糖尿病の治療および診断のための方法および組成物
本発明は、カリウムチャンネルをコードするポリヌクレオチド、ならびに糖尿病および糖尿病に対する素因の治療および診断のためにそれらのカリウムチャンネルを用いる方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2002年6月10日に提出された米国仮特許出願第60／387,642号（これはすべての目的に関して参照として本明細書に組み入れられる）の優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
カリウムチャンネルは、数多くの細胞種で原形質膜の電位の設定および調整を行っている。これらを行うことにより、これは神経の興奮性およびホルモン分泌を含む、さまざまな生理的プロセスにおいて主要な役割を果たしている。膵β細胞で膜電位の設定にかかわる重要なチャンネルの1つに、ATP感受性カリウムチャンネルであるKir6.2がある。グルコースレベルが低い時には、インスリン分泌性β細胞の細胞質におけるATPの濃度も低い。これらの条件下でKir6.2チャンネルは開口しており、それによって細胞膜を過分極させる。グルコースレベルが高い時には、細胞質のATP濃度も上昇し、Kir6.2を通過する電流を遮断する。これは原形質膜を脱分極させるとともに、L型Ca＋＋チャンネルの電位依存的開口を惹起する（Aguilar-BryanおよびBryan、Endocr. Rev. 20: 101-135 (1999)）。
【０００３】
K＋チャンネルに作用するさまざまな薬剤が2型糖尿病に対して用いられている。スルホニル尿素系薬剤はKir6.2のチャンネル活性を阻害することによってインスリン分泌を増加させる。スルホニル尿素系薬剤は、Kir6.2と会合してその活性を調節する、スルホニル尿素受容体（SUR1）というタンパク質との相互作用を介して活性を及ぼす。ジアゾキシドは、インスリン分泌を抑制するために臨床的に用いられているKATPチャンネル開口薬である（「ION CHANNELS AND DISEASE」（Ashcroft, 2000））。Kir6.2は他の組織では他のスルホニル尿素受容体タンパク質（例えば、SUR2AおよびSUR2B）と会合した状態で認められる。新生児持続性高インスリン血症性低血糖症（PHHI）として知られる症候群をもたらす、KATPチャンネルのSUR1サブユニットにおける変異は、β細胞原形質膜の定常的な脱分極およびインスリンの恒常的な分泌を引き起こす。
【０００４】
チャンネル形成ドメインはあらゆるK＋チャンネルに認められる。これらのエレメントはK＋透過性チャンネルの形成を可能にする（Pascual, J.M.ら、Neuron 14: 1055-1063 (1995)）。大半の哺乳動物K＋チャンネルはこれらの特徴物のうち1つのみを有している。カリウムチャンネルの1つのサブクラスは、4つの膜貫通セグメントドメインおよび2つのチャンネル形成ドメインを有する。このサブクラスは二量体化によって単一の孔を形成する。ヒトゲノムにはこのようなチャンネルが少なくとも14種あり、ショウジョウバエ（Drosophilla）では11種を上回り、線虫（C. elegans）ゲノムには50種前後が存在する。このようなチャンネルは、静止電位で開口しているため、しばしば「バックグラウンドチャンネル」または「漏洩チャンネル」と呼ばれており、静止電位の設定および細胞の興奮性の調節に重要である可能性が高い。
【０００５】
糖尿病は、1型糖尿病および2型糖尿病という2種類の臨床的症候群に分けることができる。1型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病（IDDM）は、膵ランゲルハンス島におけるインスリン産生性のβ細胞の高度の損失を特徴とする慢性の自己免疫疾患である。これらの細胞は進行性に破壊されるため、分泌されるインスリンの量は減少し、分泌インスリン量が正常血糖（血中グルコース濃度が正常）に必要な濃度よりも減少すると最終的には高血糖（血中グルコース濃度の異常高値）に至る。この免疫応答の厳密な誘因は不明であるが、IDDMの患者では膵β細胞に対する抗体の値が高い。しかし、これらの抗体の値が高い患者のすべてがIDDMを発症するわけではない。
【０００６】
2型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病（NIDDM）とも呼ばれる）は、筋肉、脂肪および肝細胞がインスリンに対して正常な応答を行えない場合に発症する。この応答性の障害（インスリン抵抗性と呼ばれる）は、これらの細胞の表面にあるインスリン受容体の数の減少、細胞内部のシグナル伝達経路の機能不全、またはその両方に起因すると考えられる。β細胞は最初のうちは、インスリン産生量を増加させることによってこのインスリン抵抗性を代償する。時間の経過に伴って、これらの細胞は正常な血糖値を維持するのに十分なインスリンを産生できないようになり、これは2型糖尿病への進行を意味する。
【０００７】
2型糖尿病は、ほとんど解明されていない遺伝的な危険因子と後天性危険因子―これには高脂肪食、運動不足および加齢が含まれる―の組み合わせによって生じる。2型糖尿病は、肥満および座りがちで運動不足のライフスタイルの増加、西洋風の食事習慣の普及、および多くの国での人口の全体的高齢化のために世界的に広がっている。1985年の時点で全世界に3000万人の糖尿病患者がいると推定されており、2000年までにこの数は推定1億5400万人と5倍に増加した。糖尿病患者の数は現在から2025年までに倍増し、約3億人に達すると予想されている。
【０００８】
2型糖尿病は、グルコース代謝および脂質代謝における欠陥を特徴とする複合的疾患である。空腹時血漿グルコース値、遊離脂肪酸値およびトリグリセリド値の上昇、ならびにHDL／LDL比の低下を含む、多くの代謝パラメーターの擾乱がみられることが一般的である。以上に考察したように、糖尿病の基礎をなす主な原因の一つは、グルコース値を維持するのに十分なインスリンをβ細胞が産生できないことにある。このため、糖尿病の治療において重要な治療上の目標の一つは、インスリン産生を増加させることである。本発明はこれをはじめとする問題を取り扱う。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、配列番号：10と少なくとも90％同一な配列を含むカリウムチャンネルをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：9をコードしない。いくつかの態様において、カリウムチャンネルは配列番号：10に示された配列を含む。いくつかの態様において、カリウムチャンネルは配列番号：2を含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：1を含む。
【００１０】
本発明はまた、配列番号：2と少なくとも80％同一なカリウムチャンネルをコードする、単離されたポリヌクレオチドも提供する。いくつかの態様において、配列番号：2のアミノ酸番号277に対応する、カリウムチャンネルのアミノ酸はグルタミン酸である。
【００１１】
本発明はまた、配列番号：4と少なくとも88％同一なカリウムチャンネルをコードする、単離されたポリヌクレオチドも提供する。。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：4をコードする。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：3を含む。
【００１２】
本発明はまた、上記のポリヌクレオチドがトランスフェクトされた細胞も提供する。いくつかの態様において、細胞は膵島細胞である。
【００１３】
本発明はまた、配列番号：10と少なくとも90％同一な配列を含む、単離されたポリペプチドも提供する。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：9ではない。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：10と同一な配列を含む。いくつかの態様において、配列は配列番号：2に示されている。
【００１４】
本発明はまた、配列番号：2と少なくとも80％同一な、単離されたポリペプチドも提供する。いくつかの態様において、配列番号：2のアミノ酸番号277に対応するアミノ酸はグルタミン酸である。
【００１５】
本発明はまた、配列番号：4と少なくとも88％同一な、単離されたポリペプチドも提供する。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：4を含む。
【００１６】
本発明はまた、配列番号：2または配列番号：4と特異的に結合する抗体も提供する。いくつかの態様において、抗体は配列番号：2と特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体は配列番号：4と結合する。いくつかの態様において、抗体は配列番号：9とは結合しない。いくつかの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗体はポリクローナル抗体である。
【００１７】
本発明はまた、動物におけるグルコース応答性（glucose-stimulated）インスリン産生を誘導する作用物質を同定する方法。いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：（i）作用物質を、配列番号：2、配列番号：4または配列番号：9をコードする配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む混合物と接触させ、その後に0.2×SSCにより55℃、20分間の洗浄を1回行うこと；および（ii）そのポリペプチドの発現または活性を変化させる（modulate）作用物質を選択し、それによって動物におけるグルコース応答性インスリン産生を誘導する作用物質を同定すること。
【００１８】
いくつかの態様において、段階（ii）は、ポリペプチドの発現を変化させる作用物質を選択することを含む。いくつかの態様において、段階（ii）は、ポリペプチドの活性を変化させる作用物質を選択することを含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：2を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：4を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：9を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：9を含まない。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：10を含む。
【００１９】
いくつかの態様において、ポリペプチドは固体支持体と結合している。いくつかの態様において、作用物質は固体支持体と結合している。いくつかの態様において、作用物質はポリペプチドと特異的に結合する作用物質を同定することによって選択される。いくつかの態様において、混合物はポリペプチドを発現する細胞を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドの活性は、細胞におけるカルシウム流の変化を測定することを含む段階によって決定される。いくつかの態様において、ポリペプチドの活性は、細胞の膜電位の変化を測定することを含む段階によって決定される。
【００２０】
いくつかの態様において、細胞はインスリン分泌性細胞である。いくつかの態様において、ポリペプチドの活性は、細胞によるインスリン分泌の変化を測定することを含む段階によって決定される。いくつかの態様において、ポリペプチドの活性は、細胞によるグルコース応答性インスリン分泌の変化を測定することを含む段階によって決定される。いくつかの態様において、本方法はさらに、作用物質を糖尿病動物に投与すること、および、動物をグルコース応答性インスリン分泌の増加に関して検査することを含む。
【００２１】
本発明はまた、動物におけるグルコース応答性インスリン産生を誘導する方法であって、上記の方法によって選択された作用物質の治療的有効量を投与することを含む方法も提供する。いくつかの態様において、動物はヒトである。
【００２２】
定義
「糖尿病に対する素因」は、ある人が糖尿病を発症するリスクが高い場合に、その人に存在する。多数の危険因子が当業者に知られており、これには以下のものが含まれる：遺伝要因（例えば、平均的な集団よりも糖尿病の発生率が高くなる対立遺伝子を有する、または糖尿病の親もしくは兄弟姉妹がいる）；過体重（例えば、肥満指数（BMI）が25kg／m2またはそれ以上である）；習慣的な運動不足、人種／民族（例えば、アフリカ系アメリカ人、スペイン系アメリカ人、アメリカ先住民、アジア系アメリカ人、太平洋諸島住民）；空腹時血糖障害もしくは耐糖能障害が以前に確認、高血圧（例えば、成人で140／90mmHgまたはそれ以上）；HDLコレステロール値が35mg／dlまたはそれ以上；トリグリセリド値が250mg／dlまたはそれ以上；妊娠時糖尿病もしくは9ポンドを上回る新生児の分娩の既往；および／または多嚢胞性卵巣症候群。例えば、「Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus」および「Screening for Diabetes」Diabetes Care 25(1): S5-S24 (2002)を参照されたい。
【００２３】
「正常血糖個体（lean individual）」とは、患者からのサンプルと対比して用いる場合、空腹時血糖値が110mg／dl未満、または負荷2時間後血糖値（2 hour PG）の読取り値が140mg／dl未満である成人のことを指す。「負荷2時間後血糖値」とは、75g無水グルコース相当物を水に溶解したものを含むグルコース負荷を患者に与えた後の血糖値のことを指す。この試験全体は一般に経口グルコース負荷試験（OGTT）と呼ばれる。例えば、Diabetes Care、Supplement 2002、American Diabetes Association：Clinical Practice Recommendations 2002を参照されたい。正常血糖個体におけるポリペプチドのレベルは、単一の個体からの読取り値であってもよいが、通常は、正常血糖個体の群による統計学的に意味のある平均値である。正常血糖個体におけるポリペプチドのレベルは、例えばコンピュータプログラムで、ある値によって表すことができる。
【００２４】
「β細胞抑制性カリウムチャンネル（BIK）ポリペプチド」「BIKタンパク質」または「BIK」とは、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：9、配列番号：10と実質的に同一な2つのチャンネル形成ドメインもしくはその断片、または配列番号：2、配列番号：4、配列番号：9もしくは配列番号：10と実質的に同じ活性を有するペプチド模倣物組成物を含む、カリウムチャンネルのことを指す。BIKは2つのチャンネル形成ドメインを含む。図1において、チャンネル形成ドメインは太字で示されており、膜貫通ドメインには下線が施されている。天然型BIKの発現は一般に膵臓で、より詳細には島細胞で、高度である。
【００２５】
「チャンネル形成ドメイン」とは、膜内にチャンネルを形成する、カリウムチャンネルの一部分のことを指す。ヒトBIKのチャンネル形成ドメインは図1では太字で示されている。一般的には、このようなドメイン4つが組み合わされてチャンネルが形成される。ポリペプチドがチャンネル形成ドメインを1つずつ含む場合には、一般に4つのポリペプチドがチャンネルの形成のために必要である。各ポリペプチドが4つの膜貫通ドメインおよび2つのチャンネル形成ドメインを含む場合には。例えば、Ketchumら、Nature 376: 690-5 (1995)を参照されたい。
【００２６】
本発明の「BIK核酸」または「BIKポリヌクレオチド配列」とは、BIKポリペプチドをコードする部分配列性または完全長のポリヌクレオチド配列のことである。本発明のBIK核酸の例には、配列番号：1、配列番号：3などと実質的に同一な配列、および、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：9、配列番号：10をコードするポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの態様において、BIKポリヌクレオチドは、アミノ酸277がグルタミン酸である配列番号：2と実質的に類似したポリペプチド、またはアミノ酸277がグルタミン酸である配列番号：9をコードする。
【００２７】
「BIK活性」または「カリウムチャンネル活性」とは、本明細書で用いる場合、タンパク質が細胞の原形質膜の電位を設定または調整する能力のことを指す。活性は例えば、パッチクランプ法を用いて測定しうる。パッチクランプ分析は一般に、細胞膜とマイクロピペットのガラス壁との間に高抵抗の密封状態を形成させることを含む。次に、膜内のイオンチャンネルを通って流れる電流を測定する。例えば、Ashcroftら、2000, 前記を参照されたい。また、細胞内のチャンネルの活性を検出するために、膜電位に対する感受性のある蛍光色素または蛍光共鳴エネルギー伝達（FRET）試薬を用いることもできる。Millerら、Eur J Pharmacol. 370(2): 179-85 (1999)；Fedidaら、Prog Biophys Mol Biol. 75(3): 165-99 (2000)。
【００２８】
「BIKのアゴニスト」とは、BIKと結合する、BIKを賦活する、増加させる、促進させる、活性化を増強する、感受性を高める、またはその活性もしくは発現をアップレギュレートする、作用物質のことを指す。
【００２９】
「BIKのアンタゴニスト」とは、BIKと結合する、BIKの賦活を部分的もしくは完全に阻止する、減少させる、妨げる、活性化を遅らせる、不活性化する、感受性を低下させる、またはその活性もしくは発現をダウンレギュレートする、作用物質のことを指す。
【００３０】
「抗体」とは、分析物（抗原）と特異的に結合してそれを認識する、1つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチドまたはその断片のことを指す。一般に認められている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子のほか、極めて多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεに分類され、これによってそれぞれIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgBという免疫グロブリンのクラスが規定される。
【００３１】
典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体から構成される。各四量体は2つの同一なポリペプチド鎖の対から構成され、それぞれの対は1つの「軽鎖」（約25kDa）および1つの「重鎖」（約50〜70kDa）を有する。各鎖のN末端には、抗原認識を主に担う約100〜110アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域が定められている。可変軽鎖（VL）および可変重鎖（VH）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖のことを指す。
【００３２】
抗体は、例えば、完全な免疫グロブリン、または種々のペプチダーゼによる消化によって生じる、詳細に特徴づけられているさまざまな断片として存在する。すなわち、例えばペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下方で抗体を切断し、ジスルフィド結合によってVH-CH1と連結した軽鎖であるFabの二量体、F(ab)'２を生成する。ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断するためにF(ab)'２を穏和な条件下で還元し、それによってF(ab)'２二量体をFab'単量体に変換することもできる。Fab'単量体は本質的にはヒンジ領域の一部を伴うFabである（Paul（編）「Fundamental Immunology」第3版、Raven Press, NY (1993)を参照されたい）。さまざまな抗体断片が完全抗体の消化の見地から定義されているが、当業者は、このような断片を化学的または組換えDNA法を用いてデノボ合成しうることを理解すると考えられる。このため、本明細書で用いる抗体という用語には、抗体全体の改変によって生じる抗体断片、または組換えDNA法を用いてデノボ合成されたもの（例えば、一本鎖Fv）も含まれる。
【００３３】
「ペプチド模倣物（peptidomimetic）」および「模倣物（mimetic）」という用語は、本発明のBIKポリペプチド、BIKアンタゴニスト、またはBIKアゴニストと実質的に同じ構造的および機能的な特徴を有する合成化合物のことを指す。ペプチド類似体は一般に、テンプレートペプチドと類似した特性を備えた非ペプチド薬として製薬産業で用いられている。この種の非ペプチド化合物は「ペプチド模倣物（peptide mimetic）」または「ペプチド模倣物（peptidemimetic）」と呼ばれる（Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986)；VeberおよびFreidinger、TINS p. 392 (1985)；およびEvansら、J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)、これらは参照として本明細書に組み入れられる）。治療的に有用なペプチドと構造的に類似したペプチド模倣物を用いることで、同等または向上した治療効果または予防効果が得られる可能性がある。一般に、ペプチド模倣物は、BIKポリペプチドのような、模範ポリペプチド（すなわち、生物活性または薬理活性を有するポリペプチド）と構造的に類似しているが、CH2NH-、-CH2S、-CH2-CH2-、-CH=CH-（シスおよびトランス）、-COCH2-、-CH(OH)CH2-およびCH2SO-などからなる群より選択される連鎖によって随意に置換された1つまたは複数のペプチド連鎖を有する。模倣物は合成性で非天然性のアミノ酸類似体からすべて構成されてもよく、または、一部が天然ペプチドアミノ酸で一部が非天然性のアミノ酸類似体であるキメラ分子であってもよい。模倣物はまた、天然アミノ酸の保存的置換物の任意の量を、このような置換が模倣物の構造および/または活性を実質的に変化させない限り、包含しうる。例えば、模倣物組成物は、それがBIKの結合活性もしくは酵素活性を達成する、またはBIK酵素活性を阻害もしくは増加することができるならば、本発明の範囲に含まれる。
【００３４】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAのセグメントのことを意味する；これには、コード領域（リーダーおよびトレーラー）の前および後の領域、さらには個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）も含まれる。
【００３５】
「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に適用される場合、核酸またはタンパク質が、天然の状態でそれに付随する他の細胞成分を本質的に含まないことを表す。これは均一な状態にあることが好ましいが、乾燥していても水溶液中にあってもよい。純度および均一性は通常、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学の技術を用いて決定される。調製物中に存在する最も多数を占める種であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、その遺伝子に隣接して目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中に本質的には1つのバンドを生じることを表す。これは詳細には、核酸またはタンパク質の純度が、少なくとも85％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも99％であることを意味する。
【００３６】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および、一本鎖または二本鎖の形態にあるそれらの重合体のことを指す。特に限定されない限り、この用語には、参照核酸と同程度の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体が含まれる。別に指示しない限り、個々の核酸配列には、明示的に指定された配列のほかに、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換物）および相補的配列が暗黙的に含まれる。詳細には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択した（またはすべての）コドンの第3の位置が、混合塩基および/またはデオキシイノシン残基によって置換された配列を生じさせることによって行いうる（Batzerら、Nucleic Acids Res. 19: 5081 (1991)；Ohtsukaら、J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985)；およびCassolら(1992)；Rossoliniら、Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)）。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、および遺伝子によってコードされるmRNAと互換的に用いられる。
【００３７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において、アミノ酸残基の重合体を指す目的で互換的に用いられる。これらの用語は、天然アミノ酸重合体および非天然アミノ酸重合体のほか、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸重合体に対しても適用される。本明細書で用いる場合、これらの用語には、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結された、完全長タンパク質（すなわち、抗原）を含む任意の長さのアミノ酸鎖が含まれる。
【００３８】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸のほか、天然のアミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物のことも指す。天然のアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるもののほか、その後に修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸およびO-ホスホセリンなどののこともいう。アミノ酸類似体とは、天然のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびR基と結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムのことを指す。この種の類似体は、改変されたR基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。「アミノ酸模倣物」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するものの天然アミノ酸と類似した様式で機能する化合物のことを指す。
【００３９】
本明細書ではアミノ酸を、一般的に知られた三文字記号、またはIUPAC-IUBの生化学物質命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）が推奨している一文字記号のいずれかによって参照する。ヌクレオチドも同じく、一般的に認められている一文字記号によって参照する。
【００４０】
「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に対して適用される。個々の核酸配列に関して、「保存的に改変されたバリアント」とは、同一もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸のことを指し、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一な配列のことを指す。遺伝暗号の縮重性のために、任意のタンパク質は多数の機能的に同一な核酸によってコードされうる。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUはすべてアラニンというアミノ酸をコードする。このため、コドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを変化させずに、そのコドンを対応する上記のコドンのいずれかに変化させることができる。このような核酸変形物は「サイレント変形物」であり、保存的に改変された変形物の一種である。何らかのポリペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、その核酸のあらゆる可能なサイレント変形物についても述べている。当業者は、核酸内の各コドン（通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるAUG、および通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く）を改変して、機能的に同一な分子を作製しうることを理解すると考えられる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各々のサイレント変形物は、記載する各配列に黙示的に含まれる。
【００４１】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸または少数のアミノ酸が改変、付加または除去される、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する個々の置換物、欠失物または付加物が、改変によってアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置換されるような「保存的に改変されたバリアント」であることを理解すると考えられる。機能的に類似したアミノ酸が得られる保存的置換の表も当技術分野で周知である。このような保存的に改変されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間相同体および対立遺伝子に加わるものであり、それらが除外されるわけではない。
【００４２】
以下の8つの群はそれぞれ、互いに保存的なアミノ酸を含む：
1）アラニン（A）、グリシン（G）；
2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4）アルギニン（R）、リジン（K）；
5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；
7）セリン（S）、トレオニン（T）；および
8）システイン（C）、メチオニン（M）
（例えば、Creighton、「タンパク質（Proteins）」（1984）を参照されたい）。
【００４３】
「配列一致率（percentage of sequence identity）」は、最適なアラインメントがなされた2つの配列を比較域（comparison window）にわたって比較することによって決定され、この際、比較域中のポリヌクレオチド配列の一部分は、2つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。この率は、両方の配列に同一の核酸塩基または残基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を求め、一致した位置の数を比較域における位置の総数で除算し、その結果に100を掛けて配列一致率を求めることによって算出される。
【００４４】
2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一である」または「一致」率という用語は、一定の比較域にわたって、または以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いるかもしくは手作業によるアラインメントおよび目視検査によって指定された領域にわたって、最大の対応関係が得られるように比較およびアラインメントを行った場合に、同じである、または同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドが指定された比率である（すなわち、指定された領域にわたって60％の同一性、選択的には65％、70％、75％、80％、85％、90％または95％の同一性）、2つまたはそれ以上の配列または部分配列のことを指す。このような配列を「実質的に同一である」と言う。この定義は、被験配列の相補物のことも指す。選択的には、同一性は、少なくとも約50ヌクレオチド長の領域にわたって、またはより好ましくは100〜500ヌクレオチド長もしくは1000ヌクレオチド長またはそれ以上の領域にわたって存在する。
【００４５】
2つまたはそれ以上のポリペプチド配列の文脈において、「類似性」または「類似」率という用語は、一定の比較域にわたって、または以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いるかもしくは手作業によるアラインメントおよび目視検査によって指定された領域にわたって、最大の対応関係が得られるように比較およびアラインメントを行った場合に、同じである、または上に定義した8種の保存的アミノ酸置換の定義による類似性のあるアミノ酸残基が指定された比率である（すなわち、指定された領域にわたって60％、選択的には65％、70％、75％、80％、85％、90％または95％の類似性）、2つまたはそれ以上の配列または部分配列のことを指す。このような配列を「実質的に類似している」と言う。選択的には、この同一性は、少なくとも約50ヌクレオチド長の領域にわたって、またはより好ましくは少なくとも約100〜500アミノ酸長または1000もしくはそれ以上のアミノ酸長の領域にわたって存在する。
【００４６】
配列比較のためには、1つの配列を、被験配列と比較するための参照配列として用いることが一般的である。配列比較アルゴリズムを用いる場合には、被験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列の座標を指定して、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。デフォールトのプログラムパラメーターを用いることもでき、別のパラメーターを指定することもできる。続いて、プログラムのパラメーターに基づいて、参照配列に対する被験配列の配列一致率または類似率を配列比較アルゴリズムで計算する。
【００４７】
本明細書で用いる「比較域（comparison window）」は、2つの配列の最適なアラインメントを行った後に、ある配列を同じ数の連続した位置を持つ参照配列と比較しうるような、20〜600個、通常は約50〜約200個、より一般的には約100〜約150個からなる群から選択される数の連続した位置のいずれか1つの区域に対する言及を含んでいる。比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、SmithおよびWaterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482cの局所的相同性アルゴリズムにより、NeedlemanおよびWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443の相同性アラインメントアルゴリズムにより、PearsonおよびLipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci.USA 85: 2444の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ・インプリメンテーション（Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）により、または手作業によるアラインメントおよび目視検査によって行うことができる（例えば、Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」（1995年補遺）を参照されたい）。
【００４８】
有用なアルゴリズムの一例がPILEUPである。PILEUPは漸進的な対形式のアラインメントを用いて一群の関連配列から多数の配列アラインメントを作成し、関連性および配列一致率を提示する。これはアラインメントを作成するために用いたクラスター化の関係を示す樹状図またはデンドログラムのプロットも行う。PILEUPは、FengおよびDoolittle、J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987)の漸進的アラインメント法を単純化したものを用いている。用いている方法は、HigginsおよびSharp、CABIOS 5: 151-153 (1989)と類似している。このプログラムは、それぞれ最大長が5,000ヌクレオチドまたはアミノ酸である最大300個の配列のアラインメントを行うことができる。最も類似した2つの配列の対形式のアラインメントから多数のアラインメント手順が始まり、アラインメントされた2つの配列のクラスターが作成される。続いてこのクラスターを、次に最も関連性の高い配列、またはアラインメントされた配列のクラスターに対してアラインメントを行う。2つの配列クラスターは、個々の2つの配列の対形式のアラインメントを単純に拡張することによってアラインメントを行う。最終的なアラインメントは、一連の漸進的な対形式のアラインメントを行うことによって得られる。このプログラムは、配列を比較する領域に関して特定の配列およびそのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することにより、ならびにプログラムパラメーターを指定することによって実行される。PILEUPを用いる場合には、以下のパラメーターを用いて参照配列を他の被験配列と比較して、配列一致率を決定する：デフォールトのギャップウェイト（gap weight）（3.00）、デフォールトのギャップ長ウェイト（gap length weight）（0.10）および重み付けエンドギャップ（weighted end gap）。PILEUPは、GCC配列解析ソフトウエアパッケージ、例えば、バージョン7.0（Devereauxら (1984)、Nuc. Acids Res. 12: 387-395）から入手可能である。
【００４９】
配列一致率および配列類似性の決定のために適した1つのアルゴリズムの別の例が、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、それぞれAltschulら、Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977)およびAltschulら、J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)に記載されている。BLAST解析を行うためのソフトウエアは米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.n1m.nih.gov/）に公開されている。このアルゴリズムでは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列化した場合に何らかの正値の閾値スコアTと一致する、またはそれを満たす、長さWの短いワードを検索配列中に同定することにより、高スコアの配列ペア（HSP）をまず同定する。Tは近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschulら、前記）。これらの初期の近隣ワードでのヒットは、それらを含む長いHSPを見いだすための検索を開始する源となる。ワードの検索は、累積アラインメントスコアが増加する限り、各配列の両方向に対して延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターM（一致する残基対に関する報酬スコア；常に＞0）およびN（ミスマッチ残基に関するペナルティスコア；常に＜0）を用いて算出する。アミノ酸配列の場合には、累積スコアの算出にスコア行列を用いる。各方向へのワード検索の延長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアが最大達成値に比べて量Xより低くなった場合：1つもしくは複数の負スコアの残基アラインメントの蓄積のために累積スコアがゼロまたはそれ未満になった場合；または配列のいずれかの端に達した場合。BLASTアルゴリズムのパラメーターであるW、TおよびXは整列化の感度および速度を決定する。BLASTNプログラムは（ヌクレオチド配列の場合）、デフォールトとしてワード長（W）11、期待値（E）10、M＝5、N＝-4および両ストランドの比較を用いる。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムはデフォールトとしてワード長3および期待値（E）10、ならびにBLOSUM62スコア行列（HenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915 (1989)を参照）のアラインメント（B）50、期待値（E）10、M＝5、N＝-4および両ストランドの比較を用いる。
【００５０】
BLASTアルゴリズムは、2つの配列の間の類似性に関する統計分析も行う（例えば、KahnおよびAltschul (1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照）。BLASTアルゴリズムによって得られる類似性の指標の1つは最小合計確率（smallest sum probability）（P(N)）であり、これは2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標となる。例えば、ある核酸は、被験核酸と参照核酸との比較による最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満の場合に、参照配列と類似しているとみなされる。
【００５１】
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標の1つは、以下に述べるように、第1の核酸によってコードされるポリペプチドが、第2の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば、2つのペプチドが保存的置換のみの点で異なる場合、ポリペプチドは一般に第2のポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であるというもう1つの指標は、以下に述べるように、2つの分子またはその相補物がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。2つの核酸配列が実質的に同一であるというさらにもう1つの指標は、配列の増幅に同じプライマーを用いうることである。
【００５２】
「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」という語句は、ある分子の結合、二重鎖形成またはハイブリダイゼーションが、その配列が複合混合物（例えば、全細胞またはライブラリーのDNAまたはRNA）中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定のヌクレオチド配列のみに対して起こることを指す。
【００５３】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、一般的には核酸の複合混合物において、プローブがその標的部分配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしないと考えられる条件のことを指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、環境が異なれば異なると考えられる。配列が長いほど高い温度で特異的にハイブリダイズすると考えられる。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細な手引きは、Tijssen、「Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes」、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」（1993）に記載がある。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHでの特定の配列の融点（Tｍ）よりも約5〜10℃低くなるように選択する。Tｍは、標的に対して相補的なプローブの50％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、pHおよび核酸濃度の下で）である（標的配列が過剰に存在するため、Tｍでは平衡状態でプローブの50％が占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がナトリウムイオン濃度で約1.0M未満、一般的にはナトリウムイオン（または他の塩の）濃度で約0.01〜1.0M、pH7.0〜8.3であり、温度は短いプローブ（例えば、10〜50ヌクレオチド）に関しては少なくとも約30℃であって、（例えば、50ヌクレオチドを上回るもの）に関しては少なくとも約60℃であると考えられる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの脱安定剤の添加によっても得られる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンド値の少なくとも2倍、選択的にはバックグラウンドでのハイブリダイゼーションの10倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては以下のものが考えられる：50％ホルムアミド、5×SSCおよび1％SDS、42℃でインキュベートを行い、または5×SSC、1％SDS、65℃でインキュベートを行い、その上で0.2×SSCおよび0.1％SDS、65℃で洗浄する。このような洗浄は5、15、30、60、120分またはさらに多くの分数にわたって行いうる。
【００５４】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸も、それらをコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、やはり実質的に同一である。これは例えば、遺伝暗号によって許容される最大のコドン縮重性を用いて生じた核酸のコピーの場合に起こる。このような場合には、核酸は一般に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の例には、40％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDS、37℃の緩衝液中でのハイブリダイゼーション、および1×SSC、45℃での洗浄が含まれる。このような洗浄は、5、15、30、60、120分またはさらに多くの分数にわたって行いうる。陽性のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍である。代替的なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を用いて同様に厳密な条件が得られることを、当業者は容易に認識すると考えられる。
【００５５】
「〜をコードする核酸配列」という語句は、rRNA、tRNAなどの構造RNA、または特定のタンパク質もしくはペプチドの一次アミノ酸配列、またはトランス作用性調節因子の結合部位に関する配列情報を含む核酸のことを指す。この語句には特に、特定の宿主細胞におけるコドン選好性に適合するように導入しうる、1つまたは複数の天然配列の縮重コドン（すなわち、単一のアミノ酸をコードする複数種のコドン）が含まれる。
【００５６】
細胞、核酸、タンパク質またはベクターなどに言及して用いる場合、「組換え」という用語は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸またはタンパク質の改変によって改変されたこと、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを意味する。このため、例えば、組換え細胞は、天然型（非組換え型）の細胞に認められない遺伝子を発現する、または、通常であれば異常発現される、低発現される、もしくは全く発現されないような天然遺伝子を発現する。
【００５７】
核酸の部分に言及して用いる場合、「異種」という用語は、核酸が、自然下ではお互いに同じ関係では認められない2つまたはそれ以上の部分配列を含むことを意味する。例えば、核酸は一般に、例えば、1つの源からのプロモーターおよび別の源からのコード領域というように、関連のない遺伝子に由来する2つまたはそれ以上の配列が新たな機能的核酸を生じるように配置された形で、組換え法によって産生される。同様に、異種タンパク質とは、タンパク質が、自然下ではお互いに同じ関係では認められない2つまたはそれ以上の部分配列を含むことを意味する（例えば、融合タンパク質）。
【００５８】
「発現ベクター」とは、宿主細胞内での特定の核酸の転写を許容する一連の指定された核酸配列を有する、組換え法または合成によって作製された核酸構築物のことである。発現ベクターはプラスミド、ウイルスまたは核酸断片の部分であってもよい。発現ベクターは、プロモーターと機能的に結合した転写用の核酸を含むことが一般的である。
【００５９】
「抗体と特異的に（もしくは選択的に）結合する」または「との特異的な（もしくは選択的な）免疫反応性がある」という語句は、タンパク質またはペプチドについて言及する場合、タンパク質および他の生体物質の不均一な集団の存在下でそのタンパク質の存在を決定づける結合反応のことを指す。すなわち、指示されたイムノアッセイ条件下で、指定された抗体は試料中に存在するある特定のタンパク質と結合し、他のタンパク質とは有効な量では結合しない。このような条件下での抗体に対する特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性の点から選択された抗体が必要と思われる。例えば、本発明のいずれかのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して産生された抗体を選択して、そのタンパク質とは特異的に免疫反応し、多型バリアントを除く他のタンパク質とは反応しない抗体を得ることができる。特定の抗体に対する特異的な免疫反応性のある抗原を選択するためには、さまざまなイムノアッセイ形式を用いうる。例えば、フローサイトメトリーおよびFACS分析または免疫組織化学が、あるタンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するためにルーチン的に用いられている。特異的免疫反応性の決定に用いうるイムノアッセイの形式および条件の記載については、例えば、HarlowおよびLane、「Antibodies, Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Publications, NY (1988)を参照されたい。通常、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドの信号または雑音の少なくとも2倍であると考えられ、より一般的にはバックグラウンドの10〜100倍を上回ると考えられる。
【００６０】
BIKの発現またはBIK活性の「阻害物質」「活性化物質」および「修飾物質」は、BIKの発現またはBIK活性に関するインビトロおよびインビボでのアッセイ法を用いて同定された、それぞれ阻害性、活性化性または修飾性の分子、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニストならびにそれらの相同体および模倣物を指して用いられる。「修飾物質」という用語には阻害物質および活性化物質が含まれる。阻害物質とは、例えば、BIKの発現を阻害する、またはBIKと結合する、賦活もしくは酵素活性を部分的もしくは完全に阻止する、BIKの活性を低下させる、妨げる、活性化を遅らせる、不活性化する、感受性を低下させる、もしくは活性をダウンレギュレートする作用物質、例えばアンタゴニストのことである。活性化物質とは、例えば、BIKの発現を誘導もしくは活性化する、またはBIKと結合する、それを賦活する、増加させる、開口させる、活性化する、促通する、活性化もしくは酵素活性を増強する、感受性を高める、もしくはその活性をアップレギュレートする作用物質、例えばアゴニストのことである。修飾物質には、天然および合成性のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、低分子量化学分子などが含まれる。阻害物質および活性化物質に関するこの種のアッセイ法には、例えば、BIK修飾物質の存在下または非存在下で、修飾性化合物と推定されるものを膵臓細胞または他のBIK発現細胞に対して適用した後に、上記のように、BIK活性に対する機能的な影響を判定することが含まれる。影響の程度を検討するには、活性化物質、阻害物質または修飾物質の候補によって処理したBIKを含む試料またはアッセイ物を、阻害物質、活性化物質または修飾物質を含まない対照試料と比較する。対照試料（阻害物質で処理していないもの）をBIKの相対活性値100％と指定する。BIKの阻害は、BIKの活性値が対照に比して約80％、選択的には50％または25〜1％である場合に達成される。BIKの活性化は、BIKの活性値が対照に比して110％、選択的には150％、選択的には200〜500％または1000〜3000％の高さである場合に達成される。
【００６１】
発明の詳細な説明
I．序論
本出願は、高脂肪食を与えた動物および糖尿病の動物では、驚いたことに、血糖値が正常な健康な動物でのレベルに比して、BIKが高いレベルで発現されることを示す。さらに、BIKの発現は、インスリン産生が起こる膵臓の島細胞で非常に高度である。BIKは細胞の静止電位を維持しているK＋チャンネルである。糖尿病の動物または糖尿病に対する素因のある動物で観察されるBIKのアップレギュレーションは、BIKのアップレギュレーションがインスリン分泌を妨げることを示している。このため、BIKの発現または活性に拮抗することは、糖尿病を治療するために有用である。
【００６２】
本発明は、BIK配列と命名された新たなポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列のほか、糖尿病の診断および治療のためにBIK配列を用いる方法を対象とする。本方法はまた、BIKの発現および活性に対する修飾物質を同定する方法も提供する。このような修飾物質は、1型糖尿病および2型糖尿病、ならびにこうした疾患の病的様相を治療するために有用である。
【００６３】
II．本発明に用いるための一般的な組換え核酸方法
本発明の数多くの態様においては、組換え方法を用いて、目的のBIKをコードする核酸の単離およびクローニングを行う。この種の態様は、例えば、タンパク質発現のためまたはバリアント、誘導体、発現カセットもしくはBIKポリペプチド（例えば、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：9、または配列番号：10）をコードする他の配列の作製時にBIKポリヌクレオチド（例えば、配列番号：1、または配列番号：3）を単離するために、BIK遺伝子の発現を観測するために、さまざまな種におけるBIK配列の単離もしくは検出のために、患者における診断目的のために、例えば、BIKにおける変異を検出するため、もしくはBIK核酸もしくはBIKポリペプチドの発現レベルを検出するために用いられる。いくつかの態様において、本発明のBIKをコードする配列は、異種プロモーターと機能的に結合している。1つの態様において、本発明の核酸は、特に例えばヒト、マウス、ラットなどを含む、任意の哺乳動物に由来する。
【００６４】
A．一般的な組換え核酸方法
本発明は、組換え遺伝学の分野におけるルーチン的な技術に依拠している。本発明における一般的な使用方法を開示している基本的なテキストには、Sambrookら、「Molecular Cloning、Laboratory Manual」（第3版、2001）；Kriegler、「Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual」（1990）；および「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubelら編、1994）が含まれる。
【００６５】
核酸の場合、サイズはキロベース（kb）または塩基対（bp）のいずれかによって表す。これらは、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲルでの電気泳動、配列が決定された核酸、または公表されたDNA配列から得られる推定値である。タンパク質の場合、サイズはキロダルトン（kDa）またはアミノ酸残基数によって表す。タンパク質のサイズは、ゲル電気泳動、配列が決定されたタンパク質、導き出されたアミノ酸配列、または公表されたタンパク質配列から推定される。
【００６６】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22: 1859-1862 (1981)によって最初に記載された固相ホスホロアミダイドトリエステル法に従って、Van Devanterら、Nucleic Acid Res. 12: 6159-6168 (1984)に記載された自動合成装置を用いて化学合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、未変性アクリルアミドゲル電気泳動、またはPearson & Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983)に記載された陰イオン交換HPLCによって行う。
【００６７】
クローニングされた遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、Wallaceら、Gene 16: 21-26 (1981)による二本鎖テンプレートのシークエンシング用の連鎖停止法などを用いたクローニングの後に確認することができる。
【００６８】
B．所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の単離のためのクローニング法
一般に、主題タンパク質をコードする核酸は、cDNAまたはゲノムDNAをコードするように作製されたDNA配列ライブラリーからクローニングされる。特定の配列の位置はオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることによって決定可能であり、後者の配列はBIK配列から導くことができ（例えば、配列番号：1、または配列番号：3）、これはPCRプライマー用の基準となる上に、BIK特異的プローブを単離するのに適した領域を規定する。または、配列を発現ライブラリー中にクローニングする場合には、発現された組換えタンパク質を、目的のBIKに対して作製された抗血清または精製抗体を用いて免疫学的に検出することもできる。
【００６９】
ゲノムライブラリーおよびcDNAライブラリーの作製およびスクリーニングのための方法は当業者に周知である（例えば、GublerおよびHoffman、Gene 25: 263-269 (1983)；BentonおよびDavis、Science, 196: 180-182 (1977)；およびSambrook、前記を参照されたい）。膵細胞はBIK RNAおよびcDNAを単離するのに適した細胞の一例である。
【００７０】
簡潔に述べると、cDNAライブラリーを作製するためには、mRNAを豊富に含む源を選択する必要がある。続いて、mRNAをcDNAにし、組換えベクター中に連結した上で、増殖、スクリーニングおよびクローニングのために組換え宿主にトランスフェクトする。ゲノムライブラリーの場合には、DNAを組織または細胞から抽出し、機械的剪断または酵素消化のいずれかにより、好ましくは約5〜100kbの断片を得る。続いて勾配遠心によって断片を望ましくないサイズのものから分離し、バクテリオファージλベクター中に構築する。これらのベクターおよびファージのパッケージングをインビトロで行い、組換えファージをプラークハイブリダイゼーションによって分析する。コロニーハイブリダイゼーションは、Grunsteinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961-3965 (1975)に一般的に記載された通りに行う。
【００７１】
代替的な1つの方法では、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用とmRNAまたはDNAテンプレートの増幅とを組み合わせる。適したプライマーは、特定のBIK配列、例えば、配列番号：1、または配列番号：3で前記に示された配列から設計することができる。このポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法では、目的のタンパク質をコードする核酸を、mRNA、cDNA、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーから直接増幅する。制限酵素部位をプライマーに組み入れることができる。ポリメラーゼ連鎖反応または他のインビトロ増幅法は、例えば、特定のタンパク質をクローニングして前駆タンパク質を発現させるため、生理的試料中の本発明のBIKポリペプチドをコードするmRNAの存在を検出するためのプローブとして用いるための核酸を合成するため、核酸シークエンシングのため、またはその他の目的のためにも有用と思われる（米国特許第4,683,195号および第4,683,202号を参照）。PCR反応によって増幅された遺伝子はアガロースゲルから精製し、適したベクター中にクローニングすることができる。
【００７２】
本発明のBIKポリペプチドをコードする遺伝子を哺乳動物組織から同定するために適切なプライマーおよびプローブは、本明細書で提供する配列、特に配列番号：1、もしくは配列番号：3、または配列番号：2および配列番号：4のBIKポリペプチド中のコードアミノ酸から導くことができる。PCRの一般的な概説については、Innisら、「PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications」、Academic Press、San Diego (1990)を参照されたい。
【００７３】
合成オリゴヌクレオチドを遺伝子の構築に用いることができる。これは、遺伝子のセンス鎖および非センス鎖の両方に相当する、通常は長さ40〜120bpの一連の重複オリゴヌクレオチドを用いて行われる。続いて、これらのDNA断片のアニーリング、連結およびクローニングを行う。
【００７４】
本発明のBIKポリペプチドをコードする遺伝子を、発現のために哺乳動物細胞への形質転換導入を行う前に、中間ベクター中にクローニングすることができる。これらの中間ベクターは原核生物ベクターまたはシャトルベクターであることが一般的である。タンパク質は、当業者に周知の標準的な方法を用いて原核生物に発現させることもでき、または以下に述べるように真核生物において発現させることもできる。
【００７５】
III．本発明のタンパク質の精製
天然型および組換え型のBIKはいずれも、機能アッセイ法に用いるために精製することができる。天然型BIKポリペプチドは、例えば、膵細胞などのほ乳類（例えば、ヒト）の組織、またはBIKオルソログの任意の他の源から精製することができる。組換えBIKは、任意の適した発現系から精製しうる。
【００７６】
硫酸アンモニウムなどの物質による選択的沈殿、カラムクロマトグラフィー、免疫精製法などを含む標準的な技術により、BIKを実質的に純粋になるまで精製することもできる（例えば、Scopes, 「Protein Purification: Principles and Practice」(1982)；米国特許第4,673,641号；Ausubelら、前記；およびSambrookら、前記を参照）。
【００７７】
組換えBIKを精製する場合にはさまざまな方法を用いうる。例えば、分子接着特性が立証されているタンパク質をBIKと可逆的に融合させることができる。適切なリガンドを用いて、BIKを精製カラムに選択的に吸着させ、次にそれをカラムから比較的純粋な形で遊離させることができる。続いて、酵素活性によって融合タンパク質を分離することができる。イムノアフィニティーカラムを用いてBIKを精製することも可能である。
【００７８】
A．組換え細菌からのタンパク質の精製
組換えタンパク質を形質転換細菌によって大量に発現させる場合に（通常はプロモーター誘導による、ただし発現は構成性でもよい）、タンパク質が不溶性凝集物を形成することがある。タンパク質封入体の精製に適したプロトコールがいくつかある。例えば、凝集タンパク質（本明細書では以後、封入体と称する）の精製には一般に、通常は約100〜150μg/mlリソソームおよび0.1％ノニデットP-40（非イオン性界面活性剤）を含む緩衝液中でのインキュベーションによる（ただし、これには限定されない）細菌細胞の破壊により、封入体の抽出、分離および/または精製が行われる。細胞浮遊液はPolytronグラインダー（Brinkman Instruments, Westbury, NY）を用いて破砕することができる。または、細胞を氷上で超音波処理することもできる。細菌を可溶化する代替的な方法は、Sambrookら、前記およびAusubelら、前記に記載されており、当業者には明らかであると考えられる。
【００７９】
細胞浮遊液を一般的には遠心し、封入体を含むペレットを、封入体を溶解させることはないが洗浄は行える緩衝液、例えば、20mM Tris-HCl（pH 7.2）、1mM EDTA、150mM NaClおよび2％Triton-X 100（非イオン性界面活性剤）中に再懸濁する。できるだけ多くの壊死細胞片を除去するために、洗浄の段階を繰り返すことが必要なこともある。封入体の残りのペレットを、適切な緩衝液（例えば、20mMリン酸ナトリウム、pH 6.8、150mM NaCl）中に再懸濁してもよい。その他の適切な緩衝液は当業者に明らかであると考えられる。
【００８０】
洗浄段階の後に、強力な水素受容体であり、かつ強力な水素供与体でもある溶媒（またはこれらの特性の一方をそれぞれが有する溶媒の組み合わせ）の添加によって封入体を可溶化する。続いて、封入体を形成したタンパク質を、適合性のある緩衝液による希釈または透析によって再生させることができる。適した溶媒には、尿素（約4M〜約8M）、ホルムアミド（容積/容積比で少なくとも約80％）および塩酸グアニジン（約4M〜約8M）が含まれる。凝集体形成性タンパク質を可溶化しうるいくつかの溶媒、例えばSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）および70％ギ酸は、タンパク質が非可逆的に変性し、免疫原性および/または活性がなくなる恐れがあるため、この手順に用いるには適していない。塩酸グアニジンおよび類似の薬剤は変性剤であるが、この変性は非可逆的ではなく、変性剤を除去（例えば、透析による）または希釈すると再生が起こり、目的の免疫学的および/または生物学的に活性のあるタンパク質が再構成される。可溶化の後には、標準的な分離法により、タンパク質を他の細菌タンパク質から分離することができる。
【００８１】
または、ポリペプチドを細菌の周辺質から精製することも可能である。タンパク質が細菌の周辺質に輸出された時点で、細菌の周辺質画分を低温浸透圧ショック、さらには当技術分野で知られた他の方法によって単離することができる（Ausubelら、前記を参照）。周辺質から組換えタンパク質を単離するためには、細菌細胞に遠心処理を行ってペレット化する。このペレットを20％スクロースを含む緩衝液中に再懸濁する。細胞を可溶化するためには、細菌を遠心し、氷冷した5mM MgSO4中にペレットを再懸濁して、氷浴中に約10分間おく。この細胞浮遊液を遠心し、上清をデカントして回収する。上清中に存在する組換えタンパク質は、当業者に知られた標準的な分離法によって宿主タンパク質から分離することができる。
【００８２】
B．昆虫細胞からのタンパク質の精製
タンパク質を、例えばFernandezおよびHoeffler、「Gene Expression Systems」(1999)に記載されたような真核生物遺伝子発現系から精製することもできる。いくつかの態様において、バキュロウイルス発現系は本発明のBIKタンパク質またはその他のタンパク質を単離するために用いられる。組換えバキュロウイルスは一般に、バキュロウイルスのポリへドロンコード配列を、発現させようとする遺伝子（例えば、BIKポリヌクレオチド）で置き換えることによって作製される。ポリへドロン遺伝子を欠くウイルスは特有のプラーク形態を有しているため、認識が容易である。いくつかの態様において、組換えバキュロウイルスは目的のポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドがポリへドロンプロモーターと機能的に結合するように、導入ベクター（例えば、pUCをベースとするベクター）中にまずクローニングすることによって作製される。導入ベクターを野生型DNAとともに昆虫細胞（例えば、Sf9細胞、Sf21細胞またはBT1-TN-5B1-4細胞）にトランスフェクトして、野生型ウイルスDNA中のポリへドロン遺伝子と目的のポリヌクレオチドとの相同組換えおよび置換を生じさせる。続いてウイルスを生じさせ、プラークを精製することができる。昆虫細胞のウイルス感染によってタンパク質発現が起こる。発現されたタンパク質は、分泌される場合には細胞上清から収集でき、細胞内にある場合には細胞可溶化物から収集できる。例えば、Ausubelら、およびFernandezおよびHoeffler、前記を参照されたい。
【００８３】
C．タンパク質を精製するための標準的なタンパク質分離法
1．溶解性による分別
しばしば最初の工程として、さらにタンパク質混合物が複合体である場合には、最初に塩分別を行うことにより、不要な宿主細胞タンパク質（または細胞培養液に由来するタンパク質）の多くを目的の組換えタンパク質から分離することができる。好ましい塩は、例えば硫酸アンモニウムでありうる。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を効果的に減らすことによってタンパク質を沈殿させる。そこでタンパク質は溶解性の点から沈殿する。タンパク質の疎水性が高いほど、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する可能性が高い。典型的なプロトコールでは、タンパク質溶液に硫酸アンモニウム飽和溶液を添加し、その結果、硫酸アンモニウム濃度が20〜30％となるようにする。これによって最も疎水性の高いタンパク質が沈殿すると考えられる。次に沈殿物を廃棄し（目的のタンパク質が疎水性でない場合）、硫酸アンモニウムを上清に添加し、目的のタンパク質が沈殿することが知られた濃度にする。続いて、沈殿物を緩衝液に溶解し、必要であれば過剰な塩を透析または透析濾過によって除去する。低温エタノール沈殿法などの、タンパク質の溶解性に依拠するその他の方法も当業者に知られており、複合タンパク質混合物の分別に用いることができる。
【００８４】
2．サイズの差に基づく濾過
算出された分子量に基づき、種々の孔径の膜（例えば、Amicon社またはMillipore社の膜）を通過させる限外濾過を用いて、それよりもサイズが大きいまたは小さいタンパク質を単離することができる。第1の工程として、分子量カットオフ値が目的のタンパク質の分子量よりも低い孔径の膜を通してタンパク質混合物の限外濾過を行う。続いて、限外濾過後の保持物質に、分子量カットオフ値が目的のタンパク質の分子量よりも高い膜に対する限外濾過を行う。組換えタンパク質はこの膜を通過して濾液に入ると考えられる。続いて、以下に述べるように濾液のクロマトグラフィーを行うことができる。
【００８５】
3．カラムクロマトグラフィー
目的のタンパク質を、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性および異種分子に対する親和性に基づいて他のタンパク質から分離することもできる。さらに、タンパク質に対して産生された抗体をカラム基質に結合させて、タンパク質の免疫精製を行うこともできる。これらの方法はすべて当技術分野で周知である。
【００８６】
赤血球凝集素（HA）、FLAG、Xpress、Myc、ヘキサヒスチジン（His）、およびグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）などのような様々なアフィニティータグに対して産生された抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーは、ポリペプチドを精製するために用いることができる。Hisタグもある金属（例えば、Ni）のキレート剤として作用し、従って、その金属もHis含有ポリペプチドを精製するために用いることができる。精製後、タグは任意で、特異的なタンパク質分解酵素により除去される。
【００８７】
クロマトグラフィー法を任意の規模で、しかもさまざまな製造者（例えば、Pharmacia Biotech）による装置を用いて行えることは、当業者には明らかであると考えられる。
【００８８】
IV．本発明のポリヌクレオチドの検出
当業者は、BIKポリヌクレオチドの発現の検出には多くの用途があることを認識すると考えられる。例えば、本明細書で考察するように、患者におけるBIK対立遺伝子またはBIKレベルの検出は、糖尿病を、または糖尿病の病的な影響の少なくともいくつかに対する素因を診断するために有用である。さらに、遺伝子発現の検出がBIK発現の修飾物質を同定するのに有用である。
【００８９】
核酸ハイブリダイゼーション法を用いた特定のDNAおよびRNAのさまざまな測定方法が当業者に知られている（Sambrook、前記を参照）。いくつかの方法は電気泳動分離を用いるが（例えば、DNAの検出のためのサザンブロット法、およびRNAの検出のためのノーザンブロット法）、DNAおよびRNAの測定を電気泳動分離を用いずに行うこともできる（例えば、ドットブロットによる）。ゲノムDNA（例えば、ヒトからのもの）のサザンブロット法は、本発明のBIKポリペプチドに影響を及ぼす遺伝的障害の存在を検出するための制限断片長多型（RFLP）に関するスクリーニングに用いることができる。
【００９０】
核酸ハイブリダイゼーションの形式の選択は特に重要ではない。さまざまな核酸ハイブリダイゼーション形式が当業者に知られている。例えば、一般的な形式にはサンドイッチアッセイ法および競合アッセイ法または置換（displacement）アッセイ法が含まれる。ハイブリダイゼーション法の概論は、HamesおよびHiggins、「Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach」、IRL Press (1985)；GallおよびPardue、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 63: 378-383 (1969)；ならびにJohnら、Nature, 223: 582-587 (1969)に記載されている。
【００９１】
ハイブリダイゼーション複合体の検出には、シグナルを生成する複合体が、標的とプローブポリヌクレオチドまたは核酸との二重鎖と結合する必要があると思われる。一般に、この種の結合は、リガンド結合プローブとシグナルが結合したアンチリガンド（anti-ligand）との間のような、リガンドとアンチリガンドとの相互作用によって生じる。シグナル生成複合体の結合は、超音波エネルギーに対する曝露による促進にも容易に適用しうる。
【００９２】
標識により、ハイブリダイゼーション複合体の間接的な検出も可能となる。例えば、標識がハプテンまたは抗原である場合には、抗体を用いることによって試料を検出しうる。これらの系において、シグナルは、蛍光分子もしくは酵素分子が抗体と結合することにより、または場合によっては放射性標識との結合によって生成される（例えば、Tijssen, 「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays」、「Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology」、Burdonおよびvan Knippenberg編、Elsevier (1985)、pp. 9-20を参照）。
【００９３】
プローブは一般に、同位体、発色団、発光団（lumiphore）、色素体の場合のように直接標識されるか、後にストレプトアビジン複合体が結合するビオチンの場合のように間接的に標識される。このため、本発明のアッセイ法に用いられる検出可能な標識は、一次標識（標識が直接検出可能な因子を含むか、直接検出可能な因子を生成する場合）でも二次標識（免疫学的標識において一般的なように、検出される標識が一次標識と結合する場合）でもよい。一般に、標識されたシグナル核酸がハイブリダイゼーションの検出に用いられる。相補的核酸またはシグナル核酸は、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの存在の検出に通常用いられるいくつかの方法の任意の1つによって標識しうる。最も一般的な検出方法は、３H、125I、35S、14Cまたは32Pで標識したプローブなどを用いるオートラジオグラフィーの使用である。
【００９４】
他の標識には、例えば、標識された抗体と結合するリガンド、蛍光団、化学発光物質、酵素、および、標識されたリガンドに対する特異的な結合対のメンバーとして作用する抗体が含まれる。標識、標識手順および標識の検出に関する手引きは、PolakおよびVan Noorden、「Introduction to Immunocytochemistry」第2版、Springer Verlag、NY (1997)；ならびにMolecular Probes, Inc.によって刊行された総合的なハンドブックおよびカタログであるHaugland「Handbook of Fluoroscent Probes and Research Chemicals」(1996)に記載されている。
【００９５】
一般には、検出用試薬の標識の検出には、特定のプローブまたはプローブの組み合わせを観測する検出器を用いる。典型的な検出器は、分光光度計、光電管および光ダイオード、顕微鏡、シンチレーションカウンター、カメラ、フィルムなど、さらにはそれらの組み合わせを含む。適した検出器の例は、当業者に知られたさまざまな販売元から広く入手可能である。一般的には、結合した標識部分（labeling moiety）を含む基質の光学画像を以後のコンピュータ解析のためにデジタル化する。
【００９６】
最も一般的には、例えばBIK RNAの量は、検出試薬の結合によって固体支持体に固定された標識の量を定量することによって測定される。一般に、インキュベーション中に修飾物質が存在することにより、固体支持体と結合した標識の量は、修飾物質を含まない対照インキュベーションと比べて、または個々の反応の種類に対して確立されたベースラインと比べて、増加または減少すると考えられる。標識の検出および定量のための手段は当業者に周知である。
【００９７】
いくつかの態様においては、標的核酸またはプローブを固体支持体に対して固定化する。本発明のアッセイ法に用いるのに適した固体支持体は当業者に周知である。本明細書で用いる場合、固体支持体とは、実質的に固定された配置にある材料のマトリックスのことである。
【００９８】
さまざまな自動化固相アッセイ法も適している。例えば、Affymetrix, Inc.（Santa Clara, CA）から入手しうる超大規模固定化ポリマーアレイ（VLSIPS（商標））すなわち、ジーンチップまたはマイクロアレイを、同一の調節経路に関与する複数の遺伝子の発現レベルの変化を同時に検出するために用いることができる。Tijssen、前記.、Fodorら (1991) Science, 251: 767-777；Sheldonら (1993) Clinical Chemistry 39(4) : 718-719およびKozalら (1996) Nature Medicine 2(7): 753-759を参照されたい。同様に、スポットされたcDNAアレイ（ナイロン、ガラス、または他の固体支持体に結合するcDNA配列アレイ）もまた、多数の遺伝子の発現をモニターするために用いることができる。
【００９９】
通常、アレイの構成要素は、各構成要素が基板上の指定された位置に存在するような秩序立った様式で構成されている。アレイの構成要素は基板上の指定された位置にあるため、ハイブリダイゼーションのパターンおよび強度（この両者によって一意的な発現プロファイルが生成される）を特定の遺伝子の発現レベルに関して解釈ことができ、特定の疾患もしくは状態または治療と関連づけることができる。例えば、Schenaら、Science 270: 467-470 (1995)および（Lockhartら、Nature Biotech. 14: 1675-1680 (1996)）を参照されたい。
【０１００】
ハイブリダイゼーションの特異性は、特異性-対照ポリヌクレオチド配列と、試料に既知の量を添加した特異性-対照ポリヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを比較することによって評価しうる。特異性-対照標的ポリヌクレオチドには、対応するポリヌクレオチド配列に比して1つまたは複数の配列ミスマッチがあってもよい。この方式により、相補的な標的ポリヌクレオチドのみがポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするか、それともミスマッチのあるハイブリッド二重鎖が形成されるかが判定される。
【０１０１】
ハイブリダイゼーション反応は、絶対的または示差的なハイブリダイゼーション形式で行うことができる。絶対的なハイブリダイゼーション形式では、1つの試料由来のポリヌクレオチドプローブをマイクロアレイ形式にある配列とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体の形成後に検出された信号を試料中のポリヌクレオチドプローブのレベルと相関づける。示差的なハイブリダイゼーション形式では、2つの生物試料における遺伝子セットの発現の差異を分析する。示差的ハイブリダイゼーションのためには、両方の生物試料からポリヌクレオチドプローブを調製し、異なる標識部分（labeling moiety）を用いて標識する。2種類の標識ポリヌクレオチドプローブの混合物をマイクロアレイに添加する。続いてマイクロアレイを、2種類の異なる標識からの発光を個別に検出しうる条件下で検査する。両方の生物試料に由来する実質的に同数のポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせたマイクロアレイ中の配列は、異なる複合蛍光を発する（Shalonら、国際公開公報第95／35505号）。いくつかの態様において、標識は識別可能な発光スペクトルを有する蛍光性標識、例えばCy3およびCy5蛍光団である。
【０１０２】
ハイブリダイゼーション後に、ハイブリダイズしなかった核酸を除去するためにマイクロアレイを洗浄し、ハイブリダイズしうるアレイ構成要素とポリヌクレオチドプローブとの複合体形成を検出する。複合体形成の検出のための方法は当業者に周知である。いくつかの態様においては、ポリヌクレオチドプローブを蛍光性標識で標識し、複合体形成を示す蛍光のレベルおよびパターンの測定は、共焦点蛍光顕微鏡などの蛍光顕微鏡によって行われる。
【０１０３】
示差的ハイブリダイゼーション実験では、2種類またはそれ以上の異なる生物試料からのポリヌクレオチドプローブを、発光波長の異なる2種類またはそれ以上の異なる蛍光性標識によって標識する。蛍光シグナルは、特定の波長を検出するように設定した異なる光電子倍増管を用いて検出する。2つまたはそれ以上の試料におけるポリヌクレオチドプローブの相対量／発現レベルを求める。
【０１０４】
通常、複数のマイクロアレイを同様の試験条件下で用いる場合には、ハイブリダイゼーション強度のばらつきを考慮に入れるためにマイクロアレイの蛍光強度を標準化することができる。いくつかの態様において、個々のポリヌクレオチドプローブ／標的複合体のハイブリダイゼーション強度は、各マイクロアレイ上に含まれる内部標準化対照から得られた強度を用いて標準化される。
【０１０５】
核酸の検出は例えば、二重鎖核酸と特異的に結合する標識された検出用部分（例えば、RNA-DNA二重鎖に対して特異的な抗体）を用いて行いうる。1つの例では、抗体が酵素と結合した、DNA-RNAヘテロ二重鎖を認識する抗体を用いる（通常、組換えまたは共有化学結合による）。抗体は、酵素がその基質と反応して検出可能な生成物が生じた場合に検出される。Coutleeら(1989) Analytical Biochemistry 181: 153-162；Bogulavski (1986)ら、J. Immunol. Methods 89: 123-130；Prooijen-Knegt (1982) Exp. Cell Res. 141：397-407；Rudkin (1976) Nature 265: 472-473、Stollar (1970) PNAS 65: 993-1000；Ballard (1982) Mol. Immunol. 19: 793-799；PisetskyおよびCaster (1982) Mol. Immunol. 19：645-650；Viscidiら(1988) J Clin. Microbial. 41: 199-209；ならびにKineyら(1989) J. Clin. Microbiol. 27: 6-12は、ホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖を含むRNA二重鎖に対する抗体を記載している。DNA：RNAハイブリッドに対して特異的な抗体を含むキットは、例えば、Digene Diagnostics, Inc.（Beltsville, MD）から入手可能である。
【０１０６】
入手可能な抗体に加えて、当業者は、核酸二重鎖に対して特異的な抗体を既存の技術を用いて容易に作製することができ、または商業的もしくは公的に入手可能な抗体を改変することもできる。以上に言及した技術に加えて、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法が当業者に知られている（例えば、Paul（編）、「Fundamental Immunology, Third Edition」Raven Press, Ltd., NY (1993)；Coligan, 「Current Protocols in Immunology」、Wiley/Greene, NY (1991)；HarlowおよびLane、「Antibodies: A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Press, NY (1989)；Stitesら（編）「Basic and Clinical Immunology」（第4版）Lange Medical Publications, Los Altos, CAおよびそこに引用された参考文献；Goding、「Monoclonal Antibodies: Principles and Practice」（第2版）Academic Press, New York, NY, (1986)；ならびにKohlerおよびMilstein、Nature 256: 495-497 (1975)を参照されたい）。抗体調製のために適した他の技術には、ファージベクターまたは類似のベクターにおける組換え抗体ライブラリーの選択が含まれる（例えば、Huseら、Science 246: 1275-1281 (1989)；およびWardら、Nature 341: 544-546 (1989)を参照）。特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびに抗血清は、通常、少なくとも約0.1μMのKＤ、好ましくは少なくとも約0.01μMまたはそれ未満、最も一般的かつ好ましくは0.001μMまたはそれ未満のKＤで結合すると考えられる。
【０１０７】
本発明に用いられる核酸は、陽性プローブでも陰性プローブでもよい。陽性プローブはその標的と結合し、二重鎖形成の存在が標的の存在の証拠となる。陰性プローブは疑われる標的とは結合せず、二重鎖形成が存在しないことが標的の存在の証拠となる。例えば、野生型特異的な核酸プローブまたはPCRプライマーの使用は、目的のヌクレオチド配列のみが存在する場合、アッセイ試料における陰性プローブとして役立ちうる。
【０１０８】
ハイブリダイゼーションアッセイ法の感度を、検出しようとする標的核酸を増加させる核酸増幅システムを用いることによって高めることもできる。このようなシステムの例には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）システムおよびリガーゼ連鎖反応（LCR）システムが含まれる。当技術分野で最近記載されているその他の方法には、核酸配列に基づく増幅（NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario）およびQ Betaレプリカーゼシステムがある。これらのシステムは、選択した配列が存在する場合にのみPCRプライマーまたはLCRプライマーが伸長または連結するように設計されている場合、変異体を直接同定するために用いうる。または、選択した配列を、例えば非特異的なPCRプライマーを用いて全体的に増幅し、増幅された標的領域をその後、変異の指標となる特定の配列に対して検索することもできる。Taqmanおよび分子ビーコンプローブを含む様々な検出プローブを増幅反応産物を、例えば即時にモニターするために用いることができることが理解される。
【０１０９】
本発明の核酸の発現レベルを決定するための代替的な手段の一つは、インサイチューハイブリダイゼーションである。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイ法はよく知られており、Angererら、Methods Enzymol. 152: 649-660 (1987)に概論が記載されている。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイ法では、細胞、好ましくは小脳または海馬由来のヒト細胞を固体支持体、一般的にはスライドグラスに対して固定する。DNAを検索しようとする場合には、細胞を熱またはアルカリによって変性させる。続いて細胞を、標識された特異的プローブのアニーリングを可能にする中程度の温度のハイブリダイゼーション溶液と接触させる。プローブは放射性同位体または蛍光レポーターによって標識することが好ましい。
【０１１０】
一塩基多型（SNP）解析も、BIK遺伝子の対立遺伝子（例えば、配列番号：1および9をコードするポリヌクレオチド）間の違いを検出するために有用である。BIKと関連のあるSNPは、患者におけるBIK関連疾患（例えば、糖尿病）の診断に有用である。SNP解析は、BIKまたは他の糖尿病関連標的を対象とする医薬品の有効性を予測するにも有用である。例えば、ある個体が糖尿病と関連のあるBIK関連SNPの少なくとも1つの対立遺伝子を有していれば、その個体は糖尿病に対する素因を持つ可能性が高い。個体が疾患関連BIK SNPに関してホモ接合性であれば、その個体の糖尿病に対する素因は特に大きい。
【０１１１】
Taqmanまたは分子ビーコンを用いるアッセイ法（例えば、米国特許第5,210,015号；同第5,487,972号；Tyagiら、Nature Biotechnology 14: 303 (1996)；および国際公開公報第95／13399号）などを含むさまざまなリアルタイムPCR法は、SNPの有無を観測するために有用である。そのほかのSNP検出法には、例えば、DNAシークエンシング、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング、ドットブロット法、オリゴヌクレオチドアレイ（DNAチップ）ハイブリダイゼーション分析が含まれ、または例えば、米国特許第6,177,249号；Landegrenら、Genome Research, 8: 769-776 (1998)；Botsteinら、Am J Human Genetics 32: 314-331 (1980)；Meyersら、Methods in Enzymology 155: 501-527 (1987)；Keenら、Trends in Genetics 7: 5 (1991)；Myersら、Science 230: 1242-1246 (1985)；およびKwokら、Genomics 23: 138144 (1994)に記載されている。
【０１１２】
V．BIKの免疫学的検出
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いたBIK遺伝子および遺伝子発現の検出のほかに、イムノアッセイ法を用いてBIKポリペプチド、リガンドまたはBIKに結合するもしくはBIK活性を調節する他の分子を検出することも可能である。イムノアッセイ法を用いて、BIKを定性的または定量的に分析することができる。適用可能な技術に関する一般的な概要は、HarlowおよびLane、「Antibodies: A Laboratory Manual」(1988)に記載がある。
【０１１３】
A．標的タンパク質または他の免疫原に対する抗体
目的のタンパク質または他の免疫原と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製のための方法は当業者に知られている（例えば、Coligan、前記；HarlowおよびLane、前記；Stitesら、前記およびそれに引用された参考文献；Goding、前記；ならびにKohlerおよびMilstein、Nature, 256: 495-497 (1975)を参照されたい）。このような技術には、ファージベクターまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体の調製が含まれる（例えば、Huseら、前記；およびWardら、前記を参照のこと）。例えば、イムノアッセイ法に用いるための抗血清を作製するためには、本明細書の記載のように、目的のタンパク質またはその抗原性断片を単離する。例えば、組換えタンパク質を形質転換細胞系において産生させる。マウスまたはウサギの近交系に対して、フロイントアジュバントなどの標準的アジュバントおよび標準的な免疫処置プロトコールを用いてタンパク質の免疫処置を行う。または、本明細書に開示するBIK配列に由来する合成ペプチドは、担体タンパク質と結合させ、かつ免疫原として用いられる。
【０１１４】
ポリクローナル血清を収集し、イムノアッセイ法、例えば、固体支持体上に固定した免疫原を用いる固相イムノアッセイ法において、免疫原に対する力価測定を行う。力価が10４またはそれ以上であるポリクローナル抗血清を選択し、競合結合イムノアッセイ法を用いて、非BIKタンパク質、または場合によっては他の相同タンパク質との交差反応性を調べる。特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は通常、少なくとも約0.1mMのKＤ、より一般的には少なくとも約1μM、好ましくは少なくとも約0.1μMまたはそれ未満、最も好ましくは0.01μMまたはそれ未満のKＤで結合すると考えられる。
【０１１５】
免疫原を含む本発明の多くのタンパク質を、目的のタンパク質と特異的または選択的に反応する抗体の作製に用いることができる。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の作製のために好ましい免疫原である。天然のタンパク質を純粋または不純な状態で用いてもよい。本明細書に記載したタンパク質配列を用いて作製した合成ペプチドを、そのタンパク質に対する抗体の作製のための免疫原として用いることもできる。組換えタンパク質を真核細胞または原核細胞において発現させ、上に一般的に述べた通りに精製することができる。続いて、抗体を産生しうる動物の体内にその生成物を注入する。タンパク質を測定するためのイムノアッセイ法に後で用いるために、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれを作製してもよい。
【０１１６】
ポリクローナル抗体の作製方法は当業者に周知である。簡潔に述べると、免疫原、好ましくは精製タンパク質をアジュバントと混合した上で、動物に免疫処置を行う。検査採血を行い、目的のBIKに対する反応性の力価を測定することにより、免疫原調製物に対する動物の免疫応答を観測する。免疫原に対して適切な高い力価を持つ抗体が得られた時点で、動物から血液を採取し、抗血清を調製する。必要に応じて、タンパク質に反応する抗体を濃縮するために抗血清をさらに分画することもできる（HarlowおよびLane、前記を参照）。
【０１１７】
モノクローナル抗体は、当業者によく知られた種々の技術によって入手しうる。通常は、望ましい抗原による免疫処置を受けた動物から得た脾細胞を、一般的には骨髄腫細胞との融合によって不死化させる（KohlerおよびMilstein、Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976)を参照）。代替的な不死化の方法には、エプスタイン-バーウイルス、癌遺伝子もしくはレトロウイルスによる形質転換、または当技術分野で周知の他の方法が含まれる。単一の不死化細胞から生じたクローンを抗原に対する望ましい特異性および親和性に関してスクリーニングし、このような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物宿主の腹腔内への注射を含む種々の技術によって高めることもできる。または、Huseら、Science 246: 1275-1281 (1989)に概要が示された一般的なプロトコールに従ってヒトB細胞由来のDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体またはその結合性断片をコードするDNA配列を単離することもできる。
【０１１８】
標的免疫原に特異的な抗体がひとたび得られれば、臨床医が利用しうる定性的および定量的な結果が得られる種々のイムノアッセイ法によってその免疫原を測定することができる。免疫学的手順およびイムノアッセイ手順の概説については、Stites、前記を参照されたい。さらに、本発明のイムノアッセイ法を、Maggio, 「Enzyme Immunoassay」、CRC Press, Boca Raton, Florida (1980)；Tijssen、前記；ならびにHarlowおよびLane、前記に詳細に概説がなされた複数の方式のうち任意の形式で行うこともできる。
【０１１９】
ヒト試料中の標的タンパク質を測定するためのイムノアッセイ法に、BIKまたはその断片に対して産生されたポリクローナル抗血清を用いてもよい。この抗血清は非BIKタンパク質に対する交差反応性が低くなるように選択し、イムノアッセイ法に用いる前にこの種の交差反応性を免疫吸着によって除去する。
【０１２０】
B．免疫学的結合アッセイ法
いくつかの態様において、目的のタンパク質は、よく知られたさまざまな免疫学的結合アッセイ法のうち任意のものを用いて検出および/または定量化される（例えば、米国特許第4,366,241号；第4,376,110号；第4,517,288号；および第4,837,168号を参照）。一般的なイムノアッセイ法の概説については、Asai,「Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology」、Academic Press, Inc. NY (1993)；Stites、前記を参照されたい。免疫学的結合アッセイ法（またはイムノアッセイ法）には一般に、分析物（この場合には、本発明のBIK、またはその抗原性部分配列）と特異的に結合し、しばしばそれを固定化する「捕捉剤（capture agent）」が用いられる。捕捉剤は分析物と特異的に結合する部分（moiety）である。好ましい態様において、捕捉剤は、例えば、本発明のBIKポリペプチドと特異的に結合する抗体である。抗体を、当業者に周知の数多くの手段および上記の手段のうち任意のものを用いて作製してもよい。
【０１２１】
イムノアッセイ法には、捕捉剤および分析物によって形成された複合体と特異的に結合し、それを標識する標識剤（labeling agent）もしばしば用いられる。標識剤はそれ自体が抗体/抗原複合体を含む部分の1つであってもよい。または、標識剤が、抗体/タンパク質複合体と特異的に結合する、別の抗体などの第3の部分であってもよい。
【０１２２】
好ましい態様において、標識剤は、標識を有する第2の抗体である。または、第2の抗体は標識を有しておらず、その代わりに、第2の抗体の由来となった種の抗体に対して特異的な標識された第3の抗体が結合していてもよい。第2の抗体は、酵素標識ストレプトアビジンなどの第3の標識分子が特異的に結合しうる、ビオチンなどの標識可能な部分によって修飾することができる。
【０１２３】
免疫グロブリン定常領域と特異的に結合しうるプロテインAまたはプロテインGなどの他のタンパク質を標識剤としても用いてもよい。これらのタンパク質は、連鎖球菌の細胞壁の通常の構成要素である。それらは、さまざまな種に由来する免疫グロブリン定常領域に対して強い非免疫原性反応性を示す（例えば、概論については、Kronvalら、J. Immunol. 111: 1401-1406 (1973)；およびAkerstromら、J. Immunol. 135: 2589-2542 (1985)を参照）。
【０１２４】
アッセイ全体を通じて、試薬の各々の組み合わせを用いた後には、インキュベーションおよび/または洗浄の工程が必要と思われる。インキュベーションの工程は、約5秒から数時間、好ましくは約5分から約24時間の範囲でさまざまでありうる。インキュベーション時間は、アッセイ形式、分析物、溶液の容積、濃度などに依存すると考えられる。通常、アッセイは室温で行うが、10℃〜40℃といった一定範囲の温度で行うこともできる。
【０１２５】
1．非競合アッセイ形式
組織試料から目的のタンパク質または分析物を検出するためのイムノアッセイ法は競合的でも非競合的でもよい。非競合イムノアッセイ法は、捕捉されたタンパク質または分析物の量を直接測定するアッセイ法である。例えば、1つの好ましい「サンドイッチ」アッセイ法では、捕捉剤（例えば、BIK抗体）を、それを固定化するための固体基質に対して直接結合させることができる。続いて、これらの固定化された抗体は、被験試料中に存在するBIKを捕捉する。このようにして固定化されたBIKに対して、次に、標識を有する第2の抗BIK抗体などの標識剤を結合させる。または、第2の抗体には標識がなく、その代わりに、第2の抗体の由来となった種の抗体に対して特異的な第3の抗体をそれと結合させてもよい。第2の抗体は、酵素標識ストレプトアビジンなどの第3の標識分子が特異的に結合しうる、ビオチンなどの標識可能な部分によって修飾することができる。
【０１２６】
2．競合アッセイ形式
競合アッセイ法では、試料中に存在するタンパク質または分析物によって特異的捕捉剤（例えば、BIKに対する抗体）から解離した（競合に敗れた）、添加した（外因性の）タンパク質または分析物（すなわち、目的のBIK）の量を測定することにより、試料中に存在するタンパク質または分析物の量を間接的に測定する。抗体と結合したBIKの量は、試料中に存在する免疫原の濃度と反比例する。1つの特に好ましい態様では、抗体を固体基質上に固定化する。分析物の量は、標識された分析対象分子を用意することによって検出しうる。標識に、例えば放射性標識のほかに、抗体などの検出試薬によって認識されうるペプチドまたはその他のタグ標識も含まれうることは、認識されている。
【０１２７】
競合結合形式のイムノアッセイ法を、交差反応性の決定に用いることもできる。例えば、本明細書に提供する配列によってコードされるタンパク質を、固体支持体上に固定化することができる。タンパク質をアッセイ系に添加し、固定化された抗原に対する抗血清の結合と競合する。上記のタンパク質が、固定化されたタンパク質に対する抗血清の結合と競合する能力を、本明細書に提供するいずれかの配列によってコードされるタンパク質のものと比較する。上記のタンパク質に関する交差反応性の比率を、標準的な計算を用いて算出する。上に挙げた添加したタンパク質のそれぞれとの交差反応性が10％未満であるような抗血清を選択してプールする。交差反応性のある抗体は、選択的には、例えば近縁性の低いホモログといった考慮されたタンパク質による免疫吸着により、プールした抗血清から除去される。
【０１２８】
免疫吸着がなされてプールされた抗血清は次に、おそらく本発明のタンパク質であると考えられる第2のタンパク質を、免疫原タンパク質と比較するために、上記の競合結合イムノアッセイ法に用いられる。この比較を行うためには、この2つのタンパク質を広範囲の濃度にわたって互いにアッセイし、抗血清と固定されたタンパク質との結合の50％を抑制するのに必要な各タンパク質の量を決定する。必要な第2のタンパク質の量が、必要な本明細書の蛋白質によって部分的にコードされるタンパク質の量の10分の1未満であれば、第2のタンパク質は標的タンパク質からなる免疫原に対して産生された抗体と特異的に結合するといわれる。
【０１２９】
3．その他のアッセイ形式
特に好ましい態様においては、ウエスタンブロット（イムノブロット）分析が、試料中の本発明のBIKの存在を検出および定量化するために用いられる。この技術は一般に、試料のタンパク質を分子量に基づいてゲル電気泳動によって分離し、分離されたタンパク質を適した固体支持体（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルターまたは誘導体化ナイロンフィルターなど）に移行させた上で、目的のタンパク質と特異的に結合する抗体とともに試料をインキュベートすることを含む。例えば、抗BIK抗体は、固体支持体上のBIKと特異的に結合する。これらの抗体を直接標識してもよく、または、目的のタンパク質と特異的に結合する標識抗体（例えば、標識したヒツジ抗マウス抗体）を用いて後に検出してもよい。
【０１３０】
その他のアッセイ形式には、特定の分子（例えば、抗体）と結合し、封入された試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを用いるリポソームイムノアッセイ法（LIA）が含まれる。続いて、放出された化学物質を標準的な技術に従って検出する（Monroeら、Amer. Clin. Prod. Rev. 5: 34-41 (1986)を参照）。
【０１３１】
4．標識
アッセイ法に用いる特定の標識または検出可能基は、アッセイ法に用いる抗体の特異的結合に大きな妨げとならない限り、本発明の特に重要な面ではない。検出可能基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質でありうる。このような検出可能な標識はイムノアッセイ法の分野では十分に開発されており、通常、このような方法に有用なほとんどすべての標識を本発明に適用することができる。すなわち、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電子的、工学的または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物である。本発明において有用な標識には、磁気ビーズ（例えば、Dynabeads（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３H、１２５I、３５S、１４Cまたは３２P）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびELISAに一般に用いられる他のもの）、およびコロイド金または着色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）などの比色定量用標識が含まれる。
【０１３２】
標識を、当技術分野で周知の方法に従って、アッセイ法の望ましい構成要素に直接的または間接的に結合させてもよい。以上に示した通り、非常にさまざまな標識を用いることができ、標識の選択は必要な感度、化合物との結合の容易さ、安定性の必要条件、用いうる装置、および廃棄への対応に依存する。
【０１３３】
非放射性標識はしばしば間接的な手段によって結合させる。酵素または蛍光団との結合などにより、分子をシグナル生成化合物と直接結合させることもできる。種々の酵素および蛍光化合物を本発明の方法に用いることができ、これらは当業者に周知である（用いうるさまざまな標識システムまたはシグナル生成システムの概説については、例えば、米国特許第4,391,904号を参照されたい）。
【０１３４】
標識の検出手段は当業者に周知である。すなわち、例えば、標識が放射性標識であれば、検出のための手段には、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーの場合の写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識であれば、適切な波長の光で蛍光色素を励起させ、その結果生じた蛍光を検出することによってそれを検出しうる。蛍光は、肉眼的に、写真フィルムにより、電荷結合素子（CCD）または光電子増倍管などの電子検出装置の使用によって検出しうる。同様に、酵素標識は、酵素に対する適切な基質を提供し、その結果得られた反応生成物を検出することにより検出することができる。さらに、単純な比色定量標識は、標識に伴う色を単に観察することによって検出しうる。すなわち、種々の試験紙アッセイ法において、結合した金はしばしば薄赤色に見え、一方、種々の結合ビーズはビーズの色に見える。
【０１３５】
いくつかのアッセイ形式には、標識成分を用いる必要がない。例えば、凝集アッセイ法を用いて標識抗体の存在を検出することができる。この場合には、標的抗体を含む試料により、抗原をコーティングした粒子を凝集させる。この形式では、どの成分も標識する必要はなく、単純な肉眼検査によって標的抗体の存在が検出される。
【０１３６】
VI．BIKの修飾物質の同定
BIKの修飾物質、すなわちBIK活性またはBIKポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの発現に対するアゴニストまたはアンタゴニストは、糖尿病を含むさまざまなヒト疾患の治療に有用である。BIK阻害物質の投与は、糖尿病の患者またはインスリン抵抗性のある個体の治療のために用いうる。または、BIKの活性化物質を、糖尿病の患者またはインスリン抵抗性のある個体の治療に用いることもできる。
【０１３７】
A．BIKを調節する作用物質
BIKの修飾物質としての試験を行う作用物質は、ポリペプチド、糖、核酸または脂質などの任意の低分子化合物または生物的実体でよい。一般に、被験化合物は低分子化合物およびペプチドであると考えられる。本質的にはあらゆる化合物を、本発明のアッセイ法における修飾物質またはリガンドの候補として用いることができるが、水性溶液または有機溶液（特にDMSOをベースとするもの）中に溶解しうる化合物を用いることが最も多い。アッセイ法は、アッセイ法の工程を自動化し、任意の好都合な源から化合物をアッセイ法に提供し、一般にはそれを平行して稼働させることにより（例えば、自動化アッセイ法でのマイクロタイタープレート上でのマイクロタイター形式による）、大規模化学ライブラリーをスクリーニングするように設計する。修飾物質には、BIK mRNAのレベルを低下させるように設計された作用物質（例えば、アンチセンス分子、リボザイム、DNAザイム（DNAzyme）、短鎖抑制性RNA（small inhibitory RNA）など）またはmRNAからの翻訳のレベルを低下させるように設計された作用物質（例えば、mRNA分子上の翻訳開始配列または他の配列に対して相補的なアンチセンス分子などの翻訳遮断物質）も含まれる。化合物の供給元が、Sigma社（St. Louis, MO）、Aldrich社（St. Louis, MO）、Sigma-Aldrich社（St. Louis, MO）、Fluka Chemika-Biochemica Analytika社（Buchs, Switzerland）などを含め、数多くあることは知られているであろう。
【０１３８】
いくつかの態様において、ハイスループットスクリーニング方法は、数多くの治療的化合物の候補（修飾性化合物の候補）を含むコンビナトリアル化学ライブラリーまたはペプチドリガンドライブラリーを提供することを含む。続いて、このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」または「リガンドライブラリー」を、望ましい特徴的な活性を示すライブラリーのメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定するために、本明細書に記載するような1つまたは複数のアッセイ法においてスクリーニングする。このようにして同定された化合物は、通常の「リード化合物」として役立ち、またはそれ自体を治療薬の候補もしくは実際の治療薬として用いることができる。
【０１３９】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、試薬などの化学的「構成単位（building block）」を数多く組み合わせることにより、化学合成または生物的合成によって生成された多様な化合物からなる集成物である。例えば、ポリペプチドライブラリーなどの直鎖状コンビナトリアル化学ライブラリーは、一群の構成化学単位（アミノ酸）を所定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）に関して考えられるすべてのやり方で組み合わせることによって生成される。構成化学単位のこのようなコンビナトリアル混合により、何百万もの化合物を合成することができる。
【０１４０】
コンビナトリアル化学ライブラリーの作製およびスクリーニングは当業者に周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーには、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第5,010,175号、Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493 (1991)およびHoughtonら、Nature 354: 84-88 (1991)を参照）が非制限的に含まれる。多様性のある化学物質ライブラリーを作製するためにその他の化学物質を用いることもできる。このような化学物質には、ぺプトイド（例えば、国際公開公報第91／19735号）、コード化ペプチド（例えば、国際公開公報第93／20242号）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、国際公開公報第92／00091号）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー（diversomer）（Hobbsら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993)）、ビニル性ポリペプチド（Hagiharaら、J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568 (1992)）、グルコーススカフォールディングを有する非ペプチド性ペプチド模倣物（Hirschmannら、J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992)）、低分子化合物ライブラリーの類似の有機合成（Chenら、J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)）、オリゴカルバメート（Choら、Science 261: 1303 (1993)）、および／またはペプチジルホスホネート（Campbellら、J. Org. Chem. 59: 658 (1994)）、核酸ライブラリー（Ausubel、BergerおよびSambrook、いずれも前記、を参照）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第5,539,083号を参照）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughnら、Nature Biotechnology, 14(3): 309-314 (1996)および国際特許出願番号PCT／US96／10287を参照）、炭水化物ライブラリー（例えば、Liangら、Science, 274: 1520-1522 (1996)および米国特許第5,593,853号を参照）、有機低分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum C&EN, Jan 18, p.33(1993)；イソプレノイド、米国特許第5,569,588号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号；ピロリジン、米国特許第5,525,735号および第5,519,134号；モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号；ベンゾジアゼピン、米国特許第5,288,514号などを参照）が非制限的に含まれる。
【０１４１】
コンビナトリアルライブラリーの作製用の装置は市販されている（例えば、357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MAを参照）。加えて、数多くのコンビナトリアルライブラリーがそれ自体、市販されている（例えば、ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MDなど）。
【０１４２】
B．BIKの修飾物質に関するスクリーニングの方法
細胞における、特に哺乳動物細胞、とりわけヒト細胞におけるBIKの発現または活性のレベルを変化させる作用物質を同定するためには、数多くの種類のスクリーニングプロトコールを利用することができる。一般的には、これらのスクリーニング方法は、BIKポリペプチドと結合すること、阻害物質もしくは活性化物質がBIKと結合するのを妨げること、阻害物質もしくは活性化物質とBIKとの会合を増加させること、またはBIKの発現を活性化もしくは阻害することなどによってBIKの活性を変化させる作用物質を同定するために、複数の作用物質をスクリーニングすることを含む。
【０１４３】
いくつかの態様では、あるBIKバリアントを調節するが第2のものは調節しない作用物質を同定するために、さまざまなBIKポリペプチド（例えば、配列番号：2および配列番号：9）のスクリーニングを平行して行う。例えば、配列番号：2に対する結合もしくは修飾は行うが配列番号：9に対しては行わない作用物質、またはその逆に作用する作用物質を同定するためのスクリーニングを設計することができる。
【０１４４】
1．BIK結合アッセイ法
BIKと結合しうる作用物質をスクリーニングすることにより、予備的なスクリーニングを行うことができるが、これはそのようにして同定された作用物質の少なくともいくつかはBIK修飾物質である可能性が高いためである。結合アッセイ法は、例えば、BIKと相互作用する内因性タンパク質を同定する目的にも有用である。例えば、BIKと結合する抗体、受容体またはその他の分子を、結合アッセイ法で同定することができる。
【０１４５】
結合アッセイ法は通常、BIKタンパク質を1つまたは複数の被験作用物質と接触させ、タンパク質および被験作用物質が結合複合体を形成するのに十分な時間をおくことを含む。形成された結合複合体は、確立されたさまざまな分析技術のうち任意のものを用いて検出することができる。タンパク質結合アッセイ法には、共沈、非変性SDS-ポリアクリルアミドゲル上での共移動、ウエスタンブロット上での共移動を測定する方法（例えば、Bennet, J.P.およびYamamura, H.I. (1985)「Neurotransmitter、Hormone or Drug Receptor Binding Methods」、「Neurotransmitter Receptor Binding」（Yamamura, H. I.ら編）中、pp. 61-89を参照）が非制限的に含まれる。他の結合アッセイ法には、BIKと結合した分子または標識基質の置換を同定するための質量分析法またはNMR法の使用が含まれる。この種のアッセイ法に用いるBIKタンパク質は、自然下で発現されるBIKでもクローニングされたものでも合成されたものでもよい。
【０１４６】
さらに、ほ乳類または酵母のツーハイブリッド法（例えば、Bartel, P. L.ら、Methods Enzymol, 254: 241 (1995)を参照）を、細胞内で一緒に発現された場合に相互作用または結合を行うポリペプチドまたはその他の分子を同定するために用いることもできる。
【０１４７】
2．発現アッセイ法
BIKの発現を調節する化合物のスクリーニングも提供される。スクリーニング法は、被験化合物がBIKを発現する1つまたは複数の細胞と接触させた後に、BIKの発現の増加または減少（転写物、翻訳産物のどちらか）を検出する細胞を用いたアッセイ法を行うことを含む。アッセイ法は、天然にBIKを発現する細胞を用いて、またはBIKを発現するように組み換え改変した細胞において行うことができる。。
【０１４８】
BIKの発現はさまざまなやり方で検出することができる。以下で述べるように、細胞内でのBIKの発現レベルは、BIKの転写物（またはそれに由来する相補的核酸）と特異的にハイブリダイズするプローブを用いて、細胞内で発現されるmRNAを検索することによって決定しうる。プローブ検索は、細胞を可溶化してノーザンブロット法を行うことによって、または細胞を可溶化せずにインサイチューハイブリダイゼーション法を用いることによって実施しうる。または、BIKと特異的に結合する抗体を用いて細胞可溶化物を検索する免疫学的な方法を用いて、BIKタンパク質を検出することもできる。
【０１４９】
別の細胞系アッセイ法に、標準的なレポーター遺伝子アッセイ法により細胞を用いて行われるレポーターアッセイ法が挙げられる。これらのアッセイ法は、BIKの発現を行う、またはBIKを発現しない、発現する細胞において行うことができる。これらのアッセイ法のある種のものは、検出可能な産物をコードするレポーター遺伝子と機能的に結合したBIKプロモーターを含む異種核酸構築物を用いて行われる。さまざまなレポーター遺伝子を利用しうる。いくつかのレポーターは内在性に検出可能である。この種のレポーターの一例は、蛍光検出器を用いて検出しうる蛍光を発する緑色蛍光タンパク質である。別のレポーターは検出可能な生成物を生じる。この種のレポーターはしばしば酵素である。酵素レポーターの例には、β-グルクロニダーゼ、CAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；AltonおよびVapnek (1979) Nature 282: 864-869）、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼ（Tohら (1980) Eur. J. Biochem. 182: 231-238；およびHallら (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2: 101）が非制限的に含まれる。
【０１５０】
これらのアッセイ法では、レポーター構築物を有する細胞を被験化合物と接触させる。プロモーター発現の変化は、検出可能なレポーターのレベルを検出することによって観測される。さまざまな種類のBIK修飾物質をこのアッセイ法で同定することができる。例えば、プロモーターをそれとの結合によって阻害する、転写因子もしくは他の調節因子との結合によってプロモーターを阻害する、そのプロモーターと結合する、またはプロモーターを阻害する分子を生成するカスケードを誘発する被験化合物を同定することができる。同様に、例えば、プロモーターをそれとの結合によって活性化する、転写因子もしくは他の調節因子との結合によってプロモーターを活性化する、そのプロモーターと結合する、またはプロモーターを活性化する分子を生成するカスケードを誘発する被験化合物を同定することもできる。
【０１５１】
発現または活性のレベルはベースライン値との比較が可能である。ベースライン値は、対照試料に関する値、または対照集団（例えば、2型糖尿病でない、またはそのリスクがない正常血糖個体）もしくは細胞（例えば、BIK修飾物質に曝露されない組織培養細胞）に関するBIK発現レベルを代表する統計値であってよい。陰性対照として、BIKを発現しない細胞に関する発現レベルを決定することもできる。この種の細胞は一般に、他の点では実質的に被験細胞と遺伝的に同一である。
【０１５２】
レポーターアッセイ法にはさまざまな異なる種類の細胞を用いうる。内因性BIKを発現する細胞は、例えば膵細胞である。BIKを内因的に発現しない細胞は原核細胞であっても、真核細胞であってもよい。真核細胞は、組換え核酸構築物を有する細胞の作製に通常用いられる細胞のうち任意のものでよい。例となる真核細胞には、酵母、ならびにHepG2、COS、CHOおよびHeLa細胞株などの種々の高等真核細胞が含まれる。アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞を用いることもできる。
【０１５３】
観測された活性に信頼性があることを確認するためには、レポーター構築物を含まない細胞を用いた同時並行反応を行うこと、またはレポーター構築物を有する細胞を被験化合物と接触させないことを含め、さまざまな対照をおくことができる。化合物を以下のようにさらにバリデートすることもできる。
【０１５４】
3．活性
BIKポリペプチド酵素活性の分析は、一般的な生化学的手順に従って行われる。この種のアッセイ法には、細胞系アッセイ法のほか、精製もしくは部分精製されたBIKポリペプチドまたは粗細胞可溶化物を用いるインビトロアッセイ法が含まれる。
【０１５５】
細胞または他の試料におけるBIK酵素活性のレベルを決定し、ベースライン値（例えば、対照値）と比較する。活性は試料からの粗抽出物または部分的もしくは本質的に精製されたBIKに基づいて測定することができる。BIK活性の測定は、例えば、Lesageら、Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 279：F793-F801 (2000)およびGiratdら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 282: 249-256 (2001)に記載されたように、陽イオンチャンネル活性を測定することを含む。例えば、イオン流の変化を、BIKポリペプチドを含むカリウムチャンネルを発現している細胞または膜の分極（すなわち、電位）の変化を定量することによって評価することもできる。いくつかの態様において、細胞の分極の変化は、電位固定法およびパッチクランプ法、例えば、「細胞密着（cell-attached）」モード、「インサイドアウト（inside-out）」モードおよび「ホールセル（whole cell）」モードなどにより（例えば、Ackermanら、New Engl. J. Med. 336: 1575-1595 (1997)を参照）、電流の変化を測定すること（それによって分極の変化測定すること）によって観測される。全細胞電流は、標準的な方法を用いて首尾良く定量することができる（例えば、Hamilら、PFlugers. Archiv. 391: 85 (1981)を参照）。その他の既知のアッセイ法には以下のものが含まれる：放射性標識ルビジウム流アッセイ法、および、電位感受性色素またはイオン感受性色素を用いる蛍光アッセイ法（例えば、Vestergarrd-Bogindら、J. Membrane Biol. 88: 67-75 (1988)；Danielら、J. Pharmacol. Meth. 25: 185-193 (1991)；Holevinskyら、J. Membrane Biology 137: 59-70 (1994)を参照）。BIKポリペプチドを含むチャンネルタンパク質を通過するカリウム流を抑制または増大させうる化合物に関するアッセイ法は、本発明のチャンネルを有する細胞と接しているとともにそれを含む浴液に対して化合物を適用することによって実施しうる（例えば、Blatzら、Nature 323: 718-720 (1986)；Park、J. Physiol. 481: 555-570 (1994)を参照）。一般に、試験が行われる化合物は1pM〜100mMの範囲で存在する。
【０１５６】
チャンネルの機能に対する被験化合物の影響は、電流もしくはイオン流の変化を測定することによって、または電流およびイオン流の変化に伴う結果によって測定することができる。電流またはイオン流の変化は、カリウムイオンまたはルビジウムイオンなどのイオンの流れの増加または減少によって測定される。イオンはさまざまな標準的な手法によって測定しうる。それをイオン濃度の変化、例えば、細胞内濃度の変化によって直接測定することもでき、または膜電位もしくはイオンの放射性標識によって間接的に測定することもできる。被験化合物がイオン流に及ぼす結果は極めて多岐にわたりうる。このため、任意の適した生理的変化を利用して、本発明のチャンネルに対する被験化合物の影響を評価することが可能である。被験化合物の影響は毒素結合アッセイ法によって測定することができる。機能的な結果を無傷の細胞または動物を用いて評価する場合には、伝達物質の放出、細胞内カルシウムの変化、ホルモン放出（例えば、インスリン）、既知および未解明の遺伝マーカーの両者に関する転写の変化（例えば、ノーザンブロット法）、細胞体積の変化（例えば、赤血球）、免疫応答（例えば、T細胞の活性化）、細胞増殖またはpH変化などの細胞代謝の変化、ならびに環状ヌクレオチドなどの細胞内二次メッセンジャーの変化といった、さまざまな影響を測定することもできる。
【０１５７】
4．バリデーション
前記のいずれかのスクリーニング方法によってまず同定された作用物質を、明らかな活性のバリデーションを行うためにさらに試験することができる。このような試験は、適した動物モデルを用いて行うことが好ましい。この種の方法の基本形式は、初期スクリーニングの際に同定されたリード化合物を、ヒトのモデルとして役立つ動物に投与し、その後に、BIKが実際に修飾作用を受けるか否かを判定することを含む。バリデーション試験に用いられる動物モデルは一般に、何らかの種類の哺乳動物である。適した動物の具体的な例には、霊長動物、マウスおよびラットが非制限的に含まれる。例えば、糖尿病の一遺伝子モデル（例えば、ob／obマウスおよびdb／dbマウス、ツッカーラット、ならびにツッカー糖尿病肥満ラットなど）または糖尿病の多遺伝子モデル（例えば、高脂肪食摂取マウスモデル）は、糖尿病動物におけるBIKの修飾をバリデートするのに有用な可能性がある。
【０１５８】
C．固相および溶質のハイスループットアッセイ法
本発明のハイスループットアッセイ法では、最大で数千種もの異なる修飾物質またはリガンドを1日でスクリーニングすることが可能である。詳細には、マイクロタイタープレートの各ウェルを、選択した修飾物質の候補に対して別々のアッセイ法を実行するために用い、または、濃度もしくはインキュベーション時間の影響を観察しようとする場合には、単一の修飾物質を試験するためにウェルを5〜10個ずつ用いることができる。このため、1枚の標準的なマイクロタイタープレートで、約100種（例えば、96種）の修飾物質をアッセイすることが可能である。1536穴のウェルプレートを用いれば、1枚のプレートで約100〜約1500種の異なる化合物をアッセイすることができる。1日当たり数枚の異なるプレートをアッセイできれば、本発明の統合システムを用いて最大で約6,000〜20,000種類またはそれ以上の異なる化合物をアッセイ法でスクリーニングすることが可能である。さらに、試薬操作のためのマイクロ流体（microfluidic）アプローチを用いることができる。
【０１５９】
目的の分子（例えばBIK）を、共有結合またはタグを介した結合などの非共有結合により、直接的または間接的に固体成分に結合させることができる。タグは種々の成分のうち任意のものでよい。一般的には、タグと結合する分子（タグ結合剤）を固体支持体に固定し、タグの付いた目的の分子（例えば、BIK）を、タグとタグ結合剤との相互作用によって固体支持体に結合させる。
【０１６０】
文献中に詳細に記載された既知の分子相互作用に基づき、さまざまなタグおよびタグ結合剤のうち任意のものを用いることができる。例えば、ビオチン、プロテインAまたはプロテインGのようにタグが天然の結合剤を有する場合には、それを適切なタグ結合剤（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、免疫グロブリンのFc領域、ポリ-Hisなど）との結合に用いることができる。ビオチンなどの天然の結合剤を備えた分子に対する抗体も広く入手可能であり、適切なタグ結合剤についても同様である；例えば、SIGMA Immunochemicals 1998年カタログ、SIGMA, St. Louis MOを参照されたい）。
【０１６１】
同様に、任意のハプテン性化合物または抗原性化合物を適切な抗体と組み合わせて用いて、タグ/タグ結合剤の対を形成させることもできる。数千種もの特異抗体が市販されており、ほかにも多くの抗体が文献中に記載されている。例えば、1つの一般的な構成において、タグは第1の抗体であり、タグ結合剤は第1の抗体を認識する第2の抗体である。抗体-抗原相互作用以外に、細胞膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニストなどの受容体-リガンド相互作用もタグおよびタグ結合剤の対として適している（例えば、トランスフェリン、c-kit、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体および抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリーなどの細胞受容体-リガンド相互作用；例えば、Pigott & power, 「Adhesion Molecule Facts Book 1」 (1993)を参照されたい）。同様に、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、オピエート、ステロイドなど）、細胞内受容体（例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンD；ペプチドを含む、種々の低分子リガンドの作用を媒介するもの）、薬剤、レクチン、糖、核酸（直鎖状重合体および環状重合体の両方の形態）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質および抗体は、いずれも種々の細胞受容体と相互作用しうる。
【０１６２】
ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリールスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミドおよびポリアセテートなどの合成重合体も適切なタグまたはタグ結合剤を形成しうる。その他の多くのタグ/タグ結合剤の対も本明細書に記載のアッセイ法に有用であり、これは本開示を吟味することによって当業者には明らかであると考えられる。
【０１６３】
ペプチド、ポリエーテルなどの一般的なリンカーもタグとして有用であり、これには約5-200アミノ酸のポリgly配列などのポリペプチド配列が含まれる。このような柔軟性のあるリンカーは当業者に周知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Sheanvater Polymers, Inc（Huntsville, Alabama）から販売されている。選択的には、これらのリンカーはアミド結合、スルフヒドリル結合またはヘテロ官能性結合を有する。
【０１６４】
タグ結合剤を、現在用いうる種々の方法のうち任意のものを用いて、固体基質に固定する。固体基質は一般に、タグ結合剤の一部と反応する化学基を表面に固定させる化学試薬に基質の全体または一部を曝露させることにより、誘導体化または官能性付与が行われる。例えば、比較的長い連鎖部分を付着させるのに適した基には、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基およびカルボキシル基が含まれると考えられる。ガラス表面などの種々の表面に官能性を付与するためには、アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランを用いることができる。このような固相バイオポリマーアレイの構築は文献に詳細に記載されている（例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963)（ペプチドなどの固相合成を記載している）；Geysenら、J. Immun. Meth. 102: 259-274 (1987)（ピン上での固相成分の合成を記載している）；FrankおよびDoring、Tetrahedron 44: 60316040 (1988)（セルロースディスク上での種々のペプチド配列の合成を記載している）；Fodorら、Science, 251: 767-777 (1991)；Sheldonら、Clinical Chemistiy 39(4):718-719 (1993)；ならびにKozalら、Nature Medicine 2(7): 753759 (1996)（いずれも固体基質に固定したバイオポリマーのアレイを記載している）を参照されたい。タグ結合剤を基質に固定する非化学的アプローチには、加熱、UV照射による架橋などの他の一般的な方法が含まれる。
【０１６５】
本発明は、BIKの発現または活性を変化させうる化合物をハイスループット形式で同定するためのインビトロアッセイ法を提供する。アッセイ系が高度に均一であるため、修飾物質の候補を含まない反応における細胞のBIK活性を測定する対照反応を随意に選択してもよい。このような随意選択的な対照反応は適切であり、アッセイ法の信頼性を高める。したがって、好ましい態様において、本発明の方法はこのような対照反応を含む。記載するアッセイ形式のそれぞれについて、修飾物質を含まない「修飾物質なしの」対照反応により、結合活性のバックグラウンドレベルが得られる。
【０１６６】
いくつかのアッセイ法においては、陽性対照を用いることが望ましいと考えられる。少なくとも2種類の陽性対照が適している。第1に、本発明のBIKの既知の活性化物質を1つのアッセイ試料とインキュベートすることができ、BIKの発現レベルまたは活性の上昇に起因する結果としての信号の増加を本明細書に記載の方法に従って決定する。第2に、BIKの既知の阻害物質を添加し、BIKの発現または活性に関する結果としての信号の低下を同様に検出することができる。通常であればBIKの既知の修飾物質の存在によって引き起こされる上昇または存在を阻害する修飾物質を見つけ出すために、修飾物質を活性化物質または阻害物質と組み合わせてもよいことは理解されると考えられる。
【０１６７】
D．コンピュータを用いるアッセイ法
BIKの活性を変化させる化合物に関するさらにもう1つのアッセイ法は、アミノ酸配列にコードされた構造情報に基づいてBIKの三次元構造を作成するためにコンピュータシステムを用いる、コンピュータ支援による薬物設計である。入力したアミノ酸配列がコンピュータプログラム内にあらかじめ設定したアルゴリズムと直接かつ能動的に相互作用して、タンパク質の二次、三次および四次構造モデルが生成される。続いて、リガンドとの、結合能を有する、そうでなければ調節される能力を有する構造領域（例えば、活性部位）を同定するためにタンパク質構造のモデルを検討する。同様の分析を、BIKの推定受容体またはBIK結合パートナーについて行うことができ、BIKの相互作用領域を同定するために用いることができる。次にこれらの領域を利用して、BIKと結合する化合物を同定する。
【０１６８】
ひとたび目的のタンパク質の3次構造が生成されれば、修飾物質候補をコンピュータシステムによって同定することができる。修飾物質候補の三次元構造は、化合物の化学式を入力することによって生成される。次に修飾物質候補の三次元構造をBIKのものと比較して、BIKの結合部位を同定する。エネルギー項を用いてタンパク質と修飾物質との間の結合親和性を決定し、どのリガンドがタンパク質と結合する確率が高いかを判定する。
【０１６９】
VII．組成物、キット、および統合システム
本発明は、本発明のBIKポリペプチドをコードする核酸、またはBIKタンパク質、抗BIK抗体などを用いて本明細書に記載したアッセイ法を実施するための組成物、キットおよび統合システムを提供する。
【０１７０】
本発明は、固相アッセイ法に用いるためのアッセイ組成物を提供する；このような組成物は、例えば、BIKをコードする1つまたは複数の核酸が固体支持体上に固定化されたもの、および標識試薬を含みうる。それぞれの場合に、アッセイ組成物は、ハイブリダイゼーションのために望ましい別の試薬も含みうる。本発明のBIKの発現または活性に対する修飾物質をアッセイ組成物に含めることもできる。
【０１７１】
本発明はまた、本発明のアッセイ法を行うためのキットも提供する。本キットは一般に、BIKと、またはBIKポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と特異的に結合する抗体、および作用物質の存在を検出するための標識を含む。本キットは本発明のBIKポリペプチドをコードするいくつかのポリヌクレオチド配列を含みうる。キットは上記の組成物のいずれかを含むことができ、選択的にはさらに、本発明のBIKポリペプチドをコードする遺伝子の発現に対する、または本発明のBIKポリペプチドの活性に対する影響に関してハイスループットアッセイ方法を行うための指示書といった別の構成要素、1つまたは複数の容器または区画（例えば、プローブ、標識などを保持するための）、BIKポリペプチドの発現または活性の対照修飾物質、キットの成分を混合するためのロボット型アーマチュアなども含む。
【０１７２】
本発明はまた、本発明のBIKポリペプチドの発現または活性に対する影響に関する、修飾物質の候補のハイスループットスクリーニングのための統合システムも提供する。本システムは一般に、液体を源から目的地まで移動させるためのロボット型アーマチュア、ロボット型アーマチュアを制御するための制御装置、標識検出器、標識検出を記録するデータ記憶装置、および、反応混合物を有するウェルを含むマイクロタイターディッシュ、または固定された核酸もしくは固定化部分を含む基質などのアッセイ成分を含む。
【０１７３】
さまざまなロボット型液体輸送システムが入手可能であり、または既存の構成部品を用いて容易に製造することもできる。例えば、Microlab 2200（Hamilton；Reno, NV）ピペット操作ステーション（pipetting station）を用いるZymate XP（Zymark Corporation；Hopkinton, MA）自動化ロボットを用いて、並列的な試料を96ウェルマイクロタイタープレートに移し、複数の同時並列的な結合アッセイ法を設定することができる。
【０１７４】
カメラまたはその他の記録装置（例えば、光ダイオードおよびデータ記憶装置）によって観測された（および、選択的には記録された）光学画像は、選択的にはさらに、本明細書における態様のいずれかにより、例えば、画像のデジタル化ならびにコンピュータ上での画像の記録および分析などによって処理される。PC（Intel x86またはPentiumチップ互換のDOS（登録商標）、OS2（登録商標）WINDOWS（登録商標）、WINDOWS NT（登録商標）、WINDOWS95（登録商標）、WINDOWS98（登録商標）、またはWINDOWS2000（登録商標）ベースのコンピュータ）、MACINTOSH（登録商標）またはUNIX（登録商標）ベースの（例えば、SUN（登録商標）ワークステーション）コンピュータなどを用いて、デジタル化されたビデオ画像またはデジタル化された光学画像のデジタル化、保存および分析を行うための、さまざまな市販の周辺機器およびソフトエアソフトウエアが入手可能である。
【０１７５】
従来のシステムの一つは、標本野からの光を、当技術分野で一般的に用いられる、冷却した電荷結合素子（CCD）カメラに伝える。CCDカメラは画像素子（ピクセル）のアレイを含んでいる。標本からの光はCCD上で画像化される。標本の領域（例えば、生体重合体のアレイ上の個々のハイブリダイゼーション部位）に対応する個別のピクセルがサンプリングされ、各位置に関して光強度の読み取り値が得られる。速度を高めるために多数のピクセルが並列的に処理される。本発明の装置および方法は、蛍光顕微鏡法または暗視野顕微鏡法などにより、任意の試料を観測するために容易に用いられる。
【０１７６】
VIII．投与および薬学的組成物
BIKの修飾物質（例えば、アンタゴニスト、またはアゴニスト）は、インビボでのBIK活性の修飾のために、哺乳動物対象に対して直接投与することができる。投与は、修飾性化合物を導入して、治療しようとする組織に最終的に接触させるために通常用いられる任意の経路によるもので、当技術分野において周知である。個々の化合物の投与には複数の経路を用いることができるが、ある特定の経路によって別の経路よりも即時的かつより効果的な反応が得られることがしばしばである。
【０１７７】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含みうる。薬学的に許容される担体は、一部には、投与する個々の組成物、さらには組成物の投与に用いる個々の方法によって決まる。したがって、本発明の薬学的組成物には適した製剤が広範囲にわたって存在する（例えば、「Remington 's Pharmaceutical Sciences」第17版、1985）を参照のこと）。
【０１７８】
BIKの発現または活性に対する修飾物質（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）は、単独で、または他の適した成分と組み合わせて、注射用またはポンプ装置での使用のために調製することができる。ポンプ装置（「インスリンポンプ」としても知られる）は、インスリンを患者に投与するために一般的に用いられており、このため、本発明の組成物を含むように適合させることは容易である。インスリンポンプの製造元には、Animas、DisetronicおよびMiniMedが含まれる。
【０１７９】
BIKの発現または活性に対する修飾物質（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）は、単独で、または他の適した成分と組み合わせて吸入によって投与するためのエアロゾル製剤（すなわち、それらは「噴霧」することが可能である）の形にすることができる。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される噴霧剤中に配合することができる。
【０１８０】
投与のために適した製剤には、水性および非水性の溶液、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を等張化する溶質を含みうる等張滅菌溶液、ならびに懸濁化剤、溶解補助剤、濃稠化剤、安定剤および保存料を含みうる水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。本発明の実践に際しては、組成物を例えば経口的、鼻腔内、局所的、静脈内、腹腔内、膀胱内または髄腔内に投与することができる。化合物の製剤は単位用量または複数回の用量がアンプルまたはバイアルなどの容器内に密封された形式で提供することができる。溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。修飾物質を調製済みの食品または薬剤の一部として投与することもできる。
【０１８１】
患者に投与する用量は、本発明の状況においては、一定期間にわたって対象において有益な反応を誘導するのに十分である必要がある。用量は、用いる個々の修飾物質の有効性、対象の年齢、体重、身体活動性および食事内容を含むさまざまな要因、他の薬剤との併用の可能性、ならびに糖尿病症例の重症度に応じて決まると考えられる。修飾物質の一日投与量は、既知のインスリン組成物の場合と同様のやり方で、当業者により、個々の患者について決定することが推奨される。また、用量の程度は、個々の対象における特定の化合物またはベクターの投与に伴う何らかの有害な副作用の存在、性質および程度によっても決まると考えられる。
【０１８２】
投与する修飾物質の有効量を決定する際に、医師は修飾因子の循環血漿中レベル、修飾物質の毒性および抗修飾物質抗体の産生を評価すると思われる。一般に、修飾物質当量としての用量は、一般的な対象の場合、約1ng/kg〜10mg/kgの範囲である。
【０１８３】
投与に関しては、本発明のBIK修飾物質を、修飾物質のLD-50、および修飾物質の種々の濃度での副作用を対象の体重および全般的健康状態に当てはめることによって決定される速度で投与することができる。投与は単回投与または分割投与によって行える。
【０１８４】
本発明の化合物を、所望の標的療法に応じた1つまたは複数の別の薬剤と併用して効果的に用いることもできる（例えば、Turner, N.ら、Prog. Drug Res. (1998) 51: 33-94；Haffher, S., Diabetes Care (1998) 21: 160-178；およびDeFronzo, R.ら（編）、「Diabetes Reviews」(1997) Vol.5, No.4を参照）。数多くの試験で、経口薬との併用療法の有益性が検討されている（例えば、Mahier, R., J. Clin. Endocrinol. Metab. (1999) 84: 1165-71；United Kingdom Prospective Diabetes Study Group: UKPDS 28、Diabetes Care (1998) 21: 87-92；Bardin, C. W.（編）、「Current Therapy In Endocrinology and Metabolism」第6版（Mosby-Year Book, Inc., St. Louis, MO. 1997）；Chiasson, J.ら、Ann. Intern. Med. (1994) 121: 928-935；Coniff, R.ら、Am. Ther. (1997) 19: 16-26；Coniff, R.ら、Am. J. Med. (1995) 98: 443-451；およびIwamoto, Y.ら、Diabet. Med. (1996) 13365-370；Kwiterovich, P., Am. J. Cardiol (1998) 82 (12A): 3U-17Uを参照されたい）。これらの試験により、疾患の中でも特に糖尿病は、治療レジメンに第2の薬剤を加えることによってさらに改善されうることが示されている。併用療法には、本発明のBIK修飾物質および1つまたは複数の別の薬剤を含む単一の医薬製剤の投与のほかに、BIK修飾物質および別個の医薬製剤としての各々の薬剤の投与も含まれる。例えば、BIK修飾物質およびチアゾリジンジオンを錠剤もしくはカプセル剤などの単一の経口投与用組成物としてヒト対象に投与することができ、または各々の薬剤を別個の経口投与用製剤として投与することもできる。別個の投与製剤を用いる場合には、BIK修飾物質および1つまたは複数の別の薬剤を、本質的には同じ時に（すなわち、同時に）投与することができ、または別個に時間をずらして（すなわち、逐次的に）投与することもできる。併用療法にはこれらのレジメンのすべてが含まれるものと解釈される。
【０１８５】
併用療法の1つの例は、糖尿病を変化させる（または糖尿病およびそれに関連した症状、合併症および障害を治療する）場合にみられ、この場合には、BIK修飾物質を例えば以下のものと効果的に併用することができる：スルホニル尿素（クロルプロパミド、トルブタミド、アセトヘキサミド、トラザミド、グリブリド、グリクラジド、グリナーゼ、グリメピリドおよびグリピジドなど）、ビグアナイド系薬剤（メトホルミンなど）、PPARβδアゴニスト、PPARγのリガンドまたはアゴニスト、例えばチアゾリジノン（シグリタゾン、ピオグリタゾン（例えば、米国特許第6,218,409号を参照）、トログリタゾンおよびロシグリタゾン（例えば、米国特許第5,859,037号を参照）など）；クロフィブラート、ジェムフィブロジル、フェノフィブラート、シブロフィブラート、およびベザフィブラートなどのPPARαのアゴニスト、デヒドロエピアンドロステロン（DHEAまたはその抱合硫酸エステルであるDHEA-504とも呼ばれる）；アンチグルココルチコイド；TNFα阻害剤；α-グルコシダーゼ阻害剤（アカルボース、ミグリトールおよびボグリボース）、アミリンおよびアミリン誘導体（プラムリンチド（pramlintide）など（米国特許第5,902,726号；第5,124,314号；第5,175,145号および第6,143,718号、第6,136,784号も参照のこと））、インスリン分泌促進物質（レパグリニド、グリキドンおよびナテグリニド（米国特許第6,251,856号；第6,251,865号；第6,221,633号；第6,174,856号も参照のこと））、およびインスリン。
【０１８６】
IX．糖尿病の診断
本発明はまた、糖尿病を、または糖尿病もしくは別のBIK関連疾患の病態の少なくともいくつかに対する素因を診断する方法も提供する。診断は、個体の遺伝子型の判定（例えば、SNPによる）、および、糖尿病または他のBIK関連疾患の発生と関わりがあることが知られた対立遺伝子との遺伝子型の比較を含みうる。BIK遺伝子型の判定は、医薬品の有効性ならびに糖尿病に対する素因を予測するために有用である。
【０１８７】
または、診断は、患者におけるBIKのレベルを測定し、そのレベルをあるベースラインまたは範囲と比較することも含む。一般に、ベースライン値は、正常血糖（すなわち糖尿病でなく一般的には健康な）者におけるBIKの値を代表する。以上に考察した通り、BIKレベルのベースラインの範囲からの差異（高値または低値）は、その患者が糖尿病であるか、糖尿病の病態の少なくともいくつかを発症するリスクがあることを示す。いくつかの態様において、BIKのレベルは、患者から血液試料を採取して、本明細書で考察したような任意のさまざまな検出方法を用いて試料中のBIKの量を測定することによって測定される。例えば、空腹時および摂食後の血中濃度または尿中濃度を検査することができる。
【０１８８】
いくつかの態様においては、試料におけるBIKの活性または発現のレベルを決定し、1人または複数の正常血糖者のベースライン値と比較する。または、BIKの活性または発現のレベルを、同じ個体で複数の時点、例えば1日、1週間、1カ月、1年またはそれ以上の間隔をおいて決定する。試料間にBIKの活性または発現の変化があることにより、糖尿病の発症または糖尿病を発症する素因が示される。いくつかの態様において、ベースラインレベルと個体の試料におけるレベル、または同一の個体からの少なくとも2つの試料は、例えば、少なくとも5％、10％、20％、50％、75％、100％、200％、500％、1000％またはそれ以上異なる。いくつかの態様において、個体からの試料は、上に挙げた百分率の少なくとも1つの分だけベースラインレベルを上回る。同様に、いくつかの態様において、個体からの試料は、上に挙げた比率の少なくとも1つの分だけベースラインレベルを下回る。同様に、ある個体から第1の試料を採取した後の何らかの時点で採取した試料におけるレベルは、第1の試料におけるレベルより高いことも低いこともある。
【０１８９】
いくつかの態様において、BIK活性または発現のレベルは、チアゾリジンジオン、メトホルミン、スルホニル尿素および他の標準的 な治療薬といった糖尿病治療薬の有効性をモニターするために用いられる。いくつかの態様において、BIKの活性または発現は、臨床的有効性の代用マーカーとして、糖尿病患者またはインスリン抵抗性患者の糖尿病治療薬による治療の前および後に測定される。例えば、BIKの発現または活性の低下が大きいほど有効性も大きいことが示される。
【０１９０】
実施例
以下の実施例は、請求する本発明を例示するために提供するものであり、それを限定するものではない。
【０１９１】
実施例1
本実施例は、BIKの同定および特徴決定について説明する。
【０１９２】
膵島における発現が非常に高度な、K＋チャンネルの一種であるBIK（島細胞-二孔性-酸感受性-Kチャンネル）が同定された。末梢血リンパ球、肺、胎盤、小腸、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、結腸、骨格筋、心臓および脳に由来する2μgのポリA+ RNAのClontech MTNブロットを用いてノーザンブロットを行った。このブロットを、10μgのヒト膵島全RNAならびに膵臓、精巣、副腎および脾臓の2つの標本由来の各2μgのポリA+ RNAをローディングした別のノーザンブロットとともに、同一のプローブおよび条件を用いて検索した。約2.6kbの単一のバンドが膵島で観察され、はるかに程度は落ちるものの膵臓でも観察された。膵島は膵臓全体の質量のうち1〜5％を占めるため、膵臓よりも膵島の方に多く存在したことは、BIK転写物が膵島のみに認められ、膵臓の外分泌（島でない）部分には存在しないかはるかに存在量が少ないことを反映している。さらに、BIKの発現は糖尿病の動物および高脂肪食を与えた動物で亢進していた。
【０１９３】
標準的な技術により、pZL1（Invitrogen）中に精製ヒト膵臓β細胞からの相補的DNA（cDNA）ライブラリーを作製し、約100,000クローンに対してシークエンシングを行った。これらのうち20種を上回るものが独立したBIKクローンであった。これらのクローンの1つ（bc13011）の全体をシークエンシングしたところ、特徴的なK＋チャンネル形成ドメインが2つある完全長タンパク質をコードしていた（図1）。配列番号：1および2を参照されたい。本発明者らの配列とアクセッション番号AL136087で見られる公開配列との間には対立遺伝子の差異が4つある：BIK nt 597はC（AL136087ではT）、BIK nt 800はCである（AL136087ではT）、BIK nt 934はAである（AL136087ではC）、BIK nt 1191はTである（AL136087ではC）。nt 934での一塩基多型（SNP）は、コドン277をBIKにおけるB（グルタミン酸）からAL136087ではA（アラニン）に変化させる。
【０１９４】
その後、本発明者らは、標準的な技術によってラット膵島から作製したcDNAライブラリー中に2つのオルソロガスなクローンを見いだした。これらのクローンの1つであるR1A099-C1の全体をシークエンシングしたところ、これも完全長タンパク質をコードしていた。ヒトおよびラットのBIKの推定ポリペプチド配列のアライメントにより、それらがアミノ酸レベルで87％同一であることが示されている（図2）。BIKは2つのチャンネル形成ドメインを含み、樹状図分析（MacVector）によればTWIK1およびTWIK2との類似性が最も高いように思われる（図3）。
【０１９５】
マウス膵島cDNAライブラリーからBIKのマウスクローンを多数入手し、この配列に対応するGeneChipプローブ（MBXMUSISL22471）を合成した。
【０１９６】
以上に考察したように、ヒト膵島ではBIKが膵島に多く存在することが認められる。マウス膵島（図4）およびラット膵島（図5）でもBIKが多く存在することが示されている。さらに、BIK mRNAの発現は、ヒトII型糖尿病の原因を模倣して高脂肪食を与えたC57／B6Jマウスでも亢進している（図6）。このチャンネルのmRNAは、高脂肪食の摂取によって高血糖とされたC57／B6Jマウスの膵臓ではほぼ2倍に増加する。BIKは糖尿病マウスの膵島でも増加しているが糖尿病でない対照では増加していない。このmRNAは、32％脂肪食を28週間与えたマウスでは、固形飼料を与えた同齢のマウスよりも90％（p＜0.001）増加していた。42％脂肪食を与えたC57／B6Jマウスでも、それよりは程度は落ちるが同じく有意な（30％；p＜0.02）BIK mRNAの増加がみられる。同じ高脂肪食を与えたDBAマウスでは固形飼料を与えたDBAマウスと比較して増加は認められなかった。C57B6の膵島は他の系統に比してインスリン分泌に欠陥があり、この欠陥が高脂肪食を与えることによって増強される。
【０１９７】
BIK mRNAは、肥満の糖尿病（db／db）マウスでも、血糖値が正常な非糖尿病マウスに比して大幅にアップレギュレートされる（図7）。2つのチャンネル形成ドメインを含むチャンネルの「漏出」特性からみて、BIKは、II型糖尿病のこれらのマウスモデルに認められるインスリン分泌の欠陥の一因である可能性がある。本発明の範囲を限定することは意図していない、このチャンネルの発現亢進は細胞膜を過分極させ、そのために、これらの高脂肪食摂取マウスの膵島の特徴であるインスリン分泌の低下が引き起こされる可能性が高いと考えられる。
【０１９８】
糖尿病性の膵島における膵島特異的なバックグラウンド／漏出型K＋チャンネルBIKの発現亢進は、BIKがβ細胞膜の過分極を招き、それにより、糖尿病動物の膵島で認められるグルコース応答性インスリン分泌（GSIS）の不足の一因になるという可能性を示唆する。β細胞膜の脱分極は、主としてKATPチャンネル（Kir 6.2＋SUR1）によって媒介され、インスリンの放出の引き金となる電位依存性L型Ca＋＋チャンネルの活性化に必要なため、過分極はグルコースに応答したインスリン分泌を抑制する。
【０１９９】
本発明者らは、組換えアデノウイルスを用いてBIK発現を増大させると、細胞のグルコース応答性インスリン分泌に対する応答性が低下することを示した。マウスβ細胞株HC9細胞は通常、高濃度（20MM）グルコースに応答し、低濃度（0.1mM）グルコース中でのインスリン放出に比べてインスリン放出が3〜5倍に増加する。βHC9細胞をBIKコード配列を含まない対照アデノウイルスに感染させても、インスリン分泌に対する高濃度グルコースの影響は実質的に低下しなかったが、ヒトBIKまたはN末端flagエピトープで標識したヒトBIKの発現を引き起こすウイルスに感染させると、いずれもグルコース応答性インスリン分泌を顕著に抑制した（図8A）。BIKまたはflag-BIKの発現亢進はインスリンの細胞内含有量の増加ももたらした。これはBIKによるGSISの阻害がインスリン生合成の阻害には起因しないことを示している（図8B）。
【０２００】
βHC9細胞は膵島内の正常に分化したβ細胞の特徴の多くを有するが、単離したヒト膵島にBIKアデノウイルスを感染させ、続いてこれらの膵島におけるGSISアッセイ法を行うことにより、ヒトインスリン分泌性β細胞におけるBIKの機能を直接評価することができる。2人の異なるドナーからのヒト膵島のアリコートを、BIK発現をもたらすアデノウイルスまたはBIKコード配列を含まない対照ウイルスに感染させ、その48時間後に、低濃度グルコースもしくは高濃度グルコースまたはKClを含む緩衝液を用いた膵島の周辺灌流により、グルコース応答性を分析した。BIKを感染させた膵島は16mMグルコースに対してほぼ全く非感受性であった。これに対して、対照ウイルスを感染させた膵島はこの濃度のグルコースに対して強い応答を示した。KClによるβ細胞の脱分極はBIKを感染させた膵島および対照を感染させた膵島の両者からのインスリン放出を促すが、BIKを感染させた膵島からの放出の方がわずかである。
【０２０１】
β細胞または膵島におけるBIK発現を増大させることによって起こるGSISの減弱は、BIKが、膜過分極を介したβ細胞におけるインスリン放出の負の調節に寄与することを示唆する。糖尿病db／dbマウスの膵島の場合には、BIKは糖尿病マウスの膵島で観察される相対的なグルコース非感受性の一因である可能性が高い。このため、BIKの低分子阻害物質は、インスリン分泌に対するBIKの負の作用を打ち消し、糖尿病性の膵島を正常膵島により近い状態に回復させる。その結果得られる膵島機能の改善は糖尿病をもたらすインスリン不足を好転させるはずである。したがって、BIK阻害物質は抗糖尿病薬の優れた候補である。
【０２０２】
実施例2
本実施例は、BIK依存的な膜過分極／脱分極に関するアッセイ法、およびBIKチャンネルのある程度選択的な不活性化物質としてのメタナンダミドの同定について示す。
【０２０３】
線維芽細胞におけるBIKなどのバックグラウンド／漏出型カリウムチャンネルの高レベルの発現は、原形質膜の過分極を引き起こす。さらに、これらの細胞の膜電位の観測は、BIKの低分子遮断物質を検出するためのアッセイ法ともなる。本発明者らは、BIK（および比較のための、特徴が詳細に調べられているバックグラウンド型チャンネルTASK2）を発現する安定的なHEK293細胞株を作製し、FLIPR膜電位色素およびFlexStationマイクロプレート蛍光光度計を用いてその特徴を調べた。BIKおよびTASK2を発現する細胞が示したこの色素による基礎蛍光量は、ベクターのみを発現する安定的な細胞株および親HEK293細胞よりも大幅に少なかった；この減少は過分極を意味する。さらに、BIKおよびTASK2細胞は、ベクターをトランスフェクトした安定的な細胞株に比べて、30mM KClで脱分極させた時の蛍光の変化が3〜5倍大きかった。図9を参照のこと。
【０２０４】
本発明者らは、この安定的なHEK293トランスフェクト体におけるBIKチャンネルを選択的に遮断する能力に関して、一連のチャンネル遮断物質および修飾物質の試験をFlexStation/膜電位色素アッセイ法を用いて行った。内因性化合物であるアナンダミドのメチル誘導体であるメタナンダミドがBIKのある程度選択的な遮断物質であることが判明し、この化合物（100μM）によって生じたBIK細胞での蛍光（脱分極）の増加はTASK2細胞またはベクター対照細胞に比して3倍であった（図10A）。
【０２０５】
本明細書中に説明した実施例および態様は例示のみを目的としており、当業者にはそれに鑑みてさまざまな修正または変更が想起されると考えられるが、これらは本出願の精神および範囲ならびに添付する特許請求の範囲に含まれるものとする。本明細書に引用したすべての刊行物、特許および特許出願は、その全体がすべての目的に関して参照として本明細書に組み入れられる。
【０２０６】
配列表
配列番号：1：ヒトBIK cDNA
配列番号：2：ヒトBIKのポリペプチド配列
配列番号：3：ラットBIK cDNA配列
r_BIK.配列 長さ：2351 2001年12月18日 20:31 タイプ：N チェック：1892 ..
配列番号：4：ラットBIKのポリペプチド配列
r_BIK.pep 長さ：292 2001年12月19日 14:08 タイプ：P チェック：4548 ..
配列番号：5
プライマー1 hBIKの開始コドンを含む順方向プライマー
配列番号：6
プライマー2 hBIKの終止コドンを含む逆方向プライマー
配列番号：7
プライマー3 ヒトコード領域内の内部順方向プライマー
配列番号：8
プライマー4 ヒトコード領域内の内部逆方向プライマー
配列番号：9 Genbankアクセッション番号CAC07336
配列番号：10 ヒトおよびラットのBIK間のアミノ酸コンセンサス配列
一文字記号＝個々の実体
・＝保存されている残基
＿＝保存されていない残基
【図面の簡単な説明】
【０２０７】
【図１】ヒトcDNA BIKクローンによってコードされるポリペプチド配列を示している。太字の配列はチャンネル形成ドメインを表す。下線を施した配列は膜貫通ドメインを表す。
【図２】ヒトおよびラットのBIKポリペプチド配列のClustalWアライメントを示している。
【図３】BIKのTMドメインおよび孔ドメインと、TASK2、TASK1およびTWIK1の類似のドメインとの、ClustalWアライメントを示している。
【図４】BIK mRNAが他の組織よりも膵島に多く存在することを示す、マウス膵島チップハイブリダイゼーションの結果を示している。チップを、膵臓β細胞株（βHC9）、単離マウス膵島5組、さらには種々のマウス組織：脂肪、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、下垂体、骨格筋、小腸および胸腺からの同量のcRNAとハイブリダイズさせた。平均差スコアは、それぞれの組織におけるBIK mRNAの相対的存在量を反映する。Affymetrix GeneChip分析パッケージは、BIK mRNAがβHC9、すべての膵島試料のほか、小腸にも（平均差スコアははるかに低いが）存在すると判定した。この分析パッケージは、BIK mRNAは他のいずれの組織にも存在しないと判断した。
【図５】BIK mRNAが膵島に多く存在することを示す、ラット膵島チップハイブリダイゼーションの結果を示している。チップを、単離したラット膵島5組、さらには種々のラット組織：脳、十二指腸、脂肪、心臓、腎臓、肝臓、骨格筋、膵臓および脾臓からの同量のcRNAとハイブリダイズさせた。平均差スコアは、それぞれの組織におけるBIK mRNAの相対的存在量を反映する。Affymetrix GeneChip分析パッケージにより、BIK mRNAが5組の膵島試料のすべてに存在し、他のいずれの組織にも存在しないことが示された。
【図６】C57／B6Jマウスに高脂肪食を与えることによってBIK mRNAが増加することを示す、マウス膵島チップハイブリダイゼーションの結果を示している。マウス系統C57／B6JおよびDBAを固形飼料により、または32％または42％脂肪食によって28週間飼育した。各条件下のそれぞれの系統のマウス5匹から膵島を単離した。それぞれのRNA試料をマウス膵島GeneChipにより、何千種のmRNAの含有量に関して分析した。マウスBIKのmRNAは、C57／B6マウスに高脂肪食を与えることによって有意にアップレギュレートされることが見いだされた。
【図７】糖尿病（db／db）マウスの膵島でBIK mRNAが増加していることを示す、マウス膵島チップハイブリダイゼーションの結果を示している。12週齡の糖尿病（db／db）マウスおよび非糖尿病（db／+）マウスから膵島を単離し、リアルタイム半定量的PCR（TaqMan）による分析のためにRNAを調製した。マウスBIKの相対的な変化の倍数を、試料のβ-アクチンmRNA含有量に関して調整した。
【図８】BIKがβ細胞株におけるグルコース非感受性およびインスリン保持を引き起こしたことを示している。マウスのグルコース応答性β細胞株HC9を12ウェルプレートに播き、個々のウェルをそのまま感染させずにおくか、または、ヒトBIKを発現するアデノウイルス（BIKウイルス）、N末端flag標識を有するBIKを発現するアデノウイルス（flag-BIKウイルス）、もしくはBIK（またはflag-BIK）コード配列を含まない点を除いてこれらの2つと同一なアデノウイルスに感染させた（MOI＝25）。感染24時間後に細胞を洗浄し、0.1mMグルコースを含むKRB緩衝液中に40分間置いて、KRBで洗浄した。続いて細胞を、0.1mM（図8A、色の薄いバー）または20mM（色の濃いバー）のグルコースを含むKRB中で1時間インキュベートした。細胞から分泌されたインスリンの量（図8A）は、細胞に曝露させた緩衝液のアリコートのRIAによって定量し、細胞内に残ったインスリン（インスリン含有量；図8B）は、酸-エタノールによる抽出後のRIAによって定量した。インスリン分泌量およびインスリン含有量に関する値は、3回ずつの測定の平均±S.E.である。2回目の独立した実験でも同様の結果が得られた。
【図９】周辺灌流（perifusion）下にあるヒト膵島によるインスリン分泌に対するBIK発現の影響を示している。2例のドナー由来の凍結保存ヒト膵島を解凍した上で、ヒトBIKを発現するアデノウイルス（5×106pfu／膵島細胞50個）またはBIKコード配列を含まない点を除いて同一な対照ウイルスに感染させた。48時間後に膵島を、低濃度グルコースもしくは高濃度グルコースまたはKClを含む緩衝液の周辺灌流を行えるチャンバーに入れた。逐次的に2mMグルコースに5分間、16mMグルコースに15分間、2mMグルコースに10分間、30mM KClに11分間および2mMグルコースに7分間曝露させた、サイズが同等な各群の25個の膵島からのインスリン分泌を測定した。画分は1分間隔で収集した。
【図１０】メタナンダミド（Methanandamide）がBIKのある程度選択的な不活性化物質であることを示している。pcDNA3.1（○）、またはBIK（□）もしくはTASK-2（△）を発現しうる同じベクターを安定的にトランスフェクトしたHEK293細胞を、分析の24時間前に96ウェルアッセイプレートに播いた。細胞を100μlの0.5×FLIPR Membrane Potential Dye（Molecular Devices）中で30分間インキュベートした。メタナンダミドをDMSO中に希釈したものをFlexStation装置（Molecular Devices）によってウェルに添加し、この化合物の添加前、添加中および添加後の蛍光強度の変化を記録した。蛍光強度の変化を、化合物の添加前に記録した基礎値からの増加率としてプロットされている。各値は2つずつのウェルの平均および範囲である。ほかの3回の独立した実験でも同様の結果が得られた。
【配列表】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2002年6月10日に提出された米国仮特許出願第60／387,642号（これはすべての目的に関して参照として本明細書に組み入れられる）の優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
カリウムチャンネルは、数多くの細胞種で原形質膜の電位の設定および調整を行っている。これらを行うことにより、これは神経の興奮性およびホルモン分泌を含む、さまざまな生理的プロセスにおいて主要な役割を果たしている。膵β細胞で膜電位の設定にかかわる重要なチャンネルの1つに、ATP感受性カリウムチャンネルであるKir6.2がある。グルコースレベルが低い時には、インスリン分泌性β細胞の細胞質におけるATPの濃度も低い。これらの条件下でKir6.2チャンネルは開口しており、それによって細胞膜を過分極させる。グルコースレベルが高い時には、細胞質のATP濃度も上昇し、Kir6.2を通過する電流を遮断する。これは原形質膜を脱分極させるとともに、L型Ca＋＋チャンネルの電位依存的開口を惹起する（Aguilar-BryanおよびBryan、Endocr. Rev. 20: 101-135 (1999)）。
【０００３】
K＋チャンネルに作用するさまざまな薬剤が2型糖尿病に対して用いられている。スルホニル尿素系薬剤はKir6.2のチャンネル活性を阻害することによってインスリン分泌を増加させる。スルホニル尿素系薬剤は、Kir6.2と会合してその活性を調節する、スルホニル尿素受容体（SUR1）というタンパク質との相互作用を介して活性を及ぼす。ジアゾキシドは、インスリン分泌を抑制するために臨床的に用いられているKATPチャンネル開口薬である（「ION CHANNELS AND DISEASE」（Ashcroft, 2000））。Kir6.2は他の組織では他のスルホニル尿素受容体タンパク質（例えば、SUR2AおよびSUR2B）と会合した状態で認められる。新生児持続性高インスリン血症性低血糖症（PHHI）として知られる症候群をもたらす、KATPチャンネルのSUR1サブユニットにおける変異は、β細胞原形質膜の定常的な脱分極およびインスリンの恒常的な分泌を引き起こす。
【０００４】
チャンネル形成ドメインはあらゆるK＋チャンネルに認められる。これらのエレメントはK＋透過性チャンネルの形成を可能にする（Pascual, J.M.ら、Neuron 14: 1055-1063 (1995)）。大半の哺乳動物K＋チャンネルはこれらの特徴物のうち1つのみを有している。カリウムチャンネルの1つのサブクラスは、4つの膜貫通セグメントドメインおよび2つのチャンネル形成ドメインを有する。このサブクラスは二量体化によって単一の孔を形成する。ヒトゲノムにはこのようなチャンネルが少なくとも14種あり、ショウジョウバエ（Drosophilla）では11種を上回り、線虫（C. elegans）ゲノムには50種前後が存在する。このようなチャンネルは、静止電位で開口しているため、しばしば「バックグラウンドチャンネル」または「漏洩チャンネル」と呼ばれており、静止電位の設定および細胞の興奮性の調節に重要である可能性が高い。
【０００５】
糖尿病は、1型糖尿病および2型糖尿病という2種類の臨床的症候群に分けることができる。1型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病（IDDM）は、膵ランゲルハンス島におけるインスリン産生性のβ細胞の高度の損失を特徴とする慢性の自己免疫疾患である。これらの細胞は進行性に破壊されるため、分泌されるインスリンの量は減少し、分泌インスリン量が正常血糖（血中グルコース濃度が正常）に必要な濃度よりも減少すると最終的には高血糖（血中グルコース濃度の異常高値）に至る。この免疫応答の厳密な誘因は不明であるが、IDDMの患者では膵β細胞に対する抗体の値が高い。しかし、これらの抗体の値が高い患者のすべてがIDDMを発症するわけではない。
【０００６】
2型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病（NIDDM）とも呼ばれる）は、筋肉、脂肪および肝細胞がインスリンに対して正常な応答を行えない場合に発症する。この応答性の障害（インスリン抵抗性と呼ばれる）は、これらの細胞の表面にあるインスリン受容体の数の減少、細胞内部のシグナル伝達経路の機能不全、またはその両方に起因すると考えられる。β細胞は最初のうちは、インスリン産生量を増加させることによってこのインスリン抵抗性を代償する。時間の経過に伴って、これらの細胞は正常な血糖値を維持するのに十分なインスリンを産生できないようになり、これは2型糖尿病への進行を意味する。
【０００７】
2型糖尿病は、ほとんど解明されていない遺伝的な危険因子と後天性危険因子―これには高脂肪食、運動不足および加齢が含まれる―の組み合わせによって生じる。2型糖尿病は、肥満および座りがちで運動不足のライフスタイルの増加、西洋風の食事習慣の普及、および多くの国での人口の全体的高齢化のために世界的に広がっている。1985年の時点で全世界に3000万人の糖尿病患者がいると推定されており、2000年までにこの数は推定1億5400万人と5倍に増加した。糖尿病患者の数は現在から2025年までに倍増し、約3億人に達すると予想されている。
【０００８】
2型糖尿病は、グルコース代謝および脂質代謝における欠陥を特徴とする複合的疾患である。空腹時血漿グルコース値、遊離脂肪酸値およびトリグリセリド値の上昇、ならびにHDL／LDL比の低下を含む、多くの代謝パラメーターの擾乱がみられることが一般的である。以上に考察したように、糖尿病の基礎をなす主な原因の一つは、グルコース値を維持するのに十分なインスリンをβ細胞が産生できないことにある。このため、糖尿病の治療において重要な治療上の目標の一つは、インスリン産生を増加させることである。本発明はこれをはじめとする問題を取り扱う。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、配列番号：10と少なくとも90％同一な配列を含むカリウムチャンネルをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：9をコードしない。いくつかの態様において、カリウムチャンネルは配列番号：10に示された配列を含む。いくつかの態様において、カリウムチャンネルは配列番号：2を含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：1を含む。
【００１０】
本発明はまた、配列番号：2と少なくとも80％同一なカリウムチャンネルをコードする、単離されたポリヌクレオチドも提供する。いくつかの態様において、配列番号：2のアミノ酸番号277に対応する、カリウムチャンネルのアミノ酸はグルタミン酸である。
【００１１】
本発明はまた、配列番号：4と少なくとも88％同一なカリウムチャンネルをコードする、単離されたポリヌクレオチドも提供する。。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：4をコードする。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：3を含む。
【００１２】
本発明はまた、上記のポリヌクレオチドがトランスフェクトされた細胞も提供する。いくつかの態様において、細胞は膵島細胞である。
【００１３】
本発明はまた、配列番号：10と少なくとも90％同一な配列を含む、単離されたポリペプチドも提供する。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：9ではない。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：10と同一な配列を含む。いくつかの態様において、配列は配列番号：2に示されている。
【００１４】
本発明はまた、配列番号：2と少なくとも80％同一な、単離されたポリペプチドも提供する。いくつかの態様において、配列番号：2のアミノ酸番号277に対応するアミノ酸はグルタミン酸である。
【００１５】
本発明はまた、配列番号：4と少なくとも88％同一な、単離されたポリペプチドも提供する。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：4を含む。
【００１６】
本発明はまた、配列番号：2または配列番号：4と特異的に結合する抗体も提供する。いくつかの態様において、抗体は配列番号：2と特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体は配列番号：4と結合する。いくつかの態様において、抗体は配列番号：9とは結合しない。いくつかの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗体はポリクローナル抗体である。
【００１７】
本発明はまた、動物におけるグルコース応答性（glucose-stimulated）インスリン産生を誘導する作用物質を同定する方法。いくつかの態様において、本方法は以下の段階を含む：（i）作用物質を、配列番号：2、配列番号：4または配列番号：9をコードする配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む混合物と接触させ、その後に0.2×SSCにより55℃、20分間の洗浄を1回行うこと；および（ii）そのポリペプチドの発現または活性を変化させる（modulate）作用物質を選択し、それによって動物におけるグルコース応答性インスリン産生を誘導する作用物質を同定すること。
【００１８】
いくつかの態様において、段階（ii）は、ポリペプチドの発現を変化させる作用物質を選択することを含む。いくつかの態様において、段階（ii）は、ポリペプチドの活性を変化させる作用物質を選択することを含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：2を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：4を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：9を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：9を含まない。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：10を含む。
【００１９】
いくつかの態様において、ポリペプチドは固体支持体と結合している。いくつかの態様において、作用物質は固体支持体と結合している。いくつかの態様において、作用物質はポリペプチドと特異的に結合する作用物質を同定することによって選択される。いくつかの態様において、混合物はポリペプチドを発現する細胞を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドの活性は、細胞におけるカルシウム流の変化を測定することを含む段階によって決定される。いくつかの態様において、ポリペプチドの活性は、細胞の膜電位の変化を測定することを含む段階によって決定される。
【００２０】
いくつかの態様において、細胞はインスリン分泌性細胞である。いくつかの態様において、ポリペプチドの活性は、細胞によるインスリン分泌の変化を測定することを含む段階によって決定される。いくつかの態様において、ポリペプチドの活性は、細胞によるグルコース応答性インスリン分泌の変化を測定することを含む段階によって決定される。いくつかの態様において、本方法はさらに、作用物質を糖尿病動物に投与すること、および、動物をグルコース応答性インスリン分泌の増加に関して検査することを含む。
【００２１】
本発明はまた、動物におけるグルコース応答性インスリン産生を誘導する方法であって、上記の方法によって選択された作用物質の治療的有効量を投与することを含む方法も提供する。いくつかの態様において、動物はヒトである。
【００２２】
定義
「糖尿病に対する素因」は、ある人が糖尿病を発症するリスクが高い場合に、その人に存在する。多数の危険因子が当業者に知られており、これには以下のものが含まれる：遺伝要因（例えば、平均的な集団よりも糖尿病の発生率が高くなる対立遺伝子を有する、または糖尿病の親もしくは兄弟姉妹がいる）；過体重（例えば、肥満指数（BMI）が25kg／m2またはそれ以上である）；習慣的な運動不足、人種／民族（例えば、アフリカ系アメリカ人、スペイン系アメリカ人、アメリカ先住民、アジア系アメリカ人、太平洋諸島住民）；空腹時血糖障害もしくは耐糖能障害が以前に確認、高血圧（例えば、成人で140／90mmHgまたはそれ以上）；HDLコレステロール値が35mg／dlまたはそれ以上；トリグリセリド値が250mg／dlまたはそれ以上；妊娠時糖尿病もしくは9ポンドを上回る新生児の分娩の既往；および／または多嚢胞性卵巣症候群。例えば、「Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus」および「Screening for Diabetes」Diabetes Care 25(1): S5-S24 (2002)を参照されたい。
【００２３】
「正常血糖個体（lean individual）」とは、患者からのサンプルと対比して用いる場合、空腹時血糖値が110mg／dl未満、または負荷2時間後血糖値（2 hour PG）の読取り値が140mg／dl未満である成人のことを指す。「負荷2時間後血糖値」とは、75g無水グルコース相当物を水に溶解したものを含むグルコース負荷を患者に与えた後の血糖値のことを指す。この試験全体は一般に経口グルコース負荷試験（OGTT）と呼ばれる。例えば、Diabetes Care、Supplement 2002、American Diabetes Association：Clinical Practice Recommendations 2002を参照されたい。正常血糖個体におけるポリペプチドのレベルは、単一の個体からの読取り値であってもよいが、通常は、正常血糖個体の群による統計学的に意味のある平均値である。正常血糖個体におけるポリペプチドのレベルは、例えばコンピュータプログラムで、ある値によって表すことができる。
【００２４】
「β細胞抑制性カリウムチャンネル（BIK）ポリペプチド」「BIKタンパク質」または「BIK」とは、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：9、配列番号：10と実質的に同一な2つのチャンネル形成ドメインもしくはその断片、または配列番号：2、配列番号：4、配列番号：9もしくは配列番号：10と実質的に同じ活性を有するペプチド模倣物組成物を含む、カリウムチャンネルのことを指す。BIKは2つのチャンネル形成ドメインを含む。図1において、チャンネル形成ドメインは太字で示されており、膜貫通ドメインには下線が施されている。天然型BIKの発現は一般に膵臓で、より詳細には島細胞で、高度である。
【００２５】
「チャンネル形成ドメイン」とは、膜内にチャンネルを形成する、カリウムチャンネルの一部分のことを指す。ヒトBIKのチャンネル形成ドメインは図1では太字で示されている。一般的には、このようなドメイン4つが組み合わされてチャンネルが形成される。ポリペプチドがチャンネル形成ドメインを1つずつ含む場合には、一般に4つのポリペプチドがチャンネルの形成のために必要である。各ポリペプチドが4つの膜貫通ドメインおよび2つのチャンネル形成ドメインを含む場合には。例えば、Ketchumら、Nature 376: 690-5 (1995)を参照されたい。
【００２６】
本発明の「BIK核酸」または「BIKポリヌクレオチド配列」とは、BIKポリペプチドをコードする部分配列性または完全長のポリヌクレオチド配列のことである。本発明のBIK核酸の例には、配列番号：1、配列番号：3などと実質的に同一な配列、および、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：9、配列番号：10をコードするポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの態様において、BIKポリヌクレオチドは、アミノ酸277がグルタミン酸である配列番号：2と実質的に類似したポリペプチド、またはアミノ酸277がグルタミン酸である配列番号：9をコードする。
【００２７】
「BIK活性」または「カリウムチャンネル活性」とは、本明細書で用いる場合、タンパク質が細胞の原形質膜の電位を設定または調整する能力のことを指す。活性は例えば、パッチクランプ法を用いて測定しうる。パッチクランプ分析は一般に、細胞膜とマイクロピペットのガラス壁との間に高抵抗の密封状態を形成させることを含む。次に、膜内のイオンチャンネルを通って流れる電流を測定する。例えば、Ashcroftら、2000, 前記を参照されたい。また、細胞内のチャンネルの活性を検出するために、膜電位に対する感受性のある蛍光色素または蛍光共鳴エネルギー伝達（FRET）試薬を用いることもできる。Millerら、Eur J Pharmacol. 370(2): 179-85 (1999)；Fedidaら、Prog Biophys Mol Biol. 75(3): 165-99 (2000)。
【００２８】
「BIKのアゴニスト」とは、BIKと結合する、BIKを賦活する、増加させる、促進させる、活性化を増強する、感受性を高める、またはその活性もしくは発現をアップレギュレートする、作用物質のことを指す。
【００２９】
「BIKのアンタゴニスト」とは、BIKと結合する、BIKの賦活を部分的もしくは完全に阻止する、減少させる、妨げる、活性化を遅らせる、不活性化する、感受性を低下させる、またはその活性もしくは発現をダウンレギュレートする、作用物質のことを指す。
【００３０】
「抗体」とは、分析物（抗原）と特異的に結合してそれを認識する、1つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチドまたはその断片のことを指す。一般に認められている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子のほか、極めて多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεに分類され、これによってそれぞれIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgBという免疫グロブリンのクラスが規定される。
【００３１】
典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体から構成される。各四量体は2つの同一なポリペプチド鎖の対から構成され、それぞれの対は1つの「軽鎖」（約25kDa）および1つの「重鎖」（約50〜70kDa）を有する。各鎖のN末端には、抗原認識を主に担う約100〜110アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域が定められている。可変軽鎖（VL）および可変重鎖（VH）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖のことを指す。
【００３２】
抗体は、例えば、完全な免疫グロブリン、または種々のペプチダーゼによる消化によって生じる、詳細に特徴づけられているさまざまな断片として存在する。すなわち、例えばペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下方で抗体を切断し、ジスルフィド結合によってVH-CH1と連結した軽鎖であるFabの二量体、F(ab)'２を生成する。ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断するためにF(ab)'２を穏和な条件下で還元し、それによってF(ab)'２二量体をFab'単量体に変換することもできる。Fab'単量体は本質的にはヒンジ領域の一部を伴うFabである（Paul（編）「Fundamental Immunology」第3版、Raven Press, NY (1993)を参照されたい）。さまざまな抗体断片が完全抗体の消化の見地から定義されているが、当業者は、このような断片を化学的または組換えDNA法を用いてデノボ合成しうることを理解すると考えられる。このため、本明細書で用いる抗体という用語には、抗体全体の改変によって生じる抗体断片、または組換えDNA法を用いてデノボ合成されたもの（例えば、一本鎖Fv）も含まれる。
【００３３】
「ペプチド模倣物（peptidomimetic）」および「模倣物（mimetic）」という用語は、本発明のBIKポリペプチド、BIKアンタゴニスト、またはBIKアゴニストと実質的に同じ構造的および機能的な特徴を有する合成化合物のことを指す。ペプチド類似体は一般に、テンプレートペプチドと類似した特性を備えた非ペプチド薬として製薬産業で用いられている。この種の非ペプチド化合物は「ペプチド模倣物（peptide mimetic）」または「ペプチド模倣物（peptidemimetic）」と呼ばれる（Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986)；VeberおよびFreidinger、TINS p. 392 (1985)；およびEvansら、J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)、これらは参照として本明細書に組み入れられる）。治療的に有用なペプチドと構造的に類似したペプチド模倣物を用いることで、同等または向上した治療効果または予防効果が得られる可能性がある。一般に、ペプチド模倣物は、BIKポリペプチドのような、模範ポリペプチド（すなわち、生物活性または薬理活性を有するポリペプチド）と構造的に類似しているが、CH2NH-、-CH2S、-CH2-CH2-、-CH=CH-（シスおよびトランス）、-COCH2-、-CH(OH)CH2-およびCH2SO-などからなる群より選択される連鎖によって随意に置換された1つまたは複数のペプチド連鎖を有する。模倣物は合成性で非天然性のアミノ酸類似体からすべて構成されてもよく、または、一部が天然ペプチドアミノ酸で一部が非天然性のアミノ酸類似体であるキメラ分子であってもよい。模倣物はまた、天然アミノ酸の保存的置換物の任意の量を、このような置換が模倣物の構造および/または活性を実質的に変化させない限り、包含しうる。例えば、模倣物組成物は、それがBIKの結合活性もしくは酵素活性を達成する、またはBIK酵素活性を阻害もしくは増加することができるならば、本発明の範囲に含まれる。
【００３４】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAのセグメントのことを意味する；これには、コード領域（リーダーおよびトレーラー）の前および後の領域、さらには個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）も含まれる。
【００３５】
「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に適用される場合、核酸またはタンパク質が、天然の状態でそれに付随する他の細胞成分を本質的に含まないことを表す。これは均一な状態にあることが好ましいが、乾燥していても水溶液中にあってもよい。純度および均一性は通常、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学の技術を用いて決定される。調製物中に存在する最も多数を占める種であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、その遺伝子に隣接して目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中に本質的には1つのバンドを生じることを表す。これは詳細には、核酸またはタンパク質の純度が、少なくとも85％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも99％であることを意味する。
【００３６】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および、一本鎖または二本鎖の形態にあるそれらの重合体のことを指す。特に限定されない限り、この用語には、参照核酸と同程度の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体が含まれる。別に指示しない限り、個々の核酸配列には、明示的に指定された配列のほかに、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換物）および相補的配列が暗黙的に含まれる。詳細には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択した（またはすべての）コドンの第3の位置が、混合塩基および/またはデオキシイノシン残基によって置換された配列を生じさせることによって行いうる（Batzerら、Nucleic Acids Res. 19: 5081 (1991)；Ohtsukaら、J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985)；およびCassolら(1992)；Rossoliniら、Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)）。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、および遺伝子によってコードされるmRNAと互換的に用いられる。
【００３７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において、アミノ酸残基の重合体を指す目的で互換的に用いられる。これらの用語は、天然アミノ酸重合体および非天然アミノ酸重合体のほか、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸重合体に対しても適用される。本明細書で用いる場合、これらの用語には、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結された、完全長タンパク質（すなわち、抗原）を含む任意の長さのアミノ酸鎖が含まれる。
【００３８】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸のほか、天然のアミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物のことも指す。天然のアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるもののほか、その後に修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸およびO-ホスホセリンなどののこともいう。アミノ酸類似体とは、天然のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびR基と結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムのことを指す。この種の類似体は、改変されたR基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。「アミノ酸模倣物」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するものの天然アミノ酸と類似した様式で機能する化合物のことを指す。
【００３９】
本明細書ではアミノ酸を、一般的に知られた三文字記号、またはIUPAC-IUBの生化学物質命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）が推奨している一文字記号のいずれかによって参照する。ヌクレオチドも同じく、一般的に認められている一文字記号によって参照する。
【００４０】
「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に対して適用される。個々の核酸配列に関して、「保存的に改変されたバリアント」とは、同一もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸のことを指し、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一な配列のことを指す。遺伝暗号の縮重性のために、任意のタンパク質は多数の機能的に同一な核酸によってコードされうる。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUはすべてアラニンというアミノ酸をコードする。このため、コドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを変化させずに、そのコドンを対応する上記のコドンのいずれかに変化させることができる。このような核酸変形物は「サイレント変形物」であり、保存的に改変された変形物の一種である。何らかのポリペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、その核酸のあらゆる可能なサイレント変形物についても述べている。当業者は、核酸内の各コドン（通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるAUG、および通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く）を改変して、機能的に同一な分子を作製しうることを理解すると考えられる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各々のサイレント変形物は、記載する各配列に黙示的に含まれる。
【００４１】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸または少数のアミノ酸が改変、付加または除去される、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する個々の置換物、欠失物または付加物が、改変によってアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置換されるような「保存的に改変されたバリアント」であることを理解すると考えられる。機能的に類似したアミノ酸が得られる保存的置換の表も当技術分野で周知である。このような保存的に改変されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間相同体および対立遺伝子に加わるものであり、それらが除外されるわけではない。
【００４２】
以下の8つの群はそれぞれ、互いに保存的なアミノ酸を含む：
1）アラニン（A）、グリシン（G）；
2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4）アルギニン（R）、リジン（K）；
5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；
7）セリン（S）、トレオニン（T）；および
8）システイン（C）、メチオニン（M）
（例えば、Creighton、「タンパク質（Proteins）」（1984）を参照されたい）。
【００４３】
「配列一致率（percentage of sequence identity）」は、最適なアラインメントがなされた2つの配列を比較域（comparison window）にわたって比較することによって決定され、この際、比較域中のポリヌクレオチド配列の一部分は、2つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。この率は、両方の配列に同一の核酸塩基または残基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を求め、一致した位置の数を比較域における位置の総数で除算し、その結果に100を掛けて配列一致率を求めることによって算出される。
【００４４】
2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一である」または「一致」率という用語は、一定の比較域にわたって、または以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いるかもしくは手作業によるアラインメントおよび目視検査によって指定された領域にわたって、最大の対応関係が得られるように比較およびアラインメントを行った場合に、同じである、または同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドが指定された比率である（すなわち、指定された領域にわたって60％の同一性、選択的には65％、70％、75％、80％、85％、90％または95％の同一性）、2つまたはそれ以上の配列または部分配列のことを指す。このような配列を「実質的に同一である」と言う。この定義は、被験配列の相補物のことも指す。選択的には、同一性は、少なくとも約50ヌクレオチド長の領域にわたって、またはより好ましくは100〜500ヌクレオチド長もしくは1000ヌクレオチド長またはそれ以上の領域にわたって存在する。
【００４５】
2つまたはそれ以上のポリペプチド配列の文脈において、「類似性」または「類似」率という用語は、一定の比較域にわたって、または以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いるかもしくは手作業によるアラインメントおよび目視検査によって指定された領域にわたって、最大の対応関係が得られるように比較およびアラインメントを行った場合に、同じである、または上に定義した8種の保存的アミノ酸置換の定義による類似性のあるアミノ酸残基が指定された比率である（すなわち、指定された領域にわたって60％、選択的には65％、70％、75％、80％、85％、90％または95％の類似性）、2つまたはそれ以上の配列または部分配列のことを指す。このような配列を「実質的に類似している」と言う。選択的には、この同一性は、少なくとも約50ヌクレオチド長の領域にわたって、またはより好ましくは少なくとも約100〜500アミノ酸長または1000もしくはそれ以上のアミノ酸長の領域にわたって存在する。
【００４６】
配列比較のためには、1つの配列を、被験配列と比較するための参照配列として用いることが一般的である。配列比較アルゴリズムを用いる場合には、被験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列の座標を指定して、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。デフォールトのプログラムパラメーターを用いることもでき、別のパラメーターを指定することもできる。続いて、プログラムのパラメーターに基づいて、参照配列に対する被験配列の配列一致率または類似率を配列比較アルゴリズムで計算する。
【００４７】
本明細書で用いる「比較域（comparison window）」は、2つの配列の最適なアラインメントを行った後に、ある配列を同じ数の連続した位置を持つ参照配列と比較しうるような、20〜600個、通常は約50〜約200個、より一般的には約100〜約150個からなる群から選択される数の連続した位置のいずれか1つの区域に対する言及を含んでいる。比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、SmithおよびWaterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482cの局所的相同性アルゴリズムにより、NeedlemanおよびWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443の相同性アラインメントアルゴリズムにより、PearsonおよびLipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci.USA 85: 2444の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ・インプリメンテーション（Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）により、または手作業によるアラインメントおよび目視検査によって行うことができる（例えば、Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」（1995年補遺）を参照されたい）。
【００４８】
有用なアルゴリズムの一例がPILEUPである。PILEUPは漸進的な対形式のアラインメントを用いて一群の関連配列から多数の配列アラインメントを作成し、関連性および配列一致率を提示する。これはアラインメントを作成するために用いたクラスター化の関係を示す樹状図またはデンドログラムのプロットも行う。PILEUPは、FengおよびDoolittle、J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987)の漸進的アラインメント法を単純化したものを用いている。用いている方法は、HigginsおよびSharp、CABIOS 5: 151-153 (1989)と類似している。このプログラムは、それぞれ最大長が5,000ヌクレオチドまたはアミノ酸である最大300個の配列のアラインメントを行うことができる。最も類似した2つの配列の対形式のアラインメントから多数のアラインメント手順が始まり、アラインメントされた2つの配列のクラスターが作成される。続いてこのクラスターを、次に最も関連性の高い配列、またはアラインメントされた配列のクラスターに対してアラインメントを行う。2つの配列クラスターは、個々の2つの配列の対形式のアラインメントを単純に拡張することによってアラインメントを行う。最終的なアラインメントは、一連の漸進的な対形式のアラインメントを行うことによって得られる。このプログラムは、配列を比較する領域に関して特定の配列およびそのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することにより、ならびにプログラムパラメーターを指定することによって実行される。PILEUPを用いる場合には、以下のパラメーターを用いて参照配列を他の被験配列と比較して、配列一致率を決定する：デフォールトのギャップウェイト（gap weight）（3.00）、デフォールトのギャップ長ウェイト（gap length weight）（0.10）および重み付けエンドギャップ（weighted end gap）。PILEUPは、GCC配列解析ソフトウエアパッケージ、例えば、バージョン7.0（Devereauxら (1984)、Nuc. Acids Res. 12: 387-395）から入手可能である。
【００４９】
配列一致率および配列類似性の決定のために適した1つのアルゴリズムの別の例が、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、それぞれAltschulら、Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977)およびAltschulら、J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)に記載されている。BLAST解析を行うためのソフトウエアは米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.n1m.nih.gov/）に公開されている。このアルゴリズムでは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列化した場合に何らかの正値の閾値スコアTと一致する、またはそれを満たす、長さWの短いワードを検索配列中に同定することにより、高スコアの配列ペア（HSP）をまず同定する。Tは近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschulら、前記）。これらの初期の近隣ワードでのヒットは、それらを含む長いHSPを見いだすための検索を開始する源となる。ワードの検索は、累積アラインメントスコアが増加する限り、各配列の両方向に対して延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターM（一致する残基対に関する報酬スコア；常に＞0）およびN（ミスマッチ残基に関するペナルティスコア；常に＜0）を用いて算出する。アミノ酸配列の場合には、累積スコアの算出にスコア行列を用いる。各方向へのワード検索の延長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアが最大達成値に比べて量Xより低くなった場合：1つもしくは複数の負スコアの残基アラインメントの蓄積のために累積スコアがゼロまたはそれ未満になった場合；または配列のいずれかの端に達した場合。BLASTアルゴリズムのパラメーターであるW、TおよびXは整列化の感度および速度を決定する。BLASTNプログラムは（ヌクレオチド配列の場合）、デフォールトとしてワード長（W）11、期待値（E）10、M＝5、N＝-4および両ストランドの比較を用いる。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムはデフォールトとしてワード長3および期待値（E）10、ならびにBLOSUM62スコア行列（HenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915 (1989)を参照）のアラインメント（B）50、期待値（E）10、M＝5、N＝-4および両ストランドの比較を用いる。
【００５０】
BLASTアルゴリズムは、2つの配列の間の類似性に関する統計分析も行う（例えば、KahnおよびAltschul (1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照）。BLASTアルゴリズムによって得られる類似性の指標の1つは最小合計確率（smallest sum probability）（P(N)）であり、これは2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標となる。例えば、ある核酸は、被験核酸と参照核酸との比較による最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満の場合に、参照配列と類似しているとみなされる。
【００５１】
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標の1つは、以下に述べるように、第1の核酸によってコードされるポリペプチドが、第2の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば、2つのペプチドが保存的置換のみの点で異なる場合、ポリペプチドは一般に第2のポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であるというもう1つの指標は、以下に述べるように、2つの分子またはその相補物がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。2つの核酸配列が実質的に同一であるというさらにもう1つの指標は、配列の増幅に同じプライマーを用いうることである。
【００５２】
「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」という語句は、ある分子の結合、二重鎖形成またはハイブリダイゼーションが、その配列が複合混合物（例えば、全細胞またはライブラリーのDNAまたはRNA）中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定のヌクレオチド配列のみに対して起こることを指す。
【００５３】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、一般的には核酸の複合混合物において、プローブがその標的部分配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしないと考えられる条件のことを指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、環境が異なれば異なると考えられる。配列が長いほど高い温度で特異的にハイブリダイズすると考えられる。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細な手引きは、Tijssen、「Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes」、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」（1993）に記載がある。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHでの特定の配列の融点（Tｍ）よりも約5〜10℃低くなるように選択する。Tｍは、標的に対して相補的なプローブの50％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、pHおよび核酸濃度の下で）である（標的配列が過剰に存在するため、Tｍでは平衡状態でプローブの50％が占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がナトリウムイオン濃度で約1.0M未満、一般的にはナトリウムイオン（または他の塩の）濃度で約0.01〜1.0M、pH7.0〜8.3であり、温度は短いプローブ（例えば、10〜50ヌクレオチド）に関しては少なくとも約30℃であって、（例えば、50ヌクレオチドを上回るもの）に関しては少なくとも約60℃であると考えられる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの脱安定剤の添加によっても得られる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンド値の少なくとも2倍、選択的にはバックグラウンドでのハイブリダイゼーションの10倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては以下のものが考えられる：50％ホルムアミド、5×SSCおよび1％SDS、42℃でインキュベートを行い、または5×SSC、1％SDS、65℃でインキュベートを行い、その上で0.2×SSCおよび0.1％SDS、65℃で洗浄する。このような洗浄は5、15、30、60、120分またはさらに多くの分数にわたって行いうる。
【００５４】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸も、それらをコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、やはり実質的に同一である。これは例えば、遺伝暗号によって許容される最大のコドン縮重性を用いて生じた核酸のコピーの場合に起こる。このような場合には、核酸は一般に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の例には、40％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDS、37℃の緩衝液中でのハイブリダイゼーション、および1×SSC、45℃での洗浄が含まれる。このような洗浄は、5、15、30、60、120分またはさらに多くの分数にわたって行いうる。陽性のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍である。代替的なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を用いて同様に厳密な条件が得られることを、当業者は容易に認識すると考えられる。
【００５５】
「〜をコードする核酸配列」という語句は、rRNA、tRNAなどの構造RNA、または特定のタンパク質もしくはペプチドの一次アミノ酸配列、またはトランス作用性調節因子の結合部位に関する配列情報を含む核酸のことを指す。この語句には特に、特定の宿主細胞におけるコドン選好性に適合するように導入しうる、1つまたは複数の天然配列の縮重コドン（すなわち、単一のアミノ酸をコードする複数種のコドン）が含まれる。
【００５６】
細胞、核酸、タンパク質またはベクターなどに言及して用いる場合、「組換え」という用語は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸またはタンパク質の改変によって改変されたこと、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを意味する。このため、例えば、組換え細胞は、天然型（非組換え型）の細胞に認められない遺伝子を発現する、または、通常であれば異常発現される、低発現される、もしくは全く発現されないような天然遺伝子を発現する。
【００５７】
核酸の部分に言及して用いる場合、「異種」という用語は、核酸が、自然下ではお互いに同じ関係では認められない2つまたはそれ以上の部分配列を含むことを意味する。例えば、核酸は一般に、例えば、1つの源からのプロモーターおよび別の源からのコード領域というように、関連のない遺伝子に由来する2つまたはそれ以上の配列が新たな機能的核酸を生じるように配置された形で、組換え法によって産生される。同様に、異種タンパク質とは、タンパク質が、自然下ではお互いに同じ関係では認められない2つまたはそれ以上の部分配列を含むことを意味する（例えば、融合タンパク質）。
【００５８】
「発現ベクター」とは、宿主細胞内での特定の核酸の転写を許容する一連の指定された核酸配列を有する、組換え法または合成によって作製された核酸構築物のことである。発現ベクターはプラスミド、ウイルスまたは核酸断片の部分であってもよい。発現ベクターは、プロモーターと機能的に結合した転写用の核酸を含むことが一般的である。
【００５９】
「抗体と特異的に（もしくは選択的に）結合する」または「との特異的な（もしくは選択的な）免疫反応性がある」という語句は、タンパク質またはペプチドについて言及する場合、タンパク質および他の生体物質の不均一な集団の存在下でそのタンパク質の存在を決定づける結合反応のことを指す。すなわち、指示されたイムノアッセイ条件下で、指定された抗体は試料中に存在するある特定のタンパク質と結合し、他のタンパク質とは有効な量では結合しない。このような条件下での抗体に対する特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性の点から選択された抗体が必要と思われる。例えば、本発明のいずれかのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して産生された抗体を選択して、そのタンパク質とは特異的に免疫反応し、多型バリアントを除く他のタンパク質とは反応しない抗体を得ることができる。特定の抗体に対する特異的な免疫反応性のある抗原を選択するためには、さまざまなイムノアッセイ形式を用いうる。例えば、フローサイトメトリーおよびFACS分析または免疫組織化学が、あるタンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するためにルーチン的に用いられている。特異的免疫反応性の決定に用いうるイムノアッセイの形式および条件の記載については、例えば、HarlowおよびLane、「Antibodies, Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Publications, NY (1988)を参照されたい。通常、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドの信号または雑音の少なくとも2倍であると考えられ、より一般的にはバックグラウンドの10〜100倍を上回ると考えられる。
【００６０】
BIKの発現またはBIK活性の「阻害物質」「活性化物質」および「修飾物質」は、BIKの発現またはBIK活性に関するインビトロおよびインビボでのアッセイ法を用いて同定された、それぞれ阻害性、活性化性または修飾性の分子、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニストならびにそれらの相同体および模倣物を指して用いられる。「修飾物質」という用語には阻害物質および活性化物質が含まれる。阻害物質とは、例えば、BIKの発現を阻害する、またはBIKと結合する、賦活もしくは酵素活性を部分的もしくは完全に阻止する、BIKの活性を低下させる、妨げる、活性化を遅らせる、不活性化する、感受性を低下させる、もしくは活性をダウンレギュレートする作用物質、例えばアンタゴニストのことである。活性化物質とは、例えば、BIKの発現を誘導もしくは活性化する、またはBIKと結合する、それを賦活する、増加させる、開口させる、活性化する、促通する、活性化もしくは酵素活性を増強する、感受性を高める、もしくはその活性をアップレギュレートする作用物質、例えばアゴニストのことである。修飾物質には、天然および合成性のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、低分子量化学分子などが含まれる。阻害物質および活性化物質に関するこの種のアッセイ法には、例えば、BIK修飾物質の存在下または非存在下で、修飾性化合物と推定されるものを膵臓細胞または他のBIK発現細胞に対して適用した後に、上記のように、BIK活性に対する機能的な影響を判定することが含まれる。影響の程度を検討するには、活性化物質、阻害物質または修飾物質の候補によって処理したBIKを含む試料またはアッセイ物を、阻害物質、活性化物質または修飾物質を含まない対照試料と比較する。対照試料（阻害物質で処理していないもの）をBIKの相対活性値100％と指定する。BIKの阻害は、BIKの活性値が対照に比して約80％、選択的には50％または25〜1％である場合に達成される。BIKの活性化は、BIKの活性値が対照に比して110％、選択的には150％、選択的には200〜500％または1000〜3000％の高さである場合に達成される。
【００６１】
発明の詳細な説明
I．序論
本出願は、高脂肪食を与えた動物および糖尿病の動物では、驚いたことに、血糖値が正常な健康な動物でのレベルに比して、BIKが高いレベルで発現されることを示す。さらに、BIKの発現は、インスリン産生が起こる膵臓の島細胞で非常に高度である。BIKは細胞の静止電位を維持しているK＋チャンネルである。糖尿病の動物または糖尿病に対する素因のある動物で観察されるBIKのアップレギュレーションは、BIKのアップレギュレーションがインスリン分泌を妨げることを示している。このため、BIKの発現または活性に拮抗することは、糖尿病を治療するために有用である。
【００６２】
本発明は、BIK配列と命名された新たなポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列のほか、糖尿病の診断および治療のためにBIK配列を用いる方法を対象とする。本方法はまた、BIKの発現および活性に対する修飾物質を同定する方法も提供する。このような修飾物質は、1型糖尿病および2型糖尿病、ならびにこうした疾患の病的様相を治療するために有用である。
【００６３】
II．本発明に用いるための一般的な組換え核酸方法
本発明の数多くの態様においては、組換え方法を用いて、目的のBIKをコードする核酸の単離およびクローニングを行う。この種の態様は、例えば、タンパク質発現のためまたはバリアント、誘導体、発現カセットもしくはBIKポリペプチド（例えば、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：9、または配列番号：10）をコードする他の配列の作製時にBIKポリヌクレオチド（例えば、配列番号：1、または配列番号：3）を単離するために、BIK遺伝子の発現を観測するために、さまざまな種におけるBIK配列の単離もしくは検出のために、患者における診断目的のために、例えば、BIKにおける変異を検出するため、もしくはBIK核酸もしくはBIKポリペプチドの発現レベルを検出するために用いられる。いくつかの態様において、本発明のBIKをコードする配列は、異種プロモーターと機能的に結合している。1つの態様において、本発明の核酸は、特に例えばヒト、マウス、ラットなどを含む、任意の哺乳動物に由来する。
【００６４】
A．一般的な組換え核酸方法
本発明は、組換え遺伝学の分野におけるルーチン的な技術に依拠している。本発明における一般的な使用方法を開示している基本的なテキストには、Sambrookら、「Molecular Cloning、Laboratory Manual」（第3版、2001）；Kriegler、「Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual」（1990）；および「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubelら編、1994）が含まれる。
【００６５】
核酸の場合、サイズはキロベース（kb）または塩基対（bp）のいずれかによって表す。これらは、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲルでの電気泳動、配列が決定された核酸、または公表されたDNA配列から得られる推定値である。タンパク質の場合、サイズはキロダルトン（kDa）またはアミノ酸残基数によって表す。タンパク質のサイズは、ゲル電気泳動、配列が決定されたタンパク質、導き出されたアミノ酸配列、または公表されたタンパク質配列から推定される。
【００６６】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22: 1859-1862 (1981)によって最初に記載された固相ホスホロアミダイドトリエステル法に従って、Van Devanterら、Nucleic Acid Res. 12: 6159-6168 (1984)に記載された自動合成装置を用いて化学合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、未変性アクリルアミドゲル電気泳動、またはPearson & Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983)に記載された陰イオン交換HPLCによって行う。
【００６７】
クローニングされた遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、Wallaceら、Gene 16: 21-26 (1981)による二本鎖テンプレートのシークエンシング用の連鎖停止法などを用いたクローニングの後に確認することができる。
【００６８】
B．所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の単離のためのクローニング法
一般に、主題タンパク質をコードする核酸は、cDNAまたはゲノムDNAをコードするように作製されたDNA配列ライブラリーからクローニングされる。特定の配列の位置はオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることによって決定可能であり、後者の配列はBIK配列から導くことができ（例えば、配列番号：1、または配列番号：3）、これはPCRプライマー用の基準となる上に、BIK特異的プローブを単離するのに適した領域を規定する。または、配列を発現ライブラリー中にクローニングする場合には、発現された組換えタンパク質を、目的のBIKに対して作製された抗血清または精製抗体を用いて免疫学的に検出することもできる。
【００６９】
ゲノムライブラリーおよびcDNAライブラリーの作製およびスクリーニングのための方法は当業者に周知である（例えば、GublerおよびHoffman、Gene 25: 263-269 (1983)；BentonおよびDavis、Science, 196: 180-182 (1977)；およびSambrook、前記を参照されたい）。膵細胞はBIK RNAおよびcDNAを単離するのに適した細胞の一例である。
【００７０】
簡潔に述べると、cDNAライブラリーを作製するためには、mRNAを豊富に含む源を選択する必要がある。続いて、mRNAをcDNAにし、組換えベクター中に連結した上で、増殖、スクリーニングおよびクローニングのために組換え宿主にトランスフェクトする。ゲノムライブラリーの場合には、DNAを組織または細胞から抽出し、機械的剪断または酵素消化のいずれかにより、好ましくは約5〜100kbの断片を得る。続いて勾配遠心によって断片を望ましくないサイズのものから分離し、バクテリオファージλベクター中に構築する。これらのベクターおよびファージのパッケージングをインビトロで行い、組換えファージをプラークハイブリダイゼーションによって分析する。コロニーハイブリダイゼーションは、Grunsteinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961-3965 (1975)に一般的に記載された通りに行う。
【００７１】
代替的な1つの方法では、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用とmRNAまたはDNAテンプレートの増幅とを組み合わせる。適したプライマーは、特定のBIK配列、例えば、配列番号：1、または配列番号：3で前記に示された配列から設計することができる。このポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法では、目的のタンパク質をコードする核酸を、mRNA、cDNA、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーから直接増幅する。制限酵素部位をプライマーに組み入れることができる。ポリメラーゼ連鎖反応または他のインビトロ増幅法は、例えば、特定のタンパク質をクローニングして前駆タンパク質を発現させるため、生理的試料中の本発明のBIKポリペプチドをコードするmRNAの存在を検出するためのプローブとして用いるための核酸を合成するため、核酸シークエンシングのため、またはその他の目的のためにも有用と思われる（米国特許第4,683,195号および第4,683,202号を参照）。PCR反応によって増幅された遺伝子はアガロースゲルから精製し、適したベクター中にクローニングすることができる。
【００７２】
本発明のBIKポリペプチドをコードする遺伝子を哺乳動物組織から同定するために適切なプライマーおよびプローブは、本明細書で提供する配列、特に配列番号：1、もしくは配列番号：3、または配列番号：2および配列番号：4のBIKポリペプチド中のコードアミノ酸から導くことができる。PCRの一般的な概説については、Innisら、「PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications」、Academic Press、San Diego (1990)を参照されたい。
【００７３】
合成オリゴヌクレオチドを遺伝子の構築に用いることができる。これは、遺伝子のセンス鎖および非センス鎖の両方に相当する、通常は長さ40〜120bpの一連の重複オリゴヌクレオチドを用いて行われる。続いて、これらのDNA断片のアニーリング、連結およびクローニングを行う。
【００７４】
本発明のBIKポリペプチドをコードする遺伝子を、発現のために哺乳動物細胞への形質転換導入を行う前に、中間ベクター中にクローニングすることができる。これらの中間ベクターは原核生物ベクターまたはシャトルベクターであることが一般的である。タンパク質は、当業者に周知の標準的な方法を用いて原核生物に発現させることもでき、または以下に述べるように真核生物において発現させることもできる。
【００７５】
III．本発明のタンパク質の精製
天然型および組換え型のBIKはいずれも、機能アッセイ法に用いるために精製することができる。天然型BIKポリペプチドは、例えば、膵細胞などのほ乳類（例えば、ヒト）の組織、またはBIKオルソログの任意の他の源から精製することができる。組換えBIKは、任意の適した発現系から精製しうる。
【００７６】
硫酸アンモニウムなどの物質による選択的沈殿、カラムクロマトグラフィー、免疫精製法などを含む標準的な技術により、BIKを実質的に純粋になるまで精製することもできる（例えば、Scopes, 「Protein Purification: Principles and Practice」(1982)；米国特許第4,673,641号；Ausubelら、前記；およびSambrookら、前記を参照）。
【００７７】
組換えBIKを精製する場合にはさまざまな方法を用いうる。例えば、分子接着特性が立証されているタンパク質をBIKと可逆的に融合させることができる。適切なリガンドを用いて、BIKを精製カラムに選択的に吸着させ、次にそれをカラムから比較的純粋な形で遊離させることができる。続いて、酵素活性によって融合タンパク質を分離することができる。イムノアフィニティーカラムを用いてBIKを精製することも可能である。
【００７８】
A．組換え細菌からのタンパク質の精製
組換えタンパク質を形質転換細菌によって大量に発現させる場合に（通常はプロモーター誘導による、ただし発現は構成性でもよい）、タンパク質が不溶性凝集物を形成することがある。タンパク質封入体の精製に適したプロトコールがいくつかある。例えば、凝集タンパク質（本明細書では以後、封入体と称する）の精製には一般に、通常は約100〜150μg/mlリソソームおよび0.1％ノニデットP-40（非イオン性界面活性剤）を含む緩衝液中でのインキュベーションによる（ただし、これには限定されない）細菌細胞の破壊により、封入体の抽出、分離および/または精製が行われる。細胞浮遊液はPolytronグラインダー（Brinkman Instruments, Westbury, NY）を用いて破砕することができる。または、細胞を氷上で超音波処理することもできる。細菌を可溶化する代替的な方法は、Sambrookら、前記およびAusubelら、前記に記載されており、当業者には明らかであると考えられる。
【００７９】
細胞浮遊液を一般的には遠心し、封入体を含むペレットを、封入体を溶解させることはないが洗浄は行える緩衝液、例えば、20mM Tris-HCl（pH 7.2）、1mM EDTA、150mM NaClおよび2％Triton-X 100（非イオン性界面活性剤）中に再懸濁する。できるだけ多くの壊死細胞片を除去するために、洗浄の段階を繰り返すことが必要なこともある。封入体の残りのペレットを、適切な緩衝液（例えば、20mMリン酸ナトリウム、pH 6.8、150mM NaCl）中に再懸濁してもよい。その他の適切な緩衝液は当業者に明らかであると考えられる。
【００８０】
洗浄段階の後に、強力な水素受容体であり、かつ強力な水素供与体でもある溶媒（またはこれらの特性の一方をそれぞれが有する溶媒の組み合わせ）の添加によって封入体を可溶化する。続いて、封入体を形成したタンパク質を、適合性のある緩衝液による希釈または透析によって再生させることができる。適した溶媒には、尿素（約4M〜約8M）、ホルムアミド（容積/容積比で少なくとも約80％）および塩酸グアニジン（約4M〜約8M）が含まれる。凝集体形成性タンパク質を可溶化しうるいくつかの溶媒、例えばSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）および70％ギ酸は、タンパク質が非可逆的に変性し、免疫原性および/または活性がなくなる恐れがあるため、この手順に用いるには適していない。塩酸グアニジンおよび類似の薬剤は変性剤であるが、この変性は非可逆的ではなく、変性剤を除去（例えば、透析による）または希釈すると再生が起こり、目的の免疫学的および/または生物学的に活性のあるタンパク質が再構成される。可溶化の後には、標準的な分離法により、タンパク質を他の細菌タンパク質から分離することができる。
【００８１】
または、ポリペプチドを細菌の周辺質から精製することも可能である。タンパク質が細菌の周辺質に輸出された時点で、細菌の周辺質画分を低温浸透圧ショック、さらには当技術分野で知られた他の方法によって単離することができる（Ausubelら、前記を参照）。周辺質から組換えタンパク質を単離するためには、細菌細胞に遠心処理を行ってペレット化する。このペレットを20％スクロースを含む緩衝液中に再懸濁する。細胞を可溶化するためには、細菌を遠心し、氷冷した5mM MgSO4中にペレットを再懸濁して、氷浴中に約10分間おく。この細胞浮遊液を遠心し、上清をデカントして回収する。上清中に存在する組換えタンパク質は、当業者に知られた標準的な分離法によって宿主タンパク質から分離することができる。
【００８２】
B．昆虫細胞からのタンパク質の精製
タンパク質を、例えばFernandezおよびHoeffler、「Gene Expression Systems」(1999)に記載されたような真核生物遺伝子発現系から精製することもできる。いくつかの態様において、バキュロウイルス発現系は本発明のBIKタンパク質またはその他のタンパク質を単離するために用いられる。組換えバキュロウイルスは一般に、バキュロウイルスのポリへドロンコード配列を、発現させようとする遺伝子（例えば、BIKポリヌクレオチド）で置き換えることによって作製される。ポリへドロン遺伝子を欠くウイルスは特有のプラーク形態を有しているため、認識が容易である。いくつかの態様において、組換えバキュロウイルスは目的のポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドがポリへドロンプロモーターと機能的に結合するように、導入ベクター（例えば、pUCをベースとするベクター）中にまずクローニングすることによって作製される。導入ベクターを野生型DNAとともに昆虫細胞（例えば、Sf9細胞、Sf21細胞またはBT1-TN-5B1-4細胞）にトランスフェクトして、野生型ウイルスDNA中のポリへドロン遺伝子と目的のポリヌクレオチドとの相同組換えおよび置換を生じさせる。続いてウイルスを生じさせ、プラークを精製することができる。昆虫細胞のウイルス感染によってタンパク質発現が起こる。発現されたタンパク質は、分泌される場合には細胞上清から収集でき、細胞内にある場合には細胞可溶化物から収集できる。例えば、Ausubelら、およびFernandezおよびHoeffler、前記を参照されたい。
【００８３】
C．タンパク質を精製するための標準的なタンパク質分離法
1．溶解性による分別
しばしば最初の工程として、さらにタンパク質混合物が複合体である場合には、最初に塩分別を行うことにより、不要な宿主細胞タンパク質（または細胞培養液に由来するタンパク質）の多くを目的の組換えタンパク質から分離することができる。好ましい塩は、例えば硫酸アンモニウムでありうる。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を効果的に減らすことによってタンパク質を沈殿させる。そこでタンパク質は溶解性の点から沈殿する。タンパク質の疎水性が高いほど、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する可能性が高い。典型的なプロトコールでは、タンパク質溶液に硫酸アンモニウム飽和溶液を添加し、その結果、硫酸アンモニウム濃度が20〜30％となるようにする。これによって最も疎水性の高いタンパク質が沈殿すると考えられる。次に沈殿物を廃棄し（目的のタンパク質が疎水性でない場合）、硫酸アンモニウムを上清に添加し、目的のタンパク質が沈殿することが知られた濃度にする。続いて、沈殿物を緩衝液に溶解し、必要であれば過剰な塩を透析または透析濾過によって除去する。低温エタノール沈殿法などの、タンパク質の溶解性に依拠するその他の方法も当業者に知られており、複合タンパク質混合物の分別に用いることができる。
【００８４】
2．サイズの差に基づく濾過
算出された分子量に基づき、種々の孔径の膜（例えば、Amicon社またはMillipore社の膜）を通過させる限外濾過を用いて、それよりもサイズが大きいまたは小さいタンパク質を単離することができる。第1の工程として、分子量カットオフ値が目的のタンパク質の分子量よりも低い孔径の膜を通してタンパク質混合物の限外濾過を行う。続いて、限外濾過後の保持物質に、分子量カットオフ値が目的のタンパク質の分子量よりも高い膜に対する限外濾過を行う。組換えタンパク質はこの膜を通過して濾液に入ると考えられる。続いて、以下に述べるように濾液のクロマトグラフィーを行うことができる。
【００８５】
3．カラムクロマトグラフィー
目的のタンパク質を、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性および異種分子に対する親和性に基づいて他のタンパク質から分離することもできる。さらに、タンパク質に対して産生された抗体をカラム基質に結合させて、タンパク質の免疫精製を行うこともできる。これらの方法はすべて当技術分野で周知である。
【００８６】
赤血球凝集素（HA）、FLAG、Xpress、Myc、ヘキサヒスチジン（His）、およびグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）などのような様々なアフィニティータグに対して産生された抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーは、ポリペプチドを精製するために用いることができる。Hisタグもある金属（例えば、Ni）のキレート剤として作用し、従って、その金属もHis含有ポリペプチドを精製するために用いることができる。精製後、タグは任意で、特異的なタンパク質分解酵素により除去される。
【００８７】
クロマトグラフィー法を任意の規模で、しかもさまざまな製造者（例えば、Pharmacia Biotech）による装置を用いて行えることは、当業者には明らかであると考えられる。
【００８８】
IV．本発明のポリヌクレオチドの検出
当業者は、BIKポリヌクレオチドの発現の検出には多くの用途があることを認識すると考えられる。例えば、本明細書で考察するように、患者におけるBIK対立遺伝子またはBIKレベルの検出は、糖尿病を、または糖尿病の病的な影響の少なくともいくつかに対する素因を診断するために有用である。さらに、遺伝子発現の検出がBIK発現の修飾物質を同定するのに有用である。
【００８９】
核酸ハイブリダイゼーション法を用いた特定のDNAおよびRNAのさまざまな測定方法が当業者に知られている（Sambrook、前記を参照）。いくつかの方法は電気泳動分離を用いるが（例えば、DNAの検出のためのサザンブロット法、およびRNAの検出のためのノーザンブロット法）、DNAおよびRNAの測定を電気泳動分離を用いずに行うこともできる（例えば、ドットブロットによる）。ゲノムDNA（例えば、ヒトからのもの）のサザンブロット法は、本発明のBIKポリペプチドに影響を及ぼす遺伝的障害の存在を検出するための制限断片長多型（RFLP）に関するスクリーニングに用いることができる。
【００９０】
核酸ハイブリダイゼーションの形式の選択は特に重要ではない。さまざまな核酸ハイブリダイゼーション形式が当業者に知られている。例えば、一般的な形式にはサンドイッチアッセイ法および競合アッセイ法または置換（displacement）アッセイ法が含まれる。ハイブリダイゼーション法の概論は、HamesおよびHiggins、「Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach」、IRL Press (1985)；GallおよびPardue、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 63: 378-383 (1969)；ならびにJohnら、Nature, 223: 582-587 (1969)に記載されている。
【００９１】
ハイブリダイゼーション複合体の検出には、シグナルを生成する複合体が、標的とプローブポリヌクレオチドまたは核酸との二重鎖と結合する必要があると思われる。一般に、この種の結合は、リガンド結合プローブとシグナルが結合したアンチリガンド（anti-ligand）との間のような、リガンドとアンチリガンドとの相互作用によって生じる。シグナル生成複合体の結合は、超音波エネルギーに対する曝露による促進にも容易に適用しうる。
【００９２】
標識により、ハイブリダイゼーション複合体の間接的な検出も可能となる。例えば、標識がハプテンまたは抗原である場合には、抗体を用いることによって試料を検出しうる。これらの系において、シグナルは、蛍光分子もしくは酵素分子が抗体と結合することにより、または場合によっては放射性標識との結合によって生成される（例えば、Tijssen, 「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays」、「Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology」、Burdonおよびvan Knippenberg編、Elsevier (1985)、pp. 9-20を参照）。
【００９３】
プローブは一般に、同位体、発色団、発光団（lumiphore）、色素体の場合のように直接標識されるか、後にストレプトアビジン複合体が結合するビオチンの場合のように間接的に標識される。このため、本発明のアッセイ法に用いられる検出可能な標識は、一次標識（標識が直接検出可能な因子を含むか、直接検出可能な因子を生成する場合）でも二次標識（免疫学的標識において一般的なように、検出される標識が一次標識と結合する場合）でもよい。一般に、標識されたシグナル核酸がハイブリダイゼーションの検出に用いられる。相補的核酸またはシグナル核酸は、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの存在の検出に通常用いられるいくつかの方法の任意の1つによって標識しうる。最も一般的な検出方法は、３H、125I、35S、14Cまたは32Pで標識したプローブなどを用いるオートラジオグラフィーの使用である。
【００９４】
他の標識には、例えば、標識された抗体と結合するリガンド、蛍光団、化学発光物質、酵素、および、標識されたリガンドに対する特異的な結合対のメンバーとして作用する抗体が含まれる。標識、標識手順および標識の検出に関する手引きは、PolakおよびVan Noorden、「Introduction to Immunocytochemistry」第2版、Springer Verlag、NY (1997)；ならびにMolecular Probes, Inc.によって刊行された総合的なハンドブックおよびカタログであるHaugland「Handbook of Fluoroscent Probes and Research Chemicals」(1996)に記載されている。
【００９５】
一般には、検出用試薬の標識の検出には、特定のプローブまたはプローブの組み合わせを観測する検出器を用いる。典型的な検出器は、分光光度計、光電管および光ダイオード、顕微鏡、シンチレーションカウンター、カメラ、フィルムなど、さらにはそれらの組み合わせを含む。適した検出器の例は、当業者に知られたさまざまな販売元から広く入手可能である。一般的には、結合した標識部分（labeling moiety）を含む基質の光学画像を以後のコンピュータ解析のためにデジタル化する。
【００９６】
最も一般的には、例えばBIK RNAの量は、検出試薬の結合によって固体支持体に固定された標識の量を定量することによって測定される。一般に、インキュベーション中に修飾物質が存在することにより、固体支持体と結合した標識の量は、修飾物質を含まない対照インキュベーションと比べて、または個々の反応の種類に対して確立されたベースラインと比べて、増加または減少すると考えられる。標識の検出および定量のための手段は当業者に周知である。
【００９７】
いくつかの態様においては、標的核酸またはプローブを固体支持体に対して固定化する。本発明のアッセイ法に用いるのに適した固体支持体は当業者に周知である。本明細書で用いる場合、固体支持体とは、実質的に固定された配置にある材料のマトリックスのことである。
【００９８】
さまざまな自動化固相アッセイ法も適している。例えば、Affymetrix, Inc.（Santa Clara, CA）から入手しうる超大規模固定化ポリマーアレイ（VLSIPS（商標））すなわち、ジーンチップまたはマイクロアレイを、同一の調節経路に関与する複数の遺伝子の発現レベルの変化を同時に検出するために用いることができる。Tijssen、前記.、Fodorら (1991) Science, 251: 767-777；Sheldonら (1993) Clinical Chemistry 39(4) : 718-719およびKozalら (1996) Nature Medicine 2(7): 753-759を参照されたい。同様に、スポットされたcDNAアレイ（ナイロン、ガラス、または他の固体支持体に結合するcDNA配列アレイ）もまた、多数の遺伝子の発現をモニターするために用いることができる。
【００９９】
通常、アレイの構成要素は、各構成要素が基板上の指定された位置に存在するような秩序立った様式で構成されている。アレイの構成要素は基板上の指定された位置にあるため、ハイブリダイゼーションのパターンおよび強度（この両者によって一意的な発現プロファイルが生成される）を特定の遺伝子の発現レベルに関して解釈ことができ、特定の疾患もしくは状態または治療と関連づけることができる。例えば、Schenaら、Science 270: 467-470 (1995)および（Lockhartら、Nature Biotech. 14: 1675-1680 (1996)）を参照されたい。
【０１００】
ハイブリダイゼーションの特異性は、特異性-対照ポリヌクレオチド配列と、試料に既知の量を添加した特異性-対照ポリヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを比較することによって評価しうる。特異性-対照標的ポリヌクレオチドには、対応するポリヌクレオチド配列に比して1つまたは複数の配列ミスマッチがあってもよい。この方式により、相補的な標的ポリヌクレオチドのみがポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするか、それともミスマッチのあるハイブリッド二重鎖が形成されるかが判定される。
【０１０１】
ハイブリダイゼーション反応は、絶対的または示差的なハイブリダイゼーション形式で行うことができる。絶対的なハイブリダイゼーション形式では、1つの試料由来のポリヌクレオチドプローブをマイクロアレイ形式にある配列とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体の形成後に検出された信号を試料中のポリヌクレオチドプローブのレベルと相関づける。示差的なハイブリダイゼーション形式では、2つの生物試料における遺伝子セットの発現の差異を分析する。示差的ハイブリダイゼーションのためには、両方の生物試料からポリヌクレオチドプローブを調製し、異なる標識部分（labeling moiety）を用いて標識する。2種類の標識ポリヌクレオチドプローブの混合物をマイクロアレイに添加する。続いてマイクロアレイを、2種類の異なる標識からの発光を個別に検出しうる条件下で検査する。両方の生物試料に由来する実質的に同数のポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせたマイクロアレイ中の配列は、異なる複合蛍光を発する（Shalonら、国際公開公報第95／35505号）。いくつかの態様において、標識は識別可能な発光スペクトルを有する蛍光性標識、例えばCy3およびCy5蛍光団である。
【０１０２】
ハイブリダイゼーション後に、ハイブリダイズしなかった核酸を除去するためにマイクロアレイを洗浄し、ハイブリダイズしうるアレイ構成要素とポリヌクレオチドプローブとの複合体形成を検出する。複合体形成の検出のための方法は当業者に周知である。いくつかの態様においては、ポリヌクレオチドプローブを蛍光性標識で標識し、複合体形成を示す蛍光のレベルおよびパターンの測定は、共焦点蛍光顕微鏡などの蛍光顕微鏡によって行われる。
【０１０３】
示差的ハイブリダイゼーション実験では、2種類またはそれ以上の異なる生物試料からのポリヌクレオチドプローブを、発光波長の異なる2種類またはそれ以上の異なる蛍光性標識によって標識する。蛍光シグナルは、特定の波長を検出するように設定した異なる光電子倍増管を用いて検出する。2つまたはそれ以上の試料におけるポリヌクレオチドプローブの相対量／発現レベルを求める。
【０１０４】
通常、複数のマイクロアレイを同様の試験条件下で用いる場合には、ハイブリダイゼーション強度のばらつきを考慮に入れるためにマイクロアレイの蛍光強度を標準化することができる。いくつかの態様において、個々のポリヌクレオチドプローブ／標的複合体のハイブリダイゼーション強度は、各マイクロアレイ上に含まれる内部標準化対照から得られた強度を用いて標準化される。
【０１０５】
核酸の検出は例えば、二重鎖核酸と特異的に結合する標識された検出用部分（例えば、RNA-DNA二重鎖に対して特異的な抗体）を用いて行いうる。1つの例では、抗体が酵素と結合した、DNA-RNAヘテロ二重鎖を認識する抗体を用いる（通常、組換えまたは共有化学結合による）。抗体は、酵素がその基質と反応して検出可能な生成物が生じた場合に検出される。Coutleeら(1989) Analytical Biochemistry 181: 153-162；Bogulavski (1986)ら、J. Immunol. Methods 89: 123-130；Prooijen-Knegt (1982) Exp. Cell Res. 141：397-407；Rudkin (1976) Nature 265: 472-473、Stollar (1970) PNAS 65: 993-1000；Ballard (1982) Mol. Immunol. 19: 793-799；PisetskyおよびCaster (1982) Mol. Immunol. 19：645-650；Viscidiら(1988) J Clin. Microbial. 41: 199-209；ならびにKineyら(1989) J. Clin. Microbiol. 27: 6-12は、ホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖を含むRNA二重鎖に対する抗体を記載している。DNA：RNAハイブリッドに対して特異的な抗体を含むキットは、例えば、Digene Diagnostics, Inc.（Beltsville, MD）から入手可能である。
【０１０６】
入手可能な抗体に加えて、当業者は、核酸二重鎖に対して特異的な抗体を既存の技術を用いて容易に作製することができ、または商業的もしくは公的に入手可能な抗体を改変することもできる。以上に言及した技術に加えて、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法が当業者に知られている（例えば、Paul（編）、「Fundamental Immunology, Third Edition」Raven Press, Ltd., NY (1993)；Coligan, 「Current Protocols in Immunology」、Wiley/Greene, NY (1991)；HarlowおよびLane、「Antibodies: A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Press, NY (1989)；Stitesら（編）「Basic and Clinical Immunology」（第4版）Lange Medical Publications, Los Altos, CAおよびそこに引用された参考文献；Goding、「Monoclonal Antibodies: Principles and Practice」（第2版）Academic Press, New York, NY, (1986)；ならびにKohlerおよびMilstein、Nature 256: 495-497 (1975)を参照されたい）。抗体調製のために適した他の技術には、ファージベクターまたは類似のベクターにおける組換え抗体ライブラリーの選択が含まれる（例えば、Huseら、Science 246: 1275-1281 (1989)；およびWardら、Nature 341: 544-546 (1989)を参照）。特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびに抗血清は、通常、少なくとも約0.1μMのKＤ、好ましくは少なくとも約0.01μMまたはそれ未満、最も一般的かつ好ましくは0.001μMまたはそれ未満のKＤで結合すると考えられる。
【０１０７】
本発明に用いられる核酸は、陽性プローブでも陰性プローブでもよい。陽性プローブはその標的と結合し、二重鎖形成の存在が標的の存在の証拠となる。陰性プローブは疑われる標的とは結合せず、二重鎖形成が存在しないことが標的の存在の証拠となる。例えば、野生型特異的な核酸プローブまたはPCRプライマーの使用は、目的のヌクレオチド配列のみが存在する場合、アッセイ試料における陰性プローブとして役立ちうる。
【０１０８】
ハイブリダイゼーションアッセイ法の感度を、検出しようとする標的核酸を増加させる核酸増幅システムを用いることによって高めることもできる。このようなシステムの例には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）システムおよびリガーゼ連鎖反応（LCR）システムが含まれる。当技術分野で最近記載されているその他の方法には、核酸配列に基づく増幅（NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario）およびQ Betaレプリカーゼシステムがある。これらのシステムは、選択した配列が存在する場合にのみPCRプライマーまたはLCRプライマーが伸長または連結するように設計されている場合、変異体を直接同定するために用いうる。または、選択した配列を、例えば非特異的なPCRプライマーを用いて全体的に増幅し、増幅された標的領域をその後、変異の指標となる特定の配列に対して検索することもできる。Taqmanおよび分子ビーコンプローブを含む様々な検出プローブを増幅反応産物を、例えば即時にモニターするために用いることができることが理解される。
【０１０９】
本発明の核酸の発現レベルを決定するための代替的な手段の一つは、インサイチューハイブリダイゼーションである。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイ法はよく知られており、Angererら、Methods Enzymol. 152: 649-660 (1987)に概論が記載されている。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイ法では、細胞、好ましくは小脳または海馬由来のヒト細胞を固体支持体、一般的にはスライドグラスに対して固定する。DNAを検索しようとする場合には、細胞を熱またはアルカリによって変性させる。続いて細胞を、標識された特異的プローブのアニーリングを可能にする中程度の温度のハイブリダイゼーション溶液と接触させる。プローブは放射性同位体または蛍光レポーターによって標識することが好ましい。
【０１１０】
一塩基多型（SNP）解析も、BIK遺伝子の対立遺伝子（例えば、配列番号：1および9をコードするポリヌクレオチド）間の違いを検出するために有用である。BIKと関連のあるSNPは、患者におけるBIK関連疾患（例えば、糖尿病）の診断に有用である。SNP解析は、BIKまたは他の糖尿病関連標的を対象とする医薬品の有効性を予測するにも有用である。例えば、ある個体が糖尿病と関連のあるBIK関連SNPの少なくとも1つの対立遺伝子を有していれば、その個体は糖尿病に対する素因を持つ可能性が高い。個体が疾患関連BIK SNPに関してホモ接合性であれば、その個体の糖尿病に対する素因は特に大きい。
【０１１１】
Taqmanまたは分子ビーコンを用いるアッセイ法（例えば、米国特許第5,210,015号；同第5,487,972号；Tyagiら、Nature Biotechnology 14: 303 (1996)；および国際公開公報第95／13399号）などを含むさまざまなリアルタイムPCR法は、SNPの有無を観測するために有用である。そのほかのSNP検出法には、例えば、DNAシークエンシング、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング、ドットブロット法、オリゴヌクレオチドアレイ（DNAチップ）ハイブリダイゼーション分析が含まれ、または例えば、米国特許第6,177,249号；Landegrenら、Genome Research, 8: 769-776 (1998)；Botsteinら、Am J Human Genetics 32: 314-331 (1980)；Meyersら、Methods in Enzymology 155: 501-527 (1987)；Keenら、Trends in Genetics 7: 5 (1991)；Myersら、Science 230: 1242-1246 (1985)；およびKwokら、Genomics 23: 138144 (1994)に記載されている。
【０１１２】
V．BIKの免疫学的検出
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いたBIK遺伝子および遺伝子発現の検出のほかに、イムノアッセイ法を用いてBIKポリペプチド、リガンドまたはBIKに結合するもしくはBIK活性を調節する他の分子を検出することも可能である。イムノアッセイ法を用いて、BIKを定性的または定量的に分析することができる。適用可能な技術に関する一般的な概要は、HarlowおよびLane、「Antibodies: A Laboratory Manual」(1988)に記載がある。
【０１１３】
A．標的タンパク質または他の免疫原に対する抗体
目的のタンパク質または他の免疫原と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製のための方法は当業者に知られている（例えば、Coligan、前記；HarlowおよびLane、前記；Stitesら、前記およびそれに引用された参考文献；Goding、前記；ならびにKohlerおよびMilstein、Nature, 256: 495-497 (1975)を参照されたい）。このような技術には、ファージベクターまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体の調製が含まれる（例えば、Huseら、前記；およびWardら、前記を参照のこと）。例えば、イムノアッセイ法に用いるための抗血清を作製するためには、本明細書の記載のように、目的のタンパク質またはその抗原性断片を単離する。例えば、組換えタンパク質を形質転換細胞系において産生させる。マウスまたはウサギの近交系に対して、フロイントアジュバントなどの標準的アジュバントおよび標準的な免疫処置プロトコールを用いてタンパク質の免疫処置を行う。または、本明細書に開示するBIK配列に由来する合成ペプチドは、担体タンパク質と結合させ、かつ免疫原として用いられる。
【０１１４】
ポリクローナル血清を収集し、イムノアッセイ法、例えば、固体支持体上に固定した免疫原を用いる固相イムノアッセイ法において、免疫原に対する力価測定を行う。力価が10４またはそれ以上であるポリクローナル抗血清を選択し、競合結合イムノアッセイ法を用いて、非BIKタンパク質、または場合によっては他の相同タンパク質との交差反応性を調べる。特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は通常、少なくとも約0.1mMのKＤ、より一般的には少なくとも約1μM、好ましくは少なくとも約0.1μMまたはそれ未満、最も好ましくは0.01μMまたはそれ未満のKＤで結合すると考えられる。
【０１１５】
免疫原を含む本発明の多くのタンパク質を、目的のタンパク質と特異的または選択的に反応する抗体の作製に用いることができる。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の作製のために好ましい免疫原である。天然のタンパク質を純粋または不純な状態で用いてもよい。本明細書に記載したタンパク質配列を用いて作製した合成ペプチドを、そのタンパク質に対する抗体の作製のための免疫原として用いることもできる。組換えタンパク質を真核細胞または原核細胞において発現させ、上に一般的に述べた通りに精製することができる。続いて、抗体を産生しうる動物の体内にその生成物を注入する。タンパク質を測定するためのイムノアッセイ法に後で用いるために、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれを作製してもよい。
【０１１６】
ポリクローナル抗体の作製方法は当業者に周知である。簡潔に述べると、免疫原、好ましくは精製タンパク質をアジュバントと混合した上で、動物に免疫処置を行う。検査採血を行い、目的のBIKに対する反応性の力価を測定することにより、免疫原調製物に対する動物の免疫応答を観測する。免疫原に対して適切な高い力価を持つ抗体が得られた時点で、動物から血液を採取し、抗血清を調製する。必要に応じて、タンパク質に反応する抗体を濃縮するために抗血清をさらに分画することもできる（HarlowおよびLane、前記を参照）。
【０１１７】
モノクローナル抗体は、当業者によく知られた種々の技術によって入手しうる。通常は、望ましい抗原による免疫処置を受けた動物から得た脾細胞を、一般的には骨髄腫細胞との融合によって不死化させる（KohlerおよびMilstein、Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976)を参照）。代替的な不死化の方法には、エプスタイン-バーウイルス、癌遺伝子もしくはレトロウイルスによる形質転換、または当技術分野で周知の他の方法が含まれる。単一の不死化細胞から生じたクローンを抗原に対する望ましい特異性および親和性に関してスクリーニングし、このような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物宿主の腹腔内への注射を含む種々の技術によって高めることもできる。または、Huseら、Science 246: 1275-1281 (1989)に概要が示された一般的なプロトコールに従ってヒトB細胞由来のDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体またはその結合性断片をコードするDNA配列を単離することもできる。
【０１１８】
標的免疫原に特異的な抗体がひとたび得られれば、臨床医が利用しうる定性的および定量的な結果が得られる種々のイムノアッセイ法によってその免疫原を測定することができる。免疫学的手順およびイムノアッセイ手順の概説については、Stites、前記を参照されたい。さらに、本発明のイムノアッセイ法を、Maggio, 「Enzyme Immunoassay」、CRC Press, Boca Raton, Florida (1980)；Tijssen、前記；ならびにHarlowおよびLane、前記に詳細に概説がなされた複数の方式のうち任意の形式で行うこともできる。
【０１１９】
ヒト試料中の標的タンパク質を測定するためのイムノアッセイ法に、BIKまたはその断片に対して産生されたポリクローナル抗血清を用いてもよい。この抗血清は非BIKタンパク質に対する交差反応性が低くなるように選択し、イムノアッセイ法に用いる前にこの種の交差反応性を免疫吸着によって除去する。
【０１２０】
B．免疫学的結合アッセイ法
いくつかの態様において、目的のタンパク質は、よく知られたさまざまな免疫学的結合アッセイ法のうち任意のものを用いて検出および/または定量化される（例えば、米国特許第4,366,241号；第4,376,110号；第4,517,288号；および第4,837,168号を参照）。一般的なイムノアッセイ法の概説については、Asai,「Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology」、Academic Press, Inc. NY (1993)；Stites、前記を参照されたい。免疫学的結合アッセイ法（またはイムノアッセイ法）には一般に、分析物（この場合には、本発明のBIK、またはその抗原性部分配列）と特異的に結合し、しばしばそれを固定化する「捕捉剤（capture agent）」が用いられる。捕捉剤は分析物と特異的に結合する部分（moiety）である。好ましい態様において、捕捉剤は、例えば、本発明のBIKポリペプチドと特異的に結合する抗体である。抗体を、当業者に周知の数多くの手段および上記の手段のうち任意のものを用いて作製してもよい。
【０１２１】
イムノアッセイ法には、捕捉剤および分析物によって形成された複合体と特異的に結合し、それを標識する標識剤（labeling agent）もしばしば用いられる。標識剤はそれ自体が抗体/抗原複合体を含む部分の1つであってもよい。または、標識剤が、抗体/タンパク質複合体と特異的に結合する、別の抗体などの第3の部分であってもよい。
【０１２２】
好ましい態様において、標識剤は、標識を有する第2の抗体である。または、第2の抗体は標識を有しておらず、その代わりに、第2の抗体の由来となった種の抗体に対して特異的な標識された第3の抗体が結合していてもよい。第2の抗体は、酵素標識ストレプトアビジンなどの第3の標識分子が特異的に結合しうる、ビオチンなどの標識可能な部分によって修飾することができる。
【０１２３】
免疫グロブリン定常領域と特異的に結合しうるプロテインAまたはプロテインGなどの他のタンパク質を標識剤としても用いてもよい。これらのタンパク質は、連鎖球菌の細胞壁の通常の構成要素である。それらは、さまざまな種に由来する免疫グロブリン定常領域に対して強い非免疫原性反応性を示す（例えば、概論については、Kronvalら、J. Immunol. 111: 1401-1406 (1973)；およびAkerstromら、J. Immunol. 135: 2589-2542 (1985)を参照）。
【０１２４】
アッセイ全体を通じて、試薬の各々の組み合わせを用いた後には、インキュベーションおよび/または洗浄の工程が必要と思われる。インキュベーションの工程は、約5秒から数時間、好ましくは約5分から約24時間の範囲でさまざまでありうる。インキュベーション時間は、アッセイ形式、分析物、溶液の容積、濃度などに依存すると考えられる。通常、アッセイは室温で行うが、10℃〜40℃といった一定範囲の温度で行うこともできる。
【０１２５】
1．非競合アッセイ形式
組織試料から目的のタンパク質または分析物を検出するためのイムノアッセイ法は競合的でも非競合的でもよい。非競合イムノアッセイ法は、捕捉されたタンパク質または分析物の量を直接測定するアッセイ法である。例えば、1つの好ましい「サンドイッチ」アッセイ法では、捕捉剤（例えば、BIK抗体）を、それを固定化するための固体基質に対して直接結合させることができる。続いて、これらの固定化された抗体は、被験試料中に存在するBIKを捕捉する。このようにして固定化されたBIKに対して、次に、標識を有する第2の抗BIK抗体などの標識剤を結合させる。または、第2の抗体には標識がなく、その代わりに、第2の抗体の由来となった種の抗体に対して特異的な第3の抗体をそれと結合させてもよい。第2の抗体は、酵素標識ストレプトアビジンなどの第3の標識分子が特異的に結合しうる、ビオチンなどの標識可能な部分によって修飾することができる。
【０１２６】
2．競合アッセイ形式
競合アッセイ法では、試料中に存在するタンパク質または分析物によって特異的捕捉剤（例えば、BIKに対する抗体）から解離した（競合に敗れた）、添加した（外因性の）タンパク質または分析物（すなわち、目的のBIK）の量を測定することにより、試料中に存在するタンパク質または分析物の量を間接的に測定する。抗体と結合したBIKの量は、試料中に存在する免疫原の濃度と反比例する。1つの特に好ましい態様では、抗体を固体基質上に固定化する。分析物の量は、標識された分析対象分子を用意することによって検出しうる。標識に、例えば放射性標識のほかに、抗体などの検出試薬によって認識されうるペプチドまたはその他のタグ標識も含まれうることは、認識されている。
【０１２７】
競合結合形式のイムノアッセイ法を、交差反応性の決定に用いることもできる。例えば、本明細書に提供する配列によってコードされるタンパク質を、固体支持体上に固定化することができる。タンパク質をアッセイ系に添加し、固定化された抗原に対する抗血清の結合と競合する。上記のタンパク質が、固定化されたタンパク質に対する抗血清の結合と競合する能力を、本明細書に提供するいずれかの配列によってコードされるタンパク質のものと比較する。上記のタンパク質に関する交差反応性の比率を、標準的な計算を用いて算出する。上に挙げた添加したタンパク質のそれぞれとの交差反応性が10％未満であるような抗血清を選択してプールする。交差反応性のある抗体は、選択的には、例えば近縁性の低いホモログといった考慮されたタンパク質による免疫吸着により、プールした抗血清から除去される。
【０１２８】
免疫吸着がなされてプールされた抗血清は次に、おそらく本発明のタンパク質であると考えられる第2のタンパク質を、免疫原タンパク質と比較するために、上記の競合結合イムノアッセイ法に用いられる。この比較を行うためには、この2つのタンパク質を広範囲の濃度にわたって互いにアッセイし、抗血清と固定されたタンパク質との結合の50％を抑制するのに必要な各タンパク質の量を決定する。必要な第2のタンパク質の量が、必要な本明細書の蛋白質によって部分的にコードされるタンパク質の量の10分の1未満であれば、第2のタンパク質は標的タンパク質からなる免疫原に対して産生された抗体と特異的に結合するといわれる。
【０１２９】
3．その他のアッセイ形式
特に好ましい態様においては、ウエスタンブロット（イムノブロット）分析が、試料中の本発明のBIKの存在を検出および定量化するために用いられる。この技術は一般に、試料のタンパク質を分子量に基づいてゲル電気泳動によって分離し、分離されたタンパク質を適した固体支持体（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルターまたは誘導体化ナイロンフィルターなど）に移行させた上で、目的のタンパク質と特異的に結合する抗体とともに試料をインキュベートすることを含む。例えば、抗BIK抗体は、固体支持体上のBIKと特異的に結合する。これらの抗体を直接標識してもよく、または、目的のタンパク質と特異的に結合する標識抗体（例えば、標識したヒツジ抗マウス抗体）を用いて後に検出してもよい。
【０１３０】
その他のアッセイ形式には、特定の分子（例えば、抗体）と結合し、封入された試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを用いるリポソームイムノアッセイ法（LIA）が含まれる。続いて、放出された化学物質を標準的な技術に従って検出する（Monroeら、Amer. Clin. Prod. Rev. 5: 34-41 (1986)を参照）。
【０１３１】
4．標識
アッセイ法に用いる特定の標識または検出可能基は、アッセイ法に用いる抗体の特異的結合に大きな妨げとならない限り、本発明の特に重要な面ではない。検出可能基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質でありうる。このような検出可能な標識はイムノアッセイ法の分野では十分に開発されており、通常、このような方法に有用なほとんどすべての標識を本発明に適用することができる。すなわち、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電子的、工学的または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物である。本発明において有用な標識には、磁気ビーズ（例えば、Dynabeads（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３H、１２５I、３５S、１４Cまたは３２P）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびELISAに一般に用いられる他のもの）、およびコロイド金または着色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）などの比色定量用標識が含まれる。
【０１３２】
標識を、当技術分野で周知の方法に従って、アッセイ法の望ましい構成要素に直接的または間接的に結合させてもよい。以上に示した通り、非常にさまざまな標識を用いることができ、標識の選択は必要な感度、化合物との結合の容易さ、安定性の必要条件、用いうる装置、および廃棄への対応に依存する。
【０１３３】
非放射性標識はしばしば間接的な手段によって結合させる。酵素または蛍光団との結合などにより、分子をシグナル生成化合物と直接結合させることもできる。種々の酵素および蛍光化合物を本発明の方法に用いることができ、これらは当業者に周知である（用いうるさまざまな標識システムまたはシグナル生成システムの概説については、例えば、米国特許第4,391,904号を参照されたい）。
【０１３４】
標識の検出手段は当業者に周知である。すなわち、例えば、標識が放射性標識であれば、検出のための手段には、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーの場合の写真フィルムが含まれる。標識が蛍光標識であれば、適切な波長の光で蛍光色素を励起させ、その結果生じた蛍光を検出することによってそれを検出しうる。蛍光は、肉眼的に、写真フィルムにより、電荷結合素子（CCD）または光電子増倍管などの電子検出装置の使用によって検出しうる。同様に、酵素標識は、酵素に対する適切な基質を提供し、その結果得られた反応生成物を検出することにより検出することができる。さらに、単純な比色定量標識は、標識に伴う色を単に観察することによって検出しうる。すなわち、種々の試験紙アッセイ法において、結合した金はしばしば薄赤色に見え、一方、種々の結合ビーズはビーズの色に見える。
【０１３５】
いくつかのアッセイ形式には、標識成分を用いる必要がない。例えば、凝集アッセイ法を用いて標識抗体の存在を検出することができる。この場合には、標的抗体を含む試料により、抗原をコーティングした粒子を凝集させる。この形式では、どの成分も標識する必要はなく、単純な肉眼検査によって標的抗体の存在が検出される。
【０１３６】
VI．BIKの修飾物質の同定
BIKの修飾物質、すなわちBIK活性またはBIKポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの発現に対するアゴニストまたはアンタゴニストは、糖尿病を含むさまざまなヒト疾患の治療に有用である。BIK阻害物質の投与は、糖尿病の患者またはインスリン抵抗性のある個体の治療のために用いうる。または、BIKの活性化物質を、糖尿病の患者またはインスリン抵抗性のある個体の治療に用いることもできる。
【０１３７】
A．BIKを調節する作用物質
BIKの修飾物質としての試験を行う作用物質は、ポリペプチド、糖、核酸または脂質などの任意の低分子化合物または生物的実体でよい。一般に、被験化合物は低分子化合物およびペプチドであると考えられる。本質的にはあらゆる化合物を、本発明のアッセイ法における修飾物質またはリガンドの候補として用いることができるが、水性溶液または有機溶液（特にDMSOをベースとするもの）中に溶解しうる化合物を用いることが最も多い。アッセイ法は、アッセイ法の工程を自動化し、任意の好都合な源から化合物をアッセイ法に提供し、一般にはそれを平行して稼働させることにより（例えば、自動化アッセイ法でのマイクロタイタープレート上でのマイクロタイター形式による）、大規模化学ライブラリーをスクリーニングするように設計する。修飾物質には、BIK mRNAのレベルを低下させるように設計された作用物質（例えば、アンチセンス分子、リボザイム、DNAザイム（DNAzyme）、短鎖抑制性RNA（small inhibitory RNA）など）またはmRNAからの翻訳のレベルを低下させるように設計された作用物質（例えば、mRNA分子上の翻訳開始配列または他の配列に対して相補的なアンチセンス分子などの翻訳遮断物質）も含まれる。化合物の供給元が、Sigma社（St. Louis, MO）、Aldrich社（St. Louis, MO）、Sigma-Aldrich社（St. Louis, MO）、Fluka Chemika-Biochemica Analytika社（Buchs, Switzerland）などを含め、数多くあることは知られているであろう。
【０１３８】
いくつかの態様において、ハイスループットスクリーニング方法は、数多くの治療的化合物の候補（修飾性化合物の候補）を含むコンビナトリアル化学ライブラリーまたはペプチドリガンドライブラリーを提供することを含む。続いて、このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」または「リガンドライブラリー」を、望ましい特徴的な活性を示すライブラリーのメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定するために、本明細書に記載するような1つまたは複数のアッセイ法においてスクリーニングする。このようにして同定された化合物は、通常の「リード化合物」として役立ち、またはそれ自体を治療薬の候補もしくは実際の治療薬として用いることができる。
【０１３９】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、試薬などの化学的「構成単位（building block）」を数多く組み合わせることにより、化学合成または生物的合成によって生成された多様な化合物からなる集成物である。例えば、ポリペプチドライブラリーなどの直鎖状コンビナトリアル化学ライブラリーは、一群の構成化学単位（アミノ酸）を所定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）に関して考えられるすべてのやり方で組み合わせることによって生成される。構成化学単位のこのようなコンビナトリアル混合により、何百万もの化合物を合成することができる。
【０１４０】
コンビナトリアル化学ライブラリーの作製およびスクリーニングは当業者に周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーには、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第5,010,175号、Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493 (1991)およびHoughtonら、Nature 354: 84-88 (1991)を参照）が非制限的に含まれる。多様性のある化学物質ライブラリーを作製するためにその他の化学物質を用いることもできる。このような化学物質には、ぺプトイド（例えば、国際公開公報第91／19735号）、コード化ペプチド（例えば、国際公開公報第93／20242号）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、国際公開公報第92／00091号）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー（diversomer）（Hobbsら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993)）、ビニル性ポリペプチド（Hagiharaら、J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568 (1992)）、グルコーススカフォールディングを有する非ペプチド性ペプチド模倣物（Hirschmannら、J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992)）、低分子化合物ライブラリーの類似の有機合成（Chenら、J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)）、オリゴカルバメート（Choら、Science 261: 1303 (1993)）、および／またはペプチジルホスホネート（Campbellら、J. Org. Chem. 59: 658 (1994)）、核酸ライブラリー（Ausubel、BergerおよびSambrook、いずれも前記、を参照）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第5,539,083号を参照）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughnら、Nature Biotechnology, 14(3): 309-314 (1996)および国際特許出願番号PCT／US96／10287を参照）、炭水化物ライブラリー（例えば、Liangら、Science, 274: 1520-1522 (1996)および米国特許第5,593,853号を参照）、有機低分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum C&EN, Jan 18, p.33(1993)；イソプレノイド、米国特許第5,569,588号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号；ピロリジン、米国特許第5,525,735号および第5,519,134号；モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号；ベンゾジアゼピン、米国特許第5,288,514号などを参照）が非制限的に含まれる。
【０１４１】
コンビナトリアルライブラリーの作製用の装置は市販されている（例えば、357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MAを参照）。加えて、数多くのコンビナトリアルライブラリーがそれ自体、市販されている（例えば、ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MDなど）。
【０１４２】
B．BIKの修飾物質に関するスクリーニングの方法
細胞における、特に哺乳動物細胞、とりわけヒト細胞におけるBIKの発現または活性のレベルを変化させる作用物質を同定するためには、数多くの種類のスクリーニングプロトコールを利用することができる。一般的には、これらのスクリーニング方法は、BIKポリペプチドと結合すること、阻害物質もしくは活性化物質がBIKと結合するのを妨げること、阻害物質もしくは活性化物質とBIKとの会合を増加させること、またはBIKの発現を活性化もしくは阻害することなどによってBIKの活性を変化させる作用物質を同定するために、複数の作用物質をスクリーニングすることを含む。
【０１４３】
いくつかの態様では、あるBIKバリアントを調節するが第2のものは調節しない作用物質を同定するために、さまざまなBIKポリペプチド（例えば、配列番号：2および配列番号：9）のスクリーニングを平行して行う。例えば、配列番号：2に対する結合もしくは修飾は行うが配列番号：9に対しては行わない作用物質、またはその逆に作用する作用物質を同定するためのスクリーニングを設計することができる。
【０１４４】
1．BIK結合アッセイ法
BIKと結合しうる作用物質をスクリーニングすることにより、予備的なスクリーニングを行うことができるが、これはそのようにして同定された作用物質の少なくともいくつかはBIK修飾物質である可能性が高いためである。結合アッセイ法は、例えば、BIKと相互作用する内因性タンパク質を同定する目的にも有用である。例えば、BIKと結合する抗体、受容体またはその他の分子を、結合アッセイ法で同定することができる。
【０１４５】
結合アッセイ法は通常、BIKタンパク質を1つまたは複数の被験作用物質と接触させ、タンパク質および被験作用物質が結合複合体を形成するのに十分な時間をおくことを含む。形成された結合複合体は、確立されたさまざまな分析技術のうち任意のものを用いて検出することができる。タンパク質結合アッセイ法には、共沈、非変性SDS-ポリアクリルアミドゲル上での共移動、ウエスタンブロット上での共移動を測定する方法（例えば、Bennet, J.P.およびYamamura, H.I. (1985)「Neurotransmitter、Hormone or Drug Receptor Binding Methods」、「Neurotransmitter Receptor Binding」（Yamamura, H. I.ら編）中、pp. 61-89を参照）が非制限的に含まれる。他の結合アッセイ法には、BIKと結合した分子または標識基質の置換を同定するための質量分析法またはNMR法の使用が含まれる。この種のアッセイ法に用いるBIKタンパク質は、自然下で発現されるBIKでもクローニングされたものでも合成されたものでもよい。
【０１４６】
さらに、ほ乳類または酵母のツーハイブリッド法（例えば、Bartel, P. L.ら、Methods Enzymol, 254: 241 (1995)を参照）を、細胞内で一緒に発現された場合に相互作用または結合を行うポリペプチドまたはその他の分子を同定するために用いることもできる。
【０１４７】
2．発現アッセイ法
BIKの発現を調節する化合物のスクリーニングも提供される。スクリーニング法は、被験化合物がBIKを発現する1つまたは複数の細胞と接触させた後に、BIKの発現の増加または減少（転写物、翻訳産物のどちらか）を検出する細胞を用いたアッセイ法を行うことを含む。アッセイ法は、天然にBIKを発現する細胞を用いて、またはBIKを発現するように組み換え改変した細胞において行うことができる。。
【０１４８】
BIKの発現はさまざまなやり方で検出することができる。以下で述べるように、細胞内でのBIKの発現レベルは、BIKの転写物（またはそれに由来する相補的核酸）と特異的にハイブリダイズするプローブを用いて、細胞内で発現されるmRNAを検索することによって決定しうる。プローブ検索は、細胞を可溶化してノーザンブロット法を行うことによって、または細胞を可溶化せずにインサイチューハイブリダイゼーション法を用いることによって実施しうる。または、BIKと特異的に結合する抗体を用いて細胞可溶化物を検索する免疫学的な方法を用いて、BIKタンパク質を検出することもできる。
【０１４９】
別の細胞系アッセイ法に、標準的なレポーター遺伝子アッセイ法により細胞を用いて行われるレポーターアッセイ法が挙げられる。これらのアッセイ法は、BIKの発現を行う、またはBIKを発現しない、発現する細胞において行うことができる。これらのアッセイ法のある種のものは、検出可能な産物をコードするレポーター遺伝子と機能的に結合したBIKプロモーターを含む異種核酸構築物を用いて行われる。さまざまなレポーター遺伝子を利用しうる。いくつかのレポーターは内在性に検出可能である。この種のレポーターの一例は、蛍光検出器を用いて検出しうる蛍光を発する緑色蛍光タンパク質である。別のレポーターは検出可能な生成物を生じる。この種のレポーターはしばしば酵素である。酵素レポーターの例には、β-グルクロニダーゼ、CAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；AltonおよびVapnek (1979) Nature 282: 864-869）、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼ（Tohら (1980) Eur. J. Biochem. 182: 231-238；およびHallら (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2: 101）が非制限的に含まれる。
【０１５０】
これらのアッセイ法では、レポーター構築物を有する細胞を被験化合物と接触させる。プロモーター発現の変化は、検出可能なレポーターのレベルを検出することによって観測される。さまざまな種類のBIK修飾物質をこのアッセイ法で同定することができる。例えば、プロモーターをそれとの結合によって阻害する、転写因子もしくは他の調節因子との結合によってプロモーターを阻害する、そのプロモーターと結合する、またはプロモーターを阻害する分子を生成するカスケードを誘発する被験化合物を同定することができる。同様に、例えば、プロモーターをそれとの結合によって活性化する、転写因子もしくは他の調節因子との結合によってプロモーターを活性化する、そのプロモーターと結合する、またはプロモーターを活性化する分子を生成するカスケードを誘発する被験化合物を同定することもできる。
【０１５１】
発現または活性のレベルはベースライン値との比較が可能である。ベースライン値は、対照試料に関する値、または対照集団（例えば、2型糖尿病でない、またはそのリスクがない正常血糖個体）もしくは細胞（例えば、BIK修飾物質に曝露されない組織培養細胞）に関するBIK発現レベルを代表する統計値であってよい。陰性対照として、BIKを発現しない細胞に関する発現レベルを決定することもできる。この種の細胞は一般に、他の点では実質的に被験細胞と遺伝的に同一である。
【０１５２】
レポーターアッセイ法にはさまざまな異なる種類の細胞を用いうる。内因性BIKを発現する細胞は、例えば膵細胞である。BIKを内因的に発現しない細胞は原核細胞であっても、真核細胞であってもよい。真核細胞は、組換え核酸構築物を有する細胞の作製に通常用いられる細胞のうち任意のものでよい。例となる真核細胞には、酵母、ならびにHepG2、COS、CHOおよびHeLa細胞株などの種々の高等真核細胞が含まれる。アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞を用いることもできる。
【０１５３】
観測された活性に信頼性があることを確認するためには、レポーター構築物を含まない細胞を用いた同時並行反応を行うこと、またはレポーター構築物を有する細胞を被験化合物と接触させないことを含め、さまざまな対照をおくことができる。化合物を以下のようにさらにバリデートすることもできる。
【０１５４】
3．活性
BIKポリペプチド酵素活性の分析は、一般的な生化学的手順に従って行われる。この種のアッセイ法には、細胞系アッセイ法のほか、精製もしくは部分精製されたBIKポリペプチドまたは粗細胞可溶化物を用いるインビトロアッセイ法が含まれる。
【０１５５】
細胞または他の試料におけるBIK酵素活性のレベルを決定し、ベースライン値（例えば、対照値）と比較する。活性は試料からの粗抽出物または部分的もしくは本質的に精製されたBIKに基づいて測定することができる。BIK活性の測定は、例えば、Lesageら、Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 279：F793-F801 (2000)およびGiratdら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 282: 249-256 (2001)に記載されたように、陽イオンチャンネル活性を測定することを含む。例えば、イオン流の変化を、BIKポリペプチドを含むカリウムチャンネルを発現している細胞または膜の分極（すなわち、電位）の変化を定量することによって評価することもできる。いくつかの態様において、細胞の分極の変化は、電位固定法およびパッチクランプ法、例えば、「細胞密着（cell-attached）」モード、「インサイドアウト（inside-out）」モードおよび「ホールセル（whole cell）」モードなどにより（例えば、Ackermanら、New Engl. J. Med. 336: 1575-1595 (1997)を参照）、電流の変化を測定すること（それによって分極の変化測定すること）によって観測される。全細胞電流は、標準的な方法を用いて首尾良く定量することができる（例えば、Hamilら、PFlugers. Archiv. 391: 85 (1981)を参照）。その他の既知のアッセイ法には以下のものが含まれる：放射性標識ルビジウム流アッセイ法、および、電位感受性色素またはイオン感受性色素を用いる蛍光アッセイ法（例えば、Vestergarrd-Bogindら、J. Membrane Biol. 88: 67-75 (1988)；Danielら、J. Pharmacol. Meth. 25: 185-193 (1991)；Holevinskyら、J. Membrane Biology 137: 59-70 (1994)を参照）。BIKポリペプチドを含むチャンネルタンパク質を通過するカリウム流を抑制または増大させうる化合物に関するアッセイ法は、本発明のチャンネルを有する細胞と接しているとともにそれを含む浴液に対して化合物を適用することによって実施しうる（例えば、Blatzら、Nature 323: 718-720 (1986)；Park、J. Physiol. 481: 555-570 (1994)を参照）。一般に、試験が行われる化合物は1pM〜100mMの範囲で存在する。
【０１５６】
チャンネルの機能に対する被験化合物の影響は、電流もしくはイオン流の変化を測定することによって、または電流およびイオン流の変化に伴う結果によって測定することができる。電流またはイオン流の変化は、カリウムイオンまたはルビジウムイオンなどのイオンの流れの増加または減少によって測定される。イオンはさまざまな標準的な手法によって測定しうる。それをイオン濃度の変化、例えば、細胞内濃度の変化によって直接測定することもでき、または膜電位もしくはイオンの放射性標識によって間接的に測定することもできる。被験化合物がイオン流に及ぼす結果は極めて多岐にわたりうる。このため、任意の適した生理的変化を利用して、本発明のチャンネルに対する被験化合物の影響を評価することが可能である。被験化合物の影響は毒素結合アッセイ法によって測定することができる。機能的な結果を無傷の細胞または動物を用いて評価する場合には、伝達物質の放出、細胞内カルシウムの変化、ホルモン放出（例えば、インスリン）、既知および未解明の遺伝マーカーの両者に関する転写の変化（例えば、ノーザンブロット法）、細胞体積の変化（例えば、赤血球）、免疫応答（例えば、T細胞の活性化）、細胞増殖またはpH変化などの細胞代謝の変化、ならびに環状ヌクレオチドなどの細胞内二次メッセンジャーの変化といった、さまざまな影響を測定することもできる。
【０１５７】
4．バリデーション
前記のいずれかのスクリーニング方法によってまず同定された作用物質を、明らかな活性のバリデーションを行うためにさらに試験することができる。このような試験は、適した動物モデルを用いて行うことが好ましい。この種の方法の基本形式は、初期スクリーニングの際に同定されたリード化合物を、ヒトのモデルとして役立つ動物に投与し、その後に、BIKが実際に修飾作用を受けるか否かを判定することを含む。バリデーション試験に用いられる動物モデルは一般に、何らかの種類の哺乳動物である。適した動物の具体的な例には、霊長動物、マウスおよびラットが非制限的に含まれる。例えば、糖尿病の一遺伝子モデル（例えば、ob／obマウスおよびdb／dbマウス、ツッカーラット、ならびにツッカー糖尿病肥満ラットなど）または糖尿病の多遺伝子モデル（例えば、高脂肪食摂取マウスモデル）は、糖尿病動物におけるBIKの修飾をバリデートするのに有用な可能性がある。
【０１５８】
C．固相および溶質のハイスループットアッセイ法
本発明のハイスループットアッセイ法では、最大で数千種もの異なる修飾物質またはリガンドを1日でスクリーニングすることが可能である。詳細には、マイクロタイタープレートの各ウェルを、選択した修飾物質の候補に対して別々のアッセイ法を実行するために用い、または、濃度もしくはインキュベーション時間の影響を観察しようとする場合には、単一の修飾物質を試験するためにウェルを5〜10個ずつ用いることができる。このため、1枚の標準的なマイクロタイタープレートで、約100種（例えば、96種）の修飾物質をアッセイすることが可能である。1536穴のウェルプレートを用いれば、1枚のプレートで約100〜約1500種の異なる化合物をアッセイすることができる。1日当たり数枚の異なるプレートをアッセイできれば、本発明の統合システムを用いて最大で約6,000〜20,000種類またはそれ以上の異なる化合物をアッセイ法でスクリーニングすることが可能である。さらに、試薬操作のためのマイクロ流体（microfluidic）アプローチを用いることができる。
【０１５９】
目的の分子（例えばBIK）を、共有結合またはタグを介した結合などの非共有結合により、直接的または間接的に固体成分に結合させることができる。タグは種々の成分のうち任意のものでよい。一般的には、タグと結合する分子（タグ結合剤）を固体支持体に固定し、タグの付いた目的の分子（例えば、BIK）を、タグとタグ結合剤との相互作用によって固体支持体に結合させる。
【０１６０】
文献中に詳細に記載された既知の分子相互作用に基づき、さまざまなタグおよびタグ結合剤のうち任意のものを用いることができる。例えば、ビオチン、プロテインAまたはプロテインGのようにタグが天然の結合剤を有する場合には、それを適切なタグ結合剤（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、免疫グロブリンのFc領域、ポリ-Hisなど）との結合に用いることができる。ビオチンなどの天然の結合剤を備えた分子に対する抗体も広く入手可能であり、適切なタグ結合剤についても同様である；例えば、SIGMA Immunochemicals 1998年カタログ、SIGMA, St. Louis MOを参照されたい）。
【０１６１】
同様に、任意のハプテン性化合物または抗原性化合物を適切な抗体と組み合わせて用いて、タグ/タグ結合剤の対を形成させることもできる。数千種もの特異抗体が市販されており、ほかにも多くの抗体が文献中に記載されている。例えば、1つの一般的な構成において、タグは第1の抗体であり、タグ結合剤は第1の抗体を認識する第2の抗体である。抗体-抗原相互作用以外に、細胞膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニストなどの受容体-リガンド相互作用もタグおよびタグ結合剤の対として適している（例えば、トランスフェリン、c-kit、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体および抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリーなどの細胞受容体-リガンド相互作用；例えば、Pigott & power, 「Adhesion Molecule Facts Book 1」 (1993)を参照されたい）。同様に、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、オピエート、ステロイドなど）、細胞内受容体（例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンD；ペプチドを含む、種々の低分子リガンドの作用を媒介するもの）、薬剤、レクチン、糖、核酸（直鎖状重合体および環状重合体の両方の形態）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質および抗体は、いずれも種々の細胞受容体と相互作用しうる。
【０１６２】
ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリールスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミドおよびポリアセテートなどの合成重合体も適切なタグまたはタグ結合剤を形成しうる。その他の多くのタグ/タグ結合剤の対も本明細書に記載のアッセイ法に有用であり、これは本開示を吟味することによって当業者には明らかであると考えられる。
【０１６３】
ペプチド、ポリエーテルなどの一般的なリンカーもタグとして有用であり、これには約5-200アミノ酸のポリgly配列などのポリペプチド配列が含まれる。このような柔軟性のあるリンカーは当業者に周知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Sheanvater Polymers, Inc（Huntsville, Alabama）から販売されている。選択的には、これらのリンカーはアミド結合、スルフヒドリル結合またはヘテロ官能性結合を有する。
【０１６４】
タグ結合剤を、現在用いうる種々の方法のうち任意のものを用いて、固体基質に固定する。固体基質は一般に、タグ結合剤の一部と反応する化学基を表面に固定させる化学試薬に基質の全体または一部を曝露させることにより、誘導体化または官能性付与が行われる。例えば、比較的長い連鎖部分を付着させるのに適した基には、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基およびカルボキシル基が含まれると考えられる。ガラス表面などの種々の表面に官能性を付与するためには、アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランを用いることができる。このような固相バイオポリマーアレイの構築は文献に詳細に記載されている（例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963)（ペプチドなどの固相合成を記載している）；Geysenら、J. Immun. Meth. 102: 259-274 (1987)（ピン上での固相成分の合成を記載している）；FrankおよびDoring、Tetrahedron 44: 60316040 (1988)（セルロースディスク上での種々のペプチド配列の合成を記載している）；Fodorら、Science, 251: 767-777 (1991)；Sheldonら、Clinical Chemistiy 39(4):718-719 (1993)；ならびにKozalら、Nature Medicine 2(7): 753759 (1996)（いずれも固体基質に固定したバイオポリマーのアレイを記載している）を参照されたい。タグ結合剤を基質に固定する非化学的アプローチには、加熱、UV照射による架橋などの他の一般的な方法が含まれる。
【０１６５】
本発明は、BIKの発現または活性を変化させうる化合物をハイスループット形式で同定するためのインビトロアッセイ法を提供する。アッセイ系が高度に均一であるため、修飾物質の候補を含まない反応における細胞のBIK活性を測定する対照反応を随意に選択してもよい。このような随意選択的な対照反応は適切であり、アッセイ法の信頼性を高める。したがって、好ましい態様において、本発明の方法はこのような対照反応を含む。記載するアッセイ形式のそれぞれについて、修飾物質を含まない「修飾物質なしの」対照反応により、結合活性のバックグラウンドレベルが得られる。
【０１６６】
いくつかのアッセイ法においては、陽性対照を用いることが望ましいと考えられる。少なくとも2種類の陽性対照が適している。第1に、本発明のBIKの既知の活性化物質を1つのアッセイ試料とインキュベートすることができ、BIKの発現レベルまたは活性の上昇に起因する結果としての信号の増加を本明細書に記載の方法に従って決定する。第2に、BIKの既知の阻害物質を添加し、BIKの発現または活性に関する結果としての信号の低下を同様に検出することができる。通常であればBIKの既知の修飾物質の存在によって引き起こされる上昇または存在を阻害する修飾物質を見つけ出すために、修飾物質を活性化物質または阻害物質と組み合わせてもよいことは理解されると考えられる。
【０１６７】
D．コンピュータを用いるアッセイ法
BIKの活性を変化させる化合物に関するさらにもう1つのアッセイ法は、アミノ酸配列にコードされた構造情報に基づいてBIKの三次元構造を作成するためにコンピュータシステムを用いる、コンピュータ支援による薬物設計である。入力したアミノ酸配列がコンピュータプログラム内にあらかじめ設定したアルゴリズムと直接かつ能動的に相互作用して、タンパク質の二次、三次および四次構造モデルが生成される。続いて、リガンドとの、結合能を有する、そうでなければ調節される能力を有する構造領域（例えば、活性部位）を同定するためにタンパク質構造のモデルを検討する。同様の分析を、BIKの推定受容体またはBIK結合パートナーについて行うことができ、BIKの相互作用領域を同定するために用いることができる。次にこれらの領域を利用して、BIKと結合する化合物を同定する。
【０１６８】
ひとたび目的のタンパク質の3次構造が生成されれば、修飾物質候補をコンピュータシステムによって同定することができる。修飾物質候補の三次元構造は、化合物の化学式を入力することによって生成される。次に修飾物質候補の三次元構造をBIKのものと比較して、BIKの結合部位を同定する。エネルギー項を用いてタンパク質と修飾物質との間の結合親和性を決定し、どのリガンドがタンパク質と結合する確率が高いかを判定する。
【０１６９】
VII．組成物、キット、および統合システム
本発明は、本発明のBIKポリペプチドをコードする核酸、またはBIKタンパク質、抗BIK抗体などを用いて本明細書に記載したアッセイ法を実施するための組成物、キットおよび統合システムを提供する。
【０１７０】
本発明は、固相アッセイ法に用いるためのアッセイ組成物を提供する；このような組成物は、例えば、BIKをコードする1つまたは複数の核酸が固体支持体上に固定化されたもの、および標識試薬を含みうる。それぞれの場合に、アッセイ組成物は、ハイブリダイゼーションのために望ましい別の試薬も含みうる。本発明のBIKの発現または活性に対する修飾物質をアッセイ組成物に含めることもできる。
【０１７１】
本発明はまた、本発明のアッセイ法を行うためのキットも提供する。本キットは一般に、BIKと、またはBIKポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と特異的に結合する抗体、および作用物質の存在を検出するための標識を含む。本キットは本発明のBIKポリペプチドをコードするいくつかのポリヌクレオチド配列を含みうる。キットは上記の組成物のいずれかを含むことができ、選択的にはさらに、本発明のBIKポリペプチドをコードする遺伝子の発現に対する、または本発明のBIKポリペプチドの活性に対する影響に関してハイスループットアッセイ方法を行うための指示書といった別の構成要素、1つまたは複数の容器または区画（例えば、プローブ、標識などを保持するための）、BIKポリペプチドの発現または活性の対照修飾物質、キットの成分を混合するためのロボット型アーマチュアなども含む。
【０１７２】
本発明はまた、本発明のBIKポリペプチドの発現または活性に対する影響に関する、修飾物質の候補のハイスループットスクリーニングのための統合システムも提供する。本システムは一般に、液体を源から目的地まで移動させるためのロボット型アーマチュア、ロボット型アーマチュアを制御するための制御装置、標識検出器、標識検出を記録するデータ記憶装置、および、反応混合物を有するウェルを含むマイクロタイターディッシュ、または固定された核酸もしくは固定化部分を含む基質などのアッセイ成分を含む。
【０１７３】
さまざまなロボット型液体輸送システムが入手可能であり、または既存の構成部品を用いて容易に製造することもできる。例えば、Microlab 2200（Hamilton；Reno, NV）ピペット操作ステーション（pipetting station）を用いるZymate XP（Zymark Corporation；Hopkinton, MA）自動化ロボットを用いて、並列的な試料を96ウェルマイクロタイタープレートに移し、複数の同時並列的な結合アッセイ法を設定することができる。
【０１７４】
カメラまたはその他の記録装置（例えば、光ダイオードおよびデータ記憶装置）によって観測された（および、選択的には記録された）光学画像は、選択的にはさらに、本明細書における態様のいずれかにより、例えば、画像のデジタル化ならびにコンピュータ上での画像の記録および分析などによって処理される。PC（Intel x86またはPentiumチップ互換のDOS（登録商標）、OS2（登録商標）WINDOWS（登録商標）、WINDOWS NT（登録商標）、WINDOWS95（登録商標）、WINDOWS98（登録商標）、またはWINDOWS2000（登録商標）ベースのコンピュータ）、MACINTOSH（登録商標）またはUNIX（登録商標）ベースの（例えば、SUN（登録商標）ワークステーション）コンピュータなどを用いて、デジタル化されたビデオ画像またはデジタル化された光学画像のデジタル化、保存および分析を行うための、さまざまな市販の周辺機器およびソフトエアソフトウエアが入手可能である。
【０１７５】
従来のシステムの一つは、標本野からの光を、当技術分野で一般的に用いられる、冷却した電荷結合素子（CCD）カメラに伝える。CCDカメラは画像素子（ピクセル）のアレイを含んでいる。標本からの光はCCD上で画像化される。標本の領域（例えば、生体重合体のアレイ上の個々のハイブリダイゼーション部位）に対応する個別のピクセルがサンプリングされ、各位置に関して光強度の読み取り値が得られる。速度を高めるために多数のピクセルが並列的に処理される。本発明の装置および方法は、蛍光顕微鏡法または暗視野顕微鏡法などにより、任意の試料を観測するために容易に用いられる。
【０１７６】
VIII．投与および薬学的組成物
BIKの修飾物質（例えば、アンタゴニスト、またはアゴニスト）は、インビボでのBIK活性の修飾のために、哺乳動物対象に対して直接投与することができる。投与は、修飾性化合物を導入して、治療しようとする組織に最終的に接触させるために通常用いられる任意の経路によるもので、当技術分野において周知である。個々の化合物の投与には複数の経路を用いることができるが、ある特定の経路によって別の経路よりも即時的かつより効果的な反応が得られることがしばしばである。
【０１７７】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含みうる。薬学的に許容される担体は、一部には、投与する個々の組成物、さらには組成物の投与に用いる個々の方法によって決まる。したがって、本発明の薬学的組成物には適した製剤が広範囲にわたって存在する（例えば、「Remington 's Pharmaceutical Sciences」第17版、1985）を参照のこと）。
【０１７８】
BIKの発現または活性に対する修飾物質（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）は、単独で、または他の適した成分と組み合わせて、注射用またはポンプ装置での使用のために調製することができる。ポンプ装置（「インスリンポンプ」としても知られる）は、インスリンを患者に投与するために一般的に用いられており、このため、本発明の組成物を含むように適合させることは容易である。インスリンポンプの製造元には、Animas、DisetronicおよびMiniMedが含まれる。
【０１７９】
BIKの発現または活性に対する修飾物質（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）は、単独で、または他の適した成分と組み合わせて吸入によって投与するためのエアロゾル製剤（すなわち、それらは「噴霧」することが可能である）の形にすることができる。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される噴霧剤中に配合することができる。
【０１８０】
投与のために適した製剤には、水性および非水性の溶液、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を等張化する溶質を含みうる等張滅菌溶液、ならびに懸濁化剤、溶解補助剤、濃稠化剤、安定剤および保存料を含みうる水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。本発明の実践に際しては、組成物を例えば経口的、鼻腔内、局所的、静脈内、腹腔内、膀胱内または髄腔内に投与することができる。化合物の製剤は単位用量または複数回の用量がアンプルまたはバイアルなどの容器内に密封された形式で提供することができる。溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。修飾物質を調製済みの食品または薬剤の一部として投与することもできる。
【０１８１】
患者に投与する用量は、本発明の状況においては、一定期間にわたって対象において有益な反応を誘導するのに十分である必要がある。用量は、用いる個々の修飾物質の有効性、対象の年齢、体重、身体活動性および食事内容を含むさまざまな要因、他の薬剤との併用の可能性、ならびに糖尿病症例の重症度に応じて決まると考えられる。修飾物質の一日投与量は、既知のインスリン組成物の場合と同様のやり方で、当業者により、個々の患者について決定することが推奨される。また、用量の程度は、個々の対象における特定の化合物またはベクターの投与に伴う何らかの有害な副作用の存在、性質および程度によっても決まると考えられる。
【０１８２】
投与する修飾物質の有効量を決定する際に、医師は修飾因子の循環血漿中レベル、修飾物質の毒性および抗修飾物質抗体の産生を評価すると思われる。一般に、修飾物質当量としての用量は、一般的な対象の場合、約1ng/kg〜10mg/kgの範囲である。
【０１８３】
投与に関しては、本発明のBIK修飾物質を、修飾物質のLD-50、および修飾物質の種々の濃度での副作用を対象の体重および全般的健康状態に当てはめることによって決定される速度で投与することができる。投与は単回投与または分割投与によって行える。
【０１８４】
本発明の化合物を、所望の標的療法に応じた1つまたは複数の別の薬剤と併用して効果的に用いることもできる（例えば、Turner, N.ら、Prog. Drug Res. (1998) 51: 33-94；Haffher, S., Diabetes Care (1998) 21: 160-178；およびDeFronzo, R.ら（編）、「Diabetes Reviews」(1997) Vol.5, No.4を参照）。数多くの試験で、経口薬との併用療法の有益性が検討されている（例えば、Mahier, R., J. Clin. Endocrinol. Metab. (1999) 84: 1165-71；United Kingdom Prospective Diabetes Study Group: UKPDS 28、Diabetes Care (1998) 21: 87-92；Bardin, C. W.（編）、「Current Therapy In Endocrinology and Metabolism」第6版（Mosby-Year Book, Inc., St. Louis, MO. 1997）；Chiasson, J.ら、Ann. Intern. Med. (1994) 121: 928-935；Coniff, R.ら、Am. Ther. (1997) 19: 16-26；Coniff, R.ら、Am. J. Med. (1995) 98: 443-451；およびIwamoto, Y.ら、Diabet. Med. (1996) 13365-370；Kwiterovich, P., Am. J. Cardiol (1998) 82 (12A): 3U-17Uを参照されたい）。これらの試験により、疾患の中でも特に糖尿病は、治療レジメンに第2の薬剤を加えることによってさらに改善されうることが示されている。併用療法には、本発明のBIK修飾物質および1つまたは複数の別の薬剤を含む単一の医薬製剤の投与のほかに、BIK修飾物質および別個の医薬製剤としての各々の薬剤の投与も含まれる。例えば、BIK修飾物質およびチアゾリジンジオンを錠剤もしくはカプセル剤などの単一の経口投与用組成物としてヒト対象に投与することができ、または各々の薬剤を別個の経口投与用製剤として投与することもできる。別個の投与製剤を用いる場合には、BIK修飾物質および1つまたは複数の別の薬剤を、本質的には同じ時に（すなわち、同時に）投与することができ、または別個に時間をずらして（すなわち、逐次的に）投与することもできる。併用療法にはこれらのレジメンのすべてが含まれるものと解釈される。
【０１８５】
併用療法の1つの例は、糖尿病を変化させる（または糖尿病およびそれに関連した症状、合併症および障害を治療する）場合にみられ、この場合には、BIK修飾物質を例えば以下のものと効果的に併用することができる：スルホニル尿素（クロルプロパミド、トルブタミド、アセトヘキサミド、トラザミド、グリブリド、グリクラジド、グリナーゼ、グリメピリドおよびグリピジドなど）、ビグアナイド系薬剤（メトホルミンなど）、PPARβδアゴニスト、PPARγのリガンドまたはアゴニスト、例えばチアゾリジノン（シグリタゾン、ピオグリタゾン（例えば、米国特許第6,218,409号を参照）、トログリタゾンおよびロシグリタゾン（例えば、米国特許第5,859,037号を参照）など）；クロフィブラート、ジェムフィブロジル、フェノフィブラート、シブロフィブラート、およびベザフィブラートなどのPPARαのアゴニスト、デヒドロエピアンドロステロン（DHEAまたはその抱合硫酸エステルであるDHEA-504とも呼ばれる）；アンチグルココルチコイド；TNFα阻害剤；α-グルコシダーゼ阻害剤（アカルボース、ミグリトールおよびボグリボース）、アミリンおよびアミリン誘導体（プラムリンチド（pramlintide）など（米国特許第5,902,726号；第5,124,314号；第5,175,145号および第6,143,718号、第6,136,784号も参照のこと））、インスリン分泌促進物質（レパグリニド、グリキドンおよびナテグリニド（米国特許第6,251,856号；第6,251,865号；第6,221,633号；第6,174,856号も参照のこと））、およびインスリン。
【０１８６】
IX．糖尿病の診断
本発明はまた、糖尿病を、または糖尿病もしくは別のBIK関連疾患の病態の少なくともいくつかに対する素因を診断する方法も提供する。診断は、個体の遺伝子型の判定（例えば、SNPによる）、および、糖尿病または他のBIK関連疾患の発生と関わりがあることが知られた対立遺伝子との遺伝子型の比較を含みうる。BIK遺伝子型の判定は、医薬品の有効性ならびに糖尿病に対する素因を予測するために有用である。
【０１８７】
または、診断は、患者におけるBIKのレベルを測定し、そのレベルをあるベースラインまたは範囲と比較することも含む。一般に、ベースライン値は、正常血糖（すなわち糖尿病でなく一般的には健康な）者におけるBIKの値を代表する。以上に考察した通り、BIKレベルのベースラインの範囲からの差異（高値または低値）は、その患者が糖尿病であるか、糖尿病の病態の少なくともいくつかを発症するリスクがあることを示す。いくつかの態様において、BIKのレベルは、患者から血液試料を採取して、本明細書で考察したような任意のさまざまな検出方法を用いて試料中のBIKの量を測定することによって測定される。例えば、空腹時および摂食後の血中濃度または尿中濃度を検査することができる。
【０１８８】
いくつかの態様においては、試料におけるBIKの活性または発現のレベルを決定し、1人または複数の正常血糖者のベースライン値と比較する。または、BIKの活性または発現のレベルを、同じ個体で複数の時点、例えば1日、1週間、1カ月、1年またはそれ以上の間隔をおいて決定する。試料間にBIKの活性または発現の変化があることにより、糖尿病の発症または糖尿病を発症する素因が示される。いくつかの態様において、ベースラインレベルと個体の試料におけるレベル、または同一の個体からの少なくとも2つの試料は、例えば、少なくとも5％、10％、20％、50％、75％、100％、200％、500％、1000％またはそれ以上異なる。いくつかの態様において、個体からの試料は、上に挙げた百分率の少なくとも1つの分だけベースラインレベルを上回る。同様に、いくつかの態様において、個体からの試料は、上に挙げた比率の少なくとも1つの分だけベースラインレベルを下回る。同様に、ある個体から第1の試料を採取した後の何らかの時点で採取した試料におけるレベルは、第1の試料におけるレベルより高いことも低いこともある。
【０１８９】
いくつかの態様において、BIK活性または発現のレベルは、チアゾリジンジオン、メトホルミン、スルホニル尿素および他の標準的 な治療薬といった糖尿病治療薬の有効性をモニターするために用いられる。いくつかの態様において、BIKの活性または発現は、臨床的有効性の代用マーカーとして、糖尿病患者またはインスリン抵抗性患者の糖尿病治療薬による治療の前および後に測定される。例えば、BIKの発現または活性の低下が大きいほど有効性も大きいことが示される。
【０１９０】
実施例
以下の実施例は、請求する本発明を例示するために提供するものであり、それを限定するものではない。
【０１９１】
実施例1
本実施例は、BIKの同定および特徴決定について説明する。
【０１９２】
膵島における発現が非常に高度な、K＋チャンネルの一種であるBIK（島細胞-二孔性-酸感受性-Kチャンネル）が同定された。末梢血リンパ球、肺、胎盤、小腸、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、結腸、骨格筋、心臓および脳に由来する2μgのポリA+ RNAのClontech MTNブロットを用いてノーザンブロットを行った。このブロットを、10μgのヒト膵島全RNAならびに膵臓、精巣、副腎および脾臓の2つの標本由来の各2μgのポリA+ RNAをローディングした別のノーザンブロットとともに、同一のプローブおよび条件を用いて検索した。約2.6kbの単一のバンドが膵島で観察され、はるかに程度は落ちるものの膵臓でも観察された。膵島は膵臓全体の質量のうち1〜5％を占めるため、膵臓よりも膵島の方に多く存在したことは、BIK転写物が膵島のみに認められ、膵臓の外分泌（島でない）部分には存在しないかはるかに存在量が少ないことを反映している。さらに、BIKの発現は糖尿病の動物および高脂肪食を与えた動物で亢進していた。
【０１９３】
標準的な技術により、pZL1（Invitrogen）中に精製ヒト膵臓β細胞からの相補的DNA（cDNA）ライブラリーを作製し、約100,000クローンに対してシークエンシングを行った。これらのうち20種を上回るものが独立したBIKクローンであった。これらのクローンの1つ（bc13011）の全体をシークエンシングしたところ、特徴的なK＋チャンネル形成ドメインが2つある完全長タンパク質をコードしていた（図1）。配列番号：1および2を参照されたい。本発明者らの配列とアクセッション番号AL136087で見られる公開配列との間には対立遺伝子の差異が4つある：BIK nt 597はC（AL136087ではT）、BIK nt 800はCである（AL136087ではT）、BIK nt 934はAである（AL136087ではC）、BIK nt 1191はTである（AL136087ではC）。nt 934での一塩基多型（SNP）は、コドン277をBIKにおけるB（グルタミン酸）からAL136087ではA（アラニン）に変化させる。
【０１９４】
その後、本発明者らは、標準的な技術によってラット膵島から作製したcDNAライブラリー中に2つのオルソロガスなクローンを見いだした。これらのクローンの1つであるR1A099-C1の全体をシークエンシングしたところ、これも完全長タンパク質をコードしていた。ヒトおよびラットのBIKの推定ポリペプチド配列のアライメントにより、それらがアミノ酸レベルで87％同一であることが示されている（図2）。BIKは2つのチャンネル形成ドメインを含み、樹状図分析（MacVector）によればTWIK1およびTWIK2との類似性が最も高いように思われる（図3）。
【０１９５】
マウス膵島cDNAライブラリーからBIKのマウスクローンを多数入手し、この配列に対応するGeneChipプローブ（MBXMUSISL22471）を合成した。
【０１９６】
以上に考察したように、ヒト膵島ではBIKが膵島に多く存在することが認められる。マウス膵島（図4）およびラット膵島（図5）でもBIKが多く存在することが示されている。さらに、BIK mRNAの発現は、ヒトII型糖尿病の原因を模倣して高脂肪食を与えたC57／B6Jマウスでも亢進している（図6）。このチャンネルのmRNAは、高脂肪食の摂取によって高血糖とされたC57／B6Jマウスの膵臓ではほぼ2倍に増加する。BIKは糖尿病マウスの膵島でも増加しているが糖尿病でない対照では増加していない。このmRNAは、32％脂肪食を28週間与えたマウスでは、固形飼料を与えた同齢のマウスよりも90％（p＜0.001）増加していた。42％脂肪食を与えたC57／B6Jマウスでも、それよりは程度は落ちるが同じく有意な（30％；p＜0.02）BIK mRNAの増加がみられる。同じ高脂肪食を与えたDBAマウスでは固形飼料を与えたDBAマウスと比較して増加は認められなかった。C57B6の膵島は他の系統に比してインスリン分泌に欠陥があり、この欠陥が高脂肪食を与えることによって増強される。
【０１９７】
BIK mRNAは、肥満の糖尿病（db／db）マウスでも、血糖値が正常な非糖尿病マウスに比して大幅にアップレギュレートされる（図7）。2つのチャンネル形成ドメインを含むチャンネルの「漏出」特性からみて、BIKは、II型糖尿病のこれらのマウスモデルに認められるインスリン分泌の欠陥の一因である可能性がある。本発明の範囲を限定することは意図していない、このチャンネルの発現亢進は細胞膜を過分極させ、そのために、これらの高脂肪食摂取マウスの膵島の特徴であるインスリン分泌の低下が引き起こされる可能性が高いと考えられる。
【０１９８】
糖尿病性の膵島における膵島特異的なバックグラウンド／漏出型K＋チャンネルBIKの発現亢進は、BIKがβ細胞膜の過分極を招き、それにより、糖尿病動物の膵島で認められるグルコース応答性インスリン分泌（GSIS）の不足の一因になるという可能性を示唆する。β細胞膜の脱分極は、主としてKATPチャンネル（Kir 6.2＋SUR1）によって媒介され、インスリンの放出の引き金となる電位依存性L型Ca＋＋チャンネルの活性化に必要なため、過分極はグルコースに応答したインスリン分泌を抑制する。
【０１９９】
本発明者らは、組換えアデノウイルスを用いてBIK発現を増大させると、細胞のグルコース応答性インスリン分泌に対する応答性が低下することを示した。マウスβ細胞株HC9細胞は通常、高濃度（20MM）グルコースに応答し、低濃度（0.1mM）グルコース中でのインスリン放出に比べてインスリン放出が3〜5倍に増加する。βHC9細胞をBIKコード配列を含まない対照アデノウイルスに感染させても、インスリン分泌に対する高濃度グルコースの影響は実質的に低下しなかったが、ヒトBIKまたはN末端flagエピトープで標識したヒトBIKの発現を引き起こすウイルスに感染させると、いずれもグルコース応答性インスリン分泌を顕著に抑制した（図8A）。BIKまたはflag-BIKの発現亢進はインスリンの細胞内含有量の増加ももたらした。これはBIKによるGSISの阻害がインスリン生合成の阻害には起因しないことを示している（図8B）。
【０２００】
βHC9細胞は膵島内の正常に分化したβ細胞の特徴の多くを有するが、単離したヒト膵島にBIKアデノウイルスを感染させ、続いてこれらの膵島におけるGSISアッセイ法を行うことにより、ヒトインスリン分泌性β細胞におけるBIKの機能を直接評価することができる。2人の異なるドナーからのヒト膵島のアリコートを、BIK発現をもたらすアデノウイルスまたはBIKコード配列を含まない対照ウイルスに感染させ、その48時間後に、低濃度グルコースもしくは高濃度グルコースまたはKClを含む緩衝液を用いた膵島の周辺灌流により、グルコース応答性を分析した。BIKを感染させた膵島は16mMグルコースに対してほぼ全く非感受性であった。これに対して、対照ウイルスを感染させた膵島はこの濃度のグルコースに対して強い応答を示した。KClによるβ細胞の脱分極はBIKを感染させた膵島および対照を感染させた膵島の両者からのインスリン放出を促すが、BIKを感染させた膵島からの放出の方がわずかである。
【０２０１】
β細胞または膵島におけるBIK発現を増大させることによって起こるGSISの減弱は、BIKが、膜過分極を介したβ細胞におけるインスリン放出の負の調節に寄与することを示唆する。糖尿病db／dbマウスの膵島の場合には、BIKは糖尿病マウスの膵島で観察される相対的なグルコース非感受性の一因である可能性が高い。このため、BIKの低分子阻害物質は、インスリン分泌に対するBIKの負の作用を打ち消し、糖尿病性の膵島を正常膵島により近い状態に回復させる。その結果得られる膵島機能の改善は糖尿病をもたらすインスリン不足を好転させるはずである。したがって、BIK阻害物質は抗糖尿病薬の優れた候補である。
【０２０２】
実施例2
本実施例は、BIK依存的な膜過分極／脱分極に関するアッセイ法、およびBIKチャンネルのある程度選択的な不活性化物質としてのメタナンダミドの同定について示す。
【０２０３】
線維芽細胞におけるBIKなどのバックグラウンド／漏出型カリウムチャンネルの高レベルの発現は、原形質膜の過分極を引き起こす。さらに、これらの細胞の膜電位の観測は、BIKの低分子遮断物質を検出するためのアッセイ法ともなる。本発明者らは、BIK（および比較のための、特徴が詳細に調べられているバックグラウンド型チャンネルTASK2）を発現する安定的なHEK293細胞株を作製し、FLIPR膜電位色素およびFlexStationマイクロプレート蛍光光度計を用いてその特徴を調べた。BIKおよびTASK2を発現する細胞が示したこの色素による基礎蛍光量は、ベクターのみを発現する安定的な細胞株および親HEK293細胞よりも大幅に少なかった；この減少は過分極を意味する。さらに、BIKおよびTASK2細胞は、ベクターをトランスフェクトした安定的な細胞株に比べて、30mM KClで脱分極させた時の蛍光の変化が3〜5倍大きかった。図9を参照のこと。
【０２０４】
本発明者らは、この安定的なHEK293トランスフェクト体におけるBIKチャンネルを選択的に遮断する能力に関して、一連のチャンネル遮断物質および修飾物質の試験をFlexStation/膜電位色素アッセイ法を用いて行った。内因性化合物であるアナンダミドのメチル誘導体であるメタナンダミドがBIKのある程度選択的な遮断物質であることが判明し、この化合物（100μM）によって生じたBIK細胞での蛍光（脱分極）の増加はTASK2細胞またはベクター対照細胞に比して3倍であった（図10A）。
【０２０５】
本明細書中に説明した実施例および態様は例示のみを目的としており、当業者にはそれに鑑みてさまざまな修正または変更が想起されると考えられるが、これらは本出願の精神および範囲ならびに添付する特許請求の範囲に含まれるものとする。本明細書に引用したすべての刊行物、特許および特許出願は、その全体がすべての目的に関して参照として本明細書に組み入れられる。
【０２０６】
配列表
配列番号：1：ヒトBIK cDNA
配列番号：2：ヒトBIKのポリペプチド配列
配列番号：3：ラットBIK cDNA配列
r_BIK.配列 長さ：2351 2001年12月18日 20:31 タイプ：N チェック：1892 ..
配列番号：4：ラットBIKのポリペプチド配列
r_BIK.pep 長さ：292 2001年12月19日 14:08 タイプ：P チェック：4548 ..
配列番号：5
プライマー1 hBIKの開始コドンを含む順方向プライマー
配列番号：6
プライマー2 hBIKの終止コドンを含む逆方向プライマー
配列番号：7
プライマー3 ヒトコード領域内の内部順方向プライマー
配列番号：8
プライマー4 ヒトコード領域内の内部逆方向プライマー
配列番号：9 Genbankアクセッション番号CAC07336
配列番号：10 ヒトおよびラットのBIK間のアミノ酸コンセンサス配列
一文字記号＝個々の実体
・＝保存されている残基
＿＝保存されていない残基
【図面の簡単な説明】
【０２０７】
【図１】ヒトcDNA BIKクローンによってコードされるポリペプチド配列を示している。太字の配列はチャンネル形成ドメインを表す。下線を施した配列は膜貫通ドメインを表す。
【図２】ヒトおよびラットのBIKポリペプチド配列のClustalWアライメントを示している。
【図３】BIKのTMドメインおよび孔ドメインと、TASK2、TASK1およびTWIK1の類似のドメインとの、ClustalWアライメントを示している。
【図４】BIK mRNAが他の組織よりも膵島に多く存在することを示す、マウス膵島チップハイブリダイゼーションの結果を示している。チップを、膵臓β細胞株（βHC9）、単離マウス膵島5組、さらには種々のマウス組織：脂肪、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、下垂体、骨格筋、小腸および胸腺からの同量のcRNAとハイブリダイズさせた。平均差スコアは、それぞれの組織におけるBIK mRNAの相対的存在量を反映する。Affymetrix GeneChip分析パッケージは、BIK mRNAがβHC9、すべての膵島試料のほか、小腸にも（平均差スコアははるかに低いが）存在すると判定した。この分析パッケージは、BIK mRNAは他のいずれの組織にも存在しないと判断した。
【図５】BIK mRNAが膵島に多く存在することを示す、ラット膵島チップハイブリダイゼーションの結果を示している。チップを、単離したラット膵島5組、さらには種々のラット組織：脳、十二指腸、脂肪、心臓、腎臓、肝臓、骨格筋、膵臓および脾臓からの同量のcRNAとハイブリダイズさせた。平均差スコアは、それぞれの組織におけるBIK mRNAの相対的存在量を反映する。Affymetrix GeneChip分析パッケージにより、BIK mRNAが5組の膵島試料のすべてに存在し、他のいずれの組織にも存在しないことが示された。
【図６】C57／B6Jマウスに高脂肪食を与えることによってBIK mRNAが増加することを示す、マウス膵島チップハイブリダイゼーションの結果を示している。マウス系統C57／B6JおよびDBAを固形飼料により、または32％または42％脂肪食によって28週間飼育した。各条件下のそれぞれの系統のマウス5匹から膵島を単離した。それぞれのRNA試料をマウス膵島GeneChipにより、何千種のmRNAの含有量に関して分析した。マウスBIKのmRNAは、C57／B6マウスに高脂肪食を与えることによって有意にアップレギュレートされることが見いだされた。
【図７】糖尿病（db／db）マウスの膵島でBIK mRNAが増加していることを示す、マウス膵島チップハイブリダイゼーションの結果を示している。12週齡の糖尿病（db／db）マウスおよび非糖尿病（db／+）マウスから膵島を単離し、リアルタイム半定量的PCR（TaqMan）による分析のためにRNAを調製した。マウスBIKの相対的な変化の倍数を、試料のβ-アクチンmRNA含有量に関して調整した。
【図８】BIKがβ細胞株におけるグルコース非感受性およびインスリン保持を引き起こしたことを示している。マウスのグルコース応答性β細胞株HC9を12ウェルプレートに播き、個々のウェルをそのまま感染させずにおくか、または、ヒトBIKを発現するアデノウイルス（BIKウイルス）、N末端flag標識を有するBIKを発現するアデノウイルス（flag-BIKウイルス）、もしくはBIK（またはflag-BIK）コード配列を含まない点を除いてこれらの2つと同一なアデノウイルスに感染させた（MOI＝25）。感染24時間後に細胞を洗浄し、0.1mMグルコースを含むKRB緩衝液中に40分間置いて、KRBで洗浄した。続いて細胞を、0.1mM（図8A、色の薄いバー）または20mM（色の濃いバー）のグルコースを含むKRB中で1時間インキュベートした。細胞から分泌されたインスリンの量（図8A）は、細胞に曝露させた緩衝液のアリコートのRIAによって定量し、細胞内に残ったインスリン（インスリン含有量；図8B）は、酸-エタノールによる抽出後のRIAによって定量した。インスリン分泌量およびインスリン含有量に関する値は、3回ずつの測定の平均±S.E.である。2回目の独立した実験でも同様の結果が得られた。
【図９】周辺灌流（perifusion）下にあるヒト膵島によるインスリン分泌に対するBIK発現の影響を示している。2例のドナー由来の凍結保存ヒト膵島を解凍した上で、ヒトBIKを発現するアデノウイルス（5×106pfu／膵島細胞50個）またはBIKコード配列を含まない点を除いて同一な対照ウイルスに感染させた。48時間後に膵島を、低濃度グルコースもしくは高濃度グルコースまたはKClを含む緩衝液の周辺灌流を行えるチャンバーに入れた。逐次的に2mMグルコースに5分間、16mMグルコースに15分間、2mMグルコースに10分間、30mM KClに11分間および2mMグルコースに7分間曝露させた、サイズが同等な各群の25個の膵島からのインスリン分泌を測定した。画分は1分間隔で収集した。
【図１０】メタナンダミド（Methanandamide）がBIKのある程度選択的な不活性化物質であることを示している。pcDNA3.1（○）、またはBIK（□）もしくはTASK-2（△）を発現しうる同じベクターを安定的にトランスフェクトしたHEK293細胞を、分析の24時間前に96ウェルアッセイプレートに播いた。細胞を100μlの0.5×FLIPR Membrane Potential Dye（Molecular Devices）中で30分間インキュベートした。メタナンダミドをDMSO中に希釈したものをFlexStation装置（Molecular Devices）によってウェルに添加し、この化合物の添加前、添加中および添加後の蛍光強度の変化を記録した。蛍光強度の変化を、化合物の添加前に記録した基礎値からの増加率としてプロットされている。各値は2つずつのウェルの平均および範囲である。ほかの3回の独立した実験でも同様の結果が得られた。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：10と少なくとも90％同一な配列を含むカリウムチャンネルをコードするが、ただしそのポリペプチドが配列番号：9ではない、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
カリウムチャンネルが配列番号：10に示された配列を含む、請求項1記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
カリウムチャンネルが配列番号：2を含む、請求項1記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：1を含む、請求項1記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号：2のアミノ酸番号277に対応するカリウムチャンネルのアミノ酸がグルタミン酸である、配列番号：2と少なくとも80％同一なカリウムチャンネルをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号：4と少なくとも88％同一なカリウムチャンネルをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号：4をコードする、請求項6記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号：3を含む、請求項6記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項1記載のポリヌクレオチドがトランスフェクトされた細胞。
【請求項１０】
膵島細胞である、請求項9記載の細胞。
【請求項１１】
請求項6記載のポリヌクレオチドがトランスフェクトされた細胞。
【請求項１２】
膵島細胞である、請求項11記載の細胞。
【請求項１３】
配列番号：10と少なくとも90％同一な配列を含む単離されたポリペプチドであるが、ただし配列番号：9ではないポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号：10と同一な配列を含む、請求項13記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列が配列番号：2に示されている、請求項13記載のポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号：2のアミノ酸番号277に対応するアミノ酸がグルタミン酸である、配列番号：2と少なくとも80％同一な、単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号：4と少なくとも88％同一な、単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号：4を含む、請求項17記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号：2または配列番号：4と特異的に結合する抗体。
【請求項２０】
配列番号：2と特異的に結合する、請求項19記載の抗体。
【請求項２１】
配列番号：4と結合する、請求項19記載の抗体。
【請求項２２】
配列番号：9と結合しない、請求項19記載の抗体。
【請求項２３】
モノクローナル抗体である、請求項19記載の抗体。
【請求項２４】
ポリクローナル抗体である、請求項19記載の抗体。
【請求項２５】
動物におけるグルコース応答性インスリン産生を誘導する作用物質を同定する方法であって、
（i）作用物質を、配列番号：2、配列番号：4または配列番号：9をコードする配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む混合物と接触させ、その後に0.2×SSCにより55℃、20分間の洗浄を1回行う段階；および
（ii）そのポリペプチドの発現または活性を変化させる作用物質を選択し、それによって動物におけるグルコース応答性インスリン産生を誘導する作用物質を同定する段階、を含む方法。
【請求項２６】
段階（ii）が、ポリペプチドの発現を変化させる作用物質を選択することを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
段階（ii）が、ポリペプチドの活性を変化させる作用物質を選択することを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドが配列番号：2を含む、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
ポリペプチドが配列番号：4を含む、請求項25記載の方法。
【請求項３０】
ポリペプチドが配列番号：9を含む、請求項25記載の方法。
【請求項３１】
ポリペプチドが配列番号：9を含まない、請求項25記載の方法。
【請求項３２】
ポリペプチドが配列番号：10を含む、請求項25記載の方法。
【請求項３３】
ポリペプチドが固体支持体と結合している、請求項25記載の方法。
【請求項３４】
作用物質が固体支持体と結合している、請求項25記載の方法。
【請求項３５】
作用物質が、ポリペプチドと特異的に結合する作用物質を同定することによって選択される、請求項25記載の方法。
【請求項３６】
混合物が、ポリペプチドを発現する細胞を含む、請求項25記載の方法。
【請求項３７】
ポリペプチドの活性が、細胞におけるカルシウム流の変化を測定することを含む段階によって決定される、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
ポリペプチドの活性が、細胞の膜電位の変化を測定することを含む段階によって決定される、請求項36記載の方法。
【請求項３９】
細胞がインスリン分泌性細胞である、請求項25記載の方法。
【請求項４０】
ポリペプチドの活性が、細胞によるインスリン分泌の変化を測定することを含む段階によって決定される、請求項25記載の方法。
【請求項４１】
ポリペプチドの活性が、細胞によるグルコース応答性インスリン分泌の変化を測定することを含む段階によって決定される、請求項25記載の方法。
【請求項４２】
作用物質を糖尿病の動物に投与すること、および、動物をグルコース応答性インスリン分泌の増加に関して検査することをさらに含む、請求項25記載の方法。
【請求項４３】
動物におけるグルコース応答性インスリン産生を誘導する方法であって、請求項25において選択された作用物質の治療的有効量を投与することを含む方法。
【請求項４４】
動物がヒトである、請求項43記載の方法。
【請求項１】
配列番号：10と少なくとも90％同一な配列を含むカリウムチャンネルをコードするが、ただしそのポリペプチドが配列番号：9ではない、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
カリウムチャンネルが配列番号：10に示された配列を含む、請求項1記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
カリウムチャンネルが配列番号：2を含む、請求項1記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号：1を含む、請求項1記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号：2のアミノ酸番号277に対応するカリウムチャンネルのアミノ酸がグルタミン酸である、配列番号：2と少なくとも80％同一なカリウムチャンネルをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号：4と少なくとも88％同一なカリウムチャンネルをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号：4をコードする、請求項6記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号：3を含む、請求項6記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項1記載のポリヌクレオチドがトランスフェクトされた細胞。
【請求項１０】
膵島細胞である、請求項9記載の細胞。
【請求項１１】
請求項6記載のポリヌクレオチドがトランスフェクトされた細胞。
【請求項１２】
膵島細胞である、請求項11記載の細胞。
【請求項１３】
配列番号：10と少なくとも90％同一な配列を含む単離されたポリペプチドであるが、ただし配列番号：9ではないポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号：10と同一な配列を含む、請求項13記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列が配列番号：2に示されている、請求項13記載のポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号：2のアミノ酸番号277に対応するアミノ酸がグルタミン酸である、配列番号：2と少なくとも80％同一な、単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号：4と少なくとも88％同一な、単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号：4を含む、請求項17記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号：2または配列番号：4と特異的に結合する抗体。
【請求項２０】
配列番号：2と特異的に結合する、請求項19記載の抗体。
【請求項２１】
配列番号：4と結合する、請求項19記載の抗体。
【請求項２２】
配列番号：9と結合しない、請求項19記載の抗体。
【請求項２３】
モノクローナル抗体である、請求項19記載の抗体。
【請求項２４】
ポリクローナル抗体である、請求項19記載の抗体。
【請求項２５】
動物におけるグルコース応答性インスリン産生を誘導する作用物質を同定する方法であって、
（i）作用物質を、配列番号：2、配列番号：4または配列番号：9をコードする配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む混合物と接触させ、その後に0.2×SSCにより55℃、20分間の洗浄を1回行う段階；および
（ii）そのポリペプチドの発現または活性を変化させる作用物質を選択し、それによって動物におけるグルコース応答性インスリン産生を誘導する作用物質を同定する段階、を含む方法。
【請求項２６】
段階（ii）が、ポリペプチドの発現を変化させる作用物質を選択することを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
段階（ii）が、ポリペプチドの活性を変化させる作用物質を選択することを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドが配列番号：2を含む、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
ポリペプチドが配列番号：4を含む、請求項25記載の方法。
【請求項３０】
ポリペプチドが配列番号：9を含む、請求項25記載の方法。
【請求項３１】
ポリペプチドが配列番号：9を含まない、請求項25記載の方法。
【請求項３２】
ポリペプチドが配列番号：10を含む、請求項25記載の方法。
【請求項３３】
ポリペプチドが固体支持体と結合している、請求項25記載の方法。
【請求項３４】
作用物質が固体支持体と結合している、請求項25記載の方法。
【請求項３５】
作用物質が、ポリペプチドと特異的に結合する作用物質を同定することによって選択される、請求項25記載の方法。
【請求項３６】
混合物が、ポリペプチドを発現する細胞を含む、請求項25記載の方法。
【請求項３７】
ポリペプチドの活性が、細胞におけるカルシウム流の変化を測定することを含む段階によって決定される、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
ポリペプチドの活性が、細胞の膜電位の変化を測定することを含む段階によって決定される、請求項36記載の方法。
【請求項３９】
細胞がインスリン分泌性細胞である、請求項25記載の方法。
【請求項４０】
ポリペプチドの活性が、細胞によるインスリン分泌の変化を測定することを含む段階によって決定される、請求項25記載の方法。
【請求項４１】
ポリペプチドの活性が、細胞によるグルコース応答性インスリン分泌の変化を測定することを含む段階によって決定される、請求項25記載の方法。
【請求項４２】
作用物質を糖尿病の動物に投与すること、および、動物をグルコース応答性インスリン分泌の増加に関して検査することをさらに含む、請求項25記載の方法。
【請求項４３】
動物におけるグルコース応答性インスリン産生を誘導する方法であって、請求項25において選択された作用物質の治療的有効量を投与することを含む方法。
【請求項４４】
動物がヒトである、請求項43記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００６−５０７８０１（Ｐ２００６−５０７８０１Ａ）
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５１０７２７（Ｐ２００４−５１０７２７）
【出願日】平成１５年６月１０日（２００３．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０１８４４６
【国際公開番号】ＷＯ２００３／１０３６０６
【国際公開日】平成１５年１２月１８日（２００３．１２．１８）
【出願人】（５０４２１４２８０）メタボレックス インコーポレーティッド (21)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年６月１０日（２００３．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０１８４４６
【国際公開番号】ＷＯ２００３／１０３６０６
【国際公開日】平成１５年１２月１８日（２００３．１２．１８）
【出願人】（５０４２１４２８０）メタボレックス インコーポレーティッド (21)
【Ｆターム（参考）】
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