本開示は、１種以上の体細胞、例えば、部分的に分化したまたは完全分化／最終分化した体細胞を、より分化していない状態、例えば、多能性または多分化能状態まで再プログラミングする方法に関する。さらなる実施形態において、本発明はまた、本発明の方法によって産生された再プログラミングされた体細胞、本発明の再プログラミングされた体細胞を含むキメラ動物、上記細胞の使用、および体細胞を再プログラミングするために有用な薬剤を同定するための方法にも関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのコード領域を含む核酸構築物であって、ここで、前記コード領域は、単一のオープンリーディングフレームを形成するように自己切断ペプチドをコードする核酸によって各々に連結されており、前記コード領域は、単独で、または１つ以上のさらなる再プログラミング因子と組み合わせてのいずれかで、哺乳動物体細胞を多能性まで再プログラミングすることが可能である第１および第２の再プログラミング因子をコードする、核酸構築物。
【請求項２】
第３の再プログラミング因子をコードする第３のコード領域をさらに含み、前記３つのコード領域は、単一のオープンリーディングフレームを形成するように自己切断ペプチドをコードする核酸によって互いに連結されている、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
第３および第４の再プログラミング因子をコードする第３および第４の遺伝子をさらに含み、前記４つのコード領域は、単一のオープンリーディングフレームを形成するように自己切断ペプチドをコードする核酸によって互いに連結されている、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記自己切断ペプチドがウイルス性の２Ａペプチドである、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記自己切断ペプチドがアフトウイルス２Ａペプチドである、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記再プログラミング因子がＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８、およびｃ−Ｍｙｃから選択される、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記コード領域が、哺乳動物体細胞を多能性に再プログラムするために少なくとも１種のさらなる再プログラミング因子を必要とする第１および第２の再プログラミング因子をコードする、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項８】
Ｏｃｔ４をコードしない、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項９】
Ｋｌｆ４をコードしない、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
Ｓｏｘ２をコードしない、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
ｃ−Ｍｙｃをコードしない、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
Ｌｉｎ２８をコードしない、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１３】
Ｎａｎｏｇをコードしない、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１４】
前記コード領域が、（ｉ）Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２からなるセット；（ｉｉ）Ｏｃｔ４およびＫｌｆ４からなるセット；（ｉｉｉ）Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇからなるセット；（ｉｖ）Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、およびＳｏｘ２からなるセット；（ｖ）Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８からなるセット；（ｖｉ）Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２からなるセット；ならびに（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかからなりかつｃ−Ｍｙｃをさらに含むセットから選択される再プログラミング因子のセットをコードする、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１５】
プロモーターに作動可能に連結された請求項１に記載の核酸構築物を含む発現カセットであって、ここで、前記プロモーターは、前記再プログラミング因子をコードするポリシストロン性メッセージの転写を駆動し、各再プログラミング因子が、自己切断ペプチドによって、少なくとも１つの他の再プログラミング因子に連結されている、発現カセット。
【請求項１６】
哺乳動物細胞のゲノムへの組込みを媒介する１つ以上の部位をさらに含む、請求項１５に記載の発現カセット。
【請求項１７】
請求項１５に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
【請求項１８】
レトロウイルス性である、請求項１７に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
プロモーターが誘導性である、請求項１８に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１５に記載の発現カセットを含む哺乳動物細胞。
【請求項２１】
体細胞である、請求項２０に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２２】
最終分化した体細胞である、請求項２０に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２３】
ｉＰＳ細胞である、請求項２０に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２４】
請求項２３に記載の哺乳動物ｉＰＳ細胞から少なくとも部分的に生成されるキメラマウス。
【請求項２５】
前記哺乳動物ｉＰＳ細胞をマウス未分化胚芽細胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｔ）に注入すること、および前記未分化胚芽細胞をインビボでマウスに成長させることによって生成される、請求項２４に記載のキメラマウス。
【請求項２６】
前記ｉＰＳ細胞から誘導される、請求項２４に記載のマウスから得られた細胞。
【請求項２７】
ヒト細胞である、請求項２０に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２８】
前記発現カセットが、ゲノムの座に組み込まれ、前記ゲノムの座の破壊が細胞に対して最小限の作用を有するかまたは全く作用を有さない、請求項２０に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２９】
前記発現カセットから２つの再プログラミング因子を発現する、請求項２０に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３０】
前記発現カセットから３つの再プログラミング因子を発現する、請求項２０に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３１】
前記発現カセットから３つの再プログラミング因子を発現し、前記３つの再プログラミング因子は、少なくとも０．０５％の効率で哺乳動物線維芽細胞を再プログラムするために十分ではない、請求項２０に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３２】
前記発現カセットから３つの再プログラミング因子を発現し、前記３つの再プログラミング因子は、少なくとも０．０５％の効率で哺乳動物線維芽細胞を再プログラムするために十分である、請求項２０に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３３】
座に組み込まれたレポーター遺伝子をさらに含み、前記レポーター遺伝子の活性化が多能性への再プログラミングのマーカーとして役立つ、請求項２０に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３４】
座がＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４から選択される、請求項３１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項３５】
複数の本質的に遺伝的に同一な請求項２０に記載の細胞を含む組成物。
【請求項３６】
請求項２０に記載の１つ以上の哺乳動物細胞および試験薬剤を含む、再プログラミング薬剤を同定するための組成物。
【請求項３７】
発現カセットからの再プログラミング因子の発現を誘導する薬剤をさらに含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３８】
再プログラミング薬剤を同定する方法であって：
（ｉ）再プログラミング因子が発現カセットから発現され、かつ細胞増殖が起こる条件下で、一定の期間、請求項３４に記載の組成物を維持する工程；および
（ｉｉ）細胞が再プログラミングされた状態になる程度を評価する工程であって、再プログラミングが、前記組成物が試験薬剤を欠く場合に起こるよりも有意に高い頻度で起こるとき、前記試験薬剤が再プログラミング薬剤または再プログラミングのエンハンサーとして同定される、工程
を包含する方法。
【請求項３９】
前記組成物が少なくともＸ日間維持される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記試験薬剤が少なくともＸ日間存在している、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞が、一定の期間に前記試験薬剤の非存在下で維持された場合には検出可能な頻度で再プログラミングされた状態にならないが、前記期間の少なくとも一部の間に前記試験薬剤の存在下で維持された場合には検出可能な頻度で再プログラミングされた状態になるとき、前記試験薬剤が再プログラミング薬剤として同定される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞が、一定の期間に前記試験薬剤の非存在下で維持された場合には検出可能な頻度で再プログラミングされた状態になり、かつ前記期間の少なくとも一部の間に前記試験薬剤の存在下で維持された場合には有意により高い頻度で再プログラミングされた状態になるとき、前記試験薬剤が再プログラミング薬剤のエンハンサーとして同定される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が、前記発現カセットから再プログラミング因子のセットを発現し、ここで、前記セットは、（ｉ）Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２；（ｉｉ）Ｏｃｔ４およびＫｌｆ４；（ｉｉｉ）Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇ；（ｉｖ）Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、およびＳｏｘ２；（ｖ）Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８；（ｖｉ）Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２；ならびに（ｖｉｉ）ｃ−Ｍｙｃをさらに含む（ｉ）〜（ｖｉ）ののうちの任意のものからなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
分化した体細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって：
（ａ）分化した体細胞を、前記細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１種の再プログラミング薬剤と接触させる工程；
（ｂ）前記細胞の再プログラミングを開始するために十分な期間、前記細胞の増殖のため、および前記少なくとも１種の再プログラミング薬剤の活性のために適切な条件下で前記細胞を維持する工程；ならびに
（ｃ）前記少なくとも１種の再プログラミング薬剤を機能的に不活化する工程
を包含する方法。
【請求項４５】
分化した体細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって：
（ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１種の外因的に導入された因子を含む、前記分化した体細胞を提供する工程；
（ｂ）少なくとも１種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記細胞の増殖のため、および前記少なくとも１種の外因的に導入された因子の活性化のために適切な条件下で前記細胞を維持する工程；ならびに
（ｃ）前記少なくとも１種の外因的に導入された因子を機能的に不活化する工程
を包含する方法。
【請求項４６】
多能性状態に再プログラミングされた分化した体細胞を選択する方法であって：
（ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１種の外因的に導入された因子を含む、分化した体細胞を提供する工程；
（ｂ）少なくとも１種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記細胞の増殖のため、および前記少なくとも１種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記細胞を維持する工程；
（ｃ）前記少なくとも１種の外因的に導入された因子を機能的に不活化する工程；ならびに
（ｄ）多能性の１種以上のマーカーを示す細胞と、示さない細胞とを区別する工程
を包含する方法。
【請求項４７】
再プログラミングされた分化した体細胞から誘導された、単離された多能性細胞。
【請求項４８】
再プログラミングされた分化した体細胞から誘導された少なくとも７０％の多能性細胞を含む、精製された体細胞集団。
【請求項４９】
単離された多能性細胞であって、以下の工程：
（ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１種の外因的に導入された因子を含む、前記分化した体細胞を提供する工程；
（ｂ）少なくとも１種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記細胞の増殖のため、および前記少なくとも１種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記細胞を維持する工程；
（ｃ）前記少なくとも１種の外因的に導入された因子を機能的に不活化する工程；ならびに
（ｄ）多能性の１種以上のマーカーを示す細胞と、示さない細胞とを区別する工程；
を包含する方法によって産生される細胞。
【請求項５０】
再プログラミングされた分化した体細胞から誘導された少なくとも７０％の多能性細胞を含む、精製された体細胞集団であって、以下の工程：
（ａ）分化した体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１種の外因的に導入された因子を含む、前記分化した体細胞を提供する工程；
（ｂ）少なくとも１種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記細胞の増殖のため、および前記少なくとも１種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記細胞を維持する工程；
（ｃ）前記少なくとも１種の外因的に導入された因子を機能的に不活化する工程；ならびに
（ｄ）多能性の１種以上のマーカーを示す細胞と、示さない細胞とを区別する工程；
を包含する方法によって産生される、精製された体細胞集団。
【請求項５１】
多能性細胞を体細胞から産生する方法であって、以下の工程：
（ａ）体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１種の外因的に導入された因子を各々の体細胞が含む、前記１つ以上の体細胞を提供する工程であって、前記外因的に導入された因子は、メチル化誘導サイレンシングに供されていない誘導性ベクターを使用して導入される、工程；
（ｂ）少なくとも１種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記１つ以上の細胞の増殖のため、および前記少なくとも１種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記１つ以上の細胞を維持する工程；
（ｃ）前記少なくとも１種の外因的に導入された因子を機能的に不活化する工程；
（ｄ）多能性のマーカーを示す１つ以上の細胞を選択する工程；
（ｅ）前記多能性のマーカーを示す１つ以上の細胞を利用してキメラ胚を生成する工程；
（ｆ）前記キメラ胚から１つ以上の体細胞を得る工程；
（ｇ）少なくとも１種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な時間の間、前記１つ以上の体細胞の増殖のため、および前記少なくとも１種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記１つ以上の体細胞を維持する工程；ならびに
（ｈ）多能性の１種以上のマーカーを示す細胞と、示さない細胞とを区別する工程
を包含する方法。
【請求項５２】
単離された多能性細胞であって、以下の工程：
（ａ）体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１種の外因的に導入された因子を各々の体細胞が含む、前記１つ以上の体細胞を提供する工程であって、前記外因的に導入された因子は、メチル化誘導サイレンシングに供されていない誘導性ベクターを使用して導入される、工程；
（ｂ）少なくとも１種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記１つ以上の細胞の増殖のため、および前記少なくとも１種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記１つ以上の細胞を維持する工程；
（ｃ）前記少なくとも１種の外因的に導入された因子を機能的に不活化する工程；
（ｄ）多能性のマーカーを示す１つ以上の細胞を選択する工程；
（ｅ）前記多能性のマーカーを示す１つ以上の細胞を利用してキメラ胚を生成する工程；
（ｆ）前記キメラ胚から１つ以上の分化した体細胞を得る工程；
（ｇ）少なくとも１種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記１つ以上の分化した体細胞の増殖のため、および前記少なくとも１種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記１つ以上の分化した体細胞を維持する工程；ならびに
（ｈ）多能性の１種以上のマーカーを示す細胞と、示さない細胞とを区別する工程；
を包含する方法によって産生される、細胞。
【請求項５３】
再プログラミングされた分化した体細胞から誘導された少なくとも７０％の多能性細胞を含む、精製された体細胞集団であって、以下の工程：
（ａ）体細胞の多能性状態への再プログラミングに寄与する少なくとも１種の外因的に導入された因子を各々の体細胞が含む、前記１つ以上の体細胞を提供する工程であって、前記外因的に導入された因子は、メチル化誘導サイレンシングに供されていない誘導性ベクターを使用して導入される、工程；
（ｂ）少なくとも１種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記１つ以上の細胞の増殖のため、および前記少なくとも１種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記１つ以上の細胞を維持する工程；
（ｃ）前記少なくとも１種の外因的に導入された因子を機能的に不活化する工程；
（ｄ）多能性のマーカーを示す１つ以上の細胞を選択する工程；
（ｅ）前記多能性のマーカーを示す１つ以上の細胞を利用してキメラ胚を生成する工程；
（ｆ）前記キメラ胚から１つ以上の分化した体細胞を得る工程；
（ｇ）少なくとも１種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記１つ以上の分化した体細胞の増殖のため、および前記少なくとも１種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記１つ以上の分化した体細胞を維持する工程；ならびに
（ｈ）多能性の１種以上のマーカーを示す細胞と、示さない細胞とを区別する工程
を含有する方法によって産生される、精製された体細胞集団。
【請求項５４】
分化した免疫細胞を多能性状態に再プログラミングする方法であって、以下の工程：
（ａ）各々が誘導性ベクターの制御下にあり、かつ外因的に導入されたＣ／ＥＢＰαをさらに含む、外因的に導入されたＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを含む分化した免疫細胞を提供する工程；
（ｂ）内因性Ｎａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４を活性化するために十分な期間、前記細胞の増殖のため、ならびにＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＣ／ＥＢＰαの活性のために適切な条件下で、前記細胞を維持する工程；ならびに
（ｃ）外因的に導入されたＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを機能的に不活化する工程
を包含する方法。
【請求項５５】
再プログラミングされた分化した免疫細胞から誘導された少なくとも７０％の多能性細胞を含む、精製された免疫細胞集団であって、以下の工程：
（ａ）各々が誘導性ベクターの制御下にあり、かつ外因的に導入されたＣ／ＥＢＰαをさらに含む、外因的に導入されたＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを含む分化した免疫細胞を提供する工程；
（ｂ）内因性Ｎａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４を活性化するために十分な期間、前記細胞の増殖のため、ならびにＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＣ／ＥＢＰαの活性のために適切な条件下で、前記細胞を維持する工程；ならびに
（ｃ）外因的に導入されたＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ−４、およびｃ−Ｍｙｃを機能的に不活化する工程；
を包含する方法によって産生される、精製された免疫細胞集団。
【請求項５６】
再プログラミング薬剤を同定する方法であって、以下：
（ａ）体細胞を多能性状態に再プログラミングすることに寄与する少なくとも１種の外因的に導入された因子を各々の体細胞が含む、前記１つ以上の体細胞を提供する工程であって、前記外因的に導入された因子の各々は、メチル化誘導サイレンシングに供されていない誘導性ベクターを使用して導入され、その発現は別個のインデューサによって誘導されている調節エレメントによって制御されている、工程；
（ｂ）前記細胞を再プログラミングするため、または少なくとも１種の内因性多能性遺伝子を活性化するために十分な期間、前記1つ以上の細胞の増殖のため、および前記少なくとも１種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記１つ以上の細胞を維持する工程；
（ｃ）前記少なくとも１種の外因的に導入された因子を機能的に不活化する工程；
（ｄ）多能性のマーカーを示す１つ以上の細胞を選択する工程；
（ｅ）前記多能性のマーカーを示す１つ以上の細胞を利用してキメラ胚を生成する工程；
（ｆ）前記キメラ胚から１つ以上の体細胞を得る工程；
（ｇ）前記１つ以上の体細胞の増殖のため、および前記少なくとも１種の外因的に導入された因子の活性のために適切な条件下で前記１つ以上の体細胞を維持する工程であって、ここで、前記少なくとも１種の外因的に導入された因子の活性は、少なくとも１種の内因性多能性遺伝子を活性化するためにそれ自体では不十分である、工程；
（ｈ）前記（ｇ）の体細胞を、１種以上の候補再プログラミング薬剤と接触させる工程；ならびに
（ｉ）多能性の１種以上のマーカーを示す前記１種以上の候補再プログラミング薬剤と接触した細胞を同定する工程であって、ここで、前記（ｇ）の体細胞に多能性の１種以上のマーカーを示すように誘導する候補再プログラミング薬剤が、再プログラミング薬剤として同定される、工程
を包含する方法。

【図６】

【図１３Ｂ】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３Ａ】

【図１３Ｃ】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８−１】

【図２８−２】

【図２９】

【図３０】

【図３１−１】

【図３１−２】

【図３２】

【公表番号】特表２０１１−５２４１７４（Ｐ２０１１−５２４１７４Ａ）
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１３７５４（Ｐ２０１１−５１３７５４）
【出願日】平成２１年６月１５日（２００９．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４７４２３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５２５２９
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５００４８２８１０）ホワイトヘッド・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ (7)
【Ｆターム（参考）】