短い核酸のマルチプレックス増幅
本教示は、マイクロＲＮＡのような小核酸の逆転写および増幅のための方法、組成物およびキットを提供する。高レベルのマルチプレックス化が、ｚｉｐコード化されたフォワードプライマーを含む、ＰＣＲに基づくプレ増幅反応に加えて、ｚｉｐコード化されたステムループ逆転写プライマーの使用によって、提供される。復号ＰＣＲの下流における検出プローブは、上記ステムループ逆転写プライマーによって導入されるｚｉｐコードを利用し得る。いくつかの実施形態においては、さらなる増幅が、逆転写反応をサイクリングさせることにより、達成される。本教示はまた、本明細書に記載の逆転写反応および増幅反応を行うために有用な組成物およびキットを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（分野）
本教示は、分子および細胞生物学の分野、特に短い核酸（例えば、マイクロＲＮＡ）のマルチプレックス増幅の分野中に存在する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
分子生物学における非常に多くの分野は、標的ポリヌクレオチド配列の同定を必要とする。逆転写および増幅は、標的ポリヌクレオチドの正体を尋ねるため（ｑｕｅｒｙ）に用いられる、二つの頻繁に使用される手順である。ポストゲノミクス（ｐｏｓｔ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ）時代において、科学者に利用可能な配列情報の量の増加は、複雑な核酸試料を尋ねるために、迅速な、信頼性のある、低コストで、高スループットであり、感度の高く、かつ正確な方法のための、増加した必要性を生み出した。細胞を規定および特徴付ける方法は、強固な増幅技術、および慣習的に分析された分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ）の分子の複雑さによって妨げられている。マイクロＲＮＡは、細胞機能の理解において顕著な見込みを提供する、最近発見された分子クラスである。しかしながら、マイクロＲＮＡの定量的分析は、これらの比較的短いサイズにより、妨げられている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（要旨）
いくつかの実施形態においては、本教示は、短い標的核酸のそれぞれが１８〜３０ヌクレオチド長である、少なくとも３００の異なる短い標的核酸を定量する方法を提供し、上記方法は、以下、上記少なくとも３００の異なる短い標的核酸と、少なくとも３００の異なる標的特異的ステムループ逆転写プライマーとを接触させる工程であって、ここで、上記少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーのそれぞれが、独特の３’標的特異的部分、独特のｚｉｐコード化ステム、およびループを含む、工程；上記少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーを、逆転写反応において伸長させ、逆転写産物の収集物を形成する工程；ＰＣＲに基づくプレ増幅産物の収集物を形成するために、逆転写産物の収集物に対し、ＰＣＲに基づくプレ増幅を行う工程であって、ここで上記ＰＣＲに基づくプレ増幅が、少なくとも３００の異なるフォワードプライマーおよび少なくとも一つのリバースプライマーを含み、ここで上記リバースプライマーの配列が、少なくとも一つのステムループ逆転写プライマーのループと実質的に同じ配列、およびＴｍ増大テイルを含む、工程；（この工程においては、少なくとも３００の異なるフォワードプライマーのそれぞれが、ｉ）特定の逆転写産物の配列の５’末端に相補的である３’標的特異的部分、およびｉｉ）特定の逆転写産物の配列に独特である５’ｚｉｐコードテイルを含む）；そして、ＰＣＲに基づくプレ増幅産物の収集物を、少なくとも３００の異なる反応容器へ分割する工程；上記少なくとも３００の異なる反応容器において復号ＰＣＲを行う工程であって、ここでそれぞれの復号ＰＣＲは、特定の標的核酸配列のための上記ＰＣＲに基づくプレ増幅反応におけるフォワードプライマーと実質的に同じ配列を含むフォワードプライマー、リバースプライマー、および検出プローブを含み、ここで上記検出プローブの配列は、ｉ）特定のステムループ逆転写プライマーの３’ステム領域と同じである、少なくとも６核酸塩基の配列、およびｉｉ）特定のステムループ逆転写プライマーにより尋ねられる短い標的核酸に相補的である、少なくとも６核酸塩基の配列を含む、工程；上記少なくとも３００の異なる反応容器において、検出プローブを検出する工程；ならびに、上記少なくとも３００の異なる短い標的核酸を定量する工程を包含する。
【０００４】
当業者は、以下に記載の図面が、例示的目的にすぎないことを理解する。図面は、決して、本教示の範囲を制限するとは意図されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
（例示的な実施形態の記述）
本教示の局面は、以下の実施例を考慮してさらに理解され得る（あらゆる方法において、本教示の範囲は限定的に解釈されるべきではない）。本明細書で使用されるセクションの表題は、単に構成的目的のためであり、そしていかなる方法においても記述された主題を限定するとは解釈されない。本出願に引用されるすべての文献および類似の資料（特許、特許出願、記事、書籍、論文、およびインターネットのウエブページが挙げられるが、これらには限定されない）は、あらゆる目的のためにそれらの全体が、参考として明示的に援用される。援用された参考文献中の用語の定義が、本教示中に規定された定義と異なっている場合、本教示中の定義が統制する。わずかなそして実質のない偏差が、本明細書の教示の範囲内であるように、本教示中において、論議される温度、濃度、時間、などの前の含意された「約」が存在することが理解される。本出願において、別に具体的に述べられない限り、単数形の使用は複数形を含む。例えば、「プライマー」は、１より多いプライマーが、存在し得る（しかし存在する必要はない）ということを意味する；例えば、１コピー以上の特定のプライマー種のおよび１様式以上の特異的プライマー型（しかしこれらに制限されない）、例えば、複数の異なったフォーワードプライマー（しかしこれらに制限されない）。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む」（ｃｏｎｔａｉｎｓ）、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、制限を意図しない。前述の一般的な記述および次の詳細な記述の両方は、単に例示的および説明的であり、そして本発明の制限とはならないことを理解すべきである。
【０００６】
（いくつかの定義）
本明細書中で使用される、用語「標的核酸」は、増幅および／または定量されることが求められるポリヌクレオチド配列を指す。上記標的ポリヌクレオチドは、あらゆる供給源から獲得し得、そしてかなり多数の異なった組成の構成部分を含み得る。例えば、上記標的は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、ｓｉＲＮＡであり得、そして核酸アナログまたは他の核酸模倣物（ｍｉｍｉｃ）を含み得る（一般的には、上記標的は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および／またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であるが）。上記標的は、メチル化され得るか、メチル化され得ないか、またはその両方をされ得る。上記標的は、ウラシルへ変換される、亜硫酸水素塩処理され、かつメチル化されていないシトシンであり得る。さらに、「標的ポリヌクレオチド」は、標的ポリヌクレオチドそのもの、およびその代用物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）（例えば、増幅産物）、ならびに本来の配列を指し得ることが理解される。いくつかの実施形態において、上記標的ポリヌクレオチドは、減成された供給源由来の短いＤＮＡ分子であり、このような標的ヌクレオチドは、例えば、法医学試料（例えば、Ｂｕｔｌｅｒ，２００１，Ｆｏｒｅｎｓｉｃ ＤＮＡ Ｔｙｐｉｎｇ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｅｈｉｎｄ ＳＴＲ Ｍａｒｋｅｒｓを参照のこと）（しかし、これらには制限されない）に存在し得る。本教示の標的ポリヌクレオチドは、任意の多数の供給源（限定するものではないが、ウイルス、原核生物、真核生物（例えば、植物、真菌、および動物（しかしこれらに制限されない））が挙げられる）に由来し得る。これらの供給源として、全血、組織バイオプシー、リンパ、骨髄、羊水、毛、皮膚、精液、生物戦争用薬品（ｂｉｏｗａｒｆａｒｅ ａｇｅｎｔ）、肛門分泌、膣分泌、発汗、唾液、頬側スワブ、種々の環境試料（例えば、農業、水、および土壌の試料）、一般的な研究試料、一般的な精製試料、培養細胞、溶解させた細胞を含み得るが、これらに制限されない。標的ポリヌクレオチドは、当該技術分野において公知である任意のいろいろな手順（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ，およびＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ６７００ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ、Ｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２３４，８０９号，ｍｉｒＶａｎａ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）、など）を使用し、試料から単離され得ることが理解される。標的ポリヌクレオチドは、分析より前に、切断または剪断され得る（機械的な力、超音波処理、制限エンドヌクレアーゼ切断、または当該技術分野で任意の公知の方法、のような手順の使用が挙げられる）ことが理解される。いくつかの実施形態においては、標的ポリヌクレオチドは二重鎖であり得、そして一本鎖は変性に起因し得るが、一般に、本教示の標的ポリヌクレオチドは一本鎖である。
【０００７】
本明細書で使用される、用語「逆転写反応」は、伸長反応を指し、ここでは、ステムループプライマーの３’標的特異的部分は、伸長反応産物（標的ポリヌクレオチドに相補的な鎖を含む）を形成するために伸長させられる。いくつかの実施形態においては、標的ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ分子であり、そして伸長反応は、逆転写酵素を含む逆転写反応である（ここでは、ステムループプライマーの３’末端が伸長させられる）。いくつかの実施形態においては、伸長反応は、真正細菌目の細菌由来のポリメラーゼを含む逆転写反応である。いくつかの実施形態においては、伸長反応は、ｒＴｔｈポリメラーゼ（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号Ｎ８０８−０１９２、およびＮ８０８−００９８として市販されている）を含み得る。いくつかの実施形態においては、上記標的ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡ分子であり、そして逆転写特性をまた含むポリメラーゼの使用が、最初の逆転写反応をさせ得、その後、同一の反応容器中においての、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉ−ｐｌｅｘｅｄ）ＰＣＲに基づくプレ増幅（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のような、増幅反応が続く。この方法により１つの反応容器中で２つの反応を統合させる。いくつかの実施形態においては、上記標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子であり、ならびに上記伸長反応は、ポリメラーゼを含みそしてＤＮＡの相補鎖の合成に終わる。用語、逆転写はまた、鋳型ＤＮＡ分子のＤＮＡ相補鎖（ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の合成を含む。同様に、逆転写産物は、逆転写反応において合成されるＤＮＡ分子であり得、したがって、このＤＮＡ分子は、上記鋳型へ相補的である。
【０００８】
本明細書で使用される、用語「リバースプライマー」は、逆転写反応のような反応において伸長される場合に、相補鎖を形成するプライマーをいう。伸長反応に続いて、フォワードプライマーは、合成鎖にハイブリダイズし得、そして伸長され得る。いくつかの実施形態においては、ステムループ逆転写プライマーは、逆転写反応において最初のリバースプライマーとして作用する。その後は、ステムループプライマーによりコード化された２番目のリバースプライマーが用いられ得、そして２番目のリバースプライマーは、フォワードプライマーの伸長から生じる鎖にハイブリダイズし得る。多くのステムループ逆転写プライマーが、同一の配列または実質的に同一の配列をそのループ中に含む実施形態においては、ＰＣＲに基づく、プレ増幅反応において使用される逆転写プライマーを、ユニバーサルリバースプライマーと呼ぶ。このユニバーサルリバースプライマーは、一般的にループ配列およびＴｍ増大テイル（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔａｉｌ）を含む。
【０００９】
本明細書で使用される、用語「ハイブリダイゼーション」は、一つの核酸と別の核酸との、相補塩基対の相互作用をいい、これが、二本鎖ＤＮＡ分子、三本鎖ＤＮＡ分子（ｔｒｉｐｌｅｘ）、または他の高度に規則正しい構造の形成をもたらし、そして、本明細書においては、「アニーリング」と交換可能に使用される。一般的には、ワトソン／クリック型およびフーグスティーン型の水素結合により、一次的な相互作用は塩基特異的である。（例えば、Ａ／ＴおよびＧ／Ｃ）。塩基スタッキングおよび疎水性の相互作用はまた、二本鎖ＤＮＡ分子の安定性に貢献し得る。相補的および実質上相補的な標的配列へのプライマーをハイブリダイズさせるための条件は周知であり、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）ならびにＪ．ＷｅｔｍｕｒおよびＮ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９以下参照（１９６８）に記載されている。一般的に、そのようなアニーリングが起こるかどうかは、数あるなかで、上記ポリヌクレオチドおよび上記相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）の長さ、ｐＨ、温度、一価のまたは二価の陽イオン、ハイブリダイズする領域におけるＧおよびＣヌクレオチドの割合、媒体の粘性、および変性剤の存在によって影響される。そのような変項は、ハイブリダイゼーションに必要な時間に影響する。従って、好ましいアニーリング条件は、特定の応用に依存している。そのような条件は、しかしながら、過度の実験をすることなしに当業者によってごく普通に決定され得る。相補性は、完全である必要はなく；標的配列と、本教示の一本鎖核酸との間でのハイブリダイゼーションを最小限妨げる、少数の不適正塩基対があり得ることが理解される。しかしながら、最低限にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションが起こり得ないほど不適正塩基対の数が多い場合、この配列は、一般的に、相補的標的配列ではない。このように、本明細書において、相補性とは、プライマーが、本教示の目的を達成するために、選択された反応条件の下で、ハイブリダイズする標的配列に十分に相補的であることを意味している。
【００１０】
本明細書で使用される、用語「増幅する」は、標的ポリヌクレオチドおよび／または標的ポリヌクレオチド代用物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）の少なくとも一部が複製される任意の手段を指し、一般的には、鋳型依存性の様式によって、線形的または指数関数的のいずれかにより、核酸配列を増幅するための広範囲な技術を含んでいる（しかし、これらに制限されない）。いくつかの実施形態においては、例えば、米国特許第６，１５３，４２５号および同第６，６４９，３７８号中に記載されているように、試料の調製および検出を含む独立した統合されたアプローチによって、増幅は達成され得る。核酸の増幅は、可逆的に改変した酵素、例えば米国特許第５，７７３，２５８号に記載の酵素（しかし、これに制限されない）を使用し得る。本教示はまた、様々なウラシルに基づく除染戦略を企図する。ここで、例えば、ウラシルは増幅反応に組み込まれ得、そして続いて様々なグリコシラーゼ処理（例えば、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，５３６，６４９号、および米国非仮出願特許出願第１１／１７３，１１２号を参照のこと）で、繰越し汚染産物が取り除かれ得る。当業者は、所望の酵素活性を有する任意のタンパク質が、開示された方法およびキット中で使用され得ることを理解する。逆転写酵素、ウラシルＮ−グリコシラーゼなどを含む、ＤＮＡポリメラーゼの記載を、他の場所の中、Ｔｗｙｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９；Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｇｕｉｄｅ，ｒｅｖ．０９２２９８，Ｐｒｏｍｅｇａ，１９９８；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃｓ；およびＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌで見い出し得る。
【００１１】
本明細書で使用される、用語「一致する」は、用語が指す要素間の、特定の関係を指す。一致する、のいくつかの例は以下を含む（しかし、これらに制限されない）：リバースプライマーは、標的核酸と一致し得、同様に標的核酸は、リバースプライマーと一致し得る。フォワードプライマーは、標的核酸に一致し得、同様に標的核酸は、フォワードプライマーに一致し得る。
【００１２】
本明細書で使用される、用語「反応容器」は一般的に、その中で、本教示にしたがう反応が起こり得る任意の容器を指す。いくつかの実施形態においては、反応容器は、エッペンドルフチューブであり得、そして現代の分子生物学の研究室での通常の実施における別の種類の容器であり得る。いくつかの実施形態においては、反応容器は、マイクロタイタープレート中のウエル、ガラススライド上のスポット、またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（以前は、ＭｉｃｒｏＣａｒｄＴＭ）中のウェルであり得る。例えば、多数の反応容器が、同一の支持体に存在する。いくつかの実施形態においては、例えばＣａｌｉｐｅｒおよびＦｌｕｉｄｉｇｍから市販されているラボオンチップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）様装置は、反応容器を提供し得る。いくつかの実施形態においては、Ｗｅｎｚ ｅｔ ａｌ．の米国本特許出願第１１／０５９，８２４号に記載のように、様々なマイクロ流体アプローチが用いられ得る。様々な反応容器が当該技術分野において利用可能であり、そして本教示の文脈において使用され得ることを認める。
【００１３】
本明細書で使用される、用語「ＰＣＲに基づくプレ増幅」は、複数のプライマーの組がマルチプレックスＰＣＲ増幅反応に含まれ、かつ、上記ＰＣＲに基づくプレ増幅反応が、ＰＣＲプラトーおよび／または試薬の枯渇より先に終結するように、上記マルチプレックス増幅反応が制限されたサイクル数を受ける、プロセスを指す。用語「ＰＣＲに基づくプレ増幅」は、ＰＣＲに基づくプレ増幅反応よりも、一般的により低い構成単位（ｌｏｗｅｒ−ｐｌｅｘｙ）のレベルで２番目の増幅反応が、続いて行われることを示すと考えられ得る。この２番目の増幅反応、一般的に複数の別々の２番目の増幅反応は、マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応中で使用されるプライマーによってコード化されるプライマーの組を使用し得る。しかしながら、２番目の増幅反応それぞれは、一般的に、１つまたは数個のプライマーの組を含む。ＰＣＲに基づくプレ増幅アプローチの例が、例えば、Ｘｔｒａｎａの米国特許第６，６０５，４５１号、およびＡｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願第１０／７２３，５２０号中に見い出され得る。
【００１４】
本明細書で使用される、用語「検出」は、標的ポリヌクレオチドの、存在および／または量および／または同一性を決定する、任意の様々な方法を指す。ドナー部分およびシグナル部分を使用するいくつかの実施形態においては、特定のエネルギーを移動させる蛍光色素を使用し得る。特定の、制限することにならない、例示的な、ドナー（ドナー部分）およびアクセプター（シグナル部分）の組は、例えば、米国特許番号第５，８６３，７２７号；同５，８００，９９６号；および同５，９４５，５２６号中に例示されている。ドナーおよびアクセプターのいくつかの組み合わせの使用は、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）と呼ばれる。いくつかの実施形態においては、シグナリングプローブ（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）として使用され得るフルオロフォアとして、ローダミン、シアニン３（Ｃｙ ３）、シアニン５（Ｃｙ ５）、フルオレセイン、ＶｉｃＴＭ、ＬｉｚＴＭ、ＴａｍｒａＴＭ、５−ＦａｍＴＭ、６−ＦａｍＴＭ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）が挙げられる（しかし、これらに制限されない）。（ＶｉｃＴＭ、ＬｉｚＴＭ、ＴａｍｒａＴＭ、５−ＦａｍＴＭ、６−ＦａｍＴＭ（すべてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから購入可能である））。いくつかの実施形態においては、励起された光に応じて蛍光シグナルを与える検出プローブの量は、一般的に、増幅反応において産出される核酸の量と関連がある。従って、いくつかの実施形態においては、蛍光シグナルの量は、増幅反応において生成される産物の量と関連がある。このような実施形態においては、ゆえに、蛍光指示薬から蛍光シグナルの強度を測定することにより、増幅産物の量を測定し得る。いくつかの実施形態により、蛍光シグナルにより示される増幅産物を定量するための内部標準を使用し得る。例えば、米国特許第５，７３６，３３３号を参照のこと。蛍光指示薬を含んでいる組成物を用いるサーマルサイクリング反応を実行し得、特定波長の光線を放射し得、蛍光色素の強度を読み取る、そして、それぞれのサイクル後、蛍光の強度を表示し得る装置が開発された。サーマルサイクラー、光線放射器、および蛍光シグナル検出器を備える装置は、例えば、米国特許第５，９２８，９０７号；同第６，０１５，６７４号；および同第６，１７４，６７０号に記載されており、そしてこのような装置としては、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００ ｓｅｑｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００ ｓｅｑｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）７３００ ｓｅｑｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、およびＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）７５００ ｓｅｑｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が挙げられるが、これらには制限されない。いくつかの実施形態においては、これらの機能のそれぞれは、別々の装置によって実行され得る。例えば、もし、増幅のためＱ−ベータレプリカーゼ反応を使用する場合、この反応はサーマルサイクラーにおいては起こり得ないが、特定波長で放射される光線、蛍光シグナルの検出、ならびに増幅産物の量の計算および表示を含み得る。いくつかの実施形態においては、組み合わせたサーマルサイクリングおよび蛍光検出装置が、試料中の標的の核酸配列の正確な定量のために用いられ得る。いくつかの実施形態においては、蛍光シグナルは、１以上のサーマルサイクルの間および／または後に、検出および表示され得、従って、反応が「リアルタイム」に起こっている時、増幅産物のモニタリングを可能にする。いくつかの実施形態においては、増幅前の試料中にどれだけの標的核酸配列が存在するか見積もるための、増幅産物の量および増幅サイクルの数を使用し得る。いくつかの実施形態においては、試料中の標的核酸配列の存在を示すために十分な、所定のサイクル数の後、増幅産物の量を単にモニタリングし得る。当業者は、任意の与えられた試料型、プライマー配列および反応条件について、与えられた標的ポリヌクレオチドの存在を決定するため、何サイクルが十分かを簡単に決定し得る。本明細書において使用されるように、標的の存在を決定することは、標的を同定し、そして必要に応じて標的を定量化することを含み得る。いくつかの実施形態においては、増幅産物は、与えられたサイクル数が完了するや否や、陽性または陰性として記録され得る。いくつかの実施形態においては、この結果は、電子的に直接データベースへ伝達され得、作表され得る。従って、いくつかの実施形態においては、このような機械が使用された場合、たくさんの試料が、より少ない時間および労力で処理されそして分析され得る。いくつかの実施形態においては、異なる検出プローブは、異なる標的ポリヌクレオチド間を、識別し得る。このようなプローブの制限されない例として、５’−ヌクレアーゼ蛍光プロープ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ分子）が挙げられる。ここでは、蛍光分子が、オリゴヌクレオチド結合要素を介して、蛍光消光分子に結びつけられている。いくつかの実施形態においては、５’−ヌクレアーゼ蛍光プロープのオリゴヌクレオチド結合要素（ｌｉｎｋ ｅｌｅｍｅｎｔ）は、同定する部分またはこの相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の特定の配列に結合する。いくつかの実施形態においては、それぞれが異なる波長において蛍光を発する、異なる５’−ヌクレアーゼ蛍光プロープは、同じ増幅反応内における異なる増幅産物間を識別し得る。例えば、いくつかの実施形態においては、２つの異なる波長（ＷＬＡおよびＷＬＢ）において蛍光を発し、かつ２つの異なる伸長反応産物（Ａ’およびＢ’のそれぞれ）の２つの異なる領域に特異的である、２つの異なる５’−ヌクレアーゼ蛍光プロープを使用し得る。増幅産物Ａ’は、標的ポリヌクレオチドＡが試料内に存在する場合に形成され、そして増幅産物Ｂ’は、標的ポリヌクレオチドＢが試料内に存在する場合に形成される。いくつかの実施形態においては、増幅産物Ａ’および／または増幅産物Ｂ’は、たとえ適切な標的ポリヌクレオチドが試料中に存在しなくても形成し得るが、このようなことは、上記適切な標的ポリヌクレオチドが試料中に存在する場合よりも、はっきりと、より少ない程度で起こる。増幅後、どの特定の標的核酸配列が試料中に存在しているか、検出されたシグナルの波長およびシグナルの強度に基づいて、決定し得る。従って、適切かつ検出可能な、波長ＷＬＡのみのシグナル値が検出された場合、上記試料は、標的ポリヌクレオチドＡを含むが、標的ポリヌクレオチドＢを含まないことがわかる。適切かつ検出可能な、波長ＷＬＡおよびＷＬＢのシグナル値が検出された場合、上記試料は、標的ポリヌクレオチドＡおよび標的ポリヌクレオチドＢの両方を含むことがわかる。いくつかの実施形態においては、検出は、様々なマイクロアレイおよび関連ソフトウェア、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ １７００ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを備えるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、および数あるなかでＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ａｇｉｌｅｎｔ，ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから利用可能な、別の市販アレイシステム（Ｇｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：２５１−６２，１９９９；Ｄｅ Ｂｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｎｅｒｖａ Ｂｉｏｔｅｃ １４：２４７−５２，２００２；およびＳｔｅａｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１４０−４５、増刊号を含む、２００３をまた参照のこと）により達成され得る。検出は、反応産物に組み込まれている（標識されたプライマーの一部としてかまたは増幅の間の標識されたｄＮＴＰの組み込みのおかげのいずれか）レポーター基（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｒｏｕｐ）、あるいは反応産物へ付着させられている（例えば非限定例として、レポーター基を含むハイブリダイゼーションタグ相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を媒介して、または反応産物に統合もしくは付着させたリンカーアーム（ｌｉｎｋｅｒ ａｒｍ）を媒介して）レポーター基を含み得る、ということがまた理解される。例えば、質量分析を使用する、非標識化反応産物の検出はまた、本教示の範囲内にある。
【００１５】
本明細書で使用される、用語「検出プローブ」は、一般的に、定量的またはリアルタイムＰＣＲ分析ならびに終点分析のための、増幅反応において使用される分子を指す。このような検出プローブは、標的マイクロＲＮＡ、ならびに／あるいは内因性のコントロール小核酸および／または合成の内部コントロールのような核酸コントロールの増幅をモニタリングするために使用され得る。いくつかの実施形態においては、増幅反応に存在する検出プローブは、時間の関数として生成されるアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）（単数および複数）の量をモニタリングするのに適当である。このような検出プローブの限定されない例としては、５’−エキソヌクレアーゼアッセイ（本明細書に記載の、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（米国特許第５，５３８，８４８号をまた参照のこと））、様々なステムループ分子ビーコン（例えば、米国特許第６，１０３，４７６号および第５，９２５，５１７号ならびにＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３−３０８を参照のこと）、ステムレス（ｓｔｅｍｌｅｓｓ）または線形ビーコン（例えば、ＷＯ第９９／２１８８１号を参照のこと）、ＰＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｅａｃｏｎｓＴＭ（例えば、米国特許第６，３５５，４２１号および第６，５９３，０９１号を参照のこと）、線形ＰＮＡビーコン（例えば、Ｋｕｂｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＳＰＩＥ ４２６４：５３−５８を参照のこと）、非ＦＲＥＴプローブ（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号を参照のこと）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（登録商標）／Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（登録商標）プローブ（米国特許第６，５４８，２５０号）、ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ ａｎｄ ｄｕｐｌｅｘ ＳｃｏｒｐｉｏｎＴＭプローブ（Ｓｏｌｉｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９：Ｅ９６および米国特許第６，５８９，７４３号）、湾曲（ｂｕｌｇｅ）ループプローブ（米国特許第６，５９０，０９１号）、シュードノット（ｐｓｅｕｄｏ ｋｎｏｔ）プロープ（米国特許第６，５８９，２５０号）、ｃｙｃｌｉｃｏｎｓ（米国特許第６，３８３，７５２号）、ＭＧＢ ＥｃｌｉｐｓｅＴＭプローブ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヘアピンプローブ（米国特許第６，５９６，４９０号）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ライトアップ（ｌｉｇｈｔ−ｕｐ）プローブ、自己集合したナノ粒子プローブ、および、例えば、米国特許第６，４８５，９０１号；Ｍｈｌａｎｇａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４６３−４７１；Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１７：８０４−８０７；Ｉｓａｃｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ．１４：３２１−３２８；Ｓｖａｎｖｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８１：２６−３５；Ｗｏｌｆｆｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７６６：７６９−７７１；Ｔｓｏｕｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３０：４２０８−４２１５；Ｒｉｃｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：４０８８−４０９３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｓｈａｎｇｈａｉ．３４：３２９−３３２；Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９６０６−９６１２；Ｂｒｏｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：２４９−５６；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１５：１１８−１２６；およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ １４：１１１５５−１１１６１に記載されているフェロセン−改変プローブが挙げられる。検出プローブはまた、クエンチャー（例えば、ブラックホールクエンチャー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、アイオワブラック（Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ）（ＩＤＴ）、ＱＳＹクエンチャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、およびＤａｂｓｙｌおよびＤａｂｃｅｌスルホネート／カルボキシレートクエンチャー（Ｅｐｏｃｈ）などが挙げられるが、これらに制限されない）を含み得る。検出プローブはまた、２つのプローブを含み得る。ここでは、例えば、蛍光体（ｆｌｕｏｒ）は１つのプローブ上に存在し、クエンチャーはもう一方のプローブ上に存在しており、標的上での２つのプローブ一緒のハイブリダイゼーションは、シグナルを消光し、または標的上でのハイブリダイゼーションは、蛍光の変化を通して、シグナルのサインを変える。一方の分子がＬ−ＤＮＡであり、もう一方の分子がＰＮＡである、２つのプローブを含む例示的検出プローブは、Ｌａｏ ｅｔ ａｌ．の米国非仮特許出願第１１／１７２，２８０号中で見出され得る。検出プローブはまた、カルボキシレート基の代わりにＳＯ３を有しているフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｉｎ）色素のスルホネート誘導体、フルオレセインのホスホロアミダイト体、ＣＹ５のホスホロアミダイト体（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍから市販されている）を含み得る。いくつかの実施形態においては、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、およびＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）のような挿入標識が使用され、これによって、検出プローブの非存在下において増幅産物の、リアルタイムでのまたは終点での可視化を可能にしている。いくつかの実施形態においては、挿入検出プローブおよび配列に基づいた検出プローブの両方を含み得る、リアルタイムの可視化が使用され得る。いくつかの実施形態においては、上記検出プローブは、増幅反応において相補的配列にハイブリダイズしなかった場合、少なくとも部分的に消光させられ、そして増幅反応において相補的配列にハイブリダイズした場合、少なくとも部分的に消光させない。いくつかの実施形態においては、プローブはさらに、所望の熱力学特性をさらに提供するため、多様な改変（例えば、マイナーグルーブ（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）結合剤）を含み得る（例えば、米国特許第６，４８６，３０８号を参照のこと）。いくつかの実施形態においては、検出プローブは、ステムループ逆転写プライマーによって導入されたｚｉｐコードに対応し得る。
【００１６】
いくつかの実施形態においては、上記検出プローブは、ｉ）上記ステムループリバースプライマーの３’ステム領域と同一である核酸塩基少なくとも６個の配列、およびｉｉ）標的核酸に相補的である核酸塩基少なくとも６個の配列を含む。いくつかの実施形態においては、上記検出プローブは、ｉ）上記ステムループリバースプライマーの３’ステム領域と同一である核酸塩基少なくとも７個の配列、およびｉｉ）標的核酸に相補的である核酸塩基少なくとも７個の配列を含む。いくつかの実施形態においては、上記検出プローブは、ｉ）上記ステムループリバースプライマーの３’ステム領域と同一である核酸塩基少なくとも８個の配列、およびｉｉ）標的核酸に相補的である核酸塩基少なくとも８個の配列を含む。当然、８より大きい長さが使用され得る。一般的に、核酸塩基５個よりも小さい長さは、認められない、というのは核酸塩基５個よりも小さい長さは、非特異的相互作用を導くからである。検出プローブは、ｉ）上記ステムループリバースプライマーの３’ステム領域と同一である核酸塩基少なくともＸ個の配列、およびｉｉ）標的核酸に相補的である核酸塩基少なくともＹ個の配列を含み得、ここでＸおよびＹは異なる数である、ということがまた、理解される。
【００１７】
本明細書で使用される、用語「ステムループプライマー」は、３’標的特異的部分、ステム、ループを含む分子を指す。例示的ステムループプライマーは、図１、本教示中の他の場所にも、そしてＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願第１０／９４７，４６０号において描写される。用語「３’標的特異的部分」は、標的マイクロＲＮＡまたは内因性コントロール小ＲＮＡのような標的ポリヌクレオチドへ相補的な、ステムループプライマーの一本鎖部分を指す。上記３’標的特異的部分は、ステムループプライマーのステムから下流に位置している。一般的に、３’標的特異的部分は、６個から９個の間の長さのヌクレオチドである。いくつかの実施形態においては、上記３’標的特異的部分は７ヌクレオチド長である。ごく普通の実験で、別の長さを生成し得ること、そして８ヌクレオチドより長い、または６ヌクレオチドより短い、３’標的特異的部分がまた、本教示により予期されることが理解される。一般的に、３’標的特異的部分の３’末端に近いヌクレオチドは、フォワードプライマーの３’ヌクレオチドと、最小限の相補性重複部分を有するか、または少しも重複部分を有しない；これらの領域の重複部分が、続いて起こる増幅反応における、所望されないプライマー二量体の増幅産物を、生成し得ることが理解される。いくつかの実施形態においては、３’標的特異的部分の３’末端に近いヌクレオチドおよびフォワードプライマーの３’ヌクレオチドとの間の重複部分は、０、１、２、または３個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態においては、３より大きいヌクレオチドが、３’標的特異的部分の３’末端に近いヌクレオチドとフォワードプライマーの３’ヌクレオチドとの間で相補的であり得るが、一般的にこのようなシナリオには、この中に散在させられた、さらなる非相補的ヌクレオチドが付随する。いくつかの実施形態においては、ＬＮＡのような改変された塩基が、ステムループプライマーのＴｍを増加させるために、３’標的特異的部分において使用され得る（例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００３），２１：２：７４−８１を参照）。いくつかの実施形態においては、ユニバーサル塩基が、例えば、ステムループプライマーのより小さいライブラリーを可能にするために、使用され得る。いくつかの実施形態においては、ＬＮＡおよびユニバーサル塩基を含むが、これらに制限されない改変は、逆転写の特異性を改善し得、そして潜在的に検出特異性を高め得る。用語「ステム」は、３’標的特異的部分およびループの間に存在する、ステムループプライマーの二重鎖領域を指し、そして以下により十分に論議される。用語「ループ」は、例えば、図１に描写されているように、ステムの２つの相補的鎖の間に配置されている、ステムループプライマーの領域を指す。一般的に、改変ＤＮＡまたは改変ＲＮＡ、炭素スペーサー（Ｃａｒｂｏｎ ｓｐａｃｅｒ）（例えば、Ｃ１８）、および／またはＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を含む別の部分も可能だが、上記ループは、一本鎖ヌクレオチドを含む。一般的に、上記ループは、４から３０の間のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態においては、上記ループは、１４から１８の間のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態においては、上記ループは、１６ヌクレオチド長である。当業者は、４ヌクレオチドより短いループおよび２０ヌクレオチドより長いループは、ごく普通の方法論の過程において、そして過度な実験をすることなしに、同定され得ること、ならびにこのようなより短いおよびより長いループは、本教示により予期されることを理解する。いくつかの実施形態においては、上記ループは、「ｚｉｐコード」としてまた公知である同定部分を含み得る。
【００１８】
本明細書において使用される、用語「ループの配列の少なくとも７０パーセントを含む」は、ステムループ逆転写プライマーのループの配列に関してのリバースプライマーの配列を指す。例えば、図５およびこの中に含まれる配列に関して、ステムループ逆転写プライマーは、
【００１９】
【化１】
である。
【００２０】
したがって、上記リバースプライマー配列は、上記ループ配列よりも核酸塩基が２個短い。この故に、上記ループは２０個の核酸塩基であり、そして上記リバースプライマーは１８個の核酸塩基であるので、上記リバースプライマーは、上記ループの配列の１８／２０、または、９０パーセントを含むと言い得る。この意味において、「ループの配列の少なくとも７０パーセントを含む」との表現が、本教示中で使用される。
【００２１】
もちろん、本教示は、ひとりよがりの盲目的模倣者（ｗｏｕｌｄ−ｂｅ ｃｏｐｙ−ｃａｔ）が、上記ループに関するリバースプライマーの配列において、単に１塩基または２塩基、または３塩基を変更しようと企てたに過ぎない実施形態をさらに予期する。本教示は、これらのおよび類似しているシナリオを予期する。この故に、成句「と実質的に同じ」が、配列を指すために使用された場合、これは、本教示の範囲内で、使用される配列にわずかな偏差を含むことを意図されていることが理解される。このようなわずかな改変は、本教示によって明瞭に予期される。疑わしさを回避するため、「と実質的に同じ」は、一般的に、配列が対応する配列と少なくとも９０パーセント同じということを意味する。さらに、例えば、リバースプライマーが、ステムループ逆転写プライマーのループ中に含まれている配列と、実質的に同じ配列を含むという事実を指す場合、「ループの配列の少なくとも７０パーセント」があてはまるということ、そしてさらに、少なくとも７０パーセント、少なくとも９０パーセントのループの配列が、対応するループ配列と同じということが、理解される。
【００２２】
さらに、図５に示されている例示的配列に関して、本明細書において使用されるように、用語「ｚｉｐコード化されたステム（ｚｉｐ−ｃｏｄｅｄ ｓｔｅｍ）」は、ステムループ逆転写プライマーの二重鎖領域を指す。図５におけるステムループ逆転写プライマーのステムは、８塩基対の長さである。いくつかの実施形態においては、ステムは９塩基対の長さであり得る。いくつかの実施形態においては、ステムは１０塩基対の長さであり得る。いくつかの実施形態においては、ステムは１１塩基対の長さであり得る。いくつかの実施形態においては、ステムは１２塩基対の長さであり得る。いくつかの実施形態においては、ステムは１３塩基対の長さであり得る。いくつかの実施形態においては、ステムは１４塩基対の長さであり得る。一般的に、より長いステムが可能であるが、これはオリゴヌクレオチド製造において増加した出費という損害をかけて手に入り、さらに反応の複雑性を増す。いくつかの実施形態においては、ステムは７塩基対の長さであり得る。いくつかの実施形態においては、ステムは長さ６塩基対であり得る。６塩基対の長さより短いステムは可能であるが、検出プローブ結合のレベルにおける特異性を犠牲にして遂行される。
【００２３】
本明細書において使用されるように、用語「ステムループ逆転写プライマーの３’ステム領域」は、ステムのうちの１つの鎖、特にステムループ逆転写プライマーの３’末端に一番近い鎖を指す。別の鎖は、「ステムループ逆転写プライマーの５’ステム領域」として言われ得る。
【００２４】
本明細書において使用されるように、用語「Ｔｍ増大テイル」は、ＰＣＲに基づくプレ増幅反応において使用されるリバースプライマーの５’末端に含まれる、少数（一般的に３個から１０個の間）の核酸塩基を指す。上記Ｔｍ増大テイルは、逆転写産物に相補的ではない。いくつかの実施形態においては、Ｔｍ増大テイルは、４塩基である。いくつかの実施形態においては、Ｔｍ増大テイルは、５塩基である。いくつかの実施形態においては、Ｔｍ増大テイルは、６塩基である。いくつかの実施形態においては、Ｔｍ増大テイルは、７塩基である。一般的に、より長いＴｍ増大テイルが可能であるが、これはオリゴヌクレオチド製造において増加した出費という損害をかけて手に入り、さらに反応の複雑性を増し、そしてＴｍを所望しないレベルにまで引きあげ得る。
【００２５】
本明細書において使用されるように、用語「５’ｚｉｐコードテイル」は、ＰＣＲに基づくプレ増幅反応中で使用される、フォワードプライマーの５’末端に含まれる、一般的に７個から１５個の間の、核酸塩基の配列を指す。５’ｚｉｐコードテイルは特定の標的核酸配列と結合している。すなわち、標的核酸（例えば、マイクロＲＮＡ ｌｅｔ−７ａ）は、ＰＣＲに基づくプレ増幅反応中で増幅され得る。この反応中、フォワードプライマーの５’ｚｉｐコードテイルは、ｌｅｔ−７ａと独特に結合する。このことは、フォワードプライマーにおける３’標的特異的部分とｚｉｐコードが対にされる賢明な設計（ｎｏｔｅ−ｋｅｅｐｉｎｇ）によって、達成され、従って、ｚｉｐコードが、所定の標的核酸と一緒に変化することを可能にしている。その結果、例えばマイクロＲＮＡ ｍｉＲ−２９７を尋ねるフォワードプライマーの５’ｚｉｐコードテイルは、マイクロＲＮＡ ｌｅｔ−７ａを尋ねるフォワードプライマーの５’ｚｉｐコードテイルと異なっている。このコード化（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）は高度にマルチプレックス環境下でより高い能力を可能にし、そして多数の目的の標的核酸が、対応するフォワードプライマーの５’ｚｉｐコードテイルによるｚｉｐコード情報を用いて独特にコード化されることを可能にする。従って、いくつかの表現において、本教示は、固有の逆転写産物配列に独特である５’ｚｉｐコードテイルを指す。いくつかの実施形態においては、ｚｉｐコードテイルは８個の核酸塩基である。いくつかの実施形態においては、ｚｉｐコードテイルは９個の核酸塩基である。いくつかの実施形態においては、ｚｉｐコードテイルは１０個の核酸塩基である。いくつかの実施形態においては、ｚｉｐコードテイルは１１個の核酸塩基である。いくつかの実施形態においては、ｚｉｐコードテイルは１２個の核酸塩基である。一般的に、５’ｚｉｐコードテイルのより長いステムが可能であるが、これはオリゴ製造において増加した出費という損害をかけて手に入り、そしてさらに反応の複雑性を増す。ｚｉｐコードの記載を、他の場所の中、米国特許第６，３０９，８２９号（この中で「タグセグメント（ｔａｇ ｓｅｇｍｅｎｔ）」として呼ばれる）；同第６，４５１，５２５号（この中で「タグセグメント」として呼ばれる）；同第６，３０９，８２９号（この中で「タグセグメント」として呼ばれる）；同第５，９８１，１７６号（この中で「グリッドオリゴヌクレオチド」として呼ばれる）；同第５，９３５，７９３号（この中で「同定タグ」として呼ばれる）；およびＰＣＴ公報番号ＷＯ第０１／９２５７９号(この中で「アドレスで呼び出せる（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）支持体特異的配列」として呼ばれる）で見い出し得る。
【００２６】
（例示的実施形態）
図１は、本教示のいくつかの実施形態に記載の特定の構成内容を描写する。上段、ｍｉＲＮＡ分子（１、破線）が描写される。中段、ステムループ逆転写プライマー（２）が描写される（３’標的特異的部分（３）、ステム（４）、およびループ（５）を例示する）。下段、ステムループプライマー（２）にハイブリダイズさせた、ｍｉＲＮＡ（１）が描写される（ｍｉＲＮＡ（１）の３’末端領域（６）にハイブリダイズさせた、ステムループプライマー（２）の３’標的特異的部分（３）を例示する）。
【００２７】
図２は、本教示のいくつかの実施形態に記載のプロセスの全体像を例示する。ここで、マルチプレックスの逆転写反応は、マイクロＲＮＡのような、複数の核酸上で行われる。この逆転写を、本教示のいくつかの実施形態、例えば、２つのセグメントサイクル手順、または３つのセグメントサイクル手順にしたがってサイクルし得る。また、この逆転写反応は、ステムループ逆転写プライマーを含み得る。上記逆転写反応に続いて、そして上記逆転写反応と同じ容器内で必要に応じて起こる、マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅が行われ得る。このマルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅の次に、複数の別々の、復号ＰＣＲ（ｄｅｃｏｄｉｎｇ ＰＣＲ）、ここではＰＣＲ １、ＰＣＲ ２、ＰＣＲ ３、が続き得る。標的ポリヌクレオチドのＰＣＲに基づくプレ増幅（例えば、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願第１０／７２３，５２０号、およびＸｔｒａｎａの米国特許第６，６０５，４５１号を参照）は、１，０００倍よりもより多く、最大キロ単位（ｋｉｌｏ−ｐｌｅｘ）の数の標的核酸について、ｃＤＮＡをプレ増幅させ得る。続いて起こるより低い構成単位（ｌｏｗｅｒ−ｐｌｅｘ）の増幅反応は、続いて、これらのマルチプレックス反応を復号し得、その結果、試薬の節約をともなって、複数の異なる標的ポリヌクレオチドの検出および定量を可能にする。所定の細胞型または細胞型の収集物における、１つ、一部の、またはすべてのマイクロＲＮＡの同定および定量は、‘マイクロＲＮＡサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）‘として呼ばれ得、そして本教示の方法の適用によって達成し得る。サインの論議は、例えば米国特許第６，１１０，７１１号および同第５，５１４，５４５号で見出し得、ここでメッセンジャーＲＮＡサインは、マイクロアレイのような文脈において論議される。本教示の方法は、マイクロＲＮＡのサインを個々の細胞（例えば、個々の幹細胞およびそれより生じる細胞）から規定することを可能にする。本教示は、非常に高度なレベルのマルチプレックス化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）、および単一の細胞から、多数の標的マイクロＲＮＡを代表するサインの起源を提供する。
【００２８】
例示的反応の全体像を、図３に示し、これは、本教示のいくつかの実施形態にしたがうマルチプレックスアッセイの設計を示す。ここで、ｍｉＲＮＡが、ステムループ逆転写プライマー（４１）を含むハイブリダイゼーション反応において、尋ねられることが示される。ハイブリダイゼーションに続いて、逆転写伸長反応が、伸長産物（４２）を形成するためのサイクリング手順で、必要に応じて行われ得る。上記伸長産物は、続いて、マイクロＲＮＡ特異的な、フォワードプライマー（４３）およびリバースプライマー（４４）を使用する、マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅を受け得る。その後は、マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅の上記産物は、３つ別々の、復号増幅反応へと分割される（この場合、ＰＣＲ１、ＰＣＲ２、およびＰＣＲ３）。
【００２９】
図３には明示されていないが、複数のマイクロＲＮＡ種が、このアッセイ中に存在し得ることが理解される。上記アッセイにおいては、逆転写反応において、複数の標的特異的ステムループ逆転写プライマーが使用され得る。さらに、複数の逆転写反応産物は、複数の標的特異的プライマー対を使用する、マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応において、増幅され得る。その後は、シングルプレックス（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｌｅｘ）のＰＣＲ復号反応の収集が行われ得る。例えば、ＰＣＲ１は、最初のｍｉＲＮＡに対して特異的なフォワードプライマーを含み得、ＰＣＲ２は、２番目のｍｉＲＮＡに対して特異的なフォワードプライマーを含み得、そしてＰＣＲ３は、３番目のｍｉＲＮＡに対して特異的なフォワードプライマーを含み得る。上記フォワードプライマーのそれぞれは、固有にｚｉｐコード化され、特定のマイクロＲＮＡと結合させられる、非相補的なテイル部分をさらに含み得る。さらに、ＰＣＲ１、ＰＣＲ２、およびＰＣＲ３はすべて、逆転写反応において、ステムループプライマーのループによってコード化されている、リバースプライマーを含み得る。さらに、ＰＣＲ１は、最初のｍｉＲＮＡの３’末端領域に対応する別個の検出プローブ、および最初のステムループ逆転写プライマーの、ｚｉｐコード１ステムを含み得、ＰＣＲ２は、２番目のｍｉＲＮＡの３’末端領域に対応する別個の検出プローブ、および２番目のステムループ逆転写プライマーの、ｚｉｐコード２ステムを含み得、ＰＣＲ３は、３番目のｍｉＲＮＡの３’末端領域に対応する別個の検出プローブ、および３番目のステムループ逆転写プライマーの、ｚｉｐコード３ステムを含み得る。
【００３０】
従って、いくつかの実施形態においては、本教示がコード化する反応スキームおよび復号する反応スキームを予期する。上記実施形態においては、コード化するマルチプレックスの逆転写反応に、マルチプレックスのコード化するＰＣＲに基づくプレ増幅反応が続き、そしてマルチプレックスのコード化するＰＣＲに基づくプレ増幅反応に、複数のより低い構成単位の（例えば、シングルプレックスの）復号する増幅反応が続く。従って、本教示は、マルチプレックス増幅反応における異なった分子の数を最小化するための様々な戦略を提供する。
【００３１】
図４に示すように、本教示はｚｉｐコード情報を増幅産物内へコード化する新規な方法を提供する。（Ａ）においては、マイクロＲＮＡ配列（７）は、ステムループ逆転写プライマー（８）を用いて尋ねられる。このことは逆転写反応において起こり得る。ステムループ逆転写プライマー（８）の構造は、３’標的特異的部分（９）、二重鎖ステム（１０、１２）、およびループ（１１）を含む。特定のマイクロＲＮＡを尋ねる特定のステムループリバースプライマーのステムは、上記ステム中に存在する固有のｚｉｐコード配列が、特定のマイクロＲＮＡ配列と結合するようにｚｉｐコード化され得る。ステムループ逆転写プライマーの３’ステム領域は（１０）として示されており、そして「ステムループ逆転写プライマーの５’ステム領域」は（１２）に示されている。
【００３２】
図４においてｚｉｐコード配列情報は、終始点線として示されている。（Ａ）においては、ステム（１０，１２）は、特定のマイクロＲＮＡ配列と別個に結合するｚｉｐコード配列を含む。ステムループリバースプライマー（８）の３’標的特異的部分（９）の伸長は、元のマイクロＲＮＡ標的に相補的である鎖の合成に帰着し得る。
【００３３】
（Ａ）における、上記ステムループ逆転写プライマーの上記マイクロＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションおよび伸長反応に続いて、伸長反応産物は、（Ｂ）における（１３）に帰着する。この伸長反応産物は、ステムループリバースプライマー（８）のステム（１０、１２）における配列によって、コード化されたｚｉｐコードを含む。（下記で述べられるように、上記ステムループ逆転写プライマー（１０）の３’ステム領域によりコード化されるｚｉｐコードは、（Ｃ）において起こっている復号ＰＣＲにおいて利用され得る）。（Ｂ）において起こる、ＰＣＲに基づくプレ増幅反応において、フォワードプライマー（１４）は、伸長反応産物（１３）の３’末端へハイブリダイズする。フォワードプライマー（１４）は、３’標的特異的部分（１５）およびｚｉｐコードテイル（１６）を含む。フォワードプライマーのｚｉｐコードテイルは、特定のマイクロＲＮＡと結合させられている配列である。従って、工程（Ａ）におけるステムループリバースプライマー（８）中の最初のｚｉｐコード（１０、１２）、および工程（Ｂ）におけるフォワードプライマー中の２番目のｚｉｐコードによって、基礎をなす標的核酸に隣接する２つの別個の領域（これらのそれぞれは、実験者が導入する）を含む、マイクロＲＮＡ配列が、増幅され得る。（Ｂ）における上記ＰＣＲに基づくプレ増幅反応は、さらにリバースプライマー（１７）を含む。上記リバースプライマーは、３’標的特異的部分（１８）およびＴｍ増大テイル（１９）を含む。注意、リバースプライマー（１７）の上記３’標的特異的部分（１８）は、（Ａ）のステムループ逆転写プライマー（１１）のループの配列である。
【００３４】
最終的に、ＰＣＲに基づくプレ増幅に続いて、アリコートが、より低い構成単位の復号ＰＣＲに置かれ得る。例えば、（Ｃ）において、（Ｂ）のＰＣＲに基づくプレ増幅に起因するアンプリコンの鎖が、示されている（２０）。この鎖は、復号ＰＣＲにおいて増幅され得、そして元の標的核酸が定量され得る。（Ｃ）に示されるように、上記ＰＣＲは、フォワードプライマー（１４）およびリバースプライマー（１７）を含み得る。上記プライマーは、上記ＰＣＲに基づくプレ増幅において使用されるフォワードプライマー（１４）およびリバースプライマー（１７）と同じ配列である。（Ｃ）における復号ＰＣＲは、フルオロフォア（Ｆ）およびクエンチャー（Ｑ）を含む検出プローブ（例えば、５’ヌクレアーゼ切断可能なプローブ（２１））を使用して、リアルタイムに分析され得る。上記検出プローブは、（Ａ）におけるステムループリバースプライマー中に導入されたｚｉｐコードにより、特定の増幅された標的核酸に対し高度に特異的であり得る。上記検出プローブは、標的核酸の３’末端領域に相補的な配列、およびステムループ逆転写プライマーの３’ステム領域の、ｚｉｐコード配列と同じ配列を含む。
【００３５】
それゆえ、図４に描写される分子構造により表される論理を応用することで、本教示は、多数の標的マイクロＲＮＡ配列を定量するためのアプローチを提供する。例えば、３３０個の異なったマイクロＲＮＡを増幅および定量するレベルで達成することに成功し、そしてより高度なレベルが、本教示に基づいて可能である。例えば、１０００の目的とする標的を想定し、本教示は、１０００の構成単位の逆転写反応、続いて高度なマルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応を提供する。マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応からのアリコートは、１０００のシングルプレックスのＰＣＲ復号反応に配置され得る。
【００３６】
高い程度の正確さが、それぞれのアンプリコンにコード化される、２つのｚｉｐコードにより達成される。最初、ｚｉｐコードは、個別のｚｉｐコードステムにより、それぞれのステムループリバースプライマーへコード化される。従って、１０００の目的の標的のために、１０００の異なったステムループ逆転写プライマーが使用される。１０００のステムループ逆転写プライマーのそれぞれは、特定の目的の標的を尋ねる３’標的特異的部分を有している。１０００のステムループリバースプライマーそれぞれは、さらに、ステム中に固有のｚｉｐコード配列を有している。そして、１０００のステムループリバースプライマーそれぞれは、ループを有している。上記ループは、１０００のステムループリバースプライマーのすべてに関して同じ配列であり得、それにより、マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応において、単一のリバースプライマーが使用されることを可能にしている。マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応の間、１０００の異なったフォワードプライマーが使用され得る。マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応においては、それぞれのフォワードプライマーは、３’標的特異的部分、および特定の標的核酸と固有に結合するｚｉｐコード配列を含む、５’ｚｉｐコードテイル領域を含み得る。
【００３７】
最後に、１０００の復号シングルプレックスＰＣＲのそれぞれが、逆転写コード化およびマルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応のコード化に由来するアンプリコンの両末端で起こる、ｚｉｐコードの配列情報を利用し得る。シングルプレックスのそれぞれは、逆転写／ＰＣＲに基づくプレ増幅反応において使用される、ｚｉｐコードに対応する一組のプライマーを含み得る。特に、シングルプレックスの復号ＰＣＲのそれぞれは、共通のユニバーサルリバースプライマーおよび固有のフォワードプライマーを有し得る。復号ＰＣＲは、上記標的マイクロＲＮＡに対応する配列、およびステムループリバースプライマーのｚｉｐコードステムに対応する配列を有する検出プローブをさらに含み得る。このようなアプローチは、１０００のシングルプレックスＰＣＲにおいて、１０００のｚｉｐコードプライマーのユニバーサルの組（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｔｔｅｒｙ）が使用されることを可能にし得、従って、冗長性をもつユニバーサルプライマーおよび費用において対応する削減を提供している。本教示のいくつかの実施形態においては、１０００のステムループリバースプライマーのそれぞれが、同じループを含み得る。従って、単一のリバースプライマー配列が、ＰＣＲに基づくプレ増幅反応において使用され得る。さらに、上記同一のリバースプライマー配列が、複数の復号ＰＣＲにおいて使用され得る。そのようなアプローチは、多数の異なった標的を尋ねるために必要とされる異なった分子の数を、最小化する利益を有している。もちろん、必ずしも、単一のユニバーサルリバースプライマーを使用する必要はない。従って、いくつかのステムループリバースプライマーは、これらのループ中において異なった配列を含み得、従って、ＰＣＲに基づくプレ増幅反応において、異なったリバースプライマーの対応する組の使用をもたらす。
【００３８】
マイクロＲＮＡ ｌｅｔ−７ａを尋ねるために有用である、配列の例示的収集物が、図５に示され、これらは、それぞれ、フォワードプライマー、ｌｅｔ−７ａマイクロＲＮＡ、ステムループ逆転写プライマー、検出プローブ、およびリバースプライマーである。
【００３９】
配列番号１：５’ＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴ３’
配列番号２：５’ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ３’
配列番号３：５’ＣＡＴＡＴＣＡＡＣＴＡＣＴＣＣＴＴＴＡＡＣＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＧ３’
配列番号４：５’ＴＴＴＣＣＴＣＡＴＣＡＡＣＴＡＴＡＣ３’
配列番号５：５’ＣＴＣＡＡＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＣＡＡ３’。
【００４０】
（逆転写（ＲＴ）反応のサイクリング）
いくつかの実施形態においては、本教示は、サーマルサイクリングによる増強された逆転写プライマー利用のための方法を提供する。無意識的に制限を意図することなく、本教示のサイクリング方法は、誤ったプライマーの低温での会合を破壊し、そして反復性の相同的なプライマー／ＲＮＡ核形成を可能にする、と考えられており、従って逆転写反応産物量を増加させている。本教示の方法は、ｍｉＲＮＡ逆転写反応において逆転写産物を増加させること、および標的核酸としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ反応において逆転写産物を増加させること、を含むいくらかの状況に応用され得る。
【００４１】
慣習的に、ＲＴ反応は、単一の比較的低温、３７℃〜４２℃で長時間行われる（３０分〜１時間、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，第３版を参照）。一般的に、これらの反応の目標は、例えば、ｍＲＮＡをｃＤＮＡへ転換するポリ（Ｔ）およびランダムプライマーを使用しての、長いｃＤＮＡの生成である。インキュベーションの長時間の間隔は、ＲＴ反応を完了することを可能にし、可能な限り最長のｃＤＮＡ分子を生成すると期待される。本教示によって提供される、２個の関連した考慮は、以下を含む：（１）ＲＮＡ標的が短い、または規定されたｃＤＮＡ産物が短い場合、長いインキュベーション時間は、ポリメラーゼにとって鋳型を逆転写させるために、必ずしも必要ではない。（２）単一の低ハイブリダイゼーション温度は、非相同性会合および内部の鎖の崩壊が、真正のプライミング活性を妨げることを可能にする。
【００４２】
相同性の低温プライマーハイブリダイゼーションの背後の動力学の原理は、複雑で完全には定義されていない。これらの低温では、短い相補的領域は、真正の相補的ハイブリダイゼーションを妨げる、安定した分子内結合および分子間結合を形成し得る。ＲＴ反応において一般的に存在する、プライマーおよび標的ＲＮＡの間の、濃度の大きな差のために、プライマーの小断片のみ、一工程のＲＴ反応で、標的配列へ豊富にアニーリングする。従って、本発明者らは、（１）標的会合から離して、これらのプライマーを解離させる、（２）短い分子内ハイブリダイゼーションを解離させる、および（３）ＲＴプライマーの再ハイブリダイゼーションを可能にするという条件は、過剰な未反応のプライマーに、ＲＴの別の回のためのＲＮＡ標的と反応する別の機会を与え得るとの仮定した。さらに、本発明者らは、これらの条件が逆転写酵素を不活性化させない場合、そのあと、これらの条件の反復は、利用可能な標的ＲＮＡ分子が使い尽くされるまで、ｃＤＮＡの合成を増加させ得るとの仮定した。
【００４３】
原則として、上記プライマーの濃度を、５０〜１００ｎＭから１ｕＭ以上まで増加させることは、生産的なプライマー標的ハイブリダイゼーションの数を増加させると予測されるが、このような条件はまた、特にマルチプレックス反応におけるプライマー対プライマーの相互作用の問題を増加させる。元の未反応プライマーを再利用する手順は、プライマー利用の効率を増加させ、そしてこの故に、ＲＴ反応における産物の量を増加させると仮定した。いくつかのＲＴ酵素は、５０℃、６０℃以上まで安定であり得る、という仮定で、温度サイクリングＲＴ反応（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｙｃｌｉｎｇ ＲＴ ｒｅａｃｔｉｏｎ）のスキームを設計した。
【００４４】
従って、いくつかの実施形態においては、複数の異なった標的ポリヌクレオチドおよび複数の異なった標的特異的ステムループ逆転写プライマーが、サイクリングさせる逆転写反応において使用され、同一の反応容器において、マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応が続く。
【００４５】
（２セグメントでの、ＲＴ反応のサイクリング）
いくつかの実施形態においては、最初の温度（変性温度）は、４７℃〜５３℃であり、そして２番目の温度（アニーリング／伸長温度）は３７℃〜４３℃である。
【００４６】
いくつかの実施形態においては、サイクリング逆転写反応は、最初の温度での１〜５秒間および２番目の温度での４５〜７５秒間を、少なくとも３０サイクル含む。
【００４７】
いくつかの実施形態においては、サイクリング逆転写反応は、最初の温度での１〜５秒間および２番目の温度での２５〜３５秒間を、少なくとも６０サイクル含む。
【００４８】
（３セグメントでの、ＲＴ反応のサイクリング）
いくつかの実施形態においては、サイクリングは、以下の３つのセグメントを含む：低温セグメント、中温セグメント、高温セグメント。制限することを意図することなく、３つのセグメントそれぞれの間に起こる優勢な反応は、次のように考えられ得る：上記低温セグメントは、アニーリングセグメントと考えられ得、上記中温セグメントは、伸長セグメントと考えられ得、そして上記高温セグメントは、変性セグメントと考えられ得る。したがって、いくつかの実施形態においては、サイクリング逆転写反応は、最初１６℃での３０分間のインキュベーションを含み得、これに２０℃での３０秒間、４２℃での３０秒間、および５０℃での１秒間の、６０サイクルが続く。これらの６０サイクルに、逆転写酵素を不活性化する工程、例えば、５分間、温度を８５℃まで上昇させることが続き得る。
【００４９】
いくつかの実施形態においては５０〜７０の間のサイクルであり得る。いくつかの実施形態においては、４０〜８０の間のサイクルであり得る。いくつかの実施形態においては、３０〜１００の間のサイクルであり得る。いくつかの実施形態においては、１００より大きいサイクルであり得る。
【００５０】
いくつかの実施形態においては、上記低温セグメントは１８℃〜２２℃であり得る。いくつかの実施形態においては、上記低温セグメントは１９℃〜２１℃であり得る。いくつかの実施形態においては、上記低温セグメントは１５℃〜２５℃であり得る。
【００５１】
いくつかの実施形態においては、上記低温セグメントは、２５〜３５秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、上記低温セグメントは、２０〜４０秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、上記低温セグメントは、１５〜６０秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、より長い時間は、結果の取得に不必要な遅れを加算し得ることが理解されるが、上記低温セグメントは、６０秒より長く続き得る。
【００５２】
いくつかの実施形態においては、上記中温セグメントは、３７℃〜４５℃であり得る。いくつかの実施形態においては、上記中温セグメントは、３９℃〜４３℃であり得る。
【００５３】
いくつかの実施形態においては、上記中温セグメントは、２５〜３５秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、上記中温セグメントは、２０〜４０秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、上記中温セグメントは、１５〜６０秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、より長い時間は、結果の取得に不必要な遅れを加算し得ることが理解されるが、上記中温セグメントは、６０秒より長く続き得る。
【００５４】
いくつかの実施形態においては、上記高温セグメントは、４８℃〜５５℃であり得る。いくつかの実施形態においては、上記高温セグメントは、４９℃〜５１℃であり得る。いくつかの実施形態においては、より高い温度は、酵素活性を変性させ得および／または消失させ得ることが理解されるが、上記高温セグメントは、５５℃よりも高温であり得る。
【００５５】
いくつかの実施形態においては、上記高温セグメントは、１〜１０秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、上記高温セグメントは、２〜８秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、上記高温セグメントは、１〜５秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、高温でのより長い時間は、酵素活性を変性させ得および／または消失させ得る（特に、より長い時間が用いられた場合）ことが理解されるが、上記高温セグメントは、１０秒より長く続き得る。より長い時間は、結果の取得に不必要な遅れを加算し得ることがさらに理解される。
【００５６】
いくつかの実施形態においては、特に、メッセンジャーＲＮＡのような、より長い核酸が尋ねられる実施形態においては、標的特異的プライマー対は、１００〜１５０ヌクレオチド長の間である標的ポリヌクレオチドの領域を尋ねる。より長い領域が尋ねられた時、一般的にインキュベーション時間は増加し得、そして、そのうえ変性温度は増加し得る。
【００５７】
（キット）
特定の実施形態において、本教示はまた、特定の方法を行うことをはかどらせるために設計されたキットを提供する。いくつかの実施形態においては、キットは、この方法を実行することに使用される２以上の構成要素を集合させることにより、目的の方法を行うことをはかどらせるのに役立つ。いくつかの実施形態においては、キットは、最終消費者による測定のために必要なことを最小にするために、あらかじめ測定した単位量の構成要素を含み得る。いくつかの実施形態においては、キットは、本教示の１以上の方法を行うことのための説明書を含み得る。特定の実施形態において、上記キットの構成要素は、お互いに関連して機能するように最適化されている。
【００５８】
したがって、いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも３００の短い標的核酸を増幅するためのキットを提供する。上記キットは以下を含む；少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーそれぞれが、実質的に同じループ配列を含む、少なくとも３００のステムループ逆転写プライマー；それぞれのフォワードプライマーが、別個の３’標的特異的部分および別個の５’テイルを含む、少なくとも３００のフォワードプライマー；ユニバーサルリバースプライマーの配列が、少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーのループ中に含まれる配列の少なくとも７０パーセントと実質的に同じ配列、およびＴｍ増大テイルを含む、ユニバーサルリバースプライマー。いくつかの実施形態においては、上記キットはさらに、逆転写酵素を含む。いくつかの実施形態においては、上記キットはさらに、ｄＮＴＰを含む。いくつかの実施形態においては、上記キットはさらに、ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態においては、上記キットはさらに、少なくとも３３０のフォワードプライマーのそれぞれ、およびユニバーサルリバースプライマーが、別々のウェル中に配置させられている、マイクロタイタープレートを含む。
【００５９】
本教示は、これらの例示的実施形態によって記載されているが、当業者は、これらの例示的実施形態の多数の変化および改変が、過度の実験をすることなく可能であることを、容易に理解する。そのような変化および改変のすべてが、本教示の範囲内に存在する。本教示の局面は、さらに次の実施例に照らして理解され得、この実施例は、決して本教示の範囲を制限するものとは解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６０】
ヒトの肺および心臓のＲＮＡを、Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．から購入した。Ｌｅｔ−７ａ合成ｍｉＲＮＡを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入可能した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって合成した。
【００６１】
図４および図５は、本実施例中で使用される反応成分構成を描写する。図４中に示されるように、工程ＡおよびＢは、既知ヒトｍｉＲＮＡのうち、ほとんどすべて（３３２組のうち３３０組）に対するＲＴプライマーおよび二番目の鎖の合成プライマーの３３０組を用いるマルチプレックス反応である。工程ＢのＰＣＲは、ｃＤＮＡ産物を増幅し、工程Ｃのために十分な産物を提供する。工程Ｃを、３８４ウェル反応プレートにおける個々のシングルプレックスＴａｑＭａｎ（登録商標）反応として処理し、このマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ反応後の、３３０個のｍｉＲＮＡのそれぞれが豊富なことをモニタリングする。上記リバースステムループＲＴプライマー、フォワードプライマー（二番目の鎖の合成およびプレＰＣＲプライマー）、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブすべてが、ｚｉｐコード化された配列（それぞれのプライミング反応の特異性を増加させるために、それぞれのｍｉＲＮＡに、特異的に割り当てられる）を含むことに注意せよ。この方法によって、ｍｉＲＮＡにおけるわずかな配列の差異でさえ、引き続く反応において増幅される。なぜなら、あらゆるｍｉＲＮＡ配列の差異が、さらなる、特異的なｍｉＲＮＡのｚｉｐコード化される配列によって、ＰＣＲ産物およびリアルタイムＰＣＲ反応において増幅されるからである。また、ユニバーサルリバースプライマーのＴｍを増加させるために、さらなる配列を加えた（本来のステムループＲＴプライマーのループ配列の５’末端へ）。この付加的配列を、Ｔｍ増大テイルと呼ぶ。
【００６２】
（逆転写）
５ｕｌの逆転写反応は、１０倍濃度のｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｉｎｇキットバッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を５ｕｌ、０．３３５ｕｌのＭＭＬＶ逆転写酵素（５０Ｕ／ｕｌ）、１００ｍＭ ｄＮＴＰを０．２５ｕｌ、ＡＢ ＲＮａｓｅ阻害剤２０ｕ／ｕｌを０．０６５ｕｌ、３３０構成単位のリバースステムループプライマー（それぞれ５０ｎＭ）を０．５ｕｌ、ヒト肺精製総ＲＮＡを２ｕｌ、および１．３５ｕｌのＨ２Ｏを含む。反応混合物を、ＲＮＡ試料の２ｕｌを、少なくとも１０反応のための残りの反応成分を含む新たに調製したストック反応混合物の３ｕｌへ加えることにより調製した。上記反応を次のインキュベーション条件を用いて行った：（２０℃／３０秒〜４２℃／３０秒〜５０℃／１秒）６０サイクル。続いて、８５℃で５分間のインキュベーションにより、上記酵素を不活性化した。
【００６３】
（ＰＣＲに基づくプレ増幅）
ＰＣＲに基づくプレ増幅は、２５ｕｌを含んだ。この中に、ＵＮＧを含まない２倍濃度のＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ９Ｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を１２．５ｕｌ、ＲＴ試料を５ｕｌ、３３０構成単位のフォワードプライマー（５００ｎＭ）それぞれを２．５ｕｌ、１００ｕＭのユニバーサルリバースプライマーを１．２５ｕｌ、５ｕ／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）を１．２５ｕｌ、１００ｍＭ ｄＮＴＰを０．５ｕｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２を０．５ｕｌ、および１．５ｕｌのｄＨ２Ｏを含む。反応に関する温度のプロフィールは、Ｔａｑ−ＧＯＬＤ（登録商標）を活性化するための９５℃で１０分間のインキュベーション、５５℃での２分間のインキュベーションを含み、これに、９５℃で１秒間および６５℃で１分間の１８サイクルが続いた。
【００６４】
（リアルタイムＰＣＲ）
ＰＣＲに基づくプレ増幅からの産物の２５ｕｌへ、７５ｕｌのＨ２Ｏを加え、１００ｕｌへ希釈した。それぞれのＴａｑＭａｎ（登録商標）反応についての検出プローブは、５’側にＦａｍおよび３’側にクエンチャーＭＧＢ（マイナーグルーブ結合剤）を含んだ。リアルタイム反応の混合物は、ＵＮＧを含まない２倍濃度のＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を５ｕｌ、５ｕＭのフォワードプライマーと１ｕＭのＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとの混合物を、２ｕｌ、１００ｕＭユニバーサルリバースプライマーを０．１ｕｌ、４倍濃度の希釈したＰＣＲに基づくプレ増幅試料を０．１ｕｌ、および２．８ｕｌのｄＨ２Ｏを含んだ。リアルタイム反応の混合物を、個々のフォワードプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの２ｕｌを、リアルタイムＰＣＲ試薬の残りを含む、新たに調製したストック溶液の８ｕｌへ加えることにより集めた。リアルタイムＰＣＲを、９５℃、１０分間でのホットスタート、続いて９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の、４０サイクルからなる温度管理様式を用いて、３８４ウェル形式におけるＡＢ ７９００ ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍに基づいて行った。それぞれのｍｉＲＮＡに関しての上記リアルタイムＰＣＲを、二連で処理した。
【００６５】
（実施例の結果と考察）
最近（Ｌａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２００６），３４３：８５−８９）、本発明者らは、上記短いｍｉＲＮＡを、はるかに長いステムループプライマーの３’末端に位置していた、短い８ヌクレオチドのプライミングＲＴ配列と、３’末端に上記ｍｉＲＮＡ配列の残りを有するフォワードの、二番目の鎖合成プライマーと５’末端における任意のＴｍ増大配列との間で分配することによって、複数のｍｉＲＮＡの概略を提示し得ることを示した。これらのプライマーを、マルチプレックスな方法でｍｉＲＮＡを逆転写およびＰＣＲ増幅することに使用し、個別のシングルプレックスリアルタイムＰＣＲのための十分な試料を提供し、増幅されたｍｉＲＮＡのそれぞれの相対的濃度を決定した。上記反応は、ＰＣＲに基づくプレ増幅反応の多くのサイクルに関して強固であったが、マルチプレックスのレベルの増加は、総ヒト肺ｍｉＲＮＡの、シングルプレックスプロフィールとマルチプレックスプロフィールとを比較するプロットへ、ばらつき度の増加を加える。ばらつき度を減ずるために、本発明者らは、ｍｉＲＮＡを、４８のｍｉＲＮＡに対するプライマーのマルチプレックス群へ分類した。
【００６６】
本教示は、これに関してはいくつかの新規な特徴、そしてマイクロＲＮＡ定量に対する別のマルチプレックスアプローチを提供する。最初に、複数のリバースプライマーおよびフォワードプライマー、ならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを、３３０構成単位へ増加させた。二番目に、プライマーおよびプローブのそれぞれを、図４および図５に示すように、ｚｉｐコード化した。三番目に、特別の配列を、このプライマーのＴｍを上昇させるために、プレＰＣＲ増幅反応のＵＲ（ユニバーサルリバース）プライマーの５’末端へ加えた。四番目に、プレＰＣＲ増幅サイクル数を、１４から１８へ増加させた。
【００６７】
したがって、図４は、ｍｉＲＮＡをマルチプレックス群へ分割することに関して、本教示にしたがう一つの戦略を示す。この戦略は、単一の群におけるすべてのｍｉＲＮＡのマルチプレックスアッセイを可能にする。図４は、すべてのｍｉＲＮＡに対する上記プライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、それぞれのｍｉＲＮＡに対して特異的な配列によってｚｉｐコード化されていることを示す。これは、上記ＰＣＲに基づくプレ増幅およびリアルタイムＰＣＲのための上記ｍｉＲＮＡプライマーおよびプローブは、実際のｍｉＲＮＡ配列における差異によっては、もはやお互いに違いがないが、加えられたｚｉｐコード化配列のために、大きな差異も有していることを意味する。プライマー設計においての変更は、類似したまたは関連した配列領域（ｔｒａｃｔ）を含むｍｉＲＮＡ配列に由来する、プライマーとプライマーとの相互作用を、大いに減らす。この設計は、いまだ発見されていない新規なｍｉＲＮＡを含む、すべてのｍｉＲＮＡのマルチプレックスプロフィールを可能にすることが予想される。
【００６８】
これらの実験からの結果は、上記ｚｉｐコード化されたプライマー設計は、マルチプレックスのＰＣＲに基づくプレ増幅の多くのサイクルを通して、３３０のｍｉＲＮＡを正確にプレ増幅することを示した。上記マルチプレックスのＰＣＲに基づくプレ増幅反応を、１、５、１０、１４および１８サイクルのＰＣＲの間増幅した。次に、それぞれのｍｉＲＮＡ相対的濃度を、材料および方法に記載されているように、リアルタイムＰＣＲにより決定した。これらのＰＣＲ増幅におけるそれぞれのｍｉＲＮＡに関するＣｔ値での理論上の差異は、１から５まで、５から１０まで、１０から１４まで、および１４から１８までのそれぞれのＰＣＲサイクルにおける増加に対して、４、５、４および４であるはずである。これらの間隔についての平均観察差異は、それぞれ４．１５、５．２９、３．８７および４．２５である。
【００６９】
ｚｉｐコード化されたプライマーのダイナミックレンジを評価するために、総ヒト肺ＲＮＡを、１００ｎｇから１０ｐｇまで希釈し、そして１８サイクルのＰＣＲに基づくプレ増幅を使用する、材料および方法に記載される３３０ｍｉＲＮＡのためのマルチプレックス手法により概略を提示した。それぞれのｍｉＲＮＡの相対的豊富さに対する、総ＲＮＡ試料の大きさの影響をまた分析し、そして、仮定したように用量応答関係を発見した。
【００７０】
これらの実験において、３７は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ’ ＡＢ ７９００ ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍに基づく単一コピー鋳型に関して、予想されるＣｔ値である。しかし、上記ｍｉＲＮＡを１８サイクルのＰＣＲを用いて増幅し、そして続いて４００倍（８．７Ｃｔの損失）に希釈したので、単一コピーＤＮＡの実際のＣｔ値は、２７．７（３７−１８＋８．７）である。ゆえに、このプロトコルの妥当性の評価において、２８未満のＣｔ値を有するデータポイントのみが、意義があると見なされるべきである。それぞれの希釈工程は１０倍希釈であったので、それぞれの希釈間隔（ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｖａｌ）の間のそれぞれのｍｉＲＮＡに関してのＣｔにおける予想された差異は、３．３である。２８未満のＣｔを有するｍｉＲＮＡに関する平均観察差異は、１００ｎｇから１０ｐｇまでの希釈間隔に関して、それぞれほんの、２．９３、３．４０、３．８６および３．９である。予想される平均差異は、それぞれ０．４０、−０．０７、−０．５３および−０．５７のみである。
【００７１】
適切なプライマーおよびプローブのｚｉｐコード化によって、マルチプレックスＰＴ−ＰＣＲに付与されるさらなる特異性に関しての一つの有効な試験は、非常に密接に関連しているｍｉＲＮＡに対する、非ｚｉｐコード化プライマーおよびｚｉｐコード化プライマーの能力の直接比較である。このような密接に関連しているｍｉＲＮＡの群を、ｍｉＲＮＡのｌｅｔ−７ファミリーに見出す。図６は、１００ｐＭの合成ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡと反応させた場合、Ｌａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２００６），３４３：８５−８９の１９０構成単位の非ｚｉｐコード化プライマーおよびプローブの能力と、本教示の３３０構成単位のｚｉｐコード化プライマーおよびプローブの能力とを比較する。ｚｉｐコード化バージョンのためのマルチプレックス化の上記レベルが、偽プライマー（ｓｐｕｒｉｏｕｓ ｐｒｉｍｅｒ）の相互作用の潜在性を増加させる、１４０のさらなるプライマーの組を含むので、上記比較は、特に厳密である。図６は、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの非ｚｉｐ化バージョンが、ｈａｓ−ｌｅｔ−７ａと同じ長さを有する上記ｌｅｔ−７ ｍｉＲＮＡファミリーのすべてのメンバーに対する顕著な交差反応を有しており、そして３’末端の１ヌクレオチドを欠くファミリーのメンバーのみを区別することを示している。他方では、上記ｚｉｐコード化プライマーの組は、ｈａｓ−ｌｅｔ−７ｆに対してのみ交差反応を示し、このｈａｓ−ｌｅｔ−７ｆはフォワードプライマーの３’末端から離れて配置される１塩基のみだけ、ｈａｓ−ｌｅｔ−７ａと異なる。この密接に関連しているファミリーのその他の７メンバーとは交差反応しない。ｚｉｐコード化がマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ反応に付与するさらなる特異性は、単一の細胞内で見出されるＲＮＡ試料に対応する総ＲＮＡ試料の大きさに対しての、単一のマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ反応由来のすべてのｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡプロファイリング（ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）を可能にする。したがって、本教示は、非常に小さな生検および単一細胞（単一の幹細胞を含む）におけるすべての公知のヒトｍｉＲＮＡの概略を提示するための新規な方法、組成物、およびキットを提供する。さらに、本教示は、新規マイクロＲＮＡが発見されるようなマルチプレックスのレベルの増大を可能にするために十分、柔軟でありかつ強固である。
【００７２】
したがって、いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも３００の小核酸のマルチプレックスの定量を提供する。上記実施形態においては、小核酸のそれぞれは、３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも４００の小核酸のマルチプレックスの定量を提供する。上記実施形態においては、小核酸のそれぞれは、３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも５００の小核酸のマルチプレックスの定量を提供する。上記実施形態においては、小核酸のそれぞれは、３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも６００の小核酸のマルチプレックスの定量を提供する。上記実施形態においては、小核酸のそれぞれは、３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも７００の小核酸のマルチプレックスの定量を提供する。上記実施形態においては、小核酸のそれぞれは、３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも８００の小核酸のマルチプレックスの定量を提供する。上記実施形態においては、小核酸のそれぞれは、３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも９００の小核酸のマルチプレックスの定量を提供する。上記実施形態においては、小核酸のそれぞれは、３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも１０００の小核酸のマルチプレックスの定量を提供する。上記実施形態においては、小核酸のそれぞれは、３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態においては、ダイナミックレンジは少なくとも３ ｌｏｇである。いくつかの実施形態においては、ダイナミックレンジは少なくとも４ ｌｏｇである。いくつかの実施形態においては、ダイナミックレンジは少なくとも５ ｌｏｇである。いくつかの実施形態においては、ダイナミックレンジは少なくとも６ ｌｏｇである。いくつかの実施形態においては、ダイナミックレンジは少なくとも７ ｌｏｇである。いくつかの実施形態においては、ダイナミックレンジは少なくとも８ ｌｏｇである。
【００７３】
上記開示された教示は、さまざまな応用、方法、キット、および組成物に関して述べられているが、さまざまな変化および改変が、本明細書の教示および以下の特許請求される発明から逸脱することなく、行われ得ることが理解される。前述の実施例は、開示された教示をよりよく例示するために提供され、そして本明細書に示される教示の範囲を制限するとは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、本教示のいくつかの実施形態にしたがう様々な構成の特定の局面を描写する。
【図２】図２は、本教示のいくつかの実施形態にしたがう一つの作業の流れを描写する。
【図３】図３は、本教示のいくつかの実施形態にしたがう様々な構成の特定の局面を描写する。
【図４】図４は、本教示のいくつかの実施形態にしたがう様々な構成の特定の局面を描写する。
【図５】図５は、本教示のいくつかの実施形態にしたがう様々な構成の特定の局面を描写する。
【図６】図６は、本教示のいくつかの実施形態にしたがうＣｔ値の形態における例示的データ（ｄａｔｅ）を描写する。
【技術分野】
【０００１】
（分野）
本教示は、分子および細胞生物学の分野、特に短い核酸（例えば、マイクロＲＮＡ）のマルチプレックス増幅の分野中に存在する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
分子生物学における非常に多くの分野は、標的ポリヌクレオチド配列の同定を必要とする。逆転写および増幅は、標的ポリヌクレオチドの正体を尋ねるため（ｑｕｅｒｙ）に用いられる、二つの頻繁に使用される手順である。ポストゲノミクス（ｐｏｓｔ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ）時代において、科学者に利用可能な配列情報の量の増加は、複雑な核酸試料を尋ねるために、迅速な、信頼性のある、低コストで、高スループットであり、感度の高く、かつ正確な方法のための、増加した必要性を生み出した。細胞を規定および特徴付ける方法は、強固な増幅技術、および慣習的に分析された分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡ）の分子の複雑さによって妨げられている。マイクロＲＮＡは、細胞機能の理解において顕著な見込みを提供する、最近発見された分子クラスである。しかしながら、マイクロＲＮＡの定量的分析は、これらの比較的短いサイズにより、妨げられている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（要旨）
いくつかの実施形態においては、本教示は、短い標的核酸のそれぞれが１８〜３０ヌクレオチド長である、少なくとも３００の異なる短い標的核酸を定量する方法を提供し、上記方法は、以下、上記少なくとも３００の異なる短い標的核酸と、少なくとも３００の異なる標的特異的ステムループ逆転写プライマーとを接触させる工程であって、ここで、上記少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーのそれぞれが、独特の３’標的特異的部分、独特のｚｉｐコード化ステム、およびループを含む、工程；上記少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーを、逆転写反応において伸長させ、逆転写産物の収集物を形成する工程；ＰＣＲに基づくプレ増幅産物の収集物を形成するために、逆転写産物の収集物に対し、ＰＣＲに基づくプレ増幅を行う工程であって、ここで上記ＰＣＲに基づくプレ増幅が、少なくとも３００の異なるフォワードプライマーおよび少なくとも一つのリバースプライマーを含み、ここで上記リバースプライマーの配列が、少なくとも一つのステムループ逆転写プライマーのループと実質的に同じ配列、およびＴｍ増大テイルを含む、工程；（この工程においては、少なくとも３００の異なるフォワードプライマーのそれぞれが、ｉ）特定の逆転写産物の配列の５’末端に相補的である３’標的特異的部分、およびｉｉ）特定の逆転写産物の配列に独特である５’ｚｉｐコードテイルを含む）；そして、ＰＣＲに基づくプレ増幅産物の収集物を、少なくとも３００の異なる反応容器へ分割する工程；上記少なくとも３００の異なる反応容器において復号ＰＣＲを行う工程であって、ここでそれぞれの復号ＰＣＲは、特定の標的核酸配列のための上記ＰＣＲに基づくプレ増幅反応におけるフォワードプライマーと実質的に同じ配列を含むフォワードプライマー、リバースプライマー、および検出プローブを含み、ここで上記検出プローブの配列は、ｉ）特定のステムループ逆転写プライマーの３’ステム領域と同じである、少なくとも６核酸塩基の配列、およびｉｉ）特定のステムループ逆転写プライマーにより尋ねられる短い標的核酸に相補的である、少なくとも６核酸塩基の配列を含む、工程；上記少なくとも３００の異なる反応容器において、検出プローブを検出する工程；ならびに、上記少なくとも３００の異なる短い標的核酸を定量する工程を包含する。
【０００４】
当業者は、以下に記載の図面が、例示的目的にすぎないことを理解する。図面は、決して、本教示の範囲を制限するとは意図されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
（例示的な実施形態の記述）
本教示の局面は、以下の実施例を考慮してさらに理解され得る（あらゆる方法において、本教示の範囲は限定的に解釈されるべきではない）。本明細書で使用されるセクションの表題は、単に構成的目的のためであり、そしていかなる方法においても記述された主題を限定するとは解釈されない。本出願に引用されるすべての文献および類似の資料（特許、特許出願、記事、書籍、論文、およびインターネットのウエブページが挙げられるが、これらには限定されない）は、あらゆる目的のためにそれらの全体が、参考として明示的に援用される。援用された参考文献中の用語の定義が、本教示中に規定された定義と異なっている場合、本教示中の定義が統制する。わずかなそして実質のない偏差が、本明細書の教示の範囲内であるように、本教示中において、論議される温度、濃度、時間、などの前の含意された「約」が存在することが理解される。本出願において、別に具体的に述べられない限り、単数形の使用は複数形を含む。例えば、「プライマー」は、１より多いプライマーが、存在し得る（しかし存在する必要はない）ということを意味する；例えば、１コピー以上の特定のプライマー種のおよび１様式以上の特異的プライマー型（しかしこれらに制限されない）、例えば、複数の異なったフォーワードプライマー（しかしこれらに制限されない）。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む」（ｃｏｎｔａｉｎｓ）、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、制限を意図しない。前述の一般的な記述および次の詳細な記述の両方は、単に例示的および説明的であり、そして本発明の制限とはならないことを理解すべきである。
【０００６】
（いくつかの定義）
本明細書中で使用される、用語「標的核酸」は、増幅および／または定量されることが求められるポリヌクレオチド配列を指す。上記標的ポリヌクレオチドは、あらゆる供給源から獲得し得、そしてかなり多数の異なった組成の構成部分を含み得る。例えば、上記標的は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、ｓｉＲＮＡであり得、そして核酸アナログまたは他の核酸模倣物（ｍｉｍｉｃ）を含み得る（一般的には、上記標的は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および／またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であるが）。上記標的は、メチル化され得るか、メチル化され得ないか、またはその両方をされ得る。上記標的は、ウラシルへ変換される、亜硫酸水素塩処理され、かつメチル化されていないシトシンであり得る。さらに、「標的ポリヌクレオチド」は、標的ポリヌクレオチドそのもの、およびその代用物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）（例えば、増幅産物）、ならびに本来の配列を指し得ることが理解される。いくつかの実施形態において、上記標的ポリヌクレオチドは、減成された供給源由来の短いＤＮＡ分子であり、このような標的ヌクレオチドは、例えば、法医学試料（例えば、Ｂｕｔｌｅｒ，２００１，Ｆｏｒｅｎｓｉｃ ＤＮＡ Ｔｙｐｉｎｇ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｅｈｉｎｄ ＳＴＲ Ｍａｒｋｅｒｓを参照のこと）（しかし、これらには制限されない）に存在し得る。本教示の標的ポリヌクレオチドは、任意の多数の供給源（限定するものではないが、ウイルス、原核生物、真核生物（例えば、植物、真菌、および動物（しかしこれらに制限されない））が挙げられる）に由来し得る。これらの供給源として、全血、組織バイオプシー、リンパ、骨髄、羊水、毛、皮膚、精液、生物戦争用薬品（ｂｉｏｗａｒｆａｒｅ ａｇｅｎｔ）、肛門分泌、膣分泌、発汗、唾液、頬側スワブ、種々の環境試料（例えば、農業、水、および土壌の試料）、一般的な研究試料、一般的な精製試料、培養細胞、溶解させた細胞を含み得るが、これらに制限されない。標的ポリヌクレオチドは、当該技術分野において公知である任意のいろいろな手順（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ，およびＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ６７００ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ、Ｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２３４，８０９号，ｍｉｒＶａｎａ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）、など）を使用し、試料から単離され得ることが理解される。標的ポリヌクレオチドは、分析より前に、切断または剪断され得る（機械的な力、超音波処理、制限エンドヌクレアーゼ切断、または当該技術分野で任意の公知の方法、のような手順の使用が挙げられる）ことが理解される。いくつかの実施形態においては、標的ポリヌクレオチドは二重鎖であり得、そして一本鎖は変性に起因し得るが、一般に、本教示の標的ポリヌクレオチドは一本鎖である。
【０００７】
本明細書で使用される、用語「逆転写反応」は、伸長反応を指し、ここでは、ステムループプライマーの３’標的特異的部分は、伸長反応産物（標的ポリヌクレオチドに相補的な鎖を含む）を形成するために伸長させられる。いくつかの実施形態においては、標的ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ分子であり、そして伸長反応は、逆転写酵素を含む逆転写反応である（ここでは、ステムループプライマーの３’末端が伸長させられる）。いくつかの実施形態においては、伸長反応は、真正細菌目の細菌由来のポリメラーゼを含む逆転写反応である。いくつかの実施形態においては、伸長反応は、ｒＴｔｈポリメラーゼ（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号Ｎ８０８−０１９２、およびＮ８０８−００９８として市販されている）を含み得る。いくつかの実施形態においては、上記標的ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡ分子であり、そして逆転写特性をまた含むポリメラーゼの使用が、最初の逆転写反応をさせ得、その後、同一の反応容器中においての、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉ−ｐｌｅｘｅｄ）ＰＣＲに基づくプレ増幅（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のような、増幅反応が続く。この方法により１つの反応容器中で２つの反応を統合させる。いくつかの実施形態においては、上記標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子であり、ならびに上記伸長反応は、ポリメラーゼを含みそしてＤＮＡの相補鎖の合成に終わる。用語、逆転写はまた、鋳型ＤＮＡ分子のＤＮＡ相補鎖（ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の合成を含む。同様に、逆転写産物は、逆転写反応において合成されるＤＮＡ分子であり得、したがって、このＤＮＡ分子は、上記鋳型へ相補的である。
【０００８】
本明細書で使用される、用語「リバースプライマー」は、逆転写反応のような反応において伸長される場合に、相補鎖を形成するプライマーをいう。伸長反応に続いて、フォワードプライマーは、合成鎖にハイブリダイズし得、そして伸長され得る。いくつかの実施形態においては、ステムループ逆転写プライマーは、逆転写反応において最初のリバースプライマーとして作用する。その後は、ステムループプライマーによりコード化された２番目のリバースプライマーが用いられ得、そして２番目のリバースプライマーは、フォワードプライマーの伸長から生じる鎖にハイブリダイズし得る。多くのステムループ逆転写プライマーが、同一の配列または実質的に同一の配列をそのループ中に含む実施形態においては、ＰＣＲに基づく、プレ増幅反応において使用される逆転写プライマーを、ユニバーサルリバースプライマーと呼ぶ。このユニバーサルリバースプライマーは、一般的にループ配列およびＴｍ増大テイル（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔａｉｌ）を含む。
【０００９】
本明細書で使用される、用語「ハイブリダイゼーション」は、一つの核酸と別の核酸との、相補塩基対の相互作用をいい、これが、二本鎖ＤＮＡ分子、三本鎖ＤＮＡ分子（ｔｒｉｐｌｅｘ）、または他の高度に規則正しい構造の形成をもたらし、そして、本明細書においては、「アニーリング」と交換可能に使用される。一般的には、ワトソン／クリック型およびフーグスティーン型の水素結合により、一次的な相互作用は塩基特異的である。（例えば、Ａ／ＴおよびＧ／Ｃ）。塩基スタッキングおよび疎水性の相互作用はまた、二本鎖ＤＮＡ分子の安定性に貢献し得る。相補的および実質上相補的な標的配列へのプライマーをハイブリダイズさせるための条件は周知であり、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）ならびにＪ．ＷｅｔｍｕｒおよびＮ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９以下参照（１９６８）に記載されている。一般的に、そのようなアニーリングが起こるかどうかは、数あるなかで、上記ポリヌクレオチドおよび上記相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）の長さ、ｐＨ、温度、一価のまたは二価の陽イオン、ハイブリダイズする領域におけるＧおよびＣヌクレオチドの割合、媒体の粘性、および変性剤の存在によって影響される。そのような変項は、ハイブリダイゼーションに必要な時間に影響する。従って、好ましいアニーリング条件は、特定の応用に依存している。そのような条件は、しかしながら、過度の実験をすることなしに当業者によってごく普通に決定され得る。相補性は、完全である必要はなく；標的配列と、本教示の一本鎖核酸との間でのハイブリダイゼーションを最小限妨げる、少数の不適正塩基対があり得ることが理解される。しかしながら、最低限にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションが起こり得ないほど不適正塩基対の数が多い場合、この配列は、一般的に、相補的標的配列ではない。このように、本明細書において、相補性とは、プライマーが、本教示の目的を達成するために、選択された反応条件の下で、ハイブリダイズする標的配列に十分に相補的であることを意味している。
【００１０】
本明細書で使用される、用語「増幅する」は、標的ポリヌクレオチドおよび／または標的ポリヌクレオチド代用物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）の少なくとも一部が複製される任意の手段を指し、一般的には、鋳型依存性の様式によって、線形的または指数関数的のいずれかにより、核酸配列を増幅するための広範囲な技術を含んでいる（しかし、これらに制限されない）。いくつかの実施形態においては、例えば、米国特許第６，１５３，４２５号および同第６，６４９，３７８号中に記載されているように、試料の調製および検出を含む独立した統合されたアプローチによって、増幅は達成され得る。核酸の増幅は、可逆的に改変した酵素、例えば米国特許第５，７７３，２５８号に記載の酵素（しかし、これに制限されない）を使用し得る。本教示はまた、様々なウラシルに基づく除染戦略を企図する。ここで、例えば、ウラシルは増幅反応に組み込まれ得、そして続いて様々なグリコシラーゼ処理（例えば、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，５３６，６４９号、および米国非仮出願特許出願第１１／１７３，１１２号を参照のこと）で、繰越し汚染産物が取り除かれ得る。当業者は、所望の酵素活性を有する任意のタンパク質が、開示された方法およびキット中で使用され得ることを理解する。逆転写酵素、ウラシルＮ−グリコシラーゼなどを含む、ＤＮＡポリメラーゼの記載を、他の場所の中、Ｔｗｙｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９；Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｇｕｉｄｅ，ｒｅｖ．０９２２９８，Ｐｒｏｍｅｇａ，１９９８；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃｓ；およびＡｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌで見い出し得る。
【００１１】
本明細書で使用される、用語「一致する」は、用語が指す要素間の、特定の関係を指す。一致する、のいくつかの例は以下を含む（しかし、これらに制限されない）：リバースプライマーは、標的核酸と一致し得、同様に標的核酸は、リバースプライマーと一致し得る。フォワードプライマーは、標的核酸に一致し得、同様に標的核酸は、フォワードプライマーに一致し得る。
【００１２】
本明細書で使用される、用語「反応容器」は一般的に、その中で、本教示にしたがう反応が起こり得る任意の容器を指す。いくつかの実施形態においては、反応容器は、エッペンドルフチューブであり得、そして現代の分子生物学の研究室での通常の実施における別の種類の容器であり得る。いくつかの実施形態においては、反応容器は、マイクロタイタープレート中のウエル、ガラススライド上のスポット、またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（以前は、ＭｉｃｒｏＣａｒｄＴＭ）中のウェルであり得る。例えば、多数の反応容器が、同一の支持体に存在する。いくつかの実施形態においては、例えばＣａｌｉｐｅｒおよびＦｌｕｉｄｉｇｍから市販されているラボオンチップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）様装置は、反応容器を提供し得る。いくつかの実施形態においては、Ｗｅｎｚ ｅｔ ａｌ．の米国本特許出願第１１／０５９，８２４号に記載のように、様々なマイクロ流体アプローチが用いられ得る。様々な反応容器が当該技術分野において利用可能であり、そして本教示の文脈において使用され得ることを認める。
【００１３】
本明細書で使用される、用語「ＰＣＲに基づくプレ増幅」は、複数のプライマーの組がマルチプレックスＰＣＲ増幅反応に含まれ、かつ、上記ＰＣＲに基づくプレ増幅反応が、ＰＣＲプラトーおよび／または試薬の枯渇より先に終結するように、上記マルチプレックス増幅反応が制限されたサイクル数を受ける、プロセスを指す。用語「ＰＣＲに基づくプレ増幅」は、ＰＣＲに基づくプレ増幅反応よりも、一般的により低い構成単位（ｌｏｗｅｒ−ｐｌｅｘｙ）のレベルで２番目の増幅反応が、続いて行われることを示すと考えられ得る。この２番目の増幅反応、一般的に複数の別々の２番目の増幅反応は、マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応中で使用されるプライマーによってコード化されるプライマーの組を使用し得る。しかしながら、２番目の増幅反応それぞれは、一般的に、１つまたは数個のプライマーの組を含む。ＰＣＲに基づくプレ増幅アプローチの例が、例えば、Ｘｔｒａｎａの米国特許第６，６０５，４５１号、およびＡｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願第１０／７２３，５２０号中に見い出され得る。
【００１４】
本明細書で使用される、用語「検出」は、標的ポリヌクレオチドの、存在および／または量および／または同一性を決定する、任意の様々な方法を指す。ドナー部分およびシグナル部分を使用するいくつかの実施形態においては、特定のエネルギーを移動させる蛍光色素を使用し得る。特定の、制限することにならない、例示的な、ドナー（ドナー部分）およびアクセプター（シグナル部分）の組は、例えば、米国特許番号第５，８６３，７２７号；同５，８００，９９６号；および同５，９４５，５２６号中に例示されている。ドナーおよびアクセプターのいくつかの組み合わせの使用は、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）と呼ばれる。いくつかの実施形態においては、シグナリングプローブ（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）として使用され得るフルオロフォアとして、ローダミン、シアニン３（Ｃｙ ３）、シアニン５（Ｃｙ ５）、フルオレセイン、ＶｉｃＴＭ、ＬｉｚＴＭ、ＴａｍｒａＴＭ、５−ＦａｍＴＭ、６−ＦａｍＴＭ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）が挙げられる（しかし、これらに制限されない）。（ＶｉｃＴＭ、ＬｉｚＴＭ、ＴａｍｒａＴＭ、５−ＦａｍＴＭ、６−ＦａｍＴＭ（すべてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから購入可能である））。いくつかの実施形態においては、励起された光に応じて蛍光シグナルを与える検出プローブの量は、一般的に、増幅反応において産出される核酸の量と関連がある。従って、いくつかの実施形態においては、蛍光シグナルの量は、増幅反応において生成される産物の量と関連がある。このような実施形態においては、ゆえに、蛍光指示薬から蛍光シグナルの強度を測定することにより、増幅産物の量を測定し得る。いくつかの実施形態により、蛍光シグナルにより示される増幅産物を定量するための内部標準を使用し得る。例えば、米国特許第５，７３６，３３３号を参照のこと。蛍光指示薬を含んでいる組成物を用いるサーマルサイクリング反応を実行し得、特定波長の光線を放射し得、蛍光色素の強度を読み取る、そして、それぞれのサイクル後、蛍光の強度を表示し得る装置が開発された。サーマルサイクラー、光線放射器、および蛍光シグナル検出器を備える装置は、例えば、米国特許第５，９２８，９０７号；同第６，０１５，６７４号；および同第６，１７４，６７０号に記載されており、そしてこのような装置としては、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００ ｓｅｑｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００ ｓｅｑｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）７３００ ｓｅｑｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、およびＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）７５００ ｓｅｑｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が挙げられるが、これらには制限されない。いくつかの実施形態においては、これらの機能のそれぞれは、別々の装置によって実行され得る。例えば、もし、増幅のためＱ−ベータレプリカーゼ反応を使用する場合、この反応はサーマルサイクラーにおいては起こり得ないが、特定波長で放射される光線、蛍光シグナルの検出、ならびに増幅産物の量の計算および表示を含み得る。いくつかの実施形態においては、組み合わせたサーマルサイクリングおよび蛍光検出装置が、試料中の標的の核酸配列の正確な定量のために用いられ得る。いくつかの実施形態においては、蛍光シグナルは、１以上のサーマルサイクルの間および／または後に、検出および表示され得、従って、反応が「リアルタイム」に起こっている時、増幅産物のモニタリングを可能にする。いくつかの実施形態においては、増幅前の試料中にどれだけの標的核酸配列が存在するか見積もるための、増幅産物の量および増幅サイクルの数を使用し得る。いくつかの実施形態においては、試料中の標的核酸配列の存在を示すために十分な、所定のサイクル数の後、増幅産物の量を単にモニタリングし得る。当業者は、任意の与えられた試料型、プライマー配列および反応条件について、与えられた標的ポリヌクレオチドの存在を決定するため、何サイクルが十分かを簡単に決定し得る。本明細書において使用されるように、標的の存在を決定することは、標的を同定し、そして必要に応じて標的を定量化することを含み得る。いくつかの実施形態においては、増幅産物は、与えられたサイクル数が完了するや否や、陽性または陰性として記録され得る。いくつかの実施形態においては、この結果は、電子的に直接データベースへ伝達され得、作表され得る。従って、いくつかの実施形態においては、このような機械が使用された場合、たくさんの試料が、より少ない時間および労力で処理されそして分析され得る。いくつかの実施形態においては、異なる検出プローブは、異なる標的ポリヌクレオチド間を、識別し得る。このようなプローブの制限されない例として、５’−ヌクレアーゼ蛍光プロープ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ分子）が挙げられる。ここでは、蛍光分子が、オリゴヌクレオチド結合要素を介して、蛍光消光分子に結びつけられている。いくつかの実施形態においては、５’−ヌクレアーゼ蛍光プロープのオリゴヌクレオチド結合要素（ｌｉｎｋ ｅｌｅｍｅｎｔ）は、同定する部分またはこの相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の特定の配列に結合する。いくつかの実施形態においては、それぞれが異なる波長において蛍光を発する、異なる５’−ヌクレアーゼ蛍光プロープは、同じ増幅反応内における異なる増幅産物間を識別し得る。例えば、いくつかの実施形態においては、２つの異なる波長（ＷＬＡおよびＷＬＢ）において蛍光を発し、かつ２つの異なる伸長反応産物（Ａ’およびＢ’のそれぞれ）の２つの異なる領域に特異的である、２つの異なる５’−ヌクレアーゼ蛍光プロープを使用し得る。増幅産物Ａ’は、標的ポリヌクレオチドＡが試料内に存在する場合に形成され、そして増幅産物Ｂ’は、標的ポリヌクレオチドＢが試料内に存在する場合に形成される。いくつかの実施形態においては、増幅産物Ａ’および／または増幅産物Ｂ’は、たとえ適切な標的ポリヌクレオチドが試料中に存在しなくても形成し得るが、このようなことは、上記適切な標的ポリヌクレオチドが試料中に存在する場合よりも、はっきりと、より少ない程度で起こる。増幅後、どの特定の標的核酸配列が試料中に存在しているか、検出されたシグナルの波長およびシグナルの強度に基づいて、決定し得る。従って、適切かつ検出可能な、波長ＷＬＡのみのシグナル値が検出された場合、上記試料は、標的ポリヌクレオチドＡを含むが、標的ポリヌクレオチドＢを含まないことがわかる。適切かつ検出可能な、波長ＷＬＡおよびＷＬＢのシグナル値が検出された場合、上記試料は、標的ポリヌクレオチドＡおよび標的ポリヌクレオチドＢの両方を含むことがわかる。いくつかの実施形態においては、検出は、様々なマイクロアレイおよび関連ソフトウェア、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ １７００ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを備えるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、および数あるなかでＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ａｇｉｌｅｎｔ，ＩｌｌｕｍｉｎａおよびＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから利用可能な、別の市販アレイシステム（Ｇｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：２５１−６２，１９９９；Ｄｅ Ｂｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｎｅｒｖａ Ｂｉｏｔｅｃ １４：２４７−５２，２００２；およびＳｔｅａｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１４０−４５、増刊号を含む、２００３をまた参照のこと）により達成され得る。検出は、反応産物に組み込まれている（標識されたプライマーの一部としてかまたは増幅の間の標識されたｄＮＴＰの組み込みのおかげのいずれか）レポーター基（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｒｏｕｐ）、あるいは反応産物へ付着させられている（例えば非限定例として、レポーター基を含むハイブリダイゼーションタグ相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を媒介して、または反応産物に統合もしくは付着させたリンカーアーム（ｌｉｎｋｅｒ ａｒｍ）を媒介して）レポーター基を含み得る、ということがまた理解される。例えば、質量分析を使用する、非標識化反応産物の検出はまた、本教示の範囲内にある。
【００１５】
本明細書で使用される、用語「検出プローブ」は、一般的に、定量的またはリアルタイムＰＣＲ分析ならびに終点分析のための、増幅反応において使用される分子を指す。このような検出プローブは、標的マイクロＲＮＡ、ならびに／あるいは内因性のコントロール小核酸および／または合成の内部コントロールのような核酸コントロールの増幅をモニタリングするために使用され得る。いくつかの実施形態においては、増幅反応に存在する検出プローブは、時間の関数として生成されるアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）（単数および複数）の量をモニタリングするのに適当である。このような検出プローブの限定されない例としては、５’−エキソヌクレアーゼアッセイ（本明細書に記載の、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（米国特許第５，５３８，８４８号をまた参照のこと））、様々なステムループ分子ビーコン（例えば、米国特許第６，１０３，４７６号および第５，９２５，５１７号ならびにＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３−３０８を参照のこと）、ステムレス（ｓｔｅｍｌｅｓｓ）または線形ビーコン（例えば、ＷＯ第９９／２１８８１号を参照のこと）、ＰＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｅａｃｏｎｓＴＭ（例えば、米国特許第６，３５５，４２１号および第６，５９３，０９１号を参照のこと）、線形ＰＮＡビーコン（例えば、Ｋｕｂｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＳＰＩＥ ４２６４：５３−５８を参照のこと）、非ＦＲＥＴプローブ（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号を参照のこと）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（登録商標）／Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（登録商標）プローブ（米国特許第６，５４８，２５０号）、ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ ａｎｄ ｄｕｐｌｅｘ ＳｃｏｒｐｉｏｎＴＭプローブ（Ｓｏｌｉｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９：Ｅ９６および米国特許第６，５８９，７４３号）、湾曲（ｂｕｌｇｅ）ループプローブ（米国特許第６，５９０，０９１号）、シュードノット（ｐｓｅｕｄｏ ｋｎｏｔ）プロープ（米国特許第６，５８９，２５０号）、ｃｙｃｌｉｃｏｎｓ（米国特許第６，３８３，７５２号）、ＭＧＢ ＥｃｌｉｐｓｅＴＭプローブ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヘアピンプローブ（米国特許第６，５９６，４９０号）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ライトアップ（ｌｉｇｈｔ−ｕｐ）プローブ、自己集合したナノ粒子プローブ、および、例えば、米国特許第６，４８５，９０１号；Ｍｈｌａｎｇａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４６３−４７１；Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１７：８０４−８０７；Ｉｓａｃｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ．１４：３２１−３２８；Ｓｖａｎｖｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８１：２６−３５；Ｗｏｌｆｆｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７６６：７６９−７７１；Ｔｓｏｕｒｋａｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３０：４２０８−４２１５；Ｒｉｃｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：４０８８−４０９３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｓｈａｎｇｈａｉ．３４：３２９−３３２；Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９６０６−９６１２；Ｂｒｏｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：２４９−５６；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１５：１１８−１２６；およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ １４：１１１５５−１１１６１に記載されているフェロセン−改変プローブが挙げられる。検出プローブはまた、クエンチャー（例えば、ブラックホールクエンチャー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、アイオワブラック（Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ）（ＩＤＴ）、ＱＳＹクエンチャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、およびＤａｂｓｙｌおよびＤａｂｃｅｌスルホネート／カルボキシレートクエンチャー（Ｅｐｏｃｈ）などが挙げられるが、これらに制限されない）を含み得る。検出プローブはまた、２つのプローブを含み得る。ここでは、例えば、蛍光体（ｆｌｕｏｒ）は１つのプローブ上に存在し、クエンチャーはもう一方のプローブ上に存在しており、標的上での２つのプローブ一緒のハイブリダイゼーションは、シグナルを消光し、または標的上でのハイブリダイゼーションは、蛍光の変化を通して、シグナルのサインを変える。一方の分子がＬ−ＤＮＡであり、もう一方の分子がＰＮＡである、２つのプローブを含む例示的検出プローブは、Ｌａｏ ｅｔ ａｌ．の米国非仮特許出願第１１／１７２，２８０号中で見出され得る。検出プローブはまた、カルボキシレート基の代わりにＳＯ３を有しているフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｉｎ）色素のスルホネート誘導体、フルオレセインのホスホロアミダイト体、ＣＹ５のホスホロアミダイト体（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍから市販されている）を含み得る。いくつかの実施形態においては、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、およびＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）のような挿入標識が使用され、これによって、検出プローブの非存在下において増幅産物の、リアルタイムでのまたは終点での可視化を可能にしている。いくつかの実施形態においては、挿入検出プローブおよび配列に基づいた検出プローブの両方を含み得る、リアルタイムの可視化が使用され得る。いくつかの実施形態においては、上記検出プローブは、増幅反応において相補的配列にハイブリダイズしなかった場合、少なくとも部分的に消光させられ、そして増幅反応において相補的配列にハイブリダイズした場合、少なくとも部分的に消光させない。いくつかの実施形態においては、プローブはさらに、所望の熱力学特性をさらに提供するため、多様な改変（例えば、マイナーグルーブ（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）結合剤）を含み得る（例えば、米国特許第６，４８６，３０８号を参照のこと）。いくつかの実施形態においては、検出プローブは、ステムループ逆転写プライマーによって導入されたｚｉｐコードに対応し得る。
【００１６】
いくつかの実施形態においては、上記検出プローブは、ｉ）上記ステムループリバースプライマーの３’ステム領域と同一である核酸塩基少なくとも６個の配列、およびｉｉ）標的核酸に相補的である核酸塩基少なくとも６個の配列を含む。いくつかの実施形態においては、上記検出プローブは、ｉ）上記ステムループリバースプライマーの３’ステム領域と同一である核酸塩基少なくとも７個の配列、およびｉｉ）標的核酸に相補的である核酸塩基少なくとも７個の配列を含む。いくつかの実施形態においては、上記検出プローブは、ｉ）上記ステムループリバースプライマーの３’ステム領域と同一である核酸塩基少なくとも８個の配列、およびｉｉ）標的核酸に相補的である核酸塩基少なくとも８個の配列を含む。当然、８より大きい長さが使用され得る。一般的に、核酸塩基５個よりも小さい長さは、認められない、というのは核酸塩基５個よりも小さい長さは、非特異的相互作用を導くからである。検出プローブは、ｉ）上記ステムループリバースプライマーの３’ステム領域と同一である核酸塩基少なくともＸ個の配列、およびｉｉ）標的核酸に相補的である核酸塩基少なくともＹ個の配列を含み得、ここでＸおよびＹは異なる数である、ということがまた、理解される。
【００１７】
本明細書で使用される、用語「ステムループプライマー」は、３’標的特異的部分、ステム、ループを含む分子を指す。例示的ステムループプライマーは、図１、本教示中の他の場所にも、そしてＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願第１０／９４７，４６０号において描写される。用語「３’標的特異的部分」は、標的マイクロＲＮＡまたは内因性コントロール小ＲＮＡのような標的ポリヌクレオチドへ相補的な、ステムループプライマーの一本鎖部分を指す。上記３’標的特異的部分は、ステムループプライマーのステムから下流に位置している。一般的に、３’標的特異的部分は、６個から９個の間の長さのヌクレオチドである。いくつかの実施形態においては、上記３’標的特異的部分は７ヌクレオチド長である。ごく普通の実験で、別の長さを生成し得ること、そして８ヌクレオチドより長い、または６ヌクレオチドより短い、３’標的特異的部分がまた、本教示により予期されることが理解される。一般的に、３’標的特異的部分の３’末端に近いヌクレオチドは、フォワードプライマーの３’ヌクレオチドと、最小限の相補性重複部分を有するか、または少しも重複部分を有しない；これらの領域の重複部分が、続いて起こる増幅反応における、所望されないプライマー二量体の増幅産物を、生成し得ることが理解される。いくつかの実施形態においては、３’標的特異的部分の３’末端に近いヌクレオチドおよびフォワードプライマーの３’ヌクレオチドとの間の重複部分は、０、１、２、または３個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態においては、３より大きいヌクレオチドが、３’標的特異的部分の３’末端に近いヌクレオチドとフォワードプライマーの３’ヌクレオチドとの間で相補的であり得るが、一般的にこのようなシナリオには、この中に散在させられた、さらなる非相補的ヌクレオチドが付随する。いくつかの実施形態においては、ＬＮＡのような改変された塩基が、ステムループプライマーのＴｍを増加させるために、３’標的特異的部分において使用され得る（例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００３），２１：２：７４−８１を参照）。いくつかの実施形態においては、ユニバーサル塩基が、例えば、ステムループプライマーのより小さいライブラリーを可能にするために、使用され得る。いくつかの実施形態においては、ＬＮＡおよびユニバーサル塩基を含むが、これらに制限されない改変は、逆転写の特異性を改善し得、そして潜在的に検出特異性を高め得る。用語「ステム」は、３’標的特異的部分およびループの間に存在する、ステムループプライマーの二重鎖領域を指し、そして以下により十分に論議される。用語「ループ」は、例えば、図１に描写されているように、ステムの２つの相補的鎖の間に配置されている、ステムループプライマーの領域を指す。一般的に、改変ＤＮＡまたは改変ＲＮＡ、炭素スペーサー（Ｃａｒｂｏｎ ｓｐａｃｅｒ）（例えば、Ｃ１８）、および／またはＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を含む別の部分も可能だが、上記ループは、一本鎖ヌクレオチドを含む。一般的に、上記ループは、４から３０の間のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態においては、上記ループは、１４から１８の間のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態においては、上記ループは、１６ヌクレオチド長である。当業者は、４ヌクレオチドより短いループおよび２０ヌクレオチドより長いループは、ごく普通の方法論の過程において、そして過度な実験をすることなしに、同定され得ること、ならびにこのようなより短いおよびより長いループは、本教示により予期されることを理解する。いくつかの実施形態においては、上記ループは、「ｚｉｐコード」としてまた公知である同定部分を含み得る。
【００１８】
本明細書において使用される、用語「ループの配列の少なくとも７０パーセントを含む」は、ステムループ逆転写プライマーのループの配列に関してのリバースプライマーの配列を指す。例えば、図５およびこの中に含まれる配列に関して、ステムループ逆転写プライマーは、
【００１９】
【化１】
である。
【００２０】
したがって、上記リバースプライマー配列は、上記ループ配列よりも核酸塩基が２個短い。この故に、上記ループは２０個の核酸塩基であり、そして上記リバースプライマーは１８個の核酸塩基であるので、上記リバースプライマーは、上記ループの配列の１８／２０、または、９０パーセントを含むと言い得る。この意味において、「ループの配列の少なくとも７０パーセントを含む」との表現が、本教示中で使用される。
【００２１】
もちろん、本教示は、ひとりよがりの盲目的模倣者（ｗｏｕｌｄ−ｂｅ ｃｏｐｙ−ｃａｔ）が、上記ループに関するリバースプライマーの配列において、単に１塩基または２塩基、または３塩基を変更しようと企てたに過ぎない実施形態をさらに予期する。本教示は、これらのおよび類似しているシナリオを予期する。この故に、成句「と実質的に同じ」が、配列を指すために使用された場合、これは、本教示の範囲内で、使用される配列にわずかな偏差を含むことを意図されていることが理解される。このようなわずかな改変は、本教示によって明瞭に予期される。疑わしさを回避するため、「と実質的に同じ」は、一般的に、配列が対応する配列と少なくとも９０パーセント同じということを意味する。さらに、例えば、リバースプライマーが、ステムループ逆転写プライマーのループ中に含まれている配列と、実質的に同じ配列を含むという事実を指す場合、「ループの配列の少なくとも７０パーセント」があてはまるということ、そしてさらに、少なくとも７０パーセント、少なくとも９０パーセントのループの配列が、対応するループ配列と同じということが、理解される。
【００２２】
さらに、図５に示されている例示的配列に関して、本明細書において使用されるように、用語「ｚｉｐコード化されたステム（ｚｉｐ−ｃｏｄｅｄ ｓｔｅｍ）」は、ステムループ逆転写プライマーの二重鎖領域を指す。図５におけるステムループ逆転写プライマーのステムは、８塩基対の長さである。いくつかの実施形態においては、ステムは９塩基対の長さであり得る。いくつかの実施形態においては、ステムは１０塩基対の長さであり得る。いくつかの実施形態においては、ステムは１１塩基対の長さであり得る。いくつかの実施形態においては、ステムは１２塩基対の長さであり得る。いくつかの実施形態においては、ステムは１３塩基対の長さであり得る。いくつかの実施形態においては、ステムは１４塩基対の長さであり得る。一般的に、より長いステムが可能であるが、これはオリゴヌクレオチド製造において増加した出費という損害をかけて手に入り、さらに反応の複雑性を増す。いくつかの実施形態においては、ステムは７塩基対の長さであり得る。いくつかの実施形態においては、ステムは長さ６塩基対であり得る。６塩基対の長さより短いステムは可能であるが、検出プローブ結合のレベルにおける特異性を犠牲にして遂行される。
【００２３】
本明細書において使用されるように、用語「ステムループ逆転写プライマーの３’ステム領域」は、ステムのうちの１つの鎖、特にステムループ逆転写プライマーの３’末端に一番近い鎖を指す。別の鎖は、「ステムループ逆転写プライマーの５’ステム領域」として言われ得る。
【００２４】
本明細書において使用されるように、用語「Ｔｍ増大テイル」は、ＰＣＲに基づくプレ増幅反応において使用されるリバースプライマーの５’末端に含まれる、少数（一般的に３個から１０個の間）の核酸塩基を指す。上記Ｔｍ増大テイルは、逆転写産物に相補的ではない。いくつかの実施形態においては、Ｔｍ増大テイルは、４塩基である。いくつかの実施形態においては、Ｔｍ増大テイルは、５塩基である。いくつかの実施形態においては、Ｔｍ増大テイルは、６塩基である。いくつかの実施形態においては、Ｔｍ増大テイルは、７塩基である。一般的に、より長いＴｍ増大テイルが可能であるが、これはオリゴヌクレオチド製造において増加した出費という損害をかけて手に入り、さらに反応の複雑性を増し、そしてＴｍを所望しないレベルにまで引きあげ得る。
【００２５】
本明細書において使用されるように、用語「５’ｚｉｐコードテイル」は、ＰＣＲに基づくプレ増幅反応中で使用される、フォワードプライマーの５’末端に含まれる、一般的に７個から１５個の間の、核酸塩基の配列を指す。５’ｚｉｐコードテイルは特定の標的核酸配列と結合している。すなわち、標的核酸（例えば、マイクロＲＮＡ ｌｅｔ−７ａ）は、ＰＣＲに基づくプレ増幅反応中で増幅され得る。この反応中、フォワードプライマーの５’ｚｉｐコードテイルは、ｌｅｔ−７ａと独特に結合する。このことは、フォワードプライマーにおける３’標的特異的部分とｚｉｐコードが対にされる賢明な設計（ｎｏｔｅ−ｋｅｅｐｉｎｇ）によって、達成され、従って、ｚｉｐコードが、所定の標的核酸と一緒に変化することを可能にしている。その結果、例えばマイクロＲＮＡ ｍｉＲ−２９７を尋ねるフォワードプライマーの５’ｚｉｐコードテイルは、マイクロＲＮＡ ｌｅｔ−７ａを尋ねるフォワードプライマーの５’ｚｉｐコードテイルと異なっている。このコード化（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）は高度にマルチプレックス環境下でより高い能力を可能にし、そして多数の目的の標的核酸が、対応するフォワードプライマーの５’ｚｉｐコードテイルによるｚｉｐコード情報を用いて独特にコード化されることを可能にする。従って、いくつかの表現において、本教示は、固有の逆転写産物配列に独特である５’ｚｉｐコードテイルを指す。いくつかの実施形態においては、ｚｉｐコードテイルは８個の核酸塩基である。いくつかの実施形態においては、ｚｉｐコードテイルは９個の核酸塩基である。いくつかの実施形態においては、ｚｉｐコードテイルは１０個の核酸塩基である。いくつかの実施形態においては、ｚｉｐコードテイルは１１個の核酸塩基である。いくつかの実施形態においては、ｚｉｐコードテイルは１２個の核酸塩基である。一般的に、５’ｚｉｐコードテイルのより長いステムが可能であるが、これはオリゴ製造において増加した出費という損害をかけて手に入り、そしてさらに反応の複雑性を増す。ｚｉｐコードの記載を、他の場所の中、米国特許第６，３０９，８２９号（この中で「タグセグメント（ｔａｇ ｓｅｇｍｅｎｔ）」として呼ばれる）；同第６，４５１，５２５号（この中で「タグセグメント」として呼ばれる）；同第６，３０９，８２９号（この中で「タグセグメント」として呼ばれる）；同第５，９８１，１７６号（この中で「グリッドオリゴヌクレオチド」として呼ばれる）；同第５，９３５，７９３号（この中で「同定タグ」として呼ばれる）；およびＰＣＴ公報番号ＷＯ第０１／９２５７９号(この中で「アドレスで呼び出せる（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）支持体特異的配列」として呼ばれる）で見い出し得る。
【００２６】
（例示的実施形態）
図１は、本教示のいくつかの実施形態に記載の特定の構成内容を描写する。上段、ｍｉＲＮＡ分子（１、破線）が描写される。中段、ステムループ逆転写プライマー（２）が描写される（３’標的特異的部分（３）、ステム（４）、およびループ（５）を例示する）。下段、ステムループプライマー（２）にハイブリダイズさせた、ｍｉＲＮＡ（１）が描写される（ｍｉＲＮＡ（１）の３’末端領域（６）にハイブリダイズさせた、ステムループプライマー（２）の３’標的特異的部分（３）を例示する）。
【００２７】
図２は、本教示のいくつかの実施形態に記載のプロセスの全体像を例示する。ここで、マルチプレックスの逆転写反応は、マイクロＲＮＡのような、複数の核酸上で行われる。この逆転写を、本教示のいくつかの実施形態、例えば、２つのセグメントサイクル手順、または３つのセグメントサイクル手順にしたがってサイクルし得る。また、この逆転写反応は、ステムループ逆転写プライマーを含み得る。上記逆転写反応に続いて、そして上記逆転写反応と同じ容器内で必要に応じて起こる、マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅が行われ得る。このマルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅の次に、複数の別々の、復号ＰＣＲ（ｄｅｃｏｄｉｎｇ ＰＣＲ）、ここではＰＣＲ １、ＰＣＲ ２、ＰＣＲ ３、が続き得る。標的ポリヌクレオチドのＰＣＲに基づくプレ増幅（例えば、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許出願第１０／７２３，５２０号、およびＸｔｒａｎａの米国特許第６，６０５，４５１号を参照）は、１，０００倍よりもより多く、最大キロ単位（ｋｉｌｏ−ｐｌｅｘ）の数の標的核酸について、ｃＤＮＡをプレ増幅させ得る。続いて起こるより低い構成単位（ｌｏｗｅｒ−ｐｌｅｘ）の増幅反応は、続いて、これらのマルチプレックス反応を復号し得、その結果、試薬の節約をともなって、複数の異なる標的ポリヌクレオチドの検出および定量を可能にする。所定の細胞型または細胞型の収集物における、１つ、一部の、またはすべてのマイクロＲＮＡの同定および定量は、‘マイクロＲＮＡサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）‘として呼ばれ得、そして本教示の方法の適用によって達成し得る。サインの論議は、例えば米国特許第６，１１０，７１１号および同第５，５１４，５４５号で見出し得、ここでメッセンジャーＲＮＡサインは、マイクロアレイのような文脈において論議される。本教示の方法は、マイクロＲＮＡのサインを個々の細胞（例えば、個々の幹細胞およびそれより生じる細胞）から規定することを可能にする。本教示は、非常に高度なレベルのマルチプレックス化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）、および単一の細胞から、多数の標的マイクロＲＮＡを代表するサインの起源を提供する。
【００２８】
例示的反応の全体像を、図３に示し、これは、本教示のいくつかの実施形態にしたがうマルチプレックスアッセイの設計を示す。ここで、ｍｉＲＮＡが、ステムループ逆転写プライマー（４１）を含むハイブリダイゼーション反応において、尋ねられることが示される。ハイブリダイゼーションに続いて、逆転写伸長反応が、伸長産物（４２）を形成するためのサイクリング手順で、必要に応じて行われ得る。上記伸長産物は、続いて、マイクロＲＮＡ特異的な、フォワードプライマー（４３）およびリバースプライマー（４４）を使用する、マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅を受け得る。その後は、マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅の上記産物は、３つ別々の、復号増幅反応へと分割される（この場合、ＰＣＲ１、ＰＣＲ２、およびＰＣＲ３）。
【００２９】
図３には明示されていないが、複数のマイクロＲＮＡ種が、このアッセイ中に存在し得ることが理解される。上記アッセイにおいては、逆転写反応において、複数の標的特異的ステムループ逆転写プライマーが使用され得る。さらに、複数の逆転写反応産物は、複数の標的特異的プライマー対を使用する、マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応において、増幅され得る。その後は、シングルプレックス（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｌｅｘ）のＰＣＲ復号反応の収集が行われ得る。例えば、ＰＣＲ１は、最初のｍｉＲＮＡに対して特異的なフォワードプライマーを含み得、ＰＣＲ２は、２番目のｍｉＲＮＡに対して特異的なフォワードプライマーを含み得、そしてＰＣＲ３は、３番目のｍｉＲＮＡに対して特異的なフォワードプライマーを含み得る。上記フォワードプライマーのそれぞれは、固有にｚｉｐコード化され、特定のマイクロＲＮＡと結合させられる、非相補的なテイル部分をさらに含み得る。さらに、ＰＣＲ１、ＰＣＲ２、およびＰＣＲ３はすべて、逆転写反応において、ステムループプライマーのループによってコード化されている、リバースプライマーを含み得る。さらに、ＰＣＲ１は、最初のｍｉＲＮＡの３’末端領域に対応する別個の検出プローブ、および最初のステムループ逆転写プライマーの、ｚｉｐコード１ステムを含み得、ＰＣＲ２は、２番目のｍｉＲＮＡの３’末端領域に対応する別個の検出プローブ、および２番目のステムループ逆転写プライマーの、ｚｉｐコード２ステムを含み得、ＰＣＲ３は、３番目のｍｉＲＮＡの３’末端領域に対応する別個の検出プローブ、および３番目のステムループ逆転写プライマーの、ｚｉｐコード３ステムを含み得る。
【００３０】
従って、いくつかの実施形態においては、本教示がコード化する反応スキームおよび復号する反応スキームを予期する。上記実施形態においては、コード化するマルチプレックスの逆転写反応に、マルチプレックスのコード化するＰＣＲに基づくプレ増幅反応が続き、そしてマルチプレックスのコード化するＰＣＲに基づくプレ増幅反応に、複数のより低い構成単位の（例えば、シングルプレックスの）復号する増幅反応が続く。従って、本教示は、マルチプレックス増幅反応における異なった分子の数を最小化するための様々な戦略を提供する。
【００３１】
図４に示すように、本教示はｚｉｐコード情報を増幅産物内へコード化する新規な方法を提供する。（Ａ）においては、マイクロＲＮＡ配列（７）は、ステムループ逆転写プライマー（８）を用いて尋ねられる。このことは逆転写反応において起こり得る。ステムループ逆転写プライマー（８）の構造は、３’標的特異的部分（９）、二重鎖ステム（１０、１２）、およびループ（１１）を含む。特定のマイクロＲＮＡを尋ねる特定のステムループリバースプライマーのステムは、上記ステム中に存在する固有のｚｉｐコード配列が、特定のマイクロＲＮＡ配列と結合するようにｚｉｐコード化され得る。ステムループ逆転写プライマーの３’ステム領域は（１０）として示されており、そして「ステムループ逆転写プライマーの５’ステム領域」は（１２）に示されている。
【００３２】
図４においてｚｉｐコード配列情報は、終始点線として示されている。（Ａ）においては、ステム（１０，１２）は、特定のマイクロＲＮＡ配列と別個に結合するｚｉｐコード配列を含む。ステムループリバースプライマー（８）の３’標的特異的部分（９）の伸長は、元のマイクロＲＮＡ標的に相補的である鎖の合成に帰着し得る。
【００３３】
（Ａ）における、上記ステムループ逆転写プライマーの上記マイクロＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションおよび伸長反応に続いて、伸長反応産物は、（Ｂ）における（１３）に帰着する。この伸長反応産物は、ステムループリバースプライマー（８）のステム（１０、１２）における配列によって、コード化されたｚｉｐコードを含む。（下記で述べられるように、上記ステムループ逆転写プライマー（１０）の３’ステム領域によりコード化されるｚｉｐコードは、（Ｃ）において起こっている復号ＰＣＲにおいて利用され得る）。（Ｂ）において起こる、ＰＣＲに基づくプレ増幅反応において、フォワードプライマー（１４）は、伸長反応産物（１３）の３’末端へハイブリダイズする。フォワードプライマー（１４）は、３’標的特異的部分（１５）およびｚｉｐコードテイル（１６）を含む。フォワードプライマーのｚｉｐコードテイルは、特定のマイクロＲＮＡと結合させられている配列である。従って、工程（Ａ）におけるステムループリバースプライマー（８）中の最初のｚｉｐコード（１０、１２）、および工程（Ｂ）におけるフォワードプライマー中の２番目のｚｉｐコードによって、基礎をなす標的核酸に隣接する２つの別個の領域（これらのそれぞれは、実験者が導入する）を含む、マイクロＲＮＡ配列が、増幅され得る。（Ｂ）における上記ＰＣＲに基づくプレ増幅反応は、さらにリバースプライマー（１７）を含む。上記リバースプライマーは、３’標的特異的部分（１８）およびＴｍ増大テイル（１９）を含む。注意、リバースプライマー（１７）の上記３’標的特異的部分（１８）は、（Ａ）のステムループ逆転写プライマー（１１）のループの配列である。
【００３４】
最終的に、ＰＣＲに基づくプレ増幅に続いて、アリコートが、より低い構成単位の復号ＰＣＲに置かれ得る。例えば、（Ｃ）において、（Ｂ）のＰＣＲに基づくプレ増幅に起因するアンプリコンの鎖が、示されている（２０）。この鎖は、復号ＰＣＲにおいて増幅され得、そして元の標的核酸が定量され得る。（Ｃ）に示されるように、上記ＰＣＲは、フォワードプライマー（１４）およびリバースプライマー（１７）を含み得る。上記プライマーは、上記ＰＣＲに基づくプレ増幅において使用されるフォワードプライマー（１４）およびリバースプライマー（１７）と同じ配列である。（Ｃ）における復号ＰＣＲは、フルオロフォア（Ｆ）およびクエンチャー（Ｑ）を含む検出プローブ（例えば、５’ヌクレアーゼ切断可能なプローブ（２１））を使用して、リアルタイムに分析され得る。上記検出プローブは、（Ａ）におけるステムループリバースプライマー中に導入されたｚｉｐコードにより、特定の増幅された標的核酸に対し高度に特異的であり得る。上記検出プローブは、標的核酸の３’末端領域に相補的な配列、およびステムループ逆転写プライマーの３’ステム領域の、ｚｉｐコード配列と同じ配列を含む。
【００３５】
それゆえ、図４に描写される分子構造により表される論理を応用することで、本教示は、多数の標的マイクロＲＮＡ配列を定量するためのアプローチを提供する。例えば、３３０個の異なったマイクロＲＮＡを増幅および定量するレベルで達成することに成功し、そしてより高度なレベルが、本教示に基づいて可能である。例えば、１０００の目的とする標的を想定し、本教示は、１０００の構成単位の逆転写反応、続いて高度なマルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応を提供する。マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応からのアリコートは、１０００のシングルプレックスのＰＣＲ復号反応に配置され得る。
【００３６】
高い程度の正確さが、それぞれのアンプリコンにコード化される、２つのｚｉｐコードにより達成される。最初、ｚｉｐコードは、個別のｚｉｐコードステムにより、それぞれのステムループリバースプライマーへコード化される。従って、１０００の目的の標的のために、１０００の異なったステムループ逆転写プライマーが使用される。１０００のステムループ逆転写プライマーのそれぞれは、特定の目的の標的を尋ねる３’標的特異的部分を有している。１０００のステムループリバースプライマーそれぞれは、さらに、ステム中に固有のｚｉｐコード配列を有している。そして、１０００のステムループリバースプライマーそれぞれは、ループを有している。上記ループは、１０００のステムループリバースプライマーのすべてに関して同じ配列であり得、それにより、マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応において、単一のリバースプライマーが使用されることを可能にしている。マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応の間、１０００の異なったフォワードプライマーが使用され得る。マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応においては、それぞれのフォワードプライマーは、３’標的特異的部分、および特定の標的核酸と固有に結合するｚｉｐコード配列を含む、５’ｚｉｐコードテイル領域を含み得る。
【００３７】
最後に、１０００の復号シングルプレックスＰＣＲのそれぞれが、逆転写コード化およびマルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応のコード化に由来するアンプリコンの両末端で起こる、ｚｉｐコードの配列情報を利用し得る。シングルプレックスのそれぞれは、逆転写／ＰＣＲに基づくプレ増幅反応において使用される、ｚｉｐコードに対応する一組のプライマーを含み得る。特に、シングルプレックスの復号ＰＣＲのそれぞれは、共通のユニバーサルリバースプライマーおよび固有のフォワードプライマーを有し得る。復号ＰＣＲは、上記標的マイクロＲＮＡに対応する配列、およびステムループリバースプライマーのｚｉｐコードステムに対応する配列を有する検出プローブをさらに含み得る。このようなアプローチは、１０００のシングルプレックスＰＣＲにおいて、１０００のｚｉｐコードプライマーのユニバーサルの組（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｔｔｅｒｙ）が使用されることを可能にし得、従って、冗長性をもつユニバーサルプライマーおよび費用において対応する削減を提供している。本教示のいくつかの実施形態においては、１０００のステムループリバースプライマーのそれぞれが、同じループを含み得る。従って、単一のリバースプライマー配列が、ＰＣＲに基づくプレ増幅反応において使用され得る。さらに、上記同一のリバースプライマー配列が、複数の復号ＰＣＲにおいて使用され得る。そのようなアプローチは、多数の異なった標的を尋ねるために必要とされる異なった分子の数を、最小化する利益を有している。もちろん、必ずしも、単一のユニバーサルリバースプライマーを使用する必要はない。従って、いくつかのステムループリバースプライマーは、これらのループ中において異なった配列を含み得、従って、ＰＣＲに基づくプレ増幅反応において、異なったリバースプライマーの対応する組の使用をもたらす。
【００３８】
マイクロＲＮＡ ｌｅｔ−７ａを尋ねるために有用である、配列の例示的収集物が、図５に示され、これらは、それぞれ、フォワードプライマー、ｌｅｔ−７ａマイクロＲＮＡ、ステムループ逆転写プライマー、検出プローブ、およびリバースプライマーである。
【００３９】
配列番号１：５’ＧＡＧＧＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴＧＴ３’
配列番号２：５’ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ３’
配列番号３：５’ＣＡＴＡＴＣＡＡＣＴＡＣＴＣＣＴＴＴＡＡＣＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＴＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＧ３’
配列番号４：５’ＴＴＴＣＣＴＣＡＴＣＡＡＣＴＡＴＡＣ３’
配列番号５：５’ＣＴＣＡＡＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＣＡＡ３’。
【００４０】
（逆転写（ＲＴ）反応のサイクリング）
いくつかの実施形態においては、本教示は、サーマルサイクリングによる増強された逆転写プライマー利用のための方法を提供する。無意識的に制限を意図することなく、本教示のサイクリング方法は、誤ったプライマーの低温での会合を破壊し、そして反復性の相同的なプライマー／ＲＮＡ核形成を可能にする、と考えられており、従って逆転写反応産物量を増加させている。本教示の方法は、ｍｉＲＮＡ逆転写反応において逆転写産物を増加させること、および標的核酸としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ反応において逆転写産物を増加させること、を含むいくらかの状況に応用され得る。
【００４１】
慣習的に、ＲＴ反応は、単一の比較的低温、３７℃〜４２℃で長時間行われる（３０分〜１時間、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，第３版を参照）。一般的に、これらの反応の目標は、例えば、ｍＲＮＡをｃＤＮＡへ転換するポリ（Ｔ）およびランダムプライマーを使用しての、長いｃＤＮＡの生成である。インキュベーションの長時間の間隔は、ＲＴ反応を完了することを可能にし、可能な限り最長のｃＤＮＡ分子を生成すると期待される。本教示によって提供される、２個の関連した考慮は、以下を含む：（１）ＲＮＡ標的が短い、または規定されたｃＤＮＡ産物が短い場合、長いインキュベーション時間は、ポリメラーゼにとって鋳型を逆転写させるために、必ずしも必要ではない。（２）単一の低ハイブリダイゼーション温度は、非相同性会合および内部の鎖の崩壊が、真正のプライミング活性を妨げることを可能にする。
【００４２】
相同性の低温プライマーハイブリダイゼーションの背後の動力学の原理は、複雑で完全には定義されていない。これらの低温では、短い相補的領域は、真正の相補的ハイブリダイゼーションを妨げる、安定した分子内結合および分子間結合を形成し得る。ＲＴ反応において一般的に存在する、プライマーおよび標的ＲＮＡの間の、濃度の大きな差のために、プライマーの小断片のみ、一工程のＲＴ反応で、標的配列へ豊富にアニーリングする。従って、本発明者らは、（１）標的会合から離して、これらのプライマーを解離させる、（２）短い分子内ハイブリダイゼーションを解離させる、および（３）ＲＴプライマーの再ハイブリダイゼーションを可能にするという条件は、過剰な未反応のプライマーに、ＲＴの別の回のためのＲＮＡ標的と反応する別の機会を与え得るとの仮定した。さらに、本発明者らは、これらの条件が逆転写酵素を不活性化させない場合、そのあと、これらの条件の反復は、利用可能な標的ＲＮＡ分子が使い尽くされるまで、ｃＤＮＡの合成を増加させ得るとの仮定した。
【００４３】
原則として、上記プライマーの濃度を、５０〜１００ｎＭから１ｕＭ以上まで増加させることは、生産的なプライマー標的ハイブリダイゼーションの数を増加させると予測されるが、このような条件はまた、特にマルチプレックス反応におけるプライマー対プライマーの相互作用の問題を増加させる。元の未反応プライマーを再利用する手順は、プライマー利用の効率を増加させ、そしてこの故に、ＲＴ反応における産物の量を増加させると仮定した。いくつかのＲＴ酵素は、５０℃、６０℃以上まで安定であり得る、という仮定で、温度サイクリングＲＴ反応（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｙｃｌｉｎｇ ＲＴ ｒｅａｃｔｉｏｎ）のスキームを設計した。
【００４４】
従って、いくつかの実施形態においては、複数の異なった標的ポリヌクレオチドおよび複数の異なった標的特異的ステムループ逆転写プライマーが、サイクリングさせる逆転写反応において使用され、同一の反応容器において、マルチプレックスＰＣＲに基づくプレ増幅反応が続く。
【００４５】
（２セグメントでの、ＲＴ反応のサイクリング）
いくつかの実施形態においては、最初の温度（変性温度）は、４７℃〜５３℃であり、そして２番目の温度（アニーリング／伸長温度）は３７℃〜４３℃である。
【００４６】
いくつかの実施形態においては、サイクリング逆転写反応は、最初の温度での１〜５秒間および２番目の温度での４５〜７５秒間を、少なくとも３０サイクル含む。
【００４７】
いくつかの実施形態においては、サイクリング逆転写反応は、最初の温度での１〜５秒間および２番目の温度での２５〜３５秒間を、少なくとも６０サイクル含む。
【００４８】
（３セグメントでの、ＲＴ反応のサイクリング）
いくつかの実施形態においては、サイクリングは、以下の３つのセグメントを含む：低温セグメント、中温セグメント、高温セグメント。制限することを意図することなく、３つのセグメントそれぞれの間に起こる優勢な反応は、次のように考えられ得る：上記低温セグメントは、アニーリングセグメントと考えられ得、上記中温セグメントは、伸長セグメントと考えられ得、そして上記高温セグメントは、変性セグメントと考えられ得る。したがって、いくつかの実施形態においては、サイクリング逆転写反応は、最初１６℃での３０分間のインキュベーションを含み得、これに２０℃での３０秒間、４２℃での３０秒間、および５０℃での１秒間の、６０サイクルが続く。これらの６０サイクルに、逆転写酵素を不活性化する工程、例えば、５分間、温度を８５℃まで上昇させることが続き得る。
【００４９】
いくつかの実施形態においては５０〜７０の間のサイクルであり得る。いくつかの実施形態においては、４０〜８０の間のサイクルであり得る。いくつかの実施形態においては、３０〜１００の間のサイクルであり得る。いくつかの実施形態においては、１００より大きいサイクルであり得る。
【００５０】
いくつかの実施形態においては、上記低温セグメントは１８℃〜２２℃であり得る。いくつかの実施形態においては、上記低温セグメントは１９℃〜２１℃であり得る。いくつかの実施形態においては、上記低温セグメントは１５℃〜２５℃であり得る。
【００５１】
いくつかの実施形態においては、上記低温セグメントは、２５〜３５秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、上記低温セグメントは、２０〜４０秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、上記低温セグメントは、１５〜６０秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、より長い時間は、結果の取得に不必要な遅れを加算し得ることが理解されるが、上記低温セグメントは、６０秒より長く続き得る。
【００５２】
いくつかの実施形態においては、上記中温セグメントは、３７℃〜４５℃であり得る。いくつかの実施形態においては、上記中温セグメントは、３９℃〜４３℃であり得る。
【００５３】
いくつかの実施形態においては、上記中温セグメントは、２５〜３５秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、上記中温セグメントは、２０〜４０秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、上記中温セグメントは、１５〜６０秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、より長い時間は、結果の取得に不必要な遅れを加算し得ることが理解されるが、上記中温セグメントは、６０秒より長く続き得る。
【００５４】
いくつかの実施形態においては、上記高温セグメントは、４８℃〜５５℃であり得る。いくつかの実施形態においては、上記高温セグメントは、４９℃〜５１℃であり得る。いくつかの実施形態においては、より高い温度は、酵素活性を変性させ得および／または消失させ得ることが理解されるが、上記高温セグメントは、５５℃よりも高温であり得る。
【００５５】
いくつかの実施形態においては、上記高温セグメントは、１〜１０秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、上記高温セグメントは、２〜８秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、上記高温セグメントは、１〜５秒間続き得る。いくつかの実施形態においては、高温でのより長い時間は、酵素活性を変性させ得および／または消失させ得る（特に、より長い時間が用いられた場合）ことが理解されるが、上記高温セグメントは、１０秒より長く続き得る。より長い時間は、結果の取得に不必要な遅れを加算し得ることがさらに理解される。
【００５６】
いくつかの実施形態においては、特に、メッセンジャーＲＮＡのような、より長い核酸が尋ねられる実施形態においては、標的特異的プライマー対は、１００〜１５０ヌクレオチド長の間である標的ポリヌクレオチドの領域を尋ねる。より長い領域が尋ねられた時、一般的にインキュベーション時間は増加し得、そして、そのうえ変性温度は増加し得る。
【００５７】
（キット）
特定の実施形態において、本教示はまた、特定の方法を行うことをはかどらせるために設計されたキットを提供する。いくつかの実施形態においては、キットは、この方法を実行することに使用される２以上の構成要素を集合させることにより、目的の方法を行うことをはかどらせるのに役立つ。いくつかの実施形態においては、キットは、最終消費者による測定のために必要なことを最小にするために、あらかじめ測定した単位量の構成要素を含み得る。いくつかの実施形態においては、キットは、本教示の１以上の方法を行うことのための説明書を含み得る。特定の実施形態において、上記キットの構成要素は、お互いに関連して機能するように最適化されている。
【００５８】
したがって、いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも３００の短い標的核酸を増幅するためのキットを提供する。上記キットは以下を含む；少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーそれぞれが、実質的に同じループ配列を含む、少なくとも３００のステムループ逆転写プライマー；それぞれのフォワードプライマーが、別個の３’標的特異的部分および別個の５’テイルを含む、少なくとも３００のフォワードプライマー；ユニバーサルリバースプライマーの配列が、少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーのループ中に含まれる配列の少なくとも７０パーセントと実質的に同じ配列、およびＴｍ増大テイルを含む、ユニバーサルリバースプライマー。いくつかの実施形態においては、上記キットはさらに、逆転写酵素を含む。いくつかの実施形態においては、上記キットはさらに、ｄＮＴＰを含む。いくつかの実施形態においては、上記キットはさらに、ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態においては、上記キットはさらに、少なくとも３３０のフォワードプライマーのそれぞれ、およびユニバーサルリバースプライマーが、別々のウェル中に配置させられている、マイクロタイタープレートを含む。
【００５９】
本教示は、これらの例示的実施形態によって記載されているが、当業者は、これらの例示的実施形態の多数の変化および改変が、過度の実験をすることなく可能であることを、容易に理解する。そのような変化および改変のすべてが、本教示の範囲内に存在する。本教示の局面は、さらに次の実施例に照らして理解され得、この実施例は、決して本教示の範囲を制限するものとは解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６０】
ヒトの肺および心臓のＲＮＡを、Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．から購入した。Ｌｅｔ−７ａ合成ｍｉＲＮＡを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入可能した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって合成した。
【００６１】
図４および図５は、本実施例中で使用される反応成分構成を描写する。図４中に示されるように、工程ＡおよびＢは、既知ヒトｍｉＲＮＡのうち、ほとんどすべて（３３２組のうち３３０組）に対するＲＴプライマーおよび二番目の鎖の合成プライマーの３３０組を用いるマルチプレックス反応である。工程ＢのＰＣＲは、ｃＤＮＡ産物を増幅し、工程Ｃのために十分な産物を提供する。工程Ｃを、３８４ウェル反応プレートにおける個々のシングルプレックスＴａｑＭａｎ（登録商標）反応として処理し、このマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ反応後の、３３０個のｍｉＲＮＡのそれぞれが豊富なことをモニタリングする。上記リバースステムループＲＴプライマー、フォワードプライマー（二番目の鎖の合成およびプレＰＣＲプライマー）、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブすべてが、ｚｉｐコード化された配列（それぞれのプライミング反応の特異性を増加させるために、それぞれのｍｉＲＮＡに、特異的に割り当てられる）を含むことに注意せよ。この方法によって、ｍｉＲＮＡにおけるわずかな配列の差異でさえ、引き続く反応において増幅される。なぜなら、あらゆるｍｉＲＮＡ配列の差異が、さらなる、特異的なｍｉＲＮＡのｚｉｐコード化される配列によって、ＰＣＲ産物およびリアルタイムＰＣＲ反応において増幅されるからである。また、ユニバーサルリバースプライマーのＴｍを増加させるために、さらなる配列を加えた（本来のステムループＲＴプライマーのループ配列の５’末端へ）。この付加的配列を、Ｔｍ増大テイルと呼ぶ。
【００６２】
（逆転写）
５ｕｌの逆転写反応は、１０倍濃度のｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｉｎｇキットバッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を５ｕｌ、０．３３５ｕｌのＭＭＬＶ逆転写酵素（５０Ｕ／ｕｌ）、１００ｍＭ ｄＮＴＰを０．２５ｕｌ、ＡＢ ＲＮａｓｅ阻害剤２０ｕ／ｕｌを０．０６５ｕｌ、３３０構成単位のリバースステムループプライマー（それぞれ５０ｎＭ）を０．５ｕｌ、ヒト肺精製総ＲＮＡを２ｕｌ、および１．３５ｕｌのＨ２Ｏを含む。反応混合物を、ＲＮＡ試料の２ｕｌを、少なくとも１０反応のための残りの反応成分を含む新たに調製したストック反応混合物の３ｕｌへ加えることにより調製した。上記反応を次のインキュベーション条件を用いて行った：（２０℃／３０秒〜４２℃／３０秒〜５０℃／１秒）６０サイクル。続いて、８５℃で５分間のインキュベーションにより、上記酵素を不活性化した。
【００６３】
（ＰＣＲに基づくプレ増幅）
ＰＣＲに基づくプレ増幅は、２５ｕｌを含んだ。この中に、ＵＮＧを含まない２倍濃度のＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ９Ｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を１２．５ｕｌ、ＲＴ試料を５ｕｌ、３３０構成単位のフォワードプライマー（５００ｎＭ）それぞれを２．５ｕｌ、１００ｕＭのユニバーサルリバースプライマーを１．２５ｕｌ、５ｕ／ｕｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）を１．２５ｕｌ、１００ｍＭ ｄＮＴＰを０．５ｕｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２を０．５ｕｌ、および１．５ｕｌのｄＨ２Ｏを含む。反応に関する温度のプロフィールは、Ｔａｑ−ＧＯＬＤ（登録商標）を活性化するための９５℃で１０分間のインキュベーション、５５℃での２分間のインキュベーションを含み、これに、９５℃で１秒間および６５℃で１分間の１８サイクルが続いた。
【００６４】
（リアルタイムＰＣＲ）
ＰＣＲに基づくプレ増幅からの産物の２５ｕｌへ、７５ｕｌのＨ２Ｏを加え、１００ｕｌへ希釈した。それぞれのＴａｑＭａｎ（登録商標）反応についての検出プローブは、５’側にＦａｍおよび３’側にクエンチャーＭＧＢ（マイナーグルーブ結合剤）を含んだ。リアルタイム反応の混合物は、ＵＮＧを含まない２倍濃度のＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を５ｕｌ、５ｕＭのフォワードプライマーと１ｕＭのＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとの混合物を、２ｕｌ、１００ｕＭユニバーサルリバースプライマーを０．１ｕｌ、４倍濃度の希釈したＰＣＲに基づくプレ増幅試料を０．１ｕｌ、および２．８ｕｌのｄＨ２Ｏを含んだ。リアルタイム反応の混合物を、個々のフォワードプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの２ｕｌを、リアルタイムＰＣＲ試薬の残りを含む、新たに調製したストック溶液の８ｕｌへ加えることにより集めた。リアルタイムＰＣＲを、９５℃、１０分間でのホットスタート、続いて９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の、４０サイクルからなる温度管理様式を用いて、３８４ウェル形式におけるＡＢ ７９００ ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍに基づいて行った。それぞれのｍｉＲＮＡに関しての上記リアルタイムＰＣＲを、二連で処理した。
【００６５】
（実施例の結果と考察）
最近（Ｌａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２００６），３４３：８５−８９）、本発明者らは、上記短いｍｉＲＮＡを、はるかに長いステムループプライマーの３’末端に位置していた、短い８ヌクレオチドのプライミングＲＴ配列と、３’末端に上記ｍｉＲＮＡ配列の残りを有するフォワードの、二番目の鎖合成プライマーと５’末端における任意のＴｍ増大配列との間で分配することによって、複数のｍｉＲＮＡの概略を提示し得ることを示した。これらのプライマーを、マルチプレックスな方法でｍｉＲＮＡを逆転写およびＰＣＲ増幅することに使用し、個別のシングルプレックスリアルタイムＰＣＲのための十分な試料を提供し、増幅されたｍｉＲＮＡのそれぞれの相対的濃度を決定した。上記反応は、ＰＣＲに基づくプレ増幅反応の多くのサイクルに関して強固であったが、マルチプレックスのレベルの増加は、総ヒト肺ｍｉＲＮＡの、シングルプレックスプロフィールとマルチプレックスプロフィールとを比較するプロットへ、ばらつき度の増加を加える。ばらつき度を減ずるために、本発明者らは、ｍｉＲＮＡを、４８のｍｉＲＮＡに対するプライマーのマルチプレックス群へ分類した。
【００６６】
本教示は、これに関してはいくつかの新規な特徴、そしてマイクロＲＮＡ定量に対する別のマルチプレックスアプローチを提供する。最初に、複数のリバースプライマーおよびフォワードプライマー、ならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを、３３０構成単位へ増加させた。二番目に、プライマーおよびプローブのそれぞれを、図４および図５に示すように、ｚｉｐコード化した。三番目に、特別の配列を、このプライマーのＴｍを上昇させるために、プレＰＣＲ増幅反応のＵＲ（ユニバーサルリバース）プライマーの５’末端へ加えた。四番目に、プレＰＣＲ増幅サイクル数を、１４から１８へ増加させた。
【００６７】
したがって、図４は、ｍｉＲＮＡをマルチプレックス群へ分割することに関して、本教示にしたがう一つの戦略を示す。この戦略は、単一の群におけるすべてのｍｉＲＮＡのマルチプレックスアッセイを可能にする。図４は、すべてのｍｉＲＮＡに対する上記プライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、それぞれのｍｉＲＮＡに対して特異的な配列によってｚｉｐコード化されていることを示す。これは、上記ＰＣＲに基づくプレ増幅およびリアルタイムＰＣＲのための上記ｍｉＲＮＡプライマーおよびプローブは、実際のｍｉＲＮＡ配列における差異によっては、もはやお互いに違いがないが、加えられたｚｉｐコード化配列のために、大きな差異も有していることを意味する。プライマー設計においての変更は、類似したまたは関連した配列領域（ｔｒａｃｔ）を含むｍｉＲＮＡ配列に由来する、プライマーとプライマーとの相互作用を、大いに減らす。この設計は、いまだ発見されていない新規なｍｉＲＮＡを含む、すべてのｍｉＲＮＡのマルチプレックスプロフィールを可能にすることが予想される。
【００６８】
これらの実験からの結果は、上記ｚｉｐコード化されたプライマー設計は、マルチプレックスのＰＣＲに基づくプレ増幅の多くのサイクルを通して、３３０のｍｉＲＮＡを正確にプレ増幅することを示した。上記マルチプレックスのＰＣＲに基づくプレ増幅反応を、１、５、１０、１４および１８サイクルのＰＣＲの間増幅した。次に、それぞれのｍｉＲＮＡ相対的濃度を、材料および方法に記載されているように、リアルタイムＰＣＲにより決定した。これらのＰＣＲ増幅におけるそれぞれのｍｉＲＮＡに関するＣｔ値での理論上の差異は、１から５まで、５から１０まで、１０から１４まで、および１４から１８までのそれぞれのＰＣＲサイクルにおける増加に対して、４、５、４および４であるはずである。これらの間隔についての平均観察差異は、それぞれ４．１５、５．２９、３．８７および４．２５である。
【００６９】
ｚｉｐコード化されたプライマーのダイナミックレンジを評価するために、総ヒト肺ＲＮＡを、１００ｎｇから１０ｐｇまで希釈し、そして１８サイクルのＰＣＲに基づくプレ増幅を使用する、材料および方法に記載される３３０ｍｉＲＮＡのためのマルチプレックス手法により概略を提示した。それぞれのｍｉＲＮＡの相対的豊富さに対する、総ＲＮＡ試料の大きさの影響をまた分析し、そして、仮定したように用量応答関係を発見した。
【００７０】
これらの実験において、３７は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ’ ＡＢ ７９００ ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍに基づく単一コピー鋳型に関して、予想されるＣｔ値である。しかし、上記ｍｉＲＮＡを１８サイクルのＰＣＲを用いて増幅し、そして続いて４００倍（８．７Ｃｔの損失）に希釈したので、単一コピーＤＮＡの実際のＣｔ値は、２７．７（３７−１８＋８．７）である。ゆえに、このプロトコルの妥当性の評価において、２８未満のＣｔ値を有するデータポイントのみが、意義があると見なされるべきである。それぞれの希釈工程は１０倍希釈であったので、それぞれの希釈間隔（ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｖａｌ）の間のそれぞれのｍｉＲＮＡに関してのＣｔにおける予想された差異は、３．３である。２８未満のＣｔを有するｍｉＲＮＡに関する平均観察差異は、１００ｎｇから１０ｐｇまでの希釈間隔に関して、それぞれほんの、２．９３、３．４０、３．８６および３．９である。予想される平均差異は、それぞれ０．４０、−０．０７、−０．５３および−０．５７のみである。
【００７１】
適切なプライマーおよびプローブのｚｉｐコード化によって、マルチプレックスＰＴ−ＰＣＲに付与されるさらなる特異性に関しての一つの有効な試験は、非常に密接に関連しているｍｉＲＮＡに対する、非ｚｉｐコード化プライマーおよびｚｉｐコード化プライマーの能力の直接比較である。このような密接に関連しているｍｉＲＮＡの群を、ｍｉＲＮＡのｌｅｔ−７ファミリーに見出す。図６は、１００ｐＭの合成ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲＮＡと反応させた場合、Ｌａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２００６），３４３：８５−８９の１９０構成単位の非ｚｉｐコード化プライマーおよびプローブの能力と、本教示の３３０構成単位のｚｉｐコード化プライマーおよびプローブの能力とを比較する。ｚｉｐコード化バージョンのためのマルチプレックス化の上記レベルが、偽プライマー（ｓｐｕｒｉｏｕｓ ｐｒｉｍｅｒ）の相互作用の潜在性を増加させる、１４０のさらなるプライマーの組を含むので、上記比較は、特に厳密である。図６は、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの非ｚｉｐ化バージョンが、ｈａｓ−ｌｅｔ−７ａと同じ長さを有する上記ｌｅｔ−７ ｍｉＲＮＡファミリーのすべてのメンバーに対する顕著な交差反応を有しており、そして３’末端の１ヌクレオチドを欠くファミリーのメンバーのみを区別することを示している。他方では、上記ｚｉｐコード化プライマーの組は、ｈａｓ−ｌｅｔ−７ｆに対してのみ交差反応を示し、このｈａｓ−ｌｅｔ−７ｆはフォワードプライマーの３’末端から離れて配置される１塩基のみだけ、ｈａｓ−ｌｅｔ−７ａと異なる。この密接に関連しているファミリーのその他の７メンバーとは交差反応しない。ｚｉｐコード化がマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ反応に付与するさらなる特異性は、単一の細胞内で見出されるＲＮＡ試料に対応する総ＲＮＡ試料の大きさに対しての、単一のマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ反応由来のすべてのｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡプロファイリング（ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）を可能にする。したがって、本教示は、非常に小さな生検および単一細胞（単一の幹細胞を含む）におけるすべての公知のヒトｍｉＲＮＡの概略を提示するための新規な方法、組成物、およびキットを提供する。さらに、本教示は、新規マイクロＲＮＡが発見されるようなマルチプレックスのレベルの増大を可能にするために十分、柔軟でありかつ強固である。
【００７２】
したがって、いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも３００の小核酸のマルチプレックスの定量を提供する。上記実施形態においては、小核酸のそれぞれは、３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも４００の小核酸のマルチプレックスの定量を提供する。上記実施形態においては、小核酸のそれぞれは、３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも５００の小核酸のマルチプレックスの定量を提供する。上記実施形態においては、小核酸のそれぞれは、３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも６００の小核酸のマルチプレックスの定量を提供する。上記実施形態においては、小核酸のそれぞれは、３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも７００の小核酸のマルチプレックスの定量を提供する。上記実施形態においては、小核酸のそれぞれは、３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも８００の小核酸のマルチプレックスの定量を提供する。上記実施形態においては、小核酸のそれぞれは、３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも９００の小核酸のマルチプレックスの定量を提供する。上記実施形態においては、小核酸のそれぞれは、３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態においては、本教示は、少なくとも１０００の小核酸のマルチプレックスの定量を提供する。上記実施形態においては、小核酸のそれぞれは、３０ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態においては、ダイナミックレンジは少なくとも３ ｌｏｇである。いくつかの実施形態においては、ダイナミックレンジは少なくとも４ ｌｏｇである。いくつかの実施形態においては、ダイナミックレンジは少なくとも５ ｌｏｇである。いくつかの実施形態においては、ダイナミックレンジは少なくとも６ ｌｏｇである。いくつかの実施形態においては、ダイナミックレンジは少なくとも７ ｌｏｇである。いくつかの実施形態においては、ダイナミックレンジは少なくとも８ ｌｏｇである。
【００７３】
上記開示された教示は、さまざまな応用、方法、キット、および組成物に関して述べられているが、さまざまな変化および改変が、本明細書の教示および以下の特許請求される発明から逸脱することなく、行われ得ることが理解される。前述の実施例は、開示された教示をよりよく例示するために提供され、そして本明細書に示される教示の範囲を制限するとは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、本教示のいくつかの実施形態にしたがう様々な構成の特定の局面を描写する。
【図２】図２は、本教示のいくつかの実施形態にしたがう一つの作業の流れを描写する。
【図３】図３は、本教示のいくつかの実施形態にしたがう様々な構成の特定の局面を描写する。
【図４】図４は、本教示のいくつかの実施形態にしたがう様々な構成の特定の局面を描写する。
【図５】図５は、本教示のいくつかの実施形態にしたがう様々な構成の特定の局面を描写する。
【図６】図６は、本教示のいくつかの実施形態にしたがうＣｔ値の形態における例示的データ（ｄａｔｅ）を描写する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれの短い標的核酸が１８〜３０ヌクレオチド長である、少なくとも３００の異なる短い標的核酸を定量するための方法であって、該方法が、以下、
該少なくとも３００の異なる短い標的核酸と、少なくとも３００の異なる標的特異的ステムループ逆転写プライマーとを接触させる工程であって、ここでそれぞれの該少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーが、固有の３’標的特異的部分、固有のｚｉｐコード化ステム、およびループを含む、工程；
逆転写産物の収集物を形成するために、逆転写反応において、該少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーを伸長する工程；
ＰＣＲに基づくプレ増幅（ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）産物の収集物を形成するために該逆転写産物の収集物に対し、ＰＣＲに基づくプレ増幅を行う工程であって、ここで、該ＰＣＲに基づくプレ増幅が、少なくとも３００の異なるフォワードプライマーおよび少なくとも一つのリバースプライマーを含み、ここで該リバースプライマーの配列が、該少なくとも一つのステムループ逆転写プライマーのループと実質的に同じ配列、およびＴｍ増大テイルを含み、；
この工程においては、それぞれの該少なくとも３００の異なるフォワードプライマーが、ｉ）特定の逆転写産物の配列の５’末端に相補的である３’標的特異的部分、およびｉｉ）特定の逆転写産物の配列に独特である５’ｚｉｐコードテイルを含む、工程；そして
該ＰＣＲに基づくプレ増幅産物の収集物を少なくとも３００の異なる反応容器へ分ける工程；
該３００の異なる反応容器のそれぞれにおいて復号ＰＣＲを行う工程であって、ここでそれぞれの復号ＰＣＲは、特定の標的核酸配列に関する該ＰＣＲに基づくプレ増幅反応におけるフォワードプライマーと実質的に同じ配列を含むフォワードプライマー、リバースプライマー、および検出プローブを含み、ここで、該検出プローブの配列は、ｉ）特定のステムループ逆転写プライマーの３’ステム領域と同じである少なくとも６核酸塩基の配列、およびｉｉ）該特定のステムループ逆転写プライマーにより尋ねられる該短い標的核酸に対して相補的である少なくとも６核酸塩基の配列を含む、工程；
該少なくとも３００の異なる反応容器のそれぞれにおいて、該検出プローブを検出する工程；ならびに、
該少なくとも３００の異なる短い標的核酸を定量する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記逆転写がサイクリングを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サイクリングが、２０℃で３０秒間、４２℃で３０秒間、および５０℃で１秒間の６０サイクルを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲに基づくプレ増幅が、１２〜２０サイクルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＣＲに基づくプレ増幅が、１４〜１８サイクルを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記１２〜２０サイクルそれぞれが、９５℃で１秒間および６５℃で１分間を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも３００の短い標的核酸が、マイクロＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも３００の短い標的核酸が、単一の細胞から収集される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーが、実質的に同じループ配列を含み、そして前記ＰＣＲに基づくプレ増幅反応において使用される前記リバースプライマーの配列が、該ループの配列の少なくとも７０パーセントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＣＲに基づくプレ増幅反応における少なくとも一つのリバースプライマーの前記Ｔｍ増大テイルが、少なくとも４核酸塩基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＣＲに基づくプレ増幅反応における、少なくとも一つのリバースプライマーの前記Ｔｍ増大テイルが、５核酸塩基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
標的核酸を定量するための方法であって、以下、
該標的核酸と標的特異的ステムループ逆転写プライマーを接触させる工程であって、該ステムループ逆転写プライマーが、３’標的特異的部分、ｚｉｐコード化ステム、およびループを含む、工程；
逆転写産物を形成するために、逆転写反応において該ステムループ逆転写プライマーを伸長する工程；
ＰＣＲに基づくプレ増幅産物を形成するために、該逆転写産物に対しＰＣＲに基づくプレ増幅を行う工程であって、ここで該ＰＣＲに基づくプレ増幅が、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで該リバースプライマーの配列が、該少なくとも一つのステムループ逆転写プライマーのループと実質的に同じ配列、および非相補的テイルを含み、ここで該フォワードプライマーの配列が、ｉ）特定の逆転写産物の配列の５’末端に相補的である配列、およびｉｉ）５’ｚｉｐコードテイルを含む、工程；
該ＰＣＲに基づくプレ増幅の産物のアリコートに対し復号ＰＣＲを行う工程であって、該復号ＰＣＲは、該ＰＣＲに基づくプレ増幅反応におけるフォワードプライマーと同じ配列であるフォワードプライマー、該ＰＣＲに基づくプレ増幅反応におけるリバースプライマーと実質的に同じ配列を含むリバースプライマー、および、検出プローブを含み、該検出プローブの配列が、ｉ）該ステムループリバースプライマーの３’ステム領域と同じである、少なくとも６塩基の配列、およびｉｉ）該標的核酸に対して相補的である、少なくとも６塩基の配列を含む、工程；
該検出プローブを検出する工程；ならびに
該標的核酸を定量する工程を含む、方法。
【請求項１３】
前記逆転写がサイクリングを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的核酸がマイクロＲＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的核酸が単一の細胞から収集される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＣＲに基づくプレ増幅反応において使用される前記リバースプライマーが、前記ステムループ逆転写プライマーのループと、実質的に同じ配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的核酸が１８〜３０ヌクレオチド長である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記逆転写がサイクリングを含み、そして該サイクリングが、２０℃で３０秒間、４２℃で３０秒間、および５０℃で１秒間の６０サイクルを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＣＲに基づくプレ増幅が１２〜２０サイクルを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
それぞれの短い標的核酸が１８〜３０ヌクレオチド長である、少なくとも３００の短い標的核酸を定量するための方法であって、該方法が、
マルチプレックスの逆転写反応を行う工程；
マルチプレックスのＰＣＲに基づくプレ増幅反応を行う工程；
少なくとも３００の異なる復号ＰＣＲを行う工程；および
それぞれの短い標的核酸が１８〜３０ヌクレオチド長である、すくなくとも３００の短い標的核酸を定量する工程を含む、方法。
【請求項２１】
前記マルチプレックスの逆転写反応がサイクリングを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記短い標的核酸がマイクロＲＮＡである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記短い標的核酸が単一の細胞から収集される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記短い標的核酸が１８〜３０ヌクレオチド長である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記マルチプレックスの逆転写反応が、サイクリングを含み、そして、該サイクリングが、２０℃で３０秒間、４２℃で３０秒間、および５０℃で１秒間の６０サイクルを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記マルチプレックスのＰＣＲに基づくプレ増幅が、１２〜２０サイクルを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
標的核酸を増幅するための方法であって、以下、
該標的核酸と標的特異的ステムループ逆転写プライマーとを接触させる工程であって、該ステムループ逆転写プライマーが、３’標的特異的部分、ｚｉｐコード化ステム、およびループを含む、工程；
逆転写産物を形成するために、逆転写反応において該ステムループ逆転写プライマーを伸長する工程であって、該逆転写反応がサイクリングを含む、工程；
ＰＣＲに基づくプレ増幅産物を形成するために、該逆転写産物に対してＰＣＲに基づくプレ増幅を行う工程であって、ここで該ＰＣＲに基づくプレ増幅が、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、該リバースプライマーの配列が、該少なくとも一つのステムループ逆転写プライマーのループと実質的に同じ配列、およびＴｍ増大テイルを含み、そして該フォワードプライマーの配列が、ｉ）特定の逆転写産物の配列の５’末端に相補的である配列、およびｉｉ）５’ｚｉｐコードテイルを含む、工程；ならびに
該標的核酸を増幅する工程を含む、方法。
【請求項２８】
前記マルチプレックスの逆転写反応が、サイクリングを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記短い標的核酸が、マイクロＲＮＡである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記短い標的核酸が、単一の細胞から収集される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記短い標的核酸が１８〜３０ヌクレオチド長である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記マルチプレックスの逆転写反応が、サイクリングを含み、ならびに、該サイクリングが２０℃で３０秒間、４２℃で３０秒間、および、５０℃で１秒間の６０サイクルを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記マルチプレックスのＰＣＲに基づくプレ増幅が１２〜２０サイクルを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも３００の短い標的核酸を増幅するためのキットであって、該キットが、以下、
それぞれ実質的に同じループ配列を含む、少なくとも３００のステムループ逆転写プライマー；
それぞれ別個の３’標的特異的部分および別個の５’テイルを含む、少なくとも３００のフォワードプライマー；
ユニバーサルリバースプライマーであって、ここで該ユニバーサルリバースプライマーの配列が、該少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーのループ中に含まれている配列と実質的に同じ配列、およびＴｍ増大テイルを含む、ユニバーサルリバースプライマーを含む、キット。
【請求項３５】
さらに逆転写酵素を含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
さらにｄＮＴＰを含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
さらにＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
さらにマイクロタイタープレートを含む、請求項３４に記載のキットであって、少なくとも３３０のフォワードプライマーのそれぞれ、および前記ユニバーサルリバースプライマーが別々のウェルに配置させられている、キット。
【請求項３９】
１８〜３５核酸塩基長の少なくとも３００の異なる短い標的核酸を含む組成物であって、該少なくとも３００の異なる短い標的核酸のそれぞれが、固有のステムループ逆転写プライマーにハイブリダイズされ、該少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーのそれぞれが、実質的に同じループ配列ならびに固有のｚｉｐコードステム部分および固有の３’標的特異的部分を含む、組成物。
【請求項４０】
さらに逆転写酵素を含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
さらにｄＮＴＰを含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項１】
それぞれの短い標的核酸が１８〜３０ヌクレオチド長である、少なくとも３００の異なる短い標的核酸を定量するための方法であって、該方法が、以下、
該少なくとも３００の異なる短い標的核酸と、少なくとも３００の異なる標的特異的ステムループ逆転写プライマーとを接触させる工程であって、ここでそれぞれの該少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーが、固有の３’標的特異的部分、固有のｚｉｐコード化ステム、およびループを含む、工程；
逆転写産物の収集物を形成するために、逆転写反応において、該少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーを伸長する工程；
ＰＣＲに基づくプレ増幅（ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）産物の収集物を形成するために該逆転写産物の収集物に対し、ＰＣＲに基づくプレ増幅を行う工程であって、ここで、該ＰＣＲに基づくプレ増幅が、少なくとも３００の異なるフォワードプライマーおよび少なくとも一つのリバースプライマーを含み、ここで該リバースプライマーの配列が、該少なくとも一つのステムループ逆転写プライマーのループと実質的に同じ配列、およびＴｍ増大テイルを含み、；
この工程においては、それぞれの該少なくとも３００の異なるフォワードプライマーが、ｉ）特定の逆転写産物の配列の５’末端に相補的である３’標的特異的部分、およびｉｉ）特定の逆転写産物の配列に独特である５’ｚｉｐコードテイルを含む、工程；そして
該ＰＣＲに基づくプレ増幅産物の収集物を少なくとも３００の異なる反応容器へ分ける工程；
該３００の異なる反応容器のそれぞれにおいて復号ＰＣＲを行う工程であって、ここでそれぞれの復号ＰＣＲは、特定の標的核酸配列に関する該ＰＣＲに基づくプレ増幅反応におけるフォワードプライマーと実質的に同じ配列を含むフォワードプライマー、リバースプライマー、および検出プローブを含み、ここで、該検出プローブの配列は、ｉ）特定のステムループ逆転写プライマーの３’ステム領域と同じである少なくとも６核酸塩基の配列、およびｉｉ）該特定のステムループ逆転写プライマーにより尋ねられる該短い標的核酸に対して相補的である少なくとも６核酸塩基の配列を含む、工程；
該少なくとも３００の異なる反応容器のそれぞれにおいて、該検出プローブを検出する工程；ならびに、
該少なくとも３００の異なる短い標的核酸を定量する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記逆転写がサイクリングを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サイクリングが、２０℃で３０秒間、４２℃で３０秒間、および５０℃で１秒間の６０サイクルを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲに基づくプレ増幅が、１２〜２０サイクルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＣＲに基づくプレ増幅が、１４〜１８サイクルを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記１２〜２０サイクルそれぞれが、９５℃で１秒間および６５℃で１分間を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも３００の短い標的核酸が、マイクロＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも３００の短い標的核酸が、単一の細胞から収集される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーが、実質的に同じループ配列を含み、そして前記ＰＣＲに基づくプレ増幅反応において使用される前記リバースプライマーの配列が、該ループの配列の少なくとも７０パーセントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＣＲに基づくプレ増幅反応における少なくとも一つのリバースプライマーの前記Ｔｍ増大テイルが、少なくとも４核酸塩基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＣＲに基づくプレ増幅反応における、少なくとも一つのリバースプライマーの前記Ｔｍ増大テイルが、５核酸塩基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
標的核酸を定量するための方法であって、以下、
該標的核酸と標的特異的ステムループ逆転写プライマーを接触させる工程であって、該ステムループ逆転写プライマーが、３’標的特異的部分、ｚｉｐコード化ステム、およびループを含む、工程；
逆転写産物を形成するために、逆転写反応において該ステムループ逆転写プライマーを伸長する工程；
ＰＣＲに基づくプレ増幅産物を形成するために、該逆転写産物に対しＰＣＲに基づくプレ増幅を行う工程であって、ここで該ＰＣＲに基づくプレ増幅が、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで該リバースプライマーの配列が、該少なくとも一つのステムループ逆転写プライマーのループと実質的に同じ配列、および非相補的テイルを含み、ここで該フォワードプライマーの配列が、ｉ）特定の逆転写産物の配列の５’末端に相補的である配列、およびｉｉ）５’ｚｉｐコードテイルを含む、工程；
該ＰＣＲに基づくプレ増幅の産物のアリコートに対し復号ＰＣＲを行う工程であって、該復号ＰＣＲは、該ＰＣＲに基づくプレ増幅反応におけるフォワードプライマーと同じ配列であるフォワードプライマー、該ＰＣＲに基づくプレ増幅反応におけるリバースプライマーと実質的に同じ配列を含むリバースプライマー、および、検出プローブを含み、該検出プローブの配列が、ｉ）該ステムループリバースプライマーの３’ステム領域と同じである、少なくとも６塩基の配列、およびｉｉ）該標的核酸に対して相補的である、少なくとも６塩基の配列を含む、工程；
該検出プローブを検出する工程；ならびに
該標的核酸を定量する工程を含む、方法。
【請求項１３】
前記逆転写がサイクリングを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的核酸がマイクロＲＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的核酸が単一の細胞から収集される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＣＲに基づくプレ増幅反応において使用される前記リバースプライマーが、前記ステムループ逆転写プライマーのループと、実質的に同じ配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的核酸が１８〜３０ヌクレオチド長である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記逆転写がサイクリングを含み、そして該サイクリングが、２０℃で３０秒間、４２℃で３０秒間、および５０℃で１秒間の６０サイクルを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＣＲに基づくプレ増幅が１２〜２０サイクルを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
それぞれの短い標的核酸が１８〜３０ヌクレオチド長である、少なくとも３００の短い標的核酸を定量するための方法であって、該方法が、
マルチプレックスの逆転写反応を行う工程；
マルチプレックスのＰＣＲに基づくプレ増幅反応を行う工程；
少なくとも３００の異なる復号ＰＣＲを行う工程；および
それぞれの短い標的核酸が１８〜３０ヌクレオチド長である、すくなくとも３００の短い標的核酸を定量する工程を含む、方法。
【請求項２１】
前記マルチプレックスの逆転写反応がサイクリングを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記短い標的核酸がマイクロＲＮＡである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記短い標的核酸が単一の細胞から収集される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記短い標的核酸が１８〜３０ヌクレオチド長である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記マルチプレックスの逆転写反応が、サイクリングを含み、そして、該サイクリングが、２０℃で３０秒間、４２℃で３０秒間、および５０℃で１秒間の６０サイクルを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記マルチプレックスのＰＣＲに基づくプレ増幅が、１２〜２０サイクルを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
標的核酸を増幅するための方法であって、以下、
該標的核酸と標的特異的ステムループ逆転写プライマーとを接触させる工程であって、該ステムループ逆転写プライマーが、３’標的特異的部分、ｚｉｐコード化ステム、およびループを含む、工程；
逆転写産物を形成するために、逆転写反応において該ステムループ逆転写プライマーを伸長する工程であって、該逆転写反応がサイクリングを含む、工程；
ＰＣＲに基づくプレ増幅産物を形成するために、該逆転写産物に対してＰＣＲに基づくプレ増幅を行う工程であって、ここで該ＰＣＲに基づくプレ増幅が、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、該リバースプライマーの配列が、該少なくとも一つのステムループ逆転写プライマーのループと実質的に同じ配列、およびＴｍ増大テイルを含み、そして該フォワードプライマーの配列が、ｉ）特定の逆転写産物の配列の５’末端に相補的である配列、およびｉｉ）５’ｚｉｐコードテイルを含む、工程；ならびに
該標的核酸を増幅する工程を含む、方法。
【請求項２８】
前記マルチプレックスの逆転写反応が、サイクリングを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記短い標的核酸が、マイクロＲＮＡである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記短い標的核酸が、単一の細胞から収集される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記短い標的核酸が１８〜３０ヌクレオチド長である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記マルチプレックスの逆転写反応が、サイクリングを含み、ならびに、該サイクリングが２０℃で３０秒間、４２℃で３０秒間、および、５０℃で１秒間の６０サイクルを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記マルチプレックスのＰＣＲに基づくプレ増幅が１２〜２０サイクルを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも３００の短い標的核酸を増幅するためのキットであって、該キットが、以下、
それぞれ実質的に同じループ配列を含む、少なくとも３００のステムループ逆転写プライマー；
それぞれ別個の３’標的特異的部分および別個の５’テイルを含む、少なくとも３００のフォワードプライマー；
ユニバーサルリバースプライマーであって、ここで該ユニバーサルリバースプライマーの配列が、該少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーのループ中に含まれている配列と実質的に同じ配列、およびＴｍ増大テイルを含む、ユニバーサルリバースプライマーを含む、キット。
【請求項３５】
さらに逆転写酵素を含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
さらにｄＮＴＰを含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
さらにＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
さらにマイクロタイタープレートを含む、請求項３４に記載のキットであって、少なくとも３３０のフォワードプライマーのそれぞれ、および前記ユニバーサルリバースプライマーが別々のウェルに配置させられている、キット。
【請求項３９】
１８〜３５核酸塩基長の少なくとも３００の異なる短い標的核酸を含む組成物であって、該少なくとも３００の異なる短い標的核酸のそれぞれが、固有のステムループ逆転写プライマーにハイブリダイズされ、該少なくとも３００のステムループ逆転写プライマーのそれぞれが、実質的に同じループ配列ならびに固有のｚｉｐコードステム部分および固有の３’標的特異的部分を含む、組成物。
【請求項４０】
さらに逆転写酵素を含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
さらにｄＮＴＰを含む、請求項３９に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５４５４３０（Ｐ２００８−５４５４３０Ａ）
【公表日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１４８２４（Ｐ２００８−５１４８２４）
【出願日】平成１８年５月３１日（２００６．５．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２１１７２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１７２５６
【国際公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【出願人】（５０００６９０５７）アプレラ コーポレイション (120)
【住所又は居所原語表記】８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ ９４４０４ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月３１日（２００６．５．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２１１７２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１７２５６
【国際公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【出願人】（５０００６９０５７）アプレラ コーポレイション (120)
【住所又は居所原語表記】８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ ９４４０４ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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