細菌で発現させる抗体融合タンパク質の質および収量を改善するために最適化された抗体のＤＮＡ配列およびそのタンパク質配列
本発明の目的は、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）抗体断片をコードする、最適化されたＤＮＡ塩基配列を提供することである。この新規な配列により、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ融合タンパク質だけでなく、恐らく、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）を含む他の融合タンパク質を細菌で発現させる場合においても、望ましくない副産物の生成を防ぐことができる。特質的なコドンを置換することにより、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡのｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）ドメインのＤＮＡ塩基配列を変異させて、タンパク質の翻訳が内部から開始されるのを防ぐ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
抗体毒素ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡは、遺伝子融合により緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａの末端切断型断片と連結した、ＥｒｂＢ２特異的抗体ＦＲＰ５由来の一本鎖抗体断片からなる組換え融合タンパク質である。ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、動物モデルおよび癌患者において、ＥｒｂＢ２を発現する癌細胞に対して選択的かつ高い抗腫瘍活性を示すことが文献に詳細に記載されている。現在の方法論を用いて大腸菌発現系でｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡを産生すると、主生成物である完全なｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡに加えて、副産物として末端切断型ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ断片が生じる。これまで古典的なタンパク質精製技術では、この望ましくない断片を完全に除去することはできなかった。
【０００２】
本発明の目的は、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）抗体断片をコードする、最適化されたＤＮＡ塩基配列を提供することである。この新規な配列により、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ融合タンパク質だけでなく、恐らく、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）を含む他の融合タンパク質を細菌で発現させる場合においても、望ましくない副産物の生成を防ぐことができる。特質的なコドンを置換することにより、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡのｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）ドメインのＤＮＡ塩基配列を変異させて、タンパク質の翻訳が内部から開始されるのを防ぐ。
【背景技術】
【０００３】
ほとんどの臓器の上皮細胞では、受容体型チロシンキナーゼＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）の発現レベルは一般的に低い。しかし、いくつかの癌腫においては、多くの場合遺伝子増幅の結果、ＥｒｂＢ２の発現が著しく亢進している。受容体型チロシンキナーゼＥｒｂＢ２が、多くの上皮由来の腫瘍で選択的優位に発現していること、細胞外間隙から接近しやすいこと、および癌化プロセスに関与することから、ＥｒｂＢ２は、標的化癌治療のターゲットとして望ましい。
【０００４】
毒素が本来有する細胞結合ドメインが欠失した末端切断型緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ誘導体に基づいて、この毒素をＥｒｂＢ２にターゲティングさせるために、ＥｒｂＢ２特異的なモノクローナル抗体ＦＲＰ５の一本鎖Ｆｖ抗体断片を用いた組換え毒素が開発された（非特許文献１）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞致死実験において、細菌で発現させたこのｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ分子は、乳癌腫および卵巣癌腫（非特許文献１〜３）、扁平上皮癌（非特許文献４および５）、および前立腺癌腫（非特許文献６）を含む広範囲の株化ヒト腫瘍細胞および初代培養ヒト腫瘍細胞に対して強力な抗腫瘍活性を示した。実験動物においても、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡは、生着したヒト腫瘍異種移植片（非特許文献１および３〜５）、ならびにヒトｃ−ｅｒｂＢ２コンストラクトが安定導入されたマウスおよびラットの腫瘍細胞（非特許文献７および８）の増殖を効果的に抑制した。癌患者に対して、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡを、ＥｒｂＢ２を発現する腫瘍の皮膚病変へ腫瘍内投与したところ、６０％の患者で反応が見られた。その内訳として、４０％の患者では、処置した腫瘍で腫瘍結節の完全な退縮が見られ、残りの２０％では、処置した腫瘍で腫瘍の部分的な縮小が見られた（非特許文献９）。最近行われたフェーズＩ臨床試験において、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡを静脈注射した際の最大耐用量（ＭＴＤ）、用量規定毒性および種々の薬物動態パラメーターが調べられた（非特許文献１０）。その結果、１８人の患者のうち３人で病状が安定し、別の３人の患者では症状において臨床的効果の兆候が見られた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Wels W, Harwerth IM, Mueller M, Groner B, Hynes NE. Selective inhibition of tumor cell growth by a recombinant single-chain antibody-toxin specific for the erbB-2 receptor. Cancer Res 1992;52:6310-7.
【非特許文献２】Spyridonidis A, Schmidt M, Bernhardt W, et al. Purging of mammary carcinoma cells during ex vivo culture of CD34+ hematopoietic progenitor cells with recombinant immunotoxins. Blood 1998;91:1820-7.
【非特許文献３】Schmidt M, McWatters A, White RA, et al. Synergistic interaction between an anti-p185HER-2 Pseudomonas exotoxin fusion protein [scFv(FRP5)-ETA] and ionizing radiation for inhibiting growth of ovarian cancer cells that overexpress HER-2. Gynecol Oncol 2001;80:145-55.
【非特許文献４】Wels W, Beerli R, Hellmann P, et al. EGF receptor and p185erbB-2-specific single-chain antibody toxins differ in their cell-killing activity on tumor cells expressing both receptor proteins. Int J Cancer 1995;60:137-44.
【非特許文献５】Azemar M, Schmidt M, Arlt F, et al. Recombinant antibody toxins specific for ErbB2 and EGF receptor inhibit the in vitro growth of human head and neck cancer cells and cause rapid tumor regression in vivo. Int J Cancer 2000;86:269-75.
【非特許文献６】Wang L, Liu B, Schmidt M, Lu Y, Wels W, Fan Z. Antitumor effect of an HER2-specific antibody-toxin fusion protein on human prostate cancer cells. Prostate 2001;47:21-8.
【非特許文献７】Altenschmidt U, Schmidt M, Groner B, Wels W. Targeted therapy of schwannoma cells in immunocompetent rats with an erbB2-specific antibody-toxin. Int J Cancer 1997;73:117-24.
【非特許文献８】Maurer-Gebhard M, Schmidt M, Azemar M, et al. Systemic treatment with a recombinant erbB-2 receptor-specific tumor toxin efficiently reduces pulmonary metastases in mice injected with genetically modified carcinoma cells. Cancer Res 1998;58:2661-6.
【非特許文献９】Azemar M, Djahansouzi S, Jager E, et al. Regression of cutaneous tumor lesions in patients intratumorally injected with a recombinant single-chain antibody-toxin targeted to ErbB2/HER2. Breast Cancer Res Treat 2003;82:155-64.
【非特許文献１０】von Minckwitz G, Harder S, Hovelmann S, et al. Phase I clinical study of the recombinant antibody-toxin scFv(FRP5)-ETA specific for the ErbB2/HER2 receptor in patients with advanced solid malignomas. Breast Cancer Res 2005;7:R617-R26.
【非特許文献１１】Wels W, Harwerth IM, Zwickl M, Hardman N, Groner B, Hynes NE. Construction, bacterial expression and characterization of a bifunctional single-chain antibody-phosphatase fusion protein targeted to the human erbB-2 receptor. Biotechnology (NY) 1992;10:1128-32.
【非特許文献１２】Harwerth IM, Wels W, Marte BM, Hynes NE. Monoclonal antibodies against the extracellular domain of the erbB-2 receptor function as partial ligand agonists. J Biol Chem 1992;267:15160-7.
【非特許文献１３】Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C Sequences of proteins of immunological interest, 5 edition, Vol. 1. Washington: U.S. Department of Health and Human Services, 1991.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ヒト患者の治療に用いる治療用タンパク質製剤は、規制当局から承認を受けるために、純度および均質性の面で非常に高い基準を満たさなければならない。副産物が混在する活性化合物の製剤は、患者に対して毒性反応などの副作用をもたらす可能性、および／または望ましくない免疫応答を誘導する可能性がある。したがって、このような副産物を技術的に可能な限り除去する必要があり、副産物が残存する場合は、副産物毎に、見込まれる生物活性を、または生物活性がないことを示さなければならない。その結果、このような望ましくない副産物を除去するために高度かつ高価な精製技術が必要となり、かつ／または特定の副産物を除去できない場合はさらなる試験が必要となるため、生産コストが著しく増加する。
【０００７】
ｉｎ ｖｉｖｏ投与用のｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ抗体毒素を生成するために、これまでのところ、主として細菌発現系の発現ベクターｐＳＷ２２０−５が使用されてきた（非特許文献７）。このプラスミドは、野生型毒素の第２５２〜６１３番目のアミノ酸残基で示される末端切断型緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ（ＥＴＡ）と遺伝子的に融合した、モノクローナル抗体ＦＲＰ５由来のＥｒｂＢ２特異的なｓｃＦｖ抗体断片ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）（非特許文献１１および１２）からなる融合タンパク質をコードする。上記融合タンパク質の精製および検出用に、プラスミドｐＳＷ２２０−５のｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ発現ユニットは、２つのヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）クラスターおよびＮ末端ＦＬＡＧタグをそれぞれコードする配列をさらに含む（図１Ａ）。ｐＳＷ２２０−５を用いて形質転換した細菌発現系の培養物から得られたタンパク質調製物には、全長ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡに相当する主生成物、および主要なバンドの直下に現れる主要な副産物（約１０％）が含まれる。この２つのタンパク質はいずれも、精製後のタンパク質調製物に対してＳＤＳ−ＰＡＡゲルのクマシー染色（図２Ａ、左レーンを参照）、およびＥＴＡ特異的抗体を用いたイムノブロット実験（データ示さず）を行うことによって、検出できる。また、以前行なったイムノブロット実験において、上記の副産物がｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡの外毒素Ａ部分に対する抗体によって認識されることが明らかになった。したがって、この副産物は、全長ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡの発現の過程または発現後に、細菌由来のプロテアーゼによるタンパク質分解によって生成されると考えられてきた。これまで標準的なタンパク質精製技術では、この末端切断型タンパク質断片を除去することはできなかった。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】抗体毒素ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡの各種誘導体の概観と各配列の特徴（Ａ）細菌発現系に用いるｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ誘導体のコンストラクト すべての発現カセットは、ＩＰＴＧで誘導可能なｔａｃプロモーターの制御下にあり、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ（ＥＴＡ）（野生型毒素の第２５２〜６１３番目の残基に相当）と融合した、ＥｒｂＢ２特異的なｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）をコードする。プラスミドｐＳＷ２２０−５は、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ（Ｆ）および２つのＨｉｓ６クラスター（Ｈ）をそれぞれコードする配列を有する。ｐＳＥＳ２１２およびｐＳＥＳ２１３においては、このＦＬＡＧタグとＨｉｓ６クラスターが欠失している。ｐＳＥＳ２１３は、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）配列内に変異を有し、９２番目のメチオニン（Ｍ）がセリン（Ｓ）に置換されている。その他の点では、ｐＳＥＳ２１３はｐＳＥＳ２１２と同一である。 （Ｂ）プラスミドｐＳＥＳ２１２およびｐＳＥＳ２１３におけるｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡの部分的ＤＮＡ塩基配列（配列番号１０）および部分的タンパク質配列（配列番号９） ９２番目のコドンが、潜在的な内部開始コドンＡＴＧからＴＣＧに置換されていることを示す。下線部は、シャイン−ダルガノ配列と中程度の類似性を持つ配列である。
【図２】抗体毒素ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡの各種誘導体の発現およびその生物学的抗腫瘍活性 （Ａ）ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２２０−５）、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２１２）およびｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）の各タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 発現プラスミドｐＳＷ２２０−５、ｐＳＥＳ２１２またはｐＳＥＳ２１３で形質転換された大腸菌ＤＨ５αは、それぞれのｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ誘導体を発現した。封入体を単離して変性させた後、再生させた。各タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クマシー染色を行いタンパク質を検出した。全長ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡタンパク質およびｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡタンパク質に相当するバンドを白矢印で示す。プラスミドｐＳＷ２２０−５およびｐＳＥＳ２１２の発現産物を含む試料には、主要な分解産物が含まれる（黒矢印）。ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）調製物には、この望ましくない副産物は含まれない。 （Ｂ）ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２２０−５）およびｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）の生物活性 ヒトｃ−ｅｒｂＢ２ ｃＤＮＡが安定導入されたマウスＲｅｎｃａ−ｌａｃＺ／ＥｒｂＢ２腎癌細胞（左パネル）、およびＥｒｂＢ２陰性Ｒｅｎｃａ−ｌａｃＺコントロール細胞（右パネル）に、表示した濃度のｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２２０−５）またはｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）を加えて４８時間インキュベートした。各濃度あたり３ウェルずつ用いた。ＭＴＴ代謝アッセイで５９０ｎｍの吸光度を測定することにより、細胞の生存率を求めた。ＰＢＳで処理した細胞をコントロールとした。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 （Ｃ）ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）のｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２２０−５）に対する活性比 表示した各タンパク濃度で処理した抗原陽性標的細胞および抗原陰性標的細胞において、（Ｂ）で求めたＡ５９０値を、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）処理群のｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２２０−５）処理群に対する比で示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の目的は、全長ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡが有する、治療上意味のある生物活性に影響を与えることなく、この全長タンパク質の末端切断型断片の生成を防ぐことである。本発明を適用すると、細菌発現系を用いた発現を行う際に、このような望ましくない副産物は生成しない。したがって、高純度のタンパク質調製物が容易に得られる。
【００１０】
本発明には、細菌発現系で得られた培養物から、上述した末端切断型の副産物を含まない均質なタンパク質調製物が得られるように、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡをコードする発現ユニットを変更することが包含される。本発明者らは、先の考察とは異なり、このような副産物の生成は全長タンパク質の分解によって起こるのではなく、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ ｍＲＮＡのｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）配列内にある内部ＡＵＧコドンからも翻訳が開始された結果であるという仮説を立てた。
【００１１】
第１の態様において、本発明は、配列番号１１の第２〜１２０番目のアミノ酸残基を含む第１のアミノ酸配列と、配列番号１１の第１３６〜２４２番目のアミノ酸残基を含む第２のアミノ酸配列とを含むポリペプチドであって、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列がペプチドスペーサー基によって連結しているポリペプチドに関する。好ましくは、本発明のポリペプチドは下記の構造を含む。
ＶＨ−Ｓｐ−ＶＬ
（式中、ＶＨは第１のアミノ酸配列を示し、Ｓｐはペプチドスペーサー基を示し、ＶＬは第２のアミノ酸配列を示す。）
【００１２】
従って、第１のアミノ酸配列は、通常ポリペプチドのＮ末端に位置する。通常、本発明のポリペプチドは、スペーサー基、好ましくはペプチドによって、重鎖の可変ドメインと軽鎖の可変ドメインが連結されている１本鎖抗体である。本発明のポリペプチドの第１のアミノ酸配列は、重鎖の可変ドメインを表し、第２のアミノ酸配列は、軽鎖の可変ドメインを表す。重鎖の可変ドメインが組換え抗体のＮ末端に位置する一本鎖抗体が最も好ましい。
【００１３】
第１のアミノ酸配列は、配列番号１１の第２〜１２０番目のアミノ酸残基を含み、好ましくは、配列番号１１の第１〜１２０番目のアミノ酸残基を含むか、または配列番号１１の第１〜１２０番目のアミノ酸残基からなる。さらに好ましい実施形態において、第１のアミノ酸配列は、配列番号１の第２〜１２０番目のアミノ酸残基を含み、好ましくは、配列番号１の第１〜１２０番目のアミノ酸残基を含むか、または配列番号１の第１〜１２０番目のアミノ酸残基からなる。
【００１４】
第２のアミノ酸配列は、配列番号１１の第１３６〜２４２番目のアミノ酸残基を含み、好ましくは、配列番号１１の第１３６〜２４２番目のアミノ酸残基からなる。
【００１５】
ペプチドスペーサー基の長さは、３〜３０アミノ酸残基、好ましくは５〜２５アミノ酸残基、より好ましくは１０〜２０アミノ酸残基、最も好ましくは約１５アミノ酸残基（例えば、１３、１４、１５、１６または１７アミノ酸残基など）である。また、ペプチドスペーサー基は、グリシンおよびセリンから選ばれるアミノ酸から構成されることが好ましい。スペーサー基は、３つのＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ反復サブユニットから構成される１５アミノ酸残基のペプチドであることが特に好ましい。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むことが好ましく、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むことがより好ましい。
【００１７】
配列番号１１のアミノ酸Ｘａａは、メチオニン以外の任意のアミノ酸であってもよく、または存在しなくてもよい。後者の場合、９１番目と９３番目のアミノ酸が直接ペプチド結合によって連結する。配列番号１１のＸａａとしては、天然アミノ酸、非天然アミノ酸および修飾アミノ酸を含む、メチオニン以外の任意のアミノ酸などが挙げられる。Ｘａａが天然アミノ酸である場合、Ｘａａとしては、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはセレノシステインなどが挙げられる。Ｘａａは、セリン、アラニン、トレオニンおよびシステインからなる群より選ばれるのが好ましく、セリンが最も好ましい。Ｘａａが非天然アミノ酸または修飾アミノ酸である場合、Ｘａａとしては、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、エチルグリシンまたはエチルアスパラギンなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、Ｘａａは、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５の表４で定義されるような任意の修飾アミノ酸であってもよい。この表は、参照により本明細書に援用される。
【００１８】
また、Ｘａａが「存在しなくてもよい」とは、ＦＲＰ５配列の９２番目のメチオニン（例えば、配列番号９を参照）が欠失し、かつ別のアミノ酸によって置換されていないことを意味する。この実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【００１９】
本発明の一本鎖組換え抗体は、エフェクター分子および／または宿主細胞内で産生された抗体のプロセシングを促進するためのシグナル配列をさらに含んでもよい。
【００２０】
エフェクター分子とは、治療上または診断上有用な分子を意味する。例えば、検出可能な反応を起こす酵素、例えばホスファターゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のアルカリホスファターゼや、ウシ由来のアルカリホスファターゼなどの哺乳動物由来アルカリホスファターゼ）、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素またはグルコース−６−リン酸；特異的な結合特性を有するペプチド、例えば、ビオチンと強力に結合する、ストレプトミセス属アビジニイ由来のストレプトアビジン；または抗体が結合した細胞を攻撃する酵素、毒素またはその他の薬剤、例えば、プロテアーゼ、細胞溶解素、外毒素（例えば、リシンＡ、ジフテリア毒素Ａ、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素など）などが挙げられる。以下、エフェクター分子をさらに含む一本鎖組換え抗体は、「融合タンパク質」と表すか、あるいは該当する場合、「一本鎖（組換え）抗体」または「組換え抗体」の定義に含まれるものとする。エフェクター分子は、細胞致死活性を有するポリペプチドであってもよい。細胞致死活性は、本出願の実施例３に従い測定することができる。
【００２１】
「エフェクター分子」は、生物活性を有する、上述のタンパク質の変異体も包含する。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで突然変異させたＤＮＡから生成される変異体が挙げられるが、このＤＮＡによってコードされるタンパク質が、対応する天然タンパク質の生物活性を保持していることが前提である。このような変異としては、アミノ酸の付加、置換または欠失が挙げられ、欠失が起こった場合、全長が短い変異体が得られる。例えば、コード遺伝子のクローニングを容易にするためにＤＮＡを修飾して、ホスファターゼなどの酵素を生成してもよい。または、細胞に対する結合ドメインを欠失させる、および／または細胞致死活性を増強または軽減させるようにＤＮＡを変異させて、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素などの外毒素を生成してもよい。
【００２２】
エフェクターポリペプチドは、配列番号１の第２４５〜６０６番目のアミノ酸残基を含んでもよい。
【００２３】
また、「エフェクター分子」には、細胞致死活性を有する化学物質も含まれる。細胞致死活性は、本出願の実施例３に従い測定することができる。このような化学物質としては、化学療法剤、細胞毒性化合物または細胞増殖抑制性化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。化学療法剤および細胞毒性化合物の例としては、下記が挙げられる。
−アルキル化剤
−細胞毒性を有する抗生物質
−代謝拮抗剤
−ビンカアルカロイドおよびエトポシド
−その他
【００２４】
アルキル化剤は、ＤＮＡ合成に使われるヌクレオチド前駆体に存在する化学物質のような求核性残基と反応する。アルキル化剤は、これらのヌクレオチドをアルキル化することにより、ヌクレオチドが結合してＤＮＡが構築されるのを阻害し、細胞分裂の過程に影響を与える。アルキル化剤としては、例えばマスタージェン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ）、リン酸エストラムスチン、メルファラン、クロラムブチル、プレドニムスチン、シクロホスファミド、イホスファミド、トロホスファミド、ブスルファン、トレオサルファン、チオテパ、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ニムスチン（ＡＣＮＵ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、シスプラチンまたはカルボプラチンなどが好ましく挙げられる。
【００２５】
細胞毒性を有する抗生物質は、直接ＤＮＡ合成またはＲＮＡ合成を阻害することによって作用し、細胞周期を通して効力を発するものである。細胞毒性を有する抗生物質としては、例えばアクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）またはトポテカンなどが好ましく挙げられる。
【００２６】
代謝拮抗剤は、細胞分裂過程に関わる細胞内酵素または天然代謝物質と拮抗して、細胞分裂を阻害する。代謝拮抗剤としては、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、クラドリビン、５−フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビンまたはヒドロキシ尿素などが好ましく挙げられる。
【００２７】
植物アルカロイドおよびエトポシドは、植物由来の薬剤で、細胞分裂に必要な細胞成分の集合を阻害することにより、細胞の複製を阻害する（例えば、ビンカアルカロイド、エトポシドなど）。植物アルカロイドおよびエトポシドとしては、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エトポシド（ＶＰ１６）またはテニポシド（ＶＭ２６）などが好ましく挙げられる。
【００２８】
「その他」の化合物群としては、主としてタキサン剤（例えば、パクリタキセル、タキソール、ドセタキセル、タキソテールなど）や金属錯体（例えば、シスプラチン）が挙げられ、シグナル伝達阻害剤（ＳＴＩ）や特定の酵素機能に対する阻害剤（例えば、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤などが挙げられるが、これらに限定されない）も挙げられる。ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤は、例えば、ボリノスタット、ベリノスタット、ＰＣＩ−２４７８１、ＣＨＲ−３２４２、ＪＮＪ−１６２４１１９９、ＭＧＣＤ−０１０３、ロミデプシン、ＭＳ−２７５、酪酸塩、バルプロ酸およびこれらの組み合わせからなる群より選ばれる。キナーゼ阻害剤は、例えば、イマチニブ、セディラニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、レスタウルチニブ、エンザスタウリン、パゾパニブ、アルボシディブ、ニロチニブ、バタリニブ、エルロチニブ、スニチニブおよびこれらの組み合わせからなる群より選ばれる。プロテアーゼ阻害剤は、例えば、ＷＸ−ＵＫ１、ボルテゾミブおよびこれらの組み合わせからなる群より選ばれる。
【００２９】
また、細胞致死活性を有する化学物質は、例えばコバルト６０などの放射性物質であってもよい。
【００３０】
エフェクター分子は、共有結合または非共有結合によって本発明のポリペプチドと結合していてもよい。エフェクター分子が、共有結合によって本発明のポリペプチドに結合している場合、該ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端のいずれの部分と融合していてもよい。エフェクター分子が、第２のアミノ酸配列のＣ末端と融合して、融合ポリペプチドを形成するのが好ましい。この融合ポリペプチドにおいては、第２のアミノ酸配列とエフェクター分子のアミノ酸配列との間に１以上（例えば２、３、４または５）のアミノ酸が存在していてもよい。
【００３１】
最も好ましい本発明のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列の第２〜６０６番目のアミノ酸残基を含むか、配列番号３のアミノ酸配列の第１〜６０６番目のアミノ酸残基を含むか、または配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、別のペプチド、例えば、精製を容易にするためのペプチド、特に、抗体の適用が可能なエピトープペプチド（例えば、ＦＬＡＧペプチドなど）を適宜含んでもよい。このようなペプチドを含む融合タンパク質は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を、迅速、特異的かつ／または穏和に実施できるため有利である。前記ペプチドは、融合タンパク質のＮ末端、組換え抗体とエフェクター分子との間、融合タンパク質のＣ末端のいずれに配置されてもよいが、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に配置されるのが好ましく、Ｎ末端に配置されるのが特に好ましい。これらのコンストラクトは、さらに切断部位を含むことが好ましく、それにより、例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａなどの酵素による切断、または当技術分野で公知の化学的方法によってこの切断部位から融合タンパク質を遊離することができる。これらのコンストラクトは、前記ペプチドおよび／または前記切断部位と、組換え抗体とが容易に結合できるように、１以上、例えば、１〜１０、とりわけ２程度のアミノ酸からなるペプチドスペーサーをさらに含んでもよい。前記切断部位は、組換え抗体およびエフェクター分子を含む融合タンパク質を必要に応じて容易に遊離できるように、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏで容易に遊離できるように配置される。例えば、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡで示される融合タンパク質を含むタンパク質コンストラクトにおいて、ＦＬＡＧペプチドおよびエンテロキナーゼ切断部位がスペーサーに連結され、Ｆｖ重鎖／軽鎖の可変ドメインおよび外毒素Ａを含む融合タンパク質の上流に配置される。必要に応じて、好ましくは上記タンパク質のアフィニティ精製の後に、エンテロキナーゼによってＦＬＡＧペプチドを切り離すことにより、一本鎖抗体Ｆｖ（ＦＲＰ５）および外毒素Ａを含む融合タンパク質を生成できる。
【００３３】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。一般に、「ポリヌクレオチド」とは、変更を加えたＲＮＡまたはＤＮＡであっても、変更を加えていないＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを表す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡであっても、一本鎖または二本鎖のＲＮＡであってもよい。本明細書に用いられる「ポリヌクレオチド」には、１つ以上の修飾塩基および／または例外的な塩基（例えば、イノシンなど）を含むＤＮＡやＲＮＡも含まれる。当然のことながら、当業者に公知の多くの有用な目的に合致するように、様々な変更をＤＮＡやＲＮＡに対して加えてもよい。このように、本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」は、例えば単純細胞や複雑型細胞を含むウイルスおよび細胞に特有のＤＮＡやＲＮＡの化学的形態だけでなく、化学的、酵素的または代謝的に変化した形態のポリヌクレオチドも包含する。
【００３４】
配列番号１１で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが好ましく、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがより好ましい。配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがさらに好ましい。最も好ましいポリヌクレオチドは、配列番号２で表されるヌクレオチド配列または配列番号４で表されるヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドは、単離ポリヌクレオチドが好ましい。「単離」ポリヌクレオチドとは、他の核酸配列、例えば他の染色体のＤＮＡやＲＮＡ、他の染色体外のＤＮＡやＲＮＡなど（ただし、これらに限定されない）を実質的に含まないポリヌクレオチドを表す。単離ポリヌクレオチドは、宿主細胞から精製されたものでもよく、当業者に公知の慣用の核酸精製方法を用いて、単離ポリヌクレオチドを得ることができる。「単離」ポリヌクレオチドはさらに、組換えポリヌクレオチドおよび化学合成されたポリヌクレオチドを含む。
【００３６】
本発明のさらに別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターのプラスミドである。「プラスミド」および「ベクター」は、染色体外構成要素を意味し、該構成要素は多くの場合細胞の中央代謝に属さない遺伝子を含み、通常、環状の二本鎖ＤＮＡ断片の形態をとる。このような構成要素としては、自律複製配列、ゲノム組込み型配列、ファージ、またはあらゆる起源の一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡやＲＮＡで鎖状もしくは環状のヌクレオチド配列などが挙げられる。このような構成要素において、様々なヌクレオチド配列の連結または組換えによって独自のコンストラクトが形成され、このコンストラクトによって、選択した遺伝子産物を得るためのプロモーター断片やＤＮＡ塩基配列が、適切な３’非翻訳配列と共に細胞へ導入される。通常、プラスミドまたはベクター内の本発明のポリヌクレオチドは、１つ以上の発現調節配列に作用可能に連結している。
【００３７】
「作用可能に連結する」とは、１つの核酸断片上で核酸配列同士が連結して、一方が他方の機能に影響を及ぼすことができる状態を意味する。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写調節下にある場合）、前記プロモーターは、前記コード配列と作用可能に連結していることになる。コード配列は、センス方向、アンチセンス方向のいずれの向きにも調節配列と作用可能に連結できる。「プロモーター」は、遺伝子の転写開始点より上流に位置するＤＮＡ塩基配列で、遺伝子の転写開始に必要なＲＮＡポリメラーゼおよび／またはその他のタンパク質の認識と結合に関わる。通常、遺伝子の発現条件はプロモーターによって決まる。本明細書に用いられるプロモーターと、該プロモーターに作用可能に連結された本発明のポリヌクレオチドの起源は通常異なる。
【００３８】
ベクターは、一般に、互換性のある宿主細胞と共同で２つの機能を発揮する。１つの機能は、免疫グロブリンの可変領域をコードする核酸のクローニングを促進すること、つまり、利用可能な量の核酸を産生することである（クローニングベクター）。もう一方の機能は、ベクターが染色体外因子として保持される、または宿主染色体に組込まれることによって、適切な宿主内で組換え遺伝子コンストラクトの複製と発現を行うことである（発現ベクター）。クローニングベクターは、上記のような組換え遺伝子コンストラクト、複製開始点または自律複製配列、および優性のマーカー配列を含み、任意でシグナル配列および追加の制限酵素認識部位を含む。発現ベクターは、これらに加えて、組換え遺伝子の転写と翻訳に不可欠な発現調節配列をさらに含む。
【００３９】
複製開始点または自律複製配列は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）といったウイルスなどに由来する外来性の複製起点を含むベクターを構築することにより提供されるか、または宿主細胞の染色体機構から提供される。
【００４０】
マーカーは、当該ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする。選択マーカーとしては、銅などの重金属、もしくはジェネティシン（Ｇ−４１８）、カナマイシン、ハイグロマイシンなどの抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子、またはチミジンキナーゼ、ヒポキサンチンホスホリル転移酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素等の欠損といった宿主細胞の遺伝子損傷を補完する遺伝子などが挙げられる。
【００４１】
シグナル配列としては、例えば、組換え抗体の分泌を指示するプレ配列や分泌リーダー、またはスプライシングシグナルなどが挙げられる。組換え抗体の分泌を指示するシグナル配列としては、例えば、ｏｍｐＡ遺伝子、ｐｅｌＢ（ペクチン酸リアーゼ）遺伝子またはｐｈｏＡ遺伝子のシグナル配列が挙げられる。
【００４２】
ベクターＤＮＡは、発現調節配列として、プロモーター、転写の開始と終結に必要な配列、およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含み、任意でエンハンサーおよびさらなる制御配列を含む。
【００４３】
宿主細胞の特徴に応じて、種々のプロモーター配列を用いることができる。強力で規則正しく機能するプロモーターが最も有用である。翻訳開始配列としては、例えば、シャイン−ダルガノ配列が挙げられる。転写の開始と終結に必要な配列、およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列は、一般に、ウイルスｃＤＮＡまたは真核生物ｃＤＮＡの５’非コード領域および３’非コード領域のもの（例えば、発現宿主由来のもの）をそれぞれ利用できる。エンハンサーとしては、ウイルス（例えば、シミアンウイルス、ポリオーマウイルス、ウシ乳頭腫ウイルスまたはモロニー肉腫ウイルス）由来、またはゲノム由来（特にマウス由来）の転写促進に関わるＤＮＡ塩基配列が挙げられる。
【００４４】
大腸菌株内での複製と発現に好適なベクターとしては、例えばバクテリオファージλ誘導体などのバクテリオファージや、プラスミド、具体的には、プラスミドＣｏｌＥ１およびその誘導体（例えばｐＭＢ９、ｐＳＦ２１２４、ｐＢＲ３１７、ｐＢＲ３２２およびその誘導体（例えば、ｐＵＣ９、ｐＵＣＫ０、ｐＨＲｉ１４８およびｐＬｃ２４など）など）が挙げられる。好適なベクターは、完全なレプリコン、マーカー遺伝子および制限酵素認識配列を含み、外来性ＤＮＡと、該当する場合、発現調節配列とを上記制限酵素認識配列に挿入することができる。また、好適なベクターは、任意でシグナル配列とエンハンサーを含む。
【００４５】
微生物由来プロモーターとしては、例えば、温度感受性リプレッサーにより制御され、左方向への転写開始に関わる、バクテリオファージλ由来の強力なＰＬプロモーターが挙げられる。また、例えば、ｌａｃ（ラクトース）リプレッサーにより調節され、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドにより誘導されるｌａｃプロモーター、ｔｒｐ（トリプトファン）リプレッサーにより調節され、トリプトファン欠乏などにより誘導されるｔｒｐプロモーター、およびｌａｃリプレッサーにより調節されるｔａｃプロモーター（ｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などの大腸菌プロモーターも好適である。
【００４６】
酵母内での複製と発現に好適なベクターは、酵母の複製開始点および酵母選択的な遺伝子マーカーを含む。このようなベクターとして、複製開始点としていわゆるａｒｓ配列（自律複製配列）を含むベクター群が挙げられる。このベクター群は、酵母細胞を形質転換した後、酵母細胞内の染色体外に保持され、自律的に複製する。さらに、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の２ミクロンプラスミドＤＮＡの全配列またはその一部を含むベクターを用いることもできる。このベクターは、組換えによって、細胞内に既に存在する２ミクロンプラスミドに組み込まれるか、または自律的に複製する。高い形質転換率と高いコピー数が求められる場合、この２ミクロン配列は特に好適である。
【００４７】
酵母内での発現に好適な発現調節配列としては、例えば高発現する酵母遺伝子の発現調節配列が挙げられる。したがって、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩもしくはＡＤＨII遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ３またはＰＨＯ５）遺伝子、およびイソチトクロム遺伝子のプロモーター；またはエノラーゼ遺伝子、グリセロアルデヒド−３−リン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子、ヘキソキナーゼ遺伝子、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、ホスホフクルトキナーゼ遺伝子、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ遺伝子、ピルビン酸キナーゼ遺伝子、トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子、ホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子およびグルコキナーゼ遺伝子のプロモーターなどの、解糖系に関わるプロモーターを用いることができる。
【００４８】
哺乳動物細胞内での複製と発現に好適なベクターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス２型、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）、パポーバウイルスＢＫ変異体（ＢＫＶ）、またはマウスもしくはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などのウイルスのＤＮＡに由来するプロモーター配列を備えていることが好ましい。また、上記ベクターは、アクチン、コラーゲン、ミオシンなどの、哺乳動物の発現産物に対するプロモーター、または所望の遺伝子配列に通常関連する内因性のプロモーターや調節配列（すなわち、免疫グロブリンの重鎖プロモーターまたは軽鎖プロモーター）を含んでもよい。
【００４９】
原核、真核のいずれの宿主細胞にも好適で、ウイルス複製システムに基づくベクターが好ましく、シミアンウイルスプロモーター（例えば、ｐＳＶｇｐｔ、ｐＳＶｎｅｏなど）を含み、エンハンサー（例えば、免疫グロブリン遺伝子配列に通常関連するエンハンサー、具体的にはマウスＩｇの重鎖エンハンサーまたは軽鎖エンハンサー）をさらに含むベクターが特に好ましい。
【００５０】
例えば、形質転換した宿主細胞を培養し、適宜、調製したＤＮＡを単離することにより、本発明の組換え抗体をコードする組換えＤＮＡを調製できる。
【００５１】
本発明の別の態様は、本発明のプラスミドもしくはベクターによって形質転換された、かつ／または該プラスミドもしくはベクターを含む宿主細胞である。好適な宿主細胞としては、原核細胞、真核細胞（例えば哺乳動物細胞）、酵母細胞、細菌（例えば大腸菌）などが挙げられるが、好ましくは、大腸菌である。好適な宿主細胞と形質転換手技は、米国特許第５，９３９，５３１号に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００５２】
また本発明は、宿主細胞の培養方法および本発明のポリペプチドの調製方法に関する。本発明の１つの態様は、本発明のポリペプチドの調製方法で、該方法は、本明細書に記載の宿主細胞を好適な条件下で培養する工程と、本発明のポリペプチドを回収する工程とを含む。米国特許第５，９３９，５３１号に、宿主細胞の培養方法、ならびに一本鎖組換え抗体およびその断片の生成方法が記載されている。これらの方法は、本発明の宿主細胞および本発明のポリペプチドに準用可能で、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００５３】
本発明の別の態様は、ＥｒｂＢ２の異常な活性および／または発現を伴う疾患（例えば癌や腫瘍）に対する治療剤を製造するための、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチドの使用である。このような疾患としては、例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、扁平上皮癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌、膵癌、胃癌、唾液腺癌、耳下腺腫瘍、黒色腫、子宮頚癌、膵癌、結腸癌および結腸直腸癌、膀胱癌、髄芽腫、腎臓癌、肝臓癌ならびに胃癌などが挙げられるが、これらに限定されない。このような疾患には、転移および／または微小残存病変も含まれる。
【００５４】
したがって、本発明は、医薬組成物（例えば、成長因子受容体ｃ−ｅｒｂＢ−２を過剰発現する腫瘍の治療に用いる）にも関する。該医薬組成物は、治療上有効量の本発明のポリペプチドおよび、薬学的に許容されるキャリア、希釈液または溶媒を含み、好ましくは、非経口用医薬組成物である。筋肉内、皮下、または静脈内投与用の組成物としては、例えば、等張の水溶液剤または懸濁剤などが挙げられ、使用直前に凍結乾燥製剤または濃縮製剤より調製されたものであってもよい。油中懸濁剤は、油状成分として、注射用に通常用いられる植物油、合成油または半合成油を含む。本発明の医薬組成物は滅菌されていてもよく、添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節する塩類、緩衝剤および／または粘性を調節する化合物（例えば、カルボキシセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デキストラン、ポリビニルピロリジン、ゼラチンなど）などが挙げられる。
【００５５】
本発明の医薬組成物は、約０．００１〜５０％の有効成分を含む。本発明の医薬組成物の形態としては、例えば、即時使用可能なアンプルまたはバイアルなどの投与単位剤形、または凍結乾燥した固形物などが挙げられる。
【００５６】
本発明のポリペプチドの哺乳動物に対する治療上有効量は、ポリペプチドの種類、患者の状態および投与方法によって異なるが、一般にｋｇ体重当たり約０．１〜１００μｇ、より好ましくは１〜５０μｇ、さらに好ましくは５〜２５μｇである。具体的な投与方法や適切な投与量は、主治医が患者の特性、病状および治療する腫瘍の種類などを考慮して選択する。本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の方法、例えば、混合、溶解、調合（ｃｏｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）、凍結乾燥などの慣用的な操作によって調製される。注射用医薬組成物は、当技術分野で公知の方法に従って処理され、次いでアンプルまたはバイアルへ充填され無菌状態で密封される。
【００５７】
一実施形態において、本発明のポリペプチドを別の抗癌治療と組み合わせて投与する。国際公開公報ＷＯ０３／０２４４４２ Ａ２において「第２の治療薬」として指定された抗癌治療は、すべて本明細書に援用される。
【００５８】
さらに別の態様において、本発明は、受容体型チロシンキナーゼＥｒｂＢ２の細胞外ドメインに対する一本鎖組換え抗体の産生量を向上させる方法に関する。該方法は、配列番号９のコドン９２からの翻訳開始を防ぐことを含む。これは、内部コドン９２（メチオニン９２）から翻訳が開始されることのないように配列番号１０の第２６２〜２７０番目のヌクレオチドのうち１つ以上を変異させることにより達成できる。ヌクレオチドの置換は、コードされるアミノ酸配列が変わらないような形で行われてもよい。
【００５９】
第２６２〜２７０番目のヌクレオチド配列として、３つの例を以下に示すが、本発明はこれらに限定されない。
【表１】
【００６０】
また、第２６２〜２７０番目のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸残基、すなわちリジン、セリンまたはグルタミン酸を、天然または非天然の、化学的に類似したまたは類似しない他のアミノ酸で置換してもよく、これらのアミノ酸残基が、化学修飾されたヌクレオチドによりコードされていてもよい。
【００６１】
また、上述の通り、配列番号９のアミノ酸配列においてメチオニン９２を他のアミノ酸で置換してもよい。他のアミノ酸としてはセリンが好ましい。さらに、上述の通り、配列番号９のアミノ酸配列においてメチオニン９２を他のアミノ酸で置換せずに欠失させてもよい。この実施形態を、配列番号１２のアミノ酸配列に示す。
【実施例】
【００６２】
＜実施例１＞ 変異体発現コンストラクトの分子クローニング
【００６３】
方法
ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ発現ベクターの構築
プラスミドｐＳＷ２２０−５については既に文献に記載されている（非特許文献７）。該プラスミドは、１つのオープンリーディングフレームにＮ末端ＦＬＡＧタグ、第１のＨｉｓ６クラスター、ＥｒｂＢ２特異的なｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）、第２のＨｉｓ６クラスターおよび末端切断型緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ（野生型毒素の第２５２〜６１３番目の残基に相当）をそれぞれコードする配列を含む。プラスミドｐＳＥＳ２１１（未発表；ＴｏｐｏＴａｒｇｅｔ Ｇｅｒｍａｎｙ ＡＧより提供）は、ｐＳＷ２２０−５に由来する、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ発現のためのオープンリーディングフレームを含む。ｐＳＷ２２０−５と同様に第１のＮ末端Ｈｉｓ６クラスターは保持されているが、Ｎ末端ＦＬＡＧタグおよび、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）配列と外毒素Ａ配列との間の内部Ｈｉｓ６クラスターは欠失している。ｐＳＥＳ２１１に残存するＮ末端Ｈｉｓ６クラスターを欠失させることにより、プラスミドｐＳＥＳ２１２が得られた。このプラスミドを作製するために、まず、プラスミドｐＳＥＳ２１１を鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマー５’ＮｄｅＩ−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）、すなわち５’−ＣＧＡＴＴＡＧＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＴＡＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣ−３’（配列番号５）と３’ＸｂａＩ−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）、すなわち５’−ＧＣＴＧＣＣＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＴＣ−３’（配列番号６）（ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ， Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＰＣＲを行った。この反応によって、Ｎ末端Ｈｉｓ６クラスターのコード配列を持たないｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）断片の配列が増幅された。このＰＣＲ産物を、ＴＡ−クローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてベクターｐＣＲ２．１へサブクローニングした。得られたプラスミドをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、得られたｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）断片を、同じ酵素で消化したｐＳＥＳ２１１に挿入することにより、プラスミドｐＳＥＳ２１２が得られた。プラスミドｐＳＥＳ２１２を鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーｐＳＥＳ２１２＿Ｍ９２Ｓ＿ｓｅｎｓｅ、すなわち５’−ＣＣＴＣＡＡＡＡＧＴＧＡＡＧＡＣＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号７）とｐＳＥＳ２１２＿Ｍ９２Ｓ＿ａｓ、すなわち５’−ＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴＧＴＡＧＣＣＧＡＧＴＣＴＴＣＡＣＴＴＴＴＧＡＧＧ−３’（配列番号８）（ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ）を用いてＰＣＲを行った。これによりメチオニン９２からセリンへの部位特異的変異が起こり、この変異をプラスミドｐＳＥＳ２１２に導入することにより、プラスミドｐＳＥＳ２１３が得られた。すべての発現ベクターのＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシークエンスにより確認した。
【００６４】
結果
ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡコード領域の変異に対する基準物質として、発現プラスミドｐＳＥＳ２１２（未発表）を用いた。ｐＳＥＳ２１２内のｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡコード領域は、ｐＳＷ２２０−５の対応領域に存在する、Ｎ末端ＦＬＡＧタグおよび２つのＨｉｓ６クラスターをそれぞれコードする配列が欠失している（図１Ａを参照）。さらに、ｐＳＥＳ２１２は、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ配列以外のベクターのバックボーンもｐＳＷ２２０−５とは異なる。しかし、これらの違いは、本発明においては大して重要ではない。図２Ａ（左レーンと中央レーン）に示すように、ｐＳＥＳ２１２またはｐＳＷ２２０−５発現ベクターを用いた場合、副産物である末端切断型ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡが同程度産生される。シークエンス分析によって、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）抗体の重鎖内にある相補性決定領域３（ＣＤＲ３）に近いフレームワーク領域３内、すなわちオープンリーディングフレームの第２７４〜２７６番目のヌクレオチド（ｐＳＥＳ２１２のｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡのコドン９２に対応する（図１Ｂを参照））に内部ＡＴＧコドン（ｍＲＮＡレベルではＡＵＧに相当し、内部の潜在的な開始コドンとなる）が存在することをつきとめた。さらに、この潜在的な開始コドンの上流にある第２６２〜２７０番目のヌクレオチド（図１Ｂ；下線部）に、シャイン−ダルガノ配列と中程度の類似性を持つ配列が存在する。
【００６５】
この内部ＡＴＧ／ＡＵＧコドンを変異させることによって望ましくない副産物の生成を防ぐことが可能かどうか調べるために、変異体発現プラスミドｐＳＥＳ２１３を作製した。ｐＳＥＳ２１３は、変異を有し、９２番目のコドンがＡＴＧからＴＣＧに置換されている。その結果、該コドンがコードするアミノ酸残基はメチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）ではなくセリン（Ｓｅｒ；Ｓ）になる（図１を参照）。その他の点においては、ｐＳＥＳ２１３はｐＳＥＳ２１２と同一である。メチオニンの代わりにセリンを選んだ理由としては、サブグループＶに属する他のマウス抗体重鎖では、対応する位置にセリンが存在すること（非特許文献１３）、さらに、セリンとメチオニンでは等電点や側鎖の長さが類似していることが挙げられる。
【００６６】
本発明の別の実施形態において、メチオニン以外のアミノ酸をコードするようにコドン９２を置換するもしくはコドン９２を欠失させる、および／またはシャイン−ダルガノ配列に類似しないようにもしくはシャイン−ダルガノ配列として機能しないように第２６２〜２７０番目のヌクレオチド配列を変異させることによって、同様に上記の問題を解決してもよい。
【００６７】
＜実施例２＞ 大腸菌におけるｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ誘導体の発現
【００６８】
方法
大腸菌におけるｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ誘導体の発現、封入体の調製、可溶化およびリフォールディング
発現プラスミドｐＳＷ２２０−５、ｐＳＥＳ２１２またはｐＳＥＳ２１３を用いて、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。１Ｌの発現培養物（ＬＢ、０．５％グルコース、および５０μｇ／ｍｌカナマイシン（ｐＳＥＳ２１２またはｐＳＥＳ２１３の場合）または１００μｇ／ｍｌアンピシリン（ｐＳＷ２２０−５の場合）を含む）を、ＯＤ６００が０．８になるまで３７℃で培養した。その後、培養物に０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加して、３時間発現誘導を行った。遠心分離（７，５００ｇ、１０ｍｉｎ）により回収した細胞を、ＰＢＳに再懸濁し、フレンチプレス細胞破砕機（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）を用いて溶解した。遠心分離（１０，０００ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）により回収した封入体を、洗浄バッファー（２Ｍ尿素、２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および５００ｍＭ ＮａＣｌを含有するＰＢＳ（ｐＨ８））に再懸濁し、その後遠心分離（１０，０００ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）を行って封入体を洗浄した。精製した封入体を可溶化バッファー（８Ｍ尿素および５００ｍＭ ＮａＣｌを含有するＰＢＳ（ｐＨ８））に再懸濁した。これを遠心分離した後、上清画分をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析した。遠心分離（４０，０００ｇ、３０ｍｉｎ、４℃）後、０．２２μｍフィルターでろ過して沈殿を除去した。得られたタンパク質を小分けにして−８０℃で保存した。
【００６９】
結果
ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ誘導体を生成するために、ｐＳＷ２２０−５、ｐＳＥＳ２１２またはｐＳＥＳ２１３を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、それぞれＬＢＫａｎ寒天プレート（ｐＳＥＳ２１２およびｐＳＥＳ２１３の場合）またはＬＢＡＭＰ寒天プレート（ｐＳＷ２２０−５の場合）上で形質転換体を選別した。シングルコロニーを１Ｌの発現培養液に植菌し、これを下記「材料と方法」セクションに記載の通りに培養して発現誘導を行った。この培養物から得られた細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁し、フレンチプレス細胞破砕機（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）を用いて細胞を溶解した。ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡタンパク質は、主に、この溶解物の不溶性画分に存在した（データ示さず）。遠心分離により回収した封入体を、２Ｍ尿素および２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むバッファーで洗浄した後、８Ｍ尿素を含むバッファーを用いて変性させた。これを遠心分離した後、上清画分をＰＢＳで透析することによりタンパクを再生させた。この部分的に精製された再生タンパク質に対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと次いでクマシー染色を実施し分析を行った（図２Ａを参照）。各タンパク質をｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡまたはｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡとして表し、続いて、括弧内に発現ベクター名を表示した［ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２２０−５）、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２１２）、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）］。いずれの発現培養物においても、再生された可溶性タンパク質の収量は、一様に約３０〜５０ｍｇであった。図２Ａに示すように、得られたｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２２０−５）とｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２１２）のそれぞれのタンパク質調製物は、主要な副産物（黒矢印）を含み、この副産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて全長生成物（白矢印）のバンドの直下に現れた。一方、このような望ましくない副産物は、全く同様のプロトコールに従って単離したｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）調製物には含まれなかった。
【００７０】
驚くべきことに、これらのデータから、コドン９２をＡＴＧからＴＣＧに置換して、これに対応するアミノ酸残基をメチオニンからセリンに置換することは、副産物の生成を完全に防ぐ上で必要十分であることが示された。
【００７１】
＜実施例３＞ ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡの生物活性
【００７２】
方法
細胞および培養条件
大腸菌β−ガラクトシダーゼ単独、または大腸菌β−ガラクトシダーゼおよびヒトＥｒｂＢ２を安定発現するマウス腎癌細胞（それぞれ、Ｒｅｎｃａ−ｌａｃＺ、Ｒｅｎｃａ−ｌａｃＺ／ＥｒｂＢ２）（非特許文献８）を、１０％熱不活化ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５ｍｇ／ｍｌ Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）および０．４８ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｒｅｎｃａ−ｌａｃＺ／ＥｒｂＢ２の場合のみ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地でそれぞれ維持した。
【００７３】
細胞の生存率アッセイ
通常の増殖培地を用いて、１．５×１０４細胞／ウェルの濃度になるように９６穴プレートに細胞を播種した。希釈液のみまたは様々な濃度に調製したｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ融合タンパク質をそれぞれ加え、これらの細胞を５％ＣＯ２−９５％加湿空気の環境下で３７℃、４８時間インキュベートした。各試料につき３ウェルずつ用いた。各ウェルに１０ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（Ｓｉｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ））含有ＰＢＳ溶液を１０μｌずつ加えて、細胞をさらに３時間インキュベートした。その後、２０％ＳＤＳを含む５０％ジメチルフォルムアミド溶液（ｐＨ４．７）を９０μｌ添加して、細胞を溶解した。可溶化処理後、マイクロプレートリーダーで５９０ｎｍの吸光度を測定することにより、茶色を呈するホルマザン代謝物質の形成に基づく発色の強度を定量化した。細胞の入っていないセルをブランクとした。
【００７４】
結果
ヒトＥｒｂＢ２を発現するマウスＲｅｎｃａ−ｌａｃＺ／ＥｒｂＢ２腎癌細胞および、コントロールとしてＥｒｂＢ２陰性Ｒｅｎｃａ−ｌａｃＺ腎癌細胞を用いたＭＴＴ代謝アッセイ（非特許文献８）により、各ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ誘導体の腫瘍細胞に対する殺細胞能における選択性と有効性を評価した。ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）タンパク質と並行して発現・精製を行って得られたｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２２０−５）タンパク質を細胞傷害活性アッセイの標準物質として用いた。標的細胞を漸増濃度（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）の融合タンパク質とともに４８時間インキュベートした。細胞を溶解し、可溶化処理を行った後、マイクロプレートリーダーで５９０ｎｍの吸光度を測定することにより、細胞の生存率を定量化した（図２Ｂ）。細胞の入っていないセルをブランクとした。１０μｇ／ｍｌ以下の供試濃度では、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ融合タンパク質およびｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ融合タンパク質は、ＥｒｂＢ２陰性Ｒｅｎｃａ−ｌａｃＺ細胞の生存に影響を及ぼさなかった（図２Ｂ）。一方、ＥｒｂＢ２陽性Ｒｅｎｃａ−ｌａｃＺ／ＥｒｂＢ２細胞に対しては、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ融合タンパク質およびｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ融合タンパク質は、濃度依存的に十分な殺細胞能を同等に発揮した（図２Ｂ）。図２Ｃは、様々な供試濃度における、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡのｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡに対する殺細胞活性比を示す。１．００に近い値は、有意差がないことを示す。得られた値から、生物活性においてｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡとｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡとの間に有意差は見られないことが示された。
【００７５】
驚くべきことに、これらのデータから、コドン９２をＡＴＧからＴＣＧに置換して、これに対応するアミノ酸残基をメチオニンからセリンに置換しても、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡの生物活性は影響を受けないことが示された。ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡの抗腫瘍活性は、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡと区別できないほど類似しており、また、ＥｒｂＢ２を発現する腫瘍細胞に対する選択性も保持される。
【００７６】
本明細書に記載の本発明の様々な実施形態は、互いに組み合わせることができる。
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
抗体毒素ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡは、遺伝子融合により緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａの末端切断型断片と連結した、ＥｒｂＢ２特異的抗体ＦＲＰ５由来の一本鎖抗体断片からなる組換え融合タンパク質である。ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、動物モデルおよび癌患者において、ＥｒｂＢ２を発現する癌細胞に対して選択的かつ高い抗腫瘍活性を示すことが文献に詳細に記載されている。現在の方法論を用いて大腸菌発現系でｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡを産生すると、主生成物である完全なｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡに加えて、副産物として末端切断型ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ断片が生じる。これまで古典的なタンパク質精製技術では、この望ましくない断片を完全に除去することはできなかった。
【０００２】
本発明の目的は、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）抗体断片をコードする、最適化されたＤＮＡ塩基配列を提供することである。この新規な配列により、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ融合タンパク質だけでなく、恐らく、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）を含む他の融合タンパク質を細菌で発現させる場合においても、望ましくない副産物の生成を防ぐことができる。特質的なコドンを置換することにより、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡのｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）ドメインのＤＮＡ塩基配列を変異させて、タンパク質の翻訳が内部から開始されるのを防ぐ。
【背景技術】
【０００３】
ほとんどの臓器の上皮細胞では、受容体型チロシンキナーゼＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）の発現レベルは一般的に低い。しかし、いくつかの癌腫においては、多くの場合遺伝子増幅の結果、ＥｒｂＢ２の発現が著しく亢進している。受容体型チロシンキナーゼＥｒｂＢ２が、多くの上皮由来の腫瘍で選択的優位に発現していること、細胞外間隙から接近しやすいこと、および癌化プロセスに関与することから、ＥｒｂＢ２は、標的化癌治療のターゲットとして望ましい。
【０００４】
毒素が本来有する細胞結合ドメインが欠失した末端切断型緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ誘導体に基づいて、この毒素をＥｒｂＢ２にターゲティングさせるために、ＥｒｂＢ２特異的なモノクローナル抗体ＦＲＰ５の一本鎖Ｆｖ抗体断片を用いた組換え毒素が開発された（非特許文献１）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞致死実験において、細菌で発現させたこのｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ分子は、乳癌腫および卵巣癌腫（非特許文献１〜３）、扁平上皮癌（非特許文献４および５）、および前立腺癌腫（非特許文献６）を含む広範囲の株化ヒト腫瘍細胞および初代培養ヒト腫瘍細胞に対して強力な抗腫瘍活性を示した。実験動物においても、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡは、生着したヒト腫瘍異種移植片（非特許文献１および３〜５）、ならびにヒトｃ−ｅｒｂＢ２コンストラクトが安定導入されたマウスおよびラットの腫瘍細胞（非特許文献７および８）の増殖を効果的に抑制した。癌患者に対して、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡを、ＥｒｂＢ２を発現する腫瘍の皮膚病変へ腫瘍内投与したところ、６０％の患者で反応が見られた。その内訳として、４０％の患者では、処置した腫瘍で腫瘍結節の完全な退縮が見られ、残りの２０％では、処置した腫瘍で腫瘍の部分的な縮小が見られた（非特許文献９）。最近行われたフェーズＩ臨床試験において、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡを静脈注射した際の最大耐用量（ＭＴＤ）、用量規定毒性および種々の薬物動態パラメーターが調べられた（非特許文献１０）。その結果、１８人の患者のうち３人で病状が安定し、別の３人の患者では症状において臨床的効果の兆候が見られた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Wels W, Harwerth IM, Mueller M, Groner B, Hynes NE. Selective inhibition of tumor cell growth by a recombinant single-chain antibody-toxin specific for the erbB-2 receptor. Cancer Res 1992;52:6310-7.
【非特許文献２】Spyridonidis A, Schmidt M, Bernhardt W, et al. Purging of mammary carcinoma cells during ex vivo culture of CD34+ hematopoietic progenitor cells with recombinant immunotoxins. Blood 1998;91:1820-7.
【非特許文献３】Schmidt M, McWatters A, White RA, et al. Synergistic interaction between an anti-p185HER-2 Pseudomonas exotoxin fusion protein [scFv(FRP5)-ETA] and ionizing radiation for inhibiting growth of ovarian cancer cells that overexpress HER-2. Gynecol Oncol 2001;80:145-55.
【非特許文献４】Wels W, Beerli R, Hellmann P, et al. EGF receptor and p185erbB-2-specific single-chain antibody toxins differ in their cell-killing activity on tumor cells expressing both receptor proteins. Int J Cancer 1995;60:137-44.
【非特許文献５】Azemar M, Schmidt M, Arlt F, et al. Recombinant antibody toxins specific for ErbB2 and EGF receptor inhibit the in vitro growth of human head and neck cancer cells and cause rapid tumor regression in vivo. Int J Cancer 2000;86:269-75.
【非特許文献６】Wang L, Liu B, Schmidt M, Lu Y, Wels W, Fan Z. Antitumor effect of an HER2-specific antibody-toxin fusion protein on human prostate cancer cells. Prostate 2001;47:21-8.
【非特許文献７】Altenschmidt U, Schmidt M, Groner B, Wels W. Targeted therapy of schwannoma cells in immunocompetent rats with an erbB2-specific antibody-toxin. Int J Cancer 1997;73:117-24.
【非特許文献８】Maurer-Gebhard M, Schmidt M, Azemar M, et al. Systemic treatment with a recombinant erbB-2 receptor-specific tumor toxin efficiently reduces pulmonary metastases in mice injected with genetically modified carcinoma cells. Cancer Res 1998;58:2661-6.
【非特許文献９】Azemar M, Djahansouzi S, Jager E, et al. Regression of cutaneous tumor lesions in patients intratumorally injected with a recombinant single-chain antibody-toxin targeted to ErbB2/HER2. Breast Cancer Res Treat 2003;82:155-64.
【非特許文献１０】von Minckwitz G, Harder S, Hovelmann S, et al. Phase I clinical study of the recombinant antibody-toxin scFv(FRP5)-ETA specific for the ErbB2/HER2 receptor in patients with advanced solid malignomas. Breast Cancer Res 2005;7:R617-R26.
【非特許文献１１】Wels W, Harwerth IM, Zwickl M, Hardman N, Groner B, Hynes NE. Construction, bacterial expression and characterization of a bifunctional single-chain antibody-phosphatase fusion protein targeted to the human erbB-2 receptor. Biotechnology (NY) 1992;10:1128-32.
【非特許文献１２】Harwerth IM, Wels W, Marte BM, Hynes NE. Monoclonal antibodies against the extracellular domain of the erbB-2 receptor function as partial ligand agonists. J Biol Chem 1992;267:15160-7.
【非特許文献１３】Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C Sequences of proteins of immunological interest, 5 edition, Vol. 1. Washington: U.S. Department of Health and Human Services, 1991.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ヒト患者の治療に用いる治療用タンパク質製剤は、規制当局から承認を受けるために、純度および均質性の面で非常に高い基準を満たさなければならない。副産物が混在する活性化合物の製剤は、患者に対して毒性反応などの副作用をもたらす可能性、および／または望ましくない免疫応答を誘導する可能性がある。したがって、このような副産物を技術的に可能な限り除去する必要があり、副産物が残存する場合は、副産物毎に、見込まれる生物活性を、または生物活性がないことを示さなければならない。その結果、このような望ましくない副産物を除去するために高度かつ高価な精製技術が必要となり、かつ／または特定の副産物を除去できない場合はさらなる試験が必要となるため、生産コストが著しく増加する。
【０００７】
ｉｎ ｖｉｖｏ投与用のｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ抗体毒素を生成するために、これまでのところ、主として細菌発現系の発現ベクターｐＳＷ２２０−５が使用されてきた（非特許文献７）。このプラスミドは、野生型毒素の第２５２〜６１３番目のアミノ酸残基で示される末端切断型緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ（ＥＴＡ）と遺伝子的に融合した、モノクローナル抗体ＦＲＰ５由来のＥｒｂＢ２特異的なｓｃＦｖ抗体断片ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）（非特許文献１１および１２）からなる融合タンパク質をコードする。上記融合タンパク質の精製および検出用に、プラスミドｐＳＷ２２０−５のｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ発現ユニットは、２つのヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）クラスターおよびＮ末端ＦＬＡＧタグをそれぞれコードする配列をさらに含む（図１Ａ）。ｐＳＷ２２０−５を用いて形質転換した細菌発現系の培養物から得られたタンパク質調製物には、全長ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡに相当する主生成物、および主要なバンドの直下に現れる主要な副産物（約１０％）が含まれる。この２つのタンパク質はいずれも、精製後のタンパク質調製物に対してＳＤＳ−ＰＡＡゲルのクマシー染色（図２Ａ、左レーンを参照）、およびＥＴＡ特異的抗体を用いたイムノブロット実験（データ示さず）を行うことによって、検出できる。また、以前行なったイムノブロット実験において、上記の副産物がｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡの外毒素Ａ部分に対する抗体によって認識されることが明らかになった。したがって、この副産物は、全長ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡの発現の過程または発現後に、細菌由来のプロテアーゼによるタンパク質分解によって生成されると考えられてきた。これまで標準的なタンパク質精製技術では、この末端切断型タンパク質断片を除去することはできなかった。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】抗体毒素ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡの各種誘導体の概観と各配列の特徴（Ａ）細菌発現系に用いるｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ誘導体のコンストラクト すべての発現カセットは、ＩＰＴＧで誘導可能なｔａｃプロモーターの制御下にあり、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ（ＥＴＡ）（野生型毒素の第２５２〜６１３番目の残基に相当）と融合した、ＥｒｂＢ２特異的なｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）をコードする。プラスミドｐＳＷ２２０−５は、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ（Ｆ）および２つのＨｉｓ６クラスター（Ｈ）をそれぞれコードする配列を有する。ｐＳＥＳ２１２およびｐＳＥＳ２１３においては、このＦＬＡＧタグとＨｉｓ６クラスターが欠失している。ｐＳＥＳ２１３は、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）配列内に変異を有し、９２番目のメチオニン（Ｍ）がセリン（Ｓ）に置換されている。その他の点では、ｐＳＥＳ２１３はｐＳＥＳ２１２と同一である。 （Ｂ）プラスミドｐＳＥＳ２１２およびｐＳＥＳ２１３におけるｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡの部分的ＤＮＡ塩基配列（配列番号１０）および部分的タンパク質配列（配列番号９） ９２番目のコドンが、潜在的な内部開始コドンＡＴＧからＴＣＧに置換されていることを示す。下線部は、シャイン−ダルガノ配列と中程度の類似性を持つ配列である。
【図２】抗体毒素ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡの各種誘導体の発現およびその生物学的抗腫瘍活性 （Ａ）ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２２０−５）、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２１２）およびｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）の各タンパク質調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 発現プラスミドｐＳＷ２２０−５、ｐＳＥＳ２１２またはｐＳＥＳ２１３で形質転換された大腸菌ＤＨ５αは、それぞれのｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ誘導体を発現した。封入体を単離して変性させた後、再生させた。各タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クマシー染色を行いタンパク質を検出した。全長ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡタンパク質およびｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡタンパク質に相当するバンドを白矢印で示す。プラスミドｐＳＷ２２０−５およびｐＳＥＳ２１２の発現産物を含む試料には、主要な分解産物が含まれる（黒矢印）。ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）調製物には、この望ましくない副産物は含まれない。 （Ｂ）ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２２０−５）およびｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）の生物活性 ヒトｃ−ｅｒｂＢ２ ｃＤＮＡが安定導入されたマウスＲｅｎｃａ−ｌａｃＺ／ＥｒｂＢ２腎癌細胞（左パネル）、およびＥｒｂＢ２陰性Ｒｅｎｃａ−ｌａｃＺコントロール細胞（右パネル）に、表示した濃度のｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２２０−５）またはｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）を加えて４８時間インキュベートした。各濃度あたり３ウェルずつ用いた。ＭＴＴ代謝アッセイで５９０ｎｍの吸光度を測定することにより、細胞の生存率を求めた。ＰＢＳで処理した細胞をコントロールとした。エラーバーは、平均値の標準偏差を示す。 （Ｃ）ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）のｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２２０−５）に対する活性比 表示した各タンパク濃度で処理した抗原陽性標的細胞および抗原陰性標的細胞において、（Ｂ）で求めたＡ５９０値を、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）処理群のｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２２０−５）処理群に対する比で示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の目的は、全長ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡが有する、治療上意味のある生物活性に影響を与えることなく、この全長タンパク質の末端切断型断片の生成を防ぐことである。本発明を適用すると、細菌発現系を用いた発現を行う際に、このような望ましくない副産物は生成しない。したがって、高純度のタンパク質調製物が容易に得られる。
【００１０】
本発明には、細菌発現系で得られた培養物から、上述した末端切断型の副産物を含まない均質なタンパク質調製物が得られるように、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡをコードする発現ユニットを変更することが包含される。本発明者らは、先の考察とは異なり、このような副産物の生成は全長タンパク質の分解によって起こるのではなく、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ ｍＲＮＡのｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）配列内にある内部ＡＵＧコドンからも翻訳が開始された結果であるという仮説を立てた。
【００１１】
第１の態様において、本発明は、配列番号１１の第２〜１２０番目のアミノ酸残基を含む第１のアミノ酸配列と、配列番号１１の第１３６〜２４２番目のアミノ酸残基を含む第２のアミノ酸配列とを含むポリペプチドであって、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列がペプチドスペーサー基によって連結しているポリペプチドに関する。好ましくは、本発明のポリペプチドは下記の構造を含む。
ＶＨ−Ｓｐ−ＶＬ
（式中、ＶＨは第１のアミノ酸配列を示し、Ｓｐはペプチドスペーサー基を示し、ＶＬは第２のアミノ酸配列を示す。）
【００１２】
従って、第１のアミノ酸配列は、通常ポリペプチドのＮ末端に位置する。通常、本発明のポリペプチドは、スペーサー基、好ましくはペプチドによって、重鎖の可変ドメインと軽鎖の可変ドメインが連結されている１本鎖抗体である。本発明のポリペプチドの第１のアミノ酸配列は、重鎖の可変ドメインを表し、第２のアミノ酸配列は、軽鎖の可変ドメインを表す。重鎖の可変ドメインが組換え抗体のＮ末端に位置する一本鎖抗体が最も好ましい。
【００１３】
第１のアミノ酸配列は、配列番号１１の第２〜１２０番目のアミノ酸残基を含み、好ましくは、配列番号１１の第１〜１２０番目のアミノ酸残基を含むか、または配列番号１１の第１〜１２０番目のアミノ酸残基からなる。さらに好ましい実施形態において、第１のアミノ酸配列は、配列番号１の第２〜１２０番目のアミノ酸残基を含み、好ましくは、配列番号１の第１〜１２０番目のアミノ酸残基を含むか、または配列番号１の第１〜１２０番目のアミノ酸残基からなる。
【００１４】
第２のアミノ酸配列は、配列番号１１の第１３６〜２４２番目のアミノ酸残基を含み、好ましくは、配列番号１１の第１３６〜２４２番目のアミノ酸残基からなる。
【００１５】
ペプチドスペーサー基の長さは、３〜３０アミノ酸残基、好ましくは５〜２５アミノ酸残基、より好ましくは１０〜２０アミノ酸残基、最も好ましくは約１５アミノ酸残基（例えば、１３、１４、１５、１６または１７アミノ酸残基など）である。また、ペプチドスペーサー基は、グリシンおよびセリンから選ばれるアミノ酸から構成されることが好ましい。スペーサー基は、３つのＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ反復サブユニットから構成される１５アミノ酸残基のペプチドであることが特に好ましい。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むことが好ましく、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むことがより好ましい。
【００１７】
配列番号１１のアミノ酸Ｘａａは、メチオニン以外の任意のアミノ酸であってもよく、または存在しなくてもよい。後者の場合、９１番目と９３番目のアミノ酸が直接ペプチド結合によって連結する。配列番号１１のＸａａとしては、天然アミノ酸、非天然アミノ酸および修飾アミノ酸を含む、メチオニン以外の任意のアミノ酸などが挙げられる。Ｘａａが天然アミノ酸である場合、Ｘａａとしては、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはセレノシステインなどが挙げられる。Ｘａａは、セリン、アラニン、トレオニンおよびシステインからなる群より選ばれるのが好ましく、セリンが最も好ましい。Ｘａａが非天然アミノ酸または修飾アミノ酸である場合、Ｘａａとしては、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、エチルグリシンまたはエチルアスパラギンなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、Ｘａａは、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５の表４で定義されるような任意の修飾アミノ酸であってもよい。この表は、参照により本明細書に援用される。
【００１８】
また、Ｘａａが「存在しなくてもよい」とは、ＦＲＰ５配列の９２番目のメチオニン（例えば、配列番号９を参照）が欠失し、かつ別のアミノ酸によって置換されていないことを意味する。この実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【００１９】
本発明の一本鎖組換え抗体は、エフェクター分子および／または宿主細胞内で産生された抗体のプロセシングを促進するためのシグナル配列をさらに含んでもよい。
【００２０】
エフェクター分子とは、治療上または診断上有用な分子を意味する。例えば、検出可能な反応を起こす酵素、例えばホスファターゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のアルカリホスファターゼや、ウシ由来のアルカリホスファターゼなどの哺乳動物由来アルカリホスファターゼ）、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素またはグルコース−６−リン酸；特異的な結合特性を有するペプチド、例えば、ビオチンと強力に結合する、ストレプトミセス属アビジニイ由来のストレプトアビジン；または抗体が結合した細胞を攻撃する酵素、毒素またはその他の薬剤、例えば、プロテアーゼ、細胞溶解素、外毒素（例えば、リシンＡ、ジフテリア毒素Ａ、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素など）などが挙げられる。以下、エフェクター分子をさらに含む一本鎖組換え抗体は、「融合タンパク質」と表すか、あるいは該当する場合、「一本鎖（組換え）抗体」または「組換え抗体」の定義に含まれるものとする。エフェクター分子は、細胞致死活性を有するポリペプチドであってもよい。細胞致死活性は、本出願の実施例３に従い測定することができる。
【００２１】
「エフェクター分子」は、生物活性を有する、上述のタンパク質の変異体も包含する。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで突然変異させたＤＮＡから生成される変異体が挙げられるが、このＤＮＡによってコードされるタンパク質が、対応する天然タンパク質の生物活性を保持していることが前提である。このような変異としては、アミノ酸の付加、置換または欠失が挙げられ、欠失が起こった場合、全長が短い変異体が得られる。例えば、コード遺伝子のクローニングを容易にするためにＤＮＡを修飾して、ホスファターゼなどの酵素を生成してもよい。または、細胞に対する結合ドメインを欠失させる、および／または細胞致死活性を増強または軽減させるようにＤＮＡを変異させて、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素などの外毒素を生成してもよい。
【００２２】
エフェクターポリペプチドは、配列番号１の第２４５〜６０６番目のアミノ酸残基を含んでもよい。
【００２３】
また、「エフェクター分子」には、細胞致死活性を有する化学物質も含まれる。細胞致死活性は、本出願の実施例３に従い測定することができる。このような化学物質としては、化学療法剤、細胞毒性化合物または細胞増殖抑制性化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。化学療法剤および細胞毒性化合物の例としては、下記が挙げられる。
−アルキル化剤
−細胞毒性を有する抗生物質
−代謝拮抗剤
−ビンカアルカロイドおよびエトポシド
−その他
【００２４】
アルキル化剤は、ＤＮＡ合成に使われるヌクレオチド前駆体に存在する化学物質のような求核性残基と反応する。アルキル化剤は、これらのヌクレオチドをアルキル化することにより、ヌクレオチドが結合してＤＮＡが構築されるのを阻害し、細胞分裂の過程に影響を与える。アルキル化剤としては、例えばマスタージェン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ）、リン酸エストラムスチン、メルファラン、クロラムブチル、プレドニムスチン、シクロホスファミド、イホスファミド、トロホスファミド、ブスルファン、トレオサルファン、チオテパ、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ニムスチン（ＡＣＮＵ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、シスプラチンまたはカルボプラチンなどが好ましく挙げられる。
【００２５】
細胞毒性を有する抗生物質は、直接ＤＮＡ合成またはＲＮＡ合成を阻害することによって作用し、細胞周期を通して効力を発するものである。細胞毒性を有する抗生物質としては、例えばアクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）またはトポテカンなどが好ましく挙げられる。
【００２６】
代謝拮抗剤は、細胞分裂過程に関わる細胞内酵素または天然代謝物質と拮抗して、細胞分裂を阻害する。代謝拮抗剤としては、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、クラドリビン、５−フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビンまたはヒドロキシ尿素などが好ましく挙げられる。
【００２７】
植物アルカロイドおよびエトポシドは、植物由来の薬剤で、細胞分裂に必要な細胞成分の集合を阻害することにより、細胞の複製を阻害する（例えば、ビンカアルカロイド、エトポシドなど）。植物アルカロイドおよびエトポシドとしては、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エトポシド（ＶＰ１６）またはテニポシド（ＶＭ２６）などが好ましく挙げられる。
【００２８】
「その他」の化合物群としては、主としてタキサン剤（例えば、パクリタキセル、タキソール、ドセタキセル、タキソテールなど）や金属錯体（例えば、シスプラチン）が挙げられ、シグナル伝達阻害剤（ＳＴＩ）や特定の酵素機能に対する阻害剤（例えば、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤などが挙げられるが、これらに限定されない）も挙げられる。ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤は、例えば、ボリノスタット、ベリノスタット、ＰＣＩ−２４７８１、ＣＨＲ−３２４２、ＪＮＪ−１６２４１１９９、ＭＧＣＤ−０１０３、ロミデプシン、ＭＳ−２７５、酪酸塩、バルプロ酸およびこれらの組み合わせからなる群より選ばれる。キナーゼ阻害剤は、例えば、イマチニブ、セディラニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、レスタウルチニブ、エンザスタウリン、パゾパニブ、アルボシディブ、ニロチニブ、バタリニブ、エルロチニブ、スニチニブおよびこれらの組み合わせからなる群より選ばれる。プロテアーゼ阻害剤は、例えば、ＷＸ−ＵＫ１、ボルテゾミブおよびこれらの組み合わせからなる群より選ばれる。
【００２９】
また、細胞致死活性を有する化学物質は、例えばコバルト６０などの放射性物質であってもよい。
【００３０】
エフェクター分子は、共有結合または非共有結合によって本発明のポリペプチドと結合していてもよい。エフェクター分子が、共有結合によって本発明のポリペプチドに結合している場合、該ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端のいずれの部分と融合していてもよい。エフェクター分子が、第２のアミノ酸配列のＣ末端と融合して、融合ポリペプチドを形成するのが好ましい。この融合ポリペプチドにおいては、第２のアミノ酸配列とエフェクター分子のアミノ酸配列との間に１以上（例えば２、３、４または５）のアミノ酸が存在していてもよい。
【００３１】
最も好ましい本発明のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列の第２〜６０６番目のアミノ酸残基を含むか、配列番号３のアミノ酸配列の第１〜６０６番目のアミノ酸残基を含むか、または配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、別のペプチド、例えば、精製を容易にするためのペプチド、特に、抗体の適用が可能なエピトープペプチド（例えば、ＦＬＡＧペプチドなど）を適宜含んでもよい。このようなペプチドを含む融合タンパク質は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を、迅速、特異的かつ／または穏和に実施できるため有利である。前記ペプチドは、融合タンパク質のＮ末端、組換え抗体とエフェクター分子との間、融合タンパク質のＣ末端のいずれに配置されてもよいが、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に配置されるのが好ましく、Ｎ末端に配置されるのが特に好ましい。これらのコンストラクトは、さらに切断部位を含むことが好ましく、それにより、例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａなどの酵素による切断、または当技術分野で公知の化学的方法によってこの切断部位から融合タンパク質を遊離することができる。これらのコンストラクトは、前記ペプチドおよび／または前記切断部位と、組換え抗体とが容易に結合できるように、１以上、例えば、１〜１０、とりわけ２程度のアミノ酸からなるペプチドスペーサーをさらに含んでもよい。前記切断部位は、組換え抗体およびエフェクター分子を含む融合タンパク質を必要に応じて容易に遊離できるように、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏで容易に遊離できるように配置される。例えば、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡで示される融合タンパク質を含むタンパク質コンストラクトにおいて、ＦＬＡＧペプチドおよびエンテロキナーゼ切断部位がスペーサーに連結され、Ｆｖ重鎖／軽鎖の可変ドメインおよび外毒素Ａを含む融合タンパク質の上流に配置される。必要に応じて、好ましくは上記タンパク質のアフィニティ精製の後に、エンテロキナーゼによってＦＬＡＧペプチドを切り離すことにより、一本鎖抗体Ｆｖ（ＦＲＰ５）および外毒素Ａを含む融合タンパク質を生成できる。
【００３３】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。一般に、「ポリヌクレオチド」とは、変更を加えたＲＮＡまたはＤＮＡであっても、変更を加えていないＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを表す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡであっても、一本鎖または二本鎖のＲＮＡであってもよい。本明細書に用いられる「ポリヌクレオチド」には、１つ以上の修飾塩基および／または例外的な塩基（例えば、イノシンなど）を含むＤＮＡやＲＮＡも含まれる。当然のことながら、当業者に公知の多くの有用な目的に合致するように、様々な変更をＤＮＡやＲＮＡに対して加えてもよい。このように、本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」は、例えば単純細胞や複雑型細胞を含むウイルスおよび細胞に特有のＤＮＡやＲＮＡの化学的形態だけでなく、化学的、酵素的または代謝的に変化した形態のポリヌクレオチドも包含する。
【００３４】
配列番号１１で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが好ましく、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがより好ましい。配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがさらに好ましい。最も好ましいポリヌクレオチドは、配列番号２で表されるヌクレオチド配列または配列番号４で表されるヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドは、単離ポリヌクレオチドが好ましい。「単離」ポリヌクレオチドとは、他の核酸配列、例えば他の染色体のＤＮＡやＲＮＡ、他の染色体外のＤＮＡやＲＮＡなど（ただし、これらに限定されない）を実質的に含まないポリヌクレオチドを表す。単離ポリヌクレオチドは、宿主細胞から精製されたものでもよく、当業者に公知の慣用の核酸精製方法を用いて、単離ポリヌクレオチドを得ることができる。「単離」ポリヌクレオチドはさらに、組換えポリヌクレオチドおよび化学合成されたポリヌクレオチドを含む。
【００３６】
本発明のさらに別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターのプラスミドである。「プラスミド」および「ベクター」は、染色体外構成要素を意味し、該構成要素は多くの場合細胞の中央代謝に属さない遺伝子を含み、通常、環状の二本鎖ＤＮＡ断片の形態をとる。このような構成要素としては、自律複製配列、ゲノム組込み型配列、ファージ、またはあらゆる起源の一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡやＲＮＡで鎖状もしくは環状のヌクレオチド配列などが挙げられる。このような構成要素において、様々なヌクレオチド配列の連結または組換えによって独自のコンストラクトが形成され、このコンストラクトによって、選択した遺伝子産物を得るためのプロモーター断片やＤＮＡ塩基配列が、適切な３’非翻訳配列と共に細胞へ導入される。通常、プラスミドまたはベクター内の本発明のポリヌクレオチドは、１つ以上の発現調節配列に作用可能に連結している。
【００３７】
「作用可能に連結する」とは、１つの核酸断片上で核酸配列同士が連結して、一方が他方の機能に影響を及ぼすことができる状態を意味する。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写調節下にある場合）、前記プロモーターは、前記コード配列と作用可能に連結していることになる。コード配列は、センス方向、アンチセンス方向のいずれの向きにも調節配列と作用可能に連結できる。「プロモーター」は、遺伝子の転写開始点より上流に位置するＤＮＡ塩基配列で、遺伝子の転写開始に必要なＲＮＡポリメラーゼおよび／またはその他のタンパク質の認識と結合に関わる。通常、遺伝子の発現条件はプロモーターによって決まる。本明細書に用いられるプロモーターと、該プロモーターに作用可能に連結された本発明のポリヌクレオチドの起源は通常異なる。
【００３８】
ベクターは、一般に、互換性のある宿主細胞と共同で２つの機能を発揮する。１つの機能は、免疫グロブリンの可変領域をコードする核酸のクローニングを促進すること、つまり、利用可能な量の核酸を産生することである（クローニングベクター）。もう一方の機能は、ベクターが染色体外因子として保持される、または宿主染色体に組込まれることによって、適切な宿主内で組換え遺伝子コンストラクトの複製と発現を行うことである（発現ベクター）。クローニングベクターは、上記のような組換え遺伝子コンストラクト、複製開始点または自律複製配列、および優性のマーカー配列を含み、任意でシグナル配列および追加の制限酵素認識部位を含む。発現ベクターは、これらに加えて、組換え遺伝子の転写と翻訳に不可欠な発現調節配列をさらに含む。
【００３９】
複製開始点または自律複製配列は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）といったウイルスなどに由来する外来性の複製起点を含むベクターを構築することにより提供されるか、または宿主細胞の染色体機構から提供される。
【００４０】
マーカーは、当該ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする。選択マーカーとしては、銅などの重金属、もしくはジェネティシン（Ｇ−４１８）、カナマイシン、ハイグロマイシンなどの抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子、またはチミジンキナーゼ、ヒポキサンチンホスホリル転移酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素等の欠損といった宿主細胞の遺伝子損傷を補完する遺伝子などが挙げられる。
【００４１】
シグナル配列としては、例えば、組換え抗体の分泌を指示するプレ配列や分泌リーダー、またはスプライシングシグナルなどが挙げられる。組換え抗体の分泌を指示するシグナル配列としては、例えば、ｏｍｐＡ遺伝子、ｐｅｌＢ（ペクチン酸リアーゼ）遺伝子またはｐｈｏＡ遺伝子のシグナル配列が挙げられる。
【００４２】
ベクターＤＮＡは、発現調節配列として、プロモーター、転写の開始と終結に必要な配列、およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含み、任意でエンハンサーおよびさらなる制御配列を含む。
【００４３】
宿主細胞の特徴に応じて、種々のプロモーター配列を用いることができる。強力で規則正しく機能するプロモーターが最も有用である。翻訳開始配列としては、例えば、シャイン−ダルガノ配列が挙げられる。転写の開始と終結に必要な配列、およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列は、一般に、ウイルスｃＤＮＡまたは真核生物ｃＤＮＡの５’非コード領域および３’非コード領域のもの（例えば、発現宿主由来のもの）をそれぞれ利用できる。エンハンサーとしては、ウイルス（例えば、シミアンウイルス、ポリオーマウイルス、ウシ乳頭腫ウイルスまたはモロニー肉腫ウイルス）由来、またはゲノム由来（特にマウス由来）の転写促進に関わるＤＮＡ塩基配列が挙げられる。
【００４４】
大腸菌株内での複製と発現に好適なベクターとしては、例えばバクテリオファージλ誘導体などのバクテリオファージや、プラスミド、具体的には、プラスミドＣｏｌＥ１およびその誘導体（例えばｐＭＢ９、ｐＳＦ２１２４、ｐＢＲ３１７、ｐＢＲ３２２およびその誘導体（例えば、ｐＵＣ９、ｐＵＣＫ０、ｐＨＲｉ１４８およびｐＬｃ２４など）など）が挙げられる。好適なベクターは、完全なレプリコン、マーカー遺伝子および制限酵素認識配列を含み、外来性ＤＮＡと、該当する場合、発現調節配列とを上記制限酵素認識配列に挿入することができる。また、好適なベクターは、任意でシグナル配列とエンハンサーを含む。
【００４５】
微生物由来プロモーターとしては、例えば、温度感受性リプレッサーにより制御され、左方向への転写開始に関わる、バクテリオファージλ由来の強力なＰＬプロモーターが挙げられる。また、例えば、ｌａｃ（ラクトース）リプレッサーにより調節され、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドにより誘導されるｌａｃプロモーター、ｔｒｐ（トリプトファン）リプレッサーにより調節され、トリプトファン欠乏などにより誘導されるｔｒｐプロモーター、およびｌａｃリプレッサーにより調節されるｔａｃプロモーター（ｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などの大腸菌プロモーターも好適である。
【００４６】
酵母内での複製と発現に好適なベクターは、酵母の複製開始点および酵母選択的な遺伝子マーカーを含む。このようなベクターとして、複製開始点としていわゆるａｒｓ配列（自律複製配列）を含むベクター群が挙げられる。このベクター群は、酵母細胞を形質転換した後、酵母細胞内の染色体外に保持され、自律的に複製する。さらに、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の２ミクロンプラスミドＤＮＡの全配列またはその一部を含むベクターを用いることもできる。このベクターは、組換えによって、細胞内に既に存在する２ミクロンプラスミドに組み込まれるか、または自律的に複製する。高い形質転換率と高いコピー数が求められる場合、この２ミクロン配列は特に好適である。
【００４７】
酵母内での発現に好適な発現調節配列としては、例えば高発現する酵母遺伝子の発現調節配列が挙げられる。したがって、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩもしくはＡＤＨII遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ３またはＰＨＯ５）遺伝子、およびイソチトクロム遺伝子のプロモーター；またはエノラーゼ遺伝子、グリセロアルデヒド−３−リン酸キナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子、ヘキソキナーゼ遺伝子、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、ホスホフクルトキナーゼ遺伝子、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ遺伝子、ピルビン酸キナーゼ遺伝子、トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子、ホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子およびグルコキナーゼ遺伝子のプロモーターなどの、解糖系に関わるプロモーターを用いることができる。
【００４８】
哺乳動物細胞内での複製と発現に好適なベクターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス２型、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）、パポーバウイルスＢＫ変異体（ＢＫＶ）、またはマウスもしくはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などのウイルスのＤＮＡに由来するプロモーター配列を備えていることが好ましい。また、上記ベクターは、アクチン、コラーゲン、ミオシンなどの、哺乳動物の発現産物に対するプロモーター、または所望の遺伝子配列に通常関連する内因性のプロモーターや調節配列（すなわち、免疫グロブリンの重鎖プロモーターまたは軽鎖プロモーター）を含んでもよい。
【００４９】
原核、真核のいずれの宿主細胞にも好適で、ウイルス複製システムに基づくベクターが好ましく、シミアンウイルスプロモーター（例えば、ｐＳＶｇｐｔ、ｐＳＶｎｅｏなど）を含み、エンハンサー（例えば、免疫グロブリン遺伝子配列に通常関連するエンハンサー、具体的にはマウスＩｇの重鎖エンハンサーまたは軽鎖エンハンサー）をさらに含むベクターが特に好ましい。
【００５０】
例えば、形質転換した宿主細胞を培養し、適宜、調製したＤＮＡを単離することにより、本発明の組換え抗体をコードする組換えＤＮＡを調製できる。
【００５１】
本発明の別の態様は、本発明のプラスミドもしくはベクターによって形質転換された、かつ／または該プラスミドもしくはベクターを含む宿主細胞である。好適な宿主細胞としては、原核細胞、真核細胞（例えば哺乳動物細胞）、酵母細胞、細菌（例えば大腸菌）などが挙げられるが、好ましくは、大腸菌である。好適な宿主細胞と形質転換手技は、米国特許第５，９３９，５３１号に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００５２】
また本発明は、宿主細胞の培養方法および本発明のポリペプチドの調製方法に関する。本発明の１つの態様は、本発明のポリペプチドの調製方法で、該方法は、本明細書に記載の宿主細胞を好適な条件下で培養する工程と、本発明のポリペプチドを回収する工程とを含む。米国特許第５，９３９，５３１号に、宿主細胞の培養方法、ならびに一本鎖組換え抗体およびその断片の生成方法が記載されている。これらの方法は、本発明の宿主細胞および本発明のポリペプチドに準用可能で、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００５３】
本発明の別の態様は、ＥｒｂＢ２の異常な活性および／または発現を伴う疾患（例えば癌や腫瘍）に対する治療剤を製造するための、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチドの使用である。このような疾患としては、例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、扁平上皮癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌、膵癌、胃癌、唾液腺癌、耳下腺腫瘍、黒色腫、子宮頚癌、膵癌、結腸癌および結腸直腸癌、膀胱癌、髄芽腫、腎臓癌、肝臓癌ならびに胃癌などが挙げられるが、これらに限定されない。このような疾患には、転移および／または微小残存病変も含まれる。
【００５４】
したがって、本発明は、医薬組成物（例えば、成長因子受容体ｃ−ｅｒｂＢ−２を過剰発現する腫瘍の治療に用いる）にも関する。該医薬組成物は、治療上有効量の本発明のポリペプチドおよび、薬学的に許容されるキャリア、希釈液または溶媒を含み、好ましくは、非経口用医薬組成物である。筋肉内、皮下、または静脈内投与用の組成物としては、例えば、等張の水溶液剤または懸濁剤などが挙げられ、使用直前に凍結乾燥製剤または濃縮製剤より調製されたものであってもよい。油中懸濁剤は、油状成分として、注射用に通常用いられる植物油、合成油または半合成油を含む。本発明の医薬組成物は滅菌されていてもよく、添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節する塩類、緩衝剤および／または粘性を調節する化合物（例えば、カルボキシセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デキストラン、ポリビニルピロリジン、ゼラチンなど）などが挙げられる。
【００５５】
本発明の医薬組成物は、約０．００１〜５０％の有効成分を含む。本発明の医薬組成物の形態としては、例えば、即時使用可能なアンプルまたはバイアルなどの投与単位剤形、または凍結乾燥した固形物などが挙げられる。
【００５６】
本発明のポリペプチドの哺乳動物に対する治療上有効量は、ポリペプチドの種類、患者の状態および投与方法によって異なるが、一般にｋｇ体重当たり約０．１〜１００μｇ、より好ましくは１〜５０μｇ、さらに好ましくは５〜２５μｇである。具体的な投与方法や適切な投与量は、主治医が患者の特性、病状および治療する腫瘍の種類などを考慮して選択する。本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の方法、例えば、混合、溶解、調合（ｃｏｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）、凍結乾燥などの慣用的な操作によって調製される。注射用医薬組成物は、当技術分野で公知の方法に従って処理され、次いでアンプルまたはバイアルへ充填され無菌状態で密封される。
【００５７】
一実施形態において、本発明のポリペプチドを別の抗癌治療と組み合わせて投与する。国際公開公報ＷＯ０３／０２４４４２ Ａ２において「第２の治療薬」として指定された抗癌治療は、すべて本明細書に援用される。
【００５８】
さらに別の態様において、本発明は、受容体型チロシンキナーゼＥｒｂＢ２の細胞外ドメインに対する一本鎖組換え抗体の産生量を向上させる方法に関する。該方法は、配列番号９のコドン９２からの翻訳開始を防ぐことを含む。これは、内部コドン９２（メチオニン９２）から翻訳が開始されることのないように配列番号１０の第２６２〜２７０番目のヌクレオチドのうち１つ以上を変異させることにより達成できる。ヌクレオチドの置換は、コードされるアミノ酸配列が変わらないような形で行われてもよい。
【００５９】
第２６２〜２７０番目のヌクレオチド配列として、３つの例を以下に示すが、本発明はこれらに限定されない。
【表１】
【００６０】
また、第２６２〜２７０番目のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸残基、すなわちリジン、セリンまたはグルタミン酸を、天然または非天然の、化学的に類似したまたは類似しない他のアミノ酸で置換してもよく、これらのアミノ酸残基が、化学修飾されたヌクレオチドによりコードされていてもよい。
【００６１】
また、上述の通り、配列番号９のアミノ酸配列においてメチオニン９２を他のアミノ酸で置換してもよい。他のアミノ酸としてはセリンが好ましい。さらに、上述の通り、配列番号９のアミノ酸配列においてメチオニン９２を他のアミノ酸で置換せずに欠失させてもよい。この実施形態を、配列番号１２のアミノ酸配列に示す。
【実施例】
【００６２】
＜実施例１＞ 変異体発現コンストラクトの分子クローニング
【００６３】
方法
ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ発現ベクターの構築
プラスミドｐＳＷ２２０−５については既に文献に記載されている（非特許文献７）。該プラスミドは、１つのオープンリーディングフレームにＮ末端ＦＬＡＧタグ、第１のＨｉｓ６クラスター、ＥｒｂＢ２特異的なｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）、第２のＨｉｓ６クラスターおよび末端切断型緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ（野生型毒素の第２５２〜６１３番目の残基に相当）をそれぞれコードする配列を含む。プラスミドｐＳＥＳ２１１（未発表；ＴｏｐｏＴａｒｇｅｔ Ｇｅｒｍａｎｙ ＡＧより提供）は、ｐＳＷ２２０−５に由来する、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ発現のためのオープンリーディングフレームを含む。ｐＳＷ２２０−５と同様に第１のＮ末端Ｈｉｓ６クラスターは保持されているが、Ｎ末端ＦＬＡＧタグおよび、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）配列と外毒素Ａ配列との間の内部Ｈｉｓ６クラスターは欠失している。ｐＳＥＳ２１１に残存するＮ末端Ｈｉｓ６クラスターを欠失させることにより、プラスミドｐＳＥＳ２１２が得られた。このプラスミドを作製するために、まず、プラスミドｐＳＥＳ２１１を鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマー５’ＮｄｅＩ−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）、すなわち５’−ＣＧＡＴＴＡＧＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＴＡＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣ−３’（配列番号５）と３’ＸｂａＩ−ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）、すなわち５’−ＧＣＴＧＣＣＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＴＣ−３’（配列番号６）（ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ， Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＰＣＲを行った。この反応によって、Ｎ末端Ｈｉｓ６クラスターのコード配列を持たないｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）断片の配列が増幅された。このＰＣＲ産物を、ＴＡ−クローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてベクターｐＣＲ２．１へサブクローニングした。得られたプラスミドをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、得られたｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）断片を、同じ酵素で消化したｐＳＥＳ２１１に挿入することにより、プラスミドｐＳＥＳ２１２が得られた。プラスミドｐＳＥＳ２１２を鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーｐＳＥＳ２１２＿Ｍ９２Ｓ＿ｓｅｎｓｅ、すなわち５’−ＣＣＴＣＡＡＡＡＧＴＧＡＡＧＡＣＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号７）とｐＳＥＳ２１２＿Ｍ９２Ｓ＿ａｓ、すなわち５’−ＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴＧＴＡＧＣＣＧＡＧＴＣＴＴＣＡＣＴＴＴＴＧＡＧＧ−３’（配列番号８）（ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ）を用いてＰＣＲを行った。これによりメチオニン９２からセリンへの部位特異的変異が起こり、この変異をプラスミドｐＳＥＳ２１２に導入することにより、プラスミドｐＳＥＳ２１３が得られた。すべての発現ベクターのＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシークエンスにより確認した。
【００６４】
結果
ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡコード領域の変異に対する基準物質として、発現プラスミドｐＳＥＳ２１２（未発表）を用いた。ｐＳＥＳ２１２内のｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡコード領域は、ｐＳＷ２２０−５の対応領域に存在する、Ｎ末端ＦＬＡＧタグおよび２つのＨｉｓ６クラスターをそれぞれコードする配列が欠失している（図１Ａを参照）。さらに、ｐＳＥＳ２１２は、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ配列以外のベクターのバックボーンもｐＳＷ２２０−５とは異なる。しかし、これらの違いは、本発明においては大して重要ではない。図２Ａ（左レーンと中央レーン）に示すように、ｐＳＥＳ２１２またはｐＳＷ２２０−５発現ベクターを用いた場合、副産物である末端切断型ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡが同程度産生される。シークエンス分析によって、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）抗体の重鎖内にある相補性決定領域３（ＣＤＲ３）に近いフレームワーク領域３内、すなわちオープンリーディングフレームの第２７４〜２７６番目のヌクレオチド（ｐＳＥＳ２１２のｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡのコドン９２に対応する（図１Ｂを参照））に内部ＡＴＧコドン（ｍＲＮＡレベルではＡＵＧに相当し、内部の潜在的な開始コドンとなる）が存在することをつきとめた。さらに、この潜在的な開始コドンの上流にある第２６２〜２７０番目のヌクレオチド（図１Ｂ；下線部）に、シャイン−ダルガノ配列と中程度の類似性を持つ配列が存在する。
【００６５】
この内部ＡＴＧ／ＡＵＧコドンを変異させることによって望ましくない副産物の生成を防ぐことが可能かどうか調べるために、変異体発現プラスミドｐＳＥＳ２１３を作製した。ｐＳＥＳ２１３は、変異を有し、９２番目のコドンがＡＴＧからＴＣＧに置換されている。その結果、該コドンがコードするアミノ酸残基はメチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）ではなくセリン（Ｓｅｒ；Ｓ）になる（図１を参照）。その他の点においては、ｐＳＥＳ２１３はｐＳＥＳ２１２と同一である。メチオニンの代わりにセリンを選んだ理由としては、サブグループＶに属する他のマウス抗体重鎖では、対応する位置にセリンが存在すること（非特許文献１３）、さらに、セリンとメチオニンでは等電点や側鎖の長さが類似していることが挙げられる。
【００６６】
本発明の別の実施形態において、メチオニン以外のアミノ酸をコードするようにコドン９２を置換するもしくはコドン９２を欠失させる、および／またはシャイン−ダルガノ配列に類似しないようにもしくはシャイン−ダルガノ配列として機能しないように第２６２〜２７０番目のヌクレオチド配列を変異させることによって、同様に上記の問題を解決してもよい。
【００６７】
＜実施例２＞ 大腸菌におけるｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ誘導体の発現
【００６８】
方法
大腸菌におけるｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ誘導体の発現、封入体の調製、可溶化およびリフォールディング
発現プラスミドｐＳＷ２２０−５、ｐＳＥＳ２１２またはｐＳＥＳ２１３を用いて、大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。１Ｌの発現培養物（ＬＢ、０．５％グルコース、および５０μｇ／ｍｌカナマイシン（ｐＳＥＳ２１２またはｐＳＥＳ２１３の場合）または１００μｇ／ｍｌアンピシリン（ｐＳＷ２２０−５の場合）を含む）を、ＯＤ６００が０．８になるまで３７℃で培養した。その後、培養物に０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加して、３時間発現誘導を行った。遠心分離（７，５００ｇ、１０ｍｉｎ）により回収した細胞を、ＰＢＳに再懸濁し、フレンチプレス細胞破砕機（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）を用いて溶解した。遠心分離（１０，０００ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）により回収した封入体を、洗浄バッファー（２Ｍ尿素、２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および５００ｍＭ ＮａＣｌを含有するＰＢＳ（ｐＨ８））に再懸濁し、その後遠心分離（１０，０００ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）を行って封入体を洗浄した。精製した封入体を可溶化バッファー（８Ｍ尿素および５００ｍＭ ＮａＣｌを含有するＰＢＳ（ｐＨ８））に再懸濁した。これを遠心分離した後、上清画分をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析した。遠心分離（４０，０００ｇ、３０ｍｉｎ、４℃）後、０．２２μｍフィルターでろ過して沈殿を除去した。得られたタンパク質を小分けにして−８０℃で保存した。
【００６９】
結果
ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ誘導体を生成するために、ｐＳＷ２２０−５、ｐＳＥＳ２１２またはｐＳＥＳ２１３を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、それぞれＬＢＫａｎ寒天プレート（ｐＳＥＳ２１２およびｐＳＥＳ２１３の場合）またはＬＢＡＭＰ寒天プレート（ｐＳＷ２２０−５の場合）上で形質転換体を選別した。シングルコロニーを１Ｌの発現培養液に植菌し、これを下記「材料と方法」セクションに記載の通りに培養して発現誘導を行った。この培養物から得られた細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁し、フレンチプレス細胞破砕機（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）を用いて細胞を溶解した。ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡタンパク質は、主に、この溶解物の不溶性画分に存在した（データ示さず）。遠心分離により回収した封入体を、２Ｍ尿素および２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むバッファーで洗浄した後、８Ｍ尿素を含むバッファーを用いて変性させた。これを遠心分離した後、上清画分をＰＢＳで透析することによりタンパクを再生させた。この部分的に精製された再生タンパク質に対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと次いでクマシー染色を実施し分析を行った（図２Ａを参照）。各タンパク質をｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡまたはｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡとして表し、続いて、括弧内に発現ベクター名を表示した［ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２２０−５）、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２１２）、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）］。いずれの発現培養物においても、再生された可溶性タンパク質の収量は、一様に約３０〜５０ｍｇであった。図２Ａに示すように、得られたｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２２０−５）とｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２１２）のそれぞれのタンパク質調製物は、主要な副産物（黒矢印）を含み、この副産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて全長生成物（白矢印）のバンドの直下に現れた。一方、このような望ましくない副産物は、全く同様のプロトコールに従って単離したｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）調製物には含まれなかった。
【００７０】
驚くべきことに、これらのデータから、コドン９２をＡＴＧからＴＣＧに置換して、これに対応するアミノ酸残基をメチオニンからセリンに置換することは、副産物の生成を完全に防ぐ上で必要十分であることが示された。
【００７１】
＜実施例３＞ ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡの生物活性
【００７２】
方法
細胞および培養条件
大腸菌β−ガラクトシダーゼ単独、または大腸菌β−ガラクトシダーゼおよびヒトＥｒｂＢ２を安定発現するマウス腎癌細胞（それぞれ、Ｒｅｎｃａ−ｌａｃＺ、Ｒｅｎｃａ−ｌａｃＺ／ＥｒｂＢ２）（非特許文献８）を、１０％熱不活化ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５ｍｇ／ｍｌ Ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）および０．４８ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｒｅｎｃａ−ｌａｃＺ／ＥｒｂＢ２の場合のみ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地でそれぞれ維持した。
【００７３】
細胞の生存率アッセイ
通常の増殖培地を用いて、１．５×１０４細胞／ウェルの濃度になるように９６穴プレートに細胞を播種した。希釈液のみまたは様々な濃度に調製したｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ融合タンパク質をそれぞれ加え、これらの細胞を５％ＣＯ２−９５％加湿空気の環境下で３７℃、４８時間インキュベートした。各試料につき３ウェルずつ用いた。各ウェルに１０ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（Ｓｉｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ））含有ＰＢＳ溶液を１０μｌずつ加えて、細胞をさらに３時間インキュベートした。その後、２０％ＳＤＳを含む５０％ジメチルフォルムアミド溶液（ｐＨ４．７）を９０μｌ添加して、細胞を溶解した。可溶化処理後、マイクロプレートリーダーで５９０ｎｍの吸光度を測定することにより、茶色を呈するホルマザン代謝物質の形成に基づく発色の強度を定量化した。細胞の入っていないセルをブランクとした。
【００７４】
結果
ヒトＥｒｂＢ２を発現するマウスＲｅｎｃａ−ｌａｃＺ／ＥｒｂＢ２腎癌細胞および、コントロールとしてＥｒｂＢ２陰性Ｒｅｎｃａ−ｌａｃＺ腎癌細胞を用いたＭＴＴ代謝アッセイ（非特許文献８）により、各ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ誘導体の腫瘍細胞に対する殺細胞能における選択性と有効性を評価した。ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ（２１３）タンパク質と並行して発現・精製を行って得られたｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ（２２０−５）タンパク質を細胞傷害活性アッセイの標準物質として用いた。標的細胞を漸増濃度（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）の融合タンパク質とともに４８時間インキュベートした。細胞を溶解し、可溶化処理を行った後、マイクロプレートリーダーで５９０ｎｍの吸光度を測定することにより、細胞の生存率を定量化した（図２Ｂ）。細胞の入っていないセルをブランクとした。１０μｇ／ｍｌ以下の供試濃度では、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ融合タンパク質およびｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ融合タンパク質は、ＥｒｂＢ２陰性Ｒｅｎｃａ−ｌａｃＺ細胞の生存に影響を及ぼさなかった（図２Ｂ）。一方、ＥｒｂＢ２陽性Ｒｅｎｃａ−ｌａｃＺ／ＥｒｂＢ２細胞に対しては、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡ融合タンパク質およびｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡ融合タンパク質は、濃度依存的に十分な殺細胞能を同等に発揮した（図２Ｂ）。図２Ｃは、様々な供試濃度における、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡのｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡに対する殺細胞活性比を示す。１．００に近い値は、有意差がないことを示す。得られた値から、生物活性においてｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡとｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡとの間に有意差は見られないことが示された。
【００７５】
驚くべきことに、これらのデータから、コドン９２をＡＴＧからＴＣＧに置換して、これに対応するアミノ酸残基をメチオニンからセリンに置換しても、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡの生物活性は影響を受けないことが示された。ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５−Ｍ９２Ｓ）−ＥＴＡの抗腫瘍活性は、ｓｃＦｖ（ＦＲＰ５）−ＥＴＡと区別できないほど類似しており、また、ＥｒｂＢ２を発現する腫瘍細胞に対する選択性も保持される。
【００７６】
本明細書に記載の本発明の様々な実施形態は、互いに組み合わせることができる。
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１の第２〜１２０番目のアミノ酸残基を含む第１のアミノ酸配列と、配列番号１１の第１３６〜２４２番目のアミノ酸残基を含む第２のアミノ酸配列とを含むポリペプチドであって、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列がペプチドスペーサー基によって連結しているポリペプチド。
【請求項２】
前記第１のアミノ酸配列が、配列番号１の第２〜１２０番目のアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記第１のアミノ酸配列が、配列番号１の第１〜１２０番目のアミノ酸残基からなることを特徴とする請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１１、配列番号１および配列番号１２から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項５】
エフェクター分子をさらに含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
エフェクター分子が、細胞致死活性を有するポリペプチドであることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
細胞致死活性を有するポリペプチドが毒素であるか、または生物活性を有するその変異体であることを特徴とする請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
毒素が緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素であるか、または生物活性を有するその変異体であることを特徴とする請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
エフェクター分子が、細胞致死活性を有する化学物質であることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
細胞致死活性を有する化学物質が、化学療法剤、細胞毒性化合物および細胞増殖抑制性化合物からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
細胞致死活性を有する化学物質が、放射性物質であることを特徴とする請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号２で表されるヌクレオチド配列を含む請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号４で表されるヌクレオチド配列を含む請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
１つ以上の発現調節配列と作用可能に連結した請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクター。
【請求項１７】
複製開始点または自律複製配列、１つ以上のマーカー配列および、任意で追加の制限酵素認識部位をさらに含む請求項１６に記載のプラスミドまたはベクター。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載のプラスミドまたはベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１９】
大腸菌であることを特徴とする請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の宿主細胞を好適な条件下で培養する工程と、一本鎖組換え抗体またはその断片を回収する工程とを含む、一本鎖組換え抗体またはその断片の調製方法。
【請求項２１】
ＥｒｂＢ２の異常な活性および／または発現を伴う疾患に対する治療剤を製造するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２２】
治療対象の疾患が、癌であることを特徴とする請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
癌が、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、扁平上皮癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌、膵癌、胃癌、唾液腺癌、耳下腺腫瘍、黒色腫、子宮頚癌、膵癌、結腸癌および結腸直腸癌、膀胱癌、髄芽腫、腎臓癌、肝臓癌ならびに胃癌からなる群より選ばれることを特徴とする請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
配列番号１０のコドン９２からの翻訳開始を防ぐことを含む、受容体型チロシンキナーゼＥｒｂＢ２の細胞外ドメインに対する一本鎖組換え抗体の産生量を向上させる方法。
【請求項２５】
配列番号１０を含むポリヌクレオチドにおいて、配列番号１０の第２６２〜２７０番目の塩基配列中の１つ以上のヌクレオチドを変異させることを含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
配列番号１０のヌクレオチド配列において、コドン９２をメチオニン以外のアミノ酸をコードするコドンで置換することを含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
メチオニン以外のアミノ酸が、セリンであることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
コドン９２を欠失させることを含む請求項２４に記載の方法。
【請求項１】
配列番号１１の第２〜１２０番目のアミノ酸残基を含む第１のアミノ酸配列と、配列番号１１の第１３６〜２４２番目のアミノ酸残基を含む第２のアミノ酸配列とを含むポリペプチドであって、前記第１のアミノ酸配列と前記第２のアミノ酸配列がペプチドスペーサー基によって連結しているポリペプチド。
【請求項２】
前記第１のアミノ酸配列が、配列番号１の第２〜１２０番目のアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記第１のアミノ酸配列が、配列番号１の第１〜１２０番目のアミノ酸残基からなることを特徴とする請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１１、配列番号１および配列番号１２から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項５】
エフェクター分子をさらに含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
エフェクター分子が、細胞致死活性を有するポリペプチドであることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
細胞致死活性を有するポリペプチドが毒素であるか、または生物活性を有するその変異体であることを特徴とする請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
毒素が緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素であるか、または生物活性を有するその変異体であることを特徴とする請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
エフェクター分子が、細胞致死活性を有する化学物質であることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
細胞致死活性を有する化学物質が、化学療法剤、細胞毒性化合物および細胞増殖抑制性化合物からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
細胞致死活性を有する化学物質が、放射性物質であることを特徴とする請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号２で表されるヌクレオチド配列を含む請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号４で表されるヌクレオチド配列を含む請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
１つ以上の発現調節配列と作用可能に連結した請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクター。
【請求項１７】
複製開始点または自律複製配列、１つ以上のマーカー配列および、任意で追加の制限酵素認識部位をさらに含む請求項１６に記載のプラスミドまたはベクター。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載のプラスミドまたはベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１９】
大腸菌であることを特徴とする請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の宿主細胞を好適な条件下で培養する工程と、一本鎖組換え抗体またはその断片を回収する工程とを含む、一本鎖組換え抗体またはその断片の調製方法。
【請求項２１】
ＥｒｂＢ２の異常な活性および／または発現を伴う疾患に対する治療剤を製造するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２２】
治療対象の疾患が、癌であることを特徴とする請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
癌が、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、扁平上皮癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌、膵癌、胃癌、唾液腺癌、耳下腺腫瘍、黒色腫、子宮頚癌、膵癌、結腸癌および結腸直腸癌、膀胱癌、髄芽腫、腎臓癌、肝臓癌ならびに胃癌からなる群より選ばれることを特徴とする請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
配列番号１０のコドン９２からの翻訳開始を防ぐことを含む、受容体型チロシンキナーゼＥｒｂＢ２の細胞外ドメインに対する一本鎖組換え抗体の産生量を向上させる方法。
【請求項２５】
配列番号１０を含むポリヌクレオチドにおいて、配列番号１０の第２６２〜２７０番目の塩基配列中の１つ以上のヌクレオチドを変異させることを含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
配列番号１０のヌクレオチド配列において、コドン９２をメチオニン以外のアミノ酸をコードするコドンで置換することを含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
メチオニン以外のアミノ酸が、セリンであることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
コドン９２を欠失させることを含む請求項２４に記載の方法。
【図２】
【公表番号】特表２０１０−５３２９７７（Ｐ２０１０−５３２９７７Ａ）
【公表日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１５４１３（Ｐ２０１０−５１５４１３）
【出願日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００５６３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１０２２８
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（５０６３６１９０４）トポターゲット ジャーマニィ アーゲー (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００５６３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１０２２８
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（５０６３６１９０４）トポターゲット ジャーマニィ アーゲー (4)
【Ｆターム（参考）】
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