糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法、該方法によりフェニルヒドラゾン化した糖類及び糖鎖の分析方法、並びに、前記方法を利用した糖類及び糖鎖の比較定量方法
【課題】糖類及び/又は糖鎖とフェニルヒドラジンを酢酸/有機塩基/H2O溶媒又は酢酸/有機塩基溶媒中で反応させることにより、フェニルヒドラゾン化糖類及び/又は糖鎖への誘導体化率が高く、フェニルヒドラゾン化反応における、シアリル糖鎖からのシアル酸の解離を抑制しつつ、糖類及び糖鎖をフェニルヒドラゾン化する糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法、前記方法によりフェニルヒドラゾン化した糖類及び糖鎖の分析方法、並びに、前記方法を利用した比較定量方法を提供すること。
【解決手段】糖類及び/又は糖鎖とフェニルヒドラジンを酢酸/有機塩基/H2O溶媒又は酢酸/有機塩基溶媒中で反応させ、前記糖類及び/又は糖鎖をフェニルヒドラゾン化する。
【解決手段】糖類及び/又は糖鎖とフェニルヒドラジンを酢酸/有機塩基/H2O溶媒又は酢酸/有機塩基溶媒中で反応させ、前記糖類及び/又は糖鎖をフェニルヒドラゾン化する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法、前記方法によりフェニルヒドラゾン化した糖類及び糖鎖の分析方法、並びに、前記方法を利用した糖類及び糖鎖の比較定量方法に関し、更に詳しくは、糖類及び/又は糖鎖とフェニルヒドラジンを、酢酸/有機塩基/H2O溶媒又は酢酸/有機塩基溶媒中で反応させることにより、フェニルヒドラゾン化糖類及び/又は糖鎖への誘導体化率が高いだけでなく、フェニルヒドラゾン化反応におけるシアリル糖鎖からのシアル酸の解離を抑制することのできる、糖類及び/又は糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法、前記方法によりフェニルヒドラゾン化した糖類及び糖鎖の分析方法、並びに、前記方法を利用した糖類及び糖鎖の比較定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質の糖鎖は、タンパク質の活性や体内動態を調整する上で非常に重要な役割を果たしており、胚の発生や細胞の分化、疾患等に伴って変化することが知られている。例えば、自己免疫疾患や癌においては、生体内の糖タンパク質の糖鎖が変化することが知られており、早期診断マーカーとして利用することのできる糖鎖抗原を探索するための研究が盛んに行われている。
【０００３】
糖タンパク質性医薬品やグリコサミノグリカンに由来する医薬品の開発においては、これら医薬品の糖鎖部分が、溶解性、安定性、生物活性及び体内動態等に影響を及ぼすだけでなく、抗原性にも関与していることが知られており、品質、有効性及び安全性を確保するためには、糖鎖の詳細な構造解析が必要不可欠である。また、細胞・組織利用医薬品の研究開発及び品質評価においても、糖鎖を指標とした細胞特性の解析や品質評価方法に関する研究が進められている。
【０００４】
糖類や糖鎖を解析する方法としては、従来、2-アミノピリジンや2-アミノベンザミドなどで糖類や糖鎖を誘導体化した後、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて分離し、蛍光を検出する方法が一般的であった。
最近における糖類や糖鎖の解析は、質量分析法（MS）による解析が中心となっており、ESI-MS（エレクトロスプレーイオン化法/質量分析法）やMALDI-TOFMS（マトリックス支援レーザー脱離イオン化/飛行時間型質量分析法）なども利用されている。本発明者等も、グラファイトカーボンカラムを用いた液体クロマトグラフィー/質量分析（LC/MS）による、糖鎖プロファイリング法を提案している（非特許文献1）。
【非特許文献１】Nana Kawasaki et al., "Analysis of carbohydrate heterogeneity in a glycoprotein using liquid chromatography/mass spectrometry and liquid chromatography with tandem mass spectrometry.", Analytical Biochemistry: 269(1999)p.297-303.
【０００５】
しかしながら、糖類や糖鎖の解析に質量分析法を用いた場合には、再現性に問題があるため、糖類や糖鎖の定量分析法としては、十分なものではなかった。
そこで本発明者等は、同位体標識試薬である2-アミノピリジン（AP）の重水素置換体（d6-AP）を使用して、分子量が4Da大きいピリジルアミノ化（PA）糖類及び/又は糖鎖を調製し、内部標準として用いる方法を提案した（非特許文献2）。
【非特許文献２】Jin Yuan et al., "Isotope tag method for quantitative analysis of carbohydrates by liquid chromatography-mass spectrometry.", Journal of Chromatography A: 1067（2005）p.145-152
【０００６】
しかしながら、内部標準と試料の質量差、すなわちd0-PA糖鎖とd4-PA糖鎖の質量の違いが4Daしかないため、質量分析における精度が十分ではないという問題があった。また、シアル酸を含む糖鎖（シアリル糖鎖）は、活性や体内動態に関わる重要な糖鎖であるにも拘らず、前記d0-AP又はd6-APを用いた糖鎖の誘導化反応が酢酸溶媒中で行われるため、酸に弱いシアル酸が解離するという問題もあり、更に優れた糖鎖の質量分析法（MS）が求められていた。
【０００７】
一方、フェニルヒドラジンを用いる糖のフェニルヒドラゾン化方法がある。この方法は、フィッシャーが単糖の構造決定に使用したことで有名な標識法であり、現在は、糖鎖標識法としても利用されている。この方法は、還元反応がなく脱塩操作が不要であるため、比較的簡便な方法である。
この方法を応用した分析方法として、単糖をリン酸溶液中で標識した後、HPLCで分析する方法が報告されているが（特許文献1）、酸性水溶液（リン酸溶液）中で加熱して糖をフェニルヒドラゾン化するため、この方法を糖鎖に応用した場合には、シアル酸が解離するという問題がある。
【特許文献１】特開平04-29058号公報
【０００８】
シアル酸の解離を防止する方法として、糖鎖とフェニルヒドラジンを中性条件下、10％程度の有機溶媒を含む水溶液中で加熱して反応させる方法（非特許文献3）や、MALDI-TOFMSのターゲット上において、中性条件下、室温で反応を行わせるという簡便な方法（非特許文献4）が提案されているが、これらの場合には、未反応糖鎖が残るという問題点があり、更に効率的な糖鎖の誘導体化方法が求められていた。
【非特許文献３】Erika Lattova et al."influence of the labeling group on ionization and fragmentation of carbohydrates in mass spectrometry.", Journal of the American Society for Mass Spectrometry.:16(2005)p.683-696.
【非特許文献４】Erika Lattova et al."Labelling saccharides with phenylhydrazine for electrospray and matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry.", Journal of chromatography B:793(2003)p.167-179.
【０００９】
そこで本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、糖類及び/又は糖鎖とフェニルヒドラジンを、酢酸/有機塩基/H2O溶媒又は酢酸／有機塩基溶媒中で反応させることにより、フェニルヒドラゾン化糖類及び/又は糖鎖への誘導体化率が高くなり、未反応糖類及び/又は糖鎖を最小限に抑えることができることに加え、活性や体内動態に関わる重要なシアリル糖鎖中のシアル酸が、フェニルヒドラゾン化反応中に解離することを抑制することができることを見出すと共に、更に、同位体標識試薬であるフェニルヒドラジンの重水素置換体を用いた場合には、d0-フェニルヒドラジンとd5-フェニルヒドラジンの質量の違いが5Daとなるため、これを内部標準として使用した場合には、分析精度が向上することを見出し、本発明に到達した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って本発明の第1の目的は、フェニルヒドラゾン化糖類及び/又は糖鎖への誘導体化率の高い糖類及び/又は糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法を提供することにある。
本発明の第2の目的は、シアリル糖鎖のシアル酸の解離を抑制しつつ、シアリル糖鎖をフェニルヒドラゾン化する方法を提供することにある。
本発明の第3の目的は、本発明のフェニルヒドラゾン化方法を用いた、糖類及び/又は糖鎖の分析方法を提供することにある。
本発明の第4の目的は、本発明のフェニルヒドラゾン化方法を用いた、糖類及び/又は糖鎖の比較定量方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の第5の目的は、本発明の比較定量方法を利用した、糖鎖バイオマーカーの検索方法を提供することにある。
本発明の第6の目的は、本発明の比較定量方法を利用した、糖タンパク質性医薬品又はグリコサミノグリカン由来の医薬品に対する品質同等性/同質性評価方法を提供することにある。
本発明の第7の目的は、本発明の比較定量方法を利用した、細胞組織利用医薬品の特性解析を提供することにある。
本発明の第8の目的は、本発明の比較定量方法を利用した、品質試験方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
即ち本発明における第1の発明は、酢酸/有機塩基/H2O溶媒又は酢酸/有機塩基溶媒中で、フェニルヒドラジンを糖類及び/又は糖鎖と反応させることを特徴とする、糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法である（請求項1）。本発明においては、前記有機塩基が、ピリジン及び/又はトリエチルアミンであることが好ましく（請求項2）、前記反応が4〜80℃で行われることが好ましい（請求項3）。また、前記糖類又は糖鎖として、糖タンパク質又は糖脂質から切り出された糖類又は糖鎖を用いてもよく（請求項4）、前記フェニルヒドラジンとして、フェニル基上の水素原子が全て重水素原子で置換されたd5-フェニルヒドラジンを用いてもよい（請求項5）。
【００１３】
本発明における第2の発明は、上記した第1の発明において、前記糖鎖としてシアリル糖鎖を用いることを特徴とする、糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法である（請求項6）。
【００１４】
本発明の第3の発明は、試料に含まれる糖類及び/又は糖鎖を、上記した本発明の方法によってフェニルヒドラゾン化した後分析することを特徴とする糖類及び糖鎖の分析方法であり（請求項7）、前記試料として、少なくとも1種のシアリル糖鎖を含む試料を用いても良い（請求項8）。
【００１５】
本発明における第4の発明は、測定対象試料糖類又は糖鎖を、標準試料糖類又は糖鎖と比較して定量する糖類又は糖鎖の比較定量方法において、一方の試料に含まれる糖類又は糖鎖を上記した本発明の方法によってフェニルヒドラゾン化したd5-糖類又は糖鎖とし、他方の試料に含まれる糖類又は糖鎖を同様にしてフェニルヒドラゾン化したd0-糖類又は糖鎖として両者を既知の比率で混合し、得られた混合物について、グラファイトカーボンカラム、逆相系カラム及び順相系カラムから選択されるカラムを用いて液体クロマトグラフィー/質量分析を行うことを特徴とする比較定量方法（請求項9又は11）である。本発明の比較定量方法においては、試料糖類又は糖鎖として、試料糖タンパク質から切り出された糖類又は糖鎖を、前記標準糖類又は糖鎖として、標準糖タンパク質から切り出された糖類又は糖鎖を用いても良い（請求項10及び12）。
【００１６】
更に本発明における第5の発明は、本発明の糖鎖の比較定量方法を含む糖鎖バイオマーカーの検索方法であり（請求項13）、本発明の第6の発明は、本発明の糖鎖の比較定量方法を含む、糖タンパク質性医薬品又はグリコサミノグリカン由来の医薬品の品質同等性/同質性評価方法である（請求項14）。
また本発明における第7の発明は、本発明の糖鎖の比較定量方法を含む細胞組織利用医薬品の特性解析であり（請求項15）、本発明における第8の発明は、本発明における糖鎖の比較定量方法を含む細胞組織利用医薬品の品質試験方法である（請求項16）。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の糖類及び/又は糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法は、フェニルヒドラゾン化糖類及び/又は糖鎖への誘導体化率が高く、未反応糖類及び糖鎖を最小限に抑えることができるため、より正確な糖類及び/又は糖鎖の分析を行うことができると共に、糖類又は糖鎖の誘導体化における煩雑な還元操作や後処理を必要としないため、フェニルヒドラゾン化反応後の溶液を、そのまま分析することができる。また、フェニルヒドラゾン化反応中に生じるシアリル糖鎖からのシアル酸の解離を抑制しつつ、糖鎖をフェニルヒドラゾン化することができるため、シアリル糖鎖を含む試料の分析に好適である。更に、試料糖類又は糖鎖と5Da質量差を有する内部標準を用いることにより精度を改善することができるため、シアリル糖鎖だけでなく、それ以外の糖類又は糖鎖についても、より正確な、液体クロマトグラフィー/質量分析（LC/MS）による比較定量分析が可能となる。
【００１８】
従って本発明は、胚の発生や細胞の分化、疾患等に伴って変化することが知られている糖タンパク質の糖鎖の解析に有用であり、糖鎖バイオマーカーの検索や糖タンパク質性又はグリコサミノグリカンに由来する医薬品の品質同等性／同質性評価方法、更には、細胞組織利用医薬品の特性解析や、品質試験方法に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の方法について詳細に説明する。
本発明の糖類及び/又は糖鎖とフェニルヒドラジンを、酢酸/有機塩基/H2O溶媒又は酢酸/有機塩基溶媒中で反応させる糖類及び/又は糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法は、フェニルヒドラゾン化糖類及び/又は糖鎖への誘導体化率が高く、未反応糖類及び糖鎖の残存を最小限に抑えることができるため、より正確な糖類及び/又は糖鎖の分析に有用である。ここで誘導体化率とは、糖類及び/又は糖鎖からフェニルヒドラゾン化糖類又は糖鎖に誘導体化する割合を意味する。
【００２０】
本発明において用いられる糖類としては、例えば、マンノース、グルコース、ガラクトース、アラビノース、キシロース等の中性糖類、N-アセチルグルコサミン及びN-アセチルガラクトサミン等のアミノ糖類など、周知の単糖が挙げられる。
【００２１】
また、少糖類、多糖類を化学的又は酵素的に分解して得られた糖類を、本発明の糖類として用いることも可能である。従って、食品などから得られた少糖類、多糖類等や、動植物から抽出した糖タンパク質や糖脂質などから切り出された糖鎖を、化学的又は酵素的に分解して、本発明において用いられる糖類として使用してもよい。
【００２２】
本発明において用いられる糖鎖としては、上記の糖類を構成糖とする糖鎖であれば、特に制限されることはないが、例えば、N-結合型糖鎖やO-結合型糖鎖のような糖タンパク系糖鎖；糖脂質系糖鎖；ヒアルロン酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などのグリコサミノグリカン系糖鎖のような糖鎖などが挙げられる。
食品などから得られた少糖類、多糖類等や、動植物から抽出した糖タンパク質や糖脂質などから切り出された糖鎖を、本発明において用いられる糖鎖として使用してもよい。
【００２３】
本発明のフェニルヒドラゾン化方法において使用することができるフェニルヒドラジンとしては、重水素置換しないd0-フェニルヒドラジン、又は、フェニルヒドラジンのフェニル基上に存在する全水素原子を重水素原子で置換したd5-フェニルヒドラジンを用いることができる。
本発明の比較定量方法で測定する場合には、d0-フェニルヒドラジン及びd5-フェニルヒドラジンを併用することが必要である。
【００２４】
本発明において用いられる酢酸/有機塩基/H2O溶媒又は酢酸/有機塩基溶媒の有機塩基としては、ピリジン、2-ピコリン、3-ピコリン、4-ピコリン、キノリン等の窒素複素環化合物や、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン等のアルキルアミンなどを例示することができる。
特に本発明において用いられる有機塩基としては、シアル酸の解離が少なく、未反応糖鎖を最低限に抑えることができるという観点から、ピリジン及び/又はトリエチルアミンを用いることが好ましい。
また、本発明において用いられる酢酸/有機塩基溶媒の比率［v/v］は、10/3〜3/10（酢酸含有率:約23〜77％）であることが好ましい。特に、シアル酸の解離が少なく、未反応糖鎖を最低限に抑えることができるという観点から、9/4〜5/8（酢酸含有率:約38〜69％）であることが好ましく、中でも、8/5（酢酸含有率:約62％）であることが特に好ましい。本発明において用いられる酢酸/有機塩基/H2O溶媒の比率［v/v］は、［酢酸/有機塩基（v/v;3/7〜7/3溶液）］:［H2O］が、1:9〜9:1であることが好ましく、シアル酸の解離が少なく、未反応糖鎖を最低限に抑えることができるという観点から、特に、［酢酸/有機塩基（v/v;5/5溶液）］:［H2O］が1:9であることが好ましい。
【００２５】
本発明の方法においては、酢酸/有機塩基/H2O溶媒又は酢酸/有機塩基溶媒中における糖類及び/又は糖鎖とフェニルヒドラジンの反応を、4〜80℃の範囲で行うことが好ましく、室温〜80℃の範囲で行われることが特に好ましい。また、反応時間は、10分以上であることが好ましく、30〜60分間反応させることが特に好ましい
【００２６】
即ち、本発明における糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法は、フェニルヒドラゾン化糖類及び/又は糖鎖への誘導体化率が高く、シアリル糖鎖からのシアル酸の解離を抑制しつつ、シアリル糖鎖をフェニルヒドラゾン化することができる点に最大の特徴があり、活性や体内動態に関わる重要な糖鎖であるシアリル糖鎖の分析に特に有用である。
【００２７】
本発明におけるシアリル糖鎖とは、シアル酸を含有する糖鎖を意味し、シアル酸とは、9個の骨格炭素からなるカルボキシル基を有する2-ケト-3-デオキシノノン酸を意味する。シアル酸としては、N-アセチルノイラミン酸、N-グリコリルノイラミン酸及びデアミノノイラミン酸、並びに、それらのアセチル化体、メチル化体、ラクチル化体及び硫酸化体等の修飾シアル酸などを例示することができる。
【００２８】
本発明における、試料に含まれる糖類及び/又は糖鎖を、上記した本発明の方法によりフェニルヒドラゾン化した後分析する方法は、フェニルヒドラゾン化した糖類及び/又は糖鎖を、液体クロマトグラフィー（LC）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等の公知の分析機器で分離し、紫外吸収を測定することにより行なうことができる。また、質量分析（MS）、液体クロマトグラフィー/質量分析（LC/MS）によって、質量を測定することにより分析することもできる。
【００２９】
本発明のフェニルヒドラゾン化方法は、フェニルヒドラジンと反応しない未反応糖類及び/又は糖鎖の残存を最小限に抑えることができるため、より正確に糖類及び/又は糖鎖の分析を行うことができる。例えば、上記したような糖類及び/又は糖鎖を単独で、又は、複数含有する試料を分析することができる。
また、シアリル糖鎖からのシアル酸の解離を抑制することができるので、シアリル糖鎖を含有する糖類及び/又は糖鎖の分析に有用である。たとえば、シアリル糖鎖単独試料のみならず、種々のシアリル糖鎖を含有する試料や、シアリル糖鎖と共にシアル酸を含有しない糖鎖を含む試料の分析に有用である。
【００３０】
本発明におけるフェニルヒドラゾン化した糖類及び糖鎖の比較定量方法は、先ず、本発明のフェニルヒドラゾン化方法によりフェニルヒドラゾン化d5-糖類又は糖鎖を調製し、同様に、フェニルヒドラゾン化d0-糖類又は糖鎖を調製する。次いで、得られたフェニルヒドラゾン化d5-糖類又は糖鎖とフェニルヒドラゾン化d0-糖類又は糖鎖を混合し、グラファイトカーボンカラム、逆相系カラム及び順相系カラムから選択されるカラムを用いて液体クロマトグラフィー/質量分析（LC/MS）を行う方法である。逆相系カラムとしては、例えば、C18、C8カラムなどを例示することができる。順相系カラムとしては、親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）用カラムなどを例示することができる。また、上記混合は、一方を標準試料として両者を比較定量するために行うので、等量混合とすることが好ましい。
【００３１】
これによって、上記のd5-糖類又は糖鎖、及び、d0-糖類又は糖鎖の一方を、試料糖類又は試料糖鎖のフェニルヒドラゾン化物とし、他方を、内部標準として機能する標準糖類又は標準糖鎖のフェニルヒドラゾン化物とし、標準糖類又は標準糖鎖と比較して試料糖鎖を定量することが可能となる。
【００３２】
本発明の試料糖類及び試料糖鎖、並びに、標準糖類及び標準糖鎖は、糖類及び/又は糖鎖であれば特に制限されるものではなく、本発明のフェニルヒドラゾン化方法で用いられる糖類及び/又は糖鎖として例示したものの中から適宜選択することができる。
【００３３】
更に本発明の糖鎖バイオマーカーの検索方法は、本発明の前記比較定量方法を用い、がん、免疫疾患などの患者から得られた糖鎖と、正常人の糖鎖を比較定量することにより、糖鎖バイオマーカーとなり得る、疾患に関連する糖鎖の変化を検索するものである。
【００３４】
例えば、公知の手法により、がん患者及び正常人から採取した血液又は組織から糖タンパク質を精製し、得られた糖タンパク質から糖鎖を切り出し、次いで、本発明のフェニルヒドラゾン化方法によってフェニルヒドラゾン化し、本発明の比較定量方法によって糖鎖の比較定量を行うことができる。この場合、がん患者から得られた糖鎖をd0-フェニルヒドラジンで、正常人から得られた糖鎖をd5-フェニルヒドラジンでフェニルヒドラゾン化してこれを標準試料とすることにより、変化した糖鎖を検出することができる。
【００３５】
本発明における、糖タンパク質性又はグリコサミノグリカン由来の医薬品における品質同等性/同質性評価方法は、比較対照となる糖タンパク質性又はグリコサミノグリカン由来の医薬品における糖鎖を、本発明の方法により比較定量することにより、両者の医薬品の品質同等性/同質性を評価するものである。
【００３６】
例えば、比較対照となる糖タンパク質性又はグリコサミノグリカン由来の医薬品から、公知の方法により糖鎖を切り出し、本発明のフェニルヒドラゾン化方法によってフェニルヒドラゾン化し、本発明の比較定量方法によって糖鎖の比較定量を行うことができる。この場合、一方の医薬品から得られた糖鎖をd0-フェニルヒドラジンで、他方の医薬品から得られた糖鎖をd5-フェニルヒドラジンでフェニルヒドラゾン化した後両者を比較定量することにより、両者の糖鎖に変化がないかどうかを確認し、品質同等性/同質性を評価する。
【００３７】
本発明の細胞・組織利用医薬品の特性解析及び、細胞・組織利用医薬品の品質試験方法は、比較対照となる細胞・組織利用医薬品の糖鎖を、本発明の方法により比較定量することにより、両者の医薬品の特性を解析し、品質を評価するものである。
【００３８】
例えば、公知の手法により、分化前及び分化後の細胞から糖鎖を切り出し、本発明の比較定量方法を用いることにより、細胞・組織利用医薬品の特性を解析したり、品質試験を行うことができる。この場合、分化前の細胞から得られた糖鎖をd0-フェニルヒドラジンで、分化後の細胞から得られた糖鎖をd5-フェニルヒドラジンでフェニルヒドラゾン化し、次いで両者の糖鎖の違いを分析して特性を解析する。また、両者の糖鎖に変化がないかどうかを確認し、品質同等性を評価することもできる。
【００３９】
以下、実施例によって、本発明の糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法、前記方法によりフェニルヒドラゾン化した糖類及び糖鎖の分析方法、並びに、前記方法を利用した比較定量方法について、更に詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
10％フェニルヒドラジンを含む表1の反応溶媒に、ジシアリル2本鎖糖鎖（品名：A2F Glycan,品番：CN-A2F-10U,Ludger製）を溶解し、80℃で1時間加熱することにより、フェニルヒドラゾン化糖鎖を得た。得られた反応物についてLC/MSを行い、同一クロマトグラム上に検出された未反応糖鎖とフェニルヒドラゾン化糖鎖のピーク面積から、フェニルヒドラゾン化されなかった糖鎖（未反応糖鎖）の比率（［未反応糖鎖/全ての糖鎖］×100）を算出した（図1（B）参照）。シアル酸が解離したフェニルヒドラゾン化糖鎖の比率（［解離した糖鎖/全ての糖鎖］×100）についても、シアル酸が解離した糖鎖とフェニルヒドラゾン化糖鎖のピーク面積から算出した（図1（C）参照）。
なお、実施例1-3及び比較例1-1〜1-4については、ジシアリル2本鎖糖鎖の代わりに、シアル酸の結合していない高マンノース型糖鎖（品名：MAN-9 Glycan,品番：CN-MAN9-10U,Ludger製）を用い、ジシアリル2本鎖糖鎖の場合と同様にして、フェニルヒドラゾン化及びLC/MSを行った。
その結果を表1に示す。
【００４１】
【表１】
【実施例２】
【００４２】
10％フェニルヒドラジンを含む酢酸/ピリジン混合液（8/5）に、ジシアリル2本鎖糖鎖（品名：A2F Glycan,品番：CN-A2F-10U,Ludger製）を溶解し、表2に記載された条件で反応させることによって、フェニルヒドラゾン化糖鎖を得た。得られた反応物について、実施例1と同様にして、フェニルヒドラゾン化されなかった糖鎖（未反応糖鎖）の比率、及びシアル酸が解離したフェニルヒドラゾン化糖鎖の比率を算出した。その結果を表2に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】
図1に、実施例2-2で得られたフェニルヒドラゾン化糖鎖（室温30分反応）について、LC/MSによって得られたマスクロマトグラムを示す。
実施例1と同様にして算出した未反応糖鎖の比率は3％であり、フェニルヒドラゾン化糖鎖への誘導体化率が極めて高いことが確認された。また、実施例1と同様にして算出したシアル酸が解離したフェニルヒドラゾン化糖鎖の比率は4％であり、シアル酸の解離についても、十分に抑えられていることが確認された。
【００４５】
LC／MS分析における使用機器及び分析条件は、以下の通りである。
＜液体クロマトグラフィー（LC）＞
装置：NanoFrontier nLC(日立ハイテクフィールディング）
カラム：Hypercarb(150×0.075mm,サーモフィッシャーサイエンティフィック)
トラップカートリッジ：グラファイトカーボンカートリッジ(5×0.3mm,化学物質評価研究機構)
流速：200 nL/分
バッファーA：2% CH3CN/ 5mM 酢酸アンモニウム(pH 9.6)
バッファーB：80% CH3CN/ 5mM 酢酸アンモニウム(pH 9.6)
グラジエント：バッファーB 2→90%/60min.
＜質量分析（MS）＞
装置：LTQ-FT(サーモフィッシャーサイエンティフィック)
Ion mode：Positive ion mode
【実施例３】
【００４６】
10％フェニルヒドラジンを含む表3の反応溶媒に、N-アセチルガラクトサミン（品名：N-acetyl-D-galactosamine,品番：A2795-100MG,純度：98％,SIGMA製）を溶解し、室温で反応させることによりフェニルヒドラゾン化糖類を得た。得られたフェニルヒドラゾン化糖類を、HPLCを用いて下記の条件で分離し、紫外吸収（245nm）を測定した。得られたピークの面積からフェニルヒドラゾン糖鎖の割合（％）を算出した。
＜高速液体クロマトグラフィー（HPLC）＞
装置：Magic 2002(Michrom BioResources製)
カラム：PLRP-S(150×1.0mm,Michrom BioResources製)
流速：50μL/分
バッファーA：2% CH3CN/0.1％HCOOH
バッファーB：90% CH3CN/0.1%HCOOH
グラジエント：バッファーB 0→30%/15min.
【００４７】
【表３】
＊10％フェニルヒドラジンを含む上記反応溶媒を用いて、100分間反応させた時のフェニルヒドラゾン化糖鎖のピーク面積を100として算出。
【００４８】
いずれの反応溶媒を用いた場合も40分間のフェニルヒドラゾン化で、フェニルヒドラゾン化糖類の比率は95％以上であり、誘導体化率が高いことが確認された。特に、有機塩基としてピリジンを用いた場合は、10分間の標識でフェニルヒドラゾン化糖類の比率は95％以上であり、誘導体化率が極めて高いことが確認された。
【実施例４】
【００４９】
1．糖鎖のフェニルヒドラゾン化
10％フェニルヒドラジンを含む酢酸/ピリジン（8/5）混合液に、ジシアリル2本鎖糖鎖（品名：A2F Glycan,品番：CN-A2F-10U,Ludger製）を溶解し、80℃で1時間加熱することによって、90％以上の収率で、d0-フェニルヒドラゾン化した糖鎖（d0-糖鎖）を合成した（反応スキーム1）。
実施例1及び2と同様に算出した、シアル酸が解離したフェニルヒドラゾン化糖鎖及び未反応糖鎖の合計は10％以下であった。
【００５０】
＜反応スキーム1＞
【００５１】
得られたフェニルヒドラゾン化糖鎖の糖鎖構造を確認するため、MS/MSによる分析を行った。なお、MS/MSによる分析は、実施例1及び2で行ったLC/MS分析におけるMS分析と同様にして行った。結果を、図2に示す。
フェニルヒドラゾン化糖鎖のMS/MSにより、糖鎖の配列を推定することが可能であり、B3イオン（m/z657）の検出により、側鎖にN-アセチルノイラミン酸が結合していることが確認された（図2）。
【００５２】
2．同位体標識フェニルヒドラジンによるフェニルヒドラゾン化
d5-フェニルヒドラジンを入手した（大塚製薬株式会社診断事業部：純度59％）。上記1.と同様の条件下で、ジシアリル2本鎖糖鎖（品名：A2F Glycan,品番：CN-A2F-10U,Ludger製）と反応させ、d5-フェニルヒドラゾン化した糖鎖（d5-糖鎖）を合成した（反応スキーム2）。
【００５３】
＜反応スキーム2＞
【００５４】
3．フェニルヒドラゾン化糖鎖の比較定量
上記1.で調製したd0-糖鎖に、上記2.で調製したd5-糖鎖を等量混合し、実施例1及び2で使用したものと同じ機器を用い、同様の分析条件で、液体クロマトグラフィー/質量分析［LC/MS］を行った。その結果を図3に示す。
図3中、左上の図はベースピーククロマトグラム（d0-及びd5-糖鎖が検出されている）、左中の図はm/z 1230.5のマスクロマトグラム（d0-糖鎖が検出されている）、左下の図はm/z 1233.0のマスクロマトグラム（d5-糖鎖が検出されている）を示す。
図3右は、41分前後のマススペクトル（m/z 1230.51 - 1232.52はd0-糖鎖由来イオン，m/z 1233.01 - 1235.01はd5-糖鎖由来のイオンを示す。）である。
【００５５】
m/z 1230.5及びm/z 1233.0は、d0-糖鎖及びd5-糖鎖の2価イオンに相当し、d0-糖鎖とd5-糖鎖に由来する2．5u差のイオンピークとして検出されたものである。尚、d0-糖鎖とd5-糖鎖のピーク強度は一致していないが、これはd5-フェニルジヒドラジンの純度によるものである。
以上のようにd0-糖鎖にd5-糖鎖を混合して液体クロマトグラフィー/質量分析［LC/MS］を行うことによってd0-糖鎖の比較定量を行うことのできることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法は、フェニルヒドラゾン化糖類及び/又は糖鎖への誘導体化率が高いため、より正確に糖類及び/又は糖類の分析を行うことができる。特に、フェニルヒドラゾン化反応中に生じる、シアリル糖鎖からのシアル酸の解離を抑制しつつ、糖鎖をフェニルヒドラゾン化することができるため、シアリル糖鎖を含む試料の分析に有用である。また、本発明の比較定量分析は、シアリル糖鎖だけでなく、それ以外の糖類及び/又は糖鎖の分析にも有用である。
従って、胚の発生や細胞の分化、疾患等に伴って変化することが知られている糖タンパク質等の糖鎖の分析に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ジシアリル2本鎖糖鎖のフェニルヒドラゾン化とLC/MSによって得られたマスクロマトグラム
【図２】d0-糖鎖のMS/MSスペクトル
【図３】d0-及びd5-フェニルヒドラゾン化糖鎖のLC/MS（カラム：グラファイトカーボン，糖鎖：ジシアリル2本鎖）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法、前記方法によりフェニルヒドラゾン化した糖類及び糖鎖の分析方法、並びに、前記方法を利用した糖類及び糖鎖の比較定量方法に関し、更に詳しくは、糖類及び/又は糖鎖とフェニルヒドラジンを、酢酸/有機塩基/H2O溶媒又は酢酸/有機塩基溶媒中で反応させることにより、フェニルヒドラゾン化糖類及び/又は糖鎖への誘導体化率が高いだけでなく、フェニルヒドラゾン化反応におけるシアリル糖鎖からのシアル酸の解離を抑制することのできる、糖類及び/又は糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法、前記方法によりフェニルヒドラゾン化した糖類及び糖鎖の分析方法、並びに、前記方法を利用した糖類及び糖鎖の比較定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質の糖鎖は、タンパク質の活性や体内動態を調整する上で非常に重要な役割を果たしており、胚の発生や細胞の分化、疾患等に伴って変化することが知られている。例えば、自己免疫疾患や癌においては、生体内の糖タンパク質の糖鎖が変化することが知られており、早期診断マーカーとして利用することのできる糖鎖抗原を探索するための研究が盛んに行われている。
【０００３】
糖タンパク質性医薬品やグリコサミノグリカンに由来する医薬品の開発においては、これら医薬品の糖鎖部分が、溶解性、安定性、生物活性及び体内動態等に影響を及ぼすだけでなく、抗原性にも関与していることが知られており、品質、有効性及び安全性を確保するためには、糖鎖の詳細な構造解析が必要不可欠である。また、細胞・組織利用医薬品の研究開発及び品質評価においても、糖鎖を指標とした細胞特性の解析や品質評価方法に関する研究が進められている。
【０００４】
糖類や糖鎖を解析する方法としては、従来、2-アミノピリジンや2-アミノベンザミドなどで糖類や糖鎖を誘導体化した後、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて分離し、蛍光を検出する方法が一般的であった。
最近における糖類や糖鎖の解析は、質量分析法（MS）による解析が中心となっており、ESI-MS（エレクトロスプレーイオン化法/質量分析法）やMALDI-TOFMS（マトリックス支援レーザー脱離イオン化/飛行時間型質量分析法）なども利用されている。本発明者等も、グラファイトカーボンカラムを用いた液体クロマトグラフィー/質量分析（LC/MS）による、糖鎖プロファイリング法を提案している（非特許文献1）。
【非特許文献１】Nana Kawasaki et al., "Analysis of carbohydrate heterogeneity in a glycoprotein using liquid chromatography/mass spectrometry and liquid chromatography with tandem mass spectrometry.", Analytical Biochemistry: 269(1999)p.297-303.
【０００５】
しかしながら、糖類や糖鎖の解析に質量分析法を用いた場合には、再現性に問題があるため、糖類や糖鎖の定量分析法としては、十分なものではなかった。
そこで本発明者等は、同位体標識試薬である2-アミノピリジン（AP）の重水素置換体（d6-AP）を使用して、分子量が4Da大きいピリジルアミノ化（PA）糖類及び/又は糖鎖を調製し、内部標準として用いる方法を提案した（非特許文献2）。
【非特許文献２】Jin Yuan et al., "Isotope tag method for quantitative analysis of carbohydrates by liquid chromatography-mass spectrometry.", Journal of Chromatography A: 1067（2005）p.145-152
【０００６】
しかしながら、内部標準と試料の質量差、すなわちd0-PA糖鎖とd4-PA糖鎖の質量の違いが4Daしかないため、質量分析における精度が十分ではないという問題があった。また、シアル酸を含む糖鎖（シアリル糖鎖）は、活性や体内動態に関わる重要な糖鎖であるにも拘らず、前記d0-AP又はd6-APを用いた糖鎖の誘導化反応が酢酸溶媒中で行われるため、酸に弱いシアル酸が解離するという問題もあり、更に優れた糖鎖の質量分析法（MS）が求められていた。
【０００７】
一方、フェニルヒドラジンを用いる糖のフェニルヒドラゾン化方法がある。この方法は、フィッシャーが単糖の構造決定に使用したことで有名な標識法であり、現在は、糖鎖標識法としても利用されている。この方法は、還元反応がなく脱塩操作が不要であるため、比較的簡便な方法である。
この方法を応用した分析方法として、単糖をリン酸溶液中で標識した後、HPLCで分析する方法が報告されているが（特許文献1）、酸性水溶液（リン酸溶液）中で加熱して糖をフェニルヒドラゾン化するため、この方法を糖鎖に応用した場合には、シアル酸が解離するという問題がある。
【特許文献１】特開平04-29058号公報
【０００８】
シアル酸の解離を防止する方法として、糖鎖とフェニルヒドラジンを中性条件下、10％程度の有機溶媒を含む水溶液中で加熱して反応させる方法（非特許文献3）や、MALDI-TOFMSのターゲット上において、中性条件下、室温で反応を行わせるという簡便な方法（非特許文献4）が提案されているが、これらの場合には、未反応糖鎖が残るという問題点があり、更に効率的な糖鎖の誘導体化方法が求められていた。
【非特許文献３】Erika Lattova et al."influence of the labeling group on ionization and fragmentation of carbohydrates in mass spectrometry.", Journal of the American Society for Mass Spectrometry.:16(2005)p.683-696.
【非特許文献４】Erika Lattova et al."Labelling saccharides with phenylhydrazine for electrospray and matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry.", Journal of chromatography B:793(2003)p.167-179.
【０００９】
そこで本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、糖類及び/又は糖鎖とフェニルヒドラジンを、酢酸/有機塩基/H2O溶媒又は酢酸／有機塩基溶媒中で反応させることにより、フェニルヒドラゾン化糖類及び/又は糖鎖への誘導体化率が高くなり、未反応糖類及び/又は糖鎖を最小限に抑えることができることに加え、活性や体内動態に関わる重要なシアリル糖鎖中のシアル酸が、フェニルヒドラゾン化反応中に解離することを抑制することができることを見出すと共に、更に、同位体標識試薬であるフェニルヒドラジンの重水素置換体を用いた場合には、d0-フェニルヒドラジンとd5-フェニルヒドラジンの質量の違いが5Daとなるため、これを内部標準として使用した場合には、分析精度が向上することを見出し、本発明に到達した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って本発明の第1の目的は、フェニルヒドラゾン化糖類及び/又は糖鎖への誘導体化率の高い糖類及び/又は糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法を提供することにある。
本発明の第2の目的は、シアリル糖鎖のシアル酸の解離を抑制しつつ、シアリル糖鎖をフェニルヒドラゾン化する方法を提供することにある。
本発明の第3の目的は、本発明のフェニルヒドラゾン化方法を用いた、糖類及び/又は糖鎖の分析方法を提供することにある。
本発明の第4の目的は、本発明のフェニルヒドラゾン化方法を用いた、糖類及び/又は糖鎖の比較定量方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の第5の目的は、本発明の比較定量方法を利用した、糖鎖バイオマーカーの検索方法を提供することにある。
本発明の第6の目的は、本発明の比較定量方法を利用した、糖タンパク質性医薬品又はグリコサミノグリカン由来の医薬品に対する品質同等性/同質性評価方法を提供することにある。
本発明の第7の目的は、本発明の比較定量方法を利用した、細胞組織利用医薬品の特性解析を提供することにある。
本発明の第8の目的は、本発明の比較定量方法を利用した、品質試験方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
即ち本発明における第1の発明は、酢酸/有機塩基/H2O溶媒又は酢酸/有機塩基溶媒中で、フェニルヒドラジンを糖類及び/又は糖鎖と反応させることを特徴とする、糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法である（請求項1）。本発明においては、前記有機塩基が、ピリジン及び/又はトリエチルアミンであることが好ましく（請求項2）、前記反応が4〜80℃で行われることが好ましい（請求項3）。また、前記糖類又は糖鎖として、糖タンパク質又は糖脂質から切り出された糖類又は糖鎖を用いてもよく（請求項4）、前記フェニルヒドラジンとして、フェニル基上の水素原子が全て重水素原子で置換されたd5-フェニルヒドラジンを用いてもよい（請求項5）。
【００１３】
本発明における第2の発明は、上記した第1の発明において、前記糖鎖としてシアリル糖鎖を用いることを特徴とする、糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法である（請求項6）。
【００１４】
本発明の第3の発明は、試料に含まれる糖類及び/又は糖鎖を、上記した本発明の方法によってフェニルヒドラゾン化した後分析することを特徴とする糖類及び糖鎖の分析方法であり（請求項7）、前記試料として、少なくとも1種のシアリル糖鎖を含む試料を用いても良い（請求項8）。
【００１５】
本発明における第4の発明は、測定対象試料糖類又は糖鎖を、標準試料糖類又は糖鎖と比較して定量する糖類又は糖鎖の比較定量方法において、一方の試料に含まれる糖類又は糖鎖を上記した本発明の方法によってフェニルヒドラゾン化したd5-糖類又は糖鎖とし、他方の試料に含まれる糖類又は糖鎖を同様にしてフェニルヒドラゾン化したd0-糖類又は糖鎖として両者を既知の比率で混合し、得られた混合物について、グラファイトカーボンカラム、逆相系カラム及び順相系カラムから選択されるカラムを用いて液体クロマトグラフィー/質量分析を行うことを特徴とする比較定量方法（請求項9又は11）である。本発明の比較定量方法においては、試料糖類又は糖鎖として、試料糖タンパク質から切り出された糖類又は糖鎖を、前記標準糖類又は糖鎖として、標準糖タンパク質から切り出された糖類又は糖鎖を用いても良い（請求項10及び12）。
【００１６】
更に本発明における第5の発明は、本発明の糖鎖の比較定量方法を含む糖鎖バイオマーカーの検索方法であり（請求項13）、本発明の第6の発明は、本発明の糖鎖の比較定量方法を含む、糖タンパク質性医薬品又はグリコサミノグリカン由来の医薬品の品質同等性/同質性評価方法である（請求項14）。
また本発明における第7の発明は、本発明の糖鎖の比較定量方法を含む細胞組織利用医薬品の特性解析であり（請求項15）、本発明における第8の発明は、本発明における糖鎖の比較定量方法を含む細胞組織利用医薬品の品質試験方法である（請求項16）。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の糖類及び/又は糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法は、フェニルヒドラゾン化糖類及び/又は糖鎖への誘導体化率が高く、未反応糖類及び糖鎖を最小限に抑えることができるため、より正確な糖類及び/又は糖鎖の分析を行うことができると共に、糖類又は糖鎖の誘導体化における煩雑な還元操作や後処理を必要としないため、フェニルヒドラゾン化反応後の溶液を、そのまま分析することができる。また、フェニルヒドラゾン化反応中に生じるシアリル糖鎖からのシアル酸の解離を抑制しつつ、糖鎖をフェニルヒドラゾン化することができるため、シアリル糖鎖を含む試料の分析に好適である。更に、試料糖類又は糖鎖と5Da質量差を有する内部標準を用いることにより精度を改善することができるため、シアリル糖鎖だけでなく、それ以外の糖類又は糖鎖についても、より正確な、液体クロマトグラフィー/質量分析（LC/MS）による比較定量分析が可能となる。
【００１８】
従って本発明は、胚の発生や細胞の分化、疾患等に伴って変化することが知られている糖タンパク質の糖鎖の解析に有用であり、糖鎖バイオマーカーの検索や糖タンパク質性又はグリコサミノグリカンに由来する医薬品の品質同等性／同質性評価方法、更には、細胞組織利用医薬品の特性解析や、品質試験方法に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の方法について詳細に説明する。
本発明の糖類及び/又は糖鎖とフェニルヒドラジンを、酢酸/有機塩基/H2O溶媒又は酢酸/有機塩基溶媒中で反応させる糖類及び/又は糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法は、フェニルヒドラゾン化糖類及び/又は糖鎖への誘導体化率が高く、未反応糖類及び糖鎖の残存を最小限に抑えることができるため、より正確な糖類及び/又は糖鎖の分析に有用である。ここで誘導体化率とは、糖類及び/又は糖鎖からフェニルヒドラゾン化糖類又は糖鎖に誘導体化する割合を意味する。
【００２０】
本発明において用いられる糖類としては、例えば、マンノース、グルコース、ガラクトース、アラビノース、キシロース等の中性糖類、N-アセチルグルコサミン及びN-アセチルガラクトサミン等のアミノ糖類など、周知の単糖が挙げられる。
【００２１】
また、少糖類、多糖類を化学的又は酵素的に分解して得られた糖類を、本発明の糖類として用いることも可能である。従って、食品などから得られた少糖類、多糖類等や、動植物から抽出した糖タンパク質や糖脂質などから切り出された糖鎖を、化学的又は酵素的に分解して、本発明において用いられる糖類として使用してもよい。
【００２２】
本発明において用いられる糖鎖としては、上記の糖類を構成糖とする糖鎖であれば、特に制限されることはないが、例えば、N-結合型糖鎖やO-結合型糖鎖のような糖タンパク系糖鎖；糖脂質系糖鎖；ヒアルロン酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などのグリコサミノグリカン系糖鎖のような糖鎖などが挙げられる。
食品などから得られた少糖類、多糖類等や、動植物から抽出した糖タンパク質や糖脂質などから切り出された糖鎖を、本発明において用いられる糖鎖として使用してもよい。
【００２３】
本発明のフェニルヒドラゾン化方法において使用することができるフェニルヒドラジンとしては、重水素置換しないd0-フェニルヒドラジン、又は、フェニルヒドラジンのフェニル基上に存在する全水素原子を重水素原子で置換したd5-フェニルヒドラジンを用いることができる。
本発明の比較定量方法で測定する場合には、d0-フェニルヒドラジン及びd5-フェニルヒドラジンを併用することが必要である。
【００２４】
本発明において用いられる酢酸/有機塩基/H2O溶媒又は酢酸/有機塩基溶媒の有機塩基としては、ピリジン、2-ピコリン、3-ピコリン、4-ピコリン、キノリン等の窒素複素環化合物や、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン等のアルキルアミンなどを例示することができる。
特に本発明において用いられる有機塩基としては、シアル酸の解離が少なく、未反応糖鎖を最低限に抑えることができるという観点から、ピリジン及び/又はトリエチルアミンを用いることが好ましい。
また、本発明において用いられる酢酸/有機塩基溶媒の比率［v/v］は、10/3〜3/10（酢酸含有率:約23〜77％）であることが好ましい。特に、シアル酸の解離が少なく、未反応糖鎖を最低限に抑えることができるという観点から、9/4〜5/8（酢酸含有率:約38〜69％）であることが好ましく、中でも、8/5（酢酸含有率:約62％）であることが特に好ましい。本発明において用いられる酢酸/有機塩基/H2O溶媒の比率［v/v］は、［酢酸/有機塩基（v/v;3/7〜7/3溶液）］:［H2O］が、1:9〜9:1であることが好ましく、シアル酸の解離が少なく、未反応糖鎖を最低限に抑えることができるという観点から、特に、［酢酸/有機塩基（v/v;5/5溶液）］:［H2O］が1:9であることが好ましい。
【００２５】
本発明の方法においては、酢酸/有機塩基/H2O溶媒又は酢酸/有機塩基溶媒中における糖類及び/又は糖鎖とフェニルヒドラジンの反応を、4〜80℃の範囲で行うことが好ましく、室温〜80℃の範囲で行われることが特に好ましい。また、反応時間は、10分以上であることが好ましく、30〜60分間反応させることが特に好ましい
【００２６】
即ち、本発明における糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法は、フェニルヒドラゾン化糖類及び/又は糖鎖への誘導体化率が高く、シアリル糖鎖からのシアル酸の解離を抑制しつつ、シアリル糖鎖をフェニルヒドラゾン化することができる点に最大の特徴があり、活性や体内動態に関わる重要な糖鎖であるシアリル糖鎖の分析に特に有用である。
【００２７】
本発明におけるシアリル糖鎖とは、シアル酸を含有する糖鎖を意味し、シアル酸とは、9個の骨格炭素からなるカルボキシル基を有する2-ケト-3-デオキシノノン酸を意味する。シアル酸としては、N-アセチルノイラミン酸、N-グリコリルノイラミン酸及びデアミノノイラミン酸、並びに、それらのアセチル化体、メチル化体、ラクチル化体及び硫酸化体等の修飾シアル酸などを例示することができる。
【００２８】
本発明における、試料に含まれる糖類及び/又は糖鎖を、上記した本発明の方法によりフェニルヒドラゾン化した後分析する方法は、フェニルヒドラゾン化した糖類及び/又は糖鎖を、液体クロマトグラフィー（LC）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等の公知の分析機器で分離し、紫外吸収を測定することにより行なうことができる。また、質量分析（MS）、液体クロマトグラフィー/質量分析（LC/MS）によって、質量を測定することにより分析することもできる。
【００２９】
本発明のフェニルヒドラゾン化方法は、フェニルヒドラジンと反応しない未反応糖類及び/又は糖鎖の残存を最小限に抑えることができるため、より正確に糖類及び/又は糖鎖の分析を行うことができる。例えば、上記したような糖類及び/又は糖鎖を単独で、又は、複数含有する試料を分析することができる。
また、シアリル糖鎖からのシアル酸の解離を抑制することができるので、シアリル糖鎖を含有する糖類及び/又は糖鎖の分析に有用である。たとえば、シアリル糖鎖単独試料のみならず、種々のシアリル糖鎖を含有する試料や、シアリル糖鎖と共にシアル酸を含有しない糖鎖を含む試料の分析に有用である。
【００３０】
本発明におけるフェニルヒドラゾン化した糖類及び糖鎖の比較定量方法は、先ず、本発明のフェニルヒドラゾン化方法によりフェニルヒドラゾン化d5-糖類又は糖鎖を調製し、同様に、フェニルヒドラゾン化d0-糖類又は糖鎖を調製する。次いで、得られたフェニルヒドラゾン化d5-糖類又は糖鎖とフェニルヒドラゾン化d0-糖類又は糖鎖を混合し、グラファイトカーボンカラム、逆相系カラム及び順相系カラムから選択されるカラムを用いて液体クロマトグラフィー/質量分析（LC/MS）を行う方法である。逆相系カラムとしては、例えば、C18、C8カラムなどを例示することができる。順相系カラムとしては、親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）用カラムなどを例示することができる。また、上記混合は、一方を標準試料として両者を比較定量するために行うので、等量混合とすることが好ましい。
【００３１】
これによって、上記のd5-糖類又は糖鎖、及び、d0-糖類又は糖鎖の一方を、試料糖類又は試料糖鎖のフェニルヒドラゾン化物とし、他方を、内部標準として機能する標準糖類又は標準糖鎖のフェニルヒドラゾン化物とし、標準糖類又は標準糖鎖と比較して試料糖鎖を定量することが可能となる。
【００３２】
本発明の試料糖類及び試料糖鎖、並びに、標準糖類及び標準糖鎖は、糖類及び/又は糖鎖であれば特に制限されるものではなく、本発明のフェニルヒドラゾン化方法で用いられる糖類及び/又は糖鎖として例示したものの中から適宜選択することができる。
【００３３】
更に本発明の糖鎖バイオマーカーの検索方法は、本発明の前記比較定量方法を用い、がん、免疫疾患などの患者から得られた糖鎖と、正常人の糖鎖を比較定量することにより、糖鎖バイオマーカーとなり得る、疾患に関連する糖鎖の変化を検索するものである。
【００３４】
例えば、公知の手法により、がん患者及び正常人から採取した血液又は組織から糖タンパク質を精製し、得られた糖タンパク質から糖鎖を切り出し、次いで、本発明のフェニルヒドラゾン化方法によってフェニルヒドラゾン化し、本発明の比較定量方法によって糖鎖の比較定量を行うことができる。この場合、がん患者から得られた糖鎖をd0-フェニルヒドラジンで、正常人から得られた糖鎖をd5-フェニルヒドラジンでフェニルヒドラゾン化してこれを標準試料とすることにより、変化した糖鎖を検出することができる。
【００３５】
本発明における、糖タンパク質性又はグリコサミノグリカン由来の医薬品における品質同等性/同質性評価方法は、比較対照となる糖タンパク質性又はグリコサミノグリカン由来の医薬品における糖鎖を、本発明の方法により比較定量することにより、両者の医薬品の品質同等性/同質性を評価するものである。
【００３６】
例えば、比較対照となる糖タンパク質性又はグリコサミノグリカン由来の医薬品から、公知の方法により糖鎖を切り出し、本発明のフェニルヒドラゾン化方法によってフェニルヒドラゾン化し、本発明の比較定量方法によって糖鎖の比較定量を行うことができる。この場合、一方の医薬品から得られた糖鎖をd0-フェニルヒドラジンで、他方の医薬品から得られた糖鎖をd5-フェニルヒドラジンでフェニルヒドラゾン化した後両者を比較定量することにより、両者の糖鎖に変化がないかどうかを確認し、品質同等性/同質性を評価する。
【００３７】
本発明の細胞・組織利用医薬品の特性解析及び、細胞・組織利用医薬品の品質試験方法は、比較対照となる細胞・組織利用医薬品の糖鎖を、本発明の方法により比較定量することにより、両者の医薬品の特性を解析し、品質を評価するものである。
【００３８】
例えば、公知の手法により、分化前及び分化後の細胞から糖鎖を切り出し、本発明の比較定量方法を用いることにより、細胞・組織利用医薬品の特性を解析したり、品質試験を行うことができる。この場合、分化前の細胞から得られた糖鎖をd0-フェニルヒドラジンで、分化後の細胞から得られた糖鎖をd5-フェニルヒドラジンでフェニルヒドラゾン化し、次いで両者の糖鎖の違いを分析して特性を解析する。また、両者の糖鎖に変化がないかどうかを確認し、品質同等性を評価することもできる。
【００３９】
以下、実施例によって、本発明の糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法、前記方法によりフェニルヒドラゾン化した糖類及び糖鎖の分析方法、並びに、前記方法を利用した比較定量方法について、更に詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
10％フェニルヒドラジンを含む表1の反応溶媒に、ジシアリル2本鎖糖鎖（品名：A2F Glycan,品番：CN-A2F-10U,Ludger製）を溶解し、80℃で1時間加熱することにより、フェニルヒドラゾン化糖鎖を得た。得られた反応物についてLC/MSを行い、同一クロマトグラム上に検出された未反応糖鎖とフェニルヒドラゾン化糖鎖のピーク面積から、フェニルヒドラゾン化されなかった糖鎖（未反応糖鎖）の比率（［未反応糖鎖/全ての糖鎖］×100）を算出した（図1（B）参照）。シアル酸が解離したフェニルヒドラゾン化糖鎖の比率（［解離した糖鎖/全ての糖鎖］×100）についても、シアル酸が解離した糖鎖とフェニルヒドラゾン化糖鎖のピーク面積から算出した（図1（C）参照）。
なお、実施例1-3及び比較例1-1〜1-4については、ジシアリル2本鎖糖鎖の代わりに、シアル酸の結合していない高マンノース型糖鎖（品名：MAN-9 Glycan,品番：CN-MAN9-10U,Ludger製）を用い、ジシアリル2本鎖糖鎖の場合と同様にして、フェニルヒドラゾン化及びLC/MSを行った。
その結果を表1に示す。
【００４１】
【表１】
【実施例２】
【００４２】
10％フェニルヒドラジンを含む酢酸/ピリジン混合液（8/5）に、ジシアリル2本鎖糖鎖（品名：A2F Glycan,品番：CN-A2F-10U,Ludger製）を溶解し、表2に記載された条件で反応させることによって、フェニルヒドラゾン化糖鎖を得た。得られた反応物について、実施例1と同様にして、フェニルヒドラゾン化されなかった糖鎖（未反応糖鎖）の比率、及びシアル酸が解離したフェニルヒドラゾン化糖鎖の比率を算出した。その結果を表2に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】
図1に、実施例2-2で得られたフェニルヒドラゾン化糖鎖（室温30分反応）について、LC/MSによって得られたマスクロマトグラムを示す。
実施例1と同様にして算出した未反応糖鎖の比率は3％であり、フェニルヒドラゾン化糖鎖への誘導体化率が極めて高いことが確認された。また、実施例1と同様にして算出したシアル酸が解離したフェニルヒドラゾン化糖鎖の比率は4％であり、シアル酸の解離についても、十分に抑えられていることが確認された。
【００４５】
LC／MS分析における使用機器及び分析条件は、以下の通りである。
＜液体クロマトグラフィー（LC）＞
装置：NanoFrontier nLC(日立ハイテクフィールディング）
カラム：Hypercarb(150×0.075mm,サーモフィッシャーサイエンティフィック)
トラップカートリッジ：グラファイトカーボンカートリッジ(5×0.3mm,化学物質評価研究機構)
流速：200 nL/分
バッファーA：2% CH3CN/ 5mM 酢酸アンモニウム(pH 9.6)
バッファーB：80% CH3CN/ 5mM 酢酸アンモニウム(pH 9.6)
グラジエント：バッファーB 2→90%/60min.
＜質量分析（MS）＞
装置：LTQ-FT(サーモフィッシャーサイエンティフィック)
Ion mode：Positive ion mode
【実施例３】
【００４６】
10％フェニルヒドラジンを含む表3の反応溶媒に、N-アセチルガラクトサミン（品名：N-acetyl-D-galactosamine,品番：A2795-100MG,純度：98％,SIGMA製）を溶解し、室温で反応させることによりフェニルヒドラゾン化糖類を得た。得られたフェニルヒドラゾン化糖類を、HPLCを用いて下記の条件で分離し、紫外吸収（245nm）を測定した。得られたピークの面積からフェニルヒドラゾン糖鎖の割合（％）を算出した。
＜高速液体クロマトグラフィー（HPLC）＞
装置：Magic 2002(Michrom BioResources製)
カラム：PLRP-S(150×1.0mm,Michrom BioResources製)
流速：50μL/分
バッファーA：2% CH3CN/0.1％HCOOH
バッファーB：90% CH3CN/0.1%HCOOH
グラジエント：バッファーB 0→30%/15min.
【００４７】
【表３】
＊10％フェニルヒドラジンを含む上記反応溶媒を用いて、100分間反応させた時のフェニルヒドラゾン化糖鎖のピーク面積を100として算出。
【００４８】
いずれの反応溶媒を用いた場合も40分間のフェニルヒドラゾン化で、フェニルヒドラゾン化糖類の比率は95％以上であり、誘導体化率が高いことが確認された。特に、有機塩基としてピリジンを用いた場合は、10分間の標識でフェニルヒドラゾン化糖類の比率は95％以上であり、誘導体化率が極めて高いことが確認された。
【実施例４】
【００４９】
1．糖鎖のフェニルヒドラゾン化
10％フェニルヒドラジンを含む酢酸/ピリジン（8/5）混合液に、ジシアリル2本鎖糖鎖（品名：A2F Glycan,品番：CN-A2F-10U,Ludger製）を溶解し、80℃で1時間加熱することによって、90％以上の収率で、d0-フェニルヒドラゾン化した糖鎖（d0-糖鎖）を合成した（反応スキーム1）。
実施例1及び2と同様に算出した、シアル酸が解離したフェニルヒドラゾン化糖鎖及び未反応糖鎖の合計は10％以下であった。
【００５０】
＜反応スキーム1＞
【００５１】
得られたフェニルヒドラゾン化糖鎖の糖鎖構造を確認するため、MS/MSによる分析を行った。なお、MS/MSによる分析は、実施例1及び2で行ったLC/MS分析におけるMS分析と同様にして行った。結果を、図2に示す。
フェニルヒドラゾン化糖鎖のMS/MSにより、糖鎖の配列を推定することが可能であり、B3イオン（m/z657）の検出により、側鎖にN-アセチルノイラミン酸が結合していることが確認された（図2）。
【００５２】
2．同位体標識フェニルヒドラジンによるフェニルヒドラゾン化
d5-フェニルヒドラジンを入手した（大塚製薬株式会社診断事業部：純度59％）。上記1.と同様の条件下で、ジシアリル2本鎖糖鎖（品名：A2F Glycan,品番：CN-A2F-10U,Ludger製）と反応させ、d5-フェニルヒドラゾン化した糖鎖（d5-糖鎖）を合成した（反応スキーム2）。
【００５３】
＜反応スキーム2＞
【００５４】
3．フェニルヒドラゾン化糖鎖の比較定量
上記1.で調製したd0-糖鎖に、上記2.で調製したd5-糖鎖を等量混合し、実施例1及び2で使用したものと同じ機器を用い、同様の分析条件で、液体クロマトグラフィー/質量分析［LC/MS］を行った。その結果を図3に示す。
図3中、左上の図はベースピーククロマトグラム（d0-及びd5-糖鎖が検出されている）、左中の図はm/z 1230.5のマスクロマトグラム（d0-糖鎖が検出されている）、左下の図はm/z 1233.0のマスクロマトグラム（d5-糖鎖が検出されている）を示す。
図3右は、41分前後のマススペクトル（m/z 1230.51 - 1232.52はd0-糖鎖由来イオン，m/z 1233.01 - 1235.01はd5-糖鎖由来のイオンを示す。）である。
【００５５】
m/z 1230.5及びm/z 1233.0は、d0-糖鎖及びd5-糖鎖の2価イオンに相当し、d0-糖鎖とd5-糖鎖に由来する2．5u差のイオンピークとして検出されたものである。尚、d0-糖鎖とd5-糖鎖のピーク強度は一致していないが、これはd5-フェニルジヒドラジンの純度によるものである。
以上のようにd0-糖鎖にd5-糖鎖を混合して液体クロマトグラフィー/質量分析［LC/MS］を行うことによってd0-糖鎖の比較定量を行うことのできることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法は、フェニルヒドラゾン化糖類及び/又は糖鎖への誘導体化率が高いため、より正確に糖類及び/又は糖類の分析を行うことができる。特に、フェニルヒドラゾン化反応中に生じる、シアリル糖鎖からのシアル酸の解離を抑制しつつ、糖鎖をフェニルヒドラゾン化することができるため、シアリル糖鎖を含む試料の分析に有用である。また、本発明の比較定量分析は、シアリル糖鎖だけでなく、それ以外の糖類及び/又は糖鎖の分析にも有用である。
従って、胚の発生や細胞の分化、疾患等に伴って変化することが知られている糖タンパク質等の糖鎖の分析に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ジシアリル2本鎖糖鎖のフェニルヒドラゾン化とLC/MSによって得られたマスクロマトグラム
【図２】d0-糖鎖のMS/MSスペクトル
【図３】d0-及びd5-フェニルヒドラゾン化糖鎖のLC/MS（カラム：グラファイトカーボン，糖鎖：ジシアリル2本鎖）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酢酸/有機塩基/H2O溶媒又は酢酸/有機塩基溶媒中で、フェニルヒドラジンを糖類及び/又は糖鎖と反応させることを特徴とする、糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法。
【請求項２】
前記有機塩基が、ピリジン及び/又はトリエチルアミンである、請求項1に記載された糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法。
【請求項３】
前記反応が4〜80℃で行われる、請求項1又は2に記載された糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法。
【請求項４】
前記糖類又は糖鎖が、糖タンパク質又は糖脂質から切り出された糖類又は糖鎖である、請求項1〜3の何れかに記載された糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法。
【請求項５】
前記フェニルヒドラジンが、フェニル基上の水素原子が全て重水素原子で置換されたd5-フェニルヒドラジンである、請求項1〜4の何れかに記載された糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法。
【請求項６】
前記糖鎖がシアリル糖鎖である、請求項1〜5の何れかに記載された糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法。
【請求項７】
試料に含まれる糖類及び/又は糖鎖を、請求項1〜6の方法によってフェニルヒドラゾン化した後分析することを特徴とする糖類及び糖鎖の分析方法。
【請求項８】
前記試料が少なくとも1種のシアリル糖鎖を含む、請求項7に記載された糖鎖の分析方法。
【請求項９】
測定対象試料糖類を標準試料糖類と比較して定量する糖類の比較定量方法において、一方の試料に含まれる糖類を請求項5の方法によってフェニルヒドラゾン化したd5-糖類とし、他方の試料に含まれる糖類を請求項1〜4の方法によってフェニルヒドラゾン化したd0−糖類として両者を既知の比率で混合し、得られた混合物について、グラファイトカーボンカラム、逆相系カラム及び順相系カラムから選択されるカラムを用いて液体クロマトグラフィー/質量分析を行うことを特徴とする糖類の比較定量方法。
【請求項１０】
前記試料糖類が、試料糖タンパク質又は試料糖脂質から切り出された糖類であり、前記標準糖類が、標準糖タンパク質又は標準糖脂質から切り出された糖類である、請求項9に記載された糖類の比較定量方法。
【請求項１１】
測定対象試料糖鎖を標準試料糖鎖と比較して定量する糖鎖の比較定量方法において、一方の試料に含まれる糖鎖を請求項5の方法によってフェニルヒドラゾン化したd5-糖鎖とし、他方の試料に含まれる糖鎖を請求項1〜4の方法によってフェニルヒドラゾン化したd0-糖鎖として両者を既知の比率で混合し、得られた混合物について、グラファイトカーボンカラム、逆相系カラム及び順相系カラムから選択されるカラムを用いて液体クロマトグラフィー/質量分析を行うことを特徴とする糖鎖の比較定量方法。
【請求項１２】
前記試料糖鎖が、試料糖タンパク質又は試料糖脂質から切り出された糖鎖であり、前記標準糖鎖が、標準糖タンパク質又は標準糖脂質から切り出された糖鎖である、請求項11に記載された糖鎖の比較定量方法。
【請求項１３】
請求項12に記載された糖鎖の比較定量方法を含む、糖鎖バイオマーカーの検索方法。
【請求項１４】
請求項12に記載された糖鎖の比較定量方法を含む、糖タンパク質性医薬品又はグリコサミノグリカン由来の医薬品の品質同等性/同質性評価方法。
【請求項１５】
請求項12に記載された糖鎖の比較定量方法を含む、細胞組織利用医薬品の特性解析。
【請求項１６】
請求項12に記載された糖鎖の比較定量方法を含む、細胞組織利用医薬品の品質試験方法。
【請求項１】
酢酸/有機塩基/H2O溶媒又は酢酸/有機塩基溶媒中で、フェニルヒドラジンを糖類及び/又は糖鎖と反応させることを特徴とする、糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法。
【請求項２】
前記有機塩基が、ピリジン及び/又はトリエチルアミンである、請求項1に記載された糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法。
【請求項３】
前記反応が4〜80℃で行われる、請求項1又は2に記載された糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法。
【請求項４】
前記糖類又は糖鎖が、糖タンパク質又は糖脂質から切り出された糖類又は糖鎖である、請求項1〜3の何れかに記載された糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法。
【請求項５】
前記フェニルヒドラジンが、フェニル基上の水素原子が全て重水素原子で置換されたd5-フェニルヒドラジンである、請求項1〜4の何れかに記載された糖類及び糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法。
【請求項６】
前記糖鎖がシアリル糖鎖である、請求項1〜5の何れかに記載された糖鎖のフェニルヒドラゾン化方法。
【請求項７】
試料に含まれる糖類及び/又は糖鎖を、請求項1〜6の方法によってフェニルヒドラゾン化した後分析することを特徴とする糖類及び糖鎖の分析方法。
【請求項８】
前記試料が少なくとも1種のシアリル糖鎖を含む、請求項7に記載された糖鎖の分析方法。
【請求項９】
測定対象試料糖類を標準試料糖類と比較して定量する糖類の比較定量方法において、一方の試料に含まれる糖類を請求項5の方法によってフェニルヒドラゾン化したd5-糖類とし、他方の試料に含まれる糖類を請求項1〜4の方法によってフェニルヒドラゾン化したd0−糖類として両者を既知の比率で混合し、得られた混合物について、グラファイトカーボンカラム、逆相系カラム及び順相系カラムから選択されるカラムを用いて液体クロマトグラフィー/質量分析を行うことを特徴とする糖類の比較定量方法。
【請求項１０】
前記試料糖類が、試料糖タンパク質又は試料糖脂質から切り出された糖類であり、前記標準糖類が、標準糖タンパク質又は標準糖脂質から切り出された糖類である、請求項9に記載された糖類の比較定量方法。
【請求項１１】
測定対象試料糖鎖を標準試料糖鎖と比較して定量する糖鎖の比較定量方法において、一方の試料に含まれる糖鎖を請求項5の方法によってフェニルヒドラゾン化したd5-糖鎖とし、他方の試料に含まれる糖鎖を請求項1〜4の方法によってフェニルヒドラゾン化したd0-糖鎖として両者を既知の比率で混合し、得られた混合物について、グラファイトカーボンカラム、逆相系カラム及び順相系カラムから選択されるカラムを用いて液体クロマトグラフィー/質量分析を行うことを特徴とする糖鎖の比較定量方法。
【請求項１２】
前記試料糖鎖が、試料糖タンパク質又は試料糖脂質から切り出された糖鎖であり、前記標準糖鎖が、標準糖タンパク質又は標準糖脂質から切り出された糖鎖である、請求項11に記載された糖鎖の比較定量方法。
【請求項１３】
請求項12に記載された糖鎖の比較定量方法を含む、糖鎖バイオマーカーの検索方法。
【請求項１４】
請求項12に記載された糖鎖の比較定量方法を含む、糖タンパク質性医薬品又はグリコサミノグリカン由来の医薬品の品質同等性/同質性評価方法。
【請求項１５】
請求項12に記載された糖鎖の比較定量方法を含む、細胞組織利用医薬品の特性解析。
【請求項１６】
請求項12に記載された糖鎖の比較定量方法を含む、細胞組織利用医薬品の品質試験方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−１４５１６９（Ｐ２００９−１４５１６９Ａ）
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３２２１６１（Ｐ２００７−３２２１６１）
【出願日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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