細胞培養装置、細胞培養方法および細胞培養用プログラム
【課題】コンタミネーションしにくく、また不純物が混入しにくい細胞培養装置を提供すること。
【解決手段】外室１０ｂおよび内室１０aに区画された培養モジュール１０と、培養モジュール１０に供給するための培養液を収納する培養液容器４と、培養モジュール１０を洗浄するための洗浄液を収納する洗浄液容器５と、培養液および洗浄液を供給するためのポンプＰ１，Ｐ２と、ポンプＰ１，Ｐ２の制御を行う制御部３０と、を有し、洗浄液は、細胞を培養する前に供給されるものとしている。
【解決手段】外室１０ｂおよび内室１０aに区画された培養モジュール１０と、培養モジュール１０に供給するための培養液を収納する培養液容器４と、培養モジュール１０を洗浄するための洗浄液を収納する洗浄液容器５と、培養液および洗浄液を供給するためのポンプＰ１，Ｐ２と、ポンプＰ１，Ｐ２の制御を行う制御部３０と、を有し、洗浄液は、細胞を培養する前に供給されるものとしている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養装置、細胞培養方法および細胞培養用プログラムに関する。本発明は、特には、付着系細胞の培養装置、培養方法および培養用プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体外において細胞を培養し、培養された細胞により組織を再構築するような技術が注目されている。そこで、細胞を大量にかつ簡便に培養するために、生体外における細胞培養およびそれにより培養された細胞の回収操作を半自動化または自動化することが求められている。
【０００３】
たとえば、細胞培養器内の培養液を循環させることが可能な培養装置が提案されている（特許文献１および特許文献２参照）。また、細胞培養器内の培養液を交換することが可能な培養装置も提案されている（特許文献３参照）。更には、細胞培養容器内の培養液を自動的に交換することが可能な培養装置が開示されている（特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平５−２６０９５８号公報（特許請求の範囲等）
【特許文献２】特開平５−２７６９２２号公報
【特許文献３】特開平８−１７２９５６号公報（特許請求の範囲等）
【特許文献４】特開２００２−２６２８５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ここで、上述の特許文献１および特許文献２の細胞培養装置においては、細胞の培養に影響するような不純物の混入が少ない状態で、細胞を培養するのが好ましい。そこで、細胞を培養する前に、細胞培養装置の滅菌を行う場合がある。かかる滅菌には、たとえば、ガンマ線を照射することにより細胞培養装置の滅菌を行う。しかし、細胞培養装置にガンマ線を照射すると、細胞培養装置を構成する部材の一部がガンマ線により溶出する場合があり、その溶出等した不純物が培養する細胞に影響するという問題がある。
【０００６】
本発明は、かかる要望に鑑みてなされたものであって、本発明が解決しようとする課題は、コンタミネーションしにくく、また不純物が混入しにくい細胞培養装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る細胞培養装置は、外室および内室に区画された培養モジュールと、培養モジュールに供給するための培養液を収納する培養液容器と、培養モジュールを洗浄するための洗浄液を収納する洗浄液容器と、培養液および上記洗浄液を供給するためのポンプと、ポンプの制御を行う制御部とを有する細胞培養装置であって、ここで洗浄液は、細胞を培養する前に供給されるものである。
【０００８】
本発明に係る細胞培養装置において、培養モジュール、培養液容器および洗浄液容器を含む培養用回路全体は、ポンプおよび制御部を有する制御装置に脱着可能に取り付けられている。
【０００９】
また、本発明に係る細胞培養装置において、制御部は、培養液を供給する流速と、洗浄液を供給する流速とが異なるように制御するものであってもよい。
【００１０】
さらに、本発明に係る細胞培養装置において、培養液容器および洗浄液容器の少なくとも一方は、培養モジュールよりも反重力方向側に配置されうる。
【００１１】
さらに、本発明に係る細胞培養装置において、前記培養モジュールと各部とを接続する流路には、流路を開閉するバルブが設けられている。該バルブは、好ましくは、複数方向に突出する管と、流体の流路を切り換えるための回動可能な回動部材とを備える多方活栓と、該多方活栓の栓部を固定して回動部材を回動させる多方活栓切換装置を備えている。該多方活栓切換装置は、好ましくは、回動部材に対して回動駆動力を与えるための駆動源と、駆動源の回転軸に接続され、回動部材を把持する１以上の把持柱を備えるクランプとを備え、クランプは、制御部により制御された駆動源の回動動作に基づき回動部材を回動させる。また、バルブは、外部からの雑菌の侵入のない方式、例えば、ピンチバルブであってもよい。
【００１２】
また、本発明の別の実施形態において、細胞培養方法は、外室および内室に区画された培養モジュールを洗浄する洗浄ステップと、培養液を培養モジュールに充填する培養液充填ステップと、外室に細胞を注入する細胞充填ステップと、培養液を上記内室へ供給しながら細胞を培養する培養ステップと、培養モジュールにて培養した細胞を回収する回収ステップとを有する。
【００１３】
また、本発明の別の実施形態において、細胞培養プログラムは、外室および内室に区画された培養モジュールに洗浄液を供給する洗浄ステップと、培養液を培養モジュールに供給する培養液充填ステップと、培養液を上記内室へ供給しながら細胞を培養する培養ステップと、細胞を剥がすための剥離剤、上記洗浄剤および上記培養液の少なくとも１つを上記培養モジュールに供給する回収ステップとを制御部に実行させるものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、コンタミネーションしにくく、また不純物が混入しにくい細胞培養装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本実施の形態に係る細胞培養装置の構成を示すブロック図である。
【図２】図１の細胞培養装置が有する細胞培養回路の構成を示すブロック図である。
【図３】図１の細胞培養装置が有する培養モジュールの外観を示す斜視図である。
【図４】図３の培養モジュールに含まれる中空糸の外観を示す拡大斜視図である。
【図５】図３の培養モジュールをＡ−Ａ線に沿って切断した場合の拡大断面図である。
【図６】図１の細胞培養装置が有する制御装置の外観を示す斜視図である。
【図７】図６の制御装置の構成を示すブロック図である。
【図８】本実施の形態に係る細胞培養方法の流れを示すフローチャートである。
【図９】図８のステップＳ１０１の流れを示すフローチャートである。
【図１０】ステップＳ２０１における図１の細胞培養装置の状態を示すブロック図である。
【図１１】ステップＳ２０２における図１の細胞培養装置の状態を示すブロック図である。
【図１２】ステップＳ２０３における図１の細胞培養装置の状態を示すブロック図である。
【図１３】ステップＳ２０４おける図１の細胞培養装置１の状態を示すブロック図である。
【図１４】図１の細胞培養装置において、図１３の後の状態を示すブロック図である。
【図１５】ステップＳ１０２およびステップＳ１０４における図１の細胞装置の状態を示すブロック図である。
【図１６】ステップＳ１０２における図１の細胞装置の状態を示すブロック図である。
【図１７】ステップＳ１０５における図１の細胞装置の状態を示すブロック図である。
【図１８】ステップＳ１０５のうち、図１７の後において、図１の細胞装置の状態を示すブロック図である。
【図１９】本実施の形態の変形例に係る細胞培養装置に用いられる多方活栓の構造を示す分解斜視図である。
【図２０】図１９の多方活栓のうち、クランプと栓部とを組み立てた状態を示す斜視図である。
【図２１】図１９の多方活栓をパルスモータの回転に従動してクランプが回動した際の回動部材と三方活栓の流路との関係の一例を示す平面図であり、角度ゼロの際の状態を示す。
【図２２】図１９に示す多方活栓を、図２１の状態から反時計方向に９０度回転させた際の回動部材と栓部の流路との関係の一例を示す平面図である。
【図２３】図１９に示す多方活栓を、図２２の状態から反時計方向に９０度回転させた際の回動部材と栓部の流路との関係の一例を示す平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
次に、本発明の細胞培養方法、細胞培養装置およびそのプログラムの好適な実施の形態について説明する。なお、本発明に係る細胞培養装置の実施の形態について最初に説明し、その装置の動作の説明と共に、細胞培養方法およびそのプログラムの各実施の形態について説明する。
【００１７】
１．細胞培養装置
図１は、本実施の形態に係る細胞培養装置１の構成を示すブロック図である。図２は、図１の細胞培養装置１が有する細胞培養回路２の構成を示すブロック図である。
【００１８】
本実施の形態に係る細胞培養装置１は、細胞培養回路２と制御装置３とを有する。細胞培養回路２は、制御装置３に脱離可能に取り付けされている。
【００１９】
細胞培養回路２は、細胞培養をするための回路である。細胞培養回路２は、培養液容器４、洗浄液容器５、回収容器６、剥離剤容器７、ガス交換機８および培養モジュール１０を主に有する。なお、培養液容器４、洗浄液容器５、回収容器６および剥離剤容器７は、後述の廃液容器と交換されて用いられることがある。
【００２０】
培養液容器４は、培地等の培養液を収納する容器である。培養液容器４に収納される培養液としては、培養する細胞に適した種々の培養液を用いることができる。
【００２１】
洗浄液容器５は、細胞培養回路２を洗浄するための洗浄液を保持する容器である。洗浄液容器５が保持する洗浄液としては、培養する細胞に悪影響を与えないものであれば、一般的な洗浄液を用いることができる。たとえば、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）若しくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ）等の等張緩衝液、または、培養する細胞と浸透圧が略同一のショ糖溶液、食塩水等の等張液が好適に用いられる。その中でも、実質的にカルシウムを含まないものが好ましく、特に、ＰＢＳを用いるのが好ましい。
【００２２】
回収容器６は、培養モジュール１０で培養した細胞を回収する容器である。剥離剤容器７は、培養モジュール１０にて培養した細胞を回収する際に、不織布等に接着した細胞を剥離し、回収率を向上させるために用いる剥離剤を保存する容器である。剥離剤容器７に入れる剥離剤としては、０．５ｍＭ〜１０ｍＭのＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＮＴＡ若しくはＴＴＨＡ等の２価金属のキレート剤、トリプシン若しくはコラーゲン等のタンパク質分解酵素、または、インテグリン若しくはカドヘリン等のタンパク質の接着を競合的に阻害するペプチドが好適に用いられる。かかる剥離剤を培養モジュール１０に供給すると、培養モジュール１０の筺体内壁や不織布に細胞を付着させているインテグリン等、および細胞同士を接着させているカドヘリン等の接着因子を切断できる。接着因子が切断されると付着性細胞が浮遊するため細胞の回収が容易となる。
【００２３】
培養液容器４、洗浄液容器５、回収容器６および剥離剤容器７は、たとえば、可撓性樹脂から主になる袋型容器に各液体を保持している。かかる場合には、培養液容器４、洗浄液容器５、回収容器６および剥離剤容器７は、その内部に保持する溶液の量が増減した場合に、撓んでいくため、細胞培養回路２に空気が混入しにくい。また、培養液容器４、洗浄液容器５、回収容器６および剥離剤容器７は、培養モジュール１０よりも地上から鉛直方向上方に配置され、流路を鉛直方向下方側に配置するのが好ましい。かかる場合には、たとえ培養液容器４、洗浄液容器５、回収容器６あるいは剥離剤容器７の内部に空気が混入しても、空気は、容器内で上方へ移動するため、細胞培養回路２に入りにくく、空気を介して混入した不純物が細胞に影響を与えるのを防ぐことができる。
【００２４】
ガス交換機８は、二酸化炭素等を排出し、酸素等を細胞培養回路２に注入するために備えられる。細胞は、生存に必要な酸素を培養液から取り込むと共に、二酸化炭素を排出する。ガス交換機８が培養液中の二酸化炭素濃度と酸素濃度と適切に維持することにより、培養液のｐＨが高くなるのが防止されるため、細胞の活性低下を防ぐことができる。ガス交換機８は、たとえば、ガス交換膜を有し、そのガス交換膜を介して二酸化炭素や酸素を透過させることができる。また、ガス交換機８は、二酸化炭素センサを有し、二酸化炭素センサからの信号を受けて、二酸化炭素の供給量を調整するようにしてもよい。また、ガス交換機８には、培養液中の酸素濃度が低下することで細胞の活性が低下しないように、酸素濃度や流量を調整した気体を供給するのが好ましい。
【００２５】
図３は、本実施の形態に係る細胞培養回路２が有する培養モジュール１０の外観を示す斜視図である。図４は、図４の培養モジュール１０が有する中空糸の構造を示す斜視図である。図５は、図３の培養モジュール１０のＡ−Ａ線断面図である。なお、図５においては、見易さを考慮して、各部材の縮尺を変更して図示していることに加え、中空糸１１の数を減らし、中空糸１１を直線的に図示している。
【００２６】
培養モジュール１０は、細胞を培養するためのモジュールである。培養モジュール１０としては、公知のモジュールであればどのようなものを用いてもよい。たとえば、培養モジュール１０は、その内部に、図４に示すような中空糸１１を備えている。中空糸１１は、中空の繊維である。また、培養モジュール１０は、中空糸１１により、内室１０ａと外室１０ｂとの２室に区画されている。ここで、内室１０ａとは、中空糸１１の中空部分をいい、外室１０ｂとは、中空糸１１の外側部分をいう。中空糸１１の壁部は、培養液、洗浄液および剥離剤等（以後、培養液、洗浄液および剥離剤等をまとめて、「培養液等」という。）を透過させるが、培養する細胞を通さない繊維である。
【００２７】
図４に示すように、培養モジュール１０は、中空糸１１の内室１０ａに培養液等を供給するための入口１４と、内室１０ａからの培養液等を排出するための出口１５とを有する。また、培養モジュール１０は、中空糸１１の延伸方向に略垂直な方向から外室１０ｂに細胞や培養液等を供給するための供給口１６と、外室１０ｂから細胞や培養液等を排出するための排出口１７とを有する。培養モジュール１０は、外室１０ｂに、担体として、たとえば、不織布を配置する。
【００２８】
培養モジュール１０において、中空糸１１を用いる場合には、多数の中空糸１１と不織布とを重ね合わせた積層体を巻き、棒状にする。続いて、その両端を接着剤で接着し、ばらばらにならないようにする。最後に、供給口１６および排出口１７が設けられた筒状の筺体に入れ、その筒状の筺体の開口部に、入口１４が設けられたキャップと、出口１５が設けられたキャップとを取り付ける。なお、培養した細胞を回収する際に、細胞が不織布に引っかかって回収率が低下するのを防ぐため、例えば、中空糸１１より短い不織布を重ね合わせ、出口１５側には不織布が存在しない空間を形成する。かかる構造により、培養した細胞が、出口１５の手前で不織布に引っかからないため、細胞の回収率を向上できる。
【００２９】
細胞培養回路２が予め一体として組み立てられ、一体として滅菌される場合には、細胞培養回路２の回路内部の汚染を避けることができるため好ましい。また、胞培養回路２は、内部に蒸留水や生理食塩水などの流体を充填した状態で滅菌されるのがさらに好ましい。細胞培養回路２の内部に蒸留水や生理食塩水などの流体を充填した状態で、細胞培養回路２を滅菌した場合には、輸送時あるいは細胞培養回路２を制御装置３に装着する際等に、充填された流体が細胞培養回路２の内部で移動しないように、細胞培養回路２のうち後述のバルブＶ１，Ｖ２，Ｖ３，Ｖ４，Ｖ５，Ｖ６，Ｖ７（以後、すべてのバルブを総称する場合には、「バルブＶ」という。）、ポンプＰ１およびポンプＰ２に取り付けられる部分を、着脱可能なディスポーザブルクリップにて挟み、細胞培養回路２内における流体の流通を遮断しておくのが好ましい。当該ディスポーサルクリップは、細胞培養回路２を制御装置３にセットし、電源スイッチを入れた後、あるいは、最初にバルブＶを全閉とした後等の適切なステップにて除去される。
【００３０】
図６は、本実施の形態に係る細胞培養装置１が有する制御装置３の外観を示す斜視図である。図７は、制御装置３の構成を示すブロック図である。なお、図６以外の図においては、カバー３３の図示を省略している。
【００３１】
制御装置３は、細胞培養回路２内で細胞が培養できるように、細胞培養回路２を配置し、各部の制御を行うための装置である。制御部３０、ガス交換機ホルダ３１、培養モジュールホルダ３２、カバー３３、ヒータ３４、温度センサ３５、ポンプＰ１，Ｐ２およびバルブＶを有する。
【００３２】
制御部３０は、制御装置３の各部を制御する手段である。制御部３０は、温度センサ３５からの情報を取得し、ヒータ３４を駆動させる温度調節手段３０ａ、バルブＶを開閉させるためのバルブ開閉手段３０ｂ、ポンプＰ１，Ｐ２を駆動させるポンプ駆動手段３０ｃ、およびユーザが入出力部３９から入力した指示を取得したり、動作状況を入出力部３９に表示させるための入出力手段３０ｄとして機能する。制御部３０は、たとえば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭおよびタイマ等で構成されている。制御部３０のＲＯＭおよびＲＡＭは、制御部３０が実行するプログラムを格納したり、処理対象となるデータを一時的に格納したり、あるいは制御部３０のワークメモリとして機能する。制御部３０は、ＲＯＭあるいはＲＡＭに格納されたプログラムにより各部を制御する。制御部３０は、温度センサ３５およびポンプＰ１，Ｐ２からの情報を処理する、あるいは、タイマにより計時することもある。また、制御部３０は、ヒータ３４、ポンプＰ１，Ｐ２およびバルブＶの制御を行う。また、制御部３０には、タッチパネル等から構成される入出力部３９が接続されていてもよく、ユーザは、入出力部３９から、制御部３０へ指示するあるいは現在の状況を確認するようにしてもよい。
【００３３】
ガス交換機ホルダ３１は、ガス交換機８を保持するための固定具である。培養モジュールホルダ３２は、培養モジュール１０を保持するための固定具である。ガス交換機ホルダ３１および培養モジュールホルダ３２は、ガス交換機ホルダ３１および培養モジュールホルダ３２を固定できれば、どのようなものであってもよい。
【００３４】
カバー３３は、培養モジュールホルダ３２を保護し、かつ、温度を一定にするために培養モジュールホルダ３２およびその他の部分を覆う部材である。本実施の形態では、カバー３３の内側に、ガス交換機ホルダ３１、培養モジュールホルダ３２、ヒータ３４および温度センサ３５が収納される。
【００３５】
ヒータ３４は細胞培養回路２の温度を一定にするために設けられる。細胞培養回路２の周囲温度の低下により、培養液の温度が低下し、培養中の細胞の活性が低下するのを防ぐためである。ヒータ３４としては、たとえば、温風により、カバー３３の内部の温度を一定温度に維持する、いわゆる温風ヒータを採用できる。なお、カバー３３の内部には、少なくとも培養モジュールホルダ３２およびヒータ３４および温度センサ３５が収納されていればよく、より好ましくは、培養モジュールホルダ３２、ヒータ３４および温度センサ３５以外の細胞培養回路２も収納されている。特に、培養液容器４も一緒に保温されていることで、供給する培養液の温度を一定に保つことができる。
【００３６】
ポンプＰ１およびポンプＰ２は、各部から培養モジュール１０に培養液等を供給するための駆動部である。ポンプＰ１およびポンプＰ２としては、一般的なポンプであればどのようなものを用いてもよいが、流路として弾性に富むチューブを用いる場合には、いわゆるローラポンプを好適に用いることができる。ローラポンプは、弾性のあるチューブの一点をローラで押し潰し、ローラをそのまま移動させてチューブ内部の液体を押し出しながら移動するようなポンプである。ローラが移動すると、押し潰された箇所はチューブの復元力によって元の形状に戻る際に、チューブ内部に生じた真空により次の液体を吸引することができる。
【００３７】
本実施の形態では、ポンプＰ１は、培養液容器４からガス交換機８を経て培養モジュール１０の内室に培養液を供給するための流路に設けられている。したがって、ポンプＰ１を駆動させることで、培養液容器４から培養液がガス交換機８を経て培養モジュール１０に供給される。また、ポンプＰ２は、洗浄液容器５および剥離剤容器７から培養モジュール１０の外室に続く流路のうち、洗浄液容器５および剥離剤容器７よりも培養モジュール１０側に設けられる。また、ポンプＰ２は、単位時間当たりの吐出量を調整できるのが好ましい。また、ポンプＰ２は、単位時間当たりの吐出量を、ポンプＰ１の吐出量より大きく設定できるものが好ましい。なぜなら、洗浄液により細胞培養回路２を洗浄する際には、流速が大きい程、流路壁部に付着している不純物を効率よく除去できるからである。
【００３８】
バルブＶは、流路を開閉するために用いられる。バルブＶとしては、外部から雑菌等の混入が生じない方法であればどのように流路を開閉するものでもよい。たとえば、バルブＶとしては、ピンチコックを用いることができる。バルブＶ１は剥離剤容器７の出口に、バルブＶ２は洗浄液容器６の出口に、バルブＶ３はポンプＰ２からガス交換機までの間の流路に、バルブＶ４はポンプＰ２と外室との間に、バルブＶ５は回収容器６と外室との間に、バルブＶ６は回収容器６と内室１０ａの出口１５との間に、バルブＶ７は培養液容器４と内室１０ａの出口１５との間に、それぞれ設けられる。
【００３９】
上述のような細胞培養装置１を構成することで、細胞を培養する前に、流路や各部を洗浄液で洗浄できる。したがって、細胞培養回路２にガンマ線を照射して細胞培養回路２を滅菌する場合であっても、ガンマ線により細胞培養回路２を構成する部材の一部が溶出した後に、洗浄液により細胞培養回路２を洗浄するため、不純物を除去できる。
【００４０】
また、上述のような細胞培養装置１とすることで、細胞培養回路２を制御装置３からそのまま取り外しできる。したがって、ある程度細胞を培養した場合に、細胞培養回路２をそのまま取り外して、冷凍保存すること等が可能となる。特に、培養液容器４、洗浄液容器５、回収容器６および剥離剤容器７等が袋状の容器である場合には、取り外した後、冷凍保存が容易である。また、細胞培養回路２を解凍して再び細胞の培養を開始する際に、不純物が混入しないため好ましい。
【００４１】
また、上述のような細胞培養装置１とすることで、培養温度を一定に保つことができるため、細胞の培養効率が向上する。細胞培養装置１では、従来と異なり、培養液のみを一定温度にするのではなく、培養モジュール１０を保温する、あるいは、培養モジュール１０を含む細胞培養回路２の一部または全部を保温できるため、外気温により培養液の移送中に培養液の温度が変化するのを防止できる。特に、ヒータ３４として温風ヒータを用いる場合には、温水や電熱式の場合と比較して、カバー３３内部の温度が均一であるため好ましい。
【００４２】
２．細胞培養方法
次に、本発明の実施の形態に係る細胞培養方法について説明する。なお、この実施の形態に係る細胞培養用プログラムは、本発明の実施の形態に係る細胞培養方法における各ステップを細胞培養装置１の制御部３０に実行させるプログラムである。以下、本実施の形態に係る細胞培養方法およびプログラムを、細胞培養装置１の動作と共に説明する。
【００４３】
図８は、本発明の実施の形態に係る細胞培養方法の流れを示すフローチャートである。
【００４４】
回路２を制御装置３にセットした後、ユーザが電源を入れると、制御部３０は、全てのバルブＶを全閉とする。続いて、ユーザが入出力部３９を介して制御部３０にスタート指示を与えると、制御部３０は、各流路および培養モジュール１０を洗浄液で洗浄を開始する（ステップＳ１０１：洗浄ステップ）。
【００４５】
図９は、図８のステップＳ１０１における処理の流れを説明するフローチャートである。図１０は、ステップＳ２０１における細胞培養装置１の状態を示すブロック図である。なお、図１０〜図１８では、洗浄液が通過中の流路を黒で示し、開放中のバルブＶを白抜きで、閉止中のバルブＶを黒で示す。
【００４６】
ステップＳ１０１は、図９のステップＳ２０１〜２０４の４つのステップを含む。まず、制御部３０は、内室１０ａを洗浄するため、バルブＶ２，Ｖ３，Ｖ６を開放し、バルブＶ１，Ｖ４，Ｖ５およびＶ７を閉止し、ポンプＰ１を停止し、ポンプＰ２を駆動するように制御する（ステップＳ２０１）。これにより、洗浄液容器５から供給された洗浄液は、培養モジュール１０の内室１０ａを通過し、回収容器６の代わりに置かれた廃液容器に排出される。
【００４７】
図１１は、ステップＳ２０２における細胞培養装置１の状態を示すブロック図である。
【００４８】
次に、制御部３０は、ステップＳ２０２において、中空糸１１の膜壁を洗浄するため、バルブＶ２，Ｖ３およびＶ５を開放し、バルブＶ１、Ｖ４，Ｖ６およびＶ７のバルブを閉止して、ポンプＰ１を停止し、ポンプＰ２を駆動する。かかる洗浄により、入口１４から内室に供給された洗浄液は、内室１０ａに接続されたバルブＶ６およびＶ７が閉止しているため、内室１０ａに供給された洗浄液は加圧されて中空糸１１の膜壁を透過する。かかるステップにより、中空糸１１の膜壁が洗浄され、洗浄液は、回収容器６の代わりに置かれた廃液容器に排出される。
【００４９】
図１２は、ステップＳ２０３における細胞培養装置１の状態を示すブロック図である。
【００５０】
次に、制御部３０は、ステップＳ２０３において、外室１０ｂを洗浄するため、図１２に示すように、バルブＶ２，Ｖ４およびＶ５を開放し、バルブＶ１，Ｖ３，Ｖ６およびＶ７のバルブを閉止し、ポンプＰ１を停止し、ポンプＰ２を駆動する。かかる洗浄により、洗浄液は、培養モジュール１０の外室１０ｂを通過し、通過の際に外室１０ｂを洗浄する。使用済みの洗浄液は、廃液容器に排出される。その際、外室に配置された不織布も同時に洗浄される。
【００５１】
図１３および図１４は、ステップＳ２０４おける細胞培養装置１の状態を示すブロック図である。
【００５２】
最後に、制御部３０は、ステップＳ２０４において、内室１０ａの出口１５から培養液容器４までの流路、および培養液容器４からポンプＰ１を介して内室１０ａの入り口１４まで到達する流路を洗浄する。まず、制御部３０は、内室１０ａの出口１５から培養液容器４までの流路を洗浄するため、図１３に示すように、バルブＶ２，Ｖ３およびＶ７を開放し、バルブＶ１，Ｖ４，Ｖ５およびＶ６のバルブを閉止し、ポンプＰ１を停止し、ポンプＰ２を駆動する。かかる洗浄により、洗浄液は、培養モジュール１０の内室１０ａを経て、培養液容器４の代わりに取り付けられた廃液容器に排出される。
【００５３】
続けて、制御部３０は、培養液容器４からポンプＰ１を介して内室１０ａの入り口１４まで到達する流路を洗浄するため、図１４に示すように、バルブＶ２、Ｖ３およびＶ７を開放し、バルブＶ１，Ｖ４，Ｖ５，およびＶ６を閉止して、ポンプＰ２を駆動し、ポンプＰ１を逆方向に駆動する。この時ポンプＰ１の流量とポンプＰ２の流量とは、ポンプＰ１の流量が、ポンプＰ２の流量と同じまたはそれよりも小さいのが好ましい。ポンプＰ１の流量がポンプＰ２の流量と同じまたはそれよりも小さく、かつ、ベントとしてバルブＶ７が開放された場合には、細胞培養回路２の内部の圧力を適正に保つことができるため、流路の破裂や潰れを防止できる。これにより洗浄液は、当該細胞培養回路２の内部を洗浄すると共に、余剰分の洗浄液が、内室１０ａとバルブＶ７を経由して培養液容器４の代わりに取り付けられた廃液容器に排出される。ポンプＰ１の流量およびポンプＰ２の流量を適切に設定することにより、ステップＳ２０４のうち、図１３および図１４で示す状態による洗浄工程を１つの洗浄工程とすることができると共に、その１つの工程にて内室１０ａの出口１５から培養液容器４までの流路、および培養液容器４からポンプＰ１を介して内室１０ａの入り口１４まで到達する流路を同時に洗浄できる。
【００５４】
ステップＳ１０１（ステップＳ２０１〜Ｓ２０４を含む）を完了することで、細胞を培養する前に、流路や各部を洗浄液で洗浄できる。細胞培養回路２を洗浄することで、培養する細胞に影響する不純物が除去されるため、効率よく細胞を培養できる。
【００５５】
なお、上記ステップＳ１０１の間に洗浄液容器５内の洗浄液が途切れることを防止するため、洗浄液容器５の出口とバルブＶ２との間に、液切れセンサ（不図示）を取り付けてもよい。たとえば、液切れセンサ（不図示）からの検知信号を制御部３０が受けると、制御部３０は、自動的にバルブＶ２を閉止し、ポンプＰ１およびポンプＰ２の少なくとも一方を停止し、液切れを知らせるブザーもしくはランプなどの警報手段、または、入出力部３９の画面上への表示等により、洗浄液がなくなったことをユーザに通知する。ユーザは、洗浄液容器５に新たな洗浄液を補充する、もしくは、洗浄液容器５ごと新品に交換した後、再度スタートする旨、入出力部３９から制御部３０に指示する。かかる指示を制御部３０が受信すると、制御部３０は、ポンプＰ１およびポンプＰ２の少なくとも一方を駆動し、ステップＳ１０１を再開させる。
【００５６】
接着性細胞を培養する場合には、ステップＳ１０１は、さらに、洗浄液容器５から剥離剤容器７までの流路を洗浄するステップを有しているのが好ましい。例えば、洗浄液容器５を剥離剤容器７よりも鉛直方向で高い位置に設けた場合には、制御部３０が、バルブＶ１およびＶ２を開放し、バルブＶ３，Ｖ４，Ｖ５，Ｖ６およびＶ７を閉止して、ポンプＰ１およびＰ２を停止すると、洗浄液は、落差(水頭差)により洗浄液容器５から剥離剤容器７までの流路を洗浄し、剥離剤容器７の代わりに取り付けられた廃液容器（図示せず）に排出される。また、剥離剤が安定な組成であり、細胞培養を行っている間に剥離剤が変化しない場合には、剥離剤容器７をステップＳ１０１の前に細胞培養回路２に接続するのが好ましい。かかる場合には、制御部３０は、ステップＳ１０１の前に、バルブＶ１，Ｖ４およびＶ５を開放し、バルブＶ２，Ｖ３，Ｖ６およびＶ７を閉止して、ポンプＰ２を駆動する。かかる制御により、剥離剤は、剥離剤容器７から回収容器６の代わりに配置された廃液容器までの流路、および、剥離剤容器７からポンプＰ２までの回路を洗浄できる。かかる工程の後、一旦、全てのバルブを閉止し、かつ、ポンプＰ１およびポンプＰ２を停止した後、ステップＳ１０１の洗浄を開始してもよい。なお、浮遊性細胞を培養する場合には、剥離剤容器７を用いないため、この工程は不要である。
【００５７】
ユーザが上記ステップ１０１の終了を確認し、培養液充填ステップをスタートするよう入出力部３９から制御部３０に指示すると、制御部３０は、培養液を内室１０ａおよび外室１０ｂに充填する（ステップＳ１０２：培養液充填ステップ）。
【００５８】
図１５および図１６は、ステップＳ１０２における細胞培養装置１の状態を示すブロック図である。
【００５９】
ステップＳ１０２では、制御部３０は、まず、培養モジュール１０の内室１０ａに培養液を充填し、次に、外室１０ｂに培養液を充填する。制御部３０は、培養モジュール１０の内室１０ａに培養液を充填するために、図１５に示すように、バルブＶ７を開放し、バルブＶ１，Ｖ２，Ｖ３，Ｖ４，Ｖ５およびＶ６を閉止し、ポンプＰ１を駆動し、ポンプＰ２を停止する。培養液容器４内の培養液は、ポンプＰ１およびガス交換機８を介して内室１０ａに培養液を供給する。なお、培養液は、培養モジュール１０の内室１０ａを経て、出口１５から培養液容器４へと循環する。
【００６０】
続いて、制御部３０は、培養モジュール１０の外室１０ｂに培養液を充填するために、図１６に示すように、バルブＶ５を開放し、バルブＶ１，Ｖ２，Ｖ３，Ｖ４，Ｖ６およびＶ７を閉止し、ポンプＰ１を駆動し、ポンプＰ２を停止する。培養液容器４内の培養液は、培養モジュール１０の内室１０ａへ加圧供給されるため、培養液が中空糸１１の膜壁を透過して外室１０ｂに透過することにより、外室１０ｂに培養液が供給される。なお、過剰分の培養液は、回収容器６の代わりに配置された廃液容器に排出される。
【００６１】
ユーザがステップＳ１０２の完了を確認し、細胞充填ステップをスタートするように入出力部３９から制御部３０へ指示すると、制御部３０は、培養モジュール１０の外室１０ｂに細胞を充填する（ステップＳ１０３：細胞充填ステップ）。
【００６２】
ステップＳ１０３では、制御部３０は、バルブＶ１，Ｖ２，Ｖ３，Ｖ６およびＶ７を閉止し、バルブＶ４およびバルブＶ５を開放し、ポンプＰ１およびポンプＰ２を停止させる。その後、バルブＶ４と培養モジュール１０との間に設けられた細胞充填ポート（不図示）に細胞注入用シリンジを自動又は手動で差しこみ、シリンジ内の細胞を培養器の外室１０ｂに注入する。ステップＳ１０３により、培養モジュール１０の外室１０ｂに細胞が充填される。
【００６３】
ユーザが、ステップＳ１０３の完了を確認し、培養液循環ステップをスタートするよう入出力部３９から制御部３０に指示すると、制御部３０は、内室１０ａへの培養液の供給を開始する（ステップＳ１０４：培養液循環ステップ）。
【００６４】
ステップＳ１０４では、培養液容器４から培養モジュール１０の内室１０ａに培養液を循環供給する。具体的には、制御部３０は、図１５に示す様に、バルブＶ７を開放し、バルブＶ１，Ｖ２，Ｖ３，Ｖ４，Ｖ５およびＶ６を閉止し、ポンプＰ１を駆動し、ポンプＰ２を停止する。ステップＳ１０４では、内室１０ａにて循環する培養液が、膜間の圧力差あるいは拡散作用により中空糸１１の膜壁を透過し、外室１０ｂの培養液と置換するため、外室に注入された細胞は、外室１０ｂにて栄養分である培養液を得られる。なお、ステップＳ１０４では、ポンプＰ１の回転数を変更することで、培養液の循環量を増減し、最適な培養状態を維持することができる。ステップＳ１０４は、細胞及び培養液の種類によって、通常１〜３週間、行われる。
【００６５】
また、培養液の循環中に培養液中の酸素濃度が低下すると細胞の活性が低下するため、培養液容器４の培養液を新鮮な培養液と交換することが好ましい。培養液交換時には、ユーザがストップキーを押すことで、制御部３０は、全バルブＶとポンプＰ１を停止する。ユーザが、培養液容器４内の培養液の交換を完了した後、培養工程のスタートスイッチを再び押した場合、あるいは復旧スイッチを押した場合には、ストップキーを押す前の工程に復帰し、制御部３０は、バルブＶ７を開放し、ポンプＰ１を駆動させることで、培養工程を再開させる。培養が終了すると次の回収工程に移行する。培養液の交換時期は、培養液のｐＨを測定することにより判断することもできる。
【００６６】
ユーザがステップＳ１０４を完了し、かつ細胞の回収ステップをスタートするよう入出力部３９から制御部３０に指示すると、制御部３０は、剥離剤の供給を開始する（ステップＳ１０５：回収ステップ）。
【００６７】
図１７および図１８は、ステップＳ１０５における細胞培養装置１の状態を示すブロック図である。
【００６８】
ステップＳ１０５では、制御部３０は、まず、外室１０ｂを剥離剤で満たし、その状態を一定時間維持した後で、培養液を内室１０ａおよび外室１０ｂに供給し、排出口１７から追い出された細胞を回収容器６にて回収する。まず、制御部３０は、図１７に示すように、バルブＶ１，Ｖ４およびＶ５を開放し、バルブＶ２，Ｖ３，Ｖ６およびＶ７を閉止し、ポンプＰ１を停止し、ポンプＰ２を駆動する。ステップＳ１０５では、剥離剤は、剥離剤容器７から、培養モジュール１０の外室１０ｂに供給され、外室１０ｂを充満する。外室１０ｂをオーバーフローした剥離剤は、排出口１７から回収容器６に回収される。なお、浮遊性細胞を培養する場合には、細胞が不織布等の坦体に付着しないため、剥離剤を用いなくてもよい。
【００６９】
次に、制御部３０は、ポンプＰ２からの流量検知信号又はタイマからの信号を受けて、すべてのバルブＶを閉止し、ポンプＰ１およびポンプＰ２を停止して、外室１０ｂに剥離剤を充満させた状態を維持し、剥離剤が内壁と不織布等に細胞を付着させるタンパク質を分解して、細胞を剥離させるまで待機する。待機時間は、細胞及び剥離剤の種類によって決定されるが、通常３〜８分間である。
【００７０】
続いて、タイマからの信号を受けた制御部３０は、図１８のように、バルブＶ３，Ｖ４およびＶ５を開放し、バルブＶ１，Ｖ２，Ｖ６およびＶ７を閉止し、ポンプＰ１を駆動し、ポンプＰ２を停止する。すると、培養液は、培養液容器４から培養モジュール１０の内室１０ａおよび外室１０ｂの両方へ供給され、細胞を外室１０ｂの排出口１７から追い出す。追い出された細胞は、回収容器６にて回収される。培養液を培養モジュール１０の内室１０ａへ供給することで、内室１０ａと外室１０ｂ内の圧力が等しくなるため、培養した細胞が排出口１７から追い出されて、回収容器６にて細胞を回収できる。
【００７１】
なお、ステップＳ１０５においては、培養した細胞が不織布に引っかかり細胞の回収率が低下する場合がある。不織布に引っ掛かった細胞を回収する方法としては、培養モジュール１０を揺動させたり、培養モジュール１０の内室１０ａに供給される培養液を間歇的に加圧してもよい。たとえば、入口１４の手前に、圧力センサ（不図示）を設ける。制御部３０は、その圧力センサ（不図示）からの信号を受けて、入り口１４近傍の流路の圧力が設定圧力を超えるとバルブＶ５を開放し、設定圧力以下になるとバルブＶ５を閉止する。このように、培養モジュール１０の内室１０ａに供給される培養液の圧力を間歇的に変動させることで不織布に引っかかった細胞を取り外すことができる。
【００７２】
さらに、ステップＳ１０５は、膜壁表面に浮遊する細胞を外室１０ｂから追い出すステップを有していてもよい。膜壁表面に浮遊する細胞を外室１０ｂから追い出すためには、タイマからの信号を受けた制御部３０は、バルブＶ５を開放し、バルブＶ１，Ｖ２，Ｖ３，Ｖ４，Ｖ６およびＶ７を閉止し、ポンプＰ１を駆動し、ポンプＰ２を停止する。すると、培養液は、培養液容器４から培養モジュール１０の内室１０ａへ供給する。培養モジュール１０の内室１０ａへ加圧供給された培養液は、中空糸１１の膜壁を透過して外室１０ｂに移行するので、膜壁表面に浮遊する培養細胞を膜壁から剥がすことができる。膜壁から剥がされた細胞は、外室１０ｂから追い出され、排出口１７から回収容器６にて回収される。
【００７３】
ユーザが、ステップＳ１０５の完了を確認し、入出力部３９から制御部３０に廃棄を開始するよう指示すると、全てのバルブＶが開放される。ユーザは、全てのバルブＶが開放されたことを確認した後、細胞培養回路２を細胞培養装置１から取り外すことができる。この際、制御部３０がポンプＰ１およびポンプＰ２を停止し、全てのバルブＶを閉止した状態で、ユーザは、廃棄開始に先立ち、バルブＶ５およびＶ６から細胞回収容器６に至る回路を着脱可能なクリップなどで閉止し、回収容器への万一の汚染を防止することが好ましい。
【００７４】
なお、ステップＳ１０５の後で、回収した細胞をＰＢＳ等の洗浄液により洗浄してもよい。タンパク質分解酵素等の剥離剤が接着因子以外の細胞表面マーカー、チャネルやレセプターまでも分解、破壊し、培養細胞に悪影響を与えるのを防ぐために、回収された剥離剤をＰＢＳ等の洗浄液で置換するのが好ましいからである。たとえば、回収容器６の下部に排水流路を接続し、その排水流路には、細胞の透過を阻止する多孔膜を収容したフィルタを設ける。排水流路により、細胞と一緒に回収された培養液および剥離剤は透過され、廃棄される。溶液中の細胞は、フィルタの表面に堆積する。このフィルタに体積した細胞を、ＰＢＳ等により洗浄するようにしてもよい。
【００７５】
上述の細胞培養装置１を用いることで、初心者であっても容易に細胞培養を行うことができる。ユーザは、各容器に培養液、剥離剤、洗浄剤を用意し、細胞をシリンジに収容する。そして、ユーザは、洗浄ステップＳ１０１、培養液充填ステップＳ１０２、細胞充填ステップＳ１０３、培養ステップＳ１０４および回収ステップＳ１０５を開始するよう、制御部３０に指示するだけ（たとえば、スタートスイッチを押すだけ）で、自動的に各工程が実施されるからである。また全てのステップが密閉系で実施されるため、細胞培養回路２内に雑菌が侵入しにくい。さらに、細胞を注入する前に、洗浄工程を有するため、細胞に有害な不純物を予め除去できる。
【００７６】
３．変形例
以上、本発明の細胞培養装置１および細胞培養方法の実施の形態を説明したが、本発明は、上述の実施の形態に限定されることなく、種々変形を施して実施可能である。たとえば、上述の実施の形態において、剥離剤は必須ではない。また、剥離剤として、洗浄液を用いてもよい。たとえば、浮遊系細胞を培養する場合には、剥離剤を用いなくても良く、剥離剤容器７は、必須ではない。
【００７７】
また、上述の実施の形態では、細胞培養回路２は、制御装置３に脱離可能に取り付けされているが、このような形態に限らない。細胞培養回路２は、制御装置３から取り外しできないような形態であってもよい。また、上述の実施の形態では、ガス交換機８は、細胞培養回路２に設けられていたが、ガス交換機８は、必須ではない。また、ガス交換機８のうち、一部は、細胞培養回路２に設けられ、その他の部分は、制御装置３側に設けられていてもよい。たとえば、ガス透過性の膜から主に成るチューブ（培地が内部を流れる）部分は、細胞培養回路２に設けられて、二酸化炭素や空気等の気体を供給する部分は、制御装置３側に設けられていてもよい。係る場合には、ガス交換機８のうち制御装置３の側に設けられた部分と、細胞培養回路２の側に設けられた部分とが脱離可能であるのが好ましい。
【００７８】
また、上述の実施の形態では、中空糸１１を用いた培養モジュール１０の例を示したが、このような形態に限らない。たとえば、培養モジュール１０は、中空糸１１を用いずに、平膜を用いるモジュールであってもよい。
【００７９】
また、上述の実施の形態では、培養液容器４、洗浄液容器５および剥離剤容器７を培養モジュール１０よりも鉛直方向上方に配置するものとしたが、さらに、回収容器６を培養モジュール１０よりも低い位置に設置し、かつ、廃液容器を回収容器６よりも低い位置に設置するのが好ましい。また、回収容器６と廃液容器との間、および、培養モジュール１０と回収容器６との間に開閉可能な流路を設けるのがより好ましい。かかる場合には、回収容器６と廃液容器との流路および培養モジュール１０と回収容器６との流路を開放することにより、全ての廃液を培養モジュール１０と回収容器６とを経由して廃液容器に集めることが可能なため、回収容器６の代わりに廃液容器を付け替えることなく、ステップＳ１０１を行うことができる。しかる後、回収容器６と廃液容器間の流路を閉止すれば、回収容器６と廃液容器との交換に起因する細胞培養回路２の内部に不純物あるいは雑菌等が侵入するリスクを低減できる。さらに、各流路の開閉には、外部から着脱可能なクランプ類あるいは鉗子などを補助的に用いることで、操作が簡便となる。また、培養液容器４、洗浄液容器５および剥離剤容器７を培養モジュール１０よりも鉛直方向上方に配置することで、剥離剤、洗浄液、培養液をそれぞれ落差(水頭)で流すことができるので、細胞培養回路２の内部の洗浄と置換が可能であり、最終的に洗浄に使用した液体はすべて廃液容器に集められる。
【００８０】
また、上述の実施の形態では、１つの流路の閉止あるいは開放を切り替えられるバルブＶを用いたが、このような形態に限らない。たとえば、バルブとして、多方活栓４０を用いることができる。図１９は、多方活栓４０の構造の一例を示す分解斜視図である。
【００８１】
多方活栓４０は、たとえば、パルスモータ４１、仕切板４３、クランプ５０、栓部６０を主に備える。パルスモータ４１は、上方に延出する回転軸４２を有している。パルスモータ４１は、予め決めたパルス数に相当する角度だけ回転軸４２を回転させることが可能である。なお、制御部３０は、パルスモータ４１の制御部として機能してもよく、制御部３０は各ステップに応じて、回転軸４２の長軸を軸として回転軸４２を回転させることができる。
【００８２】
パルスモータ４１の上部に位置する仕切板４３は、穴部４４を有し、その穴部４４からパルスモータ４１の回転軸４２が延出している。また、仕切板４３上には、スイッチ４５，４６が配置されている。
【００８３】
図２０は、多方活栓４０のうち、クランプ５０と栓部６０とを組み合わせた状態の斜視図である。
【００８４】
クランプ５０は、略円形の台座部５１を有し、その台座部５１の裏側中心には、凹部５２がある。この凹部５２には、パルスモータ４１の回転軸４２が嵌合する。したがって、回転軸４２が回転すると、クランプ５０も回転軸４２と一体的に回転する。クランプ５０は、さらに、台座部５１の中心からクランプ５０の径方向外側に向かって伸びる一本の押圧部材５３を備える。押圧部材５３の長さは、クランプ５０が回転した場合に、スイッチ４５，４６に届く長さである。また、台座部５１上面には、４本の把持柱５４が立設されている。
【００８５】
また、４本の把持柱５４に囲まれるように、把持柱５４よりも短い柱状部５５を有する。把持柱は、ゴムのように柔軟性に富みかつ摩擦係数の高い材料で外周が構成されているのが好ましく、たとえば、芯としてねじを用いて、そのねじに、回動部材６１の側面との隙間を十分に埋めることができる厚さを有する筒体を被せることで好適に構成される。ゴムよりも硬度の高い樹脂（例えば、フッ素樹脂）から成る筒の外表面にゴムをコートした多層構造の把持柱であってもよい。芯を金属製にし、その芯の外周に芯材よりも硬度の低い材料（たとえば、樹脂）で構成することにより、把持柱５４は、それぞれ、回動部材６１を強くグリップでき、かつ回動部材６１の表面において滑りにくくなる。回動部材６１は、把持柱５４にて着脱自在なので、大きさ若しくは形状等に関わらず市販の三方活栓を栓部６０として用いることができる。
【００８６】
把持柱５４は、略十字状の回動部材６１をグリップする。また、芯体６２は、上側から見た場合に、平面上で互いに直角である３方向に開となるＴ字状の流路６３を有する。栓部６０は、略十字状の回動部材６１および略中央に上方へ伸びる芯体６２を有する。芯体６２と流路６３とは、回転しないように固定されている。一方、芯体６２の内部には、略十字状の回動部材６１に固着されたＴ字状の流路を有する円筒が、シールを介して、回転可能に芯体６２と液密的に接合されている。この例では回動部材６１の回転により、回動部材６１に固着された円筒のＴ字状の流路が回転し、芯体６２より３方向に伸びる流路６３のＴ字状の流路と一致したときに、その方向に流通する。また回動部材６１が、芯体６２より外部３方向に伸びる流路６３に対し４５度程傾いた位置にある場合、流路は全閉となる。
【００８７】
図２１〜２３は、上面から見た場合の、クランプ５０の回転運動に応じた回動部材６１の向きと、それに固着された円筒のＴ字状の流路と、芯体６２より外部３方向にＴ字状に伸びる流路６３との流通状態を説明する平面図である。図２１〜２３では、右側の図の破線によって示される部分が、回動部材６１に固着された円筒内のＴ字状の流路６３であり、回動部材６１の長軸方向と、その左側に開口したＴ字状の流路を有している。また図中の「管１」、「管２」、「管３」は、流路６３の端部が「管１」、「管２」または「管３」の方向を向いている場合に流路６３と接続される管を示している。
【００８８】
図２１に示す位置では、流路６３は、管２と管３とを流通させ、管１は閉止状態にある。図２１に示す状態からクランプ５０が時計の針と反対方向に９０度回転すると、図２２に示す状態になる。図２２に示す状態の場合、流路６３は、管１と管３とを流通させる。また、図２２に示す状態から、クランプ５０がさらに半時計方向に９０度回転すると、図２３に示す状態となり、流路６３は、管１と管２とを流通させる。
【００８９】
上述のような三方活栓を用いた場合、本来手動にて使用する三方活栓を電動により回転させ、流路６３の開閉を切り換えることができる。例えば、管１を培養モジュール１０に接続し、管２を洗浄剤容器５に、管３を培養液容器４に接続する。管１と管３をつなぐ流路６３を正確に開放状態とする必要がある場合には、クランプ５０を正確に９０度回転させるためのパルス数だけパルスモータ４１を回転させなければならない。このため、角度ゼロの状態であるかどうか不確定であるクランプ５０を数〜数十パルス分だけ時計の針と反対方向に回転させ、その位置から押圧部材５３がスイッチ４５を押し込むまで、クランプ５０を時計の針と同方向に回転させる。スイッチ４５が押し込まれてパルスモータ４１が停止したときのクランプ５０の位置は、確実に角度ゼロの位置である。この状態から角度９０度に相当するパルス数だけクランプ５０を回転させる。この結果、図２１に示すクランプ５０の状態は、正確に９０度回転した状態となり、管１と管３とを結ぶ流路６３は完全に開の状態となる。なお、流量の正確さを必要としない場合には、上述の方法を採用しなくてもよい。
【００９０】
また、上述の実施の形態では、各ステップのスタート指示を入出力部３９から制御部３０が受け取った場合に、各ステップを実行するような形態としたが、このような形態に限らない。たとえば、制御部３０は、所定のステップが完了したことを確認した後、あるいは、所定の時間が経過後に、自動的に次のステップを開始してもよい。
【００９１】
また、上記実施の形態に係る細胞培養装置１の制御部３０を動作させるプログラムは、制御部３０が有するＲＡＭあるいはＲＯＭ等に記憶されるが、これらのプログラムは、これらの装置の出荷前に記憶されたものであっても、これらの機器の出荷後に記憶されたものであってもよい。また、これらのプログラムの一部が、これらの機器の出荷後に記憶されたものであってもよい。このように出荷後に細胞培養装置１の制御部が有するメモリに記憶されるプログラムは、たとえばＣＤ−ＲＯＭや半導体メモリなどのコンピュータ読取可能な記録媒体に記憶されているものをインストールしたものであっても、インターネットなどの伝送媒体を介してサーバ装置などからダウンロードしたものであってもよい。
【００９２】
また、上記実施の形態に係る細胞培養装置１のメモリに記憶されるプログラムおよび各種のデータは、その一部あるいは全部が、コンピュータ以外のたとえばＨＤＤなどの外部記憶デバイスや、細胞培養装置１と着脱可能なたとえばメモリカードやＣＤ−ＲＯＭに記憶されていてもよい。
【００９３】
また、上記実施の形態に係る細胞培養装置１を構成する各部の機能は、全てまたはその一部をソフトウェアによって実現しても、あるいはその少なくとも一部をハードウェアで実現しても良い。例えば、制御部３０における処理の全部またはその一部は、１または複数のプログラムによりコンピュータ上で実現してもよく、その少なくとも一部をハードウェアで実現してもよい。
【００９４】
また、上記実施の形態おける細胞培養装置１の全部または一部として動作させるためのコンピュータプログラムを、メモリカードあるいはＣＤ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納して配布し、これを別のコンピュータ、例えば、携帯電話、オーディオ機器、電子時計等にインストールし、細胞培養装置１として動作させ、あるいは、細胞培養装置１が行なう工程の一部または全部を実行させてもよい。さらに、インターネット上のサーバ装置が有するディスク装置等にプログラムを格納しておき、例えば、搬送波に重畳させて、細胞培養装置１の制御部３０となるコンピュータにダウンロード等するものとしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明は、細胞を培養するための細胞培養装置に適用できる。
【符号の説明】
【００９６】
１・・・細胞培養装置
２・・・細胞培養回路
３・・・制御装置
４・・・培養液容器（細胞培養回路の一部）
５・・・洗浄液容器（細胞培養回路の一部）
１０・・・培養モジュール（細胞培養回路の一部）
３０・・・制御部（制御装置の一部）
４０・・・多方活栓
４１・・・パルスモータ（駆動源）
４２・・・回転軸
５０・・・クランプ
５４・・・把持柱
６０・・・栓部
６１・・・回動部材
６３・・・流路
Ｐ１，Ｐ２・・・ポンプ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養装置、細胞培養方法および細胞培養用プログラムに関する。本発明は、特には、付着系細胞の培養装置、培養方法および培養用プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体外において細胞を培養し、培養された細胞により組織を再構築するような技術が注目されている。そこで、細胞を大量にかつ簡便に培養するために、生体外における細胞培養およびそれにより培養された細胞の回収操作を半自動化または自動化することが求められている。
【０００３】
たとえば、細胞培養器内の培養液を循環させることが可能な培養装置が提案されている（特許文献１および特許文献２参照）。また、細胞培養器内の培養液を交換することが可能な培養装置も提案されている（特許文献３参照）。更には、細胞培養容器内の培養液を自動的に交換することが可能な培養装置が開示されている（特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平５−２６０９５８号公報（特許請求の範囲等）
【特許文献２】特開平５−２７６９２２号公報
【特許文献３】特開平８−１７２９５６号公報（特許請求の範囲等）
【特許文献４】特開２００２−２６２８５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ここで、上述の特許文献１および特許文献２の細胞培養装置においては、細胞の培養に影響するような不純物の混入が少ない状態で、細胞を培養するのが好ましい。そこで、細胞を培養する前に、細胞培養装置の滅菌を行う場合がある。かかる滅菌には、たとえば、ガンマ線を照射することにより細胞培養装置の滅菌を行う。しかし、細胞培養装置にガンマ線を照射すると、細胞培養装置を構成する部材の一部がガンマ線により溶出する場合があり、その溶出等した不純物が培養する細胞に影響するという問題がある。
【０００６】
本発明は、かかる要望に鑑みてなされたものであって、本発明が解決しようとする課題は、コンタミネーションしにくく、また不純物が混入しにくい細胞培養装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る細胞培養装置は、外室および内室に区画された培養モジュールと、培養モジュールに供給するための培養液を収納する培養液容器と、培養モジュールを洗浄するための洗浄液を収納する洗浄液容器と、培養液および上記洗浄液を供給するためのポンプと、ポンプの制御を行う制御部とを有する細胞培養装置であって、ここで洗浄液は、細胞を培養する前に供給されるものである。
【０００８】
本発明に係る細胞培養装置において、培養モジュール、培養液容器および洗浄液容器を含む培養用回路全体は、ポンプおよび制御部を有する制御装置に脱着可能に取り付けられている。
【０００９】
また、本発明に係る細胞培養装置において、制御部は、培養液を供給する流速と、洗浄液を供給する流速とが異なるように制御するものであってもよい。
【００１０】
さらに、本発明に係る細胞培養装置において、培養液容器および洗浄液容器の少なくとも一方は、培養モジュールよりも反重力方向側に配置されうる。
【００１１】
さらに、本発明に係る細胞培養装置において、前記培養モジュールと各部とを接続する流路には、流路を開閉するバルブが設けられている。該バルブは、好ましくは、複数方向に突出する管と、流体の流路を切り換えるための回動可能な回動部材とを備える多方活栓と、該多方活栓の栓部を固定して回動部材を回動させる多方活栓切換装置を備えている。該多方活栓切換装置は、好ましくは、回動部材に対して回動駆動力を与えるための駆動源と、駆動源の回転軸に接続され、回動部材を把持する１以上の把持柱を備えるクランプとを備え、クランプは、制御部により制御された駆動源の回動動作に基づき回動部材を回動させる。また、バルブは、外部からの雑菌の侵入のない方式、例えば、ピンチバルブであってもよい。
【００１２】
また、本発明の別の実施形態において、細胞培養方法は、外室および内室に区画された培養モジュールを洗浄する洗浄ステップと、培養液を培養モジュールに充填する培養液充填ステップと、外室に細胞を注入する細胞充填ステップと、培養液を上記内室へ供給しながら細胞を培養する培養ステップと、培養モジュールにて培養した細胞を回収する回収ステップとを有する。
【００１３】
また、本発明の別の実施形態において、細胞培養プログラムは、外室および内室に区画された培養モジュールに洗浄液を供給する洗浄ステップと、培養液を培養モジュールに供給する培養液充填ステップと、培養液を上記内室へ供給しながら細胞を培養する培養ステップと、細胞を剥がすための剥離剤、上記洗浄剤および上記培養液の少なくとも１つを上記培養モジュールに供給する回収ステップとを制御部に実行させるものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、コンタミネーションしにくく、また不純物が混入しにくい細胞培養装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本実施の形態に係る細胞培養装置の構成を示すブロック図である。
【図２】図１の細胞培養装置が有する細胞培養回路の構成を示すブロック図である。
【図３】図１の細胞培養装置が有する培養モジュールの外観を示す斜視図である。
【図４】図３の培養モジュールに含まれる中空糸の外観を示す拡大斜視図である。
【図５】図３の培養モジュールをＡ−Ａ線に沿って切断した場合の拡大断面図である。
【図６】図１の細胞培養装置が有する制御装置の外観を示す斜視図である。
【図７】図６の制御装置の構成を示すブロック図である。
【図８】本実施の形態に係る細胞培養方法の流れを示すフローチャートである。
【図９】図８のステップＳ１０１の流れを示すフローチャートである。
【図１０】ステップＳ２０１における図１の細胞培養装置の状態を示すブロック図である。
【図１１】ステップＳ２０２における図１の細胞培養装置の状態を示すブロック図である。
【図１２】ステップＳ２０３における図１の細胞培養装置の状態を示すブロック図である。
【図１３】ステップＳ２０４おける図１の細胞培養装置１の状態を示すブロック図である。
【図１４】図１の細胞培養装置において、図１３の後の状態を示すブロック図である。
【図１５】ステップＳ１０２およびステップＳ１０４における図１の細胞装置の状態を示すブロック図である。
【図１６】ステップＳ１０２における図１の細胞装置の状態を示すブロック図である。
【図１７】ステップＳ１０５における図１の細胞装置の状態を示すブロック図である。
【図１８】ステップＳ１０５のうち、図１７の後において、図１の細胞装置の状態を示すブロック図である。
【図１９】本実施の形態の変形例に係る細胞培養装置に用いられる多方活栓の構造を示す分解斜視図である。
【図２０】図１９の多方活栓のうち、クランプと栓部とを組み立てた状態を示す斜視図である。
【図２１】図１９の多方活栓をパルスモータの回転に従動してクランプが回動した際の回動部材と三方活栓の流路との関係の一例を示す平面図であり、角度ゼロの際の状態を示す。
【図２２】図１９に示す多方活栓を、図２１の状態から反時計方向に９０度回転させた際の回動部材と栓部の流路との関係の一例を示す平面図である。
【図２３】図１９に示す多方活栓を、図２２の状態から反時計方向に９０度回転させた際の回動部材と栓部の流路との関係の一例を示す平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
次に、本発明の細胞培養方法、細胞培養装置およびそのプログラムの好適な実施の形態について説明する。なお、本発明に係る細胞培養装置の実施の形態について最初に説明し、その装置の動作の説明と共に、細胞培養方法およびそのプログラムの各実施の形態について説明する。
【００１７】
１．細胞培養装置
図１は、本実施の形態に係る細胞培養装置１の構成を示すブロック図である。図２は、図１の細胞培養装置１が有する細胞培養回路２の構成を示すブロック図である。
【００１８】
本実施の形態に係る細胞培養装置１は、細胞培養回路２と制御装置３とを有する。細胞培養回路２は、制御装置３に脱離可能に取り付けされている。
【００１９】
細胞培養回路２は、細胞培養をするための回路である。細胞培養回路２は、培養液容器４、洗浄液容器５、回収容器６、剥離剤容器７、ガス交換機８および培養モジュール１０を主に有する。なお、培養液容器４、洗浄液容器５、回収容器６および剥離剤容器７は、後述の廃液容器と交換されて用いられることがある。
【００２０】
培養液容器４は、培地等の培養液を収納する容器である。培養液容器４に収納される培養液としては、培養する細胞に適した種々の培養液を用いることができる。
【００２１】
洗浄液容器５は、細胞培養回路２を洗浄するための洗浄液を保持する容器である。洗浄液容器５が保持する洗浄液としては、培養する細胞に悪影響を与えないものであれば、一般的な洗浄液を用いることができる。たとえば、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）若しくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ）等の等張緩衝液、または、培養する細胞と浸透圧が略同一のショ糖溶液、食塩水等の等張液が好適に用いられる。その中でも、実質的にカルシウムを含まないものが好ましく、特に、ＰＢＳを用いるのが好ましい。
【００２２】
回収容器６は、培養モジュール１０で培養した細胞を回収する容器である。剥離剤容器７は、培養モジュール１０にて培養した細胞を回収する際に、不織布等に接着した細胞を剥離し、回収率を向上させるために用いる剥離剤を保存する容器である。剥離剤容器７に入れる剥離剤としては、０．５ｍＭ〜１０ｍＭのＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＮＴＡ若しくはＴＴＨＡ等の２価金属のキレート剤、トリプシン若しくはコラーゲン等のタンパク質分解酵素、または、インテグリン若しくはカドヘリン等のタンパク質の接着を競合的に阻害するペプチドが好適に用いられる。かかる剥離剤を培養モジュール１０に供給すると、培養モジュール１０の筺体内壁や不織布に細胞を付着させているインテグリン等、および細胞同士を接着させているカドヘリン等の接着因子を切断できる。接着因子が切断されると付着性細胞が浮遊するため細胞の回収が容易となる。
【００２３】
培養液容器４、洗浄液容器５、回収容器６および剥離剤容器７は、たとえば、可撓性樹脂から主になる袋型容器に各液体を保持している。かかる場合には、培養液容器４、洗浄液容器５、回収容器６および剥離剤容器７は、その内部に保持する溶液の量が増減した場合に、撓んでいくため、細胞培養回路２に空気が混入しにくい。また、培養液容器４、洗浄液容器５、回収容器６および剥離剤容器７は、培養モジュール１０よりも地上から鉛直方向上方に配置され、流路を鉛直方向下方側に配置するのが好ましい。かかる場合には、たとえ培養液容器４、洗浄液容器５、回収容器６あるいは剥離剤容器７の内部に空気が混入しても、空気は、容器内で上方へ移動するため、細胞培養回路２に入りにくく、空気を介して混入した不純物が細胞に影響を与えるのを防ぐことができる。
【００２４】
ガス交換機８は、二酸化炭素等を排出し、酸素等を細胞培養回路２に注入するために備えられる。細胞は、生存に必要な酸素を培養液から取り込むと共に、二酸化炭素を排出する。ガス交換機８が培養液中の二酸化炭素濃度と酸素濃度と適切に維持することにより、培養液のｐＨが高くなるのが防止されるため、細胞の活性低下を防ぐことができる。ガス交換機８は、たとえば、ガス交換膜を有し、そのガス交換膜を介して二酸化炭素や酸素を透過させることができる。また、ガス交換機８は、二酸化炭素センサを有し、二酸化炭素センサからの信号を受けて、二酸化炭素の供給量を調整するようにしてもよい。また、ガス交換機８には、培養液中の酸素濃度が低下することで細胞の活性が低下しないように、酸素濃度や流量を調整した気体を供給するのが好ましい。
【００２５】
図３は、本実施の形態に係る細胞培養回路２が有する培養モジュール１０の外観を示す斜視図である。図４は、図４の培養モジュール１０が有する中空糸の構造を示す斜視図である。図５は、図３の培養モジュール１０のＡ−Ａ線断面図である。なお、図５においては、見易さを考慮して、各部材の縮尺を変更して図示していることに加え、中空糸１１の数を減らし、中空糸１１を直線的に図示している。
【００２６】
培養モジュール１０は、細胞を培養するためのモジュールである。培養モジュール１０としては、公知のモジュールであればどのようなものを用いてもよい。たとえば、培養モジュール１０は、その内部に、図４に示すような中空糸１１を備えている。中空糸１１は、中空の繊維である。また、培養モジュール１０は、中空糸１１により、内室１０ａと外室１０ｂとの２室に区画されている。ここで、内室１０ａとは、中空糸１１の中空部分をいい、外室１０ｂとは、中空糸１１の外側部分をいう。中空糸１１の壁部は、培養液、洗浄液および剥離剤等（以後、培養液、洗浄液および剥離剤等をまとめて、「培養液等」という。）を透過させるが、培養する細胞を通さない繊維である。
【００２７】
図４に示すように、培養モジュール１０は、中空糸１１の内室１０ａに培養液等を供給するための入口１４と、内室１０ａからの培養液等を排出するための出口１５とを有する。また、培養モジュール１０は、中空糸１１の延伸方向に略垂直な方向から外室１０ｂに細胞や培養液等を供給するための供給口１６と、外室１０ｂから細胞や培養液等を排出するための排出口１７とを有する。培養モジュール１０は、外室１０ｂに、担体として、たとえば、不織布を配置する。
【００２８】
培養モジュール１０において、中空糸１１を用いる場合には、多数の中空糸１１と不織布とを重ね合わせた積層体を巻き、棒状にする。続いて、その両端を接着剤で接着し、ばらばらにならないようにする。最後に、供給口１６および排出口１７が設けられた筒状の筺体に入れ、その筒状の筺体の開口部に、入口１４が設けられたキャップと、出口１５が設けられたキャップとを取り付ける。なお、培養した細胞を回収する際に、細胞が不織布に引っかかって回収率が低下するのを防ぐため、例えば、中空糸１１より短い不織布を重ね合わせ、出口１５側には不織布が存在しない空間を形成する。かかる構造により、培養した細胞が、出口１５の手前で不織布に引っかからないため、細胞の回収率を向上できる。
【００２９】
細胞培養回路２が予め一体として組み立てられ、一体として滅菌される場合には、細胞培養回路２の回路内部の汚染を避けることができるため好ましい。また、胞培養回路２は、内部に蒸留水や生理食塩水などの流体を充填した状態で滅菌されるのがさらに好ましい。細胞培養回路２の内部に蒸留水や生理食塩水などの流体を充填した状態で、細胞培養回路２を滅菌した場合には、輸送時あるいは細胞培養回路２を制御装置３に装着する際等に、充填された流体が細胞培養回路２の内部で移動しないように、細胞培養回路２のうち後述のバルブＶ１，Ｖ２，Ｖ３，Ｖ４，Ｖ５，Ｖ６，Ｖ７（以後、すべてのバルブを総称する場合には、「バルブＶ」という。）、ポンプＰ１およびポンプＰ２に取り付けられる部分を、着脱可能なディスポーザブルクリップにて挟み、細胞培養回路２内における流体の流通を遮断しておくのが好ましい。当該ディスポーサルクリップは、細胞培養回路２を制御装置３にセットし、電源スイッチを入れた後、あるいは、最初にバルブＶを全閉とした後等の適切なステップにて除去される。
【００３０】
図６は、本実施の形態に係る細胞培養装置１が有する制御装置３の外観を示す斜視図である。図７は、制御装置３の構成を示すブロック図である。なお、図６以外の図においては、カバー３３の図示を省略している。
【００３１】
制御装置３は、細胞培養回路２内で細胞が培養できるように、細胞培養回路２を配置し、各部の制御を行うための装置である。制御部３０、ガス交換機ホルダ３１、培養モジュールホルダ３２、カバー３３、ヒータ３４、温度センサ３５、ポンプＰ１，Ｐ２およびバルブＶを有する。
【００３２】
制御部３０は、制御装置３の各部を制御する手段である。制御部３０は、温度センサ３５からの情報を取得し、ヒータ３４を駆動させる温度調節手段３０ａ、バルブＶを開閉させるためのバルブ開閉手段３０ｂ、ポンプＰ１，Ｐ２を駆動させるポンプ駆動手段３０ｃ、およびユーザが入出力部３９から入力した指示を取得したり、動作状況を入出力部３９に表示させるための入出力手段３０ｄとして機能する。制御部３０は、たとえば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭおよびタイマ等で構成されている。制御部３０のＲＯＭおよびＲＡＭは、制御部３０が実行するプログラムを格納したり、処理対象となるデータを一時的に格納したり、あるいは制御部３０のワークメモリとして機能する。制御部３０は、ＲＯＭあるいはＲＡＭに格納されたプログラムにより各部を制御する。制御部３０は、温度センサ３５およびポンプＰ１，Ｐ２からの情報を処理する、あるいは、タイマにより計時することもある。また、制御部３０は、ヒータ３４、ポンプＰ１，Ｐ２およびバルブＶの制御を行う。また、制御部３０には、タッチパネル等から構成される入出力部３９が接続されていてもよく、ユーザは、入出力部３９から、制御部３０へ指示するあるいは現在の状況を確認するようにしてもよい。
【００３３】
ガス交換機ホルダ３１は、ガス交換機８を保持するための固定具である。培養モジュールホルダ３２は、培養モジュール１０を保持するための固定具である。ガス交換機ホルダ３１および培養モジュールホルダ３２は、ガス交換機ホルダ３１および培養モジュールホルダ３２を固定できれば、どのようなものであってもよい。
【００３４】
カバー３３は、培養モジュールホルダ３２を保護し、かつ、温度を一定にするために培養モジュールホルダ３２およびその他の部分を覆う部材である。本実施の形態では、カバー３３の内側に、ガス交換機ホルダ３１、培養モジュールホルダ３２、ヒータ３４および温度センサ３５が収納される。
【００３５】
ヒータ３４は細胞培養回路２の温度を一定にするために設けられる。細胞培養回路２の周囲温度の低下により、培養液の温度が低下し、培養中の細胞の活性が低下するのを防ぐためである。ヒータ３４としては、たとえば、温風により、カバー３３の内部の温度を一定温度に維持する、いわゆる温風ヒータを採用できる。なお、カバー３３の内部には、少なくとも培養モジュールホルダ３２およびヒータ３４および温度センサ３５が収納されていればよく、より好ましくは、培養モジュールホルダ３２、ヒータ３４および温度センサ３５以外の細胞培養回路２も収納されている。特に、培養液容器４も一緒に保温されていることで、供給する培養液の温度を一定に保つことができる。
【００３６】
ポンプＰ１およびポンプＰ２は、各部から培養モジュール１０に培養液等を供給するための駆動部である。ポンプＰ１およびポンプＰ２としては、一般的なポンプであればどのようなものを用いてもよいが、流路として弾性に富むチューブを用いる場合には、いわゆるローラポンプを好適に用いることができる。ローラポンプは、弾性のあるチューブの一点をローラで押し潰し、ローラをそのまま移動させてチューブ内部の液体を押し出しながら移動するようなポンプである。ローラが移動すると、押し潰された箇所はチューブの復元力によって元の形状に戻る際に、チューブ内部に生じた真空により次の液体を吸引することができる。
【００３７】
本実施の形態では、ポンプＰ１は、培養液容器４からガス交換機８を経て培養モジュール１０の内室に培養液を供給するための流路に設けられている。したがって、ポンプＰ１を駆動させることで、培養液容器４から培養液がガス交換機８を経て培養モジュール１０に供給される。また、ポンプＰ２は、洗浄液容器５および剥離剤容器７から培養モジュール１０の外室に続く流路のうち、洗浄液容器５および剥離剤容器７よりも培養モジュール１０側に設けられる。また、ポンプＰ２は、単位時間当たりの吐出量を調整できるのが好ましい。また、ポンプＰ２は、単位時間当たりの吐出量を、ポンプＰ１の吐出量より大きく設定できるものが好ましい。なぜなら、洗浄液により細胞培養回路２を洗浄する際には、流速が大きい程、流路壁部に付着している不純物を効率よく除去できるからである。
【００３８】
バルブＶは、流路を開閉するために用いられる。バルブＶとしては、外部から雑菌等の混入が生じない方法であればどのように流路を開閉するものでもよい。たとえば、バルブＶとしては、ピンチコックを用いることができる。バルブＶ１は剥離剤容器７の出口に、バルブＶ２は洗浄液容器６の出口に、バルブＶ３はポンプＰ２からガス交換機までの間の流路に、バルブＶ４はポンプＰ２と外室との間に、バルブＶ５は回収容器６と外室との間に、バルブＶ６は回収容器６と内室１０ａの出口１５との間に、バルブＶ７は培養液容器４と内室１０ａの出口１５との間に、それぞれ設けられる。
【００３９】
上述のような細胞培養装置１を構成することで、細胞を培養する前に、流路や各部を洗浄液で洗浄できる。したがって、細胞培養回路２にガンマ線を照射して細胞培養回路２を滅菌する場合であっても、ガンマ線により細胞培養回路２を構成する部材の一部が溶出した後に、洗浄液により細胞培養回路２を洗浄するため、不純物を除去できる。
【００４０】
また、上述のような細胞培養装置１とすることで、細胞培養回路２を制御装置３からそのまま取り外しできる。したがって、ある程度細胞を培養した場合に、細胞培養回路２をそのまま取り外して、冷凍保存すること等が可能となる。特に、培養液容器４、洗浄液容器５、回収容器６および剥離剤容器７等が袋状の容器である場合には、取り外した後、冷凍保存が容易である。また、細胞培養回路２を解凍して再び細胞の培養を開始する際に、不純物が混入しないため好ましい。
【００４１】
また、上述のような細胞培養装置１とすることで、培養温度を一定に保つことができるため、細胞の培養効率が向上する。細胞培養装置１では、従来と異なり、培養液のみを一定温度にするのではなく、培養モジュール１０を保温する、あるいは、培養モジュール１０を含む細胞培養回路２の一部または全部を保温できるため、外気温により培養液の移送中に培養液の温度が変化するのを防止できる。特に、ヒータ３４として温風ヒータを用いる場合には、温水や電熱式の場合と比較して、カバー３３内部の温度が均一であるため好ましい。
【００４２】
２．細胞培養方法
次に、本発明の実施の形態に係る細胞培養方法について説明する。なお、この実施の形態に係る細胞培養用プログラムは、本発明の実施の形態に係る細胞培養方法における各ステップを細胞培養装置１の制御部３０に実行させるプログラムである。以下、本実施の形態に係る細胞培養方法およびプログラムを、細胞培養装置１の動作と共に説明する。
【００４３】
図８は、本発明の実施の形態に係る細胞培養方法の流れを示すフローチャートである。
【００４４】
回路２を制御装置３にセットした後、ユーザが電源を入れると、制御部３０は、全てのバルブＶを全閉とする。続いて、ユーザが入出力部３９を介して制御部３０にスタート指示を与えると、制御部３０は、各流路および培養モジュール１０を洗浄液で洗浄を開始する（ステップＳ１０１：洗浄ステップ）。
【００４５】
図９は、図８のステップＳ１０１における処理の流れを説明するフローチャートである。図１０は、ステップＳ２０１における細胞培養装置１の状態を示すブロック図である。なお、図１０〜図１８では、洗浄液が通過中の流路を黒で示し、開放中のバルブＶを白抜きで、閉止中のバルブＶを黒で示す。
【００４６】
ステップＳ１０１は、図９のステップＳ２０１〜２０４の４つのステップを含む。まず、制御部３０は、内室１０ａを洗浄するため、バルブＶ２，Ｖ３，Ｖ６を開放し、バルブＶ１，Ｖ４，Ｖ５およびＶ７を閉止し、ポンプＰ１を停止し、ポンプＰ２を駆動するように制御する（ステップＳ２０１）。これにより、洗浄液容器５から供給された洗浄液は、培養モジュール１０の内室１０ａを通過し、回収容器６の代わりに置かれた廃液容器に排出される。
【００４７】
図１１は、ステップＳ２０２における細胞培養装置１の状態を示すブロック図である。
【００４８】
次に、制御部３０は、ステップＳ２０２において、中空糸１１の膜壁を洗浄するため、バルブＶ２，Ｖ３およびＶ５を開放し、バルブＶ１、Ｖ４，Ｖ６およびＶ７のバルブを閉止して、ポンプＰ１を停止し、ポンプＰ２を駆動する。かかる洗浄により、入口１４から内室に供給された洗浄液は、内室１０ａに接続されたバルブＶ６およびＶ７が閉止しているため、内室１０ａに供給された洗浄液は加圧されて中空糸１１の膜壁を透過する。かかるステップにより、中空糸１１の膜壁が洗浄され、洗浄液は、回収容器６の代わりに置かれた廃液容器に排出される。
【００４９】
図１２は、ステップＳ２０３における細胞培養装置１の状態を示すブロック図である。
【００５０】
次に、制御部３０は、ステップＳ２０３において、外室１０ｂを洗浄するため、図１２に示すように、バルブＶ２，Ｖ４およびＶ５を開放し、バルブＶ１，Ｖ３，Ｖ６およびＶ７のバルブを閉止し、ポンプＰ１を停止し、ポンプＰ２を駆動する。かかる洗浄により、洗浄液は、培養モジュール１０の外室１０ｂを通過し、通過の際に外室１０ｂを洗浄する。使用済みの洗浄液は、廃液容器に排出される。その際、外室に配置された不織布も同時に洗浄される。
【００５１】
図１３および図１４は、ステップＳ２０４おける細胞培養装置１の状態を示すブロック図である。
【００５２】
最後に、制御部３０は、ステップＳ２０４において、内室１０ａの出口１５から培養液容器４までの流路、および培養液容器４からポンプＰ１を介して内室１０ａの入り口１４まで到達する流路を洗浄する。まず、制御部３０は、内室１０ａの出口１５から培養液容器４までの流路を洗浄するため、図１３に示すように、バルブＶ２，Ｖ３およびＶ７を開放し、バルブＶ１，Ｖ４，Ｖ５およびＶ６のバルブを閉止し、ポンプＰ１を停止し、ポンプＰ２を駆動する。かかる洗浄により、洗浄液は、培養モジュール１０の内室１０ａを経て、培養液容器４の代わりに取り付けられた廃液容器に排出される。
【００５３】
続けて、制御部３０は、培養液容器４からポンプＰ１を介して内室１０ａの入り口１４まで到達する流路を洗浄するため、図１４に示すように、バルブＶ２、Ｖ３およびＶ７を開放し、バルブＶ１，Ｖ４，Ｖ５，およびＶ６を閉止して、ポンプＰ２を駆動し、ポンプＰ１を逆方向に駆動する。この時ポンプＰ１の流量とポンプＰ２の流量とは、ポンプＰ１の流量が、ポンプＰ２の流量と同じまたはそれよりも小さいのが好ましい。ポンプＰ１の流量がポンプＰ２の流量と同じまたはそれよりも小さく、かつ、ベントとしてバルブＶ７が開放された場合には、細胞培養回路２の内部の圧力を適正に保つことができるため、流路の破裂や潰れを防止できる。これにより洗浄液は、当該細胞培養回路２の内部を洗浄すると共に、余剰分の洗浄液が、内室１０ａとバルブＶ７を経由して培養液容器４の代わりに取り付けられた廃液容器に排出される。ポンプＰ１の流量およびポンプＰ２の流量を適切に設定することにより、ステップＳ２０４のうち、図１３および図１４で示す状態による洗浄工程を１つの洗浄工程とすることができると共に、その１つの工程にて内室１０ａの出口１５から培養液容器４までの流路、および培養液容器４からポンプＰ１を介して内室１０ａの入り口１４まで到達する流路を同時に洗浄できる。
【００５４】
ステップＳ１０１（ステップＳ２０１〜Ｓ２０４を含む）を完了することで、細胞を培養する前に、流路や各部を洗浄液で洗浄できる。細胞培養回路２を洗浄することで、培養する細胞に影響する不純物が除去されるため、効率よく細胞を培養できる。
【００５５】
なお、上記ステップＳ１０１の間に洗浄液容器５内の洗浄液が途切れることを防止するため、洗浄液容器５の出口とバルブＶ２との間に、液切れセンサ（不図示）を取り付けてもよい。たとえば、液切れセンサ（不図示）からの検知信号を制御部３０が受けると、制御部３０は、自動的にバルブＶ２を閉止し、ポンプＰ１およびポンプＰ２の少なくとも一方を停止し、液切れを知らせるブザーもしくはランプなどの警報手段、または、入出力部３９の画面上への表示等により、洗浄液がなくなったことをユーザに通知する。ユーザは、洗浄液容器５に新たな洗浄液を補充する、もしくは、洗浄液容器５ごと新品に交換した後、再度スタートする旨、入出力部３９から制御部３０に指示する。かかる指示を制御部３０が受信すると、制御部３０は、ポンプＰ１およびポンプＰ２の少なくとも一方を駆動し、ステップＳ１０１を再開させる。
【００５６】
接着性細胞を培養する場合には、ステップＳ１０１は、さらに、洗浄液容器５から剥離剤容器７までの流路を洗浄するステップを有しているのが好ましい。例えば、洗浄液容器５を剥離剤容器７よりも鉛直方向で高い位置に設けた場合には、制御部３０が、バルブＶ１およびＶ２を開放し、バルブＶ３，Ｖ４，Ｖ５，Ｖ６およびＶ７を閉止して、ポンプＰ１およびＰ２を停止すると、洗浄液は、落差(水頭差)により洗浄液容器５から剥離剤容器７までの流路を洗浄し、剥離剤容器７の代わりに取り付けられた廃液容器（図示せず）に排出される。また、剥離剤が安定な組成であり、細胞培養を行っている間に剥離剤が変化しない場合には、剥離剤容器７をステップＳ１０１の前に細胞培養回路２に接続するのが好ましい。かかる場合には、制御部３０は、ステップＳ１０１の前に、バルブＶ１，Ｖ４およびＶ５を開放し、バルブＶ２，Ｖ３，Ｖ６およびＶ７を閉止して、ポンプＰ２を駆動する。かかる制御により、剥離剤は、剥離剤容器７から回収容器６の代わりに配置された廃液容器までの流路、および、剥離剤容器７からポンプＰ２までの回路を洗浄できる。かかる工程の後、一旦、全てのバルブを閉止し、かつ、ポンプＰ１およびポンプＰ２を停止した後、ステップＳ１０１の洗浄を開始してもよい。なお、浮遊性細胞を培養する場合には、剥離剤容器７を用いないため、この工程は不要である。
【００５７】
ユーザが上記ステップ１０１の終了を確認し、培養液充填ステップをスタートするよう入出力部３９から制御部３０に指示すると、制御部３０は、培養液を内室１０ａおよび外室１０ｂに充填する（ステップＳ１０２：培養液充填ステップ）。
【００５８】
図１５および図１６は、ステップＳ１０２における細胞培養装置１の状態を示すブロック図である。
【００５９】
ステップＳ１０２では、制御部３０は、まず、培養モジュール１０の内室１０ａに培養液を充填し、次に、外室１０ｂに培養液を充填する。制御部３０は、培養モジュール１０の内室１０ａに培養液を充填するために、図１５に示すように、バルブＶ７を開放し、バルブＶ１，Ｖ２，Ｖ３，Ｖ４，Ｖ５およびＶ６を閉止し、ポンプＰ１を駆動し、ポンプＰ２を停止する。培養液容器４内の培養液は、ポンプＰ１およびガス交換機８を介して内室１０ａに培養液を供給する。なお、培養液は、培養モジュール１０の内室１０ａを経て、出口１５から培養液容器４へと循環する。
【００６０】
続いて、制御部３０は、培養モジュール１０の外室１０ｂに培養液を充填するために、図１６に示すように、バルブＶ５を開放し、バルブＶ１，Ｖ２，Ｖ３，Ｖ４，Ｖ６およびＶ７を閉止し、ポンプＰ１を駆動し、ポンプＰ２を停止する。培養液容器４内の培養液は、培養モジュール１０の内室１０ａへ加圧供給されるため、培養液が中空糸１１の膜壁を透過して外室１０ｂに透過することにより、外室１０ｂに培養液が供給される。なお、過剰分の培養液は、回収容器６の代わりに配置された廃液容器に排出される。
【００６１】
ユーザがステップＳ１０２の完了を確認し、細胞充填ステップをスタートするように入出力部３９から制御部３０へ指示すると、制御部３０は、培養モジュール１０の外室１０ｂに細胞を充填する（ステップＳ１０３：細胞充填ステップ）。
【００６２】
ステップＳ１０３では、制御部３０は、バルブＶ１，Ｖ２，Ｖ３，Ｖ６およびＶ７を閉止し、バルブＶ４およびバルブＶ５を開放し、ポンプＰ１およびポンプＰ２を停止させる。その後、バルブＶ４と培養モジュール１０との間に設けられた細胞充填ポート（不図示）に細胞注入用シリンジを自動又は手動で差しこみ、シリンジ内の細胞を培養器の外室１０ｂに注入する。ステップＳ１０３により、培養モジュール１０の外室１０ｂに細胞が充填される。
【００６３】
ユーザが、ステップＳ１０３の完了を確認し、培養液循環ステップをスタートするよう入出力部３９から制御部３０に指示すると、制御部３０は、内室１０ａへの培養液の供給を開始する（ステップＳ１０４：培養液循環ステップ）。
【００６４】
ステップＳ１０４では、培養液容器４から培養モジュール１０の内室１０ａに培養液を循環供給する。具体的には、制御部３０は、図１５に示す様に、バルブＶ７を開放し、バルブＶ１，Ｖ２，Ｖ３，Ｖ４，Ｖ５およびＶ６を閉止し、ポンプＰ１を駆動し、ポンプＰ２を停止する。ステップＳ１０４では、内室１０ａにて循環する培養液が、膜間の圧力差あるいは拡散作用により中空糸１１の膜壁を透過し、外室１０ｂの培養液と置換するため、外室に注入された細胞は、外室１０ｂにて栄養分である培養液を得られる。なお、ステップＳ１０４では、ポンプＰ１の回転数を変更することで、培養液の循環量を増減し、最適な培養状態を維持することができる。ステップＳ１０４は、細胞及び培養液の種類によって、通常１〜３週間、行われる。
【００６５】
また、培養液の循環中に培養液中の酸素濃度が低下すると細胞の活性が低下するため、培養液容器４の培養液を新鮮な培養液と交換することが好ましい。培養液交換時には、ユーザがストップキーを押すことで、制御部３０は、全バルブＶとポンプＰ１を停止する。ユーザが、培養液容器４内の培養液の交換を完了した後、培養工程のスタートスイッチを再び押した場合、あるいは復旧スイッチを押した場合には、ストップキーを押す前の工程に復帰し、制御部３０は、バルブＶ７を開放し、ポンプＰ１を駆動させることで、培養工程を再開させる。培養が終了すると次の回収工程に移行する。培養液の交換時期は、培養液のｐＨを測定することにより判断することもできる。
【００６６】
ユーザがステップＳ１０４を完了し、かつ細胞の回収ステップをスタートするよう入出力部３９から制御部３０に指示すると、制御部３０は、剥離剤の供給を開始する（ステップＳ１０５：回収ステップ）。
【００６７】
図１７および図１８は、ステップＳ１０５における細胞培養装置１の状態を示すブロック図である。
【００６８】
ステップＳ１０５では、制御部３０は、まず、外室１０ｂを剥離剤で満たし、その状態を一定時間維持した後で、培養液を内室１０ａおよび外室１０ｂに供給し、排出口１７から追い出された細胞を回収容器６にて回収する。まず、制御部３０は、図１７に示すように、バルブＶ１，Ｖ４およびＶ５を開放し、バルブＶ２，Ｖ３，Ｖ６およびＶ７を閉止し、ポンプＰ１を停止し、ポンプＰ２を駆動する。ステップＳ１０５では、剥離剤は、剥離剤容器７から、培養モジュール１０の外室１０ｂに供給され、外室１０ｂを充満する。外室１０ｂをオーバーフローした剥離剤は、排出口１７から回収容器６に回収される。なお、浮遊性細胞を培養する場合には、細胞が不織布等の坦体に付着しないため、剥離剤を用いなくてもよい。
【００６９】
次に、制御部３０は、ポンプＰ２からの流量検知信号又はタイマからの信号を受けて、すべてのバルブＶを閉止し、ポンプＰ１およびポンプＰ２を停止して、外室１０ｂに剥離剤を充満させた状態を維持し、剥離剤が内壁と不織布等に細胞を付着させるタンパク質を分解して、細胞を剥離させるまで待機する。待機時間は、細胞及び剥離剤の種類によって決定されるが、通常３〜８分間である。
【００７０】
続いて、タイマからの信号を受けた制御部３０は、図１８のように、バルブＶ３，Ｖ４およびＶ５を開放し、バルブＶ１，Ｖ２，Ｖ６およびＶ７を閉止し、ポンプＰ１を駆動し、ポンプＰ２を停止する。すると、培養液は、培養液容器４から培養モジュール１０の内室１０ａおよび外室１０ｂの両方へ供給され、細胞を外室１０ｂの排出口１７から追い出す。追い出された細胞は、回収容器６にて回収される。培養液を培養モジュール１０の内室１０ａへ供給することで、内室１０ａと外室１０ｂ内の圧力が等しくなるため、培養した細胞が排出口１７から追い出されて、回収容器６にて細胞を回収できる。
【００７１】
なお、ステップＳ１０５においては、培養した細胞が不織布に引っかかり細胞の回収率が低下する場合がある。不織布に引っ掛かった細胞を回収する方法としては、培養モジュール１０を揺動させたり、培養モジュール１０の内室１０ａに供給される培養液を間歇的に加圧してもよい。たとえば、入口１４の手前に、圧力センサ（不図示）を設ける。制御部３０は、その圧力センサ（不図示）からの信号を受けて、入り口１４近傍の流路の圧力が設定圧力を超えるとバルブＶ５を開放し、設定圧力以下になるとバルブＶ５を閉止する。このように、培養モジュール１０の内室１０ａに供給される培養液の圧力を間歇的に変動させることで不織布に引っかかった細胞を取り外すことができる。
【００７２】
さらに、ステップＳ１０５は、膜壁表面に浮遊する細胞を外室１０ｂから追い出すステップを有していてもよい。膜壁表面に浮遊する細胞を外室１０ｂから追い出すためには、タイマからの信号を受けた制御部３０は、バルブＶ５を開放し、バルブＶ１，Ｖ２，Ｖ３，Ｖ４，Ｖ６およびＶ７を閉止し、ポンプＰ１を駆動し、ポンプＰ２を停止する。すると、培養液は、培養液容器４から培養モジュール１０の内室１０ａへ供給する。培養モジュール１０の内室１０ａへ加圧供給された培養液は、中空糸１１の膜壁を透過して外室１０ｂに移行するので、膜壁表面に浮遊する培養細胞を膜壁から剥がすことができる。膜壁から剥がされた細胞は、外室１０ｂから追い出され、排出口１７から回収容器６にて回収される。
【００７３】
ユーザが、ステップＳ１０５の完了を確認し、入出力部３９から制御部３０に廃棄を開始するよう指示すると、全てのバルブＶが開放される。ユーザは、全てのバルブＶが開放されたことを確認した後、細胞培養回路２を細胞培養装置１から取り外すことができる。この際、制御部３０がポンプＰ１およびポンプＰ２を停止し、全てのバルブＶを閉止した状態で、ユーザは、廃棄開始に先立ち、バルブＶ５およびＶ６から細胞回収容器６に至る回路を着脱可能なクリップなどで閉止し、回収容器への万一の汚染を防止することが好ましい。
【００７４】
なお、ステップＳ１０５の後で、回収した細胞をＰＢＳ等の洗浄液により洗浄してもよい。タンパク質分解酵素等の剥離剤が接着因子以外の細胞表面マーカー、チャネルやレセプターまでも分解、破壊し、培養細胞に悪影響を与えるのを防ぐために、回収された剥離剤をＰＢＳ等の洗浄液で置換するのが好ましいからである。たとえば、回収容器６の下部に排水流路を接続し、その排水流路には、細胞の透過を阻止する多孔膜を収容したフィルタを設ける。排水流路により、細胞と一緒に回収された培養液および剥離剤は透過され、廃棄される。溶液中の細胞は、フィルタの表面に堆積する。このフィルタに体積した細胞を、ＰＢＳ等により洗浄するようにしてもよい。
【００７５】
上述の細胞培養装置１を用いることで、初心者であっても容易に細胞培養を行うことができる。ユーザは、各容器に培養液、剥離剤、洗浄剤を用意し、細胞をシリンジに収容する。そして、ユーザは、洗浄ステップＳ１０１、培養液充填ステップＳ１０２、細胞充填ステップＳ１０３、培養ステップＳ１０４および回収ステップＳ１０５を開始するよう、制御部３０に指示するだけ（たとえば、スタートスイッチを押すだけ）で、自動的に各工程が実施されるからである。また全てのステップが密閉系で実施されるため、細胞培養回路２内に雑菌が侵入しにくい。さらに、細胞を注入する前に、洗浄工程を有するため、細胞に有害な不純物を予め除去できる。
【００７６】
３．変形例
以上、本発明の細胞培養装置１および細胞培養方法の実施の形態を説明したが、本発明は、上述の実施の形態に限定されることなく、種々変形を施して実施可能である。たとえば、上述の実施の形態において、剥離剤は必須ではない。また、剥離剤として、洗浄液を用いてもよい。たとえば、浮遊系細胞を培養する場合には、剥離剤を用いなくても良く、剥離剤容器７は、必須ではない。
【００７７】
また、上述の実施の形態では、細胞培養回路２は、制御装置３に脱離可能に取り付けされているが、このような形態に限らない。細胞培養回路２は、制御装置３から取り外しできないような形態であってもよい。また、上述の実施の形態では、ガス交換機８は、細胞培養回路２に設けられていたが、ガス交換機８は、必須ではない。また、ガス交換機８のうち、一部は、細胞培養回路２に設けられ、その他の部分は、制御装置３側に設けられていてもよい。たとえば、ガス透過性の膜から主に成るチューブ（培地が内部を流れる）部分は、細胞培養回路２に設けられて、二酸化炭素や空気等の気体を供給する部分は、制御装置３側に設けられていてもよい。係る場合には、ガス交換機８のうち制御装置３の側に設けられた部分と、細胞培養回路２の側に設けられた部分とが脱離可能であるのが好ましい。
【００７８】
また、上述の実施の形態では、中空糸１１を用いた培養モジュール１０の例を示したが、このような形態に限らない。たとえば、培養モジュール１０は、中空糸１１を用いずに、平膜を用いるモジュールであってもよい。
【００７９】
また、上述の実施の形態では、培養液容器４、洗浄液容器５および剥離剤容器７を培養モジュール１０よりも鉛直方向上方に配置するものとしたが、さらに、回収容器６を培養モジュール１０よりも低い位置に設置し、かつ、廃液容器を回収容器６よりも低い位置に設置するのが好ましい。また、回収容器６と廃液容器との間、および、培養モジュール１０と回収容器６との間に開閉可能な流路を設けるのがより好ましい。かかる場合には、回収容器６と廃液容器との流路および培養モジュール１０と回収容器６との流路を開放することにより、全ての廃液を培養モジュール１０と回収容器６とを経由して廃液容器に集めることが可能なため、回収容器６の代わりに廃液容器を付け替えることなく、ステップＳ１０１を行うことができる。しかる後、回収容器６と廃液容器間の流路を閉止すれば、回収容器６と廃液容器との交換に起因する細胞培養回路２の内部に不純物あるいは雑菌等が侵入するリスクを低減できる。さらに、各流路の開閉には、外部から着脱可能なクランプ類あるいは鉗子などを補助的に用いることで、操作が簡便となる。また、培養液容器４、洗浄液容器５および剥離剤容器７を培養モジュール１０よりも鉛直方向上方に配置することで、剥離剤、洗浄液、培養液をそれぞれ落差(水頭)で流すことができるので、細胞培養回路２の内部の洗浄と置換が可能であり、最終的に洗浄に使用した液体はすべて廃液容器に集められる。
【００８０】
また、上述の実施の形態では、１つの流路の閉止あるいは開放を切り替えられるバルブＶを用いたが、このような形態に限らない。たとえば、バルブとして、多方活栓４０を用いることができる。図１９は、多方活栓４０の構造の一例を示す分解斜視図である。
【００８１】
多方活栓４０は、たとえば、パルスモータ４１、仕切板４３、クランプ５０、栓部６０を主に備える。パルスモータ４１は、上方に延出する回転軸４２を有している。パルスモータ４１は、予め決めたパルス数に相当する角度だけ回転軸４２を回転させることが可能である。なお、制御部３０は、パルスモータ４１の制御部として機能してもよく、制御部３０は各ステップに応じて、回転軸４２の長軸を軸として回転軸４２を回転させることができる。
【００８２】
パルスモータ４１の上部に位置する仕切板４３は、穴部４４を有し、その穴部４４からパルスモータ４１の回転軸４２が延出している。また、仕切板４３上には、スイッチ４５，４６が配置されている。
【００８３】
図２０は、多方活栓４０のうち、クランプ５０と栓部６０とを組み合わせた状態の斜視図である。
【００８４】
クランプ５０は、略円形の台座部５１を有し、その台座部５１の裏側中心には、凹部５２がある。この凹部５２には、パルスモータ４１の回転軸４２が嵌合する。したがって、回転軸４２が回転すると、クランプ５０も回転軸４２と一体的に回転する。クランプ５０は、さらに、台座部５１の中心からクランプ５０の径方向外側に向かって伸びる一本の押圧部材５３を備える。押圧部材５３の長さは、クランプ５０が回転した場合に、スイッチ４５，４６に届く長さである。また、台座部５１上面には、４本の把持柱５４が立設されている。
【００８５】
また、４本の把持柱５４に囲まれるように、把持柱５４よりも短い柱状部５５を有する。把持柱は、ゴムのように柔軟性に富みかつ摩擦係数の高い材料で外周が構成されているのが好ましく、たとえば、芯としてねじを用いて、そのねじに、回動部材６１の側面との隙間を十分に埋めることができる厚さを有する筒体を被せることで好適に構成される。ゴムよりも硬度の高い樹脂（例えば、フッ素樹脂）から成る筒の外表面にゴムをコートした多層構造の把持柱であってもよい。芯を金属製にし、その芯の外周に芯材よりも硬度の低い材料（たとえば、樹脂）で構成することにより、把持柱５４は、それぞれ、回動部材６１を強くグリップでき、かつ回動部材６１の表面において滑りにくくなる。回動部材６１は、把持柱５４にて着脱自在なので、大きさ若しくは形状等に関わらず市販の三方活栓を栓部６０として用いることができる。
【００８６】
把持柱５４は、略十字状の回動部材６１をグリップする。また、芯体６２は、上側から見た場合に、平面上で互いに直角である３方向に開となるＴ字状の流路６３を有する。栓部６０は、略十字状の回動部材６１および略中央に上方へ伸びる芯体６２を有する。芯体６２と流路６３とは、回転しないように固定されている。一方、芯体６２の内部には、略十字状の回動部材６１に固着されたＴ字状の流路を有する円筒が、シールを介して、回転可能に芯体６２と液密的に接合されている。この例では回動部材６１の回転により、回動部材６１に固着された円筒のＴ字状の流路が回転し、芯体６２より３方向に伸びる流路６３のＴ字状の流路と一致したときに、その方向に流通する。また回動部材６１が、芯体６２より外部３方向に伸びる流路６３に対し４５度程傾いた位置にある場合、流路は全閉となる。
【００８７】
図２１〜２３は、上面から見た場合の、クランプ５０の回転運動に応じた回動部材６１の向きと、それに固着された円筒のＴ字状の流路と、芯体６２より外部３方向にＴ字状に伸びる流路６３との流通状態を説明する平面図である。図２１〜２３では、右側の図の破線によって示される部分が、回動部材６１に固着された円筒内のＴ字状の流路６３であり、回動部材６１の長軸方向と、その左側に開口したＴ字状の流路を有している。また図中の「管１」、「管２」、「管３」は、流路６３の端部が「管１」、「管２」または「管３」の方向を向いている場合に流路６３と接続される管を示している。
【００８８】
図２１に示す位置では、流路６３は、管２と管３とを流通させ、管１は閉止状態にある。図２１に示す状態からクランプ５０が時計の針と反対方向に９０度回転すると、図２２に示す状態になる。図２２に示す状態の場合、流路６３は、管１と管３とを流通させる。また、図２２に示す状態から、クランプ５０がさらに半時計方向に９０度回転すると、図２３に示す状態となり、流路６３は、管１と管２とを流通させる。
【００８９】
上述のような三方活栓を用いた場合、本来手動にて使用する三方活栓を電動により回転させ、流路６３の開閉を切り換えることができる。例えば、管１を培養モジュール１０に接続し、管２を洗浄剤容器５に、管３を培養液容器４に接続する。管１と管３をつなぐ流路６３を正確に開放状態とする必要がある場合には、クランプ５０を正確に９０度回転させるためのパルス数だけパルスモータ４１を回転させなければならない。このため、角度ゼロの状態であるかどうか不確定であるクランプ５０を数〜数十パルス分だけ時計の針と反対方向に回転させ、その位置から押圧部材５３がスイッチ４５を押し込むまで、クランプ５０を時計の針と同方向に回転させる。スイッチ４５が押し込まれてパルスモータ４１が停止したときのクランプ５０の位置は、確実に角度ゼロの位置である。この状態から角度９０度に相当するパルス数だけクランプ５０を回転させる。この結果、図２１に示すクランプ５０の状態は、正確に９０度回転した状態となり、管１と管３とを結ぶ流路６３は完全に開の状態となる。なお、流量の正確さを必要としない場合には、上述の方法を採用しなくてもよい。
【００９０】
また、上述の実施の形態では、各ステップのスタート指示を入出力部３９から制御部３０が受け取った場合に、各ステップを実行するような形態としたが、このような形態に限らない。たとえば、制御部３０は、所定のステップが完了したことを確認した後、あるいは、所定の時間が経過後に、自動的に次のステップを開始してもよい。
【００９１】
また、上記実施の形態に係る細胞培養装置１の制御部３０を動作させるプログラムは、制御部３０が有するＲＡＭあるいはＲＯＭ等に記憶されるが、これらのプログラムは、これらの装置の出荷前に記憶されたものであっても、これらの機器の出荷後に記憶されたものであってもよい。また、これらのプログラムの一部が、これらの機器の出荷後に記憶されたものであってもよい。このように出荷後に細胞培養装置１の制御部が有するメモリに記憶されるプログラムは、たとえばＣＤ−ＲＯＭや半導体メモリなどのコンピュータ読取可能な記録媒体に記憶されているものをインストールしたものであっても、インターネットなどの伝送媒体を介してサーバ装置などからダウンロードしたものであってもよい。
【００９２】
また、上記実施の形態に係る細胞培養装置１のメモリに記憶されるプログラムおよび各種のデータは、その一部あるいは全部が、コンピュータ以外のたとえばＨＤＤなどの外部記憶デバイスや、細胞培養装置１と着脱可能なたとえばメモリカードやＣＤ−ＲＯＭに記憶されていてもよい。
【００９３】
また、上記実施の形態に係る細胞培養装置１を構成する各部の機能は、全てまたはその一部をソフトウェアによって実現しても、あるいはその少なくとも一部をハードウェアで実現しても良い。例えば、制御部３０における処理の全部またはその一部は、１または複数のプログラムによりコンピュータ上で実現してもよく、その少なくとも一部をハードウェアで実現してもよい。
【００９４】
また、上記実施の形態おける細胞培養装置１の全部または一部として動作させるためのコンピュータプログラムを、メモリカードあるいはＣＤ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納して配布し、これを別のコンピュータ、例えば、携帯電話、オーディオ機器、電子時計等にインストールし、細胞培養装置１として動作させ、あるいは、細胞培養装置１が行なう工程の一部または全部を実行させてもよい。さらに、インターネット上のサーバ装置が有するディスク装置等にプログラムを格納しておき、例えば、搬送波に重畳させて、細胞培養装置１の制御部３０となるコンピュータにダウンロード等するものとしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明は、細胞を培養するための細胞培養装置に適用できる。
【符号の説明】
【００９６】
１・・・細胞培養装置
２・・・細胞培養回路
３・・・制御装置
４・・・培養液容器（細胞培養回路の一部）
５・・・洗浄液容器（細胞培養回路の一部）
１０・・・培養モジュール（細胞培養回路の一部）
３０・・・制御部（制御装置の一部）
４０・・・多方活栓
４１・・・パルスモータ（駆動源）
４２・・・回転軸
５０・・・クランプ
５４・・・把持柱
６０・・・栓部
６１・・・回動部材
６３・・・流路
Ｐ１，Ｐ２・・・ポンプ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外室および内室に区画された培養モジュールと、
上記培養モジュールに供給するための培養液を収納する培養液容器と、
上記培養モジュールを洗浄するための洗浄液を収納する洗浄液容器と、
上記培養液および上記洗浄液を供給するためのポンプと、
上記ポンプの制御を行う制御部と、を有し、
上記洗浄液は、少なくとも、細胞を培養する前に供給されることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記培養モジュール、前記培養液容器および前記洗浄液容器を含む培養用回路全体は、
前記ポンプおよび前記制御部を有する制御装置に脱着可能に取り付けられることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の細胞培養装置であって、
前記制御部は、前記培養液を供給する場合の流速と、前記洗浄液を供給する場合の流速とを変えることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養装置であって、
前記培養液容器および前記洗浄液容器の少なくとも一方は、前記培養モジュールよりも反重力方向側に配置されることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞培養装置であって、
さらに、前記培養モジュールと各部とを接続する流路には、バルブが設けられ、
上記バルブは、複数方向に突出する管と、流体の流路を切り換えるための回動可能な回動部材とを備える栓部に取り付けられることにより、当該栓部を固定して上記回動部材を回動させる多方活栓切換装置であって、
上記回動部材に対して回動駆動力を与えるための駆動源と、
上記駆動源の回転軸に接続され、上記回動部材を把持する１以上の把持柱を備えるクランプと、を備え、
前記制御部は、上記駆動源の回動動作を制御すると共に、
上記クランプは、前記制御部により制御された上記駆動源の回動動作に基づき上記回動部材を回動させることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項６】
培養液を充填する前に、外室および内室に区画された培養モジュールを洗浄する洗浄ステップと、
培養液を培養モジュールに充填する培養液充填ステップと、
上記外室に細胞を注入する細胞充填ステップと、
上記培養液を上記内室へ供給しながら細胞を培養する培養ステップと、
上記培養モジュールにて培養した細胞を回収する回収ステップと、を有することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項７】
入力手段からの入力により、
培養液を充填する前に、外室および内室に区画された培養モジュールに洗浄液を供給する洗浄ステップと、
培養液を培養モジュールに供給する培養液充填ステップと、
上記培養液を上記内室へ供給しながら細胞を培養する培養ステップと、
細胞を剥がすための剥離剤、上記洗浄剤および上記培養液の少なくとも１つを上記培養モジュールに供給する回収ステップと、
を制御部に実行させることを特徴とする細胞培養用プログラム。
【請求項１】
外室および内室に区画された培養モジュールと、
上記培養モジュールに供給するための培養液を収納する培養液容器と、
上記培養モジュールを洗浄するための洗浄液を収納する洗浄液容器と、
上記培養液および上記洗浄液を供給するためのポンプと、
上記ポンプの制御を行う制御部と、を有し、
上記洗浄液は、少なくとも、細胞を培養する前に供給されることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養装置であって、
前記培養モジュール、前記培養液容器および前記洗浄液容器を含む培養用回路全体は、
前記ポンプおよび前記制御部を有する制御装置に脱着可能に取り付けられることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の細胞培養装置であって、
前記制御部は、前記培養液を供給する場合の流速と、前記洗浄液を供給する場合の流速とを変えることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養装置であって、
前記培養液容器および前記洗浄液容器の少なくとも一方は、前記培養モジュールよりも反重力方向側に配置されることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞培養装置であって、
さらに、前記培養モジュールと各部とを接続する流路には、バルブが設けられ、
上記バルブは、複数方向に突出する管と、流体の流路を切り換えるための回動可能な回動部材とを備える栓部に取り付けられることにより、当該栓部を固定して上記回動部材を回動させる多方活栓切換装置であって、
上記回動部材に対して回動駆動力を与えるための駆動源と、
上記駆動源の回転軸に接続され、上記回動部材を把持する１以上の把持柱を備えるクランプと、を備え、
前記制御部は、上記駆動源の回動動作を制御すると共に、
上記クランプは、前記制御部により制御された上記駆動源の回動動作に基づき上記回動部材を回動させることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項６】
培養液を充填する前に、外室および内室に区画された培養モジュールを洗浄する洗浄ステップと、
培養液を培養モジュールに充填する培養液充填ステップと、
上記外室に細胞を注入する細胞充填ステップと、
上記培養液を上記内室へ供給しながら細胞を培養する培養ステップと、
上記培養モジュールにて培養した細胞を回収する回収ステップと、を有することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項７】
入力手段からの入力により、
培養液を充填する前に、外室および内室に区画された培養モジュールに洗浄液を供給する洗浄ステップと、
培養液を培養モジュールに供給する培養液充填ステップと、
上記培養液を上記内室へ供給しながら細胞を培養する培養ステップと、
細胞を剥がすための剥離剤、上記洗浄剤および上記培養液の少なくとも１つを上記培養モジュールに供給する回収ステップと、
を制御部に実行させることを特徴とする細胞培養用プログラム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公開番号】特開２０１１−１０３８８２（Ｐ２０１１−１０３８８２Ａ）
【公開日】平成２３年６月２日（２０１１．６．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５５２５３（Ｐ２０１０−２５５２５３）
【出願日】平成２２年１１月１５日（２０１０．１１．１５）
【出願人】（５１０３０２８１４）
【出願人】（５１０３０２８２５）
【出願人】（５１０３０２９３９）
【出願人】（５１０３０２８３６）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月２日（２０１１．６．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１５日（２０１０．１１．１５）
【出願人】（５１０３０２８１４）
【出願人】（５１０３０２８２５）
【出願人】（５１０３０２９３９）
【出願人】（５１０３０２８３６）
【Ｆターム（参考）】
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