糖タンパク質ホルモンスーパーアゴニスト
【課題】 in vitroおよびin vivo生物活性の両方の大きな増大を示すヒト糖タンパク質ホルモンアナログを生じるヒト糖タンパク質ホルモンの特定のアミノ酸置換を提供する。
【解決手段】 本発明は、一態様では、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される位置でα−サブユニット中に少なくとも３つの塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。
【解決手段】 本発明は、一態様では、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される位置でα−サブユニット中に少なくとも３つの塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、概して、修飾糖タンパク質ホルモンに関する。特に本発明は、スーパーアゴニスト活性を生じるヒト糖タンパク質に対する修飾に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
チロトロピン（甲状腺刺激ホルモン、ＴＳＨ）およびゴナドトロピン、絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）、ルトロピン（黄体形成ホルモン、ＬＨ）、並びにフォリトロピン（卵胞刺激ホルモン、ＦＳＨ）は、糖タンパク質ホルモンのファミリーを構成する。各ホルモンは、２つの非共有結合サブユニットであるαおよびβのヘテロ二量体である。同一種内では、α−サブユニットのアミノ酸配列は全ホルモンで同一であり、一方β−サブユニットの配列はホルモン特異的である（Pierce，J．G．and Parsons，T.F．"Glycoprotein hormones:strcture and function."Ann．Rev．Biochem．50:465-495（1981））。サブユニットの配列が魚類から哺乳類まで高度に保存されているという事実は、これらのホルモンが共通の先祖タンパク質から進化したことを意味する（Fontaine Y-A．and Burzawa-Gerard，E．"Esquisse de l'evolution des hormones gonadotopes et threotropes des vertebres."Gen．Comp．Endocrinol．32:341-347（1977））。これらのホルモンの進化的変化は、ある場合に生物学的活性の修飾を引き起こした（Licht，P．et al.，"Evolution of gonadotropin structure and function."Rec．Progr．Horm．Res.，33:169-248（1977）およびCombarnous，Y．"Molecular basis of the specificity of binding of glycoprotein hormones to their receptors."Endocrine Rev．13:670-691（1992））が、生物作用を調節する特異的構造的決定因子は明らかにされていない。例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ｈＴＳＨ）およびウシ甲状腺刺激ホルモン（ｂＴＳＨ）は、α（７０％）およびβ（８９％）サブユニット配列において高度な相同性を有するが、ｂＴＳＨはｈＴＳＨより６〜１０倍効力がある（Yamazaki，K．et al.，"Potentthyrotropic activity of human chorionic gonadotropin variants in terms of 125I incorporatin and de novo synthesized thyroid hormone release in human thyroid follicles."J．Clin．Endocrinol．Metab．80:473-479（1995））。
【０００３】
糖タンパク質ホルモンは、ある種の治療、例えば甲状腺癌患者の治療においては、極めて重要である（例えば、Meier，C.A.,et al.，"Diagnostic use of Recombinant Human Thyrotropin in Patients with Thyroid Carcinoma(Phase I/II Study)．"J．Clin．Endocrinol．Metabol．78:22（1994）参照）。この疾患の治療におけるヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の使用の可能性は、クロイツフェルト−ヤコブ病の伝染のおそれがあるために、断念された。ヒトＴＳＨの使用に代わるものとしてはウシＴＳＨの使用があるが、しかしこのアプローチは、このホルモンが副作用、例えば悪心、嘔吐、局所性硬化、じんま疹、および比較的高い可能性でアナフィラキシー性ショックを引き起こすために、非常に限定される（Meier，C.A.等）。尿中性腺刺激ホルモンの生体整合性の欠如および組換え糖タンパク質ホルモンの効能限定は、それらをより有効な組換えアナログに置き換える理由となる。したがって、ヒト由来糖タンパク質ホルモン、並びにこれらのホルモンのアゴニストの必要性がある。
【０００４】
例えば、特定の臨床状態、例えば甲状腺癌における甲状腺刺激ホルモンのアゴニストの投与は、放射性ヨウ素の癌への取込みを増強して、疾病を治療する。甲状腺刺激ホルモンのアゴニストは、より多量の放射性ヨウ素を癌に対して向け、それにより一層有効な治療
をもたらす。あるいは、排卵を誘発するために用いられる糖タンパク質ホルモンは、スーパーアゴニストに置き換えられる。これは、今日、受精能治療における大きな医学的問題であるホルモンの必要量を低下させる（Ben-Rafael，Z.,et al.，"Pharmacokinetics of follicle-stimulating hormone:clinical significance."Fertility and Sterility 63:689（1995））。野生型卵胞刺激ホルモンの使用が、多胎妊娠および流産の過刺激および高率を、明らかに多数の卵胞を刺激する多数のホルモン分子によりもたらしている場合には、卵胞刺激ホルモンのスーパーアゴニストを投与して不妊を治療し得る。この修飾ホルモンのアゴニストの使用は、少数のホルモン分子を投与して所望の結果を達成し得るために、多数の卵胞の刺激頻度を低くし得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、初めて、in vitroおよびin vivo生物活性の両方の大きな増大を示すヒト糖タンパク質ホルモンアナログを生じるヒト糖タンパク質ホルモンの特定のアミノ酸置換を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本明細書中に具体化され、広範に説明されているような本発明の目的により、本発明は、一態様では、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される位置でα−サブユニット中に少なくとも３つの塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。
【０００７】
本発明はさらに、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される位置でα−サブユニット中に少なくとも１つの塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、野生型ヒト糖タンパク質を上回る活性を有する修飾ヒト糖タンパク質ホルモンであって、野生型ヒト糖タンパク質を上回る活性を有する非ヒト糖タンパク質ホルモンの塩基性アミノ酸の位置に対応する位置に置換された同一のアミノ酸を有する修飾ヒトホルモンを提供する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、対象の糖タンパク質ホルモン活性に関連した症状を治療する方法であって、患者に治療量の本発明の糖タンパク質ホルモンを投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、ヒトホルモンの超活性(superactive)非キメラアナログを構築する方法であって、別の種由来のより活性なホモログのアミノ酸配列をヒトホルモンと比較し、ヒトホルモン中のアミノ酸を他の種由来の対応するアミノ酸で置換し、置換ヒトホルモンの活性を測定し、そして置換ヒトホルモンから超活性アナログを選択することを含む方法を提供する。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明は、修飾糖タンパク質ホルモンをコードする核酸を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、本発明の好ましい実施態様の下記の詳細な説明およびそこに含まれる実施例を、そして図面およびそれらについての前述のおよび後述の説明を参照することにより、さらに容易に理解される。
【００１３】
本発明の化合物、組成物および方法を開示し、説明するに先立って、本発明は特定のホルモン、特定の対象、即ちヒト及び非ヒト哺乳類、特定のアミノ酸、特定の臨床症状、特定のアナログ、又は、特定の方法に限定されず、当然のことととして変更しうる、と理解されるべきであり、そして多数のその修正および変更は当業者には明らかである。さらに本明細書中に用いられる用語は、特定の実施態様のみを説明するためのものであり、限定を意図するものではない。
【００１４】
本明細書および請求の範囲において、単語は、それが用いられる情況によって、１つ又はそれ以上のそれを意味する。したがって、例えば「ヒト糖タンパク質ホルモン」を例に取ると、これは少なくとも１つのヒト糖タンパク質ホルモンが用いられることを意味する。
【００１５】
一態様では、本発明は、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される位置でα−サブユニット中に少なくとも３つの塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。
【００１６】
本発明はさらに、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される位置でα−サブユニット中に少なくとも１つの塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、野生型ヒト糖タンパク質を上回る活性を有する修飾ヒト糖タンパク質ホルモンであって、野生型ヒト糖タンパク質を上回る活性を有する非ヒト糖タンパク質ホルモンの塩基性アミノ酸位置に対応する位置に置換された同一のアミノ酸を有する修飾ヒトホルモンを提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、対象の糖タンパク質ホルモン活性に関連した症状を治療する方法であって、患者に治療量の本発明の糖タンパク質ホルモンを投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、対象の生殖を補助する方法であって、補助量の本発明の糖タンパク質ホルモンを投与することを含む方法を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、ヒトホルモンの超活性非キメラアナログを構築する方法であって、別の種由来のより活性なホモログのアミノ酸配列をヒトホルモンと比較し、ヒトホルモン中のアミノ酸を他の種由来の対応するアミノ酸で置換し、置換ヒトホルモンの活性を測定し、そして置換ヒトホルモンから超活性アナログを選択することを包含する方法を提供する。
【００２１】
「ヒト」糖タンパク質ホルモンとは、野生型配列中で成されるアミノ酸置換の数がヒトと別の種との間の対応するポリペプチドホルモン中の対応する位置でのアミノ酸の相違の数の１／２を超えないことを意味する。したがって、修飾ポリペプチドホルモンは、アミノ酸コード配列に基づいて、そのアミノ酸置換が得られる非ヒト種由来の対応するポリペプチドホルモンよりヒトの野生型ポリペプチドホルモンに似ていると考えられる。例えば、ヒト糖タンパク質とウシ糖タンパク質ホルモンとの間で対応する糖タンパク質ホルモンの対応する位置に総数２０のアミノ酸の相違が存在した場合、「ヒト」糖タンパク質ホルモンは、そのアミノ酸配列内に、ウシアミノ酸配列中の対応するアミノ酸と相同である１０又はそれ以下のアミノ酸置換を含有する修飾野生型ヒトホルモンである。より具体的には、甲状腺刺激ホルモンは、本明細書中に含まれる実施例に記載するように、ヒトおよびウシホモログのα−およびβ−サブユニット間の計４０のアミノ酸の相違のうち２０又は
それ以上がヒト甲状腺刺激ホルモン中の対応する位置のアミノ酸と相同であるならば、「ヒト」のものと考えられる。
【００２２】
修飾糖タンパク質ホルモンの受容者がヒトである場合の修飾糖タンパク質ホルモンの投与に対する悪い免疫反応の危険性のために、修飾糖タンパク質ホルモンは、好ましくは、スーパーアゴニスト活性の許容不可能な損失を伴わずに考え得る最大程度にヒトアミノ酸配列と相同性を有する。あるいは、修飾糖タンパク質を投与される対象が非ヒトである場合、修飾糖タンパク質ホルモンは、好ましくは、スーパーアゴニスト活性の許容不可能な損失を伴わずに考え得る最大程度に特定の非ヒトアミノ酸配列と相同性を有する。したがって、本発明の好ましい実施態様において、特定のアミノ酸を置換することにより野生型糖タンパク質を修飾してスーパーアゴニスト活性を有する修飾糖タンパク質を構築する場合には、アゴニスト活性を増大しない置換アミノ酸は、その数が１０以下、特に９、８、７、６、５、４、３および２又は０となる。
【００２３】
同様に、「非キメラ」とは、アミノ酸置換基の数が種間の対応するポリペプチドホルモンの対応する位置でのアミノ酸の相違の数の１／２を超えず、したがって修飾ポリペプチドホルモンは、アミノ酸コード配列に基づいて、そのアミノ酸置換が得られる種由来の対応するポリペプチドホルモンより修飾される種の野生型ポリペプチドホルモンに似ていると考えられる。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明は修飾糖タンパク質ホルモンをコードする核酸を提供する。
【００２５】
糖タンパク質ホルモンは、種に共通のα−サブユニットと各ホルモンに生物学的特異性を付与する種で異なるβ−サブユニットとからなる構造的に関連したヘテロ二量体であるホルモンのファミリーを包含する。糖タンパク質ホルモンの一般的概説に関しては、Pierce，J.G．et al.，"Glycoprotein hormones:structure and function."Ann．Rev．Biochem．50:465-495（1981）、及び、Combarnous，Y．"Molecular basis of the specificity of binding of glycoprotein hormones to their receptors．"Endocrine Rev．13:670-691（1992）を参照。このファミリーのホルモンとしては、絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）、ルトロピン（黄体形成ホルモン、ＬＨ）、フォリトロピン（卵胞刺激ホルモン、ＦＳＨ）およびチロトロピン（甲状腺刺激ホルモン、ＴＳＨ）が挙げられる。位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される位置でα−サブユニット中に少なくとも１つの塩基性アミノ酸を有するこれらの糖タンパク質ホルモンは各々、本発明により提供される。
【００２６】
塩基性アミノ酸は、アミノ酸のリジン、アルギニンおよびヒスチジン、並びにこれら３つのアミノ酸のいずれかに対する修飾体であるあらゆる他の塩基性アミノ酸、普通は天然には見出されない合成塩基性アミノ酸、又は中性ｐＨで正に荷電するあらゆる他のアミノ酸を含む。
【００２７】
本発明により提供される糖タンパク質ホルモンは、いくつもの方法で得られる。例えば、糖タンパク質ホルモンをコードするＤＮＡ分子は、普通に見出される生物体から単離できる。例えば、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーが構築され、当該核酸の存在に関してスクリーニングされる。このようなライブラリーの構築およびスクリーニングの方法は当業界では十分公知であり、構築およびスクリーニング工程を実行するためのキットが市販されている（例えば、Stratagene Cloning Systems，La Jolla，ＣＡ）。一旦単離されると、核酸は適切なベクターに直接クローニングされるか、必要な場合には、その後のクローニング工程を促進するよう修飾される。このような修飾工程は一般的なことで、その一例としては、制限部位を含有するオリゴヌクレオチドリンカーの核酸末端への付加が
ある。一般的方法は、Sambrook et al.，"Molecular Cloning，a Laboratory Manual,"Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）に記載されている。
【００２８】
所望の糖タンパク質ホルモンの核酸配列が一旦得られれば、塩基性アミノ酸は、当業界で十分公知の技法により、あらゆる特定アミノ酸位置に配置させることができる。例えば、単数又は複数のアミノ酸位置に渡り、そして非塩基性アミノ酸を塩基性アミノ酸に置換し得るＰＣＲプライマーを設計することができる。次に、糖タンパク質ホルモンのあらゆる位置での塩基性アミノ酸の考え得る多数の組合せのいずれかを得るために、核酸が増幅されて野生型糖タンパク質ホルモンコード配列中に挿入される。あるいは、当業者は、点突然変異誘発のための技法により特定の核酸配列中のあらゆる点に特定の突然変異を導入し得る。一般的方法は、Smith，M．"In vitro mutagenesis"Ann．Rev．Gen.，19:423-462（1985）およびZoller，M.J．"New molecular biology methods for protein engineering"Curr．Opin．struct．Biol.，1:605-610（1991）に記載されている。
【００２９】
特定の糖タンパク質ホルモンをコードするＤＮＡ分子を得る方法の別の例は、糖タンパク質ホルモンをコードする組換えＤＮＡ分子を合成することである。例えば、オリゴヌクレオチド合成法は当業界では一般的なことであり、特定のタンパク質領域をコードするオリゴヌクレオチドは、自動化ＤＮＡ合成により容易に得られる。二本鎖分子の一本鎖のための核酸は、合成し、その相補的鎖とハイブリダイズさせ得る。結果的に生じる二本鎖分子が適切なベクター中へのクローニングのための内部制限部位又は末端での適切な５'又は３'オーバーハングを有するように、これらのオリゴヌクレオチドを設計し得る。比較的大型のタンパク質をコードする二本鎖分子は、タンパク質の特定領域をコードするいくつかの異なる二本鎖分子を先ず構築し、その後これらのＤＮＡ分子を一緒に連結することにより、容易に合成することができる。例えば、Cunningham等（"Receptor and Antibody
Epitopes in Human Growth Hormone Identified by Homolog-Scanning Mutagenesis,"Science，243:1330-1336（1989））は、重複および相補的合成オリゴヌクレオチドを先ず構築し、そしてこれらの断片を一緒に連結することにより、ヒト成長ホルモン遺伝子をコードする合成遺伝子を構築した。合成オリゴヌクレオチドからの１０５７塩基対の合成ウシロドプシン遺伝子の合成を開示したFerretti，et al.，Proc．Nat．Acad．Sci．82:599-603（1986）も参照。この方法で糖タンパク質ホルモンを構築することにより、α−サブユニット、β−サブユニットのいずれか又は両方の単数又は複数のあらゆる特定位置に塩基性アミノ酸を有するあらゆる特定の糖タンパク質ホルモンを、当業者は容易に得られる。合成遺伝子の製造の酵素鋳型反応法を記載した米国特許第５，５０３，９９５号も参照。このような技法は当業界では一般的なことであり、十分記載されている。糖タンパク質ホルモンをコードするＤＮＡ断片は、次に、下記のようにin vivo又はin vitroで発現される。
【００３０】
特定の当該糖タンパク質ホルモンをコードする核酸、又は核酸の一領域が一旦構築され、修飾され、又は単離されれば、その核酸は次に適切なベクター中にクローニングされ、これが野生型および／または修飾糖タンパク質ホルモンのin vivo又はin vitro合成を導く。ベクターは、挿入遺伝子又はハイブリッド遺伝子の転写を導き、調節するのに必要な機能性要素を有するよう意図される。これらの機能性要素としては、プロモーター、プロモーターの上流又は下流の領域、例えばプロモーターの転写活性を調節し得るエンハンサー、複製起点、プロモーターに隣接する挿入体のクローニングを助けるための適切な制限部位、抗生物質耐性遺伝子又はベクターを含有する細胞又は挿入体を含有するベクターを選択するのに役立つその他のマーカー、ＲＮＡスプライシング接続部、転写終結領域、あるいは挿入遺伝子又はハイブリッド遺伝子の発現を促進するのに役立つあらゆるその他の領域が挙げられるが、これらに限定されない（一般的には、Sambrook等参照）。
【００３１】
核酸挿入体の発現に有用な当業者に公知の大腸菌(E．coli)発現ベクターが多数存在す
る。使用に適したその他の微生物宿主としては、桿菌属、例えばBacillus subtilisおよびその他の腸内細菌科、例えばサルモネラ属、セラチア属、および種々のシュードモナス属の種が挙げられる。これらの原核生物宿主中で、典型的には宿主細胞に適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターを作製し得る。さらに、十分公知の多数の種々のプロモーターが存在し、その例としては、例えばラクトースプロモーター系、トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系、βラクタマーゼプロモーター系又はラムダファージ由来のプロモーター系がある。プロモーターは、典型的には、任意にオペレーター配列を有して発現を制御し、例えば転写および翻訳を開始および終了するためのリボソーム結合配列を有する。必要な場合には、下流の核酸挿入体の5'側でインフレームのＭｅｔコドンの挿入により、アミノ末端メチオニンが提供される。さらに、核酸挿入体のカルボキシ末端エクステンションが、標準的オリゴヌクレオチド突然変異誘発法を用いて除去される。
【００３２】
さらに、酵母発現を用いることができる。酵母発現系にはいくつかの利点がある。第一に、酵母分泌系で産生されるタンパク質は正確なジスルフィド対合を示すという証拠がある。第二に、翻訳後グリコシル化が酵母分泌系により効率的に実行される。Saccharomyces cerevisiaeのプレプロα因子リーダー領域（ＭＦ"−Ｉ遺伝子によりコードされる）は、酵母からのタンパク質分泌を導くのに一般に用いられる（Brake，et al.，"α-Factor-Directed Synthesis and Secretion of Mature Foreign Proteins in Saccharomyces cerevisiae."Proc．Nat．Acad．Sci.，81:4642-4646（1984））。プレプロα因子のリーダー領域は、シグナルペプチドおよびＫＥＸ２遺伝子によりコードされる酵母プロテアーゼ（この酵素はＬｙｓ−Ａｒｇジペプチド切断シグナル配列のカルボキシ側で前駆体タンパク質を切断する）の認識配列を含むプロ−セグメントを含有する。核酸コード配列は、プレ−プロ−α因子リーダー領域とインフレームで融合し得る。この構築物は次に強力な転写プロモーター、例えばアルコールデヒドロゲナーゼＩプロモーター又は解糖プロモーターの制御下に置かれる。核酸コード配列の後には翻訳終結コドンが続き、その後には転写終結シグナルがくる。あるいは、核酸コード配列は、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を促進するために用いられる二次タンパク質コード配列、例えばＳｊ２６又はβガラクトシダーゼに融合される。融合タンパク質の成分を分離するためのプロテアーゼ切断部位の挿入は、酵母中での発現のために用いられる構築物に適用可能である。有効な翻訳後グリコシル化および組換えタンパク質の発現は、バキュウロウイルス系でも成し遂げられる。
【００３３】
哺乳類細胞は、重要な翻訳後修飾、例えば折り畳みおよびシステイン対合、複合炭水化物構造物の付加、および活性タンパク質の分泌に好都合な環境でタンパク質の発現を可能にする。哺乳類細胞中での活性タンパク質の発現に有用なベクターは、強力ウイルスプロモーターとポリアデニル化シグナルとの間のタンパク質コード配列の挿入を特徴とする。ベクターは、ハイグロマイシン耐性、ゲンタマイシン耐性を付与する遺伝子、あるいは選択可能なマーカーとして用いるのに適したその他の遺伝子又は表現型、あるいは遺伝子増幅のためのメトトレキセート耐性を含有し得る。キメラタンパク質コード配列は、メトトレキセート耐性コードベクターを用いるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系中に、又は適切な選択マーカーを用いるその他の細胞系中に導入される。形質転換細胞中のベクターＤＮＡの存在は、サザンブロット分析により確証される。挿入コード配列に対応するＲＮＡの産生は、ノーザンブロッド分析により確認される。インタクトヒトタンパク質を分泌可能なその他の多数の適切な宿主細胞系が当業界で開発されており、その例としては、ＣＨＯ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系，Ｊｕｒｋａｔ細胞等が挙げられる。これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製の起点、プロモーター、エンハンサーおよび必要な情報プロセッシング部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列を含み得る。好ましい発現制御配列は、イムノグロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパ
ピローマウイルス等に由来するプロモーターである。当該核酸セグメントを含有するベクターは、細胞宿主の種類によって変わる十分公知の方法により宿主中に移される。例えば、塩化カルシウム形質転換は一般に原核生物細胞に対して利用されるが、一方リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストランまたはリポフェクチン介在性トランスフェクションや電気穿孔法は、他の細胞宿主に用いられる。
【００３４】
哺乳類細胞中の遺伝子の発現のための代替的ベクター、ヒトγインターフェロン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＶＩＩＩ凝固因子、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、プロテアーゼＮｅｘｉｎｌ、および好酸性主要塩基性タンパク質の発現のために開発されたものと同様のものが用いられる。さらに、ベクターはＣＭＶプロモーター配列、および哺乳類細胞（例えばＣＯＳ−７）中の挿入核酸の発現に利用可能なポリアデニル化シグナルを含み得る。
【００３５】
遺伝子又はハイブリッド遺伝子の発現は、in vivo又はin vitroによる。in vivo合成は、ベクターのための宿主として役立つ原核生物又は真核生物細胞を形質転換することを包含する。原核生物発現ベクター中に挿入される修飾糖タンパク質ホルモンの例は、本明細書中の実施例の項に示されている。
【００３６】
あるいは、遺伝子の発現はin vitro発現系で起こし得る。例えば、比較的大量のｍＲＮＡを合成するのに一般的に用いられるin vitro転写系が市販されている。このようなinvitro転写系では、糖タンパク質ホルモンをコードする核酸は、転写プロモーターに隣接して発現ベクター中にクローニングされる。例えば、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩクローニングおよび発現ベクターは、強力な原核生物転写プロモーターと側面を接するマルチクローニング部位を含有する（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，ＣＡ）。ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのようなＤＮＡ鋳型からのin vitroＲＮＡ合成のために必要な試薬をすべて含有するキットが利用できる（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，ＣＡ）。このような系によりin vitroで産生されるＲＮＡは次に、in vitroで翻訳されて、所望の糖タンパク質ホルモンを産生する（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，ＣＡ）。
【００３７】
糖タンパク質ホルモンの別の製造方法は、タンパク質化学技法により、２つのペプチド又はポリペプチドを一緒に結合させることである。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）又はＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）（Applied Biosystems，Inc.,FosterCity，ＣＡ）化学を用いて一般に利用可能な実験室装置を用いて、化学的に合成される。ハイブリッド糖タンパク質ホルモンに対応するペプチド又はポリペプチドが標準化学反応により合成されるということは、当業者は容易に理解し得る。例えば、ペプチド又はポリペプチドを合成し、その合成樹脂から切断せず、一方、ハイブリッドペプチドの他方の断片を合成し、その後樹脂から切り離し、それにより他の断片上では機能的にブロックされている末端基を露呈する。ペプチド縮合反応により、これら２つの断片はそれらのカルボキシおよびアミノ末端でそれぞれペプチド結合により共有結合されて、ハイブリッドペプチドを形成するGrant，G.A.，"Synthetic Peptides:A User Guide,"W.H.Freeman and Co.,N.Y.（1992）およびBodansky，M.and Trost，B.，Ed.，"Principles of Peptide Synthesis，"Springer-Verlag Inc.,N.Y.（1993））。あるいは、ペプチド又はポリペブチドは前記のようにin vivoで別々に合成される。単離されると、これら別々のペプチド又はポリペプチドは同様の縮合反応により糖タンパク質ホルモンを生成するために結合される。
【００３８】
例えば、クローン化又は合成ペプチドセグメントの酵素的連結により、短いペプチド断片を容易に連結させて、大ペプチド断片、ポリペプチド又は全タンパク質ドメインを生成し得る（Abrahmsen，L.，et al.,Biochemistry，30:4151（1991））。あるいは、合成ペプチドの本来の化学連結を利用して短いペプチド断片からより大きいペプチド又はポリペ
プチドを合成的に構築し得る。この方法は、２工程化学反応からなる（Dawson，et al.，"Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation,"Science，266:776-779（1994））。第一工程は、非保護合成ペプチド−α−チオエステルとアミノ末端Ｃｙｓ残基を含有する別の非保護ペプチドセグメントとを化学選択的に反応させて初期共有生成物としてチオエステル結合中間体を生成する反応である。反応条件を変えずに、この中間体は自発性迅速分子内反応を経て、連結部位に本来のペプチド結合を形成する。タンパク質分子の全合成へのこのネイティブ化学的連結法の適用は、ヒトインターロイキン８（ＩＬ−８）の調製により例示される（Clark-Lewis，I.，et al.，FEBS Lett.，307:97（1987），Clark-Lewis，I.，et al.，J．Biol．Chem.，269:16075（1994），Clark-Lewis，I.，et al.，Biochemistry，30:3128（1991）、および、Rajarathnam，K.，et al.，Biochemistry，29:1689（1994））。
【００３９】
あるいは、非保護ペプチドセグメントは化学的に結合され得るが、この場合、化学的連結の結果ペプチドセグメント間に形成された結合は非天然（非ペプチド）結合である（Schnolzer，M.,et al.，Science，256:221（1992））。この技法は、タンパク質ドメインのアナログ並びに十分な生物学的活性を有する大量の相対的に純粋なタンパク質を合成するために用いられている（deLisle Milton，R.C.,et al.，"Techniques in Protein Chemistry IV,"Academic Press，New York，pp.257-267（1992））。
【００４０】
本発明はさらに、スーパーアゴニスト又はアンタゴニスト活性を有する修飾糖タンパク質ホルモンの断片を提供する。本発明のポリペプチド断片は、そのポリペプチド断片を産生し得る発現系中にポリペプチドをコードする核酸をクローニングすることにより得られる組換えタンパク質である。例えば、β−サブユニットと一緒に糖タンパク質ホルモン受容体と相互作用して糖タンパク質ホルモンに関連した生物学的効果を生じ得る糖タンパク質ホルモンの活性ドメインを決定し得る。一例では、糖タンパク質ホルモンの活性あるいは結合特異性又は親和性に関与しないことが分かっているアミノ酸は、それぞれの活性を損失させずに欠失される。
【００４１】
例えば、アミノ又はカルボキシ末端アミノ酸が引き続いて天然又は修飾糖タンパク質ホルモンから除かれ、それぞれの活性は多数の利用可能なアッセイの１つで試験される。別の例では、修飾糖タンパク質の断片が、α又はβ−サブユニットの特定の位置で、少なくとも１つのアミノ酸で天然アミノ酸が置換された修飾ホルモンを包み、そしてアミノ末端又はカルボキシ末端アミノ酸の一部は、あるいはホルモンの内部領域で、修飾糖タンパク質ホルモンの精製を促進し得るポリペプチド断片又はその他の部分、例えばビオチンで置き換えられている。例えば、修飾糖タンパク質は、２つのポリペプチド断片をコードするそれぞれの核酸を、コード領域の発現がハイブリッドポリペプチドを生じるように発現ベクター中にクローニングするペプチド化学により、マルトース結合タンパク質に融合される。ハイブリッドポリペブチドは、それをアミロースアフィニティカラムに通してアフィニティ精製し、次にハイブリッドポリペプチドを特異的プロテアーゼＸａ因子で切断することにより、修飾糖タンパク質はマルトース結合領域から分離される（例えば、New England Biolabs Product Catalog，1996,pg.164参照）。
【００４２】
糖タンパク質ホルモンの活性断片は直接合成されるか、又はより大きな糖タンパク質ホルモンの化学的又は機械的分解により得られる。活性断片は、天然アミノ酸配列由来の少なくとも約５つの連続アミノ酸のアミノ酸配列で、関連活性、例えば結合又は調節活性を有するものと定義される。
【００４３】
断片は、他の配列と結びついていてもそうでなくても、ペプチドの活性が、修飾糖タンパク質ホルモンと比較して、有意に変化又は損傷を受けない限り、特定領域又は特定アミノ酸残基の挿入、欠失、置換又はその他の選択的修飾を含む。これらの修飾は、ジスルフ
ィド結合し得るアミノ酸を除去／付加するとか、その生物寿命を増大するといったような、いくつかの付加的特性を提供し得る。いかなる場合にも、ペプチドは生物活性特性、例えば結合活性、結合ドメインでの結合の調節等を保有しなければならない。糖タンパク質ホルモンの機能性又は活性領域は、ホルモンの特定領域の突然変異誘発、並びにその後の発現および発現ポリペプチドの試験により確認し得る。このような方法は当業者には明らかであり、その例としては、受容体をコードする核酸の特定部位の突然変異誘発が挙げられる（Zoller，M.J．等）。
【００４４】
本発明の一実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される位置でα−サブユニット中に少なくとも１つの塩基性アミノ酸を有する。一実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置１１に塩基性アミノ酸を有する。別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置１３に塩基性アミノ酸を有する。別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置１４に塩基性アミノ酸を有する。別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置１６に塩基性アミノ酸を有する。別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置１７に塩基性アミノ酸を有する。別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置２０に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、位置１１、１３、１４、１６および２０の塩基性アミノ酸はリジンである。本発明のさらに別の実施態様では、位置１７の塩基性アミノ酸はアルギニンである。
【００４５】
本発明はさらに、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される任意の２つの位置の組合せでα−サブユニット中に塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。例えば、塩基性アミノ酸は、位置１１と１３、又は位置１１と１４、又は位置１１と１６、又は位置１１と１７、又は位置１１と２０、又は位置１３と１４、又は位置１３と１７、又は位置１４と１６、又は位置１４と１７，又は位置１４と２０、又は位置１６と１７、又は位置１７と２０に存在する。本発明の一実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置１６および１３に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置２０および１３に塩基性アミノ酸を有する。さらに別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは位置１６と２０に塩基性アミノ酸を有する。
【００４６】
本発明はさらに、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される任意の３つの位置の組合せでα−サブユニット中に塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。例えば、塩基性アミノ酸は、位置１１、１３および１４、又は位置１１、１３および１６、又は位置１１、１３および１７、又は位置１１、１３および２０、又は位置１１、１４および１６、又は位置１１、１４および１７、又は位置１１、１４および２０、又は位置１１、１６および１７、又は位置１１、１６および２０、又は位置１１、１７および２０、又は位置１３、１４および１６、又は位置１３、１４および１７、又は位置１３、１４および２０、又は位置１３、１６および１７、又は位置１３、１７および２０、又は位置１４、１６および１７、又は位置１４、１６および２０、又は位置１４、１７および２０、又は位置１６、１７および２０に存在する。本発明の好ましい一実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置１３、１６および２０に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、ホルモンは甲状腺刺激ホルモンである。本発明の別の実施態様では、ホルモンは卵胞刺激ホルモンである。本発明の別の実施態様では、ホルモンは黄体形成ホルモンである。本発明の別の実施態様では、ホルモンは絨毛性性腺刺激ホルモンである。本発明のさらに別の実施態様では、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される任意の３つの位置の塩基性アミノ酸は、リジンである。
【００４７】
本発明はさらに、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択さ
れる位置でα−サブユニット中に少なくとも３つの塩基性アミノ酸を有するヒト甲状腺刺激ホルモンであって、β−サブユニットの位置５８、６３および６９からなる群から選択される少なくとも１つの位置に塩基性アミノ酸を有するものも提供する。本発明の一実施態様では、甲状腺刺激ホルモンはβ−サブユニットの位置５８に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、甲状腺刺激ホルモンはβ−サブユニットの位置６３に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、甲状腺刺激ホルモンはβ−サブユニットの位置６９に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、甲状腺刺激ホルモンは、β−サブユニットの位置５８、６３および６９の各々に塩基性アミノ酸を有する。本発明のさらに別の実施態様では、β−サブユニットの位置５８、６３および６９からなる群から選択される少なくとも１つの位置での塩基性アミノ酸は、アルギニンである。
【００４８】
本発明はさらに、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される任意の４つの位置のすべての組合せでα−サブユニット中に塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。当業者は、考えられる利用可能な組合せを容易に決定するであろう。一実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは位置１１、１３、１６および２０に塩基性アミノ酸を有する。別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは位置１１、１３、１７および２０に塩基性アミノ酸を有する。別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは位置１３、１４、１７および２０に塩基性アミノ酸を有する。好ましい実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは位置１３、１４、１６および２０に塩基性アミノ酸を有する。本発明のさらに別の実施態様では、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される任意の４つの位置の塩基性アミノ酸は、リジンである。
【００４９】
本発明はさらに、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される任意の５つの位置のすべての組合せでα−サブユニット中に塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。当業者は、考えられる利用可能な組合せを容易に決定するであろう。一実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは位置１３、１４、１６、１７および２０に塩基性アミノ酸を有する。別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは位置１１、１３、１４、１６および２０に塩基性アミノ酸を有する。本発明のさらに別の実施態様では、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される任意の５つの位置の塩基性アミノ酸は、リジンおよびアルギニンからなる群から選択される。
【００５０】
本発明はさらに、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０の６つの位置のすべておいてα−サブユニット中に塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。
【００５１】
別の態様では、本発明は位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される少なくとも１つの位置でα−サブユニット中に塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンであって、このホルモンはヒト甲状腺刺激ホルモンであり、β−サブユニットの位置５８、６３および６９からなる群から選択される少なくとも１つの位置に塩基性アミノ酸が存在するものを提供する。本発明の一実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンはヒト甲状腺刺激ホルモンのβ−サブユニットの位置５８に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンはヒト甲状腺刺激ホルモンのβ−サブユニットの位置６３に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンはヒト甲状腺刺激ホルモンのβ−サブユニットの位置６９に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、ヒト甲状腺刺激ホルモンのβ−サブユニットの位置５８、６３および６９の各々に塩基性アミノ酸を有する。本発明のさらに別の実施態様では、位置５８、６３および６９からなる群から選択される位置での塩基性アミノ酸は、アルギニンである。
【００５２】
別の態様では、本発明はヒト卵胞刺激ホルモン、ヒト黄体形成ホルモン又はヒト絨毛性性腺刺激ホルモンである糖タンパク質ホルモンであって、ヒト甲状腺刺激ホルモンのβ−サブユニットの位置５８、６３および６９に対応する、いずれか糖タンパク質ホルモンのβ−サブユニット中の位置からなる群から選択される少なくとも１つの位置に塩基性アミノ酸を含有するものを提供する。このアプローチは、非ヒトにも等しく当てはまる。例えば、２つのウシ糖タンパク質ホルモンのβ−サブユニットアミノ酸配列を比較して、配列の相違に基づいて、あらゆるサブユニットに対して置換がなされ得る。
【００５３】
他の糖タンパク質ホルモンのβ−サブユニットのどの部位がヒト甲状腺刺激ホルモンのβ−サブユニットの位置５８、６３および６９に対応するかを、当業者は容易に決定し得る。例えば、Ward，et al.,:Bellet，D and Bidard，J.M.（eds）"Structure-function relationships of gonadotropins"Serono Symposium Publications，Raven Press，New York，65:1-19（1990）を参照。ここでは、２６の種々の糖タンパク質ホルモンβ−サブユニットのアミノ酸配列が並べられ、比較されている。したがって、当業者は、他の糖タンパク質ホルモンのこれらの部位の非塩基性アミノ酸を塩基性アミノ酸に容易に置換し得る。
【００５４】
同様に、本発明は、糖タンパク質ホルモンが、他のいずれかのヒト糖タンパク質ホルモンの同一位置に対応する、糖タンパク質ホルモンのβ−サブユニット中の位置からなる群から選択される少なくとも１つの位置に塩基性アミノ酸を有するあらゆるヒト糖タンパク質を提供する。例えばヒト黄体形成ホルモンおよびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβ−サブユニットのアミノ酸配列を比較し、２つのβ−サブユニット間のアミノ酸の相違に基づいて、これらのいずれかの糖タンパク質ホルモンの選択部位で置換を成し得る。このアプローチは、非ヒトにも等しく当てはまる。
【００５５】
本発明はさらに、野生型ヒト糖タンパク質を上回る活性を示す修飾ヒト糖タンパク質であって、野生型ヒト糖タンパク質を上回る活性を示す非ヒト糖タンパク質ホルモンの塩基性アミノ酸の位置に対応する位置で置換される同一のアミノ酸を含有するものを提供する。
【００５６】
野生型ヒト糖タンパク質を上回る活性を有する非ヒト糖タンパク質ホルモンは、あらゆる非ヒト種であることができる。例えば、非ヒト種はウシであってもよい。（例えば、Benua，R.S.，et al.，"An 18 year study of the use of beef thyrotropin to increase I-131 uptake in metastatic thyroid cancer．"J.Nucl．Med．5:796-801（1964）およびHershman，J.M.,et al.，"Serum thyrotropin（TSH）levels after thyroid ablation compared with TSH levels after exogenous bovine TSH:implications for I-131 treatment of thyroid carcinoma."J．Clin．Endocrinol．Metab．34:814-818（1972）参照）。あるいは、非ヒト種はウマ、ブタ、ヒツジ等であることもできる。本明細書中の実施例には、２７の種の１０〜２１のアミノ酸領域の配列が記載されている。
【００５７】
本発明はさらに、同一の種由来の野生型糖タンパク質ホルモンを上回る活性を示す修飾糖タンパク質ホルモンであって、野生型糖タンパク質ホルモンを上回る活性を示す別の種からの糖タンパク質ホルモンの塩基性アミノ酸の位置に対応する位置に置換された同一のアミノ酸を含有するものを提供する。したがって、その活性を増大するよう修飾されている糖タンパク質は、非ヒト種由来のものである。例えば、ブタ糖タンパク質ホルモンをウシ糖タンパク質ホルモンと比較して、ブタとウシの配列が異なる位置にアミノ酸置換を有するブタ糖タンパク質ホルモンを設計し、選択された変化を有するブタ糖タンパク質ホルモンを構築し、修飾ブタ糖タンパク質ホルモンをブタに投与し得る。あるいは、修飾される糖タンパク質はウシのものであってもよい。
【００５８】
本発明はさらに、同一の種由来の野生型糖タンパク質ホルモンを上回る活性を有する修飾糖タンパク質ホルモンであって、修飾糖タンパク質ホルモンは、野生型糖タンパク質ホルモンを上回る活性を示す同一種由来の異なる糖タンパク質ホルモンの塩基性アミノ酸の位置に対応する位置に置換された同一のアミノ酸を含有するものを提供する。例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン及びヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットを比較して、あらゆる配列多様性に基づいて、これらのβサブユニットのいずれかにもアミノ酸置換を成し得る。当然、ホルモン受容体特異性は依然として保持される必要があるため、修飾糖タンパク質ホルモンの活性を一般的に増大又は低減する変化だけが意図される。このようなβサブユニット修飾の例は本明細書に含まれる実施例に説明されており、そこでは、塩基性アミノ酸は、ヒト甲状腺刺激ホルモンとヒト絨毛性性腺刺激ホルモンとの間の配列比較に基づいて、ヒト甲状腺刺激ホルモンの位置５８及び６３で置換される。
【００５９】
修飾は、野生型糖タンパク質の単数又は複数の任意の特定位置の非塩基性アミノ酸の塩基性アミノ酸による置換をいう。本発明の好ましい実施態様では、これらの修飾は非塩基性アミノ酸をリジンで置換することを包含する。
【００６０】
野生型糖タンパク質ホルモンに対する単数又は複数の修飾の効果は、多数の方法で確認できる。例えば、修飾糖タンパク質でトランスフェクトされた細胞中での環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）産生が測定され、野生型糖タンパク質ホルモンでトランスフェクトされた同様の細胞のｃＡＭＰ産生と比較できる。あるいは、修飾糖タンパク質でトランスフェクトされた細胞中のプロゲステロン産生が測定され、野生型糖タンパク質ホルモンでトランスフェクトされた同様の細胞のプロゲステロン産生と比較できる。あるいは、修飾糖タンパク質ホルモンの活性が受容体結合アッセイ、チミジン取込みアッセイ、又はＴ4分泌アッセイにより測定できる。修飾糖タンパク質ホルモンの活性を測定するためのこのようなアッセイの具体例は、本明細書中の実施例の項に記載されている。当業者は、野生型又は修飾糖タンパク質ホルモンのいずれかの活性を測定するために用いるためのあらゆる適切なアッセイを容易に決定し得る。
【００６１】
本発明の一実施態様では、修飾糖タンパク質ホルモンは野生型糖タンパク質ホルモンの活性の少なくとも３倍の活性を有する。この活性増大は、前記の、そして本明細書中の実施例に説明されたいずれかの技法により、あるいは当業者が容易に確定するようなその他の任意の適切なアッセイで、測定される。活性は、もちろん変化するので、アッセイ毎に又は細胞系毎に一致しなければならないというわけではない。例えば、本明細書中の実施例の項に記載したように、ヒト糖タンパク質ホルモンのαサブユニット中のＰ１６Ｋ突然変異の相対的効力は、ｃＡＭＰアッセイで野生型糖タンパク質ホルモンの活性と比較した場合、約６．４倍高かった。しかしながら、プロゲステロン放出アッセイでは、効力は約３．４倍、Ｖｍａｘは１．６倍であった。この特異的修飾は、少なくとも１つのアッセイでは、少なくとも約３倍の活性を示し、したがって少なくとも３倍の活性を有する糖タンパク質を示す。
【００６２】
別のアミノ酸位置を修飾するために、ヒト及び非ヒト由来の糖タンパク質ホルモン配列を標準的コンピューターソフトウエアプログラム、例えばＤＮＡＳＩＳ（Hitachi Software Engineering Co．Ltd.）を用いて整列させることができる。ヒト及び非ヒト糖タンパク質ホルモンの間で異なるアミノ酸残基を、次に、前記の技法を用いて置換し、その結果生じた糖タンパク質ホルモンを、前記のアッセイの１つを用いてアッセイする。
【００６３】
治療される又は修飾糖タンパク質ホルモンを投与される対象は、ヒト又はあらゆる非ヒト哺乳類であり得る。例えば、修飾糖タンパク質ホルモンスーパーアゴニストは、これらの糖タンパク質ホルモンをウシに投与することによりウシの過排卵に用い得る。
【００６４】
単数又は複数のあらゆる特定位置の非塩基性アミノ酸を塩基性アミノ酸に置換するのに用いられる方法は、糖タンパク質ホルモンアンタゴニストを設計するためにも用い得る。特異的置換を行い、これらの修飾糖タンパク質ホルモンの活性をモニタリングすることにより、修飾が活性低減を示す糖タンパク質ホルモンを産生したか否かを決定し得る。これらの糖タンパク質ホルモンアゴニストは、受容体代謝回転率、糖タンパク質ホルモンに対する受容体親和性といったようなホルモン受容体の試験に、あるいはグレーブズ病の治療といった治療手法、そして受胎能制御に用い得る。
【００６５】
本発明はさらに、治療量の本発明の糖タンパク質ホルモンを対象に投与することを含む、対象における糖タンパク質ホルモン活性に関連した症状の治療方法を提供する。これらの症状には、糖タンパク質ホルモン活性に関連したあらゆる症状が含まれる。これらの症状の例としては、排卵不全(ovalatory disfunction)、黄体期欠損(luteal phase defect)、原因不明不妊(unexplained infertility)、雄性因子不妊(male facter infertility)、時限性受胎(time-limited conception)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
別の例では、糖タンパク質ホルモンは甲状腺癌を診断及び治療するために投与され得る。例えば、ウシＴＳＨのヒト被験者への投与を用いて、甲状腺組織中の131Ｉの取込みを刺激し、甲状腺癌を治療する（Meier，C.A.,et al.，"Diagnostic use of Recombinant Human Thyrotropin in Patients with Thyroid Carcinoma(Phase I/II Study)."J．Clin．Endocrinol．Metabol．78:22（1994））。
【００６７】
当業者は、投与するための、そして重量、サイズ、特定症状の重症度、及び対象それ自体の種類に依っている有効量を容易に決定し得る。治療的有効量は、一般的な最適化法により、容易に決定し得る。本発明は、野生型と比較して活性の増大した糖タンパク質ホルモンを提供する。これらの修飾糖タンパク質ホルモンは、野生型糖タンパク質ホルモンと比較して低用量の投与量で同様の治療効果を達成し得るか、あるいは野生型糖タンパク質ホルモンと同用量で投与されると治療効果の増大を成し遂げ得る。
【００６８】
糖タンパク質ホルモンが経口投与されるか、非経口投与か、又は他の投与方法によるかによって、プロスタグランジンの投与は、固体、半固体又は液体投与形態、例えば錠剤、ピル、カプセル、粉末、液体、クリーム及び懸濁液等、好ましくは正確な用量の供給に適した単位用量形態で行える。糖タンパク質ホルモンは、医薬的に許容可能な担体と組合せた有効量の選択糖タンパク質を含んでもよく、さらに、他の医薬、製剤、担体、アジュバント、希釈剤等を含んでもよい。「医薬的に許容可能」とは、生物学的に又はその他望ましくない物質でないこと、即ち物質が許容不可能な生物学的作用を引き起こしたり、又は許容不可能な形態で糖タンパク質ホルモンと相互作用することなく、選択糖タンパク質ホルモンと一緒に個体に投与され得ることを意味する。このような投与形態を調製する実際的方法は、当業者には公知であるか、又は明らかであろう（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences，latest edition（Mack Publishing Co.，Easton，PA）参照）。
【００６９】
別の態様では、本発明は、補助量の本発明の糖タンパク質ホルモンを投与することを含む、対象の生殖を補助する方法を提供する。例えば、孤立性性腺刺激ホルモン不全（ＩＧＤ）を有する対象では、修飾卵胞刺激ホルモン（フォリトロピン）及び黄体形成ホルモン（ルトロピン）が対象に投与されて、正常な性腺機能を回復する。糖タンパク質ホルモン、例えばＦＳＨ及びＬＨは雌性生殖生理学には欠くことのできないものであり、これらの糖タンパク質ホルモンを対象に投与して、多数の生殖障害を克服し、それにより生殖を補助し得る、ということは当業者には広く公知である。
【００７０】
遺伝子治療は、本発明の修飾糖タンパク質ホルモンを用いてホルモン障害を治療するも
う一つのアプローチである。このアプローチでは、遺伝子が細胞中で発現され、それらの細胞のその後の世代が導入遺伝子を発現できるように、修飾糖タンパク質ホルモンをコードする遺伝子を、例えば生殖系細胞又は体細胞中に導入し得る。例えば、あらゆる特定の性腺刺激ホルモンが卵巣細胞、又はその前駆体中に挿入されて、排卵を増強し得る。あるいは、甲状腺刺激ホルモンのスーパーアゴニストをコードする遺伝子を保有する甲状腺細胞を、甲状腺癌を有する個体に導入すると、甲状腺癌の放射性ヨウ素取込みを刺激するためのＴＳＨの継続投与の必要がなくなる。コード配列を送達するのに適したベクターは、当業界で十分公知である。例えば、ベクターは、ウイルス、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス又は非ウイルス、例えば陽イオン性リポソームである。
【００７１】
本発明により提供されるような修飾糖タンパク質ホルモンは、甲状腺組織または性腺組織への治療薬のターゲッティングデリバリーのために、あるいはある種の新生物の治療に用い得る。
【００７２】
さらに別の態様では、本発明はヒトホルモンの超活性非キメラアナログの構築方法であって、別の種由来のより活性なホモログのアミノ酸配列をヒトホルモンと比較し、ヒトホルモン中のアミノ酸を他の種由来の対応するアミノ酸で置換し、置換ヒトホルモンの活性を測定して、置換ヒトホルモンから超活性アナログを選択することを含む方法を提供する。ヒトホルモンの超活性アナログは、その活性が野生型ホルモンの対応する活性を上回るあらゆるアナログを含む。例えば、トレオニンからリジンへの、αサブユニット中の位置１１でのヒト甲状腺刺激ホルモンの修飾（Ｔ１１Ｋ）は、in vitroで培養したＪＰ０９細胞のｃＡＭＰ産生の相対的増大を引き起こす（本明細書中の実施例に記載した表II参照）。したがって、ヒト甲状腺刺激ホルモンのこの修飾は、野生型ヒト甲状腺刺激ホルモンの超活性アナログをもたらす。上記のように、別の種由来のホモログの活性を測定し、その活性をヒトホルモンの活性と比較し、次に配列させた配列を比較してアミノ酸配列の相違を決定し、次に別の種由来のホルモン中の適切なアミノ酸でヒトホルモン中の対応する位置のアミノ酸を置き換え、次に前記の技法の１つにより修飾ヒトホルモンの活性を測定し、そして次に修飾ヒトホルモンの活性を野生型ヒトホルモンと比較して、それにより置換ヒトホルモンから超活性アナログを選択することにより、修飾を作り出すために置換すべき特定の単数又は複数のアミノ酸を決定し得る。
【００７３】
アミノ酸置換のすべての組合せを用いて、糖タンパク質スーパーアゴニストを生成し得る。例えば、中性アミノ酸を塩基性又は酸性アミノ酸で置換し得る。あるいは、塩基性アミノ酸を酸性又は中性アミノ酸で置換するか、あるいは酸性アミノ酸を中性又は塩基性アミノ酸で置換し得る。当業者は、前記のように、あるアミノ酸での別のアミノ酸の置換は、糖タンパク質ホルモン又は糖タンパク質ホルモンの一部をコードするヌクレオチド配列の核酸レベルであるか、あるいはポリペプチドレベルであることを認識できる。ヒトホルモンはすべて、この方法により、そして選択されたその超活性アナログにより修飾される。特に、ヒトホルモンは糖タンパク質ホルモンである。
【実施例】
【００７４】
ヒトαサブユニットのＣｙｓ１０とＰｒｏ２１との間の配列を、突然変異誘発のための一次標的として選択した（図１）。ｈＣＧベースの相同性モデリングは、αサブユニットのこの領域がすべての糖タンパク質ホルモンのβサブユニットから距離があり、いくつかの表面露出残基を含有し、そしてＰｒｏ１６とＳｅｒ１９との間に１回転の３10−ヘリックスを含む、ということを示唆した1。ヒトαサブユニットは位置１１、１３、１６、１７及び２０でウシと異なり（図１ａ）、これらの変化のうちの４つ（Ｔｈｒ１１→Ｌｙｓ、Ｇｌｎ１３→Ｌｙｓ、Ｐｒｏ１６→Ｌｙｓ及びＧｌｎ２０→Ｌｙｓ）は非保存性である。ＰＣＲ増幅を用いて、高等類人猿（チンパンジー−Pan troglodytes、オランウータン−Pongo pygmaeus）、低級類人猿（テナガザル−Hylobates sp.）、旧世界猿（ヒヒPapio
anubis）を含めたいくつかの霊長類のαサブユニット中の１１〜２０領域の配列を決定し、それらを従来公知の哺乳類配列、例えば、アカゲザル（Macaca mulatta;旧世界猿）、マーモセット（Callithrix jacchus;新世界猿）及びヒトと比較した（図１ａ）。異なる種間の同時比較は、この領域の塩基性残基が霊長類進化の相対的に遅い時期に置換された、ということを示唆した。アカゲザルαサブユニットでは、位置１１、１６及び２０のＬｙｓ残基及び位置１３のＡｒｇ残基をコードし2、ヒヒ配列は位置１６のＧｌｎをコードするが、一方テナガザル配列は位置１３にＨｉｓの弱塩基性イミダゾリウム基を１つだけ含有する（図１ａ）
。明らかに、この領域の正荷電アミノ酸のクラスターは脊椎動物進化の間に保持され、修飾されたが、しかし高等類人猿及びヒト配列中には認められない。αサブユニットの１１〜２０領域の正荷電残基の漸進的排除は、旧世界猿からのヒト科動物（ヒト及び類人猿）の進化的分岐と一致する。この領域が受容体との結合を調節し得るという我々の仮説は、以下の事項によりさらに支持された。１）ｂＴＳＨ中のＴｙｒ２１のヨウ素化への最高反応性3、２）ｈＣＧにおける抗原決定因子のマッピング4、３）個々のサブユニットのアシル化5、無水酢酸による標識6及びペジレーション(pegylation)により試験した場合の有効ホルモン−受容体相互反応のためのヒツジ及びヒトαサブユニットのＬｙｓのアミノ基の役割。
【００７５】
したがって、正荷電Ｌｙｓ残基をヒトαサブユニットのＣｙｓ１０〜Ｐｒｏ２１領域に挿入した（図１ｂ）。他の２つの領域もさらに突然変異誘発した（表Ｉ）。ＴＳＨβサブユニットにおける単一非保存性Ｌｅｕ６９→Ａｒｇ突然変異を、同様の配列比較に基づいて作った。
【００７６】
突然変異の効果
野生型（ＷＴ）又は突然変異ヒトα及びｈＴＳＨβ7又はｈＣＧβのｃＤＮＡの種々の組合せでのＣＨＯ−Ｋ１細胞中への同時トランスフェクションは、１４のｈＴＳＨ及び１１のｈＣＧヘテロ二量体の発現を引き起こした（表Ｉ）。多数の他の突然変異誘発試験8,9に対照的に、突然変異体の発現は一般的にＷＴに匹敵するものであった。Ｔ１１Ｋ、Ｑ１３Ｋ、Ｐ１６Ｋ、Ｑ２０Ｋ、Ｑ５０Ｐ及びＱ１３Ｋ＋Ｐ１６Ｋ＋Ｑ２０ＫのｈＴＳＨ α突然変異体は、ＷＴ−ｈＴＳＨより高いレベルで発現された。したがって、これらの進化的に正しいと思われる突然変異はｈＴＳＨ又はｈＣＧ分子の合成を、大規模に損なわなかったが、しかしある場合にはホルモン産生を促すことがある。
【００７７】
種々のバイオアッセイを用いて、ｈＴＳＨ及びｈＣＧ突然変異体の相対的効力及び効率を比較した。ｃＡＭＰ産生を刺激するＷＴ及び突然変異体ｈＴＳＨの能力を、安定トランスフェクト化ヒトＴＳＨ受容体を有するＣＨＯ−ＪＰ０９細胞で試験した。このアッセイは、単一αサブユニット突然変異体における下記の順序の効力を示した。Ｐ１６Ｋ（ＷＴの１／６のＥＣ50）≧Ｑ２０Ｋ＞Ｑ１３Ｋ＞Ｔ１１Ｋ＞ＷＴ−ｈＴＳＨ≒Ｑ５０Ｐ≒Ｒ６７Ｋ（表II）。ＷＴ及び突然変異体ｈＴＳＨの受容体結合活性を、ブタ甲状腺膜に対する競合的結合アッセイで評価した。ｃＡＭＰ刺激と一致して、以下の順序の効力が観察された。Ｐ１６Ｋ（ＷＴの５倍の親和性）＞Ｑ２０Ｋ≧Ｑ１３Ｋ＞Ｔ１１Ｋ＞ＷＴ−ｈＴＳＨ≒Ｑ５０Ｐ≒Ｒ６７Ｋ（表II）。したがって、ＪＰ０９細胞で観察された単一突然変異体の効力の増大は、ＴＳＨ受容体に対する親和性の増大と直接相関した。最も注目すべきことには、１１〜２０領域におけるＬｙｓ残基への各突然変異は活性の実質的増大を引き起こしたが、しかしこの決定的領域の外側の変化は受容体結合親和性及び生物活性に全く（Ｒ６７Ｋ、Ｑ５０Ｐ）影響を及ぼさなかった（表II）。ｈＴＳＨのアミノ酸１３、１６及び２０のアラニン突然変異誘発はホルモン活性を有意に変えなかったが、このことは、他の種の相同性ホルモン中に存在する塩基性アミノ酸の選択的再形成のみが機能的変化を引き起こしたことを示す。さらに、αＳｅｒ４３のＡｒｇへの交換及びαＨｉｓ９０及びαＬｙｓ９１の置換は、これらの残基がｈＴＳＨ生物活性にとってはｈＣＧ生物活性にとっ
て程重要ではなかったということを示し、このことは、塩基性残基のホルモン特異的及び部位特異的役割を強調する9。
【００７８】
組合せ突然変異を有するスーパーアゴニスト
効力の最高増大に別々に関与したＬｙｓ残基の作用をさらに調べるために、多数の置換を含有する突然変異体が作成された。最も活性な突然変異体を図２及び３に示す。二重Ｐｒｏ１６→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ及び三重Ｐｒｏ１６→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ１３→Ｌｙｓ突然変異体は、それぞれＷＴ−ｈＴＳＨの１２及び２４倍の活性を示し、ＴＳＨβサブユニットのＬｅｕ６９→Ａｒｇ置換後は３５倍まで効力がさらに増大した（図２ａ）。Ｇｌｕ１４→Ｌｙｓ置換（マグロ配列中に存在するこの位置のＬｙｓ）を含めた付加的最適化は、９５倍までの生物活性のさらなる増大を引き起こした。これらの最も有効な多重突然変異体は、効能を少なくとも１．５倍上げた（最大反応）（図２ｂ）。これらの増大は、ブタ並びにヒトＴＳＨ受容体に結合してＦＲＴＬ−５細胞（図２ｅ）での増殖並びに培養ヒト甲状腺小胞でのＴ3産生を誘発するｈＴＳＨ突然変異体の能力を試験することにより確認された。特に、Ｐｒｏ１６→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ１３→Ｌｙｓ／ＷＴ−ｈＴＳＨβ及びＰｒｏ１６→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ１３→Ｌｙｓ／Ｌｅｕ６９→Ａｒｇ突然変異体はそれぞれ、ＦＲＴＬ−５細胞における3Ｈ−チミジン取込みの最大刺激の半分を得るためにはＷＴ−ｈＴＳＨの１／１８及び１／２７の濃度を要した（図２ｅ）。ＴＳＨ生物活性に及ぼす多重突然変異の相乗効果は、αサブユニットの１３〜２０領域でのＬｙｓ残基の受容体との局所的共働に限定されなかったが、しかしβサブユニットの反対側ループでのＡｒｇ６９の関与を伴った（表II）。
【００７９】
【表１】
【００８０】
これらの知見は、動物モデルでさらに確認された。マウスにおけるＰｒｏ１６→Ｌｙｓ
、Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ及びＧｌｎ１３→Ｌｙｓ ｈＴＳＨ突然変異体の１回注入は、ＷＴ−ｈＴＳＨより有意に高く血清Ｔ4を増大した。さらに、Ｐｒｏ１６→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ１３→Ｌｙｓ／ＷＴ−ｈＴＳＨβ及びＰｒｏ１６→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ１３→Ｌｙｓ／Ｌｅｕ６９→Ａｒｇ突然変異体も、ＷＴ−ｈＴＳＨと比較して、より高いＴ4レベルを生じた（図２ｆ）。マウスに静注後６時間目のｈＴＳＨ血清レベルは同様で、ｈＴＳＨアナログはＷＴと比較して代謝クリアランス速度に大きな差異を示さなかった。
【００８１】
【表２】
【００８２】
ｈＣＧ及びｈＴＳＨのβサブユニットの配列比較はｈＣＧでの塩基性残基のクラスターを含有する領域（ＴＳＨβでの残基５８〜６９）を示したが、しかしｈＴＳＨでは認められなかった。部位特異的突然変異誘発を用いて、ｈＣＧにおけるそれらの位置に基づいて、ｈＴＳＨ中に単一及び複数の塩基性残基を導入して、さらにｈＴＳＨ βサブユニット突然変異体を作成した。Ｉ５８Ｒ、Ｅ６３Ｒ、Ｉ５８Ｒ＋Ｅ６３Ｒ、Ｉ５８Ｒ＋Ｅ６３Ｒ
＋Ｌ６９Ｒ。突然変異体ｈＴＳＨ βサブユニットをヒトαサブユニットと同時発現させて、組換え体ｈＴＳＨアナログの固有の活性を、ラットＴＨＳ受容体（ＦＲＴＬ−５細胞）及びヒトＴＳＨ受容体（ＣＨＯ−ｈＴＳＨｒ細胞）で試験した。両系において、単一置換（Ｉ５８Ｒ、Ｅ６３Ｒ）はｈＴＳＨの効力を２倍〜４倍増大し、効率のわずかな増大を生じた（図２ｇ）。２つの置換の組合せ（Ｉ５８Ｒ＋Ｅ６３Ｒ）は、野生型ｈＴＳＨの１５倍の効力及び１．５倍の効率を生じた（図２ｇ）。３つの塩基性残基が導入された組合せ突然変異体Ｉ５８Ｒ＋Ｅ６３Ｒ＋Ｌ６９Ｒの能力及び効率は、それぞれ５０倍及び１．７倍上昇した（図２ｇ）。固有活性のこれらの増大は、ＣＨＯ−ＪＰ０９細胞を用いた受容体−結合アッセイで判定した結果、受容体結合親和性の同時増大を伴った（図２ｈ）。同様に、マウスにＩ５８Ｒ＋Ｅ６３Ｒ＋Ｌ６９Ｒ突然変異体を注入すると、それらのＴ4刺激は偽処理(ＭＯＣＫ)又は対照処理マウスより有意に高かった（図２ｉ）。
【００８３】
ＣＧ突然変異体の生物活性を、ＭＡ−１０細胞でのプロゲステロン刺激及びヒトＬＨ／ｈＣＧ受容体でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞でのｃＡＭＰ刺激を用いて試験した。ｈＣＧ Ｌｙｓ突然変異体は、ＷＴ−ｈＣＧより高い能力（低ＥＣ50値）及び高い効率（Ｖmax）を示した（表II、図３ａ）。単一及び多重の突然変異の作用は、ｈＴＳＨ突然変異体に関して観察されたものと相対的に類似した。αＰｒｏ１６→Ｌｙｓ／ＷＴ−ｈＣＧβ突然変異体は、ＭＡ−１０細胞でのプロゲステロン産生の刺激及び受容体結合活性において、ＷＴ−ｈＣＧの４倍活性であり、さらにＰｒｏ１６→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ及びＰｒｏ１６→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ ｈＣＧ＋Ｇｌｎ１３→Ｌｙｓ突然変異体に関する能力及び効率の両方の増大を伴った（図３ａ及び３ｂ）。固有活性の同様の増大は、ヒトＬＨ／ｈＣＧ受容体（ＣＯＳ−７−ｈＬＨ／ｈＣＧ−Ｒ細胞）で試験した場合にも認められた（図３ｃ及び３ｄ）。
【００８４】
これらのデータは、モデルホルモン（例えばｂＴＳＨ）より高いレベルでも、２〜３のアミノ酸置換だけで、糖タンパク質ホルモン生物活性を増大するのに十分であることを示唆した。興味深いことに、ウシ及びヒトのＴＳＨ間の４０の異なる残基のうちの２〜３のみが、ｂＴＳＨの高い生物学的活性に関与すると考えられる。他の置換の大多数は保存性で、αサブユニットでのＲ６７Ｋ突然変異で説明したように、機能的意味を有さないと思われる。これに対照的に、αサブユニットのＬ１ループ及びβ１鎖中にクラスター形成する表面局在ＬｙｓはｂＴＳＨの高い生物活性に関して極めて重大である、ということが示される。したがって、２つの突然変異アミノ酸（Ｐ１６Ｋ＋Ｑ２０Ｋ）のみを有する組換え体ｈＴＳＨは、ｂＴＳＨに匹敵する固有の活性を得る（表II）。さらに、三重、四重及び五重ｈＴＳＨ突然変異体は、ｂＴＳＨより高い能力さえ示す。これらのデータは、ｂＴＳＨとｈＴＳＨとの間の活性の差が、活性を増大する置換を含めたいくつかのアミノ酸変化の結果であるが、しかし他のものはｈＴＳＨ受容体でのｂＴＳＨの生物能力を低減し得る、ということを示唆する。
【００８５】
しかし、いくつかの受容体種が単一トランスフェクト化ｃＤＮＡから作られる（隠れた部位からの代替的スプライシングにより、又は翻訳後修飾により）という可能性を排除できないけれども、活性の同様の差異が異なる細胞系で観察されたという事実は、これらのアナログの効力、効率及び親和性の増大における異なる受容体種の重要性に強く反論するものである。さらに、種々の炭水化物残基を有する天然ホルモンアイソフォームはポスト受容体レベルでそれらの作用を発揮し、受容体結合親和性に全く又は最小度の作用しか及ぼさない10。野生型ホルモン及びそれらのアナログは複数の実験系で特性評価されるため、本明細書に記載した生物活性増大の現象は、受容体の特定細胞依存性変異に関連した例外というよりもむしろ規則であるという可能性が高い。
【００８６】
糖タンパク質ホルモンアナログの合理的設計の見通し
糖タンパク質ホルモンの従来の部位特異的突然変異誘発は、アラニン走査突然変異誘発
11又は多重置換法9のような戦略を用いて、高度保存領域及び残基に主に焦点を当てた。いくつかの重要な研究は、カセット突然変異誘発および／または制限断片交換を用いたキメラサブユニットの作製を基礎にした12、13、14。非保存性残基の他の種に認められる残基への置換を基礎にした我々の戦略は首尾よくいって、生物活性の増大したｈＦＳＨ突然変異体を含めた他の糖タンパク質ホルモンアナログの生成を可能にした。ヒトαサブユニットの１１〜２０領域での塩基性残基の導入によるｈＴＳＨ、ｈＣＧ及びｈＦＳＨの生物活性の平行改良は、この領域がｈＣＧの結晶構造ベースのモデルにおける、そしてｈＴＳＨの我々の相同性モデルにおけるβサブユニットから距離があるという事実に関連がある。両モデルにおけるこの領域の仮想の同定及び１１〜２６領域と結合する抗体がサブユニット組合せに大きな影響を及ぼさないという観察15は、このドメインがすべての糖タンパク質ホルモンで同様に機能することを示唆する。αサブユニットが首尾よく工学処理されてｈＴＳＨ、ｈＣＧ又はｈＦＳＨのより強力なアゴニストを作られさえすれば、同一パラダイムが、それぞれのβサブユニットを修飾するのに用いられて、各糖タンパク質ホルモンの最終的スーパーアゴニストを生成する。例えば、ＴＳＨβユニット中の非極性Ｌｅｕ６９のＡｒｇへの付加的置換は、ｈＴＳＨ生物活性のさらなる増大を引き起こした。さらに、我々のアナログの血漿半減期は、特定の治療的要求に関して改変され得る。
【００８７】
糖タンパク質ホルモンのさらなる設計及び改善としては、ホルモン−受容体複合体の詳細な三次元構造を含む。糖タンパク質ホルモン受容体の正確な構造は解明されていないが、しかしホルモン受容体相互作用のいくつかのモデルが提唱されている15、16、17、18。Jiang等17の最新モデルによれば、αサブユニットのＬ１ループが受容体のトランスメンブラン部分との相互作用に関与する。このループ内の正荷電残基のクラスターはこのような相互作用を増強し、そして受容体中のさらなる再整列を促して、Ｇタンパク質の活性化及びシグナル変換を引き起こすのかもしれない。
【００８８】
材料及び方法
制限酵素、ＤＮＡマーカー及びその他の分子生物学的試薬は、Gibco BRL（Gaithersburg，ＭＤ）又はBoehringer-Mannheim（Indianapolis，ＩＮ）から購入した。細胞培養液、ウシ胎児血清及びＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥは、Gibco BRL（Gaithersburg，ＭＤ）から購入した。ＶｅｎｔＲ ＤＮＡポリメラーゼは、New England Biolabs（Beverly，ＭＡ）から購入した。ｐｃＤＮＡ Ｉ／Ｎｅｏベクター（Invitrogen Corp.，San Diego，ＣＡ）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローニングした全長ヒトα ｃＤＮＡ（８４０ｂｐ）及びｈＣＧ−β遺伝子は、T．H．Ji博士（University of Wyoming，Laramic，ＷＡ）から入手した。最初のイントロンを含有せず、非翻訳第一エキソン及び真正翻訳開始部位を有するｈＴＳＨ−βミニ遺伝子は、我々の実験室で構築された。ｒｈＴＳＨ−Ｇ標準は、Genzyme Corp．(Framingham，MA)からのものであった。安定発現ｈＴＳＨ受容体を有するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｈＴＳＨＲクローンＪＰ０９及びクローンＪＰ２６）は、G．Vassart博士（Universiry of Brussels，Belgium）が提供いただいた。ヒトＬＨ受容体ｃＤＮＡは、T．Minegishi博士（Gunma University，Gunma，Japan）から入手した。ＦＲＴＬ−５細胞は、L．D．Kohn博士（NIDDK，NIH，Bethesda，ＭＤ）のご厚意により得た。ＭＡ−１０細胞は、M．Ascoli博士（University of Iowa，Iowa City，ＩＡ）に提供いただいた。125Ｉ−ｃＡＭＰ及び125Ｉ−ｈＴＳＨは、Hazleton Biologicals（Vienna，ＶＡ）からのものであった。種々の霊長類の血液試料は、Yerkes Regional Primate Research Center（Emory University，Atlanta，ＧＡ）及びAnimal Resources（University of Oklahoma，Oklahoma City，ＯＫ）から入手した。
【００８９】
霊長類αサブユニット配列の確定
チンパンジー（Pan troglodytes）、オランウータン（Pongo pygmaeus）、テナガザル（Hylobates sp.）及びヒヒ（Papio anubis）の全血試料からのゲノムＤＮＡの抽出のために、ＱＩＡａｍｐR血液キット（Qiagen Inc.,Chatsworth，ＣＡ）を用いた。ゲノムＤ
ＮＡをＰＣＲに用いた。使用した合成オリゴヌクレオチドプライマーは、
5'-ＣＣＴＧＡＴＡＧＡＴＴＧＣＣＣＡＧＡＡＴＧＣ-3'（センス）（配列番号１）及び
5'-ＧＴＧＡＴＡＡＴＡＡＣＡＡＧＴＡＣＴＧＣＡＧＴＧ-3'（アンチセンス）（配列番号２）
であって、ヒト糖タンパク質ホルモンの共通αサブユニットをコードする遺伝子のヌクレオチド配列にしたがって合成した19。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ９．０）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２００μＭ ｄＮＴＰ及び２ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Promega Corp.，Madison，ＷＩ）を含有する１００μｌ反応容量中の８００〜１０００ｎｇのゲノムＤＮＡ鋳型及び１０ｐｉｃｏｍｏｌの各プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。反応混合物を鉱油で覆い、各試料を先ず、９５℃で１０分間加熱した。ＰＣＲプログラムは９５℃で１分３０秒間の変性、５５℃で１分３０秒間のアニーリング、及び７２℃で１分間の伸長のサイクルを３２回、その後の７２℃で７分間の最終伸長期間で構成された。次に、反応物を、臭化エチジウムの存在下で、１％アガロースゲル上で直接電気泳動処理した。エキソン３、イントロン３及びエキソン４に及ぶ増幅ＰＣＲ産物（〜７００ｂｐ）を、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ生成キット（Qiagen Inc.,Chatsworth，ＣＡ）を用いて精製し、ＯｒｉｇｉｎａｌＴＡクローニングキット（Invitrogen Corp.，San Diego，ＣＡ）を用いてｐＣＲTMＩＩ中にサブクローニングした。サブクローニング後、又は直接Ｓｅｑｕｅｎａｓｅキット（Ｕ.Ｓ．Biochemical Corp.，Cleveland，ＯＨ）を用いてジデオキシシーケンシングにより、断片の配列を得た。
【００９０】
相同モデリング
モデリングは、ｈＣＧとｈＴＳＨとの間の強い配列相同性によるものである。システインノット残基を対応物にして並べ、同一並びに高度保存性置換のパーセンテージを前記のように算出した1。ｈＣＧとｈＴＳＨの間の配列同一性は５８％、２つのβサブユニット配列の３１％が同一で、別の１７％はβサブユニットの高度保存性変化を含有した。ｈＴＳＨの分子モデルは、Brookhaven Data Bankから得られた結晶座標から得られるｈＣＧモデルの鋳型に依った。全座標操作及びエネルギー計算は、Convexに対しＣＨＡＲＭｍリリース２１．２を用いて実行し、分子グラフパッケージＱＵＡＮＴＡ（バージョン３．３、Molecular Simulation Inc.，University of York，York，英国）を用いて改変した。
【００９１】
部位特異的突然変異誘発
ＰＣＲベースのメガプライマー法21により、ヒトα−ｃＤＮＡ及びｈＴＳＨβミニ遺伝子の突然変異誘発を行った。ＶｅｎｔRＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs，Beverly，ＭＡ）を用いて、増幅を最適化した。ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化後、切断されたＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片を用いて、ＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ Ｉ／Ｎｅｏ（Invitrogen Corp.，San Diego，ＣＡ）中に連結した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐ大腸菌形質転換キット（Invitrogen Corp.）を用いて、ＭＣ１０６／ｐ３大腸菌細胞を形質転換した。ＱＩＡｐｒｅｐ ８プラスミドキット（ＱＩＡＧＥＮ Inc.，Chatsworth，ＣＡ）を多重プラスミドＤＮＡ調製に用いた。ＱＩＡＧＥＮ Ｍｅｇａ及びＭａｘｉ精製プロトコールを用いて、大量のプラスミドＤＮＡを精製した。さらなる突然変異誘発のために鋳型として単一突然変異を用いてα−ｃＤＮＡを含有するプラスミドを用いて、同一方法で、多重突然変異体を作った。サンガーのジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法を用いて二本鎖シーケンシングにより、突然変異を確認した。
【００９２】
組換え体ホルモンの発現
ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ，Rockville，ＭＤ）を、グルタミン及び１０％ＦＢＳ、ペニシリン（５０単位／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するハムのＦ−１２培地中に維持した。プレートの細胞（１００ｍｍ培養皿）をｐｃＤＮＡ Ｉ／ＮＥＯ中の野生型又は突然変異体α−ｃＤＮＡ、及び、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Gibco ＢＲＬ，Gaithersburg，ＭＤ）を用いてｐ（ＬＢ）ＣＭＶベクター7、又はｈＣＧ
β−ｃＤＮＡ8を含有するｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ中に挿入したｈＴＳＨミニ遺伝子で同時トランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクトした細胞をＣＨＯ−無血清培地（ＣＨＯ−ＳＦＭ−ＩＩ，Gibco BRL）に移した。遺伝子挿入物を含有しない発現プラスミドを用いた偽トランスフェクションからの対照培地を含む培地をトランスフェクション後７２時間目に回収し、濃縮して、遠心分離した。アリコートを−２０℃で凍結させ、各アッセイ前に一回だけ解氷した。ＷＴ及び突然変異体ｈＴＳＨを、前記のような四つの異なるイムノアッセイ9を用いて測定し確認した。ＷＴ及び突然変異体ｈＣＧの濃縮物を化学発光アッセイ（ｈＣＧキット、Nichols Institute，San Juan Capistrano，ＣＡ）及び免疫放射能測定アッセイ（ｈＣＧ ＩＲＭＡ、ＩＣＮ，Costa Mesa，ＣＡ）を用いて測定した。
【００９３】
ヒトＴＳＨ受容体を発現するＪＰ０９細胞におけるｃＡＭＰ刺激
ｈＴＳＨ受容体ｃＤＮＡ（ＪＰ０９）で安定的にトランスフェクト処理したＣＨＯ細胞を増殖させて、前記9のようにＷＴ及び突然変異体ｈＴＳＨの連続希釈液と一緒にインキュベートした。培地中に放出されたｃＡＭＰを、ラジオイムノアッセイにより測定した22。等量の総培地タンパク質を、偽対照及びトランスフェクト細胞からのｈＴＳＨ含有試料として用いた。
【００９４】
ヒトＬＨ受容体を発現するＣＯＳ−７細胞におけるｃＡＭＰ刺激
ｈＬＨ受容体ｃＤＮＡで一時的にトランスフェクト処理したＣＨＯ細胞を増殖させて、本質的には前記23と同様にＷＴ及び突然変異体ｈＣＧの連続希釈液と一緒にインキュベートした。培地中に放出されたｃＡＭＰを、ラジオイムノアッセイにより測定した22。等量の総培地タンパク質を、偽対照及びトランスフェクト細胞からのｈＣＧ含有試料として用いた。
【００９５】
ＭＡ−１０細胞におけるプロゲステロン産生刺激
９６ウエル(well)培養プレート中で増殖させた形質転換ネズミＬｅｙｄｉｇ細胞（ＭＡ−１０）を前記24のようにアッセイ培地中で６時間、ＷＴ及び突然変異体ｈＣＧとともにインキュベートした。培地中に放出されたプロゲステロンの量を、ラジオイムノアッセイにより測定した（ＣＴプロゲステロンキット、ＩＣＮBiomedicals，Inc.,Costa Mesa，ＣＡ）。
【００９６】
受容体結合アッセイ
ｈＴＳＨアナログの受容体結合活性を、可溶化ブタ甲状腺膜から125Ｉ−ｂＴＳＨを置き換えるその能力により、アッセイした224。ヒトＴＳＨ受容体との選択アナログの結合活性を、ＪＰ０９細胞を用いて試験した。ｈＣＧアナログのＭＡ−細胞との、そしてヒトＬＨ受容体で一時的にトランスフェクト処理したＣＯＳ−７細胞との結合活性を、前記24のように125Ｉ−ｈＣＧ及びアッセイ培地を用いて測定した。
【００９７】
ＦＲＴＬ−５細胞におけるチミジン取込み刺激
ラット甲状腺細胞（ＦＲＴＬ−５）の増殖を、前記22のようにモニタリングした。
【００９８】
マウスにおけるＴ4分泌の刺激
ＷＴ及び突然変異体ＴＳＨのin vivo生物活性を、マッケンジーのバイオアッセイ22,25の変法を用いて測定した。ＷＴ及び突然変異体ＴＳＨを、６日間、飲料水中に３μｇ／ｍｌのＴ3を投与することにより予め内因性ＴＳＨを抑制した雄アルビノＳｗｉｓｓ Ｃｒ１：ＣＦ−１マウス中に腹腔内投与した。６時間後に眼窩洞から血液試料を採取し、血清Ｔ4及びＴＳＨレベルをそれぞれ化学発光アッセイ（Nichols Institute）により測定した。
【００９９】
本出願を通して、種々の刊行物を参照した。ある刊行物は括弧内に番号を付けて示した
。全参照文献に番号を振って、下記に列挙する。本発明が属する分野の状態をより詳細に説明するために、これらの記載内容は、参照により、本明細書中に含める。
【０１００】
本発明の範囲及び精神を逸脱しない限り、種々の修正及び変更をなし得ることは、当業者には明らかである。本発明の他の実施態様は、本出願中に開示した本発明の明細及び実行を考慮すれば、当業者には明らかになる。説明及び実施例は、例示のためだけのものであり、本発明の真の範囲及び精神は以下の請求の範囲に示されるものとする。
【０１０１】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、２７の異なる種からのα−サブユニットの関連一次配列の比較を示す。（ａ）ＧｅｎＢａｎｋ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴおよびＰＤＢデータバンクから取得した、チンパンジー、オランウータン、テナガザルおよびヒヒ（下線）のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅断片のシーケンシングから得られたサブユニット配列を整列させた。配列の番号は、ヒトα−サブユニット配列のものに対応する。横線（‐‐‐）は、ヒトα−サブユニットのものと同一のアミノ酸残基を示す。異なる種間での保存されたリジン残基が太字で示されている。本研究で決定された霊長類配列には下線を施した。ヒト、チンパンジーおよびオランウータンのα−サブユニット配列は、種々の脊椎動物種における相対的に高度の類似性に拘わらず、この領域に塩基性アミノ酸を含有しない配列である。（ｂ）この領域に作られるヒト配列の突然変異は、すべての非ヒト哺乳類配列中に存在する単一および多数のＬｙｓ残基の導入を含んだ。さらに、残基１３、１６および２０のアラニンへの突然変異を用いて、Ｇｌｎ１３、Ｐｒｏ１６およびＧｌｎ２０の役割を調べた。
【図２ａ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ａ，ｂ）ＣＨＯ−ＪＰ０９細胞におけるｃＡＭＰ刺激。データは、３回（ａ）および２回（ｂ）繰り返した代表的な実験からの３重の測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【図２ｂ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ａ，ｂ）ＣＨＯ−ＪＰ０９細胞におけるｃＡＭＰ刺激。データは、３回（ａ）および２回（ｂ）繰り返した代表的な実験からの３重の測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【図２ｃ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ｃ，ｄ）ＣＨＯ−ＪＰ０９細胞に対する受容体結合活性。それぞれ図２ａおよび図２ｂの場合と同一の突然変異体を試験した。値は、２回繰り返した一実験からの４重の測定値の平均±ＳＥＭである。
【図２ｄ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ｃ，ｄ）ＣＨＯ−ＪＰ０９細胞に対する受容体結合活性。それぞれ図２ａおよび図２ｂの場合と同一の突然変異体を試験した。値は、２回繰り返した一実験からの４重の測定値の平均±ＳＥＭである。
【図２ｅ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ｅ）ＦＲＴＬ−５細胞におけるチミジン取込み刺激。値は、２回繰り返した一実験からの４重の測定値の平均±ＳＥＭである。
【図２ｆ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ｆ）マウスにおけるＴ4分泌の刺激。各データポイントは、２回繰り返したそれぞれの実験の４〜５匹の動物からの値の平均±ＳＥＭを示す。
【図２ｇ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ｇ）ＣＨＯ−ｈＴＳＨ細胞におけるｃＡＭＰ刺激。データは、３回繰り返したそれぞれの実験からの３〜４重測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【図２ｈ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ｈ）ＣＨＯ−ＪＰ０９細胞における受容体結合活性。データは、３回繰り返したそれぞれの実験からの３〜４重測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【図２ｉ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ｉ）マウスにおけるＴ4分泌の刺激。各データポイントは、２回繰り返したそれぞれの実験の４〜５匹の動物からの値の平均±ＳＥＭを示す。
【図３ａ】図３は、最も効力のあるｈＣＧアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。ＭＡ−１０細胞におけるプロゲステロン産生刺激（ａ）および受容体結合アッセイ（ｂ）。データは、データは、３回繰り返したそれぞれの実験からの３重測定値の平均±ＳＥＭを示す。プロゲステロンの相対的最大産生レベルを表IIに、ＷＴ−ｈＣＧで得られた値の％として示す。
【図３ｂ】図３は、最も効力のあるｈＣＧアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。ＭＡ−１０細胞におけるプロゲステロン産生刺激（ａ）および受容体結合アッセイ（ｂ）。データは、データは、３回繰り返したそれぞれの実験からの３重測定値の平均±ＳＥＭを示す。プロゲステロンの相対的最大産生レベルを表IIに、ＷＴ−ｈＣＧで得られた値の％として示す。
【図３ｃ】図３は、最も効力のあるｈＣＧアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。ｈＬＨ受容体を発現するＣＯＳ−７細胞におけるｃＡＭＰ刺激（ｃ）および受容体結合アッセイ（ｄ）。データは、２回繰り返したそれぞれの実験からの３重測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【図３ｄ】図３は、最も効力のあるｈＣＧアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。ｈＬＨ受容体を発現するＣＯＳ−７細胞におけるｃＡＭＰ刺激（ｃ）および受容体結合アッセイ（ｄ）。データは、２回繰り返したそれぞれの実験からの３重測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、概して、修飾糖タンパク質ホルモンに関する。特に本発明は、スーパーアゴニスト活性を生じるヒト糖タンパク質に対する修飾に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
チロトロピン（甲状腺刺激ホルモン、ＴＳＨ）およびゴナドトロピン、絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）、ルトロピン（黄体形成ホルモン、ＬＨ）、並びにフォリトロピン（卵胞刺激ホルモン、ＦＳＨ）は、糖タンパク質ホルモンのファミリーを構成する。各ホルモンは、２つの非共有結合サブユニットであるαおよびβのヘテロ二量体である。同一種内では、α−サブユニットのアミノ酸配列は全ホルモンで同一であり、一方β−サブユニットの配列はホルモン特異的である（Pierce，J．G．and Parsons，T.F．"Glycoprotein hormones:strcture and function."Ann．Rev．Biochem．50:465-495（1981））。サブユニットの配列が魚類から哺乳類まで高度に保存されているという事実は、これらのホルモンが共通の先祖タンパク質から進化したことを意味する（Fontaine Y-A．and Burzawa-Gerard，E．"Esquisse de l'evolution des hormones gonadotopes et threotropes des vertebres."Gen．Comp．Endocrinol．32:341-347（1977））。これらのホルモンの進化的変化は、ある場合に生物学的活性の修飾を引き起こした（Licht，P．et al.，"Evolution of gonadotropin structure and function."Rec．Progr．Horm．Res.，33:169-248（1977）およびCombarnous，Y．"Molecular basis of the specificity of binding of glycoprotein hormones to their receptors."Endocrine Rev．13:670-691（1992））が、生物作用を調節する特異的構造的決定因子は明らかにされていない。例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ｈＴＳＨ）およびウシ甲状腺刺激ホルモン（ｂＴＳＨ）は、α（７０％）およびβ（８９％）サブユニット配列において高度な相同性を有するが、ｂＴＳＨはｈＴＳＨより６〜１０倍効力がある（Yamazaki，K．et al.，"Potentthyrotropic activity of human chorionic gonadotropin variants in terms of 125I incorporatin and de novo synthesized thyroid hormone release in human thyroid follicles."J．Clin．Endocrinol．Metab．80:473-479（1995））。
【０００３】
糖タンパク質ホルモンは、ある種の治療、例えば甲状腺癌患者の治療においては、極めて重要である（例えば、Meier，C.A.,et al.，"Diagnostic use of Recombinant Human Thyrotropin in Patients with Thyroid Carcinoma(Phase I/II Study)．"J．Clin．Endocrinol．Metabol．78:22（1994）参照）。この疾患の治療におけるヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の使用の可能性は、クロイツフェルト−ヤコブ病の伝染のおそれがあるために、断念された。ヒトＴＳＨの使用に代わるものとしてはウシＴＳＨの使用があるが、しかしこのアプローチは、このホルモンが副作用、例えば悪心、嘔吐、局所性硬化、じんま疹、および比較的高い可能性でアナフィラキシー性ショックを引き起こすために、非常に限定される（Meier，C.A.等）。尿中性腺刺激ホルモンの生体整合性の欠如および組換え糖タンパク質ホルモンの効能限定は、それらをより有効な組換えアナログに置き換える理由となる。したがって、ヒト由来糖タンパク質ホルモン、並びにこれらのホルモンのアゴニストの必要性がある。
【０００４】
例えば、特定の臨床状態、例えば甲状腺癌における甲状腺刺激ホルモンのアゴニストの投与は、放射性ヨウ素の癌への取込みを増強して、疾病を治療する。甲状腺刺激ホルモンのアゴニストは、より多量の放射性ヨウ素を癌に対して向け、それにより一層有効な治療
をもたらす。あるいは、排卵を誘発するために用いられる糖タンパク質ホルモンは、スーパーアゴニストに置き換えられる。これは、今日、受精能治療における大きな医学的問題であるホルモンの必要量を低下させる（Ben-Rafael，Z.,et al.，"Pharmacokinetics of follicle-stimulating hormone:clinical significance."Fertility and Sterility 63:689（1995））。野生型卵胞刺激ホルモンの使用が、多胎妊娠および流産の過刺激および高率を、明らかに多数の卵胞を刺激する多数のホルモン分子によりもたらしている場合には、卵胞刺激ホルモンのスーパーアゴニストを投与して不妊を治療し得る。この修飾ホルモンのアゴニストの使用は、少数のホルモン分子を投与して所望の結果を達成し得るために、多数の卵胞の刺激頻度を低くし得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、初めて、in vitroおよびin vivo生物活性の両方の大きな増大を示すヒト糖タンパク質ホルモンアナログを生じるヒト糖タンパク質ホルモンの特定のアミノ酸置換を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本明細書中に具体化され、広範に説明されているような本発明の目的により、本発明は、一態様では、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される位置でα−サブユニット中に少なくとも３つの塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。
【０００７】
本発明はさらに、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される位置でα−サブユニット中に少なくとも１つの塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、野生型ヒト糖タンパク質を上回る活性を有する修飾ヒト糖タンパク質ホルモンであって、野生型ヒト糖タンパク質を上回る活性を有する非ヒト糖タンパク質ホルモンの塩基性アミノ酸の位置に対応する位置に置換された同一のアミノ酸を有する修飾ヒトホルモンを提供する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、対象の糖タンパク質ホルモン活性に関連した症状を治療する方法であって、患者に治療量の本発明の糖タンパク質ホルモンを投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、ヒトホルモンの超活性(superactive)非キメラアナログを構築する方法であって、別の種由来のより活性なホモログのアミノ酸配列をヒトホルモンと比較し、ヒトホルモン中のアミノ酸を他の種由来の対応するアミノ酸で置換し、置換ヒトホルモンの活性を測定し、そして置換ヒトホルモンから超活性アナログを選択することを含む方法を提供する。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明は、修飾糖タンパク質ホルモンをコードする核酸を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、本発明の好ましい実施態様の下記の詳細な説明およびそこに含まれる実施例を、そして図面およびそれらについての前述のおよび後述の説明を参照することにより、さらに容易に理解される。
【００１３】
本発明の化合物、組成物および方法を開示し、説明するに先立って、本発明は特定のホルモン、特定の対象、即ちヒト及び非ヒト哺乳類、特定のアミノ酸、特定の臨床症状、特定のアナログ、又は、特定の方法に限定されず、当然のことととして変更しうる、と理解されるべきであり、そして多数のその修正および変更は当業者には明らかである。さらに本明細書中に用いられる用語は、特定の実施態様のみを説明するためのものであり、限定を意図するものではない。
【００１４】
本明細書および請求の範囲において、単語は、それが用いられる情況によって、１つ又はそれ以上のそれを意味する。したがって、例えば「ヒト糖タンパク質ホルモン」を例に取ると、これは少なくとも１つのヒト糖タンパク質ホルモンが用いられることを意味する。
【００１５】
一態様では、本発明は、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される位置でα−サブユニット中に少なくとも３つの塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。
【００１６】
本発明はさらに、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される位置でα−サブユニット中に少なくとも１つの塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、野生型ヒト糖タンパク質を上回る活性を有する修飾ヒト糖タンパク質ホルモンであって、野生型ヒト糖タンパク質を上回る活性を有する非ヒト糖タンパク質ホルモンの塩基性アミノ酸位置に対応する位置に置換された同一のアミノ酸を有する修飾ヒトホルモンを提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、対象の糖タンパク質ホルモン活性に関連した症状を治療する方法であって、患者に治療量の本発明の糖タンパク質ホルモンを投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、対象の生殖を補助する方法であって、補助量の本発明の糖タンパク質ホルモンを投与することを含む方法を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、ヒトホルモンの超活性非キメラアナログを構築する方法であって、別の種由来のより活性なホモログのアミノ酸配列をヒトホルモンと比較し、ヒトホルモン中のアミノ酸を他の種由来の対応するアミノ酸で置換し、置換ヒトホルモンの活性を測定し、そして置換ヒトホルモンから超活性アナログを選択することを包含する方法を提供する。
【００２１】
「ヒト」糖タンパク質ホルモンとは、野生型配列中で成されるアミノ酸置換の数がヒトと別の種との間の対応するポリペプチドホルモン中の対応する位置でのアミノ酸の相違の数の１／２を超えないことを意味する。したがって、修飾ポリペプチドホルモンは、アミノ酸コード配列に基づいて、そのアミノ酸置換が得られる非ヒト種由来の対応するポリペプチドホルモンよりヒトの野生型ポリペプチドホルモンに似ていると考えられる。例えば、ヒト糖タンパク質とウシ糖タンパク質ホルモンとの間で対応する糖タンパク質ホルモンの対応する位置に総数２０のアミノ酸の相違が存在した場合、「ヒト」糖タンパク質ホルモンは、そのアミノ酸配列内に、ウシアミノ酸配列中の対応するアミノ酸と相同である１０又はそれ以下のアミノ酸置換を含有する修飾野生型ヒトホルモンである。より具体的には、甲状腺刺激ホルモンは、本明細書中に含まれる実施例に記載するように、ヒトおよびウシホモログのα−およびβ−サブユニット間の計４０のアミノ酸の相違のうち２０又は
それ以上がヒト甲状腺刺激ホルモン中の対応する位置のアミノ酸と相同であるならば、「ヒト」のものと考えられる。
【００２２】
修飾糖タンパク質ホルモンの受容者がヒトである場合の修飾糖タンパク質ホルモンの投与に対する悪い免疫反応の危険性のために、修飾糖タンパク質ホルモンは、好ましくは、スーパーアゴニスト活性の許容不可能な損失を伴わずに考え得る最大程度にヒトアミノ酸配列と相同性を有する。あるいは、修飾糖タンパク質を投与される対象が非ヒトである場合、修飾糖タンパク質ホルモンは、好ましくは、スーパーアゴニスト活性の許容不可能な損失を伴わずに考え得る最大程度に特定の非ヒトアミノ酸配列と相同性を有する。したがって、本発明の好ましい実施態様において、特定のアミノ酸を置換することにより野生型糖タンパク質を修飾してスーパーアゴニスト活性を有する修飾糖タンパク質を構築する場合には、アゴニスト活性を増大しない置換アミノ酸は、その数が１０以下、特に９、８、７、６、５、４、３および２又は０となる。
【００２３】
同様に、「非キメラ」とは、アミノ酸置換基の数が種間の対応するポリペプチドホルモンの対応する位置でのアミノ酸の相違の数の１／２を超えず、したがって修飾ポリペプチドホルモンは、アミノ酸コード配列に基づいて、そのアミノ酸置換が得られる種由来の対応するポリペプチドホルモンより修飾される種の野生型ポリペプチドホルモンに似ていると考えられる。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明は修飾糖タンパク質ホルモンをコードする核酸を提供する。
【００２５】
糖タンパク質ホルモンは、種に共通のα−サブユニットと各ホルモンに生物学的特異性を付与する種で異なるβ−サブユニットとからなる構造的に関連したヘテロ二量体であるホルモンのファミリーを包含する。糖タンパク質ホルモンの一般的概説に関しては、Pierce，J.G．et al.，"Glycoprotein hormones:structure and function."Ann．Rev．Biochem．50:465-495（1981）、及び、Combarnous，Y．"Molecular basis of the specificity of binding of glycoprotein hormones to their receptors．"Endocrine Rev．13:670-691（1992）を参照。このファミリーのホルモンとしては、絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）、ルトロピン（黄体形成ホルモン、ＬＨ）、フォリトロピン（卵胞刺激ホルモン、ＦＳＨ）およびチロトロピン（甲状腺刺激ホルモン、ＴＳＨ）が挙げられる。位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される位置でα−サブユニット中に少なくとも１つの塩基性アミノ酸を有するこれらの糖タンパク質ホルモンは各々、本発明により提供される。
【００２６】
塩基性アミノ酸は、アミノ酸のリジン、アルギニンおよびヒスチジン、並びにこれら３つのアミノ酸のいずれかに対する修飾体であるあらゆる他の塩基性アミノ酸、普通は天然には見出されない合成塩基性アミノ酸、又は中性ｐＨで正に荷電するあらゆる他のアミノ酸を含む。
【００２７】
本発明により提供される糖タンパク質ホルモンは、いくつもの方法で得られる。例えば、糖タンパク質ホルモンをコードするＤＮＡ分子は、普通に見出される生物体から単離できる。例えば、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーが構築され、当該核酸の存在に関してスクリーニングされる。このようなライブラリーの構築およびスクリーニングの方法は当業界では十分公知であり、構築およびスクリーニング工程を実行するためのキットが市販されている（例えば、Stratagene Cloning Systems，La Jolla，ＣＡ）。一旦単離されると、核酸は適切なベクターに直接クローニングされるか、必要な場合には、その後のクローニング工程を促進するよう修飾される。このような修飾工程は一般的なことで、その一例としては、制限部位を含有するオリゴヌクレオチドリンカーの核酸末端への付加が
ある。一般的方法は、Sambrook et al.，"Molecular Cloning，a Laboratory Manual,"Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）に記載されている。
【００２８】
所望の糖タンパク質ホルモンの核酸配列が一旦得られれば、塩基性アミノ酸は、当業界で十分公知の技法により、あらゆる特定アミノ酸位置に配置させることができる。例えば、単数又は複数のアミノ酸位置に渡り、そして非塩基性アミノ酸を塩基性アミノ酸に置換し得るＰＣＲプライマーを設計することができる。次に、糖タンパク質ホルモンのあらゆる位置での塩基性アミノ酸の考え得る多数の組合せのいずれかを得るために、核酸が増幅されて野生型糖タンパク質ホルモンコード配列中に挿入される。あるいは、当業者は、点突然変異誘発のための技法により特定の核酸配列中のあらゆる点に特定の突然変異を導入し得る。一般的方法は、Smith，M．"In vitro mutagenesis"Ann．Rev．Gen.，19:423-462（1985）およびZoller，M.J．"New molecular biology methods for protein engineering"Curr．Opin．struct．Biol.，1:605-610（1991）に記載されている。
【００２９】
特定の糖タンパク質ホルモンをコードするＤＮＡ分子を得る方法の別の例は、糖タンパク質ホルモンをコードする組換えＤＮＡ分子を合成することである。例えば、オリゴヌクレオチド合成法は当業界では一般的なことであり、特定のタンパク質領域をコードするオリゴヌクレオチドは、自動化ＤＮＡ合成により容易に得られる。二本鎖分子の一本鎖のための核酸は、合成し、その相補的鎖とハイブリダイズさせ得る。結果的に生じる二本鎖分子が適切なベクター中へのクローニングのための内部制限部位又は末端での適切な５'又は３'オーバーハングを有するように、これらのオリゴヌクレオチドを設計し得る。比較的大型のタンパク質をコードする二本鎖分子は、タンパク質の特定領域をコードするいくつかの異なる二本鎖分子を先ず構築し、その後これらのＤＮＡ分子を一緒に連結することにより、容易に合成することができる。例えば、Cunningham等（"Receptor and Antibody
Epitopes in Human Growth Hormone Identified by Homolog-Scanning Mutagenesis,"Science，243:1330-1336（1989））は、重複および相補的合成オリゴヌクレオチドを先ず構築し、そしてこれらの断片を一緒に連結することにより、ヒト成長ホルモン遺伝子をコードする合成遺伝子を構築した。合成オリゴヌクレオチドからの１０５７塩基対の合成ウシロドプシン遺伝子の合成を開示したFerretti，et al.，Proc．Nat．Acad．Sci．82:599-603（1986）も参照。この方法で糖タンパク質ホルモンを構築することにより、α−サブユニット、β−サブユニットのいずれか又は両方の単数又は複数のあらゆる特定位置に塩基性アミノ酸を有するあらゆる特定の糖タンパク質ホルモンを、当業者は容易に得られる。合成遺伝子の製造の酵素鋳型反応法を記載した米国特許第５，５０３，９９５号も参照。このような技法は当業界では一般的なことであり、十分記載されている。糖タンパク質ホルモンをコードするＤＮＡ断片は、次に、下記のようにin vivo又はin vitroで発現される。
【００３０】
特定の当該糖タンパク質ホルモンをコードする核酸、又は核酸の一領域が一旦構築され、修飾され、又は単離されれば、その核酸は次に適切なベクター中にクローニングされ、これが野生型および／または修飾糖タンパク質ホルモンのin vivo又はin vitro合成を導く。ベクターは、挿入遺伝子又はハイブリッド遺伝子の転写を導き、調節するのに必要な機能性要素を有するよう意図される。これらの機能性要素としては、プロモーター、プロモーターの上流又は下流の領域、例えばプロモーターの転写活性を調節し得るエンハンサー、複製起点、プロモーターに隣接する挿入体のクローニングを助けるための適切な制限部位、抗生物質耐性遺伝子又はベクターを含有する細胞又は挿入体を含有するベクターを選択するのに役立つその他のマーカー、ＲＮＡスプライシング接続部、転写終結領域、あるいは挿入遺伝子又はハイブリッド遺伝子の発現を促進するのに役立つあらゆるその他の領域が挙げられるが、これらに限定されない（一般的には、Sambrook等参照）。
【００３１】
核酸挿入体の発現に有用な当業者に公知の大腸菌(E．coli)発現ベクターが多数存在す
る。使用に適したその他の微生物宿主としては、桿菌属、例えばBacillus subtilisおよびその他の腸内細菌科、例えばサルモネラ属、セラチア属、および種々のシュードモナス属の種が挙げられる。これらの原核生物宿主中で、典型的には宿主細胞に適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターを作製し得る。さらに、十分公知の多数の種々のプロモーターが存在し、その例としては、例えばラクトースプロモーター系、トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系、βラクタマーゼプロモーター系又はラムダファージ由来のプロモーター系がある。プロモーターは、典型的には、任意にオペレーター配列を有して発現を制御し、例えば転写および翻訳を開始および終了するためのリボソーム結合配列を有する。必要な場合には、下流の核酸挿入体の5'側でインフレームのＭｅｔコドンの挿入により、アミノ末端メチオニンが提供される。さらに、核酸挿入体のカルボキシ末端エクステンションが、標準的オリゴヌクレオチド突然変異誘発法を用いて除去される。
【００３２】
さらに、酵母発現を用いることができる。酵母発現系にはいくつかの利点がある。第一に、酵母分泌系で産生されるタンパク質は正確なジスルフィド対合を示すという証拠がある。第二に、翻訳後グリコシル化が酵母分泌系により効率的に実行される。Saccharomyces cerevisiaeのプレプロα因子リーダー領域（ＭＦ"−Ｉ遺伝子によりコードされる）は、酵母からのタンパク質分泌を導くのに一般に用いられる（Brake，et al.，"α-Factor-Directed Synthesis and Secretion of Mature Foreign Proteins in Saccharomyces cerevisiae."Proc．Nat．Acad．Sci.，81:4642-4646（1984））。プレプロα因子のリーダー領域は、シグナルペプチドおよびＫＥＸ２遺伝子によりコードされる酵母プロテアーゼ（この酵素はＬｙｓ−Ａｒｇジペプチド切断シグナル配列のカルボキシ側で前駆体タンパク質を切断する）の認識配列を含むプロ−セグメントを含有する。核酸コード配列は、プレ−プロ−α因子リーダー領域とインフレームで融合し得る。この構築物は次に強力な転写プロモーター、例えばアルコールデヒドロゲナーゼＩプロモーター又は解糖プロモーターの制御下に置かれる。核酸コード配列の後には翻訳終結コドンが続き、その後には転写終結シグナルがくる。あるいは、核酸コード配列は、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を促進するために用いられる二次タンパク質コード配列、例えばＳｊ２６又はβガラクトシダーゼに融合される。融合タンパク質の成分を分離するためのプロテアーゼ切断部位の挿入は、酵母中での発現のために用いられる構築物に適用可能である。有効な翻訳後グリコシル化および組換えタンパク質の発現は、バキュウロウイルス系でも成し遂げられる。
【００３３】
哺乳類細胞は、重要な翻訳後修飾、例えば折り畳みおよびシステイン対合、複合炭水化物構造物の付加、および活性タンパク質の分泌に好都合な環境でタンパク質の発現を可能にする。哺乳類細胞中での活性タンパク質の発現に有用なベクターは、強力ウイルスプロモーターとポリアデニル化シグナルとの間のタンパク質コード配列の挿入を特徴とする。ベクターは、ハイグロマイシン耐性、ゲンタマイシン耐性を付与する遺伝子、あるいは選択可能なマーカーとして用いるのに適したその他の遺伝子又は表現型、あるいは遺伝子増幅のためのメトトレキセート耐性を含有し得る。キメラタンパク質コード配列は、メトトレキセート耐性コードベクターを用いるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系中に、又は適切な選択マーカーを用いるその他の細胞系中に導入される。形質転換細胞中のベクターＤＮＡの存在は、サザンブロット分析により確証される。挿入コード配列に対応するＲＮＡの産生は、ノーザンブロッド分析により確認される。インタクトヒトタンパク質を分泌可能なその他の多数の適切な宿主細胞系が当業界で開発されており、その例としては、ＣＨＯ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系，Ｊｕｒｋａｔ細胞等が挙げられる。これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製の起点、プロモーター、エンハンサーおよび必要な情報プロセッシング部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列を含み得る。好ましい発現制御配列は、イムノグロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパ
ピローマウイルス等に由来するプロモーターである。当該核酸セグメントを含有するベクターは、細胞宿主の種類によって変わる十分公知の方法により宿主中に移される。例えば、塩化カルシウム形質転換は一般に原核生物細胞に対して利用されるが、一方リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストランまたはリポフェクチン介在性トランスフェクションや電気穿孔法は、他の細胞宿主に用いられる。
【００３４】
哺乳類細胞中の遺伝子の発現のための代替的ベクター、ヒトγインターフェロン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＶＩＩＩ凝固因子、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、プロテアーゼＮｅｘｉｎｌ、および好酸性主要塩基性タンパク質の発現のために開発されたものと同様のものが用いられる。さらに、ベクターはＣＭＶプロモーター配列、および哺乳類細胞（例えばＣＯＳ−７）中の挿入核酸の発現に利用可能なポリアデニル化シグナルを含み得る。
【００３５】
遺伝子又はハイブリッド遺伝子の発現は、in vivo又はin vitroによる。in vivo合成は、ベクターのための宿主として役立つ原核生物又は真核生物細胞を形質転換することを包含する。原核生物発現ベクター中に挿入される修飾糖タンパク質ホルモンの例は、本明細書中の実施例の項に示されている。
【００３６】
あるいは、遺伝子の発現はin vitro発現系で起こし得る。例えば、比較的大量のｍＲＮＡを合成するのに一般的に用いられるin vitro転写系が市販されている。このようなinvitro転写系では、糖タンパク質ホルモンをコードする核酸は、転写プロモーターに隣接して発現ベクター中にクローニングされる。例えば、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩクローニングおよび発現ベクターは、強力な原核生物転写プロモーターと側面を接するマルチクローニング部位を含有する（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，ＣＡ）。ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのようなＤＮＡ鋳型からのin vitroＲＮＡ合成のために必要な試薬をすべて含有するキットが利用できる（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，ＣＡ）。このような系によりin vitroで産生されるＲＮＡは次に、in vitroで翻訳されて、所望の糖タンパク質ホルモンを産生する（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，ＣＡ）。
【００３７】
糖タンパク質ホルモンの別の製造方法は、タンパク質化学技法により、２つのペプチド又はポリペプチドを一緒に結合させることである。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）又はＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）（Applied Biosystems，Inc.,FosterCity，ＣＡ）化学を用いて一般に利用可能な実験室装置を用いて、化学的に合成される。ハイブリッド糖タンパク質ホルモンに対応するペプチド又はポリペプチドが標準化学反応により合成されるということは、当業者は容易に理解し得る。例えば、ペプチド又はポリペプチドを合成し、その合成樹脂から切断せず、一方、ハイブリッドペプチドの他方の断片を合成し、その後樹脂から切り離し、それにより他の断片上では機能的にブロックされている末端基を露呈する。ペプチド縮合反応により、これら２つの断片はそれらのカルボキシおよびアミノ末端でそれぞれペプチド結合により共有結合されて、ハイブリッドペプチドを形成するGrant，G.A.，"Synthetic Peptides:A User Guide,"W.H.Freeman and Co.,N.Y.（1992）およびBodansky，M.and Trost，B.，Ed.，"Principles of Peptide Synthesis，"Springer-Verlag Inc.,N.Y.（1993））。あるいは、ペプチド又はポリペブチドは前記のようにin vivoで別々に合成される。単離されると、これら別々のペプチド又はポリペプチドは同様の縮合反応により糖タンパク質ホルモンを生成するために結合される。
【００３８】
例えば、クローン化又は合成ペプチドセグメントの酵素的連結により、短いペプチド断片を容易に連結させて、大ペプチド断片、ポリペプチド又は全タンパク質ドメインを生成し得る（Abrahmsen，L.，et al.,Biochemistry，30:4151（1991））。あるいは、合成ペプチドの本来の化学連結を利用して短いペプチド断片からより大きいペプチド又はポリペ
プチドを合成的に構築し得る。この方法は、２工程化学反応からなる（Dawson，et al.，"Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation,"Science，266:776-779（1994））。第一工程は、非保護合成ペプチド−α−チオエステルとアミノ末端Ｃｙｓ残基を含有する別の非保護ペプチドセグメントとを化学選択的に反応させて初期共有生成物としてチオエステル結合中間体を生成する反応である。反応条件を変えずに、この中間体は自発性迅速分子内反応を経て、連結部位に本来のペプチド結合を形成する。タンパク質分子の全合成へのこのネイティブ化学的連結法の適用は、ヒトインターロイキン８（ＩＬ−８）の調製により例示される（Clark-Lewis，I.，et al.，FEBS Lett.，307:97（1987），Clark-Lewis，I.，et al.，J．Biol．Chem.，269:16075（1994），Clark-Lewis，I.，et al.，Biochemistry，30:3128（1991）、および、Rajarathnam，K.，et al.，Biochemistry，29:1689（1994））。
【００３９】
あるいは、非保護ペプチドセグメントは化学的に結合され得るが、この場合、化学的連結の結果ペプチドセグメント間に形成された結合は非天然（非ペプチド）結合である（Schnolzer，M.,et al.，Science，256:221（1992））。この技法は、タンパク質ドメインのアナログ並びに十分な生物学的活性を有する大量の相対的に純粋なタンパク質を合成するために用いられている（deLisle Milton，R.C.,et al.，"Techniques in Protein Chemistry IV,"Academic Press，New York，pp.257-267（1992））。
【００４０】
本発明はさらに、スーパーアゴニスト又はアンタゴニスト活性を有する修飾糖タンパク質ホルモンの断片を提供する。本発明のポリペプチド断片は、そのポリペプチド断片を産生し得る発現系中にポリペプチドをコードする核酸をクローニングすることにより得られる組換えタンパク質である。例えば、β−サブユニットと一緒に糖タンパク質ホルモン受容体と相互作用して糖タンパク質ホルモンに関連した生物学的効果を生じ得る糖タンパク質ホルモンの活性ドメインを決定し得る。一例では、糖タンパク質ホルモンの活性あるいは結合特異性又は親和性に関与しないことが分かっているアミノ酸は、それぞれの活性を損失させずに欠失される。
【００４１】
例えば、アミノ又はカルボキシ末端アミノ酸が引き続いて天然又は修飾糖タンパク質ホルモンから除かれ、それぞれの活性は多数の利用可能なアッセイの１つで試験される。別の例では、修飾糖タンパク質の断片が、α又はβ−サブユニットの特定の位置で、少なくとも１つのアミノ酸で天然アミノ酸が置換された修飾ホルモンを包み、そしてアミノ末端又はカルボキシ末端アミノ酸の一部は、あるいはホルモンの内部領域で、修飾糖タンパク質ホルモンの精製を促進し得るポリペプチド断片又はその他の部分、例えばビオチンで置き換えられている。例えば、修飾糖タンパク質は、２つのポリペプチド断片をコードするそれぞれの核酸を、コード領域の発現がハイブリッドポリペプチドを生じるように発現ベクター中にクローニングするペプチド化学により、マルトース結合タンパク質に融合される。ハイブリッドポリペブチドは、それをアミロースアフィニティカラムに通してアフィニティ精製し、次にハイブリッドポリペプチドを特異的プロテアーゼＸａ因子で切断することにより、修飾糖タンパク質はマルトース結合領域から分離される（例えば、New England Biolabs Product Catalog，1996,pg.164参照）。
【００４２】
糖タンパク質ホルモンの活性断片は直接合成されるか、又はより大きな糖タンパク質ホルモンの化学的又は機械的分解により得られる。活性断片は、天然アミノ酸配列由来の少なくとも約５つの連続アミノ酸のアミノ酸配列で、関連活性、例えば結合又は調節活性を有するものと定義される。
【００４３】
断片は、他の配列と結びついていてもそうでなくても、ペプチドの活性が、修飾糖タンパク質ホルモンと比較して、有意に変化又は損傷を受けない限り、特定領域又は特定アミノ酸残基の挿入、欠失、置換又はその他の選択的修飾を含む。これらの修飾は、ジスルフ
ィド結合し得るアミノ酸を除去／付加するとか、その生物寿命を増大するといったような、いくつかの付加的特性を提供し得る。いかなる場合にも、ペプチドは生物活性特性、例えば結合活性、結合ドメインでの結合の調節等を保有しなければならない。糖タンパク質ホルモンの機能性又は活性領域は、ホルモンの特定領域の突然変異誘発、並びにその後の発現および発現ポリペプチドの試験により確認し得る。このような方法は当業者には明らかであり、その例としては、受容体をコードする核酸の特定部位の突然変異誘発が挙げられる（Zoller，M.J．等）。
【００４４】
本発明の一実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される位置でα−サブユニット中に少なくとも１つの塩基性アミノ酸を有する。一実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置１１に塩基性アミノ酸を有する。別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置１３に塩基性アミノ酸を有する。別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置１４に塩基性アミノ酸を有する。別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置１６に塩基性アミノ酸を有する。別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置１７に塩基性アミノ酸を有する。別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置２０に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、位置１１、１３、１４、１６および２０の塩基性アミノ酸はリジンである。本発明のさらに別の実施態様では、位置１７の塩基性アミノ酸はアルギニンである。
【００４５】
本発明はさらに、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される任意の２つの位置の組合せでα−サブユニット中に塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。例えば、塩基性アミノ酸は、位置１１と１３、又は位置１１と１４、又は位置１１と１６、又は位置１１と１７、又は位置１１と２０、又は位置１３と１４、又は位置１３と１７、又は位置１４と１６、又は位置１４と１７，又は位置１４と２０、又は位置１６と１７、又は位置１７と２０に存在する。本発明の一実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置１６および１３に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置２０および１３に塩基性アミノ酸を有する。さらに別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは位置１６と２０に塩基性アミノ酸を有する。
【００４６】
本発明はさらに、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される任意の３つの位置の組合せでα−サブユニット中に塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。例えば、塩基性アミノ酸は、位置１１、１３および１４、又は位置１１、１３および１６、又は位置１１、１３および１７、又は位置１１、１３および２０、又は位置１１、１４および１６、又は位置１１、１４および１７、又は位置１１、１４および２０、又は位置１１、１６および１７、又は位置１１、１６および２０、又は位置１１、１７および２０、又は位置１３、１４および１６、又は位置１３、１４および１７、又は位置１３、１４および２０、又は位置１３、１６および１７、又は位置１３、１７および２０、又は位置１４、１６および１７、又は位置１４、１６および２０、又は位置１４、１７および２０、又は位置１６、１７および２０に存在する。本発明の好ましい一実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、位置１３、１６および２０に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、ホルモンは甲状腺刺激ホルモンである。本発明の別の実施態様では、ホルモンは卵胞刺激ホルモンである。本発明の別の実施態様では、ホルモンは黄体形成ホルモンである。本発明の別の実施態様では、ホルモンは絨毛性性腺刺激ホルモンである。本発明のさらに別の実施態様では、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される任意の３つの位置の塩基性アミノ酸は、リジンである。
【００４７】
本発明はさらに、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択さ
れる位置でα−サブユニット中に少なくとも３つの塩基性アミノ酸を有するヒト甲状腺刺激ホルモンであって、β−サブユニットの位置５８、６３および６９からなる群から選択される少なくとも１つの位置に塩基性アミノ酸を有するものも提供する。本発明の一実施態様では、甲状腺刺激ホルモンはβ−サブユニットの位置５８に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、甲状腺刺激ホルモンはβ−サブユニットの位置６３に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、甲状腺刺激ホルモンはβ−サブユニットの位置６９に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、甲状腺刺激ホルモンは、β−サブユニットの位置５８、６３および６９の各々に塩基性アミノ酸を有する。本発明のさらに別の実施態様では、β−サブユニットの位置５８、６３および６９からなる群から選択される少なくとも１つの位置での塩基性アミノ酸は、アルギニンである。
【００４８】
本発明はさらに、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される任意の４つの位置のすべての組合せでα−サブユニット中に塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。当業者は、考えられる利用可能な組合せを容易に決定するであろう。一実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは位置１１、１３、１６および２０に塩基性アミノ酸を有する。別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは位置１１、１３、１７および２０に塩基性アミノ酸を有する。別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは位置１３、１４、１７および２０に塩基性アミノ酸を有する。好ましい実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは位置１３、１４、１６および２０に塩基性アミノ酸を有する。本発明のさらに別の実施態様では、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される任意の４つの位置の塩基性アミノ酸は、リジンである。
【００４９】
本発明はさらに、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される任意の５つの位置のすべての組合せでα−サブユニット中に塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。当業者は、考えられる利用可能な組合せを容易に決定するであろう。一実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは位置１３、１４、１６、１７および２０に塩基性アミノ酸を有する。別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは位置１１、１３、１４、１６および２０に塩基性アミノ酸を有する。本発明のさらに別の実施態様では、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される任意の５つの位置の塩基性アミノ酸は、リジンおよびアルギニンからなる群から選択される。
【００５０】
本発明はさらに、位置１１、１３、１４、１６、１７および２０の６つの位置のすべておいてα−サブユニット中に塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンを提供する。
【００５１】
別の態様では、本発明は位置１１、１３、１４、１６、１７および２０からなる群から選択される少なくとも１つの位置でα−サブユニット中に塩基性アミノ酸を有するヒト糖タンパク質ホルモンであって、このホルモンはヒト甲状腺刺激ホルモンであり、β−サブユニットの位置５８、６３および６９からなる群から選択される少なくとも１つの位置に塩基性アミノ酸が存在するものを提供する。本発明の一実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンはヒト甲状腺刺激ホルモンのβ−サブユニットの位置５８に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンはヒト甲状腺刺激ホルモンのβ−サブユニットの位置６３に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンはヒト甲状腺刺激ホルモンのβ−サブユニットの位置６９に塩基性アミノ酸を有する。本発明の別の実施態様では、ヒト糖タンパク質ホルモンは、ヒト甲状腺刺激ホルモンのβ−サブユニットの位置５８、６３および６９の各々に塩基性アミノ酸を有する。本発明のさらに別の実施態様では、位置５８、６３および６９からなる群から選択される位置での塩基性アミノ酸は、アルギニンである。
【００５２】
別の態様では、本発明はヒト卵胞刺激ホルモン、ヒト黄体形成ホルモン又はヒト絨毛性性腺刺激ホルモンである糖タンパク質ホルモンであって、ヒト甲状腺刺激ホルモンのβ−サブユニットの位置５８、６３および６９に対応する、いずれか糖タンパク質ホルモンのβ−サブユニット中の位置からなる群から選択される少なくとも１つの位置に塩基性アミノ酸を含有するものを提供する。このアプローチは、非ヒトにも等しく当てはまる。例えば、２つのウシ糖タンパク質ホルモンのβ−サブユニットアミノ酸配列を比較して、配列の相違に基づいて、あらゆるサブユニットに対して置換がなされ得る。
【００５３】
他の糖タンパク質ホルモンのβ−サブユニットのどの部位がヒト甲状腺刺激ホルモンのβ−サブユニットの位置５８、６３および６９に対応するかを、当業者は容易に決定し得る。例えば、Ward，et al.,:Bellet，D and Bidard，J.M.（eds）"Structure-function relationships of gonadotropins"Serono Symposium Publications，Raven Press，New York，65:1-19（1990）を参照。ここでは、２６の種々の糖タンパク質ホルモンβ−サブユニットのアミノ酸配列が並べられ、比較されている。したがって、当業者は、他の糖タンパク質ホルモンのこれらの部位の非塩基性アミノ酸を塩基性アミノ酸に容易に置換し得る。
【００５４】
同様に、本発明は、糖タンパク質ホルモンが、他のいずれかのヒト糖タンパク質ホルモンの同一位置に対応する、糖タンパク質ホルモンのβ−サブユニット中の位置からなる群から選択される少なくとも１つの位置に塩基性アミノ酸を有するあらゆるヒト糖タンパク質を提供する。例えばヒト黄体形成ホルモンおよびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβ−サブユニットのアミノ酸配列を比較し、２つのβ−サブユニット間のアミノ酸の相違に基づいて、これらのいずれかの糖タンパク質ホルモンの選択部位で置換を成し得る。このアプローチは、非ヒトにも等しく当てはまる。
【００５５】
本発明はさらに、野生型ヒト糖タンパク質を上回る活性を示す修飾ヒト糖タンパク質であって、野生型ヒト糖タンパク質を上回る活性を示す非ヒト糖タンパク質ホルモンの塩基性アミノ酸の位置に対応する位置で置換される同一のアミノ酸を含有するものを提供する。
【００５６】
野生型ヒト糖タンパク質を上回る活性を有する非ヒト糖タンパク質ホルモンは、あらゆる非ヒト種であることができる。例えば、非ヒト種はウシであってもよい。（例えば、Benua，R.S.，et al.，"An 18 year study of the use of beef thyrotropin to increase I-131 uptake in metastatic thyroid cancer．"J.Nucl．Med．5:796-801（1964）およびHershman，J.M.,et al.，"Serum thyrotropin（TSH）levels after thyroid ablation compared with TSH levels after exogenous bovine TSH:implications for I-131 treatment of thyroid carcinoma."J．Clin．Endocrinol．Metab．34:814-818（1972）参照）。あるいは、非ヒト種はウマ、ブタ、ヒツジ等であることもできる。本明細書中の実施例には、２７の種の１０〜２１のアミノ酸領域の配列が記載されている。
【００５７】
本発明はさらに、同一の種由来の野生型糖タンパク質ホルモンを上回る活性を示す修飾糖タンパク質ホルモンであって、野生型糖タンパク質ホルモンを上回る活性を示す別の種からの糖タンパク質ホルモンの塩基性アミノ酸の位置に対応する位置に置換された同一のアミノ酸を含有するものを提供する。したがって、その活性を増大するよう修飾されている糖タンパク質は、非ヒト種由来のものである。例えば、ブタ糖タンパク質ホルモンをウシ糖タンパク質ホルモンと比較して、ブタとウシの配列が異なる位置にアミノ酸置換を有するブタ糖タンパク質ホルモンを設計し、選択された変化を有するブタ糖タンパク質ホルモンを構築し、修飾ブタ糖タンパク質ホルモンをブタに投与し得る。あるいは、修飾される糖タンパク質はウシのものであってもよい。
【００５８】
本発明はさらに、同一の種由来の野生型糖タンパク質ホルモンを上回る活性を有する修飾糖タンパク質ホルモンであって、修飾糖タンパク質ホルモンは、野生型糖タンパク質ホルモンを上回る活性を示す同一種由来の異なる糖タンパク質ホルモンの塩基性アミノ酸の位置に対応する位置に置換された同一のアミノ酸を含有するものを提供する。例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン及びヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβサブユニットを比較して、あらゆる配列多様性に基づいて、これらのβサブユニットのいずれかにもアミノ酸置換を成し得る。当然、ホルモン受容体特異性は依然として保持される必要があるため、修飾糖タンパク質ホルモンの活性を一般的に増大又は低減する変化だけが意図される。このようなβサブユニット修飾の例は本明細書に含まれる実施例に説明されており、そこでは、塩基性アミノ酸は、ヒト甲状腺刺激ホルモンとヒト絨毛性性腺刺激ホルモンとの間の配列比較に基づいて、ヒト甲状腺刺激ホルモンの位置５８及び６３で置換される。
【００５９】
修飾は、野生型糖タンパク質の単数又は複数の任意の特定位置の非塩基性アミノ酸の塩基性アミノ酸による置換をいう。本発明の好ましい実施態様では、これらの修飾は非塩基性アミノ酸をリジンで置換することを包含する。
【００６０】
野生型糖タンパク質ホルモンに対する単数又は複数の修飾の効果は、多数の方法で確認できる。例えば、修飾糖タンパク質でトランスフェクトされた細胞中での環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）産生が測定され、野生型糖タンパク質ホルモンでトランスフェクトされた同様の細胞のｃＡＭＰ産生と比較できる。あるいは、修飾糖タンパク質でトランスフェクトされた細胞中のプロゲステロン産生が測定され、野生型糖タンパク質ホルモンでトランスフェクトされた同様の細胞のプロゲステロン産生と比較できる。あるいは、修飾糖タンパク質ホルモンの活性が受容体結合アッセイ、チミジン取込みアッセイ、又はＴ4分泌アッセイにより測定できる。修飾糖タンパク質ホルモンの活性を測定するためのこのようなアッセイの具体例は、本明細書中の実施例の項に記載されている。当業者は、野生型又は修飾糖タンパク質ホルモンのいずれかの活性を測定するために用いるためのあらゆる適切なアッセイを容易に決定し得る。
【００６１】
本発明の一実施態様では、修飾糖タンパク質ホルモンは野生型糖タンパク質ホルモンの活性の少なくとも３倍の活性を有する。この活性増大は、前記の、そして本明細書中の実施例に説明されたいずれかの技法により、あるいは当業者が容易に確定するようなその他の任意の適切なアッセイで、測定される。活性は、もちろん変化するので、アッセイ毎に又は細胞系毎に一致しなければならないというわけではない。例えば、本明細書中の実施例の項に記載したように、ヒト糖タンパク質ホルモンのαサブユニット中のＰ１６Ｋ突然変異の相対的効力は、ｃＡＭＰアッセイで野生型糖タンパク質ホルモンの活性と比較した場合、約６．４倍高かった。しかしながら、プロゲステロン放出アッセイでは、効力は約３．４倍、Ｖｍａｘは１．６倍であった。この特異的修飾は、少なくとも１つのアッセイでは、少なくとも約３倍の活性を示し、したがって少なくとも３倍の活性を有する糖タンパク質を示す。
【００６２】
別のアミノ酸位置を修飾するために、ヒト及び非ヒト由来の糖タンパク質ホルモン配列を標準的コンピューターソフトウエアプログラム、例えばＤＮＡＳＩＳ（Hitachi Software Engineering Co．Ltd.）を用いて整列させることができる。ヒト及び非ヒト糖タンパク質ホルモンの間で異なるアミノ酸残基を、次に、前記の技法を用いて置換し、その結果生じた糖タンパク質ホルモンを、前記のアッセイの１つを用いてアッセイする。
【００６３】
治療される又は修飾糖タンパク質ホルモンを投与される対象は、ヒト又はあらゆる非ヒト哺乳類であり得る。例えば、修飾糖タンパク質ホルモンスーパーアゴニストは、これらの糖タンパク質ホルモンをウシに投与することによりウシの過排卵に用い得る。
【００６４】
単数又は複数のあらゆる特定位置の非塩基性アミノ酸を塩基性アミノ酸に置換するのに用いられる方法は、糖タンパク質ホルモンアンタゴニストを設計するためにも用い得る。特異的置換を行い、これらの修飾糖タンパク質ホルモンの活性をモニタリングすることにより、修飾が活性低減を示す糖タンパク質ホルモンを産生したか否かを決定し得る。これらの糖タンパク質ホルモンアゴニストは、受容体代謝回転率、糖タンパク質ホルモンに対する受容体親和性といったようなホルモン受容体の試験に、あるいはグレーブズ病の治療といった治療手法、そして受胎能制御に用い得る。
【００６５】
本発明はさらに、治療量の本発明の糖タンパク質ホルモンを対象に投与することを含む、対象における糖タンパク質ホルモン活性に関連した症状の治療方法を提供する。これらの症状には、糖タンパク質ホルモン活性に関連したあらゆる症状が含まれる。これらの症状の例としては、排卵不全(ovalatory disfunction)、黄体期欠損(luteal phase defect)、原因不明不妊(unexplained infertility)、雄性因子不妊(male facter infertility)、時限性受胎(time-limited conception)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
別の例では、糖タンパク質ホルモンは甲状腺癌を診断及び治療するために投与され得る。例えば、ウシＴＳＨのヒト被験者への投与を用いて、甲状腺組織中の131Ｉの取込みを刺激し、甲状腺癌を治療する（Meier，C.A.,et al.，"Diagnostic use of Recombinant Human Thyrotropin in Patients with Thyroid Carcinoma(Phase I/II Study)."J．Clin．Endocrinol．Metabol．78:22（1994））。
【００６７】
当業者は、投与するための、そして重量、サイズ、特定症状の重症度、及び対象それ自体の種類に依っている有効量を容易に決定し得る。治療的有効量は、一般的な最適化法により、容易に決定し得る。本発明は、野生型と比較して活性の増大した糖タンパク質ホルモンを提供する。これらの修飾糖タンパク質ホルモンは、野生型糖タンパク質ホルモンと比較して低用量の投与量で同様の治療効果を達成し得るか、あるいは野生型糖タンパク質ホルモンと同用量で投与されると治療効果の増大を成し遂げ得る。
【００６８】
糖タンパク質ホルモンが経口投与されるか、非経口投与か、又は他の投与方法によるかによって、プロスタグランジンの投与は、固体、半固体又は液体投与形態、例えば錠剤、ピル、カプセル、粉末、液体、クリーム及び懸濁液等、好ましくは正確な用量の供給に適した単位用量形態で行える。糖タンパク質ホルモンは、医薬的に許容可能な担体と組合せた有効量の選択糖タンパク質を含んでもよく、さらに、他の医薬、製剤、担体、アジュバント、希釈剤等を含んでもよい。「医薬的に許容可能」とは、生物学的に又はその他望ましくない物質でないこと、即ち物質が許容不可能な生物学的作用を引き起こしたり、又は許容不可能な形態で糖タンパク質ホルモンと相互作用することなく、選択糖タンパク質ホルモンと一緒に個体に投与され得ることを意味する。このような投与形態を調製する実際的方法は、当業者には公知であるか、又は明らかであろう（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences，latest edition（Mack Publishing Co.，Easton，PA）参照）。
【００６９】
別の態様では、本発明は、補助量の本発明の糖タンパク質ホルモンを投与することを含む、対象の生殖を補助する方法を提供する。例えば、孤立性性腺刺激ホルモン不全（ＩＧＤ）を有する対象では、修飾卵胞刺激ホルモン（フォリトロピン）及び黄体形成ホルモン（ルトロピン）が対象に投与されて、正常な性腺機能を回復する。糖タンパク質ホルモン、例えばＦＳＨ及びＬＨは雌性生殖生理学には欠くことのできないものであり、これらの糖タンパク質ホルモンを対象に投与して、多数の生殖障害を克服し、それにより生殖を補助し得る、ということは当業者には広く公知である。
【００７０】
遺伝子治療は、本発明の修飾糖タンパク質ホルモンを用いてホルモン障害を治療するも
う一つのアプローチである。このアプローチでは、遺伝子が細胞中で発現され、それらの細胞のその後の世代が導入遺伝子を発現できるように、修飾糖タンパク質ホルモンをコードする遺伝子を、例えば生殖系細胞又は体細胞中に導入し得る。例えば、あらゆる特定の性腺刺激ホルモンが卵巣細胞、又はその前駆体中に挿入されて、排卵を増強し得る。あるいは、甲状腺刺激ホルモンのスーパーアゴニストをコードする遺伝子を保有する甲状腺細胞を、甲状腺癌を有する個体に導入すると、甲状腺癌の放射性ヨウ素取込みを刺激するためのＴＳＨの継続投与の必要がなくなる。コード配列を送達するのに適したベクターは、当業界で十分公知である。例えば、ベクターは、ウイルス、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス又は非ウイルス、例えば陽イオン性リポソームである。
【００７１】
本発明により提供されるような修飾糖タンパク質ホルモンは、甲状腺組織または性腺組織への治療薬のターゲッティングデリバリーのために、あるいはある種の新生物の治療に用い得る。
【００７２】
さらに別の態様では、本発明はヒトホルモンの超活性非キメラアナログの構築方法であって、別の種由来のより活性なホモログのアミノ酸配列をヒトホルモンと比較し、ヒトホルモン中のアミノ酸を他の種由来の対応するアミノ酸で置換し、置換ヒトホルモンの活性を測定して、置換ヒトホルモンから超活性アナログを選択することを含む方法を提供する。ヒトホルモンの超活性アナログは、その活性が野生型ホルモンの対応する活性を上回るあらゆるアナログを含む。例えば、トレオニンからリジンへの、αサブユニット中の位置１１でのヒト甲状腺刺激ホルモンの修飾（Ｔ１１Ｋ）は、in vitroで培養したＪＰ０９細胞のｃＡＭＰ産生の相対的増大を引き起こす（本明細書中の実施例に記載した表II参照）。したがって、ヒト甲状腺刺激ホルモンのこの修飾は、野生型ヒト甲状腺刺激ホルモンの超活性アナログをもたらす。上記のように、別の種由来のホモログの活性を測定し、その活性をヒトホルモンの活性と比較し、次に配列させた配列を比較してアミノ酸配列の相違を決定し、次に別の種由来のホルモン中の適切なアミノ酸でヒトホルモン中の対応する位置のアミノ酸を置き換え、次に前記の技法の１つにより修飾ヒトホルモンの活性を測定し、そして次に修飾ヒトホルモンの活性を野生型ヒトホルモンと比較して、それにより置換ヒトホルモンから超活性アナログを選択することにより、修飾を作り出すために置換すべき特定の単数又は複数のアミノ酸を決定し得る。
【００７３】
アミノ酸置換のすべての組合せを用いて、糖タンパク質スーパーアゴニストを生成し得る。例えば、中性アミノ酸を塩基性又は酸性アミノ酸で置換し得る。あるいは、塩基性アミノ酸を酸性又は中性アミノ酸で置換するか、あるいは酸性アミノ酸を中性又は塩基性アミノ酸で置換し得る。当業者は、前記のように、あるアミノ酸での別のアミノ酸の置換は、糖タンパク質ホルモン又は糖タンパク質ホルモンの一部をコードするヌクレオチド配列の核酸レベルであるか、あるいはポリペプチドレベルであることを認識できる。ヒトホルモンはすべて、この方法により、そして選択されたその超活性アナログにより修飾される。特に、ヒトホルモンは糖タンパク質ホルモンである。
【実施例】
【００７４】
ヒトαサブユニットのＣｙｓ１０とＰｒｏ２１との間の配列を、突然変異誘発のための一次標的として選択した（図１）。ｈＣＧベースの相同性モデリングは、αサブユニットのこの領域がすべての糖タンパク質ホルモンのβサブユニットから距離があり、いくつかの表面露出残基を含有し、そしてＰｒｏ１６とＳｅｒ１９との間に１回転の３10−ヘリックスを含む、ということを示唆した1。ヒトαサブユニットは位置１１、１３、１６、１７及び２０でウシと異なり（図１ａ）、これらの変化のうちの４つ（Ｔｈｒ１１→Ｌｙｓ、Ｇｌｎ１３→Ｌｙｓ、Ｐｒｏ１６→Ｌｙｓ及びＧｌｎ２０→Ｌｙｓ）は非保存性である。ＰＣＲ増幅を用いて、高等類人猿（チンパンジー−Pan troglodytes、オランウータン−Pongo pygmaeus）、低級類人猿（テナガザル−Hylobates sp.）、旧世界猿（ヒヒPapio
anubis）を含めたいくつかの霊長類のαサブユニット中の１１〜２０領域の配列を決定し、それらを従来公知の哺乳類配列、例えば、アカゲザル（Macaca mulatta;旧世界猿）、マーモセット（Callithrix jacchus;新世界猿）及びヒトと比較した（図１ａ）。異なる種間の同時比較は、この領域の塩基性残基が霊長類進化の相対的に遅い時期に置換された、ということを示唆した。アカゲザルαサブユニットでは、位置１１、１６及び２０のＬｙｓ残基及び位置１３のＡｒｇ残基をコードし2、ヒヒ配列は位置１６のＧｌｎをコードするが、一方テナガザル配列は位置１３にＨｉｓの弱塩基性イミダゾリウム基を１つだけ含有する（図１ａ）
。明らかに、この領域の正荷電アミノ酸のクラスターは脊椎動物進化の間に保持され、修飾されたが、しかし高等類人猿及びヒト配列中には認められない。αサブユニットの１１〜２０領域の正荷電残基の漸進的排除は、旧世界猿からのヒト科動物（ヒト及び類人猿）の進化的分岐と一致する。この領域が受容体との結合を調節し得るという我々の仮説は、以下の事項によりさらに支持された。１）ｂＴＳＨ中のＴｙｒ２１のヨウ素化への最高反応性3、２）ｈＣＧにおける抗原決定因子のマッピング4、３）個々のサブユニットのアシル化5、無水酢酸による標識6及びペジレーション(pegylation)により試験した場合の有効ホルモン−受容体相互反応のためのヒツジ及びヒトαサブユニットのＬｙｓのアミノ基の役割。
【００７５】
したがって、正荷電Ｌｙｓ残基をヒトαサブユニットのＣｙｓ１０〜Ｐｒｏ２１領域に挿入した（図１ｂ）。他の２つの領域もさらに突然変異誘発した（表Ｉ）。ＴＳＨβサブユニットにおける単一非保存性Ｌｅｕ６９→Ａｒｇ突然変異を、同様の配列比較に基づいて作った。
【００７６】
突然変異の効果
野生型（ＷＴ）又は突然変異ヒトα及びｈＴＳＨβ7又はｈＣＧβのｃＤＮＡの種々の組合せでのＣＨＯ−Ｋ１細胞中への同時トランスフェクションは、１４のｈＴＳＨ及び１１のｈＣＧヘテロ二量体の発現を引き起こした（表Ｉ）。多数の他の突然変異誘発試験8,9に対照的に、突然変異体の発現は一般的にＷＴに匹敵するものであった。Ｔ１１Ｋ、Ｑ１３Ｋ、Ｐ１６Ｋ、Ｑ２０Ｋ、Ｑ５０Ｐ及びＱ１３Ｋ＋Ｐ１６Ｋ＋Ｑ２０ＫのｈＴＳＨ α突然変異体は、ＷＴ−ｈＴＳＨより高いレベルで発現された。したがって、これらの進化的に正しいと思われる突然変異はｈＴＳＨ又はｈＣＧ分子の合成を、大規模に損なわなかったが、しかしある場合にはホルモン産生を促すことがある。
【００７７】
種々のバイオアッセイを用いて、ｈＴＳＨ及びｈＣＧ突然変異体の相対的効力及び効率を比較した。ｃＡＭＰ産生を刺激するＷＴ及び突然変異体ｈＴＳＨの能力を、安定トランスフェクト化ヒトＴＳＨ受容体を有するＣＨＯ−ＪＰ０９細胞で試験した。このアッセイは、単一αサブユニット突然変異体における下記の順序の効力を示した。Ｐ１６Ｋ（ＷＴの１／６のＥＣ50）≧Ｑ２０Ｋ＞Ｑ１３Ｋ＞Ｔ１１Ｋ＞ＷＴ−ｈＴＳＨ≒Ｑ５０Ｐ≒Ｒ６７Ｋ（表II）。ＷＴ及び突然変異体ｈＴＳＨの受容体結合活性を、ブタ甲状腺膜に対する競合的結合アッセイで評価した。ｃＡＭＰ刺激と一致して、以下の順序の効力が観察された。Ｐ１６Ｋ（ＷＴの５倍の親和性）＞Ｑ２０Ｋ≧Ｑ１３Ｋ＞Ｔ１１Ｋ＞ＷＴ−ｈＴＳＨ≒Ｑ５０Ｐ≒Ｒ６７Ｋ（表II）。したがって、ＪＰ０９細胞で観察された単一突然変異体の効力の増大は、ＴＳＨ受容体に対する親和性の増大と直接相関した。最も注目すべきことには、１１〜２０領域におけるＬｙｓ残基への各突然変異は活性の実質的増大を引き起こしたが、しかしこの決定的領域の外側の変化は受容体結合親和性及び生物活性に全く（Ｒ６７Ｋ、Ｑ５０Ｐ）影響を及ぼさなかった（表II）。ｈＴＳＨのアミノ酸１３、１６及び２０のアラニン突然変異誘発はホルモン活性を有意に変えなかったが、このことは、他の種の相同性ホルモン中に存在する塩基性アミノ酸の選択的再形成のみが機能的変化を引き起こしたことを示す。さらに、αＳｅｒ４３のＡｒｇへの交換及びαＨｉｓ９０及びαＬｙｓ９１の置換は、これらの残基がｈＴＳＨ生物活性にとってはｈＣＧ生物活性にとっ
て程重要ではなかったということを示し、このことは、塩基性残基のホルモン特異的及び部位特異的役割を強調する9。
【００７８】
組合せ突然変異を有するスーパーアゴニスト
効力の最高増大に別々に関与したＬｙｓ残基の作用をさらに調べるために、多数の置換を含有する突然変異体が作成された。最も活性な突然変異体を図２及び３に示す。二重Ｐｒｏ１６→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ及び三重Ｐｒｏ１６→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ１３→Ｌｙｓ突然変異体は、それぞれＷＴ−ｈＴＳＨの１２及び２４倍の活性を示し、ＴＳＨβサブユニットのＬｅｕ６９→Ａｒｇ置換後は３５倍まで効力がさらに増大した（図２ａ）。Ｇｌｕ１４→Ｌｙｓ置換（マグロ配列中に存在するこの位置のＬｙｓ）を含めた付加的最適化は、９５倍までの生物活性のさらなる増大を引き起こした。これらの最も有効な多重突然変異体は、効能を少なくとも１．５倍上げた（最大反応）（図２ｂ）。これらの増大は、ブタ並びにヒトＴＳＨ受容体に結合してＦＲＴＬ−５細胞（図２ｅ）での増殖並びに培養ヒト甲状腺小胞でのＴ3産生を誘発するｈＴＳＨ突然変異体の能力を試験することにより確認された。特に、Ｐｒｏ１６→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ１３→Ｌｙｓ／ＷＴ−ｈＴＳＨβ及びＰｒｏ１６→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ１３→Ｌｙｓ／Ｌｅｕ６９→Ａｒｇ突然変異体はそれぞれ、ＦＲＴＬ−５細胞における3Ｈ−チミジン取込みの最大刺激の半分を得るためにはＷＴ−ｈＴＳＨの１／１８及び１／２７の濃度を要した（図２ｅ）。ＴＳＨ生物活性に及ぼす多重突然変異の相乗効果は、αサブユニットの１３〜２０領域でのＬｙｓ残基の受容体との局所的共働に限定されなかったが、しかしβサブユニットの反対側ループでのＡｒｇ６９の関与を伴った（表II）。
【００７９】
【表１】
【００８０】
これらの知見は、動物モデルでさらに確認された。マウスにおけるＰｒｏ１６→Ｌｙｓ
、Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ及びＧｌｎ１３→Ｌｙｓ ｈＴＳＨ突然変異体の１回注入は、ＷＴ−ｈＴＳＨより有意に高く血清Ｔ4を増大した。さらに、Ｐｒｏ１６→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ１３→Ｌｙｓ／ＷＴ−ｈＴＳＨβ及びＰｒｏ１６→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ１３→Ｌｙｓ／Ｌｅｕ６９→Ａｒｇ突然変異体も、ＷＴ−ｈＴＳＨと比較して、より高いＴ4レベルを生じた（図２ｆ）。マウスに静注後６時間目のｈＴＳＨ血清レベルは同様で、ｈＴＳＨアナログはＷＴと比較して代謝クリアランス速度に大きな差異を示さなかった。
【００８１】
【表２】
【００８２】
ｈＣＧ及びｈＴＳＨのβサブユニットの配列比較はｈＣＧでの塩基性残基のクラスターを含有する領域（ＴＳＨβでの残基５８〜６９）を示したが、しかしｈＴＳＨでは認められなかった。部位特異的突然変異誘発を用いて、ｈＣＧにおけるそれらの位置に基づいて、ｈＴＳＨ中に単一及び複数の塩基性残基を導入して、さらにｈＴＳＨ βサブユニット突然変異体を作成した。Ｉ５８Ｒ、Ｅ６３Ｒ、Ｉ５８Ｒ＋Ｅ６３Ｒ、Ｉ５８Ｒ＋Ｅ６３Ｒ
＋Ｌ６９Ｒ。突然変異体ｈＴＳＨ βサブユニットをヒトαサブユニットと同時発現させて、組換え体ｈＴＳＨアナログの固有の活性を、ラットＴＨＳ受容体（ＦＲＴＬ−５細胞）及びヒトＴＳＨ受容体（ＣＨＯ−ｈＴＳＨｒ細胞）で試験した。両系において、単一置換（Ｉ５８Ｒ、Ｅ６３Ｒ）はｈＴＳＨの効力を２倍〜４倍増大し、効率のわずかな増大を生じた（図２ｇ）。２つの置換の組合せ（Ｉ５８Ｒ＋Ｅ６３Ｒ）は、野生型ｈＴＳＨの１５倍の効力及び１．５倍の効率を生じた（図２ｇ）。３つの塩基性残基が導入された組合せ突然変異体Ｉ５８Ｒ＋Ｅ６３Ｒ＋Ｌ６９Ｒの能力及び効率は、それぞれ５０倍及び１．７倍上昇した（図２ｇ）。固有活性のこれらの増大は、ＣＨＯ−ＪＰ０９細胞を用いた受容体−結合アッセイで判定した結果、受容体結合親和性の同時増大を伴った（図２ｈ）。同様に、マウスにＩ５８Ｒ＋Ｅ６３Ｒ＋Ｌ６９Ｒ突然変異体を注入すると、それらのＴ4刺激は偽処理(ＭＯＣＫ)又は対照処理マウスより有意に高かった（図２ｉ）。
【００８３】
ＣＧ突然変異体の生物活性を、ＭＡ−１０細胞でのプロゲステロン刺激及びヒトＬＨ／ｈＣＧ受容体でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞でのｃＡＭＰ刺激を用いて試験した。ｈＣＧ Ｌｙｓ突然変異体は、ＷＴ−ｈＣＧより高い能力（低ＥＣ50値）及び高い効率（Ｖmax）を示した（表II、図３ａ）。単一及び多重の突然変異の作用は、ｈＴＳＨ突然変異体に関して観察されたものと相対的に類似した。αＰｒｏ１６→Ｌｙｓ／ＷＴ−ｈＣＧβ突然変異体は、ＭＡ−１０細胞でのプロゲステロン産生の刺激及び受容体結合活性において、ＷＴ−ｈＣＧの４倍活性であり、さらにＰｒｏ１６→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ及びＰｒｏ１６→Ｌｙｓ＋Ｇｌｎ２０→Ｌｙｓ ｈＣＧ＋Ｇｌｎ１３→Ｌｙｓ突然変異体に関する能力及び効率の両方の増大を伴った（図３ａ及び３ｂ）。固有活性の同様の増大は、ヒトＬＨ／ｈＣＧ受容体（ＣＯＳ−７−ｈＬＨ／ｈＣＧ−Ｒ細胞）で試験した場合にも認められた（図３ｃ及び３ｄ）。
【００８４】
これらのデータは、モデルホルモン（例えばｂＴＳＨ）より高いレベルでも、２〜３のアミノ酸置換だけで、糖タンパク質ホルモン生物活性を増大するのに十分であることを示唆した。興味深いことに、ウシ及びヒトのＴＳＨ間の４０の異なる残基のうちの２〜３のみが、ｂＴＳＨの高い生物学的活性に関与すると考えられる。他の置換の大多数は保存性で、αサブユニットでのＲ６７Ｋ突然変異で説明したように、機能的意味を有さないと思われる。これに対照的に、αサブユニットのＬ１ループ及びβ１鎖中にクラスター形成する表面局在ＬｙｓはｂＴＳＨの高い生物活性に関して極めて重大である、ということが示される。したがって、２つの突然変異アミノ酸（Ｐ１６Ｋ＋Ｑ２０Ｋ）のみを有する組換え体ｈＴＳＨは、ｂＴＳＨに匹敵する固有の活性を得る（表II）。さらに、三重、四重及び五重ｈＴＳＨ突然変異体は、ｂＴＳＨより高い能力さえ示す。これらのデータは、ｂＴＳＨとｈＴＳＨとの間の活性の差が、活性を増大する置換を含めたいくつかのアミノ酸変化の結果であるが、しかし他のものはｈＴＳＨ受容体でのｂＴＳＨの生物能力を低減し得る、ということを示唆する。
【００８５】
しかし、いくつかの受容体種が単一トランスフェクト化ｃＤＮＡから作られる（隠れた部位からの代替的スプライシングにより、又は翻訳後修飾により）という可能性を排除できないけれども、活性の同様の差異が異なる細胞系で観察されたという事実は、これらのアナログの効力、効率及び親和性の増大における異なる受容体種の重要性に強く反論するものである。さらに、種々の炭水化物残基を有する天然ホルモンアイソフォームはポスト受容体レベルでそれらの作用を発揮し、受容体結合親和性に全く又は最小度の作用しか及ぼさない10。野生型ホルモン及びそれらのアナログは複数の実験系で特性評価されるため、本明細書に記載した生物活性増大の現象は、受容体の特定細胞依存性変異に関連した例外というよりもむしろ規則であるという可能性が高い。
【００８６】
糖タンパク質ホルモンアナログの合理的設計の見通し
糖タンパク質ホルモンの従来の部位特異的突然変異誘発は、アラニン走査突然変異誘発
11又は多重置換法9のような戦略を用いて、高度保存領域及び残基に主に焦点を当てた。いくつかの重要な研究は、カセット突然変異誘発および／または制限断片交換を用いたキメラサブユニットの作製を基礎にした12、13、14。非保存性残基の他の種に認められる残基への置換を基礎にした我々の戦略は首尾よくいって、生物活性の増大したｈＦＳＨ突然変異体を含めた他の糖タンパク質ホルモンアナログの生成を可能にした。ヒトαサブユニットの１１〜２０領域での塩基性残基の導入によるｈＴＳＨ、ｈＣＧ及びｈＦＳＨの生物活性の平行改良は、この領域がｈＣＧの結晶構造ベースのモデルにおける、そしてｈＴＳＨの我々の相同性モデルにおけるβサブユニットから距離があるという事実に関連がある。両モデルにおけるこの領域の仮想の同定及び１１〜２６領域と結合する抗体がサブユニット組合せに大きな影響を及ぼさないという観察15は、このドメインがすべての糖タンパク質ホルモンで同様に機能することを示唆する。αサブユニットが首尾よく工学処理されてｈＴＳＨ、ｈＣＧ又はｈＦＳＨのより強力なアゴニストを作られさえすれば、同一パラダイムが、それぞれのβサブユニットを修飾するのに用いられて、各糖タンパク質ホルモンの最終的スーパーアゴニストを生成する。例えば、ＴＳＨβユニット中の非極性Ｌｅｕ６９のＡｒｇへの付加的置換は、ｈＴＳＨ生物活性のさらなる増大を引き起こした。さらに、我々のアナログの血漿半減期は、特定の治療的要求に関して改変され得る。
【００８７】
糖タンパク質ホルモンのさらなる設計及び改善としては、ホルモン−受容体複合体の詳細な三次元構造を含む。糖タンパク質ホルモン受容体の正確な構造は解明されていないが、しかしホルモン受容体相互作用のいくつかのモデルが提唱されている15、16、17、18。Jiang等17の最新モデルによれば、αサブユニットのＬ１ループが受容体のトランスメンブラン部分との相互作用に関与する。このループ内の正荷電残基のクラスターはこのような相互作用を増強し、そして受容体中のさらなる再整列を促して、Ｇタンパク質の活性化及びシグナル変換を引き起こすのかもしれない。
【００８８】
材料及び方法
制限酵素、ＤＮＡマーカー及びその他の分子生物学的試薬は、Gibco BRL（Gaithersburg，ＭＤ）又はBoehringer-Mannheim（Indianapolis，ＩＮ）から購入した。細胞培養液、ウシ胎児血清及びＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥは、Gibco BRL（Gaithersburg，ＭＤ）から購入した。ＶｅｎｔＲ ＤＮＡポリメラーゼは、New England Biolabs（Beverly，ＭＡ）から購入した。ｐｃＤＮＡ Ｉ／Ｎｅｏベクター（Invitrogen Corp.，San Diego，ＣＡ）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローニングした全長ヒトα ｃＤＮＡ（８４０ｂｐ）及びｈＣＧ−β遺伝子は、T．H．Ji博士（University of Wyoming，Laramic，ＷＡ）から入手した。最初のイントロンを含有せず、非翻訳第一エキソン及び真正翻訳開始部位を有するｈＴＳＨ−βミニ遺伝子は、我々の実験室で構築された。ｒｈＴＳＨ−Ｇ標準は、Genzyme Corp．(Framingham，MA)からのものであった。安定発現ｈＴＳＨ受容体を有するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｈＴＳＨＲクローンＪＰ０９及びクローンＪＰ２６）は、G．Vassart博士（Universiry of Brussels，Belgium）が提供いただいた。ヒトＬＨ受容体ｃＤＮＡは、T．Minegishi博士（Gunma University，Gunma，Japan）から入手した。ＦＲＴＬ−５細胞は、L．D．Kohn博士（NIDDK，NIH，Bethesda，ＭＤ）のご厚意により得た。ＭＡ−１０細胞は、M．Ascoli博士（University of Iowa，Iowa City，ＩＡ）に提供いただいた。125Ｉ−ｃＡＭＰ及び125Ｉ−ｈＴＳＨは、Hazleton Biologicals（Vienna，ＶＡ）からのものであった。種々の霊長類の血液試料は、Yerkes Regional Primate Research Center（Emory University，Atlanta，ＧＡ）及びAnimal Resources（University of Oklahoma，Oklahoma City，ＯＫ）から入手した。
【００８９】
霊長類αサブユニット配列の確定
チンパンジー（Pan troglodytes）、オランウータン（Pongo pygmaeus）、テナガザル（Hylobates sp.）及びヒヒ（Papio anubis）の全血試料からのゲノムＤＮＡの抽出のために、ＱＩＡａｍｐR血液キット（Qiagen Inc.,Chatsworth，ＣＡ）を用いた。ゲノムＤ
ＮＡをＰＣＲに用いた。使用した合成オリゴヌクレオチドプライマーは、
5'-ＣＣＴＧＡＴＡＧＡＴＴＧＣＣＣＡＧＡＡＴＧＣ-3'（センス）（配列番号１）及び
5'-ＧＴＧＡＴＡＡＴＡＡＣＡＡＧＴＡＣＴＧＣＡＧＴＧ-3'（アンチセンス）（配列番号２）
であって、ヒト糖タンパク質ホルモンの共通αサブユニットをコードする遺伝子のヌクレオチド配列にしたがって合成した19。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ９．０）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２００μＭ ｄＮＴＰ及び２ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Promega Corp.，Madison，ＷＩ）を含有する１００μｌ反応容量中の８００〜１０００ｎｇのゲノムＤＮＡ鋳型及び１０ｐｉｃｏｍｏｌの各プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。反応混合物を鉱油で覆い、各試料を先ず、９５℃で１０分間加熱した。ＰＣＲプログラムは９５℃で１分３０秒間の変性、５５℃で１分３０秒間のアニーリング、及び７２℃で１分間の伸長のサイクルを３２回、その後の７２℃で７分間の最終伸長期間で構成された。次に、反応物を、臭化エチジウムの存在下で、１％アガロースゲル上で直接電気泳動処理した。エキソン３、イントロン３及びエキソン４に及ぶ増幅ＰＣＲ産物（〜７００ｂｐ）を、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ生成キット（Qiagen Inc.,Chatsworth，ＣＡ）を用いて精製し、ＯｒｉｇｉｎａｌＴＡクローニングキット（Invitrogen Corp.，San Diego，ＣＡ）を用いてｐＣＲTMＩＩ中にサブクローニングした。サブクローニング後、又は直接Ｓｅｑｕｅｎａｓｅキット（Ｕ.Ｓ．Biochemical Corp.，Cleveland，ＯＨ）を用いてジデオキシシーケンシングにより、断片の配列を得た。
【００９０】
相同モデリング
モデリングは、ｈＣＧとｈＴＳＨとの間の強い配列相同性によるものである。システインノット残基を対応物にして並べ、同一並びに高度保存性置換のパーセンテージを前記のように算出した1。ｈＣＧとｈＴＳＨの間の配列同一性は５８％、２つのβサブユニット配列の３１％が同一で、別の１７％はβサブユニットの高度保存性変化を含有した。ｈＴＳＨの分子モデルは、Brookhaven Data Bankから得られた結晶座標から得られるｈＣＧモデルの鋳型に依った。全座標操作及びエネルギー計算は、Convexに対しＣＨＡＲＭｍリリース２１．２を用いて実行し、分子グラフパッケージＱＵＡＮＴＡ（バージョン３．３、Molecular Simulation Inc.，University of York，York，英国）を用いて改変した。
【００９１】
部位特異的突然変異誘発
ＰＣＲベースのメガプライマー法21により、ヒトα−ｃＤＮＡ及びｈＴＳＨβミニ遺伝子の突然変異誘発を行った。ＶｅｎｔRＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs，Beverly，ＭＡ）を用いて、増幅を最適化した。ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化後、切断されたＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片を用いて、ＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ Ｉ／Ｎｅｏ（Invitrogen Corp.，San Diego，ＣＡ）中に連結した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐ大腸菌形質転換キット（Invitrogen Corp.）を用いて、ＭＣ１０６／ｐ３大腸菌細胞を形質転換した。ＱＩＡｐｒｅｐ ８プラスミドキット（ＱＩＡＧＥＮ Inc.，Chatsworth，ＣＡ）を多重プラスミドＤＮＡ調製に用いた。ＱＩＡＧＥＮ Ｍｅｇａ及びＭａｘｉ精製プロトコールを用いて、大量のプラスミドＤＮＡを精製した。さらなる突然変異誘発のために鋳型として単一突然変異を用いてα−ｃＤＮＡを含有するプラスミドを用いて、同一方法で、多重突然変異体を作った。サンガーのジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法を用いて二本鎖シーケンシングにより、突然変異を確認した。
【００９２】
組換え体ホルモンの発現
ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ，Rockville，ＭＤ）を、グルタミン及び１０％ＦＢＳ、ペニシリン（５０単位／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するハムのＦ−１２培地中に維持した。プレートの細胞（１００ｍｍ培養皿）をｐｃＤＮＡ Ｉ／ＮＥＯ中の野生型又は突然変異体α−ｃＤＮＡ、及び、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Gibco ＢＲＬ，Gaithersburg，ＭＤ）を用いてｐ（ＬＢ）ＣＭＶベクター7、又はｈＣＧ
β−ｃＤＮＡ8を含有するｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ中に挿入したｈＴＳＨミニ遺伝子で同時トランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクトした細胞をＣＨＯ−無血清培地（ＣＨＯ−ＳＦＭ−ＩＩ，Gibco BRL）に移した。遺伝子挿入物を含有しない発現プラスミドを用いた偽トランスフェクションからの対照培地を含む培地をトランスフェクション後７２時間目に回収し、濃縮して、遠心分離した。アリコートを−２０℃で凍結させ、各アッセイ前に一回だけ解氷した。ＷＴ及び突然変異体ｈＴＳＨを、前記のような四つの異なるイムノアッセイ9を用いて測定し確認した。ＷＴ及び突然変異体ｈＣＧの濃縮物を化学発光アッセイ（ｈＣＧキット、Nichols Institute，San Juan Capistrano，ＣＡ）及び免疫放射能測定アッセイ（ｈＣＧ ＩＲＭＡ、ＩＣＮ，Costa Mesa，ＣＡ）を用いて測定した。
【００９３】
ヒトＴＳＨ受容体を発現するＪＰ０９細胞におけるｃＡＭＰ刺激
ｈＴＳＨ受容体ｃＤＮＡ（ＪＰ０９）で安定的にトランスフェクト処理したＣＨＯ細胞を増殖させて、前記9のようにＷＴ及び突然変異体ｈＴＳＨの連続希釈液と一緒にインキュベートした。培地中に放出されたｃＡＭＰを、ラジオイムノアッセイにより測定した22。等量の総培地タンパク質を、偽対照及びトランスフェクト細胞からのｈＴＳＨ含有試料として用いた。
【００９４】
ヒトＬＨ受容体を発現するＣＯＳ−７細胞におけるｃＡＭＰ刺激
ｈＬＨ受容体ｃＤＮＡで一時的にトランスフェクト処理したＣＨＯ細胞を増殖させて、本質的には前記23と同様にＷＴ及び突然変異体ｈＣＧの連続希釈液と一緒にインキュベートした。培地中に放出されたｃＡＭＰを、ラジオイムノアッセイにより測定した22。等量の総培地タンパク質を、偽対照及びトランスフェクト細胞からのｈＣＧ含有試料として用いた。
【００９５】
ＭＡ−１０細胞におけるプロゲステロン産生刺激
９６ウエル(well)培養プレート中で増殖させた形質転換ネズミＬｅｙｄｉｇ細胞（ＭＡ−１０）を前記24のようにアッセイ培地中で６時間、ＷＴ及び突然変異体ｈＣＧとともにインキュベートした。培地中に放出されたプロゲステロンの量を、ラジオイムノアッセイにより測定した（ＣＴプロゲステロンキット、ＩＣＮBiomedicals，Inc.,Costa Mesa，ＣＡ）。
【００９６】
受容体結合アッセイ
ｈＴＳＨアナログの受容体結合活性を、可溶化ブタ甲状腺膜から125Ｉ−ｂＴＳＨを置き換えるその能力により、アッセイした224。ヒトＴＳＨ受容体との選択アナログの結合活性を、ＪＰ０９細胞を用いて試験した。ｈＣＧアナログのＭＡ−細胞との、そしてヒトＬＨ受容体で一時的にトランスフェクト処理したＣＯＳ−７細胞との結合活性を、前記24のように125Ｉ−ｈＣＧ及びアッセイ培地を用いて測定した。
【００９７】
ＦＲＴＬ−５細胞におけるチミジン取込み刺激
ラット甲状腺細胞（ＦＲＴＬ−５）の増殖を、前記22のようにモニタリングした。
【００９８】
マウスにおけるＴ4分泌の刺激
ＷＴ及び突然変異体ＴＳＨのin vivo生物活性を、マッケンジーのバイオアッセイ22,25の変法を用いて測定した。ＷＴ及び突然変異体ＴＳＨを、６日間、飲料水中に３μｇ／ｍｌのＴ3を投与することにより予め内因性ＴＳＨを抑制した雄アルビノＳｗｉｓｓ Ｃｒ１：ＣＦ−１マウス中に腹腔内投与した。６時間後に眼窩洞から血液試料を採取し、血清Ｔ4及びＴＳＨレベルをそれぞれ化学発光アッセイ（Nichols Institute）により測定した。
【００９９】
本出願を通して、種々の刊行物を参照した。ある刊行物は括弧内に番号を付けて示した
。全参照文献に番号を振って、下記に列挙する。本発明が属する分野の状態をより詳細に説明するために、これらの記載内容は、参照により、本明細書中に含める。
【０１００】
本発明の範囲及び精神を逸脱しない限り、種々の修正及び変更をなし得ることは、当業者には明らかである。本発明の他の実施態様は、本出願中に開示した本発明の明細及び実行を考慮すれば、当業者には明らかになる。説明及び実施例は、例示のためだけのものであり、本発明の真の範囲及び精神は以下の請求の範囲に示されるものとする。
【０１０１】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、２７の異なる種からのα−サブユニットの関連一次配列の比較を示す。（ａ）ＧｅｎＢａｎｋ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴおよびＰＤＢデータバンクから取得した、チンパンジー、オランウータン、テナガザルおよびヒヒ（下線）のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅断片のシーケンシングから得られたサブユニット配列を整列させた。配列の番号は、ヒトα−サブユニット配列のものに対応する。横線（‐‐‐）は、ヒトα−サブユニットのものと同一のアミノ酸残基を示す。異なる種間での保存されたリジン残基が太字で示されている。本研究で決定された霊長類配列には下線を施した。ヒト、チンパンジーおよびオランウータンのα−サブユニット配列は、種々の脊椎動物種における相対的に高度の類似性に拘わらず、この領域に塩基性アミノ酸を含有しない配列である。（ｂ）この領域に作られるヒト配列の突然変異は、すべての非ヒト哺乳類配列中に存在する単一および多数のＬｙｓ残基の導入を含んだ。さらに、残基１３、１６および２０のアラニンへの突然変異を用いて、Ｇｌｎ１３、Ｐｒｏ１６およびＧｌｎ２０の役割を調べた。
【図２ａ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ａ，ｂ）ＣＨＯ−ＪＰ０９細胞におけるｃＡＭＰ刺激。データは、３回（ａ）および２回（ｂ）繰り返した代表的な実験からの３重の測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【図２ｂ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ａ，ｂ）ＣＨＯ−ＪＰ０９細胞におけるｃＡＭＰ刺激。データは、３回（ａ）および２回（ｂ）繰り返した代表的な実験からの３重の測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【図２ｃ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ｃ，ｄ）ＣＨＯ−ＪＰ０９細胞に対する受容体結合活性。それぞれ図２ａおよび図２ｂの場合と同一の突然変異体を試験した。値は、２回繰り返した一実験からの４重の測定値の平均±ＳＥＭである。
【図２ｄ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ｃ，ｄ）ＣＨＯ−ＪＰ０９細胞に対する受容体結合活性。それぞれ図２ａおよび図２ｂの場合と同一の突然変異体を試験した。値は、２回繰り返した一実験からの４重の測定値の平均±ＳＥＭである。
【図２ｅ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ｅ）ＦＲＴＬ−５細胞におけるチミジン取込み刺激。値は、２回繰り返した一実験からの４重の測定値の平均±ＳＥＭである。
【図２ｆ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ｆ）マウスにおけるＴ4分泌の刺激。各データポイントは、２回繰り返したそれぞれの実験の４〜５匹の動物からの値の平均±ＳＥＭを示す。
【図２ｇ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ｇ）ＣＨＯ−ｈＴＳＨ細胞におけるｃＡＭＰ刺激。データは、３回繰り返したそれぞれの実験からの３〜４重測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【図２ｈ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ｈ）ＣＨＯ−ＪＰ０９細胞における受容体結合活性。データは、３回繰り返したそれぞれの実験からの３〜４重測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【図２ｉ】図２は、最も効力のあるｈＴＳＨアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。（ｉ）マウスにおけるＴ4分泌の刺激。各データポイントは、２回繰り返したそれぞれの実験の４〜５匹の動物からの値の平均±ＳＥＭを示す。
【図３ａ】図３は、最も効力のあるｈＣＧアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。ＭＡ−１０細胞におけるプロゲステロン産生刺激（ａ）および受容体結合アッセイ（ｂ）。データは、データは、３回繰り返したそれぞれの実験からの３重測定値の平均±ＳＥＭを示す。プロゲステロンの相対的最大産生レベルを表IIに、ＷＴ−ｈＣＧで得られた値の％として示す。
【図３ｂ】図３は、最も効力のあるｈＣＧアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。ＭＡ−１０細胞におけるプロゲステロン産生刺激（ａ）および受容体結合アッセイ（ｂ）。データは、データは、３回繰り返したそれぞれの実験からの３重測定値の平均±ＳＥＭを示す。プロゲステロンの相対的最大産生レベルを表IIに、ＷＴ−ｈＣＧで得られた値の％として示す。
【図３ｃ】図３は、最も効力のあるｈＣＧアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。ｈＬＨ受容体を発現するＣＯＳ−７細胞におけるｃＡＭＰ刺激（ｃ）および受容体結合アッセイ（ｄ）。データは、２回繰り返したそれぞれの実験からの３重測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【図３ｄ】図３は、最も効力のあるｈＣＧアナログの生物活性および受容体結合活性を示す。ｈＬＨ受容体を発現するＣＯＳ−７細胞におけるｃＡＭＰ刺激（ｃ）および受容体結合アッセイ（ｄ）。データは、２回繰り返したそれぞれの実験からの３重測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ヒト黄体形成ホルモンまたは野生型ヒト卵胞刺激ホルモンと異なる修飾ヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）または修飾ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）であって、該修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨはα−サブユニットおよびβ−サブユニットを含み、該α−サブユニットは位置１１、１３、１４、１６及び２０から成る群から選択される位置で少なくとも３つの塩基性アミノ酸を含む、修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１１、１３及び２０に存在する請求項１の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１３、１４及び２０に存在する請求項１の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項４】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１３、１６及び２０に存在する請求項１の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項５】
α−サブユニットが位置１１、１３、１４、１６及び２０から成る群から選択される位置で少なくとも４つの塩基性アミノ酸を含む請求項１の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項６】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１１、１３、１６及び２０に存在する請求項５の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項７】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１３、１４、１６及び２０に存在する請求項５の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項８】
α−サブユニットが位置１１、１３、１４、１６及び２０から成る群から選択される位置で５つの塩基性アミノ酸を含む請求項５の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項９】
β−サブユニットの位置５８、６３及び６９から成る群から選択される少なくとも１つの位置に塩基性アミノ酸を含むようにさらに修飾された請求項１〜８のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項１０】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置５８、６３及び６９に存在する請求項９の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項１１】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置５８に存在する請求項９の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項１２】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置６３に存在する請求項９の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項１３】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置６９に存在する請求項９の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項１４】
塩基性アミノ酸がリジン及びアルギニンから成る群から選択される請求項１〜１３のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨのα−サブユニットをコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１５の核酸を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６のベクターを含む宿主。
【請求項１８】
さらにα−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に５つ未満のアミノ酸置換を有する請求項１〜１４のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項１９】
さらにα−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に４つ未満のアミノ酸置換を有する請求項１〜１４のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２０】
さらにα−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に３つ未満のアミノ酸置換を有する請求項１〜１４のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２１】
さらにα−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に２つ未満のアミノ酸置換を有する請求項１〜１４のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２２】
α−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に対応する野生型ヒトＬＨまたはＦＳＨと同一のアミノ酸配列を有する請求項１〜１４のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２３】
野生型ヒト黄体形成ホルモンまたは野生型ヒト卵胞刺激ホルモンと異なる修飾ヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）または修飾ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）であって、該修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨはα−サブユニットおよびβ−サブユニットを含み、該α−サブユニットは位置１１、１３、１４、１６及び２０から成る群から選択される少なくとも１つの位置で塩基性アミノ酸を含む、修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２４】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１１に存在する請求項２３の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２５】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１３に存在する請求項２３の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２６】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１４に存在する請求項２３の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２７】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１６に存在する請求項２３の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２８】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置２０に存在する請求項２３の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２９】
塩基性アミノ酸がリジン及びアルギニンから成る群から選択される請求項２３〜２８のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３０】
α−サブユニットが位置１１、１３、１４、１６及び２０から成る群から選択される少なくとも２つの位置に塩基性アミノ酸を含むようにさらに修飾された請求項２３の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３１】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１６及び２０に存在する請求項３０の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３２】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１６及び１３に存在する請求項３０の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３３】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置２０及び１３に存在する請求項３０の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３４】
塩基性アミノ酸がリジン及びアルギニンから成る群から選択される請求項３０〜３３のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３５】
β−サブユニットの位置５８、６３及び６９から成る群から選択される少なくとも１つの位置に塩基性アミノ酸をさらに含むようにさらに修飾された請求項２３〜３４のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３６】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置５８、６３及び６９に存在する請求項３５の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３７】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置５８に存在する請求項３５の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３８】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置６３に存在する請求項３５の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３９】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置６９に存在する請求項３５の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項４０】
請求項２３〜３４のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨのα−サブユニットをコードする核酸。
【請求項４１】
請求項４０の核酸を含むベクター。
【請求項４２】
請求項４１のベクターを含む宿主。
【請求項４３】
さらにα−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に５つ未満のアミノ酸置換を有する請求項２３〜３９のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項４４】
さらにα−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位
置に４つ未満のアミノ酸置換を有する請求項２３〜３９のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項４５】
さらにα−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に３つ未満のアミノ酸置換を有する請求項２３〜３９のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項４６】
さらにα−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に２つ未満のアミノ酸置換を有する請求項２３〜３９のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項４７】
α−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に対応する野生型ヒトＬＨまたはＦＳＨと同一のアミノ酸配列を有する請求項２３〜３９のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項４８】
野生型ヒト黄体形成ホルモンまたは野生型ヒト卵胞刺激ホルモンと異なる修飾ヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）または修飾ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）であって、該修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨはα−サブユニットおよびβ−サブユニットを含み、該β−サブユニットの位置５８、６３及び６９から成る群から選択される少なくとも１つの位置に塩基性アミノ酸を含む、修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項４９】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置５８、６３及び６９に存在する請求項４８の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項５０】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置５８に存在する請求項４８の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項５１】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置６３に存在する請求項４８の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項５２】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置６９に存在する請求項４８の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項５３】
塩基性アミノ酸がリジン及びアルギニンから成る群から選択される請求項４８〜５２のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項５４】
適切な量の請求項１〜１４，１８〜３９，４３〜５３のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨを含む、生殖を補助するための医薬。
【請求項１】
野生型ヒト黄体形成ホルモンまたは野生型ヒト卵胞刺激ホルモンと異なる修飾ヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）または修飾ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）であって、該修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨはα−サブユニットおよびβ−サブユニットを含み、該α−サブユニットは位置１１、１３、１４、１６及び２０から成る群から選択される位置で少なくとも３つの塩基性アミノ酸を含む、修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１１、１３及び２０に存在する請求項１の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１３、１４及び２０に存在する請求項１の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項４】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１３、１６及び２０に存在する請求項１の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項５】
α−サブユニットが位置１１、１３、１４、１６及び２０から成る群から選択される位置で少なくとも４つの塩基性アミノ酸を含む請求項１の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項６】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１１、１３、１６及び２０に存在する請求項５の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項７】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１３、１４、１６及び２０に存在する請求項５の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項８】
α−サブユニットが位置１１、１３、１４、１６及び２０から成る群から選択される位置で５つの塩基性アミノ酸を含む請求項５の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項９】
β−サブユニットの位置５８、６３及び６９から成る群から選択される少なくとも１つの位置に塩基性アミノ酸を含むようにさらに修飾された請求項１〜８のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項１０】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置５８、６３及び６９に存在する請求項９の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項１１】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置５８に存在する請求項９の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項１２】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置６３に存在する請求項９の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項１３】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置６９に存在する請求項９の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項１４】
塩基性アミノ酸がリジン及びアルギニンから成る群から選択される請求項１〜１３のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨのα−サブユニットをコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１５の核酸を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６のベクターを含む宿主。
【請求項１８】
さらにα−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に５つ未満のアミノ酸置換を有する請求項１〜１４のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項１９】
さらにα−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に４つ未満のアミノ酸置換を有する請求項１〜１４のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２０】
さらにα−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に３つ未満のアミノ酸置換を有する請求項１〜１４のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２１】
さらにα−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に２つ未満のアミノ酸置換を有する請求項１〜１４のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２２】
α−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に対応する野生型ヒトＬＨまたはＦＳＨと同一のアミノ酸配列を有する請求項１〜１４のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２３】
野生型ヒト黄体形成ホルモンまたは野生型ヒト卵胞刺激ホルモンと異なる修飾ヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）または修飾ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）であって、該修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨはα−サブユニットおよびβ−サブユニットを含み、該α−サブユニットは位置１１、１３、１４、１６及び２０から成る群から選択される少なくとも１つの位置で塩基性アミノ酸を含む、修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２４】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１１に存在する請求項２３の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２５】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１３に存在する請求項２３の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２６】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１４に存在する請求項２３の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２７】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１６に存在する請求項２３の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２８】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置２０に存在する請求項２３の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項２９】
塩基性アミノ酸がリジン及びアルギニンから成る群から選択される請求項２３〜２８のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３０】
α−サブユニットが位置１１、１３、１４、１６及び２０から成る群から選択される少なくとも２つの位置に塩基性アミノ酸を含むようにさらに修飾された請求項２３の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３１】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１６及び２０に存在する請求項３０の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３２】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置１６及び１３に存在する請求項３０の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３３】
α−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置２０及び１３に存在する請求項３０の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３４】
塩基性アミノ酸がリジン及びアルギニンから成る群から選択される請求項３０〜３３のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３５】
β−サブユニットの位置５８、６３及び６９から成る群から選択される少なくとも１つの位置に塩基性アミノ酸をさらに含むようにさらに修飾された請求項２３〜３４のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３６】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置５８、６３及び６９に存在する請求項３５の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３７】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置５８に存在する請求項３５の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３８】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置６３に存在する請求項３５の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項３９】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置６９に存在する請求項３５の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項４０】
請求項２３〜３４のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨのα−サブユニットをコードする核酸。
【請求項４１】
請求項４０の核酸を含むベクター。
【請求項４２】
請求項４１のベクターを含む宿主。
【請求項４３】
さらにα−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に５つ未満のアミノ酸置換を有する請求項２３〜３９のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項４４】
さらにα−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位
置に４つ未満のアミノ酸置換を有する請求項２３〜３９のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項４５】
さらにα−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に３つ未満のアミノ酸置換を有する請求項２３〜３９のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項４６】
さらにα−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に２つ未満のアミノ酸置換を有する請求項２３〜３９のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項４７】
α−サブユニットの位置１１、１３、１４、１６及び２０以外の位置に対応する野生型ヒトＬＨまたはＦＳＨと同一のアミノ酸配列を有する請求項２３〜３９のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項４８】
野生型ヒト黄体形成ホルモンまたは野生型ヒト卵胞刺激ホルモンと異なる修飾ヒト黄体形成ホルモン（ＬＨ）または修飾ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）であって、該修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨはα−サブユニットおよびβ−サブユニットを含み、該β−サブユニットの位置５８、６３及び６９から成る群から選択される少なくとも１つの位置に塩基性アミノ酸を含む、修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項４９】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置５８、６３及び６９に存在する請求項４８の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項５０】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置５８に存在する請求項４８の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項５１】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置６３に存在する請求項４８の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項５２】
β−サブユニットの塩基性アミノ酸が位置６９に存在する請求項４８の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項５３】
塩基性アミノ酸がリジン及びアルギニンから成る群から選択される請求項４８〜５２のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨ。
【請求項５４】
適切な量の請求項１〜１４，１８〜３９，４３〜５３のいずれか１項の修飾ヒトＬＨまたはＦＳＨを含む、生殖を補助するための医薬。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図２ｆ】
【図２ｇ】
【図２ｈ】
【図２ｉ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図２ｆ】
【図２ｇ】
【図２ｈ】
【図２ｉ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【公開番号】特開２００８−７９６１９（Ｐ２００８−７９６１９Ａ）
【公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３１７３１６（Ｐ２００７−３１７３１６）
【出願日】平成１９年１２月７日（２００７．１２．７）
【分割の表示】特願２００７−１２４７８５（Ｐ２００７−１２４７８５）の分割
【原出願日】平成８年５月８日（１９９６．５．８）
【出願人】（５０２００６７８２）アメリカ合衆国 (47)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月７日（２００７．１２．７）
【分割の表示】特願２００７−１２４７８５（Ｐ２００７−１２４７８５）の分割
【原出願日】平成８年５月８日（１９９６．５．８）
【出願人】（５０２００６７８２）アメリカ合衆国 (47)
【Ｆターム（参考）】
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