細胞内エストラジオール結合タンパク質、このタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびこのタンパク質を過剰発現する細胞
新規の細胞内エストラジオール結合タンパク質（「ＩＥＢＰ」）、ならびに、このタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびにこのタンパク質を産生および／または過剰発現する種々の細胞および細胞株が本明細書中に記載される。ＩＥＢＰは、エストロゲンのシグナル伝達の調節、およびエストロゲンに対する生理学的抵抗において役割を果たすと考えられている。従って、ＩＥＢＰレベルの異常な上昇または下降は、エストロゲンのシグナル伝達とほぼ相関する疾患（一例として、乳癌および骨粗鬆症）の病因の要素となり得る。本発明の種々の実施形態は、例えば、治療化合物をスクリーニングするための手段を提供することによって、そして、治療のための遺伝子標的を同定することによって、これらの状態のための処置を開発するための重要なツールを提供すると考えられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条の下で、米国仮特許出願第６０／４６８，７１７号（２００３年５月７日出願）の優先権を主張し、この仮特許出願の内容は、本明細書に参考として援用される。
【０００２】
（政府の権利）
本明細書に記載される発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ ＨｅａｌｔｈとＣｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｅｎｔｅｒのＤｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍとで、助成金番号１ ＲＯ１ ＤＫ５５８４３−０１ｌＡ１の過程で生まれた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、エストロゲンのシグナル伝達およびこのシグナル伝達に対する抵抗性に関する。特定の実施形態において、本発明は、細胞内エストラジオール結合タンパク質、このタンパク質をコードする遺伝子、およびこのタンパク質を過剰発現する種々の細胞に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
エストロゲンは、男性および女性の両方において臨床的に重要である。エストロゲンは、成長、分化、および生殖組織の発生に影響を及ぼし、また、種々の疾患において役割を果たす。例えば、エストロゲンは、骨密度を維持し、心血管系においては、エストロゲンは、循環コレステロールレベルを低下させることによって、抗アテローム硬化性の効果を発揮する。
【０００５】
エストロゲンのレベルおよび／または効果を制御することは、乳癌の大部分の形態において重要である。１２００万人を超える人々が、今年、全世界で乳癌と診断される。米国単独で、ほぼ２１１，３００名の女性および１，３００名の男性が、毎年新たに乳癌と診断されている。今日、乳癌は、女性における癌の死亡の第２位の原因であり、皮膚の癌を除いて、女性では最も一般的な癌である。
【０００６】
エストロゲンレセプターは、エストロゲンに結合する特化されたタンパク質である。これらのタンパク質は、特定のエストロゲン感受性組織内で有意な量で見出される。乳房組織内の細胞は、エストロゲンレセプターを含み、例えば、エストロゲンレセプターへのエストロゲンの結合は、これらの細胞を増殖するように刺激する。多くの乳癌腫瘍はまた、有意なレベルのエストロゲンレセプターを含み、従って、「エストロゲンレセプター陽性（「ＥＲ＋」）」といわれる。
【０００７】
乳癌細胞の成長および増殖を中断するかまたは遅らせるために使用された１つの従来の方法は、エストロゲンの効果を減少させることである。ＥＲ＋乳癌細胞の増殖は、一般に、エストロゲンレセプターをブロックすること、ホルモンレベルを低下させること、および／または増殖シグナルを受容するために利用可能なレセプターの数を減少させることによって制御され得る。乳癌を処置するかまたは乳癌の発生の防止を補助する従来の方法は、選択的エストロゲンレセプター調節物質（「ＳＥＲＭ」）を投与することによる。このモジュレーターは、増殖シグナルが細胞に達しないようにすることによって、エストロゲンレセプターをブロックする。ＳＥＲＭは、身体における特定のエストロゲンレセプターを標的とし、特定の器官に依存して、エストロゲン様応答を刺激または抑制する。乳房細胞において、ＳＥＲＭは、アンタゴニスト特性を有し、エストロゲンの効果をブロックし、それにより、乳癌細胞の増殖を遅らせる。
【０００８】
タモキシフェン（ＡｓｔｒａＺｅｎｉｃａ ＰＬＣ；Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫから商標名ＮＯＬＶＡＤＥＸで入手可能）は、一般に使用されるＳＥＲＭであり、これは、進行性の初期の乳癌を処置するために使用される。タモキシフェンはまた、乳癌の主な要望のための治療として使用される。タモキシフェンはほぼ２０年近く乳癌を処置するために使用されてきたが、いくつかの重大な欠点を有する。タモキシフェン治療は、子宮内層の癌（すなわち、子宮内膜癌および肉腫）、深部静脈内の血餅（すなわち、深部静脈血栓）、肺における血餅（すなわち、肺塞栓症）、および白内障の危険性を増大させ得る。他の有害な副作用としては、のぼせ、膣分泌物、および月経不順が挙げられ得る。
【０００９】
エストロゲンのレベルおよび／または効果の制御は、骨粗鬆症の処置および予防においても重要である。骨粗鬆症は、骨量および骨密度における進行性の減少；骨が異常に細くなり、弱くなり、そして骨折しやすくなることによって特徴づけられる一般的な骨格の障害である。骨密度は、ほぼ３５歳で自然に減少し始めるが、女性は、エストロゲンの生成が減少し始めるせいで、閉経後に骨粗鬆症の危険性は不均衡である。閉経後、ホルモン療法を受けていない女性において、エストラジオールレベルは、一般に約１０〜２０ｐｇ／ｍｌである。閉経後の女性において健康な骨を維持するために必要とされるエストレジオールの平均レベルは、約４０〜５０ｐｇ／ｍｌである。骨粗鬆症は、閉経と関連して最も重大な健康上の問題である；６５歳を超えた女性の２５％が、骨粗鬆症に罹っている。
【００１０】
骨粗鬆症は、推定４４００万人の米国人についての重大な公衆衛生上の脅威である。今日、米国において、１０００万人の個体が、既にこの疾患を有すると推定されており、ほぼ３４００万人以上が、低骨量を有すると予測されており、骨粗鬆症の危険性が増大している。１０００万人の米国人のうち、骨粗鬆症を有すると推定されているのは、８００万人が女性であり、男性は、わずか２００万人にすぎない。
【００１１】
エストロゲンは、細胞の増殖と関連しているので、骨粗鬆症処置における臨床目的は、エストロゲンの効果を増大させることである（多くの乳癌処置の臨床目的とは反対である）。従来の骨粗鬆症治療は、抗再吸収薬物、骨形成剤（ｂｏｎｅ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、および非薬理学的介入が挙げられる。ビスホスホネートは、抗再吸収薬物であり、骨粗鬆症の予防および処置のために広く利用されている；ビスホスホネートは、骨の分解および除去（すなわち、再吸収）を阻害し、代表的には、骨粗鬆症の処置および予防のための第１の選択肢である。しかし、有害な副作用（例えば、腹痛、悪心、ならびに筋肉痛および関節痛）に加えて、ビスホスホネートを摂取しているいくらかの患者は、重篤な消化性の反応を発生させ、この反応としては、食堂の過敏（ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ）、炎症または潰瘍形成が挙げられる。これらの反応は、胸痛、胸焼けまたは嚥下困難または嚥下の際の疼痛を引き起こす。ラロキシフェンは、骨粗鬆症を処置するために一般に使用されている別のＳＥＲＭであるが、血餅の危険性を有し、種々の副作用（喀血、重篤な頭痛、発語、協調もしくは視力の喪失、腕、胸部もしくは足の疼痛もしくはしびれ、および息切れ）を引き起こしうる。骨粗鬆症のためのさらに別の従来の処置は、エストロゲン−プロゲスチン治療であるが、このアプローチは、副作用（例えば、膣からの出血、腫脹、悪心、頭痛、および流体の停滞が挙げられる）と関連する。エストロゲン−プロゲスチン治療は、もはや、閉経後の女性における骨粗鬆症の第１線にたつ処置ではない。なぜなら、乳癌、発作、血餅、およびおそらく冠状動静脈疾患の危険性が増えるからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
エストロゲン関連疾患の従来の処置は、実質的な欠点を有する；多くは、部分的に有効であるに過ぎず、有害な副作用を有し、関連した状態の治癒をほとんど提供しない。現在のエストロゲン関連疾患を処置するための従来の方法は、全ての患者に適切でなくてもよい。前述および他の理由から、エストロゲンシグナル伝達の調節を制御するために使用されうる臨床的介入の必要性がある。このような介入は、エストロゲンのレベルに関連した疾患状態および健康状態；例えば、乳癌および骨粗鬆症、を処置または予防するための重要なツールである。これらの状態を担う生体分子経路の理解は、これらの状態を処置し、そして最終的には治癒させることにおいて非常に重要である。治療的介入の試験および診断技術における臨床モデルとして使用されうる細胞株は、この点において非常に有用でもある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明の種々の実施形態は、新規細胞内エストラジオール結合タンパク質（「ＩＥＢＰ」）、およびこのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、エストロゲンの生物学的活性は、例えば、その発現またはシグナル伝達を阻害または増強することによるのと同様に、ＩＥＢＰによって調節されうる。より具体的には、ＩＥＢＰのレベルを増大させることによって、エストロゲンのシグナル伝達は阻害されると考えられる。逆に、ＩＥＢＰのレベルを抑制するか、阻害するかまたは他の方法で低下させることは、エストロゲンシグナル伝達を増強する。ＩＥＢＰは、１７β−エストラジオール（Ｅ２）に結合し、エストロゲンレセプター（ＥＲ）と競合させることによって、Ｅ２へ結合するエストロゲン応答エレメント転写活性化を阻害する。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態は、ＩＥＢＰをコードするポリヌクレオチドを含む、細胞および細胞株を記載する。本発明のなおさらなる実施形態は、ＩＥＢＰを生成および／または過剰発現する、細胞および細胞株を記載する。
【００１５】
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面とともに、以下の詳細な説明から明らかになる。添付の図面は、本発明の実施形態の種々の特徴を例示によって示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、エストロゲンシグナル伝達を調節する方法が、新世界ザルにおけるホルモン抵抗性を理解することから得られ得ることを見出した。旧世界ザル（ヒトを含む）と比較すると、新世界ザルは、副腎（ａｄｒｅｎａｌ）ホルモン、副腎（ｇｏｎａｄａｌ）ホルモンおよびビタミンＤステロール／ステロイドホルモン（１７β−エストラジオールを含む）に対する相対的抵抗性を示す。メスの新世界ザルにおいて、このホルモン抵抗性表現型は、血漿エストラジオールおよびプロゲステロンの濃度の上昇によって特徴づけられる。この新世界ザルにおけるホルモン抵抗性についての正確な機構は、十分には理解されていないが、特定のホルモンに対する核レセプターの異常な発現（これは、ヒトにおけるホルモン抵抗性の主要な原因である）には関連しない。代わりに、新世界ザル細胞におけるホルモン抵抗性は、低親和性レセプター−ステロイド結合動態またはレセプター−ＤＮＡ相互作用が弱くなることのいずれかを生じる後生的な要因に起因するようである。例えば、新世界ザル細胞におけるグルココルチコイド抵抗性の研究により、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）９０に関連した、ＦＫ５０６に結合するイムノフィリン（ｉｍｍｕｎｏｐｈｉｌｉｎ）ＦＫＢＰ５１（これは、グルココルチコイドレセプターへのリガンド結合を７４％阻害する）の発現の上昇を示した。
【００１７】
新世界ザルにおけるビタミンＤ抵抗性は、ｈｓｐ−７０様細胞内ビタミンＤ結合タンパク質（「ＩＤＢＰ」）のおよびドミナントネガティブ活性化ビタミンＤエレメント結合タンパク質（「ＶＤＲＥ−ＢＰ」）の異常な発現に起因するようであり、ＶＤＲＥ−ＢＰは、ヘテロ核リボ核タンパク質Ａ（「ｈｎＲＮＰＡ」）に相同である。ビタミンＤと類似の様式で、新世界ザルにおけるエストロゲン抵抗性は、２つの補償的タンパク質の過剰発現と関連する：細胞内エストラジオール結合タンパク質（「ＩＥＢＰ」）および非レセプター関連性エストロゲン応答エレメント結合タンパク質（「ＥＲＥ−ＢＰ」）。
【００１８】
新世界ザルにおけるエストロゲン抵抗性および高レベルの循環ステロイドホルモンの裏側にある生化学的機構の理解を増すことによって、エストロゲンおよび他のステロイドホルモンに関連する疾患を処置および診断するための新たな機会が得られた。本発明は、新世界ザルにおけるエストロゲン抵抗性に関する本発明者らの研究の驚くべき結果に基づく。上記のように、彼らは、このエストロゲンに対する抵抗性が、２つの補償的タンパク質：ＩＥＢＰおよびＥＲＥ−ＢＰの過剰発現と関連したことを見出した。
【００１９】
エストロゲン効果は、一般に、エストロゲンレセプター（「ＥＲ」）を通じて媒介される。代表的には、ＥＲは、そのリガンド結合ドメイン（すなわち、エストロゲン）に結合する場合に活性化する。そのＥＲシグナル伝達に関する古典的な経路は、エストロゲン応答エレメント（「ＥＲＥ」）へのレセプター結合により媒介され、ＥＲＥは、ＥＲが高親和性で結合する特異的ＤＮＡ配列である。そのＥＲは、リガンド結合、ＤＮＡ結合および細胞シグナル伝達経路によるリン酸化の結果として、コンホメーション変化を受ける。このコンホメーション変化は、転写を活性化させることを可能にする。そのＥＲリガンドが阻害されるかまたはＥＲダイマーに十分なエストロゲンが存在しない場合、ＥＲは、活性化され得ず、ＥＲＥの転写は、減少するかまたは進まない。
【００２０】
ＩＥＢＰは、熱ショックタンパク質−２７（「ｈｓｐ２７」）ファミリーのメンバーであると考えられている。Ｈｓｐ２７は、ヒト乳癌細胞の抽出物中で、熱ショック応答性タンパク質（ＩＥＢＰに特徴的である特徴）として、およびエストロゲン応答性タンパク質として、初めて同定された。新世界ザルにおけるヒトｈｓｐ２７とＩＥＢＰとの間のｃＤＮＡの相同性の比較により、２９２ｎｔ重複において８９．４％同一性があることが示唆される。
【００２１】
以下でさらに詳細に記載されるように、用語「ＩＥＢＰ」は、本明細書で使用される場合、天然に存在するＩＥＢＰ（例えば、ヒトｈｓｐ２７タンパク質）のアミノ酸残基配列を有するタンパク質に言及するのみならず、他の等価なタンパク質（例えば、その天然に存在するＩＥＢＰまたは合成ＩＥＢＰの機能的誘導体および改変体）、ならびにＩＥＢＰに類似の様式で機能する活性部位を有する化合物にも言及する（これらの化合物が、それら自体天然に存在しようが合成であろうが関係ない）。
【００２２】
ｈｓｐ２７と同様に、ＩＥＢＰ発現は、熱ショックに応答して増大した。さらに、ＩＥＢＰ発現は、男性よりも女性において顕著であるが、卵巣摘出後の女性の乳房においては減少していた。これらの特徴は、ＩＥＢＰ発現のエストロゲン応答性を立証する。Ｃｈｅｎら，「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ １７β−Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｃｅｌｌｓ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８８：５０１−５０４（２００３）。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、そのｈｓｐ２７関連したＩＥＢＰは、エストロゲンレセプターα（ＥＲα）のリガンド結合ドメインに結合し、１７β−エストラジオール（「Ｅ２」）−ＥＲα媒介性転写を抑制するように作用すると考えられる。ＥＲα（すなわち、Ｅ２）のリガンド結合ドメインへの結合によって、ＩＥＢＰは、Ｅ２についてＥＲαと競合するので、ＥＲＥトランス活性化を阻害すると考えられる。ＩＥＢＰは、リガンド結合についてＥＲαと競合し、１７β−エストラジオール−ＥＲ指向性シグナル伝達を抑制する。ＩＥＢＰは、ＥＲＥと結合もせず、ＥＲＥに結合して、トランス活性化を阻害するためにＥＲと競合もしないとさらに考えられる。
【００２３】
ＩＥＢＰは、そのＩＥＢＰが連結されているＥＲとは異なる様式でのエストロゲン結合のための核外蓄積物として作用する。ＩＥＢＰは、ＥＲα発現には直接的には影響を及ぼさないようである。本発明者らの研究からのデータは、ｈｓｐ２７関連ＩＥＢＰは、細胞質ＥＲについてのコレプレッサーまたはシャペロンとして作用し、エストロゲン結合の際にこの機能が解離または不活化のいずれかをする。
【００２４】
ＥＲＥ−ＢＰは、ｈｎＲＮＰ Ｃ（ヘテロ核リボヌクレオタンパク質）ファミリーのメンバーである。ＥＲＥ−ＢＰの中心ＲＮＰを含有するドメインは、他のｈｎＲＮＰに対して高度の配列類似性を保有するが、これらの同じＲＮＡ結合部位もまた、ＤＮＡに対するＥＲＥ−ＢＰの結合を担うか否かは明らかではない。ｈｎＲＮＰとＥＲＥ−ＢＰとの間の一次構造の類似性にも関わらず、ＥＲＥは、いくつかの局面ではｈｎＲＮＰの古典的プロフィールとは異なる。例えば、ＥＲＥ−ＢＰは、細胞の核区画には制限されない。最近の研究に基づくと、ＥＲＥ−ＢＰは、新世界ザルの細胞の核後抽出において、ならびにエストロゲン抵抗性細胞の細胞質区画および核区画の両方から、単離された。さらに、ＥＲＥ−ＢＰは、それが核酸に結合する能力において多様であるようである。ＥＲＥ−ＢＰは、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡに結合し得、そしてまたＲＮＡとも相互作用し得る。Ｃｈｅｎら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ−Ａｃｔｉｎｇ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｍｉｌｙ」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７３：３１３５２−３１３５７（１９９８）。
【００２５】
ＥＲＥ−ＢＰは、ＥＲと競合してＥＲＥに結合することによって、ＥＲ−ＥＲＥのトランス活性化を抑制するように作用すると、考えられる。ＥＲＥ−ＢＰは、ＥＲＥに結合し、Ｅ２のリガンドには結合しない。ＥＲＥ−ＢＰは、ドミナントネガティブなシス作用様式で作用して、その応答エレメントについてＥＲと競合することによって、トランス活性化を抑制する。ＥＲＥと直接作用しＥＲ結合に干渉することによって、ＥＲＥ−ＢＰは、ＥＲ作用をサイレンシングする。
【００２６】
ＩＥＢＰは、Ｅ２についての細胞内貯蔵所として作用することにより、またはＥＲのリガンド結合ドメインへの結合により、ＥＲＥ−ＢＰと協働し得る。いずれの場合においても、正味の効果は、ＥＲＢＰが、ＥＲ−ＥＲホモダイマー化を妨害し、それによりエストロゲン抵抗性を成立させることである。
【００２７】
エストロゲン抵抗性ＮＷＰ細胞の核後抽出物からＥ２親和性クロマトグラフィーにより精製されたタンパク質のトリプシン消化ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、本発明者らは、「小さい熱ショックタンパク質」（ヒトｈｓｐ２７ならびにクリスタリンＡおよびクリスタリンＢが挙げられる）に対する類似性によりＩＥＢＰ ｃＤＮＡの増幅を可能にする縮重プライマーを設計することが可能であった（図１Ａ）。新世界ザルのＩＥＢＰと、ヒトｈｓｐ２７との間の、高度の配列同一性（８７％）（図１Ｂ）は、ＩＥＢＰが、おそらくヒトｈｓｐ２７の種間ホモログであることを示す。小さい熱ショックタンパク質（ｓＨｓｐ；１５〜４２ｋＤａ）のファミリー（これは、ｈｓｐ２７を含む）は、原核生物および真核生物の両方において見出される。ヒトゲノムにおいて、ｈｓｐ２７は、第３染色体、第７染色体、第９染色体、およびＸ染色体上の４つの異なる遺伝子によってコードされる。そのような重複性は、コードされたタンパク質がその宿主の生存のために重要であることを示す。それらのタンパク質の７０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび６０ｋＤａの分子量範囲にある対応物と同様に、上記ｓＨｓｐは、（１）細胞「ストレス」（ｈｓｐ遺伝子のプロモーター中の特異的熱ショックエンハンサーエレメントと相互作用する熱ショック因子により伝達される熱ストレスを含む）によってアップレギュレートされ、（２）それらのｓＨｓｐが結合している細胞内タンパク質の構造および機能の完全性を保護する「分子シャペロン」として機能し得る。上記の７０ｋＤａファミリー、９０ｋＤａファミリー、および６０ｋＤａファミリーの熱ショックタンパク質とは異なり、ｓＨｓｐは、（１）そのアミノ酸配列があまり相同ではなく、（２）アポトーシスを防止することにおいて中心的役割を果たし、（３）細胞骨格およびその中の細糸構造の組織化のために重要であり、（４）自己オリゴマー化のために必要とされて、ヒトの水晶体の難治性質を提供するようである。
【００２８】
そのＮ末端アミノ酸配列およびＣ末端アミノ酸配列は、ｓＨｓｐファミリーのメンバー間および種間でかなり変化し得るが、そのｓＨｓｐ分子の一般的ドメイン構造は、進化の間を通して高度に保存されたままである。約９０残基の中心αクリスタリンドメインには、可変のＮ末端伸長部およびＣ末端伸長部が隣接する。このＣ末端伸長部（極性構造）は、現在、その分子のシャペロン機能の主要媒介因子であると考えられており、一方、保存されたα−クリスタリンおよび可変のＮ末端ドメインは、そのｓＨｓｐの多量体化のために必須であると考えられる。ヒトｈｓｐ２７と高度に相同であることに加えて、α−クリスタリンと比較した場合（図１Ａおよび図１Ｂ）、エストロゲン抵抗性新世界ザル細胞から単離されたＩＥＢＰは、本明細書中で、可変のＮ末端伸長部およびＣ末端伸長部が隣接した、代表的な保存された中心α−クリスタリンコアドメインを保有することが決定された。ＩＥＢＰは、それがＥ２親和性支持体に付着する能力により単離されたことを考慮して、ＩＥＢＰ配列は、エストロゲン結合部位の存在について走査された。図１Ａにおいて示されるように、ＥＲαのリガンド結合ドメインのうちの２１アミノ酸ストレッチに対して３８％同一性を有する配列が、上記分子の高度に保存されたα−クリスタリンコアドメインにおいて検出された。公式なマッピング研究が完了しなかったが、ＩＥＢＰを構成的に過剰発現する細胞においてＥ２結合の増強を担うのは、ＩＥＢＰのこの部分とそのヒトホモログｈｓｐ２７であることが、推定される（図３Ｂ）。さらに、推定Ｅ２結合サブドメインは、ｓＨｓｐの保存されたα−クリスタリンドメイン中に存在するので、エストロゲン結合は、ｓＨｓｐ２７ファミリーの他のメンバーの関数であり得ることが、可能である。上記の保存されたα−クリスタリンドメイン中にある大きな方の熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、およびｈｓｐ６０）の原型であるＡＴＰ結合／ＡＴＰアーゼドメインに対するいくらかの配列同一性が存在するが、ＩＥＢＰおよび他のｈｓｐ７０様タンパク質の機能を支配することにおいてＡＴＰが有する役割は、もしあったとしても、決定されるべき状態のままである。
【００２９】
熱ショック因子と相互作用し得る上記のエンハンサーシスエレメントを保有することに加えて、ｈｓｐ２７プロモーターはまた、Ｓｐ１部位およびＴＡＴＡボックスに直接隣接する、エストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）の半分の部位を含む。このＥＲＥの半分の部位は、ＥＲαと相互作用することが示され得るが、多数の実験室により報告されたようなｈｓｐ２７遺伝子のＥ２指向的トランス活性化は、このＥＲＥの半分の部位を必要としない。本発明者らの研究によって、抗ヒトｈｓｐ２７反応性ＩＥＢＰは、エストロゲン応答性遺伝子産物であり、ＥＲ飽和濃度のＥ２に対して一晩暴露された後に顕著にアップレギュレートされることが確認される（図５Ａ）。従って、ＩＥＢＰは、そしておそらくはそのヒトホモログであるｈｓｐ２７は、エストロゲンによりアップレギュレートされる遺伝子産物であり、この遺伝子産物は、その後、同じホルモンに結合し得る。これらの結果は、Ｅ２が、Ｅ２相互作用タンパク質の発現をアップレギュレートし得、このＥ２相互作用タンパク質は、その後、Ｅ２−ＥＲα−ＥＲＥ指向的トランス活性化を鎮静し得ることを示す（図２および図３）。このことは、ＩＥＢＰ遺伝子発現またはｈｓｐ２７遺伝子発現の転写的ダウンレギュレーションは、その遺伝子産物がエストロゲン駆動性発現を鎮静するが完全に抑制するわけではない（図２、バー３およびバー４）能力を介してその遺伝子産物により達成され得ることを、示唆する。換言すると、ｈｓｐ２７またはＩＥＢＰは、自己調節され得る（すなわち、Ｅ２−ＥＲα指向性ｈｓｐ２７発現が増加した場合、これは、ｈｓｐ２７プロモーターのレベルにてその後のＥ２−ＥＲエンハンサー作用を弱めるタンパク質を生じる）ことが、可能である。そのようなネガティブフィードバックシステムは、Ｅ２により促進されるトランス活性化を抵抗して調節するように作用する。
【００３０】
ＥＲαを保有するヒト乳癌は、エストロゲン指向性増殖の利点に対して感受性である。このことは、この疾患における補助化学療法剤としてのＳＥＲＭの広範な使用をもたらしている。Ｅ２によりＥＲαが占有されると腫瘍細胞の成長および増殖におけるこの変化に影響を与える機構は、集中的に調査される領域のままである。Ｅ２への暴露によりヒトＥＲα発現乳癌細胞において活性化される遺伝子のうちの１つは、ｈｓｐ２７（本明細書中で報告される新世界ザルＩＥＢＰのヒトホモログ）である。同様に、エストロゲン駆動性ｈｓｐ２７発現は、ＳＥＲＭに対して細胞を暴露することによって鎮静され得る。このことは、ＥＲαと同様に、ｈｓｐ２７の調査をもたらした。なぜなら、ｈｓｐ２７腫瘍発現を伴うヒト乳癌腫瘍マーカーは、現在、腫瘍細胞におけるエストロゲン−ＥＲα相互作用の「下流」指標であると示唆されるからである。いくつかの（しかし全てではない）研究において、ｈｓｐ２７発現は、ＥＲα発現と相関することが示された。従って、本件急の一部として実行された共免疫沈降、酵母ツーハイブリッドアッセイおよびＧＳＴ沈下（ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ）アッセイ（図５Ｂおよび図６）において、ｈｓｐ２７様ＩＥＢＰとＥＲαとの間に直接的タンパク質−タンパク質相互作用についての証拠が存在し、この相互作用は、Ｅ２の存在下で促進され、臨床的に有用なＳＥＲＭタモキシフェンに対して暴露することにより妨害されたことに、注目すべきである。これらのデータは、乳癌細胞によるＥＲαおよびＩＥＢＰの同時発現が、互いに対して機能的かつ時間的に連結され得ることを示唆する。インビトロでの乳癌細胞の挙動に対する、ＩＥＢＰ（ｈｓｐ２７）およびｈｎＲＮＰ関連ＥＲＥ−ＢＰのＥ２−ＥＲα−ＥＲＥ指向性転写の、付加的なドミナントネガティブに作用する鎮静の結果は、現在調査中である。
【００３１】
従って、本発明は、新規なＩＥＢＰ、およびそのＩＥＢＰをコードするポリヌクレオチドに関し、特に、単離および／または精製されたＩＥＢＰと、その対応するコード配列とに関する。本発明のさらなる実施形態は、ＩＥＢＰをコードするポリヌクレオチドを含む細胞および細胞株、ならびにＩＥＢＰを生成および／または過剰発現する細胞および細胞株に関する。本発明のＩＥＢＰの推定ペプチドが、配列番号１として示される。このＩＥＢＰペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２として示される。本発明の種々の実施形態において使用されるＩＥＢＰの全長ｃＤＮＡに対応するポリヌクレオチド配列は、配列番号３として示される。このｃＤＮＡは、後の実施例においてより詳細に記載されるように、エストロゲン抵抗性細胞株であるＢ９５−８からクローン化された。
【００３２】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドもしくはタンパク質の修飾語としての本明細書および特許請求の範囲における用語「単離（された）」および／または「精製（された）」の使用は、そのように示されるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドもしくはタンパク質が、人工的にそのような形態で生成されており、従って、その天然のインビボ細胞環境から分離されていることを、意味する。この人の介入の結果として、本発明の組換えＤＮＡ、組換えＲＮＡ、組換えポリペプチド、および組換えタンパク質は、それらが天然で存在したようなＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、もしくはタンパク質ではない本明細書中に記載される様式で、有用である。
【００３３】
本発明の現在好ましいＩＥＢＰタンパク質としては、配列番号１のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列およびそのフラグメント、ならびにそれらの生物学的に活性な改変形態が挙げられる。当業者は、上記の配列のうちの多数の残基が、化学的、立体的、および／または電気的に類似する残基によって、生じるレセプター種の生物学的活性を実質的には改変することなく置換され得ることを、認識する。さらに、配列番号１と実質的に同じ配列を中に含む、より大きなポリペプチド配列（例えば、スプライス改変体）が、企図される。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に同じアミノ酸配列」とは、参照アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％の同一性を有し、かつその参照アミノ酸配列により規定されるタンパク質が特徴とする匹敵する機能的かつ生物学的な活性を保持する、アミノ酸配列を指す。好ましくは、「実質的に同じアミノ酸配列」を有するタンパク質は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（より好ましくは９０％）のアミノ酸同一性を有し、約９５％を超える同一性が、特に好ましい。しかし、スプライス改変体として生じるか、保存的アミノ酸置換により改変されるか、または縮重コドンの置換により生じる、記載されたレベルに満たない配列同一性を含むポリペプチド（もしくは本明細書中上記で核酸と呼ばれる）もまた、本発明の範囲内に包含されることが、認識される。
【００３５】
用語「生物学的に活性な」または「機能的な」とは、本明細書中で本発明のＩＥＢＰタンパク質またはそのポリペプチドフラグメントの修飾語として使用される場合には、ＩＥＢＰに帰せられる機能的特徴のうちの少なくとも１つを示すポリペプチドを指す。例えば、ＩＥＢＰのある生物学的活性は、哺乳動物細胞中で過剰発現された場合にその哺乳動物細胞にエストロゲン抵抗性を付与する能力である。
【００３６】
本発明のＩＥＢＰタンパク質は、当該分野で周知の方法によって、例えば、種々の組換え発現系、沈殿、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびアフィニティクロマトグラフィーなどによって、単離され得る。他の周知の方法が、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ら、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９９０））（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載される。あるいは、本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されるような周知の組換え方法を使用して、入手され得る。
【００３７】
本発明のポリペプチドを調製するための手段の例は、当該分野で周知の方法を使用して、ＩＥＢＰをコードする核酸を適切な宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、両生類細胞（例えば、卵母細胞）または哺乳動物細胞）において発現し、これもまた周知の方法を使用して、発現されたポリペプチドを回収することである。本発明のＩＥＢＰポリペプチドは、本明細書中で記載されるような発現ベクターで形質転換された細胞から、直接単離され得る。本発明のポリペプチド、その生物学的に活性なフラグメントおよび機能的等価物もまた、化学合成により生成され得る。例えば、合成ポリペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のＭｏｄｅｌ ４３０ＡまたはＭｏｄｅｌ ４３１Ａの自動ペプチド合成機（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、製造業者により提供される化学物質を使用して、生成され得る。
【００３８】
また、用語ＩＥＢＰにより包含されるものは、そのポリペプチドフラグメントまたはポリペプチドアナログである。用語「ポリペプチドアナログ」とは、本明細書中で具体的に示される配列（すなわち、配列番号１）に対して実質的に同一であるアミノ酸残基配列（機能的に類似する残基で１つ以上の残基が保存的に置換されている）を有し、かつ本明細書中に記載されるＩＥＢＰを模倣する能力を示す、任意のポリペプチドを包含する。保存的置換の例としては、ある非極性（疎水性）残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニン）で別の非極性（疎水性）残基で置換すること、ある極性（親水性）残基で別の極性（親水性）残基を（例えば、アルギニン−リジン間、グルタミン−アスパラギン間、グリシン−セリン間）置換すること、ある塩基性残基（例えば、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジン）で別の塩基性残基を置換すること、またはある酸性残基（例えば、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸）で別の酸性残基を置換することが、挙げられる。句「保存的置換」はまた、非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導された残基を使用すること（但し、そのようなポリペプチドは、必要な結合活性を示す場合）を包含する。
【００３９】
「化学的誘導体」とは、官能側鎖の反応により化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する対象ポリペプチドを指す。そのような誘導体化分子としては、例えば、遊離アミノ基が、塩酸アミン、ｐ―トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基を形成するように誘導体化された、分子が挙げられる。遊離カルボキシ基は、塩、メチルエステルおよびエチルエステル、もしくは他の型のエステル、またはヒドラジドを形成するように誘導体化され得る。遊離ヒドロキシ基は、Ｏ‐アシル誘導体またはＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導体化され得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、Ｎ−イム−ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化され得る。また、化学的誘導体として包含されるのは、２０種の標準アミノ酸の１種以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンが、プロリンの代わりにされ得る。５−ヒドロキシリジンが、リジンの代わりにされ得る。３−メチルヒスチジンが、ヒスチジンの代わりにされ得る。ホモセリンが、セリンの代わりにされ得る。オルニチンが、リジンの代わりにされ得る。本発明のポリペプチドはまた、本明細書中に配列が示されるポリペプチドの配列と比較して、１つ以上の残基の付加および／または欠失を有する任意のポリペプチドを、必須活性が維持される限りは包含する。
【００４０】
本発明はまた、受容可能なキャリアと、単離された精製ＩＥＢＰポリペプチド、その活性フラグメントもしくはポリペプチドアナログ、またはそれらの精製された成熟タンパク質およびその活性フラグメントとを、単独でかまたは互いに組み合わせて含む、組成物を提供する。これらのポリペプチドまたはタンパク質は、組換え誘導されても、化学合成されても、または天然供給源から精製されてもよい。本明細書中で使用される場合、用語「受容可能なキャリア」とは、標準的な薬学的キャリア（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）溶液、水、およびエマルジョン（例えば、水中油エマルジョンもしくは油中水エマルジョン））のうちのいずれか、ならびに種々の型の湿潤剤を包含する。
【００４１】
本発明の別の実施形態に従って、本発明のＩＥＢＰタンパク質をコードする単離された核酸、およびそのフラグメントが、提供される。本明細書中に記載される核酸分子は、当業者にとって公知である種々のタンパク質発現系中にそのような核酸が組み込まれた場合に、本発明のタンパク質を生成するために有用である。さらに、そのような核酸分子またはそのフラグメントは、容易に検出可能な置換基で標識され得、そして所定のサンプル中のＩＥＢＰ遺伝子もしくはｍＮＲＡ転写物の存在および／または量についてアッセイするためのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。本明細書中に記載される核酸およびそのフラグメントはまた、本明細書中に記載される本発明のタンパク質をコードする遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応において、プライマーおよび／またはテンプレートして有用である。
【００４２】
用語「核酸」（また、ポリペプチドとも呼ばれる）は、リボ核酸（「ＲＮＡ」）またはデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、プローブ、オリゴヌクレオチド、およびプライマーを包含する。ＤＮＡは、相的ＤＮＡ（「ｃＤＮＡ」）またはゲノムＤＮＡ（例えば、ＩＥＢＰタンパク質をコードする遺伝子）のいずれかであり得る。ＩＥＢＰポリペプチドをコードする核酸を単離するための一手段は、哺乳動物ゲノムライブラリーを、当該分野で周知の方法を使用して、天然のＤＮＡプローブまたは人工的に設計したＤＮＡプローブを用いてプロービングすることである。ＩＥＢＰ遺伝子から誘導されたＤＮＡプローブは、この目的のために特に有用である。ＩＥＢＰポリペプチドをコードするＤＮＡ分子およびｃＤＮＡ分子は、哺乳動物供給源（例えば、旧世界のザル、新世界ザル、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタなど）もしくは他の動物供給源から相補的なゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくはＲＮＡを得るため、または従来の方法によるｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーのスクリーニングにより、関連するｃＤＮＡクローンもしくはゲノムクローンを単離するために、使用され得る。核酸の例は、ＩＥＢＰポリペプチドをコードする、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または単離されたゲノムＤＮＡである。そのような核酸としては、配列番号２を含む核酸、配列番号３を含む核酸、それらの対立遺伝子改変体を含む核酸、またはそれらのスプライス改変体ｃＤＮＡ配列を含む核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、句「スプライス改変体」または「選択的にスプライシングされた」とは、本発明のポリペプチドをコードする特定のヌクレオチド配列を記載するために使用された場合には、周知の真核生物ＲＮＡスプライシングプロセスから生じるｃＤＮＡ配列を指す。そのＲＮＡスプライシングプロセスは、真核生物の一次ＲＮＡ転写物からのイントロンを除去しエキソンを連結して、細胞質の成熟ＲＮＡ分子を生成することを包含する。スプライス改変体ヌクレオチド配列を単離する方法は、当該分野で周知である。例えば、当業者は、配列番号２のＩＥＢＰコードＤＮＡから誘導されたヌクレオチドプローブ、配列番号３のＩＥＢＰコードＤＮＡから誘導されたヌクレオチドプローブ、それらの対立遺伝子改変体から誘導されたヌクレオチドプローブ、それらのスプライス改変体から誘導されたヌクレオチドプローブ、または約１０〜１５０ヌクレオチド長のそのフラグメントから誘導されたヌクレオチドプローブ、およびそれらのアンチセンス核酸を使用して、本明細書中に記載されるように同じ種または他の種のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーをスクリーニングし得る。
【００４４】
本発明の一実施形態において、本発明のＩＥＢＰタンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号２、配列番号３、それらの対立遺伝子、およびそれらのスプライス改変体、ならびにそれらのアンチセンス核酸を包含する。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に同じヌクレオチド配列」とは、参照ポリヌクレオチドに対して十分な同一性を有しており、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照ヌクレオチドにハイブリダイズするようになっている、ＤＮＡを指す。一実施形態において、参照ヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を有するＤＮＡは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードするか、または配列番号１を含むそれより大きなアミノ酸配列をコードする。別の実施形態において、参照ヌクレオチド配列と「実質的に同じヌクレオチド配列」を有するＤＮＡは、その参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％の同一性を有する。参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％（より好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％）の同一性を有するＤＮＡが、好ましい。
【００４６】
本発明はまた、配列番号２および配列番号３に示される核酸とは異なるが、同じ表現型を有する核酸を包含する。表現型が類似する核酸は、「機能的に等価な核酸」とも呼ばれる。本明細書中で使用される場合、句「機能的に等価な核酸」は、本明細書中に開示される核酸と同じタンパク質産物を産生するのと実質的に同じ様式で機能する、わずかな重要ではない配列バリエーションによって特徴付けられる核酸を包含する。特に、機能的に等価な核酸は、本明細書中に開示されるポリペプチドと同じであるか、または保存的アミノ酸改変を有するか、あるいは配列番号１を含むより大きなポリペプチドをコードするポリペプチドをコードする。例えば、保存的改変は、別の非極性残基での非極性残基の置換、または類似の荷電した残基での荷電した残基の置換を包含する。これらの改変としては、タンパク質の三次構造を実質的に変更しない改変のような当業者によって認識される改変が挙げられる。
【００４７】
遺伝コードの縮重によって、特異的ハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸に必ずしもハイブリダイズしないＩＥＢＰポリペプチドをコードする核酸をさらに提供する。本発明のＩＥＢＰポリペプチドをコードする好ましい核酸は、配列番号１をコードする核酸およびそのフラグメントを含む。本発明のＩＥＢＰタンパク質をコードする例示的な核酸は、以下から選択され得る：
（ａ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｂ）中程度にストリンジェントな条件下でＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡであって、このＤＮＡが生物学的に活性なＩＥＢＰをコードする、ＤＮＡ、および
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のいずれかに関するＤＮＡ縮重物であって、このＤＮＡが、生物学的に活性なＩＥＢＰをコードする、ＤＮＡ縮合物。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「縮重」は、参照核酸（例えば、配列番号２または配列番号３）とは少なくとも１つのヌクレオチドが異なるが、参照核酸と同じアミノ酸をコードするコドンをいう。例えば、トリプレット「ＵＣＵ」、「ＵＣＣ」、「ＵＣＡ」および「ＵＣＧ」によって特定されるコドンは、互いに対して縮重している。なぜなら、これらのコドンの４つ全てが、アミノ酸セリンをコードするからである。
【００４９】
ハイブリダイゼーションとは、水素結合による核酸の相補鎖の互いへの結合（すなわち、センス：アンチセンス鎖またはプローブ：標的−ＤＮＡ）をいう；染色体ＤＮＡにおいて天然に存在する結合に類似する。所定のプローブを標的−ＤＮＡにハイブリダイズするために使用されるストリンジェンシーレベルは、当業者によって容易に変更され得る。
【００５０】
句「ストリンジェントハイブリダイゼーション」は、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件をいうために本明細書中で使用される。当業者に公知なように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。一般的に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウム濃度および温度の関数である。代表的に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの状態で実行され、続いて、種々のより高いストリンジェンシーで洗浄される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーに対する参照は、このような洗浄条件に関連する。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、句「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」とは、標的ＤＮＡに対して、約６０％の同一性、好ましくは、約７５％の同一性、より好ましくは、約８５％の同一性を有する相補核酸に標的−ＤＮＡが結合し得る条件をいう；標的−ＤＮＡに対する約９０％を超える同一性が特に好ましい。好ましくは、中程度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ（４２℃）でのハイブリダイゼーション、続く、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ（６５℃）での洗浄に等しい条件である。
【００５２】
句「高ストリンジェシーハイブリダイゼーション」とは、０．０１８Ｍ ＮａＣｌ（６５℃）において安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件をいう（すなわち、ハイブリッドが０．０１８Ｍ ＮａＣｌ（６５℃）において安定でない場合、本明細書中に企図されるように、高ストリンジェシー条件下で安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ（４２℃）でのハイブリダイゼーション、続く、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ（６５℃）での洗浄によって提供され得る。
【００５３】
句「低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」とは、１０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ（４２℃）でのハイブリダイゼーション、続く、１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ（５０℃）での洗浄に等しい条件をいう。デンハート溶液およびＳＳＰＥは、当業者に周知であり、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液も周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照のこと。
【００５４】
本発明のポリペプチド（単数または複数）をコードする好ましい核酸は、中程度にストリンジェントな条件（好ましくは、高ストリンジェンシー条件）下で、実質的に全ての配列または実質的な部分（すなわち、これに関して、より長いフラグメントが本発明の範囲内であるとして企図されるものの、代表的には、配列番号２または配列番号３の少なくとも１５〜３０ヌクレオチド）にハイブリダイズする。
【００５５】
ＩＥＢＰ ｃＤＮＡの任意の領域の部位特異的変異誘発は、変異ＩＥＢＰ ｃＤＮＡの産生のために本明細書中において企図される。例えば、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）を使用して、ＩＥＢＰ ｃＤＮＡに対して種々のミスセンスおよび／またはナンセンス変異を構築し得る。
【００５６】
本発明の核酸は、当該分野で周知の種々の方法によって産生され得る（例えば、本明細書中に記載される方法、配列番号２の種々の領域由来のオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲ増幅の使用、など）。
【００５７】
本発明のさらなる実施形態に従って、必要に応じて標識されたＩＥＢＰコードｃＤＮＡまたはそのフラグメントは、関連する新規哺乳動物ＩＥＢＰタンパク質をコードするさらなる核酸配列に対するライブラリー（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムなど）をプローブするために使用され得る。哺乳動物ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリー（好ましくは、ヒトライブラリー）の構築は、当該分野において周知である。このようなｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、最初に、低ストリンジェンシー条件下で実施され、これは、約４２℃未満の温度、約５０％未満のホルムアミド濃度および中程度〜低の塩濃度を含む。
【００５８】
現在好ましいプローブベースのスクリーニング条件は、約３７℃の温度、約２０％のホルムアミド濃度および約５×標準生理食塩水シトレート（ＳＳＣ；２０×ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）を含む。このような条件は、完全な相同性を必要としないが、プローブ配列と実質的な程度の類似性を有する配列の同定を可能にする。句「実質的な類似性」とは、少なくとも５０％の相同性を共有する配列をいう。好ましくは、プローブと少なくとも７０％の相同性を有する配列の同定を可能にするが、プローブとより低い程度の相同性を有する配列を識別するハイブリダイゼーション条件が選択される。結果として、本発明の核酸のコード領域と実質的に同じ（すなわち、類似）の配列を有する核酸が得られる。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、核酸「プローブ」は、配列番号２または配列番号３のいずれかに記載の任意の１４個以上の連続した塩基と同じ（またはその相補体の）少なくとも１４個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは、少なくとも５０個の連続した塩基の配列を有する一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはこれらのアナログである。プローブを構築する好ましい領域は、配列番号２の５’コード領域および／または３’コード領域を含む。さらに、本発明のＩＥＢＰタンパク質の全ｃＤＮＡコード領域、または配列番号２もしくは配列番号３に対応する全配列が、プローブとして使用され得る。プローブは、本明細書中において以下に記載されるような当該分野で周知の方法によって標識され得、そして種々の診断キットにおいて使用され得る。
【００６０】
本発明のなお別の実施形態に従って、上記核酸配列を適切な宿主細胞において発現させることによって本発明のＩＥＢＰタンパク質の組換え産生するための方法が提供される。任意の細胞または細胞株が、本発明の代替の実施形態に従って宿主細胞として使用され得、ＩＥＢＰを産生するかまたは過剰発現する細胞または細胞株を作製し得る。宿主細胞から作製される改変細胞または細胞株は、例えば、エストロゲン反応性（例えば、Ｏｌｄ Ｗｏｒｌｄ ｐｒｉｍａｔｅ ６２９９胸細胞）またはエストロゲン耐性（例えば、Ｂ９５−８細胞）であり得る。このような細胞および細胞株は、例えば、薬学的調製物のスクリーニングにおいて、または種々の本発明の組成物における含有のために有意な量のＩＥＢＰを作製するために使用され得る。これらの細胞および細胞株についての他の用途は、当業者に容易に明らかである。本明細書中に記載されるＩＥＢＰタンパク質を産生するために適切な組換えＤＮＡ発現系もまた、当該分野において周知である。例えば、上記ヌクレオチド配列は、さらなる操作のためにベクター中に組み込まれ得る。本明細書中で使用される場合、「ベクター（または「プラスミド」）とは、その発現または複製のいずれかのために、細胞中に異種ＤＮＡを導入するために使用される別個のエレメントをいう。
【００６１】
適切な発現ベクターは、当該分野において周知であり、これには、調節配列（例えば、このようなＤＮＡの発現を調節し得るプロモーター領域）に作動可能に連結されるＤＮＡを発現し得るベクターが挙げられる。このように、発現ベクターとは、適切な宿主細胞への導入の際に、挿入されるＤＮＡの発現を生じるファージミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターのような組換えＤＮＡ構築物または組換えＲＮＡ構築物をいう。適切な発現ベクターは、当業者に周知であり、これには、真核生物細胞および／または原核生物細胞において複製可能なベクター、ならびにエピソームのままであるベクターまたは宿主細胞ゲノム内に組み込まれるベクターが挙げられる。さらに、ベクターは、「ウイルスベクター」の形成を生じる多くのウイルスビリオン（例えば、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス）によってベクターをパッケージ化し得る適切なパッケージングシグナルを含み得る。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター領域」とは、作動可能に連結するＤＮＡの転写を制御するＤＮＡのセグメントをいう。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼ認識、結合および転写開始に十分な特定の配列を含む。さらに、プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼのこの認識、結合および転写初期活性を調節する配列を含む。これらの配列は、シス作動性因子であり得るか、またはトランス作動性因子に応答性であり得る。プロモーター（調節の性質に依存する）は、構成的であり得るかまたは調節され得る。本発明の実施における使用に企図される例示的プロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（「ＭＭＴＶ」）ステロイド誘導性プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（「ＭＭＬＶ」）プロモーターなどが挙げられる。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結」とは、ＤＮＡと調節およびエフェクターヌクレオチド配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写部位および翻訳停止部位、ならびに他のシグナル配列）との機能的関係をいう。例えば、プロモーターへのＤＮＡの作動的連結とは、このようなＤＮＡの転写が、そのＤＮＡを特異的に認識し、結合し、そして転写するＲＮＡポリメラーゼによってプロモーターから開始するような、ＤＮＡとプロモーターとの間の物理的および機能的関係をいう。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「発現」とは、ポリ核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスをいう。ポリ核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、適切な真核生物宿主細胞または生物が選択される場合、ｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００６５】
真核生物形質転換ベクターは、当該分野において周知であり、これには、ｐＢｌｕｅｓｋｒｉｐｔおよびファージＬａｍｂｄａ ＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡから入手可能）などが挙げられる。他の適切なベクターおよびプロモーターは、米国特許第４，７９８，８８５号（この開示は、その全体が、本明細書中において参考として援用される）に詳細に記載される。
【００６６】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の形質転換のための他の適切なベクターとしては、ｐＥＴ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎから入手可能；米国特許第４，９５２，４９６号を参照のこと）；例えば、ｐＥＴ１１ａ（これは、Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導性Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃオペレーターおよびｌａｃリプレッサー遺伝子を含む）、およびｐＥＴ １２ａ−ｃ（これは、Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、およびＥ． ｃｏｌｉ ｏｍｐＴ分泌シグナルを含む）が挙げられる。別の適切なベクターは、ｐＩＮ−ＩＩＩｏｍｐＡ２（Ｄｕｆｆａｕｄら，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：４９２−５０７，１９８７を参照のこと）（これは、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーターオペレーター、ｏｍｐＡ分泌シグナルおよびｌａｃリプレッサー遺伝子を含む）である。
【００６７】
例示的な真核生物形質転換ベクターとしては、クローン化ウシパピローマウイルスゲノム、ｐＳＶ−２ｇｐｔ系（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２７７：１０８−１１４）、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇクローニング系（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．２：１６１−１７０，１９８２）のようなマウスレトロウイルスおよび真核生物カセットのクローン化ゲノム、ならびにＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって記載される発現クローニングベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２２８：８１０−８１５，１９８５）が挙げられる。各々は、入手可能であり、形質転換真核生物細胞株での目的のタンパク質の少なくともいくらかの発現の実質的な保証を提供する。
【００６８】
哺乳動物細胞のトランスフェクションのために本発明のＩＥＢＰをコードするＤＮＡに連結され得る調節エレメントを含む特に好ましいベースベクターは、ＣＭＶプロモーターに基づくベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡから入手可能））；ＭＭＴＶプロモーターに基づくベクター（例えば、ｐＭＡＭＮｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）およびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能）；ならびにＳＶ４０プロモーターに基づくベクター（例えば、ｐＳＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）である。
【００６９】
本発明の別の実施形態に従って、本発明の核酸分子（すなわち、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を含む「組換え細胞」が提供される。適切な宿主細胞（好ましくは、細菌細胞、より好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換する方法、ならびに異種タンパク質をコードする遺伝子を含むこの細胞を培養するために適用可能な方法は、当該分野において一般的に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照のこと。
【００７０】
本発明の核酸を含む発現ベクターを宿主細胞に導入して、形質導入組換え細胞（すなわち、組換え異種核酸を含む細胞）を作製する例示的な方法は、当該分野において周知である（例えば、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８１；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６−９３２を参照のこと（これらのそれぞれが、その全体において本明細書中で参考として援用される）。形質導入の例示的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する感染（例えば、米国特許第４，４０５，７１２号および同第４，６５０，７６４号を参照のこと）、リン酸カルシウムトランスフェクション（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号および同第４，６３４，６６５号を参照のこと）、デキストラン硫酸トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション（例えば、米国特許第４，３９４，４４８号および同第４，６１９，７９４号を参照のこと）、サイトフェクション（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、粒子ビーズボンバードメントなどが挙げられる。異種核酸は、必要に応じて、その染色体外（すなわち、エピソーム）維持を可能にする配列を含み得るか、または異種ＤＮＡは、宿主のゲノム内に組み込まれ得る（宿主での安定な維持を確実にするための代替の手段として）。
【００７１】
本発明の実施における使用を企図される宿主生物としては、異種タンパク質の組換え産生が実施された生物が挙げられる。このような宿主生物の例としては、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ａｎｄ Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ；例えば、米国特許第４，８８２，２７９号、同第４，８３７，１４８号、同第４，９２９，５５５号、および同第４，８５５，２３１号を参照のこと）、哺乳動物細胞（例えば、Ｂ９５−８細胞、Ｏｌｄ Ｗｏｒｌｄ ｐｒｉｍａｔｅ ６２９９細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞およびＬｔｋ細胞）、昆虫細胞などが挙げられる。現在好ましい宿主生物は、細菌である。最も好ましい細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００７２】
１つの実施形態において、本発明のＩＥＢＰタンパク質をコードする核酸は、当該分野において周知の適切なウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなど）を使用して、インビボまたはインビトロのいずれかで、哺乳動物細胞内に送達され得る。
【００７３】
ウイルスに基づく系は、種々の細胞内に比較的高レベルの異種核酸を導入し得るという利点を提供する。ＩＥＢＰタンパク質をコードするＩＥＢＰ核酸を哺乳動物細胞内に導入するための適切なウイルスベクターは、当該分野において周知である。これらのウイルスベクターとしては、例えば、単純ヘルペスウイルスベクター（Ｇｅｌｌｅｒら，１９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１６６７−１６６９）、ワクシニアウイルスベクター（例えば、Ｐｉｃｃｉｎｉら，１９８７，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５４５−５６３）；ＣＭＶベクター（Ｍｏｃａｒｓｋｉら，Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ；Ｙ．Ｇｌｕｚｍａｎ ａｎｄ Ｓ．Ｈ．Ｈｕｇｈｅｓ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐｐ．７８−８４）、ＭＭＬＶベクター（Ｄａｎｏｓら，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：６４６９）、アデノウイルスベクター（例えば、Ｌｏｇａｎら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３６５５−３６５９；Ｊｏｎｅｓら，１９７９，Ｃｅｌｌ，１７：６８３−６８９；Ｂｅｒｋｎｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６１６−６２６；Ｃｏｔｔｅｎら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６０９４−６０９８；Ｇｒａｈａｍら，１９９１，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１０９−１２７）、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。例えば、米国特許第４，４０５，７１２号および同第４，６５０，７６４号を参照のこと。特に好ましいウイルスベクターは、アデノウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターである。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、「レトロウイルスベクター」とは、２つのレトロウイルスＬＴＲ間に存在する異種遺伝子をコードする発現カセットを有する周知の遺伝子移動プラスミドをいう。レトロウイルスベクターは、代表的に、適切なパッケージングシグナルを含み、このパッケージングシグナルによって、レトロウイルスベクターまたはテンプレートとしてレトロウイルスベクターを使用して転写されるＲＮＡが、適切なパッケージング細胞株中のウイルスビリオン内にパッケージされ得る。本明細書中で使用するための適切なレトロウイルスベクターは、例えば、米国特許第５，２５２，４７９号、および ＷＩＰＯ公報ＷＯ ９２／０７５７３、ＷＯ ９０／０６９９７、ＷＯ ８９／０５３４５、ＷＯ ９２／０５２６６およびＷＯ ９２／１４８２９（これらは、本明細書中で参考として援用される）に記載され、これは、このようなレトロウイルスベクターを使用して、核酸をヒト細胞内に効率的に導入するための方法を提供する。他のレトロウイルスベクターとしては、例えば、ＭＭＴＶベクター（例えば、Ｓｈａｃｋｌｅｆｏｒｄら，１９８８， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：９６５５−９６５９を参照のこと）などが挙げられる。
【実施例】
【００７５】
以下の実施例は、ＩＥＢＰの生物学的活性、ならびにＩＥＢＰを産生および／または過剰発現する細胞および細胞株を調製するための方法を例示する。以下の実施例において、示される場合、実験的平均は、独立Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して統計的に比較した。
【００７６】
（実施例１ 細胞培養）
全ての細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。エストロゲン抵抗性のＮＷＰ細胞株であるＢ９５−８（ホルモン抵抗性の一般的なマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）由来を、ＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持した。エストロゲン応答性のＯＷＰ乳房細胞株である６２９９（アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）由来）を、ＤＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｒｖｉｎｅ；ＣＡ）中で維持した。全ての培養物を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳＩ，Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｃａｌａｂａｓａｓ，ＣＡ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン（共に、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ製）を慣用的に補充し、９５％空気、５％ ＣＯ２の雰囲気下に置いた。いくつかの実験において、コンフルエントな培養物を、回収および抽出物の調製の前に４８時間まで、Ｅ２（１０ｎＭ）を含む培地中で予めインキュベートした。
【００７７】
（実施例２ 細胞抽出物の調製）
各細胞株の後核抽出物（ｐｏｓｔｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｔｒａｃｔ）を、Ｃｈｅｎら「Ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ ａｎｄ Ｇｏｎａｄａｌ Ｓｔｅｒｏｉｄ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ａｎ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｈｉｃｈ Ｃｏｍｐｅｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ」、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，９９：６６９−６７５（１９９７）に記載されるように調製した。回収した細胞を、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄し、そして、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフロウリド（ＰＭＳＦ）を含有するＥＴＤ緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、５ｍＭジチオスレイトール（ｐＨ７．４））で２回洗浄した。この細胞ペレットを、次いで、ＥＴＤ緩衝液中に再懸濁し、５回の１０秒バーストで氷上にてホモジェナイズした。核ステロイドレセプタータンパク質を伴った核を、４℃にて、１０，０００×ｇで３０分間ペレット化した。
【００７８】
（実施例３ 相補末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）によるＩＥＢＰの分子クローニング）
以前の研究において、本発明者らは、ＮＷＰ Ｂ９５−８細胞における推定ＩＥＢＰに対応する、Ｅ２−親和性カラム精製タンパク質の代表的なフラグメントを同定し、特徴づけた。Ｃｈｅｎら「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ １７β−Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８８：５０１−５０４（２００３）。このタンパク質に対応するｍＲＮＡをクローニングするために、本発明者らは、代表的なペプチドのアミノ酸配列に対応する変性オリゴヌクレオチドを使用して、候補ｃＤＮＡのＲＡＣＥ生成を行なった。得られたＩＥＢＰについての推定アミノ酸配列の配列分析（図１Ａ）により、ヒトｈｓｐ２７に対して８７％の配列同一性、ヒトα−クリスタリンＡ鎖に対して４０％の配列同一性、そしてＢ鎖に対して４４％の配列同一性が明らかになった（図１Ｂ）。このアミノ酸配列はまた、ＥＲαのリガンド結合ドメインにおける２１アミノ酸の重なりと２８〜３８％の同一性を示したが、ステロイドホルモンレセプターに代表的なＬＸＸＬＬモチーフは存在しなかった（データ示さず）。
【００７９】
ＩＥＢＰのＮ末端に代表的なペプチド（ＲＶＰＦＳＬ）のアミノ酸に基づいて、本発明者らは、５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥのために、ＩＥＢＰ特異的なセンスオリゴヌクレオチドプライマーおよびその反転アンチセンスプライマーを設計した。ポリ（Ａ）＋ Ｂ９５−８細胞に由来するＲＮＡ（２．５μｇ）を鋳型として使用し、ＢＤ ＭＡＲＡＴＨＯＮ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、ＩＥＢＰ ｃＤＮＡの５’末端および３’末端を生成した。第２鎖ｃＤＮＡ合成およびアダプターライゲーションを、添付のマニュアルに指示されるように実施した。次いで、このアダプターライゲーションしたｃＤＮＡをＲＡＣＥ反応のためのアダプターおよびＩＥＢＰ特異的なプライマーのための鋳型として使用した：ＩＥＢＰの５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥについて、それぞれ、５’−ＣＧＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＣＧＣＧ−３’（配列番号４）および５’−ＣＧＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＣ−３’（配列番号５）。ＩＥＢＰについてのｃＤＮＡを、特異的な５’プライマーおよび３’プライマーを使用する端端増幅により生成した。次いで、この増幅産物をｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／Ｈｉｓ／ＴＯＰＯ発現ベクターにサブクローニングして、色素ターミネーターサイクル配列反応およびＡＢＩ自動シーケンサーを使用して、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙにより配列決定した。
【００８０】
（実施例４ 一過的トランスフェクション）
５×１０５個のエストロゲン抵抗性ＮＷＰ Ｂ９５−８細胞またはエストロゲン応答性ＯＷＰ乳房６２９９細胞を、１０％活性炭ストリップしたウシ胎仔血清（「ＦＣＳ」）を含有する、フェノールレッドを含まない培地中、６ウェルプレートに蒔き、８０〜９０％のコンフルエンシーまで増殖させた。表１に示すＤＮＡ調製物の組み合わせを、ＬＩＰＯＴＡＸＩ溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中２０μｇ ＤＮＡ／ｍｌの最大最終濃度までで用いて、トランスフェクションを３連で実施した。
【００８１】
【表１】
トランスフェクションの５時間後に、等容量の２０％ ＦＣＳを補充した、抗生物質を含まない培地を各ウェルに添加し、その後、１０ｎＭのＥ２を添加した。３７℃にてさらに４８時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性およびβガラクトシダーゼ活性を測定した（図２）。
【００８２】
（実施例５ ＩＥＢＰを過剰発現する細胞株の作製）
細胞株６２９９由来のＥ２応答性のＯＷＰ乳房細胞を、５．０μｇのｐｃＤＮＡ３．１／ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ ＩＥＢＰプラスミドと共に、ＬＩＰＯＴＡＸＩ溶液中で５時間インキュベートし、その後、等容量の２０％ ＦＣＳを補充した培地を添加した。一晩インキュベートした後、細胞をスプリットし（１：１０比）、５００μｇ／ｍｌのジェネティシン選択的抗生物質であるＧ４１８硫酸塩（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含有する新しい培地と共にインキュベートした。適切なコロニーが形成するまで、この培地を、３〜４日毎に交換した。単一のコロニーをピックアップし、新しいディッシュに移し、そして、さらなる研究のために、選択的抗生物質Ｇ４１８を含有する培地と共に、コンフルエントになるまでインキュベートした。
【００８３】
（実施例６ リガンド結合分析）
特異的な［３Ｈ］１７βエストラジオール（「［３Ｈ］Ｅ２」）結合を、ベクター単独および３つのＩＥＢＰを安定にトランスフェクトした細胞株の後核抽出物において測定した（図３Ｂ）。簡単には、上記のように単離した後核抽出物を、ＮａＣｌを含有するＥＴＤ緩衝液（ｐＨ８．０）中に再構成し、０．５Ｍ ＮａＣｌの最終塩濃度を達成し、０．１〜１００ｎＭの非標識の競合リガンドの存在下または非存在下にて、４ｎＭの［３Ｈ］Ｅ２と共に、４℃にて一晩インキュベートした。タンパク質結合［３Ｈ］Ｅ２を、デキストランコーティングした活性炭と共にインキュベートすることにより、未結合のステロールから分離した。実験は、三連で実施した。
【００８４】
（実施例７ ウェスタンブロット分析）
変性した細胞抽出物または精製したタンパク質を、Ｃｈｅｎら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ−Ａｃｔｉｎｇ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｍｉｌｙ」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７３：３１３５２−３１３５７（１９９８）に記載されるように、４〜１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを使用する電気泳動に供し、ニトロセルロース膜に移した。この膜を５％無脂肪ドライミルクで１時間ブロッキングし、次いで、抗ヒトｈｓｐ２７モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ；以後「Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ」）と共に２時間、そして、ＨＲＰ結合体化二次抗体と共にさらに１時間インキュベートし、その後、化学発光試薬（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて抗体応答性のタンパク質を検出した。
【００８５】
（実施例８ 免疫沈降）
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、氷上で１０分間インキュベーションすることによって、ＲＩＰＡ緩衝液（１％のノニデット ｐ−４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１ｍＭのＰＭＳＦ、３０μｌ／ｍｌのアプロチニン、１０ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウムを含有する１×ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手）で溶解した。次いで、この得られた溶解物を、２３ゲージ針を通して繰り返し吸引することにより破壊し、遠心分離（１４，０００×ｇ、１０分間）により細胞上清を得た。次いで、上清のアリコート（各々５０μｇのタンパク質を含む）を抗ＥＲα抗体または抗ｈｓｐ２７抗体と共に、４℃にて一晩インキュベートした。２０μｌのプロテインＡ／Ｇアガロース（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚから入手）を添加し、４℃にてさらに１時間インキュベートした。次いで、このタンパク質混合物を、ＲＩＰＡ緩衝液（×４）およびＰＢＳ（×１）中で繰り返し遠心分離することにより洗浄した。得られたペレットを、２×ＳＤＳサンプル緩衝液に再懸濁した。煮沸後、サンプルを、４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移した。次いで、抗ＥＲα抗体および抗ｈｓｐ２７抗体を用いてウェスタンブロット分析を行い、ＥＣＬにより可視化した（図５）。
【００８６】
（実施例９ 酵母２ハイブリッドスクリーニング）
全長ＥＲα ｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチド５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＣＣＡＣＡＣＣＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＧＧ−３’（配列番号６）および５’−ＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＣＴＣ−３’（配列番号７）を使用して増幅した。このＥＲα ｃＤＮＡを、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインベクター（ＧＡＬ４ ＤＮＡ−ＢＤ／ＥＲ）のＮｄｅＩ部位およびＢａｍＨＩ部位にクローニングした。全長ヒトｈｓｐ２７ ｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチド５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＣＡＴＴＴＴ−３’（配列番号８）および５’−ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＧＡＡＣＴＴＴＡＴＴＴＧＡＧ−３’（配列番号９）を使用して増幅した。ＩＥＢＰ ｃＤＮＡを、ＧＡＬ４ ＤＮＡ活性化ドメインベクターのＥｃｏＲＩ部位およびＸｈｏＩ部位にクローニングした。ＧＡＬ４ ＤＮＡ−ＢＤ／ＥＲを、ＧＡＬ４ ＤＮＡ−ＡＤ／ｈｓｐ２７プラスミドと共に、Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ２ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡから入手）を製造業者の指示に従って使用して同時に形質転換した；いくつかのプレートを、水（コントロール）、Ｅ２（１０〜１００ｎＭ）、またはタモキシフェン（１０〜１００ｎＭ）で処理した。
【００８７】
このプラスミドを、自動配列決定により確認した。Ｙｅａｓｔ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ３ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手）を使用して、製造業者の指示に従って酵母２ハイブリッド分析を行なった；再び、例外として、このプレートを、水、Ｅ２（１０〜１００ｎＭ）またはタモキシフェン（１０〜１００ｎＭ）で処理した。
【００８８】
（実施例１０ ＧＳＴ−プルダウンアッセイ）
ＥＲα（残基２４６〜５９５）のリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）とのＧＳＴ融合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αにおいて発現させ、製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の指示に従ってグルタチオンセファロースビーズにより精製した。後核抽出物を、ＧＳＴビーズにアプライし、１時間インキュベートした。次いで、この充填されたＧＳＴ−抽出物混合物を、５ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＰＭＳＦを含有するＰＢＳ緩衝液で繰り返し（５×）洗浄し、２×ＳＤＳサンプル緩衝液に再懸濁し、５分間煮沸した。変性したタンパク質を、４〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移し、適切な抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚから入手）でプローブし、ＥＣＬにより可視化した。
【００８９】
（実施例１１ ＩＥＢＰの発現）
以前に報告された、エストロゲン結合に対するその高い能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）が確認されているＥ２アフィニティカラム抽出を使用するＩＥＢＰの精製は、ＮＷＰ細胞におけるタンパク質の機能的関連性を明らかにしなかった。従って、ＩＥＢＰの過剰発現がエストロゲン誘導性のトランス活性化に拮抗するか、促進するか、または無関係であるかどうかを明らかにするために、実験を行なった。エストロゲン応答性の旧世界霊長類細胞を、ＩＥＢＰ ｃＤＮＡおよびＥＲＥ−プロモーター−レポーター構築物を一過的に同時トランスフェクションした。トランスフェクション後、ＥＲＥ指向型のルシフェラーゼ活性は、ベクターのみでトランスフェクトした旧世界霊長類細胞と比べて５０％減少した。ＥＲＥ−ＢＰの過剰発現はまた、ＥＲＥ媒介性の転写を抑制し、ＩＥＢＰおよびＥＲＥ−ＢＰを同時トランスフェクションした場合に、ＥＲＥルシフェラーゼレポーター活性の付加的な減少が生じた。ＩＥＢＰの作用は、部分的に排除されたが、Ｅ２での前処理により正常まで回復せず、そしてまた、コントロール細胞内でのＥＲＥ媒介性の転写を刺激した。類似の結果がまた、ＩＥＢＰの旧世界霊長類細胞への安定なトランスフェクションの後に得られた。これらの細胞におけるＩＥＢＰ発現の増加を、抗ｈｓｐ２７抗体を使用するウェスタンブロット分析により確認した。これらの研究はまた、野生型のコントロール細胞において、Ｅ２がｈｓｐ２７の発現を用量依存性の様式で刺激することを示した。その後のプロモーター−レポーターデータは、ＥＲＥルシフェラーゼレポーター活性は、野生型の細胞と比べると、ＩＥＢＰの存在下で、２〜３倍減少することを示した。一過性のトランスフェクト体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）と同様に、この作用は、Ｅ２での前処理によって部分的にのみ排除された。安定なトランスフェクト体改変体を使用して、ＩＥＢＰにより調節される転写とＥ２の後核結合との間の関係性に取り組むことがまた可能となった。
【００９０】
（実施例１２ ＩＥＢＰの特徴づけ）
一過性のトランスフェクト体および安定なトランスフェクト体の両方の分析は、ＩＥＢＰがＥＲＥ指向性の遺伝子の転写を沈めるように作用することを示した。このことは、少なくとも部分的に、エストロゲンの増強された結合によるものと考えられる。ＩＥＢＰがまた、ＥＲＥ結合についての直接的な競合因子として機能するか否かを決定するために、本発明者らは、理想化されたＥＲＥをプローブとして、組換えＥＲαおよび／またはＯＷＰ−ＩＥＢＰの安定なトランスフェクト体クローン１からの後核抽出物を結合タンパク質として使用して、電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）を実施した。データは、ＩＥＢＰが、ＥＲＥとも結合せず、ＥＲαともＥＲＥへの結合について競合しないことを示した。ＩＥＢＰはＥＲＥに直接結合するようではなかったが、そのＥＲ媒介性の転写を沈める能力は、ＥＲαとの可能な直接相互作用と一致していた。この可能性を評価するために、抗ＥＲα抗体および抗ｈｓｐ２７抗体を用いて、免疫共沈降を実施した。抗ヒトＥＲα抗体を使用して、ＥＲα未処理のタンパク質を、野生型およびＩＥＢＰを安定にトランスフェクトした細胞の両方の後核抽出物において免疫共沈降した。この免疫共沈降物を、ｈｓｐ２７抗体を使用することによって、ウェスタンブロット分析に供した。データは、ＥＲαとｈｓｐ２７との間の会合を確認した。類似の結果がまた、ｈｓｐ２７を用いる最初の免疫沈降、その後のＥＲαブロッティングにより得られた。
【００９１】
（実施例１３ ＥＲαとｈｓｐ２７とのリガンド依存性の相互作用）
ＩＥＢＰトランスフェクト体とは対照的に、未処理の野生型細胞からの抽出物においてＥＲαとｈｓｐ２７との間には比較的わずかな会合しか存在しなかった。しかし、データは、Ｅ２を用いた野生型細胞（ＩＥＢＰトランスフェクト体ではない）の一晩の処理が、ｈｓｐ２７発現を強力に増加させ、ＥＲ−Ｈｓｐ２７／ＩＥＢＰ相互作用を決定する際のリガンドの重要度の可能性を高めることを示した。従って、酵母２ハイブリッドシステムは、ＥＲαとのリガンド依存性の相互作用を確認するために採用された。全長ＥＲα ｃＤＮＡを、ＧＡＬ４活性化ドメインを含む融合タンパク質としてクローン化し、そして、酵母の同時形質転換において使用した。リガンド特異的な様式でＥＲαと相互作用するタンパク質を同定するために、１０ｎＭのＥ２またはタモキシフェンを補充したか、または補充していないＳＤ ｌｅｕ−／Ｔｒｐ−／Ｈｉｓ−／Ａｄｅ−培地において酵母のコロニーを選択した。全長ｈｓｐ２７およびＥＲ挿入物は、Ｅ２の存在下でのみ増殖した。ＥＲアゴニストであるタモキシフェンの存在下、または、Ｅ２なしの選択培地においては、増殖が観察されなかった。
【００９２】
最後に、ｈｓｐ２７とＥＲとの相互作用を確認するために、ＧＳＴ−プルダウンアッセイを行なった。ＩＥＢＰを過剰発現する細胞のタンパク質抽出物を、ＥＲを表すＧＳＴ−レセプターリガンド結合ドメイン融合タンパク質と共にインキュベートした。グルココルチコイドレセプター（ＧＲ）−融合タンパク質またはＧＳＴタンパク質単独を使用するコントロールアッセイを採用した。いずれの場合においても、ｈｓｐ２７を示したＳＤＳ−ＰＡＧＥの分離を、抗ｈｓｐ２７抗体を用いて評価した。データは、ｈｓｐ２７のみが、ＥＲ−ＧＳＴによりプルダウンされたが、ＧＲ−ＧＳＴまたはＧＳＴ単独はプルダウンされなかったことを示した。
【００９３】
上記説明は、本発明の特定の実施形態に言及しているが、多くの改変が、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが理解される。添付の特許請求の範囲は、本発明の真の範囲および精神の範囲内に含まれるような改変を網羅することを意図される。従って、ここで開示された実施形態は、全ての観点において、例示的であり、限定的ではないと考えられるべきであり、本発明の精神は、上記の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、それゆえ、特許請求の範囲と等価な意味および範囲の中にある全ての変更は、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に従って、新世界ザル（「ＮＷＰ」）細胞に由来するＩＥＢＰとヒト熱ショックタンパク質−２７（「ｈｓｐ２７」）との間の相同性の比較分析を示す。図１Ａは、ヒトｈｓｐ２７、ならびにヒトα−クリスタリンＡ（「ｈＣｒｙｓ Ａ」）およびヒトα−クリスタリンＢ（「ｈＣｒｙｓ Ｂ」）と比較した、ＩＥＢＰの全長推定アミノ酸配列を示す。陰を付けた領域は、４つ全ての分子の中での高い配列相同性の領域を示す。下線を付した領域は、−９０ファミリーおよび−７０ファミリーにおけるヒト熱ショックタンパク質のＡＴＰ結合ドメインおよび基質結合ドメインとの配列相同性の領域を示す。図１Ｂは、ｈｓｐ２７、ｈＣｒｙｓ ＡおよびｈＣｒｙｓ Ｂと比較した、ＩＥＢＰアミノ酸配列の相同性％値を示す。
【図２】図２は、本発明の一実施形態に従って、ＩＥＢＰおよびエストロゲン応答エレメント結合タンパク質（「ＥＲＥ−ＢＰ」）のエストロゲン応答エレメント（「ＥＲＥ」）ルシフェラーゼ活性の分析を示す。新世界ザルＥＲＥ−ＢＰおよび／または新世界ザルＩＥＢＰのｃＤＮＡを含む発現構築物を、１０ｎＭ １７β−エストラジオール（Ｅ２）の非存在下または存在下で、エストロゲン応答性ルシフェラーゼレポータープラスミドとＥＲａ＋ヒトＭＣＦ−７乳癌細胞株に一過性に同時トランスフェクトした。データは、ルシフェラーゼ活性の三連での測定の平均である。＊＝コントロールトランスフェクト体と比較して、統計学的に有意（Ｐ＜０．００１）。図２は、ＩＥＢＰはＥＲＥ−ＢＰと、ＥＲＥ指向性トランス活性化を抑制する（ｓｑｕｅｌｃｈ）ように協働することを示唆する。
【図３】図３は、本発明の一実施形態に従って、ＥＲＥ指向性トランス活性化のＩＥＢＰ媒介性抑制におけるエストロゲンの役割を例示し、細胞質結合の分析を示す。図３Ａは、１７β−エストラジオール（Ｅ２ １０ｎＭ；黒棒）の非存在下（左パネル）または存在下（右パネル）で、ベクター単独（白棒）で安定にトランスフェクトした新世界ザル宿主由来の野生型６２９９乳癌細胞および全長ＩＥＢＰ ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトした細胞の３種の異なるサブクローンにおけるＩＥＢＰまたはＥＲＥのプロモーター−レポータールシフェラーゼ活性の効果を示す。データは、ルシフェラーゼ活性の三連での測定の平均である。＊＝コントロールトランスフェクト体と比較して、統計学的に有意（Ｐ＜０．００１）。図３Ｂは、ＩＥＢＰで安定にトランスフェクトした細胞株の後核抽出物中の［３Ｈ］１７β−エストラジオール（Ｅ２）の置き換えを示す。データは、ベクターのみのコントロールおよび３種のＩＥＢＰ安定トランスフェクト体細胞株における、Ｅ２の漸増用量（０．１〜１００ｎＭ）により置き換えられた最大［３Ｈ］１７Ｂ−エストラジオール％の三連での測定の平均である。図３は、ＥＲＥ指向性トランス活性化のＩＥＢＰ媒介性抑制が、エストロゲンの細胞質結合の増加と関連することを示唆する。
【図４】図４は、本発明の一実施形態に従って、プローブとして二本鎖コンセンサスＥＲＥ、およびタンパク質として組換えヒトＥＲαおよび／またはＥＲＥアフィニティー生成したＥＲＥ−ＢＰを使用して、電気移動度シフトアッセイ（ｅｌｅｃｔｒｏｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ）（「ＥＭＳＡ」）を示す。ＩＥＢＰ（レーン７、パネルＡ；レーン３および４、パネルＢ）は、１００ｎＭ １７β−エストラジオール（Ｅ２）の存在下または非存在下で、ＥＲＥに結合もせず、ＥＲＥへの結合についてＥＲと競合することもなかった（レーン６、パネルＡ；レーン２および３、パネルＣ）。そのＥＲ−ＥＲＥ複合体は、１００ｎＭ Ｅ２ありまたはなしで抗ｈｓｐ２７抗体を添加することによって（レーン４および５；パネルＣ）スーパーシフトした。図４は、ＥＲＥ媒介性転写に対するＩＥＢＰの効果が、ＥＲＥとの直接的相互作用にも、ＥＲ−ＥＲＥ複合体形成の破壊にも起因しないことを示唆する。
【図５】図５Ａは、本発明の一実施形態に従って、プローブとして二本鎖コンセンサスＥＲＥ、ならびに複合体化するタンパク質として１００ｎＭ １７β−エストラジオール（Ｅ２）の存在下または非存在下で組換えヒトＥＲα、ヒトｈｓｐ２７および抗ヒトｈｓｐ２７抗体を使用するＥＭＳＡを記載する。図５Ｂは、ベクター単独またはＩＥＢＰでトランスフェクトした新世界ザル６２９９乳癌細胞の後核抽出物のタンパク質構成成分と抗ヒトｈｓｐ２７（左パネル）および抗ヒトＥＲα（右パネル）との免疫沈降、続いてそれぞれ、抗ヒトＥＲα抗体および抗ヒトｈｓｐ２７抗体での検出を示す。図５は、ヒトＥＲαとｈｓｐ２７様タンパク質との間に直接関連性があることを示唆する。
【図６】図６は、本発明の一実施形態に従って、ＩＥＢＰの１７β−エストラジオール調節性発現およびそのＥＲαとの相互作用を示す。図６Ａは、野生型乳房細胞におけるｈｓｐ２７の発現における１７β−エストラジオール媒介性増大を示す。示されるのは、漸増用量のＥ２（０．１〜１００ｎＭ）の非存在下または存在下での、野生型乳房細胞におけるｈｓｐ２７のウェスタンブロット分析である。図６Ｂは、ｈｓｐ２７とＥＲαとのリガンド１７β−エストラジオール（Ｅ２）依存性相互作用の酵母ツーハイブリッド分析を示す。ＡＨ１０９酵母細胞を、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン−ＥＲα融合タンパク質プラスミドで同時トランスフェクトし、Ｅ２（１０ｎＭ）、ＥＲアンタゴニストであるタモキシフェン（Ｔａｍ，１０ｎＭ）またはビヒクルのみ（なし）のいずれかを含むＬｅｕ培地／Ｔｒｐ培地／Ｈｉｓ培地／Ａｄｅ培地を用いてコロニー増殖により選択した。図６Ｃは、ＥＲ相互作用タンパク質のＧＳＴプルダウン分析（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）を示す。ＩＥＢＰを過剰発現する細胞のタンパク質抽出物を、ＥＲ−ＧＳＴまたはグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）−ＧＳＴ融合タンパク質またはＧＳＴタンパク質単独のいずれかとともにインキュベートした。ＧＳＴ結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ｈｓｐ２７抗体でプローブした。これらの結果は、ＥＲ−ＩＥＢＰ相互作用がリガンド１７β−エストラジオールにより促進されるが、ＳＥＲＭであるタモキシフェンにより促進されないことを示唆する。
【図７】図７は、本発明の一実施形態に従って、ＥＲ−ＥＲＥ指向性トランス活性化の通常のおよびＩＥＢＰ媒介性抑制を示す。図７Ａは、１７β−エストラジオール（Ｅ２）に結合したＥＲホモダイマーがＥＲＥと相互作用する、通常の転写事象を示す。図７Ｂは、ＩＥＢＰの影響下での「抑制された」転写事象を示す；ＥＲαとリガンドとの間のＥ２結合ＩＥＢＰの介在が、ＥＲダイマー化、ＥＲ−ＥＲＥ相互作用およびトランス活性化の妨害をもたらす。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条の下で、米国仮特許出願第６０／４６８，７１７号（２００３年５月７日出願）の優先権を主張し、この仮特許出願の内容は、本明細書に参考として援用される。
【０００２】
（政府の権利）
本明細書に記載される発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ ＨｅａｌｔｈとＣｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ ＣｅｎｔｅｒのＤｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍとで、助成金番号１ ＲＯ１ ＤＫ５５８４３−０１ｌＡ１の過程で生まれた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、エストロゲンのシグナル伝達およびこのシグナル伝達に対する抵抗性に関する。特定の実施形態において、本発明は、細胞内エストラジオール結合タンパク質、このタンパク質をコードする遺伝子、およびこのタンパク質を過剰発現する種々の細胞に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
エストロゲンは、男性および女性の両方において臨床的に重要である。エストロゲンは、成長、分化、および生殖組織の発生に影響を及ぼし、また、種々の疾患において役割を果たす。例えば、エストロゲンは、骨密度を維持し、心血管系においては、エストロゲンは、循環コレステロールレベルを低下させることによって、抗アテローム硬化性の効果を発揮する。
【０００５】
エストロゲンのレベルおよび／または効果を制御することは、乳癌の大部分の形態において重要である。１２００万人を超える人々が、今年、全世界で乳癌と診断される。米国単独で、ほぼ２１１，３００名の女性および１，３００名の男性が、毎年新たに乳癌と診断されている。今日、乳癌は、女性における癌の死亡の第２位の原因であり、皮膚の癌を除いて、女性では最も一般的な癌である。
【０００６】
エストロゲンレセプターは、エストロゲンに結合する特化されたタンパク質である。これらのタンパク質は、特定のエストロゲン感受性組織内で有意な量で見出される。乳房組織内の細胞は、エストロゲンレセプターを含み、例えば、エストロゲンレセプターへのエストロゲンの結合は、これらの細胞を増殖するように刺激する。多くの乳癌腫瘍はまた、有意なレベルのエストロゲンレセプターを含み、従って、「エストロゲンレセプター陽性（「ＥＲ＋」）」といわれる。
【０００７】
乳癌細胞の成長および増殖を中断するかまたは遅らせるために使用された１つの従来の方法は、エストロゲンの効果を減少させることである。ＥＲ＋乳癌細胞の増殖は、一般に、エストロゲンレセプターをブロックすること、ホルモンレベルを低下させること、および／または増殖シグナルを受容するために利用可能なレセプターの数を減少させることによって制御され得る。乳癌を処置するかまたは乳癌の発生の防止を補助する従来の方法は、選択的エストロゲンレセプター調節物質（「ＳＥＲＭ」）を投与することによる。このモジュレーターは、増殖シグナルが細胞に達しないようにすることによって、エストロゲンレセプターをブロックする。ＳＥＲＭは、身体における特定のエストロゲンレセプターを標的とし、特定の器官に依存して、エストロゲン様応答を刺激または抑制する。乳房細胞において、ＳＥＲＭは、アンタゴニスト特性を有し、エストロゲンの効果をブロックし、それにより、乳癌細胞の増殖を遅らせる。
【０００８】
タモキシフェン（ＡｓｔｒａＺｅｎｉｃａ ＰＬＣ；Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫから商標名ＮＯＬＶＡＤＥＸで入手可能）は、一般に使用されるＳＥＲＭであり、これは、進行性の初期の乳癌を処置するために使用される。タモキシフェンはまた、乳癌の主な要望のための治療として使用される。タモキシフェンはほぼ２０年近く乳癌を処置するために使用されてきたが、いくつかの重大な欠点を有する。タモキシフェン治療は、子宮内層の癌（すなわち、子宮内膜癌および肉腫）、深部静脈内の血餅（すなわち、深部静脈血栓）、肺における血餅（すなわち、肺塞栓症）、および白内障の危険性を増大させ得る。他の有害な副作用としては、のぼせ、膣分泌物、および月経不順が挙げられ得る。
【０００９】
エストロゲンのレベルおよび／または効果の制御は、骨粗鬆症の処置および予防においても重要である。骨粗鬆症は、骨量および骨密度における進行性の減少；骨が異常に細くなり、弱くなり、そして骨折しやすくなることによって特徴づけられる一般的な骨格の障害である。骨密度は、ほぼ３５歳で自然に減少し始めるが、女性は、エストロゲンの生成が減少し始めるせいで、閉経後に骨粗鬆症の危険性は不均衡である。閉経後、ホルモン療法を受けていない女性において、エストラジオールレベルは、一般に約１０〜２０ｐｇ／ｍｌである。閉経後の女性において健康な骨を維持するために必要とされるエストレジオールの平均レベルは、約４０〜５０ｐｇ／ｍｌである。骨粗鬆症は、閉経と関連して最も重大な健康上の問題である；６５歳を超えた女性の２５％が、骨粗鬆症に罹っている。
【００１０】
骨粗鬆症は、推定４４００万人の米国人についての重大な公衆衛生上の脅威である。今日、米国において、１０００万人の個体が、既にこの疾患を有すると推定されており、ほぼ３４００万人以上が、低骨量を有すると予測されており、骨粗鬆症の危険性が増大している。１０００万人の米国人のうち、骨粗鬆症を有すると推定されているのは、８００万人が女性であり、男性は、わずか２００万人にすぎない。
【００１１】
エストロゲンは、細胞の増殖と関連しているので、骨粗鬆症処置における臨床目的は、エストロゲンの効果を増大させることである（多くの乳癌処置の臨床目的とは反対である）。従来の骨粗鬆症治療は、抗再吸収薬物、骨形成剤（ｂｏｎｅ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、および非薬理学的介入が挙げられる。ビスホスホネートは、抗再吸収薬物であり、骨粗鬆症の予防および処置のために広く利用されている；ビスホスホネートは、骨の分解および除去（すなわち、再吸収）を阻害し、代表的には、骨粗鬆症の処置および予防のための第１の選択肢である。しかし、有害な副作用（例えば、腹痛、悪心、ならびに筋肉痛および関節痛）に加えて、ビスホスホネートを摂取しているいくらかの患者は、重篤な消化性の反応を発生させ、この反応としては、食堂の過敏（ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ）、炎症または潰瘍形成が挙げられる。これらの反応は、胸痛、胸焼けまたは嚥下困難または嚥下の際の疼痛を引き起こす。ラロキシフェンは、骨粗鬆症を処置するために一般に使用されている別のＳＥＲＭであるが、血餅の危険性を有し、種々の副作用（喀血、重篤な頭痛、発語、協調もしくは視力の喪失、腕、胸部もしくは足の疼痛もしくはしびれ、および息切れ）を引き起こしうる。骨粗鬆症のためのさらに別の従来の処置は、エストロゲン−プロゲスチン治療であるが、このアプローチは、副作用（例えば、膣からの出血、腫脹、悪心、頭痛、および流体の停滞が挙げられる）と関連する。エストロゲン−プロゲスチン治療は、もはや、閉経後の女性における骨粗鬆症の第１線にたつ処置ではない。なぜなら、乳癌、発作、血餅、およびおそらく冠状動静脈疾患の危険性が増えるからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
エストロゲン関連疾患の従来の処置は、実質的な欠点を有する；多くは、部分的に有効であるに過ぎず、有害な副作用を有し、関連した状態の治癒をほとんど提供しない。現在のエストロゲン関連疾患を処置するための従来の方法は、全ての患者に適切でなくてもよい。前述および他の理由から、エストロゲンシグナル伝達の調節を制御するために使用されうる臨床的介入の必要性がある。このような介入は、エストロゲンのレベルに関連した疾患状態および健康状態；例えば、乳癌および骨粗鬆症、を処置または予防するための重要なツールである。これらの状態を担う生体分子経路の理解は、これらの状態を処置し、そして最終的には治癒させることにおいて非常に重要である。治療的介入の試験および診断技術における臨床モデルとして使用されうる細胞株は、この点において非常に有用でもある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明の種々の実施形態は、新規細胞内エストラジオール結合タンパク質（「ＩＥＢＰ」）、およびこのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、エストロゲンの生物学的活性は、例えば、その発現またはシグナル伝達を阻害または増強することによるのと同様に、ＩＥＢＰによって調節されうる。より具体的には、ＩＥＢＰのレベルを増大させることによって、エストロゲンのシグナル伝達は阻害されると考えられる。逆に、ＩＥＢＰのレベルを抑制するか、阻害するかまたは他の方法で低下させることは、エストロゲンシグナル伝達を増強する。ＩＥＢＰは、１７β−エストラジオール（Ｅ２）に結合し、エストロゲンレセプター（ＥＲ）と競合させることによって、Ｅ２へ結合するエストロゲン応答エレメント転写活性化を阻害する。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態は、ＩＥＢＰをコードするポリヌクレオチドを含む、細胞および細胞株を記載する。本発明のなおさらなる実施形態は、ＩＥＢＰを生成および／または過剰発現する、細胞および細胞株を記載する。
【００１５】
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面とともに、以下の詳細な説明から明らかになる。添付の図面は、本発明の実施形態の種々の特徴を例示によって示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、エストロゲンシグナル伝達を調節する方法が、新世界ザルにおけるホルモン抵抗性を理解することから得られ得ることを見出した。旧世界ザル（ヒトを含む）と比較すると、新世界ザルは、副腎（ａｄｒｅｎａｌ）ホルモン、副腎（ｇｏｎａｄａｌ）ホルモンおよびビタミンＤステロール／ステロイドホルモン（１７β−エストラジオールを含む）に対する相対的抵抗性を示す。メスの新世界ザルにおいて、このホルモン抵抗性表現型は、血漿エストラジオールおよびプロゲステロンの濃度の上昇によって特徴づけられる。この新世界ザルにおけるホルモン抵抗性についての正確な機構は、十分には理解されていないが、特定のホルモンに対する核レセプターの異常な発現（これは、ヒトにおけるホルモン抵抗性の主要な原因である）には関連しない。代わりに、新世界ザル細胞におけるホルモン抵抗性は、低親和性レセプター−ステロイド結合動態またはレセプター−ＤＮＡ相互作用が弱くなることのいずれかを生じる後生的な要因に起因するようである。例えば、新世界ザル細胞におけるグルココルチコイド抵抗性の研究により、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）９０に関連した、ＦＫ５０６に結合するイムノフィリン（ｉｍｍｕｎｏｐｈｉｌｉｎ）ＦＫＢＰ５１（これは、グルココルチコイドレセプターへのリガンド結合を７４％阻害する）の発現の上昇を示した。
【００１７】
新世界ザルにおけるビタミンＤ抵抗性は、ｈｓｐ−７０様細胞内ビタミンＤ結合タンパク質（「ＩＤＢＰ」）のおよびドミナントネガティブ活性化ビタミンＤエレメント結合タンパク質（「ＶＤＲＥ−ＢＰ」）の異常な発現に起因するようであり、ＶＤＲＥ−ＢＰは、ヘテロ核リボ核タンパク質Ａ（「ｈｎＲＮＰＡ」）に相同である。ビタミンＤと類似の様式で、新世界ザルにおけるエストロゲン抵抗性は、２つの補償的タンパク質の過剰発現と関連する：細胞内エストラジオール結合タンパク質（「ＩＥＢＰ」）および非レセプター関連性エストロゲン応答エレメント結合タンパク質（「ＥＲＥ−ＢＰ」）。
【００１８】
新世界ザルにおけるエストロゲン抵抗性および高レベルの循環ステロイドホルモンの裏側にある生化学的機構の理解を増すことによって、エストロゲンおよび他のステロイドホルモンに関連する疾患を処置および診断するための新たな機会が得られた。本発明は、新世界ザルにおけるエストロゲン抵抗性に関する本発明者らの研究の驚くべき結果に基づく。上記のように、彼らは、このエストロゲンに対する抵抗性が、２つの補償的タンパク質：ＩＥＢＰおよびＥＲＥ−ＢＰの過剰発現と関連したことを見出した。
【００１９】
エストロゲン効果は、一般に、エストロゲンレセプター（「ＥＲ」）を通じて媒介される。代表的には、ＥＲは、そのリガンド結合ドメイン（すなわち、エストロゲン）に結合する場合に活性化する。そのＥＲシグナル伝達に関する古典的な経路は、エストロゲン応答エレメント（「ＥＲＥ」）へのレセプター結合により媒介され、ＥＲＥは、ＥＲが高親和性で結合する特異的ＤＮＡ配列である。そのＥＲは、リガンド結合、ＤＮＡ結合および細胞シグナル伝達経路によるリン酸化の結果として、コンホメーション変化を受ける。このコンホメーション変化は、転写を活性化させることを可能にする。そのＥＲリガンドが阻害されるかまたはＥＲダイマーに十分なエストロゲンが存在しない場合、ＥＲは、活性化され得ず、ＥＲＥの転写は、減少するかまたは進まない。
【００２０】
ＩＥＢＰは、熱ショックタンパク質−２７（「ｈｓｐ２７」）ファミリーのメンバーであると考えられている。Ｈｓｐ２７は、ヒト乳癌細胞の抽出物中で、熱ショック応答性タンパク質（ＩＥＢＰに特徴的である特徴）として、およびエストロゲン応答性タンパク質として、初めて同定された。新世界ザルにおけるヒトｈｓｐ２７とＩＥＢＰとの間のｃＤＮＡの相同性の比較により、２９２ｎｔ重複において８９．４％同一性があることが示唆される。
【００２１】
以下でさらに詳細に記載されるように、用語「ＩＥＢＰ」は、本明細書で使用される場合、天然に存在するＩＥＢＰ（例えば、ヒトｈｓｐ２７タンパク質）のアミノ酸残基配列を有するタンパク質に言及するのみならず、他の等価なタンパク質（例えば、その天然に存在するＩＥＢＰまたは合成ＩＥＢＰの機能的誘導体および改変体）、ならびにＩＥＢＰに類似の様式で機能する活性部位を有する化合物にも言及する（これらの化合物が、それら自体天然に存在しようが合成であろうが関係ない）。
【００２２】
ｈｓｐ２７と同様に、ＩＥＢＰ発現は、熱ショックに応答して増大した。さらに、ＩＥＢＰ発現は、男性よりも女性において顕著であるが、卵巣摘出後の女性の乳房においては減少していた。これらの特徴は、ＩＥＢＰ発現のエストロゲン応答性を立証する。Ｃｈｅｎら，「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ １７β−Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｃｅｌｌｓ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８８：５０１−５０４（２００３）。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、そのｈｓｐ２７関連したＩＥＢＰは、エストロゲンレセプターα（ＥＲα）のリガンド結合ドメインに結合し、１７β−エストラジオール（「Ｅ２」）−ＥＲα媒介性転写を抑制するように作用すると考えられる。ＥＲα（すなわち、Ｅ２）のリガンド結合ドメインへの結合によって、ＩＥＢＰは、Ｅ２についてＥＲαと競合するので、ＥＲＥトランス活性化を阻害すると考えられる。ＩＥＢＰは、リガンド結合についてＥＲαと競合し、１７β−エストラジオール−ＥＲ指向性シグナル伝達を抑制する。ＩＥＢＰは、ＥＲＥと結合もせず、ＥＲＥに結合して、トランス活性化を阻害するためにＥＲと競合もしないとさらに考えられる。
【００２３】
ＩＥＢＰは、そのＩＥＢＰが連結されているＥＲとは異なる様式でのエストロゲン結合のための核外蓄積物として作用する。ＩＥＢＰは、ＥＲα発現には直接的には影響を及ぼさないようである。本発明者らの研究からのデータは、ｈｓｐ２７関連ＩＥＢＰは、細胞質ＥＲについてのコレプレッサーまたはシャペロンとして作用し、エストロゲン結合の際にこの機能が解離または不活化のいずれかをする。
【００２４】
ＥＲＥ−ＢＰは、ｈｎＲＮＰ Ｃ（ヘテロ核リボヌクレオタンパク質）ファミリーのメンバーである。ＥＲＥ−ＢＰの中心ＲＮＰを含有するドメインは、他のｈｎＲＮＰに対して高度の配列類似性を保有するが、これらの同じＲＮＡ結合部位もまた、ＤＮＡに対するＥＲＥ−ＢＰの結合を担うか否かは明らかではない。ｈｎＲＮＰとＥＲＥ−ＢＰとの間の一次構造の類似性にも関わらず、ＥＲＥは、いくつかの局面ではｈｎＲＮＰの古典的プロフィールとは異なる。例えば、ＥＲＥ−ＢＰは、細胞の核区画には制限されない。最近の研究に基づくと、ＥＲＥ−ＢＰは、新世界ザルの細胞の核後抽出において、ならびにエストロゲン抵抗性細胞の細胞質区画および核区画の両方から、単離された。さらに、ＥＲＥ−ＢＰは、それが核酸に結合する能力において多様であるようである。ＥＲＥ−ＢＰは、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡに結合し得、そしてまたＲＮＡとも相互作用し得る。Ｃｈｅｎら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ−Ａｃｔｉｎｇ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｍｉｌｙ」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７３：３１３５２−３１３５７（１９９８）。
【００２５】
ＥＲＥ−ＢＰは、ＥＲと競合してＥＲＥに結合することによって、ＥＲ−ＥＲＥのトランス活性化を抑制するように作用すると、考えられる。ＥＲＥ−ＢＰは、ＥＲＥに結合し、Ｅ２のリガンドには結合しない。ＥＲＥ−ＢＰは、ドミナントネガティブなシス作用様式で作用して、その応答エレメントについてＥＲと競合することによって、トランス活性化を抑制する。ＥＲＥと直接作用しＥＲ結合に干渉することによって、ＥＲＥ−ＢＰは、ＥＲ作用をサイレンシングする。
【００２６】
ＩＥＢＰは、Ｅ２についての細胞内貯蔵所として作用することにより、またはＥＲのリガンド結合ドメインへの結合により、ＥＲＥ−ＢＰと協働し得る。いずれの場合においても、正味の効果は、ＥＲＢＰが、ＥＲ−ＥＲホモダイマー化を妨害し、それによりエストロゲン抵抗性を成立させることである。
【００２７】
エストロゲン抵抗性ＮＷＰ細胞の核後抽出物からＥ２親和性クロマトグラフィーにより精製されたタンパク質のトリプシン消化ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、本発明者らは、「小さい熱ショックタンパク質」（ヒトｈｓｐ２７ならびにクリスタリンＡおよびクリスタリンＢが挙げられる）に対する類似性によりＩＥＢＰ ｃＤＮＡの増幅を可能にする縮重プライマーを設計することが可能であった（図１Ａ）。新世界ザルのＩＥＢＰと、ヒトｈｓｐ２７との間の、高度の配列同一性（８７％）（図１Ｂ）は、ＩＥＢＰが、おそらくヒトｈｓｐ２７の種間ホモログであることを示す。小さい熱ショックタンパク質（ｓＨｓｐ；１５〜４２ｋＤａ）のファミリー（これは、ｈｓｐ２７を含む）は、原核生物および真核生物の両方において見出される。ヒトゲノムにおいて、ｈｓｐ２７は、第３染色体、第７染色体、第９染色体、およびＸ染色体上の４つの異なる遺伝子によってコードされる。そのような重複性は、コードされたタンパク質がその宿主の生存のために重要であることを示す。それらのタンパク質の７０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび６０ｋＤａの分子量範囲にある対応物と同様に、上記ｓＨｓｐは、（１）細胞「ストレス」（ｈｓｐ遺伝子のプロモーター中の特異的熱ショックエンハンサーエレメントと相互作用する熱ショック因子により伝達される熱ストレスを含む）によってアップレギュレートされ、（２）それらのｓＨｓｐが結合している細胞内タンパク質の構造および機能の完全性を保護する「分子シャペロン」として機能し得る。上記の７０ｋＤａファミリー、９０ｋＤａファミリー、および６０ｋＤａファミリーの熱ショックタンパク質とは異なり、ｓＨｓｐは、（１）そのアミノ酸配列があまり相同ではなく、（２）アポトーシスを防止することにおいて中心的役割を果たし、（３）細胞骨格およびその中の細糸構造の組織化のために重要であり、（４）自己オリゴマー化のために必要とされて、ヒトの水晶体の難治性質を提供するようである。
【００２８】
そのＮ末端アミノ酸配列およびＣ末端アミノ酸配列は、ｓＨｓｐファミリーのメンバー間および種間でかなり変化し得るが、そのｓＨｓｐ分子の一般的ドメイン構造は、進化の間を通して高度に保存されたままである。約９０残基の中心αクリスタリンドメインには、可変のＮ末端伸長部およびＣ末端伸長部が隣接する。このＣ末端伸長部（極性構造）は、現在、その分子のシャペロン機能の主要媒介因子であると考えられており、一方、保存されたα−クリスタリンおよび可変のＮ末端ドメインは、そのｓＨｓｐの多量体化のために必須であると考えられる。ヒトｈｓｐ２７と高度に相同であることに加えて、α−クリスタリンと比較した場合（図１Ａおよび図１Ｂ）、エストロゲン抵抗性新世界ザル細胞から単離されたＩＥＢＰは、本明細書中で、可変のＮ末端伸長部およびＣ末端伸長部が隣接した、代表的な保存された中心α−クリスタリンコアドメインを保有することが決定された。ＩＥＢＰは、それがＥ２親和性支持体に付着する能力により単離されたことを考慮して、ＩＥＢＰ配列は、エストロゲン結合部位の存在について走査された。図１Ａにおいて示されるように、ＥＲαのリガンド結合ドメインのうちの２１アミノ酸ストレッチに対して３８％同一性を有する配列が、上記分子の高度に保存されたα−クリスタリンコアドメインにおいて検出された。公式なマッピング研究が完了しなかったが、ＩＥＢＰを構成的に過剰発現する細胞においてＥ２結合の増強を担うのは、ＩＥＢＰのこの部分とそのヒトホモログｈｓｐ２７であることが、推定される（図３Ｂ）。さらに、推定Ｅ２結合サブドメインは、ｓＨｓｐの保存されたα−クリスタリンドメイン中に存在するので、エストロゲン結合は、ｓＨｓｐ２７ファミリーの他のメンバーの関数であり得ることが、可能である。上記の保存されたα−クリスタリンドメイン中にある大きな方の熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、およびｈｓｐ６０）の原型であるＡＴＰ結合／ＡＴＰアーゼドメインに対するいくらかの配列同一性が存在するが、ＩＥＢＰおよび他のｈｓｐ７０様タンパク質の機能を支配することにおいてＡＴＰが有する役割は、もしあったとしても、決定されるべき状態のままである。
【００２９】
熱ショック因子と相互作用し得る上記のエンハンサーシスエレメントを保有することに加えて、ｈｓｐ２７プロモーターはまた、Ｓｐ１部位およびＴＡＴＡボックスに直接隣接する、エストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）の半分の部位を含む。このＥＲＥの半分の部位は、ＥＲαと相互作用することが示され得るが、多数の実験室により報告されたようなｈｓｐ２７遺伝子のＥ２指向的トランス活性化は、このＥＲＥの半分の部位を必要としない。本発明者らの研究によって、抗ヒトｈｓｐ２７反応性ＩＥＢＰは、エストロゲン応答性遺伝子産物であり、ＥＲ飽和濃度のＥ２に対して一晩暴露された後に顕著にアップレギュレートされることが確認される（図５Ａ）。従って、ＩＥＢＰは、そしておそらくはそのヒトホモログであるｈｓｐ２７は、エストロゲンによりアップレギュレートされる遺伝子産物であり、この遺伝子産物は、その後、同じホルモンに結合し得る。これらの結果は、Ｅ２が、Ｅ２相互作用タンパク質の発現をアップレギュレートし得、このＥ２相互作用タンパク質は、その後、Ｅ２−ＥＲα−ＥＲＥ指向的トランス活性化を鎮静し得ることを示す（図２および図３）。このことは、ＩＥＢＰ遺伝子発現またはｈｓｐ２７遺伝子発現の転写的ダウンレギュレーションは、その遺伝子産物がエストロゲン駆動性発現を鎮静するが完全に抑制するわけではない（図２、バー３およびバー４）能力を介してその遺伝子産物により達成され得ることを、示唆する。換言すると、ｈｓｐ２７またはＩＥＢＰは、自己調節され得る（すなわち、Ｅ２−ＥＲα指向性ｈｓｐ２７発現が増加した場合、これは、ｈｓｐ２７プロモーターのレベルにてその後のＥ２−ＥＲエンハンサー作用を弱めるタンパク質を生じる）ことが、可能である。そのようなネガティブフィードバックシステムは、Ｅ２により促進されるトランス活性化を抵抗して調節するように作用する。
【００３０】
ＥＲαを保有するヒト乳癌は、エストロゲン指向性増殖の利点に対して感受性である。このことは、この疾患における補助化学療法剤としてのＳＥＲＭの広範な使用をもたらしている。Ｅ２によりＥＲαが占有されると腫瘍細胞の成長および増殖におけるこの変化に影響を与える機構は、集中的に調査される領域のままである。Ｅ２への暴露によりヒトＥＲα発現乳癌細胞において活性化される遺伝子のうちの１つは、ｈｓｐ２７（本明細書中で報告される新世界ザルＩＥＢＰのヒトホモログ）である。同様に、エストロゲン駆動性ｈｓｐ２７発現は、ＳＥＲＭに対して細胞を暴露することによって鎮静され得る。このことは、ＥＲαと同様に、ｈｓｐ２７の調査をもたらした。なぜなら、ｈｓｐ２７腫瘍発現を伴うヒト乳癌腫瘍マーカーは、現在、腫瘍細胞におけるエストロゲン−ＥＲα相互作用の「下流」指標であると示唆されるからである。いくつかの（しかし全てではない）研究において、ｈｓｐ２７発現は、ＥＲα発現と相関することが示された。従って、本件急の一部として実行された共免疫沈降、酵母ツーハイブリッドアッセイおよびＧＳＴ沈下（ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ）アッセイ（図５Ｂおよび図６）において、ｈｓｐ２７様ＩＥＢＰとＥＲαとの間に直接的タンパク質−タンパク質相互作用についての証拠が存在し、この相互作用は、Ｅ２の存在下で促進され、臨床的に有用なＳＥＲＭタモキシフェンに対して暴露することにより妨害されたことに、注目すべきである。これらのデータは、乳癌細胞によるＥＲαおよびＩＥＢＰの同時発現が、互いに対して機能的かつ時間的に連結され得ることを示唆する。インビトロでの乳癌細胞の挙動に対する、ＩＥＢＰ（ｈｓｐ２７）およびｈｎＲＮＰ関連ＥＲＥ−ＢＰのＥ２−ＥＲα−ＥＲＥ指向性転写の、付加的なドミナントネガティブに作用する鎮静の結果は、現在調査中である。
【００３１】
従って、本発明は、新規なＩＥＢＰ、およびそのＩＥＢＰをコードするポリヌクレオチドに関し、特に、単離および／または精製されたＩＥＢＰと、その対応するコード配列とに関する。本発明のさらなる実施形態は、ＩＥＢＰをコードするポリヌクレオチドを含む細胞および細胞株、ならびにＩＥＢＰを生成および／または過剰発現する細胞および細胞株に関する。本発明のＩＥＢＰの推定ペプチドが、配列番号１として示される。このＩＥＢＰペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２として示される。本発明の種々の実施形態において使用されるＩＥＢＰの全長ｃＤＮＡに対応するポリヌクレオチド配列は、配列番号３として示される。このｃＤＮＡは、後の実施例においてより詳細に記載されるように、エストロゲン抵抗性細胞株であるＢ９５−８からクローン化された。
【００３２】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドもしくはタンパク質の修飾語としての本明細書および特許請求の範囲における用語「単離（された）」および／または「精製（された）」の使用は、そのように示されるＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドもしくはタンパク質が、人工的にそのような形態で生成されており、従って、その天然のインビボ細胞環境から分離されていることを、意味する。この人の介入の結果として、本発明の組換えＤＮＡ、組換えＲＮＡ、組換えポリペプチド、および組換えタンパク質は、それらが天然で存在したようなＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、もしくはタンパク質ではない本明細書中に記載される様式で、有用である。
【００３３】
本発明の現在好ましいＩＥＢＰタンパク質としては、配列番号１のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列およびそのフラグメント、ならびにそれらの生物学的に活性な改変形態が挙げられる。当業者は、上記の配列のうちの多数の残基が、化学的、立体的、および／または電気的に類似する残基によって、生じるレセプター種の生物学的活性を実質的には改変することなく置換され得ることを、認識する。さらに、配列番号１と実質的に同じ配列を中に含む、より大きなポリペプチド配列（例えば、スプライス改変体）が、企図される。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に同じアミノ酸配列」とは、参照アミノ酸配列に対して少なくとも約７０％の同一性を有し、かつその参照アミノ酸配列により規定されるタンパク質が特徴とする匹敵する機能的かつ生物学的な活性を保持する、アミノ酸配列を指す。好ましくは、「実質的に同じアミノ酸配列」を有するタンパク質は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（より好ましくは９０％）のアミノ酸同一性を有し、約９５％を超える同一性が、特に好ましい。しかし、スプライス改変体として生じるか、保存的アミノ酸置換により改変されるか、または縮重コドンの置換により生じる、記載されたレベルに満たない配列同一性を含むポリペプチド（もしくは本明細書中上記で核酸と呼ばれる）もまた、本発明の範囲内に包含されることが、認識される。
【００３５】
用語「生物学的に活性な」または「機能的な」とは、本明細書中で本発明のＩＥＢＰタンパク質またはそのポリペプチドフラグメントの修飾語として使用される場合には、ＩＥＢＰに帰せられる機能的特徴のうちの少なくとも１つを示すポリペプチドを指す。例えば、ＩＥＢＰのある生物学的活性は、哺乳動物細胞中で過剰発現された場合にその哺乳動物細胞にエストロゲン抵抗性を付与する能力である。
【００３６】
本発明のＩＥＢＰタンパク質は、当該分野で周知の方法によって、例えば、種々の組換え発現系、沈殿、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびアフィニティクロマトグラフィーなどによって、単離され得る。他の周知の方法が、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ら、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９９０））（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載される。あるいは、本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されるような周知の組換え方法を使用して、入手され得る。
【００３７】
本発明のポリペプチドを調製するための手段の例は、当該分野で周知の方法を使用して、ＩＥＢＰをコードする核酸を適切な宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、両生類細胞（例えば、卵母細胞）または哺乳動物細胞）において発現し、これもまた周知の方法を使用して、発現されたポリペプチドを回収することである。本発明のＩＥＢＰポリペプチドは、本明細書中で記載されるような発現ベクターで形質転換された細胞から、直接単離され得る。本発明のポリペプチド、その生物学的に活性なフラグメントおよび機能的等価物もまた、化学合成により生成され得る。例えば、合成ポリペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のＭｏｄｅｌ ４３０ＡまたはＭｏｄｅｌ ４３１Ａの自動ペプチド合成機（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、製造業者により提供される化学物質を使用して、生成され得る。
【００３８】
また、用語ＩＥＢＰにより包含されるものは、そのポリペプチドフラグメントまたはポリペプチドアナログである。用語「ポリペプチドアナログ」とは、本明細書中で具体的に示される配列（すなわち、配列番号１）に対して実質的に同一であるアミノ酸残基配列（機能的に類似する残基で１つ以上の残基が保存的に置換されている）を有し、かつ本明細書中に記載されるＩＥＢＰを模倣する能力を示す、任意のポリペプチドを包含する。保存的置換の例としては、ある非極性（疎水性）残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニン）で別の非極性（疎水性）残基で置換すること、ある極性（親水性）残基で別の極性（親水性）残基を（例えば、アルギニン−リジン間、グルタミン−アスパラギン間、グリシン−セリン間）置換すること、ある塩基性残基（例えば、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジン）で別の塩基性残基を置換すること、またはある酸性残基（例えば、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸）で別の酸性残基を置換することが、挙げられる。句「保存的置換」はまた、非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導された残基を使用すること（但し、そのようなポリペプチドは、必要な結合活性を示す場合）を包含する。
【００３９】
「化学的誘導体」とは、官能側鎖の反応により化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する対象ポリペプチドを指す。そのような誘導体化分子としては、例えば、遊離アミノ基が、塩酸アミン、ｐ―トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基を形成するように誘導体化された、分子が挙げられる。遊離カルボキシ基は、塩、メチルエステルおよびエチルエステル、もしくは他の型のエステル、またはヒドラジドを形成するように誘導体化され得る。遊離ヒドロキシ基は、Ｏ‐アシル誘導体またはＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導体化され得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、Ｎ−イム−ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化され得る。また、化学的誘導体として包含されるのは、２０種の標準アミノ酸の１種以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンが、プロリンの代わりにされ得る。５−ヒドロキシリジンが、リジンの代わりにされ得る。３−メチルヒスチジンが、ヒスチジンの代わりにされ得る。ホモセリンが、セリンの代わりにされ得る。オルニチンが、リジンの代わりにされ得る。本発明のポリペプチドはまた、本明細書中に配列が示されるポリペプチドの配列と比較して、１つ以上の残基の付加および／または欠失を有する任意のポリペプチドを、必須活性が維持される限りは包含する。
【００４０】
本発明はまた、受容可能なキャリアと、単離された精製ＩＥＢＰポリペプチド、その活性フラグメントもしくはポリペプチドアナログ、またはそれらの精製された成熟タンパク質およびその活性フラグメントとを、単独でかまたは互いに組み合わせて含む、組成物を提供する。これらのポリペプチドまたはタンパク質は、組換え誘導されても、化学合成されても、または天然供給源から精製されてもよい。本明細書中で使用される場合、用語「受容可能なキャリア」とは、標準的な薬学的キャリア（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）溶液、水、およびエマルジョン（例えば、水中油エマルジョンもしくは油中水エマルジョン））のうちのいずれか、ならびに種々の型の湿潤剤を包含する。
【００４１】
本発明の別の実施形態に従って、本発明のＩＥＢＰタンパク質をコードする単離された核酸、およびそのフラグメントが、提供される。本明細書中に記載される核酸分子は、当業者にとって公知である種々のタンパク質発現系中にそのような核酸が組み込まれた場合に、本発明のタンパク質を生成するために有用である。さらに、そのような核酸分子またはそのフラグメントは、容易に検出可能な置換基で標識され得、そして所定のサンプル中のＩＥＢＰ遺伝子もしくはｍＮＲＡ転写物の存在および／または量についてアッセイするためのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。本明細書中に記載される核酸およびそのフラグメントはまた、本明細書中に記載される本発明のタンパク質をコードする遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応において、プライマーおよび／またはテンプレートして有用である。
【００４２】
用語「核酸」（また、ポリペプチドとも呼ばれる）は、リボ核酸（「ＲＮＡ」）またはデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、プローブ、オリゴヌクレオチド、およびプライマーを包含する。ＤＮＡは、相的ＤＮＡ（「ｃＤＮＡ」）またはゲノムＤＮＡ（例えば、ＩＥＢＰタンパク質をコードする遺伝子）のいずれかであり得る。ＩＥＢＰポリペプチドをコードする核酸を単離するための一手段は、哺乳動物ゲノムライブラリーを、当該分野で周知の方法を使用して、天然のＤＮＡプローブまたは人工的に設計したＤＮＡプローブを用いてプロービングすることである。ＩＥＢＰ遺伝子から誘導されたＤＮＡプローブは、この目的のために特に有用である。ＩＥＢＰポリペプチドをコードするＤＮＡ分子およびｃＤＮＡ分子は、哺乳動物供給源（例えば、旧世界のザル、新世界ザル、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタなど）もしくは他の動物供給源から相補的なゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくはＲＮＡを得るため、または従来の方法によるｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーのスクリーニングにより、関連するｃＤＮＡクローンもしくはゲノムクローンを単離するために、使用され得る。核酸の例は、ＩＥＢＰポリペプチドをコードする、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または単離されたゲノムＤＮＡである。そのような核酸としては、配列番号２を含む核酸、配列番号３を含む核酸、それらの対立遺伝子改変体を含む核酸、またはそれらのスプライス改変体ｃＤＮＡ配列を含む核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、句「スプライス改変体」または「選択的にスプライシングされた」とは、本発明のポリペプチドをコードする特定のヌクレオチド配列を記載するために使用された場合には、周知の真核生物ＲＮＡスプライシングプロセスから生じるｃＤＮＡ配列を指す。そのＲＮＡスプライシングプロセスは、真核生物の一次ＲＮＡ転写物からのイントロンを除去しエキソンを連結して、細胞質の成熟ＲＮＡ分子を生成することを包含する。スプライス改変体ヌクレオチド配列を単離する方法は、当該分野で周知である。例えば、当業者は、配列番号２のＩＥＢＰコードＤＮＡから誘導されたヌクレオチドプローブ、配列番号３のＩＥＢＰコードＤＮＡから誘導されたヌクレオチドプローブ、それらの対立遺伝子改変体から誘導されたヌクレオチドプローブ、それらのスプライス改変体から誘導されたヌクレオチドプローブ、または約１０〜１５０ヌクレオチド長のそのフラグメントから誘導されたヌクレオチドプローブ、およびそれらのアンチセンス核酸を使用して、本明細書中に記載されるように同じ種または他の種のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーをスクリーニングし得る。
【００４４】
本発明の一実施形態において、本発明のＩＥＢＰタンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号２、配列番号３、それらの対立遺伝子、およびそれらのスプライス改変体、ならびにそれらのアンチセンス核酸を包含する。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に同じヌクレオチド配列」とは、参照ポリヌクレオチドに対して十分な同一性を有しており、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照ヌクレオチドにハイブリダイズするようになっている、ＤＮＡを指す。一実施形態において、参照ヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を有するＤＮＡは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードするか、または配列番号１を含むそれより大きなアミノ酸配列をコードする。別の実施形態において、参照ヌクレオチド配列と「実質的に同じヌクレオチド配列」を有するＤＮＡは、その参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％の同一性を有する。参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％（より好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％）の同一性を有するＤＮＡが、好ましい。
【００４６】
本発明はまた、配列番号２および配列番号３に示される核酸とは異なるが、同じ表現型を有する核酸を包含する。表現型が類似する核酸は、「機能的に等価な核酸」とも呼ばれる。本明細書中で使用される場合、句「機能的に等価な核酸」は、本明細書中に開示される核酸と同じタンパク質産物を産生するのと実質的に同じ様式で機能する、わずかな重要ではない配列バリエーションによって特徴付けられる核酸を包含する。特に、機能的に等価な核酸は、本明細書中に開示されるポリペプチドと同じであるか、または保存的アミノ酸改変を有するか、あるいは配列番号１を含むより大きなポリペプチドをコードするポリペプチドをコードする。例えば、保存的改変は、別の非極性残基での非極性残基の置換、または類似の荷電した残基での荷電した残基の置換を包含する。これらの改変としては、タンパク質の三次構造を実質的に変更しない改変のような当業者によって認識される改変が挙げられる。
【００４７】
遺伝コードの縮重によって、特異的ハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸に必ずしもハイブリダイズしないＩＥＢＰポリペプチドをコードする核酸をさらに提供する。本発明のＩＥＢＰポリペプチドをコードする好ましい核酸は、配列番号１をコードする核酸およびそのフラグメントを含む。本発明のＩＥＢＰタンパク質をコードする例示的な核酸は、以下から選択され得る：
（ａ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｂ）中程度にストリンジェントな条件下でＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡであって、このＤＮＡが生物学的に活性なＩＥＢＰをコードする、ＤＮＡ、および
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のいずれかに関するＤＮＡ縮重物であって、このＤＮＡが、生物学的に活性なＩＥＢＰをコードする、ＤＮＡ縮合物。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「縮重」は、参照核酸（例えば、配列番号２または配列番号３）とは少なくとも１つのヌクレオチドが異なるが、参照核酸と同じアミノ酸をコードするコドンをいう。例えば、トリプレット「ＵＣＵ」、「ＵＣＣ」、「ＵＣＡ」および「ＵＣＧ」によって特定されるコドンは、互いに対して縮重している。なぜなら、これらのコドンの４つ全てが、アミノ酸セリンをコードするからである。
【００４９】
ハイブリダイゼーションとは、水素結合による核酸の相補鎖の互いへの結合（すなわち、センス：アンチセンス鎖またはプローブ：標的−ＤＮＡ）をいう；染色体ＤＮＡにおいて天然に存在する結合に類似する。所定のプローブを標的−ＤＮＡにハイブリダイズするために使用されるストリンジェンシーレベルは、当業者によって容易に変更され得る。
【００５０】
句「ストリンジェントハイブリダイゼーション」は、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件をいうために本明細書中で使用される。当業者に公知なように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。一般的に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウム濃度および温度の関数である。代表的に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの状態で実行され、続いて、種々のより高いストリンジェンシーで洗浄される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーに対する参照は、このような洗浄条件に関連する。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、句「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」とは、標的ＤＮＡに対して、約６０％の同一性、好ましくは、約７５％の同一性、より好ましくは、約８５％の同一性を有する相補核酸に標的−ＤＮＡが結合し得る条件をいう；標的−ＤＮＡに対する約９０％を超える同一性が特に好ましい。好ましくは、中程度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ（４２℃）でのハイブリダイゼーション、続く、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ（６５℃）での洗浄に等しい条件である。
【００５２】
句「高ストリンジェシーハイブリダイゼーション」とは、０．０１８Ｍ ＮａＣｌ（６５℃）において安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件をいう（すなわち、ハイブリッドが０．０１８Ｍ ＮａＣｌ（６５℃）において安定でない場合、本明細書中に企図されるように、高ストリンジェシー条件下で安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ（４２℃）でのハイブリダイゼーション、続く、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ（６５℃）での洗浄によって提供され得る。
【００５３】
句「低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」とは、１０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ（４２℃）でのハイブリダイゼーション、続く、１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ（５０℃）での洗浄に等しい条件をいう。デンハート溶液およびＳＳＰＥは、当業者に周知であり、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液も周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照のこと。
【００５４】
本発明のポリペプチド（単数または複数）をコードする好ましい核酸は、中程度にストリンジェントな条件（好ましくは、高ストリンジェンシー条件）下で、実質的に全ての配列または実質的な部分（すなわち、これに関して、より長いフラグメントが本発明の範囲内であるとして企図されるものの、代表的には、配列番号２または配列番号３の少なくとも１５〜３０ヌクレオチド）にハイブリダイズする。
【００５５】
ＩＥＢＰ ｃＤＮＡの任意の領域の部位特異的変異誘発は、変異ＩＥＢＰ ｃＤＮＡの産生のために本明細書中において企図される。例えば、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）を使用して、ＩＥＢＰ ｃＤＮＡに対して種々のミスセンスおよび／またはナンセンス変異を構築し得る。
【００５６】
本発明の核酸は、当該分野で周知の種々の方法によって産生され得る（例えば、本明細書中に記載される方法、配列番号２の種々の領域由来のオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲ増幅の使用、など）。
【００５７】
本発明のさらなる実施形態に従って、必要に応じて標識されたＩＥＢＰコードｃＤＮＡまたはそのフラグメントは、関連する新規哺乳動物ＩＥＢＰタンパク質をコードするさらなる核酸配列に対するライブラリー（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムなど）をプローブするために使用され得る。哺乳動物ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリー（好ましくは、ヒトライブラリー）の構築は、当該分野において周知である。このようなｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、最初に、低ストリンジェンシー条件下で実施され、これは、約４２℃未満の温度、約５０％未満のホルムアミド濃度および中程度〜低の塩濃度を含む。
【００５８】
現在好ましいプローブベースのスクリーニング条件は、約３７℃の温度、約２０％のホルムアミド濃度および約５×標準生理食塩水シトレート（ＳＳＣ；２０×ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）を含む。このような条件は、完全な相同性を必要としないが、プローブ配列と実質的な程度の類似性を有する配列の同定を可能にする。句「実質的な類似性」とは、少なくとも５０％の相同性を共有する配列をいう。好ましくは、プローブと少なくとも７０％の相同性を有する配列の同定を可能にするが、プローブとより低い程度の相同性を有する配列を識別するハイブリダイゼーション条件が選択される。結果として、本発明の核酸のコード領域と実質的に同じ（すなわち、類似）の配列を有する核酸が得られる。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、核酸「プローブ」は、配列番号２または配列番号３のいずれかに記載の任意の１４個以上の連続した塩基と同じ（またはその相補体の）少なくとも１４個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは、少なくとも５０個の連続した塩基の配列を有する一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはこれらのアナログである。プローブを構築する好ましい領域は、配列番号２の５’コード領域および／または３’コード領域を含む。さらに、本発明のＩＥＢＰタンパク質の全ｃＤＮＡコード領域、または配列番号２もしくは配列番号３に対応する全配列が、プローブとして使用され得る。プローブは、本明細書中において以下に記載されるような当該分野で周知の方法によって標識され得、そして種々の診断キットにおいて使用され得る。
【００６０】
本発明のなお別の実施形態に従って、上記核酸配列を適切な宿主細胞において発現させることによって本発明のＩＥＢＰタンパク質の組換え産生するための方法が提供される。任意の細胞または細胞株が、本発明の代替の実施形態に従って宿主細胞として使用され得、ＩＥＢＰを産生するかまたは過剰発現する細胞または細胞株を作製し得る。宿主細胞から作製される改変細胞または細胞株は、例えば、エストロゲン反応性（例えば、Ｏｌｄ Ｗｏｒｌｄ ｐｒｉｍａｔｅ ６２９９胸細胞）またはエストロゲン耐性（例えば、Ｂ９５−８細胞）であり得る。このような細胞および細胞株は、例えば、薬学的調製物のスクリーニングにおいて、または種々の本発明の組成物における含有のために有意な量のＩＥＢＰを作製するために使用され得る。これらの細胞および細胞株についての他の用途は、当業者に容易に明らかである。本明細書中に記載されるＩＥＢＰタンパク質を産生するために適切な組換えＤＮＡ発現系もまた、当該分野において周知である。例えば、上記ヌクレオチド配列は、さらなる操作のためにベクター中に組み込まれ得る。本明細書中で使用される場合、「ベクター（または「プラスミド」）とは、その発現または複製のいずれかのために、細胞中に異種ＤＮＡを導入するために使用される別個のエレメントをいう。
【００６１】
適切な発現ベクターは、当該分野において周知であり、これには、調節配列（例えば、このようなＤＮＡの発現を調節し得るプロモーター領域）に作動可能に連結されるＤＮＡを発現し得るベクターが挙げられる。このように、発現ベクターとは、適切な宿主細胞への導入の際に、挿入されるＤＮＡの発現を生じるファージミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターのような組換えＤＮＡ構築物または組換えＲＮＡ構築物をいう。適切な発現ベクターは、当業者に周知であり、これには、真核生物細胞および／または原核生物細胞において複製可能なベクター、ならびにエピソームのままであるベクターまたは宿主細胞ゲノム内に組み込まれるベクターが挙げられる。さらに、ベクターは、「ウイルスベクター」の形成を生じる多くのウイルスビリオン（例えば、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス）によってベクターをパッケージ化し得る適切なパッケージングシグナルを含み得る。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター領域」とは、作動可能に連結するＤＮＡの転写を制御するＤＮＡのセグメントをいう。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼ認識、結合および転写開始に十分な特定の配列を含む。さらに、プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼのこの認識、結合および転写初期活性を調節する配列を含む。これらの配列は、シス作動性因子であり得るか、またはトランス作動性因子に応答性であり得る。プロモーター（調節の性質に依存する）は、構成的であり得るかまたは調節され得る。本発明の実施における使用に企図される例示的プロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（「ＭＭＴＶ」）ステロイド誘導性プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（「ＭＭＬＶ」）プロモーターなどが挙げられる。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結」とは、ＤＮＡと調節およびエフェクターヌクレオチド配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写部位および翻訳停止部位、ならびに他のシグナル配列）との機能的関係をいう。例えば、プロモーターへのＤＮＡの作動的連結とは、このようなＤＮＡの転写が、そのＤＮＡを特異的に認識し、結合し、そして転写するＲＮＡポリメラーゼによってプロモーターから開始するような、ＤＮＡとプロモーターとの間の物理的および機能的関係をいう。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「発現」とは、ポリ核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスをいう。ポリ核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、適切な真核生物宿主細胞または生物が選択される場合、ｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００６５】
真核生物形質転換ベクターは、当該分野において周知であり、これには、ｐＢｌｕｅｓｋｒｉｐｔおよびファージＬａｍｂｄａ ＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡから入手可能）などが挙げられる。他の適切なベクターおよびプロモーターは、米国特許第４，７９８，８８５号（この開示は、その全体が、本明細書中において参考として援用される）に詳細に記載される。
【００６６】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の形質転換のための他の適切なベクターとしては、ｐＥＴ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎから入手可能；米国特許第４，９５２，４９６号を参照のこと）；例えば、ｐＥＴ１１ａ（これは、Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導性Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃオペレーターおよびｌａｃリプレッサー遺伝子を含む）、およびｐＥＴ １２ａ−ｃ（これは、Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、およびＥ． ｃｏｌｉ ｏｍｐＴ分泌シグナルを含む）が挙げられる。別の適切なベクターは、ｐＩＮ−ＩＩＩｏｍｐＡ２（Ｄｕｆｆａｕｄら，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：４９２−５０７，１９８７を参照のこと）（これは、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーターオペレーター、ｏｍｐＡ分泌シグナルおよびｌａｃリプレッサー遺伝子を含む）である。
【００６７】
例示的な真核生物形質転換ベクターとしては、クローン化ウシパピローマウイルスゲノム、ｐＳＶ−２ｇｐｔ系（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２７７：１０８−１１４）、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇクローニング系（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．２：１６１−１７０，１９８２）のようなマウスレトロウイルスおよび真核生物カセットのクローン化ゲノム、ならびにＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって記載される発現クローニングベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２２８：８１０−８１５，１９８５）が挙げられる。各々は、入手可能であり、形質転換真核生物細胞株での目的のタンパク質の少なくともいくらかの発現の実質的な保証を提供する。
【００６８】
哺乳動物細胞のトランスフェクションのために本発明のＩＥＢＰをコードするＤＮＡに連結され得る調節エレメントを含む特に好ましいベースベクターは、ＣＭＶプロモーターに基づくベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡから入手可能））；ＭＭＴＶプロモーターに基づくベクター（例えば、ｐＭＡＭＮｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）およびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能）；ならびにＳＶ４０プロモーターに基づくベクター（例えば、ｐＳＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）である。
【００６９】
本発明の別の実施形態に従って、本発明の核酸分子（すなわち、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を含む「組換え細胞」が提供される。適切な宿主細胞（好ましくは、細菌細胞、より好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換する方法、ならびに異種タンパク質をコードする遺伝子を含むこの細胞を培養するために適用可能な方法は、当該分野において一般的に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照のこと。
【００７０】
本発明の核酸を含む発現ベクターを宿主細胞に導入して、形質導入組換え細胞（すなわち、組換え異種核酸を含む細胞）を作製する例示的な方法は、当該分野において周知である（例えば、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８１；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６−９３２を参照のこと（これらのそれぞれが、その全体において本明細書中で参考として援用される）。形質導入の例示的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する感染（例えば、米国特許第４，４０５，７１２号および同第４，６５０，７６４号を参照のこと）、リン酸カルシウムトランスフェクション（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号および同第４，６３４，６６５号を参照のこと）、デキストラン硫酸トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション（例えば、米国特許第４，３９４，４４８号および同第４，６１９，７９４号を参照のこと）、サイトフェクション（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、粒子ビーズボンバードメントなどが挙げられる。異種核酸は、必要に応じて、その染色体外（すなわち、エピソーム）維持を可能にする配列を含み得るか、または異種ＤＮＡは、宿主のゲノム内に組み込まれ得る（宿主での安定な維持を確実にするための代替の手段として）。
【００７１】
本発明の実施における使用を企図される宿主生物としては、異種タンパク質の組換え産生が実施された生物が挙げられる。このような宿主生物の例としては、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ａｎｄ Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ；例えば、米国特許第４，８８２，２７９号、同第４，８３７，１４８号、同第４，９２９，５５５号、および同第４，８５５，２３１号を参照のこと）、哺乳動物細胞（例えば、Ｂ９５−８細胞、Ｏｌｄ Ｗｏｒｌｄ ｐｒｉｍａｔｅ ６２９９細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞およびＬｔｋ細胞）、昆虫細胞などが挙げられる。現在好ましい宿主生物は、細菌である。最も好ましい細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００７２】
１つの実施形態において、本発明のＩＥＢＰタンパク質をコードする核酸は、当該分野において周知の適切なウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなど）を使用して、インビボまたはインビトロのいずれかで、哺乳動物細胞内に送達され得る。
【００７３】
ウイルスに基づく系は、種々の細胞内に比較的高レベルの異種核酸を導入し得るという利点を提供する。ＩＥＢＰタンパク質をコードするＩＥＢＰ核酸を哺乳動物細胞内に導入するための適切なウイルスベクターは、当該分野において周知である。これらのウイルスベクターとしては、例えば、単純ヘルペスウイルスベクター（Ｇｅｌｌｅｒら，１９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１６６７−１６６９）、ワクシニアウイルスベクター（例えば、Ｐｉｃｃｉｎｉら，１９８７，Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５４５−５６３）；ＣＭＶベクター（Ｍｏｃａｒｓｋｉら，Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ；Ｙ．Ｇｌｕｚｍａｎ ａｎｄ Ｓ．Ｈ．Ｈｕｇｈｅｓ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐｐ．７８−８４）、ＭＭＬＶベクター（Ｄａｎｏｓら，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：６４６９）、アデノウイルスベクター（例えば、Ｌｏｇａｎら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３６５５−３６５９；Ｊｏｎｅｓら，１９７９，Ｃｅｌｌ，１７：６８３−６８９；Ｂｅｒｋｎｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６１６−６２６；Ｃｏｔｔｅｎら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６０９４−６０９８；Ｇｒａｈａｍら，１９９１，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１０９−１２７）、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。例えば、米国特許第４，４０５，７１２号および同第４，６５０，７６４号を参照のこと。特に好ましいウイルスベクターは、アデノウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターである。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、「レトロウイルスベクター」とは、２つのレトロウイルスＬＴＲ間に存在する異種遺伝子をコードする発現カセットを有する周知の遺伝子移動プラスミドをいう。レトロウイルスベクターは、代表的に、適切なパッケージングシグナルを含み、このパッケージングシグナルによって、レトロウイルスベクターまたはテンプレートとしてレトロウイルスベクターを使用して転写されるＲＮＡが、適切なパッケージング細胞株中のウイルスビリオン内にパッケージされ得る。本明細書中で使用するための適切なレトロウイルスベクターは、例えば、米国特許第５，２５２，４７９号、および ＷＩＰＯ公報ＷＯ ９２／０７５７３、ＷＯ ９０／０６９９７、ＷＯ ８９／０５３４５、ＷＯ ９２／０５２６６およびＷＯ ９２／１４８２９（これらは、本明細書中で参考として援用される）に記載され、これは、このようなレトロウイルスベクターを使用して、核酸をヒト細胞内に効率的に導入するための方法を提供する。他のレトロウイルスベクターとしては、例えば、ＭＭＴＶベクター（例えば、Ｓｈａｃｋｌｅｆｏｒｄら，１９８８， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：９６５５−９６５９を参照のこと）などが挙げられる。
【実施例】
【００７５】
以下の実施例は、ＩＥＢＰの生物学的活性、ならびにＩＥＢＰを産生および／または過剰発現する細胞および細胞株を調製するための方法を例示する。以下の実施例において、示される場合、実験的平均は、独立Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して統計的に比較した。
【００７６】
（実施例１ 細胞培養）
全ての細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。エストロゲン抵抗性のＮＷＰ細胞株であるＢ９５−８（ホルモン抵抗性の一般的なマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）由来を、ＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持した。エストロゲン応答性のＯＷＰ乳房細胞株である６２９９（アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）由来）を、ＤＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｒｖｉｎｅ；ＣＡ）中で維持した。全ての培養物を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳＩ，Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｃａｌａｂａｓａｓ，ＣＡ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン（共に、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ製）を慣用的に補充し、９５％空気、５％ ＣＯ２の雰囲気下に置いた。いくつかの実験において、コンフルエントな培養物を、回収および抽出物の調製の前に４８時間まで、Ｅ２（１０ｎＭ）を含む培地中で予めインキュベートした。
【００７７】
（実施例２ 細胞抽出物の調製）
各細胞株の後核抽出物（ｐｏｓｔｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｔｒａｃｔ）を、Ｃｈｅｎら「Ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ ａｎｄ Ｇｏｎａｄａｌ Ｓｔｅｒｏｉｄ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ａｎ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｈｉｃｈ Ｃｏｍｐｅｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ」、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，９９：６６９−６７５（１９９７）に記載されるように調製した。回収した細胞を、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄し、そして、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフロウリド（ＰＭＳＦ）を含有するＥＴＤ緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、５ｍＭジチオスレイトール（ｐＨ７．４））で２回洗浄した。この細胞ペレットを、次いで、ＥＴＤ緩衝液中に再懸濁し、５回の１０秒バーストで氷上にてホモジェナイズした。核ステロイドレセプタータンパク質を伴った核を、４℃にて、１０，０００×ｇで３０分間ペレット化した。
【００７８】
（実施例３ 相補末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）によるＩＥＢＰの分子クローニング）
以前の研究において、本発明者らは、ＮＷＰ Ｂ９５−８細胞における推定ＩＥＢＰに対応する、Ｅ２−親和性カラム精製タンパク質の代表的なフラグメントを同定し、特徴づけた。Ｃｈｅｎら「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ １７β−Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８８：５０１−５０４（２００３）。このタンパク質に対応するｍＲＮＡをクローニングするために、本発明者らは、代表的なペプチドのアミノ酸配列に対応する変性オリゴヌクレオチドを使用して、候補ｃＤＮＡのＲＡＣＥ生成を行なった。得られたＩＥＢＰについての推定アミノ酸配列の配列分析（図１Ａ）により、ヒトｈｓｐ２７に対して８７％の配列同一性、ヒトα−クリスタリンＡ鎖に対して４０％の配列同一性、そしてＢ鎖に対して４４％の配列同一性が明らかになった（図１Ｂ）。このアミノ酸配列はまた、ＥＲαのリガンド結合ドメインにおける２１アミノ酸の重なりと２８〜３８％の同一性を示したが、ステロイドホルモンレセプターに代表的なＬＸＸＬＬモチーフは存在しなかった（データ示さず）。
【００７９】
ＩＥＢＰのＮ末端に代表的なペプチド（ＲＶＰＦＳＬ）のアミノ酸に基づいて、本発明者らは、５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥのために、ＩＥＢＰ特異的なセンスオリゴヌクレオチドプライマーおよびその反転アンチセンスプライマーを設計した。ポリ（Ａ）＋ Ｂ９５−８細胞に由来するＲＮＡ（２．５μｇ）を鋳型として使用し、ＢＤ ＭＡＲＡＴＨＯＮ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、ＩＥＢＰ ｃＤＮＡの５’末端および３’末端を生成した。第２鎖ｃＤＮＡ合成およびアダプターライゲーションを、添付のマニュアルに指示されるように実施した。次いで、このアダプターライゲーションしたｃＤＮＡをＲＡＣＥ反応のためのアダプターおよびＩＥＢＰ特異的なプライマーのための鋳型として使用した：ＩＥＢＰの５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥについて、それぞれ、５’−ＣＧＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＣＧＣＧ−３’（配列番号４）および５’−ＣＧＣＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＣ−３’（配列番号５）。ＩＥＢＰについてのｃＤＮＡを、特異的な５’プライマーおよび３’プライマーを使用する端端増幅により生成した。次いで、この増幅産物をｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／Ｈｉｓ／ＴＯＰＯ発現ベクターにサブクローニングして、色素ターミネーターサイクル配列反応およびＡＢＩ自動シーケンサーを使用して、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙにより配列決定した。
【００８０】
（実施例４ 一過的トランスフェクション）
５×１０５個のエストロゲン抵抗性ＮＷＰ Ｂ９５−８細胞またはエストロゲン応答性ＯＷＰ乳房６２９９細胞を、１０％活性炭ストリップしたウシ胎仔血清（「ＦＣＳ」）を含有する、フェノールレッドを含まない培地中、６ウェルプレートに蒔き、８０〜９０％のコンフルエンシーまで増殖させた。表１に示すＤＮＡ調製物の組み合わせを、ＬＩＰＯＴＡＸＩ溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中２０μｇ ＤＮＡ／ｍｌの最大最終濃度までで用いて、トランスフェクションを３連で実施した。
【００８１】
【表１】
トランスフェクションの５時間後に、等容量の２０％ ＦＣＳを補充した、抗生物質を含まない培地を各ウェルに添加し、その後、１０ｎＭのＥ２を添加した。３７℃にてさらに４８時間後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性およびβガラクトシダーゼ活性を測定した（図２）。
【００８２】
（実施例５ ＩＥＢＰを過剰発現する細胞株の作製）
細胞株６２９９由来のＥ２応答性のＯＷＰ乳房細胞を、５．０μｇのｐｃＤＮＡ３．１／ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ ＩＥＢＰプラスミドと共に、ＬＩＰＯＴＡＸＩ溶液中で５時間インキュベートし、その後、等容量の２０％ ＦＣＳを補充した培地を添加した。一晩インキュベートした後、細胞をスプリットし（１：１０比）、５００μｇ／ｍｌのジェネティシン選択的抗生物質であるＧ４１８硫酸塩（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含有する新しい培地と共にインキュベートした。適切なコロニーが形成するまで、この培地を、３〜４日毎に交換した。単一のコロニーをピックアップし、新しいディッシュに移し、そして、さらなる研究のために、選択的抗生物質Ｇ４１８を含有する培地と共に、コンフルエントになるまでインキュベートした。
【００８３】
（実施例６ リガンド結合分析）
特異的な［３Ｈ］１７βエストラジオール（「［３Ｈ］Ｅ２」）結合を、ベクター単独および３つのＩＥＢＰを安定にトランスフェクトした細胞株の後核抽出物において測定した（図３Ｂ）。簡単には、上記のように単離した後核抽出物を、ＮａＣｌを含有するＥＴＤ緩衝液（ｐＨ８．０）中に再構成し、０．５Ｍ ＮａＣｌの最終塩濃度を達成し、０．１〜１００ｎＭの非標識の競合リガンドの存在下または非存在下にて、４ｎＭの［３Ｈ］Ｅ２と共に、４℃にて一晩インキュベートした。タンパク質結合［３Ｈ］Ｅ２を、デキストランコーティングした活性炭と共にインキュベートすることにより、未結合のステロールから分離した。実験は、三連で実施した。
【００８４】
（実施例７ ウェスタンブロット分析）
変性した細胞抽出物または精製したタンパク質を、Ｃｈｅｎら、「Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ−Ａｃｔｉｎｇ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｍｉｌｙ」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７３：３１３５２−３１３５７（１９９８）に記載されるように、４〜１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを使用する電気泳動に供し、ニトロセルロース膜に移した。この膜を５％無脂肪ドライミルクで１時間ブロッキングし、次いで、抗ヒトｈｓｐ２７モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ；以後「Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ」）と共に２時間、そして、ＨＲＰ結合体化二次抗体と共にさらに１時間インキュベートし、その後、化学発光試薬（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて抗体応答性のタンパク質を検出した。
【００８５】
（実施例８ 免疫沈降）
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、氷上で１０分間インキュベーションすることによって、ＲＩＰＡ緩衝液（１％のノニデット ｐ−４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１ｍＭのＰＭＳＦ、３０μｌ／ｍｌのアプロチニン、１０ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウムを含有する１×ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手）で溶解した。次いで、この得られた溶解物を、２３ゲージ針を通して繰り返し吸引することにより破壊し、遠心分離（１４，０００×ｇ、１０分間）により細胞上清を得た。次いで、上清のアリコート（各々５０μｇのタンパク質を含む）を抗ＥＲα抗体または抗ｈｓｐ２７抗体と共に、４℃にて一晩インキュベートした。２０μｌのプロテインＡ／Ｇアガロース（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚから入手）を添加し、４℃にてさらに１時間インキュベートした。次いで、このタンパク質混合物を、ＲＩＰＡ緩衝液（×４）およびＰＢＳ（×１）中で繰り返し遠心分離することにより洗浄した。得られたペレットを、２×ＳＤＳサンプル緩衝液に再懸濁した。煮沸後、サンプルを、４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移した。次いで、抗ＥＲα抗体および抗ｈｓｐ２７抗体を用いてウェスタンブロット分析を行い、ＥＣＬにより可視化した（図５）。
【００８６】
（実施例９ 酵母２ハイブリッドスクリーニング）
全長ＥＲα ｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチド５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＣＣＡＣＡＣＣＡＡＡＧＣＡＴＣＡＧＧＧ−３’（配列番号６）および５’−ＧＣＣＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＣＴＣ−３’（配列番号７）を使用して増幅した。このＥＲα ｃＤＮＡを、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインベクター（ＧＡＬ４ ＤＮＡ−ＢＤ／ＥＲ）のＮｄｅＩ部位およびＢａｍＨＩ部位にクローニングした。全長ヒトｈｓｐ２７ ｃＤＮＡを、オリゴヌクレオチド５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣＧＣＣＣＣＧＣＡＴＴＴＴ−３’（配列番号８）および５’−ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＧＡＡＣＴＴＴＡＴＴＴＧＡＧ−３’（配列番号９）を使用して増幅した。ＩＥＢＰ ｃＤＮＡを、ＧＡＬ４ ＤＮＡ活性化ドメインベクターのＥｃｏＲＩ部位およびＸｈｏＩ部位にクローニングした。ＧＡＬ４ ＤＮＡ−ＢＤ／ＥＲを、ＧＡＬ４ ＤＮＡ−ＡＤ／ｈｓｐ２７プラスミドと共に、Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ２ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡから入手）を製造業者の指示に従って使用して同時に形質転換した；いくつかのプレートを、水（コントロール）、Ｅ２（１０〜１００ｎＭ）、またはタモキシフェン（１０〜１００ｎＭ）で処理した。
【００８７】
このプラスミドを、自動配列決定により確認した。Ｙｅａｓｔ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ３ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手）を使用して、製造業者の指示に従って酵母２ハイブリッド分析を行なった；再び、例外として、このプレートを、水、Ｅ２（１０〜１００ｎＭ）またはタモキシフェン（１０〜１００ｎＭ）で処理した。
【００８８】
（実施例１０ ＧＳＴ−プルダウンアッセイ）
ＥＲα（残基２４６〜５９５）のリガンド結合ドメイン（「ＬＢＤ」）とのＧＳＴ融合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αにおいて発現させ、製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の指示に従ってグルタチオンセファロースビーズにより精製した。後核抽出物を、ＧＳＴビーズにアプライし、１時間インキュベートした。次いで、この充填されたＧＳＴ−抽出物混合物を、５ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＰＭＳＦを含有するＰＢＳ緩衝液で繰り返し（５×）洗浄し、２×ＳＤＳサンプル緩衝液に再懸濁し、５分間煮沸した。変性したタンパク質を、４〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に移し、適切な抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚから入手）でプローブし、ＥＣＬにより可視化した。
【００８９】
（実施例１１ ＩＥＢＰの発現）
以前に報告された、エストロゲン結合に対するその高い能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）が確認されているＥ２アフィニティカラム抽出を使用するＩＥＢＰの精製は、ＮＷＰ細胞におけるタンパク質の機能的関連性を明らかにしなかった。従って、ＩＥＢＰの過剰発現がエストロゲン誘導性のトランス活性化に拮抗するか、促進するか、または無関係であるかどうかを明らかにするために、実験を行なった。エストロゲン応答性の旧世界霊長類細胞を、ＩＥＢＰ ｃＤＮＡおよびＥＲＥ−プロモーター−レポーター構築物を一過的に同時トランスフェクションした。トランスフェクション後、ＥＲＥ指向型のルシフェラーゼ活性は、ベクターのみでトランスフェクトした旧世界霊長類細胞と比べて５０％減少した。ＥＲＥ−ＢＰの過剰発現はまた、ＥＲＥ媒介性の転写を抑制し、ＩＥＢＰおよびＥＲＥ−ＢＰを同時トランスフェクションした場合に、ＥＲＥルシフェラーゼレポーター活性の付加的な減少が生じた。ＩＥＢＰの作用は、部分的に排除されたが、Ｅ２での前処理により正常まで回復せず、そしてまた、コントロール細胞内でのＥＲＥ媒介性の転写を刺激した。類似の結果がまた、ＩＥＢＰの旧世界霊長類細胞への安定なトランスフェクションの後に得られた。これらの細胞におけるＩＥＢＰ発現の増加を、抗ｈｓｐ２７抗体を使用するウェスタンブロット分析により確認した。これらの研究はまた、野生型のコントロール細胞において、Ｅ２がｈｓｐ２７の発現を用量依存性の様式で刺激することを示した。その後のプロモーター−レポーターデータは、ＥＲＥルシフェラーゼレポーター活性は、野生型の細胞と比べると、ＩＥＢＰの存在下で、２〜３倍減少することを示した。一過性のトランスフェクト体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）と同様に、この作用は、Ｅ２での前処理によって部分的にのみ排除された。安定なトランスフェクト体改変体を使用して、ＩＥＢＰにより調節される転写とＥ２の後核結合との間の関係性に取り組むことがまた可能となった。
【００９０】
（実施例１２ ＩＥＢＰの特徴づけ）
一過性のトランスフェクト体および安定なトランスフェクト体の両方の分析は、ＩＥＢＰがＥＲＥ指向性の遺伝子の転写を沈めるように作用することを示した。このことは、少なくとも部分的に、エストロゲンの増強された結合によるものと考えられる。ＩＥＢＰがまた、ＥＲＥ結合についての直接的な競合因子として機能するか否かを決定するために、本発明者らは、理想化されたＥＲＥをプローブとして、組換えＥＲαおよび／またはＯＷＰ−ＩＥＢＰの安定なトランスフェクト体クローン１からの後核抽出物を結合タンパク質として使用して、電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）を実施した。データは、ＩＥＢＰが、ＥＲＥとも結合せず、ＥＲαともＥＲＥへの結合について競合しないことを示した。ＩＥＢＰはＥＲＥに直接結合するようではなかったが、そのＥＲ媒介性の転写を沈める能力は、ＥＲαとの可能な直接相互作用と一致していた。この可能性を評価するために、抗ＥＲα抗体および抗ｈｓｐ２７抗体を用いて、免疫共沈降を実施した。抗ヒトＥＲα抗体を使用して、ＥＲα未処理のタンパク質を、野生型およびＩＥＢＰを安定にトランスフェクトした細胞の両方の後核抽出物において免疫共沈降した。この免疫共沈降物を、ｈｓｐ２７抗体を使用することによって、ウェスタンブロット分析に供した。データは、ＥＲαとｈｓｐ２７との間の会合を確認した。類似の結果がまた、ｈｓｐ２７を用いる最初の免疫沈降、その後のＥＲαブロッティングにより得られた。
【００９１】
（実施例１３ ＥＲαとｈｓｐ２７とのリガンド依存性の相互作用）
ＩＥＢＰトランスフェクト体とは対照的に、未処理の野生型細胞からの抽出物においてＥＲαとｈｓｐ２７との間には比較的わずかな会合しか存在しなかった。しかし、データは、Ｅ２を用いた野生型細胞（ＩＥＢＰトランスフェクト体ではない）の一晩の処理が、ｈｓｐ２７発現を強力に増加させ、ＥＲ−Ｈｓｐ２７／ＩＥＢＰ相互作用を決定する際のリガンドの重要度の可能性を高めることを示した。従って、酵母２ハイブリッドシステムは、ＥＲαとのリガンド依存性の相互作用を確認するために採用された。全長ＥＲα ｃＤＮＡを、ＧＡＬ４活性化ドメインを含む融合タンパク質としてクローン化し、そして、酵母の同時形質転換において使用した。リガンド特異的な様式でＥＲαと相互作用するタンパク質を同定するために、１０ｎＭのＥ２またはタモキシフェンを補充したか、または補充していないＳＤ ｌｅｕ−／Ｔｒｐ−／Ｈｉｓ−／Ａｄｅ−培地において酵母のコロニーを選択した。全長ｈｓｐ２７およびＥＲ挿入物は、Ｅ２の存在下でのみ増殖した。ＥＲアゴニストであるタモキシフェンの存在下、または、Ｅ２なしの選択培地においては、増殖が観察されなかった。
【００９２】
最後に、ｈｓｐ２７とＥＲとの相互作用を確認するために、ＧＳＴ−プルダウンアッセイを行なった。ＩＥＢＰを過剰発現する細胞のタンパク質抽出物を、ＥＲを表すＧＳＴ−レセプターリガンド結合ドメイン融合タンパク質と共にインキュベートした。グルココルチコイドレセプター（ＧＲ）−融合タンパク質またはＧＳＴタンパク質単独を使用するコントロールアッセイを採用した。いずれの場合においても、ｈｓｐ２７を示したＳＤＳ−ＰＡＧＥの分離を、抗ｈｓｐ２７抗体を用いて評価した。データは、ｈｓｐ２７のみが、ＥＲ−ＧＳＴによりプルダウンされたが、ＧＲ−ＧＳＴまたはＧＳＴ単独はプルダウンされなかったことを示した。
【００９３】
上記説明は、本発明の特定の実施形態に言及しているが、多くの改変が、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが理解される。添付の特許請求の範囲は、本発明の真の範囲および精神の範囲内に含まれるような改変を網羅することを意図される。従って、ここで開示された実施形態は、全ての観点において、例示的であり、限定的ではないと考えられるべきであり、本発明の精神は、上記の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、それゆえ、特許請求の範囲と等価な意味および範囲の中にある全ての変更は、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に従って、新世界ザル（「ＮＷＰ」）細胞に由来するＩＥＢＰとヒト熱ショックタンパク質−２７（「ｈｓｐ２７」）との間の相同性の比較分析を示す。図１Ａは、ヒトｈｓｐ２７、ならびにヒトα−クリスタリンＡ（「ｈＣｒｙｓ Ａ」）およびヒトα−クリスタリンＢ（「ｈＣｒｙｓ Ｂ」）と比較した、ＩＥＢＰの全長推定アミノ酸配列を示す。陰を付けた領域は、４つ全ての分子の中での高い配列相同性の領域を示す。下線を付した領域は、−９０ファミリーおよび−７０ファミリーにおけるヒト熱ショックタンパク質のＡＴＰ結合ドメインおよび基質結合ドメインとの配列相同性の領域を示す。図１Ｂは、ｈｓｐ２７、ｈＣｒｙｓ ＡおよびｈＣｒｙｓ Ｂと比較した、ＩＥＢＰアミノ酸配列の相同性％値を示す。
【図２】図２は、本発明の一実施形態に従って、ＩＥＢＰおよびエストロゲン応答エレメント結合タンパク質（「ＥＲＥ−ＢＰ」）のエストロゲン応答エレメント（「ＥＲＥ」）ルシフェラーゼ活性の分析を示す。新世界ザルＥＲＥ−ＢＰおよび／または新世界ザルＩＥＢＰのｃＤＮＡを含む発現構築物を、１０ｎＭ １７β−エストラジオール（Ｅ２）の非存在下または存在下で、エストロゲン応答性ルシフェラーゼレポータープラスミドとＥＲａ＋ヒトＭＣＦ−７乳癌細胞株に一過性に同時トランスフェクトした。データは、ルシフェラーゼ活性の三連での測定の平均である。＊＝コントロールトランスフェクト体と比較して、統計学的に有意（Ｐ＜０．００１）。図２は、ＩＥＢＰはＥＲＥ−ＢＰと、ＥＲＥ指向性トランス活性化を抑制する（ｓｑｕｅｌｃｈ）ように協働することを示唆する。
【図３】図３は、本発明の一実施形態に従って、ＥＲＥ指向性トランス活性化のＩＥＢＰ媒介性抑制におけるエストロゲンの役割を例示し、細胞質結合の分析を示す。図３Ａは、１７β−エストラジオール（Ｅ２ １０ｎＭ；黒棒）の非存在下（左パネル）または存在下（右パネル）で、ベクター単独（白棒）で安定にトランスフェクトした新世界ザル宿主由来の野生型６２９９乳癌細胞および全長ＩＥＢＰ ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトした細胞の３種の異なるサブクローンにおけるＩＥＢＰまたはＥＲＥのプロモーター−レポータールシフェラーゼ活性の効果を示す。データは、ルシフェラーゼ活性の三連での測定の平均である。＊＝コントロールトランスフェクト体と比較して、統計学的に有意（Ｐ＜０．００１）。図３Ｂは、ＩＥＢＰで安定にトランスフェクトした細胞株の後核抽出物中の［３Ｈ］１７β−エストラジオール（Ｅ２）の置き換えを示す。データは、ベクターのみのコントロールおよび３種のＩＥＢＰ安定トランスフェクト体細胞株における、Ｅ２の漸増用量（０．１〜１００ｎＭ）により置き換えられた最大［３Ｈ］１７Ｂ−エストラジオール％の三連での測定の平均である。図３は、ＥＲＥ指向性トランス活性化のＩＥＢＰ媒介性抑制が、エストロゲンの細胞質結合の増加と関連することを示唆する。
【図４】図４は、本発明の一実施形態に従って、プローブとして二本鎖コンセンサスＥＲＥ、およびタンパク質として組換えヒトＥＲαおよび／またはＥＲＥアフィニティー生成したＥＲＥ−ＢＰを使用して、電気移動度シフトアッセイ（ｅｌｅｃｔｒｏｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙ）（「ＥＭＳＡ」）を示す。ＩＥＢＰ（レーン７、パネルＡ；レーン３および４、パネルＢ）は、１００ｎＭ １７β−エストラジオール（Ｅ２）の存在下または非存在下で、ＥＲＥに結合もせず、ＥＲＥへの結合についてＥＲと競合することもなかった（レーン６、パネルＡ；レーン２および３、パネルＣ）。そのＥＲ−ＥＲＥ複合体は、１００ｎＭ Ｅ２ありまたはなしで抗ｈｓｐ２７抗体を添加することによって（レーン４および５；パネルＣ）スーパーシフトした。図４は、ＥＲＥ媒介性転写に対するＩＥＢＰの効果が、ＥＲＥとの直接的相互作用にも、ＥＲ−ＥＲＥ複合体形成の破壊にも起因しないことを示唆する。
【図５】図５Ａは、本発明の一実施形態に従って、プローブとして二本鎖コンセンサスＥＲＥ、ならびに複合体化するタンパク質として１００ｎＭ １７β−エストラジオール（Ｅ２）の存在下または非存在下で組換えヒトＥＲα、ヒトｈｓｐ２７および抗ヒトｈｓｐ２７抗体を使用するＥＭＳＡを記載する。図５Ｂは、ベクター単独またはＩＥＢＰでトランスフェクトした新世界ザル６２９９乳癌細胞の後核抽出物のタンパク質構成成分と抗ヒトｈｓｐ２７（左パネル）および抗ヒトＥＲα（右パネル）との免疫沈降、続いてそれぞれ、抗ヒトＥＲα抗体および抗ヒトｈｓｐ２７抗体での検出を示す。図５は、ヒトＥＲαとｈｓｐ２７様タンパク質との間に直接関連性があることを示唆する。
【図６】図６は、本発明の一実施形態に従って、ＩＥＢＰの１７β−エストラジオール調節性発現およびそのＥＲαとの相互作用を示す。図６Ａは、野生型乳房細胞におけるｈｓｐ２７の発現における１７β−エストラジオール媒介性増大を示す。示されるのは、漸増用量のＥ２（０．１〜１００ｎＭ）の非存在下または存在下での、野生型乳房細胞におけるｈｓｐ２７のウェスタンブロット分析である。図６Ｂは、ｈｓｐ２７とＥＲαとのリガンド１７β−エストラジオール（Ｅ２）依存性相互作用の酵母ツーハイブリッド分析を示す。ＡＨ１０９酵母細胞を、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン−ＥＲα融合タンパク質プラスミドで同時トランスフェクトし、Ｅ２（１０ｎＭ）、ＥＲアンタゴニストであるタモキシフェン（Ｔａｍ，１０ｎＭ）またはビヒクルのみ（なし）のいずれかを含むＬｅｕ培地／Ｔｒｐ培地／Ｈｉｓ培地／Ａｄｅ培地を用いてコロニー増殖により選択した。図６Ｃは、ＥＲ相互作用タンパク質のＧＳＴプルダウン分析（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）を示す。ＩＥＢＰを過剰発現する細胞のタンパク質抽出物を、ＥＲ−ＧＳＴまたはグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）−ＧＳＴ融合タンパク質またはＧＳＴタンパク質単独のいずれかとともにインキュベートした。ＧＳＴ結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ｈｓｐ２７抗体でプローブした。これらの結果は、ＥＲ−ＩＥＢＰ相互作用がリガンド１７β−エストラジオールにより促進されるが、ＳＥＲＭであるタモキシフェンにより促進されないことを示唆する。
【図７】図７は、本発明の一実施形態に従って、ＥＲ−ＥＲＥ指向性トランス活性化の通常のおよびＩＥＢＰ媒介性抑制を示す。図７Ａは、１７β−エストラジオール（Ｅ２）に結合したＥＲホモダイマーがＥＲＥと相互作用する、通常の転写事象を示す。図７Ｂは、ＩＥＢＰの影響下での「抑制された」転写事象を示す；ＥＲαとリガンドとの間のＥ２結合ＩＥＢＰの介在が、ＥＲダイマー化、ＥＲ−ＥＲＥ相互作用およびトランス活性化の妨害をもたらす。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内エストラジオール結合タンパク質（ＩＥＢＰ）を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１に示されるものと実質的に同じアミノ酸配列をさらに含む、生物学的に活性なＩＥＢＰポリペプチドを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
細胞内エストラジオール結合タンパク質（ＩＥＢＰ）を含む単離されたポリペプチド；およびキャリアを含む、組成物。
【請求項５】
前記単離されたポリペプチドが、配列番号１に示されるものと実質的に同じアミノ酸配列をさらに含む、生物学的に活性なＩＥＢＰポリペプチドをさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記単離されたポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記キャリアは、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、エマルジョンおよび湿潤剤からなる群より選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｂ）中等度にストリンジェントな条件下で該（ａ）のＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡであって、該ＤＮＡは、生物学的に活性なＩＥＢＰをコードする、ＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかに関して変性したＤＮＡであって、該ＤＮＡは、生物学的に活性なＩＥＢＰをコードする、ＤＮＡ、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかに対して完全に相補的なＤＮＡ、
からなる群より選択される、細胞内エストラジオール結合タンパク質（ＩＥＢＰ）をコードする、単離された核酸。
【請求項９】
前記単離された核酸は、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡからなる群より選択される、請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
配列番号２に示されるものと実質的に同じ核酸配列をさらに含む核酸を含む、請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１１】
配列番号３に示されるものと実質的に同じ核酸配列をさらに含む核酸を含む、請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１２】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを保有する、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項８に記載の単離された核酸を保有する、組換え宿主細胞。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、Ｂ９５−８細胞、６２９９乳房細胞およびＥ．ｃｏｌｉ細胞からなる群より選択される、請求項１４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１６】
前記宿主細胞が、ＩＥＢＰを過剰発現する、請求項１４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１４に記載の宿主細胞およびキャリアを含む、組成物。
【請求項１８】
前記キャリアは、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、エマルジョンおよび湿潤剤からなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１】
細胞内エストラジオール結合タンパク質（ＩＥＢＰ）を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１に示されるものと実質的に同じアミノ酸配列をさらに含む、生物学的に活性なＩＥＢＰポリペプチドを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
細胞内エストラジオール結合タンパク質（ＩＥＢＰ）を含む単離されたポリペプチド；およびキャリアを含む、組成物。
【請求項５】
前記単離されたポリペプチドが、配列番号１に示されるものと実質的に同じアミノ酸配列をさらに含む、生物学的に活性なＩＥＢＰポリペプチドをさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記単離されたポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記キャリアは、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、エマルジョンおよび湿潤剤からなる群より選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｂ）中等度にストリンジェントな条件下で該（ａ）のＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡであって、該ＤＮＡは、生物学的に活性なＩＥＢＰをコードする、ＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかに関して変性したＤＮＡであって、該ＤＮＡは、生物学的に活性なＩＥＢＰをコードする、ＤＮＡ、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかに対して完全に相補的なＤＮＡ、
からなる群より選択される、細胞内エストラジオール結合タンパク質（ＩＥＢＰ）をコードする、単離された核酸。
【請求項９】
前記単離された核酸は、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡからなる群より選択される、請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
配列番号２に示されるものと実質的に同じ核酸配列をさらに含む核酸を含む、請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１１】
配列番号３に示されるものと実質的に同じ核酸配列をさらに含む核酸を含む、請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１２】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを保有する、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項８に記載の単離された核酸を保有する、組換え宿主細胞。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、Ｂ９５−８細胞、６２９９乳房細胞およびＥ．ｃｏｌｉ細胞からなる群より選択される、請求項１４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１６】
前記宿主細胞が、ＩＥＢＰを過剰発現する、請求項１４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１４に記載の宿主細胞およびキャリアを含む、組成物。
【請求項１８】
前記キャリアは、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、エマルジョンおよび湿潤剤からなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００６−５２５０３０（Ｐ２００６−５２５０３０Ａ）
【公表日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１４３００（Ｐ２００６−５１４３００）
【出願日】平成１６年５月６日（２００４．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４０２８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０００１９８
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【出願人】（３９８０６２１４９）セダーズ−シナイ メディカル センター (34)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月６日（２００４．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４０２８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０００１９８
【国際公開日】平成１７年１月６日（２００５．１．６）
【出願人】（３９８０６２１４９）セダーズ−シナイ メディカル センター (34)
【Ｆターム（参考）】
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