糖尿病性網膜症の診断および予防
【課題】 発症早期に糖尿病性網膜症の発症またはその発症可能性を判定（診断）する方法、およびその判定（診断）キットを提供することにある。さらに、糖尿病性網膜症の発症に対する有効な予防方法および予防薬剤を提供する。
【解決手段】 本発明においては、Ａｎｇ−１遺伝子またはその翻訳産物であるタンパク質の変異が、糖尿病性網膜症の発症と因果関係があることを明らかにした。さらに、上記変異の有無を検出することによって、糖尿病性網膜症の発症またはその発症可能性を簡便に判定する方法などを確立した。
【解決手段】 本発明においては、Ａｎｇ−１遺伝子またはその翻訳産物であるタンパク質の変異が、糖尿病性網膜症の発症と因果関係があることを明らかにした。さらに、上記変異の有無を検出することによって、糖尿病性網膜症の発症またはその発症可能性を簡便に判定する方法などを確立した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病性網膜症の診断および予防に関するものであって、特に、アンギオポエチン−１遺伝子またはその翻訳産物たるタンパク質を用いた糖尿病性網膜症の診断および予防に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病性網膜症（diabetic retinopathy、以下「ＤＲ」ともいう）は、糖尿病性腎症、および糖尿病性神経障害と並ぶ糖尿病の３大合併症であり、発症頻度も高く、重大な慢性疾患である。
【０００３】
糖尿病患者の血液は、糖分を多く含み粘性が高いため、網膜の毛細血管を詰まらせたり、血管壁に負担をかけたりする結果、網膜に必要な酸素や栄養が不足する。ＤＲは、その結果起こる疾患であり、眼底出血や硝子体出血などの症状を示す。糖尿病性網膜症は進行過程に従って、単純型ＤＲ、前増殖型ＤＲ、および増殖型ＤＲの３段階に分けることができる。
【０００４】
単純型ＤＲは、ＤＲの初期の段階である。この段階では、網膜に酸素を送る毛細血管に毛細血管瘤やしみ状出血が見られる。また、タンパク質などが網膜に溜まって、硬性白斑ができたりすることがある。
【０００５】
前増殖型ＤＲは、単純型ＤＲが進行した段階である。この段階では、白斑の数が増え、毛細血管が部分的に塞がれるという症状が見られる。
【０００６】
増殖型ＤＲは、前増殖型ＤＲがさらに進行した段階である。網膜の毛細血管が塞がれて、網膜に送られる酸素が不足してしまうため、これを補うために新しい新生血管が現れる。しかし、新生血管はもろいため、出血をおこしやすく、また、網膜剥離を起こしたり、さらに進行したりすると失明に至る場合もある。
【０００７】
ＤＲでは、単純型ＤＲの場合、網膜の中心部に出血、浮腫が起きなければ目立った自覚症状はなく、自覚症状が現れたときには既に失明の危機にひんした状態（増殖型ＤＲの状態）であることがほとんどである。また、ＤＲは、我が国の成人の失明原因の第１位でもある。したがって、ＤＲ患者は身体的にも精神的にも大きな苦痛を生涯に亘って背負うことになる。
【０００８】
ＤＲの診断は、主に、眼底の検査により行われる。具体的には、（１）眼球に光を当てて、レンズを通して瞳孔から眼球の内部を観察し、網膜の異常の有無を検査する「眼底検査」や、（２）静脈から色素を注射しながら眼底を調べる「蛍光眼底造影」などにより行われる。
【０００９】
また、ＤＲの治療は、通常、病態の病状の進行過程によって選択すべき治療手段が異なる。例えば、上記単純型ＤＲの場合、血管強化薬の投与や、抗血小板療法を含め、内科的に血糖をコントロールする治療方法や、薬物により網膜の変化を抑える治療方法が採られる。一方、前増殖型ＤＲや増殖型ＤＲの段階になると、レーザー光線の熱で網膜を焼くことによって、血管の新生を抑える「網膜光凝固療法」が採られる。さらに、増殖型ＤＲの段階で、硝子体出血や網膜剥離の症状が見られると、硝子体手術を行う場合がある。しかし、硝子体手術は合併症を引き起こすことが多く、術後の経過が悪いことがある。
【００１０】
ところで、ＤＲの発症機序は、近年の研究で徐々に明らかにされつつある。具体的には、ＤＲは、まず、白血球が網膜血管系に付着し、これに続いて血管内皮細胞の障害と血液網膜関門(blood-retinal barrier)の破壊とが起こることにより発症することが明らかにされた。また、糖尿病発症ラットを用いた実験で、この過程を阻止する因子としてアンギオポエチン−１（Angiopoietin-1、以下、「Ａｎｇ−１」ともいう）の有用性が報告された（非特許文献１を参照）。
【００１１】
Ａｎｇ−１の主な作用には、血管内皮増殖因子（vascular endotherial growth factor、以下「ＶＥＧＦ」ともいう）によって誘導された新生血管の裏打ち、新生血管の造成を促進する作用、および血管周囲平滑筋の造成促進作用がある。Ａｎｇ−１は、血管内皮上の血管新生関連チロシンキナーゼ型受容体であるＴｉｅ−２（tyrosine kinase with immunoglobulin and endothelial growth factor homology domains）受容体に作用して、インテグリンを介したフィブロネクチンへの接着を促進する。また、この一連の細胞内シグナル伝達の過程でＡｎｇ−１は、血管内皮細胞の遊走を促進し、同時に血管内皮細胞の細胞死を抑制することによって、生存効果を上げることが明らかになっている（非特許文献２を参照）。
【００１２】
一方、本発明者らは、Ａｎｇ−１遺伝子における変異が、関節リウマチ（rheumatoid arthritis、以下「ＲＡ」ともいう）の発症との因果関係が認められることを明らかにしている（特許文献１を参照）。特許文献１では、ＲＡ患者集団において、Ａｎｇ−１遺伝子における下記の変異が有意に多いことが示されている。
【００１３】
上記Ａｎｇ−１遺伝子における変異は、Ａｎｇ−１遺伝子のｃＤＮＡとしてＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：ＡＢ０８４４５４）の第８０４番目の塩基と第８０５番目の塩基の間に、「ＧＧＴ」というグリシンをコードする３塩基が挿入された変異（ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：Ｕ８３５０５））であった。上記のＡｎｇ−１遺伝子における変異の位置は、Ａｎｇ−１分子内に存在するｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインとｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ−ｌｉｋｅドメインとの中間に存在するものであった。
【特許文献１】特開２００３−２０４７９０公報（平成１５（２００３）年７月２２日公開）
【非特許文献１】Antonia M. Joussen et al., Suppression of diabetic retinopathy with Angiopoetin-1, American journal of pathology, 160, 1683-1693 (2003)
【非特許文献２】Christopher D. Kontos et al., Tyrosine 1101 of Tie2 is the major site of association of p85 and is required for activation of phosphatidylinositol 3-kinase and Akt, Molecular and Cellular Biology, 18, 4131-4140 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ＤＲは、上述したように、最終的に重篤な症状を引き起こす疾患であるが、発症初期段階では、自覚症状がないため、早期発見が困難である。また、ＤＲの診断も、眼底の検査という主観的に診断する方法によるものが主流であった。したがって、現在、ＤＲの発症について、客観的にかつ正確に診断できる技術、または、将来的にＤＲを発症する可能性を診断できる技術の確立が強く望まれている。
【００１５】
上記の客観的にＤＲの発症、または将来的に発症する可能性を診断する方法としては、分子生物学的手法を用いた診断方法が有効な診断方法の１つと考えられる。しかしながら、非特許文献１に示されるように、ＤＲの発症と因果関係のある遺伝子の報告はあるものの、ＤＲの発症との因果関係が明らかとされた遺伝子の異常（変異）はこれまでに全く知られていない。そのため、分子生物学的手法を用いたＤＲの発症、または将来的に発症する可能性を早期に診断する技術を確立するには至っていない。
【００１６】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、発症早期にＤＲの発症またはその発症可能性を判定（診断）する方法、およびその判定（診断）キット、並びにＤＲ発症に対する有効な予防方法および予防薬剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＤＲの発症と因果関係がある遺伝子の変異を独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
すなわち、本発明にかかるＤＲの発症またはその発症の可能性の判定方法は、生体から分離された試料を用いて、糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性を判定する方法であって、アンギオポエチン−１タンパク質（以下、「Ａｎｇ−１」ともいう）をコードするポリヌクレオチドにおける変異の有無を検出する工程を含み、かつ、上記変異が、変異型アンギオポエチン−１タンパク質（以下、「変異型Ａｎｇ−１」ともいう）の第２６９番目のアミノ酸であるグリシンをコードする３塩基の欠失変異であることを特徴としている。
【００１９】
また、本発明にかかるＤＲの発症またはその発症の可能性の判定方法は、生体から分離された試料を用いて、糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性を判定する方法であって、アンギオポエチン−１遺伝子（以下、「Ａｎｇ−１遺伝子」ともいう）における変異の有無を検出する工程を含み、かつ、上記変異が、変異型アンギオポエチン−１遺伝子（以下、「変異型Ａｎｇ−１遺伝子」ともいう）の翻訳領域中第８０５〜８０７番目の塩基である「ＧＧＴ」（ＧおよびＴは、それぞれ、グアニンおよびチミンを表す）の３塩基の欠失変異であることを特徴としている。
【００２０】
さらに、本発明にかかるＤＲの発症またはその発症の可能性の判定方法は、生体から分離された試料を用いて、糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性を判定する方法であって、Ａｎｇ−１における変異の有無を検出する工程を含み、かつ、上記変異が、変異型Ａｎｇ−１の第２６９番目のアミノ酸であるグリシンの欠失変異であることを特徴としている。
【００２１】
本発明にかかるＤＲの発症またはその発症の可能性の判定キットは、上記いずれかのＤＲの発症またはその発症の可能性の判定方法を利用することを特徴としている。
【００２２】
上記ＤＲの発症またはその発症の可能性の判定キットは、プライマー、プローブおよび抗体の中から少なくとも１つを含むことが好ましい。
【００２３】
上記プライマーは、上記変異型Ａｎｇ−１遺伝子の翻訳領域中第８０５〜８０７番目の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーであることが好ましい。
【００２４】
上記プローブは、上記変異型Ａｎｇ−１遺伝子の翻訳領域中第８０５〜８０７番目の塩基を含む領域に結合することが好ましい。
【００２５】
上記抗体は、上記変異型Ａｎｇ−１、または、上記変異型Ａｎｇ−１の第２６９番目のアミノ酸であるグリシンが欠落した正常型アンギオポエチン−１タンパク質（以下、「正常型Ａｎｇ−１」ともいう）のいずれか一方のみを認識することが好ましい。
【００２６】
本発明にかかるＤＲの発症に対する予防方法は、変異型Ａｎｇ−１の第２６９番目のグリシンが欠落した正常型Ａｎｇ−１を有する者に、第２６９番目のアミノ酸としてグリシンを有する変異型Ａｎｇ−１、もしくは当該変異型Ａｎｇ−１をコードするＤＮＡ、または、変異型Ａｎｇ−１がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を補完することを特徴としている。
【００２７】
本発明にかかるＤＲの発症に対する予防薬剤は、糖尿病性網膜症の発症を予防するために用いられる予防薬剤であって、変異型アンギオポエチン−１タンパク質の第２６９番目のグリシンが欠落した正常型アンギオポエチン−１タンパク質有する者を投与対象とし、第２６９番目のアミノ酸としてグリシンを有する変異型アンギオポエチン−１タンパク質、もしくは当該変異型アンギオポエチン−１タンパク質をコードするＤＮＡ、または、当該変異型アンギオポエチン−１タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を主成分とすることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２８】
以上のように、本発明によれば、Ａｎｇ−１遺伝子またはその翻訳産物であるタンパク質を利用して、それらにおける変異の有無を検出することにより、ＤＲの発症またはその発症の可能性を判定することができる。それゆえ、ＤＲの発症またはその発症可能性を簡便に判定することができるという効果を奏する。さらに、変異型Ａｎｇ−１遺伝子もしくはその翻訳産物である変異型Ａｎｇ−１を用いることにより、ＤＲの予防方法や予防薬剤の開発への応用も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明を完成させるのに先立ち、本発明者らは、上記特許文献１に開示されるＡｎｇ−１遺伝子の変異は、Ｔｉｅ−２受容体を介したシグナル伝達に影響を与える可能性があることを独自に導き出した。より具体的に言えば、本発明者らは、Ａｎｇ−１遺伝子の変異が、ＤＲの発症機転の根幹をなす網膜血管構造の安定化および血管の成熟した構築に重大な影響を持つ可能性があることを導き出した。そこで、本発明者らは、Ａｎｇ−１遺伝子の変異がＤＲの発症に関連する因子であるか否かを検討した。
【００３０】
その結果、本発明者らは、Ａｎｇ−１遺伝子のｃＤＮＡとしてＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：Ｕ８３５０５）を有する遺伝子、すなわち、「ＧＧＴ」の３塩基が挿入された遺伝子を有する者がＤＲ患者では、有意に少ないことを明らかにした。つまり、Ａｎｇ−１遺伝子における上記「ＧＧＴ」の挿入変異は、ＤＲ発症の抑制制御因子である可能性を見出した。さらに、上記「ＧＧＴ」の３塩基を有さない、健常者に多い配列を、Ｇｅｎｂａｎｋに、アクセッション番号：ＡＢ０８４４５４として、登録した。このように、本発明者らは、上記の「ＧＧＴ」の３塩基の挿入変異をもつＡｎｇ−１遺伝子が、ＤＲの発症抑制制御因子であることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００３１】
本発明の実施形態について、説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３２】
なお、本明細書において、特に断らない限り、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの各塩基を示す。また、アミノ酸およびアミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。
【００３３】
また、本明細書において、「遺伝子」とは、少なくともゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のポリヌクレオチドを含む意味であり、本発明にかかる遺伝子としては、上記変異型Ａｎｇ−１遺伝子のｃＤＮＡのほか、このｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡや、このｍＲＮＡの鋳型となるゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、上記「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「遺伝子」は、翻訳領域以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やプロモーター配列、ベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００３４】
＜１．アンギオポエチン−１遺伝子およびアンギオポエチン−１タンパク質＞
本明細書において、「Ａｎｇ−１遺伝子」とは、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：ＡＢ０８４４５４）、および塩基配列（アクセッション番号：Ｕ８３５０８）などのように、塩基配列データベース上でアンギオポエチン−１遺伝子として公開されている塩基配列を有する遺伝子の総称である。
【００３５】
一方、本明細書において、「変異型Ａｎｇ−１遺伝子」とは、後述する変異型Ａｎｇ−１をコードする遺伝子である。具体的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシンを持ったタンパク質をコードする遺伝子である。例えば、配列番号２に示される塩基配列を有し、その配列中第８０５〜８０７番目の塩基として「ＧＧＴ」の３塩基を持った遺伝子を例に挙げることができる。上記配列番号２に示される塩基配列は、Ａｎｇ−１遺伝子のｃＤＮＡとしてＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：Ｕ８３５０８）に相当する。また、上記配列番号２中の第８０５〜８０７番目の塩基は、上記Ａｎｇ−１遺伝子のｃＤＮＡとしてＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：Ｕ８３５０８）の第１１１４〜１１１６番目の塩基に相当する。
【００３６】
また、本明細書において、「正常型Ａｎｇ−１遺伝子」とは、後述する正常型Ａｎｇ−１をコードする遺伝子であって、例えば、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：ＡＢ０８４４５４）を有する遺伝子を例に挙げることができる。
【００３７】
さらに、本発明にかかる正常型Ａｎｇ−１遺伝子、および変異型Ａｎｇ−１遺伝子には、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：ＡＢ０８４４５４）、および上記配列番号２に示される塩基配列の一部に、挿入、置換、および／または欠失などの変異が挿入されているポリヌクレオチドであって、正常型Ａｎｇ−１、および変異型Ａｎｇ−１と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が含まれることは言うまでもない。なお、上記変異の数は、１つでも、複数でもよい。さらに、上記配列番号２に示される塩基配列の５’上流および／または３’下流に付加配列を有しているポリヌクレオチドも、本発明にかかる変異型Ａｎｇ−１遺伝子に含まれる。
【００３８】
本明細書において、「Ａｎｇ−１」とは、上記Ａｎｇ−１遺伝子の翻訳産物、および各種データベース上でアンギオポエチンー１としてアミノ酸配列が公開されているタンパク質の総称である。
【００３９】
一方、本明細書において、「変異型Ａｎｇ−１」とは、上記変異型Ａｎｇ−１遺伝子の翻訳産物を指す。例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシンを持ったタンパク質が挙げられる。
【００４０】
また、本明細書において、「正常型Ａｎｇ−１」とは、上記正常型Ａｎｇ−１遺伝子の翻訳産物を指す。例えば、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列中、第２６９番目のグリシンが欠落したタンパク質が挙げられる。
【００４１】
上記正常型Ａｎｇ−１および変異型Ａｎｇ−１は、さらに付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。上記付加的なポリペプチドが付加される場合としては、例えば、Ｈｉｓタグ等によって当該タンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。さらに、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列の一部に、挿入、置換、および／または欠失などの変異が挿入されているタンパク質であって、変異型Ａｎｇ−１と同等の機能を有するタンパク質が、本発明にかかる変異型Ａｎｇ−１に含まれることは言うまでもない。さらに、正常型Ａｎｇ−１についても、同様のことが言える。なお、上記変異の数は、１つでも、複数でもよい。
【００４２】
＜２．ＤＲの発症またはその発症の可能性の判定方法＞
本発明にかかるＤＲの発症またはその発症可能性の判定方法（換言すれば、ＤＲの診断方法）は、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−１をコードするポリヌクレオチド、またはＡｎｇ−１遺伝子における変異の有無を検出する工程を含んでいればよく、その他の構成については特に限定されるものではない。
【００４３】
上記Ａｎｇ−１の変異としては、上記変異型Ａｎｇ−１における第２６９番目のアミノ酸であるグリシンの欠失変異であることが好ましい。例えば、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列における第２６９番目のアミノ酸であるグリシンの欠失変異が挙げられる。
【００４４】
また、上記Ａｎｇ−１をコードするポリヌクレオチドの変異としては、上記変異型Ａｎｇ−１の第２６９番目のアミノ酸であるグリシンをコードする３塩基の欠失変異であることが好ましい。例えば、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列における第２６９番目のアミノ酸であるグリシンをコードする「ＧＧＴ」の３塩基の欠失変異が挙げられる。
【００４５】
さらに、上記Ａｎｇ−１遺伝子の変異としては、変異型Ａｎｇ−１遺伝子の翻訳領域中第８０５〜８０７番目の塩基である「ＧＧＴ」の３塩基の欠失変異であることが好ましい。例えば、上記配列番号２に示される塩基配列における上記塩基配列中第８０５〜８０７番目の塩基である「ＧＧＴ」の３塩基の欠失変異が挙げられる。
【００４６】
本発明にかかるＤＲの発症またはその発症可能性の判定方法の具体的な構成について、以下に詳細に述べる。本発明にかかるＤＲの発症またはその発症可能性の判定方法として、具体的には、（Ａ）ゲノムＤＮＡを用いる方法、（Ｂ）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる方法、（Ｃ）本発明にかかるタンパク質を用いる方法を挙げることができる。以下、これら３種の方法について説明する。
【００４７】
（Ａ）ゲノムＤＮＡを用いる方法
ゲノムＤＮＡを用いる本判定方法は、例えば次のようにして実施できる。
【００４８】
被験者のゲノムは、常法により人体の全ての細胞より得ることが可能であるが、例えば、毛髪、各臓器、末梢リンパ球、滑膜細胞などから得ることができる。また、得られた細胞を培養し、増殖したものから得ることもできる。さらに、末梢血から得ることも可能である。
【００４９】
得られたゲノムは、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法およびＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅して用いることができる。
【００５０】
ゲノム上の変異の有無を検出する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Oligonucleotide Ligation Assay）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＤＲＦＡ法、インベーダー法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法、プライマーオリゴベースエクステンション（Primer Oligo Base Extension）法などが挙げられる。
【００５１】
例えば、ゲノムから、Ａｎｇ−１遺伝子上の上記変異位置を含む領域を増幅後、得られるＰＣＲ産物をサブクローニングし、これをダイレクトシークエンスすることによってゲノム上の変異の有無を検出できる。
【００５２】
また、Ａｎｇ−１遺伝子上の上記変異位置を含む領域をオリゴヌクレオチドプローブに用いることによって、ゲノム上の変異の有無を検出できる。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、上記変異位置を含む領域の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをチップ上に固定してＤＮＡチップを構成し、当該ＤＮＡチップを上記変異の有無の検出用に用いるような場合が挙げられる。この場合、オリゴヌクレオチドプローブの長さとしては、上記変異位置を含む７〜５０ヌクレオチド、あるいは１０〜３０ヌクレオチドが好ましく、１５〜２５ヌクレオチドがより好ましい。
【００５３】
また、ゲノム上の変異の有無は、適当な制限酵素を使用し、切断されるゲノム断片のサイズの違いをサザンブロッティングなどで検出することによっても検出することができる。
【００５４】
このように、ゲノム上の変異を検出することにより、被験者のＤＲの診断（発症またはその発症可能性の判定）を客観的かつ簡便に行うことができる。具体的には、正常型Ａｎｇ−１遺伝子（３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子）がホモで検出された場合は、ＤＲを発症している可能性または将来発症する可能性は高いと判定することができる。一方、変異型Ａｎｇ−１遺伝子（３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子）と正常型Ａｎｇ−１遺伝子とがヘテロで検出されたり、変異型Ａｎｇ−１遺伝子がホモで検出されたりした場合には、ＤＲを発症している可能性または将来発症する可能性が低いと判定することができる。
【００５５】
なお、上記判定方法により使用されるプライマーおよびプローブは、常法により、ＤＮＡシンセサイザーなどにより作製することができる。
【００５６】
（Ｂ）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる方法
ｍＲＮＡを利用する場合、例えば、被験者の細胞より抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを作製し、上記変異位置を含む領域を増幅後、上記と同様、増幅断片の塩基配列を直接シークエンスすることにより、またはＤＮＡチップを用いることにより、あるいはＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法を用いることにより、上記変異の有無を検出できる。
【００５７】
上記変異位置を含む領域の増幅に用いるプライマーとしては、特に限定されるものではないが、例えば、以下のプライマーの組み合わせによりｃＤＮＡを鋳型とした増幅反応が可能である。
センスプライマー１：5’-CCACCAACAACAGTGTCCTT-3’（配列番号３）
センスプライマー２：5’-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3’（配列番号４）
センスプライマー３：5’-GCTGGCAGTACAATGACAG-3’（配列番号５）
アンチセンスプライマー１：5’-TCAAAAATCTAAAGGTCGAAT-3（配列番号６）
アンチセンスプライマー２：5’-CAGCTTGATATACATCTGCACAG-3’（配列番号７）
このように、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）上の変異を検出することにより、上記ゲノムＤＮＡを用いる方法の場合と同様に、被験者のＤＲの診断（発症またはその発症可能性の判定）を簡便に行うことができる。
【００５８】
（Ｃ）タンパク質を用いる方法
被験者の細胞より調製したタンパク質を利用する場合、配列番号１のアミノ酸配列において上記変異位置におけるグリシン挿入の有無を検出する方法が挙げられる。このグリシン挿入の有無の検出は、通常のタンパク質のシークエンス方法に準ずればよいが、例えば、グリシン挿入型タンパク質（変異型Ａｎｇ−１）、またはグリシン欠落型タンパク質（正常型Ａｎｇ−１）のみを認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法で検出する方法、タンパク質を単離し、直接または必要に応じ、酵素等で切断し、プロテインシークエンサーを利用して変異を検出する方法、アミノ酸の等電点の変異を検出する方法および質量分析により質量の差を検出する方法が挙げられ、好ましくは、正常型Ａｎｇ−１または変異型Ａｎｇ−１のいずれか一方のみを認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法で検出する方法が挙げられる。
【００５９】
このように、上記変異位置におけるグリシン挿入の有無を検出することにより、被験者のＤＲの診断（発症またはその発症可能性の判定）を客観的かつ簡便に行うことができる。具体的には、変異型Ａｎｇ−１が検出されなかった場合（換言すれば、正常型Ａｎｇ−１しか検出されなかった場合）は、ＤＲを発症している可能性または将来発症する可能性は高いと判定することができる。一方、両方のタンパク質が検出された場合および特に変異型Ａｎｇ−１のみが検出された場合は、ＤＲを発症している可能性または将来発症する可能性は低いと判定することができる。
【００６０】
なお、上記タンパク質の調製方法は、特に限定されず、被験者のあらゆる組織、細胞などから従来公知の方法で調製することができる。特に、Ａｎｇ−１の発現量が多い組織から調製することが好ましい。
【００６１】
また、上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれの方法においても、上記被験者は、特に限定されるものではないが、糖尿病を発症している者、またはＤＲを発症している者が好ましい。
【００６２】
さらに、本発明にかかるＤＲの発症またはその発症の可能性の判定方法が適用されるサンプルは、人体等の生体から分離された試料であればよく、上記例示されたものに限定されるものではない。
【００６３】
＜３．ＤＲの発症またはその発症可能性の判定キット＞
本発明にかかるＤＲの発症またはその発症可能性の判定キット（換言すれば、ＤＲの診断キット）は、上記の変異を検出できる試薬を少なくとも含んでいればよく、その他の構成は特に限定されるものではない。上記の変異を検出できる試薬としては、例えば、プライマー、プローブ、および抗体などを挙げることができる。これらの試薬は、単独で含まれてもよく、また、複数の組み合わせで含まれていてもよい。さらに、上記判定キットは、上記例示する試薬に加えて、その他の試薬を組み合わせることによっても得ることができる。
【００６４】
具体的には、ゲノム上およびｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）上の変異の有無を検出するキットとしては、上記変異位置を含む領域を増幅できるように設計されたプライマーを含み、さらに、上記変異の有無を検出できるように設計されたプローブ、制限酵素、マクサムギルバート法およびサンガー法などの塩基配列決定法に利用される試薬など、変異を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせたキットが挙げられる。なお、かかる試薬は、採用される検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素、ＲＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、変異の検出の妨げとならない適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
【００６５】
プライマーを含むキットの場合、プライマーは、上記変異位置を含む領域を増幅できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば上記配列番号３〜７に示されるプライマーから選択して用いることができる。
【００６６】
また、プローブを含むキットの場合、プローブは、上記変異位置を含む領域に結合できるものであれば、特に限定されるものではない。
【００６７】
さらに、タンパク質上の変異の有無を検出するキットとしては、例えば正常型Ａｎｇ−１または変異型Ａｎｇ−１のいずれか一方のみを認識する抗体を含むキットなどが挙げられる。
【００６８】
これらの判定キットを使用することにより、上記＜２．ＤＲの発症またはその発症の可能性の判定方法＞の項で述べたように、ＤＲの診断（発症またはその発症可能性の判定）を客観的かつ簡便に行うことができる
また、本発明にかかるＤＲの発症またはその発症可能性の判定キットが適用される被験者は特に限定されるものではないが、糖尿病を発症している者、またはＤＲを発症している者が好ましい。
【００６９】
＜４．ＤＲの発症の予防方法および予防薬剤＞
上述したように、正常型Ａｎｇ−１は、ＤＲの発症の一要因となるタンパク質である。一方、正常型Ａｎｇ−１に１アミノ酸の挿入変異がある、すなわち、上述のグリシンが挿入された変異型Ａｎｇ−１は、ＤＲの発症を抑制する効果をもつ。したがって、上記グリシンが挿入された変異型Ａｎｇ−１を、正常型Ａｎｇ−１を有する者に補完することは、ＤＲの発症に対する予防方法として有効であると考えられる。そこで、本発明は、（Ａ）ＤＲの発症に対する予防方法、または（Ｂ）ＤＲの発症に対する予防薬剤に用いてもよい。
【００７０】
（Ａ）ＤＲの発症に対する予防方法
本発明にかかるＤＲの発症に対する予防方法は、正常型Ａｎｇ−１を有する者に、変異型Ａｎｇ−１または当該変異型Ａｎｇ−１をコードするＤＮＡ、あるいは、当該変異型Ａｎｇ−１がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を補完するＤＲの発症に対する予防方法であることが好ましい。
【００７１】
（Ｂ）ＤＲの発症に対する予防薬剤
本発明にかかるＤＲの発症に対する予防薬剤は、上記正常型Ａｎｇ−１を有する者において、ＤＲの発症を予防するために用いられる予防薬剤であって、変異型Ａｎｇ−１または当該変異型Ａｎｇ−１をコードするＤＮＡ、あるいは、当該変異型Ａｎｇ−１がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を主成分とするＤＲの発症に対する予防薬剤であることが好ましい。
【００７２】
上記のＤＲの発症に対する予防方法および予防薬剤では、変異型Ａｎｇ−１の補完方法は特に限定されるものではない。例えば、公知のタンパク質発現系や遺伝子導入方法などを用いることができる。具体的には、哺乳細胞にタンパク質を発現させる場合に用いる発現ベクターやウイルスベクターなどを用いた方法が挙げられる。
【００７３】
また、上記レセプタータンパク質としては、例えば、Ｔｉｅ−２受容体が挙げられる。Ａｎｇ−１がＴｉｅ−２受容体のリガンドであることは、例えば、非特許文献２などに開示されている。したがって、このＴｉｅ−２受容体のアゴニストとして作用する低分子化合物を経口または静注などによって体内に投与することは、ＤＲの発症に対する予防方法として有効であると考えられる。なお、ここでいう低分子化合物とは、ペプチドなどのタンパク質をも含むものである。
【００７４】
また、変異型Ａｎｇ−１または当該変異型Ａｎｇ−１をコードするＤＮＡと、上記レセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物とは、予防薬剤として択一的に使用されるだけでなく、組み合わせて使用することも可能である。
【００７５】
また、本発明にかかるＤＲの発症に対する予防方法もしくは予防薬剤が適用される被験者は特に限定されるものではないが、糖尿病を発症している者が好ましい。
【００７６】
なお本発明は、以上例示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術範囲に含まれる。
【実施例】
【００７７】
本発明について、実施例および図１〜５に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。なお、以下の実施例におけるＤＲ関連遺伝子における変異の有無は次のようにして評価した。
【００７８】
〔Ａｎｇ−１遺伝子における変異の有無の評価方法〕
（１）配列分析
被験者の末梢血を、公知の方法によりＥＤＴＡ採血した。採血した上記末梢血からRNA isolation kit （GENTRA SYSTEMS, MN）を用いて、トータルＲＮＡを単離した。単離した上記トータルＲＮＡから公知の方法により、Oligo dTプライマーによる逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。そして、Ａｎｇ−１遺伝子のエクソン４から５にかけて設定したプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅断片を得た。なお、上記の反応に使用したプライマーは、以下に示すとおりである。
センスプライマーＦ２−２：5’-CCACCAACAACAGTGTCCTT-3’（配列番号３）
センスプライマーＦ２−４：5’-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3’（配列番号４）
アンチセンスプライマーＲ１１８６：5’-CAGCTTGATATACATCTGCACAG-3’（配列番号７）
また、上記センスプライマーＦ２−２およびＦ２−４、ならびに上記アンチセンスプライマーＲ１１８６の設定位置については、図１に示すとおりである。
【００７９】
さらに、上記ＲＴ−ＰＣＲにおける増幅条件は以下の通りである。まず、上記合成ｃＤＮＡを鋳型に、上記センスプライマーＦ２−２およびアンチセンスプライマーＲ１１８６をプライマーに用いて、ＲＴ−ＰＣＲによる断片増幅を行った。
【００８０】
上記ＲＴ−ＰＣＲにおける反応液は、ｃＤＮＡ、１×ＰＣＲ−Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Applied Biosystems）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ、２００ｎＭ のそれぞれのプライマー、２．５ＵのAmpliTaq Gold DNA-Polymerase （Applied Biosystems）を含むように調製した。
【００８１】
さらに、上記ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、９５℃で１２分の行程を１サイクル、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒および７２℃で１分の行程を３０サイクルとした。
【００８２】
以上の条件によりＲＴ−ＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ産物１μｌを鋳型とし、プライマーに上記センスプライマーＦ２−４およびアンチセンスプライマーＲ１１８６を用いて、上記の反応液組成および反応条件でＰＣＲを行い、増幅断片を得た。
【００８３】
その結果、得られた増幅断片をエタノール沈殿により精製した。次に、上記センスプライマーＦ２−４とBigDye Terminator(Applied Biosystems, CA）とを用いたダイターミネーター法によって、精製した増幅断片から配列分析用の試料を調製した。その後、蛍光ＤＮＡシークエンサー（ABI377、Applied Biosystems）にて、その試料の配列分析を行った。配列解析により決定した上記増幅断片の配列を、配列番号１に示される変異型Ａｎｇ−１遺伝子の配列と比較することにより、Ａｎｇ−１遺伝子における変異の有無を評価することとした（図２右側上段、中段を参照）。塩基番号８０５からシークエンスフェログラム（波形シグナル）の重複が認められる場合、変異型Ａｎｇ−１遺伝子と正常型Ａｎｇ−１遺伝子とがヘテロで存在すると判定することとした（図２右側下段を参照）。
【００８４】
なお、図２中、「−／−」、「ｍｔ／ｍｔ」、および「ｍｔ／−」は、それぞれ、正常型Ａｎｇ−１遺伝子がホモで検出された場合、変異型Ａｎｇ−１遺伝子がホモで検出された場合、および正常型Ａｎｇ−１遺伝子と変異型Ａｎｇ−１遺伝子とがヘテロで検出された場合を意味する。
【００８５】
（２）鎖長分析
上記の配列分析の場合と同様の方法で増幅断片を得た。ただし、鎖長分析では、上記センスプライマーＦ２−４はＴＥＴ蛍光標識したものを用いた。最終ＰＣＲ反応産物を１０倍に希釈した上記増幅断片を含む溶液を用いて、鎖長分析を行った。鎖長分析は上記の希釈された増幅断片を含む溶液を１μｌ、５ｍｇ／ｍｌ Blue Dextran、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、分子量マーカーＧＳ５００ ＴＡＭＲＡ（Applied Biosystems）０．３μｌを含むホルムアミド液３μｌを試料とし、蛍光ＤＮＡシークエンサーを用いて行った。
【００８６】
鎖長分析では、１０１塩基もしくは９８塩基のピークのいずれが出現するかにより、Ａｎｇ−１遺伝子における変異の有無を判定することとした（図２左側上段、中段を参照）。また、１０１塩基と９８塩基との両方のピークが出現する場合には、ヘテロであると判定することとした（図２左側下段を参照）。
【００８７】
〔実施例１〕
ＤＲ患者から上記の方法で採血した末梢血を用いて、上記の配列分析および鎖長分析を行った。図３は、上記変異位置を含む領域のシークエンス解析結果を示している。図３に示すように、Ａｎｇ−１遺伝子においては、３塩基挿入型および３塩基欠失型の２種類が存在することが見出された。なお、同図（左）が３塩基挿入型の解析結果であり、同図（右）が３塩基欠失型の解析結果である。つまり、３塩基挿入型では、「ＧＧＴ」の３塩基挿入が生じていることが確認でき（図３（左）を参照）、３塩基欠失型では、この３塩基が欠失していることが確認できた（図３（右）を参照）。
【００８８】
なお、配列番号２には、このうち３塩基挿入型の遺伝子配列が示されている。この３塩基挿入型では、配列番号２に示されるように、その配列中第８０５〜８０７番目の塩基として「ＧＧＴ」の３塩基が挿入されている。
【００８９】
また、上記３塩基挿入型遺伝子の翻訳産物であるタンパク質は、配列番号１に示されるように、そのアミノ酸配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシンが挿入されている。一方、上記３塩基欠失型遺伝子の翻訳産物であるタンパク質においては、この第２６９番目のグリシンが欠落している。
【００９０】
〔実施例２〕
ＲＡ患者、ＤＲ患者、および健常者から採血した末梢血を用いて、上記方法により、Ａｎｇ−１遺伝子における上記３塩基挿入変異の有無を検出した結果を図４に示す。
【００９１】
なお、図４において、ｎは各種被験者の全体数を示し、正常型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する者（図中および以下、「−／−」と示す）、正常型Ａｎｇ−１遺伝子と変異型Ａｎｇ−１遺伝子とをヘテロで有する者（図中および以下、「ｍｔ／−」と示す）、変異型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する者（図中および以下、「ｍｔ／ｍｔ」と示す）の数をそれぞれの欄に示している。さらに、括弧内には、各種被験者における上記それぞれの者の割合を示す。
【００９２】
図４に示すように、健常者では、「−／−」は１１．９％、「ｍｔ／−」は７８．０％、「ｍｔ／ｍｔ」は１０．１％であった。ＲＡ患者では、「−／−」は５．１％、「ｍｔ／−」は７９．０％、「ｍｔ／ｍｔ」は２４．５％であった。また、ＤＲ患者では、「−／−」は２５．８％、「ｍｔ／−」は３６．５％、「ｍｔ／ｍｔ」は３７．９％であった。さらに、変異型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する者について、健常者群と、ＲＡ患者群およびＤＲ患者群との間の有意差をカイ２乗検定により解析した。その結果、健常者群とＲＡ患者群との間のＰ値は、１０−２、健常者群とＤＲ患者群との間のＰ値は、１０−４であった。すなわち、ＤＲ患者において、正常型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する者が有意に多かった。
【００９３】
〔実施例３〕
ＤＲ患者について、年齢、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、空腹時血糖（ＦＢＳ）、総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ）／ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、および糖尿病発病後の年数を調べた。なお、ＨｂＡ１ｃ、ＦＢＳ、Ｔ−Ｃｈｏ、およびＨＤＬ−Ｃは、空腹時採血サンプルを用いて、定法に従い、測定した。その結果、各測定項目とも、Ａｎｇ−１遺伝子の変異の有無による相違は見られなかった。
【００９４】
なお、図５において、正常型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する者（図中および以下、「−／−」と示す）、正常型Ａｎｇ−１遺伝子と変異型Ａｎｇ−１遺伝子とをヘテロで有する者（図中および以下、「ｍｔ／−」と示す）、変異型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する者（図中および以下、「ｍｔ／ｍｔ」と示す）のうち、上記各種測定項目の測定結果をそれぞれの欄に示している。
【００９５】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
以上のように、本発明では、Ａｎｇ−１、もしくはＡｎｇ−１遺伝子における変異を検出することにより、ＤＲの発症の可能性を予測することができる。それゆえ、ＤＲの発症またはその発症可能性の判定方法や判定キットに代表される診断医療の分野だけでなく、保健医学分野に広く利用することができる。さらには、変異型Ａｎｇ−１、もしくは変異型Ａｎｇ−１遺伝子を用いることにより、ＤＲの発症の予防方法や予防薬剤に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本発明にかかるＡｎｇ−１遺伝子のｃＤＮＡの一部を模式的に示した概略図である。
【図２】本実施例において、Ａｎｇ−１遺伝子の３塩基欠失変異位置を含む領域の配列解析および鎖長解析を行った結果を示す図である。
【図３】本実施例において、Ａｎｇ−１遺伝子の３塩基挿入変異位置を含む領域のシークエンス解析を行った結果を示す図である。
【図４】本実施例において、ＲＡ患者、ＤＲ患者、および健常者において、Ａｎｇ−１遺伝子における３塩基欠失変異の有無の検出を行った結果を示す表である。
【図５】本実施例において、ＤＲ患者について、年齢、ＨｂＡ１ｃ、ＦＢＳ、Ｔ−Ｃｈｏ／ＨＤＬ−Ｃ、および糖尿病発病後の年数を調べた結果を示す表である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病性網膜症の診断および予防に関するものであって、特に、アンギオポエチン−１遺伝子またはその翻訳産物たるタンパク質を用いた糖尿病性網膜症の診断および予防に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病性網膜症（diabetic retinopathy、以下「ＤＲ」ともいう）は、糖尿病性腎症、および糖尿病性神経障害と並ぶ糖尿病の３大合併症であり、発症頻度も高く、重大な慢性疾患である。
【０００３】
糖尿病患者の血液は、糖分を多く含み粘性が高いため、網膜の毛細血管を詰まらせたり、血管壁に負担をかけたりする結果、網膜に必要な酸素や栄養が不足する。ＤＲは、その結果起こる疾患であり、眼底出血や硝子体出血などの症状を示す。糖尿病性網膜症は進行過程に従って、単純型ＤＲ、前増殖型ＤＲ、および増殖型ＤＲの３段階に分けることができる。
【０００４】
単純型ＤＲは、ＤＲの初期の段階である。この段階では、網膜に酸素を送る毛細血管に毛細血管瘤やしみ状出血が見られる。また、タンパク質などが網膜に溜まって、硬性白斑ができたりすることがある。
【０００５】
前増殖型ＤＲは、単純型ＤＲが進行した段階である。この段階では、白斑の数が増え、毛細血管が部分的に塞がれるという症状が見られる。
【０００６】
増殖型ＤＲは、前増殖型ＤＲがさらに進行した段階である。網膜の毛細血管が塞がれて、網膜に送られる酸素が不足してしまうため、これを補うために新しい新生血管が現れる。しかし、新生血管はもろいため、出血をおこしやすく、また、網膜剥離を起こしたり、さらに進行したりすると失明に至る場合もある。
【０００７】
ＤＲでは、単純型ＤＲの場合、網膜の中心部に出血、浮腫が起きなければ目立った自覚症状はなく、自覚症状が現れたときには既に失明の危機にひんした状態（増殖型ＤＲの状態）であることがほとんどである。また、ＤＲは、我が国の成人の失明原因の第１位でもある。したがって、ＤＲ患者は身体的にも精神的にも大きな苦痛を生涯に亘って背負うことになる。
【０００８】
ＤＲの診断は、主に、眼底の検査により行われる。具体的には、（１）眼球に光を当てて、レンズを通して瞳孔から眼球の内部を観察し、網膜の異常の有無を検査する「眼底検査」や、（２）静脈から色素を注射しながら眼底を調べる「蛍光眼底造影」などにより行われる。
【０００９】
また、ＤＲの治療は、通常、病態の病状の進行過程によって選択すべき治療手段が異なる。例えば、上記単純型ＤＲの場合、血管強化薬の投与や、抗血小板療法を含め、内科的に血糖をコントロールする治療方法や、薬物により網膜の変化を抑える治療方法が採られる。一方、前増殖型ＤＲや増殖型ＤＲの段階になると、レーザー光線の熱で網膜を焼くことによって、血管の新生を抑える「網膜光凝固療法」が採られる。さらに、増殖型ＤＲの段階で、硝子体出血や網膜剥離の症状が見られると、硝子体手術を行う場合がある。しかし、硝子体手術は合併症を引き起こすことが多く、術後の経過が悪いことがある。
【００１０】
ところで、ＤＲの発症機序は、近年の研究で徐々に明らかにされつつある。具体的には、ＤＲは、まず、白血球が網膜血管系に付着し、これに続いて血管内皮細胞の障害と血液網膜関門(blood-retinal barrier)の破壊とが起こることにより発症することが明らかにされた。また、糖尿病発症ラットを用いた実験で、この過程を阻止する因子としてアンギオポエチン−１（Angiopoietin-1、以下、「Ａｎｇ−１」ともいう）の有用性が報告された（非特許文献１を参照）。
【００１１】
Ａｎｇ−１の主な作用には、血管内皮増殖因子（vascular endotherial growth factor、以下「ＶＥＧＦ」ともいう）によって誘導された新生血管の裏打ち、新生血管の造成を促進する作用、および血管周囲平滑筋の造成促進作用がある。Ａｎｇ−１は、血管内皮上の血管新生関連チロシンキナーゼ型受容体であるＴｉｅ−２（tyrosine kinase with immunoglobulin and endothelial growth factor homology domains）受容体に作用して、インテグリンを介したフィブロネクチンへの接着を促進する。また、この一連の細胞内シグナル伝達の過程でＡｎｇ−１は、血管内皮細胞の遊走を促進し、同時に血管内皮細胞の細胞死を抑制することによって、生存効果を上げることが明らかになっている（非特許文献２を参照）。
【００１２】
一方、本発明者らは、Ａｎｇ−１遺伝子における変異が、関節リウマチ（rheumatoid arthritis、以下「ＲＡ」ともいう）の発症との因果関係が認められることを明らかにしている（特許文献１を参照）。特許文献１では、ＲＡ患者集団において、Ａｎｇ−１遺伝子における下記の変異が有意に多いことが示されている。
【００１３】
上記Ａｎｇ−１遺伝子における変異は、Ａｎｇ−１遺伝子のｃＤＮＡとしてＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：ＡＢ０８４４５４）の第８０４番目の塩基と第８０５番目の塩基の間に、「ＧＧＴ」というグリシンをコードする３塩基が挿入された変異（ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：Ｕ８３５０５））であった。上記のＡｎｇ−１遺伝子における変異の位置は、Ａｎｇ−１分子内に存在するｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインとｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ−ｌｉｋｅドメインとの中間に存在するものであった。
【特許文献１】特開２００３−２０４７９０公報（平成１５（２００３）年７月２２日公開）
【非特許文献１】Antonia M. Joussen et al., Suppression of diabetic retinopathy with Angiopoetin-1, American journal of pathology, 160, 1683-1693 (2003)
【非特許文献２】Christopher D. Kontos et al., Tyrosine 1101 of Tie2 is the major site of association of p85 and is required for activation of phosphatidylinositol 3-kinase and Akt, Molecular and Cellular Biology, 18, 4131-4140 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ＤＲは、上述したように、最終的に重篤な症状を引き起こす疾患であるが、発症初期段階では、自覚症状がないため、早期発見が困難である。また、ＤＲの診断も、眼底の検査という主観的に診断する方法によるものが主流であった。したがって、現在、ＤＲの発症について、客観的にかつ正確に診断できる技術、または、将来的にＤＲを発症する可能性を診断できる技術の確立が強く望まれている。
【００１５】
上記の客観的にＤＲの発症、または将来的に発症する可能性を診断する方法としては、分子生物学的手法を用いた診断方法が有効な診断方法の１つと考えられる。しかしながら、非特許文献１に示されるように、ＤＲの発症と因果関係のある遺伝子の報告はあるものの、ＤＲの発症との因果関係が明らかとされた遺伝子の異常（変異）はこれまでに全く知られていない。そのため、分子生物学的手法を用いたＤＲの発症、または将来的に発症する可能性を早期に診断する技術を確立するには至っていない。
【００１６】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、発症早期にＤＲの発症またはその発症可能性を判定（診断）する方法、およびその判定（診断）キット、並びにＤＲ発症に対する有効な予防方法および予防薬剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＤＲの発症と因果関係がある遺伝子の変異を独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
すなわち、本発明にかかるＤＲの発症またはその発症の可能性の判定方法は、生体から分離された試料を用いて、糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性を判定する方法であって、アンギオポエチン−１タンパク質（以下、「Ａｎｇ−１」ともいう）をコードするポリヌクレオチドにおける変異の有無を検出する工程を含み、かつ、上記変異が、変異型アンギオポエチン−１タンパク質（以下、「変異型Ａｎｇ−１」ともいう）の第２６９番目のアミノ酸であるグリシンをコードする３塩基の欠失変異であることを特徴としている。
【００１９】
また、本発明にかかるＤＲの発症またはその発症の可能性の判定方法は、生体から分離された試料を用いて、糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性を判定する方法であって、アンギオポエチン−１遺伝子（以下、「Ａｎｇ−１遺伝子」ともいう）における変異の有無を検出する工程を含み、かつ、上記変異が、変異型アンギオポエチン−１遺伝子（以下、「変異型Ａｎｇ−１遺伝子」ともいう）の翻訳領域中第８０５〜８０７番目の塩基である「ＧＧＴ」（ＧおよびＴは、それぞれ、グアニンおよびチミンを表す）の３塩基の欠失変異であることを特徴としている。
【００２０】
さらに、本発明にかかるＤＲの発症またはその発症の可能性の判定方法は、生体から分離された試料を用いて、糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性を判定する方法であって、Ａｎｇ−１における変異の有無を検出する工程を含み、かつ、上記変異が、変異型Ａｎｇ−１の第２６９番目のアミノ酸であるグリシンの欠失変異であることを特徴としている。
【００２１】
本発明にかかるＤＲの発症またはその発症の可能性の判定キットは、上記いずれかのＤＲの発症またはその発症の可能性の判定方法を利用することを特徴としている。
【００２２】
上記ＤＲの発症またはその発症の可能性の判定キットは、プライマー、プローブおよび抗体の中から少なくとも１つを含むことが好ましい。
【００２３】
上記プライマーは、上記変異型Ａｎｇ−１遺伝子の翻訳領域中第８０５〜８０７番目の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーであることが好ましい。
【００２４】
上記プローブは、上記変異型Ａｎｇ−１遺伝子の翻訳領域中第８０５〜８０７番目の塩基を含む領域に結合することが好ましい。
【００２５】
上記抗体は、上記変異型Ａｎｇ−１、または、上記変異型Ａｎｇ−１の第２６９番目のアミノ酸であるグリシンが欠落した正常型アンギオポエチン−１タンパク質（以下、「正常型Ａｎｇ−１」ともいう）のいずれか一方のみを認識することが好ましい。
【００２６】
本発明にかかるＤＲの発症に対する予防方法は、変異型Ａｎｇ−１の第２６９番目のグリシンが欠落した正常型Ａｎｇ−１を有する者に、第２６９番目のアミノ酸としてグリシンを有する変異型Ａｎｇ−１、もしくは当該変異型Ａｎｇ−１をコードするＤＮＡ、または、変異型Ａｎｇ−１がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を補完することを特徴としている。
【００２７】
本発明にかかるＤＲの発症に対する予防薬剤は、糖尿病性網膜症の発症を予防するために用いられる予防薬剤であって、変異型アンギオポエチン−１タンパク質の第２６９番目のグリシンが欠落した正常型アンギオポエチン−１タンパク質有する者を投与対象とし、第２６９番目のアミノ酸としてグリシンを有する変異型アンギオポエチン−１タンパク質、もしくは当該変異型アンギオポエチン−１タンパク質をコードするＤＮＡ、または、当該変異型アンギオポエチン−１タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を主成分とすることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２８】
以上のように、本発明によれば、Ａｎｇ−１遺伝子またはその翻訳産物であるタンパク質を利用して、それらにおける変異の有無を検出することにより、ＤＲの発症またはその発症の可能性を判定することができる。それゆえ、ＤＲの発症またはその発症可能性を簡便に判定することができるという効果を奏する。さらに、変異型Ａｎｇ−１遺伝子もしくはその翻訳産物である変異型Ａｎｇ−１を用いることにより、ＤＲの予防方法や予防薬剤の開発への応用も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明を完成させるのに先立ち、本発明者らは、上記特許文献１に開示されるＡｎｇ−１遺伝子の変異は、Ｔｉｅ−２受容体を介したシグナル伝達に影響を与える可能性があることを独自に導き出した。より具体的に言えば、本発明者らは、Ａｎｇ−１遺伝子の変異が、ＤＲの発症機転の根幹をなす網膜血管構造の安定化および血管の成熟した構築に重大な影響を持つ可能性があることを導き出した。そこで、本発明者らは、Ａｎｇ−１遺伝子の変異がＤＲの発症に関連する因子であるか否かを検討した。
【００３０】
その結果、本発明者らは、Ａｎｇ−１遺伝子のｃＤＮＡとしてＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：Ｕ８３５０５）を有する遺伝子、すなわち、「ＧＧＴ」の３塩基が挿入された遺伝子を有する者がＤＲ患者では、有意に少ないことを明らかにした。つまり、Ａｎｇ−１遺伝子における上記「ＧＧＴ」の挿入変異は、ＤＲ発症の抑制制御因子である可能性を見出した。さらに、上記「ＧＧＴ」の３塩基を有さない、健常者に多い配列を、Ｇｅｎｂａｎｋに、アクセッション番号：ＡＢ０８４４５４として、登録した。このように、本発明者らは、上記の「ＧＧＴ」の３塩基の挿入変異をもつＡｎｇ−１遺伝子が、ＤＲの発症抑制制御因子であることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００３１】
本発明の実施形態について、説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３２】
なお、本明細書において、特に断らない限り、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの各塩基を示す。また、アミノ酸およびアミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。
【００３３】
また、本明細書において、「遺伝子」とは、少なくともゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のポリヌクレオチドを含む意味であり、本発明にかかる遺伝子としては、上記変異型Ａｎｇ−１遺伝子のｃＤＮＡのほか、このｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡや、このｍＲＮＡの鋳型となるゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、上記「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「遺伝子」は、翻訳領域以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やプロモーター配列、ベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００３４】
＜１．アンギオポエチン−１遺伝子およびアンギオポエチン−１タンパク質＞
本明細書において、「Ａｎｇ−１遺伝子」とは、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：ＡＢ０８４４５４）、および塩基配列（アクセッション番号：Ｕ８３５０８）などのように、塩基配列データベース上でアンギオポエチン−１遺伝子として公開されている塩基配列を有する遺伝子の総称である。
【００３５】
一方、本明細書において、「変異型Ａｎｇ−１遺伝子」とは、後述する変異型Ａｎｇ−１をコードする遺伝子である。具体的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシンを持ったタンパク質をコードする遺伝子である。例えば、配列番号２に示される塩基配列を有し、その配列中第８０５〜８０７番目の塩基として「ＧＧＴ」の３塩基を持った遺伝子を例に挙げることができる。上記配列番号２に示される塩基配列は、Ａｎｇ−１遺伝子のｃＤＮＡとしてＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：Ｕ８３５０８）に相当する。また、上記配列番号２中の第８０５〜８０７番目の塩基は、上記Ａｎｇ−１遺伝子のｃＤＮＡとしてＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：Ｕ８３５０８）の第１１１４〜１１１６番目の塩基に相当する。
【００３６】
また、本明細書において、「正常型Ａｎｇ−１遺伝子」とは、後述する正常型Ａｎｇ−１をコードする遺伝子であって、例えば、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：ＡＢ０８４４５４）を有する遺伝子を例に挙げることができる。
【００３７】
さらに、本発明にかかる正常型Ａｎｇ−１遺伝子、および変異型Ａｎｇ−１遺伝子には、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（アクセッション番号：ＡＢ０８４４５４）、および上記配列番号２に示される塩基配列の一部に、挿入、置換、および／または欠失などの変異が挿入されているポリヌクレオチドであって、正常型Ａｎｇ−１、および変異型Ａｎｇ−１と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が含まれることは言うまでもない。なお、上記変異の数は、１つでも、複数でもよい。さらに、上記配列番号２に示される塩基配列の５’上流および／または３’下流に付加配列を有しているポリヌクレオチドも、本発明にかかる変異型Ａｎｇ−１遺伝子に含まれる。
【００３８】
本明細書において、「Ａｎｇ−１」とは、上記Ａｎｇ−１遺伝子の翻訳産物、および各種データベース上でアンギオポエチンー１としてアミノ酸配列が公開されているタンパク質の総称である。
【００３９】
一方、本明細書において、「変異型Ａｎｇ−１」とは、上記変異型Ａｎｇ−１遺伝子の翻訳産物を指す。例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、その配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシンを持ったタンパク質が挙げられる。
【００４０】
また、本明細書において、「正常型Ａｎｇ−１」とは、上記正常型Ａｎｇ−１遺伝子の翻訳産物を指す。例えば、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列中、第２６９番目のグリシンが欠落したタンパク質が挙げられる。
【００４１】
上記正常型Ａｎｇ−１および変異型Ａｎｇ−１は、さらに付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。上記付加的なポリペプチドが付加される場合としては、例えば、Ｈｉｓタグ等によって当該タンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。さらに、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列の一部に、挿入、置換、および／または欠失などの変異が挿入されているタンパク質であって、変異型Ａｎｇ−１と同等の機能を有するタンパク質が、本発明にかかる変異型Ａｎｇ−１に含まれることは言うまでもない。さらに、正常型Ａｎｇ−１についても、同様のことが言える。なお、上記変異の数は、１つでも、複数でもよい。
【００４２】
＜２．ＤＲの発症またはその発症の可能性の判定方法＞
本発明にかかるＤＲの発症またはその発症可能性の判定方法（換言すれば、ＤＲの診断方法）は、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−１をコードするポリヌクレオチド、またはＡｎｇ−１遺伝子における変異の有無を検出する工程を含んでいればよく、その他の構成については特に限定されるものではない。
【００４３】
上記Ａｎｇ−１の変異としては、上記変異型Ａｎｇ−１における第２６９番目のアミノ酸であるグリシンの欠失変異であることが好ましい。例えば、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列における第２６９番目のアミノ酸であるグリシンの欠失変異が挙げられる。
【００４４】
また、上記Ａｎｇ−１をコードするポリヌクレオチドの変異としては、上記変異型Ａｎｇ−１の第２６９番目のアミノ酸であるグリシンをコードする３塩基の欠失変異であることが好ましい。例えば、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列における第２６９番目のアミノ酸であるグリシンをコードする「ＧＧＴ」の３塩基の欠失変異が挙げられる。
【００４５】
さらに、上記Ａｎｇ−１遺伝子の変異としては、変異型Ａｎｇ−１遺伝子の翻訳領域中第８０５〜８０７番目の塩基である「ＧＧＴ」の３塩基の欠失変異であることが好ましい。例えば、上記配列番号２に示される塩基配列における上記塩基配列中第８０５〜８０７番目の塩基である「ＧＧＴ」の３塩基の欠失変異が挙げられる。
【００４６】
本発明にかかるＤＲの発症またはその発症可能性の判定方法の具体的な構成について、以下に詳細に述べる。本発明にかかるＤＲの発症またはその発症可能性の判定方法として、具体的には、（Ａ）ゲノムＤＮＡを用いる方法、（Ｂ）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる方法、（Ｃ）本発明にかかるタンパク質を用いる方法を挙げることができる。以下、これら３種の方法について説明する。
【００４７】
（Ａ）ゲノムＤＮＡを用いる方法
ゲノムＤＮＡを用いる本判定方法は、例えば次のようにして実施できる。
【００４８】
被験者のゲノムは、常法により人体の全ての細胞より得ることが可能であるが、例えば、毛髪、各臓器、末梢リンパ球、滑膜細胞などから得ることができる。また、得られた細胞を培養し、増殖したものから得ることもできる。さらに、末梢血から得ることも可能である。
【００４９】
得られたゲノムは、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法およびＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅して用いることができる。
【００５０】
ゲノム上の変異の有無を検出する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Oligonucleotide Ligation Assay）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＤＲＦＡ法、インベーダー法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法、プライマーオリゴベースエクステンション（Primer Oligo Base Extension）法などが挙げられる。
【００５１】
例えば、ゲノムから、Ａｎｇ−１遺伝子上の上記変異位置を含む領域を増幅後、得られるＰＣＲ産物をサブクローニングし、これをダイレクトシークエンスすることによってゲノム上の変異の有無を検出できる。
【００５２】
また、Ａｎｇ−１遺伝子上の上記変異位置を含む領域をオリゴヌクレオチドプローブに用いることによって、ゲノム上の変異の有無を検出できる。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、上記変異位置を含む領域の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをチップ上に固定してＤＮＡチップを構成し、当該ＤＮＡチップを上記変異の有無の検出用に用いるような場合が挙げられる。この場合、オリゴヌクレオチドプローブの長さとしては、上記変異位置を含む７〜５０ヌクレオチド、あるいは１０〜３０ヌクレオチドが好ましく、１５〜２５ヌクレオチドがより好ましい。
【００５３】
また、ゲノム上の変異の有無は、適当な制限酵素を使用し、切断されるゲノム断片のサイズの違いをサザンブロッティングなどで検出することによっても検出することができる。
【００５４】
このように、ゲノム上の変異を検出することにより、被験者のＤＲの診断（発症またはその発症可能性の判定）を客観的かつ簡便に行うことができる。具体的には、正常型Ａｎｇ−１遺伝子（３塩基欠失型Ａｎｇ−１遺伝子）がホモで検出された場合は、ＤＲを発症している可能性または将来発症する可能性は高いと判定することができる。一方、変異型Ａｎｇ−１遺伝子（３塩基挿入型Ａｎｇ−１遺伝子）と正常型Ａｎｇ−１遺伝子とがヘテロで検出されたり、変異型Ａｎｇ−１遺伝子がホモで検出されたりした場合には、ＤＲを発症している可能性または将来発症する可能性が低いと判定することができる。
【００５５】
なお、上記判定方法により使用されるプライマーおよびプローブは、常法により、ＤＮＡシンセサイザーなどにより作製することができる。
【００５６】
（Ｂ）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる方法
ｍＲＮＡを利用する場合、例えば、被験者の細胞より抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを作製し、上記変異位置を含む領域を増幅後、上記と同様、増幅断片の塩基配列を直接シークエンスすることにより、またはＤＮＡチップを用いることにより、あるいはＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法を用いることにより、上記変異の有無を検出できる。
【００５７】
上記変異位置を含む領域の増幅に用いるプライマーとしては、特に限定されるものではないが、例えば、以下のプライマーの組み合わせによりｃＤＮＡを鋳型とした増幅反応が可能である。
センスプライマー１：5’-CCACCAACAACAGTGTCCTT-3’（配列番号３）
センスプライマー２：5’-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3’（配列番号４）
センスプライマー３：5’-GCTGGCAGTACAATGACAG-3’（配列番号５）
アンチセンスプライマー１：5’-TCAAAAATCTAAAGGTCGAAT-3（配列番号６）
アンチセンスプライマー２：5’-CAGCTTGATATACATCTGCACAG-3’（配列番号７）
このように、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）上の変異を検出することにより、上記ゲノムＤＮＡを用いる方法の場合と同様に、被験者のＤＲの診断（発症またはその発症可能性の判定）を簡便に行うことができる。
【００５８】
（Ｃ）タンパク質を用いる方法
被験者の細胞より調製したタンパク質を利用する場合、配列番号１のアミノ酸配列において上記変異位置におけるグリシン挿入の有無を検出する方法が挙げられる。このグリシン挿入の有無の検出は、通常のタンパク質のシークエンス方法に準ずればよいが、例えば、グリシン挿入型タンパク質（変異型Ａｎｇ−１）、またはグリシン欠落型タンパク質（正常型Ａｎｇ−１）のみを認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法で検出する方法、タンパク質を単離し、直接または必要に応じ、酵素等で切断し、プロテインシークエンサーを利用して変異を検出する方法、アミノ酸の等電点の変異を検出する方法および質量分析により質量の差を検出する方法が挙げられ、好ましくは、正常型Ａｎｇ−１または変異型Ａｎｇ−１のいずれか一方のみを認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法で検出する方法が挙げられる。
【００５９】
このように、上記変異位置におけるグリシン挿入の有無を検出することにより、被験者のＤＲの診断（発症またはその発症可能性の判定）を客観的かつ簡便に行うことができる。具体的には、変異型Ａｎｇ−１が検出されなかった場合（換言すれば、正常型Ａｎｇ−１しか検出されなかった場合）は、ＤＲを発症している可能性または将来発症する可能性は高いと判定することができる。一方、両方のタンパク質が検出された場合および特に変異型Ａｎｇ−１のみが検出された場合は、ＤＲを発症している可能性または将来発症する可能性は低いと判定することができる。
【００６０】
なお、上記タンパク質の調製方法は、特に限定されず、被験者のあらゆる組織、細胞などから従来公知の方法で調製することができる。特に、Ａｎｇ−１の発現量が多い組織から調製することが好ましい。
【００６１】
また、上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれの方法においても、上記被験者は、特に限定されるものではないが、糖尿病を発症している者、またはＤＲを発症している者が好ましい。
【００６２】
さらに、本発明にかかるＤＲの発症またはその発症の可能性の判定方法が適用されるサンプルは、人体等の生体から分離された試料であればよく、上記例示されたものに限定されるものではない。
【００６３】
＜３．ＤＲの発症またはその発症可能性の判定キット＞
本発明にかかるＤＲの発症またはその発症可能性の判定キット（換言すれば、ＤＲの診断キット）は、上記の変異を検出できる試薬を少なくとも含んでいればよく、その他の構成は特に限定されるものではない。上記の変異を検出できる試薬としては、例えば、プライマー、プローブ、および抗体などを挙げることができる。これらの試薬は、単独で含まれてもよく、また、複数の組み合わせで含まれていてもよい。さらに、上記判定キットは、上記例示する試薬に加えて、その他の試薬を組み合わせることによっても得ることができる。
【００６４】
具体的には、ゲノム上およびｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）上の変異の有無を検出するキットとしては、上記変異位置を含む領域を増幅できるように設計されたプライマーを含み、さらに、上記変異の有無を検出できるように設計されたプローブ、制限酵素、マクサムギルバート法およびサンガー法などの塩基配列決定法に利用される試薬など、変異を検出するために必要な試薬を１つ以上組み合わせたキットが挙げられる。なお、かかる試薬は、採用される検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素、ＲＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、変異の検出の妨げとならない適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
【００６５】
プライマーを含むキットの場合、プライマーは、上記変異位置を含む領域を増幅できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば上記配列番号３〜７に示されるプライマーから選択して用いることができる。
【００６６】
また、プローブを含むキットの場合、プローブは、上記変異位置を含む領域に結合できるものであれば、特に限定されるものではない。
【００６７】
さらに、タンパク質上の変異の有無を検出するキットとしては、例えば正常型Ａｎｇ−１または変異型Ａｎｇ−１のいずれか一方のみを認識する抗体を含むキットなどが挙げられる。
【００６８】
これらの判定キットを使用することにより、上記＜２．ＤＲの発症またはその発症の可能性の判定方法＞の項で述べたように、ＤＲの診断（発症またはその発症可能性の判定）を客観的かつ簡便に行うことができる
また、本発明にかかるＤＲの発症またはその発症可能性の判定キットが適用される被験者は特に限定されるものではないが、糖尿病を発症している者、またはＤＲを発症している者が好ましい。
【００６９】
＜４．ＤＲの発症の予防方法および予防薬剤＞
上述したように、正常型Ａｎｇ−１は、ＤＲの発症の一要因となるタンパク質である。一方、正常型Ａｎｇ−１に１アミノ酸の挿入変異がある、すなわち、上述のグリシンが挿入された変異型Ａｎｇ−１は、ＤＲの発症を抑制する効果をもつ。したがって、上記グリシンが挿入された変異型Ａｎｇ−１を、正常型Ａｎｇ−１を有する者に補完することは、ＤＲの発症に対する予防方法として有効であると考えられる。そこで、本発明は、（Ａ）ＤＲの発症に対する予防方法、または（Ｂ）ＤＲの発症に対する予防薬剤に用いてもよい。
【００７０】
（Ａ）ＤＲの発症に対する予防方法
本発明にかかるＤＲの発症に対する予防方法は、正常型Ａｎｇ−１を有する者に、変異型Ａｎｇ−１または当該変異型Ａｎｇ−１をコードするＤＮＡ、あるいは、当該変異型Ａｎｇ−１がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を補完するＤＲの発症に対する予防方法であることが好ましい。
【００７１】
（Ｂ）ＤＲの発症に対する予防薬剤
本発明にかかるＤＲの発症に対する予防薬剤は、上記正常型Ａｎｇ−１を有する者において、ＤＲの発症を予防するために用いられる予防薬剤であって、変異型Ａｎｇ−１または当該変異型Ａｎｇ−１をコードするＤＮＡ、あるいは、当該変異型Ａｎｇ−１がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を主成分とするＤＲの発症に対する予防薬剤であることが好ましい。
【００７２】
上記のＤＲの発症に対する予防方法および予防薬剤では、変異型Ａｎｇ−１の補完方法は特に限定されるものではない。例えば、公知のタンパク質発現系や遺伝子導入方法などを用いることができる。具体的には、哺乳細胞にタンパク質を発現させる場合に用いる発現ベクターやウイルスベクターなどを用いた方法が挙げられる。
【００７３】
また、上記レセプタータンパク質としては、例えば、Ｔｉｅ−２受容体が挙げられる。Ａｎｇ−１がＴｉｅ−２受容体のリガンドであることは、例えば、非特許文献２などに開示されている。したがって、このＴｉｅ−２受容体のアゴニストとして作用する低分子化合物を経口または静注などによって体内に投与することは、ＤＲの発症に対する予防方法として有効であると考えられる。なお、ここでいう低分子化合物とは、ペプチドなどのタンパク質をも含むものである。
【００７４】
また、変異型Ａｎｇ−１または当該変異型Ａｎｇ−１をコードするＤＮＡと、上記レセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物とは、予防薬剤として択一的に使用されるだけでなく、組み合わせて使用することも可能である。
【００７５】
また、本発明にかかるＤＲの発症に対する予防方法もしくは予防薬剤が適用される被験者は特に限定されるものではないが、糖尿病を発症している者が好ましい。
【００７６】
なお本発明は、以上例示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術範囲に含まれる。
【実施例】
【００７７】
本発明について、実施例および図１〜５に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。なお、以下の実施例におけるＤＲ関連遺伝子における変異の有無は次のようにして評価した。
【００７８】
〔Ａｎｇ−１遺伝子における変異の有無の評価方法〕
（１）配列分析
被験者の末梢血を、公知の方法によりＥＤＴＡ採血した。採血した上記末梢血からRNA isolation kit （GENTRA SYSTEMS, MN）を用いて、トータルＲＮＡを単離した。単離した上記トータルＲＮＡから公知の方法により、Oligo dTプライマーによる逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。そして、Ａｎｇ−１遺伝子のエクソン４から５にかけて設定したプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法により増幅断片を得た。なお、上記の反応に使用したプライマーは、以下に示すとおりである。
センスプライマーＦ２−２：5’-CCACCAACAACAGTGTCCTT-3’（配列番号３）
センスプライマーＦ２−４：5’-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3’（配列番号４）
アンチセンスプライマーＲ１１８６：5’-CAGCTTGATATACATCTGCACAG-3’（配列番号７）
また、上記センスプライマーＦ２−２およびＦ２−４、ならびに上記アンチセンスプライマーＲ１１８６の設定位置については、図１に示すとおりである。
【００７９】
さらに、上記ＲＴ−ＰＣＲにおける増幅条件は以下の通りである。まず、上記合成ｃＤＮＡを鋳型に、上記センスプライマーＦ２−２およびアンチセンスプライマーＲ１１８６をプライマーに用いて、ＲＴ−ＰＣＲによる断片増幅を行った。
【００８０】
上記ＲＴ−ＰＣＲにおける反応液は、ｃＤＮＡ、１×ＰＣＲ−Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Applied Biosystems）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ、２００ｎＭ のそれぞれのプライマー、２．５ＵのAmpliTaq Gold DNA-Polymerase （Applied Biosystems）を含むように調製した。
【００８１】
さらに、上記ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、９５℃で１２分の行程を１サイクル、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒および７２℃で１分の行程を３０サイクルとした。
【００８２】
以上の条件によりＲＴ−ＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ産物１μｌを鋳型とし、プライマーに上記センスプライマーＦ２−４およびアンチセンスプライマーＲ１１８６を用いて、上記の反応液組成および反応条件でＰＣＲを行い、増幅断片を得た。
【００８３】
その結果、得られた増幅断片をエタノール沈殿により精製した。次に、上記センスプライマーＦ２−４とBigDye Terminator(Applied Biosystems, CA）とを用いたダイターミネーター法によって、精製した増幅断片から配列分析用の試料を調製した。その後、蛍光ＤＮＡシークエンサー（ABI377、Applied Biosystems）にて、その試料の配列分析を行った。配列解析により決定した上記増幅断片の配列を、配列番号１に示される変異型Ａｎｇ−１遺伝子の配列と比較することにより、Ａｎｇ−１遺伝子における変異の有無を評価することとした（図２右側上段、中段を参照）。塩基番号８０５からシークエンスフェログラム（波形シグナル）の重複が認められる場合、変異型Ａｎｇ−１遺伝子と正常型Ａｎｇ−１遺伝子とがヘテロで存在すると判定することとした（図２右側下段を参照）。
【００８４】
なお、図２中、「−／−」、「ｍｔ／ｍｔ」、および「ｍｔ／−」は、それぞれ、正常型Ａｎｇ−１遺伝子がホモで検出された場合、変異型Ａｎｇ−１遺伝子がホモで検出された場合、および正常型Ａｎｇ−１遺伝子と変異型Ａｎｇ−１遺伝子とがヘテロで検出された場合を意味する。
【００８５】
（２）鎖長分析
上記の配列分析の場合と同様の方法で増幅断片を得た。ただし、鎖長分析では、上記センスプライマーＦ２−４はＴＥＴ蛍光標識したものを用いた。最終ＰＣＲ反応産物を１０倍に希釈した上記増幅断片を含む溶液を用いて、鎖長分析を行った。鎖長分析は上記の希釈された増幅断片を含む溶液を１μｌ、５ｍｇ／ｍｌ Blue Dextran、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、分子量マーカーＧＳ５００ ＴＡＭＲＡ（Applied Biosystems）０．３μｌを含むホルムアミド液３μｌを試料とし、蛍光ＤＮＡシークエンサーを用いて行った。
【００８６】
鎖長分析では、１０１塩基もしくは９８塩基のピークのいずれが出現するかにより、Ａｎｇ−１遺伝子における変異の有無を判定することとした（図２左側上段、中段を参照）。また、１０１塩基と９８塩基との両方のピークが出現する場合には、ヘテロであると判定することとした（図２左側下段を参照）。
【００８７】
〔実施例１〕
ＤＲ患者から上記の方法で採血した末梢血を用いて、上記の配列分析および鎖長分析を行った。図３は、上記変異位置を含む領域のシークエンス解析結果を示している。図３に示すように、Ａｎｇ−１遺伝子においては、３塩基挿入型および３塩基欠失型の２種類が存在することが見出された。なお、同図（左）が３塩基挿入型の解析結果であり、同図（右）が３塩基欠失型の解析結果である。つまり、３塩基挿入型では、「ＧＧＴ」の３塩基挿入が生じていることが確認でき（図３（左）を参照）、３塩基欠失型では、この３塩基が欠失していることが確認できた（図３（右）を参照）。
【００８８】
なお、配列番号２には、このうち３塩基挿入型の遺伝子配列が示されている。この３塩基挿入型では、配列番号２に示されるように、その配列中第８０５〜８０７番目の塩基として「ＧＧＴ」の３塩基が挿入されている。
【００８９】
また、上記３塩基挿入型遺伝子の翻訳産物であるタンパク質は、配列番号１に示されるように、そのアミノ酸配列中第２６９番目のアミノ酸としてグリシンが挿入されている。一方、上記３塩基欠失型遺伝子の翻訳産物であるタンパク質においては、この第２６９番目のグリシンが欠落している。
【００９０】
〔実施例２〕
ＲＡ患者、ＤＲ患者、および健常者から採血した末梢血を用いて、上記方法により、Ａｎｇ−１遺伝子における上記３塩基挿入変異の有無を検出した結果を図４に示す。
【００９１】
なお、図４において、ｎは各種被験者の全体数を示し、正常型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する者（図中および以下、「−／−」と示す）、正常型Ａｎｇ−１遺伝子と変異型Ａｎｇ−１遺伝子とをヘテロで有する者（図中および以下、「ｍｔ／−」と示す）、変異型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する者（図中および以下、「ｍｔ／ｍｔ」と示す）の数をそれぞれの欄に示している。さらに、括弧内には、各種被験者における上記それぞれの者の割合を示す。
【００９２】
図４に示すように、健常者では、「−／−」は１１．９％、「ｍｔ／−」は７８．０％、「ｍｔ／ｍｔ」は１０．１％であった。ＲＡ患者では、「−／−」は５．１％、「ｍｔ／−」は７９．０％、「ｍｔ／ｍｔ」は２４．５％であった。また、ＤＲ患者では、「−／−」は２５．８％、「ｍｔ／−」は３６．５％、「ｍｔ／ｍｔ」は３７．９％であった。さらに、変異型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する者について、健常者群と、ＲＡ患者群およびＤＲ患者群との間の有意差をカイ２乗検定により解析した。その結果、健常者群とＲＡ患者群との間のＰ値は、１０−２、健常者群とＤＲ患者群との間のＰ値は、１０−４であった。すなわち、ＤＲ患者において、正常型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する者が有意に多かった。
【００９３】
〔実施例３〕
ＤＲ患者について、年齢、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、空腹時血糖（ＦＢＳ）、総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ）／ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、および糖尿病発病後の年数を調べた。なお、ＨｂＡ１ｃ、ＦＢＳ、Ｔ−Ｃｈｏ、およびＨＤＬ−Ｃは、空腹時採血サンプルを用いて、定法に従い、測定した。その結果、各測定項目とも、Ａｎｇ−１遺伝子の変異の有無による相違は見られなかった。
【００９４】
なお、図５において、正常型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する者（図中および以下、「−／−」と示す）、正常型Ａｎｇ−１遺伝子と変異型Ａｎｇ−１遺伝子とをヘテロで有する者（図中および以下、「ｍｔ／−」と示す）、変異型Ａｎｇ−１遺伝子をホモで有する者（図中および以下、「ｍｔ／ｍｔ」と示す）のうち、上記各種測定項目の測定結果をそれぞれの欄に示している。
【００９５】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
以上のように、本発明では、Ａｎｇ−１、もしくはＡｎｇ−１遺伝子における変異を検出することにより、ＤＲの発症の可能性を予測することができる。それゆえ、ＤＲの発症またはその発症可能性の判定方法や判定キットに代表される診断医療の分野だけでなく、保健医学分野に広く利用することができる。さらには、変異型Ａｎｇ−１、もしくは変異型Ａｎｇ−１遺伝子を用いることにより、ＤＲの発症の予防方法や予防薬剤に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本発明にかかるＡｎｇ−１遺伝子のｃＤＮＡの一部を模式的に示した概略図である。
【図２】本実施例において、Ａｎｇ−１遺伝子の３塩基欠失変異位置を含む領域の配列解析および鎖長解析を行った結果を示す図である。
【図３】本実施例において、Ａｎｇ−１遺伝子の３塩基挿入変異位置を含む領域のシークエンス解析を行った結果を示す図である。
【図４】本実施例において、ＲＡ患者、ＤＲ患者、および健常者において、Ａｎｇ−１遺伝子における３塩基欠失変異の有無の検出を行った結果を示す表である。
【図５】本実施例において、ＤＲ患者について、年齢、ＨｂＡ１ｃ、ＦＢＳ、Ｔ−Ｃｈｏ／ＨＤＬ−Ｃ、および糖尿病発病後の年数を調べた結果を示す表である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離された試料を用いて、糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性を判定する方法であって、
アンギオポエチン−１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおける変異の有無を検出する工程を含み、かつ、
上記変異が、変異型アンギオポエチン−１タンパク質の第２６９番目のアミノ酸であるグリシンをコードする３塩基の欠失変異であることを特徴とする糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定方法。
【請求項２】
生体から分離された試料を用いて、糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性を判定する方法であって、
アンギオポエチン−１遺伝子における変異の有無を検出する工程を含み、かつ、
上記変異が、変異型アンギオポエチン−１遺伝子の翻訳領域中第８０５〜８０７番目の塩基である「ＧＧＴ」（ＧおよびＴは、それぞれ、グアニンおよびチミンを表す）の３塩基の欠失変異であることを特徴とする糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定方法。
【請求項３】
生体から分離された試料を用いて、糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性を判定する方法であって、
アンギオポエチン−１タンパク質における変異の有無を検出する工程を含み、かつ、
上記変異が変異型アンギオポエチン−１タンパク質の第２６９番目のアミノ酸であるグリシンの欠失変異であることを特徴とする糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定方法を利用することを特徴とする糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項５】
上記糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定キットが、プライマー、プローブおよび抗体のうち、少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項４に記載の糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項６】
上記プライマーが、上記変異型アンギオポエチン−１遺伝子の翻訳領域中第８０５〜８０７番目の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーであることを特徴とする請求項５に記載の糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項７】
上記プローブが、上記変異型アンギオポエチン−１遺伝子の翻訳領域中第８０５〜８０７番目の塩基を含む領域に結合することを特徴とする請求項５に記載の糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項８】
上記抗体が、上記変異型アンギオポエチン−１タンパク質、または、上記変異型アンギオポエチン−１タンパク質の第２６９番目のアミノ酸であるグリシンが欠落した正常型アンギオポエチン−１タンパク質のいずれか一方のみを認識することを特徴とする請求項５に記載の糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項９】
変異型アンギオポエチン−１タンパク質の第２６９番目のグリシンが欠落した正常型アンギオポエチン−１タンパク質を有する者に、第２６９番目のアミノ酸としてグリシンを有する変異型アンギオポエチン−１タンパク質、もしくは当該変異型アンギオポエチン−１タンパク質をコードするＤＮＡ、または、当該変異型アンギオポエチン−１タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を補完することを特徴とする糖尿病性網膜症の発症の予防方法。
【請求項１０】
糖尿病性網膜症の発症を予防するために用いられる予防薬剤であって、
変異型アンギオポエチン−１タンパク質の第２６９番目のグリシンが欠落した正常型アンギオポエチン−１タンパク質を有する者を投与対象とし、
第２６９番目のアミノ酸としてグリシンを有する変異型アンギオポエチン−１タンパク質もしくは当該変異型アンギオポエチン−１タンパク質をコードするＤＮＡ、または、当該変異型アンギオポエチン−１タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を主成分とすることを特徴とする糖尿病性網膜症の発症の予防薬剤。
【請求項１】
生体から分離された試料を用いて、糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性を判定する方法であって、
アンギオポエチン−１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおける変異の有無を検出する工程を含み、かつ、
上記変異が、変異型アンギオポエチン−１タンパク質の第２６９番目のアミノ酸であるグリシンをコードする３塩基の欠失変異であることを特徴とする糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定方法。
【請求項２】
生体から分離された試料を用いて、糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性を判定する方法であって、
アンギオポエチン−１遺伝子における変異の有無を検出する工程を含み、かつ、
上記変異が、変異型アンギオポエチン−１遺伝子の翻訳領域中第８０５〜８０７番目の塩基である「ＧＧＴ」（ＧおよびＴは、それぞれ、グアニンおよびチミンを表す）の３塩基の欠失変異であることを特徴とする糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定方法。
【請求項３】
生体から分離された試料を用いて、糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性を判定する方法であって、
アンギオポエチン−１タンパク質における変異の有無を検出する工程を含み、かつ、
上記変異が変異型アンギオポエチン−１タンパク質の第２６９番目のアミノ酸であるグリシンの欠失変異であることを特徴とする糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定方法を利用することを特徴とする糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項５】
上記糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定キットが、プライマー、プローブおよび抗体のうち、少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項４に記載の糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項６】
上記プライマーが、上記変異型アンギオポエチン−１遺伝子の翻訳領域中第８０５〜８０７番目の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーであることを特徴とする請求項５に記載の糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項７】
上記プローブが、上記変異型アンギオポエチン−１遺伝子の翻訳領域中第８０５〜８０７番目の塩基を含む領域に結合することを特徴とする請求項５に記載の糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項８】
上記抗体が、上記変異型アンギオポエチン−１タンパク質、または、上記変異型アンギオポエチン−１タンパク質の第２６９番目のアミノ酸であるグリシンが欠落した正常型アンギオポエチン−１タンパク質のいずれか一方のみを認識することを特徴とする請求項５に記載の糖尿病性網膜症の発症またはその発症の可能性の判定キット。
【請求項９】
変異型アンギオポエチン−１タンパク質の第２６９番目のグリシンが欠落した正常型アンギオポエチン−１タンパク質を有する者に、第２６９番目のアミノ酸としてグリシンを有する変異型アンギオポエチン−１タンパク質、もしくは当該変異型アンギオポエチン−１タンパク質をコードするＤＮＡ、または、当該変異型アンギオポエチン−１タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を補完することを特徴とする糖尿病性網膜症の発症の予防方法。
【請求項１０】
糖尿病性網膜症の発症を予防するために用いられる予防薬剤であって、
変異型アンギオポエチン−１タンパク質の第２６９番目のグリシンが欠落した正常型アンギオポエチン−１タンパク質を有する者を投与対象とし、
第２６９番目のアミノ酸としてグリシンを有する変異型アンギオポエチン−１タンパク質もしくは当該変異型アンギオポエチン−１タンパク質をコードするＤＮＡ、または、当該変異型アンギオポエチン−１タンパク質がリガンドとなるレセプタータンパク質のアゴニストとしての低分子化合物を主成分とすることを特徴とする糖尿病性網膜症の発症の予防薬剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−３２５５２８（Ｐ２００６−３２５５２８Ａ）
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１５５９３７（Ｐ２００５−１５５９３７）
【出願日】平成１７年５月２７日（２００５．５．２７）
【出願人】（５０４１５６７０６）株式会社膠原病研究所 (13)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２７日（２００５．５．２７）
【出願人】（５０４１５６７０６）株式会社膠原病研究所 (13)
【Ｆターム（参考）】
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