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細胞増殖性疾患分析のための方法および核酸
説明

細胞増殖性疾患分析のための方法および核酸

【課題】肝細胞増殖性障害を検出するか、または検出して区別する、あるいは結腸直腸細胞増殖性障害を検出するか、または検出して区別する方法、核酸およびキットを提供する。
【解決手段】被検者から単離された生物学的試料中のセプチン9(その転写変異体全てを含む)、FOXL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FATおよび特定の配列を有する少なくとも1つの遺伝子またはゲノム配列の発現レベルを決定することを含み、過小発現および/またはCpGメチル化が前記疾患の存在またはクラスの指標である被検者の細胞増殖性疾患を検出および/または分類する方法。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
被検者から単離された生物学的試料中のセプチン9(その転写変異体全てを含む)、FOXL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FATおよび配列番号160〜配列番号165からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子またはゲノム配列の発現レベルを決定することを含み、過小発現および/またはCpGメチル化が前記疾患の存在またはクラスの指標である被検者の細胞増殖性疾患を検出および/または分類する方法。
【請求項2】
新生物の細胞増殖性疾患は、良性細胞増殖性疾患と区別され、CpGメチル化の過小発現および/または存在が新生物の細胞増殖性疾患の存在の指標であり、その非存在は良性細胞増殖性疾患の存在の指標であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項3】
前記細胞増殖性疾患は癌である、請求項1記載の方法。
【請求項4】
前記細胞増殖性疾患は肝細胞性癌腫または結腸直腸癌腫である、請求項3記載の方法。
【請求項5】
前記発現レベルは前記遺伝子から転写されたmRNAの存在、非存在またはレベルを検出することによって決定される、請求項1〜4のいずれかに記載される方法。
【請求項6】
前記発現レベルは前記遺伝子またはその配列がコードするポリペプチドの存在、非存在またはレベルを検出することによって決定される、請求項1〜4のいずれかに記載される方法。
【請求項7】
前記ポリペプチドはウェスタンブロット分析、クロマトグラフィー、免疫測定、ELISA免疫測定、放射線免疫測定、抗体およびこれらの組合せからなる群から選択される1つまたは複数の手段によって検出される、請求項6記載の方法。
【請求項8】
前記発現は前記遺伝子内のCpGメチル化の存否を検出することによって決定され、メチル化の存在が細胞増殖性疾患の存在を示す、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
ゲノムDNAの少なくとも1つの標的領域内のメチル化および非メチル化CpGジヌクレオチドを区別する少なくとも1つの試薬または一連の試薬に、前記被検者から得た生物学的試料から単離されたゲノムDNAを接触させることを含み、標的領域はそれぞれ配列番号1〜配列番号3、配列番号24、配列番号28、配列番号159〜配列番号167からなる群から選択される少なくとも1つの配列の少なくとも16個の近接するヌクレオチドの1つの配列を含むか、あるいはこれにストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、前記近接するヌクレオチドは少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列を含み、それによって少なくとも部分的に細胞増殖性疾患を検出および/または分類することができる被検者の細胞増殖性疾患を検出および/または分類する方法。
【請求項10】
下記工程:
a.被検者から得た生物学的試料からゲノムDNAを抽出またはそうでなければ単離し;
b.a)におけるゲノムDNAまたはその断片を、その5−位で非メチル化されているシトシン塩基をウラシルまたはハイブリダイゼーション特性においてシトシンと区別して検出できる他の塩基に変換する1つまたは複数の試薬で処理し;
c.処理されたゲノムDNAまたは処理されたその断片を、増幅酵素および配列番号10〜配列番号15、配列番号28〜配列番号33、配列番号30〜31、配列番号42〜配列番号43、配列番号38〜配列番号39、配列番号50〜配列番号51、配列番号168〜配列番号203からなる群から選択される配列およびこれらの相補鎖に相補的であるか、あるいは中程度にストリンジェント、またはストリンジェントな条件下にハイブリダイズする少なくとも9個のヌクレオチドの近接する配列を含む少なくとも1つのプライマーと接触させ、処理されたゲノムDNAまたはその断片は少なくとも1つの増幅産物を生成するように増幅されるか、あるいは増幅されず、そして
d.前記増幅産物の存否または特性に基づいて、配列番号1〜配列番号3、配列番号24、配列番号28、配列番号159〜配列番号167からなる群から選択される配列の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態またはレベル、または配列番号1〜配列番号3、配列番号24、配列番号28、配列番号159〜配列番号167からなる群から選択される配列の複数のCpGジヌクレオチドの平均メチル化状態またはレベル、または平均メチル化状態またはレベルを反映する値を決定し、それにより少なくとも部分的に細胞増殖性疾患を検出および分類することのうちの少なくとも1つを行う;
ことを含む細胞増殖性疾患を検出および/または分類する方法。
【請求項11】
b)において、ゲノムDNAまたはその断片を処理することは、重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩およびこれらの組合せからなる群から選択される試薬の使用を含む、請求項9記載の方法。
【請求項12】
c)において、接触または増幅することは、増幅酵素としての耐熱性DNAポリメラーゼの使用;5'−3'エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼの使用;ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用;検出可能な標識を有する増幅産物核酸分子の生成を含む群から選択される少なくとも1つの方法の使用を含む、請求項9記載の方法。
【請求項13】
被検者から得られた生物学的試料は、セルライン、組織学スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、糞便、結腸溶出液、尿、血漿、血清、全血、単離された血球、血液から単離された細胞およびこれらの組合せを含む群から選択される、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
d)において、さらに配列番号10〜配列番号15、配列番号28〜配列番号33、配列番号30〜配列番号31、配列番号42〜配列番号43、配列番号38〜配列番号39、配列番号50〜配列番号51、配列番号168〜配列番号203からなる群から選択される配列およびこれらの相補鎖に相補的であるか、あるいは中程度にストリンジェントまたはストリンジェントな条件下にハイブリダイズする長さ少なくとも9個のヌクレオチドの近接する配列を各ケースで含む少なくとも1つの核酸分子またはペプチド核酸の使用を含み、前記核酸分子またはペプチド核酸分子はそれがハイブリダイズする核酸の増幅を抑制する、請求項10記載の方法。
【請求項15】
d)において決定することは、配列番号10〜配列番号15、配列番号28〜配列番号33、配列番号30〜配列番号31、配列番号42〜配列番号43、配列番号38〜配列番号39、配列番号50〜配列番号51、配列番号168〜配列番号203からなる群から選択される配列およびその相補鎖に相補的であるか、あるいは中程度にストリンジェントまたはストリンジェントな条件下にハイブリダイズする少なくとも長さ9個のヌクレオチドの近接する配列を含む各ケースでの少なくとも1つの核酸分子またはペプチド核酸のハイブリダイゼーションを含む、請求項10記載の方法。
【請求項16】
このようにハイブリダイズする少なくとも1つの核酸分子またはペプチド核酸分子は固相に結合されている、請求項15記載の方法。
【請求項17】
さらに少なくとも1つのヌクレオチド塩基によって、このようにハイブリダイズする少なくとも1つの核酸分子を伸長することを含む、請求項15記載の方法。
【請求項18】
d)において決定することは、増幅産物の配列決定を含む、請求項10記載の方法。
【請求項19】
c)において接触または増幅することは、メチル化特異的プライマーの使用を含む、請求項10記載の方法。
【請求項20】
下記工程:
a.被検者から得た生物学的試料からゲノムDNAを抽出またはそうでなければ単離し;
b.a)におけるゲノムDNAまたはその断片を1つまたは複数のメチル化感受性制限酵素で消化し;b)のDNA制限酵素消化物を増幅酵素および配列番号1〜配列番号3、配列番号24、配列番号28、配列番号159〜配列番号167から選択される配列の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含む配列の増幅に適した少なくとも2つのプライマーと接触させ;そして、
c.増幅産物の存否に基づいて、配列番号1〜配列番号3、配列番号24、配列番号28、配列番号159〜配列番号167からなる群から選択される配列の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態またはレベルを決定し、それにより少なくとも部分的に、細胞増殖性疾患を検出および分類することのうちの少なくとも1つを行う;
ことを含む細胞増殖性疾患を検出および/または分類する方法。
【請求項21】
増幅産物の存否は配列番号1〜配列番号3、配列番号24、配列番号28、配列番号159〜配列番号167から選択される配列の少なくとも長さ16塩基長セグメントと同一であるか、相補的であるか、またはストリンジェントまたは高度にストリンジェントな条件下にハイブリダイズする少なくとも1つの核酸またはペプチド核酸へのハイブリダイゼーションによって決定される、請求項20記載の方法。
【請求項22】
ゲノム配列番号1〜配列番号3、配列番号24、配列番号28、配列番号159〜167から誘導された処理核酸であって、該処理はゲノムDNA配列の少なくとも1つの非メチル化シトシン塩基をウラシルまたはハイブリダイゼーションにおいてシトシンと区別して検出できる他の塩基に変換するのに適している処理された核酸。
【請求項23】
配列番号10〜配列番号15、配列番号28〜配列番号33、配列番号30〜配列番号31、配列番号42〜配列番号43、配列番号38〜配列番号39、配列番号50〜配列番号51、配列番号168〜配列番号203からなる群から選択される処理されたゲノムDNA配列およびこれらに相補的な配列の少なくとも16個の近接するヌクレオチドを含み、該処理はゲノムDNA配列の少なくとも1つの非メチル化シトシン塩基をウラシルまたはハイブリダイゼーションにおいてシトシンと区別して検出できる他の塩基に変換するのに適している処理された核酸。
【請求項24】
配列番号10〜配列番号15、配列番号28〜配列番号33、配列番号30〜配列番号31、配列番号42〜配列番号43、配列番号38〜配列番号39、配列番号50〜配列番号51、配列番号168〜配列番号203からなる群から選択される処理されたDNA配列およびこれらに相補的な配列の少なくとも50個の近接するヌクレオチドを含む核酸。
【請求項25】
近接する塩基配列は少なくとも1つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチド配列を含む、請求項22〜24のいずれかに記載の核酸。
【請求項26】
診断手段として、配列番号1〜配列番号3、配列番号24、配列番号28、配列番号159〜配列番号167、配列番号10〜配列番号15、配列番号28〜配列番号33、配列番号30〜配列番号31、配列番号42〜配列番号43、配列番号38〜配列番号39、配列番号50〜配列番号51、配列番号168〜配列番号203からなる群から選択される核酸配列およびそれらに相補的な配列の少なくとも16個の近接するヌクレオチドを含む核酸。
【請求項27】
(a)セプチン9(その転写変異体全てを含む)、FOXL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FATおよび配列番号160〜配列番号165からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子またはゲノム配列の転写産物に、ストリンジェントまたは中程度にストリンジェントな条件下にハイブリダイズすることができる複数のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド;(b)オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよび転写産物を含む患者の生物学的試料を収容するのに適した容器、ここで、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは転写産物にストリンジェントまたは中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる;(c)(b)におけるハイブリダイゼーションを検出するための手段;および所望により、(d)使用のための指示書およびキット結果の解説書を含む、請求項3記載の方法を実施するのに適したキット。
【請求項28】
(a)セプチン9(その転写変異体全てを含む)、FOXL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FATおよび配列番号160〜配列番号165からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子またはゲノム配列のポリペプチドを検出するための手段;(b)前記手段およびポリペプチドを含む患者の生物学的試料を収容するのに適した容器、ここで該手段はポリペプチドと複合体を形成することができる;(c)(b)の複合体を検出するための手段を含む、請求項5記載の方法を実施するのに適したキット。
【請求項29】
(a)重亜硫酸塩試薬;(b)前記重亜硫酸塩試薬および患者の生物学的試料を収容するのに適した容器;(c)その配列が各ケースで、配列番号10〜配列番号15、配列番号28〜配列番号33、配列番号30〜配列番号31、配列番号42〜配列番号43、配列番号38〜配列番号39、配列番号50〜配列番号51、配列番号168〜配列番号203から選択される配列の9塩基長またはより好ましくは18塩基長セグメントと同一であるか、相補的であるか、あるいはストリンジェントまたは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする2つのオリゴヌクレオチドを含む少なくとも1セットのオリゴヌクレオチドを含む、請求項9記載の方法を実施するのに適したキット。
【請求項30】
(a)メチル化感受性制限酵素試薬;(b)前記試薬および患者の生物学的試料を収容するのに適した容器;(c)配列番号1〜配列番号3、配列番号24、配列番号28、配列番号159〜配列番号167から選択される配列の少なくとも9塩基長セグメントと同一であるか、相補的であるか、あるいはストリンジェントまたは高度にストリンジェントな条件下にハイブリダイズする1つまたは複数の核酸またはペプチド核酸を含む少なくとも1セットのオリゴヌクレオチドを含む、請求項9記載の方法を実施するのに適したキット。
【請求項31】
細胞増殖性疾患の診断および/または分類における請求項1〜21記載の方法、請求項22〜26記載の核酸および/または請求項27〜30記載のキットの使用。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【図12】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【図16】
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【図17】
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【図18】
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【図19】
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【図20】
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【図21】
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【図22】
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【図23】
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【図24】
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【図25】
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【図26】
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【図27】
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【図28】
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【図29】
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【図30】
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【図31】
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【図32】
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【図33】
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【図34】
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【図35】
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【図36】
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【図37】
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【公開番号】特開2013−90629(P2013−90629A)
【公開日】平成25年5月16日(2013.5.16)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−247015(P2012−247015)
【出願日】平成24年11月9日(2012.11.9)
【分割の表示】特願2008−506752(P2008−506752)の分割
【原出願日】平成18年4月17日(2006.4.17)
【出願人】(500247105)エピゲノミクス アーゲー (15)
【Fターム(参考)】