細胞加工装置及び細胞加工方法
【課題】高いスループットレートにおける遺伝子導入の際に不要な細胞の混在を防ぐ。
【解決手段】細胞または粒子４をそれぞれ搬送するための複数の微小流路上が合流して複数の微小流路上のそれぞれの細胞または粒子４を互いに融合させるための細胞加工装置にて、２分割センサー６にて細胞または粒子４を検出する。細胞または粒子４が検出されたか否かに基づいて当該微小流路への細胞または粒子４の送液速度を制御する。
【解決手段】細胞または粒子４をそれぞれ搬送するための複数の微小流路上が合流して複数の微小流路上のそれぞれの細胞または粒子４を互いに融合させるための細胞加工装置にて、２分割センサー６にて細胞または粒子４を検出する。細胞または粒子４が検出されたか否かに基づいて当該微小流路への細胞または粒子４の送液速度を制御する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞に刺激を与えたり、改質したり、改変するための細胞加工装置及び細胞加工方法に関し、特に流路を用いた細胞加工装置及び細胞加工方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微小流路を用いた粒子を処理するには、粒子を保持する保持メカニズムを用いる技術が考えられている（例えば、特許文献１参照。）。この保持メカニズムは、流体フローによって及ぼされる配置力を超えるように作用しうる。こうすることで、複数の保持メカニズムに保持された粒子を、流路の薬液にさらすことができる。
【０００３】
また、拡散前面を検出した結果のプロフィールに示された拡散の状況から、目的物の濃度を検出する技術が考えられている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００４】
特許文献１及び特許文献２以外の従来行われている遺伝子導入には、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポーレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法が挙げられる。
【特許文献１】特表２００５−５２１４２５号公報（第１頁、第７６頁、第７７頁、ＦＩＧ．１１Ｃ）
【特許文献２】特表２００３−５００６５３号公報（第１頁、第９頁、図３Ａ）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
こうした従来技術は、本来物質を検出したり濃度を求めたりといった微小流路の特徴を生かした分析技術μＴＡＳ（micro total analysis system）として粒子（細胞を含む）を使用、操作するものである。
【０００６】
このため、粒子操作は、細胞に刺激を与えたり、改質したり、改変したりするための操作には十分に適しているとは言えない場合が多い。
【０００７】
本来、細胞を改変するための遺伝子導入（トランスフェクション）は、個々の細胞に確実で、ハイスループットな遺伝子導入が必要とされる。そのため細胞操作は、細胞一つ一つに漏れなく遺伝子を導入し、且つこの操作をスループット高く行わなければならない。
【０００８】
こうした場合、特許文献１に記載されたような保持メカニズムを有することは必ずしも必要ではない。むしろ、流体フローによって及ぼされる配置力に逆らわず、流体フローのスループットレートで細胞操作を行う必要がある。
【０００９】
また、特許文献２に記載されたような流路方向に対して横断面となるような拡散前面を検出して、目的の濃度を求める必要も無い。
【００１０】
また、特許文献１及び特許文献２以外の従来行われている上述した遺伝子導入は、いずれも細胞個々の単一操作を行っていない。そのため、こうした操作の後には遺伝子導入された細胞とそうではない細胞とが混在してしまうという問題点がある。
【００１１】
従来では、こうした細胞を選別するために、いくつかの薬剤耐性遺伝子や蛍光マーカー遺伝子を目的遺伝子の下流につなぎ、後から薬剤や蛍光コロニー、フローサイトメータによって選別できるよう細工することが必須である。
【００１２】
本発明は、上述したような従来の技術が有する問題点に鑑みてなされたものであって、高いスループットレートにおける遺伝子導入の際に不要な細胞の混在を防ぐことができる細胞加工装置及び細胞加工方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために本発明は、
細胞を含む粒子をそれぞれ搬送するための複数の流路上が合流して前記複数の流路上のそれぞれの粒子を互いに融合させるための細胞加工装置であって、
前記流路上にて前記粒子を検出する検出手段と、
前記検出手段によって粒子が検出されたか否かに基づいて当該流路への該粒子の送液速度を制御する制御手段とを有する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、以上説明したように構成されているので、高いスループットレートにおける遺伝子導入の際に不要な細胞の混在を防ぐことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
【００１６】
図１は、本発明の細胞加工装置に設けられた流路の一形態を示す図である。
【００１７】
本形態は図１に示すように、それぞれ異なる物質を搬送し、それらがＹ字またはＴ字形（例えば、Ｔ字路３）で互いに合流（融合）する複数の流路である。また、この合流地点が多段に設けられているものである。そして、合流地点の上流側、下流側、または双方に物質を検出する検出手段であるセンサー１が設けられている。
【００１８】
これらの合流する流路のうち少なくとも１つの流路は、改質または改変される細胞を搬送するためのものでなくてはならない。また、他の流路のうち少なくとも１つの流路は、上記細胞を改質または改変するためのＤＮＡやＲＮＡ等の核酸、ペプチドまたは蛋白質を含む粒子、または細胞（ウイルスを含む）を搬送するものでなくてはならない。
【００１９】
上記以外の流路は、単に培地交換、バッファー交換や各種グロスファクターなどの細胞の育成に関わる因子、薬剤選択をするための薬剤、シグナル伝達物質、各種標識抗体などを添加するための流路を含んでも良い。こうした流路はセンサー１を持たなくても良い。図１に示したＴ字路３にはセンサー１が設けられていない。
【００２０】
また、流路の長さについては、細胞分裂や細胞改質に必要な滞留時間を満たすような長さであっても良い。滞留時間の長い流路として、図１に示した蛇行路２や、流路切り替えバルブと組み合わせた循環流路を用いることができる。
【００２１】
また、センサー１を設ける位置については、三叉路の近傍が良く、目的に応じて合流地点の上流側と下流側とのいずれかに設けても良い。細胞と粒子との接触を果たす場合、または細胞と薬液とが接触を果たす場合は、上流側に設けることが望ましい。また、細胞と粒子が融合を果たした後、外部から刺激を印加する外部刺激印加手段によって核内に目的物質を移行させる場合は、下流側に設けることが望ましい。
【００２２】
本形態の流路のような微小流路内で扱う細胞は、数ミクロンから数百ミクロンのサイズである。また、細胞であるため、これを操作するためには流路内は親水性である必要がある。
【００２３】
一方、微小流路内で扱う非細胞粒子は、数十ナノから数ミクロンのサイズである。
【００２４】
これらの個々の粒子について、単一操作を行いやすくするためには、粒子に対する流路幅が流路の１倍を超えて１０倍以下程度であることが望ましい。しかし、極端に流路幅を細くすると、粒子が含まれた液体を流路に導入することが困難になるため、流路径ｒに対して送液圧力Ｐを考慮することが必要である。このときの条件は次式で表される。
【００２５】
Ｐ＞２Ｔｃｏｓθ／ｒ−ρｇｈ （式１）
ここで、Ｔは表面張力、θは溶液と流路との接触角、ｇは重力加速度、ρは溶液の密度、ｈは溶液の高さである。流路が水平（ｈ＝０）に設置された状態であれば、（式１）の第２項を考慮する必要は無い。
【００２６】
この他、電気泳動や電気浸透流を送液手段に用いることができるが、バッファー組成や塩濃度、ｐＨ等に制約があり、ポンプでの送液がより望ましい。
【００２７】
また、流路の材質は、シリコン基板、ガラス、樹脂、ＰＤＭＳなどのエラストマーの他、熱、紫外線等で流路のパターニングが可能なポリアクリルアミドゲルのようなゲルを用いることができる。
【００２８】
センサー１の形態について述べる。粒子の検出は、一対の電極による電気的インピーダンス変化を計測するもの、または受光素子によって光学的な光強度変化を計測するものを用いることができる。
【００２９】
電極または受光素子で構成されたセンサーのサイズは、検出感度の観点から考えると、検出すべき粒子と同程度かそれよりも小さいことが望ましい。
【００３０】
また、ピンホールを設け、レーザー光を用いて一般的な熱レンズ計測系や共焦点光学系の構成で受光素子の光強度変化を計測する方法も、小さな粒子検出には良い。この場合、光受光素子前にピンホールを設ける必要がある。
【００３１】
図２（ａ）は、２分割センサーを用いた流路の一例を示す図であり、図２（ｂ）は、２分割センサーの出力の様子を示す図である。
【００３２】
図２（ａ）に示したＹ字流路には、粒子または細胞の位置検出をより精度良く行うために２分割センサー６が合流地点の上流側に設けられている。異なる流路から流れてくる粒子同士の接触を果たすためには、双方の流路にセンサーを設けなければならない。
【００３３】
また、２分割センサー６から出力される２つの光強度信号をそれぞれＦ、Ｒとする。ＦとＲとをそれぞれ差動増幅回路の入力（Ｆ）９と差動増幅回路の入力（Ｒ）１０とに導くと、差動増幅回路の出力信号８が得られる。これにより、粒子または細胞４が２分割センサー６の中心を通過すると、図２（ｂ）の破線に示すような零クロス信号を発生させることができる。このため粒子または細胞４の位置を正確に知ることができる。この情報をポンプの駆動、流速制御に用いる。
【００３４】
次に、お互いの粒子が出会うためのタイミング制御形態について述べる。
【００３５】
センサー１から粒子または細胞の検出信号を受け取ると、残る一方の流路に設けられたセンサー１からの粒子または細胞の検出信号が発生しない限り、ポンプによる流路への送液がストップされる。その後、残る一方の流路に設けられたセンサー１からの粒子または細胞の検出信号が発生すると、合流地点までの各流路内の粒子または細胞の位置を計算しながら、それぞれの流路を流れる粒子または細胞が互いに出会うように、両方のポンプが駆動される。
【００３６】
次に、流路を流れる粒子または細胞の必要な性質について述べる。
【００３７】
ここで、改質、改変される細胞に接触を果たすＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、ペプチドまたは蛋白質を含む非細胞粒子は、接触後、エンドサイトーシスによって細胞と融合するという特徴を有していなければならない。このような特徴を有するものとして、一般的なリポフェクション法に用いられるリポソームの中に、これらＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、ペプチドまたは蛋白質を内包させたものを用いることができる。ウイルスの場合は本来、細胞表面のレセプターを介して容易にエンドサイトーシスを起こす。また、一般的な数百ナノまでのナノ粒子は、リポソームのような脂質膜を持たずともエンドサイトーシスを起こしうる。従来行われているリン酸カルシウム法によるナノ粒子も、こうしたナノ粒子と同様と考えられる。さらに、数十以下のナノ粒子については、細胞の核膜孔サイズが２５ｎｍほどであることから、核内にも容易に到達することが予想される。
【００３８】
また、トランスフェクションの形態においては、例えばＲＮＡｉのように細胞質に導入することで目的を果たせる場合や、核内まで移行させなければならない場合を考慮する必要がある。
【００３９】
ＤＮＡのように核内まで運ばなくてはならない場合には、例えば細胞質から核内に移行させる外部刺激印加手段として、外部から温度、電気パルス（電気刺激）、超音波、光、磁気を融合後に加えることができる手段を持っていると良い。このため、融合後の粒子を検出する手段を設けてもよい。このとき、こうした外部刺激に対応したリポソーム、ｐＨ、光、温度感受性リポソーム、磁性体を内包したリポソームまたは磁性ナノ粒子、ウイルス粒子を用いることができる。磁性粒子の場合には、磁力で引き付け、核膜を突き破って、目的物を核内に移行させる手法をとることができる。なお、超音波を用いる場合は、リポソームの瞬間的破裂による核内導入を目的とする以外に、振動を加えることで流路内に定在波が立つために、定在波の節目に相当する流路中央に粒子が集まる性質がある。これを利用して流路に対して粒子が小さすぎる場合に、粒子を流路中央に集めるだけの目的として使用することができる。
【００４０】
以上、１つの細胞とそれを改質するための粒子とを融合させるに必要な形態について述べたが、複数の流路を組み合わせて複数の粒子導入をすることにより、より高度なトランスフェクションを行うことができる。
【００４１】
従来のトランスフェクションは、例えば、遺伝子は導入されたけれども一過性で、相同組換えに至るには困難を極めたりすることがよくある。こうした問題の背景には、遺伝子導入する細胞周期の状態、インポーチン、イクスポーチン、核内移行シグナルの発生など、シグナル伝達全体に関連する因子の状態を無視できないことが挙げられる。また、核内においても、ＤＮＡメチル化の状態、ヒストンのメチル化、アセチル化、脱アセチル化に関連する因子を無視できないことが挙げられる。一方、こうした因子に作用する、または関連する薬剤は近年多く報告されるようになり、こうした薬剤を組み合わせて、複数段階からなる、高度なトランスフェクションを行う形態も、本発明を用いることによって可能となる。
【００４２】
図３は、粒子または細胞を刺激するために他の流路から薬剤を供給する一形態を示す図である。
【００４３】
本形態は図３に示すように、Ｔ字で合流する流路である。粒子または細胞４が１つの流路から供給され、一方の流路には粒子または細胞４を刺激するための薬剤がパルス的に供給される。こうした段階を、トランスフェクションを行う前、または後に設けてより高度なトランスフェクションを行うことができる。
（実施例１）
（流路の作製）
図４は、本発明の流路における実施例１を示す図である。
【００４４】
実施例１では図４に示すように、Ｙ字流路の合流地点に単結晶Ｓｉ基板を用いたｐｉｎフォトダイオードの４分割センサー１１を、また、合流地点の下流側に第２のｐｉｎフォトダイオード１１ａをそれぞれ配置する。この流路は、ｎ層となる基板の上に、水素化アモルファスシリコン、水素化アモルファスシリコンカーバイトをＰＣＶＤ（plasma chemical vapor deposition ）法で堆積する。そのとき、膜厚をそれぞれ３６０ｎｍ、１４０ｎｍとし、その上にＡｕ電極をパターニングする。成膜条件は、１×１０-7Torr、ＲＦパワー２０mW/cm2、２５０℃、堆積時１２０ mTorrである。スパッタ法でＳｉＯ2を封止膜として積層し、その上から、シリコーン系離型剤をスピンコート、ＳＵ８レジストを塗布、露光して流路パターンを形成する。次にＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を型に流し込んで剥離後、中のＳＵ８造物を除去した後、硬化したＰＤＭＳを再度かぶせて流路とする。
（装着および動作）
図５は、本発明の細胞加工装置の実施の一形態を示す図である。
【００４５】
本形態は図５に示すような構成となる。流路２４をホルダー７に装着し、流路２４とシリンジ１２，１２ａ、およびシャーレ２２との間をチューブ２３で接続する。ここで、流路２４は図４にて説明した流路である。シリンジ１２，１２ａは流路２４の２つの流路それぞれに接続されている。４分割センサー１１は、４つに分割されたセンサーそれぞれにて検出された光強度信号を、Ｉ／Ｖ変換回路１３を介して図２に示したようにペアにして差動増幅回路に導き、Ａ／Ｄ変換回路１４がＡ／Ｄ変換する。合流地点の下流側に設けられた第２のｐｉｎフォトダイオード１１ａは、検出された光強度信号を、Ｉ／Ｖ変換回路１３ａを介してＡ／Ｄ変換回路１４ａへ導き、Ａ／Ｄ変換回路１４ａがＡ／Ｄ変換する。Ａ／Ｄ変換回路１４，１４ａにてＡ／Ｄ変換されたデータは、マイコン２５によってシリンジポンプ１５の駆動のＯＮ／ＯＦＦ判定および、電気パルス印加タイミング発生信号に用いる。予め十分離散的となるような濃度、０．５×１０5個/ｍｌに培地で希釈、かつポリエチレングリコールの濃度が２０％になるように調整したマウスミエローマ細胞をシリンジ１２に吸い込み、シリンジポンプ１５に装着する。一方、マウスリンパ節から採取した細胞を同一濃度に調整し、もう一方のシリンジ１２ａに装着する。シリンジポンプ１５は２つのシリンジが装着可能でそれぞれ独立に駆動を制御できる制御手段である。次に、予め扁平にしたタングステン針に金蒸着を施した電極１６を、融合後の細胞検出のための第２のｐｉｎフォトダイオード１１ａ側部に設けた、電極差込凹部２１に実態顕微鏡で観察しながら差し込む。次に、ハロゲンランプ１７で流路２４全体を照明し、シリンジポンプ１５を駆動する。気体から液体に差しかかる最初のシグナルがセンサーにはいり、粒子を検出するとマイコン２５は粒子が互いに出会うように流速を制御する。また合流後、融合した粒子を第２のｐｉｎフォトダイオード１１ａで検出すると、電極１６にパルスが印加され、核内の融合を促進する。
（実施例２）
（流路の作製）
図６は、本発明の流路における実施例２を示す図である。図６（ａ）は、本実施例を流路上部から見た図であり、また図６（ｂ）は、本実施例を流路側面から見た図である。
【００４６】
実施例２は図６に示すように、ガラス基板を用い、流路直下にピンホール１９を配置する。ピンホール１９は、流路の裏面にスパッタ法で、アルミを蒸着し、サイズ約４００ｎｍとする。実施例１と同様、ＳＵ８レジストを塗布、露光して流路パターンを形成する。次に、ＰＤＭＳを型に流し込んで剥離後、中のＳＵ８造物を除去した後、硬化したＰＤＭＳを再度かぶせて流路とする。流路には、PC modifier（株式会社AIバイオチップスの商品）を満たして内部を親水処理しておく。処理方法は能書に従う。
（装着および動作）
チューブの接続を実施例１と同様に行う。図６（ｂ）に示すように、各ピンホール１９には、コリメータレンズ付きの赤色可視光が半導体レーザー光源モジュール２０のアパーチャ２０ａを通り、流路に照射される。そして、流路に照射された可視光が粒子像面からの一部の光はピンホール１９を通過してアバランシエフォトダイオード１８によって検出される。アバランシエフォトダイオード１８の出力はＩ／Ｖ変換回路を介してＡ／Ｄ変換され、変換データはマイコンによってシリンジポンプ駆動のＯＮ／ＯＦＦ判定に用いる。予め十分離散的となるような濃度、０．５×１０5個/ｍｌに培地で希釈、調整したマウスＥＳ細胞をシリンジに吸い込み、シリンジポンプに装着する。一方、リポフェクタミン2000 （インビトロジェン株式会社の商品名）を使って、ハウスキーピングジーンの下流にＧＦＰ遺伝子をつないだプラスミドＤＮＡを内包したリポソームを作製する。作製方法は能書に従う。先ほどとほぼ同じ濃度になるように調整した後、リポソームをシリンジに吸い込み、シリンジポンプに装着する。その後、シリンジポンプを駆動し、実施例１と同様に、細胞とリポソームが出会うように流速制御する。
【００４７】
上記のように本発明においては、微小流路下で細胞個々の単一操作を実現することができるために、遺伝子導入された細胞とそうでない細胞が混在する結果とならない。また、マイクロインジェクション法と比べ、大幅にスループットレートを向上することができる。
【００４８】
したがって本発明は、従来問題とされたスループットレートの課題、遺伝子導入されなかった細胞が混在するといった課題を解決する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の細胞加工装置に設けられた流路の一形態を示す図である。
【図２】（ａ）は、２分割センサーを用いた流路の一例を示す図であり、（ｂ）は、２分割センサーの出力の様子を示す図である。
【図３】粒子または細胞を刺激するために他の流路から薬剤を供給する一形態を示す図である。
【図４】本発明の流路における実施例１を示す図である。
【図５】本発明の細胞加工装置の実施の一形態を示す図である。
【図６】本発明の流路における実施例２を示す図である。
【符号の説明】
【００５０】
１ センサー
２ 蛇行路
３ Ｔ字路
４ 粒子または細胞
５ 薬剤
６ ２分割センサー
７ ホルダー
８ 差動増幅回路の出力信号
９ 差動増幅回路の入力（Ｆ）
１０ 差動増幅回路の入力（Ｒ）
１１ ４分割センサー
１１ａ 第２のｐｉｎフォトダイオード
１２，１２ａ シリンジ
１３，１３ａ Ｉ／Ｖ変換回路
１４，１４ａ Ａ／Ｄ変換回路
１５ シリンジポンプ
１６ 電極
１７ ハロゲンランプ
１８ アバランシエフォトダイオード
１９ ピンホール
２０ 半導体レーザ光源モジュール
２１ 電極差込凹部
２２ シャーレ
２３ チューブ
２４ 流路
２５ マイコン
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞に刺激を与えたり、改質したり、改変するための細胞加工装置及び細胞加工方法に関し、特に流路を用いた細胞加工装置及び細胞加工方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微小流路を用いた粒子を処理するには、粒子を保持する保持メカニズムを用いる技術が考えられている（例えば、特許文献１参照。）。この保持メカニズムは、流体フローによって及ぼされる配置力を超えるように作用しうる。こうすることで、複数の保持メカニズムに保持された粒子を、流路の薬液にさらすことができる。
【０００３】
また、拡散前面を検出した結果のプロフィールに示された拡散の状況から、目的物の濃度を検出する技術が考えられている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００４】
特許文献１及び特許文献２以外の従来行われている遺伝子導入には、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポーレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法が挙げられる。
【特許文献１】特表２００５−５２１４２５号公報（第１頁、第７６頁、第７７頁、ＦＩＧ．１１Ｃ）
【特許文献２】特表２００３−５００６５３号公報（第１頁、第９頁、図３Ａ）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
こうした従来技術は、本来物質を検出したり濃度を求めたりといった微小流路の特徴を生かした分析技術μＴＡＳ（micro total analysis system）として粒子（細胞を含む）を使用、操作するものである。
【０００６】
このため、粒子操作は、細胞に刺激を与えたり、改質したり、改変したりするための操作には十分に適しているとは言えない場合が多い。
【０００７】
本来、細胞を改変するための遺伝子導入（トランスフェクション）は、個々の細胞に確実で、ハイスループットな遺伝子導入が必要とされる。そのため細胞操作は、細胞一つ一つに漏れなく遺伝子を導入し、且つこの操作をスループット高く行わなければならない。
【０００８】
こうした場合、特許文献１に記載されたような保持メカニズムを有することは必ずしも必要ではない。むしろ、流体フローによって及ぼされる配置力に逆らわず、流体フローのスループットレートで細胞操作を行う必要がある。
【０００９】
また、特許文献２に記載されたような流路方向に対して横断面となるような拡散前面を検出して、目的の濃度を求める必要も無い。
【００１０】
また、特許文献１及び特許文献２以外の従来行われている上述した遺伝子導入は、いずれも細胞個々の単一操作を行っていない。そのため、こうした操作の後には遺伝子導入された細胞とそうではない細胞とが混在してしまうという問題点がある。
【００１１】
従来では、こうした細胞を選別するために、いくつかの薬剤耐性遺伝子や蛍光マーカー遺伝子を目的遺伝子の下流につなぎ、後から薬剤や蛍光コロニー、フローサイトメータによって選別できるよう細工することが必須である。
【００１２】
本発明は、上述したような従来の技術が有する問題点に鑑みてなされたものであって、高いスループットレートにおける遺伝子導入の際に不要な細胞の混在を防ぐことができる細胞加工装置及び細胞加工方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために本発明は、
細胞を含む粒子をそれぞれ搬送するための複数の流路上が合流して前記複数の流路上のそれぞれの粒子を互いに融合させるための細胞加工装置であって、
前記流路上にて前記粒子を検出する検出手段と、
前記検出手段によって粒子が検出されたか否かに基づいて当該流路への該粒子の送液速度を制御する制御手段とを有する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、以上説明したように構成されているので、高いスループットレートにおける遺伝子導入の際に不要な細胞の混在を防ぐことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
【００１６】
図１は、本発明の細胞加工装置に設けられた流路の一形態を示す図である。
【００１７】
本形態は図１に示すように、それぞれ異なる物質を搬送し、それらがＹ字またはＴ字形（例えば、Ｔ字路３）で互いに合流（融合）する複数の流路である。また、この合流地点が多段に設けられているものである。そして、合流地点の上流側、下流側、または双方に物質を検出する検出手段であるセンサー１が設けられている。
【００１８】
これらの合流する流路のうち少なくとも１つの流路は、改質または改変される細胞を搬送するためのものでなくてはならない。また、他の流路のうち少なくとも１つの流路は、上記細胞を改質または改変するためのＤＮＡやＲＮＡ等の核酸、ペプチドまたは蛋白質を含む粒子、または細胞（ウイルスを含む）を搬送するものでなくてはならない。
【００１９】
上記以外の流路は、単に培地交換、バッファー交換や各種グロスファクターなどの細胞の育成に関わる因子、薬剤選択をするための薬剤、シグナル伝達物質、各種標識抗体などを添加するための流路を含んでも良い。こうした流路はセンサー１を持たなくても良い。図１に示したＴ字路３にはセンサー１が設けられていない。
【００２０】
また、流路の長さについては、細胞分裂や細胞改質に必要な滞留時間を満たすような長さであっても良い。滞留時間の長い流路として、図１に示した蛇行路２や、流路切り替えバルブと組み合わせた循環流路を用いることができる。
【００２１】
また、センサー１を設ける位置については、三叉路の近傍が良く、目的に応じて合流地点の上流側と下流側とのいずれかに設けても良い。細胞と粒子との接触を果たす場合、または細胞と薬液とが接触を果たす場合は、上流側に設けることが望ましい。また、細胞と粒子が融合を果たした後、外部から刺激を印加する外部刺激印加手段によって核内に目的物質を移行させる場合は、下流側に設けることが望ましい。
【００２２】
本形態の流路のような微小流路内で扱う細胞は、数ミクロンから数百ミクロンのサイズである。また、細胞であるため、これを操作するためには流路内は親水性である必要がある。
【００２３】
一方、微小流路内で扱う非細胞粒子は、数十ナノから数ミクロンのサイズである。
【００２４】
これらの個々の粒子について、単一操作を行いやすくするためには、粒子に対する流路幅が流路の１倍を超えて１０倍以下程度であることが望ましい。しかし、極端に流路幅を細くすると、粒子が含まれた液体を流路に導入することが困難になるため、流路径ｒに対して送液圧力Ｐを考慮することが必要である。このときの条件は次式で表される。
【００２５】
Ｐ＞２Ｔｃｏｓθ／ｒ−ρｇｈ （式１）
ここで、Ｔは表面張力、θは溶液と流路との接触角、ｇは重力加速度、ρは溶液の密度、ｈは溶液の高さである。流路が水平（ｈ＝０）に設置された状態であれば、（式１）の第２項を考慮する必要は無い。
【００２６】
この他、電気泳動や電気浸透流を送液手段に用いることができるが、バッファー組成や塩濃度、ｐＨ等に制約があり、ポンプでの送液がより望ましい。
【００２７】
また、流路の材質は、シリコン基板、ガラス、樹脂、ＰＤＭＳなどのエラストマーの他、熱、紫外線等で流路のパターニングが可能なポリアクリルアミドゲルのようなゲルを用いることができる。
【００２８】
センサー１の形態について述べる。粒子の検出は、一対の電極による電気的インピーダンス変化を計測するもの、または受光素子によって光学的な光強度変化を計測するものを用いることができる。
【００２９】
電極または受光素子で構成されたセンサーのサイズは、検出感度の観点から考えると、検出すべき粒子と同程度かそれよりも小さいことが望ましい。
【００３０】
また、ピンホールを設け、レーザー光を用いて一般的な熱レンズ計測系や共焦点光学系の構成で受光素子の光強度変化を計測する方法も、小さな粒子検出には良い。この場合、光受光素子前にピンホールを設ける必要がある。
【００３１】
図２（ａ）は、２分割センサーを用いた流路の一例を示す図であり、図２（ｂ）は、２分割センサーの出力の様子を示す図である。
【００３２】
図２（ａ）に示したＹ字流路には、粒子または細胞の位置検出をより精度良く行うために２分割センサー６が合流地点の上流側に設けられている。異なる流路から流れてくる粒子同士の接触を果たすためには、双方の流路にセンサーを設けなければならない。
【００３３】
また、２分割センサー６から出力される２つの光強度信号をそれぞれＦ、Ｒとする。ＦとＲとをそれぞれ差動増幅回路の入力（Ｆ）９と差動増幅回路の入力（Ｒ）１０とに導くと、差動増幅回路の出力信号８が得られる。これにより、粒子または細胞４が２分割センサー６の中心を通過すると、図２（ｂ）の破線に示すような零クロス信号を発生させることができる。このため粒子または細胞４の位置を正確に知ることができる。この情報をポンプの駆動、流速制御に用いる。
【００３４】
次に、お互いの粒子が出会うためのタイミング制御形態について述べる。
【００３５】
センサー１から粒子または細胞の検出信号を受け取ると、残る一方の流路に設けられたセンサー１からの粒子または細胞の検出信号が発生しない限り、ポンプによる流路への送液がストップされる。その後、残る一方の流路に設けられたセンサー１からの粒子または細胞の検出信号が発生すると、合流地点までの各流路内の粒子または細胞の位置を計算しながら、それぞれの流路を流れる粒子または細胞が互いに出会うように、両方のポンプが駆動される。
【００３６】
次に、流路を流れる粒子または細胞の必要な性質について述べる。
【００３７】
ここで、改質、改変される細胞に接触を果たすＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、ペプチドまたは蛋白質を含む非細胞粒子は、接触後、エンドサイトーシスによって細胞と融合するという特徴を有していなければならない。このような特徴を有するものとして、一般的なリポフェクション法に用いられるリポソームの中に、これらＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、ペプチドまたは蛋白質を内包させたものを用いることができる。ウイルスの場合は本来、細胞表面のレセプターを介して容易にエンドサイトーシスを起こす。また、一般的な数百ナノまでのナノ粒子は、リポソームのような脂質膜を持たずともエンドサイトーシスを起こしうる。従来行われているリン酸カルシウム法によるナノ粒子も、こうしたナノ粒子と同様と考えられる。さらに、数十以下のナノ粒子については、細胞の核膜孔サイズが２５ｎｍほどであることから、核内にも容易に到達することが予想される。
【００３８】
また、トランスフェクションの形態においては、例えばＲＮＡｉのように細胞質に導入することで目的を果たせる場合や、核内まで移行させなければならない場合を考慮する必要がある。
【００３９】
ＤＮＡのように核内まで運ばなくてはならない場合には、例えば細胞質から核内に移行させる外部刺激印加手段として、外部から温度、電気パルス（電気刺激）、超音波、光、磁気を融合後に加えることができる手段を持っていると良い。このため、融合後の粒子を検出する手段を設けてもよい。このとき、こうした外部刺激に対応したリポソーム、ｐＨ、光、温度感受性リポソーム、磁性体を内包したリポソームまたは磁性ナノ粒子、ウイルス粒子を用いることができる。磁性粒子の場合には、磁力で引き付け、核膜を突き破って、目的物を核内に移行させる手法をとることができる。なお、超音波を用いる場合は、リポソームの瞬間的破裂による核内導入を目的とする以外に、振動を加えることで流路内に定在波が立つために、定在波の節目に相当する流路中央に粒子が集まる性質がある。これを利用して流路に対して粒子が小さすぎる場合に、粒子を流路中央に集めるだけの目的として使用することができる。
【００４０】
以上、１つの細胞とそれを改質するための粒子とを融合させるに必要な形態について述べたが、複数の流路を組み合わせて複数の粒子導入をすることにより、より高度なトランスフェクションを行うことができる。
【００４１】
従来のトランスフェクションは、例えば、遺伝子は導入されたけれども一過性で、相同組換えに至るには困難を極めたりすることがよくある。こうした問題の背景には、遺伝子導入する細胞周期の状態、インポーチン、イクスポーチン、核内移行シグナルの発生など、シグナル伝達全体に関連する因子の状態を無視できないことが挙げられる。また、核内においても、ＤＮＡメチル化の状態、ヒストンのメチル化、アセチル化、脱アセチル化に関連する因子を無視できないことが挙げられる。一方、こうした因子に作用する、または関連する薬剤は近年多く報告されるようになり、こうした薬剤を組み合わせて、複数段階からなる、高度なトランスフェクションを行う形態も、本発明を用いることによって可能となる。
【００４２】
図３は、粒子または細胞を刺激するために他の流路から薬剤を供給する一形態を示す図である。
【００４３】
本形態は図３に示すように、Ｔ字で合流する流路である。粒子または細胞４が１つの流路から供給され、一方の流路には粒子または細胞４を刺激するための薬剤がパルス的に供給される。こうした段階を、トランスフェクションを行う前、または後に設けてより高度なトランスフェクションを行うことができる。
（実施例１）
（流路の作製）
図４は、本発明の流路における実施例１を示す図である。
【００４４】
実施例１では図４に示すように、Ｙ字流路の合流地点に単結晶Ｓｉ基板を用いたｐｉｎフォトダイオードの４分割センサー１１を、また、合流地点の下流側に第２のｐｉｎフォトダイオード１１ａをそれぞれ配置する。この流路は、ｎ層となる基板の上に、水素化アモルファスシリコン、水素化アモルファスシリコンカーバイトをＰＣＶＤ（plasma chemical vapor deposition ）法で堆積する。そのとき、膜厚をそれぞれ３６０ｎｍ、１４０ｎｍとし、その上にＡｕ電極をパターニングする。成膜条件は、１×１０-7Torr、ＲＦパワー２０mW/cm2、２５０℃、堆積時１２０ mTorrである。スパッタ法でＳｉＯ2を封止膜として積層し、その上から、シリコーン系離型剤をスピンコート、ＳＵ８レジストを塗布、露光して流路パターンを形成する。次にＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を型に流し込んで剥離後、中のＳＵ８造物を除去した後、硬化したＰＤＭＳを再度かぶせて流路とする。
（装着および動作）
図５は、本発明の細胞加工装置の実施の一形態を示す図である。
【００４５】
本形態は図５に示すような構成となる。流路２４をホルダー７に装着し、流路２４とシリンジ１２，１２ａ、およびシャーレ２２との間をチューブ２３で接続する。ここで、流路２４は図４にて説明した流路である。シリンジ１２，１２ａは流路２４の２つの流路それぞれに接続されている。４分割センサー１１は、４つに分割されたセンサーそれぞれにて検出された光強度信号を、Ｉ／Ｖ変換回路１３を介して図２に示したようにペアにして差動増幅回路に導き、Ａ／Ｄ変換回路１４がＡ／Ｄ変換する。合流地点の下流側に設けられた第２のｐｉｎフォトダイオード１１ａは、検出された光強度信号を、Ｉ／Ｖ変換回路１３ａを介してＡ／Ｄ変換回路１４ａへ導き、Ａ／Ｄ変換回路１４ａがＡ／Ｄ変換する。Ａ／Ｄ変換回路１４，１４ａにてＡ／Ｄ変換されたデータは、マイコン２５によってシリンジポンプ１５の駆動のＯＮ／ＯＦＦ判定および、電気パルス印加タイミング発生信号に用いる。予め十分離散的となるような濃度、０．５×１０5個/ｍｌに培地で希釈、かつポリエチレングリコールの濃度が２０％になるように調整したマウスミエローマ細胞をシリンジ１２に吸い込み、シリンジポンプ１５に装着する。一方、マウスリンパ節から採取した細胞を同一濃度に調整し、もう一方のシリンジ１２ａに装着する。シリンジポンプ１５は２つのシリンジが装着可能でそれぞれ独立に駆動を制御できる制御手段である。次に、予め扁平にしたタングステン針に金蒸着を施した電極１６を、融合後の細胞検出のための第２のｐｉｎフォトダイオード１１ａ側部に設けた、電極差込凹部２１に実態顕微鏡で観察しながら差し込む。次に、ハロゲンランプ１７で流路２４全体を照明し、シリンジポンプ１５を駆動する。気体から液体に差しかかる最初のシグナルがセンサーにはいり、粒子を検出するとマイコン２５は粒子が互いに出会うように流速を制御する。また合流後、融合した粒子を第２のｐｉｎフォトダイオード１１ａで検出すると、電極１６にパルスが印加され、核内の融合を促進する。
（実施例２）
（流路の作製）
図６は、本発明の流路における実施例２を示す図である。図６（ａ）は、本実施例を流路上部から見た図であり、また図６（ｂ）は、本実施例を流路側面から見た図である。
【００４６】
実施例２は図６に示すように、ガラス基板を用い、流路直下にピンホール１９を配置する。ピンホール１９は、流路の裏面にスパッタ法で、アルミを蒸着し、サイズ約４００ｎｍとする。実施例１と同様、ＳＵ８レジストを塗布、露光して流路パターンを形成する。次に、ＰＤＭＳを型に流し込んで剥離後、中のＳＵ８造物を除去した後、硬化したＰＤＭＳを再度かぶせて流路とする。流路には、PC modifier（株式会社AIバイオチップスの商品）を満たして内部を親水処理しておく。処理方法は能書に従う。
（装着および動作）
チューブの接続を実施例１と同様に行う。図６（ｂ）に示すように、各ピンホール１９には、コリメータレンズ付きの赤色可視光が半導体レーザー光源モジュール２０のアパーチャ２０ａを通り、流路に照射される。そして、流路に照射された可視光が粒子像面からの一部の光はピンホール１９を通過してアバランシエフォトダイオード１８によって検出される。アバランシエフォトダイオード１８の出力はＩ／Ｖ変換回路を介してＡ／Ｄ変換され、変換データはマイコンによってシリンジポンプ駆動のＯＮ／ＯＦＦ判定に用いる。予め十分離散的となるような濃度、０．５×１０5個/ｍｌに培地で希釈、調整したマウスＥＳ細胞をシリンジに吸い込み、シリンジポンプに装着する。一方、リポフェクタミン2000 （インビトロジェン株式会社の商品名）を使って、ハウスキーピングジーンの下流にＧＦＰ遺伝子をつないだプラスミドＤＮＡを内包したリポソームを作製する。作製方法は能書に従う。先ほどとほぼ同じ濃度になるように調整した後、リポソームをシリンジに吸い込み、シリンジポンプに装着する。その後、シリンジポンプを駆動し、実施例１と同様に、細胞とリポソームが出会うように流速制御する。
【００４７】
上記のように本発明においては、微小流路下で細胞個々の単一操作を実現することができるために、遺伝子導入された細胞とそうでない細胞が混在する結果とならない。また、マイクロインジェクション法と比べ、大幅にスループットレートを向上することができる。
【００４８】
したがって本発明は、従来問題とされたスループットレートの課題、遺伝子導入されなかった細胞が混在するといった課題を解決する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の細胞加工装置に設けられた流路の一形態を示す図である。
【図２】（ａ）は、２分割センサーを用いた流路の一例を示す図であり、（ｂ）は、２分割センサーの出力の様子を示す図である。
【図３】粒子または細胞を刺激するために他の流路から薬剤を供給する一形態を示す図である。
【図４】本発明の流路における実施例１を示す図である。
【図５】本発明の細胞加工装置の実施の一形態を示す図である。
【図６】本発明の流路における実施例２を示す図である。
【符号の説明】
【００５０】
１ センサー
２ 蛇行路
３ Ｔ字路
４ 粒子または細胞
５ 薬剤
６ ２分割センサー
７ ホルダー
８ 差動増幅回路の出力信号
９ 差動増幅回路の入力（Ｆ）
１０ 差動増幅回路の入力（Ｒ）
１１ ４分割センサー
１１ａ 第２のｐｉｎフォトダイオード
１２，１２ａ シリンジ
１３，１３ａ Ｉ／Ｖ変換回路
１４，１４ａ Ａ／Ｄ変換回路
１５ シリンジポンプ
１６ 電極
１７ ハロゲンランプ
１８ アバランシエフォトダイオード
１９ ピンホール
２０ 半導体レーザ光源モジュール
２１ 電極差込凹部
２２ シャーレ
２３ チューブ
２４ 流路
２５ マイコン
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む粒子をそれぞれ搬送するための複数の流路が合流して前記複数の流路上を搬送されるそれぞれの粒子を互いに融合させるための細胞加工装置であって、
前記流路上にて前記粒子を検出する検出手段と、
前記検出手段によって粒子が検出されたか否かに基づいて当該流路への該粒子の送液速度を制御する制御手段とを有する細胞加工装置。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞加工装置において、
前記制御手段は、前記複数の流路のうち１つの流路上の検出手段にて前記粒子が検出された場合、他の流路上の検出手段にて前記粒子が検出されるまで、当該流路への送液を停止することを特徴とする細胞加工装置。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の細胞加工装置において、
前記検出手段は、前記流路における光強度変化または電気的インピーダンス変化を検出することにより、前記流路上にて前記粒子を検出することを特徴とする細胞加工装置。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載の細胞加工装置において、
前記検出手段は、受光素子であることを特徴とする細胞加工装置。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞加工装置において、
前記受光素子は、１つのセンサーと、２分割センサーと、４分割センサーとのいずれかのセンサーであることを特徴とする細胞加工装置。
【請求項６】
請求項１または請求項２に記載の細胞加工装置において、
前記検出手段は、ピンホールであることを特徴とする細胞加工装置。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の細胞加工装置において、
前記流路が合流した流路上に、前記粒子に刺激を印加する外部刺激印加手段を有することを特徴とする細胞加工装置。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞加工装置において、
前記外部刺激印加手段は、前記流路が合流した流路の外部から光と、温度と、超音波と、磁気と、電気刺激とのいずれかの刺激を印加することを特徴とする細胞加工装置。
【請求項９】
請求項７または請求項８に記載の細胞加工装置において、
前記外部刺激印加手段は、前記検出手段によって粒子が検出されたか否かに基づいて該刺激を印加することを特徴とする細胞加工装置。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の細胞加工装置において、
前記粒子に薬剤をパルス的に供給することを特徴とする細胞加工装置。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の細胞加工装置において、
前記粒子は、ＤＮＡやＲＮＡの核酸、ペプチドまたは蛋白質を含むリポソームであることを特徴とする細胞加工装置。
【請求項１２】
細胞を含む粒子をそれぞれ搬送するための複数の流路が１つの流路に合流して前記複数の流路上を搬送されるそれぞれの粒子を互いに融合させるための細胞加工装置における細胞加工方法であって、
前記流路上にて前記粒子を検出する処理と、
前記粒子が検出されたか否かに基づいて当該流路への該粒子の送液速度を制御する処理とを有する細胞加工方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の細胞加工方法において、
前記複数の流路のうち１つの流路上にて前記粒子が検出された場合、他の流路上にて前記粒子が検出されるまで、当該流路への送液を停止する処理を有することを特徴とする細胞加工方法。
【請求項１４】
請求項１２または請求項１３に記載の細胞加工方法において、
前記流路上における光強度変化または電気的インピーダンス変化を検出する処理を有することを特徴とする細胞加工方法。
【請求項１５】
請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載の細胞加工方法において、
前記流路が合流した流路上にて前記粒子に刺激を印加する処理を有することを特徴とする細胞加工方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の細胞加工方法において、
前記流路が合流した流路の外部から光と、温度と、超音波と、磁気と、電気刺激とのいずれかの刺激を印加する処理を有することを特徴とする細胞加工方法。
【請求項１７】
請求項１５または請求項１６に記載の細胞加工方法において、
前記流路上にて粒子が検出されたか否かに基づいて該刺激を印加する処理を有することを特徴とする細胞加工方法。
【請求項１８】
請求項１２乃至１７のいずれか１項に記載の細胞加工方法において、
前記粒子に薬剤をパルス的に供給する処理を有することを特徴とする細胞加工方法。
【請求項１】
細胞を含む粒子をそれぞれ搬送するための複数の流路が合流して前記複数の流路上を搬送されるそれぞれの粒子を互いに融合させるための細胞加工装置であって、
前記流路上にて前記粒子を検出する検出手段と、
前記検出手段によって粒子が検出されたか否かに基づいて当該流路への該粒子の送液速度を制御する制御手段とを有する細胞加工装置。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞加工装置において、
前記制御手段は、前記複数の流路のうち１つの流路上の検出手段にて前記粒子が検出された場合、他の流路上の検出手段にて前記粒子が検出されるまで、当該流路への送液を停止することを特徴とする細胞加工装置。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の細胞加工装置において、
前記検出手段は、前記流路における光強度変化または電気的インピーダンス変化を検出することにより、前記流路上にて前記粒子を検出することを特徴とする細胞加工装置。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載の細胞加工装置において、
前記検出手段は、受光素子であることを特徴とする細胞加工装置。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞加工装置において、
前記受光素子は、１つのセンサーと、２分割センサーと、４分割センサーとのいずれかのセンサーであることを特徴とする細胞加工装置。
【請求項６】
請求項１または請求項２に記載の細胞加工装置において、
前記検出手段は、ピンホールであることを特徴とする細胞加工装置。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の細胞加工装置において、
前記流路が合流した流路上に、前記粒子に刺激を印加する外部刺激印加手段を有することを特徴とする細胞加工装置。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞加工装置において、
前記外部刺激印加手段は、前記流路が合流した流路の外部から光と、温度と、超音波と、磁気と、電気刺激とのいずれかの刺激を印加することを特徴とする細胞加工装置。
【請求項９】
請求項７または請求項８に記載の細胞加工装置において、
前記外部刺激印加手段は、前記検出手段によって粒子が検出されたか否かに基づいて該刺激を印加することを特徴とする細胞加工装置。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の細胞加工装置において、
前記粒子に薬剤をパルス的に供給することを特徴とする細胞加工装置。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の細胞加工装置において、
前記粒子は、ＤＮＡやＲＮＡの核酸、ペプチドまたは蛋白質を含むリポソームであることを特徴とする細胞加工装置。
【請求項１２】
細胞を含む粒子をそれぞれ搬送するための複数の流路が１つの流路に合流して前記複数の流路上を搬送されるそれぞれの粒子を互いに融合させるための細胞加工装置における細胞加工方法であって、
前記流路上にて前記粒子を検出する処理と、
前記粒子が検出されたか否かに基づいて当該流路への該粒子の送液速度を制御する処理とを有する細胞加工方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の細胞加工方法において、
前記複数の流路のうち１つの流路上にて前記粒子が検出された場合、他の流路上にて前記粒子が検出されるまで、当該流路への送液を停止する処理を有することを特徴とする細胞加工方法。
【請求項１４】
請求項１２または請求項１３に記載の細胞加工方法において、
前記流路上における光強度変化または電気的インピーダンス変化を検出する処理を有することを特徴とする細胞加工方法。
【請求項１５】
請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載の細胞加工方法において、
前記流路が合流した流路上にて前記粒子に刺激を印加する処理を有することを特徴とする細胞加工方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の細胞加工方法において、
前記流路が合流した流路の外部から光と、温度と、超音波と、磁気と、電気刺激とのいずれかの刺激を印加する処理を有することを特徴とする細胞加工方法。
【請求項１７】
請求項１５または請求項１６に記載の細胞加工方法において、
前記流路上にて粒子が検出されたか否かに基づいて該刺激を印加する処理を有することを特徴とする細胞加工方法。
【請求項１８】
請求項１２乃至１７のいずれか１項に記載の細胞加工方法において、
前記粒子に薬剤をパルス的に供給する処理を有することを特徴とする細胞加工方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−２７１９０５（Ｐ２００８−２７１９０５Ａ）
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１２１５５８（Ｐ２００７−１２１５５８）
【出願日】平成１９年５月２日（２００７．５．２）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２日（２００７．５．２）
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
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