本発明は、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む組成物を投与する工程によって癌を予防する、または癌治療を受けた後に癌の再発を予防する方法であって、前記癌は黒色腫、前立腺癌、前立腺上皮内腫瘍、大腸癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌および肺癌からなる群から選択される方法に関する。本発明はさらに、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つおよびドセタキセルおよび／またはダカルバジンを含む組成物、ならびにγ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つをドセタキセルおよび／またはダカルバジンと一緒に含む組成物を投与する工程によって癌を阻害、停止させる、または後退させるための方法に関する。本発明はまた、前記組成物を製造する方法にも関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その内容がこれによりあらゆる目的のために参照により全体として組み込まれる２００８年１０月２３日に出願された米国特許仮出願第６１／１０７，８４２号明細書の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、分子生物学および生化学の分野、詳細には癌の生化学および分子生物学の分野に向けられる。
【背景技術】
【０００３】
癌、またはより正確には悪性腫瘍は、一群の細胞が制御されない成長（正常限界を越える分裂）、侵襲（隣接組織上への侵入および隣接組織の破壊）、ならびに時々転移（身体内の他の場所へのリンパ液もしくは血液による伝播）を提示する１種の疾患である。
【０００４】
特定の癌の進行、またはその欠如は、高度に可変性であり、腫瘍のタイプや治療への応答に左右される。治療様式には、手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、および免疫療法が含まれる。一般には、各タイプの癌は極めて特異的に治療されるが、様々な様式の組み合わせが使用されることが多く、例えば、手術が先行して行われ、その後に放射線療法が実施される。治療への応答は、腫瘍のタイプ、腫瘍のサイズ、および腫瘍が転移しているかどうかに左右される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
癌を治療する大多数の公知の方法は、患者に重篤な副作用を及ぼす。このため本発明の目的は、癌を治療するさらなる方法を探索することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の態様では、本発明は、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む、またはこれらからなる組成物を投与する工程によって癌を予防する、または癌治療を受けた後の癌の再発を予防する方法に関するが、このとき上記癌は黒色腫、前立腺癌、大腸癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌および肺癌からなる群から選択される。
【０００７】
また別の態様では、本発明は、、および５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−３−フェニルイソセリン，Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，１３−エステル（ドセタキセル）および／または（５Ｚ）−５−（ジメチルアミノヒドラジニリデン）イミダゾール−４−カルボキサミド（ダカルバジン）とともにγ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む、またはこれらからなる組成物に関する。
【０００８】
さらにまた別の態様では、本発明は、５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル−３−フェニルイソセリン，１３−エステル（ドセタキセル）および／または（５Ｚ）−５−（ジメチルアミノヒドラジニリデン）イミダゾール−４−カルボキサミド（ダカルバジン）と共に、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む、またはこれらからなる組成物を投与する工程によって癌を阻害する、または後退させる方法に関する。
【０００９】
また別の態様では、本発明は、動物体において癌を予防する、または癌治療を受けた後に動物体内での癌の再発を予防するための医薬品を製造するためのγ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む組成物の使用に関するが、このとき上記癌は、黒色腫、前立腺癌、大腸癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌および肺癌からなる群から選択される。
【００１０】
さらにまた別の態様では、本発明は、癌を治療するための医薬品を製造するための、５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−３−フェニルイソセリン，Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，１３−エステル（ドセタキセル）または（５Ｚ）−５−（ジメチルアミノヒドラジニリデン）イミダゾール−４−カルボキサミド（ダカルバジン）とともに、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールをのうちの少なくとも１つを含む、組成物の使用に関する。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明は、５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−３−フェニルイソセリン，Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，１３−エステル（ドセタキセル）および／または（５Ｚ）−５−（ジメチルアミノヒドラジニリデン）イミダゾール−４−カルボキサミド（ダカルバジン）とともにγ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む、またはこれらからなる組成物を製造する方法であって、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−３−フェニルイソセリン，Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，１３−エステル（ドセタキセル）および／または（５Ｚ）−５−（ジメチルアミノヒドラジニリデン）イミダゾール−４−カルボキサミド（ダカルバジン）とともにと混合する工程を含む方法に関する。
【００１２】
本発明は、詳細な説明を参照して非限定的な実施例および添付の図面と結び付けて考察すればより明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】γ−Ｔ３がＰＣ−３細胞内の前立腺癌幹細胞マーカーをダウンレギュレートすることを示している実験の結果を示す図である。（Ａ）γ−Ｔ３処理後の前立腺癌幹細胞マーカーであるＣＤ４４およびＣＤ１３３のウエスタンブロッティング。γ−Ｔ３が用量および時間依存性で両方の幹細胞マーカーを統計的有意にダウンレギュレートすることに留意されたい。（Ｂ）２４時間にわたる５μｇ／ｍＬのγ−Ｔ３処理後のＰＣ−３細胞内のＣＤ４４^＋集団についてのフローサイトメトリー分析。矢印によって指示したγＴ３−処理後のＣＤ４４^＋集団は、未処理コントロール群（陰影付きピーク）と比較して減少した。（Ｃ）γ−Ｔ３処理後のＣＤ４４およびＣＤ１３３のｍＲＮＡレベル。マーカーが４８および７２時間の処理後に減少したことに留意されたい。サンプルは、ＧＡＰＤＨによって標準化した。（Ｄ）２．５および５μｇ／ｍＬのγ−Ｔ３を用いた２４、４８および７２時間にわたる処理後のＰＣ−３細胞の生存性はＭＴＴアッセイによって試験した。各実験は、少なくとも３回繰り返した。結果は、平均値±ＳＤ（標準偏差）として提示した。（Ｅ）γ−Ｔ３処理したＰＣ−３細胞内のアポトーシスマーカーのウエスタンブロッティングの結果。ＰＡＲＰ（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ）、カスパーゼ３、７、９の切断形は全く検出されず、γ−Ｔ３処理によるアポトーシスの誘導が生じないことを示していることに留意されたい。
【図２】γ−Ｔ３がＰＣ−３細胞の幹細胞の特性を抑制することを示している実験の結果を示す図である。（Ａ）細胞凝集塊（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）形成アッセイは、γ−Ｔ３もしくは溶剤で処理された細胞を用いて実施した。２００個のＰＣ−３細胞をポリＨＥＭＡコーティングされた１２ウエルプレート上に播種し、１４日間にわたりγ−Ｔ３もしくは溶剤のいずれかで処理した。形成されたプロスタスフェア（ｐｒｏｓｔａｓｐｈｅｒｅ）数を計数し、結果を平均値±ＳＤとして提示した。γ−Ｔ３処理は、ＰＣ−３細胞の細胞凝集塊形成能力を効率的に抑制することに留意されたい。（Ｂ）プロスタスフェアの画像は、顕微鏡下で捕捉した。γ−Ｔ３処理群ではプロスタスフェアを見いだせないことに留意されたい。
【図３】γ−Ｔ３が他の癌細胞系内でも癌の幹様細胞を抑制することを示している実験の結果を示す図である。（Ａ）溶剤およびγ−Ｔ３で処理したＤＵ１４５およびＭＧＨ−Ｕ１細胞内でのＣＤ４４のウエスタンブロッティング。両方の細胞系のＣＤ４４発現は、低用量γ−Ｔ３処理後にダウンレギュレートされた（注意：５μｇ／ｍＬのγ−Ｔ３は１２．１７６μＭと等価である）。（ＢおよびＣ）様々な用量のγ−Ｔ３を用いた２４および４８時間にわたる処理後のＤＵ１４５およびＭＧＨ−ＵＩ（膀胱癌）細胞の生存性を示しているＭＴＴアッセイ。（ＤおよびＥ）細胞凝集塊形成アッセイは、γ−Ｔ３もしくは溶剤で処理された細胞を用いて実施した。γ−Ｔ３処理は、両方の細胞系の細胞凝集塊形成能力を効率的に抑制することに留意されたい。細胞凝集塊の画像は、顕微鏡下で捕捉した。γ−Ｔ３処理群では細胞凝集塊を見いだせないことに留意されたい。
【図４】γ−Ｔ３が生体内でのＰＣ−３細胞の腫瘍原性を減少させることを示している実験の結果を示す図である。（Ａ）２週間にわたりＰＣ−３−Ｌｕｃ細胞が同所移植により注射されたＳＣＩＤマウスの生物発光画像。上の列にあるＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全）マウスには溶剤処理ＰＣ−３−Ｌｕｃ細胞を注射し、下の列にあるマウスにはγ−Ｔ３処理ＰＣ−３−Ｌｕｃ細胞を注射した。γ−Ｔ３群からの３匹のマウスは検出可能な腫瘍を示さなかったことに留意されたい。（Ｂ）２週間後に検出可能な腫瘍を発生したマウスのパーセンテージ。γ−Ｔ３群におけるマウスの半分以上は検出可能な腫瘍を形成しなかったが、コントロール群では１００％の腫瘍形成が見いだされたことに留意されたい（ｎ＝１６）。
【図５】γ−Ｔ３が標的とする癌幹細胞が濃縮されたプロスタスフェアに及ぼす作用を示している実験の結果を示す図である。（Ａ）ＣＳＣが濃縮されたプロスタスフェアは、血清置換培地が補給された非接着性培養中でＤＵ１４５細胞を１４日間にわたり維持することによって形成した。プロスタスフェアは次に、溶剤、γ−Ｔ３（１０、２０μｇ／ｍＬ）またはドセタキセル（Ｄｏｃ、４０ｎｇ／ｍＬ）のいずれかを用いて処理した。処理の前後に、細胞凝集塊を顕微鏡下で計数した。結果は、コントロール群に比較した細胞凝集塊数における平均変化（％）±ＳＤとして提示した。細胞凝集塊はγ−Ｔ３処理に対して高度に感受性であったが、高用量のドセタキセルに対しては耐性であったことに留意されたい。（Ｂ）溶剤、４０ｎｇ／ｍＬのドセタキセルおよび１０μｇ／ｍＬのγ−Ｔ３を用いた４８時間の処理後のプロスタスフェアの画像。γ−Ｔ３処理細胞凝集塊は解離することが見いだされた。
【図６】図６Ａは、γ−Ｔ３がｍＴＯＲおよびβ−カテニンに影響を及ぼすとは決定されなかったが、Ａｋｔシグナリング経路を抑制することを示す図である。ＡＫＴシグナリング経路の活性化はヒト前立腺癌と高度に相関しており、ＡＫＴの構成的活性形を発現するトランスジェニック動物は前立腺上皮内腫瘍を発生する。（Ｂ）γ−Ｔ３は、多能性幹細胞表現型のための重要な調節因子であるＯＣＴ３／４およびＮｅｓｔｉｎ ｍＲＮＡ発現を増強した。
【図７】γ−トコトリエノールまたはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む組成物が、癌（図７に例示した実施形態では前立腺癌）が発生する前（上から３番目の経路）およびそれが従来型抗癌療法を用いて治療された後（上から２番目の経路）に予防するために使用される、本発明の１つの態様の特定の実施形態を例示する図である。第１経路は、前立腺癌幹細胞（ＰＣＳＣ）を含む固形前立腺癌の腫瘍が例えば化学療法、またはドセタキセルなどの化学療法薬を用いた従来型抗癌療法を用いて治療される通常の療法を例示する図である。これらの療法はＰＣＳＣには影響を及ぼさないので、腫瘍はＰＣＳＣに基づいて再発する可能性がある。本明細書で言及した実験において証明されたように、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む組成物が動物体に投与されると、固形前立腺癌の腫瘍の発生を予防することができる（第３経路）。さらに、腫瘍治療後のγ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む組成物の適用は、ＰＣＳＣが癌細胞再生を開始することを防止できる。すなわち、本明細書で請求する組成物は、癌の再発を防止する。
【図８】γ−Ｔ３、ならびにδ−Ｔ３およびγ−Ｔ３を含む組成物は、前立腺癌発生の前駆体である可能性が極めて高い前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）の形成を防止することを示す図である。使用した前立腺癌マウスモデルは以前に公表された（Ｇａｂｒｉｌ，Ｍ．Ｙ．，Ｄｕａｎ，Ｗ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００５），ｖｏｌ．１１，ｎｏ．３，ｐ．３４８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９５），ｖｏｌ．９２，ｐｐ．３４３９−３４４３；Ｄｕａｎ，Ｗ．，Ｇａｂｒｉｌ，Ｍ．Ｙ．，ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００５）２４，１５１０−１５２４；Ｗａｎｇ Ｓ，Ｇａｏ Ｊ，ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２００３，ｖｏｌ．４，ｎｏ．３，ｐｐ．２０９−２１；Ｇａｂｒｉｌ，Ｍ．Ｙ．，Ｏｎｉｔａ，Ｔ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２００２，ｖｏｌ．９，ｎｏ．２３，ｐｐ．１５８９−９９）。手短には、マウスに週５日間の治療を４〜６カ月間継続して実施した。治療終了時にマウスを安楽死させ、ＰＩＮおよび低／高悪性度の前立腺癌の発生を試験する目的で生検のためにマウスの前立腺を採取した。
【図９】ビタミンＥ異性体が前立腺細胞に及ぼす作用を証明する結果を例示する図である。（Ａ）細胞生存性は、様々なビタミンＥ異性体を用いた２４および４８時間にわたる処理後にＭＴＴアッセイによって試験した。ビタミンＥ異性体、特別にはトコトリエノール類は、前立腺細胞の生存性に様々な程度で選択的に影響を及ぼすが、非腫瘍原性前立腺上皮細胞には有意な影響を及ぼさないことに留意されたい。ＰＣ−３は、ＬＮＣａＰに比較してビタミンＥ異性体に対して高応答性である。（Ｂ）ＩＣ_５０でのγ−Ｔ３の存在下でのＬＮＣａＰおよびＰＣ−３の増殖率。ＩＣ_５０用量レベルは、図９Ａにおける用量レベルと対応する。α−Ｔ３については、１００μＭを使用した。ＵＤは、未決定ＩＣ_５０を示している。
【図１０】γ−Ｔ３処理によるアポトーシスの誘導を証明する結果を例示する図である。（Ａ）フローサイトメトリーによる細胞周期の分析。２４時間にわたりＩＣ_５０でのγ−Ｔ３とともに培養したコントロール細胞および処理細胞をフローサイトメトリー分析にかけた。処理後に下位−Ｇ１集団が出現することに留意されたい。（Ｂ）ＰＣ−３におけるアポトーシス促進性経路のＩＣ_５０時間依存性および２４時間用量依存性活性化（各々、時間およびμＭ）。γ−Ｔ３は重要な分子（切断されたカスパーゼ３、７、８、９、ＰＡＲＰ）の活性化を誘導し、細胞用量および時間依存性でＢｃｌ−２およびＢａｘの量間の比率を変調させることに留意されたい。（Ｃ）ＩＣ_５０のγ−Ｔ３は、２４時間の培養期間にわたって、アポトーシス促進遺伝子を活性化し、ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３の生存促進遺伝子発現を抑制するが、非腫瘍原性前立腺上皮細胞（ＰＺ−ＨＰＶ）の生存促進遺伝子発現を抑制しない。
【図１１】γ−Ｔ３による生存促進性経路の不活性化を証明している結果を例示する図である。（Ａ）ＮＦ−κＢ経路の活性にγ−Ｔ３が及ぼす作用は、ＩＣ_５０時間依存性および２４時間用量依存性ウエスタンブロッティング（各々、時間およびμＭ）によって試験した。ＮＦ−κＢ ｐ６５およびリン酸化ＩκＢの核転座がγ−Ｔ３処理によって阻害されたことに留意されたい。（Ｂ）γ−Ｔ３の処理は、さらにまたＰＣ−３細胞内のＩｄファミリータンパク質およびＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）のダウンレギュレーションを生じさせた。
【図１２】Ｊｕｎ Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）活性化がγ−Ｔ３誘導性アポトーシスに関与することを証明している結果を例示する図である。（Ａ）２４時間にわたるγ−Ｔ３およびＪＮＫ阻害剤（ＳＰ６００１２５）との培養後の細胞生存性は、ＭＴＴアッセイによって試験した。ＪＮＫ阻害剤の添加はＰＣ−３細胞内のγ−Ｔ３の細胞毒性を緩和したが、これはＪＮＫがγ−Ｔ３の抗増殖性作用を媒介することを示唆していることに留意されたい。（Ｂ）２４時間用量依存性およびＩＣ_５０時間依存性γ−Ｔ３処理後のＪＮＫ活性（各々、μＭおよび時間）は、ＭＫＫ４、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ｃ−ｊｕｎおよびＡＴＦ−２のリン酸化レベルを測定することによって上昇することが見いだされた。したがって、γ−Ｔ３抗癌特性におけるＪＮＫの関与が確証されている。
【図１３】γ−Ｔ３処理による細胞侵襲の阻害を証明している結果を例示する図である。（Ａ）２４時間用量依存性およびＩＣ_５０時間依存性γ−Ｔ３処理は上皮マーカー（Ｅ−カドヘリン、γ−カテニン）の発現を誘導したが、間葉マーカー（ビメンチン、Ｔｗｉｓｔおよびα−ＳＭＡ）ならびにＥ−カドヘリンの抑制因子（Ｓｎａｉｌ）の発現を抑制した。（Ｂ）指示した用量のγ−Ｔ３で処理された侵襲性アンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞（ＰＣ−３）を採取し、次にマトリゲル（０．５ｍｇ／ｍＬ）をコーティングしたインサート内へプレーティングした。膜を越えて侵襲した細胞をクリスタル・バイオレットで染色し、画像は顕微鏡下で写真撮影した。抽出用緩衝液を用いて溶解させた後、５９５ｎｍで吸光度を測定した。
【図１４】γ−Ｔ３がドセタキセル誘導性アポトーシスに及ぼす相乗作用を証明している結果を例示する図である。（Ａ）２４時間にわたるドセタキセルおよびγ−Ｔ３併用処理が及ぼす作用。細胞は、２４時間にわたり様々な用量のγ−Ｔ３および１００ｎＭのドセタキセルとともに培養した。細胞生存性は、ＭＴＴアッセイによって試験した。ドセタキセルおよびγ−Ｔ３の併用処理後のアポトーシス性のＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞のパーセンテージは、いずれかの薬剤単独で処理した場合より統計的有意に高かった。（Ｂ）ウエスタンブロッティングを使用することによって、２４時間にわたるγ−Ｔ３とドセタキセルとの併用処理はアポトーシス促進分子（切断されたＰＡＲＰ、カスパーゼ３、７、８、９）の活性化を通してＰＣ−３細胞のアポトーシスを増強することがさらに証明された。増殖遺伝子の追加の抑制は、さらにまたＩｄ−１、ＥＧＦＲ、ＩκＢ、ＮＦ−κＢ ｐ６５についても確証された。（Ｃ）ＰＣａ細胞において提案されたＴ３抗癌経路。黒色腫細胞における提案された抗癌経路は、さらに図２６Ｃにおいて別個に示した。
【図１５】γ−Ｔ３処理による乳癌細胞（ＢＣａ）におけるアポトーシスの誘導を示している結果を例示する図である。（Ａ）様々なビタミンＥ異性体のＩＣ_５０は、２４時間の処理後のＭＴＴアッセイによる細胞生存性の試験によって決定した。ビタミンＥ異性体、特別にはβ−、γ−およびδ−Ｔ３は様々な程度でＢＣａ細胞の生存性を選択的に阻害するが、非腫瘍原性乳癌上皮細胞には有意な影響を及ぼさないことに留意されたい。ＵＤは、未決定ＩＣ_５０値を示している。（Ｂ）γ−Ｔ３（ＩＣ_{５０−９０}）を用いた細胞の処理は、下位−Ｇ１細胞集団の誘導を生じさせた。アポトーシス細胞（下位−Ｇ１分画）の比率は用量依存性で増加した。（Ｃ）γ−Ｔ３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＤＮＡ断片化を誘導する。手短には、細胞を採取し、断片化ＤＮＡを抽出し、臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲル中での電気泳動法によって分析した。（Ｄ）γ−Ｔ３によって誘導されたＤＮＡ断片化はさらに末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴＵＮＥＬアッセイ）によっても検出された（「未処理」黒色画像、すなわちＤＮＡ損傷は検出できない；２０および４０μＭのγ−Ｔ３、重度のＤＮＡ損傷を備えるアポトーシス細胞はＤＮＡ中のニックの存在によって緑色蛍光中に出現し、これは次に末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによって同定できる）（スケールバー：２５μｍ）。
【図１６】γ−Ｔ３処理によるアポトーシス促進分子の活性化を証明している結果を例示する図である。（Ａ）γ−Ｔ３処理は臨界アポトーシス分子（切断されたカスパーゼ３、７、８、９、ＰＡＲＰ）の活性化を誘導し、細胞用量依存性でＢｃｌ−２およびＢａｘの量間の比率を変調させることに留意されたい。（Ｂ）γ−Ｔ３はＭＣＦ７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のアポトーシス促進遺伝子を活性化したが、非腫瘍原性乳癌上皮細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）を活性化しなかった。
【図１７】γ−Ｔ３による生存促進性経路の不活性化を証明している結果を例示する図である。（Ａ）γ−Ｔ３がＮＦ−κＢ経路に及ぼす作用をウエスタンブロッティングによって試験した。ＩκＢのリン酸化は、全細胞溶解液中でのγ−Ｔ３処理によって阻害された。同様に、核転座ＮＦ−κＢ ｐ６５は、核タンパク質抽出物中で阻害された。（Ｂ）γ−Ｔ３の処理は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞内でのＥＧＦＲおよびＩｄファミリータンパク質の発現のダウンレギュレーションを生じさせた。（Ｃ）γ−Ｔ３の処理は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞内でのＩｄ１の上流調節因子のダウンレギュレーションもまた生じさせた（Ｓｒｃ、Ｓｍａｄ１／５／８およびＬＯＸ）。限局性接着キナーゼ活性（Ｆａｋ）は、ＬＯＸ活性化と強度に相関していた。（Ｄ）γ−Ｔ３で処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は溶解したので、この溶解液を、抗Ｓｒｃ抗体を使用する免疫沈降アッセイのために使用した。結果は、ＳｒｃおよびＳｍａｄ１／５／８の間の物理的相関がγ−Ｔ３処理によって影響を受けたことを示した。
【図１８】γ−Ｔ３誘導性アポトーシス中のＪｕｎ Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）およびＭＡＰＫ／ＥＲＫ活性化を証明している結果を示す図である。（Ａ）ＪＮＫ活性は、２４時間にわたるγ−Ｔ３処理後にＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ｃ−ｊｕｎおよびＡＴＦ−２のリン酸化レベルを測定することによって試験した。全タンパク質のリン酸化レベルがγ−Ｔ３によって誘導され、これはＪＮＫがγ−Ｔ３処理によって活性化されることを示唆していることに留意されたい。（Ｂ）２４時間にわたるγ−Ｔ３およびＪＮＫ阻害剤（ＳＰ６００１２５）との培養後の細胞生存性は、ＭＴＴアッセイによって試験した。ＪＮＫ阻害剤の添加はγ−Ｔ３がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に及ぼす細胞毒性を緩和したが、これはＪＮＫがγ−Ｔ３の抗増殖性作用を媒介することを示唆していることに留意されたい。（Ｃ）Ｍｅｋ１／２、Ｅｒｋ１／２およびＥｌｋ１のリン酸化レベルを測定することによって試験したＭＡＰＫ／ＥＲＫ活性は、２４時間にわたるγ−Ｔ３処理後に上昇することが見いだされた。（Ｄ）２４時間にわたるγ−Ｔ３およびＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤（Ｕ０１２６／ＰＤ０９０５９）との培養後の細胞生存性は、ＭＴＴアッセイによって試験した。ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤の添加は、γ−Ｔ３がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に及ぼす細胞毒性に影響を及ぼさなかったことに留意されたい。
【図１９】γ−Ｔ３処理による細胞侵襲の阻害を証明している結果を例示する図である。（Ａ）指示した用量のγ−Ｔ３で処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を採取し、次にマトリゲル（０．５ｍｇ／ｍＬ）をコーティングしたインサート内へプレーティングした。膜を越えて侵襲した細胞をクリスタル・バイオレットで染色し、画像は顕微鏡下で写真撮影した。抽出用緩衝液を用いて溶解させた後、５９５ｎｍでの吸光度を測定し、平均値および標準偏差で提示した（右のパネル）。（Ｂ）２４時間用量依存性γ−Ｔ３処理は上皮マーカー（α−、β−、γ−カテニン）の発現に影響を及ぼさなかったが、間葉マーカー（Ｔｗｉｓｔおよびα−ＳＭＡ）ならびにＥ−カドヘリンの抑制因子（Ｓｎａｉｌ、Ｔｗｉｓｔ）の発現を抑制した。ＰＣ−３は、野生型Ｅ−カドヘリンを発現するアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞系を表している。
【図２０】γ−Ｔ３がドセタキセル誘導性アポトーシスに及ぼす相乗作用を示している実験の結果を例示する図である。（Ａ）２４時間にわたるドセタキセルおよびγ−Ｔ３併用処理の作用。細胞は、２４時間にわたり様々な用量のγ−Ｔ３と一緒に５０ｎＭのドセタキセルとともに培養した。細胞生存性は、ＭＴＴアッセイによって試験した。ドセタキセルおよびγ−Ｔ３の併用処理後の生存性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞数は、いずれかの薬剤単独で処理した場合より統計的有意に低かった。（Ｂ〜Ｃ）ウエスタンブロッティングを使用することによって、２４時間にわたるγ−Ｔ３とドセタキセルとの併用処理はアポトーシス促進分子（切断されたＰＡＲＰ、カスパーゼ３、７、８、９）の活性化を通してＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のアポトーシスを促進することがさらに証明された。Ｉｄ−１およびＥＧＦＲ発現の抑制は、さらにウエスタンブロッティング分析によって確証された。γ−ＴＰは、γ−トコフェロールを表す。（Ｄ）２４時間にわたるγ−Ｔ３および３−アミノプロプリニトリル（ＡＰＮ）との培養後の細胞生存性は、ＭＴＴアッセイによって試験した。ＡＰＮの添加は、γ−Ｔ３がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に及ぼす細胞毒性を緩和することに留意されたい。（Ｅ）Ｉｄ１ ｍＲＮＡは、γ−Ｔ３処理後に抑制されると決定された。しかし、Ｉｄ１ ｍＲＮＡは、γ−Ｔ３と３−アミノプロプリニトリル（ＡＰＮ）との併用処理後に部分的に回復すると決定された。ＧＡＰＤＨの量は、ローディングコントロールとして測定した。（Ｆ）γ−Ｔ３と３−アミノプロプリニトリル（ＡＰＮ）との併用処理は、アポトーシス促進遺伝子（カスパーゼ３、７、８、９およびＰＡＲＰ）の活性化を後退させ、Ｉｄ１の構成的活性化を部分的に回復させた。
【図２１】ビタミンＥ異性体が黒色腫細胞に及ぼす作用を証明している結果を例示する図である。（Ａ）細胞生存性は、様々なビタミンＥ異性体を用いた２４および４８時間にわたる処理後にＭＴＴアッセイによって試験した。ビタミンＥ異性体、特別にはトコトリエノール類が様々な程度で黒色腫細胞の生存性に影響を及ぼすことに留意されたい。（Ｂ）ＩＣ_５０でのγ−Ｔ３の存在下でのＣ３２の増殖率。α−Ｔ３については、１００μＭを使用した。
【図２２】γ−Ｔ３処理によるアポトーシスの誘導を証明している結果を例示する図である。（Ａ）フローサイトメトリーによる細胞周期の分析。コントロール細胞および２４時間にわたりＩＣ_５０でのγ−Ｔ３とともに培養した処理細胞をフローサイトメトリー分析にかけた。下位−Ｇ１集団が処理後に出現することに留意されたい。（Ｂ）Ｃ３２およびＧ３６１におけるアポトーシス促進性経路の用量依存性（μＭ）活性化。γ−Ｔ３が２４時間にわたる培養期間中に細胞用量依存性で重要な分子（切断されたカスパーゼ３、７、９、ＰＡＲＰ）の活性化を誘導することに留意されたい。
【図２３】Ｃ３２細胞におけるγ−Ｔ３による生存促進性経路の不活性化を証明している結果を例示する図である。（Ａ）γ−Ｔ３（μＭ）がＮＦ−κＢ経路に及ぼす作用をウエスタンブロッティングによって試験した。ＮＦ−κＢ ｐ６５およびリン酸化ＩκＢの核転座がγ−Ｔ３処理によって阻害されたことに留意されたい。（Ｂ）γ−Ｔ３（μＭ）の処理は、さらにまたＣ３２細胞内のＩｄファミリータンパク質およびＥＧＦＲのダウンレギュレーションを生じさせた。
【図２４】Ｊｕｎ Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）活性化がＣ３２細胞内でのγ−Ｔ３誘導性アポトーシスに関与することを証明している結果を例示する図である。（Ａ）２４時間にわたるγ−Ｔ３およびＪＮＫ阻害剤（ＳＰ６００１２５）との培養後の細胞生存性を、ＭＴＴアッセイによって試験した。ＪＮＫ阻害剤の添加はＣ３２内のγ−Ｔ３の細胞毒性を緩和したが、これはＪＮＫがγ−Ｔ３の抗増殖性作用を媒介することを示唆していることに留意されたい。（Ｂ）γ−Ｔ３処理後のＪＮＫ活性は、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ｃ−ｊｕｎおよびＡＴＦ２のリン酸化レベルを測定することによって上昇することが見いだされた。そこで、γ−Ｔ３抗癌特性におけるＪＮＫの関与が確証された。
【図２５】悪性黒色腫Ｇ３６１におけるγ−Ｔ３処理による細胞侵襲の阻害を証明している結果を例示する図である。（Ａ）指示した用量のγ−Ｔ３で処理されたＧ３６１細胞を採取し、次にマトリゲル（０．５ｍｇ／ｍＬ）をコーティングしたインサート内へプレーティングした。膜を越えて侵襲された細胞を、顕微鏡下で写真撮影した。抽出用緩衝液を用いて溶解させた後、５９５ｎｍで吸光度を測定した。（Ｂ）γ−Ｔ３処理は上皮マーカー（Ｅ−カドヘリンおよびγ−カテニン）の発現を誘導した；しかし間葉マーカー（ビメンチン、α−ＳＭＡおよびＴｗｉｓｔ）の発現を抑制した。２４時間にわたり様々な用量のγ−Ｔ３で処理されたＧ３６１細胞を溶解させ、ウエスタンブロッティングによって分析した。
【図２６】Ｃ３２内でドセタキセルおよびダカルバジン誘導性アポトーシスにγ−Ｔ３が及ぼす相乗作用を証明している結果を例示する図である。（Ａ）ドセタキセルおよびγ−Ｔ３併用処理が及ぼす作用。Ｃ３２細胞は、２４時間にわたり４０μＭのγ−Ｔ３および５０ｎＭ／５００μＭのドセタキセル／ダカルバジン各々とともに培養した。細胞生存性は、ＭＴＴアッセイによって試験した。ドセタキセルおよびγ−Ｔ３の併用処理後のコントロールと比較した生存性Ｃ３２細胞のパーセンテージは、いずれかの薬剤単独で処理した場合より統計的有意に低かった。（Ｂ）ウエスタンブロッティングを使用することによって、さらにγ−Ｔ３とドセタキセルまたはダカルバジンいずれかとの併用処理はアポトーシス促進分子（切断されたＰＡＲＰ、カスパーゼ３、７、８、９）の活性化を通してＣ３２細胞のアポトーシスを増強することが証明された。増殖遺伝子の追加の抑制は、さらにまたＣ３２細胞内でのＩｄ−１、ＥＧＦＲ、ホスホロ−ＩκＢについても確証された。（Ｃ）黒色腫細胞において提案されたＴ３抗癌経路。Ｐｃａ細胞における提案された抗癌経路は、さらに図１２Ｃでもさらに別個に示した。
【図２７】薬物動態、単回投与急性毒性および血清バイオマーカーを示している実験の結果を例示する図である。（Ａ）４５週齢のＣ５７ＢＬ／６黒色マウスは、１ｍｇのγ−トコトリエノールを含有する単回用量腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を受けた。５匹のマウスは、様々な時点（１０分、３０分、１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間および７２時間後）で致死させた。血清中のγ−トコトリエノール濃度は、材料および方法の項に記載したＨＰＬＣ法を用いて分析した。（Ｂ）９０匹のＣ５７ＢＬ／６黒色マウス（各群１０匹）は、１００μＬの注射用量中に１、２、４、８、１２、１６、２０、３０および４０ｍｇのγ−トコトリエノールを含有する単回用量腹腔内注射を受けた。マウスの体重および生存率を３０日間観察し、その後にＣＯ_２吸入によって安楽死させた。（Ｃ）１０匹のＣ５７ＢＬ／６黒色マウスは、１ｍｇのγ−トコトリエノールまたはＤＭＳＯブランクを含有する週５回のｉ．ｐ．注射を受けた。マウスを、心臓出血によって致死させ、血清を材料および方法の項に記載したバイオマーカー検出方法にかけた。試験したいずれのパラメータにおいても毒物学的変化は見られなかった。バイオマーカーの血清濃度は、アルブミン（Ａｌｂ）、クレアチン（Ｃｒｅ）、アラニントランスアミラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ウレア（Ｕｒｅ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（ＲＡＮＤＯＸ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、英国クルムリン）である。
【図２８】体重、腫瘍サイズおよび投与されたγ−Ｔ３の臓器分布を示している実験の結果を示す図である。雄性ＢＡＬＢ／ｃの無胸腺ヌードマウスにＰＣａ細胞を移植し、無作為に３群へ選択した（ｎ＝１群につき５匹）；コントロール（溶剤としてのＤＭＳＯ）、γ−Ｔ３（５０ｍｇ／ｋｇ／日）およびγ−Ｔ３とドセタキセルの併用療法（５０ｍｇのγ−Ｔ３／ｋｇ／日、および７．５ｍｇのドセタキセル／ｋｇ／週）。マウスの体重を計量し（Ａ）、腫瘍は、各薬物療法前にデジタル式炭素繊維製カリパス（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ペンシルベニア州ピッツバーグ）を用いて測定した（Ｂ）。（Ｃ）臓器および血清中のγ−Ｔ３濃度は、材料および方法の項に記載したＨＰＬＣ法を用いて分析した。
【図２９】薬物治療後の雄性ＢＡＬＢ／ｃ非胸腺ヌードマウス上で異種移植されたＰＣａ細胞の画像描出を例示する図である。（Ａ〜Ｂ）２回の反復実験のために、雄性ＢＡＬＢ／ｃ無胸腺ヌードマウスにＰＣａ細胞を移植し、無作為に３群へ選択した（ｎ＝１群につき１０匹）；コントロール（溶剤としてのＤＭＳＯ）、γ−Ｔ３（５０ｍｇ／ｋｇ／日）およびγ−Ｔ３とドセタキセルの併用療法（５０ｍｇのγ−Ｔ３／ｋｇ／日、および７．５ｍｇのドセタキセル／ｋｇ／週）。マウスは、ルシフェリン溶液（１５０ｍｇ／ｋｇ（体重））のｉ．ｐ．注射を受けた。（Ａ１）は、ＤＭＳＯ（溶媒）、単独薬剤（１．５ｍｇのγ−Ｔ３／日／マウス）または併用療法（１．５ｍｇのγ−Ｔ３／日／マウスおよび０．７５ｍｇのドセタキセル／週／マウス）で治療された皮下ＰＣ３−Ｌｕｃ腫瘍を有するヌードマウスの側面図を示している。２百万個のＰＣ３−Ｌｕｃ細胞を雄性ヌードマウスに接種し、腫瘍抑制はＩＶＩＳ（商標）イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．社、米国マサチューセッツ州ホプキントン）を用いてルシフェリンの投与５分後に監視した。（Ｂ１）は、ＤＭＳＯ（溶媒）、単独薬剤（１．０ｍｇのγ−Ｔ３／日／マウス）または併用療法（１．０ｍｇのγ−Ｔ３／日／マウスおよび０．１５ｍｇのドセタキセル／週／マウス）で治療された皮下ＰＣ３−Ｌｕｃ腫瘍を有するヌードマウスの側面図を示している。百万個のＰＣ３−Ｌｕｃ細胞を雄性ヌードマウスに接種し、腫瘍抑制はＩＶＩＳ（商標）イメージングシステムを用いて治療終了時に監視した。（Ａ２およびＢ２）異なる治療群におけるマウスの平均インビボシグナル強度。（Ａ３およびＢ３）コントロール、γ−Ｔ３、ならびにγ−Ｔ３およびドセタキセルの併用療法における代表的な腫瘍の写真。矢印は、ヌードマウス上の上皮内腫瘍を示している。（Ａ４およびＢ４）コントロール、γＴ３ならびにγＴ３およびドセタキセル群から切除した腫瘍のサイズを示す写真である。
【図３０】γ−Ｔ３抗腫瘍作用が癌細胞増殖に及ぼす作用を例示している画像。ＰＣＮＡ、Ｋｉ６７およびＩｄ−１のダウンレギュレーションは、ＰＣＮＡ、Ｋｉ６７およびＩｄ−１に対するマウス抗体ならびに二次抗体抗であるマウスＦａｂ−ＨＲＰを用いたＩＨＣ免疫組織化学検査によって決定した。これら３つの細胞増殖分子についての発現レベルは、γ−Ｔ３単独またはドセタキセル（Ｄｏｃｅ）との併用療法のいずれかを用いた治療後にはより低かった（全画像におけるスケールバー：１００μｍ）。
【図３１】γ−Ｔ３抗腫瘍作用が癌細胞アポトーシスに及ぼす作用を例示している画像を示す図である。切断カスパーゼ３および切断ＰＣＮＡの存在は、切断カスパーゼ３および切断ＰＡＲＰに対するウサギポリクローナル抗体ならびに二次抗体である抗ウサギＦａｂ−ＨＲＰを用いたＩＨＣ免疫組織化学検査によって決定した。これら２つの分子についての発現レベルは、γ−Ｔ３単独またはドセタキセル（Ｄｏｃｅ）との併用療法のいずれかを用いた治療後にはより高かった（全画像におけるスケールバー：１００μｍ）。
【図３２】γ−Ｔ３抗腫瘍作用が腫瘍サプレッサー遺伝子およびその抑制体に及ぼす作用を例示している画像を示す図である。腫瘍サプレッサー遺伝子（Ｅ−カドヘリン；（Ａ））およびその抑制体（Ｓｎａｉｌ；（Ｂ））の発現における変化は、Ｅ−カドヘリンおよびＳｎａｉｌに対する抗体ならびに二次抗体であるＦａｂ−ＨＲＰを用いたＩＨＣ免疫組織化学検査によって決定した。これら２つの分子についての発現レベルは、γ−Ｔ３単独またはドセタキセル（Ｄｏｃｅ）との併用療法のいずれかを用いた治療後には反比例していた（全画像におけるスケールバー：１００μｍ）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
第１態様では、本発明は、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む組成物を投与する工程によって癌を予防する、または癌治療を受けた後の癌の再発を予防する方法に関する。
【００１５】
本発明者らは初めて、本明細書で言及する組成物が、ａ）本明細書で言及するウエスタンブロッティングおよびフローサイトメトリー分析から明らかなように、幹細胞マーカーであるＣＤ１３３およびＣＤ４４などの幹細胞マーカーの発現をダウンレギュレートできる、およびｂ）スフェアおよび腫瘍の形成を抑制できることを証明する。そこで、本発明者らによって、癌細胞に発達する可能性がある細胞の本明細書で言及した組成物による前処理が細胞の腫瘍開始能力を妨害することが見いだされることが証明された。これらの所見は、本明細書で言及する実験結果から明白になるように、生体外での（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ならびに生体内での（Ｉｎ ｖｉｖｏ）データによって裏付けられている。本発明のこの態様の一般的原理は、γ−およびδ−トコトリエノ−ルのうちの少なくとも１つを含む組成物が癌の治療を防止するため、または癌治療を受けた後の癌の再発を回避するために使用された１つの実施例に基づいて図７に例示されている。図８に例示したさらに別の実施例では、前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）を発生するように遺伝子組換えされている特殊なマウスは、γ−もしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つまたはγ−およびδ−トコトリエノールの混合物を含む組成物が与えられるとＰＩＮを発生しない。
【００１６】
「癌の予防」は、癌が発生するのを予防する、または遅延させる行為を意味する。本発明の場合には、本明細書で言及する組成物を投与する工程は、癌が動物体内で発生できない作用を有する。予防は、本明細書で言及した組成物が、既に動物体内に存在する癌細胞を治療するため、または言い換えると既に癌に罹患している動物体を治療するために使用される「癌治療」とは区別しなければならない。時々、用語「化学的予防」が使用される。用語「癌治療」と同様に、「化学的予防」もまた既に癌に罹患している患者の治療に関連しており、本発明の特許請求項において言及する「癌の予防」と誤解されてはならない。化学的予防は、この特定種類の治療を受けている動物体にとってほとんどが重篤な副作用を有する化学療法の使用を回避するための治療が想定されることを意味している。
【００１７】
また別の実施形態では、本明細書で言及した組成物はさらにまた、癌治療を受けた後の癌の再発を予防するために使用することもできる。これは、癌に罹患した、そして動物体を癌から治癒させるための治療を受けた動物体が癌を再発することを予防するために本明細書で言及した組成物を使用することを意味している。１つの実施形態では、それは動物体が癌から動物体を治癒もしくは回復させるための治療を受けて終了したことを意味する。進行中の癌治療との相違は、本明細書で言及した組成物が癌細胞の増殖を破壊もしくは停止させるためではなく、「癌を予防する」ために癌が再発するのを予防もしくは遅延させるために使用されるという事実に基づいている。本明細書で言及する「回復」もしくは「治癒」は、臨床的には癌の徴候もしくは症状の永続的不在；癌の完全な寛解または癌の臨床的証拠の消失としての完全な応答であると規定されている。
【００１８】
「癌治療」は、癌細胞を排除または除去することを目的とする、あらゆる種類の既知の癌の治療を意味する。癌治療もしくは療法の主要な物理療法は、手術、および放射線療法（局所性および局所限局性疾患のため）、ならびに化学療法（全身性疾患のため）である。その他の重要な方法には、ホルモン療法（選択された癌、例えば前立腺癌、乳癌または子宮内膜などのため）、免疫療法（モノクローナル抗体、インターフェロン、およびその他の生物学的応答修飾因子および腫瘍ワクチン類）、例えばレチノイド剤などの分化誘導薬、細胞および分子生物学の発展した知識を利用する薬剤の使用ならびに上記の治療もしくは療法の組み合わせが挙げられる。
【００１９】
一般に、「癌」はその正常な制御機構を消失した、したがって調節されない成長（増殖）、分化の欠如、局所的組織侵襲、および頻回に転移を有する１群の細胞（通常は単細胞に由来する）を意味すると考えられている。癌性（悪性）細胞は、あらゆる器官内のあらゆる組織から発生する可能性がある。癌性細胞は成長して増殖するにつれて、それらは正常隣接組織に侵襲して破壊できる、腫瘍と呼ばれる一塊の癌性組織を形成する。用語「腫瘍」は、異常な増殖もしくは塊を意味しているが、腫瘍は癌性の場合も非癌性の場合もある。原発（初期）部位からの癌性細胞は、全身にわたって伝播（転移）することができる。癌性細胞は、形質転換と呼ばれる複雑なプロセスで、健常細胞から発生する。このプロセスにおける第１工程は、細胞遺伝物質（ＤＮＡまたは時々は染色体構造）中の変化が細胞を癌性になるように刺激する開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）である。細胞の遺伝物質中のこの変化は特発性で発生することがある、または癌を誘発する物質（発癌物質）によって引き起こされることもある。γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む本明細書で言及した組成物は、この開始を予防することができる。
【００２０】
１つの実施形態では、本明細書で言及した組成物を用いて治療できる癌のタイプは、例えば染色体異常などの遺伝的突然変異によって誘発された癌、または例えば少数を挙げるとパピローマウイルス、エプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルスなどのウイルスによって誘発された癌であってよい。遺伝的突然変異の原因となる遺伝子のうち２つの主要な遺伝子群は、発癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子である。発癌遺伝子は細胞増殖を調節する正常遺伝子の異常な形態（癌原遺伝子）であるが、腫瘍サプレッサー遺伝子は細胞分割およびＤＮＡ修復において重要な役割を果たす固有の遺伝子であり、細胞内の不適切な増殖シグナルを検出するために極めて重要である。そこで、１つの実施形態では、治療対象の癌は、発癌遺伝子の突然変異によって誘発された癌、または腫瘍サプレッサー遺伝子の突然変異によって誘発された癌のいずれかを意味する。
【００２１】
また別の実施形態では、癌のタイプには、リンパ球性白血病、骨髄性白血病、悪性リンパ腫、骨髄増殖性疾患、または固形腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態では、癌は、黒色腫（皮膚癌）、前立腺癌、大腸癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌および肺癌が挙げられるがこれらに限定されない癌のタイプを意味する。１つの実施例では、癌は、前立腺癌、乳癌または黒色腫（皮膚癌）を意味する。また別の実施形態では、本発明は、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む組成物を投与する工程によって、前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）の予防または癌治療を受けた後の前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）の再発の予防に向けられる。
【００２２】
ビタミンＥは、２つの主要成分であるトコフェロール類（Ｔ）およびトコトリエノール類（Ｔ３）から構成される。トコトリエノール類（Ｔ３）は主としてパーム油中に見いだされる。トコフェロール類（Ｔ）と一緒に、これらは全ての生存細胞への有意な抗酸化物質活性源を提供する。この共通の抗酸化物特性は、それらの構造的側鎖（トコトリエノールについてはファルネシルまたはトコフェロールについては飽和フィチル側鎖を含有する）のみ異なるトコトリエノール類とトコフェロール類の化学構造における類似性を反映している。クロマノール環上のヒドロキシル基からの共通する水素原子は、連鎖伝播性ペルオキシルフリーラジカルを除去するように機能する。これらのクロマノール環上のメチル基の所在位置に依存して、トコフェロール類およびトコトリエノール類は４つの異性体形：アルファ（α）、ベータ（β）、ガンマ（γ）、およびデルタ（δ）に識別することができる。
【００２３】
上述したように、癌を予防するため、または癌治療を受けた後の癌の再発を予防するために、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む組成物が使用される。γ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールはビタミンＥの異性体である。ビタミンＥは、２つの主要成分であるトコフェロール類（Ｔ）およびトコトリエノール類（Ｔ３）から構成される。トコトリエノール類（Ｔ３）は主としてパーム油中に見いだされる。トコフェロール類（Ｔ）と一緒に、これらは全ての生存細胞への有意な抗酸化物質活性源を提供する。この共通の抗酸化物質性の性質は、それらの構造的側鎖（トコトリエノールについてはファルネシルまたはトコフェロールについては飽和フィチル側鎖を含有する）しか相違していないトコトリエノール類とトコフェロール類の化学構造における類似性を反映している。
【００２４】
様々なトコフェロールおよびトコトリエノールのアイソフォームが存在する（式ＩおよびＩＩを参照されたい）。トコフェロール類は、クロマノール環およびホモゲンチシン酸塩（ＨＧＡ）および二リン酸フィチルに各々由来するクロマノール環および１５炭素テールからなる。他方、トコトリエノール類は、構造的には炭化水素テール中の３つのトランス二重結合の存在によってトコフェロール類とは異なる。式Ｉおよび式ＩＩならびにそれに続く説明は、トコフェロール類（Ｔ）およびトコトリエノール類（Ｔ３）の公知のアイソフォームに関する概説を提供する。
【化１】

【００２５】
式Ｉ（Ａ）：Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｍｅは、α−トコフェロールとして公知であり、α−トコフェロールもしくは５，７，８−トリメチルトコールと指定されている；Ｒ１＝Ｒ３＝Ｍｅ；Ｒ２＝Ｈは、β−トコフェロールとして公知であり、β−トコフェロールもしくは５，８−ジメチルトコールと指定されている；Ｒ１＝Ｈ；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｍｅは、γ−トコフェロールとして公知であり、γ−トコフェロールもしくは７，８−ジメチルトコールと指定されている；Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ；Ｒ３＝Ｍｅは、δ−トコフェロールとして公知であり、δ−トコフェロールもしくは８−メチルトコールと指定されている。式ＩＩ（Ｂ）：Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈは、２−メチル−２−（４，８，１２−トリメチルトリデカ−３，７，１１−トリエニル）クロマン−６−オールであり、トコトリエノールと指定されている；Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｍｅは、以前はζ１もしくはζ２−トコフェロールとして公知であり、５，７，８−トリメチルトコトリエノールもしくはα−トコトリエノールと指定されている。名称トコクロマノール−３もまた使用されてきた；Ｒ１＝Ｒ３＝Ｍｅ；Ｒ２＝Ｈは、以前はγ−トコフェロールとして公知であり、５，８−ジメチルトコトリエノールもしくはβ−トコトリエノールと指定されている；Ｒ１＝Ｈ；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｍｅは、以前はγ−トコフェロールとして公知であり、７，８−ジメチルトコトリエノールもしくはγ−トコトリエノールと指定されている。名称プラストクロマノール−３もまた使用されてきた；Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ；Ｒ３＝Ｍｅは、８−メチルトコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールと指定されている。
【００２６】
本明細書で言及した組成物は、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのいずれかまたは両方のアイソフォーム、すなわちγ−トコトリエノールとδ−トコトリエノールの混合物を含む、またはこれらからなる。１つの実施形態では、γ−もしくはδ−トコトリエノールの量を濃縮することができる。「濃縮（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」は、トコトリエノールの各アイソフォームが、その天然源から単離されたトコトリエノールの全アイソフォームを含む正規混合物中におけるより高い量で含まれることを意味する。例えば、パーム油から単離されたトコトリエノールは、γ−トコトリエノールおよびσ−トコトリエノールを上記油の総重量に基づいて１０重量％未満の量で含んでいる。そこで、本発明の実施形態に関しては、「濃縮」調製物は、γ−トコトリエノールもしくはσ−トコトリエノールまたはγ−トコトリエノールもしくはσ−トコトリエノールの混合物を上記調製物（または組成物）の総重量に基づいて１０重量％を超える量で含むあらゆる調製物を意味する。
例えば、濃縮調製物は、γ−トコトリエノールもしくはσ−トコトリエノールを少なくとも１０重量％の量で含んでいる。
また別の実施例では、濃縮調製物は、γ−トコトリエノールおよびσ−トコトリエノールの混合物を含んでいるが、このときγ−トコトリエノールは４重量％の量で、そしてσ−トコトリエノールは６重量％の量で、つまり合計すると１０重量％の量で含まれている。
【００２７】
また別の実施形態では、「濃縮」は、γ−トコトリエノールおよびσ−トコトリエノールの混合物中でさえ、両方の成分は少なくとも１０重量％の量で、つまり少なくとも１０重量％のγ−トコトリエノールおよび少なくとも１０重量％のσ−トコトリエノール（総計して組成物全体の２０重量％）の量で含まれることを意味する。
【００２８】
また別の実施形態では、濃縮トコトリエノール組成物または調製物は、γ−トロトリエノールまたはδトコトリエノールを上記組成物の総重量に基づいて少なくとも１０重量％、または少なくとも２０重量％、または少なくとも３０重量％、または少なくとも４０重量％、または少なくとも５０重量％、または少なくとも６０重量％、または少なくとも７０重量％、または少なくとも８０重量％、または少なくとも９０重量％の量で含む組成物または調製物を意味する。
【００２９】
さらにまた別の実施形態では、濃縮γ−および／またはδ−トコトリエノール組成物または調製物は、上記調製物の総重量に基づいて約１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％または少なくとも９０重量％の量でこのトコトリエノールアイソフォームのうちの少なくとも１つを含む組成物または調製物を意味する。さらに別の実施形態では、本明細書で言及した組成物は、γ−およびδ−トコトリエノールを一緒に上記に規定した量で含んでもよい。
【００３０】
また別の実施形態では、本組成物は、γ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールを１：Ｙ（式中、Ｙは１０未満である）の比率で含むことができる。例えば、パーム油から単離されたγ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールは、γ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールを１：０．３８の比率で含んでおり；アナトー油（ａｎｎａｔｔｏ ｏｉｌ）から単離された場合はγ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールを１：９の比率で含んでいる。そこで、さらに別の実施形態では、本組成物はγ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールを１：（０．３〜約０．７）または１：（４〜９）の比率で含むことができる。多数の天然生成物もまたトコトリエノールの他のアイソフォームを含む可能性があるので、本明細書で言及した組成物はγ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールだけを含む訳ではなく、さらにα−トコトリエノールもしくはβ−トコトリエノールまたはα−トコトリエノールおよびβ−トコトリエノールを含んでもよい。また別の実施例では、本明細書で言及した組成物は、実質的にはα−トコトリエノールおよび／もしくはβ−トコトリエノールならびに／またはα−トコトリエノールおよびβ−トコトリエノールならびに／または任意のトコフェロールを実質的に含んでいない。しかし１つの実施形態では、例えばα−、β−、γ−またはδ−トコフェロールなどの少なくとも１つのトコフェロールが本明細書で言及した組成物中に含まれることもまた可能である。例えば、トコトリエノール類およびトコフェロール類をパーム油の総重量の７０重量％で含むように単離および濃縮されたパーム油は、α−トコフェロール、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールを０．２４：０．２４：０．０３３：０．３３：０．１３の比率で含むことができる。
【００３１】
１つの実施形態では、癌を予防するため、または癌の再発を予防するための、少なくとも１つのγ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールを含む本組成物は、さらなる抗癌活性物質を含んでいない。この実施形態に関連して、抗癌活性物質は、例えばドキソルビキシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｘｉｎ）、パクリタキセル、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などの、それ自体が癌を予防するために作用するあらゆる物質を意味する。
【００３２】
また別の実施形態では、本発明の組成物は、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキンガレート（ＥＣＧ）、およびエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）などの緑茶ポリフェノール類、または例えばニンニク由来のＳ−アリルメルカプトシステインおよびニンニク由来のアリシンなどの有機硫黄化合物、または例えばトラメテス・ベルシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）およびコリオラス・ベルシカラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）各々から単離された多糖−Ｋ（クレスチン、ＰＳＫ）および多類ペプチド（ＰＳＰ）などのタンパク質結合多糖類、または例えばトマトや他の赤色果実および野菜中で見いだされるリコピンなどの赤色カルテノイド色素をさらに含むことができる。
【００３３】
動物体に投与される組成物の量は、成体体重６０ｋｇにつき約１０ｍｇ〜約１，０００ｍｇまたは成体体重６０ｋｇにつき約１０ｍｇ〜約５００ｍｇであってよい。
【００３４】
また別の実施形態では、本組成物は、動物の血液中で個別トコトリエノール異性体の約０．１〜３０ｍｇ／Ｌまたは約１０〜３０ｍｇ／Ｌの血清中濃度を得るための量で投与される。１つの実施例では、γ−トコトリエノールの濃度は、約１ｍｇ／Ｌである。
【００３５】
１つの実施形態では、動物体は哺乳動物である。哺乳動物の例には、ヒト、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ウシ、イヌまたはネコが含まれるがこれらに限定されない。
【００３６】
また別の態様では、本発明は、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つ、および５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−３−フェニルイソセリン，Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，１３−エステル（ドセタキセル）および／または（５Ｚ）−５−（ジメチルアミノヒドラジニリデン）イミダゾール−４−カルボキサミド（ダカルバジン）を含む組成物に関する。
【００３７】
例えば、前立腺癌（ＰＣａ）は、肺癌を除くその他全ての癌の中で最大数の死亡症例の原因である。腫瘍の緩徐に進行する性質に起因して、前立腺癌の患者の多くは診断時に既に転移性疾患を発生しており、ホルモンアブレーション療法後には不可避的にホルモン不応期に進むであろう。現時点ではホルモン不応性前立腺癌（ＨＲＰＣ）に対する治癒的治療は依然として存在しない。ＨＲＰＣ患者のために最も効果的な治療法であるドセタキセルをベースとする化学療法は生存期間中央値を３カ月間しか改善できない。このため、転移性ＨＲＰＣに対する効果的な治療戦略が至急に必要とされている。
【００３８】
現在までに、転移性ＨＲＰＣに対する現行療法の失敗の背景となる理由は完全には理解されていないが、現行療法が高度に分化した腫瘍細胞を標的とする場合にのみ成功するが、推定癌幹／前駆細胞には影響を及ぼさないことを提示してきた根拠が増えつつある。正常幹細胞に関しては、癌幹細胞（ＣＳＣ）は成熟幹細胞に比較して静止性であると思われる。この特性は、ＣＳＣを主として活動的に複製中の細胞を標的とする化学療法薬に対して耐性にさせる。さらに、前立腺ＣＳＣはアンドロゲン受容体を発現しない。そこで、前立腺ＣＳＣは、成熟腫瘍細胞のようにはホルモンアブレーションに応答しない。自己更新および分化能力のおかげで、前立腺ＣＳＣは、ホルモンアブレーション後に不均一腫瘍集団（アンドロゲン依存性および非依存性両方の細胞を備える）を再生することができるので、これが腫瘍再発の原因となる。γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つをドセタキセルと一緒に含む本発明の組成物を使用すると、本明細書で言及した生体外でのおよび生体内での試験結果によって裏付けられたように、例えば前立腺癌などの癌を首尾よく治療できることが初めて証明された。
【００３９】
本発明者らは本明細書で初めて、ドセタキセルもしくはダカルバジン誘導性アポトーシスが本明細書で言及した組成物の存在下では有意に増強されることを証明したが、これは例えば黒色腫細胞、乳癌細胞および前立腺癌細胞などの癌細胞に対するγ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つならびにドセタキセルおよび／またはダカルバジンの相乗作用を示唆している。本発明者らが実施した半数致死量（ＬＤ_５０）試験は、トコトリエノール類抽出物を用いた治療後に毒性を指示しなかったが（ＬＤ_５０≧２，０００ｍｇ／ｋｇ）、この試験からの結果は、トコトリエノール異性体類が、例えば悪性黒色腫、乳癌、肝臓癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌または前立腺癌などの癌を治療するために、例えばドセタキセルおよびダカルバジンなどの化学療法薬と併用して安全かつ有効な抗癌薬として使用できることを証明している。
【００４０】
本明細書で言及した実験の結果は、初めて、例えばγ−トコトリエノールなどのトコトリエノールにおけるＪＮＫ経路の関与が黒色腫細胞または乳癌細胞または前立腺細胞などの癌細胞においてアポトーシスを誘導したことを確証している。注目すべきことは、ＪＮＫ経路が化学療法薬であるドセタキセルおよびダカルバジンによって誘導される細胞アポトーシスにも関与することも公知である点である。これらの所見を考慮に入れると、本発明者らにはトコトリエノールがＪＮＫ経路の活性化の結果としてドセタキセルおよびダカルバジンとの相乗性相互作用を有するのではないかという疑問が生じた。このため、本発明者らは、化学療法薬単独、またはトコトリエノールとの併用療法の抗増殖能力を比較した。注目すべきことに、化学療法薬とトコトリエノールとの併用療法は高率のアポトーシス細胞を生じさせるが、γ−トコフェロールなどのトコフェロールは生じさせないことが見いだされた。
【００４１】
本発明者らはさらに、本明細書で言及した組成物が、例えばＩｄ−１、Ｉｄ−２、Ｉｄ−３またはＩｄ−４などのＩｄファミリーの少なくとも１つのタンパク質の活性を変調させられることもまた見いだした。１つの実施形態では、本明細書で言及した組成物は、Ｉｄ−１の活性を阻害する。さらに、本明細書で言及した組成物は、Ｅ−カドヘリンおよびγ−カテニンの発現の回復を通して細胞侵襲、すなわち癌の転移を阻害することもまた見いだされた。そこで１つの実施形態では、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つならびにドセタキセルおよび／またはダカルバジンを含む本組成物は、癌の転移を阻害する。
【００４２】
本明細書で言及したトコトリエノール濃縮組成物もしくは調製物と併用できるドセタキセルは、例えば乳癌、卵巣癌、および非小細胞性肺癌を治療するために使用される抗腫瘍医薬品である。ドセタキセルは、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ社によって名称Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）注射用濃縮液を付けて市販されている。ドセタキセルは、一般には１０サイクルのコースにわたって３週間毎に１回の１時間の注入として投与される。ドセタキセルは、化学療法薬のクラスであるタキサン系に属しており、希少な西洋イチイ（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｙｅｗ）であるテキサス・ブレビフォリア（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）からの抽出物であるタキソールの半合成アナログ（パクリタキセル）である。ドセタキセルの抗癌活性は、ＧＴＰの非存在下では生理学的微小管脱重合／分解を防止しながら、微小管重合を促進および安定化する能力に起因する。これは微小管形成のために必要とされる遊離チューブリンの有意な減少をもたらし、有糸分裂の中期と後期との間の有糸分裂細胞分割の阻害を生じさせ、その後の癌細胞分割および増殖を防止する。
【００４３】
本明細書で言及したトコトリエノール濃縮組成物もしくは調製物と併用して使用できるその他の化学療法薬は、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）である。ダカルバジンは、アルキル化剤のグループに属する。ダカルバジンは、抗腫瘍活性を備えるトリアゼン誘導体である。ダカルバジンは、細胞周期の全期中にＤＮＡをアルキル化して架橋させ、結果としてＤＮＡ機能の崩壊、細胞周期停止、およびアポトーシスを生じさせる。そこで、ダカルバジンは、様々な癌、特にほんの少数例を挙げると悪性黒色腫、ホジキン（Ｈｏｄｇｋｉｎ）リンパ腫、肉腫、および膵臓の島細胞癌を治療するために使用される。
【００４４】
また別の態様では、本発明は、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル−３−フェニルイソセリン，１３−エステル（ドセタキセル）および／または（５Ｚ）−５−（ジメチルアミノヒドラジニリデン）イミダゾール−４−カルボキサミド（ダカルバジン）とともに含む組成物を投与する工程によって癌を阻害する、停止させる、または後退させる方法に関する。
【００４５】
本発明の状況では、「後退させる」は、腫瘍塊のサイズを減少させ、最終的には腫瘍を完全に排除することを意味する。そこで、癌を後退させることは、癌を治癒させる、つまり動物体内にあらゆる癌の徴候を排除することを意味する。癌を「阻害する」または「停止させる」ことは、腫瘍を安定化させることを意味する。安定化された腫瘍は、疾患の改善も悪化も示さない。
【００４６】
γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む本組成物の一部は、本発明の第１態様に関連して上述した他の物質（ポリフェノール類など）と同一調製物、量、組み合わせで使用できる。γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む組成物または調製物は、化学療法薬、つまりドセタキセルおよび／またはダカルバジンとは別個に投与できる、または１つの組成物中で一緒に調製することができる。
【００４７】
癌を阻害する、または停止させる、または後退させる方法では、上記癌は黒色腫（皮膚癌）、前立腺癌、大腸癌、前立腺上皮内腫瘍、膀胱癌、肝臓癌、乳癌または肺癌の形態にあってよい。
【００４８】
１つの実施形態では、本発明は、黒色腫を阻害する、または後退させる方法に関するが、本組成物は、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル−３−フェニルイソセリン，１３−エステル（ドセタキセル）および／または（５Ｚ）−５−（ジメチルアミノヒドラジニリデン）イミダゾール−４−カルボキサミド（ダカルバジン）のうちのいずれか１つを含む。さらにまた別の実施形態では、本発明は、前立腺癌、または乳癌もしくは前立腺上皮内腫瘍を阻害する、または後退させる方法に関するが、本組成物は、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル−３−フェニルイソセリン，１３−エステル（ドセタキセル）のうちのいずれか１つを含む。さらにまた別の態様では、本発明は、上述した癌または癌のタイプを治療するための医薬品を製造するための、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールをのうちの少なくとも１つを５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−３−フェニルイソセリン，Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，１３−エステル（ドセタキセル）および／または（５Ｚ）−５−（ジメチルアミノヒドラジニリデン）イミダゾール−４−カルボキサミド（ダカルバジン）のうちのいずれか１つを含む組成物の使用に関する。
【００４９】
ビタミンＥおよびそれらのアイソフォームは一般的に水不溶性であるので、本明細書で言及した組成物は、１つの実施形態では水溶性形で調製される。そこで、本明細書で言及した組成物は、特定化合物の添加によって水溶性化される。本明細書で言及した組成物の水溶性化形は、例えば、それを固体分散液に調製することによって入手できる。水分散性および水溶性トコトリエノール形を調製する他の方法は、米国特許第５８６９７０４号明細書に開示されている。
【００５０】
用語「固体分散液」は、少なくとも２つの成分を含む固体状態（液体または気体状態とは対照的）にある系を規定しており、このとき１つの成分は他の成分もしくは成分全体に分散している。例えば、有効成分（トコトリエノール類）または有効成分の組み合わせ（トコトリエノール類および化学療法薬）は、医薬上許容される水溶性ポリマーおよび医薬上許容される界面活性剤からなるマトリックス中に分散させられる。
【００５１】
用語「固体分散液」は、別の相に分散した１つの相の微粒子を有する系を含んでいる。これらの粒子は、典型的にはサイズが４００μｍ未満、例えばサイズが１００μｍ未満、１０μｍ未満、または１μｍ未満である。前記成分の分散液が、上記系が１つの相全体に化学的および物理的に一様もしくは均質である、または１つの相からなる（熱力学において規定されるように）ような場合は、そのような固体分散液は「固体溶液」もしくは「ガラス溶液」と呼ばれるであろう。ガラス溶液は、溶質がガラス状溶媒中に溶解している均質なガラス質系である。
【００５２】
このような固体分散液は、異なる経路を介して投与できる。例えば、経口投与される固体剤形には、カプセル剤、糖衣錠、顆粒剤、ピル剤、散剤、および錠剤が含まれるがこれらに限定されない。このような剤形を調製するために一般に使用される賦形剤には、カプセル化材料、または吸収促進剤、抗酸化物質、結合剤、緩衝剤、コーティング剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、フレーバー剤、保湿剤、潤滑剤、保存料、噴射剤、離型剤、安定化剤、甘味料、可溶化剤、およびそれらの混合物などの調整物添加物が含まれる。
【００５３】
固体剤形で経口投与される化合物のための賦形剤には、寒天、アルギン酸、水酸化アルミニウム、安息香酸ベンジル、１，３−ブチレングリコール、ヒマシ油、セルロース、酢酸セルロース、カカオ脂、コーンスターチ、コーン油、綿実油、エタノール、酢酸エチル、炭酸エチル、エチルセルロース、エチルラウリエート（ｅｔｈｙｌ ｌａｕｒｅａｔｅ）、オレイン酸エチル、ゼラチン、胚芽油、グルコース、グリセロール、落花生油、イソプロパノール、等張食塩水、ラクトース、水酸化マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、麦芽、オリーブ油、ピーナッツ油、リン酸カリウム塩、ジャガイモデンプン、プロピレングリコール、タルク、トラガンタ、水、ベニバナ油、ゴマ油、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム塩、大豆油、スクロース、テトラヒドロフルフリルアルコール、およびそれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない。
【００５４】
１つの実施形態では、剤形は、γ−トコトリエノールおよび／またはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つまたはドセタキセルおよび／またはダカルバジンと一緒のγ−トコトリエノールおよび／またはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つの混合物の固体溶液もしくは固体分散液を含むことができ、上記マトリックスは少なくとも１つの医薬上許容される水溶性ポリマーおよび少なくとも１つの医薬上許容される界面活性剤を含むことができる。適切な医薬上許容される水溶性ポリマーには、少なくとも５０℃、または少なくとも６０℃、または約８０℃〜約１８０℃のガラス転移温度（Ｔ_ｇ）を有する水溶性ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
上記に規定したＴ_ｇを有する水溶性ポリマーは、機械的に安定性であり、通常の温度範囲内では十分に温度安定性である固体溶液もしくは固体分散液の調製を可能にするので、上記固体溶液もしくは固体分散液はそれ以上加工処理せずに剤形として使用できる、またはほんの少量の打錠助剤を用いて錠剤に圧縮することができる。
【００５６】
本明細書で言及した剤形に含まれる水溶性ポリマーは、２（ｗ／ｖ）％の水溶液中に２０℃で溶解させた場合に１〜５，０００ｍＰａ・ｓ、または１〜７００ｍＰａ・ｓ、または５ｍＰａ・ｓ〜１００ｍＰａ・ｓの見掛け粘度を有していてよいポリマーである。
【００５７】
本明細書で言及した剤形に使用するのに適切な水溶性ポリマーには、Ｎ−ビニルラクタムのホモポリマーおよびコポリマー、特別にはＮ−ビニルピロリドンのホモポリマーおよびコポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、Ｎ−ビニルピロリドンと酢酸ビニルもしくはプロピオン酸ビニルのコポリマー；セルロースエステル類およびセルロースエーテル類、特別にはメチルセルロースおよびエチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース類、特別にはヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシアルキルアルキルセルロース類、特別にはヒドロキシプロピルメチルセルロース、セルロースフタル酸塩類もしくはコハク酸塩類、特別には酢酸フタル酸セルロースおよびフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくは酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース；高分子量酸化ポリアルキレン類、例えば酸化ポリエチレンおよび酸化プロピレンおよび酸化エチレンと酸化プロピレンのコポリマー；ポリアクリレート類およびポリメタクリレート類、例えばメタクリル酸／アクリル酸エチルコポリマー類、メタクリル酸／メタクリル酸メチルコポリマー類、ブチルメタクリレート／２−ジメチルアミノエチルメタクリレートコポリマー、ポリ（ヒドロキシアルキルアクリレート類）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート類）；ポリアクリルアミド類、酢酸ビニルポリマー類、例えば醋酸ビニルとクロトン酸のコポリマー類、部分加水分解酢酸ポリビニル類（部分鹸化「ポリビニルアルコール」とも呼ばれる）、ポリビニルアルコール；オリゴ糖および多糖類、例えばカラゲナン類、ガラクトマンナン類およびキサンタンガム、またはそれらのうちの１つ以上の混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
本明細書で使用する用語「医薬上許容される界面活性剤」は、医薬上許容される非イオン性の界面活性剤を意味する。本明細書で言及した剤形は、１２〜１８、または１３〜１７、または１４〜１６の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）値を有する少なくとも１つの界面活性剤を含んでいる。ＨＬＢ系は界面活性剤に数値を付けており、親油性物質には低いＨＬＢ値が付けられ、親水性物質には高いＨＬＢ値が付けられる。
【００５９】
１つの実施形態では、本明細書で言及した剤形は、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、例えば、ポリオキシエチレングリコールトリリシノオレエートもしくはポリオキシ３５ヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ）またはポリオキシエチレングリコールオキシステアレート、例えばポリエチレングリコール４０水素化ヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＲＨ４０、ポリオキシル４０水素化ヒマシ油もしくはマクロゴールグリセロールヒドロキシステアレートとしても公知である）もしくはポリエチレングリコール６０水素化ヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＲＨ６０）；またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノ脂肪酸エステル、例えば、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０）、またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）から選択される１つ以上の医薬上許容される界面活性剤を含んでいる。１８より大きい、または１２より小さいＨＬＢ値を備える界面活性剤を含む他の界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー類もしくはポリオキシエチレンポリプロピレングリコールとしても公知の酸化エチレンと酸化プロピレンとのブロックコポリマー類、例えばＰｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）１２４、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）１８８、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）２３７、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）３８８、またはＰｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）４０７などもまた使用できる。
【００６０】
２つ以上の界面活性剤が使用される場合は、１２〜１８のＨＬＢ値を有する界面活性剤が、使用される界面活性剤の総重量の好ましくは少なくとも５０重量％、より好ましくは少なくとも６０重量％を占める。
【００６１】
本明細書で言及した剤形は、さらにまた追加の賦形剤もしくは添加物、例えば流動調節剤、潤滑剤、バルク化剤（充填剤）および崩壊剤などを含むことができる。このような追加の賦形剤は、制限なく、全剤形の重量で０％〜１５％を含むことができる。
【００６２】
本明細書で言及した剤形は、幾つかの層からなる剤形、例えば積層錠剤または多層錠剤として提供できる。これらは、開放形または閉鎖形であってよい。「閉鎖形剤形」は、１つの層が少なくとも１つの他の層によって完全に取り囲まれている剤形である。多層形は、相互に不適合性である２つの有効成分を加工処理できる、または上記有効成分の放出特性を制御できるという利点を有する。例えば、外層の１つに有効成分を含めることによって初期用量を、そして内層に有効成分を含めることによって維持用量を提供することが可能である。多層錠剤のタイプは、顆粒の２つ以上の層を圧縮する工程によって製造することができる。
【００６３】
さらに、錠剤上のフィルムコートが、錠剤を嚥下できる容易さに寄与することができる。フィルムコートは、風味をさらに改善し、優美な外観を提供する。所望であれば、フィルムコートは腸溶コートであってよい。フィルムコートは、通常はポリマーフィルム形成材料、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびアクリレートもしくはメタクリレートコポリマーを含む。フィルム形成ポリマーの他に、フィルムコートは、可塑剤、例えばポリエチレングリコール、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）タイプ、および任意で色素、例えば二酸化チタンもしくは酸化鉄類を含むことができる。フィルムコーティングは、さらにまた抗接着剤としてタルクも含むことができる。フィルムコートは、通常は剤形の重量の５重量％を占める。
【００６４】
本明細書で言及した組成物を調製する他の特定の形態には、トコトリエノール類の天然油液、例えばソフトゲルを製造するために使用できるヤシ油、ソフトドリンクを製造するために使用できる水溶性エマルジョン液形、軟質カプセルおよび錠剤を製造するために使用できる冷水分散性粉末、または硬質カプセルを製造するために使用できるビーズレット（ｂｅａｄｌｅｔｓ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
水溶性エマルジョン液の形態にある本明細書で言及した組成物を製造するためには、出発材料としてトコトリエノール液が使用され、これにグリセリンおよび乳化剤のブレンドが加えられる。その後、混合物がエマルジョンに均質化される。
【００６６】
水溶性エマルジョン液を調製するために使用できる乳化剤の例には、グリセリン脂肪酸エステル類、モノグリセリドの酢酸エステル類、モノグリセリドの乳酸エステル類、モノグリセリドのクエン酸エステル類、モノグリセリドのコハク酸エステル類、モノグリセリドのジアセチル酒石酸エステル類、脂肪酸のポリグリセロールエステル類、ポリリシノール酸ポリグリセロール、脂肪酸のソルビタンエステル類、脂肪酸のプロピレングリコールエステル類、デンプン誘導体、界面活性剤、脂肪酸のスクロースエステル類、二乳酸のカルシウムステアロイル、レシチン、または酵素消化レシチン／酵素処理レシチンが含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
本明細書で言及した組成物の冷水分散性粉末は、出発材料としてトコトリエノール油液を用意することによって製造できる。例えば、加工コーンスターチ、マルトデキストリン、シクロデキストリン類もしくはコーンスターチなどの乳化剤がトコトリエノール油に加えられる。この混合物は、その後乾燥粉末にスプレー乾燥することができる。
【００６８】
本明細書で言及した組成物のビーズレットは、出発材料としてトコトリエノール油液を用意することによって入手できる。その後に、１つの実施形態では、ゼラチン、コーンスターチ、スクロースおよびパルミチン酸アスコルビルがトコトリエノール油に加えられる。この混合物は、乾燥ビーズレットにスプレー乾燥させられる。
【００６９】
注射用調製物は、正確に計算された用量の皮下、筋肉内もしくは腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を介して上記の組成物の動物体の循環系内への導入および送達を可能にする。プロピレングリコールは、そのような調製物のために一般に使用される溶媒である。また別の実施形態では、本組成物は、油中水型調製物で調製される。
【００７０】
そこで１つの実施形態では、本明細書で言及した組成物は、錠剤、ビーズレット、または（ソフト）ゲル、または糖衣錠、または徐放性調製物、または軟膏、または注射用調製物としての形態、またはカプセル化形で投与される。カプセル化形は、例えば、リン脂質中に封入された組成物を含むことができる。
【００７１】
さらにまた別の態様では、本発明は、本明細書で言及した組成物または調製物のいずれかを製造する方法に関する。そのような組成物を調製するあらゆる公知の方法を使用できる。そこで、１つの実施形態では、そのような組成物を製造する方法は、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−３−フェニルイソセリン，Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，１３−エステル（ドセタキセル）および／または（５Ｚ）−５−（ジメチルアミノヒドラジニリデン）イミダゾール−４−カルボキサミド（ダカルバジン）と混合する工程を含んでいる。
【００７２】
本明細書で例示的に記載した本発明は、本明細書には特別に開示していない任意の要素、制限の非存在下で適切に実施することができる。そこで例えば、用語「〜を含む」、「〜を包含する」、「〜を含有する」などは、拡張的に、かつ限定なしに読み取られるべきである。さらに、本明細書で使用した用語および表現は説明のために使用されたものであって限定のために使用されたのではないこと、そしてそのような用語および表現の使用においては本明細書に示した特徴およびその部分のあらゆる等価物を排除することは意図しておらず、本明細書で主張する本発明の範囲内で様々な修飾が可能であると理解されたい。そこで、本発明は好ましい実施形態および任意の特徴によって詳細に開示してきたが、本明細書に開示した本発明の修飾および変更は当業者であれば使用できること、そしてそのような修飾および変更は本発明の範囲内に含まれると考察されると理解すべきである。
【００７３】
本明細書では、本発明について広汎かつ一般的に記載してきた。一般的開示に含まれるより狭い種および亜属の分類もまた本発明の一部を形成している。これは、切除された材料が特別に本明細書で言及されているかどうかとは無関係に、属から任意の主題物質を除くという条件もしくは消極的な限定を備える本発明の一般的説明を含んでいる。
【００７４】
その他の実施形態は、下記の特許請求項および非限定的な実施例に含まれる。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ（Ｍａｒｋｕｓｈ）群によって記載される場合は、当業者は、本発明がさらにまたマーカッシュ群の任意の個別要素またはマーカッシュ群の部分群の要素に関して記載されていることを理解するであろう。
【実施例】
【００７５】
１．下記の実験では、黒色腫細胞系を使用して様々なトコフェロールおよびトコトリエノール異性体の抗増殖性作用を比較した。全８種のビタミンＥ異性体が、悪性皮膚癌細胞の増殖を阻害できることが見いだされた。効力は各異性体間で変動し、γ−Ｔ３の効力が最も高かった。γ−Ｔ３の作用に関する詳細な試験は、２つの黒色腫細胞系のγ−Ｔ３処理がアポトーシスの誘導を生じさせることを明らかにしたが、これは例えばＩｄ−１またはＥＧＦＲなどの生存促進因子のダウンレギュレーションと関連していた。これと同時に、ＪＮＫの活性化およびＮＦ−κＢの不活性化もまたこの処理後に観察された。特異的阻害剤であるＳＰ６００１２５によるＪＮＫ活性の阻害は、γ−Ｔ３処理に対する感受性を部分的に遮断し、これはγ−Ｔ３誘導性アポトーシスがＪＮＫシグナリング経路を通して媒介されることを指示している。さらに、γ−Ｔ３処理はさらにまたＥ−カドヘリン、γ−カテニンの発現も回復させ、黒色腫細胞内の間葉マーカーの発現を抑制し、細胞侵襲の阻害を生じさせた。興味深いことに、ドセタキセルもしくはダカルバジン誘導性アポトーシスは、γ−Ｔ３の存在下では有意に増強されることが見いだされ、これはトコトリエノール異性体、例えばγ−Ｔ３と化学療法薬（ドセタキセルおよびダカルバジン）との間の黒色腫細胞に対する相乗作用を証明している。以前の報告書および本発明者らの半数致死量（ＬＤ_５０）試験（データは示していない）は、トコトリエノール抽出物を用いた処理後の毒性を示しておらず（ＬＤ_５０≧２，０００ｍｇ／ｋｇ）、この試験からの結果は、Ｔ３異性体を単独、または悪性黒色腫を治療するための他の化合療法薬と併用してのいずれかで安全かつ効果的な抗癌薬として使用できることを提案している。
【００７６】
１．１．材料および実験条件
【００７７】
１．１．１ 黒色腫細胞系、細胞培養条件および化学薬品−メラニン欠乏性黒色腫（Ｃ３２）、悪性黒色腫（Ｇ３６１）細胞（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル）は、３７℃の５％ＣＯ_２中で、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシンが補給されたＡＴＣＣが推奨する各培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）中で維持した。ドセタキセル、ダカルバジン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）およびＪＮＫ阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させた。処理溶液は、所望の濃度を得るために培養培地中で希釈した。
【００７８】
１．１．２ トコトリエノールおよびトコフェロール異性体は、ヤシ油から抽出し、Ｄａｖｏｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社（シンガポール国）の分離技術を使用して精製した。粗ヤシ油（ＣＰＯ）供給材料は、Ｋｕａｌａ Ｌｕｍｐｕｒ Ｋｅｐｏｎｇ Ｂｅｒｈａｄ社から購入した。参照標準物質として対応するトコトリエノール異性体を使用して、Ｔ３およびＴ異性体の純度は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）パーセンテージ面積（％面積）によって≧９７％であると検証された。
【００７９】
１．１．３ 細胞生存性試験および時間経過実験−細胞生存性試験のために、１００μＬの培地中に再懸濁させた１×１０^４個の細胞を９６ウエルプレートの各ウエル内でプレーティングした。細胞は次に様々な濃度のビタミンＥ異性体を用いて２４時間にわたり処理した。処理後、２０μＬの３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）溶液を各ウエルに加え、細胞を３７℃で２時間にわたり培養した。次にホルマザン結晶を２００μＬのＤＭＳＯ中に再懸濁させ、５９５ｎｍでの吸光度を測定した。ＪＮＫ阻害剤試験のためには、細胞にビタミンＥ異性体を添加する前に８時間にわたり２０μＭのＳＰ６００１２５で前処理した。時間経過試験のためには、５×１０^３個の細胞を様々な濃度のビタミンＥ異性体で処理し、指示した時点でＭＴＴ細胞増殖アッセイにかけた。異性体についてのＩＣ_５０が＞１００μＭである場合は、処理用量として１００μＭが使用される。各実験は３つのウエル内で３回繰返し、増殖曲線は平均値および標準偏差を示した。
【００８０】
γ−Ｔ３がドセタキセルおよびダカルバジンの細胞毒性に及ぼす作用を試験するために、細胞をγ−Ｔ３とドセタキセルまたはダカルバジンとで共培養した。２４時間後、細胞をウエスタンブロッティングおよびＭＴＴ細胞増殖アッセイにかけた。
【００８１】
１．１．３ フローサイトメトリー−細胞周期分布は、フローサイトメトリーを使用して試験した。手短には、細胞をトリプシン処理によって採取し、４℃の７０％エタノール中で一晩かけて固定し、次にＰＢＳ中に再懸濁させた。一晩にわたり４℃で培養した後、２×１０^６個の細胞を３７℃で１５分間にわたり２０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）および２ｍｇのＲＮａｓｅＡとともに培養した。細胞は次にＢＤ ＳＬＲＩＩ血球計数器によって試験し、結果は、ＭｏｄＦｉｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いて分析した。データは、全集団における細胞周期分布のパーセンテージとして表示した。
【００８２】
１．１．４ マトリゲル侵襲アッセイ−マトリゲル侵襲アッセイは、修飾を加えて以前に公表された方法にしたがって実施した。手短には、細胞は２４時間にわたりγ−Ｔ３異性体を加えて、または加えずに無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中で前培養した。次に０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する５００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁させた細胞（２．５×１０^５）をＭａｔｒｉｇｅｌ（０．５ｍｇ／ｍＬ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、メリーランド州ベッドフォード）が手作業でコーティングされた孔径８μｍのインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、メリーランド州ベッドフォード）の上方のチャンバに加えた。下方のチャンバには、１０％ＦＣＳが補給されたフィブロネクチン（１０μｇ／ｍＬ）およびＲＰＭＩ１６４０を含有する５００μＬの侵襲緩衝液を化学誘引物質として加えた。細胞は、５％ＣＯ_２加湿条件下で２４時間にわたり３７℃で培養した。培養期間の終了時に、インサートはＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ染色溶液（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて染色した。インサートの内部上の非侵襲細胞は消毒綿でこすり落とした。細胞侵襲を次に、位相差顕微鏡によって試験した。侵襲性細胞は、抽出用緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、メリーランド州ベッドフォード）を用いて抽出し、細胞数は５９５ｎｍでの吸光度に基づいて推定した。
【００８３】
１．１．５ ウエスタンブロッティング−詳細なプロトコルは以前に記載されており、当技術分野において公知である。手短には、細胞溶解液は、溶解緩衝液［５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１％ ＮＰ４０、０．５％デオキシコレート、０．１％ ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍＬのアプロチニン、１μｇ／ｍＬのロイペプチンおよび１ｍｍｏｌ／Ｌのフッ化フェニルメチルスルホニル］中に細胞ペレットを懸濁させることによって調製した。核タンパク質抽出のためには、ＮｕｃＢｕｓｔｅｒ（商標）タンパク質抽出キットを使用した。タンパク質濃度は、ＤＣタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて測定した。等量のタンパク質（３０μｇ）を電気泳動法のために１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に装填し、次に二フッ化ポリビニリデン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）上に移した。次に膜を室温で１時間にわたりＥ−カドヘリン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、メリーランド州ベッドフォード）、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニン、Ｉｄ−１、Ｉｄ−３、ＥＧＦＲ、ホスホロ−ｃ−ｊｕｎ、ホスホロ−ＡＴＦ２、切断ＰＡＲＰ、ビメンチン、α−ｓ平滑筋アクチン、Ｔｗｉｓｔ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カリフォルニア州）、ホスホロ−ＩκＢ−α（Ｓｅｒ３２／３６）、ホスホロ−ＩＫＫα（Ｓｅｒ１８０）／ＩＫＫベータ（Ｓｅｒ１８１）、ホスホロ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）Ｇ９、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、ＮＦ−κＢ ｐ６５（５Ａ５）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、メリーランド州ベバリー）、Ｓｎａｉｌ（Ａｂｅａｍ社）に対する一次抗体とともに培養した。適切な二次抗体との培養後に、ＥＣＬウエスタンブロッティングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）によってシグナルを視認した。β−アクチンおよびヒストンＨ１の発現を全細胞溶解液および核タンパク質溶解液各々のための内部装填コントロールとして評価した。
【００８４】
１．２．結果−ビタミンＥ異性体の抗増殖性作用
【００８５】
黒色腫細胞は、用量を増加させながら（０、２０、４０および６０μＭ）様々な時点にビタミンＥ異性体を用いて処理した。この結果は、ビタミンＥ異性体が皮膚癌細胞（Ｇ３６１およびＣ３２）の増殖を有意に抑制することを証明した（図２１Ａ）。細胞増殖の阻害は、用量依存性阻害を示したＴ３異性体、特別にはγ−Ｔ３についてより有意に強力であった（図２１Ｂ）。Ｇ３６１細胞において５０％増殖阻害（ＩＣ_５０）を誘発した濃度に基づくと、阻害作用の順序は、γ−Ｔ３＞δ−Ｔ３＞β−Ｔ３＞α−Ｔ３（＝）α−Ｔ（＝）β−Ｔ（＝）γ−Ｔ（＝）δ−Ｔであった。
【００８６】
γ−Ｔ３誘導性増殖阻害の原因となるメカニズムを試験するために、γ−Ｔ３処理を行った、または行わない細胞の細胞周期分布をフローサイトメトリーによって分析した。その結果、γ−Ｔ３を用いた細胞の処理は下位−Ｇ１細胞集団の誘導を生じさせ、これは処理後のアポトーシス細胞の存在を示していた（図２２Ａ）。フローサイトメトリーの結果と一致して、プロカスパーゼ３、７、９ならびにＰＡＲＰの活性化は、切断産物の外観によって証明されたように、様々なγ−Ｔ３用量で処理されたＣ３２細胞において観察された（図２２Ｂ）。その一方で、アポトーシス促進タンパク質のγ−Ｔ３媒介性活性化は、γ−Ｔ３処理が細胞増殖の阻害に及ぼす作用と一致して、用量依存性であった。
【００８７】
γ−Ｔ３は、生存促進性シグナリング経路をダウンレギュレートする−ＮＦ−κＢはＣ３２中では構成的に活性化されると報告されたので、γ−Ｔ３がＮＦ−κＢ活性化の抑制に帰せられる細胞アポトーシスを誘導した可能性があると考えられた。様々な用量のγ−Ｔ３を用いて処理されたＣ３２のＮＦ−κＢ活性は、ＮＦ−κＢサブユニットｐ６５の転座を試験することによって測定した。図２３Ａに例示したように、γ−Ｔ３処理は用量依存性で構成的ＮＦ−κＢ ｐ６５活性を抑制した。γ−Ｔ３がＮＦ−κＢシグナリングに及ぼす作用は、例えばホスホロ−ＩκＢα／β、ＩκＢα／β、ホスホロ−ＩＫＫα／βおよびホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）などの他の上流調節因子の発現を試験することによってさらに探索した。ＮＦ−κＢの核への転座は、ＩＫＫα／βによるリン酸化を通して分解されるＩκＢα／βタンパク質によって阻害される。ＩＫＫα／βは順に、ＰＩ３Ｋによってリン酸化および活性化される。γ−Ｔ３処理Ｃ３２細胞内では、リン酸化ＩκＢα／βのレベルにおける用量依存性減少が観察された（図２３Ａ）。これは、リン酸化されたＩＫＫα／β、ＩκＢα／βのレベルの低下ならびにＰＩ３Ｋ ｐ８５およびＮＦ−κＢ ｐ６５核転座の阻害と関連している。これらの結果は、γ−Ｔ３がＩκＢα／βの脱リン酸化および蓄積を通してＮＦ−κＢ活性を抑制したことを示している。
【００８８】
γ−Ｔ３処理は皮膚癌の発生および進行に関与する多数の重要なタンパク質もまたダウンレギュレートすることが見いだされた。図２３Ｂに示したように、Ｉｄ−１およびＩｄ−３発現レベルは、γ−Ｔ３の用量を増加させる処理によってほぼ検出不能なレベルへ有意に抑制された。ＥＧＦ−Ｒタンパク質レベルへの類似の作用もまた観察された。ＥＧＦ−ＲおよびＩｄタンパク質ファミリーは癌細胞の増殖および生存にとって必須であるので、それらのダウンレギュレーションはγ−Ｔ３誘導性増殖停止およびアポトーシスと関連する可能性がある。
【００８９】
γ−Ｔ３処理によるアポトーシス促進性経路の活性化−ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、ストレスおよび遺伝毒性物質によって活性化される進化的に保存されたセリン／トレオニンプロテインキナーゼである。ＪＮＫは、全３つのＪｕｎ転写因子およびＡＰ−１ファミリーのＡＴＦ−２メンバーのアミノ末端基をリン酸化する。活性化された転写因子は遺伝子発現を変調させて、細胞移動および細胞死を含む適切な生物学的応答を生成する。Ｃ３２細胞が様々な用量のγ−Ｔ３で処理されると、ＪＮＫリン酸化活性における用量依存性上昇が検出された（図２４Ｂ）。一方、ＡＴＦ−２またはｃ−ｊｕｎなどのＪＮＫ下流エフェクタのリン酸化は、全部がγ−Ｔ３によってアップレギュレートされ、これはＪＮＫシグナリング経路がγ−Ｔ３によって活性化されたことを支持していた。
【００９０】
黒色腫細胞におけるγ−Ｔ３誘導性アポトーシスにおけるＪＮＫ活性化の重要性をさらに確認するために、特異的阻害剤であるＳＰ６００１２５を用いたＪＮＫの不活性化が細胞をγ−Ｔ３から保護できるかどうかについて調査した。図２４Ａに示したように、γ−Ｔ３と２０μＭのＳＰ６００１２５による併用処理はγ−Ｔ３単独による処理と比較してアポトーシス細胞のパーセンテージを減少させ、これはＪＮＫ活性化がＣ３２におけるγ−Ｔ３誘導性アポトーシスのために必要であることを確証している。
【００９１】
γ−Ｔ３が細胞分割の阻害に及ぼす作用−γ−Ｔ３が多数の癌に抗増殖性作用を有することは証明されているが、それが癌転移に影響を及ぼすかどうかは明白ではない。このため、γ−Ｔ３が皮膚癌細胞の侵襲能力を抑制できるかどうかを試験した。図２５Ｂに示したように、マトリゲル侵襲アッセイを使用すると、γ−Ｔ３処理（ＩＣ_５０およびＩＣ_８５）Ｇ３６１細胞が、マトリゲル層を通して侵襲した細胞数の減少によって証明されたように、未処理コントロールと比較して２倍低い侵襲能力を示すことが見いだされた。細胞侵襲に及ぼすこの阻害作用は、侵襲チャンバ内に加えられた生存細胞の数は同一であったので、γ−Ｔ３によって誘導された細胞増殖阻害の結果ではなかった。これらの結果は、γ−Ｔ３が、それらの細胞毒性作用とは無関係に、黒色腫細胞の侵襲能力を阻害できることを示している。
【００９２】
Ｅ−カドヘリン発現のダウンレギュレーションは、転移性癌について最も頻回に報告された特徴の１つである。癌細胞内でのＥ−カドヘリン発現の回復は、転移能力の抑制を引き起こす。黒色腫では、Ｅ−カドヘリン発現のダウンレギュレーションは、高悪性度腫瘍および不良な予後と相関しており、これはＥ−カドヘリン発現が黒色腫進行において役割を果たすことを示している。興味深いことに、Ｅ−カドヘリンおよびγ−カテニンタンパク質発現はγ−Ｔ３による処理後にアップレギュレートされ、Ｅ−カドヘリンの抑制因子（Ｓｎａｉｌ）はダウンレギュレートされることが見いだされたが（図２５Ａ）、β−カテニンについての発現は全処理用量で一定のままであった。これとは別に、間葉マーカー（ビメンチン、α−ＳＭＡおよびＴｗｉｓｔ）は全部がγ−Ｔ３による処理後にダウンレギュレートされた。これらの結果は、癌細胞侵襲にγ−Ｔ３が及ぼす阻害作用がＥ−カドヘリン、γ−カテニンタンパク質発現の誘導；ならびにＳｎａｉｌ、ビメンチン、α−ＳＭＡおよびＴｗｉｓｔの抑制を通して機能する可能性があることを示唆した。
【００９３】
γ−Ｔ３処理がドセタキセルおよびダカルバジン誘導性アポトーシスに及ぼす作用−γ−Ｔ３が化学療法薬と相乗的に作用できるかどうかを試験するために、γ−Ｔ３単独またはドセタキセルまたはダカルバジンとの併用での作用を試験した。後者の２つは、肺癌、卵巣癌、乳癌、白血病および悪性黒色腫に対して生体外でのおよび生体内での作用を有することが公知である重要なクラスの抗癌剤を表している。図２６Ａに示したように、ドセタキセルまたはダカルバジンとγ−Ｔ３との併用処理後のＣ３２細胞系内での生存細胞のパーセンテージは、γ−Ｔ３またはドセタキセル単独で処理した場合のパーセンテージより有意に低かった。ウエスタンブロッティングを使用すると、γ−Ｔ３とドセタキセルまたはダカルバジンいずれかとの併用処理がアポトーシス促進タンパク質（切断されたＰＡＲＰ、カスパーゼ３、７）の活性化ならびに生存促進タンパク質（Ｉｄ−１、ＥＧＦＲおよびホスホロ−ＩκＢ）のダウンレギュレーションを通して細胞アポトーシスを増強することもまた証明された（図２６Ｂ）。アポトーシス細胞の濃度は、γ−Ｔ（γ−トコフェロール）およびドセタキセルにより併用処理した細胞とは強度に対照的である。これらの結果は、γ−Ｔ３が皮膚癌細胞に対してドセタキセルまたはダカルバジンと相乗的に作用できるが、γ−Ｔは相乗的に作用できないことを示唆した。
【００９４】
１．３．上記の実験は、８つのビタミンＥ異性体の中で、γ−Ｔ３が生存促進（Ｉｄ−１、Ｉｄ−３、ＥＧＦＲおよびＮＦ−κＢ）ならびにアポトーシス促進（カスパーゼ）経路両方の変調を通して黒色腫細胞増殖を阻害することを証明している。一方、γ−Ｔ３が悪性黒色腫細胞侵襲をＥ−カドヘリンおよびγ−カテニン発現の回復によって阻害することが初めて証明された。この阻害作用もまたＴｗｉｓｔ、α−ＳＭＡおよびビメンチンのような間葉マーカーについての発現の抑制と関連していた。γ−Ｔ３はドセタキセルおよびダカルバジンの抗癌作用を増強するという所見と一緒に、これらの実験は、γ−Ｔ３が皮膚癌を治療するための安全かつ効果的な抗癌剤として使用できるという強力な根拠を提供している。
【００９５】
さらに、γ−Ｔ３は、ＩκＢキナーゼ活性化の阻害を通して構成的ＮＦ−κＢ活性を抑制し、黒色腫細胞におけるアポトーシスをもたらすことが証明された。結果として、これはカスパーゼ３、７、９およびＰＡＲＰの活性化によるアポトーシスの誘導を生じさせた。注目すべきであるのは、γ−Ｔ３が以前に上皮成長因子（ＥＧＦ）およびその他の炎症促進サイトカインによって誘導されるＮＦ−κＢ活性化を無効にすることが証明されている点である。これに含まれる分子的メカニズムはその時点には明白ではなかったが、γ−Ｔ３がＮＦ−κＢの抑制における共通工程を通して機能する可能性があると提案された。本明細書で言及した実験結果は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦ−Ｒ）のダウンレギュレーションが皮膚癌におけるγ−Ｔ３誘導性ＮＦ−κＢ不活性化と相関することを明らかにした（図２３Ｂ）。
【００９６】
これによってγ−Ｔ３がＮＦ−κＢ経路にその作用を媒介できると考えられる１つのメカニズムは、Ｉｄ−１の抑制を通してであると考えられた。以前は、Ｉｄ−１を構成的に発現する皮膚メラノサイトは、細胞増殖またはテロメアの長さにおける変化とは関連していない遅延性細胞老化であることが証明された。さらに、上昇したＩｄ−１タンパク質レベルは放射状増殖期黒色腫において一貫して存在することもまた決定され、これは上昇したＩｄ−１タンパク質レベルが黒色腫における発癌現象の開始において役割を果たすことを示唆している。これとは別に他の細胞系では、以前に、前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）における異所性Ｉｄ−１発現はＮＦ−κＢ転写活性化活性ならびにｐ６５およびｐ５０タンパク質の核転座の増加を生じさせ、これにはそれらの下流エフェクタであるＢｃｌ−ｘＬおよびＩＣＡＭ−Ｉのアップレギュレーションが付随することが証明された。さらに、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびレトロウイルス構築体によるホルモン非依存性前立腺癌細胞におけるＩｄ−１の不活性化は、ＴＮＦ誘導性アポトーシスに対する増加した感受性と関連しているｐ６５およびｐ５０タンパク質の核レベルの減少を生じさせた。これらの所見を考察すると、これらの結果は、Ｉｄ遺伝子ファミリーはγ−Ｔ３によって直接的に標的とされるＮＦ−κＢの上流調節因子の１つである可能性があること、そしてＮＦ−κＢシグナリング経路の阻害は黒色腫細胞におけるγ−Ｔ３誘導性抗増殖の原因となる可能性があることを強力に示唆している。
【００９７】
上記の実験では、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）がγ−Ｔ３誘導性アポトーシスに関与することもまた証明された。黒色腫細胞をγ−Ｔ３により処理すると、例えばｃ−ＪｕｎおよびＡＴＦ−２などのＪＮＫ経路に関連する一連の分子（図２４Ａ）が同時に活性化された。一方、ＪＮＫ阻害剤（ＳＰ６００１２５）の処理は黒色腫細胞をγ−Ｔ３誘導性アポトーシスから保護することが証明された（図２４Ａ）。これはさらに、黒色腫細胞におけるγ−Ｔ３誘導性アポトーシスにＪＮＫ経路が関与することを確証している。本明細書で言及した所見は、γ−Ｔ３が化学療法薬への共通エンハンサーとして機能できることを証明している。
【００９８】
本明細書で言及した実験では、Ｅ−カドヘリンおよびγ−カテニン発現の回復は、Ｓｎａｉｌ、α−ＳＭＡ、ビメンチンおよびＴｗｉｓｔの抑制と一緒に、黒色腫細胞侵襲へのγ−Ｔ３の阻害作用の原因となる可能性があることが決定された。本明細書で言及した結果は、悪性黒色腫細胞侵襲を抑制するための潜在的薬剤でもあることを示唆する最初の根拠を提供している。上皮マーカー（Ｅ−カドヘリンおよびγ−カテニン）のダウンレギュレーションならびに間葉マーカー（α−ＳＭＡ、ビメンチンおよびＴｗｉｓｔ）のアップレギュレーションは、転移性癌において最も頻回に報告された現象の一部である。Ｅ−カドヘリン発現の消失は、癌細胞の転移期への進行において重要な役割を果たすこの上皮−間葉転移（ＥＭＴ）を促進することができると示唆されている。癌細胞におけるＥ−カドヘリン不活性化の原因となる正確なメカニズムは不明であるが、その抑制因子であるＳｎａｉｌに起因する転写レベルの変化が数種の癌タイプにおける減少した発現の原因となるメカニズムの１つであると思われる。本明細書で言及した実験では、γ−Ｔ３処理黒色腫細胞は増加したＥ−カドヘリン発現を示し（図２５Ａ）、これは減少したＳｎａｉｌタンパク質発現および侵襲能力と関連している（図２５Ｂ）が見いだされた。細胞質カドヘリン結合タンパク質の１ファミリーであるカテニン類（α，γ）は、Ｅ−カドヘリンをアクチン細胞骨格へ連結させるので、正常Ｅ−カドヘリン機能のために必須であると考えられる。本明細書で言及した実験は、γ−Ｔ３がＥ−カドヘリンおよびγ−カテニンの発現だけをアップレギュレートし、α−カテニンの発現はアップレギュレートしないことを証明している。β−カテニンの発現は一定のままで留まっている。γ−Ｔ３処理Ｇ３６１細胞は上昇した機能的Ｅ−カドヘリン発現にとって重要な分子であるα−カテニン発現を示さないが、γ−Ｔ３は、Ｅ−カドヘリンをベースとする細胞接着複合体の確立において重要な役割を果たすと報告されているビンキュリンなどの他の分子を通してＥ−カドヘリンの機能を回復させることができる。これらをまとめると、実験結果は、γ−Ｔ３が間葉−上皮転移（ＭＥＴ）の誘導を通して癌転移を抑制できることを示唆している。
【００９９】
図２６Ｃに要約したように、これらの結果は、γ−Ｔ３が多数の分子経路を通して作用する黒色腫細胞増殖および侵襲の強力な阻害剤であることを証明した。天然Ｔ３抽出物の長期間摂取後に副作用を観察することはできなかったので（ＬＤ_５０≧２，０００ｍｇ／ｋｇ、データは示していない）、γ−Ｔ３は、Ｉｄ１関連性悪性黒色腫を治療するために単独で、または化学療法と併用して使用することができる。
【０１００】
２．以下の実験では、前立腺癌細胞を用いて様々なトコフェロールおよびトコトリエノール異性体が及ぼす抗増殖性作用を比較し、それらの活性にとって原因となる分子経路について試験した。γ−トコトリエノールの阻害作用は最も強力であり、プロカスパーゼ類の活性化および下位−Ｇ１細胞集団の存在によって証明されるようにアポトーシスの誘導を生じさせた。生存促進遺伝子についての試験は、γ−トコトリエノール誘導性細胞死にはＮＦ−κＢ、ＥＧＦ−ＲおよびＩｄファミリータンパク質（Ｉｄ１およびＩｄ３）の抑制が関連していることを明らかにした。一方、γ−トコトリエノール処理もまたＪＮＫシグナリング経路の誘導を生じさせ、特異的阻害剤（ＳＰ６００１２５）によるＪＮＫ活性の阻害はγ−トコトリエノールの作用を部分的に遮断することができた。γ−トコトリエノール処理は間葉マーカーの抑制ならびにＥ−カドヘリンおよびγ−カテニン発現の回復をもたらしたが、これは細胞侵襲能力の抑制と関連していた。さらに、細胞がγ−トコトリエノールおよび例えばドセタキセルなどの化学療法薬を用いて併用処理された場合には相乗作用が観察された。これらの結果は、γ−トコトリエノールの抗増殖性作用が複数のシグナリング経路を通して作用することを示唆しており、ＰＣａ細胞に対するγ−トコトリエノールの抗侵襲および化学増感作用を証明した。
【０１０１】
２．１．材料および実験条件
【０１０２】
２．１．１ 前立腺癌細胞系、細胞培養条件および化学薬品−ヒトアンドロゲン依存性ＰＣａ細胞（ＬＮＣａＰ）、ヒトアンドロゲン非依存性ＰＣａ細胞（ＰＣ−３）（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル）は、３７℃の５％ＣＯ_２中で、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および２％ペニシリン−ストレプトマイシンが補給されたＡＴＣＣが推奨する各培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）中で維持した。ヒト不死化前立腺上皮細胞（ＰＺ−ＨＰＶ−７）（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル）は、ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）およびヒト組換え上皮成長因子（ＥＧＦ、５ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ）が補給されたケラチン生成細胞無血清培地（Ｋ−ＳＦＭ）中で維持した。ドセタキセル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）およびＪＮＫ阻害剤のＳＰ６００１２５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させた。処理溶液は、所望の濃度を得るために培養培地に希釈した。
【０１０３】
２．１．２ 以下の実験のためには、１．１．２の下で上述した同一のトコトリエノールおよびトコフェロール異性体を使用した。
【０１０４】
２．１．３ 細胞生存性試験および時間経過実験−細胞生存性試験のために、１００μＬの培地中に再懸濁させた５×１０^３個の細胞を９６ウエルプレートの各ウエル内でプレーティングした。細胞は次に様々な濃度（２０、４０、６０、８０、１００μＭ）のビタミンＥ異性体を用いて２４および４８時間にわたって処理した。処理後、２０μＬのＭＴＴ溶液を各ウエル内に加え、細胞を３７℃で２時間にわたり培養した。次にホルマザン結晶を２００μＬのＤＭＳＯ中に再懸濁させ、５９５ｎｍでの吸光度を測定した。ＪＮＫ阻害剤試験のためには、細胞にビタミンＥ異性体を添加する前に８時間にわたり２０μＭのＳＰ６００１２５で前処理した。時間経過試験のためには、５×１０^３個の細胞（ＬＮＣａＰおよびＰＣ３）をＩＣ_５０濃度のビタミンＥ異性体で処理し、指示した時点でＭＴＴ細胞増殖アッセイにかけた。異性体についてのＩＣ_５０が＞１００μＭである場合は、処理用量として１００μＭが使用される。各実験は３つのウエル内で３回繰返し、増殖曲線は平均値および標準偏差を示した。
【０１０５】
γ−Ｔ３がドセタキセルの細胞毒性に及ぼす作用を試験するために、細胞をγ−Ｔ３とともに３時間にわたり前培養し、その後に２０および１００ｎＭのドセタキセルを添加した。２４時間後、細胞を各々ウエスタンブロッティングおよびＭＴＴアッセイにかけた。
【０１０６】
２．１．４ フローサイトメトリーは、項目１．１．３の下で上述したように実施したマトリゲル侵襲アッセイは、項目１．１．４の下で上述したように実施した。ウエスタンブロッティングは、項目１．１．５の下で上述したように実施した。
【０１０７】
２．２ 結果−ビタミンＥ異性体の抗増殖性作用
【０１０８】
ＰＣａ細胞は用量を上昇させながら（低：２０μＭ、中：４０μＭおよび高：８０μＭ）、そして様々な時点にビタミンＥ異性体を用いて２４および４８時間にわたり処理した。これらの結果は、ビタミンＥ異性体が正常前立腺上皮細胞（ＰＺ−ＨＰＶ−７）の増殖率には有意な影響を及ぼさないが、ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３の増殖を有意に抑制することを証明した（図９Ａ）。ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３における半数細胞増殖率（ＩＣ_５０）を阻害する用量は、培養時間の長さと反比例していた。驚くべきことに、ＰＣ−３細胞はＬＮＣａＰ細胞よりもビタミンＥ異性体の増殖阻害に高感受性であった。細胞増殖の阻害は、用量および時間依存性阻害を示したＰＣ−３中のＴ３異性体、特別にはγ−Ｔ３についてより有意に強力であった（図９Ｂ）。δ−Ｔ３はＬＮＣａＰにおける細胞増殖を抑制することにより強力であったが（図９Ａ）、ＩＣ_５０値はＰＣ−３中のγ−Ｔ３についての数値より有意に高かった。これとは別に、γ−Ｔはさらにまたγ−Ｔ３に類似する用量でＬＮＣａＰ細胞におけるアポトーシスを誘導することも見いだされた（データは示していない）。２４時間にわたり様々な異性体とともに培養されたＰＣ−３細胞におけるＩＣ_５０値に基づくと、阻害作用の順序は、γ−Ｔ３＞δ−Ｔ３＞β−Ｔ３＞γ−Ｔ＞δ−Ｔ（＝）α−Ｔ３（＝）α−Ｔ（＝）β−Ｔであった。その後の実験については、ＰＣ−３（γ−Ｔ３）にとって最も強力な異性体を調査したが、それはそれらが一般にＬＮＣａＰ細胞と比較して化学療法薬に対してより侵襲性および耐性であると考えられるからである。
【０１０９】
γ−Ｔ３−誘導性増殖阻害の原因となるメカニズムを試験するために、２４時間にわたるγ−Ｔ３処理を行った、または行わない細胞の細胞周期分布をフローサイトメトリーによって分析した。その結果、γ−Ｔ３（ＩＣ_{５０−９５}）を用いた細胞の処理は下位−Ｇ１細胞集団の誘導を生じさせ、これは処理後のアポトーシス細胞の存在を示していた（図１０Ａ）。アポトーシス細胞（下位−Ｇ１分画）の比率は用量依存性で増加した。注目に値することに、γ−Ｔ３は以前に一部の細胞系においてＧ１停止を誘導すると報告されたが、γ−Ｔ３を用いて処理された前立腺癌細胞におけるＧ１集団の有意な増加は観察されなかった。フローサイトメトリーにおける下位−Ｇ１細胞集団の誘導と一致して、プロカスパーゼ３、７、８、９ならびにＰＡＲＰの活性化は、切断産物の外観によって証明されたように、様々なγ−Ｔ３用量で２４時間にわたり処理されたＰＣ−３細胞において観察された。Ｂｃｌ−２のダウンレギュレーションもまた処理後に検出されたが、Ｂａｘの発現は影響を受けず、これはＰＣ−３細胞におけるｐ５３発現の欠如に起因する可能性が高い（図１０Ｂ）。一方、アポトーシス促進タンパク質のこれらのγ−Ｔ３−媒介性活性化ならびにＢｃｌ−２／Ｂａｘ比の変化は用量および時間依存性であり（図１０Ｂ）、γ−Ｔ３処理が細胞増殖の阻害に及ぼす作用と一致していた。さらに、ＩＣ_５０のγ−Ｔ３処理後のこれらのアポトーシス促進遺伝子の活性化（図１０Ｃ）はＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞においてのみ観察され、ＰＺ−ＨＰＶ−７では観察されなかったので、これはγ−Ｔ３がアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞のアポトーシスを特異的に誘導することを示した。
【０１１０】
γ−Ｔ３は、生存促進性シグナリング経路をダウンレギュレートする−ＮＦ−κＢはＰＣ−３中では構成的に活性化することは公知であるので、γ−Ｔ３がＮＦ−κＢ活性化の抑制に帰せられる細胞アポトーシスを誘導した可能性があると考えられた。様々な期間にわたって様々な用量またはＩＣ_５０でのγ−Ｔ３を用いて処理されたＰＣ−３のＮＦ−κＢ活性は、ＮＦ−κＢサブユニットｐ６５の転座を試験することによって測定した。図１１Ａに例示したように、γ−Ｔ３処理は用量依存性および時間依存性で構成的ＮＦ−κＢ ｐ６５活性を抑制した。γ−Ｔ３がＮＦ−κＢシグナリングに及ぼす作用は、例えばホスホロ−ＩκＢα／βおよびＩκＢα／βなどの他の上流調節因子の発現を試験することによってさらに探索した。γ−Ｔ３処理ＰＣ−３細胞内では、リン酸化ＩκＢα／βのレベルにおける用量依存性減少が観察された（図１１Ａ）。これは、ＩκＢα／β（一部の図ではＩκＢａ／ｂと表示した）のレベル上昇ならびにＮＦ−κＢ ｐ６５核転座の阻害と結び付いている。これらの結果は、γ−Ｔ３がＩκＢα／βの脱リン酸化および蓄積を通してＮＦ−κＢ活性を抑制したことを示している。
【０１１１】
γ−Ｔ３処理は前立腺癌の発生および進行に関与する多数の重要なタンパク質もまたダウンレギュレートすることが見いだされた。図１１Ｂに示したように、ＥＧＦ−Ｒ発現レベルは、γ−Ｔ３の用量を増加させる処理によってほぼ検出不能なレベルへ有意に抑制された。Ｉｄ−１およびＩｄ−３タンパク質レベルへの類似の作用が観察された。ＥＧＦ−ＲおよびＩｄタンパク質ファミリーは癌細胞増殖および生存にとって必須であるので、それらのダウンレギュレーションはγ−Ｔ３誘導性増殖停止およびアポトーシスと関連する可能性がある。
【０１１２】
既に言及したような、γ−Ｔ３処理によるアポトーシス促進性経路の活性化−ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−末端キナーゼは、ストレスおよび遺伝毒性物質によって活性化される進化的に保存されたセリン／トレオニンプロテインキナーゼである。ＪＮＫは、全３つのＪｕｎ転写因子およびＡＰ−１ファミリーのＡＴＦ−２メンバーのアミノ末端基をリン酸化する。活性化された転写因子は遺伝子発現を変調させて、細胞移動および細胞死を含む適切な生物学的応答を生成する。ＰＣ−３細胞を様々な用量のγ−Ｔ３で処理すると、ＪＮＫリン酸化活性における用量および時間依存性上昇が検出された（図１２Ｂ）。一方、ＡＴＦ−２またはｃ−ｊｕｎなどのＪＮＫ下流エフェクタのリン酸化は、全部がγ−Ｔ３によってアップレギュレートされ、これはＪＮＫシグナリング経路がγ−Ｔ３によって活性化されたことを裏付けていた。
【０１１３】
皮膚癌細胞系について上述したように、ＰＣａ細胞におけるγ−Ｔ３誘導性アポトーシスにおけるＪＮＫ活性化の重要性をさらに確認するために、特異的阻害剤であるＳＰ６００１２５を用いたＪＮＫの不活性化が細胞をγ−Ｔ３から保護できるかどうかについて調査した。図１２Ａに示したように、同一細胞系においてＪＮＫ活性を阻害すると以前に決定された用量である２０μＭのＳＰ６００１２５と一緒のγ−Ｔ３による併用処理は、γ−Ｔ３単独による処理と比較してアポトーシス細胞のパーセンテージを減少させたので、これはＪＮＫ活性化がγ−Ｔ３誘導性アポトーシスのために必要であることを確証している。
【０１１４】
γ−Ｔ３が細胞分割の阻害に及ぼす作用−γ−Ｔ３が多数の癌に抗増殖性作用を有することは証明されているが、それが癌転移に影響を及ぼすかどうかは明白ではない。このため、γ−Ｔ３が前立腺癌細胞の侵襲能力を抑制できるかどうかを試験した。図１３Ｂに示したように、マトリゲル侵襲アッセイを使用すると、２４時間にわたってγ−Ｔ３処理（ＩＣ_５０）されたＰＣ−３細胞が、マトリゲル層を通して侵襲した細胞数の減少によって証明されたように、未処理コントロールと比較して２．５倍低い侵襲能力を示すことが見いだされた。細胞侵襲に及ぼすこの阻害作用は、侵襲チャンバ内に加えられた生存細胞の数は同一であったので、γ−Ｔ３によって誘導された細胞増殖阻害の結果ではなかった。これらの結果は、γ−Ｔ３が、それらの細胞毒性作用とは無関係に、ＰＣａ細胞の侵襲能力を阻害できることを示している。
【０１１５】
Ｅ−カドヘリン発現のダウンレギュレーションは、転移性癌について最も頻回に報告された特徴の１つである。癌細胞内でのＥ−カドヘリン発現の回復は、転移能力の抑制を引き起こす。ＰＣａでは、Ｅ−カドヘリン発現のダウンレギュレーションは、高悪性度腫瘍および不良な予後と相関しており、これはＥ−カドヘリン発現がＰＣａ進行において役割を果たすことを示している。興味深いことに、Ｅ−カドヘリンおよびγ−カテニンタンパク質発現はγ−Ｔ３による処理後にアップレギュレートされ、Ｅ−カドヘリンの抑制因子（Ｓｎａｉｌ）はダウンレギュレートされたが（図１３Ａ）、β−カテニンについての発現は全処理用量および時点で一定のままであった。ＰＣ−３細胞内でのα−カテニンの欠失のおかげで、発現は検出されなかった。これとは別に、間葉マーカー（ビメンチン、α−ＳＭＡおよびＴｗｉｓｔ）は全部がγ−Ｔ３による２４時間にわたる処理後にダウンレギュレートされた。
【０１１６】
γ−Ｔ３処理がドセタキセル誘導性アポトーシスに及ぼす作用−γ−Ｔ３が化学療法薬と相乗的に作用できるかどうかを試験するために、γ−Ｔ３単独またはドセタキセルなどの抗癌剤との併用での作用を試験した。図１４Ａに示したように、ドセタキセルとγ−Ｔ３との併用処理後のＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞系内でのアポトーシス細胞のパーセンテージは、γ−Ｔ３またはドセタキセル単独で処理した場合のパーセンテージより有意に高かった。ウエスタンブロッティングを使用すると、γ−Ｔ３とドセタキセルとの併用処理がアポトーシス促進タンパク質（切断されたＰＡＲＰ、カスパーゼ３、７、８、９）の活性化ならびに生存促進タンパク質（Ｉｄ−１、ＥＧＦＲ、ＩκＢおよびＮＦ−κＢ ｐ６５））のダウンレギュレーションを通して細胞アポトーシスを増強することもまた証明された（図１４Ｂ）。アポトーシス細胞の濃度は、ドセタキセルとのγ−Ｔ併用処理とは全く対照的である。これらの結果は、γ−Ｔ３およびドセタキセルが前立腺癌細胞に対して相乗作用を及ぼすことを証明している。
【０１１７】
本明細書で言及した実験は、γ−Ｔ３がＥ−カドヘリン、γ−カテニン発現の回復および間葉マーカーの抑制によって細胞侵襲を阻害することを初めて証明した。γ−Ｔ３はドセタキセルの抗癌作用を増強するという所見と一緒に、これらの実験は、γ−Ｔ３が前立腺癌を治療するための安全かつ効果的な抗癌剤として開発できるという強力な根拠を提供している。これらの結果は、γ−およびδ−Ｔ３が異なる細胞タイプ特異性および効力を備える腫瘍抑制能力を有することを示唆している。
【０１１８】
本明細書で言及した実験では、γ−Ｔ３が、ＩκＢキナーゼ活性化の阻害を通して構成的ＮＦ−κＢ活性を抑制し、ＰＣａ細胞におけるアポトーシスをもたらすことが証明された。さらに、γ−Ｔ３誘導性ＮＦ−κＢ不活性化が用量依存性および時間依存性でＢｃｌ−２のレベルもダウンレギュレートすることも証明された。結果として、これはカスパーゼ３、７、８、９およびＰＡＲＰの活性化によるアポトーシスを誘導した。Ｐ５３状態において異なる様々な細胞系を用いて得られた以前の実験結果と一致して、実験結果は、ｐ５３がγ−Ｔ３誘導性アポトーシスに必要とされないことを示しており、これはｐ５３−ヌル細胞系（ＰＣ−３およびＨＬ−６０）がγ−Ｔ３処理に対して依然として応答性であるためである。注目すべきであるのは、γ−Ｔ３が以前に上皮成長因子（ＥＧＦ）およびその他の炎症促進サイトカインによって誘導されるＮＦ−κＢ活性化を無効にすることが証明されている点である。これに含まれる分子的メカニズムはその時点には明白ではなかったが、γ−Ｔ３がＮＦ−κＢの抑制における共通工程を通して機能する可能性があると提案された。本明細書で言及した実験結果は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦ−Ｒ）のダウンレギュレーションがγ−Ｔ３誘導性ＮＦ−κＢ不活性化と相関することを明らかにした（図１１Ｂ）。この所見は、γ−Ｔ３がＫＢＭ−５細胞におけるＥＧＦ処理によるＮＦ−κＢ活性化を抑制できた理由を説明することができる。興味深いことに、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞系であるＰＣ−３は、アンドロゲン依存性ＬＮＣａＰ細胞よりγ−Ｔ３処理に対して高感受性であることが見いだされた。ＰＣ−３細胞は構成的ＮＦ−κＢ活性化を有することが見いだされており、一般にはＬＮＣａＰ細胞より化学療法薬誘導性アポトーシスに対してより耐性である。この観察に対する正確な理由は不明であるが、非腫瘍原性前立腺上皮細胞が同様にγ−Ｔ３に対して高度に耐性であるという事実に基づくと、γ−Ｔ３はより高悪性度の表現型を備える細胞を優先的に標的とすることが考えられる。
【０１１９】
それによってγ−Ｔ３がＮＦ−κＢ経路にその作用を媒介できると考えられる１つのメカニズムはＩｄ−１およびＥＧＦ−Ｒの抑制を通してであると考えられている。以前に、ＬＮＣａＰ細胞における異所性Ｉｄ−１発現はＮＦ−κＢ転写活性化活性ならびにｐ６５およびｐ５０タンパク質の核転座の増加を生じさせ、これにはそれらの下流エフェクタであるＢｃｌ−ｘＬおよびＩＣＡＭ−Ｉのアップレギュレーションが付随することが証明された。さらに、ＤＵ１４５細胞におけるＩｄ−１のそのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびレトロウイルス構築体による不活性化は、ＴＮＦ誘導性アポトーシスに対する増加した感受性と関連しているｐ６５およびｐ５０タンパク質の核レベルの減少を生じさせた。これらの所見を考察すると、本明細書で言及したこれらの結果は、Ｉｄ遺伝子ファミリーはγ−Ｔ３によって直接的に標的とされるＮＦ−κＢの上流調節因子の１つである可能性があること、そしてＮＦ−κＢシグナリング経路の阻害はγ−Ｔ３誘導性抗増殖の原因となる可能性があることを強力に示唆している。
【０１２０】
本明細書ではでは、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼがγ−Ｔ３誘導性アポトーシスに関与することもまた証明された。ＰＣａ細胞をγ−Ｔ３により処理すると、例えばｃ−ＪｕｎおよびＡＴＦ−２などのＪＮＫ経路に関連する一連の分子（図１２Ａ）が同時に活性化された。一方、ＪＮＫ阻害剤（ＳＰ６００１２５）の処理はＰＣａ細胞をγ−Ｔ３誘導性アポトーシスから保護することが証明された（図１２Ａ）。これはさらに、ＰＣａ細胞におけるγ−Ｔ３誘導性アポトーシスにＪＮＫ経路が関与することを確証している。注目すべきことは、ＪＮＫ経路が化学療法薬であるドセタキセルによって誘導される細胞アポトーシスにも関与することも公知である点である。これらの所見を考慮に入れたために、γ−Ｔ３がＪＮＫ経路の活性化の結果としてドセタキセルとの相乗性相互作用を有するのではないかという疑問が生じた。このためにドセタキセル処理単独、およびγ−Ｔ３との併用処理の抗増殖能力を比較した。驚くべきことに、ドセタキセルおよびγ−Ｔ３の併用療法はより高率のアポトーシス細胞を生じさせるが、γ−Ｔは生じさせないことが見いだされた（図１４Ａ）。この所見は、γ−Ｔ３と化学療法薬との相乗作用性の役割を示している。
【０１２１】
さらに、Ｅ−カドヘリンおよびγ−カテニン発現の回復は、Ｓｎａｉｌ、α−ＳＭＡ、ビメンチンおよびＴｗｉｓｔの抑制と一緒になって、ＰＣａ細胞侵襲能力へのγ−Ｔ３の阻害作用の原因となる可能性があることが証明された。γ−Ｔ３の抗増殖性作用は数種の癌のタイプにおいて報告されてきたが、本明細書で言及した結果は、γ−Ｔ３が癌侵襲を抑制するための潜在的薬剤である可能性があることを示唆する最初の根拠を提供している。Ｅ−カドヘリンのダウンレギュレーションおよび間葉マーカー（α−ＳＭＡ、ビメンチンおよびＴｗｉｓｔ）のアップレギュレーションは、転移性癌において最も頻回に報告された現象の一部である。Ｅ−カドヘリン発現の消失で、癌細胞の転移期への進行において重要な役割を果たす上皮−間葉転移（ＥＭＴ）を促進することができると示唆されている。癌細胞におけるＥ−カドヘリン不活性化の原因となる正確なメカニズムは不明であるが、その抑制因子であるＳｎａｉｌに起因する転写レベルの変化が数種の癌タイプにおける減少した発現の原因となるメカニズムの１つであると思われる。本明細書で言及した実験の結果に起因して、γ−Ｔ３処理ＰＣａ細胞は増加したＥ−カドヘリン発現を示し（図１３Ａ）、これは減少したＳｎａｉｌタンパク質発現および侵襲能力と関連している（図１３Ｂ）ことが見いだされた。細胞質カドヘリン結合タンパク質の１ファミリーであるカテニン類（α、γ）は、Ｅ−カドヘリンをアクチン細胞骨格へ連結させるので、正常Ｅ−カドヘリン機能のために必須であると考えられる。γ−Ｔ３がＥ−カドヘリンおよびγ−カテニンの発現だけをアップレギュレートし、α−カテニンの発現はアップレギュレートしないことが見いだされた。β−カテニンについての発現は、ニンニク誘導体を用いた以前の実験に類似して静止したままである。ＰＣ−３細胞は機能的Ｅ−カドヘリン発現にとって重要な分子であるα−カテニンを発現しないが、γ−Ｔ３は、Ｅ−カドヘリンをベースとする細胞接着複合体の確立において重要な役割を果たすと報告されているビンキュリンなどの他の分子を通してＥ−カドヘリンの機能を回復させることができる。これらをまとめると、本明細書で言及した実験結果は、γ−Ｔ３が間葉−上皮転移（ＭＥＴ）の誘導を通して癌転移を抑制できることを示唆している。
【０１２２】
図１４Ｃに要約したように、これらの結果は、γ−Ｔ３が多数の分子経路を通して作用するＰＣａ細胞増殖および侵襲の強力かつ特異的な阻害剤であることを証明した。天然Ｔ３抽出物の長期間摂取後に副作用を観察することはできないので（ＬＤ_５０≧２，０００ｍｇ／ｋｇ、データは示していない）、γ−Ｔ３は、進行期ＰＣａを治療するために単独で、または化学療法と併用して使用することができる。
【０１２３】
３．以下の実験は、組成物を含むγ−トコトリエノールが乳癌（ＢＣａ）細胞およびその活性の原因となる基礎にある分子経路に及ぼす抗増殖性作用に関する説明を提供する。これらの結果は、組成物を含むγ−トコトリエノールを用いた乳癌細胞の処理がプロカスパーゼ類の活性化、下位−Ｇ１細胞の蓄積およびＤＮＡ断片化によって証明されるアポトーシスの誘導を生じさせることを証明した。生存促進遺伝子の試験は、γ−トコトリエノール誘導性細胞死にはそれらの上流調節因子（Ｓｒｃ、Ｓｍａｄ１／５／８、ＦａｋおよびＬＯＸ）の変調を通してＩｄ１およびＮＦ−κＢの抑制が関連することを明らかにした。一方、γ−トコトリエノール処理もまたＪＮＫシグナリング経路の誘導を生じさせ、特異的阻害剤によるＪＮＫ活性の阻害はγ−トコトリエノールの作用を部分的に遮断した。さらに、細胞がγ−トコトリエノールおよび例えばドセタキセルなどの化学療法薬を用いて併用処理された場合には相乗作用が観察された。興味深いことに、γ−トコトリエノールを用いて処理された細胞では、α−トコフェロールまたはβ−アミノプロプリオニトリルはＩｄ１発現を部分的に回復させることが見いだされた。一方、Ｉｄ１のこの回復は、細胞をγ−トコトリエノール誘導性アポトーシスから保護することが見いだされた。これらの結果は、γ−トコトリエノールが乳癌細胞に及ぼす抗増殖性および化学増感作用がＩｄ１タンパク質のダウンレギュレーションを通して媒介されることを示唆した。
【０１２４】
３．１．材料および実験条件
【０１２５】
３．１．１ 乳癌細胞系、細胞培養条件および化学薬品−ヒトエストロゲン依存性ＢＣａ細胞（ＭＣＦ−７）、ヒトエストロゲン非依存性ＢＣａ細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞（ＰＣ−３）（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル）は、３７℃の５％ＣＯ_２中で、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および２％ペニシリン−ストレプトマイシンが補給されたＡＴＣＣが推奨する各培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）中で維持した。ヒト不死化非腫瘍原性乳癌上皮細胞系（ＭＣＦ−１０Ａ）（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル）は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から入手できるＭＥＧＭ Ｂｕｌｌｅｔキットの一部として供給されるＭＥＢＭ中で維持した。完全増殖培地を作製するために、基底培地中に以下の成分を加えた：ＧＡ−１０００以外のキットとともに供給される全ＭＥＧＭ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ添加物（ＢＰＥ １３ｍｇ／ｍＬ、２ｍＬ；ヒドロコルチゾン０．５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍＬ；ｈＥＧＦ １０μｇ／ｍＬ、０．５ｍＬ；インスリン５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍＬ）；１００ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素。安定性のＳｉ−Ｉｄ１ ＰＣ−３細胞系（Ｉｄ１ノックダウンモデル）は、以前のプロトコルに基づいてＹＣ Ｗｏｎｇ教授（ＨＫＵ）によって寄贈された。ドセタキセル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、独国ダルムシュタット）、ＪＮＫ阻害剤のＳＰ６００１２５、Ｅｒｋ阻害剤のＵ０１２６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国セントルイス）およびβ−アミノプロプリオニトリル（ＡＰＮ）（ＴＣＩ社、日本国）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させた。処理溶液は、所望の濃度を得るために培養培地中に希釈させた。
【０１２６】
３．１．２ Ｉｄ１形質転換体の生成−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１×１０^５個の細胞／ウエル）は１２ウエルの培養プレート内へプレーティングし、２４時間にわたり増殖させた。ｐｃ−Ｉｄ１またはｐｃＤＮＡ（ＭＴ Ｌｉｎｇ教授、ＩＨＢＩからの寄贈）は、γ−Ｔ３処理前に２４時間にわたりＦｕｇｅｎｅ ６試薬を使用して細胞内へ形質転換させた。２４時間後、細胞はＭＴＴ細胞生存性についてアッセイを行うか、ウエスタンブロッティングのために溶解させた。
【０１２７】
３．１．３ 以下の実験のためには、１．１．２の下で上述した同一のトコトリエノールおよびトコフェロール異性体を使用した。
【０１２８】
３．１．４ 細胞生存性および時間経過実験は、以下の相違を含めて項目１．１．３の下で上述したように実施した。阻害剤試験のためには、細胞にビタミンＥ異性体を添加する前に８時間にわたり標的用量で阻害剤（Ｕ０１２６、ＰＤ９８０５９およびＡＰＮ）を用いて前処理した。
【０１２９】
３．１．５ ＤＮＡ断片化アッセイ−γ−Ｔ３との２４時間にわたる培養後に、３×１０^６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を採取し、氷上で６０分間にわたり溶解緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中に懸濁させた。サンプルを遠心分離し、上清を取り除き、３７℃で４０分間にわたり５μＬのＲＮａｓｅＡ（１０μｇ／ｍＬ）とともに培養し、１ｍＬの無水エタノールを加えた。試験管を２０分間にわたり２０℃に置き、次にＤＮＡをペレット化するために遠心分離した。ＤＮＡサンプルは臭化エチジウム（０．２μｇ／ｍＬ）を含有する２％アガロースゲル上で３時間にわたる８０Ｖでの電気泳動法によって分析し、ＵＶ照明下で視認した。
【０１３０】
３．１．６ 末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性チオリン酸デオキシウリジンニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイ−アポトーシス中のＤＮＡストランド破損は、インサイチュー細胞死検出試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して試験した。手短には、１×１０^６個の細胞を２４時間にわたりγ−Ｔ３で前処理した。その後、細胞を３７℃で６０分間にわたり反応混合液と培養した。染色した細胞を分析し、蛍光顕微鏡によってガラススライド上で捕捉した。
【０１３１】
３．１．７ フローサイトメトリーは、項目１．１．３の下で上述したように実施した。マトリゲル侵襲アッセイは、項目１．１．４の下で上述したように実施した。ウエスタンブロッティングは、項目１．１．５の下で上述したように実施した。
【０１３２】
３．１．８ Ｉｄ−１のＲＴ−ＰＣＲ−全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬を製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のプロトコルにしたがって用いて単離した。ｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて合成し、次にＰＣＲによってＩｄ−１特異的プライマー（フォワードプライマー、Ｉｄ１−Ｓ、５’−ＣＴＣ ＣＡＧ ＣＡＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ＧＡＣ ＴＡ−３’およびリバースプライマー、Ｉｄ１−ＡＳ、５’−ＡＡＣ ＧＣＡ ＴＧＣ ＣＧＣ ＣＴＣ−３’）を用いて増幅させた。ＰＣＲサイクリングプロトコルは、以下の通りであった：９５℃で１０分間、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間および７２℃で１０分間の３０サイクル。グリセロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼを内部コントロールとして増幅させた。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、ゲルドキュメンテーションシステムを使用して分析した。
【０１３３】
３．２．結果−ビタミンＥ異性体が乳癌（Ｂｃａ）細胞に及ぼす抗増殖性作用
【０１３４】
用量を増やしながら（低：２０μＭ、中：４０μＭおよび高：８０μＭ）ビタミンＥ異性体を用いてＢＣａ細胞を２４時間にわたり処理した。これらの結果は、ビタミンＥ異性体が正常乳房上皮細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）の増殖率には有意な影響を及ぼさないが、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１の増殖を有意に抑制することを証明した（図１５Ａ）。驚くべきことに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はＭＣＦ−７細胞よりもビタミンＥ異性体の増殖阻害に高感受性であった。細胞増殖の阻害は、用量依存性阻害を示したＭＤＡ−ＭＢ−２３１中のＴ３異性体、特別にはγ−Ｔ３についてより有意に強力であった。２４時間にわたり様々な異性体とともに培養されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＩＣ_５０値に基づくと、阻害作用の順序は、γ−Ｔ３＞β−Ｔ３＞δ−Ｔ３であった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞はＭＣＦ−７細胞と比較するとより侵襲性であり、化学療法薬に対して耐性であるので、その後の実験のためには、γ−Ｔ３がＭＤＡ−ＭＢ−２３１に及ぼす作用を調査することを決定した。
【０１３５】
γ−Ｔ３−誘導性増殖阻害の原因となるメカニズムを試験するために、２４時間にわたるγ−Ｔ３処理を行った、または行わない細胞の細胞周期分布およびゲノムＤＮＡ断片化をフローサイトメトリー、ゲル電気泳動法およびＴＵＮＥＬアッセイによって分析した。その結果、γ−Ｔ３（ＩＣ_{５０−９０}）を用いた細胞の処理は下位−Ｇ１細胞集団の誘導（図１５Ｂ）およびＤＮＡ断片化（図１５Ｃ〜Ｄ）を生じさせ、これは処理後のアポトーシス細胞の存在を示していた。アポトーシス細胞（下位−Ｇ１分画）の比率は用量依存性で増加した。
【０１３６】
γ−Ｔ３誘導性アポトーシスのメカニズムを詳細に試験するために、最初に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるプログラムされた細胞死がカスパーゼ依存性であるかどうかを調査した。図１６Ａに示したように、プロカスパーゼ３、７、８、９ならびにＰＡＲＰの活性化は、切断産物の外観によって証明されたように、様々なγ−Ｔ３用量で２４時間にわたり処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において観察された。Ｂｃｌ−２のダウンレギュレーションもまた、Ｂａｘ発現のアップレギュレーションと一緒に、処理後に検出された（図１６Ａ）。一方、アポトーシス促進タンパク質のこれらのγ−Ｔ３媒介性活性化ならびにＢｃｌ−２／Ｂａｘ比の変化は用量依存性であった（図１６Ａ）。さらに、γ−Ｔ３処理後によるこれらのアポトーシス促進遺伝子の活性化（図１６Ｂ）はＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ−７細胞においてのみ観察され、ＭＣＦ−１０Ａ細胞では観察されなかったので、これはγ−Ｔ３がＢＣａ細胞においてアポトーシスを特異的に誘導することを示した。
【０１３７】
３．３．γ−Ｔ３はＢＣａ細胞における生存促進性シグナリング経路をダウンレギュレートした
【０１３８】
ＮＦ−κＢはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞内では構成的に活性化されると報告されたので、γ−Ｔ３がＮＦ−κＢ活性化の抑制に帰せられる細胞アポトーシスを誘導した可能性があると考えられた。様々な用量のγ−Ｔ３を用いて処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１のＮＦ−κＢ活性は、ＮＦ−κＢサブユニットｐ６５の核転座を試験することによって測定した。図１７Ａに例示したように、γ−Ｔ３処理は用量依存性でＮＦ−κＢ ｐ６５の核レベルを抑制した。γ−Ｔ３がＮＦ−κＢシグナリングに及ぼす作用を、例えばｐ−ＩκＢα／βおよびＩκＢα／βなどの、他の上流調節因子の発現を試験することによって、さらに探索した。γ−Ｔ３処理ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞内では、リン酸化ＩκＢα／βのレベルにおける用量依存性減少が観察された（図１７Ａ）。これは、ＩκＢα／βのレベル上昇ならびにＮＦ−κＢ ｐ６５核転座の阻害と結び付いている。これらの結果は、γ−Ｔ３がＩκＢα／βの脱リン酸化および蓄積を通してＮＦ−κＢ活性を抑制したことを示している。
【０１３９】
３．４．γ−Ｔ３は、ＢＣａ細胞においてＩｄ１シグナリング経路およびその上流調節タンパク質をダウンレギュレートした。
【０１４０】
驚くべきことに、γ−Ｔ３処理はＢＣａの発生および進行に関与する多数の重要なタンパク質もまたダウンレギュレートすることが見いだされた。図１７Ｂに示したように、Ｉｄ−１およびＩｄ−３発現レベルは、γ−Ｔ３の用量を増加させる処理によってほぼ検出不能なレベルへ有意に抑制された。ＥＧＦ−Ｒタンパク質レベルへの類似の作用もまた観察された。ＥＧＦ−ＲおよびＩｄタンパク質ファミリーはＢＣａ細胞増殖および生存にとって必須であるので、それらのダウンレギュレーションはγ−Ｔ３誘導性増殖停止およびアポトーシスと関連する可能性がある。
【０１４１】
Ｉｄ１転写産物およびタンパク質レベルは以前にＢＣａ細胞内のＳｒｃ、Ｓｍａｄ１／５、ＬＯＸおよびＦａｋシグナリング経路によって直接的または間接的に調節されることが証明されているので、γ−Ｔ３がＢＣａ細胞内のＩｄ１の上流調節因子に及ぼす作用についてさらに試験した。これらの結果は、Ｓｒｃのリン酸化ならびにＳｍａｄ１／５／８、ＬＯＸおよび活性化Ｆａｋのタンパク質レベルがγ−Ｔ３処理によって用量依存性で抑制されることを証明した（図１７Ｃ）。一方、抗Ｓｒｃ抗体を用いて明らかにされた免疫沈降アッセイは、ＳｒｃとＳｍａｄ１／５／８との相互作用の減少を明らかにしたが、これはγ−Ｔ３によるＳｍａｄ１／５／８タンパク質レベルの抑制に起因する可能性が高い（図１７Ｄ）。これはおそらくＳｒｃ−Ｓｍａｄ複合体のＩｄ−１プロモーターのＳｒｃ応答性領域への結合の減少を引き起こし、γ−Ｔ３によるＩｄ−１タンパク質発現の観察された抑制を生じさせた。
【０１４２】
３．５．γ−Ｔ３はＢＣａ細胞におけるアポトーシス促進性シグナリング経路を活性化した
【０１４３】
ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、ストレスおよび遺伝毒性物質によって活性化される進化的に保存されたセリン／トレオニンプロテインキナーゼである。ＪＮＫは、全３つのＪｕｎ転写因子およびＡＰ−１ファミリーのＡＴＦ−２メンバーのアミノ末端基をリン酸化する。活性化された転写因子は遺伝子発現を変調させて、細胞移動および細胞死を含む適切な生物学的応答を生成する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が様々な用量のγ−Ｔ３で処理されると、ＪＮＫリン酸化活性における用量依存性上昇が検出された（図１８Ａ）。一方、ＡＴＦ−２またはｃ−ｊｕｎなどのＪＮＫ下流エフェクタのリン酸化は、全部がγ−Ｔ３によってアップレギュレートされ、これはＪＮＫシグナリング経路がγ−Ｔ３によって活性化されたことを裏付けている。
【０１４４】
ＢＣａ細胞のγ−Ｔ３誘導性アポトーシスにおけるＪＮＫ活性化の重要性をさらに確認するために、特異的阻害剤であるＳＰ６００１２５を用いたＪＮＫの不活性化が細胞をγ−Ｔ３から保護できるかどうかについて調査した。図１８Ｂに示したように、２０μＭのＳＰ６００１２５とのγ−Ｔ３による併用処理はγ−Ｔ３単独による処理と比較して生存細胞のパーセンテージを上昇させ、これはＪＮＫ活性化がγ−Ｔ３誘導性アポトーシスのために必要であることを確証している。
【０１４５】
３．６．ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の活性化はＢＣａ細胞におけるγ−Ｔ３誘導性アポトーシスとは関連していなかった
【０１４６】
ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼは、成長因子、サイトカインおよび発癌物質を含む様々な刺激によって活性化される細胞内シグナリング経路の１つである。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ）経路はＭＤＡ−ＭＢ−２３１ではＥｒｋ１／２、Ｍｅｋ１／２およびＥｌｋ１のリン酸化によって証明された（図１８Ｃ）ようにγ−Ｔ３によって活性化されることが見いだされたが、それらの活性化はγ−Ｔ３誘導性アポトーシスのために直接的には必要とされず、それは特異的阻害剤であるＵ０１２６／ＰＤ９８０５９によるＭＡＰＫの不活性化がγ−Ｔ３処理後の癌細胞生存性を回復させることができなかったからである（図１８Ｄ）。
【０１４７】
３．７．γ−Ｔ３がＢＣａ細胞侵襲の阻害に及ぼす作用
【０１４８】
γ−Ｔ３が多数の癌に抗増殖性作用を有することは証明されているが、ＢＣａの転移に影響を及ぼすかどうかは明白ではない。このため、γ−Ｔ３がＢＣａ細胞の侵襲能力を抑制できるかどうかを試験した。図１９Ａに示したように、マトリゲル侵襲アッセイを使用すると、２４時間にわたってγ−Ｔ３処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が、マトリゲル層を通して侵襲された細胞数の減少によって証明されたように、未処理コントロールと比較して少なくとも２倍低い侵襲能力を示すことが見いだされた。侵襲チャンバ内に加えられた生存細胞の数が同一であったので、細胞侵襲に及ぼすこの阻害作用は、γ−Ｔ３によって誘導された細胞増殖阻害の結果ではなかった。これらの結果は、γ−Ｔ３が、それらの細胞毒性作用とは無関係に、ＢＣａ細胞の侵襲能力を阻害できることを示している。
【０１４９】
Ｅ−カドヘリン発現のダウンレギュレーションは、転移性癌について最も頻回に報告された特徴の１つである。癌細胞内でのＥ−カドヘリン発現の回復は、転移能力の抑制をもたらす。ＢＣａでは、Ｅ−カドヘリン発現のダウンレギュレーションは、高悪性度腫瘍および不良な予後と相関しており、これはＥ−カドヘリン発現がＢＣａ進行において役割を果たすことを示している。これまでＭＤＡ−ＭＢ−２３１を検出することは、それがＥ−カドヘリン陰性ヒトＢＣａ細胞系であるので不可能であった。一方、γ−Ｔ３処理はα−およびβ−カテニンタンパク質に影響を及ぼせなかったが、γ−カテニン発現を増強した。２つのＥ−カドヘリン抑制因子であるＳｎａｉｌおよびＴｗｉｓｔの発現は、γ−Ｔ３処理後にはどちらもダウンレギュレートされた（図１９Ｂ）。さらに、間葉マーカーであるα−ＳＭＡは２４時間にわたるγ−Ｔ３処理後にはダウンレギュレートされ（図１９Ｂ）、これはγ−Ｔ３が上皮から間葉への転移（ＥＭＴ）の阻害を通してＢＣａ侵襲を抑制できることを示している。
【０１５０】
３．８．γ−Ｔ３処理がドセタキセル誘導性アポトーシスに及ぼす作用
【０１５１】
例えば熟成ニンニク抽出物または果物もしくは植物から抽出されるレスベラトロールなどの天然産物の多くは、抗癌作用を有することが証明されている。以前の試験は、これらの天然産物の多くが化学療法に対する癌細胞の感受性を増加させ、前立腺腫瘍に対する放射線療法の有効性を増強することを証明している。γ−Ｔ３が化学療法薬と相乗的に作用できるかどうかを試験するために、γ−Ｔ３単独またはドセタキセルとの併用での作用を試験した。図２０Ａに示したように、ドセタキセルとγ−Ｔ３との併用処理後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系内でのアポトーシス細胞のパーセンテージは、γ−Ｔ３またはドセタキセル単独で処理した場合のパーセンテージより有意に高かった。ウエスタンブロッティングを使用して、本発明者らは、γ−Ｔ３とドセタキセルとの併用処理がアポトーシス促進タンパク質（切断されたＰＡＲＰ、カスパーゼ３、７、８、９）の活性化ならびに生存促進タンパク質（Ｉｄ−１、ＥＧＦＲ）のダウンレギュレーションを通して細胞アポトーシスを増強することをさらに証明した（図２０Ｂ）。類似の作用はＭＣＦ−７細胞においても観察されたが（図２０Ｃ）、これはγ−Ｔ３およびドセタキセルがＢＣａ細胞に対して相乗作用を有する可能性があることを示唆している。
【０１５２】
３．９．β−アミノプロピオニトリル（ＡＰＮ）はγ−Ｔ３誘導性アポトーシスを減衰させた
γ−Ｔ３とβ−アミノプロピオニトリル（ＡＰＮ；ＬＯＸの非特異的阻害剤）との併用処理はＩｄ１の発現をほぼ完全に回復させ、そして同時に細胞増殖およびウエスタンブロッティング分析によって証明されたように、γ−Ｔ３誘導性カスパーゼ依存性アポトーシスを阻害した（図２０ＤおよびＥ）。しかし、γ−Ｔ３およびγ−Ｔ３−ＡＰＮ併用処理を用いて見られたＰＡＲＰ切断レベルのほんの僅かな減少は、カスパーゼ非依存性アポトーシスの誘導を示唆した。これらの所見は予想外であるので、そこでγ−Ｔ３およびＡＰＮ併用処理中にＩｄ１誘導を引き起こす他のメカニズムの関与を示唆している。図２０Ｆは、乳癌細胞におけるγ−トコトリエノールについての抗癌経路を要約している。
【０１５３】
４．以下の実験では、前立腺癌（ＰＣａ）腫瘍に対するγ−トコトリエノール（γ−Ｔ３）の生体内での抗腫瘍作用をその薬物動態、組織分布およびドセタキセルとの相乗相互作用と一緒に調査した。手短には、腹腔内注射後に、γ−Ｔ３は血清から急速に消失し、ＰＣａ腫瘍中に選択的に沈着する。γ−Ｔ３の短期間投与は、腫瘍の有意な収縮を生じさせた。一方、腫瘍増殖のそれ以上の阻害は、γ−Ｔ３およびドセタキセルの併用治療によって達成された。γ−Ｔ３の抗腫瘍作用は細胞増殖マーカーの発現の減少および癌細胞アポトーシスの速度上昇と結び付いていた。これらの結果は、ＰＣａ腫瘍に対するγ−Ｔ３の生体内での抗腫瘍性を証明した。
【０１５４】
４．１．材料および実験条件
【０１５５】
４．１．１ ヒト前立腺癌細胞系ＰＣ−３を、ＡＴＣＣから入手し、３７℃の加湿した９５％空気、５％ＣＯ_２中において１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、オーストリア国パッシング）が補給されたＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールズバッド）中で増殖させた。ドセタキセル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）をジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国ミズーリ州セントルイス）中に溶解させた。例えばヘプタンおよび酢酸エチルなどの溶媒はＴｅｄｉａ Ｃｏｍｐａｎｙ社（米国オハイオ州フェアフィールド）から購入した。Ｄ−ルシフェリン、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）および１０％中性緩衝ホルマリン液は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。
【０１５６】
４．１．２ 以下の実験のためには、１．１．２の下で上述した同一のトコトリエノールおよびトコフェロール異性体を使用した。
【０１５７】
４．１．３ ＰＣ−３前立腺癌異種移植モデルの確立−生物発光性ＰＣ−３−Ｌｕｃヒト前立腺癌細胞系を、公知の方法にしたがって生成した。手短には、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするｃＤＮＡをｐＬｅｎｔｉ−６／Ｖ５内にクローニングした。この構築体を、パッケージングミックスを用いてＨＥＫ２９３内へ同時に形質転換させ、レンチウイルスを回収し、ＰＣ−３細胞に感染させるために使用した。形質転換体を、１週間にわたり１０μｇ／ｍＬのブラスチシジンを用いる選択することによってプール（ＰＣ−３−Ｌｕｃ）として入手した。動物実験プロトコルは、動物の適正かつ人道的な使用についてのシンガポール国のＮＡＣＬＡＲ（実験動物を使用する研究に関する国立諮問委員会）ガイドラインによって承認された。雄性ＢＡＬＢ／ｃ無胸腺ムードマウス（４〜５週齢、１８〜２２ｇ）は、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（米国メイン州バーハーバー）から購入した。マウスを、生物資源センター第１科（シンガポール国バイオポリス）内の標準条件（２０．８±２℃、５５±１％の相対湿度、１２時間明暗サイクル）下で収容し、齧歯類飼料（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、インディアナ州インディアナポリス）および発熱物質無含有環境で供給される塩素化逆浸透水を与えた。手短には、１００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０中の１×１０^６個のＰＣ−３−Ｌｕｃ細胞を、２６ゲージの針を備える１ｍＬのシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、米国ニュージャージー州ベクトンディッキンソン）を使用してヌードマウスの側腹部に皮下注射した。全外科手技は、無菌条件下で実施した。
【０１５８】
約１００ｍｍ^３（接種２週間後）の類似の腫瘍サイズを有するマウスを選択し、３群に無作為に割付けた（ｎ＝１群当たり５匹）；コントロール群（溶剤としてのＤＭＳＯ）、γ−Ｔ３（５０ｍｇ／ｋｇ／日）群およびγ−Ｔ３とドセタキセルの併用療法群（５０ｍｇのγ−Ｔ３／ｋｇ／日および７．５ｍｇのドセタキセル／ｋｇ／週）。マウスを毎日計量し、腫瘍は、同時にデジタル式炭素繊維製カリパス（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ペンシルベニア州ピッツバーグ）を用いて測定した。腫瘍容積は、４／３^＊π^＊（平均径／２）^３として計算した。マウスには２週間にわたり週５回投与した。１０日間の治療後、マウスはＣＯ_２吸入によって安楽死させた。血液サンプルは、２５ゲージ針を用いる心臓出血を通して採取した。血液サンプルは室温で３０分間にわたり培養し、その後に３０分間かけて４℃で４，４００ｒｐｍで遠心分離した。上清としての血清を血漿から分離し、−８０℃で保存した。腫瘍、肝臓、腎臓、脾臓、肺および心臓を採取した。腫瘍の一部は、１０％中性緩衝ホルマリン液中で固定した。
腫瘍の残りおよび単離した臓器全部は、直ちに液体窒素中に浸漬し、−８０℃で保存した。
【０１５９】
４．１．４ マウスにおけるγ−トコトリエノールの薬物動態−Ｃ５７ＢＬ／６黒色マウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（米国メイン州バーハーバー）から購入した。４０匹の５週齢のマウスに、１ｍｇのγ−Ｔ３を含有する単回ｉ．ｐ．注射を実施した。５匹のマウスを、様々な時点に致死させた（１０分、３０分、１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間および７２時間後）。血液サンプルは、心臓出血を通して採取した。血清を単離するために、血液サンプルは室温で３０分間にわたり培養し、その後に３０分間かけて４℃で４，４００ｒｐｍで遠心分離した。血清中のγ−Ｔ３の濃度は、下記のＨＰＬＣ法を使用して分析した。
【０１６０】
４．１．５ 単回投与急性毒性試験−最大耐用量（ＭＴＤ）を、死亡を全く伴わない最高用量が見いだされるまで様々なマウス群で用量を上昇させることによって決定した。手短には、９０匹のＣ５７ＢＬ／６黒色マウス（各群１０匹）は、１００μＬの注射用量中に１、２、４、８、１２、１６、２０、３０および４０ｍｇを含有する単回用量腹腔内注射を受けた。マウスの体重および生存率を３０日間観察し、その後にＣＯ_２吸入によって安楽死させた。
【０１６１】
４．１．６ 血清、腫瘍および臓器からのγ−トコトリエノールの抽出−血清を解凍し、５分間かけて超音波浴（Ｌａｂ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ社、米国イリノイ州ヴァーノンヒルズ）中で音波処理し、その後に１０秒間ボルテックスミキサーにかけた。１００μＬの血清を、９００μＬの水を含有するＩＷＡＫＩ社Ｐｙｒｅｘガラス製試験管（インドネシア国ジャワトゥンガ州）中に移した。腫瘍および臓器を調製するためには、組織を１ｍＬの水中でホウケイ酸ガラス製ホモジナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ペンシルベニア州ピッツバーグ）中でホモジナイズし、その後にＰｙｒｅｘガラス製試験管中へ移した。純度９９％を備える５μＬのδ−Ｔ３（１ｍＬのエタノール中に溶解させた１００ｍｇのδ−Ｔ３）を内部標準溶液として使用し、混合液中へスパイク混合した。この試験管を１０秒間ボルテックスミキサーにかけ、２分間超音波処理した。標的分析物の酸化を最小限に抑えるために、４ｍＬのブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）溶液（１００ｍＬのヘプタン中の５ｍｇのＢＨＴ）を加えた。液−液抽出は、１０秒間にわたり強力にボルテックスミキサーにかけることによって実施した。液−液抽出の後に、試験管は４，０００ｒｐｍで５分間にわたりＨｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３−ＳＲ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｐａｇｎｅｌｌ社、英国バッキンガムシャー州）内で遠心分離した。３．９ｍＬの有機相をまた別のＰｙｒｅｘ製試験管内へ移した。抽出を繰返し、第２の有機相を取り出し、第１の相と一緒にプールした。有機溶液は、Ｂｕｃｈｉ ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ−２０５（スイス国フラヴィル）を用いて蒸発させ、乾燥した残留物を１．５ｍＬのヘプタン中で再構成させ、濾過し、その後にＨＰＬＣ分析を実施した。
【０１６２】
４．１．７ 高性能液体クロマトグラフィーによるγ−トコトリエノール濃度の決定−ＨＰＬＣ法の順相は、当技術分野において公知の方法の変法として実施した。１０μＬのサンプルをＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ社、米国カリフォルニア州サンタクララ）内へ注入した。クロマトグラフィーによる分離は、Ｚｏｒｂａｘ Ｓｉｌｉｃａ ６０（５μｍ、２５０×４ｍｍの内径（ｉ．ｄ．））分析カラムによって実施した。使用した移動相は、１．０ｍＬ／分の流量でヘプタン／酢酸エチル（９０：１０、ｖ／ｖ）の混合液であった。γ−Ｔ３の吸光度は、励起波長２９０ｎｍおよび発光波長３６０ｎｍに設定したダイオードアレイ検出器を用いて監視した。
【０１６３】
４．１．８ 血清に基づく毒性アッセイ−１０匹のＣ５７ＢＬ／６黒色マウスに、１ｍｇのγ−トコトリエノールまたはＤＭＳＯブランクを含有する週５回の腹腔内注射を実施した。マウスは心臓出血によって致死させ、血清は上述した方法によって抽出した。次にバイオマーカーであるアルブミン、クレアチン、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、尿素およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）をＲＡＮＤＯＸ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（英国クルムリン）から購入した比色法に基づく検出キットによって測定した。
【０１６４】
４．１．９ 免疫組織化学検査−マウスの腫瘍、肝臓、腎臓、脾臓、肺および心臓は、１２時間にわたり１０％中性緩衝ホルマリン液中で固定した。固定後、組織サンプルをパラフィンブロック内に加工処理した。組織切片は厚さ５μｍにＫｅｄｅｅマイクロトーム（Ｃｈｉｎａ ＪＩＮＨＵＡ Ｋｅｄｉ社、中国浙江省）を用いて切断し、次にトルエン中で脱パラフィン化し、アルコールから蒸留水へ段階的に再水和させた。内因性ペルオキシダーゼ活性を、切片をメタノール中の０．６％過酸化水素で２０分間処理することによって遮断し、その後に抗原回復処理を実施した（Ｄａｋｏ社、デンマーク国グロストルップ）。切片を次に３７℃で１時間にわたりペルオキシダーゼブロッキング溶液（Ｄａｋｏ社、デンマーク国グロストルップ）とともに培養し、あらゆる非特異的抗原を取り除いた。標本は、Ｓｎａｉｌ（１：２００）、Ｉｄ１（１：２５０）（Ａｂｃａｍ社、英国ケンブリッジ）、切断カスパーゼ−３および切断ＰＡＲＰ（１：５０；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国マサチューセッツ州ベバリー）に対するウサギ一次ポリクローナル抗体および増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、Ｋｉ−６７、Ｅ−カドヘリン（１：５０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国カリフォルニア州サンタクルーズ）に対するマウスモノクローナル抗体とともに４℃で一晩培養した。ＴＢＳ中で数回すすぎ洗いした後、切片は３７℃で１時間にわたりＤａｋｏ ＲＥＡＬＴ ＥｎＶｉｓｉｏｎＴ／ＨＲＰ、ウサギ／マウス溶液とともに培養した。この反応は、Ｄａｋｏ ＲＥＡＬＴ ＤＡＢ^＋色原体によって視認した。Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン（Ｄａｋｏ社、デンマーク国グロストルップ）を対染色として使用した。標準倒立光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社、日本国東京）を使用してスライドを分析した。
【０１６５】
４．１．１０ 生物発光の画像化−特発性前立腺腫瘍モデルからのルシフェラーゼ活性の生体内での生物発光の画像化は、生存中の画像の取得および分析用のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇｌｍａｇｅ ａｃｑｕｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．社、米国マサチューセッツ州ホプキントン）を備えるＩＶＩＳイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．社、米国マサチューセッツ州ホプキントン）を用いて実施した。Ｄ−ルシフェリンは、ＤＰＢＳ中で１５ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解させ、濾過滅菌し、−２０℃で保存した。治療の終了時に、マウスにはルシフェリン溶液（１５０ｍｇ／ｋｇ体重）のｉ．ｐ．注射を実施した。画像は、ルシフェリン投与の５分後に取得した。シグナル強度は、腫瘍からの関心領域を含む検出された全光子数の合計として定量した。
【０１６６】
４．２．結果−薬物動態および単回投与急性毒性−γ−Ｔ３は本明細書で報告したように生体外でのＰＣａ細胞において増殖を阻害してアポトーシスを誘導したので、生体内でのＰＣａ増殖へのγ−Ｔ３の抗腫瘍作用を試験した。本試験は、腹腔内投与後の血漿中のγ−Ｔ３の薬物動態的挙動を調査することから開始した。マウスには１ｍｇのγ−Ｔ３を注射し、血液をその後の様々な時点のγ−Ｔ３濃度についてアッセイした。血清薬物動態プロファイルに示したように（図２７Ａ）、血漿γ−Ｔ３濃度は投与後３０分間以内に２６０ｐｐｍから５０ｐｐｍへ減少した。この濃度は、少なくとも７２時間にわたって一定のままである。
【０１６７】
γ−Ｔ３の単回投与急性毒性を評価するために、γ−Ｔ３を、最大耐用量（ＭＴＤ）を決定するために用量を増大させながら９種の用量で腹腔内注射した。ＭＴＤは３０日間の観察期間中に１０匹のマウス中１匹も死亡せず、次の高用量では少なくとも１匹のマウスが死亡する用量であると規定されている。図２７Ｂに示したように、ＭＴＤは１２ｍｇであることが見いだされた。１ｍｇのγ−トコトリエノールまたはＤＭＳＯブランクを含有するｉ．ｐ．注射を週５回受けたマウスについて、試験したいずれのパラメータにおいても毒物学的変化は見いだされなかった（図２７Ｃ）。
【０１６８】
γ−Ｔ３はＰＣ−３−Ｌｕｃ前立腺癌異種移植片の増殖を阻害する−γ−Ｔ３は生体外でＰＣａ細胞において増殖を阻害してアポトーシスを誘導したので、生体内でのＰＣａ増殖へのγ−Ｔ３の抗腫瘍作用を試験した。無胸腺ヌードマウスにＰＣ−３−Ｌｕｃ細胞を同種移植し、コントロール（ＤＭＳＯ）群、γ−Ｔ３群および併用（γ−Ｔ３＋ドセタキセル）治療群に分けた。γ−Ｔ３についての用量（５０ｍｇ／ｋｇ／日）を選択したのは、この用量が高用量で観察された処理関連死亡を誘導せずにヌードマウスにおける有意な抗腫瘍作用を提供したためであった（図２８Ａ）。ドセタキセルについてと同様に、用量は７．５ｍｇ／ｋｇ／週であると決定した。腫瘍増殖は、週５回監視した。全群について全試験を通して体重における有意な変化は見られなかった（図２８Ａ）。コントロール群中の腫瘍は急速に増殖し、治療開始第１４日までに６２０±１０ｍｍ^３の平均容積に達した。これとは対照的に、γ−Ｔ３またはγ−Ｔ３＋ドセタキセルで治療されたマウス上の腫瘍増殖は顕著に阻害された；腫瘍容積は各々３００±４８ｍｍ^３および２４０±６２ｍｍ^３の平均値のままであった（図２８Ｂおよび図２９）。これらの結果は、γ−Ｔ３が生体内でのＰＣａ増殖に有意な阻害作用を有することを示した（ｐ値＝０．００１８）（図２９）。
【０１６９】
血清γ−Ｔ３濃度は、投与後急速に低下する（図２７Ａ）。これが薬物クリアランスまたは内臓への特異的沈着に起因するのかどうかを理解することが極めて重要である。最初に、ＨＰＬＣ分析を用いて１０日間にわたり５０ｍｇ／ｋｇ／日で治療されたマウスからの重要臓器各々のγ−Ｔ３濃度を決定した。図２８Ｃに示したように、脾臓および肝臓は治療期間の終了時に最高濃度のγ−Ｔ３沈着を有することが見いだされたが、γ−Ｔ３はさらに心臓、腎臓および肺組織中でも検出することができた。より重要なことに、腫瘍組織の検査はγ−Ｔ３が主として腫瘍内に蓄積した、体重１ｇにつきγ−Ｔ３が０．１５±０．０３ｍｇの濃度に達することを明らかにしたが、これは他の内臓において検出される量の少なくとも２倍であった。これらの結果はγ−Ｔ３が前立腺腫瘍組織中に選択的に沈着することを示唆しており、これはγ−Ｔ３が観察可能な毒性と関連していない用量で有意な抗腫瘍活性を発揮できる理由を説明するのに役立つ。
【０１７０】
γ−Ｔ３が癌細胞増殖およびアポトーシスに及ぼす生体内での作用−γ−Ｔ３の抗腫瘍作用が生体内での実験に記載したように（上記の項目２を参照されたい）、細胞増殖およびアポトーシスの誘導を通して媒介されるかどうかを確証するために、各治療群からのマウスの腫瘍組織を免疫組織化学検査によって試験した。図３０に示したように、γ−Ｔ３がＰＣａ腫瘍に及ぼす抗増殖性作用は、γ−Ｔ３を用いて、またはγ−Ｔ３とドセタキセルとを用いた治療後に、全タンパク質がダウンレギュレートされることを示したＰＣＮＡ、Ｋｉ６７およびＩｄ−１の濃度の試験によって確証された。一方、γ−Ｔ３はさらに切断されたカスパーゼ３およびＰＡＲＰの濃度を誘導したが（図３１）、これはγ−Ｔ３治療後により多くの細胞がアポトーシスを経験したことを示唆している。
【０１７１】
腫瘍サプレッサー遺伝子へのγ−Ｔ３抗腫瘍作用−Ｅ−カドヘリン発現のダウンレギュレーションは、転移性癌について最も頻回に報告された特徴の１つである。癌細胞内でのＥ−カドヘリン発現の回復は、転移能力の抑制をもたらす。ＰＣａでは、Ｅ−カドヘリン発現のダウンレギュレーションは、高悪性度腫瘍および不良な予後と相関しており、これはＥ−カドヘリン発現がＰＣａ進行において役割を果たすことを示している。γ−Ｔ３は前立腺癌細胞の生体外での侵襲能力をＥ−カドヘリン発現のアップレギュレーションを通して阻害することが見いだされたので、次にγ−Ｔ３がさらに生体内での前立腺癌細胞内のＥ−カドヘリン濃度にも影響を及ぼせるかどうかを分析した。無胸腺ヌードマウスのコントロール群、γ−Ｔ３群およびγ−Ｔ３とドセタキセルとの併用治療群からの腫瘍切片のＥ−カドヘリン発現を免疫組織化学検査によって試験したところ、結果は、Ｅ−カドヘリンがγ−Ｔ３治療後にアップレギュレートされるが（図３２Ａ）、Ｅ−カドヘリンの抑制因子であるＳｎａｉｌがダウンレギュレートされる（図３２Ｂ）ことを示した。これらのデータは、腫瘍増殖の阻害に加えて、γ−Ｔ３は生体内での抗転移活性を有する可能性があることを示唆した。
【０１７２】
４．３．このセクションで言及した実験は、γ−Ｔ３がヌードマウスにおける前立腺腫瘍の増殖を抑制することを証明したが、これは前立腺癌に対するγ−Ｔ３の生体内での抗腫瘍作用に関する最初の報告である。生体内でのγ−Ｔ３の抗腫瘍作用に関する試験は、高度に精製されたγ−Ｔ３が不足していることおよびγ−Ｔ３を腫瘍細胞へ送達することが難しいことから、限定される。γ−Ｔ３がＰＣａ細胞増殖に及ぼす阻害作用は生体外での高速増殖性細胞に対して特異的であることが証明された。このとき、γ−Ｔ３投与の腹腔内経路がＰＣａ腫瘍増殖を阻害することに有効であることが見いだされた。
【０１７３】
γ−Ｔ３の蓄積は、抗腫瘍活性のために極めて重要である。γ−Ｔ３は、おそらく腫瘍組織での高増殖速度に起因して、固形腫瘍内で選択的に蓄積することが見いだされた。さらに、γ−Ｔ３は重要臓器の大多数において見いだされることもまた証明された。しかし、５つの重要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓）でのγ−Ｔ３の沈着は、固形腫瘍において見いだされる沈着のおよそ半分であった（図２８Ｃ）。これらの所見に関する矛盾は投与方法に起因する可能性が高いが、これは、γ−Ｔ３は本明細書で言及した実験では腹腔内注射によって投与されたが、それらの試験ではマウスに経口投与によって与えられたからである。それでも、重要臓器におけるγ−Ｔ３の沈着にもかかわらず、体重、正常臓器重量および血清毒性濃度への観察できる作用は見られない。
【０１７４】
γ−Ｔ３が生体内での腫瘍増殖を阻害するメカニズムは、明確には理解されていない。ビタミンＥの古典的な抗酸化物質特性を媒介するすべてのトコクロマノール分子において見いだされるヒドロキシル成分は、一般にはγ−Ｔ３の高腫瘍活性とは関連していないと考えられる。
【０１７５】
本明細書に記載したように、γ−Ｔ３は侵襲および転移を阻害すると考えられるＥ−カドヘリン遺伝子をアップレギュレートすることが見いだされた。さらにＰＣａ細胞系であるＰＣ−３によって構成的に発現させられるＩｄ−１は、γ−Ｔ３処理によって抑制され、ＮＦ−κＢ経路分子の抑制をもたらした。このとき、生体内での条件下で前立腺癌に対するγ−Ｔ３の抗腫瘍活性をさらに確認することも可能であった。
【０１７６】
細胞増殖およびアポトーシスは腫瘍増殖にとって極めて重要なプロセスであるので、本発明者らの腫瘍モデルにおけるγ−Ｔ３によるこれらのプロセスの変調を調査した。生体外でのγ−Ｔ３の有意な抗増殖作用と一致して、ＰＣＮＡ、Ｋｉ６７およびＩｄ−１（図３０）発現の抑制によって明らかなように、生体内でのγ−Ｔ３の顕著な抗増殖性作用が観察された（図３０）。さらに、ＰＣａ細胞における生体内でのアポトーシスの有意な誘導が観察された。γ−Ｔ３誘導性アポトーシスの原因となる正確なメカニズムは、完全には理解されていない。本明細書で言及した実験の結果は、アポトーシスのプロセスを生体内でのγ−Ｔ３抗腫瘍作用の重要なメカニズムとして裏付ける（図３１）。これらの観察所見が意味することは、γ−Ｔ３をＰＣａに対する他の抗増殖剤との相乗作用で使用できることにある。
【０１７７】
本明細書で言及した実験では腫瘍転移は試験しなかったが、γ−Ｔ３処理はＥ−カドヘリンの増強した発現を生じさせるので、そこでγ−Ｔ３は抗転移活性を有することを裏付けると思われる。Ｅ−カドヘリンの機能または発現の消失は癌の進行および転移と関係付けられてきたが、それは組織内の細胞接着を減少させ、結果として細胞運動性の増加を生じさせるからである。これは順に、癌細胞が基底膜を越えて周囲組織を侵襲することを可能にさせることがある。γ−Ｔ３との正確な相互作用についてはまだ調査されなければならないが、リン脂質膜中の独特のトコトリエノール類である可能性がある。本明細書ではγ−Ｔ３がＥ−カドヘリンの誘導によって生体外での癌細胞侵襲を阻害できることもまた証明されたので、本所見は、γ−Ｔ３の生体内での抗転移作用に関する詳細な調査を正当化する強力な根拠を提供する。
【０１７８】
これらをまとめると、ビタミンＥの１つの誘導体であるγ−Ｔ３は癌細胞増殖の阻害およびアポトーシスの誘導を通してＰＣａ増殖を生体内で阻害できることが証明された。
【０１７９】
５．根拠は、前立腺癌が細胞のまれな下位集団、つまり前立腺癌幹細胞（ＣＳＣ）を起源とすることを裏付けている。前立腺癌に対する従来型療法は、主として大多数の分化腫瘍細胞を標的とすると考えられるが、治療後の疾患再発の原因となる可能性があるＣＳＣは見逃す。このため、ＣＳＣの排除に成功することはこの疾患からの完全寛解を達成するための効果的戦略である可能性がある。γ−Ｔ３は、ウエスタンブロッティングおよびフローサイトメトリー分析によって証明されたように、アンドロゲン非依存性（ＡＩ）、前立腺癌細胞系（ＰＣ−３およびＤＵ１４５）における前立腺癌幹細胞マーカー（ＣＤ１３３／ＣＤ４４）の発現をダウンレギュレートできることが初めて証明された。一方、前立腺癌細胞の細胞凝集塊形成能力は、γ−Ｔ３治療により有意に妨害された。より重要なことに、ＰＣ−３細胞のγ−Ｔ３による前処理は、これらの細胞の腫瘍開始能力を妨害することが見いだされた。本セクションで言及したデータは、γ−Ｔ３が前立腺ＣＳＣを標的とする際の効果的薬剤となり得ることを示唆している。
【０１８０】
５．１ 材料および実験条件
【０１８１】
５．１．１ 前立腺癌細胞系ＰＣ−３、ＤＵ１４５および膀胱癌細胞系ＭＧＨ−Ｕ１（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル）は、１（ｗ／ｖ）％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）および５％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）が補給されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）中で維持した。全細胞は、３７℃の５％ＣＯ_２環境内で維持した。
【０１８２】
５．１．２ トコトリエノール異性体を、項目１．１．２の下で上述したように抽出および精製した。
【０１８３】
５．１．３ ルシフェラーゼタンパク質を安定性で発現するＰＣ−３細胞の生成−ルシフェラーゼを発現するＰＣ−３細胞系であるＰＣ−３ Ｌｕｃは、ウイラルパワ（Ｖｉｒａｌｐｏｗｅｒ）レンチウイルス遺伝子発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて製造業者の取扱説明書にしたがって生成した。
手短には、ＨＥＫ２９３は、レンチウイルス発現システムと一緒に提供されるパッケージングミックスと一緒に、全長ルシフェラーゼタンパク質を発現するｐＬｅｎｔｉ６−ＤＥＳＴ−Ｖ５−Ｌｕｃベクターを用いて形質転換させた。４８時間の形質転換後、上清を回収し、ポリブレン（８μｇ／ｍＬ）と混合し、ＰＣ−３細胞を感染させるために使用した。
感染後、陽性形質転換体を、６日間にわたりブラスチシジン（１０μｇ／ｍＬ）を用いた処理によるプールとして選択した。
【０１８４】
５．１．４ 細胞生存性アッセイ−γ−Ｔ３処理後の細胞生存性を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイによって測定した。手短には、細胞を９６ウエルプレート上に播種し、指示した時点について様々な濃度のγ−Ｔ３を用いて処理した。処理の終了時に、ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）を各ウエルに加え、室温で４時間にわたり培養した。ＤＭＳＯを次に各ウエルに加えてホルマザン結晶を溶解させた。このプレートを室温でさらに５分間にわたり培養し、光学密度（ＯＤ）をＬａｂｓｙｓｔｅｍマルチスキャン・マイクロプレート・リーダー（Ｍｅｒｃｋ Ｅｕｒｏｌａｂ社、スイス国ディーティコン）上の波長５７０ｎｍで測定した。全個別ウエルは、３連ずつ設定した。細胞生存性のパーセンテージは、指示した濃度で処理細胞と未処理細胞とのＯＤ比として提示した。
【０１８５】
５．１．５ ウエスタンブロッティングは、項目１．１．５の下で上述したように実施した。この膜は、ＣＤ１３３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、カリフォルニア州オーバーン）、Ｂｃｌ−２、ＰＡＲＰ、切断カスパーゼ３、７、９（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、マサチューセッツ州ベバリー）、ＣＤ４４およびβ−アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カリフォルニア州サンタクルーズ）に対して向けられた一次抗体とともに培養した。ＴＢＳ−Ｔを用いて洗浄した後、この膜はマウスまたはウサギのＩｇＧいずれかに対する二次抗体とともに培養し、そのシグナルはＥＣＬとウエスタンブロッティングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）とを用いて可視化した。
【０１８６】
５．１．６ 半定量的ＲＴ−ＰＣＲ−全ＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して製造業者のプロトコルにしたがって単離した。ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴのための第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して合成し、ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて実施した。ＣＤ１３３のＲＴ−ＰＣＲのためのプライマー配列およびＰＣＲ条件は、以前に記載した。ｍＲＮＡの量は、ＧＡＰＤＨに比して定量した。
【０１８７】
５．１．７ 細胞凝集塊形成アッセイ−細胞凝集塊形成アッセイは、以前の試験（Ｆｏｌｋｉｎｓ Ｃ、ｐ３５６０）から修正したプロトコルを用いて実施した。手短には、細胞を最初にトリプシン化し、１×ＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ Ｆ１２培地中に再懸濁させた。２００個の細胞をポリＨＥＭＡでプレコートされた２４ウエルプレート（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）の各ウエル内に加えた。細胞は、４μｇ／ｍＬのインスリン（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、および２０ｎｇ／ｍＬの塩基性ＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）が補給されたＤＭＥＭ／Ｆ１２ ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）中で増殖させた。上記の上清を備える新鮮な培地を毎日加えた。γ−Ｔ３を指示した時点に加え、アッセイ第１４日または処理終了時に細胞凝集塊数を計数した。各実験は３回繰返し、各データポイントは平均値および標準偏差を示した。
【０１８８】
５．１．８ フローサイトメトリー−ＣＤ４４陽性細胞のフローサイトメトリー分析は、当技術分野において公知の方法を用いて実施した。手短には、細胞は２％ ＦＢＳを含有するＰＢＳ中でＰＥ−コンジュゲート化抗ヒトＣＤ４４抗体とともに培養した。
アイソタイプ適合マウス免疫グロブリンをコントロールとして機能させた。次にサンプルを、ＦＡＣＳ ＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国カリフォルニア州サンノゼ）を用いて分析した。
【０１８９】
５．１．９ 同所性ＰＣ−３異種移植片モデル−同所性モデルは、当技術分野において公知の方法を用いて確立した。手短には、８週齢ＣＢ−１７ ＳＣＩＤマウスを安楽死させ、解剖顕微鏡下に配置した（Ｏｌｙｍｐｕｓ社、日本国東京）。腹部性中線での切開を実施し、膀胱基部で背側前立腺を曝露させた。２４時間にわたるγ−Ｔ３処理を行った、または行わない等量の生存性ＰＣ３−Ｌｕｃ細胞（５μＬの無血清ＲＰＭＩ中に再懸濁させた２．６×１０^４個）をマウスの背側前立腺に注射した。臓器を置換し、腹部を閉鎖した。細胞の生物発光シグナルを検出するために、マウスを安楽死させ、次に８０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリン溶液（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ニュージャージー州クランベリー）をｉ．ｐ．によって注射した。シグナルは、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ １００シリーズイメージングシステムによって捕捉した。腫瘍の進行は、腫瘍移植６週間後まで２週間毎に生物発光シグナル（光子数／秒／単位面積）を測定することによって監視した。マウスは頸椎脱臼によって致死させ、腫瘍を採取し、１０％ホルマリン中で固定した。全ての外科手技および動物取扱方法は、香港大学の教育および研究における生きた動物の使用に関する委員会の指針に従って実施した。
【０１９０】
５．２．結果−γ−Ｔ３がＣＳＣマーカー発現に及ぼす作用−γ−Ｔ３がＣＳＣ特性に影響を及ぼすかどうかを試験するために、他の細胞系の中でも最高パーセンテージのＣＳＣ（ＰＣａ幹細胞発癌遺伝子）を含有すると報告されているＰＣ−３細胞系における前立腺ＣＳＣマーカーの発現にγ−Ｔ３が及ぼす作用を最初に調査した。ＰＣ−３細胞は、最初に２４、４８および７２時間にわたって用量を増加させながらγ−Ｔ３（０、２．５および５μｇ／ｍＬ）を用いて処理した。処理後、２つの確立された前立腺ＣＳＣマーカーであるＣＤ４４およびＣＤ１３３の発現は、ウエスタンブロッティングによって試験した。図１Ａに示したように、ＣＤ４４のタンパク質発現は、時間および用量依存性でγ−Ｔ３処理後に有意にダウンレギュレートされた。ＣＤ１３３でも類似の作用が観察され、これはγ−Ｔ３処理がＣＳＣ集団を標的とすることができることを示唆している（図１Ａ）。γ−Ｔ３がＣＳＣマーカーの発現に影響を及ぼすかどうかを確認するために、γ−Ｔ３処理後のＰＣ−３細胞内のＣＤ４４^＋集団の変化をフローサイトメトリーによって試験した。２４時間にわたるγ−Ｔ３処理（５μｇ／ｍＬ）後に、ＣＤ４４^＋ ＰＣ−３細胞の集団を、未処理コントロール（図１Ｂ）と比較して減少することが見いだされ、これはウエスタンブロッティングの結果と一致している。
【０１９１】
ＣＤ４４およびＣＤ１３３における変化が遺伝子転写の減少に起因するかどうかを試験するために、２．５および５μｇ／ｍＬのγ−Ｔ３を用いて処理したＰＣ−３細胞内のＣＤ４４およびＣＤ１３３のｍＲＮＡ濃度を、ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。図１Ｃに示したように、ＣＤ１３３ ｍＲＮＡの減少は、４８および７２時間にわたって２．５および５μｇ／ｍＬのγ−Ｔ３で処理された細胞内で観察された。ＣＤ４４ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションは、７２時間にわたりγ−Ｔ３で処理された細胞内でも観察された。これらの結果は、γ−Ｔ３が転写レベルでのＣＤ４４およびＣＤ１３３発現を抑制できることを示した。興味深いことに、γ−Ｔ３によるＣＳＣマーカーのダウンレギュレーションは、アポトーシスの誘導の結果ではないが、それは生存性アッセイ（図１Ｄ）ならびに共通のアポトーシスマーカーのウエスタンブロッティング（図１Ｅ）はどちらもアポトーシスの劇的な誘導を検出できなかったからである。
【０１９２】
γ−Ｔ３は、非接着性培養条件下でＰＣ−３のプロスタスフェア形成を阻害する−非接着性培養中でプロスタスフェアを形成する能力は、前立腺癌幹細胞の特性の１つである。γ−Ｔ３が前立腺ＣＳＣに及ぼす作用をさらに試験するために、ＰＣ−３細胞のプロスタスフェアをγ−Ｔ３の存在下または非存在下で試験した。これは、細胞を表面接着から防止するポリＨＥＭＡプレコーティングプレート内へＰＣ−３細胞をプレーティングすることによって実施した。細胞は、γ−Ｔ３（５μｇ／ｍＬ）を用いて、または用いずに血清置換培地中で増殖させた。図２Ａに示したように、細胞を１０日間にわたり培養した後に、１ウエルにつき平均２１個のプロスタスフェアが未処理群において見いだされた。しかし、γ−Ｔ３で処理された全ウエル内でプロスタスフェアは観察できなかった（図２ＡおよびＢ）。これらの結果は、γ−Ｔ３が前立腺癌細胞のプロスタスフェア形成を効果的に阻害できることを示している。
【０１９３】
γ−Ｔ３は、他の癌細胞系においてＣＳＣ特性を抑制する−上記の実験からの結果は、γ−Ｔ３がアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞系ＰＣ−３においてＣＤ４４^＋ ＣＤ１３３^＋癌幹細胞様細胞を標的とすることができることを示唆した。しかし、この抑制性作用は、一般的作用よりむしろＰＣ−３細胞にのみ特異的であると考えられる。この抑制作用は、他の癌細胞系を用いて実験を繰り返すように促す。ＤＵ１４５はＣＳＣ特性を有することが証明されているまた別の前立腺癌細胞系であり、図３Ａに示したように、細胞生存性に最小の作用を有する用量のγ−Ｔ３処理もまた時間および用量依存性でＣＤ４４発現の抑制もまた生じさせる。一方、ＤＵ１４５の細胞凝集塊形成能力は、γ−Ｔ３処理によってほぼ完全に抑制された（図３Ｄ）。類似の作用は膀胱癌細胞系（ＭＧＨ−Ｕ１）においても観察され（図３Ｂ、ＣおよびＥ）、これは観察されたγ−Ｔ３がＣＳＣに及ぼす作用は前立腺癌に制限されないことを示唆した。
【０１９４】
γ−Ｔ３は、生体内での前立腺癌細胞の腫瘍原性を有意に減少させる−ＣＳＣは癌の開始において重要な役割を果たすと示唆されているので、γ−Ｔ３処理はＰＣ−３細胞の腫瘍形成能力を阻害できることが考えられる。この仮説を試験するために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を構成的に発現するＰＣ−３細胞（ＰＣ−３−Ｌｕｃ）を最初に５μｇ／ｍＬのγ−Ｔ３または溶剤を用いて２４時間にわたり前処理した。引き続いて処理群およびコントロール群からの同等数の生存性ＰＣ−３−Ｌｕｃ細胞をＳＣＩＤマウスに同所性で注射し、腫瘍形成をライブ生物発光の画像化によって監視した。図４に示したように、移植の２週間後には、溶剤処理したＰＣ−３−Ｌｕｃを移植した全７匹のマウスが腫瘍を発生した。しかし、ＰＣ−３−Ｌｕｃで前処理されたγ−Ｔ３が移植されたマウスの半数以上（７匹中５匹）は、可視腫瘍を発生できなかった（図４）。腫瘍開始速度の有意な減少は、γ−Ｔ３が高度に進行性のＰＣ−３細胞の腫瘍原性能力を減少させられることを示しており、これはγ−Ｔ３処理後のＣＳＣ集団の減少に起因する可能性が高い。
【０１９５】
γ−Ｔ３は化学療法薬耐性癌幹細胞様細胞を効果的に排除する−γ−Ｔ３が、濃縮されたＣＳＣ集団を含有することが証明されている前形成されたプロスタスフェアも標的とできるかどうかも試験された。プロスタスフェアは、各プロスタスフェアが相当に大きなサイズに達する１４日間にわたり非接着性培養中でＤＵ１４５を増殖させることによって形成した。予想されたように、これらのプロスタスフェアは、ドセタキセルなどの化学療法薬に対して高度に耐性であった（図５Ａ）。ＤＵ１４５細胞においてアポトーシスを誘導することが公知である４０ｎｇ／ｍＬの用量では、ドセタキセルはプロスタスフェアに何らかの観察可能な作用を誘導することができなかったが、これはＣＳＣが濃縮された細胞はドセタキセルに対して高度に耐性であることを示唆している。しかし、７０％および７６％の細胞凝集塊数の減少は、細胞凝集塊が１０μｇ／ｍＬおよび２０μｇ／ｍＬのγ−Ｔ３で処理された場合に観察された（図５Ａ）。細胞凝集塊数の減少に加えて、γ−Ｔ３処理はさらに細胞凝集塊のサイズを減少させ、ならびに細胞凝集塊の形状をより拡大した構造へ変化させた（図５Ｂ）。
【０１９６】
５．３ 本明細書では、γ−Ｔ３によるＣＳＣマーカーのダウンレギュレーションならびにプロスタスフェアおよび腫瘍形成の抑制によって証明されたように、γ−Ｔ３が抗ＣＳＣ作用を有することが初めて証明された。前立腺内の推定癌幹細胞は２００５年に初めて同定され、このとき前立腺内の推定癌幹細胞がＣＤ４４^＋／ａｌｐｈａ２ｂｅｔａ１ｈｉ／ＣＤ１３３^＋表面マーカーを発現することが見いだされた。これらの癌開始細胞は、さらにまた確立されたアンドロゲン依存性細胞系ＬＮＣａＰおよびアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞系ＤＵ１４５においても同定されている。
【０１９７】
本明細書では、ＰＣ−３細胞内で発現したＣＳＣマーカーであるＣＤ４４およびＣＤ１３３はどちらもγ−Ｔ３処理によってダウンレギュレートされることが証明された（図１）。さらに、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞系ＤＵ１４５および膀胱癌細胞系ＭＧＨ−Ｕ１におけるＣＤ４４の有意な減少もまた観察された（図４）。興味深いことに、γ−Ｔ３処理後の細胞アポトーシスにおける細胞生存性の有意な減少または上昇を検出することはできず（図１）、これは本試験で使用されたγ−Ｔ３処理の用量がＣＳＣ集団を標的とすることができるが、非ＣＳＣ細胞のアポトーシスを誘導するためには不十分であることを示している。これはさらに、γ−Ｔ３がＣＳＣに対する特異的作用を有する可能性があることを意味している。
【０１９８】
非接着性無血清条件下でスフェアを形成する能力は、幹細胞の重要な特性である。近年、細胞凝集塊形成アッセイは、推定ＣＳＣを同定および濃縮するための方法として使用された。本明細書で言及した実験では、全３種の悪性細胞系ＰＣ−３、ＤＵ１４５およびＭＧＨ−Ｕ１は非接着性培養中で細胞凝集塊を形成することができたが、これはこれらの細胞系内での癌幹細胞様細胞の存在を示唆した。これらの結果にしたがうと、ＰＣ−３、ＤＵ１４５およびＭＧＨ−Ｕ１各々からの７％、５．４％および１．４％の細胞は、細胞凝集塊を形成することができた。プロスタスフェアにはＣＳＣが濃縮されているので（各々ＰＣ−３およびＤＵ１４５スフェア中の６．２５％および１２．２％のＣＤ１３３^＋、ＣＤ４４^＋細胞）、γ−Ｔ３がプロスタスフェア形成に及ぼす阻害作用は、γ−Ｔ３が前立腺癌幹細胞様細胞を生体外で標的とする、または排除する際の強力な薬剤である可能性を指示している（図５）。類似の作用はＭＧＨ−Ｕ１細胞でも観察されたが、この場合、γ−Ｔ３処理は細胞凝集塊形成において１００％阻害を生じさせた（図３Ｅ）。膀胱内の推定癌幹細胞は未だ同定されていないが、γ−Ｔ３のＭＧＨ−Ｕ１の幹細胞特性に向かう抑制細胞は、γ−Ｔ３の抗ＣＳＣ作用が前立腺癌に制限されないことを示唆している。これは、γ−Ｔ３が膀胱癌細胞におけるＣＤ４４発現もまたダウンレギュレートできるという所見によって裏付けられている。
【０１９９】
ＣＳＣが連続移植可能な腫瘍を生体内で生成する能力は、それらが腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）である可能性が高いことを示唆している。この仮説は、単離されたＣＳＣ集団が、免疫不全マウスに注射された場合に非ＣＳＣ対応物より高度に腫瘍原性であるという事実によって支持される。本明細書に開示したように、ＰＣ−３細胞がγ−Ｔ３で前処理された場合は、腫瘍原性能力の急激な減少が観察される（図４）。全γ−Ｔ３前処理ＰＣ−３が最終的には検出可能な腫瘍を発生できると言う事実（データは示していない）にもかかわらず、初期腫瘍開始期での検出可能な腫瘍の劇的な減少および腫瘍形成の遅延は、γ−Ｔ３が前立腺ＣＳＣを標的とする際に高効力であるという本発明者らの仮説を支持している。
【０２００】
ＣＳＣの存在は、化学耐性の一因となることが示唆されている。前立腺癌細胞は、一般に、一般的化学療法薬に対して高度に耐性である。ドセタキセルは、患者生存率を有意に向上させることを証明した唯一の有効な化学療法薬を表している。ＤＵ１４５に対するドセタキセルのＩＣ_９０用量は、１．０１ｎｇ／ｍＬである。しかし本試験では、４０ｎｇ／ｍＬのドセタキセルを用いたプロスタスフェアの処理はプロスタスフェア数の有意な減少を誘導できなかったが、これはＣＳＣが化学療法薬治療に対して耐性であることをさらに確証している。他方では、γ−Ｔ３は、プロスタスフェアの解離と関連しているプロスタスフェア数の劇的な減少を誘導することができなかった（図５）。この根拠は、抗ＣＳＣ作用がγ−Ｔ３の化学増感作用の主な原因となりえることを強く示唆している。これらを要約すると、γ−Ｔ３処理が前立腺ＣＳＣマーカーの発現をダウンレギュレートするだけではなく、ＣＳＣ特性も効果的に阻害することが証明された。
【０２０１】
図６（Ａ）に示した結果は、ＡＫＴの発現が低用量（すなわち、０〜約５μｇ／ｍＬまたは約２．５μｇ／ｍＬまたは約５μｇ／ｍＬ）のγ−トコトリエノールを用いてダウンレギュレートされることを示しており、これはＡＫＴシグナリング経路の脱活性化を示唆した。前述のように、解離した前立腺細胞内での構成的に活性なＡＫＴのレンチウイルス媒介性発現により、明白な癌腫へ進行する前立腺上皮内腫瘍病変を含有する前立腺小管が再生した。
【０２０２】
図６（Ｂ）に示した結果は、Ｏｃｔ３／４およびＮｅｓｔｉｎの発現が低用量（すなわち、０〜約５μｇ／ｍＬまたは約２．５μｇ／ｍＬまたは約５μｇ／ｍＬ）のγ−トコトリエノールを用いてアップレギュレートされることを示しており、これは幹細胞表現型の活性化（多分化能の獲得）を示唆した。一般に、これら２つの遺伝子は密接に調節されるが、過剰または過少は細胞の分化を実際に誘発するからである。
【０２０３】
６．前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）の形成の予防
【０２０４】
実験のためには、以前に公表された５週齢の前立腺癌マウスモデル（Ｇａｂｒｉｌ，Ｍ．Ｙ．，Ｄｕａｎ，Ｗ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００５），ｖｏｌ．１１，ｎｏ．３，ｐ．３４８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９５），ｖｏｌ．９２，ｐｐ．３４３９−３４４３；Ｄｕａｎ，Ｗ．，Ｇａｂｒｉｌ，Ｍ．Ｙ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００５）２４，１５１０−１５２４；Ｗａｎｇ Ｓ，Ｇａｏ Ｊら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．，２００３，ｖｏｌ．４，ｎｏ．３，ｐｐ．２０９−２１；Ｇａｂｒｉｌ，Ｍ．Ｙ．，Ｏｎｉｔａ，Ｔ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２００２，ｖｏｌ．９，ｎｏ．２３，ｐｐ．１５８９−９９）を使用した。全動物実験は、動物実験委員会によって承認された標準プロトコルにしたがって実施した。遺伝子型決定法はＰＳＰ−ＴＧＭＡＰにおいて実施し、ＫＩＭＡＰマウスは以前に報告されたように迅速ＰＣＲ遺伝子型決定法によって同定した（項目６の下で言及した参考文献を参照されたい）。
【０２０５】
１つの典型的な実験では、動物には経口投与を介して３０週間にわたり１ｍｇ／日のγ−トコトリエノールを与えた。１０、２０および３０週間の終了時に、動物を致死させた。男性付属腺、すなわち腹葉および背側前立腺葉と一緒に前立腺、および凝固腺を前立腺腫瘍発生、前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）発生および微小浸潤の組織病理学的特性解析のために個別に解剖した。
【０２０６】
ＡＢＣキット（ＳｔｒｅｐｔＡＢＣ Ｃｏｍｐｌｅｘキット；ＤＡＫＯ社、カナダ国オンタリオ州ミシサーガ）を用いたＩＨＣについてのプロトコルは、１：５００の希釈率で使用した標準クロモグラニン（Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ）（ポリクローナル抗体、Ｄｉａ Ｓｏｒｉｎ社、米国ミネソタ州スティルウォーター）にしたがって実施した。
【０２０７】
腫瘍発生を試験するために、以前に報告された確立された診断基準にしたがって一部の修正を行った（項目番号６の下に言及した上記の参考文献を参照されたい）。ＣａＰ診断についての臨床標準の不均質性および多病巣性にしたがって、本試験では組織学的な格付けや採点に関するヒトに近い遺伝子組み換えされた（ＧＥ）マウスの標準システムを立証した。観察された腺癌の構造的パターンは、５種の異なるＧＥ組織学的悪性度によって評価した：ＧＥ−悪性度１（超高分化）、明確な境界をもち、緻密に充填された、単独の、個別の一様な腺；ＧＥ−悪性度２（高分化）、不規則な辺縁をもち、ゆるく充填された、単独の、個別の一様な腺；ＧＥ−悪性度３（変動性の変形した構造を備える腺）、単独の、個別の、一様に散在性の腺および平滑な限局性の乳頭／篩状塊；ＧＥ−悪性度４（低分化）、不規則な、侵襲性辺縁および融合腺を備える篩状の塊；ＧＥ−悪性度５、非腺状個体、細胞の丸みを帯びた塊、中心壊死の病巣を備える篩状の塊（コメド癌として公知）および非分化低分化癌。最も広汎性のＧＥ組織学的悪性度（「一次パターン／悪性度」）および第２の広汎性ＧＥ組織学的パターン（「二次パターン／悪性度」）に基づくと、新規のＧＥ採点システムは、一次パターンＧＥ悪性度数を二次ＧＥ悪性度数に加えることによって得られた。本試験を通して１つのパターンしか所見されなかった場合は、点数は悪性度数を２倍にすることによって得られた。図８に示したように、γ−もしくはδ−トコトリエノールまたはγ−およびδ−トコトリエノールの混合物を含む組成物が与えられたマウスはＰＩＮを発生しなかった。
【図１Ａ−Ｃ】

【図１Ｄ−Ｅ】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む組成物を投与する工程によって癌を予防する、または癌治療を受けた後の癌の再発を予防する方法であって、前記癌は黒色腫、前立腺癌、前立腺上皮内腫瘍、大腸癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌および肺癌からなる群より選択される、方法。
【請求項２】
前記癌治療は、手術、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、分化誘導薬、および前記の治療または療法の組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌は、前立腺癌である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物は、γ−トコトリエノールおよび／またはδ−トコトリエノールの濃縮調製物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物は、前記組成物の総重量％に基づいて、１０重量％のγ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールまたはγ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールの混合物を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物は、γ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールを１：Ｙの比率で含み、Ｙは１０未満である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物は、α−トコトリエノールおよび／またはβ−トコトリエノールおよび／またはα−トコフェロールをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物は、成体体重６０ｋｇにつき約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇの総トコトリエノール重量％含量、または成体体重６０ｋｇにつき約１０ｍｇ〜約５００ｍｇの総トコトリエノール重量％含量で投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物は、動物の血液中で各個別トコトリエノール異性体について、約０．１〜３０ｍｇ／Ｌまたは約１０〜３０ｍｇ／Ｌの血清濃度が得られる量で投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記動物は、哺乳動物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物は、ヒト、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ウシ、イヌおよびネコからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物は、液状天然油、水溶性エマルジョン、冷水分散性粉末、およびビーズレット（ｂｅａｄｌｅｔｓ）として調製される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物は、錠剤、ゲル、糖衣錠、徐放性調製物、軟膏、もしくは注射用調製物として、またはカプセル化形で投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物は、経口で、または皮内、皮下、もしくは腹腔内に投与される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物は、緑茶ポリフェノール、有機硫黄化合物、トラメテス・ベルシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｏｌｏｒ）またはコリオラス・ベルシカラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）から単離したタンパク質結合多糖類、赤色カルテノイド色素および上記の物質の組み合わせからなる群より選択される１つの物質をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記緑茶ポリフェノールは、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、没食子酸（ＥＣＧ）および没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記有機硫黄化合物は、ニンニク由来Ｓ−アリルメルカプトシステインおよびニンニク由来アリシンからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質結合多糖類は、多糖−Ｋ（クレスチン、ＰＳＫ）または多糖ペプチド（ＰＳＰ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記赤色カルテノイド色素は、リコピンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つ、および５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−３−フェニルイソセリン，Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，１３−エステル（ドセタキセル）および／または（５Ｚ）−５−（ジメチルアミノヒドラジニリデン）イミダゾール−４−カルボキサミド（ダカルバジン）を含む組成物。
【請求項２１】
γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む組成物を、５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル−３−フェニルイソセリン，１３−エステル（ドセタキセル）および／または（５Ｚ）−５−（ジメチルアミノヒドラジニリデン）イミダゾール−４−カルボキサミド（ダカルバジン）と共に投与することによって、癌を阻害または後退させる方法。
【請求項２２】
前記癌は、黒色腫、前立腺癌、大腸癌、肝臓癌、前立腺上皮内腫瘍、膀胱癌、乳癌および肺癌からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物は、５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル−３−フェニルイソセリン，１３−エステル（ドセタキセル）および／または（５Ｚ）−５−（ジメチルアミノヒドラジニリデン）イミダゾール−４−カルボキサミド（ダカルバジン）と共に、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む、黒色腫を阻害または後退させるための請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物は、５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル−３−フェニルイソセリン，１３−エステル（ドセタキセル）と共に、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む、前立腺癌を阻害または後退させるための請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物は、５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル−３−フェニルイソセリン，１３−エステル（ドセタキセル）と共にγ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む、乳癌を阻害または後退させるための、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物は、γ−トコトリエノールおよび／またはδ−トコトリエノールの濃縮調製物である、請求項２０に記載の組成物または請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物は、前記組成物の総重量％に基づいて１０重量％超のγ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールまたはγ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールの混合物を含む、請求項２０もしくは２６の組成物または請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物は、γ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールを１：Ｙの比率で含み、Ｙは１０未満である、請求項２０もしくは請求項２６〜２７の記載の組成物または請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物は、α−トコトリエノールおよび／またはβ−トコトリエノールおよび／またはα−トコフェロールをさらに含む、請求項２０もしくは請求項２６〜２８に記載の組成物または請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物は、緑茶ポリフェノール、有機硫黄化合物、タンパク質結合多糖類、トラメテス・ベルシカラーもしくはコリオラス・ベルシカラーから単離した多糖ペプチド、赤色カルテノイド色素ならびに上記の物質の組み合わせからなる群より選択される１つの物質をさらに含む、請求項２０もしくは２６〜２９に記載の組成物または請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物は、成体体重６０ｋｇにつき、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇの総トコトリエノール重量％含量、または成体体重６０ｋｇにつき約１０ｍｇ〜約５００ｍｇの総トコトリエノール重量％含量で投与される、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物は、動物の血液中で各個別トコトリエノール異性体について約０．１〜３０ｍｇ／Ｌまたは約１０〜３０ｍｇ／Ｌの血清濃度が得られる量で投与される、請求項２１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記動物は、哺乳動物である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物は、ヒト、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ウシ、イヌおよびネコからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物は、水可溶化形で投与される、請求項２１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物は、錠剤、ゲル、糖衣錠、徐放性調製物、軟膏、もしくは注射用調製物としての形態で、またはカプセル化形で投与される、請求項２１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物は、皮内、皮下、もしくは腹腔内に、または経口で投与される、請求項２１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
動物体において癌を予防する、または癌治療を受けた後に動物体内での癌の再発を予防するための医薬品を製造するためのγ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを含む組成物の使用であって、前記癌は、黒色腫、前立腺癌、大腸癌、肝臓癌、前立腺上皮内腫瘍、膀胱癌、乳癌および肺癌からなる群より選択される、使用。
【請求項３９】
癌を治療するための医薬品を製造するための、５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−３−フェニルイソセリン，Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，１３−エステル（ドセタキセル）および／または（５Ｚ）−５−（ジメチルアミノヒドラジニリデン）イミダゾール−４−カルボキサミド（ダカルバジン）と共に、γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールをのうちの少なくとも１つを含む、組成物の使用。
【請求項４０】
γ−トコトリエノールもしくはδ−トコトリエノールのうちの少なくとも１つを、５，２０−エポキシ−１，２，４，７，１０，１３−ヘキサヒドロキシタキス−１１−エン−９−オン−４−アセテート−２−ベンゾアート三水和物を含む（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−カルボキシ−３−フェニルイソセリン，Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル，１３−エステル（ドセタキセル）および／または（５Ｚ）−５−（ジメチルアミノヒドラジニリデン）イミダゾール−４−カルボキサミド（ダカルバジン）と混合する工程を含む、請求項２０に記載の組成物を製造する方法。

【図２】

【図３Ａ−Ｂ】

【図３Ｃ−Ｄ】

【図３Ｅ】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０Ａ１】

【図１０Ａ２】

【図１０Ａ３】

【図１０Ａ４】

【図１０Ａ５Ａ−Ｂ】

【図１０Ｃ】

【図１１】

【図１２】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１４Ｃ】

【図１５Ａ−Ｂ】

【図１５Ｃ】

【図１５Ｄ】

【図１６】

【図１７Ａ−Ｂ】

【図１７Ｃ−Ｄ】

【図１８Ａ−Ｂ】

【図１８Ｃ−Ｄ】

【図１９Ａ】

【図１９Ｂ】

【図２０Ａ−Ｂ】

【図２０Ｃ−Ｄ】

【図２０Ｅ】

【図２０Ｆ】

【図２１Ａ】

【図２１Ｂ】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６Ａ】

【図２６Ｂ】

【図２６Ｃ】

【図２７Ａ−Ｂ】

【図２７Ｃ】

【図２８Ａ】

【図２８Ｂ−Ｃ】

【図２９Ａ１】

【図２９Ａ２−３】

【図２９Ａ４】

【図２９Ｂ１】

【図２９Ｂ２−３】

【図２９Ｂ４】

【図３０】

【図３１】

【図３２Ａ】

【図３２Ｂ】

【公表番号】特表２０１２−５０６４２６（Ｐ２０１２−５０６４２６Ａ）
【公表日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３３１４２（Ｐ２０１１−５３３１４２）
【出願日】平成２１年１０月２０日（２００９．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００９／０００３９０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４７６６３
【国際公開日】平成２２年４月２９日（２０１０．４．２９）
【出願人】（５１０２９９３８５）ダボス　ライフ　サイエンス　ピーティーイー．　リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】