移植用細胞の製造方法
本発明は、哺乳動物の心筋組織に移植するための細胞を調製する方法を特徴とする。
その方法は、（ａ）不死化されていない骨髄幹細胞を供給する、（ｂ）骨髄幹細胞の特質を維持する条件下で２回継体培養する、（ｃ）骨髄幹細胞を心筋特異的培地で培養し心筋芽細胞に分化させる、及び（ｄ）骨髄幹細胞の約８０〜９０％が心筋芽細胞に分化されたときに、工程（Ｃ）の細胞を採取する工程を含有する。
この方法によって誘導された心筋芽細胞は、５−アザシチジンのような脱メチル化試薬を用いて得られたものよりも臨床的により適切に適用できる。従って、心臓機能不良を伴う疾患であると診断された哺乳動物(例えばヒト)の治療に、高い細胞の取り込み及び細胞の生存率を有する、心筋細胞に誘導された哺乳動物の骨髄幹細胞が提供される。
その方法は、（ａ）不死化されていない骨髄幹細胞を供給する、（ｂ）骨髄幹細胞の特質を維持する条件下で２回継体培養する、（ｃ）骨髄幹細胞を心筋特異的培地で培養し心筋芽細胞に分化させる、及び（ｄ）骨髄幹細胞の約８０〜９０％が心筋芽細胞に分化されたときに、工程（Ｃ）の細胞を採取する工程を含有する。
この方法によって誘導された心筋芽細胞は、５−アザシチジンのような脱メチル化試薬を用いて得られたものよりも臨床的により適切に適用できる。従って、心臓機能不良を伴う疾患であると診断された哺乳動物(例えばヒト)の治療に、高い細胞の取り込み及び細胞の生存率を有する、心筋細胞に誘導された哺乳動物の骨髄幹細胞が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は哺乳動物の心筋組織に移植するための細胞を製造する方法に関するものである。特に、哺乳動物の骨髄幹細胞を生物学的な成長因子で処理して心臓系に分化させ、分化した骨髄幹細胞を一定期間インビトロで処理して細胞の取り込み及び細胞の生存率を高め、生じた骨髄幹細胞を心筋梗塞の哺乳動物に移植し、変化した状態を評価する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
成体の骨髄から得られる間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肝細胞及び心筋細胞などの様々な細胞に分化する能力を有している。このような能力のため、骨髄幹細胞は細胞移植に好適に用いられている。
【０００３】
心筋梗塞は、世界における最も重大な死因の一つとなっている。成人の心臓では心筋芽細胞（cardiomyogenic cell）が増殖できないため、心筋梗塞による心筋細胞死により健康な細胞部位が傷つけられる。
【０００４】
最近の研究では、骨髄幹細胞は心臓に移植された後に顕著な柔軟性を示すことが見出されている。心筋に移植された骨髄幹細胞は心筋芽細胞に分化転換（transdifferentiate）する能力を有するので、心筋の再生に使用することが可能である。しかし、治療に於ける有効性が見込まれるにもかかわらず、骨髄幹細胞は有意な機能改善を示すほどには心筋芽細胞に分化しない。従って、骨髄幹細胞を心筋細胞に分化させる更なる研究がなされている。
【０００５】
５−アザシチジンのような脱メチル化試薬で処理することにより、骨髄幹細胞を心筋細胞に分化させることが可能であるとの報告がある。５−アザシチジンは、ゲノムのヌクレオシド配列を無作為で脱メチル化し、正常のサイレント遺伝子の発現をもたらすものである。５−アザシチジンで処理した骨髄幹細胞は、心筋細胞（ＭｙｏＤ陽性）、骨細胞（オステオカルシン陽性）、脂肪細胞（ＰＰＡＲ−陽性）及び心筋芽細胞（心筋トロポニンＩ陽性）のような、様々な細胞を発生させる。骨髄幹細胞は、５−アザシチジンに曝露されるとｃ−ａｂｌ及びインターロイキン−６の転写が急速に増加し、主な基質タンパク質であるコラーゲンＩの発現は減少する。しかしながら、５−アザシチジンのような脱メチル化試薬は、人体には安全であるが、心筋芽細胞といった一つの細胞型に有意に分化させることはできない。
【０００６】
本発明者らは以上のような問題点を考慮して、骨髄幹細胞は、移植する前に特定の生物環境に曝すと心筋系に分化転換し易くなると推測し、細胞を一つの細胞型(例えば、心筋芽細胞のような）へ誘導するのに適した生物学的な成長因子及び条件を見出すべく試みた。その結果として、生物学的な成長因子を処理することで、骨髄幹細胞を心筋細胞系へ直接誘導する特異的な方法を開発した。更に、細胞の取り込み及び細胞の生存率を高めるために、誘導された骨髄幹細胞を投与する前にインビトロで一定の期間処理する方法も開発した。当該方法により誘導された骨髄幹細胞を梗塞犬の心筋に移植し心筋梗塞が改善したのを確認した。
【０００７】
本出願人であるＡＮＴＥＲＯＧＥＮ ＣＯ．，ＬＴＤ所有の韓国特許出願第１０-２００３-０００４５６５号には、骨髄幹細胞から心筋芽細胞を高収率で生産する方法が記載されている。本発明は、先願に較べ、更に具体的で改良された方法を提供するものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は哺乳動物の骨髄幹細胞を生物学的な成長因子を用いて心筋細胞に誘導し、誘導された骨髄幹細胞を、細胞の取り込み及び細胞の生存率を高めるために、移植する前に一定期間処理する方法を提供するものであり、また、こうして生産された骨髄幹細胞を心機能が不完全な障害と診断された哺乳動物(例えば、ヒト)を治療するために提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様に於いて、
(ａ) 不死化されていない骨髄幹細胞を供給する、
(ｂ) 骨髄幹細胞を、骨髄幹細胞の特質を維持する条件下で２回継代培養する、
(ｃ) 骨髄幹細胞を、心筋芽細胞に分化させるために心筋特異的培地で培養する、及び
(ｄ) 工程(ｃ)の細胞の約８０〜９０％が心筋芽細胞に分化されたときに、その細胞を採取する、
工程を含有してなる、哺乳動物の心筋組織に移植するための細胞の生産方法を提供する。
本発明の方法に於いて、骨髄幹細胞は、移植先の哺乳動物由来のものであってもよい。骨髄幹細胞は、工程(ｃ)に於いて、１時間〜２１日間培養するのが好ましく、６日間培養するのがより好ましい。
【００１０】
工程（ｃ）に於ける心筋特異的培地は、生物学的な成長因子であるｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子)、ＢＭＰ-２(骨形成因子２)及びＩＧＦ-１（インスリン様成長因子１）を含む。培地は、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ-２及びＩＧＦ-１をそれぞれ１〜２００ｎｇ/ｍｌの濃度で含有し、２〜２０％の牛胎仔血清、１〜１０００μＭのＬ-アスコルビン酸-２-ＰＯ４、５〜１５ｎｇ/ｍｌのＬＩＦ、及び１〜２００ｎＭのデキサメタゾンをさらに含有することが好ましい。
【００１１】
本発明の方法によれば、培養された骨髄幹細胞は移植に適した心筋芽細胞に特異的なマーカーを発現する。上記の工程に於いて、ＭＥＦ２タンパク質を発現しているが、ＭＦ−２０は発現していない細胞を採取するのが好ましい。
【００１２】
本発明による、哺乳動物の心臓組織に移植するための細胞の産生は下記の方法：
移植前に骨髄幹細胞を心筋系細胞に誘導する、
誘導された骨髄幹細胞を、細胞の取り込み及び細胞の生存率を高めるために、一定期間培養する、及び
哺乳動物の心筋梗塞モデルに移植して評価する
によって実施される。
【００１３】
まず、移植する前に骨髄幹細胞を心筋系統に誘導する方法は次の工程を含む。
(１) 不死化されていない骨髄幹細胞を供給する、
(２) 十分な数の細胞を得るために骨髄幹細胞を継代培養する、
(３) 前記骨髄幹細胞を生物学的な成長因子を含む心筋特異的な培地(cardiac specific media)で培養して心筋芽細胞に分化させる、
(４) 工程(３)の細胞の分化状態をモニタリングする、そして
(５) 前記細胞の約６０〜９０％が心筋芽細胞に分化されたときに、工程(３)の細胞を採取する。
【００１４】
更に又、誘導された骨髄幹細胞を、細胞の取り込み及び細胞の生存率を高めるために、一定期間培養する方法は次の工程を含む。
(１) 不死化されていない骨髄幹細胞を供給する、
(２) 十分な数の細胞を得るために前記骨髄幹細胞を継代培養する、
(３）前記骨髄幹細胞を生物学的成長因子を含有する心筋特異的培地で１時間〜２１日間培養して心筋芽細胞に分化させる、
(４) 工程(３)の細胞の分化状態を特定の期間モニタリングする、そして
(５) 細胞の約８０〜９０％が心筋芽細胞に分化されたときに、工程(３)の細胞を採取する。
【００１５】
更にまた、細胞を哺乳動物の心筋梗塞モデルに移植してその効果を評価する方法は次のような工程を含む。
(１) 心筋梗塞哺乳動物モデルを製造する、
(２) 哺乳動物から骨髄幹細胞を分離する、
(３) 十分な数の細胞を得るために、骨髄幹細胞を継代培養する、
(４) 前記骨髄幹細胞を生物学的な成長因子を含む心筋特異的培地で６日間培養して心筋芽細胞に分化させる、
(５) 細胞の約８０〜９０％が心筋芽細胞に分化されたときに、工程(４)の細胞を採取する、そして
(６) 心筋芽細胞を哺乳動物に移植する。
【００１６】
本発明者らは、哺乳動物の骨髄幹細胞を、心臓系に分化させるために生物学的な成長因子で処理して、損傷を受けた心筋での細胞の取り込み及び細胞の生存率を高めるために、この細胞を投与前の一定期間培養した。更に、培養した細胞を哺乳動物の梗塞を起こした心筋層に移植して、分化の状態を評価した。本発明によって誘導された心筋芽細胞は、５−アザシチジンのような脱メチル化試薬を用いて得られたものに較べより好適である。
【００１７】
以下、本発明をさらに詳述する。
哺乳動物の心筋組織に移植する細胞をインビトロで製造する工程に於いては骨髄幹細胞を心筋細胞系に誘導するために全工程で成長因子が使用される。心筋細胞に誘導するために、特に生物学的な成長因子は全て、胚の発達過程で使用することができる。このような成長因子には、ｂＦＧＦ(塩基性線維芽細胞成長因子)、ＢＭＰ-２(骨形成因子２)及びＩＧＦ-１(インスリン様成長因子１)、ＴＧＦ-β、Ｗｎｔ-阻害物質、アクチビン(activin)、レチノ酸(retinoic acid)、Ｅｒｂ-２、全ＦＧＦ成長因子メンバー、全ＴＧＦ成長因子メンバー、及び全ＩＧＦ成長因子メンバーなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
移植された細胞は、活発に増殖し、十分に分化する。骨髄幹細胞は心筋細胞系に特異的に誘導され（心筋特異的マーカーにより同定可能である）、使用される。これらのマーカーには、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２（筋細胞エンハンサー因子２）、及びＳＲＦ（血清応答因子）等が含まれるが、これらに限定されるものではない。心臓分化マーカーの発現により同定される心筋芽細胞もまた使用可能である。これらのマーカーは、ＭＨＣ（ミオシン重鎖）、ｃＴｎＩ（心筋トロポニンＩ）、ｃＴｎＴ（心筋トロポニンＴ）、心筋αアクチン、αアクチン及びＭＬＣ２（ミオシン軽鎖）等を含むが、これらに限定されるものではない。骨髄幹細胞は、互いにコミニュケートするという特徴を有する心筋細胞として利用することも可能である。このような細胞の表現型は、周期的な収縮及び心臓と関連するマーカーの発現によって評価できる。心臓と関連するマーカーの同定には、例えばレポータ遺伝子の発現(心筋特異的プロモーターによって誘導されるＬａｃＺ）、ＲＮＡ発現（逆転写ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＲＮａｓｅプロテクション法）又はタンパク質の発現（免疫蛍光アッセイ、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリー）等の、検出可能な何れの方法を用いてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
上記の方法によって移植する細胞には、心筋芽細胞に分化する過程の何れの細胞を用いてよい。
「骨髄間葉系幹細胞又は骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）」は骨髄間葉由来の幹細胞、即ちＣＤ４５を意味する。また骨髄間葉系幹細胞は、骨髄幹細胞及び「骨髄多能性前駆細胞」をも意味する。
「心臓細胞(cardiac cell)」は分化した心臓細胞(例えば、心筋細胞)又は心臓細胞を生成したり心臓細胞に分化するように決定づけられた細胞（例えば、cardiomyoblast（心筋新生細胞）又はcardiomyogenic cell （心筋芽細胞））を意味する。
「心筋細胞（cardiomyocyte）」は検出可能な量の心臓マーカー（例えば、α−ミオシン重鎖、ｃＴｎＩ、ＭＬＣ２ｖ、心筋αアクチン、及びインビボでコネキシン４３）を発現し、収縮し、増殖しない心臓の筋肉細胞を意味する。
「心筋新生細胞（cardiomyoblast）」は検出可能な量の心臓マーカーを発現し、収縮し、増殖する細胞を意味する。
「心筋芽細胞（cadiomyogenic cell）」は検出可能な量のＣｓｘ/Ｎｋｘ２．５ＲＮＡ又はタンパク質を発現し、組織化された筋節構造（sarcomeric structure）や収縮を示さず、そして好ましくは検出可能な量のミオシン重鎖タンパク質を発現しない細胞を意味する。
「心筋特異的(cardiac specific)」とは最終的に分化されたマーカーが発現する前に、心臓の初期転写因子が発現する心臓分化の初期過程を意味する。
「心筋特異的培地（cardiac specific media）」は骨髄幹細胞を心筋細胞に誘導するｂＦＧＦ、ＢＭＰ-２及びＩＧＦ-１を含有する培地を意味する。
「分化転換（transdifferentiation）」は、胚葉起源が異なる他の細胞型に分化することを意味する。
本発明の他の特徴と利点は以下の本発明の好ましい態様の記載及び請求の範囲から明らかである。
【００２０】
(発明の効果)
本発明により誘導された心筋芽細胞は、５−アザシチジンのような脱メチル化試薬を用いて誘導されたものと較べ、より好適に臨床に適用できる。本発明は、高い細胞の取り込み及び細胞の生存率を有する、心筋細胞に誘導された哺乳動物の骨髄幹細胞を提供し、心臓機能不良を伴う疾患と診断された哺乳動物(例えばヒト)の治療に当該誘導された骨髄幹細胞を用いるものである。
(実施例)
【００２１】
（発明の最良の形態）
以下、多様な実施例により、本発明を具体的に説明する。これら実施例は説明のためのみに提供されるものであり、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。更に、当該実施例は、イヌの骨髄から単離した骨髄幹細胞について説明するものであるが、本発明は、これらに限定されることなく、ヒト、ラット、マウス、サル等を含む全ての哺乳動物から単離した骨髄幹細胞に適用されるものである。
【実施例１】
【００２２】
生物学的成長因子で処理して骨髄幹細胞から心筋芽細胞を誘導する方法
心筋梗塞を起こして４週間以上経過した後に、ヘパリンに浸した注射器で、イヌの腸骨から１５〜２０ｍｌの骨髄幹細胞を採取した。採取した骨髄幹細胞を２〜２０％の牛胎仔血清、１〜１，０００μＭのＬ-アスコルビン酸−２−ＰＯ４、５〜１５ｎｇ/ｍｌのＬＩＦ(白血病抑制因子)及び１〜２００ｎＭのデキサメタゾンを含む培地で培養した。全ての培養器とスライドを、骨髄幹細胞を入れる前に、室温で１５分間、５ｎｇ/ｍｌのコラーゲンでコーティングした。当該インビトロ条件は、骨髄幹細胞の自己再生を保持させて、成長因子のような分化試薬に対する反応性を失わずに、継代増殖させるものである。さらに当該条件は、継代培養しても、骨髄幹細胞が間葉性の形態（mesenchynmal morphology）と核型(keryotype)を維持できるようにするものである。図１は、イヌから単離して培養した骨髄幹細胞の位相差顕微鏡写真(１００倍)である。
【００２３】
骨髄幹細胞を２回継代培養して４ウェルのチャンバースライドに植菌し、心筋分化培地で処理した。分化培地は、ＤＭＥＭ中に２〜２０％の牛胎仔血清、１〜１０００μＭのＬ-アスコルビン酸-２-ＰＯ４、５〜１５ｎｇ/ｍｌのＬＩＦ、１〜２００ｎＭのデキサメタゾン、１〜２００ｎｇ/ｍｌのｂＦＧＦ、１〜２００ｎｇ/ｍｌのＢＭＰ２及び１〜２００ｎｇ/ｍｌのＩＧＦ-１を含むものである。この培地は、胚の発生過程において、心筋に分化する重要な役割を果たすものとして知られる成長因子を含んでいる。
【００２４】
成長因子の存在下で１４日間培養した後、約５０〜９０％の骨髄幹細胞がＭＥＦ２タンパク質を発現した。図２は、イヌの骨髄幹細胞を心臓細胞特異的培地で培養した後のＭＥＦ２(Ａ)とデスミン(Ｂ)の形態（morphology）及び発現を示す一連の顕微鏡写真（１００倍）であり、一方、(Ｃ)はＭＦ-２０の陰性対照である。
これらの細胞において、ＭＥＦ２タンパク質は見出されたが、ＭＦ-２０との免疫反応によって確認できる心臓分化マーカーの発現は見られなかった。よって、細胞は、心筋特異的マーカーは発現するものの、最終分化(terminal differentiation)マーカーを発現しないものとみられる。
【００２５】
ＭＥＦ２の発現は、心臓系特異マーカーとして使用され、発現したタンパク質は細胞核に位置する。ＭＥＦ２転写因子は、心臓に分化誘導される前の胚発生過程において、心臓前駆体細胞に発現する。これらの遺伝子は、胚発生過程に於ける初期の心臓前方中胚葉（precardiac mesoderm）で発現する。更に、ＭＥＦ２タンパク質は、完全な心臓分化に必要とされる多くの構造遺伝子の発現に於ける重要な転写因子である。
【００２６】
次のような方法で、細胞において検出するのが可能なようにＭＥＦ２又はミオシン重鎖を標識した。培養された細胞を４％のホルムアルデヒドで２０分間冷蔵固定し、その後０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ-１００を含有するＰＢＳで１５分間処理した。ＰＢＳで３回洗浄した後、得られた細胞をブロッティング溶液（１％の牛胎仔血清アルブミン及び０．２％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で１５分間処理した。処理した試料を抗ＭＥＦ２（１:２００、ｓｃ-１０７９４、Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz）、ＭＦ-２０（１:１００、 Developmental Studies Hybridoma Bank、University of Iowa、Iowa City、Iowa)、抗デスミン（１:１００〜２００、Sigma-Aldrich）及び、必要により、アイソタイプ抗体（ＭＥＦ２に対してウサギＩｇＧ２ｂ、ＭＦ-２０に対してマウスＩｇＧ２ｂ、Ｄｅｓｍｉｎに対してマウスＩｇＧ１)のうち一種を用いて４℃で恒湿槽中で一晩培養する。その後、試料スライドを洗浄液（０．５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄し、次いで、供給業者が提供する指示書にしたがって２次抗原（ＭＥＦ２にはロバ抗ウサギＩｇＧ、ＭＦ２０とデスミンにはロバ抗マウスＩｇＧ：Molecular Probe）と反応させた。３回洗浄後、試料を蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＴＳ１００顕微鏡）で観察した。
【実施例２】
【００２７】
高い細胞取り込みと細胞生存率を有する骨髄幹細胞を心筋芽細胞に一定期間誘導する方法
骨髄幹細胞は、心筋特異的培地で、１時間〜２１日間のうちの各期間に亘り生物学的な成長因子で処理することができるが、この間に、約４０〜９０％の細胞で核タンパク質であるＭＥＦ２の発現が見られる。心筋特異的培地で処理する期間に応じて、心筋芽細胞への誘導を６０〜９０％まで増加させることができる。最適な期間処理することにより、８０〜９０％の細胞に於いてＭＦ２タンパク質を発現させることができる。移植する骨髄幹細胞は、８０〜９０％がＭＥＦ２タンパク質を発現するものであり、梗塞を起こした心臓を再生させるのには最適なものである。
【００２８】
成犬から単離した骨髄幹細胞を心筋特異的培地で６日間培養し、蛍光顕微鏡で観察すると、最適量のＭＥＦ２タンパクが核内に存在することが示された。梗塞犬への細胞移植は、移植した細胞が心筋に組み込まれ、イヌが移植後９６日間生存したことを示した。図７は、移植９６日後の心筋梗塞犬の心筋に移植した骨髄幹細胞の局在を示す顕微鏡写真(４０倍)である。赤色の蛍光は心臓に移植したＤｉＩ標識した骨髄幹細胞、緑色の蛍光はＭＦ２０抗体に反応した心筋芽細胞を示すものである。当該インビボ実験は次のように実施された。
【００２９】
誘導の最適時間を決定するために、イヌの骨髄幹細胞を２回継代培養して、この培養細胞をコラーゲンでコーティングした４ウェルのチャンバースライドに１０，０００細胞／チャンバーの濃度で植菌した。２４時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄して、１ｍｌの心筋特異的培地を添加した。一つのスライドには、心筋特異的培地を使用せず陰性対照群とした。心筋特異的培地で処理して１、２、３、４、５、６、８及び１０日後に細胞を固定し、ＭＥＦ２抗体を染色して、蛍光顕微鏡で観察した。図３は、心筋特異的培地で処理し、染色した、ＢＭＳＣ（骨髄幹細胞）に於けるＭＥＦ２の発現を示す一連の顕微鏡写真（Ａ〜Ｆは２００倍、Ｇ〜Ｎは１００倍）である。Ａ及びＤは非処理細胞を示し、Ｂ及びＥは心筋特異的な培地で処理してから１日後の細胞を示し、Ｃ及びＦは処理後２日、Ｇ及びＫは処理後３日、Ｈ及びＬは処理後６日の細胞を示している。Ｉ及びＭは、８日間処理し、その後ウサギＩｇＧで染色した陰性対照である。ＭＥＦ２染色の相対的強度試験の結果、心筋特異的培地で６日間処理したものが最大の発現を示している。
以上のような結果に基づき、心筋特異的培地で６日間処理した後に採取した細胞を心筋インビボ試験でイヌの梗塞モデルに使用した。
【実施例３】
【００３０】
骨髄幹細胞の移植及び取り込み率及び生存率の評価
心筋芽細胞系へとインビトロで誘導した骨髄幹細胞を、イヌの心筋梗塞組織に移植した。イヌの心筋梗塞は、右冠状動脈の永久閉塞によるものである。骨髄幹細胞移植に先立ち、梗塞を少なくとも２ヶ月間安定化した。移植による免疫拒否反応を防止するために、それぞれの移植レシピエントのイヌから下記の要領で、骨髄を採取して、骨髄幹細胞を調製した。
【００３１】
心エコー検査により心筋梗塞を確認し、結紮後約４週間が経過してから長骨髄腸骨を穿刺して骨髄を吸引した。 骨髄を直ちにヘパリンと混合し、冷凍し、ドライアイスと共に組織培養装置へ移した。そこで、３７℃で解凍し、摂動して（perturbated）、通常のＤＭＥＭで一回洗浄した。そして、培養液（２〜２０％の牛胎仔血清、１〜１、０００μＭのＬ-アスコルビン酸-２-ＰＯ４、５〜１５ｎｇ/ｍｌのＬＩＦ、１〜２００ｎＭのデキサメタゾン）の入った組織培養フラスコに入れた。２回継代培養した後、骨髄幹細胞を１〜２００ｎｇ/ｍｌのｂＦＧＦ、１〜２００ｎｇ/ｍｌのＢＭＰ２、及び１〜２００ｎｇ/ｍｌのＩＧＦ-１を含有する培地で６日間培養した。移植後の細胞の生存と経過を追跡するために、骨髄幹細胞を採取する際に赤色の蛍光マーカーであるＤｉＩで標識した。約２×１０８個の細胞を採取し、心臓の梗塞部位に注入した。
【００３２】
移植後の骨髄幹細胞の生存を、ＤｉＩ蛍光の事後分析による視覚化により測定した。図４は、移植１５日後の梗塞犬の心筋における移植した骨髄幹細胞の局在を示す顕微鏡写真（４０倍）である。赤色の蛍光は宿主の心筋に移植したＤｉＩ標識した骨髄幹細胞を、緑色の蛍光はＭＦ２０抗原で染色した心筋芽細胞を、そして青色の蛍光はＤＡＰＩで標識した核を示す。図４に示されるように、移植１５日後の心筋層でＤｉＩ陽性細胞の大きな塊が観察された。これは骨髄幹細胞が長期間生存していることを示唆している。特に、ＤｉＩで標識した幹細胞は、ＭＦ２０陽性である心筋細胞を含んでいる心筋層内部位で、またＭＦ２０陽性である心筋細胞が欠如している心筋梗塞部位で観察された。
【００３３】
移植した細胞の長期間にわたる生存能力を調べるためにイヌを犠牲にして観察した。図５は、移植７０日後のイヌの心筋梗塞における移植した骨髄幹細胞の局在を示している顕微鏡写真(４０倍)である。赤色の蛍光は、心筋に移植したＤｉＩ標識した骨髄幹細胞を、緑色の蛍光はＭＨＣ抗体に反応した心筋芽細胞を、そして青色の蛍光はＤＡＰＩで標識した核を示す。図６は、移植７０日後のイヌの心筋梗塞における移植した骨髄幹細胞の局在を示す顕微鏡写真(４０倍)である。赤色の蛍光は心筋に移植したＤｉＩ標識した骨髄幹細胞を、緑色の蛍光はｃＴＮＩ抗体に反応した心筋芽細胞を示す。
【００３４】
更に図７は、移植後９６日の心筋梗塞犬の心筋に移植した骨髄幹細胞の局在を示す顕微鏡写真であって(４０倍)、赤色の蛍光は心臓に移植したＤｉＩ標識した骨髄幹細胞、緑色の蛍光はＭＦ２０抗体に反応した心筋芽細胞を示す。図５〜図７に示めされるように、全ての場合において、梗塞領域でＤｉＩで標識した細胞が観察された。一部、ＤｉＩ蛍光が、ＭＦ２０を含んだ心筋特異的マーカーと同じ領域で観察された。更に、梗塞領域の境界部位は、心筋特異的マーカーであるＭＨＣα／β及びＴＮＩも発現するＤｉＩ陽性の幹細胞を含んでいた。
これらのデータは、上記の方法によって、インビトロで調整され、移植した骨髄幹細胞が、宿主の心筋に生存し、取り込まれて、心臓分化に特異的なマーカーを発現することを示すものである。
【実施例４】
【００３５】
心筋梗塞の改善
上述のイヌの心筋梗塞モデルを用いて、心エコー検査（ＥＣＧ）により骨髄幹細胞移植の回復効果を評価した。骨髄幹細胞移植後３．５週間、４．５週間、及び５週間後に心エコー検査を行い、移植前の心エコー検査と比較した。
【００３６】
図８は、梗塞犬の心筋に導入した骨髄幹細胞の移植前（ＢＬ）及び移植後（４、８及び１２週）の心拍数の変化を示めすグラフである。図９は、心エコー検査において梗塞犬の心筋に誘導した骨髄幹細胞の移植前（ＢＬ）及び移植後４、８、１２週の短縮率（fractional shortening）と領域短縮率（area shortening）の変化を示めす一連のグラフである。更に、図１０は、心エコー検査においての梗塞犬の心筋に誘導した骨髄幹細胞の移植前（ＢＬ）及び４、８、１２週後の後壁の厚さの変化を示しているグラフである。
【００３７】
図８〜１０に示めされるように、各々の動物において、梗塞部位に於ける収縮は、心筋の隣接領域にさらに同期化された。心エコー検査の結果は、実施例３の組織学的所見を確認し、培養した骨髄幹細胞の移植は、梗塞後の心臓組織を部分的に回復させたことを立証するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
本発明の上記又はその他の目的、特徴及び利点は、添付の図面と併せて上記の詳細な説明によって、より明確に理解されるものである。
【図１】図１は、イヌから単離して、培養した骨髄幹細胞の位相差顕微鏡写真(１００倍)である。
【図２】図２は、イヌの骨髄幹細胞を心臓細胞特異的培地で培養した後のＭＥＦ２(Ａ)及びデスミン(Ｂ)の形態（morphology）及び発現を示す一連の顕微鏡写真（１００倍）であり、一方、(Ｃ)はＭＦ-２０の陰性対照である。
【図３】図３は、心筋特異的培地で処理し、染色した骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）に於けるＭＥＦ２の発現を示す一連の顕微鏡写真（Ａ〜Ｆは２００倍、Ｇ〜Ｎは１００倍）である。Ａ及びＤは非処理細胞を示し、Ｂ及びＥは心筋特異的な培地で処理してから１日後の細胞を示し、Ｃ及びＦは処理後２日、Ｇ及びＫは処理後３日、Ｈ及びＬは処理後６日の細胞を示している。Ｉ及びＭは、８日間処理し、その後ウサギＩｇＧで染色した陰性対照である。
【図４】図４は、移植１５日後の梗塞犬の心筋における移植した骨髄幹細胞の局在を示す顕微鏡写真（４０倍）である。赤色蛍光は宿主の心筋に移植したＤｉＩ標識した骨髄幹細胞を、緑色蛍光はＭＦ２０抗原で染色した心筋芽細胞を、そして青色蛍光はＤＡＰＩで標識した核を示している。
【図５】図５は、移植７０日後のイヌの心筋梗塞における移植した骨髄幹細胞の局在を示す顕微鏡写真(４０倍)である。赤色の蛍光は、心筋に移植したＤｉＩ標識した骨髄幹細胞を、緑色の蛍光はＭＨＣ抗体に反応した心筋芽細胞を、そして青色の蛍光はＤＡＰＩで標識した核を示している。
【図６】図６は、移植７０日後のイヌの心筋梗塞における移植した骨髄幹細胞の局在を示す顕微鏡写真(４０倍)である。赤色の蛍光は心筋に移植したＤｉＩで標識した骨髄幹細胞を、緑色の蛍光はｃＴＮＩ抗体に反応した心筋芽細胞を示している。
【図７】図７は、移植９６日後の心筋梗塞犬の心筋に移植した骨髄幹細胞の局在を示す顕微鏡写真（４０倍）である。赤色蛍光は心臓に移植したＤｉＩで標識した骨髄幹細胞、緑色蛍光はＭＦ２０抗体に反応した心筋芽細胞を示すものである。
【図８】図８は、梗塞犬の心筋に導入した骨髄幹細胞の移植前（ＢＬ）及び移植後（４、８及び１２週）の心拍数の変化を示めすグラフである。
【図９】図９は、心エコー検査に於いて、梗塞犬の心筋に誘導された骨髄幹細胞の移植前（ＢＬ）及び移植後４、８、１２週の短縮率（fractional shortening）と領域短縮率（area shortening）の変化を示めす一連のグラフである。
【図１０】図１０は、心エコー検査に於いて、梗塞犬の心筋に誘導された骨髄幹細胞の移植前（ＢＬ）及び移植後４、８、１２週の後壁の厚さの変化を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は哺乳動物の心筋組織に移植するための細胞を製造する方法に関するものである。特に、哺乳動物の骨髄幹細胞を生物学的な成長因子で処理して心臓系に分化させ、分化した骨髄幹細胞を一定期間インビトロで処理して細胞の取り込み及び細胞の生存率を高め、生じた骨髄幹細胞を心筋梗塞の哺乳動物に移植し、変化した状態を評価する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
成体の骨髄から得られる間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肝細胞及び心筋細胞などの様々な細胞に分化する能力を有している。このような能力のため、骨髄幹細胞は細胞移植に好適に用いられている。
【０００３】
心筋梗塞は、世界における最も重大な死因の一つとなっている。成人の心臓では心筋芽細胞（cardiomyogenic cell）が増殖できないため、心筋梗塞による心筋細胞死により健康な細胞部位が傷つけられる。
【０００４】
最近の研究では、骨髄幹細胞は心臓に移植された後に顕著な柔軟性を示すことが見出されている。心筋に移植された骨髄幹細胞は心筋芽細胞に分化転換（transdifferentiate）する能力を有するので、心筋の再生に使用することが可能である。しかし、治療に於ける有効性が見込まれるにもかかわらず、骨髄幹細胞は有意な機能改善を示すほどには心筋芽細胞に分化しない。従って、骨髄幹細胞を心筋細胞に分化させる更なる研究がなされている。
【０００５】
５−アザシチジンのような脱メチル化試薬で処理することにより、骨髄幹細胞を心筋細胞に分化させることが可能であるとの報告がある。５−アザシチジンは、ゲノムのヌクレオシド配列を無作為で脱メチル化し、正常のサイレント遺伝子の発現をもたらすものである。５−アザシチジンで処理した骨髄幹細胞は、心筋細胞（ＭｙｏＤ陽性）、骨細胞（オステオカルシン陽性）、脂肪細胞（ＰＰＡＲ−陽性）及び心筋芽細胞（心筋トロポニンＩ陽性）のような、様々な細胞を発生させる。骨髄幹細胞は、５−アザシチジンに曝露されるとｃ−ａｂｌ及びインターロイキン−６の転写が急速に増加し、主な基質タンパク質であるコラーゲンＩの発現は減少する。しかしながら、５−アザシチジンのような脱メチル化試薬は、人体には安全であるが、心筋芽細胞といった一つの細胞型に有意に分化させることはできない。
【０００６】
本発明者らは以上のような問題点を考慮して、骨髄幹細胞は、移植する前に特定の生物環境に曝すと心筋系に分化転換し易くなると推測し、細胞を一つの細胞型(例えば、心筋芽細胞のような）へ誘導するのに適した生物学的な成長因子及び条件を見出すべく試みた。その結果として、生物学的な成長因子を処理することで、骨髄幹細胞を心筋細胞系へ直接誘導する特異的な方法を開発した。更に、細胞の取り込み及び細胞の生存率を高めるために、誘導された骨髄幹細胞を投与する前にインビトロで一定の期間処理する方法も開発した。当該方法により誘導された骨髄幹細胞を梗塞犬の心筋に移植し心筋梗塞が改善したのを確認した。
【０００７】
本出願人であるＡＮＴＥＲＯＧＥＮ ＣＯ．，ＬＴＤ所有の韓国特許出願第１０-２００３-０００４５６５号には、骨髄幹細胞から心筋芽細胞を高収率で生産する方法が記載されている。本発明は、先願に較べ、更に具体的で改良された方法を提供するものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は哺乳動物の骨髄幹細胞を生物学的な成長因子を用いて心筋細胞に誘導し、誘導された骨髄幹細胞を、細胞の取り込み及び細胞の生存率を高めるために、移植する前に一定期間処理する方法を提供するものであり、また、こうして生産された骨髄幹細胞を心機能が不完全な障害と診断された哺乳動物(例えば、ヒト)を治療するために提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様に於いて、
(ａ) 不死化されていない骨髄幹細胞を供給する、
(ｂ) 骨髄幹細胞を、骨髄幹細胞の特質を維持する条件下で２回継代培養する、
(ｃ) 骨髄幹細胞を、心筋芽細胞に分化させるために心筋特異的培地で培養する、及び
(ｄ) 工程(ｃ)の細胞の約８０〜９０％が心筋芽細胞に分化されたときに、その細胞を採取する、
工程を含有してなる、哺乳動物の心筋組織に移植するための細胞の生産方法を提供する。
本発明の方法に於いて、骨髄幹細胞は、移植先の哺乳動物由来のものであってもよい。骨髄幹細胞は、工程(ｃ)に於いて、１時間〜２１日間培養するのが好ましく、６日間培養するのがより好ましい。
【００１０】
工程（ｃ）に於ける心筋特異的培地は、生物学的な成長因子であるｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子)、ＢＭＰ-２(骨形成因子２)及びＩＧＦ-１（インスリン様成長因子１）を含む。培地は、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ-２及びＩＧＦ-１をそれぞれ１〜２００ｎｇ/ｍｌの濃度で含有し、２〜２０％の牛胎仔血清、１〜１０００μＭのＬ-アスコルビン酸-２-ＰＯ４、５〜１５ｎｇ/ｍｌのＬＩＦ、及び１〜２００ｎＭのデキサメタゾンをさらに含有することが好ましい。
【００１１】
本発明の方法によれば、培養された骨髄幹細胞は移植に適した心筋芽細胞に特異的なマーカーを発現する。上記の工程に於いて、ＭＥＦ２タンパク質を発現しているが、ＭＦ−２０は発現していない細胞を採取するのが好ましい。
【００１２】
本発明による、哺乳動物の心臓組織に移植するための細胞の産生は下記の方法：
移植前に骨髄幹細胞を心筋系細胞に誘導する、
誘導された骨髄幹細胞を、細胞の取り込み及び細胞の生存率を高めるために、一定期間培養する、及び
哺乳動物の心筋梗塞モデルに移植して評価する
によって実施される。
【００１３】
まず、移植する前に骨髄幹細胞を心筋系統に誘導する方法は次の工程を含む。
(１) 不死化されていない骨髄幹細胞を供給する、
(２) 十分な数の細胞を得るために骨髄幹細胞を継代培養する、
(３) 前記骨髄幹細胞を生物学的な成長因子を含む心筋特異的な培地(cardiac specific media)で培養して心筋芽細胞に分化させる、
(４) 工程(３)の細胞の分化状態をモニタリングする、そして
(５) 前記細胞の約６０〜９０％が心筋芽細胞に分化されたときに、工程(３)の細胞を採取する。
【００１４】
更に又、誘導された骨髄幹細胞を、細胞の取り込み及び細胞の生存率を高めるために、一定期間培養する方法は次の工程を含む。
(１) 不死化されていない骨髄幹細胞を供給する、
(２) 十分な数の細胞を得るために前記骨髄幹細胞を継代培養する、
(３）前記骨髄幹細胞を生物学的成長因子を含有する心筋特異的培地で１時間〜２１日間培養して心筋芽細胞に分化させる、
(４) 工程(３)の細胞の分化状態を特定の期間モニタリングする、そして
(５) 細胞の約８０〜９０％が心筋芽細胞に分化されたときに、工程(３)の細胞を採取する。
【００１５】
更にまた、細胞を哺乳動物の心筋梗塞モデルに移植してその効果を評価する方法は次のような工程を含む。
(１) 心筋梗塞哺乳動物モデルを製造する、
(２) 哺乳動物から骨髄幹細胞を分離する、
(３) 十分な数の細胞を得るために、骨髄幹細胞を継代培養する、
(４) 前記骨髄幹細胞を生物学的な成長因子を含む心筋特異的培地で６日間培養して心筋芽細胞に分化させる、
(５) 細胞の約８０〜９０％が心筋芽細胞に分化されたときに、工程(４)の細胞を採取する、そして
(６) 心筋芽細胞を哺乳動物に移植する。
【００１６】
本発明者らは、哺乳動物の骨髄幹細胞を、心臓系に分化させるために生物学的な成長因子で処理して、損傷を受けた心筋での細胞の取り込み及び細胞の生存率を高めるために、この細胞を投与前の一定期間培養した。更に、培養した細胞を哺乳動物の梗塞を起こした心筋層に移植して、分化の状態を評価した。本発明によって誘導された心筋芽細胞は、５−アザシチジンのような脱メチル化試薬を用いて得られたものに較べより好適である。
【００１７】
以下、本発明をさらに詳述する。
哺乳動物の心筋組織に移植する細胞をインビトロで製造する工程に於いては骨髄幹細胞を心筋細胞系に誘導するために全工程で成長因子が使用される。心筋細胞に誘導するために、特に生物学的な成長因子は全て、胚の発達過程で使用することができる。このような成長因子には、ｂＦＧＦ(塩基性線維芽細胞成長因子)、ＢＭＰ-２(骨形成因子２)及びＩＧＦ-１(インスリン様成長因子１)、ＴＧＦ-β、Ｗｎｔ-阻害物質、アクチビン(activin)、レチノ酸(retinoic acid)、Ｅｒｂ-２、全ＦＧＦ成長因子メンバー、全ＴＧＦ成長因子メンバー、及び全ＩＧＦ成長因子メンバーなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
移植された細胞は、活発に増殖し、十分に分化する。骨髄幹細胞は心筋細胞系に特異的に誘導され（心筋特異的マーカーにより同定可能である）、使用される。これらのマーカーには、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２（筋細胞エンハンサー因子２）、及びＳＲＦ（血清応答因子）等が含まれるが、これらに限定されるものではない。心臓分化マーカーの発現により同定される心筋芽細胞もまた使用可能である。これらのマーカーは、ＭＨＣ（ミオシン重鎖）、ｃＴｎＩ（心筋トロポニンＩ）、ｃＴｎＴ（心筋トロポニンＴ）、心筋αアクチン、αアクチン及びＭＬＣ２（ミオシン軽鎖）等を含むが、これらに限定されるものではない。骨髄幹細胞は、互いにコミニュケートするという特徴を有する心筋細胞として利用することも可能である。このような細胞の表現型は、周期的な収縮及び心臓と関連するマーカーの発現によって評価できる。心臓と関連するマーカーの同定には、例えばレポータ遺伝子の発現(心筋特異的プロモーターによって誘導されるＬａｃＺ）、ＲＮＡ発現（逆転写ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＲＮａｓｅプロテクション法）又はタンパク質の発現（免疫蛍光アッセイ、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリー）等の、検出可能な何れの方法を用いてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
上記の方法によって移植する細胞には、心筋芽細胞に分化する過程の何れの細胞を用いてよい。
「骨髄間葉系幹細胞又は骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）」は骨髄間葉由来の幹細胞、即ちＣＤ４５を意味する。また骨髄間葉系幹細胞は、骨髄幹細胞及び「骨髄多能性前駆細胞」をも意味する。
「心臓細胞(cardiac cell)」は分化した心臓細胞(例えば、心筋細胞)又は心臓細胞を生成したり心臓細胞に分化するように決定づけられた細胞（例えば、cardiomyoblast（心筋新生細胞）又はcardiomyogenic cell （心筋芽細胞））を意味する。
「心筋細胞（cardiomyocyte）」は検出可能な量の心臓マーカー（例えば、α−ミオシン重鎖、ｃＴｎＩ、ＭＬＣ２ｖ、心筋αアクチン、及びインビボでコネキシン４３）を発現し、収縮し、増殖しない心臓の筋肉細胞を意味する。
「心筋新生細胞（cardiomyoblast）」は検出可能な量の心臓マーカーを発現し、収縮し、増殖する細胞を意味する。
「心筋芽細胞（cadiomyogenic cell）」は検出可能な量のＣｓｘ/Ｎｋｘ２．５ＲＮＡ又はタンパク質を発現し、組織化された筋節構造（sarcomeric structure）や収縮を示さず、そして好ましくは検出可能な量のミオシン重鎖タンパク質を発現しない細胞を意味する。
「心筋特異的(cardiac specific)」とは最終的に分化されたマーカーが発現する前に、心臓の初期転写因子が発現する心臓分化の初期過程を意味する。
「心筋特異的培地（cardiac specific media）」は骨髄幹細胞を心筋細胞に誘導するｂＦＧＦ、ＢＭＰ-２及びＩＧＦ-１を含有する培地を意味する。
「分化転換（transdifferentiation）」は、胚葉起源が異なる他の細胞型に分化することを意味する。
本発明の他の特徴と利点は以下の本発明の好ましい態様の記載及び請求の範囲から明らかである。
【００２０】
(発明の効果)
本発明により誘導された心筋芽細胞は、５−アザシチジンのような脱メチル化試薬を用いて誘導されたものと較べ、より好適に臨床に適用できる。本発明は、高い細胞の取り込み及び細胞の生存率を有する、心筋細胞に誘導された哺乳動物の骨髄幹細胞を提供し、心臓機能不良を伴う疾患と診断された哺乳動物(例えばヒト)の治療に当該誘導された骨髄幹細胞を用いるものである。
(実施例)
【００２１】
（発明の最良の形態）
以下、多様な実施例により、本発明を具体的に説明する。これら実施例は説明のためのみに提供されるものであり、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。更に、当該実施例は、イヌの骨髄から単離した骨髄幹細胞について説明するものであるが、本発明は、これらに限定されることなく、ヒト、ラット、マウス、サル等を含む全ての哺乳動物から単離した骨髄幹細胞に適用されるものである。
【実施例１】
【００２２】
生物学的成長因子で処理して骨髄幹細胞から心筋芽細胞を誘導する方法
心筋梗塞を起こして４週間以上経過した後に、ヘパリンに浸した注射器で、イヌの腸骨から１５〜２０ｍｌの骨髄幹細胞を採取した。採取した骨髄幹細胞を２〜２０％の牛胎仔血清、１〜１，０００μＭのＬ-アスコルビン酸−２−ＰＯ４、５〜１５ｎｇ/ｍｌのＬＩＦ(白血病抑制因子)及び１〜２００ｎＭのデキサメタゾンを含む培地で培養した。全ての培養器とスライドを、骨髄幹細胞を入れる前に、室温で１５分間、５ｎｇ/ｍｌのコラーゲンでコーティングした。当該インビトロ条件は、骨髄幹細胞の自己再生を保持させて、成長因子のような分化試薬に対する反応性を失わずに、継代増殖させるものである。さらに当該条件は、継代培養しても、骨髄幹細胞が間葉性の形態（mesenchynmal morphology）と核型(keryotype)を維持できるようにするものである。図１は、イヌから単離して培養した骨髄幹細胞の位相差顕微鏡写真(１００倍)である。
【００２３】
骨髄幹細胞を２回継代培養して４ウェルのチャンバースライドに植菌し、心筋分化培地で処理した。分化培地は、ＤＭＥＭ中に２〜２０％の牛胎仔血清、１〜１０００μＭのＬ-アスコルビン酸-２-ＰＯ４、５〜１５ｎｇ/ｍｌのＬＩＦ、１〜２００ｎＭのデキサメタゾン、１〜２００ｎｇ/ｍｌのｂＦＧＦ、１〜２００ｎｇ/ｍｌのＢＭＰ２及び１〜２００ｎｇ/ｍｌのＩＧＦ-１を含むものである。この培地は、胚の発生過程において、心筋に分化する重要な役割を果たすものとして知られる成長因子を含んでいる。
【００２４】
成長因子の存在下で１４日間培養した後、約５０〜９０％の骨髄幹細胞がＭＥＦ２タンパク質を発現した。図２は、イヌの骨髄幹細胞を心臓細胞特異的培地で培養した後のＭＥＦ２(Ａ)とデスミン(Ｂ)の形態（morphology）及び発現を示す一連の顕微鏡写真（１００倍）であり、一方、(Ｃ)はＭＦ-２０の陰性対照である。
これらの細胞において、ＭＥＦ２タンパク質は見出されたが、ＭＦ-２０との免疫反応によって確認できる心臓分化マーカーの発現は見られなかった。よって、細胞は、心筋特異的マーカーは発現するものの、最終分化(terminal differentiation)マーカーを発現しないものとみられる。
【００２５】
ＭＥＦ２の発現は、心臓系特異マーカーとして使用され、発現したタンパク質は細胞核に位置する。ＭＥＦ２転写因子は、心臓に分化誘導される前の胚発生過程において、心臓前駆体細胞に発現する。これらの遺伝子は、胚発生過程に於ける初期の心臓前方中胚葉（precardiac mesoderm）で発現する。更に、ＭＥＦ２タンパク質は、完全な心臓分化に必要とされる多くの構造遺伝子の発現に於ける重要な転写因子である。
【００２６】
次のような方法で、細胞において検出するのが可能なようにＭＥＦ２又はミオシン重鎖を標識した。培養された細胞を４％のホルムアルデヒドで２０分間冷蔵固定し、その後０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ-１００を含有するＰＢＳで１５分間処理した。ＰＢＳで３回洗浄した後、得られた細胞をブロッティング溶液（１％の牛胎仔血清アルブミン及び０．２％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で１５分間処理した。処理した試料を抗ＭＥＦ２（１:２００、ｓｃ-１０７９４、Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz）、ＭＦ-２０（１:１００、 Developmental Studies Hybridoma Bank、University of Iowa、Iowa City、Iowa)、抗デスミン（１:１００〜２００、Sigma-Aldrich）及び、必要により、アイソタイプ抗体（ＭＥＦ２に対してウサギＩｇＧ２ｂ、ＭＦ-２０に対してマウスＩｇＧ２ｂ、Ｄｅｓｍｉｎに対してマウスＩｇＧ１)のうち一種を用いて４℃で恒湿槽中で一晩培養する。その後、試料スライドを洗浄液（０．５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄し、次いで、供給業者が提供する指示書にしたがって２次抗原（ＭＥＦ２にはロバ抗ウサギＩｇＧ、ＭＦ２０とデスミンにはロバ抗マウスＩｇＧ：Molecular Probe）と反応させた。３回洗浄後、試料を蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＴＳ１００顕微鏡）で観察した。
【実施例２】
【００２７】
高い細胞取り込みと細胞生存率を有する骨髄幹細胞を心筋芽細胞に一定期間誘導する方法
骨髄幹細胞は、心筋特異的培地で、１時間〜２１日間のうちの各期間に亘り生物学的な成長因子で処理することができるが、この間に、約４０〜９０％の細胞で核タンパク質であるＭＥＦ２の発現が見られる。心筋特異的培地で処理する期間に応じて、心筋芽細胞への誘導を６０〜９０％まで増加させることができる。最適な期間処理することにより、８０〜９０％の細胞に於いてＭＦ２タンパク質を発現させることができる。移植する骨髄幹細胞は、８０〜９０％がＭＥＦ２タンパク質を発現するものであり、梗塞を起こした心臓を再生させるのには最適なものである。
【００２８】
成犬から単離した骨髄幹細胞を心筋特異的培地で６日間培養し、蛍光顕微鏡で観察すると、最適量のＭＥＦ２タンパクが核内に存在することが示された。梗塞犬への細胞移植は、移植した細胞が心筋に組み込まれ、イヌが移植後９６日間生存したことを示した。図７は、移植９６日後の心筋梗塞犬の心筋に移植した骨髄幹細胞の局在を示す顕微鏡写真(４０倍)である。赤色の蛍光は心臓に移植したＤｉＩ標識した骨髄幹細胞、緑色の蛍光はＭＦ２０抗体に反応した心筋芽細胞を示すものである。当該インビボ実験は次のように実施された。
【００２９】
誘導の最適時間を決定するために、イヌの骨髄幹細胞を２回継代培養して、この培養細胞をコラーゲンでコーティングした４ウェルのチャンバースライドに１０，０００細胞／チャンバーの濃度で植菌した。２４時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄して、１ｍｌの心筋特異的培地を添加した。一つのスライドには、心筋特異的培地を使用せず陰性対照群とした。心筋特異的培地で処理して１、２、３、４、５、６、８及び１０日後に細胞を固定し、ＭＥＦ２抗体を染色して、蛍光顕微鏡で観察した。図３は、心筋特異的培地で処理し、染色した、ＢＭＳＣ（骨髄幹細胞）に於けるＭＥＦ２の発現を示す一連の顕微鏡写真（Ａ〜Ｆは２００倍、Ｇ〜Ｎは１００倍）である。Ａ及びＤは非処理細胞を示し、Ｂ及びＥは心筋特異的な培地で処理してから１日後の細胞を示し、Ｃ及びＦは処理後２日、Ｇ及びＫは処理後３日、Ｈ及びＬは処理後６日の細胞を示している。Ｉ及びＭは、８日間処理し、その後ウサギＩｇＧで染色した陰性対照である。ＭＥＦ２染色の相対的強度試験の結果、心筋特異的培地で６日間処理したものが最大の発現を示している。
以上のような結果に基づき、心筋特異的培地で６日間処理した後に採取した細胞を心筋インビボ試験でイヌの梗塞モデルに使用した。
【実施例３】
【００３０】
骨髄幹細胞の移植及び取り込み率及び生存率の評価
心筋芽細胞系へとインビトロで誘導した骨髄幹細胞を、イヌの心筋梗塞組織に移植した。イヌの心筋梗塞は、右冠状動脈の永久閉塞によるものである。骨髄幹細胞移植に先立ち、梗塞を少なくとも２ヶ月間安定化した。移植による免疫拒否反応を防止するために、それぞれの移植レシピエントのイヌから下記の要領で、骨髄を採取して、骨髄幹細胞を調製した。
【００３１】
心エコー検査により心筋梗塞を確認し、結紮後約４週間が経過してから長骨髄腸骨を穿刺して骨髄を吸引した。 骨髄を直ちにヘパリンと混合し、冷凍し、ドライアイスと共に組織培養装置へ移した。そこで、３７℃で解凍し、摂動して（perturbated）、通常のＤＭＥＭで一回洗浄した。そして、培養液（２〜２０％の牛胎仔血清、１〜１、０００μＭのＬ-アスコルビン酸-２-ＰＯ４、５〜１５ｎｇ/ｍｌのＬＩＦ、１〜２００ｎＭのデキサメタゾン）の入った組織培養フラスコに入れた。２回継代培養した後、骨髄幹細胞を１〜２００ｎｇ/ｍｌのｂＦＧＦ、１〜２００ｎｇ/ｍｌのＢＭＰ２、及び１〜２００ｎｇ/ｍｌのＩＧＦ-１を含有する培地で６日間培養した。移植後の細胞の生存と経過を追跡するために、骨髄幹細胞を採取する際に赤色の蛍光マーカーであるＤｉＩで標識した。約２×１０８個の細胞を採取し、心臓の梗塞部位に注入した。
【００３２】
移植後の骨髄幹細胞の生存を、ＤｉＩ蛍光の事後分析による視覚化により測定した。図４は、移植１５日後の梗塞犬の心筋における移植した骨髄幹細胞の局在を示す顕微鏡写真（４０倍）である。赤色の蛍光は宿主の心筋に移植したＤｉＩ標識した骨髄幹細胞を、緑色の蛍光はＭＦ２０抗原で染色した心筋芽細胞を、そして青色の蛍光はＤＡＰＩで標識した核を示す。図４に示されるように、移植１５日後の心筋層でＤｉＩ陽性細胞の大きな塊が観察された。これは骨髄幹細胞が長期間生存していることを示唆している。特に、ＤｉＩで標識した幹細胞は、ＭＦ２０陽性である心筋細胞を含んでいる心筋層内部位で、またＭＦ２０陽性である心筋細胞が欠如している心筋梗塞部位で観察された。
【００３３】
移植した細胞の長期間にわたる生存能力を調べるためにイヌを犠牲にして観察した。図５は、移植７０日後のイヌの心筋梗塞における移植した骨髄幹細胞の局在を示している顕微鏡写真(４０倍)である。赤色の蛍光は、心筋に移植したＤｉＩ標識した骨髄幹細胞を、緑色の蛍光はＭＨＣ抗体に反応した心筋芽細胞を、そして青色の蛍光はＤＡＰＩで標識した核を示す。図６は、移植７０日後のイヌの心筋梗塞における移植した骨髄幹細胞の局在を示す顕微鏡写真(４０倍)である。赤色の蛍光は心筋に移植したＤｉＩ標識した骨髄幹細胞を、緑色の蛍光はｃＴＮＩ抗体に反応した心筋芽細胞を示す。
【００３４】
更に図７は、移植後９６日の心筋梗塞犬の心筋に移植した骨髄幹細胞の局在を示す顕微鏡写真であって(４０倍)、赤色の蛍光は心臓に移植したＤｉＩ標識した骨髄幹細胞、緑色の蛍光はＭＦ２０抗体に反応した心筋芽細胞を示す。図５〜図７に示めされるように、全ての場合において、梗塞領域でＤｉＩで標識した細胞が観察された。一部、ＤｉＩ蛍光が、ＭＦ２０を含んだ心筋特異的マーカーと同じ領域で観察された。更に、梗塞領域の境界部位は、心筋特異的マーカーであるＭＨＣα／β及びＴＮＩも発現するＤｉＩ陽性の幹細胞を含んでいた。
これらのデータは、上記の方法によって、インビトロで調整され、移植した骨髄幹細胞が、宿主の心筋に生存し、取り込まれて、心臓分化に特異的なマーカーを発現することを示すものである。
【実施例４】
【００３５】
心筋梗塞の改善
上述のイヌの心筋梗塞モデルを用いて、心エコー検査（ＥＣＧ）により骨髄幹細胞移植の回復効果を評価した。骨髄幹細胞移植後３．５週間、４．５週間、及び５週間後に心エコー検査を行い、移植前の心エコー検査と比較した。
【００３６】
図８は、梗塞犬の心筋に導入した骨髄幹細胞の移植前（ＢＬ）及び移植後（４、８及び１２週）の心拍数の変化を示めすグラフである。図９は、心エコー検査において梗塞犬の心筋に誘導した骨髄幹細胞の移植前（ＢＬ）及び移植後４、８、１２週の短縮率（fractional shortening）と領域短縮率（area shortening）の変化を示めす一連のグラフである。更に、図１０は、心エコー検査においての梗塞犬の心筋に誘導した骨髄幹細胞の移植前（ＢＬ）及び４、８、１２週後の後壁の厚さの変化を示しているグラフである。
【００３７】
図８〜１０に示めされるように、各々の動物において、梗塞部位に於ける収縮は、心筋の隣接領域にさらに同期化された。心エコー検査の結果は、実施例３の組織学的所見を確認し、培養した骨髄幹細胞の移植は、梗塞後の心臓組織を部分的に回復させたことを立証するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
本発明の上記又はその他の目的、特徴及び利点は、添付の図面と併せて上記の詳細な説明によって、より明確に理解されるものである。
【図１】図１は、イヌから単離して、培養した骨髄幹細胞の位相差顕微鏡写真(１００倍)である。
【図２】図２は、イヌの骨髄幹細胞を心臓細胞特異的培地で培養した後のＭＥＦ２(Ａ)及びデスミン(Ｂ)の形態（morphology）及び発現を示す一連の顕微鏡写真（１００倍）であり、一方、(Ｃ)はＭＦ-２０の陰性対照である。
【図３】図３は、心筋特異的培地で処理し、染色した骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）に於けるＭＥＦ２の発現を示す一連の顕微鏡写真（Ａ〜Ｆは２００倍、Ｇ〜Ｎは１００倍）である。Ａ及びＤは非処理細胞を示し、Ｂ及びＥは心筋特異的な培地で処理してから１日後の細胞を示し、Ｃ及びＦは処理後２日、Ｇ及びＫは処理後３日、Ｈ及びＬは処理後６日の細胞を示している。Ｉ及びＭは、８日間処理し、その後ウサギＩｇＧで染色した陰性対照である。
【図４】図４は、移植１５日後の梗塞犬の心筋における移植した骨髄幹細胞の局在を示す顕微鏡写真（４０倍）である。赤色蛍光は宿主の心筋に移植したＤｉＩ標識した骨髄幹細胞を、緑色蛍光はＭＦ２０抗原で染色した心筋芽細胞を、そして青色蛍光はＤＡＰＩで標識した核を示している。
【図５】図５は、移植７０日後のイヌの心筋梗塞における移植した骨髄幹細胞の局在を示す顕微鏡写真(４０倍)である。赤色の蛍光は、心筋に移植したＤｉＩ標識した骨髄幹細胞を、緑色の蛍光はＭＨＣ抗体に反応した心筋芽細胞を、そして青色の蛍光はＤＡＰＩで標識した核を示している。
【図６】図６は、移植７０日後のイヌの心筋梗塞における移植した骨髄幹細胞の局在を示す顕微鏡写真(４０倍)である。赤色の蛍光は心筋に移植したＤｉＩで標識した骨髄幹細胞を、緑色の蛍光はｃＴＮＩ抗体に反応した心筋芽細胞を示している。
【図７】図７は、移植９６日後の心筋梗塞犬の心筋に移植した骨髄幹細胞の局在を示す顕微鏡写真（４０倍）である。赤色蛍光は心臓に移植したＤｉＩで標識した骨髄幹細胞、緑色蛍光はＭＦ２０抗体に反応した心筋芽細胞を示すものである。
【図８】図８は、梗塞犬の心筋に導入した骨髄幹細胞の移植前（ＢＬ）及び移植後（４、８及び１２週）の心拍数の変化を示めすグラフである。
【図９】図９は、心エコー検査に於いて、梗塞犬の心筋に誘導された骨髄幹細胞の移植前（ＢＬ）及び移植後４、８、１２週の短縮率（fractional shortening）と領域短縮率（area shortening）の変化を示めす一連のグラフである。
【図１０】図１０は、心エコー検査に於いて、梗塞犬の心筋に誘導された骨髄幹細胞の移植前（ＢＬ）及び移植後４、８、１２週の後壁の厚さの変化を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ) 不死化されていない骨髄幹細胞を供給する、
(ｂ)骨髄幹細胞を、骨髄幹細胞の特質を維持する条件下で２回継代培養する、
(ｃ)骨髄幹細胞を、心筋芽細胞に分化させるために心筋特異的培地で培養する、及び
(ｄ)工程(ｃ)の細胞の約８０〜９０％が心筋芽細胞に分化されたときに、当該細胞を採取する、
工程を含有してなる、哺乳動物の心筋組織に移植するための細胞を生産する方法。
【請求項２】
骨髄幹細胞が、移植する哺乳動物由来のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程(ｃ)において、骨髄幹細胞を１時間〜２１日間培養する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程(ｃ)において、骨髄幹細胞を６日間培養する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
心筋特異的培地が、生物学的な成長因子を含む培地である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
生物学的な成長因子が、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）、ＢＭＰ-２（骨形成因子２）及びＩＧＦ-１（インスリン様成長因子１）である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
培地が、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ-２及びＩＧＦ-１を、それぞれ１〜２００ｎｇ/ｍｌの濃度で含み、そして更に２〜２０％のウシ胎仔血清、１〜１０００μＭＬのアスコルビン酸-２-ＰＯ４、５〜１５ｎｇ/ｍｌのＬＩＦ、及び１〜２００ｎＭのデキサメタゾンを含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
移植に適した心筋芽細胞に特異的なマーカーを発現する細胞を培養する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＭＥＦ２タンパク質を発現しているがＭＦ-２０を発現していない工程に於ける細胞を採取する請求項８に記載の方法。
【請求項１】
(ａ) 不死化されていない骨髄幹細胞を供給する、
(ｂ)骨髄幹細胞を、骨髄幹細胞の特質を維持する条件下で２回継代培養する、
(ｃ)骨髄幹細胞を、心筋芽細胞に分化させるために心筋特異的培地で培養する、及び
(ｄ)工程(ｃ)の細胞の約８０〜９０％が心筋芽細胞に分化されたときに、当該細胞を採取する、
工程を含有してなる、哺乳動物の心筋組織に移植するための細胞を生産する方法。
【請求項２】
骨髄幹細胞が、移植する哺乳動物由来のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程(ｃ)において、骨髄幹細胞を１時間〜２１日間培養する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程(ｃ)において、骨髄幹細胞を６日間培養する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
心筋特異的培地が、生物学的な成長因子を含む培地である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
生物学的な成長因子が、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）、ＢＭＰ-２（骨形成因子２）及びＩＧＦ-１（インスリン様成長因子１）である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
培地が、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ-２及びＩＧＦ-１を、それぞれ１〜２００ｎｇ/ｍｌの濃度で含み、そして更に２〜２０％のウシ胎仔血清、１〜１０００μＭＬのアスコルビン酸-２-ＰＯ４、５〜１５ｎｇ/ｍｌのＬＩＦ、及び１〜２００ｎＭのデキサメタゾンを含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
移植に適した心筋芽細胞に特異的なマーカーを発現する細胞を培養する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＭＥＦ２タンパク質を発現しているがＭＦ-２０を発現していない工程に於ける細胞を採取する請求項８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００７−５１３６２５（Ｐ２００７−５１３６２５Ａ）
【公表日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４３７３３（Ｐ２００６−５４３７３３）
【出願日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００２９８３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５６７７９
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（５０３３７３１８２）アントロジェン カンパニー リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００２９８３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５６７７９
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（５０３３７３１８２）アントロジェン カンパニー リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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