突然変異の検出法と誘発法
芽条突然変異を誘発する新規植物転移因子およびその転移酵素とその転移効率の向上による効率的な芽条突然変異誘発方法を提供する。 下記の塩基配列を有する末端逆位反復配列（配列番号１および配列番号２）を有する新規転移因子をカーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）より初めて単離し、塩基配列を決定した。この転移因子は、その配列中にその転移酵素をコードする遺伝子を含んでいた。この転移因子は遺伝子に挿入することにより芽条突然変異を誘発し、環境ストレスにより転移頻度が上昇する。ＴＡＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＡ−−−−ＴＴＴＧＣＣＡＧＣＴＣＴＡ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、植物の芽条突然変異を誘発する新規の転移因子、転移酵素および転移酵素をコードする塩基配列を用いた突然変異の検出方法、誘発方法、安定化方法や突然変異遺伝子の同定方法および遺伝子の発現が抑制された変異体の選抜に関する。
【背景技術】
突然変異は作物の品種改良や分子遺伝学的研究に重要であり、自然に発生する芽条突然変異や人為的な突然変異が利用される。本発明でいう芽条突然変異とは植物体の一部に体細胞の遺伝子レベルでの突然変異が生じることを指し、芽条突然変異体とは該突然変異体のことを指す。栄養繁殖作物である花きや果樹などの作物では、交雑を経ない芽条突然変異は品種育成に重要な遺伝変異を提供する。しかし、芽条突然変異による変異の分子的なメカニズムについては、その原因は不明であり自然発生に任せている。また、自然突然変異は１００万分の１程度の確率でしか起こらないとされており、この効率をあげるために突然変異を誘発させる手法として放射線照射や変異原性をもつ化学物質などが利用されるが、変異出現率を増加させようとすると望ましい変異の他にも変異が入ってしまい目的の形質に加えて劣悪な形質を伴う場合が多く、非常に多くの個体からなる変異集団の中から目的のものを探す必要があり効率が低い。
転移因子（トランスポゾンともいう）は原核生物から真核生物にいたる生物種に広く見出される、ゲノム上を転移する可動性遺伝因子である。植物ではシロイヌナズナ、ハクサイなどで見出されており［特開２００３−９３０７４号公報］、またトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）の穀粒やキンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ）の花弁［蛋白質 核酸 酵素 ３７ １０４７−１０５９（１９９２）］、アサガオ（Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ ｎｉｌ）の花弁［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：７０１６−７０２３（２０００）］、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）の花弁［Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １３：３９−５０（１９９８）］、およびカーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）の花弁におけるアントシアニン色素生合成系遺伝子の発現を制御する転移因子がよく知られている。
例えば白色花弁に赤い斑の入るカーネーション品種では、アントシアニン色素生合成酵素のひとつであるジヒドロフラボノール−４−リダクターゼ（以下、ＤＦＲという）遺伝子内に転移因子が挿入している。ＤＦＲ遺伝子は赤色色素合成に必要であるが、転移因子が挿入しているとＤＦＲ遺伝子が機能しないため花色は白色となる。ところが、花弁形成時に挿入している転移因子が脱離することによりＤＦＲ遺伝子の機能が回復し、赤い斑の入った模様ができることが解明された［Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．４３：５７８−５８５（２００２）］。このように個体内の一部の細胞において転移因子が脱離しセクター状の変異を有する事例において、トウモロコシ、キンギョソウ、アサガオ、ペチュニアなどでは転移因子の関与が分子遺伝学的に解明されている。
また、転移因子による変異は生殖細胞を経て後代へ伝達されることも明らかとなっている。この場合転移因子は生殖細胞の形成期に転移したものであり、後代に転移因子による突然変異体が得られる。この事象を利用して、既知の転移因子を遺伝子導入などによりに導入し、その後代で得られた変異体を、導入した転移因子を指標に解析することにより遺伝子を単離する手法が開発されトランスポゾンタギングと呼ばれている［Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ７：６７７−６８５（１９９５）］。
このように転移因子を変異原とする試みが行われるようになったが、現在の手法は芽条での転移因子の遺伝子への挿入による変異を得るにいたっておらず、もっぱら交配あるいは交雑を経由した変異体の取得にとどまっている。このように転移因子が個体を構成する一部の細胞で転移する事例は知られており、レトロトランスポゾンによる芽条突然変異の例も報告されている［Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４：９８２（２００４）］。しかしながら、芽条突然変異のような栄養繁殖による変異の固定が可能な突然変異がレトロトランスポゾン以外の転移因子により引き起こされている例は報告がない。
【特許文献１】特開２００３−９３０７４号公報
【非特許文献１】 蛋白質 核酸 酵素 ３７ １０４７−１０５９（１９９２）
【非特許文献２】 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：７０１６−７０２３（２０００）
【非特許文献３】 Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １３：３９−５０（１９９８）
【非特許文献４】 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．４３：５７８−５８５（２００２）
【非特許文献５】 Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ７：６７７−６８５（１９９５）
【非特許文献６】 Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４：９８２（２００４）
【発明の開示】
従来、発生頻度の非常に低い自然突然変異と、目的とする変異に加え目的としない変異が伴ってしまう放射線や化学物質による人為的な突然変異を利用し芽条突然変異体が得られていた。このような技術下では多数の個体を扱い、その中から目的とする変異体を選抜する必要があり、効率が非常に低かった。また、従来の方法により得られた突然変異体は変異した遺伝子を特定するために多くの労力を必要とする。これらの課題を解決するために、本発明は芽条突然変異を誘発する植物の新規転移因子を提供すること、新規転移因子の有無や脱離の有無を検出する方法を提供すること、この新規転移因子を変異原として利用して芽条突然変異を誘発する手法を提供することを目的とする。
芽条突然変異を誘発する転移因子を突然変異原として利用しこの転移を人為的に促すことにより、１細胞あたりの変異する遺伝子が少数であるが効率高く芽条突然変異体が得られる理想的な突然変異方法となる。また、前述のとおり原因遺伝子に転移因子という指標が存在することになり、原因遺伝子の単離が容易になる。
前記の課題を解決するために発明者は研究を重ね、紫花色を示すカーネーション系統９５ＳＰ（ミセスパープル、日本国での種苗法に基づく品種登録番号７２９１号、キリンビール社）、その芽条突然変異体であるピンク花色を示すカーネーション系統９７ＳＰｉ（ミセスピンクロサリオ、日本国での種苗法に基づく品種登録番号８９７６号、キリンビール社）、濃赤花色を示す９７ＳＥ（ミセスエレガント、日本国での種苗法に基づく品種登録番号９２４７号、キリンビール社）、カーネーション品種カリー（バルブレ＆ブラン社）、Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｂａｒｂａｔｕｓ、ピンク花色を示すカーネーション系統９９ＳＰ４、およびピンク花色を示すカーネーション系統９９ＳＰ５を用い以下の知見を見出した。
すなわち、カーネーション系統９７ＳＰｉのアントシアニン生合成に関与する酵素であるフラボノイド３’水酸化酵素をコードするゲノミック遺伝子にはカーネーション系統９５ＳＰにはないＤＮＡが挿入していた。挿入している塩基配列は転移因子が有する典型的な特徴を備えていた。すなわち、両端に配列番号１および配列番号２に示す１３塩基の逆位反復配列を有し、該配列が挿入した位置の両側には８塩基の同一方向の同一塩基配列が存在していた。また、逆位反復配列はトウモロコシの転移因子であるＡＣのそれに類似しているが（図１）、内部の約４ｋｂにわたる塩基配列には類似性は認められなかった。該塩基配列にはオープンリーディングフレームが存在し、この塩基配列をアミノ酸に変換した配列は、キンギョソウ由来の転移因子およびトウモロコシ由来の転移因子にそれぞれコードされる転移酵素のアミノ酸配列と相同性を示した（図２）。この転移酵素の発現をリターンＰＣＲ（以下リターンＰＣＲという）により検出することが可能である。
さらに９７ＳＰｉから先祖返りをおこした紫花色を示す個体の花弁では挿入していた塩基配列が脱離しており、９７ＳＰｉが生成した後もこの塩基配列が転移する能力を有していることが明らかである。
また、９７ＳＰｉから両端に配列番号１および配列番号２に示す１３塩基の逆位反復配列を有するが、内部に転移酵素遺伝子をもたない非自律性転移因子と考えられるＤＮＡ塩基配列を得た。このＤＮＡ配列は９５ＳＰおよび９５ＳＰの突然変異体である９７ＳＥにも存在し、９７ＳＥでは９５ＳＰにはない新たなゲノム部位に挿入しており、該配列が挿入した位置の両側には８塩基の同一方向の同一塩基配列が存在していた。９７ＳＥでは９５ＳＰとは異なるゲノム部位に挿入していることから該配列は可動であることが確認された。
本発明は、ゲノム上を転移し芽条突然変異を誘発する転移因子を初めて単離、同定したものである。また、ダイアンサス属の染色体ＤＮＡに由来する転移因子である本発明の転移因子のうち転移酵素をコードしているものは、本酵素の発現を制御することにより転移を制御することを可能とする。また、本発明の転移因子のうち転移酵素をコードしていないものについても、転移酵素をコードする転移因子の転移酵素の発現を制御することにより転移を制御することを可能とすると予想される。
本発明の転移因子は、芽条突然変異を誘発する性質を有する。したがって転移を促す温度等の特定の環境条件を与えること、あるいは転移酵素を人為的に発現することにより、効率よく芽条突然変異を誘発することが可能となるという有用性がある。芽条突然変異体は本発明により明らかとなった転移因子の塩基配列情報を利用して容易に検出することが可能となる。
また、本転移因子により誘発された突然変異を解析することにより容易に原因となる遺伝子を単離することが可能となる。
さらに、転移因子の遺伝子への挿入により、アンチセンスといった遺伝子組換え技術を用いることなく遺伝子の発現が抑制された変異体を得ることができるが、遺伝子が破壊された芽条を得ることが重要な遺伝的にヘテロな個体や生殖および種子形成に関与する遺伝子の場合、転移因子による芽条突然変異が有用である。本転移因子により誘発された突然変異の中から目的とする遺伝子破壊個体を容易にスクリーニングすることが可能であり、遺伝子組み換えを行うことなしに、遺伝子の発現の抑制が可能となる。
また、逆に温度等の環境条件への暴露を控えたりＲＮＡｉなどの手法を用い人為的に転移酵素の発現を抑制することによって芽条突然変異を安定化することも可能となる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−３２３４２８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、各種植物と本発明の植物（カーネーション系統９７ＳＰｉ）における転移因子中の末端逆位反復配列の相同性比較。ここで、クラスターは転移因子のタイプを意味する。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５８：９４９−９５７ ２００１の記載を基に作成した。
図２−１は、本発明で用いた植物（カーネーション系統９７ＳＰｉ）における転移酵素とキンギョソウ転移因子Ｔａｍ３の転移酵素とのアミノ酸レベルでの相同性比較。ここで、Ｒ，Ｑ等の記号が２配列間に示されたものは、当該アミノ酸同士が同一であり、＋で示されたものは当該アミノ酸同士が類似であることを示す。例えばＬとＩとＶとＭは疎水性のアミノ酸において共通しているのでこの記号を付す。また、Ｑｕｅｒｙは本発明の転移因子が有する転移酵素のアミノ酸配列を示し、Ｓｂｊｃｔはキンギョソウの転移因子Ｔａｍ３が有する転移酵素のアミノ酸配列を示す。
図２−２は、図２−１のつづき。
図３−１は、９５ＳＰのフラボノイド３’水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）遺伝子ｃＤＮＡ塩基配列（Ｑｕｅｒｙ）とＧｅｎＢａｎｋ ＡＸ０２８８１９に記載されているＦ３’Ｈ遺伝子のｃＤＮＡ配列（Ｓｕｂｊｅｃｔ）の比較。｜は相同な塩基、＊は相違する塩基を表す。
図３−２は、図３−１のつづき。
図４は、各種カーネーションでの転移因子脱離の有無確認。ＧＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡＴＡＣＴＣＡＧＴＡＣＡ（２４塩基：配列番号１０）およびＧＧＴＣＴＡＧＴＴＡＧＴＣＡＧＣＴＡＣＧＧ（２１塩基：配列番号１６）２種のプライマーを用い、系統９５ＳＰ、９７ＳＰｉのＤＮＡおよび９７ＳＰｉの個体から部分的に紫花色に先祖返りをおこした花の花弁のＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。９５ＳＰ（レーン３）のフラボノイド３’水酸化酵素遺伝子には９７ＳＰｉに存在する位置に本発明の転移因子は存在しない。さらに、紫花色に先祖返りをおこした花の花弁（レーン２０、２１）では本発明の転移因子はフラボノイド３’水酸化酵素遺伝子から脱離しており、本発明の転移因子が転移能を有することは明らかである。レーンの説明； １：分子量マーカー（λＨｉｎｄＩＩＩ） ２：９７ＳＰｉ ３：９５ＳＰ ４−１９：９７ＳＰｉ ２０−２１：９７ＳＰｉの個体から部分的に紫花色へ先祖返りをおこした花の花弁
図５は、各種カーネーションでの転移酵素の転写発現確認。系統９５ＳＰおよび９７ＳＰｉからｃＤＮＡを調整し、プライマーＣＡＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡ（２３塩基：配列番号２０）およびＧＡＧＡＣＴＣＡＴＡＧＴＧＧＴＴＡＴＡＴＡＣＡ（２３塩基：配列番号１４）を用いＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３分）を３０回、７２℃３分）を行った（イ）。また、プライマーＴＴＣＴＴＣＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＡＧ（２３塩基：配列番号２１）およびＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣ（２３塩基：配列番号１７）を用い同様にＰＣＲを行った（ロ）。このような手法により、転移酵素の発現を評価することが可能である。レーンの説明； １：分子量マーカー（λＨｉｎｄＩＩＩ） ２：９７ＳＰｉイ ３：９５ＳＰイ ４：９７ＳＰｉロ ５：９５ＳＰロ
図６は、各種ダイアンサス属植物での転移因子の有無確認。ＧＧＴＣＴＡＧＴＴＡＧＴＣＡＧＣＴＡＣＧＧ（２１塩基：配列番号１６）およびＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣ（２３塩基：配列番号１７）という２種のプライマーを用いＰＣＲを行い本発明の転移因子の存在をダイアンサス属植物で調査したところ、カーネーションの他品種（レーン３）やカーネーション以外のダイアンサス属植物（レーン４、５）にも存在することが明らかとなった。レーンの説明； １：分子量マーカー（λＨｉｎｄＩＩＩ） ２：９７ＳＰｉ ３：カーネーション品種カリー ４：Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ５：Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｂａｒｂａｔｕｓ
図７は、各種カーネーションでの転移因子の転移（芽条突然変異）の有無の確認。系統９５ＳＰ、９７ＳＰｉおよび９５ＳＰからの芽条突然変異体である系統９９ＳＰ４、９９ＳＰ５のゲノムＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩあるいはＳｐｅＩにより分解した（それぞれ図７−Ａと７−Ｂ）。これら分解産物を材料にプライマーＣＧＡＡＴＡＣＣＧＴＧＣＴＴＴＧＧＡＣＧ（２０塩基：配列番号１８）およびＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣ（２３塩基：配列番号１７）を用いインバースＰＣＲを行い、本発明の転移因子の転移を評価した。それぞれバンドパターンに変化がみられ、本発明の転移因子が転移したことが検出された。レーンの説明； Ａ ＨｉｎｄＩＩＩ １：９７ＳＰｉ ２：９５ＳＰ ３：９９ＳＰ５ ４：９９ＳＰ４ ５：分子量マーカー（λＨｉｎｄＩＩＩ）レーンの説明； Ｂ ＳｐｅＩ １：分子量マーカー（λＨｉｎｄＩＩＩ） ２：９７ＳＰｉ ３：９５ＳＰ ４：９９ＳＰ５ ５：９９ＳＰ４
【発明を実施するための最良の形態】
芽条突然変異を誘発する転移因子
ピンク花色カーネーション９７ＳＰｉは紫花色カーネーション９５ＳＰより得られた芽条突然変異体である。両者の花色色素をＴＬＣにより分析し、前者の花色色素はペラルゴニジン骨格をもち、後者はシアニジン骨格をもつことを明らかにした。このことによりこの芽条突然変異の原因遺伝子は、フラボノイド３’水酸化酵素であると考えられた。フラボノイド３’水酸化酵素のｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＸ０２８８１９）をもとに作成したプライマーＡＡＧＣＡＴＡＴＴＧＣＮＴＡＹＡＡＹＴＡＹＣＡＮＧＡ（２６塩基：配列番号５）およびＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＤＡＴＮＧＣＣＣＡＮＡＹＲＴＴ（２６塩基：配列番号６）を用いＰＣＲにより、９５ＳＰのフラボノイド３’水酸化酵素ｃＤＮＡ配列を得た。ここで塩基Ｙ、Ｒ、Ｎはそれぞれ、Ｃ又はＴ、Ａ又はＧ、任意の塩基（Ａ又はＧ又はＣ又はＴ）を指す。以下の実施例も同様である。次に得られたｃＤＮＡ配列をもとに作成したプライマーＴＡＡＡＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡ（２１塩基：配列番号７）およびＡＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴＴＴＧＡＴ（２１塩基：配列番号８）を用いインバースＰＣＲを行い、ここまでに明らかとなった塩基配列をもとにプライマーＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＣＡＧＴＡＣＡ（２１塩基：配列番号９）とＧＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡＴＡＣＴＣＡＧＴＡＣＡ（２４塩基：配列番号１０）およびプライマーＡＡＴＧＴＣＡＣＣＣＴＴＡＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＴＣＴＡ（２７塩基：配列番号１１）とＴＡＧＣＡＡＧＧＣＣＴＴＡＡＴＴＴＣＴＧＴＧ（２２塩基：配列番号１２）、２組み合わせのプライマーを作成しＰＣＲによりフラボノイド３’水酸化酵素遺伝子のゲノム塩基配列を明らかにした。さらにここまでに明らかとなったフラボノイド３’水酸化酵素遺伝子のゲノム塩基配列をもとに設計したプライマーＣＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧＴＴＴＧＣＧＡＣＣ（２０塩基：配列番号１３）およびＴＡＡＡＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡ（２１塩基：配列番号７）を用い、ゲノムＤＮＡを鋳型にインバースＰＣＲを行い、９７ＳＰｉおよび９５ＳＰの産物を比較し９７ＳＰｉに特異的に存在するＤＮＡ断片を得た。
さらにこのＤＮＡ断片の塩基配列をもとに作成したプライマーＧＡＧＡＣＴＣＡＴＡＧＴＧＧＴＴＡＴＡＴＡＣＡ（２３塩基：配列番号１４）およびフラボノイド３’水酸化酵素遺伝子の塩基配列をもとに作成したプライマーＴＡＡＣＡＡＣＡＣＧＴＡＡＣＣＧＡＡＡＡＴＡＴＡ（２４塩基：配列番号１５）を用いＰＣＲを行い９７ＳＰｉのフラボノイド３’水酸化酵素のゲノミック遺伝子に挿入する９５ＳＰにはないＤＮＡを得、塩基配列を決定した。この塩基配列は転移因子が有する特徴を備えていた。すなわち、両端に１３塩基の逆位反復配列を有し、該配列が挿入した位置の両側には８塩基の同一方向の同一塩基配列（ＡＧＴＴＡＡＴＴ）が存在していた。
また、該塩基配列にはオープンリーディングフレームが存在し、この配列の相同性を検索すると塩基レベルでは相同性は検出されないものの、この配列をアミノ酸に変換した配列ではキンギョソウ由来の転移因子およびトウモロコシ由来の転移因子にそれぞれコードされる転移酵素のアミノ酸配列と相同性を示した。このうちキンギョソウのＴａｍ３とのアミノ酸レベルで相同性比較を図２に示す。ＢＬＡＳＴ検索により解析したところ、両者間の相同性は２９％であった。
さらに９７ＳＰｉの個体から部分的に先祖返りをおこした紫花色を示す花の花弁から単離したＤＮＡをＰＣＲにより検定すると、挿入していた塩基配列が脱離しており９７ＳＰｉが生成した後もこの塩基配列が転移する能力を有していることが明らかとなった。
この塩基配列を配列番号４に、対応する転移酵素部分のアミノ酸配列を配列番号３に示す。この転移因子は、ｈＡＴ型の自律性転移因子に分類されることから、５’末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有し、配列番号１及び配列番号２に示す配列を直接に、又は４０００塩基より短い任意のリンカーを介し、連結された非自律性因子も転移酵素が外部から供給されることにより、芽条突然変異を誘発することが可能である。９７ＳＰｉのゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号４の塩基配列をもとに作成したプライマーＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＣ（２５塩基：配列番号２３）およびプライマーＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＧＣ（２７塩基：配列番号２４）を用いＰＣＲを行い、得られた産物の塩基配列を決定し、配列番号２２に示す自然に存在するこのような転移酵素遺伝子をもたない非自律性因子を得た。本非自律性因子は、９５ＳＰおよび９５ＳＰからの突然変異体である９７ＳＥにも存在し、９７ＳＥでは９５ＳＰには存在しないゲノム部位に挿入が見られることから、可動であることが明らかである。さらに、９７ＳＥ特異的に挿入が見られるゲノム部位の塩基配列を決定したところ、両端に転移酵素遺伝子を有する転移因子と相同な配列番号１および配列番号２に示すそれぞれ１３塩基の逆位反復配列を有し、該配列が挿入した位置の両側には８塩基の同一方向の同一塩基配列（ＧＴＴＡＴＡＴＧ）が存在していた。
このような自然に存在する非自律性因子も、本発明の転移酵素遺伝子をもつ転移因子の転移酵素が供給されることにより、芽条突然変異を誘発することが可能であると予想される。
本発明で用いられる塩基配列には配列番号４および配列番号２２の塩基配列以外に、
（１）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（２）配列番号３のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は（両端に）付加されたものであり、かつ転移活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（３）配列番号４に示す塩基配列のうち１０５６番目のＡから３４９７番目のＴまでである塩基配列
（４）配列番号４に示す塩基配列の縮重異性体
（５）上記（１）〜（３）いずれかに記載の塩基配列または上記（４）に記載の縮重異性体又は配列番号４とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコードされるポリペプチドが転移活性を有する塩基配列および配列番号２２とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列も含まれる。
また本発明には、以下の（１）〜（２）のいずれかのポリペプチド
（１）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（２）配列番号３のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は（両端に）付加されたものであり、かつ転移酵素活性有するポリペプチド、も含まれる。
ここで上記（２）でいうアミノ酸の欠失、置換、挿入又は（両端に）付加の操作は、例えば、Ｄ．Ｆ．Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）５６６２−５６６６、Ｓ．Ｉｎｏｕｙｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９（１９８２）３４３８−３４４１、ＷＯ８５／００８１７、Ｒ．Ｐ．Ｗｈａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３１６（１９８５）６０１−６０５に記載されている部位特定突然変異誘発法等により当業者であれば容易に実施することができる。ここで得られた変異型アミノ酸配列を有するポリペプチドは芽条突然変異を誘発する転移活性を有すればよく、当該転移活性の有無は以下の実施例で述べる方法により判断できる。
上記（４）でいう縮重異性体とは、縮重コドンにおいてのみ異なっていて同一のポリペプチドをコードすることのできる塩基配列を意味する。たとえばある塩基配列に対してあるアミノ酸のどれかに対応するコドン、例えばＡｓｎに対応するコドン（ＡＡＣ）が、これと縮重関係にある例えばＡＡＴに変わったものを本発明は縮重異性体と呼ぶものとする。
上記（５）でいうストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度が、１０ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭであり、温度が２５℃〜７０℃、好ましくは４２℃〜５５℃での条件をいう［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）］。
さらに、本発明で用いられる塩基配列には、転移する能力を有する限り、上記の配列番号４あるいは配列番号２２の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列、も含まれる。ここで、このような相同性の数値は、塩基配列比較用プログラム：例えばＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ ｖ３．７やＢＬＡＳＴ：ＮＣＢＩのサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／）を用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターにより算出されるものである。
転移酵素をコードする塩基配列を含むＤＮＡ又はその部分の変異体は、転移活性を有していればよく、その活性の高さは特に限定されないが、それぞれ、該塩基配列を含むＤＮＡ又はその部分の転移活性と同等の活性を実質的に有することが好ましい。ここで、「当該活性を実質的に有する」とは、該活性を利用した実際の使用態様において、これらのＤＮＡ又はその部分と、同一の条件でほぼ同様の利用が可能な程度の活性が維持されていることをいう。また、ここでいう当該活性とは、例えば植物細胞や植物体、好ましくは双子葉植物の細胞や植物体における活性、より好ましくはカーネーションの細胞や植物体における活性をいう。ここで転移活性は、例えば、Ｈａｓｈｉｄａらの報告［Ｐｌａｎｔ Ｐｙｓｉｏｌ．１３２：１２０７−１２１６］の方法に従って、欠失で自律性を失った転移因子を含むプラスミドを作成し、これをｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔにより細胞内に打ち込んで、プラスミドから転移する頻度を見ることにより測定することができる。
さらに、得られた転移因子の塩基配列のうち配列番号４をもとにプライマーを作成しＰＣＲを行ったところ、カーネーションの品種カリーのみならずＤｉａｎｔｈｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓおよびＤｉａｎｔｈｕｓ ｂａｒｂａｔｕｓでも予想される大きさの増幅産物が得られたので、この転移因子は少なくともダイアンサス属に存在することが明らかである。なお、この転移因子は転移酵素の活性を有し上記のような転移を起こすものであれば、本発明で見出されたダイアンサス属に限らず含まれ、幅広い植物での花色などの突然変異現象を説明できる。そのような植物としてダイアンサス属以外に例えばダイアンサス属が含まれるナデシコ科、バラ科、オシロイバナ科、キク科、ヒルガオ科、ツリフネソウ科やナス科の植物が挙げられるが何等これらの植物に限定されることなく、幅広く単子葉、双子葉の植物でも見出される可能性がある。
転移因子有無の検出に用いるプライマーの設計は転移因子の塩基配列のうち、連続する８塩基以上、望ましくは１６塩基以上、更に望ましくは２０塩基以上、更に好適には２０〜３０塩基の部分を２ヶ所任意に選ぶことにより可能である。以下の実施例で用いたプライマー配列はＧＧＴＣＴＡＧＴＴＡＧＴＣＡＧＣＴＡＣＧＧ（２１塩基：配列番号１６）およびＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣ（２１塩基：配列番号１７）であるが、これ以外のものでも構わない。２つのプライマーの選択位置の間の距離を、好適には、１００から１０００塩基、更に好適には、３００から６００塩基とすることができる。このようなプライマーは、プライマー間の目的とするＤＮＡ断片を増幅するものであればよく、例えばＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０などの解析ソフトを利用することにより任意に選んで使用することができる。このようなプライマーは、数種類、望ましくは１種の増幅産物が得られるようなものであればＰＣＲ等の遺伝子増幅法による本検出に用いることができる。このような遺伝子増幅法としては、ＰＣＲ法を挙げることができるが、ＰＣＲ法に限定されず、特定的プライマーを使用する増幅法であれば、用いることができ、例えばＰＣＲ法は遺伝子増幅ＰＣＲ法共立出版株式会社（１９９０）を参照すれば、当業者であれば容易に行い得る。
プライマーには、配列番号４および配列番号２２から設計される特異的部分（実施例参照）に加え、アダプター配列を付加することもできる。このようなアダプター配列を付加したＰＣＲ法として、ＰＣＲ−ＡＦＬＰ法やＰＣＲ−ＶＥＣＴＯＲＥＴＴＥ法が挙げられるが、これらに限られることなく他にＣＴの繰り返し数に着目したＰＣＲ−ＳＳＲ法、塩基配列に依存した高次構造の相違に着目したＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、２本鎖ＤＮＡの融解温度の相違に着目したＰＣＲ−ＤＧＧＥ法等も適宜用いることができる。このような手法は当業者であれば、容易に選択し行うことができる。
転移因子の有無の検出に用いるプローブには、配列番号４あるいは配列番号２２の塩基配列又は上記（１）〜（５）の塩基のうち少なくとも連続した１００塩基又はその相補的配列を有する１００塩基を含むプローブを用いることができる。プローブには、通常用いられる手段、例えば、放射線標識（アマシャム社メガプライム法）、ＤＩＧ標識（ロシュ社方法準拠）等で標識することができる。
また転移因子が挿入された遺伝子が同定できれば、転移因子の脱離を次のようにして確認できる。例えば、本発明により得られた転移因子をプローブとしサザンハイブリダイゼーションにより、又は転移因子の塩基配列をもとにプライマーを作成しインバースＰＣＲを行うことにより、変異体と変異体が由来するもととなる個体の相違を検出することにより、変異遺伝子（転移因子が挿入された遺伝子）の一部（断片）を単離することができる。
このようにして得られたＤＮＡ断片を用い変異遺伝子全体を容易に単離することができる。
転移因子の脱離有無の検出に用いるプライマーの設計は、本転移因子が花色発現酵素をコードする塩基配列に挿入されている場合は、転移因子の塩基配列と花色発現酵素をコードする塩基配列（ここではフラボノイド３’水酸化酵素遺伝子のゲノム塩基配列）から、それぞれ連続する８塩基以上、望ましくは１６塩基以上、更に望ましくは２０塩基以上、更に好適には２０〜３０塩基の部分を２ヶ所任意に選ぶことにより可能である。以下の実施例で用いたプライマー配列は配列番号１９および配列番号４に示す塩基配列から、それぞれＧＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡＴＡＣＴＣＡＧＴＡＣＡ（２４塩基：配列番号１０）およびＧＧＴＣＴＡＧＴＴＡＧＴＣＡＧＣＴＡＣＧＧ（２１塩基：配列番号１６）であるが、これ以外のものでも構わない。このようなプライマーは、プライマー間の目的とするＤＮＡ断片を増幅するものであればよく、例えばＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０などの解析ソフトを利用することにより任意に選んで使用することができる。
このようなプライマーは、数種類、望ましくは１種の増幅産物が得られるようなものであればＰＣＲ等の遺伝子増幅法による本検出に用いることができる。このような遺伝子増幅法としては、ＰＣＲ法を挙げることができるが、ＰＣＲ法に限定されず、特定的プライマーを使用する増幅法であれば、用いることができ、例えばＰＣＲ法は遺伝子増幅ＰＣＲ法 共立出版株式会社（１９９０）を参照すれば、当業者であれば容易に行い得る。
また本発明には、
（１）配列番号４あるいは配列番号２２の塩基配列のうち少なくとも連続した８塩基を含むプライマーを用いた遺伝子増幅法により、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は以下の［Ａ］に記載のＤＮＡ若しくは［Ｂ］に記載の転移因子塩基配列を検出することを特徴とする芽条突然変異の有無を検出する方法、
［Ａ］： 以下の（ａ）〜（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）のいずれかの塩基配列又は（ｅ）の縮重異性体を含んでなるＤＮＡ。
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は（両端に）付加されたものであり、かつ転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（ｃ）配列番号４の塩基配列
（ｄ）配列番号４の塩基配列のうち１０５６番目のＡから３４９７番目のＴまでである塩基配列
（ｅ）配列番号４の塩基配列の縮重異性体
（ｆ）上記（ａ）〜（ｄ）いずれかに記載の塩基配列又は上記（ｅ）に記載の縮重異性体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコードされるポリペプチドが転移活性を有する塩基配列
（ｇ） 以下の（ｉ）〜（ｉｉ）のいずれかの塩基配列
（ｉ）配列番号２２の塩基配列
（ｉｉ）上記（ｉ）に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列；
［Ｂ］： ５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有し、配列番号１及び配列番号２に示す配列を直接に、又は４０００塩基より短い任意のリンカーを介し、連結された非自律性の転移因子。
（２）配列番号４あるいは配列番号２２の塩基配列のうち少なくとも連続した８塩基を含むプライマーを用いた遺伝子増幅法により、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は上記［Ａ］に記載のＤＮＡを有する転移因子若しくは［Ｂ］に記載の転移因子の有無を検出する方法、
（３）配列番号４あるいは配列番号２２の塩基配列のうち少なくとも連続した８塩基を含むプライマーと本転移因子が挿入している周囲の塩基配列のうち少なくとも連続した８塩基を含むプライマーを用いた遺伝子増幅法により、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は上記［Ａ］に記載のＤＮＡを有する転移因子若しくは［Ｂ］に記載の転移因子の脱離有無を検出する方法、も含まれる。
より具体的には、配列番号４の塩基配列のうち少なくとも８塩基の塩基が連続した任意の場所と配列番号１９の塩基配列のうち少なくとも８塩基の塩基が連続した任意の場所をプライマーとして利用したＰＣＲ法により、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は上記［Ａ］に記載のＤＮＡを有する転移因子若しくは［Ｂ］に記載の転移因子の脱離有無を検出する方法、も含まれる。
（４） 配列番号４あるいは配列番号２２の塩基配列のうち少なくとも連続した１００塩基又はその相補的配列を有する１００塩基を含むプローブを利用した、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は上記［Ａ］に記載のＤＮＡを有する転移因子若しくは［Ｂ］に記載の塩基配列を検出することを特徴とする芽条突然変異の有無を検出する方法、
（５） 配列番号４あるいは配列番号２２の塩基配列のうち少なくとも連続する１００塩基又はその相補的配列を有する１００塩基を含むプローブを利用した、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は上記［Ａ］に記載のＤＮＡを有する転移因子若しくは［Ｂ］に記載の転移因子の有無を検出する方法も含まれる。
これら（１）〜（５）の検出法に係る説明は、以下の通りである。
芽条突然変異の検出
本発明の転移因子の塩基配列を利用することによりサザンハイブリダイゼーション、インバースＰＣＲあるいはトランスポゾンディスプレイなどの手法を用いて、もととなる個体との相違を調査することにより突然変異体を容易に検出することができる。
以下の実施例ではインバースＰＣＲを用い突然変異の検出を行った。ここで用いた制限酵素はＨｉｎｄＩＩＩあるいはＳｐｅＩであり、プライマーはＣＧＡＡＴＡＣＣＧＴＧＣＴＴＴＧＧＡＣＧ（２０塩基：配列番号１８）およびＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣ（２３塩基：配列番号１７）であるが、これ以外のものでも構わない。制限酵素は設定したひとつのプライマーの３’末端から５’末端側へもうひとつのプライマーの３’末端までの間に切断点をもたず、かついずれかひとつのプライマーの３’末端から転移因子の３’末端までの間に切断点をもたない酵素であれば、本検出に用いることができる。本検出に用いるプライマーは本転移因子の塩基配列のうち、連続する８塩基以上、望ましくは１６塩基以上、更に望ましくは２０塩基以上、更に好適には２０〜３０塩基の部分を２ヶ所逆方向に任意に選ぶことにより可能である。このようなプライマーは、プライマー間の目的とするＤＮＡ断片を増幅するものであればよく、例えばＯｌｉｇｏ ４．０などの解析ソフトを利用することにより任意に選んで使用することができる。
芽条突然変異を誘発する転移因子の転移促進による突然変異
（１）転移因子の利用法
転移因子の転移を誘発する環境条件としてカルス培養・紫外線照射・放射線照射・病原菌の感染などが知られている（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９９８；１０：４２７−３４）。また、低温（ＭＧＧ １９８７；２０７：８２−８９）や高温（特開２００３−９３０７４号公報）など温度条件も転移を促進する要因として報告されている。このように種々の環境的あるいは人為的な要因により転移が活性化されることが明らかとなっている。これらの条件に植物を暴露することにより、転移因子の転移（突然変異誘発）を促進することが可能である。
本発明で得られた配列番号４および配列番号２２に示す塩基配列を有する転移因子は、実際に転移することが可能である。また、それぞれが転移することにより芽条突然変異を誘発することがＤＮＡレベルで明らかとなった。本発明で得られた９７ＳＰｉのフラボノイド３’水酸化酵素に挿入している転移因子は、限定されるものではないが、少なくとも低温あるいは短日あるいはそれら両方の条件下において顕著に転移が促進される。このように当該促進に伴って芽条突然変異体を効率よく得ることが可能となる。また、すでに述べたようにカルス培養・紫外線照射・放射線照射・病原菌の感染（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９９８；１０：４２７−３４）あるいは高温（特開２００３−９３０７４号公報）などの条件も、本発明の転移因子の転移を促進する条件の候補である。
また、転移因子の転移の促進には転移因子自身の脱メチル化が関与することが知られている（植物の生長調節２００１；３６：１７８−１８０）。ＤＮＡメチル化酵素遺伝子の発現抑制や、脱メチル化を促すために５−アザシチジンなどの化学物質処理を行うことにより転移因子の転移を促進することが可能であると考えられる。このような転移因子の活性化（可動）条件を容易に検出するには種々の条件においた植物の転移酵素活性を調査することも有効である。
そこで、予め転移因子の存在する個体をスクリーニングし、転移因子の存在が確認された植物について、上記の転移を誘発する条件に曝したり、化学処理をすることにより、芽条突然変異を効率よく導入できる。
転移酵素の転写量はノーザンハイブリダイゼーションやリターンＰＣＲにより把握することにより推定することが可能であり、容易に転移を促す要因の特定ができ、芽条突然変異を得る条件を決定することが可能である。また、メチレーション感受性の制限酵素とメチレーション非感受性の制限酵素を用いＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、ＣＡＰＳなどのＤＮＡ多型検出方法を用いること（Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１１：２１２−２１４）、あるいはメチルシトシン残基に影響をおよぼさずにシトシン残基を化学的にウラシルへ変換し塩基配列を解読することにより（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９９４）２２：２９９０−２９９７）容易に転移因子のメチレーション程度を検定することができる。このような評価は当業者であれば容易に行うことができる。
これら転移因子がもつ転移酵素の転写量を監視することおよび転移因子のメチレーション程度を評価することにより、転移因子の転移活性を評価することが可能となり容易に転移を促す条件を得ることができる。
本発明には、請求項１記載のＤＮＡを用いて宿主を形質転換し（当該ＤＮＡ：遺伝子が発現した）形質転換体を作出することにより転移酵素を発現し自律性因子、非自律性因子を問わず転移因子の転移を促進することにより芽条突然変異体を作出する方法、即ち芽条突然変異の誘発法も含まれる。このような方法につき、以下（２）〜（４）に説明する。
（２）転移酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ
転移酵素をコードする遺伝子を転移酵素をコードする遺伝子自身のプロモーターのみならずカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなど植物での機能がみとめられるプロモーターと交換し、遺伝子導入の手法を用い植物に導入し、請求項１（１）〜（４）、（６）、（７）に記載のいずれかの塩基配列又は請求項１（５）に記載の縮重異性体又は請求項５に記載される転移因子のいずれかを転移させることにより芽条突然変異を促すことが可能である。
ここでプロモーターとしてカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを例示したが、植物で機能するものであれば、何等これに限定されるものではない。
また、誘導性プロモーターに結合し遺伝子導入の手法を用い植物に導入することにより、誘導条件下でのみ転移を促すことができる。また、遺伝子組み換えを経ずとも一過的に転移酵素をコードする遺伝子を発現することにより転移を促進することもできる。
ここで誘導性プロモーターとして、例えばヒートショック誘導性（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９５ ４４：４６６−４７２）のものを用いることができる。但し、誘導性であり、且つ植物細胞や植物体内で機能するものであれば、上記プロモーターに限定されるものではない。
なお、上述のプロモーターは、該プロモーターを含むＤＮＡの塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによる増幅反応によって得ることができる。具体的には、誘導性プロモーターの場合このような遺伝子の１つであるヒートショック蛋白遺伝子（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ（１９８９）２１９：３６５−３７２）のプロモーター領域（ヒートショック蛋白遺伝子の翻訳開始点から−６７８の領域）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、増幅することにより得ることができる。ここでＰＣＲに用いることができる鋳型ＤＮＡとしては、例えばシロイヌナズナのゲノムＤＮＡが挙げられるが、何等これに限定されるものではない。
このようなプロモーターについても上記の転移因子の遺伝子同様、プロモーター活性を有する限りにおいて種々の変異体のものを用いることが出来る。該変異体の作成は、上記の転移因子の遺伝子の記載と同様、上記各種プロモーターに関わる文献に記載の塩基配列を参照すれば、当業者であれば格別の困難性なしに実施できる。上記のように取得した変異体がプロモーターとしての活性を有するか否か、さらには、プロモーターを含むＤＮＡ又はその部分のプロモーター活性を実質的に保持するか否かは、転移因子の遺伝子を繋いで宿主細胞内で発現させることにより、上記の芽条突然変異検出法あるいは目視、花色分析など生体成分の分析により確かめることができ、このような方法は当業者であれば容易に行うことができる。
また、必要に応じて転写終結を指令するターミネーターを転移酵素をコードする遺伝子の下流に連結することもできる。
ターミネーターとしては、例えば、３５Ｓ遺伝子、ｎｏｓ遺伝子やｏｃｓ遺伝子のターミネーターなどが挙げられる（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４４（１９９３）９８５−９９４、″Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ″）が、植物細胞内や植物体内で機能することが知られているターミネーターであればこれらに限定されるものではない。
また、必要に応じてプロモーター配列と転移因子の遺伝子との間に、遺伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列、例えばトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈｌ）のイントロン［Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １：１１８３−１２００（１９８７）］を導入することができる。
ＤＮＡはさらに、翻訳エンハンサー、翻訳終止コドン等の構成要素を含むことができる。翻訳エンハンサー及び翻訳終止コドンとしては、公知のものを適宜組み合わせて用いることができる。ウイルス起源の翻訳エンハンサーとしては、例えば、タバコモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４、ブロモモザイクウイルスＲＮＡ３、ポテトウイルスＸ、タバコエッチウイルスなどの配列が挙げられる（Ｇａｌｌｉｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５（１９８７）８６９３−８７１１）。また、植物起源の翻訳エンハンサーとして、ダイズのβ−１，３グルカナーゼ（Ｇｌｕ）由来の配列（石田功、三沢典彦著、講談社サイエンティフィク編、細胞工学実験操作入門、講談社、ｐ．１１９、１９９２）やタバコのフェレドキシン結合性サブユニット（ＰｓａＤｂ）由来の配列（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１９９５）１２４６６−１２４７０）などが挙げられる。翻訳終止コドンとしてはＴＡＡ，ＴＡＧ，ＴＧＡなどの配列が挙げられる［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ前出等の記載］。また、プロモーター中の転写エンハンサーとして、３５Ｓ遺伝子のエンハンサー部分が同定され、それらを複数個並べて繋げることにより、活性を高めることが報告されており（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１（１９８９）１４１−１５０）、この部分をＤＮＡの一部として用いることも可能である。これらの各種構成要素は、その性質に応じて、それぞれが機能し得る形でＤＮＡ鎖中に組み込まれることが好ましい。そのような操作は、当業者であれば適切に行うことができる。
上記ＤＮＡは、遺伝子工学の分野で慣用されている手法を用いることにより、当業者であれば容易に製造することができる。また、本発明のＤＮＡは、天然の供給源から単離されたものに限定されるものではなく、上記のような構造を有するものであれば、人工的な構築物であってもよい。該ＤＮＡは、周知慣用されている核酸合成の方法に従って合成する事により、得ることができる。
（３）形質転換と遺伝子発現個体の確認
上記の転移因子の遺伝子によって宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養又は栽培することにより、転移因子としての酵素活性を有するタンパク質を発現することができ、転移因子の転移挿入により任意の酵素をコードする遺伝子の活性発現が抑制された突然変異体を作製することができる。
形質転換後の本発明の鎖は、プラスミド、ファージ又はゲノムＤＮＡの中に挿入された形で、微生物（特に細菌）、ファージ粒子又は植物の中に存在することができる。ここで、細菌としては、典型的には、大腸菌、アグロバクテリウム等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の好ましい実施形態では、本発明のＤＮＡは、タンパク質を発現させようとしている構造遺伝子が、植物細胞内や植物体内で安定に発現し得るように、本発明のＤＮＡ、翻訳エンハンサー、翻訳終止コドン、及びターミネーター等とが一体に結合して、これがゲノムに挿入された形態で植物中に存在する。
宿主の好ましい例としては、イネ、ムギ、トウモロコシ、ネギ、ユリ、ラン等の単子葉植物やダイズ、ナタネ、トマト、バレイショ、キク、バラ、カーネーション、ペチュニア、カスミソウ、シクラメン等の双子葉植物といった植物細胞が挙げられ、特に好ましい具体例としては、世界での生産流通消費数量が多い３大切花であるキク、カーネーション、バラや近年栄養系でも世界的に生産流通消費量が飛躍的に伸びているペチュニア等の植物細胞などが挙げられる。また、具体的な植物材料としては、例えば、生長点、苗条原基、分裂組織、葉片、茎片、根片、塊茎片、葉柄片、プロトプラスト、カルス、葯、花粉、花粉管、花柄片、花茎片、花弁、がく片等が挙げられる。
宿主に外来遺伝子を導入する方法としては、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができる。その好ましい例として、例えば、生物学的方法としては、ウィルス、アグロバクテリウムのＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド等をベクターとして用いる方法が挙げられ、物理学的方法としては、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール、パーティクルガン、マイクロインジェクション（″Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ″前出）、シリコンニトリドウイスカー、シリコンカーバイドウイスカー（Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ８５（１９９５）７５−８０、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３１（１９９５）１０１−１０４、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３２（１９９８）３１−４３）によって遺伝子を導入する方法等が挙げられる。当該導入方法については、当業者であれば適宜選択し、使用することができる。
さらに、本発明のＤＮＡで形質転換された植物細胞を再生させることにより、導入された遺伝子がその細胞内で発現する形質転換植物を作製することができる。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、「植物細胞培養マニュアル、山田康之編著、講談社サイエンティフィク、１９８４」等の文献を参照することにより、当業者であれば容易に行うことができる。
一般に、植物に導入した遺伝子は、宿主植物のゲノム中に組み込まれるが、その場合、導入されるゲノム上での位置が異なることにより導入遺伝子の発現が異なるポジションイフェクトと呼ばれる現象が見られる。導入遺伝子がより強く発現している形質転換体は、導入遺伝子のＤＮＡ断片をプローブとして用いるノーザン法により宿主植物中に発現しているｍＲＮＡレベルを検定することによって選抜することができる。
本発明に用いる遺伝子を導入した形質転換植物に目的の遺伝子が組み込まれていることの確認は、これらの細胞及び組織から常法に従ってＤＮＡを抽出し、公知のＰＣＲ法又はサザンハイブリダイゼーションを用いて導入した遺伝子を検出することにより行うことができる。また、形質転換植物での発現は、例えばリターンＰＣＲにより容易に行うことができる。
（４）一過的発現
本発明の転移因子にコードされる転移酵素を植物で機能するプロモーターに結合し、一過的に発現することにより、限られた時間内でのみ転移因子の転移を促し突然変異を誘発することが可能である。一過的発現としてはＰＶＸなどウイルスを使ったもの（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ（１９９５）７：２４９−２５７）やアグロバクテリウム（Ｐｌａｎｔ Ｊ（２００３）３３：９４９−９５６．）による系が知られているが、これらに限定されるものではない。
さらに本発明には、配列番号４あるいは配列番号２２の塩基配列、および配列番号４あるいは配列番号２２とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、および請求項５に記載のＤＮＡを宿主に導入し、転移酵素を供給することにより転移を促すことにより芽条突然変異体を誘発することも含む。
前述した形質転換と同様にＤＮＡの宿主への導入は当業者であれば容易に行うことができる。導入されたＤＮＡは、請求項１に記載したＤＮＡを有する個体（前述した形質転換体を含む）と交配すること、あるいは前述した形質転換などの手法により転移酵素を供給することにより転移が可能となる。このようにして芽条突然変異を誘発することも可能である。
本発明には、上記形質転換体を含め転移因子の転移により得られた芽条突然変異体の安定化方法も含まれる。このような方法につき、以下に説明する。
芽条突然変異の安定化
転移因子を遺伝子内に有する個体では、自然突然変異の発生率より大きな頻度でこの遺伝子から転移因子が脱離することによる復帰細胞が得られることがあり、易変性と呼ばれる（バイオホルティ ７ ７５−７９ １９９２農耕と園芸編 誠文堂新光社）。易変性は農業生産物の品質の安定性を低下させる要因である。転移因子が脱離する際には、存在した遺伝子に転移因子のＤＮＡ塩基を数塩基ランダムに残していくことが知られており、この現象を利用すれば転移因子が脱離したにも関わらず遺伝子の機能が破壊されているものが得られる。つまり、転移因子の転移を促しその遺伝子から脱離したものを選抜することにより安定な変異体を得ることができる。ここで、芽条突然変異を誘発する転移因子で述べたように転移因子が変異遺伝子から脱離した個体を、転移因子の一部および変異遺伝子の一部をプライマーとしてＰＣＲを行うこと、あるいは前出の芽条突然変異の検出で述べた方法によりスクリーニングすることが可能である。また、転移因子あるいは変異遺伝子もしくは転移因子と変異遺伝子をプローブにサザンハイブリダイゼーションを行うことによってもスクリーニングが可能である。上記転移因子離脱後の転移因子に由来する数塩基の残存有無については、例えばその領域を含む部分を遺伝子増幅法で増幅し直接塩基配列を決定することにより芽条突然変異の安定化を確認することができる。
また、逆に転移を助長する温度等の環境条件への暴露を控えたり、ＲＮＡｉなどの手法を用い人為的に転移酵素の発現を抑制することによって芽条突然変異誘発を安定化することも可能となる。
本発明には、上記形質転換体を利用した芽条突然変異体の単離方法も含まれる。このような方法につき、以下に説明する。
転移因子により誘発された芽条突然変異の変異遺伝子の単離
本発明により得られた転移因子をプローブとしサザンハイブリダイゼーションを行うことあるいは転移因子の塩基配列をもとにプライマーを作成しインバースＰＣＲを行うことにより、変異体とそのもととなる個体の相違を検出することにより変異遺伝子の一部を単離することができる。このようにして得られたＤＮＡ断片を用い変異遺伝子全体を容易に単離することができる。本発明の転移因子はこのような場面で、芽条突然変異を起こすという特徴から後代のみならず当代においても遺伝子単離の道具となり得る。
転移因子により誘発された遺伝子の発現が抑制された変異体の選抜
ある遺伝子の機能を抑制しようとする場合、アンチセンス技術などを用い遺伝子組み換えにより達成することが行われているが、本発明の転移因子の転移によりこのような遺伝子の発現を抑制された変異体を遺伝子組み換えを利用することなく作り出すことが可能となる。即ち、例えば低温あるいは短日あるいはそれら両方の条件により転移因子を有する植物の転移因子を転移させ突然変異を誘発することにより、ある遺伝子の発現が抑制された変異体を作成することができる。そして、目的の遺伝子に転移因子が挿入しているものをＰＣＲ法により容易に検出（選抜）することが可能である。
転移因子により誘発された変異集団の中から目的とする遺伝子および転移因子のＤＮＡをもとにサザンハイブリダイゼーションあるいはＰＣＲを行うことにより、目的とする遺伝子に転移因子が挿入した個体を選抜することが容易にできる。
なお、本発明の転移因子のうち内部に転移酵素を有しているものは自ら転移することが可能である（自律性）が、一般的に転移因子は内部の配列を除去しても転移酵素の供給があれば転移することが知られている［Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １３２：１２０７−１２１６（２００３）］。例えば、本文献ではＢａｌｌ部位からＴｔｈＨＢ８１部位の２２６０塩基が欠落しても、転移酵素の供給により転移することができる。このように転移因子の内部を一部欠落させることにより転移酵素活性をもたない転移因子を得ることができ、得られた転移因子は転移酵素を有していないので自らのみでは転移することができないが、転移酵素の供給下で転移することが可能である。本発明で得られた内部に転移酵素をもたないものは、自然界に存在する転移酵素の供給下で転移可能な転移因子である。このような転移酵素供給下で転移可能な転移因子が自然界に存在することは知られており、非自律性因子と呼ばれている［蛋白質核酸 酵素 ３７：１０４７−１０５９（１９９２）］。転移因子が自律性か非自律性かは、発現可能な転移酵素遺伝子を有するか否かによって推察することができる。
本発明の転移因子においても転移酵素をコードする塩基配列の全部あるいは一部を除去（欠失）するまたは塩基の置換、挿入又は（両端に）付加するといった変異を導入することにより、上述したような転移酵素が働かない転移因子を作成することは当業者であれば容易である。また、本発明の転移因子のＤＮＡ配列の全部あるいは一部をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により当業者であれば容易に本発明の転移因子と相同性を有するものを得ることが可能である。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析することによりそれらの中から転移酵素部分に変異があり、かつ上述したような転移酵素が働かない転移因子を作成するあるいは見出すことは当業者であれば容易である。
このように人為的に作成、あるいは自然界から選抜することにより、本発明の転移因子と相同性を有するが自身では転移することができない転移因子を当業者であれば容易に得ることが可能である。これらは本発明の転移酵素により転移することが可能であるので、このような転移酵素活性をもたない転移因子を上述したような芽条突然変異の検出、芽条突然変異を誘発する転移因子の転移促進による突然変異、芽条突然変異の安定化、転移因子により誘発された芽条突然変異の変異遺伝子の同定、転移因子により誘発された遺伝子の発現が抑制された変異体の選抜に用いることができる。
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明は、何等実施例に限られるものではない。また、以下の実施例で用いられたカーネーション系統９５ＳＰ、９７ＳＰｉ、９７ＳＥ、９９ＳＰ５および９９ＳＰ４は、麒麟麦酒株式会社の植物開発研究所内にて保存されており、実験材料として分譲要請に応じることができる。連絡先は、〒３２９−１４１４ 日本国栃木県塩谷郡喜連川町大字早乙女字申塚３３７７番地（電話；国番号８１−２８−６８６−０５０１、ファクシミリ；国番号８１−２８−６８６−０５０２）である。
【実施例１】
カーネーションの花弁色素の分析
カーネーションの花弁の色素分析は山口雅篤の方法（南九州大学園芸学部研究報告（１９８８）・第１９号１−７８頁：カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ Ｌ．）の花色育種に関する基礎的研究）によった。系統９５ＳＰと９７ＳＰｉの花弁を５％酢酸５０％エタノールでそれぞれ抽出した後、ＴＬＣ（酢酸：塩酸：水＝１５：３：８２）で展開した。それらの展開像を既知のシアニジン３グルコシド５グルコシド（Ｃｙ３Ｇ５Ｇ）の色素を持つカーネーション花弁（品種バーバラ：ヒルベルダ社）から抽出したものとペラルゴニジン３グルコシド５グルコシドグルコシド（Ｐｇ３Ｇ５Ｇ）の色素を持つカーネーション花弁（品種ライラック：シリー ブラザーズ社）から抽出したものと比較することにより、９５ＳＰはシアニジン骨格をもつ色素、９７ＳＰｉはペラルゴニジン骨格をもつ色素を主要に含むことが推定できた。
【実施例２】
カーネーションのゲノムＤＮＡの調整
カーネーション系統９５ＳＰ、カーネーション系統９７ＳＰｉ、カーネーション系統９７ＳＥ、カーネーション系統９９ＳＰ５および９９ＳＰ４のＤＮＡの調整は、インビトロの葉片を材料にＮｕｃｌｅｏｎ ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ（アマシャム社）を用い添付のプロトコールに従って行った。
なお、９９ＳＰ５及び９９ＳＰ４は以下の手法により得、材料とした。定法に従ってＸ線４ＫＲを照射した９５ＳＰの草丈約５ｃｍ長のインビトロ植物１０００個体を温室に馴化し、腋芽を採り育成しそれから発根した個体の腋芽を採り育成することを数回繰り返しピンク色の花をつけるもの（９７ＳＰｉと同じ花色の個体）として２個体（９９ＳＰ５、９９ＳＰ４）を得た。
【実施例３】
カーネーションのｃＤＮＡの調整
カーネーション系統９５ＳＰのｃＤＮＡの調整は、細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ２ 植物のＰＣＲ実験プロトコール（１９９５）４２−４３に記載の方法に従い、花弁を材料に単離したＲＮＡをもとに、タカラ社のｃＤＮＡ合成キットを用い添付のプロトコールに従いキットに添付されている１８塩基のｄＴプライマーを用いて行った。
【実施例４】
フラボノイド３’水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）遺伝子のクローン化と塩基配列の決定
（１）カーネーション系統９５ＳＰのＦ３’Ｈ遺伝子のクローン化とｃＤＮＡ塩基配列の決定
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＸ０２８８１９に記載されているＦ３’Ｈ遺伝子のｃＤＮＡ配列を参考にしプライマーＡＡＧＣＡＴＡＴＴＧＣＮＴＡＹＡＡＹＴＡＹＣＡＮＧＡ（２６塩基：配列番号５）およびＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＤＡＴＮＧＣＣＣＡＮＡＹＲＴＴ（２６塩基：配列番号６）を作成した。これらのプライマーを用いインビトロのカーネーション系統９５ＳＰの花弁から得られた全ｃＤＮＡ画分に対し、ＰＣＲ（条件：９５℃５分、（９５℃３０秒、３５℃３０秒、７２℃１分）を３０回、７２℃１０分）を行った。得られた増幅産物をｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて８４８塩基の塩基配列を決定した。得られた塩基配列を上記ＧｅｎＢａｎｋ ＡＸ０２８８１９に記載されているＦ３’Ｈ遺伝子のｃＤＮＡ配列と比較すると５ヶ所の塩基置換と１ヶ所の３塩基の挿入がみられた（図３）。
（２）カーネーション系統９７ＳＰｉのＦ３’Ｈ遺伝子のクローン化とゲノムＤＮＡ塩基配列の決定
次に、細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ２ 植物のＰＣＲ実験プロトコール（１９９５） ６９−７２に従い、カーネーション系統９７ＳＰｉのゲノムＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩで分解し、その分解産物を材料に前記カーネーション系統９５ＳＰで得られたＦ３’Ｈ遺伝子塩基配列をもとに作成したプライマーＴＡＡＡＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡ（２１塩基：配列番号７）およびＡＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴＴＴＧＡＴ（２１塩基：配列番号８）を用いインバースＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃２分）を３０回、７２℃３分）を行った。得られた約１．６ｋｂの増幅産物をｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列を決定した。ここで得られた塩基配列を制限酵素ＮｄｅＩの切断点で２つに分割し２種の塩基配列を得た。
さらにＧｅｎＢａｎｋ ＡＸ０２８８１９に記載されているｃＤＮＡ配列と実施例４（１）で明らかとなったカーネーション系統９５ＳＰのＦ３’Ｈ遺伝子ｃＤＮＡ配列および前段落で明らかとなったカーネーション系統９７ＳＰｉのＦ３’Ｈ遺伝子の一部分のゲノムＤＮＡ塩基配列をもとに以下のプライマーを作成した。プライマーＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＣＡＧＴＡＣＡ（２１塩基：配列番号９）およびＧＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡＴＡＣＴＣＡＧＴＡＣＡ（２４塩基：配列番号１０）を用い、カーネーション系統９７ＳＰｉのゲノムＤＮＡに対しＰＣＲ（条件：９５℃５分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３分）を３０回、７２℃３分）を行った。この約１．９ｋｂの増幅産物と、プライマーＡＡＴＧＴＣＡＣＣＣＴＴＡＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＴＣＴＡ（２７塩基：配列番号１１）およびＴＡＧＣＡＡＧＧＣＣＴＴＡＡＴＴＴＣＴＧＴＧ（２２塩基：配列番号１２）により同様にして得られた約２．９ｋｂの増幅産物をｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列を決定した。
（３）カーネーションのＦ３’Ｈ遺伝子のゲノムＤＮＡ塩基配列
実施例４（１）のｃＤＮＡ配列、実施例４（２）インバースＰＣＲによる約１．６ｋｂＤＮＡ断片から得られた２種のＤＮＡ配列、実施例４（２）ＰＣＲによる約１．９ｋｂＤＮＡ断片のＤＮＡ配列および実施例４（２）ＰＣＲによる約２．９ｋｂＤＮＡ断片のＤＮＡ配列、合計５種の塩基配列を結合し重複部分を除くことにより、カーネーションＦ３’Ｈ遺伝子のゲノムＤＮＡ塩基配列５７４３塩基を決定した（配列番号１９）。また、９７ＳＰｉには対立遺伝子として２つのＦ３’Ｈ遺伝子が存在することが予想されるが、９７ＳＰｉでは配列番号１９の２５２７番目の塩基ＡのあとにＧが挿入されフレームシフトを起こしていることが明らかとなった。
【実施例５】
カーネーション系統９７ＳＰｉからの転移因子のクローン化と塩基配列の決定
インバースＰＣＲは、細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ２ 植物のＰＣＲ実験プロトコール（１９９５） ６９−７２に従い行った。実施例２に記載した方法によりカーネーション系統９５ＳＰおよび９７ＳＰｉよりゲノムＤＮＡを調整し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで分解した。これら分解産物を材料に実施例４（１）で得られた８４８塩基のＤＮＡ配列をもとに作成したプライマーＣＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧＴＴＴＧＣＧＡＣＣ（２０塩基：配列番号１３）およびＴＡＡＡＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡ（２１塩基：配列番号７）を用いインバースＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃２分）を３０回、７２℃３分）を行った。得られた増幅産物を１％アガロースゲルを用い１００Ｖで２０分間電気泳動することにより分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。この結果、９７ＳＰｉに特異的に存在する約２．５ｋｂの増幅産物が得られた。これをｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列を決定した。この塩基配列を内部に存在する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断点で分割し２種の塩基配列としたところ、約３００塩基の１種は実施例４で得られたＤＮＡ塩基配列（配列番号１９）の一部と全長にわたり一致した。
次に前段落で明らかとなった約２．５ｋｂのＤＮＡ配列をもとに作成したプライマーＧＡＧＡＣＴＣＡＴＡＧＴＧＧＴＴＡＴＡＴＡＣＡ（２３塩基：配列番号１４）および実施例４（２）で得られた約１．９ｋｂのＤＮＡ配列をもとに作成したプライマーＴＡＡＣＡＡＣＡＣＧＴＡＡＣＣＧＡＡＡＡＴＡＴＡ（２４塩基：配列番号１５）を用い、カーネーション系統９７ＳＰｉのゲノムＤＮＡを材料にＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３分）を３０回、７２℃３分）を行った。得られた約３ｋｂの増幅産物をｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列を決定した。
本実施例で得られた３種のＤＮＡ塩基配列のうち実施例４で得られた塩基配列と一致した１種を除いた２種の塩基配列を結合し重複した部分を除外し、さらに両末端に存在する実施例４で得られたフラボノイド３’水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）遺伝子のゲノムＤＮＡ塩基配列（配列番号１９）と相同な４０塩基および９３１塩基の部分を除外することにより本発明の転移因子のＤＮＡ塩基配列（配列番号４）を得た。ここでＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ ｖ３．７による解析によりオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、１０５６番目の塩基Ａから３４９７番目のＴまでの２４４２塩基であった。
次に配列番号１９および配列番号４に示すＤＮＡ塩基配列からＧＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡＴＡＣＴＣＡＧＴＡＣＡ（２４塩基：配列番号１０）およびＧＧＴＣＴＡＧＴＴＡＧＴＣＡＧＣＴＡＣＧＧ（２１塩基：配列番号１６）２種のプライマーにより、本発明の転移因子の内部からフラボノイド３’水酸化酵素の部分までをＰＣＲを用い増幅することが可能となる。９５ＳＰ、９７ＳＰｉのＤＮＡおよび９７ＳＰｉの個体から部分的に紫花色に先祖返りをおこした花の花弁ＤＮＡを鋳型にこれら２種のプライマーを用いＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３分）を３０回、７２℃３分）を行ったところ、９５ＳＰ（レーン３）や紫色に先祖返りをおこした花の花弁（レーン２０、２１）では、増幅産物が得られず本発明の転移因子はフラボノイド３’水酸化酵素遺伝子より脱離をおこしていることが明らかとなった（図４）。このことより本発明の転移因子が転移能を有することは明らかである。
また、実施例４で明らかとなった９７ＳＰｉの花色発現に係る塩基配列（フラボノイド３’水酸化酵素遺伝子、配列番号１９の２５２７番目の塩基ＡのあとにＧが挿入されているもの）と本発明の転移因子の塩基配列（配列番号４）に続く両側の塩基配列を比較することにより、本発明の転移因子は配列番号１９の３９０８番目の塩基Ｔの後ろに挿入し、転移因子の両側で、配列番号１９の塩基配列中３９０１番目から３９０８番目までのＡＧＴＴＡＡＴＴという８塩基を重複していることが明らかになった。
つづいて、配列番号４に示す明らかとなった転移因子の塩基配列からＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＣ（２５塩基：配列番号２３）およびＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＧＣ（２７塩基：配列番号２４）２種のプライマーにより、９７ＳＰｉのゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃２分）を３０回、７２℃３分）を行い増幅産物を得た。これをｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列を決定した。得られた増幅産物のうち約０．７ｋｂのものを、配列番号２２に示す。この塩基配列は両端約０．２ｋｂにわたりそれぞれ配列番号４に示す転移因子とほぼ相同であるが、オープンリーディングフレームはなく、内部に転移酵素遺伝子をもたない非自律性転移因子であると判断した。
インバースＰＣＲにより９５ＳＰと９７ＳＥの相違を検討した。すなわちカーネーション系統９５ＳＰおよび９５ＳＰからの芽条突然変異体である９７ＳＥのゲノムＤＮＡを実施例２に記載の方法で調整し、制限酵素ＥｃｏＲＩにより分解した。これら分解産物を材料にプライマーＣＧＡＡＴＡＣＣＧＴＧＣＴＴＴＧＧＡＣＧ（２０塩基：配列番号１８）およびＴＣＧＴＧＣＣＧＴＧＣＡＣＣＧＧＴＴＴ（１９塩基：配列番号２５）を用いインバースＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３分）を３０回、７２℃３分）を行った。インバースＰＣＲは、細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ２ 植物のＰＣＲ実験プロトコール（１９９５） ６９−７２に従い行った。得られた増幅産物を１％アガロースゲルを用い１００Ｖで６０分間電気泳動することにより分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。この結果、９５ＳＰには存在しないが、９７ＳＥに存在する約４．５ｋｂの増幅産物が得られた。この増幅産物をｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて部分的に塩基配列を決定した。得られた塩基配列から作成したプライマーＴＡＴＡＣＧＧＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＴＣＡＧＡ（２２塩基：配列番号２６）およびＣＴＡＧＴＡＴＧＣＴＡＧＴＣＴＧＡＡＧＧＣ（２１塩基：配列番号２７）を用い９５ＳＰおよび９７ＳＥのゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃２分）を３０回、７２℃３分）を行った後に、１％アガロースゲルを用い１００Ｖで３０分間電気泳動することにより分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。得られた増幅産物のうち９５ＳＰに存在せず９７ＳＥに存在する約１．３ｋｂの増幅産物をｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列を決定した。この結果、この増幅産物には配列番号２２に示すＤＮＡ配列が、配列番号２８に示す塩基配列の第１１４番目のＣから第１２１番目のＣの８塩基（ＧＴＴＡＴＡＴＧ）を同一方向に重複した間に存在していた。即ち、当該８塩基の部分がＧＴＴＡＴＡＴＧ・・・・ＧＴＴＡＴＡＴＧとなり、・・・・の所に配列番号２２の配列が挿入していた。このことから配列番号２２に示す非自律性因子が可動であり９７ＳＥが９５ＳＰから突然変異により得られた時点あるいはそれ以降に転移したことが明らかである。
ここで示したインバースＰＣＲによる転移の評価方法は、実施例８で述べる突然変異の検出法の実施例とともに突然変異の検出に有効な方法の１つである。
【実施例６】
リターンＰＣＲによる転移酵素発現の評価
実施例３に記載した方法によりカーネーション系統９５ＳＰおよび９７ＳＰｉからｃＤＮＡを調整し、プライマーＣＡＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡ（２３塩基：配列番号２０）およびＧＡＧＡＣＴＣＡＴＡＧＴＧＧＴＴＡＴＡＴＡＣＡ（２３塩基：配列番号１４）を用いＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３分）を３０回、７２℃３分）を行った。
また、プライマーＴＴＣＴＴＣＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＡＧ（２３塩基：配列番号２１）およびＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣ（２３塩基：配列番号１７）を用い同様にＰＣＲを行った。得られた増幅産物を１％アガロースゲルを用い１００Ｖで２０分間電気泳動することにより分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。この結果、予想される大きさ（それぞれ約１．９ｋｂおよび約１．１ｋｂ）の増幅が検出された（図５）。これらの産物のうち系統９７ＳＰｉより得られたものについてｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて部分的に塩基配列を決定したところ、本発明の転移因子が有する転移酵素をコードする遺伝子の一部と相同であった。このようにリターンＰＣＲにより転移酵素の転写発現を容易に検出することが可能であった。
【実施例７】
他のダイアンサス属植物での転移因子の存在の調査
カーネーション品種カリー、Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（一般の花種子販売業者で購入）およびＤｉａｎｔｈｕｓ ｂａｒｂａｔｕｓ（一般の花種子販売業者で購入）、ポジティブコントロールとして９７ＳＰｉからのＤＮＡの調整は、実施例２と同様に行った。ただしカーネーション品種カリーは温室で育成した植物の葉を材料にＤＮＡを調整した。他の２種は水分を含むろ紙上に播種し６日後に発芽した子葉と胚軸からＤＮＡを調整した。これらのＤＮＡを鋳型に下記のＰＣＲを行った。
明らかとなった本発明の転移因子塩基配列から、ＧＧＴＣＴＡＧＴＴＡＧＴＣＡＧＣＴＡＣＧＧ（２１塩基：配列番号１６）およびＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣ（２３塩基：配列番号１７）という２種のプライマーを用い、ＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３０秒）を３０回、７２℃３分）を行った。増幅産物は１％アガロースゲルを用い１００Ｖで２０分間電気泳動することにより分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。
この結果、ポジティブコントロールの９７ＳＰｉと同様に、カーネーション品種カリー（レーン３）、Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（レーン４）およびＤｉａｎｔｈｕｓ ｂａｒｂａｔｕｓ（レーン５）いずれからも予想される約４６０塩基の増幅産物が得られ、これらの植物にも本発明の転移因子が存在することが明らかとなった（図６）。
【実施例８】
突然変異の検出
実施例５で述べたインバースＰＣＲは、細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ２植物のＰＣＲ実験プロトコール（１９９５） ６９−７２に従い行った。カーネーション系統９５ＳＰ、９７ＳＰｉおよび９５ＳＰからの芽条突然変異体である系統９９ＳＰ４、９９ＳＰ５のゲノムＤＮＡを実施例２に記載の方法で調整し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩあるいはＳｐｅＩにより分解した。これら分解産物を材料にプライマーＣＧＡＡＴＡＣＣＧＴＧＣＴＴＴＧＧＡＣＧ（２０塩基：配列番号１８）およびＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣ（２３塩基：配列番号１７）を用いインバースＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃５分）を３０回、７２℃３分）を行った。得られた増幅産物を１％アガロースゲルを用い５０Ｖで１２０分間電気泳動することにより分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。この結果、それぞれ複数種の増幅産物を分離することが可能であり、用いた４系統それぞれに特異的に得られる増幅産物が検出され、これらは転移因子の転移によると考えられた。このように転移因子が転移することにより誘発されたゲノムＤＮＡ上の変異を検出することが可能であった（図７）。
また、インバースＰＣＲの増幅産物の一部についてＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて部分的に塩基配列を決定し、本発明の転移因子に含まれる予想される配列と相同であることを確認した。このことより本実施例の増幅産物は本発明の転移因子を含む目的とする増幅産物であることが明らかである。
【実施例９】
環境による転移因子の転移促進
本発明で得られた９７ＳＰｉのフラボノイド３’水酸化酵素に挿入する転移因子の脱離は、花色がピンクから紫になることで表現型として検出することが可能である。９７ＳＰｉの定植苗（約５ｃｍ長）を２種の条件下の温室内で定法に従い２ヶ月間（２００３年９月４日から２００３年１０月３１日）育成したのち、開花時に紫色の斑の有無を検定した。第１は、ガラス温室で昼温２５−３３℃・夜温２３−３０℃・自然日長（１３−１２時間）の条件とした。第２は、人工気象器コイトトロン（小糸製作所製）を用いて昼温２０度・夜温１０度・８時間日長に調整した条件とした。この結果、第１の条件で開花した４５花のうち３花に紫の斑が見られたのに対し（６．７％）、第２の条件では開花した５１花のうち３５花に紫の斑が見られた（６８．６％）。このことから、低温、あるいは短日、あるいは低温および短日の条件が、９７ＳＰｉのフラボノイド３’水酸化酵素に挿入する転移因子の脱離を促進することが明らかである。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明で初めて見出された芽条突然変異誘発型転移因子の転移酵素発現量をリターンＰＣＲによって検出することおよびこの転移因子のメチレーション程度を評価することにより、効率的に芽条突然変異を起こしやすい環境条件を特定するあるいは芽条突然変異をおこしやすい個体を選抜することができる。
また、当該転移因子の転移を突然変異の検出方法に述べた手法により検出することにより、芽条変異をおこす環境条件を特定するあるいは芽条突然変異をおこしやすい個体を選抜することができる。
このようにして得られた環境条件および個体を利用して効率的に芽条突然変異を誘発することが可能となる。また、当該転移因子の転移酵素遺伝子を遺伝子工学的に利用することにより芽条突然変異体を効率よく作り出すことが可能となる。このようにして一細胞あたりの変異箇所が少ないにもかかわらず変異する頻度の高い、従来の手法の問題を解決する理想的な突然変異方法を提供し、突然変異育種が重要である果樹や花卉などの育種を効率よく進展させることが可能となる。
さらに、農業生産上問題となる易変性を示す個体において原因が転移因子によるものであれば、転移因子の転移を促すことにより安定化することが可能となる。また、転移をおこしやすい環境条件を避けることあるいは転移酵素遺伝子の発現を遺伝子工学的に抑制することにより安定に農業生産を行うことが可能となる。
得られた芽条突然変異体から突然変異の原因遺伝子を容易に同定・単離することが可能となる。また、目的の遺伝子に当該転移因子が挿入しているものをＰＣＲなどの手法により容易に検出（選抜）することが可能となり、遺伝子の発現が抑制された変異体を効率よく得ることができる。このような技術は植物分子遺伝学研究を加速させ得る。
【配列表】
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【技術分野】
本発明は、植物の芽条突然変異を誘発する新規の転移因子、転移酵素および転移酵素をコードする塩基配列を用いた突然変異の検出方法、誘発方法、安定化方法や突然変異遺伝子の同定方法および遺伝子の発現が抑制された変異体の選抜に関する。
【背景技術】
突然変異は作物の品種改良や分子遺伝学的研究に重要であり、自然に発生する芽条突然変異や人為的な突然変異が利用される。本発明でいう芽条突然変異とは植物体の一部に体細胞の遺伝子レベルでの突然変異が生じることを指し、芽条突然変異体とは該突然変異体のことを指す。栄養繁殖作物である花きや果樹などの作物では、交雑を経ない芽条突然変異は品種育成に重要な遺伝変異を提供する。しかし、芽条突然変異による変異の分子的なメカニズムについては、その原因は不明であり自然発生に任せている。また、自然突然変異は１００万分の１程度の確率でしか起こらないとされており、この効率をあげるために突然変異を誘発させる手法として放射線照射や変異原性をもつ化学物質などが利用されるが、変異出現率を増加させようとすると望ましい変異の他にも変異が入ってしまい目的の形質に加えて劣悪な形質を伴う場合が多く、非常に多くの個体からなる変異集団の中から目的のものを探す必要があり効率が低い。
転移因子（トランスポゾンともいう）は原核生物から真核生物にいたる生物種に広く見出される、ゲノム上を転移する可動性遺伝因子である。植物ではシロイヌナズナ、ハクサイなどで見出されており［特開２００３−９３０７４号公報］、またトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）の穀粒やキンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ）の花弁［蛋白質 核酸 酵素 ３７ １０４７−１０５９（１９９２）］、アサガオ（Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ ｎｉｌ）の花弁［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：７０１６−７０２３（２０００）］、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）の花弁［Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １３：３９−５０（１９９８）］、およびカーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）の花弁におけるアントシアニン色素生合成系遺伝子の発現を制御する転移因子がよく知られている。
例えば白色花弁に赤い斑の入るカーネーション品種では、アントシアニン色素生合成酵素のひとつであるジヒドロフラボノール−４−リダクターゼ（以下、ＤＦＲという）遺伝子内に転移因子が挿入している。ＤＦＲ遺伝子は赤色色素合成に必要であるが、転移因子が挿入しているとＤＦＲ遺伝子が機能しないため花色は白色となる。ところが、花弁形成時に挿入している転移因子が脱離することによりＤＦＲ遺伝子の機能が回復し、赤い斑の入った模様ができることが解明された［Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．４３：５７８−５８５（２００２）］。このように個体内の一部の細胞において転移因子が脱離しセクター状の変異を有する事例において、トウモロコシ、キンギョソウ、アサガオ、ペチュニアなどでは転移因子の関与が分子遺伝学的に解明されている。
また、転移因子による変異は生殖細胞を経て後代へ伝達されることも明らかとなっている。この場合転移因子は生殖細胞の形成期に転移したものであり、後代に転移因子による突然変異体が得られる。この事象を利用して、既知の転移因子を遺伝子導入などによりに導入し、その後代で得られた変異体を、導入した転移因子を指標に解析することにより遺伝子を単離する手法が開発されトランスポゾンタギングと呼ばれている［Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ７：６７７−６８５（１９９５）］。
このように転移因子を変異原とする試みが行われるようになったが、現在の手法は芽条での転移因子の遺伝子への挿入による変異を得るにいたっておらず、もっぱら交配あるいは交雑を経由した変異体の取得にとどまっている。このように転移因子が個体を構成する一部の細胞で転移する事例は知られており、レトロトランスポゾンによる芽条突然変異の例も報告されている［Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４：９８２（２００４）］。しかしながら、芽条突然変異のような栄養繁殖による変異の固定が可能な突然変異がレトロトランスポゾン以外の転移因子により引き起こされている例は報告がない。
【特許文献１】特開２００３−９３０７４号公報
【非特許文献１】 蛋白質 核酸 酵素 ３７ １０４７−１０５９（１９９２）
【非特許文献２】 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：７０１６−７０２３（２０００）
【非特許文献３】 Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １３：３９−５０（１９９８）
【非特許文献４】 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．４３：５７８−５８５（２００２）
【非特許文献５】 Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ７：６７７−６８５（１９９５）
【非特許文献６】 Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４：９８２（２００４）
【発明の開示】
従来、発生頻度の非常に低い自然突然変異と、目的とする変異に加え目的としない変異が伴ってしまう放射線や化学物質による人為的な突然変異を利用し芽条突然変異体が得られていた。このような技術下では多数の個体を扱い、その中から目的とする変異体を選抜する必要があり、効率が非常に低かった。また、従来の方法により得られた突然変異体は変異した遺伝子を特定するために多くの労力を必要とする。これらの課題を解決するために、本発明は芽条突然変異を誘発する植物の新規転移因子を提供すること、新規転移因子の有無や脱離の有無を検出する方法を提供すること、この新規転移因子を変異原として利用して芽条突然変異を誘発する手法を提供することを目的とする。
芽条突然変異を誘発する転移因子を突然変異原として利用しこの転移を人為的に促すことにより、１細胞あたりの変異する遺伝子が少数であるが効率高く芽条突然変異体が得られる理想的な突然変異方法となる。また、前述のとおり原因遺伝子に転移因子という指標が存在することになり、原因遺伝子の単離が容易になる。
前記の課題を解決するために発明者は研究を重ね、紫花色を示すカーネーション系統９５ＳＰ（ミセスパープル、日本国での種苗法に基づく品種登録番号７２９１号、キリンビール社）、その芽条突然変異体であるピンク花色を示すカーネーション系統９７ＳＰｉ（ミセスピンクロサリオ、日本国での種苗法に基づく品種登録番号８９７６号、キリンビール社）、濃赤花色を示す９７ＳＥ（ミセスエレガント、日本国での種苗法に基づく品種登録番号９２４７号、キリンビール社）、カーネーション品種カリー（バルブレ＆ブラン社）、Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｂａｒｂａｔｕｓ、ピンク花色を示すカーネーション系統９９ＳＰ４、およびピンク花色を示すカーネーション系統９９ＳＰ５を用い以下の知見を見出した。
すなわち、カーネーション系統９７ＳＰｉのアントシアニン生合成に関与する酵素であるフラボノイド３’水酸化酵素をコードするゲノミック遺伝子にはカーネーション系統９５ＳＰにはないＤＮＡが挿入していた。挿入している塩基配列は転移因子が有する典型的な特徴を備えていた。すなわち、両端に配列番号１および配列番号２に示す１３塩基の逆位反復配列を有し、該配列が挿入した位置の両側には８塩基の同一方向の同一塩基配列が存在していた。また、逆位反復配列はトウモロコシの転移因子であるＡＣのそれに類似しているが（図１）、内部の約４ｋｂにわたる塩基配列には類似性は認められなかった。該塩基配列にはオープンリーディングフレームが存在し、この塩基配列をアミノ酸に変換した配列は、キンギョソウ由来の転移因子およびトウモロコシ由来の転移因子にそれぞれコードされる転移酵素のアミノ酸配列と相同性を示した（図２）。この転移酵素の発現をリターンＰＣＲ（以下リターンＰＣＲという）により検出することが可能である。
さらに９７ＳＰｉから先祖返りをおこした紫花色を示す個体の花弁では挿入していた塩基配列が脱離しており、９７ＳＰｉが生成した後もこの塩基配列が転移する能力を有していることが明らかである。
また、９７ＳＰｉから両端に配列番号１および配列番号２に示す１３塩基の逆位反復配列を有するが、内部に転移酵素遺伝子をもたない非自律性転移因子と考えられるＤＮＡ塩基配列を得た。このＤＮＡ配列は９５ＳＰおよび９５ＳＰの突然変異体である９７ＳＥにも存在し、９７ＳＥでは９５ＳＰにはない新たなゲノム部位に挿入しており、該配列が挿入した位置の両側には８塩基の同一方向の同一塩基配列が存在していた。９７ＳＥでは９５ＳＰとは異なるゲノム部位に挿入していることから該配列は可動であることが確認された。
本発明は、ゲノム上を転移し芽条突然変異を誘発する転移因子を初めて単離、同定したものである。また、ダイアンサス属の染色体ＤＮＡに由来する転移因子である本発明の転移因子のうち転移酵素をコードしているものは、本酵素の発現を制御することにより転移を制御することを可能とする。また、本発明の転移因子のうち転移酵素をコードしていないものについても、転移酵素をコードする転移因子の転移酵素の発現を制御することにより転移を制御することを可能とすると予想される。
本発明の転移因子は、芽条突然変異を誘発する性質を有する。したがって転移を促す温度等の特定の環境条件を与えること、あるいは転移酵素を人為的に発現することにより、効率よく芽条突然変異を誘発することが可能となるという有用性がある。芽条突然変異体は本発明により明らかとなった転移因子の塩基配列情報を利用して容易に検出することが可能となる。
また、本転移因子により誘発された突然変異を解析することにより容易に原因となる遺伝子を単離することが可能となる。
さらに、転移因子の遺伝子への挿入により、アンチセンスといった遺伝子組換え技術を用いることなく遺伝子の発現が抑制された変異体を得ることができるが、遺伝子が破壊された芽条を得ることが重要な遺伝的にヘテロな個体や生殖および種子形成に関与する遺伝子の場合、転移因子による芽条突然変異が有用である。本転移因子により誘発された突然変異の中から目的とする遺伝子破壊個体を容易にスクリーニングすることが可能であり、遺伝子組み換えを行うことなしに、遺伝子の発現の抑制が可能となる。
また、逆に温度等の環境条件への暴露を控えたりＲＮＡｉなどの手法を用い人為的に転移酵素の発現を抑制することによって芽条突然変異を安定化することも可能となる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−３２３４２８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、各種植物と本発明の植物（カーネーション系統９７ＳＰｉ）における転移因子中の末端逆位反復配列の相同性比較。ここで、クラスターは転移因子のタイプを意味する。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５８：９４９−９５７ ２００１の記載を基に作成した。
図２−１は、本発明で用いた植物（カーネーション系統９７ＳＰｉ）における転移酵素とキンギョソウ転移因子Ｔａｍ３の転移酵素とのアミノ酸レベルでの相同性比較。ここで、Ｒ，Ｑ等の記号が２配列間に示されたものは、当該アミノ酸同士が同一であり、＋で示されたものは当該アミノ酸同士が類似であることを示す。例えばＬとＩとＶとＭは疎水性のアミノ酸において共通しているのでこの記号を付す。また、Ｑｕｅｒｙは本発明の転移因子が有する転移酵素のアミノ酸配列を示し、Ｓｂｊｃｔはキンギョソウの転移因子Ｔａｍ３が有する転移酵素のアミノ酸配列を示す。
図２−２は、図２−１のつづき。
図３−１は、９５ＳＰのフラボノイド３’水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）遺伝子ｃＤＮＡ塩基配列（Ｑｕｅｒｙ）とＧｅｎＢａｎｋ ＡＸ０２８８１９に記載されているＦ３’Ｈ遺伝子のｃＤＮＡ配列（Ｓｕｂｊｅｃｔ）の比較。｜は相同な塩基、＊は相違する塩基を表す。
図３−２は、図３−１のつづき。
図４は、各種カーネーションでの転移因子脱離の有無確認。ＧＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡＴＡＣＴＣＡＧＴＡＣＡ（２４塩基：配列番号１０）およびＧＧＴＣＴＡＧＴＴＡＧＴＣＡＧＣＴＡＣＧＧ（２１塩基：配列番号１６）２種のプライマーを用い、系統９５ＳＰ、９７ＳＰｉのＤＮＡおよび９７ＳＰｉの個体から部分的に紫花色に先祖返りをおこした花の花弁のＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。９５ＳＰ（レーン３）のフラボノイド３’水酸化酵素遺伝子には９７ＳＰｉに存在する位置に本発明の転移因子は存在しない。さらに、紫花色に先祖返りをおこした花の花弁（レーン２０、２１）では本発明の転移因子はフラボノイド３’水酸化酵素遺伝子から脱離しており、本発明の転移因子が転移能を有することは明らかである。レーンの説明； １：分子量マーカー（λＨｉｎｄＩＩＩ） ２：９７ＳＰｉ ３：９５ＳＰ ４−１９：９７ＳＰｉ ２０−２１：９７ＳＰｉの個体から部分的に紫花色へ先祖返りをおこした花の花弁
図５は、各種カーネーションでの転移酵素の転写発現確認。系統９５ＳＰおよび９７ＳＰｉからｃＤＮＡを調整し、プライマーＣＡＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡ（２３塩基：配列番号２０）およびＧＡＧＡＣＴＣＡＴＡＧＴＧＧＴＴＡＴＡＴＡＣＡ（２３塩基：配列番号１４）を用いＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３分）を３０回、７２℃３分）を行った（イ）。また、プライマーＴＴＣＴＴＣＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＡＧ（２３塩基：配列番号２１）およびＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣ（２３塩基：配列番号１７）を用い同様にＰＣＲを行った（ロ）。このような手法により、転移酵素の発現を評価することが可能である。レーンの説明； １：分子量マーカー（λＨｉｎｄＩＩＩ） ２：９７ＳＰｉイ ３：９５ＳＰイ ４：９７ＳＰｉロ ５：９５ＳＰロ
図６は、各種ダイアンサス属植物での転移因子の有無確認。ＧＧＴＣＴＡＧＴＴＡＧＴＣＡＧＣＴＡＣＧＧ（２１塩基：配列番号１６）およびＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣ（２３塩基：配列番号１７）という２種のプライマーを用いＰＣＲを行い本発明の転移因子の存在をダイアンサス属植物で調査したところ、カーネーションの他品種（レーン３）やカーネーション以外のダイアンサス属植物（レーン４、５）にも存在することが明らかとなった。レーンの説明； １：分子量マーカー（λＨｉｎｄＩＩＩ） ２：９７ＳＰｉ ３：カーネーション品種カリー ４：Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ５：Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｂａｒｂａｔｕｓ
図７は、各種カーネーションでの転移因子の転移（芽条突然変異）の有無の確認。系統９５ＳＰ、９７ＳＰｉおよび９５ＳＰからの芽条突然変異体である系統９９ＳＰ４、９９ＳＰ５のゲノムＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩあるいはＳｐｅＩにより分解した（それぞれ図７−Ａと７−Ｂ）。これら分解産物を材料にプライマーＣＧＡＡＴＡＣＣＧＴＧＣＴＴＴＧＧＡＣＧ（２０塩基：配列番号１８）およびＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣ（２３塩基：配列番号１７）を用いインバースＰＣＲを行い、本発明の転移因子の転移を評価した。それぞれバンドパターンに変化がみられ、本発明の転移因子が転移したことが検出された。レーンの説明； Ａ ＨｉｎｄＩＩＩ １：９７ＳＰｉ ２：９５ＳＰ ３：９９ＳＰ５ ４：９９ＳＰ４ ５：分子量マーカー（λＨｉｎｄＩＩＩ）レーンの説明； Ｂ ＳｐｅＩ １：分子量マーカー（λＨｉｎｄＩＩＩ） ２：９７ＳＰｉ ３：９５ＳＰ ４：９９ＳＰ５ ５：９９ＳＰ４
【発明を実施するための最良の形態】
芽条突然変異を誘発する転移因子
ピンク花色カーネーション９７ＳＰｉは紫花色カーネーション９５ＳＰより得られた芽条突然変異体である。両者の花色色素をＴＬＣにより分析し、前者の花色色素はペラルゴニジン骨格をもち、後者はシアニジン骨格をもつことを明らかにした。このことによりこの芽条突然変異の原因遺伝子は、フラボノイド３’水酸化酵素であると考えられた。フラボノイド３’水酸化酵素のｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＸ０２８８１９）をもとに作成したプライマーＡＡＧＣＡＴＡＴＴＧＣＮＴＡＹＡＡＹＴＡＹＣＡＮＧＡ（２６塩基：配列番号５）およびＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＤＡＴＮＧＣＣＣＡＮＡＹＲＴＴ（２６塩基：配列番号６）を用いＰＣＲにより、９５ＳＰのフラボノイド３’水酸化酵素ｃＤＮＡ配列を得た。ここで塩基Ｙ、Ｒ、Ｎはそれぞれ、Ｃ又はＴ、Ａ又はＧ、任意の塩基（Ａ又はＧ又はＣ又はＴ）を指す。以下の実施例も同様である。次に得られたｃＤＮＡ配列をもとに作成したプライマーＴＡＡＡＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡ（２１塩基：配列番号７）およびＡＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴＴＴＧＡＴ（２１塩基：配列番号８）を用いインバースＰＣＲを行い、ここまでに明らかとなった塩基配列をもとにプライマーＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＣＡＧＴＡＣＡ（２１塩基：配列番号９）とＧＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡＴＡＣＴＣＡＧＴＡＣＡ（２４塩基：配列番号１０）およびプライマーＡＡＴＧＴＣＡＣＣＣＴＴＡＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＴＣＴＡ（２７塩基：配列番号１１）とＴＡＧＣＡＡＧＧＣＣＴＴＡＡＴＴＴＣＴＧＴＧ（２２塩基：配列番号１２）、２組み合わせのプライマーを作成しＰＣＲによりフラボノイド３’水酸化酵素遺伝子のゲノム塩基配列を明らかにした。さらにここまでに明らかとなったフラボノイド３’水酸化酵素遺伝子のゲノム塩基配列をもとに設計したプライマーＣＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧＴＴＴＧＣＧＡＣＣ（２０塩基：配列番号１３）およびＴＡＡＡＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡ（２１塩基：配列番号７）を用い、ゲノムＤＮＡを鋳型にインバースＰＣＲを行い、９７ＳＰｉおよび９５ＳＰの産物を比較し９７ＳＰｉに特異的に存在するＤＮＡ断片を得た。
さらにこのＤＮＡ断片の塩基配列をもとに作成したプライマーＧＡＧＡＣＴＣＡＴＡＧＴＧＧＴＴＡＴＡＴＡＣＡ（２３塩基：配列番号１４）およびフラボノイド３’水酸化酵素遺伝子の塩基配列をもとに作成したプライマーＴＡＡＣＡＡＣＡＣＧＴＡＡＣＣＧＡＡＡＡＴＡＴＡ（２４塩基：配列番号１５）を用いＰＣＲを行い９７ＳＰｉのフラボノイド３’水酸化酵素のゲノミック遺伝子に挿入する９５ＳＰにはないＤＮＡを得、塩基配列を決定した。この塩基配列は転移因子が有する特徴を備えていた。すなわち、両端に１３塩基の逆位反復配列を有し、該配列が挿入した位置の両側には８塩基の同一方向の同一塩基配列（ＡＧＴＴＡＡＴＴ）が存在していた。
また、該塩基配列にはオープンリーディングフレームが存在し、この配列の相同性を検索すると塩基レベルでは相同性は検出されないものの、この配列をアミノ酸に変換した配列ではキンギョソウ由来の転移因子およびトウモロコシ由来の転移因子にそれぞれコードされる転移酵素のアミノ酸配列と相同性を示した。このうちキンギョソウのＴａｍ３とのアミノ酸レベルで相同性比較を図２に示す。ＢＬＡＳＴ検索により解析したところ、両者間の相同性は２９％であった。
さらに９７ＳＰｉの個体から部分的に先祖返りをおこした紫花色を示す花の花弁から単離したＤＮＡをＰＣＲにより検定すると、挿入していた塩基配列が脱離しており９７ＳＰｉが生成した後もこの塩基配列が転移する能力を有していることが明らかとなった。
この塩基配列を配列番号４に、対応する転移酵素部分のアミノ酸配列を配列番号３に示す。この転移因子は、ｈＡＴ型の自律性転移因子に分類されることから、５’末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有し、配列番号１及び配列番号２に示す配列を直接に、又は４０００塩基より短い任意のリンカーを介し、連結された非自律性因子も転移酵素が外部から供給されることにより、芽条突然変異を誘発することが可能である。９７ＳＰｉのゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号４の塩基配列をもとに作成したプライマーＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＣ（２５塩基：配列番号２３）およびプライマーＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＧＣ（２７塩基：配列番号２４）を用いＰＣＲを行い、得られた産物の塩基配列を決定し、配列番号２２に示す自然に存在するこのような転移酵素遺伝子をもたない非自律性因子を得た。本非自律性因子は、９５ＳＰおよび９５ＳＰからの突然変異体である９７ＳＥにも存在し、９７ＳＥでは９５ＳＰには存在しないゲノム部位に挿入が見られることから、可動であることが明らかである。さらに、９７ＳＥ特異的に挿入が見られるゲノム部位の塩基配列を決定したところ、両端に転移酵素遺伝子を有する転移因子と相同な配列番号１および配列番号２に示すそれぞれ１３塩基の逆位反復配列を有し、該配列が挿入した位置の両側には８塩基の同一方向の同一塩基配列（ＧＴＴＡＴＡＴＧ）が存在していた。
このような自然に存在する非自律性因子も、本発明の転移酵素遺伝子をもつ転移因子の転移酵素が供給されることにより、芽条突然変異を誘発することが可能であると予想される。
本発明で用いられる塩基配列には配列番号４および配列番号２２の塩基配列以外に、
（１）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（２）配列番号３のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は（両端に）付加されたものであり、かつ転移活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（３）配列番号４に示す塩基配列のうち１０５６番目のＡから３４９７番目のＴまでである塩基配列
（４）配列番号４に示す塩基配列の縮重異性体
（５）上記（１）〜（３）いずれかに記載の塩基配列または上記（４）に記載の縮重異性体又は配列番号４とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコードされるポリペプチドが転移活性を有する塩基配列および配列番号２２とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列も含まれる。
また本発明には、以下の（１）〜（２）のいずれかのポリペプチド
（１）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（２）配列番号３のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は（両端に）付加されたものであり、かつ転移酵素活性有するポリペプチド、も含まれる。
ここで上記（２）でいうアミノ酸の欠失、置換、挿入又は（両端に）付加の操作は、例えば、Ｄ．Ｆ．Ｍａｒｋ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）５６６２−５６６６、Ｓ．Ｉｎｏｕｙｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９（１９８２）３４３８−３４４１、ＷＯ８５／００８１７、Ｒ．Ｐ．Ｗｈａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３１６（１９８５）６０１−６０５に記載されている部位特定突然変異誘発法等により当業者であれば容易に実施することができる。ここで得られた変異型アミノ酸配列を有するポリペプチドは芽条突然変異を誘発する転移活性を有すればよく、当該転移活性の有無は以下の実施例で述べる方法により判断できる。
上記（４）でいう縮重異性体とは、縮重コドンにおいてのみ異なっていて同一のポリペプチドをコードすることのできる塩基配列を意味する。たとえばある塩基配列に対してあるアミノ酸のどれかに対応するコドン、例えばＡｓｎに対応するコドン（ＡＡＣ）が、これと縮重関係にある例えばＡＡＴに変わったものを本発明は縮重異性体と呼ぶものとする。
上記（５）でいうストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度が、１０ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭであり、温度が２５℃〜７０℃、好ましくは４２℃〜５５℃での条件をいう［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）］。
さらに、本発明で用いられる塩基配列には、転移する能力を有する限り、上記の配列番号４あるいは配列番号２２の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９４％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する塩基配列、も含まれる。ここで、このような相同性の数値は、塩基配列比較用プログラム：例えばＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ ｖ３．７やＢＬＡＳＴ：ＮＣＢＩのサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／）を用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターにより算出されるものである。
転移酵素をコードする塩基配列を含むＤＮＡ又はその部分の変異体は、転移活性を有していればよく、その活性の高さは特に限定されないが、それぞれ、該塩基配列を含むＤＮＡ又はその部分の転移活性と同等の活性を実質的に有することが好ましい。ここで、「当該活性を実質的に有する」とは、該活性を利用した実際の使用態様において、これらのＤＮＡ又はその部分と、同一の条件でほぼ同様の利用が可能な程度の活性が維持されていることをいう。また、ここでいう当該活性とは、例えば植物細胞や植物体、好ましくは双子葉植物の細胞や植物体における活性、より好ましくはカーネーションの細胞や植物体における活性をいう。ここで転移活性は、例えば、Ｈａｓｈｉｄａらの報告［Ｐｌａｎｔ Ｐｙｓｉｏｌ．１３２：１２０７−１２１６］の方法に従って、欠失で自律性を失った転移因子を含むプラスミドを作成し、これをｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔにより細胞内に打ち込んで、プラスミドから転移する頻度を見ることにより測定することができる。
さらに、得られた転移因子の塩基配列のうち配列番号４をもとにプライマーを作成しＰＣＲを行ったところ、カーネーションの品種カリーのみならずＤｉａｎｔｈｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓおよびＤｉａｎｔｈｕｓ ｂａｒｂａｔｕｓでも予想される大きさの増幅産物が得られたので、この転移因子は少なくともダイアンサス属に存在することが明らかである。なお、この転移因子は転移酵素の活性を有し上記のような転移を起こすものであれば、本発明で見出されたダイアンサス属に限らず含まれ、幅広い植物での花色などの突然変異現象を説明できる。そのような植物としてダイアンサス属以外に例えばダイアンサス属が含まれるナデシコ科、バラ科、オシロイバナ科、キク科、ヒルガオ科、ツリフネソウ科やナス科の植物が挙げられるが何等これらの植物に限定されることなく、幅広く単子葉、双子葉の植物でも見出される可能性がある。
転移因子有無の検出に用いるプライマーの設計は転移因子の塩基配列のうち、連続する８塩基以上、望ましくは１６塩基以上、更に望ましくは２０塩基以上、更に好適には２０〜３０塩基の部分を２ヶ所任意に選ぶことにより可能である。以下の実施例で用いたプライマー配列はＧＧＴＣＴＡＧＴＴＡＧＴＣＡＧＣＴＡＣＧＧ（２１塩基：配列番号１６）およびＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣ（２１塩基：配列番号１７）であるが、これ以外のものでも構わない。２つのプライマーの選択位置の間の距離を、好適には、１００から１０００塩基、更に好適には、３００から６００塩基とすることができる。このようなプライマーは、プライマー間の目的とするＤＮＡ断片を増幅するものであればよく、例えばＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０などの解析ソフトを利用することにより任意に選んで使用することができる。このようなプライマーは、数種類、望ましくは１種の増幅産物が得られるようなものであればＰＣＲ等の遺伝子増幅法による本検出に用いることができる。このような遺伝子増幅法としては、ＰＣＲ法を挙げることができるが、ＰＣＲ法に限定されず、特定的プライマーを使用する増幅法であれば、用いることができ、例えばＰＣＲ法は遺伝子増幅ＰＣＲ法共立出版株式会社（１９９０）を参照すれば、当業者であれば容易に行い得る。
プライマーには、配列番号４および配列番号２２から設計される特異的部分（実施例参照）に加え、アダプター配列を付加することもできる。このようなアダプター配列を付加したＰＣＲ法として、ＰＣＲ−ＡＦＬＰ法やＰＣＲ−ＶＥＣＴＯＲＥＴＴＥ法が挙げられるが、これらに限られることなく他にＣＴの繰り返し数に着目したＰＣＲ−ＳＳＲ法、塩基配列に依存した高次構造の相違に着目したＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、２本鎖ＤＮＡの融解温度の相違に着目したＰＣＲ−ＤＧＧＥ法等も適宜用いることができる。このような手法は当業者であれば、容易に選択し行うことができる。
転移因子の有無の検出に用いるプローブには、配列番号４あるいは配列番号２２の塩基配列又は上記（１）〜（５）の塩基のうち少なくとも連続した１００塩基又はその相補的配列を有する１００塩基を含むプローブを用いることができる。プローブには、通常用いられる手段、例えば、放射線標識（アマシャム社メガプライム法）、ＤＩＧ標識（ロシュ社方法準拠）等で標識することができる。
また転移因子が挿入された遺伝子が同定できれば、転移因子の脱離を次のようにして確認できる。例えば、本発明により得られた転移因子をプローブとしサザンハイブリダイゼーションにより、又は転移因子の塩基配列をもとにプライマーを作成しインバースＰＣＲを行うことにより、変異体と変異体が由来するもととなる個体の相違を検出することにより、変異遺伝子（転移因子が挿入された遺伝子）の一部（断片）を単離することができる。
このようにして得られたＤＮＡ断片を用い変異遺伝子全体を容易に単離することができる。
転移因子の脱離有無の検出に用いるプライマーの設計は、本転移因子が花色発現酵素をコードする塩基配列に挿入されている場合は、転移因子の塩基配列と花色発現酵素をコードする塩基配列（ここではフラボノイド３’水酸化酵素遺伝子のゲノム塩基配列）から、それぞれ連続する８塩基以上、望ましくは１６塩基以上、更に望ましくは２０塩基以上、更に好適には２０〜３０塩基の部分を２ヶ所任意に選ぶことにより可能である。以下の実施例で用いたプライマー配列は配列番号１９および配列番号４に示す塩基配列から、それぞれＧＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡＴＡＣＴＣＡＧＴＡＣＡ（２４塩基：配列番号１０）およびＧＧＴＣＴＡＧＴＴＡＧＴＣＡＧＣＴＡＣＧＧ（２１塩基：配列番号１６）であるが、これ以外のものでも構わない。このようなプライマーは、プライマー間の目的とするＤＮＡ断片を増幅するものであればよく、例えばＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０などの解析ソフトを利用することにより任意に選んで使用することができる。
このようなプライマーは、数種類、望ましくは１種の増幅産物が得られるようなものであればＰＣＲ等の遺伝子増幅法による本検出に用いることができる。このような遺伝子増幅法としては、ＰＣＲ法を挙げることができるが、ＰＣＲ法に限定されず、特定的プライマーを使用する増幅法であれば、用いることができ、例えばＰＣＲ法は遺伝子増幅ＰＣＲ法 共立出版株式会社（１９９０）を参照すれば、当業者であれば容易に行い得る。
また本発明には、
（１）配列番号４あるいは配列番号２２の塩基配列のうち少なくとも連続した８塩基を含むプライマーを用いた遺伝子増幅法により、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は以下の［Ａ］に記載のＤＮＡ若しくは［Ｂ］に記載の転移因子塩基配列を検出することを特徴とする芽条突然変異の有無を検出する方法、
［Ａ］： 以下の（ａ）〜（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）のいずれかの塩基配列又は（ｅ）の縮重異性体を含んでなるＤＮＡ。
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は（両端に）付加されたものであり、かつ転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（ｃ）配列番号４の塩基配列
（ｄ）配列番号４の塩基配列のうち１０５６番目のＡから３４９７番目のＴまでである塩基配列
（ｅ）配列番号４の塩基配列の縮重異性体
（ｆ）上記（ａ）〜（ｄ）いずれかに記載の塩基配列又は上記（ｅ）に記載の縮重異性体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコードされるポリペプチドが転移活性を有する塩基配列
（ｇ） 以下の（ｉ）〜（ｉｉ）のいずれかの塩基配列
（ｉ）配列番号２２の塩基配列
（ｉｉ）上記（ｉ）に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列；
［Ｂ］： ５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有し、配列番号１及び配列番号２に示す配列を直接に、又は４０００塩基より短い任意のリンカーを介し、連結された非自律性の転移因子。
（２）配列番号４あるいは配列番号２２の塩基配列のうち少なくとも連続した８塩基を含むプライマーを用いた遺伝子増幅法により、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は上記［Ａ］に記載のＤＮＡを有する転移因子若しくは［Ｂ］に記載の転移因子の有無を検出する方法、
（３）配列番号４あるいは配列番号２２の塩基配列のうち少なくとも連続した８塩基を含むプライマーと本転移因子が挿入している周囲の塩基配列のうち少なくとも連続した８塩基を含むプライマーを用いた遺伝子増幅法により、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は上記［Ａ］に記載のＤＮＡを有する転移因子若しくは［Ｂ］に記載の転移因子の脱離有無を検出する方法、も含まれる。
より具体的には、配列番号４の塩基配列のうち少なくとも８塩基の塩基が連続した任意の場所と配列番号１９の塩基配列のうち少なくとも８塩基の塩基が連続した任意の場所をプライマーとして利用したＰＣＲ法により、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は上記［Ａ］に記載のＤＮＡを有する転移因子若しくは［Ｂ］に記載の転移因子の脱離有無を検出する方法、も含まれる。
（４） 配列番号４あるいは配列番号２２の塩基配列のうち少なくとも連続した１００塩基又はその相補的配列を有する１００塩基を含むプローブを利用した、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は上記［Ａ］に記載のＤＮＡを有する転移因子若しくは［Ｂ］に記載の塩基配列を検出することを特徴とする芽条突然変異の有無を検出する方法、
（５） 配列番号４あるいは配列番号２２の塩基配列のうち少なくとも連続する１００塩基又はその相補的配列を有する１００塩基を含むプローブを利用した、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は上記［Ａ］に記載のＤＮＡを有する転移因子若しくは［Ｂ］に記載の転移因子の有無を検出する方法も含まれる。
これら（１）〜（５）の検出法に係る説明は、以下の通りである。
芽条突然変異の検出
本発明の転移因子の塩基配列を利用することによりサザンハイブリダイゼーション、インバースＰＣＲあるいはトランスポゾンディスプレイなどの手法を用いて、もととなる個体との相違を調査することにより突然変異体を容易に検出することができる。
以下の実施例ではインバースＰＣＲを用い突然変異の検出を行った。ここで用いた制限酵素はＨｉｎｄＩＩＩあるいはＳｐｅＩであり、プライマーはＣＧＡＡＴＡＣＣＧＴＧＣＴＴＴＧＧＡＣＧ（２０塩基：配列番号１８）およびＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣ（２３塩基：配列番号１７）であるが、これ以外のものでも構わない。制限酵素は設定したひとつのプライマーの３’末端から５’末端側へもうひとつのプライマーの３’末端までの間に切断点をもたず、かついずれかひとつのプライマーの３’末端から転移因子の３’末端までの間に切断点をもたない酵素であれば、本検出に用いることができる。本検出に用いるプライマーは本転移因子の塩基配列のうち、連続する８塩基以上、望ましくは１６塩基以上、更に望ましくは２０塩基以上、更に好適には２０〜３０塩基の部分を２ヶ所逆方向に任意に選ぶことにより可能である。このようなプライマーは、プライマー間の目的とするＤＮＡ断片を増幅するものであればよく、例えばＯｌｉｇｏ ４．０などの解析ソフトを利用することにより任意に選んで使用することができる。
芽条突然変異を誘発する転移因子の転移促進による突然変異
（１）転移因子の利用法
転移因子の転移を誘発する環境条件としてカルス培養・紫外線照射・放射線照射・病原菌の感染などが知られている（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９９８；１０：４２７−３４）。また、低温（ＭＧＧ １９８７；２０７：８２−８９）や高温（特開２００３−９３０７４号公報）など温度条件も転移を促進する要因として報告されている。このように種々の環境的あるいは人為的な要因により転移が活性化されることが明らかとなっている。これらの条件に植物を暴露することにより、転移因子の転移（突然変異誘発）を促進することが可能である。
本発明で得られた配列番号４および配列番号２２に示す塩基配列を有する転移因子は、実際に転移することが可能である。また、それぞれが転移することにより芽条突然変異を誘発することがＤＮＡレベルで明らかとなった。本発明で得られた９７ＳＰｉのフラボノイド３’水酸化酵素に挿入している転移因子は、限定されるものではないが、少なくとも低温あるいは短日あるいはそれら両方の条件下において顕著に転移が促進される。このように当該促進に伴って芽条突然変異体を効率よく得ることが可能となる。また、すでに述べたようにカルス培養・紫外線照射・放射線照射・病原菌の感染（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９９８；１０：４２７−３４）あるいは高温（特開２００３−９３０７４号公報）などの条件も、本発明の転移因子の転移を促進する条件の候補である。
また、転移因子の転移の促進には転移因子自身の脱メチル化が関与することが知られている（植物の生長調節２００１；３６：１７８−１８０）。ＤＮＡメチル化酵素遺伝子の発現抑制や、脱メチル化を促すために５−アザシチジンなどの化学物質処理を行うことにより転移因子の転移を促進することが可能であると考えられる。このような転移因子の活性化（可動）条件を容易に検出するには種々の条件においた植物の転移酵素活性を調査することも有効である。
そこで、予め転移因子の存在する個体をスクリーニングし、転移因子の存在が確認された植物について、上記の転移を誘発する条件に曝したり、化学処理をすることにより、芽条突然変異を効率よく導入できる。
転移酵素の転写量はノーザンハイブリダイゼーションやリターンＰＣＲにより把握することにより推定することが可能であり、容易に転移を促す要因の特定ができ、芽条突然変異を得る条件を決定することが可能である。また、メチレーション感受性の制限酵素とメチレーション非感受性の制限酵素を用いＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、ＣＡＰＳなどのＤＮＡ多型検出方法を用いること（Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１１：２１２−２１４）、あるいはメチルシトシン残基に影響をおよぼさずにシトシン残基を化学的にウラシルへ変換し塩基配列を解読することにより（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９９４）２２：２９９０−２９９７）容易に転移因子のメチレーション程度を検定することができる。このような評価は当業者であれば容易に行うことができる。
これら転移因子がもつ転移酵素の転写量を監視することおよび転移因子のメチレーション程度を評価することにより、転移因子の転移活性を評価することが可能となり容易に転移を促す条件を得ることができる。
本発明には、請求項１記載のＤＮＡを用いて宿主を形質転換し（当該ＤＮＡ：遺伝子が発現した）形質転換体を作出することにより転移酵素を発現し自律性因子、非自律性因子を問わず転移因子の転移を促進することにより芽条突然変異体を作出する方法、即ち芽条突然変異の誘発法も含まれる。このような方法につき、以下（２）〜（４）に説明する。
（２）転移酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ
転移酵素をコードする遺伝子を転移酵素をコードする遺伝子自身のプロモーターのみならずカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなど植物での機能がみとめられるプロモーターと交換し、遺伝子導入の手法を用い植物に導入し、請求項１（１）〜（４）、（６）、（７）に記載のいずれかの塩基配列又は請求項１（５）に記載の縮重異性体又は請求項５に記載される転移因子のいずれかを転移させることにより芽条突然変異を促すことが可能である。
ここでプロモーターとしてカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを例示したが、植物で機能するものであれば、何等これに限定されるものではない。
また、誘導性プロモーターに結合し遺伝子導入の手法を用い植物に導入することにより、誘導条件下でのみ転移を促すことができる。また、遺伝子組み換えを経ずとも一過的に転移酵素をコードする遺伝子を発現することにより転移を促進することもできる。
ここで誘導性プロモーターとして、例えばヒートショック誘導性（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９５ ４４：４６６−４７２）のものを用いることができる。但し、誘導性であり、且つ植物細胞や植物体内で機能するものであれば、上記プロモーターに限定されるものではない。
なお、上述のプロモーターは、該プロモーターを含むＤＮＡの塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによる増幅反応によって得ることができる。具体的には、誘導性プロモーターの場合このような遺伝子の１つであるヒートショック蛋白遺伝子（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ（１９８９）２１９：３６５−３７２）のプロモーター領域（ヒートショック蛋白遺伝子の翻訳開始点から−６７８の領域）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、増幅することにより得ることができる。ここでＰＣＲに用いることができる鋳型ＤＮＡとしては、例えばシロイヌナズナのゲノムＤＮＡが挙げられるが、何等これに限定されるものではない。
このようなプロモーターについても上記の転移因子の遺伝子同様、プロモーター活性を有する限りにおいて種々の変異体のものを用いることが出来る。該変異体の作成は、上記の転移因子の遺伝子の記載と同様、上記各種プロモーターに関わる文献に記載の塩基配列を参照すれば、当業者であれば格別の困難性なしに実施できる。上記のように取得した変異体がプロモーターとしての活性を有するか否か、さらには、プロモーターを含むＤＮＡ又はその部分のプロモーター活性を実質的に保持するか否かは、転移因子の遺伝子を繋いで宿主細胞内で発現させることにより、上記の芽条突然変異検出法あるいは目視、花色分析など生体成分の分析により確かめることができ、このような方法は当業者であれば容易に行うことができる。
また、必要に応じて転写終結を指令するターミネーターを転移酵素をコードする遺伝子の下流に連結することもできる。
ターミネーターとしては、例えば、３５Ｓ遺伝子、ｎｏｓ遺伝子やｏｃｓ遺伝子のターミネーターなどが挙げられる（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４４（１９９３）９８５−９９４、″Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ″）が、植物細胞内や植物体内で機能することが知られているターミネーターであればこれらに限定されるものではない。
また、必要に応じてプロモーター配列と転移因子の遺伝子との間に、遺伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列、例えばトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈｌ）のイントロン［Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １：１１８３−１２００（１９８７）］を導入することができる。
ＤＮＡはさらに、翻訳エンハンサー、翻訳終止コドン等の構成要素を含むことができる。翻訳エンハンサー及び翻訳終止コドンとしては、公知のものを適宜組み合わせて用いることができる。ウイルス起源の翻訳エンハンサーとしては、例えば、タバコモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４、ブロモモザイクウイルスＲＮＡ３、ポテトウイルスＸ、タバコエッチウイルスなどの配列が挙げられる（Ｇａｌｌｉｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５（１９８７）８６９３−８７１１）。また、植物起源の翻訳エンハンサーとして、ダイズのβ−１，３グルカナーゼ（Ｇｌｕ）由来の配列（石田功、三沢典彦著、講談社サイエンティフィク編、細胞工学実験操作入門、講談社、ｐ．１１９、１９９２）やタバコのフェレドキシン結合性サブユニット（ＰｓａＤｂ）由来の配列（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１９９５）１２４６６−１２４７０）などが挙げられる。翻訳終止コドンとしてはＴＡＡ，ＴＡＧ，ＴＧＡなどの配列が挙げられる［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ前出等の記載］。また、プロモーター中の転写エンハンサーとして、３５Ｓ遺伝子のエンハンサー部分が同定され、それらを複数個並べて繋げることにより、活性を高めることが報告されており（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１（１９８９）１４１−１５０）、この部分をＤＮＡの一部として用いることも可能である。これらの各種構成要素は、その性質に応じて、それぞれが機能し得る形でＤＮＡ鎖中に組み込まれることが好ましい。そのような操作は、当業者であれば適切に行うことができる。
上記ＤＮＡは、遺伝子工学の分野で慣用されている手法を用いることにより、当業者であれば容易に製造することができる。また、本発明のＤＮＡは、天然の供給源から単離されたものに限定されるものではなく、上記のような構造を有するものであれば、人工的な構築物であってもよい。該ＤＮＡは、周知慣用されている核酸合成の方法に従って合成する事により、得ることができる。
（３）形質転換と遺伝子発現個体の確認
上記の転移因子の遺伝子によって宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養又は栽培することにより、転移因子としての酵素活性を有するタンパク質を発現することができ、転移因子の転移挿入により任意の酵素をコードする遺伝子の活性発現が抑制された突然変異体を作製することができる。
形質転換後の本発明の鎖は、プラスミド、ファージ又はゲノムＤＮＡの中に挿入された形で、微生物（特に細菌）、ファージ粒子又は植物の中に存在することができる。ここで、細菌としては、典型的には、大腸菌、アグロバクテリウム等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の好ましい実施形態では、本発明のＤＮＡは、タンパク質を発現させようとしている構造遺伝子が、植物細胞内や植物体内で安定に発現し得るように、本発明のＤＮＡ、翻訳エンハンサー、翻訳終止コドン、及びターミネーター等とが一体に結合して、これがゲノムに挿入された形態で植物中に存在する。
宿主の好ましい例としては、イネ、ムギ、トウモロコシ、ネギ、ユリ、ラン等の単子葉植物やダイズ、ナタネ、トマト、バレイショ、キク、バラ、カーネーション、ペチュニア、カスミソウ、シクラメン等の双子葉植物といった植物細胞が挙げられ、特に好ましい具体例としては、世界での生産流通消費数量が多い３大切花であるキク、カーネーション、バラや近年栄養系でも世界的に生産流通消費量が飛躍的に伸びているペチュニア等の植物細胞などが挙げられる。また、具体的な植物材料としては、例えば、生長点、苗条原基、分裂組織、葉片、茎片、根片、塊茎片、葉柄片、プロトプラスト、カルス、葯、花粉、花粉管、花柄片、花茎片、花弁、がく片等が挙げられる。
宿主に外来遺伝子を導入する方法としては、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができる。その好ましい例として、例えば、生物学的方法としては、ウィルス、アグロバクテリウムのＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド等をベクターとして用いる方法が挙げられ、物理学的方法としては、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール、パーティクルガン、マイクロインジェクション（″Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ″前出）、シリコンニトリドウイスカー、シリコンカーバイドウイスカー（Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ８５（１９９５）７５−８０、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３１（１９９５）１０１−１０４、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３２（１９９８）３１−４３）によって遺伝子を導入する方法等が挙げられる。当該導入方法については、当業者であれば適宜選択し、使用することができる。
さらに、本発明のＤＮＡで形質転換された植物細胞を再生させることにより、導入された遺伝子がその細胞内で発現する形質転換植物を作製することができる。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、「植物細胞培養マニュアル、山田康之編著、講談社サイエンティフィク、１９８４」等の文献を参照することにより、当業者であれば容易に行うことができる。
一般に、植物に導入した遺伝子は、宿主植物のゲノム中に組み込まれるが、その場合、導入されるゲノム上での位置が異なることにより導入遺伝子の発現が異なるポジションイフェクトと呼ばれる現象が見られる。導入遺伝子がより強く発現している形質転換体は、導入遺伝子のＤＮＡ断片をプローブとして用いるノーザン法により宿主植物中に発現しているｍＲＮＡレベルを検定することによって選抜することができる。
本発明に用いる遺伝子を導入した形質転換植物に目的の遺伝子が組み込まれていることの確認は、これらの細胞及び組織から常法に従ってＤＮＡを抽出し、公知のＰＣＲ法又はサザンハイブリダイゼーションを用いて導入した遺伝子を検出することにより行うことができる。また、形質転換植物での発現は、例えばリターンＰＣＲにより容易に行うことができる。
（４）一過的発現
本発明の転移因子にコードされる転移酵素を植物で機能するプロモーターに結合し、一過的に発現することにより、限られた時間内でのみ転移因子の転移を促し突然変異を誘発することが可能である。一過的発現としてはＰＶＸなどウイルスを使ったもの（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ（１９９５）７：２４９−２５７）やアグロバクテリウム（Ｐｌａｎｔ Ｊ（２００３）３３：９４９−９５６．）による系が知られているが、これらに限定されるものではない。
さらに本発明には、配列番号４あるいは配列番号２２の塩基配列、および配列番号４あるいは配列番号２２とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、および請求項５に記載のＤＮＡを宿主に導入し、転移酵素を供給することにより転移を促すことにより芽条突然変異体を誘発することも含む。
前述した形質転換と同様にＤＮＡの宿主への導入は当業者であれば容易に行うことができる。導入されたＤＮＡは、請求項１に記載したＤＮＡを有する個体（前述した形質転換体を含む）と交配すること、あるいは前述した形質転換などの手法により転移酵素を供給することにより転移が可能となる。このようにして芽条突然変異を誘発することも可能である。
本発明には、上記形質転換体を含め転移因子の転移により得られた芽条突然変異体の安定化方法も含まれる。このような方法につき、以下に説明する。
芽条突然変異の安定化
転移因子を遺伝子内に有する個体では、自然突然変異の発生率より大きな頻度でこの遺伝子から転移因子が脱離することによる復帰細胞が得られることがあり、易変性と呼ばれる（バイオホルティ ７ ７５−７９ １９９２農耕と園芸編 誠文堂新光社）。易変性は農業生産物の品質の安定性を低下させる要因である。転移因子が脱離する際には、存在した遺伝子に転移因子のＤＮＡ塩基を数塩基ランダムに残していくことが知られており、この現象を利用すれば転移因子が脱離したにも関わらず遺伝子の機能が破壊されているものが得られる。つまり、転移因子の転移を促しその遺伝子から脱離したものを選抜することにより安定な変異体を得ることができる。ここで、芽条突然変異を誘発する転移因子で述べたように転移因子が変異遺伝子から脱離した個体を、転移因子の一部および変異遺伝子の一部をプライマーとしてＰＣＲを行うこと、あるいは前出の芽条突然変異の検出で述べた方法によりスクリーニングすることが可能である。また、転移因子あるいは変異遺伝子もしくは転移因子と変異遺伝子をプローブにサザンハイブリダイゼーションを行うことによってもスクリーニングが可能である。上記転移因子離脱後の転移因子に由来する数塩基の残存有無については、例えばその領域を含む部分を遺伝子増幅法で増幅し直接塩基配列を決定することにより芽条突然変異の安定化を確認することができる。
また、逆に転移を助長する温度等の環境条件への暴露を控えたり、ＲＮＡｉなどの手法を用い人為的に転移酵素の発現を抑制することによって芽条突然変異誘発を安定化することも可能となる。
本発明には、上記形質転換体を利用した芽条突然変異体の単離方法も含まれる。このような方法につき、以下に説明する。
転移因子により誘発された芽条突然変異の変異遺伝子の単離
本発明により得られた転移因子をプローブとしサザンハイブリダイゼーションを行うことあるいは転移因子の塩基配列をもとにプライマーを作成しインバースＰＣＲを行うことにより、変異体とそのもととなる個体の相違を検出することにより変異遺伝子の一部を単離することができる。このようにして得られたＤＮＡ断片を用い変異遺伝子全体を容易に単離することができる。本発明の転移因子はこのような場面で、芽条突然変異を起こすという特徴から後代のみならず当代においても遺伝子単離の道具となり得る。
転移因子により誘発された遺伝子の発現が抑制された変異体の選抜
ある遺伝子の機能を抑制しようとする場合、アンチセンス技術などを用い遺伝子組み換えにより達成することが行われているが、本発明の転移因子の転移によりこのような遺伝子の発現を抑制された変異体を遺伝子組み換えを利用することなく作り出すことが可能となる。即ち、例えば低温あるいは短日あるいはそれら両方の条件により転移因子を有する植物の転移因子を転移させ突然変異を誘発することにより、ある遺伝子の発現が抑制された変異体を作成することができる。そして、目的の遺伝子に転移因子が挿入しているものをＰＣＲ法により容易に検出（選抜）することが可能である。
転移因子により誘発された変異集団の中から目的とする遺伝子および転移因子のＤＮＡをもとにサザンハイブリダイゼーションあるいはＰＣＲを行うことにより、目的とする遺伝子に転移因子が挿入した個体を選抜することが容易にできる。
なお、本発明の転移因子のうち内部に転移酵素を有しているものは自ら転移することが可能である（自律性）が、一般的に転移因子は内部の配列を除去しても転移酵素の供給があれば転移することが知られている［Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １３２：１２０７−１２１６（２００３）］。例えば、本文献ではＢａｌｌ部位からＴｔｈＨＢ８１部位の２２６０塩基が欠落しても、転移酵素の供給により転移することができる。このように転移因子の内部を一部欠落させることにより転移酵素活性をもたない転移因子を得ることができ、得られた転移因子は転移酵素を有していないので自らのみでは転移することができないが、転移酵素の供給下で転移することが可能である。本発明で得られた内部に転移酵素をもたないものは、自然界に存在する転移酵素の供給下で転移可能な転移因子である。このような転移酵素供給下で転移可能な転移因子が自然界に存在することは知られており、非自律性因子と呼ばれている［蛋白質核酸 酵素 ３７：１０４７−１０５９（１９９２）］。転移因子が自律性か非自律性かは、発現可能な転移酵素遺伝子を有するか否かによって推察することができる。
本発明の転移因子においても転移酵素をコードする塩基配列の全部あるいは一部を除去（欠失）するまたは塩基の置換、挿入又は（両端に）付加するといった変異を導入することにより、上述したような転移酵素が働かない転移因子を作成することは当業者であれば容易である。また、本発明の転移因子のＤＮＡ配列の全部あるいは一部をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により当業者であれば容易に本発明の転移因子と相同性を有するものを得ることが可能である。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析することによりそれらの中から転移酵素部分に変異があり、かつ上述したような転移酵素が働かない転移因子を作成するあるいは見出すことは当業者であれば容易である。
このように人為的に作成、あるいは自然界から選抜することにより、本発明の転移因子と相同性を有するが自身では転移することができない転移因子を当業者であれば容易に得ることが可能である。これらは本発明の転移酵素により転移することが可能であるので、このような転移酵素活性をもたない転移因子を上述したような芽条突然変異の検出、芽条突然変異を誘発する転移因子の転移促進による突然変異、芽条突然変異の安定化、転移因子により誘発された芽条突然変異の変異遺伝子の同定、転移因子により誘発された遺伝子の発現が抑制された変異体の選抜に用いることができる。
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明は、何等実施例に限られるものではない。また、以下の実施例で用いられたカーネーション系統９５ＳＰ、９７ＳＰｉ、９７ＳＥ、９９ＳＰ５および９９ＳＰ４は、麒麟麦酒株式会社の植物開発研究所内にて保存されており、実験材料として分譲要請に応じることができる。連絡先は、〒３２９−１４１４ 日本国栃木県塩谷郡喜連川町大字早乙女字申塚３３７７番地（電話；国番号８１−２８−６８６−０５０１、ファクシミリ；国番号８１−２８−６８６−０５０２）である。
【実施例１】
カーネーションの花弁色素の分析
カーネーションの花弁の色素分析は山口雅篤の方法（南九州大学園芸学部研究報告（１９８８）・第１９号１−７８頁：カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ Ｌ．）の花色育種に関する基礎的研究）によった。系統９５ＳＰと９７ＳＰｉの花弁を５％酢酸５０％エタノールでそれぞれ抽出した後、ＴＬＣ（酢酸：塩酸：水＝１５：３：８２）で展開した。それらの展開像を既知のシアニジン３グルコシド５グルコシド（Ｃｙ３Ｇ５Ｇ）の色素を持つカーネーション花弁（品種バーバラ：ヒルベルダ社）から抽出したものとペラルゴニジン３グルコシド５グルコシドグルコシド（Ｐｇ３Ｇ５Ｇ）の色素を持つカーネーション花弁（品種ライラック：シリー ブラザーズ社）から抽出したものと比較することにより、９５ＳＰはシアニジン骨格をもつ色素、９７ＳＰｉはペラルゴニジン骨格をもつ色素を主要に含むことが推定できた。
【実施例２】
カーネーションのゲノムＤＮＡの調整
カーネーション系統９５ＳＰ、カーネーション系統９７ＳＰｉ、カーネーション系統９７ＳＥ、カーネーション系統９９ＳＰ５および９９ＳＰ４のＤＮＡの調整は、インビトロの葉片を材料にＮｕｃｌｅｏｎ ＰｈｙｔｏＰｕｒｅ（アマシャム社）を用い添付のプロトコールに従って行った。
なお、９９ＳＰ５及び９９ＳＰ４は以下の手法により得、材料とした。定法に従ってＸ線４ＫＲを照射した９５ＳＰの草丈約５ｃｍ長のインビトロ植物１０００個体を温室に馴化し、腋芽を採り育成しそれから発根した個体の腋芽を採り育成することを数回繰り返しピンク色の花をつけるもの（９７ＳＰｉと同じ花色の個体）として２個体（９９ＳＰ５、９９ＳＰ４）を得た。
【実施例３】
カーネーションのｃＤＮＡの調整
カーネーション系統９５ＳＰのｃＤＮＡの調整は、細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ２ 植物のＰＣＲ実験プロトコール（１９９５）４２−４３に記載の方法に従い、花弁を材料に単離したＲＮＡをもとに、タカラ社のｃＤＮＡ合成キットを用い添付のプロトコールに従いキットに添付されている１８塩基のｄＴプライマーを用いて行った。
【実施例４】
フラボノイド３’水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）遺伝子のクローン化と塩基配列の決定
（１）カーネーション系統９５ＳＰのＦ３’Ｈ遺伝子のクローン化とｃＤＮＡ塩基配列の決定
ＧｅｎＢａｎｋ ＡＸ０２８８１９に記載されているＦ３’Ｈ遺伝子のｃＤＮＡ配列を参考にしプライマーＡＡＧＣＡＴＡＴＴＧＣＮＴＡＹＡＡＹＴＡＹＣＡＮＧＡ（２６塩基：配列番号５）およびＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＤＡＴＮＧＣＣＣＡＮＡＹＲＴＴ（２６塩基：配列番号６）を作成した。これらのプライマーを用いインビトロのカーネーション系統９５ＳＰの花弁から得られた全ｃＤＮＡ画分に対し、ＰＣＲ（条件：９５℃５分、（９５℃３０秒、３５℃３０秒、７２℃１分）を３０回、７２℃１０分）を行った。得られた増幅産物をｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて８４８塩基の塩基配列を決定した。得られた塩基配列を上記ＧｅｎＢａｎｋ ＡＸ０２８８１９に記載されているＦ３’Ｈ遺伝子のｃＤＮＡ配列と比較すると５ヶ所の塩基置換と１ヶ所の３塩基の挿入がみられた（図３）。
（２）カーネーション系統９７ＳＰｉのＦ３’Ｈ遺伝子のクローン化とゲノムＤＮＡ塩基配列の決定
次に、細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ２ 植物のＰＣＲ実験プロトコール（１９９５） ６９−７２に従い、カーネーション系統９７ＳＰｉのゲノムＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩで分解し、その分解産物を材料に前記カーネーション系統９５ＳＰで得られたＦ３’Ｈ遺伝子塩基配列をもとに作成したプライマーＴＡＡＡＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡ（２１塩基：配列番号７）およびＡＡＧＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴＴＴＧＡＴ（２１塩基：配列番号８）を用いインバースＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃２分）を３０回、７２℃３分）を行った。得られた約１．６ｋｂの増幅産物をｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列を決定した。ここで得られた塩基配列を制限酵素ＮｄｅＩの切断点で２つに分割し２種の塩基配列を得た。
さらにＧｅｎＢａｎｋ ＡＸ０２８８１９に記載されているｃＤＮＡ配列と実施例４（１）で明らかとなったカーネーション系統９５ＳＰのＦ３’Ｈ遺伝子ｃＤＮＡ配列および前段落で明らかとなったカーネーション系統９７ＳＰｉのＦ３’Ｈ遺伝子の一部分のゲノムＤＮＡ塩基配列をもとに以下のプライマーを作成した。プライマーＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＣＡＧＴＡＣＡ（２１塩基：配列番号９）およびＧＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡＴＡＣＴＣＡＧＴＡＣＡ（２４塩基：配列番号１０）を用い、カーネーション系統９７ＳＰｉのゲノムＤＮＡに対しＰＣＲ（条件：９５℃５分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３分）を３０回、７２℃３分）を行った。この約１．９ｋｂの増幅産物と、プライマーＡＡＴＧＴＣＡＣＣＣＴＴＡＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＴＣＴＡ（２７塩基：配列番号１１）およびＴＡＧＣＡＡＧＧＣＣＴＴＡＡＴＴＴＣＴＧＴＧ（２２塩基：配列番号１２）により同様にして得られた約２．９ｋｂの増幅産物をｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列を決定した。
（３）カーネーションのＦ３’Ｈ遺伝子のゲノムＤＮＡ塩基配列
実施例４（１）のｃＤＮＡ配列、実施例４（２）インバースＰＣＲによる約１．６ｋｂＤＮＡ断片から得られた２種のＤＮＡ配列、実施例４（２）ＰＣＲによる約１．９ｋｂＤＮＡ断片のＤＮＡ配列および実施例４（２）ＰＣＲによる約２．９ｋｂＤＮＡ断片のＤＮＡ配列、合計５種の塩基配列を結合し重複部分を除くことにより、カーネーションＦ３’Ｈ遺伝子のゲノムＤＮＡ塩基配列５７４３塩基を決定した（配列番号１９）。また、９７ＳＰｉには対立遺伝子として２つのＦ３’Ｈ遺伝子が存在することが予想されるが、９７ＳＰｉでは配列番号１９の２５２７番目の塩基ＡのあとにＧが挿入されフレームシフトを起こしていることが明らかとなった。
【実施例５】
カーネーション系統９７ＳＰｉからの転移因子のクローン化と塩基配列の決定
インバースＰＣＲは、細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ２ 植物のＰＣＲ実験プロトコール（１９９５） ６９−７２に従い行った。実施例２に記載した方法によりカーネーション系統９５ＳＰおよび９７ＳＰｉよりゲノムＤＮＡを調整し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで分解した。これら分解産物を材料に実施例４（１）で得られた８４８塩基のＤＮＡ配列をもとに作成したプライマーＣＡＣＡＣＧＡＴＴＣＧＴＴＴＧＣＧＡＣＣ（２０塩基：配列番号１３）およびＴＡＡＡＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＴＣＣＣＡ（２１塩基：配列番号７）を用いインバースＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃２分）を３０回、７２℃３分）を行った。得られた増幅産物を１％アガロースゲルを用い１００Ｖで２０分間電気泳動することにより分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。この結果、９７ＳＰｉに特異的に存在する約２．５ｋｂの増幅産物が得られた。これをｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列を決定した。この塩基配列を内部に存在する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断点で分割し２種の塩基配列としたところ、約３００塩基の１種は実施例４で得られたＤＮＡ塩基配列（配列番号１９）の一部と全長にわたり一致した。
次に前段落で明らかとなった約２．５ｋｂのＤＮＡ配列をもとに作成したプライマーＧＡＧＡＣＴＣＡＴＡＧＴＧＧＴＴＡＴＡＴＡＣＡ（２３塩基：配列番号１４）および実施例４（２）で得られた約１．９ｋｂのＤＮＡ配列をもとに作成したプライマーＴＡＡＣＡＡＣＡＣＧＴＡＡＣＣＧＡＡＡＡＴＡＴＡ（２４塩基：配列番号１５）を用い、カーネーション系統９７ＳＰｉのゲノムＤＮＡを材料にＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３分）を３０回、７２℃３分）を行った。得られた約３ｋｂの増幅産物をｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列を決定した。
本実施例で得られた３種のＤＮＡ塩基配列のうち実施例４で得られた塩基配列と一致した１種を除いた２種の塩基配列を結合し重複した部分を除外し、さらに両末端に存在する実施例４で得られたフラボノイド３’水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）遺伝子のゲノムＤＮＡ塩基配列（配列番号１９）と相同な４０塩基および９３１塩基の部分を除外することにより本発明の転移因子のＤＮＡ塩基配列（配列番号４）を得た。ここでＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ ｖ３．７による解析によりオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、１０５６番目の塩基Ａから３４９７番目のＴまでの２４４２塩基であった。
次に配列番号１９および配列番号４に示すＤＮＡ塩基配列からＧＴＴＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡＴＡＣＴＣＡＧＴＡＣＡ（２４塩基：配列番号１０）およびＧＧＴＣＴＡＧＴＴＡＧＴＣＡＧＣＴＡＣＧＧ（２１塩基：配列番号１６）２種のプライマーにより、本発明の転移因子の内部からフラボノイド３’水酸化酵素の部分までをＰＣＲを用い増幅することが可能となる。９５ＳＰ、９７ＳＰｉのＤＮＡおよび９７ＳＰｉの個体から部分的に紫花色に先祖返りをおこした花の花弁ＤＮＡを鋳型にこれら２種のプライマーを用いＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３分）を３０回、７２℃３分）を行ったところ、９５ＳＰ（レーン３）や紫色に先祖返りをおこした花の花弁（レーン２０、２１）では、増幅産物が得られず本発明の転移因子はフラボノイド３’水酸化酵素遺伝子より脱離をおこしていることが明らかとなった（図４）。このことより本発明の転移因子が転移能を有することは明らかである。
また、実施例４で明らかとなった９７ＳＰｉの花色発現に係る塩基配列（フラボノイド３’水酸化酵素遺伝子、配列番号１９の２５２７番目の塩基ＡのあとにＧが挿入されているもの）と本発明の転移因子の塩基配列（配列番号４）に続く両側の塩基配列を比較することにより、本発明の転移因子は配列番号１９の３９０８番目の塩基Ｔの後ろに挿入し、転移因子の両側で、配列番号１９の塩基配列中３９０１番目から３９０８番目までのＡＧＴＴＡＡＴＴという８塩基を重複していることが明らかになった。
つづいて、配列番号４に示す明らかとなった転移因子の塩基配列からＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＡＣＣＧＧＴＧＣ（２５塩基：配列番号２３）およびＡＧＡＴＣＴＡＧＡＧＣＴＧＧＣＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＧＣ（２７塩基：配列番号２４）２種のプライマーにより、９７ＳＰｉのゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃２分）を３０回、７２℃３分）を行い増幅産物を得た。これをｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列を決定した。得られた増幅産物のうち約０．７ｋｂのものを、配列番号２２に示す。この塩基配列は両端約０．２ｋｂにわたりそれぞれ配列番号４に示す転移因子とほぼ相同であるが、オープンリーディングフレームはなく、内部に転移酵素遺伝子をもたない非自律性転移因子であると判断した。
インバースＰＣＲにより９５ＳＰと９７ＳＥの相違を検討した。すなわちカーネーション系統９５ＳＰおよび９５ＳＰからの芽条突然変異体である９７ＳＥのゲノムＤＮＡを実施例２に記載の方法で調整し、制限酵素ＥｃｏＲＩにより分解した。これら分解産物を材料にプライマーＣＧＡＡＴＡＣＣＧＴＧＣＴＴＴＧＧＡＣＧ（２０塩基：配列番号１８）およびＴＣＧＴＧＣＣＧＴＧＣＡＣＣＧＧＴＴＴ（１９塩基：配列番号２５）を用いインバースＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３分）を３０回、７２℃３分）を行った。インバースＰＣＲは、細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ２ 植物のＰＣＲ実験プロトコール（１９９５） ６９−７２に従い行った。得られた増幅産物を１％アガロースゲルを用い１００Ｖで６０分間電気泳動することにより分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。この結果、９５ＳＰには存在しないが、９７ＳＥに存在する約４．５ｋｂの増幅産物が得られた。この増幅産物をｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて部分的に塩基配列を決定した。得られた塩基配列から作成したプライマーＴＡＴＡＣＧＧＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＴＣＡＧＡ（２２塩基：配列番号２６）およびＣＴＡＧＴＡＴＧＣＴＡＧＴＣＴＧＡＡＧＧＣ（２１塩基：配列番号２７）を用い９５ＳＰおよび９７ＳＥのゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃２分）を３０回、７２℃３分）を行った後に、１％アガロースゲルを用い１００Ｖで３０分間電気泳動することにより分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。得られた増幅産物のうち９５ＳＰに存在せず９７ＳＥに存在する約１．３ｋｂの増幅産物をｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列を決定した。この結果、この増幅産物には配列番号２２に示すＤＮＡ配列が、配列番号２８に示す塩基配列の第１１４番目のＣから第１２１番目のＣの８塩基（ＧＴＴＡＴＡＴＧ）を同一方向に重複した間に存在していた。即ち、当該８塩基の部分がＧＴＴＡＴＡＴＧ・・・・ＧＴＴＡＴＡＴＧとなり、・・・・の所に配列番号２２の配列が挿入していた。このことから配列番号２２に示す非自律性因子が可動であり９７ＳＥが９５ＳＰから突然変異により得られた時点あるいはそれ以降に転移したことが明らかである。
ここで示したインバースＰＣＲによる転移の評価方法は、実施例８で述べる突然変異の検出法の実施例とともに突然変異の検出に有効な方法の１つである。
【実施例６】
リターンＰＣＲによる転移酵素発現の評価
実施例３に記載した方法によりカーネーション系統９５ＳＰおよび９７ＳＰｉからｃＤＮＡを調整し、プライマーＣＡＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡ（２３塩基：配列番号２０）およびＧＡＧＡＣＴＣＡＴＡＧＴＧＧＴＴＡＴＡＴＡＣＡ（２３塩基：配列番号１４）を用いＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３分）を３０回、７２℃３分）を行った。
また、プライマーＴＴＣＴＴＣＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＡＧ（２３塩基：配列番号２１）およびＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣ（２３塩基：配列番号１７）を用い同様にＰＣＲを行った。得られた増幅産物を１％アガロースゲルを用い１００Ｖで２０分間電気泳動することにより分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。この結果、予想される大きさ（それぞれ約１．９ｋｂおよび約１．１ｋｂ）の増幅が検出された（図５）。これらの産物のうち系統９７ＳＰｉより得られたものについてｐＧＥＭ Ｔ ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてＴＡクローニング（ＰＣＲ実験ノート，谷口武利編著，羊土社（１９９７））し、ＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて部分的に塩基配列を決定したところ、本発明の転移因子が有する転移酵素をコードする遺伝子の一部と相同であった。このようにリターンＰＣＲにより転移酵素の転写発現を容易に検出することが可能であった。
【実施例７】
他のダイアンサス属植物での転移因子の存在の調査
カーネーション品種カリー、Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（一般の花種子販売業者で購入）およびＤｉａｎｔｈｕｓ ｂａｒｂａｔｕｓ（一般の花種子販売業者で購入）、ポジティブコントロールとして９７ＳＰｉからのＤＮＡの調整は、実施例２と同様に行った。ただしカーネーション品種カリーは温室で育成した植物の葉を材料にＤＮＡを調整した。他の２種は水分を含むろ紙上に播種し６日後に発芽した子葉と胚軸からＤＮＡを調整した。これらのＤＮＡを鋳型に下記のＰＣＲを行った。
明らかとなった本発明の転移因子塩基配列から、ＧＧＴＣＴＡＧＴＴＡＧＴＣＡＧＣＴＡＣＧＧ（２１塩基：配列番号１６）およびＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣ（２３塩基：配列番号１７）という２種のプライマーを用い、ＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３０秒）を３０回、７２℃３分）を行った。増幅産物は１％アガロースゲルを用い１００Ｖで２０分間電気泳動することにより分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。
この結果、ポジティブコントロールの９７ＳＰｉと同様に、カーネーション品種カリー（レーン３）、Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（レーン４）およびＤｉａｎｔｈｕｓ ｂａｒｂａｔｕｓ（レーン５）いずれからも予想される約４６０塩基の増幅産物が得られ、これらの植物にも本発明の転移因子が存在することが明らかとなった（図６）。
【実施例８】
突然変異の検出
実施例５で述べたインバースＰＣＲは、細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ２植物のＰＣＲ実験プロトコール（１９９５） ６９−７２に従い行った。カーネーション系統９５ＳＰ、９７ＳＰｉおよび９５ＳＰからの芽条突然変異体である系統９９ＳＰ４、９９ＳＰ５のゲノムＤＮＡを実施例２に記載の方法で調整し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩあるいはＳｐｅＩにより分解した。これら分解産物を材料にプライマーＣＧＡＡＴＡＣＣＧＴＧＣＴＴＴＧＧＡＣＧ（２０塩基：配列番号１８）およびＣＧＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣ（２３塩基：配列番号１７）を用いインバースＰＣＲ（条件：９５℃２分、（９５℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃５分）を３０回、７２℃３分）を行った。得られた増幅産物を１％アガロースゲルを用い５０Ｖで１２０分間電気泳動することにより分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。この結果、それぞれ複数種の増幅産物を分離することが可能であり、用いた４系統それぞれに特異的に得られる増幅産物が検出され、これらは転移因子の転移によると考えられた。このように転移因子が転移することにより誘発されたゲノムＤＮＡ上の変異を検出することが可能であった（図７）。
また、インバースＰＣＲの増幅産物の一部についてＡＢＩ３１０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて部分的に塩基配列を決定し、本発明の転移因子に含まれる予想される配列と相同であることを確認した。このことより本実施例の増幅産物は本発明の転移因子を含む目的とする増幅産物であることが明らかである。
【実施例９】
環境による転移因子の転移促進
本発明で得られた９７ＳＰｉのフラボノイド３’水酸化酵素に挿入する転移因子の脱離は、花色がピンクから紫になることで表現型として検出することが可能である。９７ＳＰｉの定植苗（約５ｃｍ長）を２種の条件下の温室内で定法に従い２ヶ月間（２００３年９月４日から２００３年１０月３１日）育成したのち、開花時に紫色の斑の有無を検定した。第１は、ガラス温室で昼温２５−３３℃・夜温２３−３０℃・自然日長（１３−１２時間）の条件とした。第２は、人工気象器コイトトロン（小糸製作所製）を用いて昼温２０度・夜温１０度・８時間日長に調整した条件とした。この結果、第１の条件で開花した４５花のうち３花に紫の斑が見られたのに対し（６．７％）、第２の条件では開花した５１花のうち３５花に紫の斑が見られた（６８．６％）。このことから、低温、あるいは短日、あるいは低温および短日の条件が、９７ＳＰｉのフラボノイド３’水酸化酵素に挿入する転移因子の脱離を促進することが明らかである。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明で初めて見出された芽条突然変異誘発型転移因子の転移酵素発現量をリターンＰＣＲによって検出することおよびこの転移因子のメチレーション程度を評価することにより、効率的に芽条突然変異を起こしやすい環境条件を特定するあるいは芽条突然変異をおこしやすい個体を選抜することができる。
また、当該転移因子の転移を突然変異の検出方法に述べた手法により検出することにより、芽条変異をおこす環境条件を特定するあるいは芽条突然変異をおこしやすい個体を選抜することができる。
このようにして得られた環境条件および個体を利用して効率的に芽条突然変異を誘発することが可能となる。また、当該転移因子の転移酵素遺伝子を遺伝子工学的に利用することにより芽条突然変異体を効率よく作り出すことが可能となる。このようにして一細胞あたりの変異箇所が少ないにもかかわらず変異する頻度の高い、従来の手法の問題を解決する理想的な突然変異方法を提供し、突然変異育種が重要である果樹や花卉などの育種を効率よく進展させることが可能となる。
さらに、農業生産上問題となる易変性を示す個体において原因が転移因子によるものであれば、転移因子の転移を促すことにより安定化することが可能となる。また、転移をおこしやすい環境条件を避けることあるいは転移酵素遺伝子の発現を遺伝子工学的に抑制することにより安定に農業生産を行うことが可能となる。
得られた芽条突然変異体から突然変異の原因遺伝子を容易に同定・単離することが可能となる。また、目的の遺伝子に当該転移因子が挿入しているものをＰＣＲなどの手法により容易に検出（選抜）することが可能となり、遺伝子の発現が抑制された変異体を効率よく得ることができる。このような技術は植物分子遺伝学研究を加速させ得る。
【配列表】
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（４）（６）（７）のいずれかの塩基配列又は（５）の縮重異性体を含んでなるＤＮＡ。
（１）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（２）配列番号３のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は（両端に）付加されたものであり、かつ転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（３）配列番号４の塩基配列
（４）配列番号４の塩基配列のうち１０５６番目のＡから３４９７番目のＴまでである塩基配列
（５）配列番号４の塩基配列の縮重異性体
（６）上記（１）〜（４）いずれかに記載の塩基配列又は上記（５）に記載の縮重異性体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコードされるポリペプチドが転移活性を有する塩基配列
（７） 以下の（イ）〜（ロ）のいずれかの塩基配列。
（イ）配列番号２２の塩基配列
（ロ）上記（イ）に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
【請求項２】
配列番号４又は配列番号２２の塩基配列のうち少なくとも連続した８塩基を含むプライマーを利用した遺伝子増幅法により、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は請求項１に記載のＤＮＡを検出することを特徴とする芽条突然変異の有無を検出する方法。
【請求項３】
配列番号４又は配列番号２２の塩基配列のうち少なくとも連続する８塩基を含むプライマーを利用した遺伝子増幅法により、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は請求項１に記載のＤＮＡを有する転移因子の有無を検出する方法。
【請求項４】
配列番号４又は配列番号２２の塩基配列のうち少なくとも連続した８塩基を含むプライマーと本転移因子が挿入されている周囲の塩基配列のうち少なくとも連続する８塩基を含むプライマーを利用した遺伝子増幅法により、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は請求項１に記載のＤＮＡを有する転移因子の脱離有無を検出する方法。
【請求項５】
５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有し、配列番号１及び配列番号２に示す配列を直接に、又は４０００塩基より短い任意のリンカーを介し、連結された非自律性の転移因子。
【請求項６】
以下の（１）〜（２）のいずれかのポリペプチド。
（１）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（２）配列番号３のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は（両端に）付加されたものであり、かつ転移酵素活性を有するポリペプチド
【請求項７】
請求項１（１）〜（４）、（６）、（７）に記載のいずれかの塩基配列又は請求項１（５）に記載の縮重異性体又は請求項５に記載の転移因子のいずれかを含んでなるＤＮＡの転移を促進することにより芽条突然変異を誘発する方法。
【請求項１】
以下の（１）〜（４）（６）（７）のいずれかの塩基配列又は（５）の縮重異性体を含んでなるＤＮＡ。
（１）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（２）配列番号３のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は（両端に）付加されたものであり、かつ転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列
（３）配列番号４の塩基配列
（４）配列番号４の塩基配列のうち１０５６番目のＡから３４９７番目のＴまでである塩基配列
（５）配列番号４の塩基配列の縮重異性体
（６）上記（１）〜（４）いずれかに記載の塩基配列又は上記（５）に記載の縮重異性体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつコードされるポリペプチドが転移活性を有する塩基配列
（７） 以下の（イ）〜（ロ）のいずれかの塩基配列。
（イ）配列番号２２の塩基配列
（ロ）上記（イ）に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
【請求項２】
配列番号４又は配列番号２２の塩基配列のうち少なくとも連続した８塩基を含むプライマーを利用した遺伝子増幅法により、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は請求項１に記載のＤＮＡを検出することを特徴とする芽条突然変異の有無を検出する方法。
【請求項３】
配列番号４又は配列番号２２の塩基配列のうち少なくとも連続する８塩基を含むプライマーを利用した遺伝子増幅法により、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は請求項１に記載のＤＮＡを有する転移因子の有無を検出する方法。
【請求項４】
配列番号４又は配列番号２２の塩基配列のうち少なくとも連続した８塩基を含むプライマーと本転移因子が挿入されている周囲の塩基配列のうち少なくとも連続する８塩基を含むプライマーを利用した遺伝子増幅法により、５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有する転移因子又は請求項１に記載のＤＮＡを有する転移因子の脱離有無を検出する方法。
【請求項５】
５‘末端に配列番号１に示す塩基配列を有し、かつ３’末端に配列番号２に示す塩基配列を有し、配列番号１及び配列番号２に示す配列を直接に、又は４０００塩基より短い任意のリンカーを介し、連結された非自律性の転移因子。
【請求項６】
以下の（１）〜（２）のいずれかのポリペプチド。
（１）配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（２）配列番号３のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は（両端に）付加されたものであり、かつ転移酵素活性を有するポリペプチド
【請求項７】
請求項１（１）〜（４）、（６）、（７）に記載のいずれかの塩基配列又は請求項１（５）に記載の縮重異性体又は請求項５に記載の転移因子のいずれかを含んでなるＤＮＡの転移を促進することにより芽条突然変異を誘発する方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２６３６３
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【発行日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１３９８９（Ｐ２００５−５１３９８９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４００７
【国際出願日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【出願人】（０００２５３５０３）麒麟麦酒株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【発行日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４００７
【国際出願日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【出願人】（０００２５３５０３）麒麟麦酒株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
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