癌腫の診断
【課題】悪性症状（例えば癌腫）の検出および治療のための改良型診断マーカーおよび治療用標的を提供する。
【解決手段】可溶性および細胞表面形態のＨＥ４ａポリペプチドは、例えば卵巣癌において過剰発現される、ＨＥ４ａをコードする核酸配列。ならびにこのような被験体からの試料中の可溶性および／または細胞表面形態で天然に存在する分子とのＨＥ４ａポリペプチドに特異的な抗体の反応性を検出する方法。ＨＥ４ａヌクレオチド配列を用いたハイブリダイゼーションスクリーニングにより、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法。
【解決手段】可溶性および細胞表面形態のＨＥ４ａポリペプチドは、例えば卵巣癌において過剰発現される、ＨＥ４ａをコードする核酸配列。ならびにこのような被験体からの試料中の可溶性および／または細胞表面形態で天然に存在する分子とのＨＥ４ａポリペプチドに特異的な抗体の反応性を検出する方法。ＨＥ４ａヌクレオチド配列を用いたハイブリダイゼーションスクリーニングにより、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、悪性症状（例えば癌）に、特にある種の癌腫（例えば卵巣癌）を診断するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌は、広範な疾患を包含しており、世界中で４人に約１人が罹患している。癌の悪影響の重症度は顕著であり、医療政策および手法に、ならびに一般的に社会に影響を及ぼす。多くの種類の癌の特質は悪性細胞の急速かつ非調節性増殖であるため、癌へのアプローチ改善に際しての中心となる問題は、早期の検出および診断の必要性である。悪性症状の存在を診断するための正確で、信頼できる判定基準を開発するために、多数の試みがなされてきた。特に、癌細胞により独自に発現されるかまたは悪性症状を有する被験体において顕著に高レベルで存在する腫瘍関連抗原として周知である血清学的に限定された抗原性マーカーの使用に向けて努力がなされてきた。
【０００３】
しかしながら腫瘍関連抗原発現の高不均質性、例えば癌抗原の極端な多様性のために、癌診断に有用である付加的な腫瘍マーカーが必要である。癌関連抗原と反応性の多数のモノクローナル抗体が周知である（例えばＰａｐｓｉｄｅｒｏ，１９８５ Ｓｅｍｉｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１：１７１，Ａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｓｕｒｇ．Ａｎｎ．１８：４１参照）。これらのそしてその他のに記載されたモノクローナル抗体は、種々の異なる癌関連抗原、例えば糖タンパク質、糖脂質およびムチンと結合する（例えばＦｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．９：１２１；米国特許第４，７３７，５７９号；米国特許第４，７５３，８９４号；米国特許第４，５７９，８２７号；米国特許第４，７１３，３５２号参照）。多数のこのようなモノクローナル抗体は、所定の細胞系列または組織型から生じるある腫瘍上では制限発現を示すが、他の腫瘍では示さない腫瘍関連抗原を認識する。
【０００４】
特定の種類の悪性疾患を同定するために有用であるようである腫瘍関連抗原の例は相対的にほんのわずかである。例えばモノクローナル抗体Ｂ７２．３は、多数の異なる癌、例えばすべてでないがほとんどの卵巣癌および圧倒的大多数の非小細胞肺癌、結腸癌および乳癌で選択的に発現される高分子量（>１０６Ｄａ）腫瘍関連ムチン抗原と特異的に結合する（例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ，１９８７ Ａｃｔａ Ｃｙｔｏｌ．１：５３７；米国特許第４，６１２，２８２号参照）。それにもかかわらず、腫瘍の外科的切除後に細胞関連腫瘍マーカー、例えばＢ７２．３により認識されるムチン抗原は、実質的腫瘍塊の蓄積前の悪性症状の早期検出が好ましい診断スクリーニングに対する限定的有用性を有し得る。
【０００５】
侵襲性外科手術が通常は蓄積腫瘍塊の検出後にのみ示される腫瘍関連抗原に関する外科的切除検体をスクリーニングすることによる特定種類の癌の診断に代わるものは、非侵襲性または最小侵襲性手法により被験体から得られる試料中のこのような抗原を検出するための組成物および方法を提供することである。例えば卵巣およびその他の癌腫においては、一般に、容易に得られる生物学的流体（例えば血清または粘膜分泌物）の試料中で検出可能である多数の可溶性腫瘍関連抗原が存在する。このようなマーカーのひとつは、血流中にも流出される癌関連抗原であるＣＡ１２５であり、この場合それは血清中で検出可能である（例えばＢａｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９：８８３；Ｌｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ．７１：８４２）。血清およびその他の生物学的流体中のＣＡ１２５レベルは、卵巣およびその他の癌腫の診断および／または予後プロフィールを提供しようと努力して、他のマーカー、例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、扁平上皮細胞癌抗原（ＳＣＣ）、組織ポリペプチド特異的抗原（ＴＰＳ）、シアリルＴＮムチン（ＳＴＮ）および胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＰＬＡＰ）のレベルと一緒に測定されてきた（例えばＳａｒａｎｄａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ．３６：７５５；Ｓａｒａｎｄａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１９：７３；Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１７ （４Ｂ）：２９４５；Ｋｕｄｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｉｎｖｅｓｔ．４７：５２；Ｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．１０４：１０２４；Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．１０５：１１３６；Ｃｉｏｆｆｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｔｕｍｏｒｉ ８３：５９４；Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１７ （４Ｂ）：２９４９；Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１７ （４Ｂ）：３０１９）。
【０００６】
しかしながら血清ＣＡ１２５の、単独でのまたはその他の周知の指示薬と組合せた、レベル増大は、悪性疾患の、または特定の悪性疾患（例えば卵巣癌）の限定的診断を提供しない。例えば膣液および血清中のＣＡ１２５、ＣＥＡおよびＳＣＣ増大は、子宮頸部癌および生殖路癌と比較して、良性婦人科学的疾患においてもっとも強く炎症と相関する（例えばＭｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．６：１８２；Ｓａｒａｎｄａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ．３６：７５５）。別の実施例として、血清ＣＡ１２５増大は、神経芽細胞腫にも随伴し得る（例えばＨｉｒｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｓｕｒｇ．Ｔｏｄａｙ ２８：３４９）が、ＣＥＡおよびＳＣＣ増大はとりわけ、結腸直腸癌に随伴し得る（Ｇｅｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１７ （４Ｂ）：２９３９）。別のマーカーである分化抗原メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）は正常中皮細胞の表面で発現され、ある種の癌細胞、例えば上皮性卵巣腫瘍および中皮種でも発現される。メソテリンに関する組成物および方法（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５２：１８１；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ．５０：３７３；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ．５１：５４８；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３６；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６６９；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：８０５；Ｋｏｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１９８４）、ならびに構造的に関連するメソテリン関連抗原（ＭＲＡ；例えばＳｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１１５３１参照）が当該技術分野で周知であり、例としては、ＷＯ００／５０９００に、ならびに米国特許出願０９／５１３，５９７号に記載されたような癌の検出および療法における使用が挙げられる。したがって、用いられるべき付加的マーカー、例えば多因子診断スクリーニングに有用なマーカーがぜひとも必要であることは明らかである（例えばＳａｒａｎｄａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｋｕｄｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７参照）。
【０００７】
以下でさらに詳細に記載されるように、このような付加的マーカーは、多様な機能を有する小型の酸−および熱安定性分子の異種の群を含み、ヒト精巣上体４−ジスルフィドコアタンパク質または「ＨＥ４」を含むタンパク質の「４−ジスルフィドコア」ファミリー内から有用に提供され得た（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．４５：３５０−３５７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｇｅｎｅ ２２９：１０１；Ｓｃｈｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｇｅｎｅ ２３８：３７５）。４−ジスルフィドコアファミリー成員ポリペプチドのアミノ酸配列中の８つのコアシステイン残基の保存スペーシングは、緊密な、安定した構造へのこれらの分子のフォールディングを指図すると考えられる。４−ジスルフィドコアファミリーの成員の多くは、プロテアーゼ阻害剤である．しかしながらいくつかのファミリー成員、例えばＨＥ４に関しては、機能は未だ限定的に確認されてはいない。４−ジスルフィドコアファミリーのタンパク質のその他の成員としては、Ｗｐ−タンパク質、例えばＳＬＰ−１、およびｐｓ２０が挙げられ、そして４−ジスルフィドコアファミリーのタンパク質の付加的成員がいくつかの種から単離されている。これらのタンパク質は、４−ジスルフィドコアにより安定化されるいくつかの特性、例えばそれらのサイズが小さいこと、ならびにそれらの熱−および酸安定性構造を共有する。これらのタンパク質は分泌細胞により作られ、粘膜分泌物、例えば精漿、乳汁、耳下腺および子宮頸部分泌物中に見出される。
【０００８】
４−ジスルフィドコアファミリーの原型分子であるＷｐ−タンパク質は乳漿リンタンパク質としても周知であり、クローン化されている（Ｄａｎｄｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：３９８７−３９９１）。乳漿リンタンパク質は、約１〜２ｍｇ／ｍｌで乳汁中で発現されるが、遺伝子が過メチル化される乳癌によっては発現されない。プロテアーゼに対する阻害活性は、乳漿リンタンパク質に関しては見出されていない。しかしながらトランスジェニック動物中の遺伝子の過剰発現は、哺乳動物肺胞細胞の発達を減損し（Ｂｕｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９１ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ Ｄｅｖ．３６：６７−７４）、このことは、乳汁分泌中のこのタンパク質に関する重要な役割を示唆する。別の４−ジスルフィドコアファミリータンパク質である分泌白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰ−１）はヒト子宮頸部からクローン化されたが、他の粘膜分泌物、例えば精漿および耳下腺分泌液中にも存在する（Ｈｅｉｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ，１９８６ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６０：６１−６７）。ＳＬＰ−１は、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼおよびカテプシンＧの強力な阻害剤である１２ｋＤａの二ドメインタンパク質である。キモトリプシンと複合されたＳＬＰ−１の結晶構造が発表されている（Ｇｒｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８８ ＥＭＢＯ Ｊ．７：３４５−３５１）。これらのデータは、ＳＬＰ−１ドメインが独立して働き、同時に異なるプロテアーゼを阻害することを示し、そしてその２つがキモトリプシンと結合するドメイン中の小（８アミノ酸）活性部位を同定した。
【０００９】
エラフィンは、このポリペプチドのアミノ酸配列を確定するためにヒト乾癬皮膚から単離された４−ジスルフィドコアファミリーの単一ドメインタンパク質成員である（Ｗｉｅｄｏｗ ｅｔ ａｌ，１９９０ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４７９１−１４７９５）。エラフィンはエラスターゼの強力な阻害剤であるが、その他のプロテアーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシン、カテプシンＧまたはプラスミンに対する明らかな阻害活性を示さない。エラフィンのアミノ酸配列は、ＳＬＰ−１のＣ末端領域（ドメイン１）と３８％の相同性を示す。ｐｓ２０タンパク質をコードする遺伝子が近年、平滑筋から単離されたが、ｐｓ２０タンパク質は哺乳動物細胞中への遺伝子のトランスフェクションにより発現された（Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４５７４−４５８４）。ｐｓ２０は癌細胞の増殖を抑制することが見出され、そしてｐｓ２０は、増殖阻害剤としても言及されてきた。しかしながら今までのところこのタンパク質に関しては、直接的機能活性、例えばプロテアーゼの抑制は記載されていない。
【００１０】
上記のように、プロテアーゼ阻害活性は、精巣上体上皮細胞で最初に同定されたＨＥ４に関しては同定されていないが、その他の小型酸および熱安定性プロテイナーゼ阻害剤は精漿から特性化されており、精子を結合し、精子と卵の細胞外マトリクスとの相互作用を調節することにより受精能に一役を果たすと考えられた（Ｆｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ，Ｒｅｉｃｈ，Ｅ．，Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．，Ｓｈａｗ，Ｅ．（ｅｄｓ．），１９７５ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．７３７−７６６；Ｓａｌｉｎｇ，１９８９ Ｏｘｆ．Ｒｅｖ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｌ．１１：３３９−３８８）。ＨＥ４ ｃＤＮＡは、ヒト精巣上体から最初に単離され（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．４５：３５０−３５７）、ＨＥ４ ｃＤＮＡは後に、卵巣癌から構築されたｃＤＮＡライブラリー中で高頻度で検出された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｇｅｎｅ ２２９：１０１；Ｓｃｈｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｇｅｎｅ ２３８：３７５）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記の理由のために、明らかに、悪性症状（例えば癌腫）の検出および治療のための改良型診断マーカーおよび治療用標的の必要性が存在する。本発明の組成物および方法は、可溶性形態でおよび／または細胞表面で天然に生じるポリペプチドを検出するためにＨＥ４および／またはＨＥ４関連抗原に特異的な抗体を用いて悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法を提供し、そしてその他の関連利点を提供することにより、従来技術のこれらの限界を克服する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要約
本発明は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングするのに有用な組成物および方法に向けられる。特に本発明は、ＨＥ４ａとして本明細書中で言及されるＨＥ４ポリペプチドの可溶性および細胞表面形態、または可溶性形態で天然に生ずる、そしてＨＥ４ａポリペプチドに特異的である少なくとも１つの抗体と反応性の抗原決定基を有する ＨＥ４ａ分子が被験体からの生物学的試料中に検出され得る、という予期せぬ知見に関する。
【００１３】
本発明の一つの局面は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と被験体からの生物学的試料（被験体からの少なくとも１つの細胞を含む）を接触させることであって、それにより試料中の可溶性形態で天然に存在するかまたは特定の実施形態では細胞表面分子として存在する、少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有する分子の生物学的試料中での存在を確定する、接触させること、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する。実施形態によっては、生物学的試料は、血液、血清、漿液、血漿、リンパ、尿、脳脊髄液、唾液、粘膜分泌物、膣分泌物、腹水、胸水、囲心腔液、腹膜液、腹腔液、培地、ならし培地または灌注液である。
【００１４】
ある種の他の実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドは、配列番号５、７、９または１１のうちのいずれか一つに記述されるアミノ酸配列を有するポリペプチドあるいはその断片または誘導体を含む。別の実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチド改変体はスプライス改変体である。本発明の特定の実施形態では、抗体はポリクローナル抗体を含み、他の実施形態では抗体は親和性精製抗体を含む。特に好ましい実施形態では、抗体はモノクローナル抗体を含む。別の実施形態では、抗体は組換え抗体を含み、別の実施形態では、抗体はキメラ抗体を含む。別の実施形態では、抗体はヒト化抗体を含む。別の実施形態では、抗体は単鎖抗体を含む。
【００１５】
本発明の実施形態によっては、抗体と抗原決定基の結合の検出は、放射性核種の検出を包含する。他の実施形態では、抗体と抗原決定基の結合の検出は、蛍光体の検出を包含する。別の実施形態では、抗体と抗原決定基の結合の検出は、アビジン分子とビオチン分子の間の結合事象の検出を包含し、別の実施形態では、抗体と抗原決定基の結合の検出は、ストレプトアビジン分子とビオチン分子の間の結合事象の検出を包含する。特定の実施形態では、抗体と抗原決定基の結合の検出は、酵素反応の産物の分光光度検出を包含する。本発明の実施形態によっては、上記少なくとも１つの抗体は検出可能に標識され、一方ある種の他の実施形態では、上記少なくとも１つの抗体は検出可能に標識されず、抗体と抗原決定基の結合の検出は間接的である。
【００１６】
本発明の特定の実施形態によると、悪性症状は腺癌、中皮腫、卵巣癌、膵臓癌あるいは非小細胞肺癌であり得る。
【００１７】
本発明の別の局面は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、少なくとも１つの抗体と被験体からの生物学的試料を接触させることであって、それにより（ｉ）試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、ならびに（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の生物学的試料中での存在を確定する、接触させること（この場合、上記試料は被験体からの細胞を含み、上記分子は上記少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有し、その抗原結合部位は、２Ｈ５、３Ｄ８または４Ｈ４であるモノクローナル抗体の免疫特異的結合を競合的に抑制する）、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する方法を提供することである。
【００１８】
本発明の別の局面は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、少なくとも１つの抗体と被験体からの生物学的試料を接触させることであって、それにより（ｉ）試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、ならびに（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の生物学的試料中での存在を確定する、接触させること（この場合、上記試料は被験体からの細胞を含み、上記分子は上記抗体と反応性がある抗原決定基を有し、その抗原結合部位は、モノクローナル抗体３Ｄ８の免疫特異的結合を競合的に抑制する）、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する方法を提供する。
【００１９】
本発明のさらに別の局面は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、少なくとも１つのＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体と被験体からの生物学的試料を接触させることであって、それにより（ｉ）試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、ならびに（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の生物学的試料中での存在を確定する、接触させること（この場合、上記試料は被験体からの細胞を含み、上記分子は上記少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有し、その抗原結合部位は、２Ｈ５、３Ｄ８および４Ｈ４からなる群から選択されるモノクローナル抗体の免疫特異的結合を競合的に抑制し）、上記少なくとも１つの抗原は、ＨＥ４ａ抗原に免疫特異的に結合する、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する方法を提供する。特定の実施形態では、ＨＥ４ａ抗原はモノクローナル抗体３Ｄ８、２Ｈ５または４Ｈ４とも免疫特異的に反応性がある。
【００２０】
別の局面に向けると、本発明は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、少なくとも１つのＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と被験体からの生物学的試料を接触させることであって、それにより（ｉ）試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、ならびに（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の生物学的試料中での存在を確定する、接触させること（この場合、上記試料は被験体からの細胞を含み、上記分子は上記少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有し、その抗原結合部位は、２Ｈ５または４Ｈ４であるモノクローナル抗体の免疫特異的結合を競合的に抑制し、上記少なくとも１つの抗原は、ＨＥ４ａ抗原に免疫特異的に結合する）、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する方法を提供する。特定の実施形態では、メソテリン関連抗原は３Ｄ８とも免疫特異的に反応性がある。
【００２１】
別の局面に向けると、本発明は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、少なくとも１つの固定された第一の抗体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合させ、それにより免疫複合体を形成させるための条件下で、そのために十分な時間、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの固定された第一の抗体と被験体からの生物学的試料を接触させることであって、それにより試料中の可溶性形態で天然に存在する分子の生物学的試料中での存在を確定する、接触させること、上記少なくとも１つの固定された第一の抗体と特異的に結合しない試料の構成成分を除去すること、および上記少なくとも１つの第二の抗体と上記ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドの特異的結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、上記免疫複合体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチド少なくとも１つの第二の抗体と接触させること（この場合、上記少なくとも１つの第二の抗体の抗原結合部位はモノクローナル抗体２Ｈ５の免疫特異的結合を競合的に抑制しない）、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する方法を提供する。
【００２２】
本発明のさらに別の局面は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、少なくとも１つの固定された第一の抗体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合させ、それにより免疫複合体を形成させるための条件下で、そのために十分な時間、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの固定された第一の抗体と被験体からの生物学的試料を接触させることであって、それにより試料中の可溶性形態で天然に存在する分子の生物学的試料中での存在を確定する、接触させること（この場合、上記少なくとも１つの第一の抗体の抗原結合部位はモノクローナル抗体３Ｄ８の免疫特異的結合を競合的に抑制する）、上記少なくとも１つの固定された第一の抗体と特異的に結合しない試料の構成成分を除去すること、および上記少なくとも１つの第二の抗体と上記ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドの特異的結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、上記免疫複合体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチド少なくとも１つの第二の抗体と接触させること（この場合、上記少なくとも１つの第二の抗体の抗原結合部位は、モノクローナル抗体２Ｈ５の免疫特異的結合を競合的に抑制しない）、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する方法を提供する。
【００２３】
本発明の別の局面は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、少なくとも１つの固定された第一の抗体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合させ、それにより免疫複合体を形成させるための条件下で、そのために十分な時間、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの固定された第一の抗体と被験体からの生物学的試料を接触させることであって、それにより試料中の可溶性形態で天然に存在する分子の生物学的試料中での存在を確定する、接触させること（この場合、上記少なくとも１つの第一の抗体の抗原結合部位はモノクローナル抗体３Ｄ８の免疫特異的結合を競合的に抑制する）、上記少なくとも１つの固定された第一の抗体と特異的に結合しない試料の構成成分を除去すること、および上記少なくとも１つの第二の抗体とＨＥ４ａ抗原ポリペプチドの特異的結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、上記免疫複合体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの第二の抗体と接触させること（この場合、上記少なくとも１つの第二の抗体の抗原結合部位はモノクローナル抗体２Ｈ５の免疫特異的結合を競合的に抑制しない）、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する方法を提供する。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明の方法は、悪性症状の少なくとも１つの可溶性マーカーの試料中の存在を確定すること（上記マーカーはメソテリン関連抗原、癌胎児性抗原、ＣＡ１２５、シアリルＴＮ、扁平上皮細胞癌抗原、組織ポリペプチド抗原あるいは胎盤アルカリ性ホスファターゼである）をさらに包含する。
【００２５】
本発明の別の局面は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法を提供することであって、抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、（ｉ）悪性症状を有する疑いのある一次被験体からの一次生物学的試料、ならびに（ｉｉ）悪性症状を有さないことが周知である第二の被験体からの第二の生物学的試料の各々を、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と接触させることであって、それにより（ｉ）試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、および（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の上記一次および第二の生物学的試料の各々における存在を確定する、接触させること（この場合、上記一次および第二の生物学的試料は各々、上記一次および第二の被験体からの細胞をそれぞれ含み、上記分子は、上記少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有する）、および一次生物学的試料中の上記抗体と上記抗原決定基の検出可能な結合を、第二の生物学的試料中の上記抗体と上記抗原決定基の検出可能な結合のレベルと比較すること、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する方法を提供することである。
【００２６】
別の局面において、本発明は被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体の存在を被験体からの生物学的試料中で検出することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）関連抗原ポリペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号１１または配列番号１３のうちのいずれかに記述されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００２７】
別の局面に向けると、本発明はＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル免疫グロブリン可変部を含む、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体であって、配列番号５、配列番号７、配列番号１１または配列番号１３のうちのいずれかに記述されるアミノ酸配列を有する抗体。特定の実施形態では、抗体は融合タンパク質であり、一方ある種の他の実施形態では、抗体は単鎖抗体である。ある種の他の実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドはグリコシル化ポリペプチドをさらに含む。別の実施形態では、抗体は配列番号１１に記述されるＨＥ４ａ抗原ポリペプチド配列と特異的に結合するが、配列番号９に記述されるポリペプチド配列とは特異的に結合せず、あるいは抗体は配列番号１１に記述されるＨＥ４ａ抗体ポリペプチド配列および配列番号９に記述されるポリペプチド配列と特異的に結合する。特定の実施形態において、抗体はモノクローナル抗体２Ｈ５、３Ｄ８または４Ｈ４である。
【００２８】
さらに別の局面において、本発明は被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、試料中での可溶性形態で天然で存在する抗体のＨＥ４ａポリペプチドとの結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、被験体からの生物学的試料を検出可能に標識されたＨＥ４ａポリペプチドと接触させること、およびそれから悪性症状の存在を検出することを含む。
【００２９】
別の局面に目を向けると、本発明は、配列番号５、配列番号７、配列番号１１または配列番号１３に記述されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるＨＥ４ａ抗原ポリペプチドをコードする核酸分子であるか、あるいはＨＥ４ａ抗原ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードし、または中等度ストリンジェント条件下でＨＥ４ａ抗原をコードするこのような核酸分子とハイブリダイズすることが可能な核酸分子である単離核酸分子を提供するが、この場合、単離核酸分子は、配列番号９に記述されるヌクレオチド配列からなる核酸分子ではない。特定の実施形態では、本発明は、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドをコードする核酸分子と相補的である少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３０】
他の実施形態では、本発明は、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに融合されるポリペプチド配列を含む融合タンパク質を提供する。さらなる特定の実施形態では、融合ドメインは、免疫グロブリンあるいはその改変体または断片である。さらなる実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに融合されるポリペプチド配列は、プロテアーゼにより切断される。別の実施形態では、ポリペプチド配列は、リガンドに対する親和性を有する親和性タグポリペプチドである。
【００３１】
他の実施形態では、本発明は、上記のようなＨＥ４ａ抗原ポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結される少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現構築物を提供する。特定の実施形態では、プロモーターは調節されたプロモーターであり、他の特定の実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドが第二の核酸配列のポリペプチド産物との融合タンパク質として発現される。さらなる実施形態では、第二の核酸配列のポリペプチド産物は免疫グロブリン定常部である。別の実施形態では、発現構築物は組換えウイルス発現構築物である。他の実施形態によると、本発明は、本明細書中に提供されるような組換え発現構築物を含む宿主細胞を提供する。１つの実施形態では、宿主細胞は原核生物細胞であり、別の実施形態では、宿主細胞は真核生物細胞である。
【００３２】
別の局面では、本発明は、本明細書中に提供されるようなＨＥ４ａ抗原ポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結される少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現構築物を含む宿主細胞を培養することによって、組換えＨＥ４ａ抗原ポリペプチドを産生する方法を提供する。特定の実施形態では、プロモーターは調節されたプロモーターである。別の実施形態では、本発明は、組換えＨＥ４ａ抗原ポリペプチドを発現するために、本明細書で提供される組換えウイルス発現構築物に感染された宿主細胞を培養することによって、組換えＨＥ４ａ抗原ポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００３３】
別の実施形態では、本発明はまた、試料中のＨＥ４ａ発現を検出する方法であって、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａポリペプチドあるいはその断片または改変体をコードする核酸配列を含む試料と接触させること、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするＨＥ４ａポリペプチドコード核酸の量を試料中で検出して、それから試料中のＨＥ４ａ発現を検出することによって、試料中のＨＥ４ａ発現を検出する方法を提供する。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするＨＥ４ａポリペプチドコード核酸の量がポリメラーゼ連鎖反応を用いて確定される。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするＨＥ４ａポリペプチドコード核酸の量がハイブリダイゼーションアッセイを用いて確定される。別の実施形態では、試料はＲＮＡまたはｃＤＮＡ調製物を含む。
【００３４】
本発明の他の特定の実施形態によれば、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体であって、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル免疫グロブリン可変部を含む抗体を含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、悪性症状を治療する方法が提供される。別の実施形態では、本発明は、悪性症状を治療する方法であって、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａポリペプチドまたはその断片を含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。さらなる特定の実施形態では、組成物は、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａポリペプチドまたはその断片と特異的に結合可能な抗体の患者における産生を誘導する。また、さらなる他の特定の実施形態では、組成物は、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａポリペプチドまたはその断片を特異的に認識可能なＴリンパ球を患者において誘導する。他の特定の実施形態によれば、受胎、避妊、および／または受精能（ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）を変更する（例えば適切な対照と比較して統計学的に有意の方法で増大または低減する）組成物および方法であって、ＨＥ４ａポリペプチドあるいはその断片または改変体（例えば融合タンパク質）を投与すること、またはＨＥ４ａポリペプチドあるいはその断片または改変体と特異的に結合する免疫グロブリン可変部を含む組成物を投与することを含む、組成物および方法が提供される。ある種の他の実施形態によれば、受胎、避妊および／または受精能を変更する（例えば適切な対照と比較して、統計学的有意の方法で増大または低減する）組成物および方法であって、ＨＥ４ａポリペプチドあるいはその断片または改変体（例えば融合タンパク質）を投与すること、もしくはＨＥ４ａポリペプチドあるいはその断片または改変体と特異的に結合する免疫グロブリン可変部を含む組成物を投与することを含む組成物および方法が提供される。
【００３５】
本発明のこれらのおよびその他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば明らかになる。さらに、本発明のある種の局面をより詳細に記述する種々の参照文献が本明細書中に記述されており、したがってそれらのに記載内容は全て、参照により本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】図１は、ヒト試料のパネルにおけるｃＤＮＡをコードするＨＥ４ａの実時間ＰＣＲ検出を示す。
【図１Ｂ】図１は、ヒト試料のパネルにおけるｃＤＮＡをコードするＨＥ４ａの実時間ＰＣＲ検出を示す。
【図２】図２は、発現ＨＥ４ａ融合タンパク質のウエスタンブロット分析を示す。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡによる２匹の免疫マウス（１６０５および１７３４）からの血清中のＨＥ４ａ−ｍＩｇ融合タンパク質と反応性がある抗体の検出を表す。
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡを用いたハイブリドーマ上清のスクリーニングならびにＨＥ４ａ特異的ハイブリドーマ抗体の検出の代表的結果を表す。
【図５】図５は、捕獲試薬として固定化ＨＥ４ａ特異的モノクローナル抗体３Ｄ８を、検出試薬としてビオチニル化ＨＥ４ａ特異的モノクローナル抗体２Ｈ５を用いた二重決定因子サンドイッチＥＬＩＳＡによるＨＥ４ａ−ｈＩｇＧ融合タンパク質の検出を示す。卵巣癌細胞株４００７（Δ）からの上清液中の可溶性ＨＥ４ａの検出も示されている。
【図６】図６は、卵巣癌患者からの連続希釈腹水中のＨＥ４ａ抗原のサンドイッチＥＬＩＳＡによる検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明は、一部は、ＨＥ４に非常によく似ているが、それとは異なる配列を示す、本明細書中に記載されたようなタンパク質の「４−ジスルフィドコア」ファミリーの新規の成員であるＨＥ４ａの発見に関する（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ．４５：３５０−３５７）。本明細書中に示されたように、ＨＥ４ａ（ＨＥ４ではない）は、甚だ予期せぬことに、ある種の悪性疾患において、例えば卵巣癌において、ならびに多数のその他のヒト組織中で、ヒト精巣上皮細胞におけるＨＥ４の制限発現パターンとは大いに異なって、過剰発現されることが示されている（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。本発明は、一部は、被験体中で天然に生じるＨＥ４ａポリペプチドとして本明細書中で言及されるある種の遺伝子産物の細胞表面および／または可溶性形態の検出を提供する本明細書に記載された組成物および方法から得られる意外な利点、例えばある種の癌腫（例えば卵巣癌）を有する被験体におけるこのようなポリペプチドのレベル増大にも関する。したがって本発明は、このような細胞表面および／または可溶性ＨＥ４ａポリペプチドの特異的検出による被験体における悪性症状の検出および診断のための有用な組成物および方法を提供する。
【００３８】
以下で詳細に記載されるように、本発明の特定の実施形態は、可溶性および細胞表面形態のＨＥ４ａおよびＨＥ４ポリペプチド、例えばＨＥ４およびＨＥ４ａポリペプチド抗原および融合タンパク質を含むＨＥ４ａポリペプチドに関する。ある種の他の実施形態では、本発明は、ＨＥ４ａポリペプチドの断片、誘導体および／または類似体に関する。要するに、本発明の特定の実施形態によれば、被験体からの生物学的試料をヒトＨＥ４ａポリペプチドに特異的な抗体と接触させることにより、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法を提供する。ＨＥ４ａポリペプチドおよびＨＥ４ａ−Ｉｇ融合タンパク質の完全アミノ酸および核酸コード配列は、卵巣癌ｃＤＮＡ由来の核酸分子がＫｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）により開示されたようなＨＥ４とは別個の配列を有する発現産物をコードするという意外な観察、ならびにＫｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．により開示されたようなＨＥ４発現が精巣上皮細胞に限定される一方、本発明の開示によるＨＥ４ａ発現は卵巣癌において容易に検出可能である、というさらなる予期せぬ観察を含めて、本明細書中に開示されている。
【００３９】
本明細書中に記載されているように、当業者がルーチンにそして過度の実験なしで、当該技術分野で周知の方法とともに本発明の教示を用いて、宿主を免疫感作し、ＨＥ４ａポリペプチド特異的抗体産生に関してスクリーニングし得るよう、ＨＥ４ａポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体が提供される。例えば組換えＨＥ４ａ発現ベクターおよび宿主細胞（例えば組換えＨＥ４ａ融合タンパク質）の構築は、本明細書中に記載されており、ＨＥ４ａ特異的抗体を提供する。
【００４０】
本明細書中に開示されたＨＥ４ａポリペプチドの物理化学的および免疫化学的特性から、そしてここに開示されたＨＥ４ａをコードする核酸配列を用いて、当業者は、周知の方法に従って特異的抗体を産生および特性化するために用いられ得る組換えＨＥ４ａも調製し得る。ＨＥ４ａポリペプチドは、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、酵母、細菌またはその他の細胞中で発現され得る。無細胞翻訳系も、本明細書中に開示されたＨＥ４ａポリペプチドＤＮＡコード領域由来のＲＮＡを用いて、このようなタンパク質を産生するために用いられ得る。原核生物および真核生物宿主とともに用いるための適切なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８９）によりに記載されている。本発明の好ましい実施形態では、ＨＥ４ａポリペプチドは哺乳動物細胞中で発現され得る。
【００４１】
本発明の核酸は、ＲＮＡの形態で、またはＤＮＡの形態であり、このＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを包含する。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得るし、一本鎖である場合には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。本発明に用いるためのＨＥ４ａポリペプチドをコードするコード配列は、配列番号３、４、６、１０または１２で提供されるコード配列と同一であり得るし、あるいは遺伝暗号の冗長または縮重の結果として、例えば配列番号１０および配列番号１２のｃＤＮＡと同一のＨＥ４ａポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。したがって本発明は、配列番号５、配列番号７、配列番号１１または配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＥ４ａ抗原ポリペプチドをコードする単離核酸分子、あるいはこのようなＨＥ４ａポリペプチドコード核酸とハイブリダイズすることが可能な核酸分子、またはそれらと相補的な配列を有する核酸分子を提供する。
【００４２】
改変体は、ネイティブＨＥ４ａ抗原ポリペプチドまたはその一部分をコードするポリヌクレオチド配列、例えば配列番号１０および配列番号１２に記述される核酸配列と、好ましくは少なくとも約７０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも約８０％〜８５％の同一性、もっとも好ましくは少なくとも約９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を示す。同一性％は、当業者に周知のコンピューターアルゴリズムを、例えばＡｌｉｇｎまたはＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５，１９９１；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５１０９１９，１９９２）（これはＮＣＢＩウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）で利用可能である）を用いて配列を比較することにより、容易に確定され得る。デフォルトパラメーターが用いられ得る。
【００４３】
ある種の改変体は、ネイティブ遺伝子と実質的に相同である。このようなポリヌクレオチド改変体は、中等度ストリンジェント条件下で、ネイティブＨＥ４ａ抗原をコードする天然ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（または相補配列）とハイブリダイズすることが可能である。適切な中等度ストリンジェント条件としては、例えば以下の過程またはそれらの等価物が挙げられる：５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で予備洗浄する過程；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣでの一晩ハイブリダイズする過程；その後、６５℃で２０分間、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣの各々で２回洗浄する過程。付加的ストリンジェントなに関しては、条件としては、例えば０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での６０℃で１５分間の洗浄、あるいはその等価物が挙げられる。何らかの点で特定の目的となる核酸に対して選択的である適度なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を作り出すための慣例として変更され得るパラメーターを、当業者は容易に理解し、そして、このような条件はとりわけ、ハイブリダイゼーションに関与する特定核酸配列、例えばＨＥ４ａポリペプチドをコードする配列番号１０および配列番号１２として本明細書中に開示されたものの一関数であり得ることをさらに理解する。核酸ハイブリダイゼーション条件の選択に関しては、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９５も参照されたい。
【００４４】
ＨＥ４ａポリペプチド、例えば配列番号１１のアミノ酸配列を有するヒトＨＥ４ａポリペプチド、または本発明に従って用いるための任意のその他のＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸としては：ＨＥ４ａポリペプチドに関するコード配列のみ；ＨＥ４ａポリペプチドに関するコード配列および付加的コード配列；ＨＥ４ａポリペプチドに関するコード配列（および任意の付加的コード配列）および非コード配列、例えばイントロンあるいはＨＥ４ａポリペプチドに関するコード配列の非コード配列５’および／または３’が挙げられるが、これらに限定されない。これらはさらに、例えば調節されたまたは調節可能なプロモーター、エンハンサー、その他の転写調節配列、リプレッサー結合配列、翻訳調節配列または任意のその他の調節核酸配列であり得る１つまたは複数の調節核酸配列を包含し得るが、これらに限定される必要はない。したがって「ＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸」という用語は、ポリペプチドに関するコード配列のみ、ならびに付加的コードおよび／または非コード配列（単数または複数）を含む核酸を包含する。
【００４５】
本発明はさらに、ＨＥ４ａポリペプチド、例えば配列番号１１の推定アミノ酸配列を有するヒトＨＥ４ａポリペプチドの断片、類似体および誘導体をコードする本明細書中に記載された核酸の改変体に関する。ＨＥ４ａをコードする核酸の改変体は、核酸の天然対立遺伝子改変体または天然に生じない改変体であり得る。当該技術分野で周知であるように、対立遺伝子改変体は、そのいずれかがコード化ＨＥ４ａポリペプチドの機能を実質的に変更しない１つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失または付加のうちの少なくとも１つを有し得る核酸配列の代替的形態である。したがって例えば本発明は、配列番号５、７または１１で示されるのと同一のＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸、ならびにこのような核酸の改変体を包含し、これらの改変体はこれらのポリペプチドのいずれかの断片、誘導体または類似体をコードし得る。
【００４６】
ＨＥ４ａの改変体および誘導体は、ＨＥ４ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異により生成され得る。ネイティブアミノ酸配列の変更は、多数の慣用的方法のいずれかにより成し遂げられ得る。突然変異は、ネイティブ配列の断片への結繋を可能にする制限部位が側面に接する突然改変体配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより特定の遺伝子座に導入され得る。結繋後、結果として得られる制限再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を有する類似体をコードする。
【００４７】
あるいは、変更遺伝子を提供するためにオリゴヌクレオチド位置特異的突然変異誘発手法が用いられ得るが、この場合、予定コドンは置換、欠失または挿入により変更され得る。このような変更の作製方法の例は、Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ （ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ １９８５，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；Ｋｕｎｋｅｌ （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８，１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７，１９８７）；および米国特許第４，５１８，５８４号および第４，７３７，４６２号に開示されている。
【００４８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス作用物質およびＨＥ４ａポリペプチドあるいはその改変体または断片をコードする核酸配列に特異的なリボザイムとして使用するための核酸分子の、ならびに遺伝子療法のための標的化送達のためのＨＥ４ａ遺伝子をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドの同定は、当該技術分野で周知の方法を含む。例えばこのようなオリゴヌクレオチドの望ましい特性、長さおよびその他の特徴が周知である。ある種の好ましい実施形態では、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書中に提供されるようなＨＥ４ａポリペプチドをコードする単離核酸分子と相補的な少なくとも１５〜３０個の連続ヌクレオチドを含み、ある種の他の好ましい実施形態では、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書中に提供されるようなＨＥ４ａポリペプチドをコードする単離核酸分子と相補的な少なくとも３１〜５０、５１〜７５、７６〜１２５個またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、スルフェート、ケチル、ホスホロジチオネート、ホスホルアミデート、ホスフェートエステルのような結合およびその他のこのような結合を用いることにより、内因性核溶解性酵素による分解に抵抗するよう設計される（例えばＡｇｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８：３５３９−３５４２ （１９８７）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３：６６５７−６６６５ （１９７１）；Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒｅｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２６：２１９１−２１９４ （１９８５）；Ｍｏｏｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：４７６９−４７８２ （１９８９）；Ｕｚｎａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４０：１３７−１４３ （１９８４）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：３６７−４０２ （１９８５）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１４：９７−１００ （１９８９）；Ｓｔｅｉｎ Ｉｎ ：Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃｏｈｅｎ，Ｅｄ，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．９７−１１７ （１９８９）；Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７２３７−７２４６ （１９８８）参照）。
【００４９】
アンチセンスヌクレオチドは、配列特異的方法で、核酸、例えばｍＲＮＡまたはＤＮＡと結合するオリゴヌクレオチドである。相補的配列を有するｍＲＮＡに結合される場合、アンチセンスはｍＲＮＡの翻訳を防止する（例えば米国特許第５，１６８，０５３号（Ａｌｔｍａｎ等）；米国特許第５，１９０，９３１号（Ｉｎｏｕｙｅ）；米国特許第５，１３５，９１７号（Ｂｕｒｃｈ）；米国特許第５，０８７，６１７号（Ｓｍｉｔｈ）およびＣｌｕｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：３４０５−３４１１（これはダンベルアンチセンスオリゴヌクレオチドをに記載する）参照）。三重分子は、二重ＤＮＡを結合して、共直線性三重分子を形成し、それにより転写を防止する単一ＤＮＡ鎖を指す（例えば二重鎖ＤＮＡ上の標的部位に結合する合成オリゴヌクレオチドの製造方法をに記載する米国特許第５，１７６，９９６号（Ｈｏｇａｎ等）参照）。
【００５０】
本発明のこの実施形態によれば、特に有用なアンチセンスヌクレオチドおよび三重分子は、ＨＥ４ａポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳の抑制が実行されるよう、ＨＥ４ａポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡのセンス鎖と相補的であるかまたはそれと結合する分子である。
【００５１】
リボザイムは、ＲＮＡ基質、例えばｍＲＮＡを特異的に切断して、細胞性遺伝子発現の特異的抑制または妨害を生じるＲＮＡ分子である。ＲＮＡ鎖の切断および／または結繋に関与するリボザイムには少なくとも５つの周知の種類がある。リボザイムは任意のＲＮＡ転写体に標的化されて、このような転写体を触媒的に切断し得る（例えば米国特許第５，２７２，２６２号；米国特許第５，１４４，０１９号、ならびに米国特許第５，１６８，０５３号、第５，１８０，８１８号、第５，１１６，７４２号および第５，０９３，２４６号（Ｃｅｃｈ等）参照）。本発明の特定の実施形態によれば、任意のこのようなＨＥ４ａｍＲＮＡ特異的リボザイムまたはこのようなリボザイムをコードする核酸は、宿主細胞に送達されて、ＨＥ４ａ遺伝子発現の抑制を実行し得る。したがってリボザイム等は、核への導入時に、リボザイムが直接転写されるよう、真核生物プロモーター（例えば真核生物ウイルスプロモーター）に連結されたリボザイムをコードするＤＮＡにより宿主細胞に送達され得る。
【００５２】
生物学的活性を必要とされないアミノ酸残基または配列の種々の付加または置換、あるいは末端または内部残基または配列の欠失をコードする等価のＤＮＡ構築物も、本発明に包含される。例えば生物学的活性に不可欠であるというわけではないＣｙｓ残基をコードする配列は、Ｃｙｓ残基を欠失させるかまたは他のアミノ酸で置換させて、復元時に不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するよう変更され得る。その他の等価物は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を強化するための隣接二塩基性アミノ酸残基の修飾により調製され得る。ＥＰ２１２，９１４は、タンパク質中のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性化するための部位特異的突然変異誘発の使用を開示する。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位は、残基を欠失、付加または置換して、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＬｙｓおよびＬｙｓ−Ａｒｇ対をこれらの隣接塩基性残基の発生を排除するよう変更することにより、不活性化される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対合はＫＥＸ２切断にかなり低感受性であり、Ａｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの転換は、ＫＥＸ２部位を不活性化するための保存的な、そして好ましいアプローチを示す。
【００５３】
適切なＤＮＡ配列（単数または複数）は、種々の手法により、選択宿主細胞に適した多数の周知のベクターのいずれかに挿入され得る。概してＤＮＡ配列は、当該技術分野で周知の手法により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数または複数）に挿入される。クローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製のための、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を包含する酵素反応のための標準技法、ならびに種々の分離技法は、周知のものであり、当業者に一般的に用いられる。多数の標準技法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．& Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）；ならびにその他に記載されている。
【００５４】
哺乳動物発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ ２３：１７５ （１９８１）によりに記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株、ならびに適合性ベクターを発現し得るその他の細胞株、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製の起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与体および受容体部位、転写終結配列および５’フランキング非転写化配列を含む。例えばＳＶ４０スプライスおよびポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を用いて、必要な非転写化遺伝因子を提供し得る。宿主細胞中への構築物の導入は、当業者が熟知している種々の方法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクションまたは電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）（これらに限定されない）により実行され得る（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
【００５５】
本発明はさらに、ＨＥ４ａポリペプチドに関し、特に悪性症状を検出する方法に関する。好ましい実施形態では、悪性疾患は、ＨＥ４ａポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有する、天然可溶性分子の生物学的試料中での、あるいは細胞表面の存在を細胞を含む試料中での存在を確定することにより、検出される。別の好ましい実施形態では、悪性疾患は、少なくとも１つの天然ＨＥ４ａポリペプチドの生物学的試料中での存在を確定することにより、検出される。本明細書中に提供されるように、「ＨＥ４ａ抗原ポリペプチド」または「ＨＥ４ａポリペプチド」は、その任意の断片、誘導体または類似体を含めた配列番号１１のアミノ酸配列を有する任意のポリペプチドを包含し、そして配列番号１０または配列番号１２を含む核酸分子により、あるいは配列番号１０または配列番号１２の核酸分子とハイブリダイズすることが可能な核酸分子によりコードされる任意のポリペプチド、あるいはその断片、誘導体または類似体も包含する。本発明のある種の好ましい実施形態は、本明細書中に提供されるようなＨＥ４ａ配列（例えば配列番号１０〜１３）を対象とする組成物および方法を意図するが、これらは、構造、機能および／または細胞型発現あるいは組織分布あるいはその他（例えば抗体限定検出可能エピトープ、ならびに例えばオリゴヌクレオチド限定ハイブリダイゼーション検出）の差に基づいて、Ｋｉｒｃｈｏｆｆ等（例えばＢｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ．４５：３５０；配列番号８〜９）に開示されたＨＥ４配列を発現的に除外する。
【００５６】
本発明のＨＥ４ａポリペプチドは非修飾化ポリペプチドであり得るし、あるいは例えばグリコシル化、リン酸化、脂肪アシル化（例えばグリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼｃ媒介性加水分解またはその他）、プロテアーゼ切断、脱リン酸化または任意のその他の種類のタンパク質翻訳後修飾（例えば共有的化学結合の形成または切断を包含する修飾）により、翻訳後修飾されたポリペプチドであり得る。
【００５７】
「断片」、「誘導体」および「類似体」という用語は、ＨＥ４ａポリペプチド、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドまたはＨＥ４ａ融合タンパク質に言及する場合、このようなポリペプチドと本質的に同一の生物学的機能および／または活性を保有する任意のＨＥ４ａポリペプチドを指す。したがって類似体としては、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドアイソフォーム、例えば示差的翻訳後修飾化ＨＥ４ａポリペプチドまたは改変体（例えばスプライス改変体）が挙げられ得る。当該技術分野で周知であるように、「スプライス改変体」は、ＲＮＡ転写体の示差的細胞内プロセシングから生じるポリペプチドの改変体または代替的形態を包含する。例えば２つの別個のｍＲＮＡ種は、互いのスプライス改変体であって、この場合、それらは一ｍＲＮＡ種中の特定のエキソンに対応する配列の全部または一部の封入ならびに他の種からのその非存在によってのみ異なる。当業者が理解するように、その他の構造的関係は、スプライス改変体として一般的にみなされるｍＲＮＡ種間に存在し得る。ＨＥ４ａポリペプチドはさらに、プロタンパク質部分を切断して活性ＨＥ４ａポリペプチドを生成することにより達成され得るプロタンパク質を包含する。
【００５８】
ＨＥ４ａポリペプチドの、またはＨＥ４ａ抗原ポリペプチドの断片、誘導体および類似体の生物学的機能および／または活性としては、本明細書中に開示されたような、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法におけるマーカーとしてのこのようなポリペプチドの使用が挙げられるが、これに限定される必要はない。例えば被験体からの試料中で天然で可溶性形態であり、ＨＥ４ａポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有する分子を検出することにより、ＨＥ４ａポリペプチドの生物学的機能および／または活性を当業者はモニタリングし得る。さらに、特定の実施形態では、本発明のスクリーニングする方法は、天然で可溶性形態であり、そして（ｉ）悪性症状を有する疑いがある一次被験体からの一次生物学的試料、および（ｉｉ）悪性症状がないことが周知である第二の被験体からの第二の生物学的試料の各々において、ＨＥ４ａポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有する検出可能分子の相対的定量、レベルおよび／または量を比較することを対象とすることに留意すべきである。したがって生物学的試料中のＨＥ４ａポリペプチドの相対的定量的存在は、ＨＥ４ａポリペプチドの生物学的機能および／または活性であり得るが、このような機能および／または活性は、そのように限定されるべきでない。
【００５９】
ＨＥ４ａポリペプチドの断片、誘導体または類似体は、（ｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基が保存または非保存性アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換されるもの；（ｉｉ）付加的アミノ酸、例えばＨＥ４ａポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製のために用いられ得るアミノ酸がＨＥ４ａポリペプチドに融合されるもの；あるいは（ｉｉｉ）短縮ＨＥ４ａポリペプチドであり得る。このような断片、誘導体および類似体は、本明細書中の教示から、当業者の範囲内であるとみなされる。
【００６０】
短縮ＨＥ４ａポリペプチドは、全長バージョンより短いＨＥ４ａポリペプチドを含む任意のＨＥ４ａポリペプチド分子であり得る。本発明により提供される短縮分子は短縮生物学的ポリマーを包含し、本発明の好ましい実施形態では、このような短縮分子は、短縮核酸分子または短縮ポリペプチドであり得る。短縮核酸分子は、周知のまたはに記載された核酸分子の全長未満のヌクレオチド配列を有するが、この場合、このような周知のまたはに記載された核酸分子は、当業者がそれを全長分子とみなす限りは、天然、合成または組換え核酸分子であり得る。したがって例えば遺伝子配列に対応する短縮核酸分子は、全長未満の遺伝子を含有し、この場合、遺伝子はコードおよび非コード配列、プロモーター、エンハンサーおよびその他の調節配列、フランキング配列等、ならびに遺伝子の一部として認識されるその他の機能性および非機能性配列を含む。別の例では、ｍＲＮＡ配列に対応する短縮核酸分子は、全長未満のｍＲＮＡ転写体を含有し、これは種々の翻訳化および非翻訳化領域、ならびにその他の機能性および非機能性配列を含み得る。その他の好ましい実施形態では、短縮分子は、特定タンパク質の全長未満のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００６１】
本明細書中で用いる場合、「欠失」は、当業者により理解されるようなその一般的意味を有し、例えば本明細書中で提供される短縮分子の場合のような対応する全長分子と比較して、末端または非末端領域からの配列の１つまたは複数の一部分を欠く分子を指し得る。線状生物学的ポリマー（例えば核酸分子またはポリペプチド）である短縮分子は、分子の末端からの１つまたは複数の欠失、あるいは分子の非末端領域からの欠失を有し得るが、この場合、このような欠失は１〜１５００個の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基、好ましくは１〜５００個の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基、さらに好ましくは１〜３００個の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の欠失であり得る。
【００６２】
当該技術分野で周知であるように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、ポリペプチドのアミノ酸配列およびそれに対する保存アミノ酸置換を、第二のポリペプチドの配列と比較することにより確定される。２つのポリペプチドまたはヌクレオチド配列間の類似性、あるいは同一性％でさえ、当業者に周知のコンピューターアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５，１９９１；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）（これはＮＣＢＩウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）で利用可能である）を用いて配列を比較することにより、容易に確定され得る。その他の有用なコンピューターアルゴリズムの例は、ＡｌｉｇｎおよびＦＡＳＴＡのようなプログラムに用いられるものであり、これらは、例えばＩｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ Ｈｕｍａｉｎｅ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，ＦｒａｎｃｅのＧｅｎｅｓｔｒｅａｍインターネットウエブサイト（ｗｗｗ２．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｈｏｍｅ．ｅｎｇ．ｈｔｍｌ）でアクセスされ、デフォルトパラメーターとともに用いられ得る。本発明のポリペプチドの断片または一部は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチドを産生するために用いられ、したがって断片は、全長ポリペプチドを産生するための中間体として用いられ得る。
【００６３】
「単離される」という用語は、物質がその元の環境（例えばそれが天然に生じる場合には、天然環境）から取り出されることを意味する。例えば生体動物中に存在する天然ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは単離されないが、天然系中の共存物質のいくつかまたは全部から分離される同一ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、単離される。このようなポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、組成物の一部であり得るし、さらにこのような組成物がその天然環境の一部でない場合は単離される。
【００６４】
アフィニティー技法は、本発明の方法に従って用いるためにＨＥ４ａポリペプチドを単離するという状況において特に有用であり、そして分離を実行するためにＨＥ４ａポリペプチドとの特異的結合相互作用を利用する任意の方法を含み得る。例えばＨＥ４ａポリペプチドは共有結合オリゴ糖部分を含有し得るため（例えば実施例に記載される図２参照）、アフィニティー技法、例えばレクチンによる炭水化物結合を可能にする条件下での適切な固定化レクチンとのＨＥ４ａポリペプチドの結合は、特に有用なアフィニティー技法であり得る。その他の有用なアフィニティー技法としては、ＨＥ４ａポリペプチドを単離するための免疫学的技法が挙げられるが、この技法は、複合体中に存在する抗原および抗原決定基に関する部位を併有する抗体間の特異的結合相互作用に拠る。免疫学的技法としては、イムノアフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降、固相免疫吸着またはその他のイムノアフィニティー法が挙げられるが、これらに限定される必要はない。これらのおよびその他の有用なアフィニティー技法に関しては、例えばＳｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，１９８７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ＮＹ；Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（これらのに記載内容は全て、複合体を単離し、特性化するための技法（例えばアフィニティー技法）に関する詳細に関して、参照により本明細書中に援用される）を参照されたい。
【００６５】
本明細書中に記載されているように、本発明は、ＨＥ４ａに融合されたポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。このようなＨＥ４ａ融合タンパク質は、付加的コード配列に枠内で融合されたＨＥ４ａコード配列を有する核酸によりコードされて、例えばＨＥ４ａ融合タンパク質の欠失、単離および／または精製（これらに限定されない）を可能にする付加的機能性または非機能性ポリペプチド配列に融合されたＨＥ４ａポリペプチド配列の発現を提供する。このようなＨＥ４ａ融合タンパク質は、タンパク質−タンパク質親和性、金属親和性または電荷親和性ベースのポリペプチド精製により、あるいはＨＥ４ａポリペプチドが融合タンパク質から分離可能であるよう、プロテアーゼにより切断可能である融合配列を含有する融合タンパク質の特異的プロテアーゼ切断により、ＨＥ４ａ融合タンパク質の検出、単離および／または精製を可能にし得る。
【００６６】
したがってＨＥ４ａ融合タンパク質は、リガンドとの特異的親和性相互作用によりＨＥ４ａの検出および単離を促すためにＨＥ４ａに付加されるポリペプチドまたはペプチドを指す親和性タグポリペプチド配列を含み得る。リガンドは、本明細書中に提供されるような特異的結合相互作用により親和性タグが相互作用し得る任意の分子、受容体、対受容体（ｃｏｕｎｔｅｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）、抗体等であり得る。このようなペプチドとしては、例えば米国特許第５，０１１，９１２号にならびにＨｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，（１９８８ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４）に記載されたようなポリ−Ｈｉｓまたは抗原性同定ペプチド、あるいはＸＰＲＥＳＳ（登録商標）エピトープタグ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。親和性配列は、例えば細菌宿主の場合にはマーカーに融合される成熟ポリペプチドの精製のために提供されるｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＱＥ−９ベクターにより供給されるようなヘキサ−ヒスチジンタグであり得るし、あるいは親和性配列は、哺乳動物宿主、例えばＣＯＳ−７細胞が用いられる場合には、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来の抗体限定エピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｃｅｌｌ ３７：７６７）。
【００６７】
ＨＥ４ａ融合タンパク質は、特に好ましい実施形態では、そして以下でより詳細に記載されるように、さらに、ＨＥ４ａの検出、単離および／または局在化を促すためにＨＥ４ａに付加される免疫グロブリン定常部ポリペプチドを含み得る。免疫グロブリン定常部ポリペプチドは、好ましくはＨＥ４ａポリペプチドのＣ末端に融合される。非限定的理論によれば、本明細書中に提供されるようなＨＥ４ａ融合タンパク質中の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常部ドメインの含入は、例えば特定宿主中で用いられる場合、特定のＩｇ領域の免疫原性／非免疫原性特性（すなわち、「自己」対「非自己」）に関連したもの、あるいは融合タンパク質の単離および／または検出を促すものといった利点を提供し得る。Ｉｇ融合タンパク質のこれらのおよびその他の利点は、本発明の開示に基づいて、当業者に理解される。抗体由来ポリペプチドの種々の部分（例えばＦｃドメイン）に融合された異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の一般的調製は、例えばＡｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１）およびＢｙｒｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０）によりに記載されている。ＨＥ４ａ：Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合は、適切な発現ベクター中に挿入される。本発明の特定の実施形態では、ＨＥ４ａ：Ｆｃ融合タンパク質は、非常によく似た抗体分子にアセンブルされ、この場合、鎖間ジスルフィド結合がＦｃポリペプチド間に形成されて、二量体ＨＥ４ａ融合タンパク質を生じる。
【００６８】
ＨＥ４ａをコードする配列に枠内で連結されたＤＮＡ配列によりコードされる免疫グロブリンＶ領域ドメインを含む融合ポリペプチドに基づいて予備選定抗原に対する特異的結合親和性を有するＨＥ４ａ融合タンパク質も、本明細書中に提供されるようなその改変体および断片を含めて、本発明の範囲内である。免疫グロブリンＶ領域融合ポリペプチドを有する融合タンパク質の構築のための一般的戦略は、例えばＥＰ０３１８５５４；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号および米国特許第５，４７６，７８６号に開示されている。
【００６９】
本発明の核酸は、所望の親和性特性、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのような酵素を有するその他のポリペプチドに融合されたＨＥ４ａポリペプチドを含む融合タンパク質もコードし得る。別の例としては、ＨＥ４ａ融合タンパク質は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡポリペプチドに融合されたＨＥ４ａポリペプチドも含む。プロテインＡコード核酸、および免疫グロブリン定常部に対する親和性を有する融合タンパク質の構築におけるそれらの使用は、一般的に、例えば米国特許第５，１００，７８８号に開示されている。ＨＥ４ａ融合タンパク質の構築のためのその他の有用な親和性ポリペプチドとしては、例えばＷＯ８９／０３４２２、米国特許第５，４８９，５２８号、米国特許第５，６７２，６９１号、ＷＯ９３／２４６３１、米国特許第５，１６８，０４９号、米国特許第５，２７２，２５４号およびその他に開示されたようなストレプトアビジン融合タンパク質、ならびにアビジン融合タンパク質（例えばＥＰ５１１，７４７参照）が挙げられ得る。本明細書中に、そして引用参考文献中に提供されているように、ＨＥ４ａポリペプチド配列は、全長融合ポリペプチドであり得るとともに代替的にその改変体または断片であり得る融合ポリペプチド配列に融合され得る。
【００７０】
本発明は、融合タンパク質を細胞核に向かわせるポリペプチド配列であって、当業者が精通している種々の周知の細胞内タンパク質分類メカニズムのいずれかにより、小胞体（ＥＲ）の管腔中に存在し、古典的ＥＲ−ゴルジ分泌経路を介して細胞から分泌され（例えばｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．１１５：１９５−２０１，１９９０参照）、形質膜中に組み入れられ、特定の細胞質構成成分（例えば膜貫通細胞表面受容体の細胞質ドメイン）と会合し、または特定の細胞下位置に向けられるポリペプチド配列を含有するＨＥ４ａ融合タンパク質も意図する（例えばＲｏｔｈｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３７２：５５−６３，１９９４、Ａｄｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１０３１７およびそこに引用された参考文献参照）。したがってこれらのおよび関連の実施形態は、予備限定細胞内、膜または細胞外局在化に対して当該ポリペプチドを標的化することを対象とする当該組成物および方法を包含する。
【００７１】
本発明は、本発明の核酸を含むベクターおよび構築物に関し、特に上記のような本発明のＨＥ４ａポリペプチドをコードする任意の核酸を含む「組換え発現構築物」、本発明のベクターおよび／または構築物で遺伝子操作される宿主細胞、そして組換え技法による本発明のＨＥ４ａポリペプチドおよび融合タンパク質、あるいはその断片または改変体の産生にも関する。ＨＥ４ａタンパク質は、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、酵母、細菌またはその他の細胞中で発現され得る。無細胞翻訳系も、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を産生するために用いられ得る。原核生物および真核生物宿主とともに用いるための適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）によりに記載されている。
【００７２】
一般に、組換え発現ベクターは、複製の起点、ならびに宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能マーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＲＰ１遺伝子、ならびに下流構造配列の転写を指図する高発現遺伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、解糖酵素、例えば、特に、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ａ−因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始および終結配列を用いて、適切な段階でアッセンブルされる。任意に、異種配列は、例えば所望の特徴、例えば発現組換え産物の安定化または簡易精製を付与するＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
【００７３】
細菌使用のための有用な発現構築物は、機能性プロモーターを用いて作動可能読取り段階に適切な翻訳開始および終結シグナルと一緒に所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を発現ベクター中に挿入することにより、構築される。構築物は、ベクター構築物の保持を保証し、望ましい場合には、宿主内での増幅を提供するために、１つまたは複数の表現型選択可能マーカーおよび複製の起点を含み得る。形質転換のための適切な原核生物宿主としては、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス属、ストレプトミセス属およびブドウ球菌属内の種々の種が挙げられるが、その他も選択物として用いられ得る。任意のその他のプラスミドまたはベクターは、それらが複製可能で、かつ宿主中で生育可能である限り、用いられ得る。
【００７４】
細菌使用のための有用な発現ベクターの代表的なしかし非限定例は、選択可能マーカー、および周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝因子（ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む市販のプラスミドに由来する複製の細菌起点を含み得る。このような市販ベクターとしては、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「主鎖」区分は、適切なプロモーターおよび発現される構造配列と併合される。
【００７５】
適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖後、適切な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘導）により、本明細書中に提供されるような調節プロモータが誘導され、細胞がさらなる期間、培養される。細胞は、典型的には遠心分離により収穫され、物理的または化学的手段により破壊され、その結果生じた粗製抽出物がさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、任意の便利な方法により、例えば凍結解凍循環、音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用により破壊され得る。このような方法は、当業者には周知である。
【００７６】
したがって例えば本明細書中で提供されるような本発明の核酸は、ＨＥ４ａポリペプチドを発現するための組換え発現構築物として種々の発現ベクター構築物のいずれかに含まれ得る。このようなベクターおよび構築物としては、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病ウイルスの組合せに由来するベクターが挙げられる。しかしながら任意のその他のベクターは、それが複製可能であり、宿主中で生育可能である限り、組換え発現構築物の調製のために用いられ得る。
【００７７】
適切なＤＮＡ配列（単数または複数）は、種々の手法によりベクター中に挿入され得る。概してＤＮＡ配列は、当該技術分野で周知の手法により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数または複数）に挿入される。クローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製のための、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を包含する酵素反応のための標準技法、ならびに種々の分離技法は、周知のものであり、当業者に一般的に用いられる。多数の標準技法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．& Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８２ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）；ならびにその他に記載されている。
【００７８】
発現ベクター中のＤＮＡ配列は、少なくとも１つの適切な発現制御配列（例えばプロモーターまたは調節プロモータ）に作動可能に連結されて、ｍＲＮＡ合成を指図する。このような発現制御配列の代表例としては、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐ、ラムダファージＰＬプロモーター、ならびに原核生物細胞または真核生物細胞あるいはそれらのウイルス中の遺伝子の発現を制御することが周知であるその他のプロモーターが挙げられる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたはその他のベクターを選択可能マーカーとともに用いて、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特定の命名された細菌プロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐが挙げられる。真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ極初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内であり、ＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結される少なくとも１つのプロモーターまたは調節プロモータを含むある種の特に好ましい組換え発現構築物の調製の選択が、本明細書中に記載されている。
【００７９】
上記のように、特定の実施形態では、ベクターはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターである。例えばレトロウイルスプラスミドベクターが得られるレトロウイルスとしては、モロニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび哺乳動物腫瘍ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
ウイルスベクターは、１つまたは複数のプロモーターを含む。用いられ得る適切なプロモーターとしては、レトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、ならびにＭｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０ （１９８９）に記載されたヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、あるいは任意のその他のプロモーター（例えば細胞プロモーター、例えば真核生物細胞プロモーター、例えばヒストン、ｐｏｌＩＩＩおよびβ−アクチンプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。用いられ得るその他のウイルスプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびＢ１９パルボウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から当業者には明らかであり、上記のような調節プロモータまたはプロモーターの中からであり得る。
【００８１】
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入して、プロデューサー細胞株を生成するために用いられる。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例としては、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１：５−１４ （１９９０）（このに記載内容は全て、参照により本明細書中に援用される）に記載されているようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ψ−２、Ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、当該技術分野で周知の任意の手段により、パッケージング細胞を形質導入し得る。このような手段としては、電気穿孔、リポソームの使用、ならびにリン酸カルシウム沈降が挙げられるが、これらに限定されない。一代替的方法では、レトロウイルスプラスミドベクターはリポソーム中に封入されるかまたは脂質に結合されて、次に宿主に投与され得る。
【００８２】
プロデューサー細胞株は、ＨＥ４ａポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸配列（単数または複数）を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。このようなレトロウイルスベクター粒子は次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで真核生物細胞を形質導入するために用いられ得る。形質導入化真核生物細胞は、ＨＥ４ａポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸（単数または複数）を発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、胚性幹細胞、胚性癌腫細胞、ならびに造血性幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、気管支上皮細胞および種々のその他の培養適応細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
組換えＨＥ４ａ発現構築物を調製するためにウイルスベクターが用いられる本発明の実施形態の別の例として、好ましい一実施形態では、ＨＥ４ａポリペプチドまたは融合タンパク質の発現を指図する組換えウイルス構築物により形質導入される宿主細胞は、ウイルス出芽中にウイルス粒子により組み入れられる宿主細胞膜の一部に由来する発現されたＨＥ４ａポリペプチドまたは融合タンパク質を含有するウイルス粒子を産生し得る。別の好ましい実施形態では、ＨＥ４ａコード核酸配列は、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３９，Ｃ．Ｄ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５；Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｓｅｃｔｉｏｎ ＩＩ ｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒ １６ ｉｎ：Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐａｇｅｓ １６−３２ ｔｏ １６−４８に記載されているように、バキュロウイルスシャトルベクター中でクローン化され、これは次に、バキュロウイルスで組換えられて、組換えバキュロウイルス発現構築物を生じ、Ｓｆ９宿主細胞を感染させるために用いられ得る。
【００８４】
別の局面では、本発明は、上記の組換えＨＥ４ａ発現構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は通常、例えばクローニングベクター、シャトルベクターまたは発現構築物であり得る本発明のベクターおよび／または発現構築物を用いて遺伝子工学処理される（形質導入、形質転換、またはトランスフェクトされる）。ベクターまたは構築物は、例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態であり得る。工学処理宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、または特定の遺伝子、例えばＨＥ４ａポリペプチドまたはＨＥ４ａ融合タンパク質をコードする遺伝子を増幅するのに適しているように修飾された慣用的栄養培地中で培養され得る。発現のために選択された特定の宿主細胞のための培養条件、例えば温度、ｐＨ等は、当業者には容易に明らかになる。
【００８５】
宿主細胞は、高等真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞または下等真核生物細胞、例えば酵母細胞であり得るか、あるいは宿主細胞は、原核生物細胞、例えば細菌細胞であり得る。本発明の適切な宿主細胞の代表例としては、細菌細胞、例えば大腸菌、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞、例えば酵母；昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびヨトウ類（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳまたは２９３細胞；アデノウイルス；植物細胞、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎにすでに適合されたかまたはｄｅ ｎｏｖｏでそのように確立された任意の適切な細胞が挙げられるが、これらに限定されない。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であるとみなされる。
【００８６】
種々の哺乳動物細胞培養系も組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。したがって本発明は、一部は、ＨＥ４ａをコードする核酸配列に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現構築物を含む宿主細胞を培養することによる、組換えＨＥ４ａポリペプチドの産生方法に向けられる。特定の実施形態では、プロモーターは、本明細書中に提供されるような調節プロモーター、例えばテトラサイクリン抑制性プロモーターであり得る。特定の実施形態では、組換え発現構築物は、本明細書中に提供されるような組換えウイルス発現構築物である。哺乳動物発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ ２３：１７５ （１９８１）によりに記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株、ならびに適合性ベクターを発現可能なその他の細胞株、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、例えばＭＲＡ発現構築物の調製に関して本明細書中に記載されているように、複製の起点、適切なプロモーターおよびエンハンサーを、ならびに任意に必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与体および受容体部位、転写終結配列および５’フランキング非転写化配列も含む。ＳＶ４０スプライス由来のＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位を用いて、必要な非転写化遺伝要素を提供し得る。宿主細胞中への構築物の導入は、当業者が熟知している種々の方法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクションまたは電気穿孔（これらに限定されない）により実行され得る（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
【００８７】
発現された組換えＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）またはそれから得られる融合タンパク質は、無傷宿主細胞；無傷細胞小器官、例えば細胞膜、細胞内小胞またはその他の細胞小器官；あるいは破壊細胞調製物、例えば細胞ホモジネートまたは溶解物、単一膜および多重膜小胞またはその他の調製物（これらに限定されない）の形態で、免疫原として有用であり得る。あるいは、発現された組換えメソテリン関連抗原ポリペプチド（またはメソテリンポリペプチド）または融合タンパク質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えばイムノアフィニティークロマトグラフィー）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた方法により、組換え細胞培養から回収され、精製され得る。タンパク質リォールディング過程は、必要な場合、成熟タンパク質の立体配置を完成する場合に用いられ得る。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、最終精製過程のために用いられ得る。発現された組換えＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）または融合タンパク質は、当業者により容易に実施され得るルーチン抗体スクリーニングのためのいくつかのアッセイ立体配置のいずれかにおける標的抗原としても有用であり得る。
【００８８】
したがって本発明の方法に用いられる特異的抗体の産生のための免疫原であるＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）は、天然精製産物、または化学合成手法の産物であってもよく、あるいは原核生物宿主から、または好ましくは真核生物宿主から組換え技法により産生されてもよい。組換え産生手法に用いられる宿主によっては、本発明のポリペプチドはグリコシル化されるか、またはそうでなければ、当該技術分野で周知であるように、そして本明細書中に提供されるように、翻訳後修飾され得る。
【００８９】
本発明によれば、可溶性ヒトＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）は、被験体または生物学的供給源からの生物学的試料中で検出され得る。生物学的試料は、被験体または生物学的供給源から、血液試料、生検検体、組織外植片、器官培養、生物学的流体または任意のその他の組織または細胞調製物を得ることにより提供され得る。被験体または生物学的供給源は、ヒトまたは非ヒト動物、一次細胞培養または培養適応細胞株、例えば染色体的組込みまたはエピソーム性組換え核酸配列、不死化または不死化可能細胞株、体細胞ハイブリッド細胞株、分化または分化可能細胞株、形質転換細胞株等を含有し得る遺伝子工学処理細胞株（これらに限定されない）であり得る。本発明のある種の好ましい実施形態では、被験体または生物学的供給源は、悪性症状を有する疑いがあるかまたは有する危険性があり得るが、この悪性症状は、ある種のさらに好ましい実施形態では、卵巣癌、例えば卵巣癌腫であり、本発明のある種のその他の好ましい実施形態では、被験体または生物学的供給源は、このような疾患の危険性または存在を有さないことが周知であり得る。
【００９０】
ある種の好ましい実施形態では、生物学的試料は、被験体または生物学的供給源からの少なくとも１つの細胞を含み、ある種のその他の好ましい実施形態では、生物学的試料は、可溶性ヒトメソテリン関連抗原ポリペプチドを含有する生物学的流体である。生物学的流体は、典型的には生理学的温度で液体であり、被験体または生物学的供給源中に存在し、それから引き抜かれ、それから発現されるかまたはそうでなければ抽出され得る天然に存在する流体を含み得る。特定の組織、器官または局在化領域由来のある種の生物学的流体、ならびにある種のその他の生物学的流体は、被験体または生物学的供給源中により全体的または系統的に置かれ得る。生物学的流体の例としては、血液、血清および漿液、血漿、リンパ、尿、脳脊髄液、唾液、分泌組織および器官の粘膜分泌物、膣分泌物、腹水、例えば非固形腫瘍に関連したもの、胸水、囲心腔液、腹膜液、腹腔またはその他の体腔液等が挙げられる。生物学的流体としては、被験体または生物学的供給源と接触する溶液、例えば細胞および器官培地（例えば細胞または器官ならし培地）、灌注液等も挙げられる。ある種の非常に好ましい実施形態では、生物学的試料は血清であり、他の非常に好ましい実施形体では、生物学的試料は血漿である。その他の好ましい実施形態では、生物学的試料は無細胞溶液である。
【００９１】
ある種のその他の好ましい実施形態では、生物学的試料は無傷細胞を含み、ある種のその他の好ましい実施形態では、生物学的試料は、配列番号１１または１３に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａ抗原ポリペプチドあるいはその断片または改変体をコードする核酸配列を含有する細胞抽出物を含む。
【００９２】
試料中の「可溶性形態で天然に存在する分子」とは、可溶性タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、またはそれらの誘導体；脂質、脂肪酸等、またはそれらの誘導体；炭水化物、糖等、またはそれらの誘導体、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、プリン、ピリミジンまたは関連分子、あるいはそれらの誘導体等；あるいはそれらの任意の組合せ、例えば糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、プロテオリピド、あるいは本明細書中に提供されるような生物学的試料の可溶性または無細胞構成分である任意のその他の生物学的分子であり得る。「可溶性形態で天然に存在する分子」とはさらに、溶液中に存在するかまたは生物学的試料、例えば本明細書中に提供されるような生物学的流体中に存在する、そして無傷細胞の表面に結合されない分子を指す。例えば可溶性形態で天然に存在する分子としては、溶質；高分子複合体の構成成分；細胞から脱粒され、分泌され、または輸送される物質；コロイド；マイクロ粒子またはナノ粒子あるいはその他の微小懸濁粒子等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
被験体における悪性症状の存在は、被験体における異形成細胞、癌性細胞および／または形質転換細胞の存在、例えば新性細胞、腫瘍細胞、非接触阻害化細胞または癌遺伝子的形質転換細胞等を指す。例証として、本発明の状況においては、悪性症状は、このようなポリペプチドのレベル増大が被験体からの生物学的試料中で検出可能であるような方法で、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）を分泌し、脱粒し、輸出し、または放出することができる癌細胞の被験体中での存在をさらに指し得るが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、例えばこのような癌細胞は、悪性上皮細胞、例えば癌腫細胞であり、特に好ましい実施形態では、このような癌細胞は、例えば胸腔、囲心腔、腹膜、腹腔およびその他の体腔を裏打ちすることが判明している扁平上皮細胞または中皮細胞の形質転換化改変体である悪性中皮腫細胞である。
【００９４】
本発明の最も好ましい実施形態では、その存在が悪性症状の存在を意味する腫瘍細胞は、卵巣癌細胞、例えば原発性および転移性卵巣癌細胞である。原発性および転移性腫瘍からのヒト卵巣癌細胞株の確立および特性化である（例えばＯＶＣＡＲ−３、Ａｍｅｒ．Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．６６：３７８）と同様に、悪性疾患を卵巣癌と分類するための判定基準は、当該技術分野で周知である（例えばＢｅｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．１０５：１１３６；Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１７ （４Ｂ）：３０１９）；Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１７ （４Ｂ）：２９４９；Ｃｉｏｆｆｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｔｕｍｏｒｉ ８３：５９４；およびそれらに引用された参考文献参照）。その他の実施形態では、悪性症状は、中皮腫、膵臓癌、非小細胞肺癌または別の形態の癌、例えば種々の癌腫（例えば扁平上皮細胞癌および腺癌）のいずれか、ならびに例えば肉腫および血液学的悪性疾患（例えば白血病、リンパ腫、骨髄腫等）であり得る。これらのおよびその他の悪性症状の分類は当業者に周知であり、本発明の開示は、過度の実験を伴わずに、このような悪性症状におけるＨＥ４ａポリペプチドの存在を確定する。
【００９５】
本明細書中に提供されるように、被験体における悪性症状の存在に関するスクリーニング方法は、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体またはＨＥ４ａポリペプチドに特異的な抗体の使用を特徴づけ得る。
【００９６】
ＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）に特異的である抗体は、モノクローナル抗体として、またはポリクローナル抗血清として容易に生成され、あるいは当該技術分野で周知の方法を用いて望ましい特性を有するよう設計される遺伝子工学処理化免疫グロブリン（Ｉｇ）として産生され得る。例えば限定ではなく例証として、抗体は、組換えＩｇＧ、免疫グロブリン由来配列を有するキメラ融合タンパク質、または本発明のヒトＨＥ４ａポリペプチドの検出のためにすべて用いられ得る「ヒト化」抗体（例えば米国特許第５，６９３，７６２号、第５，５８５，０８９号、第４，８１６，５６７号、第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号およびそれらに引用された参考文献参照）を包含し得る。このような抗体は、本明細書中に提供されるように、例えば以下に記載されるようにＨＥ４ａポリペプチドを用いた免疫感作により、調製され得る。例えば本明細書中に提供されるように、免疫原として用いるためにこれらのポリペプチドを当業者がルーチンに調製し得るよう、ＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸配列が開示される。例えばモノクローナル抗体、例えば以下でさらに詳細に記載される２Ｈ５、３Ｄ８および４Ｈ４は、本発明によるある種の方法を実施するために用いられ得る。
【００９７】
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、ならびにＨＥ４ａポリペプチドを特異的に結合する分子である任意の天然に存在するかまたは組換え的に産生される結合相手を包含する。抗体は、それらが約１０４Ｍ−１以上の、好ましくは約１０５Ｍ−１以上の、さらに好ましくは約１０６Ｍ−１以上の、さらにより好ましくは約１０７Ｍ−１以上のＫａでＨＥ４ａポリペプチドを結合する場合、「免疫特異的」であるまたは特異的に結合すると定義される。結合相手または抗体の親和性は、慣用的技法を用いて、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０ （１９４９）によりに記載された技法を用いて、容易に確定され得る。ＨＥ４ａポリペプチドの結合相手としてのその他のタンパク質の確定は、他のタンパク質またはポリペプチドと特異的に相互作用するタンパク質を同定し、得るための多数の周知の方法のいずれか、例えば米国特許第５，２８３，１７３号および米国特許第５，４６８，６１４号または等価物に記載されたような酵母二ハイブリッドスクリーニング系を用いて、実施され得る。本発明は、ＨＥ４ａポリペプチドと特異的に結合する結合相手および抗体を調製するための、ＨＥ４ａポリペプチド、ならびにＨＥ４ａポリペプチドのアミノ酸配列を基礎にしたポリペプチドの使用も包含する。
【００９８】
抗体は一般に、当業者に周知の種々の技法のいずれかにより調製され得る（例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８参照）。このような一技法では、好ましくは１つまたは複数の追加免疫感作を組み入れる予定スケジュールに従って、ＨＥ４ａポリペプチドを含む免疫原、例えばその表面にＨＥ４ａポリペプチドを有する細胞または単離ＨＥ４ａポリペプチドが、最初に適切な動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヤギ）に注射され、動物は定期的に血を抜き取られる。次に、ＨＥ４ａポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体が、例えば適切な固体支持体に結合されたポリペプチドを用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより、このような抗血清から精製され得る。
【００９９】
ＨＥ４ａポリペプチドまたはそれらの改変体に特異的なモノクローナル抗体は、例えばＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７６ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９）の技法およびその改良技法を用いて、調製され得る。要するにこれらの方法は、所望の特異性（すなわち当該メソテリンポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生可能な不死細胞株の調製を包含する。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫感作された動物から得られる脾臓細胞から産生され得る。脾臓細胞は次に、例えば、骨髄腫細胞融合相手、好ましくは免疫感作動物と同系であるものとの融合により免疫感作される。例えば脾臓細胞および骨髄腫細胞は、膜融合促進剤、例えばポリエチレングリコールまたは非イオン性洗剤と２〜３分間併合され、次に、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが骨髄腫細胞の増殖は支持しない選択培地上で低密度でプレート化され得る。好ましい選択技法は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いる。十分な時間の後、通常は約１〜２週間後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーが選択され、ポリペプチドに対する結合活性に関して試験される。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。ＨＥ４ａポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体を生じるハイブリドーマが、本発明により意図される。
【０１００】
モノクローナル抗体は、増殖中のハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、収量を増強するために、種々の技法、例えば適切な脊椎動物宿主（例えばマウス）の腹膜腔中へのハイブリドーマ細胞株の注射が用いられ得る。次にモノクローナル抗体が腹水または血液から採取され得る。慣用的技法により、例えばクロマトグラフィー、ゲル濾過、沈降および抽出により、夾雑物が抗体から除去される。例えば抗体は、標準技法を用いて固定化プロテインＧまたはプロテインＡ上でのクロマトグラフィーにより、精製され得る。
【０１０１】
特定の実施形態内では、抗体の抗原結合断片の使用が選択され得る。このような断片としては、標準技法を用いて（例えばＦａｂおよびＦｃ断片を産生するためのパパインを用いた消化により）調製され得るＦａｂ断片が挙げられる。ＦａｂおよびＦｃ断片は、標準技法を用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより（例えば固定化プロテインＡカラム上で）分離され得る（例えばＷｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ参照）。
【０１０２】
種々のエフェクタータンパク質をコードする配列にインフレームで連結されるＤＮＡ配列によりコードされる免疫グロブリンＶ領域ドメインにより、予備選定抗原に対する特異的結合親和性を有する多機能性融合タンパク質は、例えばＥＰ−Ｂ１−０３１８５５４、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号および米国特許第５，４７６，７８６号に開示されているように、当該技術分野で周知である。このようなエフェクタータンパク質は、当業者が熟知している種々の技法、限定はされないが例えばビオチン模倣配列（例えばＬｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：２２５およびそこに引用された参考文献参照）、検出可能標識部分を用いた直接共有的修飾、特異的標識レポーター分子との非共有結合、検出可能基質の酵素的修飾、あるいは固相支持体上での免疫感作（共有的または非共有的）のいずれかにより融合タンパク質の結合を検出するために用いられ得るポリペプチドドメインを包含する。
【０１０３】
本発明に用いるための単鎖抗体は、ファージディスプレイのような方法によっても生成され、選択され得る（例えば米国特許第５，２２３，４０９号；Ｓｃｈｌｅｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：４７；およびそれらに引用された参考文献参照）。要するにこの方法では、ＤＮＡ配列は、線維状ファージ、例えばＭ１３の遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩに挿入される。多重クローニング部位を有するいくつかのベクターが、挿入のために開発されている（ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １２８：２９−３６，１９９３；Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０，１９９０；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２２８−２５７，１９９３）。挿入ＤＮＡ配列は無作為に生成されるか、またはＨＥ４ａポリペプチドとの結合のための周知の結合ドメインの改変体であり得る。単鎖抗体は、この方法を用いて容易に生成され得る。一般に挿入物は、６〜２０アミノ酸をコードする。挿入配列によりコードされるペプチドは、バクテリオファージの表面に表示される。ＨＥ４ａポリペプチドに関する結合ドメインを発現するバクテリオファージは、固定化ＨＥ４ａポリペプチド、例えば当該技術分野で周知の方法および本明細書中に開示されるような核酸コード配列を用いて調製される組換えポリペプチドと結合することにより選択される。非結合ファージは、典型的には１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡを含有し、塩を有さないかまたは低塩濃度を有する洗浄液により除去される。結合ファージは、例えば塩を含有する緩衝剤で溶離される。ＮａＣｌ濃度は、すべてのファージが溶離されるまで、段階的に増大される。典型的には、高親和性で結合するファージは、より高い塩濃度により放出される。溶離ファージは、細菌宿主中で増殖される。さらに数回の選択を実施して、高親和性で結合する多少のファージに関して選択し得る。次に、結合ファージ中の挿入物のＤＮＡ配列が決定される。一旦、結合ペプチドの予測アミノ酸配列が分かれば、ＨＥ４ａポリペプチドに特異的な抗体として本明細書中で用いるのに十分なペプチドは、組換え手段により、または合成的に作製され得る。組換え手段は、抗体が融合タンパク質として産生される場合に用いられる。ペプチドは、親和性または結合を最大にするために、２つ以上の類似のまたは類似でないペプチドのタンデムアレイとしても生成され得る。
【０１０４】
ＨＥ４ａポリペプチドに特異的な抗体と反応性がある抗原決定基を検出するためには、検出試薬は典型的には抗体であり、これは本明細書中に記載されたように調製され得る。試料中のポリペプチドを検出するための抗体を用いるために当業者に周知の種々のアッセイフォーマットが存在し、例としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光測定法、免疫沈降法、平衡透析、免疫拡散法およびその他の技法が挙げられるが、これらに限定されない（例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ参照）。例えばアッセイは、ウエスタンブロットフォーマットで実施され得るが、この場合、生物学的試料からのタンパク質調製物はゲル電気泳動に付され、適切な膜に移されて、抗体と反応させられる。次に、当該技術分野で周知であり、かつ以下に記載されるような適切な検出試薬を用いて、膜上の抗体の存在が検出され得る。
【０１０５】
別の実施形態では、アッセイは、標的ＨＥ４ａポリペプチドと結合し、それを残りの試料から除去するために固体支持体上に固定された抗体の使用を包含する。結合ＨＥ４ａポリペプチドは次に、別個のＨＥ４ａポリペプチド抗原決定基と反応性の第二の抗体、例えば検出可能レポーター部分を含有する試薬を用いて検出され得る。非限定的な例として、この実施形態によると、固定化抗体、ならびに別個の抗原決定基を認識する第二の抗体は、モノクローナル抗体２Ｈ５、３Ｄ８および４Ｈ４から選択される本明細書中に記載されるモノクローナル抗体のうちの任意の２つであり得る。あるいは、ＨＥ４ａポリペプチドが検出可能レポーター部分で標識されて、固定化抗体と試料とのインキュベーション後に固定化ＨＥ４ａポリペプチドに特異的な固定化抗体と結合させられる、競合アッセイが利用され得る。試料の構成成分が標識ポリペプチドと抗体との結合を阻害する程度は、試料と固定化抗体との反応性を示し、その結果、試料中のＨＥ４ａのレベルを示す。
【０１０６】
抗体が結合され得る固体支持体は、当業者に周知の任意の材料、例えばマイクロタイタープレート中の試験ウエル、ニトロセルロースフィルターまたは別の適切な膜であり得る。あるいは支持体は、ビーズまたは円板、例えばガラス、ファイバーグラス、ラテックスまたはプラスチック、例えばポリスチレンまたはポリ塩化ビニルであり得る。抗体は、特許および科学文献中に詳細に記載されている当業者に周知の種々の技法を用いて、固体支持体上に固定され得る。
【０１０７】
ある種の好ましい実施形態では、試料中のＨＥ４ａ抗原ポリペプチドの検出のためのアッセイは、二抗体サンドイッチアッセイである。このアッセイは、試料中に天然に存在し、抗体と反応性がある抗原決定基を有する可溶性分子が固定化抗体に結合されて（例えば室温で３０分間のインキュベーション時間で一般的に十分である）、抗原−抗体複合体または免疫複合体を形成するように、まず、固体支持体に、一般的には微小滴定プレートのウエルに固定されたＨＥ４ａポリペプチド特異的抗体（例えば２Ｈ５、３Ｄ８または４Ｈ４等のモノクローナル抗体）を、生物学的試料と接触させることにより実施され得る。次に、試料の非結合構成成分が、固定化免疫複合体から除去される。次に、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二抗体が付加されるが、この場合、第二の抗体の抗原結合部位は、固定化第一抗体の抗原結合部位とＨＥ４ａポリペプチド（例えば固体支持体上に固定されたモノクローナル抗体と同一でない２Ｈ５、３Ｄ８または４Ｈ４のようなモノクローナル抗体）との結合を競合的に阻害しない。第二の抗体は、直接検出され得るよう、本明細書中に提供されるように検出可能に標識され得る。あるいは第二の抗体は、検出可能に標識された第二の（または「第二段階」）抗抗体の使用により、または本明細書中に提供されるような特異的検出試薬の使用により、間接的に検出され得る。イムノアッセイに精通した者は、二抗体サンドイッチイムノアッセイにおいて特定抗原（例えばメソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎｅ）ポリペプチド）を免疫学的に検出するための多数の試薬および立体配置が存在することを理解するので、本発明の方法は、いかなる特定の検出手法にも限定されない。
【０１０８】
上述の二抗体サンドイッチアッセイを用いる本発明のある種の好ましい実施形体では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な一次固定化抗体はポリクローナル抗体であり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二の抗体はポリクローナル抗体である。本発明のある種のその他の実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な一次固定化抗体はモノクローナル抗体であり、統一のため、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二の抗体はポリクローナル抗体である。本発明のある種のその他の実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な一次固定化抗体はポリクローナル抗体であり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二の抗体はモノクローナル抗体である。本発明のある種のその他の非常に好ましい実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な一次固定化抗体はモノクローナル抗体であり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二の抗体はモノクローナル抗体である。例えばこれらの実施形態では、これらのモノクローナル抗体の任意の対方式の組合せが用いられ得るよう、本明細書中に提供されるようなモノクローナル抗体２Ｈ５、３Ｄ８および４Ｈ４は、ＨＥ４ａポリペプチド上の別個の、非競合的抗原決定基（例えばエピトープ）を認識する、ということに留意すべきである。本発明のその他の好ましい実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な一次固定化抗体および／またはＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二の抗体は、当該技術分野で周知であり、かつ本明細書中で言及される、例えば限定ではなく例証として、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、免疫グロブリンＶ領域融合タンパク質または単鎖抗体と呼ばれる抗体の種類のいずれかであり得る。本発明は、本明細書中に開示され、特許請求された方法におけるその他の抗体形態、断片、誘導体等の使用を包含すると、当業者は理解する。
【０１０９】
ある種の特に好ましい実施形態では、第二の抗体は、検出可能レポーター部分または標識、例えば酵素、染料、放射性核種、発光基、蛍光基またはビオチン等を含有し得る。次に、固体支持体に結合されたままの第二の抗体の量が、特異的検出可能レポーター部分または標識に適した方法を用いて確定される。放射性基に関しては、シンチレーション計数またはオートラジオグラフ法が一般に適している。抗体−酵素接合体は、種々のカップリング技法を用いて調製され得る（概説に関しては、例えばＳｃｏｕｔｅｎ ，Ｗ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３５：３０−６５，１９８７参照）。分光分析法は、染料（例えば酵素反応の比色分析産物）、発光基および蛍光基を検出するために用いられ得る。ビオチンは、異なるレポーター基（一般的に放射性基または蛍光基または酵素）に結合されたアビジンまたはストレプトアビジンを用いて検出され得る。酵素レポーター基は一般に、基質の付加（一般に特定時間の）と、その後の分光分析、分光光度分析または反応産物のその他の分析により検出され得る。標準および標準付加は、周知の技法を用いて、試料中のメソテリンポリペプチドのレベルを確定するために用いられ得る。
【０１１０】
別の実施形態では、本発明は、生物学的供給源または被験体からの生物学的試料中の免疫特異的反応性抗体の検出により悪性症状の存在に関してスクリーニングするための、本明細書中に提供されるようなＨＥ４ａ抗原ポリペプチドの使用を意図する。この実施形態によれば、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（あるいはその断片または改変体、例えば本明細書中に提供されるような短縮ＨＥ４ａ抗原ポリペプチド）は検出可能に標識され、生物学的試料と接触されて、試料中の天然で可溶性形態の抗体のＨＥ４ａ抗原ポリペプチドとの結合が検出される。例えばＨＥ４ａ抗原ポリペプチドは、周知の方法、例えば容易に検出可能な（例えば放射性標識された）アミノ酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳中の取り込みと呼応して、本明細書中に開示された配列を用いることにより、あるいはその他の検出可能レポーター部分、例えば上記のものを用いることにより、生合成的に標識され得る。理論に結び付けて考えたくはないが、本発明のこの実施形態は、ある種のＨＥ４ａポリペプチド、例えば本明細書中に開示されたＨＥ４ａ融合ポリペプチドが、特に免疫原性であるために特異的かつ検出可能な抗体を生じるポリペプチドを提供し得る、ということを意図する。例えばこの理論によれば、ある種のＨＥ４ａ融合ポリペプチドは、強烈な免疫応答を引き起こす「非自己」抗原を示し得るが、一方、融合ドメインを欠くＨＥ４ａポリペプチドは、体液性または細胞媒介性免疫を容易に引き出さない、より類似する「自己」抗原として、免疫系により見られ得る。
【０１１１】
上記のように、本発明は、一部は、可溶性形態のＨＥ４ａ抗原ポリペプチドが被験体中に天然に存在し、例えばある種の癌腫を有する被験体においてこのような可溶性ＨＥ４ａポリペプチドのレベルが増大する、という意外な知見に関する。
【０１１２】
本発明による悪性症状の存在に関するスクリーニング方法は、被験体からの生物学的試料中の２つ以上の腫瘍関連マーカーの検出により、さらに強化され得る。したがって、特定の実施形態では、本発明は、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体との天然に存在する可溶性試料構成成分の反応性を検出するほかに、当該技術分野で周知の、そして本明細書中に提供されるような確立された方法を用いた悪性症状の少なくとも１つの付加的な可溶性マーカーの検出も包含するスクリーニング方法を提供する。上記のように、容易に得られる生物学的流体の試料中に検出可能であるいくつかの可溶性腫瘍関連抗原が一般的に存在する。例えば本発明の特定の実施形態は、Ｓｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１１５３１）に記載され、そして米国特許出願０９／５２３，５９７号にもに記載されているような新規の可溶性メソテリン関連抗原（ＭＲＡ）ポリペプチドのようなポリペプチドを含むヒトメソテリンポリペプチドに関する。
【０１１３】
本明細書中に提供されるように、「メソテリンポリペプチド」は、以下のペプチド：
ＥＶＥＫＴＡＣＰＳＧＫＫＡＲＥＩＤＥＳ（配列番号１４）
を含むアミノ酸配列を有し、そしてさらに、ＭＡｂ Ｋ−１（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３６；ＭＡｂ Ｋ−１は、例えばＳｉｇｎｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡから入手可能である）の、あるいはＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．０９／５１３，５９７に提供されたようなモノクローナル抗体ＯＶ５６９、４Ｈ３、３Ｇ３または１Ａ６の免疫特異的結合を競合的に阻害する抗原結合部位を有する少なくとも１つの抗体と反応性がある少なくとも１つの抗原決定基を有する可溶性ポリペプチドである。
【０１１４】
したがって、本発明により用いるためのこれらの付加的な可溶性腫瘍関連抗原としては、メソテリンおよびメソテリン関連抗原、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、シアリルＴＮ、ＳＣＣ、ＴＰＳおよびＰＬＡＰが挙げられるが、これらに限定されず、例えば、Ｂａｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９：８８３；Ｌｉｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ．７１：８４２；Ｓａｒａｎｄａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ．３６：７５５；Ｓａｒａｎｄａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１９：７３；Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃ Ｒｅｓ．１７（４Ｂ）：２９４５；Ｋｕｄｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｉｎｖｅｓｔ．４７：５２；Ｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．１０４：１０２４；Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．１０５：１１３６；Ｃｉｏｆｆｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｔｕｍｏｒｉ ８３：５９４；Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１７（４Ｂ）：２９４９ Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１７（４Ｂ）：３０１１９を参照、そしてさらに、生物学的試料中のそれらの存在が本明細書中に提供されるような少なくとも１つの悪性症状の存在と相関し得る任意の周知のマーカーが挙げられ得る。
【０１１５】
あるいは、ＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸配列は、標準ハイブリダイゼーションおよび／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を用いて検出され得る。本明細書中に提供されるＨＥ４ａ ｃＤＮＡ配列に基づいて、適切なプローブおよびプライマーが当業者により設計され得る。アッセイは一般に、生物学的供給源、例えば真核生物細胞、細菌，ウイルス、このような生物体から調製される抽出物、ならびに生体内に見出される流体から得られる種々の試料のいずれかを用いて実施され得る。
【０１１６】
以下の実施例は例証として提供されるものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１１７】
（実施例１：ヒト試料中のＨＥ４ａ発現の実時間ＰＣＲ検出）
ワシントン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、スウェーデン病院（Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）およびフレッド・ハッチンソン癌リサーチセンター（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）（すべてワシントン州シアトル所在）により認可された手法に従って、１５８例のヒト組織生検または生検からのＲＮＡ試料を得た。正常組織（副腎、骨髄、脳、結腸、子宮内膜、胃、心臓、腎臓、肝臓、肺、肺、乳腺、骨格筋、骨格筋、子宮筋層、末梢神経、末梢血リンパ球調製物、唾液腺、皮膚、小腸、脊髄、脾臓、脾臓、気管、胸腺、子宮、末梢血リンパ球培養および４０例の正常卵巣）からの、良性卵巣病変（１３例の漿液性嚢腺腫）からの、境界悪性疾患の２例の卵巣腫瘍からの、３例のＩ期粘液性卵巣癌腫からの、３例のＩ期漿液性卵巣癌腫からの、３７例のＩＩＩ期漿液性卵巣癌種からの、７例のＩＶ期漿液性卵巣癌腫からの試料、転移性卵巣癌種からの組織の６例の試料、および卵巣癌を有する女性からの２例の卵管が含まれた。組織試料はすべて、治療前の女性から採取し、各腫瘍の一部は、直ちに液体窒素中に入れて、残りの検体はルーチン組織学検査に付した。組織病理学的検査で８０％より多い腫瘍細胞からなることが判明した、そして壊死を伴わない試料のみを、ハイブリダイゼーションおよび実時間ＰＣＲ実験に用いた。卵巣表面上皮培養（ＯＳＥ、Ｂ．Ｋａｒｌａｎ，Ｃｅｄａｒｓ Ｓｉｎａｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｌｏｓ Ａａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡから入手）からのＲＮＡ、ならびに３例の付加的ＯＳＥ試料（Ｒ．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）も含まれた。全１５１例（非悪性組織９４例および癌５７例）を、下記のようにＨＥ４ａを含めた当該遺伝子の過剰発現の実時間定量的ＰＣＲ確証のために保存した。
【０１１８】
実時間定量的ＰＣＲを、以下のように実施した。ＨＥ４実時間ＰＣＲプライマーは、以下の：
ＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＧＧＣＧＴＧＴ（フォワード）（配列番号１５）
および
ＧＡＡＡＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＧＧＴＣＡ（リバース）（配列番号１６）
であった。
【０１１９】
これらのプライマーは、４２７塩基長（ｂｐ）のＰＣＲ産物を生じた。メーカーに特定されたようにオリゴ−ｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いて、総ＲＮＡを逆転写した。ＡＢＩ７７００機（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）およびＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎプロトコールを用いて、実時間定量的ＰＣＲを実施した。白血球ｃＤＮＡ調製物の２倍連続希釈の５つの複製物を、標準（Ｓ３１ｉｉｉ１２５、これは、従来の実験では、正常および悪性組織において普遍的に発現されることが実証された。Ｓｃｈｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｇｅｎｅ１９９９参照）の増幅のための鋳型として役立てた。
【０１２０】
ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｕ６１７３４、フォワードプライマー：ＣＧＡＣＧＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡ（配列番号１７）
リバースプライマー：ＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡ（配列番号１８）。
【０１２１】
負の対照は、酵素を用いずに逆転写された卵巣癌腫からの総ＲＮＡからなり、そして一ウエルは、いかなる鋳型も伴わずにＰＣＲの全構成成分を含有した。全行程を二重反復試験で実施した。単一ＰＣＲ帯域の存在に関して、各行程をアガロースゲル上で分析し、人工帯域を排除した。各９６ウエルプレートに関する結果を、ＰＣＲ機のメーカーにより提供されたソフトウエア（シーケンスデテクター（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（登録商標））を用いて分析した。この分析は、標準に対する該核酸配列（ＨＥ４ａ）の発現レベルの確定を可能にした。
【０１２２】
発現値は、図１に示したように、内部標準に対して任意の単位で示したが、測定の標準単位でのｍＲＮＡ分子の絶対量を反映しなかった。平均ＨＥ４ａ発現レベルの振幅およびこれらの値とその他の周知の遺伝子（注目すべきは高発現遺伝子としてのβアクチン）の比較に基づいて、図１は、ＨＥ４ａをコードする転写体が中等度〜高度の相対レベルで発現されたことを示す。
【０１２３】
（実施例２：ＨＥ４ａをコードする核酸配列のクローニングおよび発現）
高生産量ＨＥ４ａ ｃＤＮＡクローンからのＨＥ４ａ融合構築物ｃＤＮＡの増幅：Ｋｉｒｃｈｏｆｆ等（１９９１）により最初に発表されたＨＥ４に関するｃＤＮＡ配列（配列番号８）を、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ６３１８７に寄託し、本明細書中に記載されるようなＨＥ４ａをコードするｃＤＮＡ（配列番号１０）をクローン化するためのオリゴヌクレオチドプライマー設計の基礎を提供した。高生産量ｃＤＮＡアレイを用いて示差的発現された遺伝子産物として同定され、単離されたＨＥ４ａに関するｃＤＮＡを、ｐＳＰＯＲＴ中で８４０塩基対断片としてクローン化した。このｃＤＮＡをＰＣＲ反応において鋳型として用いて、本実施例に記載したような合成融合タンパク質遺伝子を作製するのに適した形態でＨＥ４ａを増幅した。
【０１２４】
ＨＥ４コード配列（配列番号８）の一部は、推定分泌シグナルペプチドをコードすると思われた。したがってこのネイティブリーダーペプチドを最初の構築物に用いて、できるだけ多くの分子の構造を保存した。さらに、ＨＥ４ａは相対的に小さく、配列はいかなる異常な構造的特徴、例えば膜貫通ドメインまたは細胞質ターゲッティング配列も含有しなかったため、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに融合された完全ＨＥ４ａ遺伝子産物を組入れた融合タンパク質を設計した。クローニングに適した制限部位をコードするプライマーを設計し、最終構築物のためのタンパク質ドメインの必要な枠内融合を作製した。５’プライマー（配列番号１またはＨＥ４−５’）は３９−ｍｅｒで、これはＨｉｎｄＩＩＩ部位、最初のＡＴＧに隣接する発現を改良するためのＫｏｚａｋ配列、ならびに前に公表されたＨＥ４配列を基礎にしたＨＥ４ａリーダーペプチドの一部を包含した。３’プライマー（配列番号２またはＨＥ４−３’−１）は３６−ｍｅｒで、これはヒトＩｇ尾部ｃＤＮＡへの融合のための枠内ＢａｍＨＩ部位を含み、ＨＥ４コード配列の３’末端はＳＴＯＰコドン直前で切頭された。これら２つのプライマーを５０ｐｍｏｌで、そして１ ｎｇのＨＥ４／ｐＳＰＯＲＴプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲ増幅反応を実施した。５０μｌの反応物は、２．５単位（０．５ｍｌ）のＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ Ｓｈｕｚｏ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）、希釈緩衝液およびヌクレオチドも、パッケージ挿入使用説明書にしたがって含入した。９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒の増幅プロフィールで、反応物を３０回増幅した。全長ＨＥ４に関する予測サイズ（約４００塩基対）のＰＣＲ産物を得た。
【０１２５】
これらの断片を制限消化し、精製して、ヒトＩｇＧ１挿入物をすでに含有する適切に消化された哺乳動物発現プラスミドに結繋した。結繋産物をＤＨ５α細菌細胞中で形質転換させて、形質転換体をＨＥ４−ｈＩｇＧ１融合遺伝子挿入物の存在に関してスクリーニングした。次に、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１０（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）シーケンサーでＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクルシーケンシングキット（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、いくつかの単離物からのプラスミドＤＮＡをシーケンシングした。さらに、これらの単離物からのプラスミドＤＮＡをまた、に記載されたように（Ｈａｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：３）ＣＯＳ７細胞のＤＥＡＥ−デキストラン一過性トランスフェクションにより、トランスフェクトした。培養上清を７２時間後に採取し、プロテインＡ−アガロースを用いた免疫沈降、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびウエスタンブロッティングによりスクリーニングした（図２）。ヤギ抗ヒトＩｇＧ接合体を１：５０００で用いて、その後ＥＣＬ現像を用いて、ウエスタンブロットをプローブした。
【０１２６】
配列分析からの結果は、得られたＨＥ４ａコード配列（配列番号１０）および推定アミノ酸配列（配列番号１１）は、公表済みＨＥ４コード（配列番号８）および翻訳化（配列番号９）配列とはいくつかの位置で異なる、ということを示した。したがって配列は、正常ヒト精巣上体からおよびいくつかの腫瘍細胞株から得られるｃＤＮＡから、および原発性腫瘍ＲＮＡから得て、そして配列番号１０に記述されるようなＨＥ４ａコード配列および配列番号１１に記述される推定コード化アミノ酸配列を確証した。
【０１２７】
腫瘍細胞株からのＨＥ４ｃＤＮＡのクローニング：メーカーの使用説明書に従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、いくつかの卵巣腫瘍細胞株、例えば４００７およびＯＶＣＡＲ３（例えばＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．６１：２４２０参照）から、ＲＮＡを調製した。メーカーの指示に従って１〜３μｇのＲＮＡ、無作為六量体およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｃＤＮＡを調製した。１μｇのｃＤＮＡ、２．５単位（０．５ｍｌ）のＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ Ｓｈｕｚｏ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）、希釈緩衝液およびヌクレオチドを、パッケージ挿入使用説明書にしたがって含入する５０μｌの反応液中の無作為プライム化ｃＤＮＡならびにＨＥ４−５’およびＨＥ４−３’−１特異的プライマーから、ＨＥ４ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒の増幅プロフィールで、反応物を３０回増幅した。腫瘍由来ｃＤＮＡからのＨＥ４のＰＣＲ増幅のために、ＨＥ４−５’およびＨＥ４−３’−１オリゴヌクレオチドを再び用いた。全長ＨＥ４に関する予測サイズのＰＣＲ産物を得て、配列分析のために、断片をｐＴ−ＡｄｖａｎＴＡｇｅベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）中でクローン化した。挿入物を有するクローンを上記と同様にシーケンシングし、腫瘍ＲＮＡ試料からのＰＣＲ断片は、上記の元のクローンと同一のＨＥ４ａ配列をコードすることが判明した。これらのＨＥ４ａ配列は、ＨＥ４に関する公表済み配列とは異なっていた（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。同様に、ＨＥ４ａコード配列は、正常精巣上体（配列番号１０）から、ならびに原発性腫瘍組織ｃＤＮＡ（配列番号１２）から得られ、したがって上記の新規ＨＥ４ａ配列と適合したが、しかしＫｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９１）のＨＥ４配列（配列番号８）とは異なった。
【０１２８】
ＨＥ４Ｉｇ融合タンパク質の産生：上記のｐＣＤＮＡ３の誘導体である哺乳動物発現ベクターｐＤ１８の多クローニング部位に、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片として、ＨＥ４−ｈＩｇＧ１ ｃＤＮＡ構築物（配列番号７）を挿入した（Ｈａｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４８：２４２）。構築物を、上記（Ｈａｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：３）のようにＤＥＡＥ−デキストラン一過性トランスフェクションにより、最初にトランスフェクトした。いくつかの単離物からのプラスミドＤＮＡを調製し、ＣＯＳ７細胞を一過性トランスフェクトするために用いた。培養上清を７２時間後に採取し、プロテインＡ−アガロースを用いた免疫沈降、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびウエスタンブロッティングによりスクリーニングした（図２）。
【０１２９】
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．１９８６ Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５）を用いて、高レベルの当該融合タンパク質を発現する安定株を構築した。ｐＤ１８ベクター中で高コピー電気穿孔により（Ｈａｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４８：２４２；Ｂａｒｓｏｕｍ，１９９０ ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：２９３）、ならびに組換えインスリン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）、グルタミン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＥＭのための２×非必須アミノ酸（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１００ｎＭのメトトレキセート（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するエクセル３０２ＣＨＯ培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＰＡ）中での限定希釈によるメトトレキセート耐性クローンの選択により、ＨＥ４Ｉｇを発現する安定ＣＨＯ株を作製した。次に耐性クローンからの培養上清をＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡによりアッセイして、高産生株に関してスクリーニングした。消耗上清を大規模培養から採取し、２ｍｌプロテインＡ−アガロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）カラム上でのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、ＨＥ４Ｉｇを精製した。融合タンパク質を０．１Ｍクエン酸塩緩衝液（ｐＨ２．７）中の０．８ｍｌ分画としてカラムから溶離し、１００μｌの１Ｍトリスベース（ｐＨ１０．５）を用いて中和した。溶離分画を２８０ｎｍでの吸光度に関してアッセイし、融合タンパク質を含有する分画をプールして、７リットルのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で一晩透析し、０．２μｍの注射器フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を通して濾過滅菌した。
【０１３０】
安定トランスフェクト体を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスの感作のために十分なタンパク質を産生した。マウスを最初に１０μｇの精製ＨＥ４−ｈＩｇＧ１融合タンパク質を用いて、４週間間隔で腹腔内（ＩＰ）注射した。この免疫感作プロトコールを用いた初回注射および２回の追加免疫後、１０μｇのタンパク質＋ＴｉｔｅｒＭａｘ金アジュバントＩＰを、次にさらに２回の追加免疫のＳＣをマウスに注射した後、脾臓を摘出した。感作マウスからの脾臓細胞を骨髄腫相手Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５３と融合することにより、ハイブリドーマを作製した。
【０１３１】
ＨＥ４Ｉｇ融合タンパク質のウエスタン分析：１０％Ｔｒｉｓ／ＢｉｓＮＯＶＥＸゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により、タンパク質試料を分解し、半乾燥ブロッティングによりＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に移した。ＰＢＳ／０．２５％ＮＰ−４０またはＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）中の５％脱脂乾燥乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）中で、４℃で一晩インキュベートすることにより、膜を遮断して、非特異的抗体結合を防止した。膜を、ＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１／１０，０００）とともに、またはＴＢＳ−Ｔ中のＨＲＰ−ストレプトアビジン（１：５０００）（Ｃａｌｔａｇ）とともに、室温または４℃で１時間、静かに撹拌しながらインキュベートした。ＴＢＳＴで２回すすぎ、４回洗浄後、ＥＣＬ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）試薬中で６０秒間、膜をインキュベートし、帯域の可視化のためにオートラジオグラフィーフィルムに曝露した（図２）。培養上清から、または精製試料のプロテインＡ溶離液から融合タンパク質試料を採取し、５０μｌのプロテインＡアガロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いてプロテインＡを沈降させた。免疫沈降物を洗浄し、緩衝剤を投入したＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元試料中に再懸濁して、沸騰させ、次に１０％Ｔｒｉｓ／ＢｉｓＮＯＶＥＸゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分解し、半乾燥ブロッティングによりＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に移した。ＰＢＳ／０．２５％ＮＰ−４０またはＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）中の５％脱脂乾燥乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）中で、４℃で１時間から一晩インキュベートすることにより、膜を遮断して、非特異的抗体結合を防止した。膜を、ＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１／１０，０００）とともにインキュベートし、ＴＢＳ−Ｔ中で洗浄して、ＥＣＬ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）試薬中で６０秒間、曝露した。次にＥＣＬ−ブロットを、帯域の可視化のためにオートラジオグラフィーフィルムに曝露した。図２のレーン１は、ＣＴＬＡ４−ｈＩｇＧ１トランスフェクト化ＣＯＳ７細胞の上清からの免疫沈降試料を含有し、レーン３およびレーン４はＨＥ４−ｈＩｇＧ１融合タンパク質培養上清を含有し、レーン５は偽トランスフェクト化ＣＯＳ上清を含有した。ＨＥ４−ｈＩｇＧ１融合タンパク質は、還元ゲルまたはウエスタンブロット上で約４８ｋＤａの見かけのＭｒで走行し、予測アミノ酸配列に基づいて予測された３９ｋＤａより大きかったが、これは、分子がグリコシル化されたことを示唆する。
【０１３２】
ＨＥ４−ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質の構築および発現：ＨＥ４−ｈＩｇＧ１融合遺伝子と同様の構築物を作製したが、しかしヒトＩｇＧ Ｆｃ断片の代わりにネズミＩｇＧ２ａドメインを用いた。マウスの免疫感作がヒトＩｇ尾部融合ドメインの免疫原性により影響を受けないよう、代替尾を用いた。ｍＩｇＧ２ａ尾部の既存のｃＤＮＡクローンは、上記のＨＥ４ａクローンに関して枠外にあり、したがってｍＩｇＧ２ａカセットをこのようなプラスミドから再増幅して、枠内融合ドメインを作製した。用いたフォワードセンスプライマーは、
ｍＩｇＧ２ａＢＡＭＩＦ：
５’−ｇｔｔｇｔｃｇｇａｔｃｃｇａｇｃｃｃａｇａｇｇｇｃｃｃａｃａａｔｃａａｇ３’（配列番号１９）
であり、一方、リバースアンチセンスプライマーを以下のように命名した：
ｍＩｇＧ２ａ３’Ｘｂａ＋Ｓ：
５’−ｇｔｔｇｔｔｔｃｔａｇａｔｔａｔｃａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇｔｃｃｇｇｇａｇａａｇｃｔｃ−３’（配列番号２０）
用いた鋳型は、ネズミＩｇＧ２ａ Ｆｃドメインに融合されるが、コドンスペーシングに関する枠害の融合接合部に制限部位を有さないネズミＣＴＬＡ４を含有した。ＨＥ４との融合遺伝子が完全ＨＥ４−ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質の発現を生じるよう、新規のオリゴヌクレオチドは、フレームシフトを作製し、ＢａｍＨＩ部位でのリーディングフレームを変更する。ヒト融合遺伝子に関してに記載したのと同様に、ＰＣＲ産物を増幅し、サブクローニングして、プロセシングした。ＨＥ４−ヒトＩｇＧ１融合タンパク質に関して上記したのと同様に、分子をｐＤ１８哺乳動物発現ベクター中でサブクローニングし、安定ＣＨＯクローンを生成し、癒合タンパク質を発現させた。
【０１３３】
（実施例３：ＨＥ４ａに特異的なモノクローナル抗体）
抗ＨＥ４ａＭａｂの生成：最初の実験で、上記と同様に調製したＨＥ４ａ−ｈＩｇＧ融合タンパク質を用いて、アジュバントを用いた場合と用いない場合とで、数匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作した。これらのマウスにおいて高抗体力価が観察されたが、ｈＩｇＧ尾を有する対照融合タンパク質（ＣＴＬＡ４−ｈＩｇ融合）に対して同様に高い力価が観察されたため、抗体はＨＥ４ａに特異的でなかった。したがって、ＨＥ４ａ−ｍＩｇＧ融合タンパク質を免疫感作のために用いた。図３は、メーカーの使用説明書に従ってＨＥ４ａ−ｍＩｇＧ＋アジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ（商品名）、ＣｙｔＲｘ Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）で各々２回免疫感作された（尾部に皮下投与された）２匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（１６０５および１７３４）におけるＨＥ４ａに対して高力価（ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒｅｄ）抗体をもたらした２つの免疫感作からの結果を示す。高いＨＥ４ａ特異的抗体力価を示すマウスからの脾臓細胞を用いて標準方法により、ＨＥ４ａ特異的ハイブリドーマを調製した。図４は、マウス１６０５（その血清データを図３に示す）からの脾臓細胞を用いて作製されたハイブリドーマの、ＥＬＩＳＡによる初回試験を示す。３つのウエルは、ＨＥ４ａ−ｈＩｇに対して高反応性を示した。その後、限定希釈によるクローニング後に、３つのハイブリドーマ２Ｈ５、３Ｄ８および４Ｈ４をこれらのウエルから単離した。ハイブリドーマ２Ｈ５および３Ｄ８は、競合アッセイにより異なるエピトープを確認することが判明した。
【０１３４】
腫瘍診断のためのＥＬＩＳＡの構築および適用：上記で言及した２つのＭＡｂ２Ｈ５および３Ｄ８を用いて、血清およびその他の流体中のメソテリン／ＭＰＦおよび関連抗原を測定するＥＬＩＳＡ（Ｓｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，１１５３１，１９９９）の作製に用いたのと同様のアプローチを用いて、二重決定因子（「サンドイッチ」）ＥＬＩＳＡを構築した。図５は、ＤＭＥＭ培地中で希釈されたＨＥ４ａ−ｈＩｇＧを用いて調製された標準曲線の一例を示す。図に示したように、１ｎｇのレベルのＨＥ４ａ−ｈＩｇＧで、シグナルを検出した。図５は、卵巣癌腫株（４００７）からの非希釈培地が検出可能シグナルを示した、ということも示す。図６は、卵巣癌を診断された患者（ＯＶ５０で示す）からの腹水が、試験した最高希釈（１：１２８０）で依然として検出可能であったＨＥ４ａ抗原を含有した、ということを示す。
【０１３５】
用いた２つの抗体の最適量を確定することにより、初回ＨＥ４ａＥＬＩＳＡを改良した。これらの抗体の１つである２Ｈ５をビオチニル化し、他方の抗体３Ｄ８を、試験プレートの底に結合させることにより固定した。アッセイのための２つのモノクローナル抗体のそれぞれの用量は、２．５および１００μｇ／ｍｌであった。異なるＭａｂおよび直前に記載した使用中のＭａｂの用量を除いて、アッセイ方法は、メソテリン／ＭＰＦおよび関連分子に関してに記載したものと同一であった（Ｓｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，１１５３１）。
【０１３６】
卵巣癌を有する患者からのならびに種々の対照からの血清の予備試験は、ＨＥ４ａタンパク質が、卵巣癌を有する患者、例えば早期疾患を有する患者の有意の分画で増大されるが、バックグラウンドが非常に低い対照血清中では増大されないことを示した。上記のサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイおよび約４００名の患者からのコード化血清試料（Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡにより提供された）を用いた試験では、卵巣癌と診断された患者からの全試料が、ＨＥ４ａＥＬＩＳＡにより陽性であると正しくスコアされ、これはさらに擬陽性と予測されることはなかった。したがって、理論に結び付けて考えたくはないが、血清およびその他の体液中のＨＥ４ａタンパク質に関するアッセイは、それにより卵巣癌に関する既存の診断アッセイ（例えばＣＡ１２５）に対する臨床的に有益な補足物を提供し得ることが意図される。さらに、ＥＬＩＳＡは卵巣癌の診断を補助するその能力に関して今まで調べられてきたが、ＨＥ４ａコード抗原を過剰発現する任意の腫瘍にも同様に適用可能であるはずである。同一のＥＬＩＳＡまたはその変法は、将来的な試験がこのようなものを同定する場合には、ＨＥ４関連分子の試験にも適用可能であるはずである。
【０１３７】
細胞表面でのＨＥ４タンパク質の発現：卵巣癌細胞株を負の対照としてのＢ細胞株とともに用いて、フローサイトメトリーを用いて実施した試験は、ＨＥ４ａコード抗原がいくつかの卵巣癌の間で、細胞表面で発現される、ということを示した。用いた細胞株および用いたフローサイトメトリー技法は、以前に記載されている（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１，２４２０）。例えば、ＯＶＣＡＲ３細胞の９３％が陽性であり、同様に卵巣癌株４０１０からの細胞の７１％および卵巣癌株ＨＥ５０ＯＶからの細胞の３８％が陽性であったが、一方、試験した別の１０例の卵巣癌株からは２０％未満の細胞が陽性であった。このことは、非限定理論によると、細胞表面のＨＥ４ａ抗原は、ＨＥ４ａ特異的抗体媒介性および／またはＨＥ４ａ特異的Ｔ細胞媒介性療法といったような免疫療法戦略のための標的を提供する、ということを示唆する。
【０１３８】
（実施例４：ＨＥ４ａエピトープを標的化する予防的および治療的ワクチン）
上記の組成物および方法を用いて、ある種の腫瘍（特に悪性卵巣腫瘍）中でのＨＥ４ａコード核酸配列の増幅および／またはＨＥ４ａ過剰発現の検出を実施し、ＨＥ４ａ発現レベルを正常組織中のレベルと比較する。腫瘍中のＨＥ４ａ特異的モノクローナル抗体規定エピトープの出現増大は、癌療法における適用可能性を有する予防的または防止的ワクチンに対する標的として用いられるＨＥ４ａエピトープの同定を提供する。このようなワクチンはまた、受精能（特定の実施形態では、四−ジスルフィドコアファミリーの成員、例えばＳｌｐ−１によるプロテアーゼ阻害に関する周知のアッセイを用いたＨＥ４ａプロテアーゼ阻害またはプロテアーゼ強化活性の実証により反映され得る）を有用に変更し得る（例えば適切な対照と比較して、統計学的に有意の方法で増大または低減する）。ワクチン製造のための多様なアプローチが確認されており、多数の概論に記載されている（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．"Ｖａｃｃｉｎｅｓ"，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ｐ．４６３，１９９９による）。これらの例としては、タンパク質、融合タンパク質およびペプチド、ＤＮＡプラスミド、組換えウイルス、抗イディオタイプ抗体、ペプチドエピトープでｉｎ ｖｉｔｒｏでパルス処理された樹状細胞、ならびに抗イディオタイプ抗体の使用が挙げられるが、これらに限定されない。ワクチンは、単独で、またはアジュバントおよび／またはリンホカイン、例えばＧＭＣＳＦと組合せて、用いられ得る。非限定的な理論によれば、Ｔ細胞は細胞表面のＭＨＣ分子の状況で存在するエピトープを認識するが、循環抗原または免疫複合体と反応しないため、上記のような循環可溶性ＨＥ４ａタンパク質の検出は、Ｔ細胞媒介性免疫を誘導するワクチンの使用を妨害するとは予測されない。
【０１３９】
上記から、説明のために本発明の特定の実施形態を本明細書中に記載してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の変更が成され得る、と理解される。したがって本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０１４０】
本明細書中では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」とは、「包含する、または〜からなる」ことを意味し、そして「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは「〜を包含する、または〜からなる」ことを意味する。
【０１４１】
特定の形態で、または開示された機能、あるいは開示された結果を得るための方法または過程を実施するための手段に関して表された上記の説明または添付の特許請求の範囲あるいは添付の図面に示された特質は、適宜、別個に、またはこのような特質の任意の組合せで、その多様な形態で本発明を実現するために利用され得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、悪性症状（例えば癌）に、特にある種の癌腫（例えば卵巣癌）を診断するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌は、広範な疾患を包含しており、世界中で４人に約１人が罹患している。癌の悪影響の重症度は顕著であり、医療政策および手法に、ならびに一般的に社会に影響を及ぼす。多くの種類の癌の特質は悪性細胞の急速かつ非調節性増殖であるため、癌へのアプローチ改善に際しての中心となる問題は、早期の検出および診断の必要性である。悪性症状の存在を診断するための正確で、信頼できる判定基準を開発するために、多数の試みがなされてきた。特に、癌細胞により独自に発現されるかまたは悪性症状を有する被験体において顕著に高レベルで存在する腫瘍関連抗原として周知である血清学的に限定された抗原性マーカーの使用に向けて努力がなされてきた。
【０００３】
しかしながら腫瘍関連抗原発現の高不均質性、例えば癌抗原の極端な多様性のために、癌診断に有用である付加的な腫瘍マーカーが必要である。癌関連抗原と反応性の多数のモノクローナル抗体が周知である（例えばＰａｐｓｉｄｅｒｏ，１９８５ Ｓｅｍｉｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１：１７１，Ａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｓｕｒｇ．Ａｎｎ．１８：４１参照）。これらのそしてその他のに記載されたモノクローナル抗体は、種々の異なる癌関連抗原、例えば糖タンパク質、糖脂質およびムチンと結合する（例えばＦｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．９：１２１；米国特許第４，７３７，５７９号；米国特許第４，７５３，８９４号；米国特許第４，５７９，８２７号；米国特許第４，７１３，３５２号参照）。多数のこのようなモノクローナル抗体は、所定の細胞系列または組織型から生じるある腫瘍上では制限発現を示すが、他の腫瘍では示さない腫瘍関連抗原を認識する。
【０００４】
特定の種類の悪性疾患を同定するために有用であるようである腫瘍関連抗原の例は相対的にほんのわずかである。例えばモノクローナル抗体Ｂ７２．３は、多数の異なる癌、例えばすべてでないがほとんどの卵巣癌および圧倒的大多数の非小細胞肺癌、結腸癌および乳癌で選択的に発現される高分子量（>１０６Ｄａ）腫瘍関連ムチン抗原と特異的に結合する（例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ，１９８７ Ａｃｔａ Ｃｙｔｏｌ．１：５３７；米国特許第４，６１２，２８２号参照）。それにもかかわらず、腫瘍の外科的切除後に細胞関連腫瘍マーカー、例えばＢ７２．３により認識されるムチン抗原は、実質的腫瘍塊の蓄積前の悪性症状の早期検出が好ましい診断スクリーニングに対する限定的有用性を有し得る。
【０００５】
侵襲性外科手術が通常は蓄積腫瘍塊の検出後にのみ示される腫瘍関連抗原に関する外科的切除検体をスクリーニングすることによる特定種類の癌の診断に代わるものは、非侵襲性または最小侵襲性手法により被験体から得られる試料中のこのような抗原を検出するための組成物および方法を提供することである。例えば卵巣およびその他の癌腫においては、一般に、容易に得られる生物学的流体（例えば血清または粘膜分泌物）の試料中で検出可能である多数の可溶性腫瘍関連抗原が存在する。このようなマーカーのひとつは、血流中にも流出される癌関連抗原であるＣＡ１２５であり、この場合それは血清中で検出可能である（例えばＢａｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９：８８３；Ｌｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ．７１：８４２）。血清およびその他の生物学的流体中のＣＡ１２５レベルは、卵巣およびその他の癌腫の診断および／または予後プロフィールを提供しようと努力して、他のマーカー、例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、扁平上皮細胞癌抗原（ＳＣＣ）、組織ポリペプチド特異的抗原（ＴＰＳ）、シアリルＴＮムチン（ＳＴＮ）および胎盤アルカリ性ホスファターゼ（ＰＬＡＰ）のレベルと一緒に測定されてきた（例えばＳａｒａｎｄａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ．３６：７５５；Ｓａｒａｎｄａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１９：７３；Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１７ （４Ｂ）：２９４５；Ｋｕｄｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｉｎｖｅｓｔ．４７：５２；Ｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．１０４：１０２４；Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．１０５：１１３６；Ｃｉｏｆｆｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｔｕｍｏｒｉ ８３：５９４；Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１７ （４Ｂ）：２９４９；Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１７ （４Ｂ）：３０１９）。
【０００６】
しかしながら血清ＣＡ１２５の、単独でのまたはその他の周知の指示薬と組合せた、レベル増大は、悪性疾患の、または特定の悪性疾患（例えば卵巣癌）の限定的診断を提供しない。例えば膣液および血清中のＣＡ１２５、ＣＥＡおよびＳＣＣ増大は、子宮頸部癌および生殖路癌と比較して、良性婦人科学的疾患においてもっとも強く炎症と相関する（例えばＭｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．６：１８２；Ｓａｒａｎｄａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ．３６：７５５）。別の実施例として、血清ＣＡ１２５増大は、神経芽細胞腫にも随伴し得る（例えばＨｉｒｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｓｕｒｇ．Ｔｏｄａｙ ２８：３４９）が、ＣＥＡおよびＳＣＣ増大はとりわけ、結腸直腸癌に随伴し得る（Ｇｅｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１７ （４Ｂ）：２９３９）。別のマーカーである分化抗原メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）は正常中皮細胞の表面で発現され、ある種の癌細胞、例えば上皮性卵巣腫瘍および中皮種でも発現される。メソテリンに関する組成物および方法（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５２：１８１；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ．５０：３７３；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ．５１：５４８；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３６；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６６９；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：８０５；Ｋｏｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１９８４）、ならびに構造的に関連するメソテリン関連抗原（ＭＲＡ；例えばＳｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１１５３１参照）が当該技術分野で周知であり、例としては、ＷＯ００／５０９００に、ならびに米国特許出願０９／５１３，５９７号に記載されたような癌の検出および療法における使用が挙げられる。したがって、用いられるべき付加的マーカー、例えば多因子診断スクリーニングに有用なマーカーがぜひとも必要であることは明らかである（例えばＳａｒａｎｄａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｋｕｄｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７参照）。
【０００７】
以下でさらに詳細に記載されるように、このような付加的マーカーは、多様な機能を有する小型の酸−および熱安定性分子の異種の群を含み、ヒト精巣上体４−ジスルフィドコアタンパク質または「ＨＥ４」を含むタンパク質の「４−ジスルフィドコア」ファミリー内から有用に提供され得た（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．４５：３５０−３５７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｇｅｎｅ ２２９：１０１；Ｓｃｈｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｇｅｎｅ ２３８：３７５）。４−ジスルフィドコアファミリー成員ポリペプチドのアミノ酸配列中の８つのコアシステイン残基の保存スペーシングは、緊密な、安定した構造へのこれらの分子のフォールディングを指図すると考えられる。４−ジスルフィドコアファミリーの成員の多くは、プロテアーゼ阻害剤である．しかしながらいくつかのファミリー成員、例えばＨＥ４に関しては、機能は未だ限定的に確認されてはいない。４−ジスルフィドコアファミリーのタンパク質のその他の成員としては、Ｗｐ−タンパク質、例えばＳＬＰ−１、およびｐｓ２０が挙げられ、そして４−ジスルフィドコアファミリーのタンパク質の付加的成員がいくつかの種から単離されている。これらのタンパク質は、４−ジスルフィドコアにより安定化されるいくつかの特性、例えばそれらのサイズが小さいこと、ならびにそれらの熱−および酸安定性構造を共有する。これらのタンパク質は分泌細胞により作られ、粘膜分泌物、例えば精漿、乳汁、耳下腺および子宮頸部分泌物中に見出される。
【０００８】
４−ジスルフィドコアファミリーの原型分子であるＷｐ−タンパク質は乳漿リンタンパク質としても周知であり、クローン化されている（Ｄａｎｄｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：３９８７−３９９１）。乳漿リンタンパク質は、約１〜２ｍｇ／ｍｌで乳汁中で発現されるが、遺伝子が過メチル化される乳癌によっては発現されない。プロテアーゼに対する阻害活性は、乳漿リンタンパク質に関しては見出されていない。しかしながらトランスジェニック動物中の遺伝子の過剰発現は、哺乳動物肺胞細胞の発達を減損し（Ｂｕｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９１ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ Ｄｅｖ．３６：６７−７４）、このことは、乳汁分泌中のこのタンパク質に関する重要な役割を示唆する。別の４−ジスルフィドコアファミリータンパク質である分泌白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰ−１）はヒト子宮頸部からクローン化されたが、他の粘膜分泌物、例えば精漿および耳下腺分泌液中にも存在する（Ｈｅｉｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ，１９８６ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６０：６１−６７）。ＳＬＰ−１は、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼおよびカテプシンＧの強力な阻害剤である１２ｋＤａの二ドメインタンパク質である。キモトリプシンと複合されたＳＬＰ−１の結晶構造が発表されている（Ｇｒｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８８ ＥＭＢＯ Ｊ．７：３４５−３５１）。これらのデータは、ＳＬＰ−１ドメインが独立して働き、同時に異なるプロテアーゼを阻害することを示し、そしてその２つがキモトリプシンと結合するドメイン中の小（８アミノ酸）活性部位を同定した。
【０００９】
エラフィンは、このポリペプチドのアミノ酸配列を確定するためにヒト乾癬皮膚から単離された４−ジスルフィドコアファミリーの単一ドメインタンパク質成員である（Ｗｉｅｄｏｗ ｅｔ ａｌ，１９９０ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４７９１−１４７９５）。エラフィンはエラスターゼの強力な阻害剤であるが、その他のプロテアーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシン、カテプシンＧまたはプラスミンに対する明らかな阻害活性を示さない。エラフィンのアミノ酸配列は、ＳＬＰ−１のＣ末端領域（ドメイン１）と３８％の相同性を示す。ｐｓ２０タンパク質をコードする遺伝子が近年、平滑筋から単離されたが、ｐｓ２０タンパク質は哺乳動物細胞中への遺伝子のトランスフェクションにより発現された（Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４５７４−４５８４）。ｐｓ２０は癌細胞の増殖を抑制することが見出され、そしてｐｓ２０は、増殖阻害剤としても言及されてきた。しかしながら今までのところこのタンパク質に関しては、直接的機能活性、例えばプロテアーゼの抑制は記載されていない。
【００１０】
上記のように、プロテアーゼ阻害活性は、精巣上体上皮細胞で最初に同定されたＨＥ４に関しては同定されていないが、その他の小型酸および熱安定性プロテイナーゼ阻害剤は精漿から特性化されており、精子を結合し、精子と卵の細胞外マトリクスとの相互作用を調節することにより受精能に一役を果たすと考えられた（Ｆｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ，Ｒｅｉｃｈ，Ｅ．，Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．，Ｓｈａｗ，Ｅ．（ｅｄｓ．），１９７５ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．７３７−７６６；Ｓａｌｉｎｇ，１９８９ Ｏｘｆ．Ｒｅｖ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｌ．１１：３３９−３８８）。ＨＥ４ ｃＤＮＡは、ヒト精巣上体から最初に単離され（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．４５：３５０−３５７）、ＨＥ４ ｃＤＮＡは後に、卵巣癌から構築されたｃＤＮＡライブラリー中で高頻度で検出された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｇｅｎｅ ２２９：１０１；Ｓｃｈｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｇｅｎｅ ２３８：３７５）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記の理由のために、明らかに、悪性症状（例えば癌腫）の検出および治療のための改良型診断マーカーおよび治療用標的の必要性が存在する。本発明の組成物および方法は、可溶性形態でおよび／または細胞表面で天然に生じるポリペプチドを検出するためにＨＥ４および／またはＨＥ４関連抗原に特異的な抗体を用いて悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法を提供し、そしてその他の関連利点を提供することにより、従来技術のこれらの限界を克服する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要約
本発明は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングするのに有用な組成物および方法に向けられる。特に本発明は、ＨＥ４ａとして本明細書中で言及されるＨＥ４ポリペプチドの可溶性および細胞表面形態、または可溶性形態で天然に生ずる、そしてＨＥ４ａポリペプチドに特異的である少なくとも１つの抗体と反応性の抗原決定基を有する ＨＥ４ａ分子が被験体からの生物学的試料中に検出され得る、という予期せぬ知見に関する。
【００１３】
本発明の一つの局面は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と被験体からの生物学的試料（被験体からの少なくとも１つの細胞を含む）を接触させることであって、それにより試料中の可溶性形態で天然に存在するかまたは特定の実施形態では細胞表面分子として存在する、少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有する分子の生物学的試料中での存在を確定する、接触させること、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する。実施形態によっては、生物学的試料は、血液、血清、漿液、血漿、リンパ、尿、脳脊髄液、唾液、粘膜分泌物、膣分泌物、腹水、胸水、囲心腔液、腹膜液、腹腔液、培地、ならし培地または灌注液である。
【００１４】
ある種の他の実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドは、配列番号５、７、９または１１のうちのいずれか一つに記述されるアミノ酸配列を有するポリペプチドあるいはその断片または誘導体を含む。別の実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチド改変体はスプライス改変体である。本発明の特定の実施形態では、抗体はポリクローナル抗体を含み、他の実施形態では抗体は親和性精製抗体を含む。特に好ましい実施形態では、抗体はモノクローナル抗体を含む。別の実施形態では、抗体は組換え抗体を含み、別の実施形態では、抗体はキメラ抗体を含む。別の実施形態では、抗体はヒト化抗体を含む。別の実施形態では、抗体は単鎖抗体を含む。
【００１５】
本発明の実施形態によっては、抗体と抗原決定基の結合の検出は、放射性核種の検出を包含する。他の実施形態では、抗体と抗原決定基の結合の検出は、蛍光体の検出を包含する。別の実施形態では、抗体と抗原決定基の結合の検出は、アビジン分子とビオチン分子の間の結合事象の検出を包含し、別の実施形態では、抗体と抗原決定基の結合の検出は、ストレプトアビジン分子とビオチン分子の間の結合事象の検出を包含する。特定の実施形態では、抗体と抗原決定基の結合の検出は、酵素反応の産物の分光光度検出を包含する。本発明の実施形態によっては、上記少なくとも１つの抗体は検出可能に標識され、一方ある種の他の実施形態では、上記少なくとも１つの抗体は検出可能に標識されず、抗体と抗原決定基の結合の検出は間接的である。
【００１６】
本発明の特定の実施形態によると、悪性症状は腺癌、中皮腫、卵巣癌、膵臓癌あるいは非小細胞肺癌であり得る。
【００１７】
本発明の別の局面は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、少なくとも１つの抗体と被験体からの生物学的試料を接触させることであって、それにより（ｉ）試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、ならびに（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の生物学的試料中での存在を確定する、接触させること（この場合、上記試料は被験体からの細胞を含み、上記分子は上記少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有し、その抗原結合部位は、２Ｈ５、３Ｄ８または４Ｈ４であるモノクローナル抗体の免疫特異的結合を競合的に抑制する）、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する方法を提供することである。
【００１８】
本発明の別の局面は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、少なくとも１つの抗体と被験体からの生物学的試料を接触させることであって、それにより（ｉ）試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、ならびに（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の生物学的試料中での存在を確定する、接触させること（この場合、上記試料は被験体からの細胞を含み、上記分子は上記抗体と反応性がある抗原決定基を有し、その抗原結合部位は、モノクローナル抗体３Ｄ８の免疫特異的結合を競合的に抑制する）、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する方法を提供する。
【００１９】
本発明のさらに別の局面は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、少なくとも１つのＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体と被験体からの生物学的試料を接触させることであって、それにより（ｉ）試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、ならびに（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の生物学的試料中での存在を確定する、接触させること（この場合、上記試料は被験体からの細胞を含み、上記分子は上記少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有し、その抗原結合部位は、２Ｈ５、３Ｄ８および４Ｈ４からなる群から選択されるモノクローナル抗体の免疫特異的結合を競合的に抑制し）、上記少なくとも１つの抗原は、ＨＥ４ａ抗原に免疫特異的に結合する、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する方法を提供する。特定の実施形態では、ＨＥ４ａ抗原はモノクローナル抗体３Ｄ８、２Ｈ５または４Ｈ４とも免疫特異的に反応性がある。
【００２０】
別の局面に向けると、本発明は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、少なくとも１つのＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と被験体からの生物学的試料を接触させることであって、それにより（ｉ）試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、ならびに（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の生物学的試料中での存在を確定する、接触させること（この場合、上記試料は被験体からの細胞を含み、上記分子は上記少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有し、その抗原結合部位は、２Ｈ５または４Ｈ４であるモノクローナル抗体の免疫特異的結合を競合的に抑制し、上記少なくとも１つの抗原は、ＨＥ４ａ抗原に免疫特異的に結合する）、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する方法を提供する。特定の実施形態では、メソテリン関連抗原は３Ｄ８とも免疫特異的に反応性がある。
【００２１】
別の局面に向けると、本発明は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、少なくとも１つの固定された第一の抗体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合させ、それにより免疫複合体を形成させるための条件下で、そのために十分な時間、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの固定された第一の抗体と被験体からの生物学的試料を接触させることであって、それにより試料中の可溶性形態で天然に存在する分子の生物学的試料中での存在を確定する、接触させること、上記少なくとも１つの固定された第一の抗体と特異的に結合しない試料の構成成分を除去すること、および上記少なくとも１つの第二の抗体と上記ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドの特異的結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、上記免疫複合体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチド少なくとも１つの第二の抗体と接触させること（この場合、上記少なくとも１つの第二の抗体の抗原結合部位はモノクローナル抗体２Ｈ５の免疫特異的結合を競合的に抑制しない）、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する方法を提供する。
【００２２】
本発明のさらに別の局面は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、少なくとも１つの固定された第一の抗体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合させ、それにより免疫複合体を形成させるための条件下で、そのために十分な時間、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの固定された第一の抗体と被験体からの生物学的試料を接触させることであって、それにより試料中の可溶性形態で天然に存在する分子の生物学的試料中での存在を確定する、接触させること（この場合、上記少なくとも１つの第一の抗体の抗原結合部位はモノクローナル抗体３Ｄ８の免疫特異的結合を競合的に抑制する）、上記少なくとも１つの固定された第一の抗体と特異的に結合しない試料の構成成分を除去すること、および上記少なくとも１つの第二の抗体と上記ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドの特異的結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、上記免疫複合体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチド少なくとも１つの第二の抗体と接触させること（この場合、上記少なくとも１つの第二の抗体の抗原結合部位は、モノクローナル抗体２Ｈ５の免疫特異的結合を競合的に抑制しない）、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する方法を提供する。
【００２３】
本発明の別の局面は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、少なくとも１つの固定された第一の抗体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合させ、それにより免疫複合体を形成させるための条件下で、そのために十分な時間、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの固定された第一の抗体と被験体からの生物学的試料を接触させることであって、それにより試料中の可溶性形態で天然に存在する分子の生物学的試料中での存在を確定する、接触させること（この場合、上記少なくとも１つの第一の抗体の抗原結合部位はモノクローナル抗体３Ｄ８の免疫特異的結合を競合的に抑制する）、上記少なくとも１つの固定された第一の抗体と特異的に結合しない試料の構成成分を除去すること、および上記少なくとも１つの第二の抗体とＨＥ４ａ抗原ポリペプチドの特異的結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、上記免疫複合体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの第二の抗体と接触させること（この場合、上記少なくとも１つの第二の抗体の抗原結合部位はモノクローナル抗体２Ｈ５の免疫特異的結合を競合的に抑制しない）、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する方法を提供する。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明の方法は、悪性症状の少なくとも１つの可溶性マーカーの試料中の存在を確定すること（上記マーカーはメソテリン関連抗原、癌胎児性抗原、ＣＡ１２５、シアリルＴＮ、扁平上皮細胞癌抗原、組織ポリペプチド抗原あるいは胎盤アルカリ性ホスファターゼである）をさらに包含する。
【００２５】
本発明の別の局面は、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法を提供することであって、抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、（ｉ）悪性症状を有する疑いのある一次被験体からの一次生物学的試料、ならびに（ｉｉ）悪性症状を有さないことが周知である第二の被験体からの第二の生物学的試料の各々を、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と接触させることであって、それにより（ｉ）試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、および（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の上記一次および第二の生物学的試料の各々における存在を確定する、接触させること（この場合、上記一次および第二の生物学的試料は各々、上記一次および第二の被験体からの細胞をそれぞれ含み、上記分子は、上記少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有する）、および一次生物学的試料中の上記抗体と上記抗原決定基の検出可能な結合を、第二の生物学的試料中の上記抗体と上記抗原決定基の検出可能な結合のレベルと比較すること、およびそれから悪性症状の存在を検出することを包含する方法を提供することである。
【００２６】
別の局面において、本発明は被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体の存在を被験体からの生物学的試料中で検出することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）関連抗原ポリペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号１１または配列番号１３のうちのいずれかに記述されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００２７】
別の局面に向けると、本発明はＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル免疫グロブリン可変部を含む、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体であって、配列番号５、配列番号７、配列番号１１または配列番号１３のうちのいずれかに記述されるアミノ酸配列を有する抗体。特定の実施形態では、抗体は融合タンパク質であり、一方ある種の他の実施形態では、抗体は単鎖抗体である。ある種の他の実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドはグリコシル化ポリペプチドをさらに含む。別の実施形態では、抗体は配列番号１１に記述されるＨＥ４ａ抗原ポリペプチド配列と特異的に結合するが、配列番号９に記述されるポリペプチド配列とは特異的に結合せず、あるいは抗体は配列番号１１に記述されるＨＥ４ａ抗体ポリペプチド配列および配列番号９に記述されるポリペプチド配列と特異的に結合する。特定の実施形態において、抗体はモノクローナル抗体２Ｈ５、３Ｄ８または４Ｈ４である。
【００２８】
さらに別の局面において、本発明は被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、試料中での可溶性形態で天然で存在する抗体のＨＥ４ａポリペプチドとの結合を検出するための条件下で、そのために十分な時間、被験体からの生物学的試料を検出可能に標識されたＨＥ４ａポリペプチドと接触させること、およびそれから悪性症状の存在を検出することを含む。
【００２９】
別の局面に目を向けると、本発明は、配列番号５、配列番号７、配列番号１１または配列番号１３に記述されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであるＨＥ４ａ抗原ポリペプチドをコードする核酸分子であるか、あるいはＨＥ４ａ抗原ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードし、または中等度ストリンジェント条件下でＨＥ４ａ抗原をコードするこのような核酸分子とハイブリダイズすることが可能な核酸分子である単離核酸分子を提供するが、この場合、単離核酸分子は、配列番号９に記述されるヌクレオチド配列からなる核酸分子ではない。特定の実施形態では、本発明は、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドをコードする核酸分子と相補的である少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３０】
他の実施形態では、本発明は、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに融合されるポリペプチド配列を含む融合タンパク質を提供する。さらなる特定の実施形態では、融合ドメインは、免疫グロブリンあるいはその改変体または断片である。さらなる実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに融合されるポリペプチド配列は、プロテアーゼにより切断される。別の実施形態では、ポリペプチド配列は、リガンドに対する親和性を有する親和性タグポリペプチドである。
【００３１】
他の実施形態では、本発明は、上記のようなＨＥ４ａ抗原ポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結される少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現構築物を提供する。特定の実施形態では、プロモーターは調節されたプロモーターであり、他の特定の実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドが第二の核酸配列のポリペプチド産物との融合タンパク質として発現される。さらなる実施形態では、第二の核酸配列のポリペプチド産物は免疫グロブリン定常部である。別の実施形態では、発現構築物は組換えウイルス発現構築物である。他の実施形態によると、本発明は、本明細書中に提供されるような組換え発現構築物を含む宿主細胞を提供する。１つの実施形態では、宿主細胞は原核生物細胞であり、別の実施形態では、宿主細胞は真核生物細胞である。
【００３２】
別の局面では、本発明は、本明細書中に提供されるようなＨＥ４ａ抗原ポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結される少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現構築物を含む宿主細胞を培養することによって、組換えＨＥ４ａ抗原ポリペプチドを産生する方法を提供する。特定の実施形態では、プロモーターは調節されたプロモーターである。別の実施形態では、本発明は、組換えＨＥ４ａ抗原ポリペプチドを発現するために、本明細書で提供される組換えウイルス発現構築物に感染された宿主細胞を培養することによって、組換えＨＥ４ａ抗原ポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００３３】
別の実施形態では、本発明はまた、試料中のＨＥ４ａ発現を検出する方法であって、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａポリペプチドあるいはその断片または改変体をコードする核酸配列を含む試料と接触させること、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするＨＥ４ａポリペプチドコード核酸の量を試料中で検出して、それから試料中のＨＥ４ａ発現を検出することによって、試料中のＨＥ４ａ発現を検出する方法を提供する。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするＨＥ４ａポリペプチドコード核酸の量がポリメラーゼ連鎖反応を用いて確定される。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするＨＥ４ａポリペプチドコード核酸の量がハイブリダイゼーションアッセイを用いて確定される。別の実施形態では、試料はＲＮＡまたはｃＤＮＡ調製物を含む。
【００３４】
本発明の他の特定の実施形態によれば、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体であって、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル免疫グロブリン可変部を含む抗体を含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、悪性症状を治療する方法が提供される。別の実施形態では、本発明は、悪性症状を治療する方法であって、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａポリペプチドまたはその断片を含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。さらなる特定の実施形態では、組成物は、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａポリペプチドまたはその断片と特異的に結合可能な抗体の患者における産生を誘導する。また、さらなる他の特定の実施形態では、組成物は、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａポリペプチドまたはその断片を特異的に認識可能なＴリンパ球を患者において誘導する。他の特定の実施形態によれば、受胎、避妊、および／または受精能（ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）を変更する（例えば適切な対照と比較して統計学的に有意の方法で増大または低減する）組成物および方法であって、ＨＥ４ａポリペプチドあるいはその断片または改変体（例えば融合タンパク質）を投与すること、またはＨＥ４ａポリペプチドあるいはその断片または改変体と特異的に結合する免疫グロブリン可変部を含む組成物を投与することを含む、組成物および方法が提供される。ある種の他の実施形態によれば、受胎、避妊および／または受精能を変更する（例えば適切な対照と比較して、統計学的有意の方法で増大または低減する）組成物および方法であって、ＨＥ４ａポリペプチドあるいはその断片または改変体（例えば融合タンパク質）を投与すること、もしくはＨＥ４ａポリペプチドあるいはその断片または改変体と特異的に結合する免疫グロブリン可変部を含む組成物を投与することを含む組成物および方法が提供される。
【００３５】
本発明のこれらのおよびその他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば明らかになる。さらに、本発明のある種の局面をより詳細に記述する種々の参照文献が本明細書中に記述されており、したがってそれらのに記載内容は全て、参照により本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】図１は、ヒト試料のパネルにおけるｃＤＮＡをコードするＨＥ４ａの実時間ＰＣＲ検出を示す。
【図１Ｂ】図１は、ヒト試料のパネルにおけるｃＤＮＡをコードするＨＥ４ａの実時間ＰＣＲ検出を示す。
【図２】図２は、発現ＨＥ４ａ融合タンパク質のウエスタンブロット分析を示す。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡによる２匹の免疫マウス（１６０５および１７３４）からの血清中のＨＥ４ａ−ｍＩｇ融合タンパク質と反応性がある抗体の検出を表す。
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡを用いたハイブリドーマ上清のスクリーニングならびにＨＥ４ａ特異的ハイブリドーマ抗体の検出の代表的結果を表す。
【図５】図５は、捕獲試薬として固定化ＨＥ４ａ特異的モノクローナル抗体３Ｄ８を、検出試薬としてビオチニル化ＨＥ４ａ特異的モノクローナル抗体２Ｈ５を用いた二重決定因子サンドイッチＥＬＩＳＡによるＨＥ４ａ−ｈＩｇＧ融合タンパク質の検出を示す。卵巣癌細胞株４００７（Δ）からの上清液中の可溶性ＨＥ４ａの検出も示されている。
【図６】図６は、卵巣癌患者からの連続希釈腹水中のＨＥ４ａ抗原のサンドイッチＥＬＩＳＡによる検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明は、一部は、ＨＥ４に非常によく似ているが、それとは異なる配列を示す、本明細書中に記載されたようなタンパク質の「４−ジスルフィドコア」ファミリーの新規の成員であるＨＥ４ａの発見に関する（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ．４５：３５０−３５７）。本明細書中に示されたように、ＨＥ４ａ（ＨＥ４ではない）は、甚だ予期せぬことに、ある種の悪性疾患において、例えば卵巣癌において、ならびに多数のその他のヒト組織中で、ヒト精巣上皮細胞におけるＨＥ４の制限発現パターンとは大いに異なって、過剰発現されることが示されている（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。本発明は、一部は、被験体中で天然に生じるＨＥ４ａポリペプチドとして本明細書中で言及されるある種の遺伝子産物の細胞表面および／または可溶性形態の検出を提供する本明細書に記載された組成物および方法から得られる意外な利点、例えばある種の癌腫（例えば卵巣癌）を有する被験体におけるこのようなポリペプチドのレベル増大にも関する。したがって本発明は、このような細胞表面および／または可溶性ＨＥ４ａポリペプチドの特異的検出による被験体における悪性症状の検出および診断のための有用な組成物および方法を提供する。
【００３８】
以下で詳細に記載されるように、本発明の特定の実施形態は、可溶性および細胞表面形態のＨＥ４ａおよびＨＥ４ポリペプチド、例えばＨＥ４およびＨＥ４ａポリペプチド抗原および融合タンパク質を含むＨＥ４ａポリペプチドに関する。ある種の他の実施形態では、本発明は、ＨＥ４ａポリペプチドの断片、誘導体および／または類似体に関する。要するに、本発明の特定の実施形態によれば、被験体からの生物学的試料をヒトＨＥ４ａポリペプチドに特異的な抗体と接触させることにより、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法を提供する。ＨＥ４ａポリペプチドおよびＨＥ４ａ−Ｉｇ融合タンパク質の完全アミノ酸および核酸コード配列は、卵巣癌ｃＤＮＡ由来の核酸分子がＫｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）により開示されたようなＨＥ４とは別個の配列を有する発現産物をコードするという意外な観察、ならびにＫｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．により開示されたようなＨＥ４発現が精巣上皮細胞に限定される一方、本発明の開示によるＨＥ４ａ発現は卵巣癌において容易に検出可能である、というさらなる予期せぬ観察を含めて、本明細書中に開示されている。
【００３９】
本明細書中に記載されているように、当業者がルーチンにそして過度の実験なしで、当該技術分野で周知の方法とともに本発明の教示を用いて、宿主を免疫感作し、ＨＥ４ａポリペプチド特異的抗体産生に関してスクリーニングし得るよう、ＨＥ４ａポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体が提供される。例えば組換えＨＥ４ａ発現ベクターおよび宿主細胞（例えば組換えＨＥ４ａ融合タンパク質）の構築は、本明細書中に記載されており、ＨＥ４ａ特異的抗体を提供する。
【００４０】
本明細書中に開示されたＨＥ４ａポリペプチドの物理化学的および免疫化学的特性から、そしてここに開示されたＨＥ４ａをコードする核酸配列を用いて、当業者は、周知の方法に従って特異的抗体を産生および特性化するために用いられ得る組換えＨＥ４ａも調製し得る。ＨＥ４ａポリペプチドは、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、酵母、細菌またはその他の細胞中で発現され得る。無細胞翻訳系も、本明細書中に開示されたＨＥ４ａポリペプチドＤＮＡコード領域由来のＲＮＡを用いて、このようなタンパク質を産生するために用いられ得る。原核生物および真核生物宿主とともに用いるための適切なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８９）によりに記載されている。本発明の好ましい実施形態では、ＨＥ４ａポリペプチドは哺乳動物細胞中で発現され得る。
【００４１】
本発明の核酸は、ＲＮＡの形態で、またはＤＮＡの形態であり、このＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを包含する。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得るし、一本鎖である場合には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。本発明に用いるためのＨＥ４ａポリペプチドをコードするコード配列は、配列番号３、４、６、１０または１２で提供されるコード配列と同一であり得るし、あるいは遺伝暗号の冗長または縮重の結果として、例えば配列番号１０および配列番号１２のｃＤＮＡと同一のＨＥ４ａポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。したがって本発明は、配列番号５、配列番号７、配列番号１１または配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＥ４ａ抗原ポリペプチドをコードする単離核酸分子、あるいはこのようなＨＥ４ａポリペプチドコード核酸とハイブリダイズすることが可能な核酸分子、またはそれらと相補的な配列を有する核酸分子を提供する。
【００４２】
改変体は、ネイティブＨＥ４ａ抗原ポリペプチドまたはその一部分をコードするポリヌクレオチド配列、例えば配列番号１０および配列番号１２に記述される核酸配列と、好ましくは少なくとも約７０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも約８０％〜８５％の同一性、もっとも好ましくは少なくとも約９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を示す。同一性％は、当業者に周知のコンピューターアルゴリズムを、例えばＡｌｉｇｎまたはＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５，１９９１；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５１０９１９，１９９２）（これはＮＣＢＩウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）で利用可能である）を用いて配列を比較することにより、容易に確定され得る。デフォルトパラメーターが用いられ得る。
【００４３】
ある種の改変体は、ネイティブ遺伝子と実質的に相同である。このようなポリヌクレオチド改変体は、中等度ストリンジェント条件下で、ネイティブＨＥ４ａ抗原をコードする天然ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（または相補配列）とハイブリダイズすることが可能である。適切な中等度ストリンジェント条件としては、例えば以下の過程またはそれらの等価物が挙げられる：５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で予備洗浄する過程；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣでの一晩ハイブリダイズする過程；その後、６５℃で２０分間、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣの各々で２回洗浄する過程。付加的ストリンジェントなに関しては、条件としては、例えば０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での６０℃で１５分間の洗浄、あるいはその等価物が挙げられる。何らかの点で特定の目的となる核酸に対して選択的である適度なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を作り出すための慣例として変更され得るパラメーターを、当業者は容易に理解し、そして、このような条件はとりわけ、ハイブリダイゼーションに関与する特定核酸配列、例えばＨＥ４ａポリペプチドをコードする配列番号１０および配列番号１２として本明細書中に開示されたものの一関数であり得ることをさらに理解する。核酸ハイブリダイゼーション条件の選択に関しては、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９５も参照されたい。
【００４４】
ＨＥ４ａポリペプチド、例えば配列番号１１のアミノ酸配列を有するヒトＨＥ４ａポリペプチド、または本発明に従って用いるための任意のその他のＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸としては：ＨＥ４ａポリペプチドに関するコード配列のみ；ＨＥ４ａポリペプチドに関するコード配列および付加的コード配列；ＨＥ４ａポリペプチドに関するコード配列（および任意の付加的コード配列）および非コード配列、例えばイントロンあるいはＨＥ４ａポリペプチドに関するコード配列の非コード配列５’および／または３’が挙げられるが、これらに限定されない。これらはさらに、例えば調節されたまたは調節可能なプロモーター、エンハンサー、その他の転写調節配列、リプレッサー結合配列、翻訳調節配列または任意のその他の調節核酸配列であり得る１つまたは複数の調節核酸配列を包含し得るが、これらに限定される必要はない。したがって「ＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸」という用語は、ポリペプチドに関するコード配列のみ、ならびに付加的コードおよび／または非コード配列（単数または複数）を含む核酸を包含する。
【００４５】
本発明はさらに、ＨＥ４ａポリペプチド、例えば配列番号１１の推定アミノ酸配列を有するヒトＨＥ４ａポリペプチドの断片、類似体および誘導体をコードする本明細書中に記載された核酸の改変体に関する。ＨＥ４ａをコードする核酸の改変体は、核酸の天然対立遺伝子改変体または天然に生じない改変体であり得る。当該技術分野で周知であるように、対立遺伝子改変体は、そのいずれかがコード化ＨＥ４ａポリペプチドの機能を実質的に変更しない１つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失または付加のうちの少なくとも１つを有し得る核酸配列の代替的形態である。したがって例えば本発明は、配列番号５、７または１１で示されるのと同一のＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸、ならびにこのような核酸の改変体を包含し、これらの改変体はこれらのポリペプチドのいずれかの断片、誘導体または類似体をコードし得る。
【００４６】
ＨＥ４ａの改変体および誘導体は、ＨＥ４ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異により生成され得る。ネイティブアミノ酸配列の変更は、多数の慣用的方法のいずれかにより成し遂げられ得る。突然変異は、ネイティブ配列の断片への結繋を可能にする制限部位が側面に接する突然改変体配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより特定の遺伝子座に導入され得る。結繋後、結果として得られる制限再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を有する類似体をコードする。
【００４７】
あるいは、変更遺伝子を提供するためにオリゴヌクレオチド位置特異的突然変異誘発手法が用いられ得るが、この場合、予定コドンは置換、欠失または挿入により変更され得る。このような変更の作製方法の例は、Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ （ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ １９８５，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；Ｋｕｎｋｅｌ （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８，１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７，１９８７）；および米国特許第４，５１８，５８４号および第４，７３７，４６２号に開示されている。
【００４８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス作用物質およびＨＥ４ａポリペプチドあるいはその改変体または断片をコードする核酸配列に特異的なリボザイムとして使用するための核酸分子の、ならびに遺伝子療法のための標的化送達のためのＨＥ４ａ遺伝子をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドの同定は、当該技術分野で周知の方法を含む。例えばこのようなオリゴヌクレオチドの望ましい特性、長さおよびその他の特徴が周知である。ある種の好ましい実施形態では、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書中に提供されるようなＨＥ４ａポリペプチドをコードする単離核酸分子と相補的な少なくとも１５〜３０個の連続ヌクレオチドを含み、ある種の他の好ましい実施形態では、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書中に提供されるようなＨＥ４ａポリペプチドをコードする単離核酸分子と相補的な少なくとも３１〜５０、５１〜７５、７６〜１２５個またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、スルフェート、ケチル、ホスホロジチオネート、ホスホルアミデート、ホスフェートエステルのような結合およびその他のこのような結合を用いることにより、内因性核溶解性酵素による分解に抵抗するよう設計される（例えばＡｇｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８：３５３９−３５４２ （１９８７）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３：６６５７−６６６５ （１９７１）；Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒｅｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２６：２１９１−２１９４ （１９８５）；Ｍｏｏｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：４７６９−４７８２ （１９８９）；Ｕｚｎａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４０：１３７−１４３ （１９８４）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：３６７−４０２ （１９８５）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１４：９７−１００ （１９８９）；Ｓｔｅｉｎ Ｉｎ ：Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃｏｈｅｎ，Ｅｄ，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．９７−１１７ （１９８９）；Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７２３７−７２４６ （１９８８）参照）。
【００４９】
アンチセンスヌクレオチドは、配列特異的方法で、核酸、例えばｍＲＮＡまたはＤＮＡと結合するオリゴヌクレオチドである。相補的配列を有するｍＲＮＡに結合される場合、アンチセンスはｍＲＮＡの翻訳を防止する（例えば米国特許第５，１６８，０５３号（Ａｌｔｍａｎ等）；米国特許第５，１９０，９３１号（Ｉｎｏｕｙｅ）；米国特許第５，１３５，９１７号（Ｂｕｒｃｈ）；米国特許第５，０８７，６１７号（Ｓｍｉｔｈ）およびＣｌｕｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：３４０５−３４１１（これはダンベルアンチセンスオリゴヌクレオチドをに記載する）参照）。三重分子は、二重ＤＮＡを結合して、共直線性三重分子を形成し、それにより転写を防止する単一ＤＮＡ鎖を指す（例えば二重鎖ＤＮＡ上の標的部位に結合する合成オリゴヌクレオチドの製造方法をに記載する米国特許第５，１７６，９９６号（Ｈｏｇａｎ等）参照）。
【００５０】
本発明のこの実施形態によれば、特に有用なアンチセンスヌクレオチドおよび三重分子は、ＨＥ４ａポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳の抑制が実行されるよう、ＨＥ４ａポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡのセンス鎖と相補的であるかまたはそれと結合する分子である。
【００５１】
リボザイムは、ＲＮＡ基質、例えばｍＲＮＡを特異的に切断して、細胞性遺伝子発現の特異的抑制または妨害を生じるＲＮＡ分子である。ＲＮＡ鎖の切断および／または結繋に関与するリボザイムには少なくとも５つの周知の種類がある。リボザイムは任意のＲＮＡ転写体に標的化されて、このような転写体を触媒的に切断し得る（例えば米国特許第５，２７２，２６２号；米国特許第５，１４４，０１９号、ならびに米国特許第５，１６８，０５３号、第５，１８０，８１８号、第５，１１６，７４２号および第５，０９３，２４６号（Ｃｅｃｈ等）参照）。本発明の特定の実施形態によれば、任意のこのようなＨＥ４ａｍＲＮＡ特異的リボザイムまたはこのようなリボザイムをコードする核酸は、宿主細胞に送達されて、ＨＥ４ａ遺伝子発現の抑制を実行し得る。したがってリボザイム等は、核への導入時に、リボザイムが直接転写されるよう、真核生物プロモーター（例えば真核生物ウイルスプロモーター）に連結されたリボザイムをコードするＤＮＡにより宿主細胞に送達され得る。
【００５２】
生物学的活性を必要とされないアミノ酸残基または配列の種々の付加または置換、あるいは末端または内部残基または配列の欠失をコードする等価のＤＮＡ構築物も、本発明に包含される。例えば生物学的活性に不可欠であるというわけではないＣｙｓ残基をコードする配列は、Ｃｙｓ残基を欠失させるかまたは他のアミノ酸で置換させて、復元時に不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するよう変更され得る。その他の等価物は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を強化するための隣接二塩基性アミノ酸残基の修飾により調製され得る。ＥＰ２１２，９１４は、タンパク質中のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性化するための部位特異的突然変異誘発の使用を開示する。ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位は、残基を欠失、付加または置換して、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＬｙｓおよびＬｙｓ−Ａｒｇ対をこれらの隣接塩基性残基の発生を排除するよう変更することにより、不活性化される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対合はＫＥＸ２切断にかなり低感受性であり、Ａｒｇ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの転換は、ＫＥＸ２部位を不活性化するための保存的な、そして好ましいアプローチを示す。
【００５３】
適切なＤＮＡ配列（単数または複数）は、種々の手法により、選択宿主細胞に適した多数の周知のベクターのいずれかに挿入され得る。概してＤＮＡ配列は、当該技術分野で周知の手法により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数または複数）に挿入される。クローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製のための、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を包含する酵素反応のための標準技法、ならびに種々の分離技法は、周知のものであり、当業者に一般的に用いられる。多数の標準技法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．& Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）；ならびにその他に記載されている。
【００５４】
哺乳動物発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ ２３：１７５ （１９８１）によりに記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株、ならびに適合性ベクターを発現し得るその他の細胞株、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製の起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与体および受容体部位、転写終結配列および５’フランキング非転写化配列を含む。例えばＳＶ４０スプライスおよびポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を用いて、必要な非転写化遺伝因子を提供し得る。宿主細胞中への構築物の導入は、当業者が熟知している種々の方法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクションまたは電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）（これらに限定されない）により実行され得る（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
【００５５】
本発明はさらに、ＨＥ４ａポリペプチドに関し、特に悪性症状を検出する方法に関する。好ましい実施形態では、悪性疾患は、ＨＥ４ａポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有する、天然可溶性分子の生物学的試料中での、あるいは細胞表面の存在を細胞を含む試料中での存在を確定することにより、検出される。別の好ましい実施形態では、悪性疾患は、少なくとも１つの天然ＨＥ４ａポリペプチドの生物学的試料中での存在を確定することにより、検出される。本明細書中に提供されるように、「ＨＥ４ａ抗原ポリペプチド」または「ＨＥ４ａポリペプチド」は、その任意の断片、誘導体または類似体を含めた配列番号１１のアミノ酸配列を有する任意のポリペプチドを包含し、そして配列番号１０または配列番号１２を含む核酸分子により、あるいは配列番号１０または配列番号１２の核酸分子とハイブリダイズすることが可能な核酸分子によりコードされる任意のポリペプチド、あるいはその断片、誘導体または類似体も包含する。本発明のある種の好ましい実施形態は、本明細書中に提供されるようなＨＥ４ａ配列（例えば配列番号１０〜１３）を対象とする組成物および方法を意図するが、これらは、構造、機能および／または細胞型発現あるいは組織分布あるいはその他（例えば抗体限定検出可能エピトープ、ならびに例えばオリゴヌクレオチド限定ハイブリダイゼーション検出）の差に基づいて、Ｋｉｒｃｈｏｆｆ等（例えばＢｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ．４５：３５０；配列番号８〜９）に開示されたＨＥ４配列を発現的に除外する。
【００５６】
本発明のＨＥ４ａポリペプチドは非修飾化ポリペプチドであり得るし、あるいは例えばグリコシル化、リン酸化、脂肪アシル化（例えばグリコシルホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼｃ媒介性加水分解またはその他）、プロテアーゼ切断、脱リン酸化または任意のその他の種類のタンパク質翻訳後修飾（例えば共有的化学結合の形成または切断を包含する修飾）により、翻訳後修飾されたポリペプチドであり得る。
【００５７】
「断片」、「誘導体」および「類似体」という用語は、ＨＥ４ａポリペプチド、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドまたはＨＥ４ａ融合タンパク質に言及する場合、このようなポリペプチドと本質的に同一の生物学的機能および／または活性を保有する任意のＨＥ４ａポリペプチドを指す。したがって類似体としては、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドアイソフォーム、例えば示差的翻訳後修飾化ＨＥ４ａポリペプチドまたは改変体（例えばスプライス改変体）が挙げられ得る。当該技術分野で周知であるように、「スプライス改変体」は、ＲＮＡ転写体の示差的細胞内プロセシングから生じるポリペプチドの改変体または代替的形態を包含する。例えば２つの別個のｍＲＮＡ種は、互いのスプライス改変体であって、この場合、それらは一ｍＲＮＡ種中の特定のエキソンに対応する配列の全部または一部の封入ならびに他の種からのその非存在によってのみ異なる。当業者が理解するように、その他の構造的関係は、スプライス改変体として一般的にみなされるｍＲＮＡ種間に存在し得る。ＨＥ４ａポリペプチドはさらに、プロタンパク質部分を切断して活性ＨＥ４ａポリペプチドを生成することにより達成され得るプロタンパク質を包含する。
【００５８】
ＨＥ４ａポリペプチドの、またはＨＥ４ａ抗原ポリペプチドの断片、誘導体および類似体の生物学的機能および／または活性としては、本明細書中に開示されたような、被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法におけるマーカーとしてのこのようなポリペプチドの使用が挙げられるが、これに限定される必要はない。例えば被験体からの試料中で天然で可溶性形態であり、ＨＥ４ａポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有する分子を検出することにより、ＨＥ４ａポリペプチドの生物学的機能および／または活性を当業者はモニタリングし得る。さらに、特定の実施形態では、本発明のスクリーニングする方法は、天然で可溶性形態であり、そして（ｉ）悪性症状を有する疑いがある一次被験体からの一次生物学的試料、および（ｉｉ）悪性症状がないことが周知である第二の被験体からの第二の生物学的試料の各々において、ＨＥ４ａポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有する検出可能分子の相対的定量、レベルおよび／または量を比較することを対象とすることに留意すべきである。したがって生物学的試料中のＨＥ４ａポリペプチドの相対的定量的存在は、ＨＥ４ａポリペプチドの生物学的機能および／または活性であり得るが、このような機能および／または活性は、そのように限定されるべきでない。
【００５９】
ＨＥ４ａポリペプチドの断片、誘導体または類似体は、（ｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基が保存または非保存性アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換されるもの；（ｉｉ）付加的アミノ酸、例えばＨＥ４ａポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製のために用いられ得るアミノ酸がＨＥ４ａポリペプチドに融合されるもの；あるいは（ｉｉｉ）短縮ＨＥ４ａポリペプチドであり得る。このような断片、誘導体および類似体は、本明細書中の教示から、当業者の範囲内であるとみなされる。
【００６０】
短縮ＨＥ４ａポリペプチドは、全長バージョンより短いＨＥ４ａポリペプチドを含む任意のＨＥ４ａポリペプチド分子であり得る。本発明により提供される短縮分子は短縮生物学的ポリマーを包含し、本発明の好ましい実施形態では、このような短縮分子は、短縮核酸分子または短縮ポリペプチドであり得る。短縮核酸分子は、周知のまたはに記載された核酸分子の全長未満のヌクレオチド配列を有するが、この場合、このような周知のまたはに記載された核酸分子は、当業者がそれを全長分子とみなす限りは、天然、合成または組換え核酸分子であり得る。したがって例えば遺伝子配列に対応する短縮核酸分子は、全長未満の遺伝子を含有し、この場合、遺伝子はコードおよび非コード配列、プロモーター、エンハンサーおよびその他の調節配列、フランキング配列等、ならびに遺伝子の一部として認識されるその他の機能性および非機能性配列を含む。別の例では、ｍＲＮＡ配列に対応する短縮核酸分子は、全長未満のｍＲＮＡ転写体を含有し、これは種々の翻訳化および非翻訳化領域、ならびにその他の機能性および非機能性配列を含み得る。その他の好ましい実施形態では、短縮分子は、特定タンパク質の全長未満のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００６１】
本明細書中で用いる場合、「欠失」は、当業者により理解されるようなその一般的意味を有し、例えば本明細書中で提供される短縮分子の場合のような対応する全長分子と比較して、末端または非末端領域からの配列の１つまたは複数の一部分を欠く分子を指し得る。線状生物学的ポリマー（例えば核酸分子またはポリペプチド）である短縮分子は、分子の末端からの１つまたは複数の欠失、あるいは分子の非末端領域からの欠失を有し得るが、この場合、このような欠失は１〜１５００個の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基、好ましくは１〜５００個の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基、さらに好ましくは１〜３００個の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の欠失であり得る。
【００６２】
当該技術分野で周知であるように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、ポリペプチドのアミノ酸配列およびそれに対する保存アミノ酸置換を、第二のポリペプチドの配列と比較することにより確定される。２つのポリペプチドまたはヌクレオチド配列間の類似性、あるいは同一性％でさえ、当業者に周知のコンピューターアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５，１９９１；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）（これはＮＣＢＩウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）で利用可能である）を用いて配列を比較することにより、容易に確定され得る。その他の有用なコンピューターアルゴリズムの例は、ＡｌｉｇｎおよびＦＡＳＴＡのようなプログラムに用いられるものであり、これらは、例えばＩｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ Ｈｕｍａｉｎｅ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，ＦｒａｎｃｅのＧｅｎｅｓｔｒｅａｍインターネットウエブサイト（ｗｗｗ２．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｈｏｍｅ．ｅｎｇ．ｈｔｍｌ）でアクセスされ、デフォルトパラメーターとともに用いられ得る。本発明のポリペプチドの断片または一部は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチドを産生するために用いられ、したがって断片は、全長ポリペプチドを産生するための中間体として用いられ得る。
【００６３】
「単離される」という用語は、物質がその元の環境（例えばそれが天然に生じる場合には、天然環境）から取り出されることを意味する。例えば生体動物中に存在する天然ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは単離されないが、天然系中の共存物質のいくつかまたは全部から分離される同一ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、単離される。このようなポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、組成物の一部であり得るし、さらにこのような組成物がその天然環境の一部でない場合は単離される。
【００６４】
アフィニティー技法は、本発明の方法に従って用いるためにＨＥ４ａポリペプチドを単離するという状況において特に有用であり、そして分離を実行するためにＨＥ４ａポリペプチドとの特異的結合相互作用を利用する任意の方法を含み得る。例えばＨＥ４ａポリペプチドは共有結合オリゴ糖部分を含有し得るため（例えば実施例に記載される図２参照）、アフィニティー技法、例えばレクチンによる炭水化物結合を可能にする条件下での適切な固定化レクチンとのＨＥ４ａポリペプチドの結合は、特に有用なアフィニティー技法であり得る。その他の有用なアフィニティー技法としては、ＨＥ４ａポリペプチドを単離するための免疫学的技法が挙げられるが、この技法は、複合体中に存在する抗原および抗原決定基に関する部位を併有する抗体間の特異的結合相互作用に拠る。免疫学的技法としては、イムノアフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降、固相免疫吸着またはその他のイムノアフィニティー法が挙げられるが、これらに限定される必要はない。これらのおよびその他の有用なアフィニティー技法に関しては、例えばＳｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，１９８７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ＮＹ；Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（これらのに記載内容は全て、複合体を単離し、特性化するための技法（例えばアフィニティー技法）に関する詳細に関して、参照により本明細書中に援用される）を参照されたい。
【００６５】
本明細書中に記載されているように、本発明は、ＨＥ４ａに融合されたポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。このようなＨＥ４ａ融合タンパク質は、付加的コード配列に枠内で融合されたＨＥ４ａコード配列を有する核酸によりコードされて、例えばＨＥ４ａ融合タンパク質の欠失、単離および／または精製（これらに限定されない）を可能にする付加的機能性または非機能性ポリペプチド配列に融合されたＨＥ４ａポリペプチド配列の発現を提供する。このようなＨＥ４ａ融合タンパク質は、タンパク質−タンパク質親和性、金属親和性または電荷親和性ベースのポリペプチド精製により、あるいはＨＥ４ａポリペプチドが融合タンパク質から分離可能であるよう、プロテアーゼにより切断可能である融合配列を含有する融合タンパク質の特異的プロテアーゼ切断により、ＨＥ４ａ融合タンパク質の検出、単離および／または精製を可能にし得る。
【００６６】
したがってＨＥ４ａ融合タンパク質は、リガンドとの特異的親和性相互作用によりＨＥ４ａの検出および単離を促すためにＨＥ４ａに付加されるポリペプチドまたはペプチドを指す親和性タグポリペプチド配列を含み得る。リガンドは、本明細書中に提供されるような特異的結合相互作用により親和性タグが相互作用し得る任意の分子、受容体、対受容体（ｃｏｕｎｔｅｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）、抗体等であり得る。このようなペプチドとしては、例えば米国特許第５，０１１，９１２号にならびにＨｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，（１９８８ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４）に記載されたようなポリ−Ｈｉｓまたは抗原性同定ペプチド、あるいはＸＰＲＥＳＳ（登録商標）エピトープタグ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。親和性配列は、例えば細菌宿主の場合にはマーカーに融合される成熟ポリペプチドの精製のために提供されるｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＱＥ−９ベクターにより供給されるようなヘキサ−ヒスチジンタグであり得るし、あるいは親和性配列は、哺乳動物宿主、例えばＣＯＳ−７細胞が用いられる場合には、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来の抗体限定エピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｃｅｌｌ ３７：７６７）。
【００６７】
ＨＥ４ａ融合タンパク質は、特に好ましい実施形態では、そして以下でより詳細に記載されるように、さらに、ＨＥ４ａの検出、単離および／または局在化を促すためにＨＥ４ａに付加される免疫グロブリン定常部ポリペプチドを含み得る。免疫グロブリン定常部ポリペプチドは、好ましくはＨＥ４ａポリペプチドのＣ末端に融合される。非限定的理論によれば、本明細書中に提供されるようなＨＥ４ａ融合タンパク質中の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常部ドメインの含入は、例えば特定宿主中で用いられる場合、特定のＩｇ領域の免疫原性／非免疫原性特性（すなわち、「自己」対「非自己」）に関連したもの、あるいは融合タンパク質の単離および／または検出を促すものといった利点を提供し得る。Ｉｇ融合タンパク質のこれらのおよびその他の利点は、本発明の開示に基づいて、当業者に理解される。抗体由来ポリペプチドの種々の部分（例えばＦｃドメイン）に融合された異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の一般的調製は、例えばＡｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１）およびＢｙｒｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０）によりに記載されている。ＨＥ４ａ：Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合は、適切な発現ベクター中に挿入される。本発明の特定の実施形態では、ＨＥ４ａ：Ｆｃ融合タンパク質は、非常によく似た抗体分子にアセンブルされ、この場合、鎖間ジスルフィド結合がＦｃポリペプチド間に形成されて、二量体ＨＥ４ａ融合タンパク質を生じる。
【００６８】
ＨＥ４ａをコードする配列に枠内で連結されたＤＮＡ配列によりコードされる免疫グロブリンＶ領域ドメインを含む融合ポリペプチドに基づいて予備選定抗原に対する特異的結合親和性を有するＨＥ４ａ融合タンパク質も、本明細書中に提供されるようなその改変体および断片を含めて、本発明の範囲内である。免疫グロブリンＶ領域融合ポリペプチドを有する融合タンパク質の構築のための一般的戦略は、例えばＥＰ０３１８５５４；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号および米国特許第５，４７６，７８６号に開示されている。
【００６９】
本発明の核酸は、所望の親和性特性、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのような酵素を有するその他のポリペプチドに融合されたＨＥ４ａポリペプチドを含む融合タンパク質もコードし得る。別の例としては、ＨＥ４ａ融合タンパク質は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡポリペプチドに融合されたＨＥ４ａポリペプチドも含む。プロテインＡコード核酸、および免疫グロブリン定常部に対する親和性を有する融合タンパク質の構築におけるそれらの使用は、一般的に、例えば米国特許第５，１００，７８８号に開示されている。ＨＥ４ａ融合タンパク質の構築のためのその他の有用な親和性ポリペプチドとしては、例えばＷＯ８９／０３４２２、米国特許第５，４８９，５２８号、米国特許第５，６７２，６９１号、ＷＯ９３／２４６３１、米国特許第５，１６８，０４９号、米国特許第５，２７２，２５４号およびその他に開示されたようなストレプトアビジン融合タンパク質、ならびにアビジン融合タンパク質（例えばＥＰ５１１，７４７参照）が挙げられ得る。本明細書中に、そして引用参考文献中に提供されているように、ＨＥ４ａポリペプチド配列は、全長融合ポリペプチドであり得るとともに代替的にその改変体または断片であり得る融合ポリペプチド配列に融合され得る。
【００７０】
本発明は、融合タンパク質を細胞核に向かわせるポリペプチド配列であって、当業者が精通している種々の周知の細胞内タンパク質分類メカニズムのいずれかにより、小胞体（ＥＲ）の管腔中に存在し、古典的ＥＲ−ゴルジ分泌経路を介して細胞から分泌され（例えばｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．１１５：１９５−２０１，１９９０参照）、形質膜中に組み入れられ、特定の細胞質構成成分（例えば膜貫通細胞表面受容体の細胞質ドメイン）と会合し、または特定の細胞下位置に向けられるポリペプチド配列を含有するＨＥ４ａ融合タンパク質も意図する（例えばＲｏｔｈｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３７２：５５−６３，１９９４、Ａｄｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１０３１７およびそこに引用された参考文献参照）。したがってこれらのおよび関連の実施形態は、予備限定細胞内、膜または細胞外局在化に対して当該ポリペプチドを標的化することを対象とする当該組成物および方法を包含する。
【００７１】
本発明は、本発明の核酸を含むベクターおよび構築物に関し、特に上記のような本発明のＨＥ４ａポリペプチドをコードする任意の核酸を含む「組換え発現構築物」、本発明のベクターおよび／または構築物で遺伝子操作される宿主細胞、そして組換え技法による本発明のＨＥ４ａポリペプチドおよび融合タンパク質、あるいはその断片または改変体の産生にも関する。ＨＥ４ａタンパク質は、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、酵母、細菌またはその他の細胞中で発現され得る。無細胞翻訳系も、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を産生するために用いられ得る。原核生物および真核生物宿主とともに用いるための適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）によりに記載されている。
【００７２】
一般に、組換え発現ベクターは、複製の起点、ならびに宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能マーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＲＰ１遺伝子、ならびに下流構造配列の転写を指図する高発現遺伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、解糖酵素、例えば、特に、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ａ−因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始および終結配列を用いて、適切な段階でアッセンブルされる。任意に、異種配列は、例えば所望の特徴、例えば発現組換え産物の安定化または簡易精製を付与するＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。
【００７３】
細菌使用のための有用な発現構築物は、機能性プロモーターを用いて作動可能読取り段階に適切な翻訳開始および終結シグナルと一緒に所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を発現ベクター中に挿入することにより、構築される。構築物は、ベクター構築物の保持を保証し、望ましい場合には、宿主内での増幅を提供するために、１つまたは複数の表現型選択可能マーカーおよび複製の起点を含み得る。形質転換のための適切な原核生物宿主としては、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス属、ストレプトミセス属およびブドウ球菌属内の種々の種が挙げられるが、その他も選択物として用いられ得る。任意のその他のプラスミドまたはベクターは、それらが複製可能で、かつ宿主中で生育可能である限り、用いられ得る。
【００７４】
細菌使用のための有用な発現ベクターの代表的なしかし非限定例は、選択可能マーカー、および周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝因子（ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む市販のプラスミドに由来する複製の細菌起点を含み得る。このような市販ベクターとしては、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「主鎖」区分は、適切なプロモーターおよび発現される構造配列と併合される。
【００７５】
適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖後、適切な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘導）により、本明細書中に提供されるような調節プロモータが誘導され、細胞がさらなる期間、培養される。細胞は、典型的には遠心分離により収穫され、物理的または化学的手段により破壊され、その結果生じた粗製抽出物がさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、任意の便利な方法により、例えば凍結解凍循環、音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用により破壊され得る。このような方法は、当業者には周知である。
【００７６】
したがって例えば本明細書中で提供されるような本発明の核酸は、ＨＥ４ａポリペプチドを発現するための組換え発現構築物として種々の発現ベクター構築物のいずれかに含まれ得る。このようなベクターおよび構築物としては、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病ウイルスの組合せに由来するベクターが挙げられる。しかしながら任意のその他のベクターは、それが複製可能であり、宿主中で生育可能である限り、組換え発現構築物の調製のために用いられ得る。
【００７７】
適切なＤＮＡ配列（単数または複数）は、種々の手法によりベクター中に挿入され得る。概してＤＮＡ配列は、当該技術分野で周知の手法により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数または複数）に挿入される。クローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製のための、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を包含する酵素反応のための標準技法、ならびに種々の分離技法は、周知のものであり、当業者に一般的に用いられる。多数の標準技法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．& Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８２ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）；ならびにその他に記載されている。
【００７８】
発現ベクター中のＤＮＡ配列は、少なくとも１つの適切な発現制御配列（例えばプロモーターまたは調節プロモータ）に作動可能に連結されて、ｍＲＮＡ合成を指図する。このような発現制御配列の代表例としては、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐ、ラムダファージＰＬプロモーター、ならびに原核生物細胞または真核生物細胞あるいはそれらのウイルス中の遺伝子の発現を制御することが周知であるその他のプロモーターが挙げられる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたはその他のベクターを選択可能マーカーとともに用いて、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特定の命名された細菌プロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐが挙げられる。真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ極初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内であり、ＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結される少なくとも１つのプロモーターまたは調節プロモータを含むある種の特に好ましい組換え発現構築物の調製の選択が、本明細書中に記載されている。
【００７９】
上記のように、特定の実施形態では、ベクターはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターである。例えばレトロウイルスプラスミドベクターが得られるレトロウイルスとしては、モロニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび哺乳動物腫瘍ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
ウイルスベクターは、１つまたは複数のプロモーターを含む。用いられ得る適切なプロモーターとしては、レトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、ならびにＭｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０ （１９８９）に記載されたヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、あるいは任意のその他のプロモーター（例えば細胞プロモーター、例えば真核生物細胞プロモーター、例えばヒストン、ｐｏｌＩＩＩおよびβ−アクチンプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。用いられ得るその他のウイルスプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびＢ１９パルボウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から当業者には明らかであり、上記のような調節プロモータまたはプロモーターの中からであり得る。
【００８１】
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入して、プロデューサー細胞株を生成するために用いられる。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例としては、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１：５−１４ （１９９０）（このに記載内容は全て、参照により本明細書中に援用される）に記載されているようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ψ−２、Ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、当該技術分野で周知の任意の手段により、パッケージング細胞を形質導入し得る。このような手段としては、電気穿孔、リポソームの使用、ならびにリン酸カルシウム沈降が挙げられるが、これらに限定されない。一代替的方法では、レトロウイルスプラスミドベクターはリポソーム中に封入されるかまたは脂質に結合されて、次に宿主に投与され得る。
【００８２】
プロデューサー細胞株は、ＨＥ４ａポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸配列（単数または複数）を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。このようなレトロウイルスベクター粒子は次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで真核生物細胞を形質導入するために用いられ得る。形質導入化真核生物細胞は、ＨＥ４ａポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸（単数または複数）を発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、胚性幹細胞、胚性癌腫細胞、ならびに造血性幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、気管支上皮細胞および種々のその他の培養適応細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
組換えＨＥ４ａ発現構築物を調製するためにウイルスベクターが用いられる本発明の実施形態の別の例として、好ましい一実施形態では、ＨＥ４ａポリペプチドまたは融合タンパク質の発現を指図する組換えウイルス構築物により形質導入される宿主細胞は、ウイルス出芽中にウイルス粒子により組み入れられる宿主細胞膜の一部に由来する発現されたＨＥ４ａポリペプチドまたは融合タンパク質を含有するウイルス粒子を産生し得る。別の好ましい実施形態では、ＨＥ４ａコード核酸配列は、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３９，Ｃ．Ｄ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９５；Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｓｅｃｔｉｏｎ ＩＩ ｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒ １６ ｉｎ：Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐａｇｅｓ １６−３２ ｔｏ １６−４８に記載されているように、バキュロウイルスシャトルベクター中でクローン化され、これは次に、バキュロウイルスで組換えられて、組換えバキュロウイルス発現構築物を生じ、Ｓｆ９宿主細胞を感染させるために用いられ得る。
【００８４】
別の局面では、本発明は、上記の組換えＨＥ４ａ発現構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は通常、例えばクローニングベクター、シャトルベクターまたは発現構築物であり得る本発明のベクターおよび／または発現構築物を用いて遺伝子工学処理される（形質導入、形質転換、またはトランスフェクトされる）。ベクターまたは構築物は、例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態であり得る。工学処理宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、または特定の遺伝子、例えばＨＥ４ａポリペプチドまたはＨＥ４ａ融合タンパク質をコードする遺伝子を増幅するのに適しているように修飾された慣用的栄養培地中で培養され得る。発現のために選択された特定の宿主細胞のための培養条件、例えば温度、ｐＨ等は、当業者には容易に明らかになる。
【００８５】
宿主細胞は、高等真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞または下等真核生物細胞、例えば酵母細胞であり得るか、あるいは宿主細胞は、原核生物細胞、例えば細菌細胞であり得る。本発明の適切な宿主細胞の代表例としては、細菌細胞、例えば大腸菌、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞、例えば酵母；昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびヨトウ類（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳまたは２９３細胞；アデノウイルス；植物細胞、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎにすでに適合されたかまたはｄｅ ｎｏｖｏでそのように確立された任意の適切な細胞が挙げられるが、これらに限定されない。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であるとみなされる。
【００８６】
種々の哺乳動物細胞培養系も組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。したがって本発明は、一部は、ＨＥ４ａをコードする核酸配列に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現構築物を含む宿主細胞を培養することによる、組換えＨＥ４ａポリペプチドの産生方法に向けられる。特定の実施形態では、プロモーターは、本明細書中に提供されるような調節プロモーター、例えばテトラサイクリン抑制性プロモーターであり得る。特定の実施形態では、組換え発現構築物は、本明細書中に提供されるような組換えウイルス発現構築物である。哺乳動物発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ ２３：１７５ （１９８１）によりに記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株、ならびに適合性ベクターを発現可能なその他の細胞株、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、例えばＭＲＡ発現構築物の調製に関して本明細書中に記載されているように、複製の起点、適切なプロモーターおよびエンハンサーを、ならびに任意に必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与体および受容体部位、転写終結配列および５’フランキング非転写化配列も含む。ＳＶ４０スプライス由来のＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位を用いて、必要な非転写化遺伝要素を提供し得る。宿主細胞中への構築物の導入は、当業者が熟知している種々の方法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクションまたは電気穿孔（これらに限定されない）により実行され得る（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
【００８７】
発現された組換えＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）またはそれから得られる融合タンパク質は、無傷宿主細胞；無傷細胞小器官、例えば細胞膜、細胞内小胞またはその他の細胞小器官；あるいは破壊細胞調製物、例えば細胞ホモジネートまたは溶解物、単一膜および多重膜小胞またはその他の調製物（これらに限定されない）の形態で、免疫原として有用であり得る。あるいは、発現された組換えメソテリン関連抗原ポリペプチド（またはメソテリンポリペプチド）または融合タンパク質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えばイムノアフィニティークロマトグラフィー）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた方法により、組換え細胞培養から回収され、精製され得る。タンパク質リォールディング過程は、必要な場合、成熟タンパク質の立体配置を完成する場合に用いられ得る。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、最終精製過程のために用いられ得る。発現された組換えＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）または融合タンパク質は、当業者により容易に実施され得るルーチン抗体スクリーニングのためのいくつかのアッセイ立体配置のいずれかにおける標的抗原としても有用であり得る。
【００８８】
したがって本発明の方法に用いられる特異的抗体の産生のための免疫原であるＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）は、天然精製産物、または化学合成手法の産物であってもよく、あるいは原核生物宿主から、または好ましくは真核生物宿主から組換え技法により産生されてもよい。組換え産生手法に用いられる宿主によっては、本発明のポリペプチドはグリコシル化されるか、またはそうでなければ、当該技術分野で周知であるように、そして本明細書中に提供されるように、翻訳後修飾され得る。
【００８９】
本発明によれば、可溶性ヒトＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）は、被験体または生物学的供給源からの生物学的試料中で検出され得る。生物学的試料は、被験体または生物学的供給源から、血液試料、生検検体、組織外植片、器官培養、生物学的流体または任意のその他の組織または細胞調製物を得ることにより提供され得る。被験体または生物学的供給源は、ヒトまたは非ヒト動物、一次細胞培養または培養適応細胞株、例えば染色体的組込みまたはエピソーム性組換え核酸配列、不死化または不死化可能細胞株、体細胞ハイブリッド細胞株、分化または分化可能細胞株、形質転換細胞株等を含有し得る遺伝子工学処理細胞株（これらに限定されない）であり得る。本発明のある種の好ましい実施形態では、被験体または生物学的供給源は、悪性症状を有する疑いがあるかまたは有する危険性があり得るが、この悪性症状は、ある種のさらに好ましい実施形態では、卵巣癌、例えば卵巣癌腫であり、本発明のある種のその他の好ましい実施形態では、被験体または生物学的供給源は、このような疾患の危険性または存在を有さないことが周知であり得る。
【００９０】
ある種の好ましい実施形態では、生物学的試料は、被験体または生物学的供給源からの少なくとも１つの細胞を含み、ある種のその他の好ましい実施形態では、生物学的試料は、可溶性ヒトメソテリン関連抗原ポリペプチドを含有する生物学的流体である。生物学的流体は、典型的には生理学的温度で液体であり、被験体または生物学的供給源中に存在し、それから引き抜かれ、それから発現されるかまたはそうでなければ抽出され得る天然に存在する流体を含み得る。特定の組織、器官または局在化領域由来のある種の生物学的流体、ならびにある種のその他の生物学的流体は、被験体または生物学的供給源中により全体的または系統的に置かれ得る。生物学的流体の例としては、血液、血清および漿液、血漿、リンパ、尿、脳脊髄液、唾液、分泌組織および器官の粘膜分泌物、膣分泌物、腹水、例えば非固形腫瘍に関連したもの、胸水、囲心腔液、腹膜液、腹腔またはその他の体腔液等が挙げられる。生物学的流体としては、被験体または生物学的供給源と接触する溶液、例えば細胞および器官培地（例えば細胞または器官ならし培地）、灌注液等も挙げられる。ある種の非常に好ましい実施形態では、生物学的試料は血清であり、他の非常に好ましい実施形体では、生物学的試料は血漿である。その他の好ましい実施形態では、生物学的試料は無細胞溶液である。
【００９１】
ある種のその他の好ましい実施形態では、生物学的試料は無傷細胞を含み、ある種のその他の好ましい実施形態では、生物学的試料は、配列番号１１または１３に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａ抗原ポリペプチドあるいはその断片または改変体をコードする核酸配列を含有する細胞抽出物を含む。
【００９２】
試料中の「可溶性形態で天然に存在する分子」とは、可溶性タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、またはそれらの誘導体；脂質、脂肪酸等、またはそれらの誘導体；炭水化物、糖等、またはそれらの誘導体、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、プリン、ピリミジンまたは関連分子、あるいはそれらの誘導体等；あるいはそれらの任意の組合せ、例えば糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、プロテオリピド、あるいは本明細書中に提供されるような生物学的試料の可溶性または無細胞構成分である任意のその他の生物学的分子であり得る。「可溶性形態で天然に存在する分子」とはさらに、溶液中に存在するかまたは生物学的試料、例えば本明細書中に提供されるような生物学的流体中に存在する、そして無傷細胞の表面に結合されない分子を指す。例えば可溶性形態で天然に存在する分子としては、溶質；高分子複合体の構成成分；細胞から脱粒され、分泌され、または輸送される物質；コロイド；マイクロ粒子またはナノ粒子あるいはその他の微小懸濁粒子等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
被験体における悪性症状の存在は、被験体における異形成細胞、癌性細胞および／または形質転換細胞の存在、例えば新性細胞、腫瘍細胞、非接触阻害化細胞または癌遺伝子的形質転換細胞等を指す。例証として、本発明の状況においては、悪性症状は、このようなポリペプチドのレベル増大が被験体からの生物学的試料中で検出可能であるような方法で、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）を分泌し、脱粒し、輸出し、または放出することができる癌細胞の被験体中での存在をさらに指し得るが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、例えばこのような癌細胞は、悪性上皮細胞、例えば癌腫細胞であり、特に好ましい実施形態では、このような癌細胞は、例えば胸腔、囲心腔、腹膜、腹腔およびその他の体腔を裏打ちすることが判明している扁平上皮細胞または中皮細胞の形質転換化改変体である悪性中皮腫細胞である。
【００９４】
本発明の最も好ましい実施形態では、その存在が悪性症状の存在を意味する腫瘍細胞は、卵巣癌細胞、例えば原発性および転移性卵巣癌細胞である。原発性および転移性腫瘍からのヒト卵巣癌細胞株の確立および特性化である（例えばＯＶＣＡＲ−３、Ａｍｅｒ．Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．６６：３７８）と同様に、悪性疾患を卵巣癌と分類するための判定基準は、当該技術分野で周知である（例えばＢｅｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．１０５：１１３６；Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１７ （４Ｂ）：３０１９）；Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１７ （４Ｂ）：２９４９；Ｃｉｏｆｆｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｔｕｍｏｒｉ ８３：５９４；およびそれらに引用された参考文献参照）。その他の実施形態では、悪性症状は、中皮腫、膵臓癌、非小細胞肺癌または別の形態の癌、例えば種々の癌腫（例えば扁平上皮細胞癌および腺癌）のいずれか、ならびに例えば肉腫および血液学的悪性疾患（例えば白血病、リンパ腫、骨髄腫等）であり得る。これらのおよびその他の悪性症状の分類は当業者に周知であり、本発明の開示は、過度の実験を伴わずに、このような悪性症状におけるＨＥ４ａポリペプチドの存在を確定する。
【００９５】
本明細書中に提供されるように、被験体における悪性症状の存在に関するスクリーニング方法は、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体またはＨＥ４ａポリペプチドに特異的な抗体の使用を特徴づけ得る。
【００９６】
ＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（またはＨＥ４ａポリペプチド）に特異的である抗体は、モノクローナル抗体として、またはポリクローナル抗血清として容易に生成され、あるいは当該技術分野で周知の方法を用いて望ましい特性を有するよう設計される遺伝子工学処理化免疫グロブリン（Ｉｇ）として産生され得る。例えば限定ではなく例証として、抗体は、組換えＩｇＧ、免疫グロブリン由来配列を有するキメラ融合タンパク質、または本発明のヒトＨＥ４ａポリペプチドの検出のためにすべて用いられ得る「ヒト化」抗体（例えば米国特許第５，６９３，７６２号、第５，５８５，０８９号、第４，８１６，５６７号、第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号およびそれらに引用された参考文献参照）を包含し得る。このような抗体は、本明細書中に提供されるように、例えば以下に記載されるようにＨＥ４ａポリペプチドを用いた免疫感作により、調製され得る。例えば本明細書中に提供されるように、免疫原として用いるためにこれらのポリペプチドを当業者がルーチンに調製し得るよう、ＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸配列が開示される。例えばモノクローナル抗体、例えば以下でさらに詳細に記載される２Ｈ５、３Ｄ８および４Ｈ４は、本発明によるある種の方法を実施するために用いられ得る。
【００９７】
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、ならびにＨＥ４ａポリペプチドを特異的に結合する分子である任意の天然に存在するかまたは組換え的に産生される結合相手を包含する。抗体は、それらが約１０４Ｍ−１以上の、好ましくは約１０５Ｍ−１以上の、さらに好ましくは約１０６Ｍ−１以上の、さらにより好ましくは約１０７Ｍ−１以上のＫａでＨＥ４ａポリペプチドを結合する場合、「免疫特異的」であるまたは特異的に結合すると定義される。結合相手または抗体の親和性は、慣用的技法を用いて、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０ （１９４９）によりに記載された技法を用いて、容易に確定され得る。ＨＥ４ａポリペプチドの結合相手としてのその他のタンパク質の確定は、他のタンパク質またはポリペプチドと特異的に相互作用するタンパク質を同定し、得るための多数の周知の方法のいずれか、例えば米国特許第５，２８３，１７３号および米国特許第５，４６８，６１４号または等価物に記載されたような酵母二ハイブリッドスクリーニング系を用いて、実施され得る。本発明は、ＨＥ４ａポリペプチドと特異的に結合する結合相手および抗体を調製するための、ＨＥ４ａポリペプチド、ならびにＨＥ４ａポリペプチドのアミノ酸配列を基礎にしたポリペプチドの使用も包含する。
【００９８】
抗体は一般に、当業者に周知の種々の技法のいずれかにより調製され得る（例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８参照）。このような一技法では、好ましくは１つまたは複数の追加免疫感作を組み入れる予定スケジュールに従って、ＨＥ４ａポリペプチドを含む免疫原、例えばその表面にＨＥ４ａポリペプチドを有する細胞または単離ＨＥ４ａポリペプチドが、最初に適切な動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヤギ）に注射され、動物は定期的に血を抜き取られる。次に、ＨＥ４ａポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体が、例えば適切な固体支持体に結合されたポリペプチドを用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより、このような抗血清から精製され得る。
【００９９】
ＨＥ４ａポリペプチドまたはそれらの改変体に特異的なモノクローナル抗体は、例えばＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７６ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９）の技法およびその改良技法を用いて、調製され得る。要するにこれらの方法は、所望の特異性（すなわち当該メソテリンポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生可能な不死細胞株の調製を包含する。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫感作された動物から得られる脾臓細胞から産生され得る。脾臓細胞は次に、例えば、骨髄腫細胞融合相手、好ましくは免疫感作動物と同系であるものとの融合により免疫感作される。例えば脾臓細胞および骨髄腫細胞は、膜融合促進剤、例えばポリエチレングリコールまたは非イオン性洗剤と２〜３分間併合され、次に、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが骨髄腫細胞の増殖は支持しない選択培地上で低密度でプレート化され得る。好ましい選択技法は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いる。十分な時間の後、通常は約１〜２週間後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーが選択され、ポリペプチドに対する結合活性に関して試験される。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。ＨＥ４ａポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体を生じるハイブリドーマが、本発明により意図される。
【０１００】
モノクローナル抗体は、増殖中のハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、収量を増強するために、種々の技法、例えば適切な脊椎動物宿主（例えばマウス）の腹膜腔中へのハイブリドーマ細胞株の注射が用いられ得る。次にモノクローナル抗体が腹水または血液から採取され得る。慣用的技法により、例えばクロマトグラフィー、ゲル濾過、沈降および抽出により、夾雑物が抗体から除去される。例えば抗体は、標準技法を用いて固定化プロテインＧまたはプロテインＡ上でのクロマトグラフィーにより、精製され得る。
【０１０１】
特定の実施形態内では、抗体の抗原結合断片の使用が選択され得る。このような断片としては、標準技法を用いて（例えばＦａｂおよびＦｃ断片を産生するためのパパインを用いた消化により）調製され得るＦａｂ断片が挙げられる。ＦａｂおよびＦｃ断片は、標準技法を用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより（例えば固定化プロテインＡカラム上で）分離され得る（例えばＷｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ参照）。
【０１０２】
種々のエフェクタータンパク質をコードする配列にインフレームで連結されるＤＮＡ配列によりコードされる免疫グロブリンＶ領域ドメインにより、予備選定抗原に対する特異的結合親和性を有する多機能性融合タンパク質は、例えばＥＰ−Ｂ１−０３１８５５４、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号および米国特許第５，４７６，７８６号に開示されているように、当該技術分野で周知である。このようなエフェクタータンパク質は、当業者が熟知している種々の技法、限定はされないが例えばビオチン模倣配列（例えばＬｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：２２５およびそこに引用された参考文献参照）、検出可能標識部分を用いた直接共有的修飾、特異的標識レポーター分子との非共有結合、検出可能基質の酵素的修飾、あるいは固相支持体上での免疫感作（共有的または非共有的）のいずれかにより融合タンパク質の結合を検出するために用いられ得るポリペプチドドメインを包含する。
【０１０３】
本発明に用いるための単鎖抗体は、ファージディスプレイのような方法によっても生成され、選択され得る（例えば米国特許第５，２２３，４０９号；Ｓｃｈｌｅｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：４７；およびそれらに引用された参考文献参照）。要するにこの方法では、ＤＮＡ配列は、線維状ファージ、例えばＭ１３の遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩに挿入される。多重クローニング部位を有するいくつかのベクターが、挿入のために開発されている（ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １２８：２９−３６，１９９３；Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０，１９９０；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２２８−２５７，１９９３）。挿入ＤＮＡ配列は無作為に生成されるか、またはＨＥ４ａポリペプチドとの結合のための周知の結合ドメインの改変体であり得る。単鎖抗体は、この方法を用いて容易に生成され得る。一般に挿入物は、６〜２０アミノ酸をコードする。挿入配列によりコードされるペプチドは、バクテリオファージの表面に表示される。ＨＥ４ａポリペプチドに関する結合ドメインを発現するバクテリオファージは、固定化ＨＥ４ａポリペプチド、例えば当該技術分野で周知の方法および本明細書中に開示されるような核酸コード配列を用いて調製される組換えポリペプチドと結合することにより選択される。非結合ファージは、典型的には１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡを含有し、塩を有さないかまたは低塩濃度を有する洗浄液により除去される。結合ファージは、例えば塩を含有する緩衝剤で溶離される。ＮａＣｌ濃度は、すべてのファージが溶離されるまで、段階的に増大される。典型的には、高親和性で結合するファージは、より高い塩濃度により放出される。溶離ファージは、細菌宿主中で増殖される。さらに数回の選択を実施して、高親和性で結合する多少のファージに関して選択し得る。次に、結合ファージ中の挿入物のＤＮＡ配列が決定される。一旦、結合ペプチドの予測アミノ酸配列が分かれば、ＨＥ４ａポリペプチドに特異的な抗体として本明細書中で用いるのに十分なペプチドは、組換え手段により、または合成的に作製され得る。組換え手段は、抗体が融合タンパク質として産生される場合に用いられる。ペプチドは、親和性または結合を最大にするために、２つ以上の類似のまたは類似でないペプチドのタンデムアレイとしても生成され得る。
【０１０４】
ＨＥ４ａポリペプチドに特異的な抗体と反応性がある抗原決定基を検出するためには、検出試薬は典型的には抗体であり、これは本明細書中に記載されたように調製され得る。試料中のポリペプチドを検出するための抗体を用いるために当業者に周知の種々のアッセイフォーマットが存在し、例としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光測定法、免疫沈降法、平衡透析、免疫拡散法およびその他の技法が挙げられるが、これらに限定されない（例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ参照）。例えばアッセイは、ウエスタンブロットフォーマットで実施され得るが、この場合、生物学的試料からのタンパク質調製物はゲル電気泳動に付され、適切な膜に移されて、抗体と反応させられる。次に、当該技術分野で周知であり、かつ以下に記載されるような適切な検出試薬を用いて、膜上の抗体の存在が検出され得る。
【０１０５】
別の実施形態では、アッセイは、標的ＨＥ４ａポリペプチドと結合し、それを残りの試料から除去するために固体支持体上に固定された抗体の使用を包含する。結合ＨＥ４ａポリペプチドは次に、別個のＨＥ４ａポリペプチド抗原決定基と反応性の第二の抗体、例えば検出可能レポーター部分を含有する試薬を用いて検出され得る。非限定的な例として、この実施形態によると、固定化抗体、ならびに別個の抗原決定基を認識する第二の抗体は、モノクローナル抗体２Ｈ５、３Ｄ８および４Ｈ４から選択される本明細書中に記載されるモノクローナル抗体のうちの任意の２つであり得る。あるいは、ＨＥ４ａポリペプチドが検出可能レポーター部分で標識されて、固定化抗体と試料とのインキュベーション後に固定化ＨＥ４ａポリペプチドに特異的な固定化抗体と結合させられる、競合アッセイが利用され得る。試料の構成成分が標識ポリペプチドと抗体との結合を阻害する程度は、試料と固定化抗体との反応性を示し、その結果、試料中のＨＥ４ａのレベルを示す。
【０１０６】
抗体が結合され得る固体支持体は、当業者に周知の任意の材料、例えばマイクロタイタープレート中の試験ウエル、ニトロセルロースフィルターまたは別の適切な膜であり得る。あるいは支持体は、ビーズまたは円板、例えばガラス、ファイバーグラス、ラテックスまたはプラスチック、例えばポリスチレンまたはポリ塩化ビニルであり得る。抗体は、特許および科学文献中に詳細に記載されている当業者に周知の種々の技法を用いて、固体支持体上に固定され得る。
【０１０７】
ある種の好ましい実施形態では、試料中のＨＥ４ａ抗原ポリペプチドの検出のためのアッセイは、二抗体サンドイッチアッセイである。このアッセイは、試料中に天然に存在し、抗体と反応性がある抗原決定基を有する可溶性分子が固定化抗体に結合されて（例えば室温で３０分間のインキュベーション時間で一般的に十分である）、抗原−抗体複合体または免疫複合体を形成するように、まず、固体支持体に、一般的には微小滴定プレートのウエルに固定されたＨＥ４ａポリペプチド特異的抗体（例えば２Ｈ５、３Ｄ８または４Ｈ４等のモノクローナル抗体）を、生物学的試料と接触させることにより実施され得る。次に、試料の非結合構成成分が、固定化免疫複合体から除去される。次に、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二抗体が付加されるが、この場合、第二の抗体の抗原結合部位は、固定化第一抗体の抗原結合部位とＨＥ４ａポリペプチド（例えば固体支持体上に固定されたモノクローナル抗体と同一でない２Ｈ５、３Ｄ８または４Ｈ４のようなモノクローナル抗体）との結合を競合的に阻害しない。第二の抗体は、直接検出され得るよう、本明細書中に提供されるように検出可能に標識され得る。あるいは第二の抗体は、検出可能に標識された第二の（または「第二段階」）抗抗体の使用により、または本明細書中に提供されるような特異的検出試薬の使用により、間接的に検出され得る。イムノアッセイに精通した者は、二抗体サンドイッチイムノアッセイにおいて特定抗原（例えばメソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎｅ）ポリペプチド）を免疫学的に検出するための多数の試薬および立体配置が存在することを理解するので、本発明の方法は、いかなる特定の検出手法にも限定されない。
【０１０８】
上述の二抗体サンドイッチアッセイを用いる本発明のある種の好ましい実施形体では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な一次固定化抗体はポリクローナル抗体であり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二の抗体はポリクローナル抗体である。本発明のある種のその他の実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な一次固定化抗体はモノクローナル抗体であり、統一のため、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二の抗体はポリクローナル抗体である。本発明のある種のその他の実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な一次固定化抗体はポリクローナル抗体であり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二の抗体はモノクローナル抗体である。本発明のある種のその他の非常に好ましい実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な一次固定化抗体はモノクローナル抗体であり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二の抗体はモノクローナル抗体である。例えばこれらの実施形態では、これらのモノクローナル抗体の任意の対方式の組合せが用いられ得るよう、本明細書中に提供されるようなモノクローナル抗体２Ｈ５、３Ｄ８および４Ｈ４は、ＨＥ４ａポリペプチド上の別個の、非競合的抗原決定基（例えばエピトープ）を認識する、ということに留意すべきである。本発明のその他の好ましい実施形態では、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な一次固定化抗体および／またはＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な第二の抗体は、当該技術分野で周知であり、かつ本明細書中で言及される、例えば限定ではなく例証として、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、免疫グロブリンＶ領域融合タンパク質または単鎖抗体と呼ばれる抗体の種類のいずれかであり得る。本発明は、本明細書中に開示され、特許請求された方法におけるその他の抗体形態、断片、誘導体等の使用を包含すると、当業者は理解する。
【０１０９】
ある種の特に好ましい実施形態では、第二の抗体は、検出可能レポーター部分または標識、例えば酵素、染料、放射性核種、発光基、蛍光基またはビオチン等を含有し得る。次に、固体支持体に結合されたままの第二の抗体の量が、特異的検出可能レポーター部分または標識に適した方法を用いて確定される。放射性基に関しては、シンチレーション計数またはオートラジオグラフ法が一般に適している。抗体−酵素接合体は、種々のカップリング技法を用いて調製され得る（概説に関しては、例えばＳｃｏｕｔｅｎ ，Ｗ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３５：３０−６５，１９８７参照）。分光分析法は、染料（例えば酵素反応の比色分析産物）、発光基および蛍光基を検出するために用いられ得る。ビオチンは、異なるレポーター基（一般的に放射性基または蛍光基または酵素）に結合されたアビジンまたはストレプトアビジンを用いて検出され得る。酵素レポーター基は一般に、基質の付加（一般に特定時間の）と、その後の分光分析、分光光度分析または反応産物のその他の分析により検出され得る。標準および標準付加は、周知の技法を用いて、試料中のメソテリンポリペプチドのレベルを確定するために用いられ得る。
【０１１０】
別の実施形態では、本発明は、生物学的供給源または被験体からの生物学的試料中の免疫特異的反応性抗体の検出により悪性症状の存在に関してスクリーニングするための、本明細書中に提供されるようなＨＥ４ａ抗原ポリペプチドの使用を意図する。この実施形態によれば、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチド（あるいはその断片または改変体、例えば本明細書中に提供されるような短縮ＨＥ４ａ抗原ポリペプチド）は検出可能に標識され、生物学的試料と接触されて、試料中の天然で可溶性形態の抗体のＨＥ４ａ抗原ポリペプチドとの結合が検出される。例えばＨＥ４ａ抗原ポリペプチドは、周知の方法、例えば容易に検出可能な（例えば放射性標識された）アミノ酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳中の取り込みと呼応して、本明細書中に開示された配列を用いることにより、あるいはその他の検出可能レポーター部分、例えば上記のものを用いることにより、生合成的に標識され得る。理論に結び付けて考えたくはないが、本発明のこの実施形態は、ある種のＨＥ４ａポリペプチド、例えば本明細書中に開示されたＨＥ４ａ融合ポリペプチドが、特に免疫原性であるために特異的かつ検出可能な抗体を生じるポリペプチドを提供し得る、ということを意図する。例えばこの理論によれば、ある種のＨＥ４ａ融合ポリペプチドは、強烈な免疫応答を引き起こす「非自己」抗原を示し得るが、一方、融合ドメインを欠くＨＥ４ａポリペプチドは、体液性または細胞媒介性免疫を容易に引き出さない、より類似する「自己」抗原として、免疫系により見られ得る。
【０１１１】
上記のように、本発明は、一部は、可溶性形態のＨＥ４ａ抗原ポリペプチドが被験体中に天然に存在し、例えばある種の癌腫を有する被験体においてこのような可溶性ＨＥ４ａポリペプチドのレベルが増大する、という意外な知見に関する。
【０１１２】
本発明による悪性症状の存在に関するスクリーニング方法は、被験体からの生物学的試料中の２つ以上の腫瘍関連マーカーの検出により、さらに強化され得る。したがって、特定の実施形態では、本発明は、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体との天然に存在する可溶性試料構成成分の反応性を検出するほかに、当該技術分野で周知の、そして本明細書中に提供されるような確立された方法を用いた悪性症状の少なくとも１つの付加的な可溶性マーカーの検出も包含するスクリーニング方法を提供する。上記のように、容易に得られる生物学的流体の試料中に検出可能であるいくつかの可溶性腫瘍関連抗原が一般的に存在する。例えば本発明の特定の実施形態は、Ｓｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１１５３１）に記載され、そして米国特許出願０９／５２３，５９７号にもに記載されているような新規の可溶性メソテリン関連抗原（ＭＲＡ）ポリペプチドのようなポリペプチドを含むヒトメソテリンポリペプチドに関する。
【０１１３】
本明細書中に提供されるように、「メソテリンポリペプチド」は、以下のペプチド：
ＥＶＥＫＴＡＣＰＳＧＫＫＡＲＥＩＤＥＳ（配列番号１４）
を含むアミノ酸配列を有し、そしてさらに、ＭＡｂ Ｋ−１（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３６；ＭＡｂ Ｋ−１は、例えばＳｉｇｎｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡから入手可能である）の、あるいはＵ．Ｓ．Ａ．Ｎ．０９／５１３，５９７に提供されたようなモノクローナル抗体ＯＶ５６９、４Ｈ３、３Ｇ３または１Ａ６の免疫特異的結合を競合的に阻害する抗原結合部位を有する少なくとも１つの抗体と反応性がある少なくとも１つの抗原決定基を有する可溶性ポリペプチドである。
【０１１４】
したがって、本発明により用いるためのこれらの付加的な可溶性腫瘍関連抗原としては、メソテリンおよびメソテリン関連抗原、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、シアリルＴＮ、ＳＣＣ、ＴＰＳおよびＰＬＡＰが挙げられるが、これらに限定されず、例えば、Ｂａｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９：８８３；Ｌｉｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ．７１：８４２；Ｓａｒａｎｄａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ．３６：７５５；Ｓａｒａｎｄａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１９：７３；Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃ Ｒｅｓ．１７（４Ｂ）：２９４５；Ｋｕｄｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｉｎｖｅｓｔ．４７：５２；Ｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．１０４：１０２４；Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．１０５：１１３６；Ｃｉｏｆｆｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｔｕｍｏｒｉ ８３：５９４；Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１７（４Ｂ）：２９４９ Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ａｎｔｉｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１７（４Ｂ）：３０１１９を参照、そしてさらに、生物学的試料中のそれらの存在が本明細書中に提供されるような少なくとも１つの悪性症状の存在と相関し得る任意の周知のマーカーが挙げられ得る。
【０１１５】
あるいは、ＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸配列は、標準ハイブリダイゼーションおよび／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を用いて検出され得る。本明細書中に提供されるＨＥ４ａ ｃＤＮＡ配列に基づいて、適切なプローブおよびプライマーが当業者により設計され得る。アッセイは一般に、生物学的供給源、例えば真核生物細胞、細菌，ウイルス、このような生物体から調製される抽出物、ならびに生体内に見出される流体から得られる種々の試料のいずれかを用いて実施され得る。
【０１１６】
以下の実施例は例証として提供されるものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１１７】
（実施例１：ヒト試料中のＨＥ４ａ発現の実時間ＰＣＲ検出）
ワシントン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、スウェーデン病院（Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）およびフレッド・ハッチンソン癌リサーチセンター（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）（すべてワシントン州シアトル所在）により認可された手法に従って、１５８例のヒト組織生検または生検からのＲＮＡ試料を得た。正常組織（副腎、骨髄、脳、結腸、子宮内膜、胃、心臓、腎臓、肝臓、肺、肺、乳腺、骨格筋、骨格筋、子宮筋層、末梢神経、末梢血リンパ球調製物、唾液腺、皮膚、小腸、脊髄、脾臓、脾臓、気管、胸腺、子宮、末梢血リンパ球培養および４０例の正常卵巣）からの、良性卵巣病変（１３例の漿液性嚢腺腫）からの、境界悪性疾患の２例の卵巣腫瘍からの、３例のＩ期粘液性卵巣癌腫からの、３例のＩ期漿液性卵巣癌腫からの、３７例のＩＩＩ期漿液性卵巣癌種からの、７例のＩＶ期漿液性卵巣癌腫からの試料、転移性卵巣癌種からの組織の６例の試料、および卵巣癌を有する女性からの２例の卵管が含まれた。組織試料はすべて、治療前の女性から採取し、各腫瘍の一部は、直ちに液体窒素中に入れて、残りの検体はルーチン組織学検査に付した。組織病理学的検査で８０％より多い腫瘍細胞からなることが判明した、そして壊死を伴わない試料のみを、ハイブリダイゼーションおよび実時間ＰＣＲ実験に用いた。卵巣表面上皮培養（ＯＳＥ、Ｂ．Ｋａｒｌａｎ，Ｃｅｄａｒｓ Ｓｉｎａｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｌｏｓ Ａａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡから入手）からのＲＮＡ、ならびに３例の付加的ＯＳＥ試料（Ｒ．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）も含まれた。全１５１例（非悪性組織９４例および癌５７例）を、下記のようにＨＥ４ａを含めた当該遺伝子の過剰発現の実時間定量的ＰＣＲ確証のために保存した。
【０１１８】
実時間定量的ＰＣＲを、以下のように実施した。ＨＥ４実時間ＰＣＲプライマーは、以下の：
ＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＧＧＣＧＴＧＴ（フォワード）（配列番号１５）
および
ＧＡＡＡＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＧＧＴＣＡ（リバース）（配列番号１６）
であった。
【０１１９】
これらのプライマーは、４２７塩基長（ｂｐ）のＰＣＲ産物を生じた。メーカーに特定されたようにオリゴ−ｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いて、総ＲＮＡを逆転写した。ＡＢＩ７７００機（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）およびＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎプロトコールを用いて、実時間定量的ＰＣＲを実施した。白血球ｃＤＮＡ調製物の２倍連続希釈の５つの複製物を、標準（Ｓ３１ｉｉｉ１２５、これは、従来の実験では、正常および悪性組織において普遍的に発現されることが実証された。Ｓｃｈｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｇｅｎｅ１９９９参照）の増幅のための鋳型として役立てた。
【０１２０】
ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｕ６１７３４、フォワードプライマー：ＣＧＡＣＧＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＣＣＡＡ（配列番号１７）
リバースプライマー：ＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡ（配列番号１８）。
【０１２１】
負の対照は、酵素を用いずに逆転写された卵巣癌腫からの総ＲＮＡからなり、そして一ウエルは、いかなる鋳型も伴わずにＰＣＲの全構成成分を含有した。全行程を二重反復試験で実施した。単一ＰＣＲ帯域の存在に関して、各行程をアガロースゲル上で分析し、人工帯域を排除した。各９６ウエルプレートに関する結果を、ＰＣＲ機のメーカーにより提供されたソフトウエア（シーケンスデテクター（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（登録商標））を用いて分析した。この分析は、標準に対する該核酸配列（ＨＥ４ａ）の発現レベルの確定を可能にした。
【０１２２】
発現値は、図１に示したように、内部標準に対して任意の単位で示したが、測定の標準単位でのｍＲＮＡ分子の絶対量を反映しなかった。平均ＨＥ４ａ発現レベルの振幅およびこれらの値とその他の周知の遺伝子（注目すべきは高発現遺伝子としてのβアクチン）の比較に基づいて、図１は、ＨＥ４ａをコードする転写体が中等度〜高度の相対レベルで発現されたことを示す。
【０１２３】
（実施例２：ＨＥ４ａをコードする核酸配列のクローニングおよび発現）
高生産量ＨＥ４ａ ｃＤＮＡクローンからのＨＥ４ａ融合構築物ｃＤＮＡの増幅：Ｋｉｒｃｈｏｆｆ等（１９９１）により最初に発表されたＨＥ４に関するｃＤＮＡ配列（配列番号８）を、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ６３１８７に寄託し、本明細書中に記載されるようなＨＥ４ａをコードするｃＤＮＡ（配列番号１０）をクローン化するためのオリゴヌクレオチドプライマー設計の基礎を提供した。高生産量ｃＤＮＡアレイを用いて示差的発現された遺伝子産物として同定され、単離されたＨＥ４ａに関するｃＤＮＡを、ｐＳＰＯＲＴ中で８４０塩基対断片としてクローン化した。このｃＤＮＡをＰＣＲ反応において鋳型として用いて、本実施例に記載したような合成融合タンパク質遺伝子を作製するのに適した形態でＨＥ４ａを増幅した。
【０１２４】
ＨＥ４コード配列（配列番号８）の一部は、推定分泌シグナルペプチドをコードすると思われた。したがってこのネイティブリーダーペプチドを最初の構築物に用いて、できるだけ多くの分子の構造を保存した。さらに、ＨＥ４ａは相対的に小さく、配列はいかなる異常な構造的特徴、例えば膜貫通ドメインまたは細胞質ターゲッティング配列も含有しなかったため、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに融合された完全ＨＥ４ａ遺伝子産物を組入れた融合タンパク質を設計した。クローニングに適した制限部位をコードするプライマーを設計し、最終構築物のためのタンパク質ドメインの必要な枠内融合を作製した。５’プライマー（配列番号１またはＨＥ４−５’）は３９−ｍｅｒで、これはＨｉｎｄＩＩＩ部位、最初のＡＴＧに隣接する発現を改良するためのＫｏｚａｋ配列、ならびに前に公表されたＨＥ４配列を基礎にしたＨＥ４ａリーダーペプチドの一部を包含した。３’プライマー（配列番号２またはＨＥ４−３’−１）は３６−ｍｅｒで、これはヒトＩｇ尾部ｃＤＮＡへの融合のための枠内ＢａｍＨＩ部位を含み、ＨＥ４コード配列の３’末端はＳＴＯＰコドン直前で切頭された。これら２つのプライマーを５０ｐｍｏｌで、そして１ ｎｇのＨＥ４／ｐＳＰＯＲＴプラスミドを鋳型として用いて、ＰＣＲ増幅反応を実施した。５０μｌの反応物は、２．５単位（０．５ｍｌ）のＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ Ｓｈｕｚｏ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）、希釈緩衝液およびヌクレオチドも、パッケージ挿入使用説明書にしたがって含入した。９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒の増幅プロフィールで、反応物を３０回増幅した。全長ＨＥ４に関する予測サイズ（約４００塩基対）のＰＣＲ産物を得た。
【０１２５】
これらの断片を制限消化し、精製して、ヒトＩｇＧ１挿入物をすでに含有する適切に消化された哺乳動物発現プラスミドに結繋した。結繋産物をＤＨ５α細菌細胞中で形質転換させて、形質転換体をＨＥ４−ｈＩｇＧ１融合遺伝子挿入物の存在に関してスクリーニングした。次に、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１０（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）シーケンサーでＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクルシーケンシングキット（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、いくつかの単離物からのプラスミドＤＮＡをシーケンシングした。さらに、これらの単離物からのプラスミドＤＮＡをまた、に記載されたように（Ｈａｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：３）ＣＯＳ７細胞のＤＥＡＥ−デキストラン一過性トランスフェクションにより、トランスフェクトした。培養上清を７２時間後に採取し、プロテインＡ−アガロースを用いた免疫沈降、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびウエスタンブロッティングによりスクリーニングした（図２）。ヤギ抗ヒトＩｇＧ接合体を１：５０００で用いて、その後ＥＣＬ現像を用いて、ウエスタンブロットをプローブした。
【０１２６】
配列分析からの結果は、得られたＨＥ４ａコード配列（配列番号１０）および推定アミノ酸配列（配列番号１１）は、公表済みＨＥ４コード（配列番号８）および翻訳化（配列番号９）配列とはいくつかの位置で異なる、ということを示した。したがって配列は、正常ヒト精巣上体からおよびいくつかの腫瘍細胞株から得られるｃＤＮＡから、および原発性腫瘍ＲＮＡから得て、そして配列番号１０に記述されるようなＨＥ４ａコード配列および配列番号１１に記述される推定コード化アミノ酸配列を確証した。
【０１２７】
腫瘍細胞株からのＨＥ４ｃＤＮＡのクローニング：メーカーの使用説明書に従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、いくつかの卵巣腫瘍細胞株、例えば４００７およびＯＶＣＡＲ３（例えばＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．６１：２４２０参照）から、ＲＮＡを調製した。メーカーの指示に従って１〜３μｇのＲＮＡ、無作為六量体およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｃＤＮＡを調製した。１μｇのｃＤＮＡ、２．５単位（０．５ｍｌ）のＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ Ｓｈｕｚｏ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）、希釈緩衝液およびヌクレオチドを、パッケージ挿入使用説明書にしたがって含入する５０μｌの反応液中の無作為プライム化ｃＤＮＡならびにＨＥ４−５’およびＨＥ４−３’−１特異的プライマーから、ＨＥ４ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒の増幅プロフィールで、反応物を３０回増幅した。腫瘍由来ｃＤＮＡからのＨＥ４のＰＣＲ増幅のために、ＨＥ４−５’およびＨＥ４−３’−１オリゴヌクレオチドを再び用いた。全長ＨＥ４に関する予測サイズのＰＣＲ産物を得て、配列分析のために、断片をｐＴ−ＡｄｖａｎＴＡｇｅベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）中でクローン化した。挿入物を有するクローンを上記と同様にシーケンシングし、腫瘍ＲＮＡ試料からのＰＣＲ断片は、上記の元のクローンと同一のＨＥ４ａ配列をコードすることが判明した。これらのＨＥ４ａ配列は、ＨＥ４に関する公表済み配列とは異なっていた（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。同様に、ＨＥ４ａコード配列は、正常精巣上体（配列番号１０）から、ならびに原発性腫瘍組織ｃＤＮＡ（配列番号１２）から得られ、したがって上記の新規ＨＥ４ａ配列と適合したが、しかしＫｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９１）のＨＥ４配列（配列番号８）とは異なった。
【０１２８】
ＨＥ４Ｉｇ融合タンパク質の産生：上記のｐＣＤＮＡ３の誘導体である哺乳動物発現ベクターｐＤ１８の多クローニング部位に、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片として、ＨＥ４−ｈＩｇＧ１ ｃＤＮＡ構築物（配列番号７）を挿入した（Ｈａｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４８：２４２）。構築物を、上記（Ｈａｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：３）のようにＤＥＡＥ−デキストラン一過性トランスフェクションにより、最初にトランスフェクトした。いくつかの単離物からのプラスミドＤＮＡを調製し、ＣＯＳ７細胞を一過性トランスフェクトするために用いた。培養上清を７２時間後に採取し、プロテインＡ−アガロースを用いた免疫沈降、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびウエスタンブロッティングによりスクリーニングした（図２）。
【０１２９】
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．１９８６ Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５）を用いて、高レベルの当該融合タンパク質を発現する安定株を構築した。ｐＤ１８ベクター中で高コピー電気穿孔により（Ｈａｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４８：２４２；Ｂａｒｓｏｕｍ，１９９０ ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：２９３）、ならびに組換えインスリン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）、グルタミン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＥＭのための２×非必須アミノ酸（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１００ｎＭのメトトレキセート（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するエクセル３０２ＣＨＯ培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＰＡ）中での限定希釈によるメトトレキセート耐性クローンの選択により、ＨＥ４Ｉｇを発現する安定ＣＨＯ株を作製した。次に耐性クローンからの培養上清をＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡによりアッセイして、高産生株に関してスクリーニングした。消耗上清を大規模培養から採取し、２ｍｌプロテインＡ−アガロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）カラム上でのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、ＨＥ４Ｉｇを精製した。融合タンパク質を０．１Ｍクエン酸塩緩衝液（ｐＨ２．７）中の０．８ｍｌ分画としてカラムから溶離し、１００μｌの１Ｍトリスベース（ｐＨ１０．５）を用いて中和した。溶離分画を２８０ｎｍでの吸光度に関してアッセイし、融合タンパク質を含有する分画をプールして、７リットルのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で一晩透析し、０．２μｍの注射器フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を通して濾過滅菌した。
【０１３０】
安定トランスフェクト体を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスの感作のために十分なタンパク質を産生した。マウスを最初に１０μｇの精製ＨＥ４−ｈＩｇＧ１融合タンパク質を用いて、４週間間隔で腹腔内（ＩＰ）注射した。この免疫感作プロトコールを用いた初回注射および２回の追加免疫後、１０μｇのタンパク質＋ＴｉｔｅｒＭａｘ金アジュバントＩＰを、次にさらに２回の追加免疫のＳＣをマウスに注射した後、脾臓を摘出した。感作マウスからの脾臓細胞を骨髄腫相手Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５３と融合することにより、ハイブリドーマを作製した。
【０１３１】
ＨＥ４Ｉｇ融合タンパク質のウエスタン分析：１０％Ｔｒｉｓ／ＢｉｓＮＯＶＥＸゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により、タンパク質試料を分解し、半乾燥ブロッティングによりＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に移した。ＰＢＳ／０．２５％ＮＰ−４０またはＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）中の５％脱脂乾燥乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）中で、４℃で一晩インキュベートすることにより、膜を遮断して、非特異的抗体結合を防止した。膜を、ＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１／１０，０００）とともに、またはＴＢＳ−Ｔ中のＨＲＰ−ストレプトアビジン（１：５０００）（Ｃａｌｔａｇ）とともに、室温または４℃で１時間、静かに撹拌しながらインキュベートした。ＴＢＳＴで２回すすぎ、４回洗浄後、ＥＣＬ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）試薬中で６０秒間、膜をインキュベートし、帯域の可視化のためにオートラジオグラフィーフィルムに曝露した（図２）。培養上清から、または精製試料のプロテインＡ溶離液から融合タンパク質試料を採取し、５０μｌのプロテインＡアガロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いてプロテインＡを沈降させた。免疫沈降物を洗浄し、緩衝剤を投入したＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元試料中に再懸濁して、沸騰させ、次に１０％Ｔｒｉｓ／ＢｉｓＮＯＶＥＸゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分解し、半乾燥ブロッティングによりＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に移した。ＰＢＳ／０．２５％ＮＰ−４０またはＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）中の５％脱脂乾燥乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）中で、４℃で１時間から一晩インキュベートすることにより、膜を遮断して、非特異的抗体結合を防止した。膜を、ＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１／１０，０００）とともにインキュベートし、ＴＢＳ−Ｔ中で洗浄して、ＥＣＬ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）試薬中で６０秒間、曝露した。次にＥＣＬ−ブロットを、帯域の可視化のためにオートラジオグラフィーフィルムに曝露した。図２のレーン１は、ＣＴＬＡ４−ｈＩｇＧ１トランスフェクト化ＣＯＳ７細胞の上清からの免疫沈降試料を含有し、レーン３およびレーン４はＨＥ４−ｈＩｇＧ１融合タンパク質培養上清を含有し、レーン５は偽トランスフェクト化ＣＯＳ上清を含有した。ＨＥ４−ｈＩｇＧ１融合タンパク質は、還元ゲルまたはウエスタンブロット上で約４８ｋＤａの見かけのＭｒで走行し、予測アミノ酸配列に基づいて予測された３９ｋＤａより大きかったが、これは、分子がグリコシル化されたことを示唆する。
【０１３２】
ＨＥ４−ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質の構築および発現：ＨＥ４−ｈＩｇＧ１融合遺伝子と同様の構築物を作製したが、しかしヒトＩｇＧ Ｆｃ断片の代わりにネズミＩｇＧ２ａドメインを用いた。マウスの免疫感作がヒトＩｇ尾部融合ドメインの免疫原性により影響を受けないよう、代替尾を用いた。ｍＩｇＧ２ａ尾部の既存のｃＤＮＡクローンは、上記のＨＥ４ａクローンに関して枠外にあり、したがってｍＩｇＧ２ａカセットをこのようなプラスミドから再増幅して、枠内融合ドメインを作製した。用いたフォワードセンスプライマーは、
ｍＩｇＧ２ａＢＡＭＩＦ：
５’−ｇｔｔｇｔｃｇｇａｔｃｃｇａｇｃｃｃａｇａｇｇｇｃｃｃａｃａａｔｃａａｇ３’（配列番号１９）
であり、一方、リバースアンチセンスプライマーを以下のように命名した：
ｍＩｇＧ２ａ３’Ｘｂａ＋Ｓ：
５’−ｇｔｔｇｔｔｔｃｔａｇａｔｔａｔｃａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇｔｃｃｇｇｇａｇａａｇｃｔｃ−３’（配列番号２０）
用いた鋳型は、ネズミＩｇＧ２ａ Ｆｃドメインに融合されるが、コドンスペーシングに関する枠害の融合接合部に制限部位を有さないネズミＣＴＬＡ４を含有した。ＨＥ４との融合遺伝子が完全ＨＥ４−ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質の発現を生じるよう、新規のオリゴヌクレオチドは、フレームシフトを作製し、ＢａｍＨＩ部位でのリーディングフレームを変更する。ヒト融合遺伝子に関してに記載したのと同様に、ＰＣＲ産物を増幅し、サブクローニングして、プロセシングした。ＨＥ４−ヒトＩｇＧ１融合タンパク質に関して上記したのと同様に、分子をｐＤ１８哺乳動物発現ベクター中でサブクローニングし、安定ＣＨＯクローンを生成し、癒合タンパク質を発現させた。
【０１３３】
（実施例３：ＨＥ４ａに特異的なモノクローナル抗体）
抗ＨＥ４ａＭａｂの生成：最初の実験で、上記と同様に調製したＨＥ４ａ−ｈＩｇＧ融合タンパク質を用いて、アジュバントを用いた場合と用いない場合とで、数匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫感作した。これらのマウスにおいて高抗体力価が観察されたが、ｈＩｇＧ尾を有する対照融合タンパク質（ＣＴＬＡ４−ｈＩｇ融合）に対して同様に高い力価が観察されたため、抗体はＨＥ４ａに特異的でなかった。したがって、ＨＥ４ａ−ｍＩｇＧ融合タンパク質を免疫感作のために用いた。図３は、メーカーの使用説明書に従ってＨＥ４ａ−ｍＩｇＧ＋アジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ（商品名）、ＣｙｔＲｘ Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）で各々２回免疫感作された（尾部に皮下投与された）２匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（１６０５および１７３４）におけるＨＥ４ａに対して高力価（ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒｅｄ）抗体をもたらした２つの免疫感作からの結果を示す。高いＨＥ４ａ特異的抗体力価を示すマウスからの脾臓細胞を用いて標準方法により、ＨＥ４ａ特異的ハイブリドーマを調製した。図４は、マウス１６０５（その血清データを図３に示す）からの脾臓細胞を用いて作製されたハイブリドーマの、ＥＬＩＳＡによる初回試験を示す。３つのウエルは、ＨＥ４ａ−ｈＩｇに対して高反応性を示した。その後、限定希釈によるクローニング後に、３つのハイブリドーマ２Ｈ５、３Ｄ８および４Ｈ４をこれらのウエルから単離した。ハイブリドーマ２Ｈ５および３Ｄ８は、競合アッセイにより異なるエピトープを確認することが判明した。
【０１３４】
腫瘍診断のためのＥＬＩＳＡの構築および適用：上記で言及した２つのＭＡｂ２Ｈ５および３Ｄ８を用いて、血清およびその他の流体中のメソテリン／ＭＰＦおよび関連抗原を測定するＥＬＩＳＡ（Ｓｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，１１５３１，１９９９）の作製に用いたのと同様のアプローチを用いて、二重決定因子（「サンドイッチ」）ＥＬＩＳＡを構築した。図５は、ＤＭＥＭ培地中で希釈されたＨＥ４ａ−ｈＩｇＧを用いて調製された標準曲線の一例を示す。図に示したように、１ｎｇのレベルのＨＥ４ａ−ｈＩｇＧで、シグナルを検出した。図５は、卵巣癌腫株（４００７）からの非希釈培地が検出可能シグナルを示した、ということも示す。図６は、卵巣癌を診断された患者（ＯＶ５０で示す）からの腹水が、試験した最高希釈（１：１２８０）で依然として検出可能であったＨＥ４ａ抗原を含有した、ということを示す。
【０１３５】
用いた２つの抗体の最適量を確定することにより、初回ＨＥ４ａＥＬＩＳＡを改良した。これらの抗体の１つである２Ｈ５をビオチニル化し、他方の抗体３Ｄ８を、試験プレートの底に結合させることにより固定した。アッセイのための２つのモノクローナル抗体のそれぞれの用量は、２．５および１００μｇ／ｍｌであった。異なるＭａｂおよび直前に記載した使用中のＭａｂの用量を除いて、アッセイ方法は、メソテリン／ＭＰＦおよび関連分子に関してに記載したものと同一であった（Ｓｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，１１５３１）。
【０１３６】
卵巣癌を有する患者からのならびに種々の対照からの血清の予備試験は、ＨＥ４ａタンパク質が、卵巣癌を有する患者、例えば早期疾患を有する患者の有意の分画で増大されるが、バックグラウンドが非常に低い対照血清中では増大されないことを示した。上記のサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイおよび約４００名の患者からのコード化血清試料（Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡにより提供された）を用いた試験では、卵巣癌と診断された患者からの全試料が、ＨＥ４ａＥＬＩＳＡにより陽性であると正しくスコアされ、これはさらに擬陽性と予測されることはなかった。したがって、理論に結び付けて考えたくはないが、血清およびその他の体液中のＨＥ４ａタンパク質に関するアッセイは、それにより卵巣癌に関する既存の診断アッセイ（例えばＣＡ１２５）に対する臨床的に有益な補足物を提供し得ることが意図される。さらに、ＥＬＩＳＡは卵巣癌の診断を補助するその能力に関して今まで調べられてきたが、ＨＥ４ａコード抗原を過剰発現する任意の腫瘍にも同様に適用可能であるはずである。同一のＥＬＩＳＡまたはその変法は、将来的な試験がこのようなものを同定する場合には、ＨＥ４関連分子の試験にも適用可能であるはずである。
【０１３７】
細胞表面でのＨＥ４タンパク質の発現：卵巣癌細胞株を負の対照としてのＢ細胞株とともに用いて、フローサイトメトリーを用いて実施した試験は、ＨＥ４ａコード抗原がいくつかの卵巣癌の間で、細胞表面で発現される、ということを示した。用いた細胞株および用いたフローサイトメトリー技法は、以前に記載されている（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１，２４２０）。例えば、ＯＶＣＡＲ３細胞の９３％が陽性であり、同様に卵巣癌株４０１０からの細胞の７１％および卵巣癌株ＨＥ５０ＯＶからの細胞の３８％が陽性であったが、一方、試験した別の１０例の卵巣癌株からは２０％未満の細胞が陽性であった。このことは、非限定理論によると、細胞表面のＨＥ４ａ抗原は、ＨＥ４ａ特異的抗体媒介性および／またはＨＥ４ａ特異的Ｔ細胞媒介性療法といったような免疫療法戦略のための標的を提供する、ということを示唆する。
【０１３８】
（実施例４：ＨＥ４ａエピトープを標的化する予防的および治療的ワクチン）
上記の組成物および方法を用いて、ある種の腫瘍（特に悪性卵巣腫瘍）中でのＨＥ４ａコード核酸配列の増幅および／またはＨＥ４ａ過剰発現の検出を実施し、ＨＥ４ａ発現レベルを正常組織中のレベルと比較する。腫瘍中のＨＥ４ａ特異的モノクローナル抗体規定エピトープの出現増大は、癌療法における適用可能性を有する予防的または防止的ワクチンに対する標的として用いられるＨＥ４ａエピトープの同定を提供する。このようなワクチンはまた、受精能（特定の実施形態では、四−ジスルフィドコアファミリーの成員、例えばＳｌｐ−１によるプロテアーゼ阻害に関する周知のアッセイを用いたＨＥ４ａプロテアーゼ阻害またはプロテアーゼ強化活性の実証により反映され得る）を有用に変更し得る（例えば適切な対照と比較して、統計学的に有意の方法で増大または低減する）。ワクチン製造のための多様なアプローチが確認されており、多数の概論に記載されている（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．"Ｖａｃｃｉｎｅｓ"，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ｐ．４６３，１９９９による）。これらの例としては、タンパク質、融合タンパク質およびペプチド、ＤＮＡプラスミド、組換えウイルス、抗イディオタイプ抗体、ペプチドエピトープでｉｎ ｖｉｔｒｏでパルス処理された樹状細胞、ならびに抗イディオタイプ抗体の使用が挙げられるが、これらに限定されない。ワクチンは、単独で、またはアジュバントおよび／またはリンホカイン、例えばＧＭＣＳＦと組合せて、用いられ得る。非限定的な理論によれば、Ｔ細胞は細胞表面のＭＨＣ分子の状況で存在するエピトープを認識するが、循環抗原または免疫複合体と反応しないため、上記のような循環可溶性ＨＥ４ａタンパク質の検出は、Ｔ細胞媒介性免疫を誘導するワクチンの使用を妨害するとは予測されない。
【０１３９】
上記から、説明のために本発明の特定の実施形態を本明細書中に記載してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の変更が成され得る、と理解される。したがって本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０１４０】
本明細書中では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」とは、「包含する、または〜からなる」ことを意味し、そして「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは「〜を包含する、または〜からなる」ことを意味する。
【０１４１】
特定の形態で、または開示された機能、あるいは開示された結果を得るための方法または過程を実施するための手段に関して表された上記の説明または添付の特許請求の範囲あるいは添付の図面に示された特質は、適宜、別個に、またはこのような特質の任意の組合せで、その多様な形態で本発明を実現するために利用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の工程：
抗体と抗原決定基との結合を検出するために十分な条件下でかつそのために十分な時間にわたり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と被験体からの生物学的試料とを接触させて、該試料中において可溶性形態で天然に存在し、かつ、該少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有する分子の、該生物学的試料中での存在を確定する工程、および
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む方法。
【請求項２】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の：
抗体と抗原決定基との結合を検出するために十分な条件下でかつそのために十分な時間にわたり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と被験体からの細胞を含む生物学的試料を接触させて、該少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有する細胞表面分子の前記生物学的試料中での存在を確定する工程、および
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む方法。
【請求項３】
前記生物学的試料は、血液、血清、漿液、血漿、リンパ、尿、脳脊髄液、唾液、粘膜分泌物、膣分泌物、腹水、胸水、囲心腔液、腹膜液、腹腔液、培地、ならし培地および灌注液からなる群から選択される、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的試料は血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的試料は血漿である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的試料は腹水および胸水からなる群から選択される、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的試料は膣分泌物である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＨＥ４ａ抗原が配列番号１１に記述される配列を有するポリペプチドあるいはその断片または誘導体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドがスプライス改変体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＥ４ａ抗原は配列番号５に記述される配列を有するポリペプチドあるいはその断片または誘導体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドはスプライス改変体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドはＨＥ４ａ抗原改変体あるいはその断片または誘導体である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体はポリクローナル抗体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体は親和性精製抗体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体はモノクローナル抗体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体は組換え抗体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体はキメラ抗体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体はヒト化抗体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体は単鎖抗体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体と抗原決定基の結合の検出は放射性核種の検出を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体と抗原決定基の結合の検出は蛍光体（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）の検出を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
抗体と抗原決定基の結合の検出がアビジン分子とビオチン分子の間の結合事象の検出を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体と抗原決定基の結合の検出はストレプトアビジン分子とビオチン分子の間の結合事象の検出を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体と抗原決定基の結合の検出は酵素反応の生成物の分光光度検出を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの抗体は検出可能に標識される、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの抗体は検出可能に標識されず、抗体と抗原決定基の結合の検出が間接的である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記悪性症状は、腺癌、中皮腫、卵巣癌、膵臓癌および非小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の工程：
抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、少なくとも１つの抗体と被験体からの生物学的試料を接触させて（ｉ）該試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、ならびに（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の該生物学的試料中での存在を確定する工程であって、該試料は被験体からの細胞を含み、該分子は該少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有し、該抗体の抗原結合部位は、２Ｈ５、３Ｄ８および４Ｈ４からなる群から選択されるモノクローナル抗体の免疫特異的結合を競合的に抑制する、工程、および
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項２９】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の工程：
抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、少なくとも１つの抗体と被験体からの生物学的試料を接触させて（ｉ）該試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、ならびに（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の該生物学的試料中での存在を確定する工程であって、該試料は被験体からの細胞を含み、該分子は該抗体と反応性がある抗原決定基を有し、該抗体の抗原結合部位は、モノクローナル抗体３Ｄ８の免疫特異的結合を競合的に抑制する、工程、および
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項３０】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の：
抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、少なくとも１つのＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体と被験体からの生物学的試料を接触させて（ｉ）該試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、ならびに（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の該生物学的試料中での存在を確定する工程であって、該試料は被験体からの細胞を含み、該分子は該抗体と反応性がある抗原決定基を有し、ここで、該少なくとも１つの抗原は、ＨＥ４ａ抗原に免疫特異的に結合する、工程
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項３１】
前記ＨＥ４ａ抗原は、３Ｄ８、２Ｈ５および４Ｈ４からなる群から選択されるモノクローナル抗体とも免疫特異的に反応性がある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の：
抗体と前記抗原決定基との結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、少なくとも１つのＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と被験体からの生物学的試料を接触させて（ｉ）該試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、ならびに（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の該生物学的試料中での存在を確定する、接触させる工程であって、該試料は被験体からの細胞を含み、該分子は該少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有し、その抗原結合部位は、２Ｈ５、および４Ｈ４からなる群から選択されるモノクローナル抗体の免疫特異的結合を競合的に抑制し、ここで、該少なくとも１つの抗原は、ＨＥ４ａ抗原に免疫特異的に結合する、工程、ならびに
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項３３】
前記ＨＥ４抗原はモノクローナル抗体３Ｄ８と免疫特異的に反応性がある、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の：
少なくとも１つの固定された第一の抗体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合させて、免疫複合体を形成するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、該ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な該少なくとも１つの固定された第一抗体と被験体からの生物学的試料とを接触させて、該試料中の可溶性形態で天然に存在する分子の該生物学的試料中での存在を確定する工程であって、該少なくとも１つの第一の抗体の抗原結合部位がモノクローナル抗体３Ｄ８の免疫特異的結合を競合的に抑制する、工程、
該少なくとも１つの固定された第一の抗体と特異的に結合しない試料の構成成分を除去する工程、および
該少なくとも１つの第二の抗体と該ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドとの特異的結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、該免疫複合体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチド少なくとも１つの第二の抗体と接触させる工程であって、該少なくとも１つの第二の抗体の抗原結合部位がモノクローナル抗体２Ｈ５の免疫特異的結合を競合的に抑制しない、工程、および、悪性症状の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項３５】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の：
少なくとも１つの固定された第一の抗体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合させて、それにより免疫複合体を形成するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの固定された第一の抗体と被験体からの生物学的試料を接触させて、該試料中の可溶性形態で天然に存在する分子の該生物学的試料中での存在を確定する工程であって、該少なくとも１つの第一の抗体の抗原結合部位がモノクローナル抗体３Ｄ８の免疫特異的結合を競合的に抑制する、工程、
前記少なくとも１つの固定された第一の抗体と特異的に結合しない試料の構成成分を除去する工程；ならびに
該少なくとも１つの第二の抗体と該ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドの特異的結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、該免疫複合体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに少なくとも１つの第二の抗体と接触させる工程であって、該少なくとも１つの第二の抗体の抗原結合部位がモノクローナル抗体２Ｈ５の免疫特異的結合を競合的に抑制しない、工程、および、
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項３６】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の：
少なくとも１つの固定された第一の抗体をメソテリン関連抗原ポリペプチドと特異的に結合させることにより免疫複合体を形成するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの固定された第一の抗体と被験体からの生物学的試料を接触させて、該試料中の可溶性形態で天然に存在する分子の該生物学的試料中での存在を確定する工程であって、該少なくとも１つの第一の抗体の抗原結合部位がモノクローナル抗体３Ｄ８の免疫特異的結合を競合的に抑制する、工程、
該少なくとも１つの固定された第一の抗体と特異的に結合しない試料の構成成分を除去する工程；ならびに
該少なくとも１つの第二の抗体と該ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドの特異的結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、該免疫複合体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの第二の抗体と接触させる工程であって、該少なくとも１つの第二の抗体の抗原結合部位はモノクローナル抗体４Ｈ４の免疫特異的結合を競合的に抑制しない、工程、および
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項３７】
中皮種関連抗原、癌胎児性抗原、ＣＡ１２５、シアリルＴＮ、扁平上皮細胞癌抗原、組織ポリペプチド抗原および胎盤アルカリ性ホスファターゼからなる群から選択される悪性症状の少なくとも１つの可溶性マーカーの前記試料中の存在を確定する工程をさらに含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の：
抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、（ｉ）悪性症状を有する疑いのある一次被験体からの一次生物学的試料、ならびに（ｉｉ）悪性症状を有さないことが周知である第二の被験体からの第二の生物学的試料の各々を、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と接触させて、（ｉ）該試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、および（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の該第一および第二の生物学的試料の各々における存在を確定する工程であって、該第一および第二の生物学的試料は各々、該第一および第二の被験体からの細胞をそれぞれ含み、該分子は、該少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有する、工程、
第一の生物学的試料中の該抗体と該抗原決定基の検出可能な結合を、第二の生物学的試料中の該抗体と該抗原決定基の検出可能な結合のレベルと比較する工程、および
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項３９】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の工程：
ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体の存在を被験体からの生物学的試料中で検出する工程
を含む、方法。
【請求項４０】
前記ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル免疫グロブリン可変部を含むＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体であって、
前記ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、抗体。
【請求項４２】
融合タンパク質である、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４３】
単鎖抗体である、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４４】
ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドがグリコシル化される、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４５】
（ｉ）配列番号１１に記述されるＨＥ４ａ抗原ポリペプチド配列と特異的に結合するが、配列番号９に記述されるポリペプチド配列とは特異的に結合しない抗体、（ｉｉ）配列番号９に記述されるポリペプチド配列と特異的に結合し、そして配列番号１１に記述されるＨＥ４ａポリペプチド配列と特異的に結合する抗体からなる群から選択される、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４６】
モノクローナル抗体２Ｈ５、３Ｄ８および４Ｈ４からなる群から選択される、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４７】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の：
該試料中の可溶性形態である天然の抗体の該ＨＥ４ａポリペプチドとの結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、被験体からの生物学的試料を検出可能に標識されたＨＥ４ａポリペプチドと接触させる工程、および
悪性症状の存在を検出する工程
を含む方法。
【請求項４８】
（ａ）ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドおよび少なくとも１つの融合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸分子であって、該ポリペプチドが配列番号５に記述されるアミノ酸配列、配列番号７に記述されるアミノ酸配列、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列および配列番号１３に記述されるアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、融合タンパク質をコードする核酸分子、ならびに
（ｂ）中等度のストリンジェント条件下で該（ａ）の核酸分子とハイブリダイズすることが可能な、そしてＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群から選択される単離核酸分子であって、配列番号９に記述されるヌクレオチド配列からなる核酸分子ではない、単離核酸分子。
【請求項４９】
請求項４８に記載の核酸分子と相補的な少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
融合ドメインに融合されるＨＥ４ａポリペプチド配列を含む、融合タンパク質。
【請求項５１】
前記融合ドメインは免疫グロブリンあるいはその改変体または断片である、請求項５０に記載の融合タンパク質。
【請求項５２】
前記ＨＥ４ａポリペプチドに融合されるポリペプチド配列はプロテアーゼにより切断可能である、請求項５０に記載の融合タンパク質。
【請求項５３】
前記ポリペプチド配列はリガンドに対する親和性を有する親和性タグポリペプチドである、請求項５０に記載の融合タンパク質。
【請求項５４】
請求項４８に記載の核酸に作動可能に連結される少なくとも１つのプロモーターを含む、組換え発現構築物。
【請求項５５】
前記プロモーターは調節されるプロモーターである、請求項５４に記載の発現構築物。
【請求項５６】
前記ＨＥ４ａポリペプチドは第二の核酸配列のポリペプチド産物との融合タンパク質として発現される、請求項５４に記載の発現構築物。
【請求項５７】
前記第二の核酸配列のポリペプチド産物は免疫グロブリン定常部である、請求項５６に記載の発現構築物。
【請求項５８】
組換えウイルス発現構築物である、請求項５４に記載の組換え発現構築物。
【請求項５９】
請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の組換え発現構築物を含む、宿主細胞。
【請求項６０】
原核生物細胞である、請求項５９に記載の宿主細胞。
【請求項６１】
真核生物細胞である、請求項５９に記載の宿主細胞。
【請求項６２】
組換えＨＥ４ａポリペプチドを産生する方法であって、以下の：
請求項４８に記載の核酸配列に作動可能に連結される少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現構築物を含む宿主細胞を培養する工程
を含む方法。
【請求項６３】
前記プロモーターは調節されるプロモーターである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
組換えＨＥ４ａポリペプチドを産生する方法であって、
請求項５８に記載の組換えウイルス発現構築物に感染された宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
【請求項６５】
試料中のＨＥ４ａ発現を検出する方法であって、以下の：
（ａ）請求項４９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａポリペプチドあるいはその断片または改変体をコードする核酸配列を含む試料と接触させる工程、および
（ｂ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするＨＥ４ａポリペプチドコード核酸の量を試料中で検出し、それから前記試料中のＨＥ４ａ発現を検出する工程を含む、方法。
【請求項６６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするＨＥ４ａポリペプチドコード核酸の量は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて確定される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするＨＥ４ａポリペプチドコード核酸の量は、ハイブリダイゼーションアッセイを用いて確定される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記試料はＲＮＡまたはｃＤＮＡ調製物を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
悪性症状の治療方法であって、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体であって、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル免疫グロブリン可変部を含む抗体を含む組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項７０】
悪性症状を治療する方法であって、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａポリペプチドを含む組成物またはその断片を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項７１】
前記組成物は、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａポリペプチドまたはその断片と特異的に結合することが可能な抗体の患者における産生を誘導する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記組成物は、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａポリペプチドまたはその断片を特異的に認識可能なＴリンパ球を患者において誘導する、請求項７０に記載の方法。
【請求項１】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の工程：
抗体と抗原決定基との結合を検出するために十分な条件下でかつそのために十分な時間にわたり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と被験体からの生物学的試料とを接触させて、該試料中において可溶性形態で天然に存在し、かつ、該少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有する分子の、該生物学的試料中での存在を確定する工程、および
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む方法。
【請求項２】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の：
抗体と抗原決定基との結合を検出するために十分な条件下でかつそのために十分な時間にわたり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と被験体からの細胞を含む生物学的試料を接触させて、該少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有する細胞表面分子の前記生物学的試料中での存在を確定する工程、および
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む方法。
【請求項３】
前記生物学的試料は、血液、血清、漿液、血漿、リンパ、尿、脳脊髄液、唾液、粘膜分泌物、膣分泌物、腹水、胸水、囲心腔液、腹膜液、腹腔液、培地、ならし培地および灌注液からなる群から選択される、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的試料は血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的試料は血漿である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的試料は腹水および胸水からなる群から選択される、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的試料は膣分泌物である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＨＥ４ａ抗原が配列番号１１に記述される配列を有するポリペプチドあるいはその断片または誘導体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドがスプライス改変体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＥ４ａ抗原は配列番号５に記述される配列を有するポリペプチドあるいはその断片または誘導体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドはスプライス改変体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドはＨＥ４ａ抗原改変体あるいはその断片または誘導体である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体はポリクローナル抗体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体は親和性精製抗体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体はモノクローナル抗体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体は組換え抗体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体はキメラ抗体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体はヒト化抗体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体は単鎖抗体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体と抗原決定基の結合の検出は放射性核種の検出を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体と抗原決定基の結合の検出は蛍光体（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）の検出を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
抗体と抗原決定基の結合の検出がアビジン分子とビオチン分子の間の結合事象の検出を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体と抗原決定基の結合の検出はストレプトアビジン分子とビオチン分子の間の結合事象の検出を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体と抗原決定基の結合の検出は酵素反応の生成物の分光光度検出を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの抗体は検出可能に標識される、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの抗体は検出可能に標識されず、抗体と抗原決定基の結合の検出が間接的である、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記悪性症状は、腺癌、中皮腫、卵巣癌、膵臓癌および非小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の工程：
抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、少なくとも１つの抗体と被験体からの生物学的試料を接触させて（ｉ）該試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、ならびに（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の該生物学的試料中での存在を確定する工程であって、該試料は被験体からの細胞を含み、該分子は該少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有し、該抗体の抗原結合部位は、２Ｈ５、３Ｄ８および４Ｈ４からなる群から選択されるモノクローナル抗体の免疫特異的結合を競合的に抑制する、工程、および
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項２９】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の工程：
抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、少なくとも１つの抗体と被験体からの生物学的試料を接触させて（ｉ）該試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、ならびに（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の該生物学的試料中での存在を確定する工程であって、該試料は被験体からの細胞を含み、該分子は該抗体と反応性がある抗原決定基を有し、該抗体の抗原結合部位は、モノクローナル抗体３Ｄ８の免疫特異的結合を競合的に抑制する、工程、および
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項３０】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の：
抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、少なくとも１つのＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体と被験体からの生物学的試料を接触させて（ｉ）該試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、ならびに（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の該生物学的試料中での存在を確定する工程であって、該試料は被験体からの細胞を含み、該分子は該抗体と反応性がある抗原決定基を有し、ここで、該少なくとも１つの抗原は、ＨＥ４ａ抗原に免疫特異的に結合する、工程
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項３１】
前記ＨＥ４ａ抗原は、３Ｄ８、２Ｈ５および４Ｈ４からなる群から選択されるモノクローナル抗体とも免疫特異的に反応性がある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の：
抗体と前記抗原決定基との結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、少なくとも１つのＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と被験体からの生物学的試料を接触させて（ｉ）該試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、ならびに（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の該生物学的試料中での存在を確定する、接触させる工程であって、該試料は被験体からの細胞を含み、該分子は該少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有し、その抗原結合部位は、２Ｈ５、および４Ｈ４からなる群から選択されるモノクローナル抗体の免疫特異的結合を競合的に抑制し、ここで、該少なくとも１つの抗原は、ＨＥ４ａ抗原に免疫特異的に結合する、工程、ならびに
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項３３】
前記ＨＥ４抗原はモノクローナル抗体３Ｄ８と免疫特異的に反応性がある、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の：
少なくとも１つの固定された第一の抗体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合させて、免疫複合体を形成するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、該ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な該少なくとも１つの固定された第一抗体と被験体からの生物学的試料とを接触させて、該試料中の可溶性形態で天然に存在する分子の該生物学的試料中での存在を確定する工程であって、該少なくとも１つの第一の抗体の抗原結合部位がモノクローナル抗体３Ｄ８の免疫特異的結合を競合的に抑制する、工程、
該少なくとも１つの固定された第一の抗体と特異的に結合しない試料の構成成分を除去する工程、および
該少なくとも１つの第二の抗体と該ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドとの特異的結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、該免疫複合体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチド少なくとも１つの第二の抗体と接触させる工程であって、該少なくとも１つの第二の抗体の抗原結合部位がモノクローナル抗体２Ｈ５の免疫特異的結合を競合的に抑制しない、工程、および、悪性症状の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項３５】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の：
少なくとも１つの固定された第一の抗体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合させて、それにより免疫複合体を形成するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの固定された第一の抗体と被験体からの生物学的試料を接触させて、該試料中の可溶性形態で天然に存在する分子の該生物学的試料中での存在を確定する工程であって、該少なくとも１つの第一の抗体の抗原結合部位がモノクローナル抗体３Ｄ８の免疫特異的結合を競合的に抑制する、工程、
前記少なくとも１つの固定された第一の抗体と特異的に結合しない試料の構成成分を除去する工程；ならびに
該少なくとも１つの第二の抗体と該ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドの特異的結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、該免疫複合体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに少なくとも１つの第二の抗体と接触させる工程であって、該少なくとも１つの第二の抗体の抗原結合部位がモノクローナル抗体２Ｈ５の免疫特異的結合を競合的に抑制しない、工程、および、
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項３６】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の：
少なくとも１つの固定された第一の抗体をメソテリン関連抗原ポリペプチドと特異的に結合させることにより免疫複合体を形成するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの固定された第一の抗体と被験体からの生物学的試料を接触させて、該試料中の可溶性形態で天然に存在する分子の該生物学的試料中での存在を確定する工程であって、該少なくとも１つの第一の抗体の抗原結合部位がモノクローナル抗体３Ｄ８の免疫特異的結合を競合的に抑制する、工程、
該少なくとも１つの固定された第一の抗体と特異的に結合しない試料の構成成分を除去する工程；ならびに
該少なくとも１つの第二の抗体と該ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドの特異的結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、該免疫複合体をＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの第二の抗体と接触させる工程であって、該少なくとも１つの第二の抗体の抗原結合部位はモノクローナル抗体４Ｈ４の免疫特異的結合を競合的に抑制しない、工程、および
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項３７】
中皮種関連抗原、癌胎児性抗原、ＣＡ１２５、シアリルＴＮ、扁平上皮細胞癌抗原、組織ポリペプチド抗原および胎盤アルカリ性ホスファターゼからなる群から選択される悪性症状の少なくとも１つの可溶性マーカーの前記試料中の存在を確定する工程をさらに含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の：
抗体と抗原決定基との結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、（ｉ）悪性症状を有する疑いのある一次被験体からの一次生物学的試料、ならびに（ｉｉ）悪性症状を有さないことが周知である第二の被験体からの第二の生物学的試料の各々を、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも１つの抗体と接触させて、（ｉ）該試料中の可溶性形態で天然に存在する分子、および（ｉｉ）細胞表面分子からなる群から選択される分子の該第一および第二の生物学的試料の各々における存在を確定する工程であって、該第一および第二の生物学的試料は各々、該第一および第二の被験体からの細胞をそれぞれ含み、該分子は、該少なくとも１つの抗体と反応性がある抗原決定基を有する、工程、
第一の生物学的試料中の該抗体と該抗原決定基の検出可能な結合を、第二の生物学的試料中の該抗体と該抗原決定基の検出可能な結合のレベルと比較する工程、および
それから悪性症状の存在を検出する工程
を含む、方法。
【請求項３９】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の工程：
ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体の存在を被験体からの生物学的試料中で検出する工程
を含む、方法。
【請求項４０】
前記ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル免疫グロブリン可変部を含むＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体であって、
前記ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号１１および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、抗体。
【請求項４２】
融合タンパク質である、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４３】
単鎖抗体である、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４４】
ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドがグリコシル化される、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４５】
（ｉ）配列番号１１に記述されるＨＥ４ａ抗原ポリペプチド配列と特異的に結合するが、配列番号９に記述されるポリペプチド配列とは特異的に結合しない抗体、（ｉｉ）配列番号９に記述されるポリペプチド配列と特異的に結合し、そして配列番号１１に記述されるＨＥ４ａポリペプチド配列と特異的に結合する抗体からなる群から選択される、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４６】
モノクローナル抗体２Ｈ５、３Ｄ８および４Ｈ４からなる群から選択される、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４７】
被験体における悪性症状の存在に関してスクリーニングする方法であって、以下の：
該試料中の可溶性形態である天然の抗体の該ＨＥ４ａポリペプチドとの結合を検出するための条件下でかつそのために十分な時間にわたり、被験体からの生物学的試料を検出可能に標識されたＨＥ４ａポリペプチドと接触させる工程、および
悪性症状の存在を検出する工程
を含む方法。
【請求項４８】
（ａ）ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドおよび少なくとも１つの融合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸分子であって、該ポリペプチドが配列番号５に記述されるアミノ酸配列、配列番号７に記述されるアミノ酸配列、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列および配列番号１３に記述されるアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、融合タンパク質をコードする核酸分子、ならびに
（ｂ）中等度のストリンジェント条件下で該（ａ）の核酸分子とハイブリダイズすることが可能な、そしてＨＥ４ａポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群から選択される単離核酸分子であって、配列番号９に記述されるヌクレオチド配列からなる核酸分子ではない、単離核酸分子。
【請求項４９】
請求項４８に記載の核酸分子と相補的な少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
融合ドメインに融合されるＨＥ４ａポリペプチド配列を含む、融合タンパク質。
【請求項５１】
前記融合ドメインは免疫グロブリンあるいはその改変体または断片である、請求項５０に記載の融合タンパク質。
【請求項５２】
前記ＨＥ４ａポリペプチドに融合されるポリペプチド配列はプロテアーゼにより切断可能である、請求項５０に記載の融合タンパク質。
【請求項５３】
前記ポリペプチド配列はリガンドに対する親和性を有する親和性タグポリペプチドである、請求項５０に記載の融合タンパク質。
【請求項５４】
請求項４８に記載の核酸に作動可能に連結される少なくとも１つのプロモーターを含む、組換え発現構築物。
【請求項５５】
前記プロモーターは調節されるプロモーターである、請求項５４に記載の発現構築物。
【請求項５６】
前記ＨＥ４ａポリペプチドは第二の核酸配列のポリペプチド産物との融合タンパク質として発現される、請求項５４に記載の発現構築物。
【請求項５７】
前記第二の核酸配列のポリペプチド産物は免疫グロブリン定常部である、請求項５６に記載の発現構築物。
【請求項５８】
組換えウイルス発現構築物である、請求項５４に記載の組換え発現構築物。
【請求項５９】
請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の組換え発現構築物を含む、宿主細胞。
【請求項６０】
原核生物細胞である、請求項５９に記載の宿主細胞。
【請求項６１】
真核生物細胞である、請求項５９に記載の宿主細胞。
【請求項６２】
組換えＨＥ４ａポリペプチドを産生する方法であって、以下の：
請求項４８に記載の核酸配列に作動可能に連結される少なくとも１つのプロモーターを含む組換え発現構築物を含む宿主細胞を培養する工程
を含む方法。
【請求項６３】
前記プロモーターは調節されるプロモーターである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
組換えＨＥ４ａポリペプチドを産生する方法であって、
請求項５８に記載の組換えウイルス発現構築物に感染された宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
【請求項６５】
試料中のＨＥ４ａ発現を検出する方法であって、以下の：
（ａ）請求項４９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａポリペプチドあるいはその断片または改変体をコードする核酸配列を含む試料と接触させる工程、および
（ｂ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするＨＥ４ａポリペプチドコード核酸の量を試料中で検出し、それから前記試料中のＨＥ４ａ発現を検出する工程を含む、方法。
【請求項６６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするＨＥ４ａポリペプチドコード核酸の量は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて確定される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするＨＥ４ａポリペプチドコード核酸の量は、ハイブリダイゼーションアッセイを用いて確定される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記試料はＲＮＡまたはｃＤＮＡ調製物を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
悪性症状の治療方法であって、ＨＥ４ａ抗原ポリペプチドに特異的な抗体であって、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａ抗原ポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル免疫グロブリン可変部を含む抗体を含む組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項７０】
悪性症状を治療する方法であって、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａポリペプチドを含む組成物またはその断片を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項７１】
前記組成物は、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａポリペプチドまたはその断片と特異的に結合することが可能な抗体の患者における産生を誘導する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記組成物は、配列番号１１に記述されるアミノ酸配列を有するＨＥ４ａポリペプチドまたはその断片を特異的に認識可能なＴリンパ球を患者において誘導する、請求項７０に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−１６１３１７（Ｐ２０１２−１６１３１７Ａ）
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５６９７９（Ｐ２０１２−５６９７９）
【出願日】平成２４年３月１４日（２０１２．３．１４）
【分割の表示】特願２００９−１０４７１７（Ｐ２００９−１０４７１７）の分割
【原出願日】平成１４年８月２９日（２００２．８．２９）
【出願人】（５０１１９９０３６）パシフィック ノースウエスト リサーチ インスティテュート (4)
【出願人】（５０２４５７８０３）ユニヴァーシティ オブ ワシントン (93)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年３月１４日（２０１２．３．１４）
【分割の表示】特願２００９−１０４７１７（Ｐ２００９−１０４７１７）の分割
【原出願日】平成１４年８月２９日（２００２．８．２９）
【出願人】（５０１１９９０３６）パシフィック ノースウエスト リサーチ インスティテュート (4)
【出願人】（５０２４５７８０３）ユニヴァーシティ オブ ワシントン (93)
【Ｆターム（参考）】
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