新規のヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）ムテインまたはその改変体、ならびに核酸分子およびその改変体が、提供される。これらのムテインを作製するための方法、ならびに動物の免疫系を刺激するための方法もまた、開示される。さらに、本発明は、本発明の核酸分子を含む組換え発現ベクターおよびその発現ベクターが導入されている宿主細胞も提供する。治療有効量の本発明のヒトＩＬ−２ムテインおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物が、包含される。上記ＩＬ−２ムテインは、天然のＩＬ−２またはプロロイキン（登録商標）ＩＬ−２よりも低毒性である一方で、ＮＫ細胞媒介性効果を維持または増強し、そして上記ＩＬ−２ムテインは、癌を処置する際、および免疫応答を刺激する際に使用するため薬学的組成物において使用され得る。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、改善された治療効能を有するヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）のムテインに関する。また、癌を処置するため、および哺乳動物の免疫系を刺激するために利用され得る新規の分子および薬学的処方物の製造方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴ細胞の増殖および機能の強力な刺激物質である（非特許文献１）。この天然に存在するリンホカインは、単独でか、またはリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞もしくは腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）と組み合わせた場合のいずれも、種々の悪性疾患に対して抗腫瘍活性を有することが示されている（例えば、非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６を参照のこと）。しかしながら、腫瘍成長に関して明確な治療結果を達成するために使用される高用量のＩＬ−２は、重度の副作用（例えば、発熱および悪寒、低血圧および毛細管漏出（血管漏出症候群（ｖａｓｃｕｌａｒ ｌｅａｋ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、すなわちＶＬＳ）および神経学的変化）をしばしば引き起こす（例えば、非特許文献７；非特許文献８；および非特許文献９を参照のこと）。
【０００３】
ＩＬ−２誘導性毒性およびＶＬＳの根拠となる正確な機構は明らかではないが、蓄積されたデータによれば、ＩＬ−２誘導性ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６を含む炎症誘発性サイトカインの過剰生産の結果としての用量制限性の毒性（ＤＬＴ）を誘発することが示唆されている。これらのサイトカインは、単球／マクロファージを活性化し、一酸化窒素生産を誘導し、その後の内皮細胞の損傷をもたらす（非特許文献１０；非特許文献１１）。これらの観察により、高親和性ＩＬ−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）がＴ細胞上で選択的に発現されるという仮説に基づいてＮＫ細胞ではなくＴ細胞に対して優先的な選択性を示すＩＬ−２ムテインの開発に導かれる人々が存在する（例えば、ＢＡＹ５０−４７９８、特許文献１に開示される成熟ヒトＩＬ−２のＮ８８Ｒ ＩＬ−２ムテインおよび非特許文献１２を参照のこと）。
【０００４】
天然（ＮＫ）、ＬＡＫおよび抗体依存性（ＡＤＣＣ）細胞溶解殺傷、サイトカイン生産および増殖のような多様なＮＫのエフェクター機能は、異なるＮＫ細胞内シグナル伝達経路における特定の中間体の活性化に依存している。重要なことに、ＩＬ−２−ＩＬ−２Ｒ相互作用の選択的モジュレーションが、多様な下流のＮＫ細胞媒介性およびＴ細胞媒介性のエフェクター機能（例えば、増殖、サイトカイン生産および細胞溶解殺傷）に影響し得るという証拠が存在する（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。
【０００５】
プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（登録商標）ＩＬ−２（組換えヒトＩＬ−２ムテインアルデスロイキンを含む；Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）は、転移性の黒色腫および腎臓癌の処置のためにＦＤＡによって認可されており、非ホジキンリンパ腫、ＨＩＶおよび乳癌を含む他の臨床適応に関して研究されている。しかしながら、ＩＬ−２に関連する毒性の副作用に起因して、このインターロイキンのより多くの治療用途を可能にするより毒性の低いＩＬ−２ムテインについての必要が存在する。改善された耐容性および／または増強されたＩＬ−２媒介性のＮＫ細胞またはＴ細胞のエフェクター機能を有するＩＬ−２ムテインは、より広範な用途を有しており、そして癌治療のため、および免疫応答を調節するために特に有益である。
【特許文献１】国際公開第９９／６０１２８号パンフレット
【非特許文献１】Ｍｏｒｇａｎら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」１９７６年、第１９３巻：１００７−１０１１
【非特許文献２】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」１９８７年、第３１６巻：８８９−８９７
【非特許文献３】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、「Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．」１９８８年、第２０８巻：１２１−１３５
【非特許文献４】Ｔｏｐａｌｉａｎら、「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．」１９８８年、第６巻：８３９−８５３
【非特許文献５】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」１９８８年、第３１９巻：１６７６−１６８０
【非特許文献６】Ｗｅｂｅｒら、「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．」１９９２年、第１０巻：３３−４０
【非特許文献７】Ｄｕｇｇａｎら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」１９９２年、第１２巻：１１５−１２２
【非特許文献８】Ｇｉｓｓｅｌｂｒｅｃｈｔら、「Ｂｌｏｏｄ」１９９４年、第８３巻：２０８１−２０８５
【非特許文献９】ＳｚｎｏｌおよびＰａｒｋｉｎｓｏｎ、「Ｂｌｏｏｄ」１９９４年、第８３巻：２０２０−２０２２
【非特許文献１０】Ｄｕｂｉｎｅｔｔら、「Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．」１９９４年、第１５７巻：１７０−１８０
【非特許文献１１】Ｓａｍｌｏｗｓｋｉら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．」１９９５年、第１８巻：１６６−１７８
【非特許文献１２】Ｓｈａｎａｆｅｌｔら、「Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」２０００年、第１８巻：１１９７−２０２
【非特許文献１３】Ｓａｕｖｅら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」１９９１年、第８８巻：４６３６−４６４０
【非特許文献１４】Ｈｅａｔｏｎら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」１９９３年、第５３巻：２５９７−２６０２
【非特許文献１５】Ｅｃｋｅｎｂｅｒｇら、「Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．」２０００年、第１９１巻：５２９−５４０
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、低減された毒性であることが予測される改善された機能プロファイルを有するインターロイキン−２（ＩＬ−２）のムテインに関する。ヒトＩＬ−２のムテインをコードする単離された核酸分子およびこれらのムテインを含む単離されたポリペプチドが、提供される。このムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと比較して、ＮＫ細胞の増殖を維持または増大させ、ＮＫ細胞媒介性のＮＫ、ＬＡＫおよびＡＤＣＣ細胞溶解機能を維持し、そしてＴ細胞増殖機能を維持しながら、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産をより低いレベルで誘導する。癌を処置する際および免疫応答を調節する際のこれらの改善されたヒトＩＬ−２ムテインの臨床使用もまた、記載される。
【０００７】
１つの局面において、本発明は、ヒトＩＬ−２のムテインをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。特定の実施形態において、上記核酸分子は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ヒトＩＬ−２のムテインをコードする。
【０００８】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９および７１に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、ヒトＩＬ−２のムテインをコードする単離された核酸分子を包含する。
【０００９】
特定の実施形態において、本発明は、ヒトＩＬ−２のムテインをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を包含し、このムテインは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０および７２からなる群より選択される配列の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列を有する。
【００１０】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９および７１からなる群より選択される配列のヌクレオチド４〜３９９を含むヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を包含する。
【００１１】
特定の実施形態において、本明細書に記載される核酸分子は、さらに置換を含み得、ここで配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９または７１のヌクレオチド３７３〜３７５は、アラニンをコードするトリプレットコドンで置き換えられている。
【００１２】
特定の実施形態において、本明細書に記載される核酸分子は、さらに置換を含み得、ここで配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９または７１のヌクレオチド３７３〜３７５は、システインをコードするトリプレットコドンで置き換えられている。
【００１３】
特定の実施形態において、本明細書に記載された核酸分子は、発現を最適化するためにさらに改変される。このような核酸は、ムテインをコードする１以上のコドンが目的の宿主細胞内での発現に関して最適化されているヌクレオチド配列を含む。最適化コドンを含有する例示的な核酸としては、配列番号７３、配列番号７３のヌクレオチド４〜３９９、配列番号７４および配列番号７４のヌクレオチド４〜３９９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
本発明は、選択された宿主細胞における使用のための発現ベクターをさらに包含し、ここでこの発現ベクターは、本発明の１以上の核酸を含む。このような発現ベクターにおいて、上記核酸配列は、選択された宿主細胞内での発現と適合性のある制御エレメントに作動可能に連結される。多くの発現制御エレメントが当該分野で公知であり、これらとしては、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳開始の最適化のための配列および翻訳終止配列が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な転写プロモーターとしては、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
別の局面において、本発明は、本発明の発現ベクターを含む細胞を提供し、ここで核酸配列（例えば、ヒトＩＬ−２のムテインをコードする配列）は、選択された細胞内の発現と適合性のある制御エレメントに作動可能に連結される。１つの実施形態において、そのような細胞は、哺乳動物細胞である。例示的な哺乳動物細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の実施において有用であり得る他の細胞、細胞型、組織型などとしては、以下にから得られるものが挙げられるが、これらに限定されない：昆虫（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｔｎ５）およびＳｆ９）、細菌、酵母、植物、抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、幹細胞およびその先祖細胞）、初代細胞、不死化細胞、腫瘍誘導細胞。
【００１６】
別の局面において、本発明は、ヒトＩＬ−２ムテインの組換え生産のための本発明の発現ベクターおよび宿主細胞のいずれ含む組成物を提供する。このような組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。
【００１７】
さらなる局面において、本発明は、ヒトＩＬ−２のムテインを含む単離されたポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、本発明は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを包含する。
【００１８】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２〜１３３を含む単離されたポリペプチドを包含する。
【００１９】
特定の実施形態において、本明細書中に記載されるポリペプチドは、さらに置換を含み得、ここでアラニン残基は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換される。
【００２０】
特定の実施形態において、本明細書中に記載されるポリペプチドは、さらに置換を含み得、ここでシステイン残基は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換される。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明は、ヒトＩＬ−２ムテインを含む単離されたポリペプチドを包含し、ここで上記ムテインは、配列番号４の１２５位のシステインに対して置換されたセリンおよび配列番号４内の少なくとも２つのさらなるアミノ酸の置換を有する配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、ここで上記ムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量と比較して、１）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を維持または増強し、そして２）ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産の低減されたレベルを誘導する。例示的な組み合わせ置換としては、１９Ｄ４０Ｄ、１９Ｄ８１Ｋ、３６Ｄ４２Ｒ、３６Ｄ６１Ｒ、３６Ｄ６５Ｌ、４０Ｄ３６Ｄ、４０Ｄ６１Ｒ、４０Ｄ６５Ｙ、４０Ｄ７２Ｎ、４０Ｄ８０Ｋ、４０Ｇ３６Ｄ、４０Ｇ６５Ｙ、８０Ｋ３６Ｄ、８０Ｋ６５Ｙ、８１Ｋ３６Ｄ、８１Ｋ４２Ｅ ８１Ｋ６１Ｒ、８１Ｋ６５Ｙ、８１Ｋ７２Ｎ、８１Ｋ８８Ｄ、８１Ｋ９１Ｄ、８１Ｋ１０７Ｈ、８１Ｌ１０７Ｈ、９１Ｎ９５Ｇ、１０７Ｈ３６Ｄ、１０７Ｈ４２Ｅ、１０７Ｈ６５Ｙ、１０７Ｒ３６Ｄ、１０７Ｒ７２Ｎ、４０Ｄ８１Ｋ１０７Ｈ、４０Ｇ８１Ｋ１０７Ｈおよび９１Ｎ９４Ｙ９５Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、このムテインは、配列番号４の１位のアラニンの欠失をさらに含む。
【００２２】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖の増加およびＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のレベルの低減は、ＮＫ−９２バイオアッセイを使用して検出され得る。ＮＫ細胞の増殖およびＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産に対する本明細書中に記載されたポリペプチドの効果は、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量の効果と比較される。特定の実施形態において、ＮＫ−９２バイオアッセイを使用して、本明細書中に記載されるポリペプチドが、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量で観察されるレベルと比較して炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−αを低減されたレベルで誘導することを示す。
【００２３】
特定の実施形態において、ＮＫ３．３細胞毒性バイオアッセイを使用して、本明細書中に記載されるポリペプチドが、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量で観察される細胞毒性と比較して、ヒトＮＫ細胞媒介性ナチュラルキラー細胞毒性、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞毒性またはＡＤＣＣ媒介性細胞毒性を維持または改善することを示す。
【００２４】
特定の実施形態において、ムテインにより誘導されるＮＫ細胞増殖は、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導される増殖の１５０％超である。
【００２５】
特定の実施形態において、ムテインにより誘導されるＮＫ細胞増殖は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導される増殖の１７０％超である。
【００２６】
特定の実施形態において、ムテインにより誘導されるＮＫ細胞の増殖は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導される増殖の約２００％〜約２５０％である。
【００２７】
特定の実施形態において、上記ムテインにより誘導されるＮＫ細胞の増殖は、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導される増殖よりも少なくとも１０％増大している。
【００２８】
特定の実施形態において、上記ムテインにより誘導されるＮＫ細胞の増殖は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導される増殖よりも少なくとも１５％増大している。
【００２９】
特定の実施形態において、上記ムテインにより誘導される炎症誘発性サイトカイン生産は、同様のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導される産生の１００％未満である。
【００３０】
特定の実施形態において、上記ムテインにより誘導される炎症誘発性サイトカイン生産は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導される産生の７０％未満である。
【００３１】
特定の実施形態において、本発明は、ヒトＩＬ−２のムテインを含む単離されたポリペプチドを包含し、上記ムテインは、配列番号４の１２５位のシステインに対して置換されたセリンおよび配列番号４内の少なくとも２つのさらなるアミノ酸の置換を有する配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、ここで上記ムテインのＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産に対するＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞の増殖の比は、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインの同様の量で観察されるものよりも少なくとも１．５倍高く、ここで０．１ｎＭムテインにおけるＮＫ細胞増殖および１．０ｎＭムテインにおけるＴＮＦ−α生産は、ＮＫ−９２バイオアッセイを用いてアッセイされる。特定の実施形態において、上記比は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されるものよりも少なくとも２．５倍高い。他の実施形態において、上記比は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されるものよりも少なくとも３．０倍高い。
【００３２】
特定の実施形態において、本発明は、ヒトＩＬ−２のムテインについてのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを包含し、ここで上記ムテインは、配列番号４の１２５位のシステインに対して置換されたセリンおよび少なくとも２つのさらなるアミノ酸置換を有する配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、ここでさらなる置換は、１９位、３６位、４０位、４２位、６１位、６５位、７２位、８０位、８１位、８８位、９１位、９５位および１０７位からなる群より選択される配列番号４の位置に存在する。例示的な組み合わせ置換としては、１９Ｄ４０Ｄ、１９Ｄ８１Ｋ、３６Ｄ４２Ｒ、３６Ｄ６１Ｒ、３６Ｄ６５Ｌ、４０Ｄ３６Ｄ、４０Ｄ６１Ｒ、４０Ｄ６５Ｙ、４０Ｄ７２Ｎ、４０Ｄ８０Ｋ、４０Ｇ３６Ｄ、４０Ｇ６５Ｙ、８０Ｋ３６Ｄ、８０Ｋ６５Ｙ、８１Ｋ３６Ｄ、８１Ｋ４２Ｅ ８１Ｋ６１Ｒ、８１Ｋ６５Ｙ、８１Ｋ７２Ｎ、８１Ｋ８８Ｄ、８１Ｋ９１Ｄ、８１Ｋ１０７Ｈ、８１Ｌ１０７Ｈ、９１Ｎ９５Ｇ、１０７Ｈ３６Ｄ、１０７Ｈ４２Ｅ、１０７Ｈ６５Ｙ、１０７Ｒ３６Ｄ、１０７Ｒ７２Ｎ、４０Ｄ８１Ｋ１０７Ｈ、４０Ｇ８１Ｋ１０７Ｈおよび９１Ｎ９４Ｙ９５Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、上記ポリペプチドは、配列番号４の１位にアラニンの欠失をさらに含む。
【００３３】
別の局面において、本発明は、ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）のムテインを産生する方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載される任意の核酸分子を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程；ポリペプチドとしてのその核酸分子の発現を可能にする条件下で細胞培養培地において上記宿主細胞を培養する工程；およびそのポリペプチドを単離する工程を包含する。特定の実施形態において、ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）のムテインは、同様のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ヒトＩＬ−２から選択される参照ヒトＩＬ−２ムテインの同様の量と比較して、ＮＫ細胞の増殖を維持または増強し得、そしてまたＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産をより低いレベルで誘導し、ここでＮＫ細胞の増殖および炎症誘発性サイトカイン生産は、ＮＫ−９２バイオアッセイを用いてアッセイされる。
【００３４】
別の局面において、本発明は、ヒトＩＬ−２のムテインを含む本明細書中に記載される１以上のポリペプチドの治療有効量を含む組成物を提供する。そのような組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含み得る。
【００３５】
別の局面において、本発明は、哺乳動物の免疫系を刺激するための方法を提供する。この方法は、哺乳動物に治療有効量のヒトＩＬ−２ムテインを投与する工程を包含し、ここで、上記ムテインは、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２から選択される参照ＩＬ−２ムテインの同様の量と比較して、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産をより低いレベルで誘導し、そしてＮＫ細胞の増殖を維持または増強し、ここでＮＫ細胞の増殖および炎症誘発性サイトカイン生産は、ＮＫ−９２バイオアッセイを用いてアッセイされる。特定の実施形態において、上記哺乳動物はヒトである。
【００３６】
特定の実施形態において、免疫系を刺激するために使用されるヒトＩＬ−２ムテインは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３７】
特定の実施形態において、免疫系を刺激するために使用されるヒトＩＬ−２ムテインは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列を含む。
【００３８】
特定の実施形態において、免疫系を刺激するために使用されるヒトＩＬ−２ムテインは、さらに置換を含み得、ここでアラニン残基は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換されている。
【００３９】
特定の実施形態において、免疫系を刺激するために使用されるヒトＩＬ−２ムテインは、置換をさらに含み得、ここでシステイン残基は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換される。
【００４０】
別の局面において、本発明は、哺乳動物において癌を処置するための方法を提供し、この方法は、上記哺乳動物に治療有効量のヒトＩＬ−２ムテインを投与する工程を包含し、ここで上記ムテインは、同様のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２から選択される参照ＩＬ−２ムテインの同様の濃度と比較してＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産をより低いレベルで誘導し、そしてＮＫ細胞の増殖を維持または増強し、ここで上記ＮＫ細胞の増殖および上記炎症誘発性サイトカイン生産は、ＮＫ−９２バイオアッセイを使用してアッセイされる。特定の実施形態において、上記哺乳動物はヒトである。
【００４１】
特定の実施形態において、癌を処置するために使用されるヒトＩＬ−２ムテインは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【００４２】
特定の実施形態において、癌を処置するために使用されるヒトＩＬ−２ムテインは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列を含み得る。
【００４３】
特定の実施形態において、癌を処置するために使用されるヒトＩＬ−２ムテインは、置換をさらに含み得、ここでアラニン残基は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換される。
【００４４】
特定の実施形態において、癌を処置するために使用されるヒトＩＬ−２ムテインは、置換をさらに含み得、ここでシステイン残基は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換される。
【００４５】
別の局面において、本発明は、処置プロトコルとしてインターロイキン−２（ＩＬ−２）投与を受けている被験体においてＩＬ−２誘導性毒性症状を低減するための方法を提供する。処置の方法は、ＩＬ−２ムテインとしてＩＬ−２を投与する工程を包含する。
【００４６】
特定の実施形態において、処置に使用されるＩＬ−２ムテインは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４７】
特定の実施形態において、処置に使用されるＩＬ−２ムテインは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２からなる群より選択されるアミノ酸配列の残基２〜１３３を含む。
【００４８】
特定の実施形態において、処置に使用されるＩＬ−２ムテインは、置換をさらに含み、ここでアラニン残基は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換される。
【００４９】
特定の実施形態において、処置に使用されるＩＬ−２ムテインは、置換をさらに含み、ここでシステイン残基は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、低減した毒性および／または改善されたＮＫ細胞またはＴ細胞のエフェクター機能に起因して、改善された治療効能を有するヒトインターロイキン−２（ｈＩＬ−２）のムテインに関する。本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテインおよび生物学的に活性なその改変体は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと比較して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖は維持または増大させながら低減した炎症誘発性サイトカイン生産を誘発する。「炎症誘発性サイトカイン」によって、免疫系を刺激し得るサイトカインが意図される。このようなサイトカインとしては、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
用語「ムテイン」は、アミノ酸の欠失、置換または両方により、天然に存在するタンパク質についてのアミノ酸配列とは異なる変異アミノ酸配列を含むタンパク質をいう。本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、成熟ヒトＩＬ−２配列の１２５位のシステイン残基に対して置換されたセリン残基（すなわち、Ｃ１２５Ｓ）および少なくとも１つの他のアミノ酸置換を有することによって成熟ヒトＩＬ−２配列とは異なるアミノ酸配列を含み、そして、成熟ヒトＩＬ−２配列と比較して１以上のアミノ酸欠失（例えば、成熟ヒトＩＬ−２タンパク質の１位におけるＮ末端アラニン（Ａｌａ）の欠失）をさらに含み得る。代替的な実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、成熟ヒトＩＬ−２配列の１２５位のシステイン残基を保持しているが、少なくとも１つの他のアミノ酸置換を有しており、そして、成熟ヒトＩＬ−２配列と比較して１以上のアミノ酸欠失（例えば、成熟ヒトＩＬ−２タンパク質の１位におけるＮ末端アラニン（Ａｌａ）の欠失）をさらに含み得る。これらのヒトＩＬ−２ムテインは、その製造において使用される宿主発現系に応じて、グリコシル化または非グリコシル化され得る。本明細書中で開示される特定の置換は、本明細書中に記載されるＮＫ−９２細胞アッセイを使用して、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと比較した場合に、低減した炎症誘発性サイトカイン生産を誘発する所望の活性を保持する一方でＮＫ細胞の増殖を維持または増強するヒトＩＬ−２の改変体を生じる。低減した毒性および／または改善されたＮＫ細胞増殖を有するＩＬ−２改変体を生じるヒトＩＬ−２配列内の位置およびそれらの位置における関連する置換を同定すると、ヒトＩＬ−２配列内の他の残基を変化させることによりこれらの所望の活性もまた保持する、本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテインの改変体を得ることは当業者の知るとおりである。本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテインのこのような変異体もまた、本発明により包含されることが意図され、そして以下にさらに規定される。
【００５２】
ヒトＩＬ−２は、配列番号２に示される前駆体ポリペプチドとしてまず翻訳される。この前駆体ポリペプチドは、例えば、配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列によってコードされる。この前駆体ポリペプチドは、配列番号２の残基１〜２０におけるシグナル配列を含む。用語「成熟ヒトＩＬ−２」は、例えば、配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列によってコードされる配列番号４に示されるアミノ酸配列を指す。用語「Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン」または「Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２」は、成熟ヒトＩＬ−２配列の１位に存在するＮ末端アラニンを保持し、そして成熟ヒトＩＬ−２配列の１２５位のシステインに対するセリンの置換を有する成熟ヒトＩＬ−２のムテインを指す。Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインは、配列番号５に示されるようなヌクレオチド配列によってコードされる配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する。用語「デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２」および「デス−アラニル−１，セリン−１２５ヒトＩＬ−２」は、成熟ヒトＩＬ−２配列のアミノ酸１２５位のシステインに対するセリンの置換を有し、そして成熟ヒトＩＬ−２配列の１位（すなわち、配列番号４の１位）に存在するＮ末端アラニンを欠いている成熟ヒトＩＬ−２のムテインを指す。デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２は、配列番号７に示されるようなヌクレオチド配列によってコードされる配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する。「アルデスロイキン」と称されているＥ．ｃｏｌｉ組換え生産デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインは、商標プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（登録商標）ＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の下に市販されている処方物として利用可能である。本発明の目的のためには、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインは、本発明のヒトＩＬ−２ムテインにより示されるべき所望の活性を決定するための参照ＩＬ−２ムテインとして機能する。すなわち、本発明の適切なヒトＩＬ−２ムテインにおけるＮＫ細胞による低減したＩＬ−２誘導性炎症誘発性サイトカイン生産（特に、ＴＮＦ−α生産）の所望の活性は、同様のアッセイ条件下におけるデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインの等しい量により誘導されるＮＫ細胞の炎症誘発性サイトカイン生産の量と比較して測定される。同様に、本発明の適切なヒトＩＬ−２ムテインにおいてＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を維持または増大する所望の活性は、同様のアッセイ条件下におけるデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインの等しい量により誘導されるＮＫ細胞増殖の量と比較して測定される。
【００５３】
少なくとも２つのさらなる置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含み、これらの２種の参照ＩＬ−２ムテインと比較した場合にＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産をより低いレベルで誘導する一方でＮＫ細胞増殖を維持または増大させるような、ヒトＩＬ−２ムテインをコードする単離された核酸分子およびその生物学的に活性な変異体が、提供される。本発明の核酸分子によりコードされる単離されたポリペプチドもまた、提供される。
【００５４】
本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、本明細書中においては、「偶数の配列番号１０〜７２に示される配列」とも称される、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０および７２に示されるムテインを包含する。本発明はまた、これらのムテインをコードする任意のヌクレオチド配列（例えば、それぞれ、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９および７１に示されるコード配列）を提供する。これらのコード配列はまた、本明細書において「奇数の配列番号９〜７１に示される配列」とも称される。これらの前述のアミノ酸配列に示されるムテインは、少なくとも２つのさらなる置換を有するＣ１２５ＳヒトＩＬ−２アミノ酸配列を含み、ここでこれらのさらなる置換は、以下の表１に示される組み合わせ置換によって表される。「組み合わせ置換」によって、ヒトＩＬ−２ムテイン配列内に存在する２以上の残基の置換の群が意図される。従って、例えば、「１９Ｄ４０Ｄ」として設計される組み合わせ置換は、本発明のヒトＩＬ−２ムテインが、成熟ヒトＩＬ−２（配列番号４に示される）の１９位に対応する位置におけるロイシン残基に対するアスパラギン酸残基（すなわち、Ｄ）の置換と、成熟ヒトＩＬ−２（配列番号４に示される）の４０位に対応する位置におけるロイシン残基に対するアスパラギン酸残基（すなわち、Ｄ）の置換との両方を含むことを意味することが意図される。同様に、「４０Ｄ８１Ｋ１０７Ｈ」として設計される組み合わせ置換は、本発明のヒトＩＬ−２ムテインが、以下の置換の３つ全てを含むことを意味することが意図される：成熟ヒトＩＬ−２の４０位に対応する位置におけるロイシン残基に対するアスパラギン酸残基（すなわち、Ｄ）の置換、成熟ヒトＩＬ−２の８１位に対応する位置におけるアルギニン残基に対するリジン残基（すなわち、Ｋ）の置換、および成熟ヒトＩＬ−２の１０７位に対応する位置におけるチロシン残基に対するヒスチジン残基（すなわち、Ｈ）の置換。代替的な実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、欠失されたこれらのアミノ酸の１位の元のアラニン残基を有し、従って、少なくとも２つのさらなる置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２アミノ酸配列を含み、ここでこれらのさらなる置換は、以下の表１に示される組み合わせ置換によって表される。従って、これらのムテインは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２に示される配列の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列を有する。本発明はまた、これらのムテインをコードする任意のヌクレオチド配列（例えば、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９および７１に示される配列のヌクレオチド４〜３９９に示されるコード配列）を提供する。
【００５５】
本明細書中に記載される所望のヒトＩＬ−２ムテイン機能プロファイルを有する、本発明のヒトＩＬ−２ムテインの生物学的に活性な改変体、そのフラグメントおよび切断型もまた、提供される。例えば、開示されるヒトＩＬ−２ムテインのフラグメントまたは切断型は、当該分野で周知であり、本明細書中の他の箇所で記載される組換えＤＮＡ技術を用いて、完全長ヒトＩＬ−２ムテインアミノ酸配列からアミノ酸残基を除去することによって作製され得る。本発明のヒトＩＬ−２ムテインの適切な改変体は、新規のヒトＩＬ−２ムテイン自身により示される活性と同様の生物学的活性を有しており、すなわち、これらは、本明細書中の他の箇所に開示されるバイオアッセイを用いて参照ＩＬ−２分子（すなわち、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２）と比較した場合に、新規のヒトＩＬ−２ムテインの低い毒性（すなわち、低いかまたは低減された炎症誘発性サイトカイン生産）、ならびにＮＫ細胞増殖を維持または増大させる能力を有する。本明細書において同定される任意の所定の新規のヒトＩＬ−２ムテインの改変体は、それが低減された毒性を有するという所望の生物学的プロファイルを保持している限り、すなわち、参照ヒトＩＬ−２ムテインと比較してＮＫ細胞による低いレベルの炎症誘発性サイトカイン生産および／または増大したＮＫ細胞増殖を誘導する限り、本発明の新規のヒトＩＬ−２ムテインで観察されるものと比較してある特定の生物学的活性の異なる絶対レベルを有し得ることが認識される。
【００５６】
（表１．少なくとも２つのさらなる置換を有するＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）またはデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）のアミノ酸配列を含む、本発明のヒトＩＬ−２ムテインの例であって、ここでさらなる置換は、以下に示される組み合わせ置換より選択される。残基の位置は、配列番号４に示される成熟ヒトＩＬ−２配列内の位置に関連している。これらの位置はまた、配列番号６に示されるＣ１２５ＳヒトＩＬ−２配列内の位置に対応する。各残基の位置は、その位置において天然に存在する残基に対して置換されているアミノ酸についての１文字略語の後にくる。）
【００５７】
【表１】

本発明の組成物は、本発明のヒトＩＬ−２ムテインまたはその生物学的に活性な改変体の組換え生産のためのベクターおよび宿主細胞をさらに含む。さらに、本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテインまたはその生物学的に活性な改変体の治療有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物もまた、提供される。
【００５８】
参照ＩＬ−２ムテインで観察されるものと比較してより低いレベルのＮＫ細胞による炎症誘発性生産を誘導し、そしてＮＫ細胞の増殖を維持または増大させるヒトＩＬ−２のムテインの製造方法は、本発明によって包含される。これらの方法は、本発明の新規のヒトＩＬ−２ムテインをコードするか、またはその生物学的に活性な改変体をコードする核酸分子を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、コードされたポリペプチドの発現を可能にする条件下において細胞培養用の培地中で宿主細胞を培養する工程、およびこのポリペプチド産物を単離する工程を包含する。
【００５９】
また、動物の免疫系を刺激するためか、または哺乳動物において癌を処置するための方法も提供され、この方法は、本発明のヒトＩＬ−２ムテインまたはその生物学的に活性な改変体の治療有効量を動物に投与する工程を包含し、ここでＩＬ−２ムテインまたはその改変体は、本明細書中の以下に開示されるバイオアッセイを用いて決定される場合、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較して、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産をより低いレベルで誘導し、そしてＮＫ細胞増殖を維持または増大させる。
【００６０】
本発明はまた、処置プロトコルとしてＩＬ−２投与を受けている被験体におけるインターロイキン−２（ＩＬ−２）誘導性毒性症状を低減するための方法を提供する。この方法は、本発明のＩＬ−２ムテイン（すなわち、本明細書中の以下に開示されるバイオアッセイを用いて決定した場合、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較して、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産をより低いレベルで誘導し、そしてＮＫ細胞の増殖を維持または増大させるムテイン）を投与する工程を包含する。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）およびヌクレオチドアナログを用いて作製される上記ＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを包含することが意図される。核酸分子は、１本鎖であっても２本鎖であってもよいが、好ましくは２本鎖ＤＮＡである。本発明は、単離された核酸もしくはタンパク質組成物、または実質的に精製された核酸もしくはタンパク質組成物を包含する。「単離された」もしくは「精製された」核酸分子またはタンパク質またはその生物学的に活性な部分は、その天然に存在する環境中で見出される場合に、その核酸分子もしくはタンパク質に通常伴っているか、またはそれらと相互作用する成分を、実質的または本質的に含有しない。従って、単離もしくは精製された核酸分子またはタンパク質は、組換え技術により製造された場合、他の細胞物質または培養培地を実質的に含有しないか、あるいは化学合成された場合、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含有しない。好ましくは、「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ内の核酸に天然に隣接する核酸（すなわち、その核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）（好ましくは、タンパク質コード配列）を含有しない。例えば、種々の実施形態において、単離された核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ内の核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列の約５ｋｂ、約４ｋｂ、約３ｋｂ、約２ｋｂ、約１ｋｂ、約０．５ｋｂまたは約０．１ｋｂ未満を含み得る。細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、夾雑タンパク質の約３０％、２０％、１０％、５％または１％（乾燥重量による）未満を有するタンパク質の調製物を含む。本発明のタンパク質またはその生物学的に活性な改変体が組換え生産される場合、好ましくは、培養培地は、化学前駆体または目的の非タンパク質化学物質の約３０％、２０％、１０％、５％または１％（乾燥重量による）未満を表す。
【００６２】
（新規のヒトＩＬ−２ムテインの生物学的活性）
本発明の新規のヒトＩＬ−２ムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと比較して、またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと比較して、高値の治療指数を有する。本発明のムテインを分類するために、同様のタンパク質濃度および類似のアッセイ条件を用いていずれかの所定の比較がなされる場合、後者の２つのムテインは、本発明の新規のムテインの生物学的プロファイルがこれら２つの前もって特徴付けられたヒトＩＬ−２ムテインの生物学的プロファイルと比較されることから、本明細書において「参照ＩＬ−２ムテイン」と称される。本発明のムテインの高値の治療指数は、これら２つの参照ＩＬ−２ムテインのいずれかの毒性プロファイルならびにＮＫ細胞および／またはＴ細胞のエフェクター機能と比較される場合、これらのムテインの改善された毒性プロファイル（すなわち、ムテインはＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカインの生産をより低いレベルで誘導する）、毒性の上昇を伴わないＮＫ細胞および／もしくはＴ細胞のエフェクター機能の増大、または改善された毒性プロファイルおよびＮＫ細胞および／もしくはＴ細胞のエフェクター機能の増大の両方において反映される。
【００６３】
３つの機能的終点を使用して、上昇した治療指数を有するムテインを選択した：（１）デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較してＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性炎症誘発性サイトカイン生産を低減する能力；（２）デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較してＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産の増大を伴うことなく、ＮＫ細胞およびＴ細胞のＩＬ−２誘導性増殖を維持または増大させる能力；ならびに（３）デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較してＮＫ媒介性細胞溶解細胞殺傷を維持または改善（すなわち、増大）する能力。ＮＫ媒介性細胞溶解細胞殺傷は、ＮＫ媒介性、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）媒介性および抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）媒介性の細胞溶解殺傷を包含する。
【００６４】
治療指数において最大の改善を示す本明細書中に開示される新規のヒトＩＬ−２ムテインは、改善された臨床的利益を予測する３種の機能的なクラスに属する。特記すべきは、これらのムテインの全てが、維持または増大されたＴ細胞増殖活性およびＮＫ媒介性細胞溶解活性を示すことである。ムテインの第１の機能クラスは、ＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を維持しつつ、参照ＩＬ−２ムテイン（すなわち、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較してＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性炎症誘発性サイトカイン生産を低減する有益な変異を有することによって特徴付けられる。ムテインの第２の機能クラスは、参照ＩＬ−２ムテインの何れかにより誘導されるものと比較して、炎症誘発性サイトカイン生産にマイナスの影響を与える（すなわち、増大する）ことなく、参照ＩＬ−２ムテインの何れかにより誘導されるものと比較してＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を増大させる。ムテインの第３の機能クラスは、これら２つの参照ＩＬ−２ムテインの何れにより誘導されるこれらの活性のレベルと比較した場合、それらがＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を増大させながら、ＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性炎症誘発性サイトカイン生産を低減することができるという点において「二官能性」であるムテインを含む。
【００６５】
新しく単離されたＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖および炎症誘発性サイトカイン生産を測定するためのアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｐｅｒｕｓｓｉａ（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：３７０およびＢａｕｍｅら（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１−６を参照のこと。ＮＫ−９２細胞株は、ＩＬ−２の存在下での増殖を含む、ＮＫ細胞の表現型および機能的特性を有する（Ｇｏｎｇら（１９９４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ８：６５２）が、ＩＬ−２の存在下のＴＮＦ−αの生産は殆どまたは全く無いことが以前に報告されている（Ｎａｇａｓｈｉｍａら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９１：３８５０）。ヒトＮＫ細胞およびＴ細胞の機能的活性化をスクリーニングするために開発されたＩＬ−２バイオアッセイは、本明細書中および以下の実験の節において開示される。他のアッセイを使用してＮＫ細胞増殖およびＮＫ細胞の炎症誘発性サイトカイン生産、およびＴ細胞エフェクター機能を測定し得るが、好ましくは、本明細書中に開示されるＩＬ−２バイオアッセイを用いて目的のＩＬ−２ムテインをスクリーニングし、それらが本明細書中に開示されるムテインの所望の特性を保持しているか否かを決定する。特に興味深いものは、ＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産の誘導の低減である。すなわち、１つの実施形態において、ＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖およびＴＮＦ−α生産は、ヒトＮＫ−９２細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２４０７、ＣＭＣＣ ＩＤ＃１９２５）に関して以下に記載されるＩＬ−２バイオアッセイを使用して測定される。ＮＫ−９２細胞株に関する説明については、Ｇｏｎｇら（１９９４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ８（４）：６５２−６５８を参照のこと。本発明の目的のために、このバイオアッセイは、「ＮＫ−９２バイオアッセイ」と称される。
【００６６】
「低減する」または「低減された」炎症誘発性サイトカイン産生によって、特にＮＫ細胞によるＴＮＦα生産の誘導に関して、本発明のヒトＩＬ−２ムテインが、参照ＩＬ−２ムテイン（すなわち、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン）により誘導されるものと比較して低減した、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のレベルを誘導することが意図される。本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、類似のアッセイ条件下においてデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導されるものの少なくとも２０％であるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産の最小レベルを誘導するが、本発明のムテインにより誘導され得るＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産の最大レベルは、ムテインが分類される機能クラスに依存する。
【００６７】
従って、例えば、いくつかの実施形態において、上記ムテインは、ＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産に対する負の影響を有することなくＮＫ細胞増殖の大きく増強された誘導のために選択されている（すなわち、ムテインの第２の機能クラス）。これらの実施態様において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、参照ＩＬ−２ムテインにより誘導されるものと同様（すなわち、±１０％）、または好ましくは参照ＩＬ−２ムテインにより誘導されるものの９０％未満のＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルを誘導し、ここでＴＮＦ−α生産は、ヒトＮＫ−９２細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２４０７、ＣＭＣＣ ＩＤ＃１１９２５）を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）、そしてそれぞれのヒトＩＬ−２ムテインの１．０ｎＭまたは１００ｐＭ（すなわち、０．１ｎＭ）濃度を用いてアッセイされる。本発明の他の実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導されるＴＮＦ−α生産の９０％未満、好ましくは８５％未満、更に好ましくは８０％未満であるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルを誘導し、ここでＴＮＦ−α生産は、ヒトＮＫ−９２細胞株を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）、そしてそれぞれのヒトＩＬ−２ムテインの１．０ｎＭ濃度を用いてアッセイされる。いくつかの実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるＴＮＦ−α生産の少なくとも２０％であるが６０％未満を誘導し、ここでＴＮＦ−α生産は、ヒトＮＫ−９２細胞株を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）、そしてそれぞれのヒトＩＬ−２ムテインの１．０ｎＭ濃度を用いてアッセイされる。参照ＩＬ−２ムテインと比較してＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖も維持または増大するこのようなムテインは、ＩＬ−２ムテインの第１の機能クラスに属する。
【００６８】
「維持する」によって、本発明のヒトＩＬ−２ムテインが、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量で観察される活性のレベルに対して、所望の生物学的活性の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも８５％〜１００％まで（すなわち、同等の値）を誘導することが意図される。従って、所望の生物学的活性がＮＫ細胞増殖の誘導である場合は、本発明の適切なＩＬ−２ムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導されるＮＫ細胞増殖活性の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％〜１００％まで（±５％）のＮＫ細胞増殖のレベルを誘導し、ここでＮＫ細胞増殖は、同じバイオアッセイ（すなわち、本明細書中で開示されるＮＫ−９２バイオアッセイ）および同様の量のこれらＩＬ−２ムテインを用いる類似の条件下でアッセイされる。
【００６９】
「増強する」または「増大させる」または「改善する」によって、ヒトＩＬ−２ムテインが、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量で観察されるものと比較して増大しているレベルの所望の生物学的活性を誘導することが意図される。従って、所望の生物学的活性がＮＫ細胞増殖の誘導である場合は、本発明の適切なＩＬ−２ムテインは、同じＮＫ細胞増殖アッセイ（例えば、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイ）を使用してデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量で観察されるＮＫ細胞増殖活性の少なくとも１０５％、１１０％、１１５％、より好ましくは少なくとも１２０％、更により好ましくは少なくとも１２５％、そして最も好ましくは少なくとも１３０％、１４０％または１５０％であるＮＫ細胞増殖のレベルを誘導する。
【００７０】
ＮＫ細胞増殖を測定するアッセイは、当該分野で周知である（例えば、Ｂａｕｍｅら（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．２２：１−６、Ｇｏｎｇら（１９９４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ８（４）：６５２−６５８および本明細書中で記載されるＮＫ−９２バイオアッセイを参照のこと）。好ましくは、ＮＫ−９２細胞を用いて、ＩＬ−２誘導性炎症誘発性サイトカイン生産（特に、ＴＮＦ−α生産）およびＮＫ細胞増殖を測定する（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイ）。ＮＫ細胞増殖アッセイにおいて使用するのに適切なヒトＩＬ−２ムテイン濃度は、約０．００５ｎＭ（５ｐＭ）〜約１．０ｎＭ（１０００ｐＭ）、（０．００５ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１．０ｎＭおよび他の約０．００５ｎＭと約１．０ｎＭの間のこのような値が挙げられる）を包含する。本明細書中の以下に記載される好ましい実施形態において、ＮＫ細胞増殖アッセイは、ＮＫ−９２細胞および約０．１ｎＭまたは約１．０ｎＭのヒトＩＬ−２ムテインの濃度を用いて実施される。
【００７１】
炎症誘発性サイトカイン生産の低減された誘導および維持または増強されたＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖の結果として、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の何れかよりも、より好ましいＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖：ＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性炎症誘発性サイトカイン生産の比を有し、ここでこれらの活性は、各ムテインについて類似のタンパク質濃度およびバイオアッセイ条件を用いて測定される。測定される炎症誘発性サイトカインがＴＮＦ−αである場合、本発明の適切なヒトＩＬ−２ムテインは、同様のバイオアッセイ条件およびタンパク質濃度の下でのデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で得られるものの少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも１．７５倍、２．０倍、２．２５倍、更に好ましくは参照ＩＬ−２ムテインで得られるものの少なくとも２．７５倍、３．０倍または３．２５倍である、０．１ｎＭムテインにおけるＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖：１．０ｎＭムテインにおけるＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産の比を有する。いくつかの実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、同様のバイオアッセイ条件およびタンパク質濃度の下でのデス−アラニル−１，ヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で得られるものの少なくとも３．５倍、３．７５倍、４．０倍、４．５倍、または更には５．０倍である、０．１ｎＭムテインにおけるＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖：１．０ｎＭムテインにおけるＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産の比を有する。
【００７２】
本発明のムテインはまた、同様のバイオアッセイ条件およびタンパク質濃度の下でのデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されるものと比較して、ＮＫ細胞生存を増強（すなわち、増大）する。ＮＫ細胞生存は、本明細書中に記載されるアッセイを含む当該分野で公知の任意のアッセイを用いて決定され得る。従って、例えば、目的のＩＬ−２ムテインの存在下のＮＫ細胞の生存は、ＮＫ細胞においてグルココルチコステロイドのプログラムされた細胞死をブロックし、そしてＢＣＬ−２発現を誘導するＩＬ−２ムテインの能力を測定することによって、決定され得る（例えば、Ａｒｍａｎｔら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８５：３３１を参照のこと）。
【００７３】
本発明は、ＮＫ細胞生存に対するＩＬ−２の効果をモニタリングするためのアッセイを提供する。従って、１つの実施形態において、目的のヒトＩＬ−２ムテインの存在下でのＮＫ細胞の生存は、ｐＡＫＴ ＥＬＩＳＡを用いたＮＫ３．３細胞（ＣＭＣＣ ＩＤ＃１２０２２；Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ（１９８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９（６）：２８３１−２８３７を参照のこと）における細胞生存シグナル伝達カスケードを誘導するムテインの能力を測定することによって決定される。この様式において、目的のＩＬ−２ムテインによるＮＫ細胞におけるＡＫＴのリン酸化のアップレギュレーションは、ＮＫ細胞生存の指標として使用される。
【００７４】
本発明の方法において使用するためのＩＬ−２ムテインは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化および／または増やして、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）活性および抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する。休止（非活性化）ＮＫ細胞は、ヒト赤白血病Ｋ５６２細胞株のような「ＮＫ細胞感受性」標的と称される特定の細胞標的に対する、自発的または天然の細胞毒性を媒介する。ＩＬ−２による活性化の後、ＮＫ細胞は、ＬＡＫ活性を獲得する。このようなＬＡＫ活性は、例えば、種々の腫瘍細胞および他の「ＬＡＫ感受性／ＮＫ非感受性」標的（例えば、休止（すなわち、非活性化）ＮＫ細胞による溶解に通常は耐性であるＤａｕｄｉ Ｂ細胞リンパ腫株）を殺傷するＩＬ−２活性化ＮＫ細胞の能力を測定することによりアッセイされ得る。同様に、ＡＤＣＣ活性は、「ＬＡＫ感受性／ＮＫ非感受性」の標的細胞（例えば、Ｄａｕｄｉ Ｂ細胞リンパ腫株）、または関連する腫瘍細胞に特異的な抗体の最適濃度の存在下で休止（すなわち、非活性化）ＮＫ細胞により容易に溶解されない他の標的細胞を溶解する、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞の能力を測定することによってアッセイされ得る。ＮＫ／ＬＡＫ細胞の細胞毒性活性およびＡＤＣＣを発生させて測定するための方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １７，Ｕｎｉｔ ７．７，７．１８および７．２７（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９６）を参照のこと。１つの実施形態において、本発明のＩＬ−２ムテインのＡＤＣＣ活性は、末梢血ＮＫ細胞の表現型および機能的特徴を示すＮＫ３．３細胞株を用いて測定される。本発明の目的のために、このアッセイは、本明細書において「ＮＫ３．３細胞毒性バイオアッセイ」と称される。
【００７５】
本発明のヒトＩＬ−２ムテインはまた、同様のバイオアッセイ条件およびタンパク質濃度の下でデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察されるものと比較して、ＩＬ−２誘導性Ｔ細胞増殖を維持または増強し得る。Ｔ細胞増殖アッセイは、当該分野で周知である。１つの実施形態において、ヒトＴ細胞株Ｋｉｔ２２５（ＣＭＣＣ ＩＤ＃１１２３４；Ｈｏｒｉら（１９８７）Ｂｌｏｏｄ ７０（４）：１０６９−１０７２）を使用して、本明細書の以下に記載されるアッセイに従ってＴ細胞増殖を測定する。
【００７６】
上記した通り、本明細書において同定された主要なヒトＩＬ−２ムテイン候補（すなわち、最も改善された治療指数を有する新規のムテイン）は、３つの機能クラスに分類される。第１の機能クラスは、１．０ｎＭのタンパク質濃度において同様の条件下で全ムテインをアッセイした場合に、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるものの約６０％以下のＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のより低値のレベルを誘導し、そしてデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較してＮＫ細胞の増殖を維持または増強するムテインを含む。これらのムテインは、以下の２つのサブクラスにさらに分けられる：（１）これらのムテインが約１．０ｎＭのタンパク質濃度において同様の条件下でアッセイされる場合に、参照ヒトＩＬ−２ムテインで観察されるものと比較してＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を増強（すなわち、１００％超）するが、約０．１ｎＭ以下の濃度の参照ヒトＩＬ−２ムテインで観察されるものと比較して低減された（すなわち、１００％未満の）ＮＫ細胞増殖活性を有するヒトＩＬ−２ムテイン；および（２）これらのムテインが約１．０ｎＭ〜約０．０５ｎＭ（すなわち約５０ｐＭ）のタンパク質濃度において同様の条件下でアッセイされる場合に、参照ヒトＩＬ−２ムテインで観察されるものと比較してＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖を増強（すなわち、１００％超）または維持（すなわち、少なくとも約７０％〜約１００％）するヒトＩＬ−２ムテイン。１つの実施形態において、ＩＬ−２誘導性ＮＫ増殖およびＴＮＦ−α生産は、ＮＫ−９２細胞を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）測定され、この測定において、ＮＫ細胞増殖は、市販のＭＴＴ色素還元キット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）非放射活性細胞増殖アッセイキット；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎより入手可能））を用いて決定され、そして刺激指数は、比色読み取り値に基づいて計算され、そしてＴＮＦ−αは、市販のＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｃｙｔｏｓｃｒｅｅｎ^ＴＭ ヒトＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキット；Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて定量される。この第１の機能クラスのサブクラス（１）に属するヒトＩＬ−２ムテインとしては、１９Ｄ４０Ｄ、３６Ｄ６１Ｒ、３６Ｄ６５Ｌ、４０Ｄ６１Ｒ、４０Ｄ６５Ｙ、４０Ｇ６５Ｙ、８１Ｋ９１Ｄからなる群より選択される少なくとも１つの組み合わせ置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含むムテインが挙げられ、ここで残基の位置（すなわち、１９、３６、４０、６１、６５、８１または９１）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）ものである。本明細書中の以下の実施例２および表３を参照のこと。第１の機能クラスのサブクラス（２）に属するヒトＩＬ−２ムテインとしては、４０Ｄ７２Ｎ、８０Ｋ６５Ｙ、８１Ｋ８８Ｄ、８１Ｋ４２Ｅ、８１Ｋ７２Ｎ、１０７Ｈ６５Ｙ、１０７Ｒ７２Ｎからなる群より選択される少なくとも１つの組み合わせ置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含むムテインが挙げられ、ここで残基の位置（すなわち、４０、４２、６５、７２、８０、８１、８８または１０７）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）ものである。本明細書中の以下の実施例２および表４を参照のこと。
【００７７】
第２の機能クラスのヒトＩＬ−２ムテインとしては、ＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産に対して有害な影響を及ぼすことなくＮＫ細胞増殖を強力に増大させるムテインが挙げられる。この機能グループに属するムテインは、以下の３つの選択基準を満たす：（１）０．００５ｎＭ（すなわち、５ｐＭ）、０．０２ｎＭ（すなわち、２０ｐＭ）、０．０５ｎＭ（すなわち、５０ｐＭ）、０．１ｎＭ（すなわち、１００ｐＭ）または１．０ｎＭ（すなわち、１０００ｐＭ）からなる群より選択されるヒトＩＬ−２ムテインの１以上の濃度において、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるレベルの約２００％超であるＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖のレベル；（２）０．００５ｎＭ（すなわち、５ｐＭ）、０．０２ｎＭ（すなわち、２０ｐＭ）、０．０５ｎＭ（すなわち、５０ｐＭ）、０．１ｎＭ（すなわち、１００ｐＭ）または１．０ｎＭ（すなわち、１０００ｐＭ）からなる群より選択されるヒトＩＬ−２ムテインの少なくとも２つの濃度について測定される場合に、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるレベルの約１５０％超であるＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖のレベル；ならびに（３）ＴＮＦ−α生産が１．０ｎＭ（すなわち、１０００ｐＭ）または０．１ｎＭ（すなわち、１００ｐＭ）のムテイン濃度でアッセイされる場合に、参照ＩＬ−２ムテインにより誘導されるものと同様（すなわち、±１０％）、または好ましくは参照ＩＬ−２ムテインにより誘導されるものの９０％未満であるＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産のレベル。１つの実施形態において、ＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産およびＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、ＮＫ−９２細胞を用いて（すなわち、本明細書中で開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）決定され、ここでＴＮＦ−α生産はＥＬＩＳＡを用いて測定され、そしてＮＫ細胞増殖は上記したＭＴＴアッセイにより測定される。この第２の機能クラスに属するヒトＩＬ−２ムテインとしては、１９Ｄ８１Ｋ、４０Ｇ３６Ｄおよび８１Ｋ３６Ｄからなる群より選択される少なくとも１つの組み合わせ置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含むムテインが挙げられ、ここで残基の位置（すなわち、１９、３６、４０または８１）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）ものである。本明細書中の以下の実施例３および表５を参照のこと。
【００７８】
第３の機能クラスのヒトＩＬ−２ムテインとしては、それらが、参照ＩＬ−２ムテインと比較してＮＫ細胞増殖の増大およびＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産の低減を誘導する点において「二官能性」であるムテインが挙げられる。この第３の機能クラスに属するムテインは、以下の基準を満たす：（１）０．００５ｎＭ（すなわち、５ｐＭ）、０．０２ｎＭ（すなわち、２０ｐＭ）、０．０５ｎＭ（すなわち、５０ｐＭ）、０．１ｎＭ（すなわち、１００ｐＭ）または１．０ｎＭ（すなわち、１０００ｐＭ）からなる群より選択されるいずれか１つのムテイン濃度についてアッセイされる場合に、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察されるレベルの少なくとも約１５０％であるＮＫ細胞増殖のレベルを誘導すること；および（２）約１．０ｎＭのムテイン濃度においてアッセイされる場合にデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導されるレベルの約７５％未満であるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α生産のレベルを誘導すること。１つの実施形態において、ＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産およびＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、ＮＫ−９２細胞を用いて（すなわち、本明細書中に開示されるＮＫ−９２バイオアッセイを用いて）決定され、ここでＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産は、ＥＬＩＳＡを用いて測定され、そしてＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖は、上記したＭＴＴ試験によって測定される。この第３の機能クラスに属するヒトＩＬ−２ムテインとしては、３６Ｄ４２Ｒ、３６Ｄ８０Ｋ、４０Ｄ８０Ｋ、８１Ｋ６１Ｒ、９１Ｎ９５Ｇ、１０７Ｈ３６Ｄ、１０７Ｒ３６Ｄおよび９１Ｎ９４Ｙ９５Ｇからなる群より選択される少なくとも１つの組み合わせ置換を有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含むムテインが挙げられ、ここで残基の位置（すなわち、３６、４０、４２、６１、８０、８１、９１、９４、９５または１０７）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）ものである。本明細書中の以下の実施例４および表６を参照のこと。
【００７９】
本発明はまた、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２に関して観察されるものと比較して改善された治療指数に寄与する他の選択基準を満たすヒトＩＬ−２ムテインを提供する。従って、例えば、別の実施形態において、本発明は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察されるものより少なくとも１．２５倍、１．５倍、１．７５倍高く、好ましくは少なくとも２．０倍、２．５倍、３．０倍高く、より好ましくは少なくとも３．５倍、３．７５倍、４．０倍、４．５倍〜５倍高い、１．０ｎＭムテインにおけるＮＫ細胞によるＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α産生に対する０．１ｎＭムテインにおけるＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖の比もまた示すヒトＩＬ−２ムテインを提供する。これらの基準を満たすムテインとしては、表１に示されるすべてのムテインが挙げられるが、１９Ｄ４０Ｄ組み合わせ置換を含むヒトＩＬ−２ムテインは除く。この指数の上昇は、増強されたＮＫ細胞エフェクター機能および低減された毒性の有益な効果を考慮して改善された臨床的な利益を予測する。
【００８０】
（新規のヒトＩＬ−２ムテインの生物学的に活性な改変体）
本発明はまた、参照ＩＬ−２分子と比較してこれらの改善された特性もまた有する本明細書中に開示される新規のヒトＩＬ−２ムテインの生物学的に活性な改変体を提供する。すなわち、この生物学的に活性な改変体は、本明細書中の他の箇所に開示されるバイオアッセイを使用して、参照ＩＬ−２分子（すなわち、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２）と比較した場合、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカインの低い生産または低減された産生を誘導し、そしてＮＫ細胞増殖を維持または増大させる。前述の通り、本明細書において同定される何れかの所定の新規のヒトＩＬ−２ムテインの改変体は、それが参照ＩＬ−２分子と比較して所望の特性（すなわち、本明細書の他の箇所に開示されるバイオアッセイを使用して参照ＩＬ−２分子と比較した場合に、炎症誘発性サイトカイン生産が低減し、そして／またはＮＫ細胞増殖が増大するという、低減された毒性）を有する限り、本発明の新規のヒトＩＬ−２ムテインで観察されるものと比較して特定の生物学的活性の異なる絶対的レベルを有し得ることが認識される。
【００８１】
「改変体」によって、実質的に同様の配列が意図される。本明細書中に記載される新規のヒトＩＬ−２ムテインの改変体は、天然に存在する核酸配列またはアミノ酸配列に由来してもよいし（例えば、ＩＬ−２遺伝子座に存在する対立遺伝子改変体）、組換え生産された核酸配列またはアミノ酸配列に由来してもよい（例えば、ムテイン）。ポリペプチド改変体は、本明細書中に開示される新規のヒトＩＬ−２ムテインのフラグメントであってもよいし、または、それらは、上記変異体ポリペプチドが本明細書中に開示される新規のヒトＩＬ−２ムテイン内に存在する目的の特定のアミノ酸置換を保持している限り、１以上のさらなるアミノ酸の置換もしくは欠失、またはアミノ酸挿入を有することによって新規のヒトＩＬ−２ムテインと異なっていてもよい。従って、適切なポリペプチド改変体としては、成熟ヒトＩＬ−２配列（すなわち、配列番号４）の１２５位に対応するＣ１２５Ｓ置換、本発明の新規のヒトＩＬ−２ムテインの改善された治療指数に寄与するものとして本明細書中で同定された組み合わせ置換のうちの１つ（すなわち、上記表１に示される組み合わせ置換）を有し、そして１以上のさらなるアミノ酸の置換もしくは欠失、またはアミノ酸挿入を有するものが挙げられる。従って、例えば、上記新規のヒトＩＬ−２ムテインが、表１に示される組み合わせ置換のうちの１つを有するデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）のアミノ酸配列を含む場合、これらの新規のヒトＩＬ−２ムテインの適切な生物学的に活性な改変体はまた、Ｃ１２５Ｓ置換ならびに表１に示される組み合わせ置換を含むが、上記改変体ポリペプチドが参照ＩＬ−２分子（すなわち、参照ＩＬ−２ムテインＣ１２５ＳヒトＩＬ−２またはデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２）と比較して所望の特性を有し、従って、参照ヒトＩＬ−２分子（すなわち、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２）と比較した場合に炎症誘発性サイトカイン生産が低減し、そして／またはＮＫ細胞増殖が増大するという、低減された毒性を有する限り、上記の生物学的に活性な改変体は、１以上のさらなる置換、挿入または欠失を有する点においてそれぞれの新規のヒトＩＬ−２ムテインとは異なり得る。このような改変体は、それぞれの新規のヒトＩＬ−２ムテイン（例えば、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２に示される新規ヒトＩＬ−２ムテイン）のアミノ酸配列と少なくとも７０％、一般的に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％同一であり、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を有し、ここで配列同一性の割合は、本明細書中の以下で記述するとおりに決定される。
【００８２】
他の実施形態において、上記生物学的に活性な改変体は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の残基２〜１３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、一般的に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％同一であり、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を有し、ここで配列同一性の割合は、本明細書中の以下で記述するとおりに決定される。
【００８３】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインの生物学的に活性な改変体は、ヒトＩＬ−２ムテインの所望の機能特性に影響しない、アラニンのような別の中性のアミノ酸で置き換えられたＣ１２５Ｓ置換を有する。従って、例えば、このような改変体は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位におけるセリン残基に対して置換されたアラニン残基を含むアミノ酸配列を有する。さらに他の実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテイン生物学的に活性な改変体は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の残基２〜１３３を含むが、例外として、これらの配列の１２５位においてセリン残基に対して置換されたアラニン残基を有する。
【００８４】
本発明の代替的な実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインの生物学的に活性な改変体は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２のアミノ酸配列を含むが、例外として、これらの配列の１２５位においてセリン残基に対して置換されたシステイン残基を有する。さらに他の実施形態において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインの生物学的に活性な改変体は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の残基２〜１３３を含むが、例外として、これらの配列の１２５位においてセリン残基に対して置換されたシステイン残基を有する。
【００８５】
核酸「改変体」によって、本発明の新規のヒトＩＬ−２ムテインをコードするが、そのヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮重に起因して本明細書中に開示される新規のムテイン配列とは異なるポリヌクレオチドが意図される。天然に存在するアミノ酸についてのコドンは当該分野で周知であり、これらとしては、組換えタンパク質を発現するために使用される特定の宿主生物において最も頻繁に使用されているコドンが挙げられる。本明細書中に開示されるＩＬ−２ムテインをコードするヌクレオチド配列は、添付する配列表に示されるもの、ならびに遺伝子コードの縮重により開示される配列とは異なるヌクレオチド配列を包含する。
【００８６】
従って、例えば、本発明のＩＬ−２ムテインがアスパラギン酸（すなわち、Ｄ）の置換を含む場合（例えば、１９Ｄ４０Ｄ、１９Ｄ８１Ｋ、３６Ｄ４２Ｒ、３６Ｄ６１Ｒ、３６Ｄ６５Ｌ、４０Ｄ３６Ｄ、４０Ｄ６１Ｒ、４０Ｄ６５Ｙ、４０Ｄ７２Ｎ、４０Ｄ８０Ｋ、４０Ｇ３６Ｄ、８０Ｋ３６Ｄ、８１Ｋ３６Ｄ、８１Ｋ８８Ｄ、８１Ｋ９１Ｄ、１０７Ｈ３６Ｄ、１０７Ｒ３６Ｄまたは４０Ｄ８１Ｋ１０７Ｈの組み合わせ置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニル−１，Ｃ１２５Ｓムテイン）、置換されたアスパラギン酸残基をコードするヌクレオチド配列は、アスパラギン酸についての２つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＧＡＣおよびＧＡＴ）から選択され得る。上記組み合わせ置換が２つの類似の残基の置換を含む場合（例えば、１９Ｄ４０Ｄまたは４０Ｄ３６Ｄの組み合わせ置換を含むムテイン）、その置換された残基は、同じ一般的なコドンによってコードされてもよいし（すなわち、両方の置換がＧＡＣまたはＧＡＴのいずれかによってコードされる）、代替的な一般的コドンによってコードされてもよい（すなわち、一方はＧＡＣによってコードされ、もう一方はＧＡＴによってコードされる）。同様に、本発明のＩＬ−２ムテインがグリシン（すなわち、Ｇ）の置換を含む場合（例えば、４０Ｇ３６Ｄ、４０Ｇ６５Ｙ、９１Ｎ９５Ｇ、４０Ｇ８１Ｋ１０７Ｈまたは９１Ｎ９４Ｙ９５Ｇの組み合わせ置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニル−１，Ｃ１２５Ｓムテイン）、置換されたグリシン残基をコードするヌクレオチド配列は、グリシンについての４つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡおよびＧＧＧ）から選択され得る。
【００８７】
本発明のＩＬ−２ムテインがリジン（すなわち、Ｋ）の置換を含む場合（例えば、１９Ｄ８１Ｋ、４０Ｄ８０Ｋ、８０Ｋ３６Ｄ、８０Ｋ６５Ｙ、８１Ｋ３６Ｄ、８１Ｋ４２Ｅ、８１Ｋ６１Ｒ、８１Ｋ６５Ｙ、８１Ｋ７２Ｎ、８１Ｋ８８Ｄ、８１Ｋ９１Ｄ、８１Ｋ１０７Ｈ、４０Ｄ８１Ｋ１０７Ｈまたは４０Ｇ８１Ｋ１０７Ｈの組み合わせ置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニル−１，Ｃ１２５Ｓムテイン）、置換されたリジン残基をコードするヌクレオチド配列は、リジンについての２つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＡＡＡおよびＡＡＧ）から選択され得る。同様に、本発明のＩＬ−２ムテインがロイシン残基（すなわち、Ｌ）の置換を含む場合（例えば、３６Ｄ６５Ｌまたは８１Ｌ１０７Ｈの組み合わせ置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニル−１，Ｃ１２５Ｓムテイン）、置換されたロイシン残基をコードするヌクレオチド配列は、ロイシンについての６つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡおよびＣＴＧ）から選択され得る。
【００８８】
本発明のＩＬ−２ムテインがアスパラギン（すなわち、Ｎ）の置換を含む場合（例えば、４０Ｄ７２Ｎ、８１Ｋ７２Ｎ、９１Ｎ９５Ｇ、１０７Ｒ７２Ｎまたは９１Ｎ９４Ｙ９５Ｇの組み合わせ置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニル−１，Ｃ１２５Ｓムテイン）、置換されたアスパラギン残基をコードするヌクレオチド配列は、アスパラギンについて２つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＧＡＴおよびＧＡＣ）から選択され得る。同様に、本発明のＩＬ−２ムテインがヒスチジン（すなわち、Ｈ）の置換を含む場合（例えば、８１Ｋ１０７Ｈ、８１Ｌ１０７Ｈ、１０７Ｈ３６Ｄ、１０７Ｈ４２Ｅ、１０７Ｈ６５Ｙ、４０Ｄ８１Ｋ１０７Ｈまたは４０Ｇ８１Ｋ１０７Ｈの組み合わせ置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニル−１，Ｃ１２５Ｓムテイン）、置換されたヒスチジン残基をコードするヌクレオチド配列は、ヒスチジンについての２つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＣＡＴおよびＣＡＣ）から選択され得る。
【００８９】
本発明のＩＬ−２ムテインがアルギニン（すなわち、Ｒ）の置換を含む場合（例えば、３６Ｄ４２Ｒ、３６Ｄ６１Ｒ、４０Ｄ６１Ｒ、８１Ｋ６１Ｒ、１０７Ｒ３６Ｄまたは１０７Ｒ７２Ｎの組み合わせ置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニル−１，Ｃ１２５Ｓムテイン）、置換されたアルギニン残基をコードするヌクレオチド配列は、アルギニンについての６つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧ）から選択され得る。同様に、本発明のＩＬ−２ムテインがチロシン（すなわち、Ｙ）の置換を含む場合（例えば、４０Ｄ６５Ｙ、４０Ｇ６５Ｙ、８０Ｋ６５Ｙ、８１Ｋ６５Ｙ、１０７Ｈ６５Ｙまたは９１Ｎ９４Ｙ９５Ｇの組み合わせ置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニル−１，Ｃ１２５Ｓムテイン）、置換されたチロシン残基をコードするヌクレオチド配列は、チロシンについての２つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＴＡＴおよびＴＡＣ）から選択され得る。本発明のＩＬ−２ムテインがグルタミン酸（すなわち、Ｅ）の置換を含む場合（例えば、８１Ｋ４２Ｅまたは１０７Ｈ４２Ｅの組み合わせ置換を含むＣ１２５Ｓまたはデス−アラニル−１，Ｃ１２５Ｓムテイン）、置換されたグルタミン酸残基をコードするヌクレオチド配列は、グルタミン酸についての２つの一般的なトリプレットコドン（すなわち、ＧＡＡおよびＧＡＧ）から選択され得る。
【００９０】
前述の核酸改変体のリストは、本明細書において同定される特定の残基の置換をコードするために利用され得る一般的なコドンを列挙しているが、本発明が、遺伝子コードにおける縮重の結果として、本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテインをコードする全ての核酸改変体を包含することが認識される。
【００９１】
天然のヒトＩＬ−２の天然に存在する対立遺伝子改変体は、周知の分子生物学の技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術）を用いて同定され得、そしてこれらの新規のヒトＩＬ−２ムテインの所望の治療指数に影響することなく本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテイン内に導入され得るさらなる変異への指針として機能し得る。改変体ヌクレオチド配列はまた、例えば部位特異的変異誘発によって作製されているが、以下に議論するように、なお本明細書に開示される新規ＩＬ−２ムテインをコードする合成誘導されたヌクレオチド配列に由来するムテインも包含する。一般的に、本発明のヌクレオチド配列改変体は、例えば、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９または７１に示される新規のヒトＩＬ−２ムテインコード配列に関して、そのそれぞれの新規のヒトＩＬ−２ムテインヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、一般的に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有し、ここで配列同一性の割合は、本明細書中の以下に注記するように決定される。他の実施形態において、本発明のヌクレオチド配列改変体は、例えば、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９または７１に示されるコード配列のヌクレオチド４〜３９９と少なくとも７０％、一般的に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有し、ここで配列同一性の割合は、本明細書中の以下に注記するように決定される。
【００９２】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、本発明のＩＬ−２ムテインをコードするオープンレーディングフレームを含む核酸分子を指す。本明細書中で使用される場合、語句「対立遺伝子改変体」は、ＩＬ−２遺伝子座に存在するヌクレオチド配列、またはそのヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを指す。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的にはＩＬ−２遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変化をもたらす。各々このようなヌクレオチドのバリエーションの任意のものおよび全てと、天然の対立遺伝子変異の結果であり、そして本発明の新規のヒトＩＬ−２ムテインの機能活性を変更しないＩＬ−２配列において結果として生じるアミノ酸の多形またはバリエーションとは、本発明に従って変異され得る配列であることが意図され、そして結果として生じる配列の全てが、本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【００９３】
例えば、本明細書中に開示される新規のヒトＩＬ−２ムテインのアミノ酸配列改変体は、その変異が表１に同定される組み合わせ置換を変更しない限り、新規のＩＬ−２ムテインをコードするクローニングされたＤＮＡ配列内において変異を作製することによって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当該分野で周知である。例えば、ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ（編）（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；米国特許第４，８７３，１９２号およびそこに引用されている参考文献を参照のこと。ＩＬ−２ムテインの所望の生物学的活性（すなわち、毒性の低減、およびＮＫ細胞増殖の維持または増大を予測するＮＫ細胞による炎症誘発性生産の低減）に影響し得ない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見出され得る。
【００９４】
本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテインの生物学的に活性な改変体を設計する場合、保存的な置換（例えば、１つのアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸に交換すること）が好ましくあり得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられている置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。例えば、Ｂｏｗｉｅら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６を参照のこと。保存的置換の例としては、Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔ＧｌｎおよびＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、このような置換は、アミノ末端連続システイン残基のような保存されたシステイン残基に対しては行われない。
【００９５】
本明細書中で同定される所望の置換以外の残基の置換、欠失または挿入のいずれかを介して改変され得るヒトＩＬ−２タンパク質の領域に関する指針は、当該分野で見出され得る。例えば、Ｂａｚａｎ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：４１０−４１２；ＭｃＫａｙ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：４１２；Ｔｈｅｚｅら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：４８１−４８６；ＢｕｃｈｌｉおよびＣｉａｒｄｅｌｌｉ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ ３０７：４１１−４１５；Ｃｏｌｌｉｎｓら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７７０９−７７１３；Ｋｕｚｉｅｌら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５７３１；Ｅｃｋｅｎｂｅｒｇら（１９９７）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９：４８８−４９８で考察されている構造／機能の関連および／または結合研究を参照のこと。
【００９６】
本発明の新規のヒトＩＬ−２ムテインの改変体の構築において、その改変体をコードするヌクレオチド配列の改変は、その改変体ポリペプチドが所望の活性を保有し続けることが可能なようになされる。明らかに、改変体ポリペプチドをコードするＤＮＡ内に作製されるいずれの変異も、リーディングフレームの範囲外にその配列を配置してはならず、そして好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を形成する相補領域を作製しない。ポリペプチドの改変体は、わずか１〜１５個のアミノ酸残基（例えば、６〜１０個、わずか５個、わずか４個、３個、２個または更には１個のアミノ酸残基）だけ異なり得る。ヌクレオチド配列の改変体は、わずか１〜３０個のヌクレオチド（例えば、６〜２５個、わずか５個、わずか４個、３個、２個または更には１個のヌクレオチド）だけ異なり得る。
【００９７】
本発明のヒトＩＬ−２ムテインの生物学的に活性な改変体は、これらのムテインのフラグメントを含む。「フラグメント」によって、コードヌクレオチド配列の部分またはアミノ酸配列の部分が意図される。コード配列に関して、ヒトＩＬ−２ムテインヌクレオチド配列のフラグメントは、新規のヒトＩＬ−２ムテインの所望の生物学的活性を保持するムテインフラグメントをコードし得る。本明細書中に開示される新規のヒトＩＬ−２ムテインのフラグメントは、新規のヒトＩＬ−２ポリペプチドの１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸、４０アミノ酸、４５アミノ酸、５０アミノ酸、５５アミノ酸、６０アミノ酸、６５アミノ酸、７０アミノ酸、７５アミノ酸、８０アミノ酸、８５アミノ酸、９０アミノ酸、９５アミノ酸、１００アミノ酸、１０５アミノ酸、１１０アミノ酸、１１５アミノ酸、１２０アミノ酸、１２５アミノ酸、１３０アミノ酸であっても、完全長までのものであってもよい。コードヌクレオチド配列のフラグメントは、新規のヒトＩＬ−２ムテインをコードするヌクレオチド配列の少なくとも４５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１３５ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１６５ヌクレオチド、１８０ヌクレオチド、１９５ヌクレオチド、２１０ヌクレオチド、２２５ヌクレオチド、２４０ヌクレオチド、２５５ヌクレオチド、２７０ヌクレオチド、２８５ヌクレオチド、３００ヌクレオチド、３１５ヌクレオチド、３３０ヌクレオチド、３４５ヌクレオチド、３６０ヌクレオチド、３７５ヌクレオチド、３９０ヌクレオチドから全ヌクレオチド配列までの範囲であってよい。
【００９８】
本明細書中で開示されるヒトＩＬ−２ムテインおよびその生物学的に活性な改変体は、それらが参照ＩＬ−２分子と比較して所望の特性を有する限り（すなわち、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと比較して低減した毒性および／または増大したＮＫ細胞増殖を有する限り）、さらに改変され得る。さらなる改変としては、リン酸化、非天然アミノ酸アナログの置換などが挙げられるが、これらに限定されない。延長されたインビボ曝露をもたらし得、そしてそれによりＩＬ−２ムテインの薬学的処方物の効能を増大させ得るＩＬ−２ムテインの改変としては、タンパク質分子のグリコシル化またはＰＥＧ化が挙げられる。本来グリコシル化されていないタンパク質のグリコシル化は、その分子へＮ連結型グリコシル化部位を挿入することによって通常は行われる。このアプローチは、ＩＬ−２ムテインのようなタンパク質の半減期を延長するために使用され得る。さらに、このアプローチは、免疫原性エピトープを遮蔽し、タンパク質溶解度を上昇させ、凝集を低減し、そして発現および精製の収率を増大させるために使用され得る。
【００９９】
本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテインの改変体が一旦得られれば、ヒトＩＬ−２ムテイン配列の欠失、挿入および置換が、特定のヒトＩＬ−２ムテインの特徴の劇的な変化を生じることは予測されない。しかしながら、置換、欠失または挿入の正確な効果を、それを実施するよりも前に予測することが困難である場合、当業者は、その効果が慣用的なスクリーニングアッセイによって評価されることを理解する。すなわち、ＩＬ−２誘導性のＮＫ細胞増殖またはＴ細胞増殖の活性は、本明細書中に記載されるアッセイを含む当該分野で公知の標準的な細胞増殖アッセイによって評価され得る。ＩＬ−２誘導性炎症誘発性サイトカイン生産は、サイトカイン特異的ＥＬＩＳＡ（例えば、本明細書中の他の箇所に記載されるＴＮＦ−α特異的ＥＬＩＳＡ）を用いて測定され得る。ＮＫ細胞生存シグナル伝達は、ｐＡＫＴ ＥＬＩＳＡ（例えば、本明細書中の以下の記載されるアッセイを参照のこと）によって測定され得る。ＮＫ細胞媒介性細胞溶解活性（すなわち、細胞毒性）は、当該分野で公知のアッセイ（例えば、本明細書中の他の箇所で記載されるＮＫ媒介性、ＬＡＫ媒介性またはＡＤＣＣ媒介性の細胞溶解活性の測定）によって測定され得る。
【０１００】
本明細書中に開示されるヒトＩＬ−２ムテインおよびその生物学的に活性な改変体は、投薬頻度を低減するか、またはＩＬ−２耐容性をさらに向上させるために、第２のタンパク質に融合されたか、またはポリプロリンもしくは水溶性重合体に共有結合で結合体化されたＩＬ−２ムテイン（または本明細書に定義される、その生物学的に活性な改変体）を含むＩＬ−２融合体または結合体として構築され得る。例えば、ヒトＩＬ−２ムテイン（または本明細書に定義される、その生物学的に活性な改変体）は、当該分野で公知の方法を使用してヒトアルブミンまたはアルブミンフラグメントに融合され得る（例えば、ＷＯ ０１／７９２５８を参照のこと）。あるいは、ヒトＩＬ−２（または本明細書に定義される、その生物学的に活性な改変体）は、当該分野で公知の方法を使用して、ポリプロリンまたはポリエチレングリコールのホモポリマーおよびポリオキシエチル化ポリオールに共有結合で結合体化され得、その場合ホモポリマーは、未置換であるか、または一端においてアルキル基で置換されており、そしてポリオールは未置換である（例えば、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号および同第４，８９４，２２６号を参照のこと）。
【０１０１】
「配列同一性」によって、上記改変体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の特定の連続するセグメントが、参照配列のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と整列されて比較される場合に、同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基が、改変体配列および参照配列内に見出されることが意図される。配列アライメントおよび配列間の同一性の決定のための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １９（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡＬＩＧＮプログラム（Ｄａｙｈｏｆｆ（１９７８），Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：補遺３（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）を参照のこと。２つのヌクレオチド配列の最適なアライメントに関して、改変体ヌクレオチド配列の連続セグメントは、参照ヌクレオチド配列に関して付加されたヌクレオチドまたは欠失したヌクレオチドを有し得る。同様に、２つのアミノ酸配列の最適アライメントの目的のために、改変体アミノ酸配列の連続セグメントは、参照アミノ酸配列に関して付加されたアミノ酸残基または欠失したアミノ酸残基を有し得る。参照ヌクレオチド配列または参照アミノ酸配列との比較のために使用される連続セグメントは、少なくとも２０個の連続するヌクレオチド、またはアミノ酸残基を含み、そして３０個、４０個、５０個、１００個またはそれより多いヌクレオチドまたはアミノ酸の残基であり得る。改変体のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列にギャップが含まれていることに伴って配列同一性が上昇することに対する補正は、ギャップペナルティーを割り当てることによって行われ得る。配列アライメントの方法は、当該分野で周知である。
【０１０２】
２つの配列間の同一性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。本発明の目的のために、アミノ酸配列の配列同一性の割合は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムを使用して（ギャップオープンペナルティー１２およびギャップエクステンションペナルティー２、ＢＬＯＳＵＭマトリックス６２でのアファイン６ギャップサーチを使用）決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９に教示される。あるいは、ヌクレオチド配列の同一性の割合は、ギャップオープンペナルティー２５およびギャップエクステンションペナルティー５を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーサーチアルゴリズムを使用して決定される。配列同一性のこのような決定は、例えば、ＴｉｍｅＬｏｇｉｃのＤｅＣｙｐｈｅｒ Ｈａｒｄｗａｒｅ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒを用いて実施され得る。
【０１０３】
アミノ酸同一性の割合を考慮する際には、一部のアミノ酸の位置は、ポリヌクレオチド機能の特性に影響しない保存的アミノ酸置換の結果として異なっていてよいことが更に認識される。これらの例において、配列同一性の割合は、保存的に置換されたアミノ酸における類似性を説明するために上方に調節され得る。このような調節は当該分野で周知である。例えば、Ｍｅｙｅｒｓら（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１−１７を参照のこと。
【０１０４】
（組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
一般的に、本発明のヒトＩＬ−２ムテインは、ベクター、好ましくは発現ベクターから発現される。ベクターは、宿主細胞内の自律複製のために有用であるか、または、宿主細胞内への導入によりその宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得、そしてこれにより、宿主ゲノムとともに複製される（例えば非エピソーム性哺乳動物ベクター）。発現ベクターは、それらが作動可能に連結されているコード配列の発現を指向することができる。一般的に、組換えＤＮＡ技術において利用できる発現ベクターは、プラスミド（ベクター）の形態である場合が多い。しかしながら、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターの他の形態も包含することを意図している。
【０１０５】
本発明の発現構築物またはベクターは、宿主細胞内における核酸分子の発現に適する形態の本発明のヒトＩＬ−２ムテインをコードする核酸分子を含む。目的のコード配列は、例えば、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０２：３０５−３１０およびＤｅｖｏｓ（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：４３０７−４３２３により記載されている組換えＤＮＡ技術によるか、またはＷａｎｇら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：１４３１−１４３３に記載されている通り変異で変更されたＩＬ−２を用いて、作製できる。奇数配列番号９〜７１に示すコード配列は、一般的にはメッセンジャーＲＮＡにおける翻訳開始コドンＡＴＧであるメチオニンに対するコドンではなく、配列番号４の成熟ヒトＩＬ−２配列の第１の残基に対するコドン（すなわち、１位のアラニンに対するコドン）で開始することが認識される。これらの開示されたヌクレオチド配列はまた、奇数配列番号９〜７１の３９９位のヌクレオチドの後の翻訳終止コドンを欠いている。これらの配列または奇数配列番号９〜３４３のヌクレオチド４〜３９９を含む配列が本発明のヒトＩＬ−２ムテインを発現するために使用される場合は、これらのヒトＩＬ−２ムテインコード配列を含む発現構築物は、さらに翻訳開始コドン、例えばＡＴＧコドンを、ヒトＩＬ−２ムテインコード配列の上流および適切なリーディングフレーム内に含むことが認識される。翻訳開始コドンは、ヒトＩＬ−２ムテインコード配列を含む配列内に既に存在する、例えばＡＴＧのような翻訳開始コドンを利用することにより、ヒトＩＬ−２ムテインコード配列の開始コドンから上流の位置に提供することができ、またはその他の態様において、発現に使用されるべきプラスミドのような外来の供給源から提供され得る（ただし、ヒトＩＬ−２ムテインコード配列における開始コドンの前に最初に現れる翻訳開始コドンは、ヒトＩＬ−２ムテインコード配列の開始コドンの適切なリーディングフレーム内にある）。同様に、本明細書に開示するヒトＩＬ−２ムテインコード配列は、偶数配列番号１０〜７２に示す配列の最後のアミノ酸で終了するヒトＩＬ−２ムテインの産生を可能にするためには、例えばＴＧＡのような、１つまたは複数の翻訳終止コドンを後続させている。
【０１０６】
組換え発現ベクターは、発現すべき核酸配列に作動可能に連結した発現のために使用すべき宿主細胞に基づいて選択される１つまたは複数の調節配列を含む。「作動可能に連結」とは、目的のヌクレオチド配列（すなわち、本発明のヒトＩＬ−２ムテインをコードする配列）がヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で（すなわち、インビトロの転写／翻訳系において、または宿主細胞内にベクターを導入する場合は宿主細胞において）調節配列に連結されていることを意味する。「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を包含する。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０），Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を参照のこと。調節配列は、宿主細胞の多くの型におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指向するもの、および特定の宿主細胞のみにおけるヌクレオチドの発現を指向するもの（例えば、組織特異的調節配列）を包含する。当業者の理解するように、発現ベクターの設計は、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような要因に依存し得る。本発明の発現構築物を宿主細胞に導入することにより、本明細書に開示したヒトＩＬ−２ムテインを産生すること、または生物学的に活性なその改変体を産生することができる。
【０１０７】
本発明の発現構築物またはベクターは、原核生物または真核生物の宿主細胞内でヒトＩＬ−２ムテインまたはその改変体を発現させるために設計することができる。原核細胞におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、構成プロモーターまたは誘導プロモーターを含有するベクターを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで行われる。Ｅ．ｃｏｌｉ内の組換えタンパク質発現を最大限にするための方策は、例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ（１９９０），Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），ｐｐ．１１９−１２８およびＷａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８に見出され得る。ヒトＩＬ−２ムテインまたはその改変体を増殖させるため、回収するため、破壊するため、または細胞から抽出するためのプロセスは、実質的に、例えば、米国特許第４，６０４，３７７号；同第４，７３８，９２７号；同第４，６５６，１３２号；同第４，５６９，７９０号；同第４，７４８，２３４号；同第４，５３０，７８７号；同第４，５７２，７９８号；同第４，７４８，２３４号および同第４，９３１，５４３号に記載されている。
【０１０８】
組換えヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体は、酵母またはヒトの細胞のような真核細胞中でも行うことができる。適切な真核生物宿主細胞には、以下が挙げられる：昆虫細胞（培養昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）中でタンパク質を発現するために使用できるバキュロウイルスベクターの例としては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる）；酵母細胞（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｎｖｉｓｉａｅでの発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら，（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびｐＰｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が挙げられる）；または哺乳動物細胞（哺乳動物発現ベクターとしては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７；１９５）が挙げられる）。適当な哺乳動物細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞が挙げられる。哺乳動物細胞において、発現ベクターの制御機能は、ウイルスの調節エレメントにより与えられる場合が多い。例えば、一般的に使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核細胞および真核細胞の両方のための他の適当な発現系は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）の第１６章および１７章を参照のこと。Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０），Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を参照のこと。
【０１０９】
本発明のヒトＩＬ−２ムテインをコードする配列は、目的の宿主細胞内での発現のために最適化することができる。配列のＧ−Ｃ含量は所定の宿主細胞内で発現される既知遺伝子を参照に計算されるように、その細胞宿主に対して平均的なレベルに調節され得る。コドン最適化の方法は当該分野で周知である。個々のコドンは、最適化され得る（例えば、残基の置換（例えばＣ１２５Ｓ置換、Ｃ１２５Ａ置換および／または表１に示すさらなる組み合わせ置換）がなされているコドン）。あるいは、コード配列内のコドンの１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％までが特定の宿主細胞における発現のために最適化されているように、ヒトＩＬ−２ムテインコード配列内の他のコドンを最適化して、宿主細胞内の発現を増強することができる。例えば、３６Ｄ６１Ｒおよび１０７Ｒ３６Ｄの組み合わせ置換に関するコドンが、それぞれＥ．ｃｏｌｉでの発現のために最適化されている、配列番号７３および７４に開示したヒトＩＬ−２ムテイン配列を参照のこと。
【０１１０】
用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書においては、交換可能に使用される。このような用語は、特定の被験体細胞のみならず、そのような細胞の子孫または潜在的子孫も指すものであることが理解される。変異または環境の影響により特定の改変は後続する世代でも起こりえるため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではなくてよく、しかしなお、本明細書において使用される用語の範囲に包含される。
【０１１１】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して原核細胞または真核細胞内に導入され得る。本明細書において使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、宿主細胞内に外来性核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための種々の当該分野で知られた技術（リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、粒子銃またはエレクトロポレーションが挙げられる）を指すことが意図される。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適当な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）および他の標準的な分子生物学の実験マニュアルに見出され得る。
【０１１２】
本発明のＩＬ−２ムテインおよび生物学的に活性なその改変体を作製するために使用される原核細胞および真核細胞は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に一般的に記載されているもののような、適切な培地中で培養される。
【０１１３】
（薬学的組成物）
ヒトＩＬ−２ムテインまたはその改変体を作製し、精製した後、これらは、ヒト治療および獣医学的治療における用途（例えば癌の治療、免疫療法および感染症の処置）のための薬学的組成物中に組み込まれ得る。したがって、ヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体は、種々の治療用途のための薬学的処方物として処方され得る。組成物として、ヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体は、当該分野で公知の方法により、被験体に非経口投与される。被験体としては、哺乳動物、例えば霊長類、ヒト、イヌ、ウシ、ウマなどが挙げられる。これらの薬学的組成物は、本発明のヒトＩＬ−２ムテインの有効性を増大させるか、または所望の性質を増強する他の化合物を含有してよい。薬学的組成物は、選択された経路を介した投与に関して安全でなければならず、それらは、滅菌されていなければならず、生物活性を保持していなければならず、そしてヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体を安定に可溶化させなければならない。処方プロセスに応じて、本発明のＩＬ−２ムテイン薬学的組成物は、液体形態において、常温、冷蔵または冷凍して保存され得、または、経口または非経口の投与経路を含む種々の方法のいずれかにより投与される前に、溶液、懸濁液または乳液に再構成され得る凍結乾燥粉末のような乾燥形態で調製される。
【０１１４】
このような薬学的組成物は、典型的には、少なくとも１つのヒトＩＬ−２ムテイン、生物学的に活性なその改変体、またはその組み合わせ、および、薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的投与のために本発明のヒトＩＬ−２ムテインを処方するための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（編）（１９９５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）を参照のこと。
【０１１５】
本明細書において使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与と適合性のある任意の溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含する。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当該分野で周知である。いずれかの従来の培地または薬剤が活性化合物と適合性を有さない場合を除き、このような媒体は、本発明のヒトＩＬ−２ムテインの薬学的処方物において使用され得る。補助的な活性化合物もまた上記組成物に組み込まれ得る。
【０１１６】
本発明のヒトＩＬ−２ムテインまたはその改変体を含むＩＬ−２ムテイン薬学的組成物は、意図される投与経路に適合するように処方される。投与経路は、所望の結果により変動する。ＩＬ−２ムテイン薬学的組成物は、ボーラス投薬、連続注入または持続注入（短時間、すなわち、１〜６時間の注入）により投与され得る。ＩＬ−２ムテイン薬学的組成物は、経口、鼻内、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内投与など）で、皮内投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与および直腸投与により、または肺吸入により投与され得る。
【０１１７】
非経口、皮内または経皮的な適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分：滅菌希釈液、例えば注射用水、生理食塩水、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗細菌剤（例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート形成剤（例えばＥＤＴＡ）；界面活性剤（例えばポリソルベート８０）；ＳＤＳ；緩衝剤（例えば酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩）、および浸透圧調節剤（例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース）、を含有できる。ｐＨは、酸または塩基（例えば塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調節され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに充填され得る。
【０１１８】
注射用途に適する薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射用溶液もしくは分散液の要時調製のための滅菌粉末を包含する。処方プロセスにおいてタンパク質の凝集物の形成を最小限にする場合、静脈内投与用の適当なキャリアとしては、生理食塩水、静菌性の水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ^ＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌されねばならず、容易にシリンジ使用できる程度の流体性を有すべきである。これは、製造および保存の条件下に安定であるべきであり、そして、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対抗して保存されなければならない。キャリアは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびこれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流体性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合は、所望の粒径を維持することにより、そして、界面活性剤の使用により、維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合において、等張性剤（例えば、糖類）、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、塩化ナトリウムを組成物中に含有させることが好ましい。注射用組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含有させることにより実現され得る。
【０１１９】
滅菌注射用溶液は、必要に応じて上記した成分の１つまたは組み合わせを用いて適切な溶媒中に必要量の活性化合物（例えば、タンパク質または抗体）を組み込み、その後、濾過滅菌することにより調製され得る。一般的に、分散液は、基剤となる分散媒および上記列挙したものより選ばれる他の必要な成分を含有する滅菌ビヒクル内に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合は、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより活性成分と予め滅菌濾過された溶液に由来する任意のさらなる所望の成分との粉末が得られる。
【０１２０】
経口用組成物は、一般的に不活性希釈剤または可食キャリアを含有する。これらは、ゼラチンカプセルに封入されてもよいし、錠剤中に圧縮されてもよい。経口投与のためには、薬剤は、胃内を通り抜ける腸溶性形態中に含有され得るか、または、既知の方法によりさらにコーティングまたは混合されて消化管の特定の領域で放出され得る。経口治療用投与の目的のためには、活性化合物は、賦形剤と共に組込まれ、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で使用され得る。経口用組成物はまた、マウスウォッシュとして使用するための流体キャリアを用いて調製され得、その場合、流体キャリア中の化合物は口内に適用され、含嗽され（ｓｗｉｓｈｅｄ）、そして吐瀉されるか、嚥下される。薬学的に適合性のある結合剤および／またはアジュバント物質は、組成物の部分として含有され得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、いずれかの以下の成分、または同様の性質の化合物を含有し得る：例えば、結合剤（例えば微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたは乳糖、錠剤崩壊剤、例えばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチ）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；滑剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバー）。
【０１２１】
全身投与は、経粘膜または経皮的な手段により行うこともできる。経粘膜または経皮的な投与のために、透過すべき障壁に対して適切な浸透剤が、処方物中で使用される。このような浸透剤は、一般的に当該分野で公知であり、そして例えば経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。
【０１２２】
１つの実施形態において、活性化合物は、身体からの急速な排出に対抗して化合物を保護するキャリアを用いて調製される（例えば、制御放出処方物（インプラントおよびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる）。生分解性、生体適合性の重合体（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸）が使用され得る。このような処方物の調製方法は当業者に明らかある。材料は、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から購入できる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞に標的化されたリポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような、当該分野公知の方法に従って調製され得る。
【０１２３】
投与を容易にし、そして投薬量を均一にするために、経口用組成物または非経口組成物を投薬単位形態に処方することが特に有利である。投薬単位形態とは、本明細書においては、処置すべき被験体に対する単位投薬量として適切な、物理的に個別の単位を指し；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共に所望の治療効果をもたらすために計算された活性化合物の所定量を含有する。本発明の投薬単位形態の詳細は、活性化合物の固有の性質および達成すべき特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのそのような活性化合物の混合の、当該分野において固有の制限により影響され、そしてこれに直接左右される。
【０１２４】
本発明のヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体は、ヒトＩＬ−２の分野で公知の、任意の公知の処方プロセスを用いて処方され得る。本発明の方法において有用である適当な処方は、種々の特許および刊行物に記載されている。例えば、米国特許第４，６０４，３７７号は、非ＩＬ−２タンパク質および内毒素を実質的に含有しない治療量のＩＬ−２、生理学的に許容可能な水溶性キャリア、およびＩＬ−２を可溶化するための十分な量の界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）を有する、好ましいＩＬ−２処方物を示している。糖類のような他の成分も含有できる。米国特許第４，７６６，１０６号は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾ＩＬ−２を含む処方物を示している。欧州特許出願公開２６８，１１０は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ−８０）、ポリエチレングリコールモノステアレートおよびオクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ４０５）からなる群より選択される種々の非イオン系界面活性剤を用いて処方されるＩＬ−２を示す。米国特許第４，９９２，２７１号は、ヒト血清アルブミンを含むＩＬ−２処方物を開示しており、そして米国特許第５，０７８，９９７号は、ヒト血清アルブミンおよびアミノ酸を含むＩＬ−２処方物を開示している。米国特許第６，５２５，１０２号は、ポリペプチドの主要な安定化剤として作用するアミノ酸塩基、および、ポリペプチドの安定性に対して許容できるｐＨ範囲内で溶液を緩衝するための酸および／またはその塩形態を含むＩＬ−２処方物を開示する。同時係属中の米国特許出願１０／４０８，６４８は、肺送達のために適するＩＬ−２処方物を開示している。
【０１２５】
（治療用途）
本発明のヒトＩＬ−２ムテインまたはこれらのヒトＩＬ−２ムテインから得られた生物学的に活性な改変体を含む薬学的処方物は、免疫系の刺激および癌（例えば、ネイティブのヒトＩＬ−２またはプロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（登録商標）ＩＬ−２を用いて現在治療されているもの）の処置において有用である。本発明のヒトＩＬ−２ムテインおよび適当な生物学的に活性なその改変体は、炎症誘発性サイトカイン産生が低減しており、より低い毒性を有すると予測されるという利点を有する一方で、ＮＫ細胞の増殖、生存、ＮＫ媒介性細胞毒性（ＮＫ、ＬＡＫおよびＡＤＣＣ）ならびにＴ細胞増殖のような、所望の機能的活性を維持または増強する。
【０１２６】
その予測される低毒性のため、高用量のＩＬ−２が要求される臨床適応において、本発明のヒトＩＬ−２ムテインおよび生物学的に活性なその改変体は、毒性作用を最低限にしながら、ネイティブのＩＬ−２またはプロロイキン（登録商標）ＩＬ−２の投与され得る用量と同等以上の用量で投与され得る。したがって、本発明は、処置プロトコルとしてインターロイキン−２（ＩＬ−２）投与を受けている被験体においてＩＬ−２誘導性毒性症状を低減するための方法を提供し、この方法は、本明細書に開示するＩＬ−２ムテインとして、ＩＬ−２を投与する工程を含む。さらに、本発明のヒトＩＬ−２ムテインおよび適切な生物学的に活性なその改変体は、より大きい治療効果というさらなる利点を有し、より低用量のこれらのヒトＩＬ−２ムテインは、ネイティブＩＬ−２またはプロロイキン（登録商標）ＩＬ−２の同等の用量の治療効果よりも高い治療効果を提供し得る。
【０１２７】
本発明のＩＬ−２ムテイン薬学的組成物の薬学的有効量が、被験体に投与される。「薬学的有効量」によって、疾患または状態の処置、予防または診断において有用である量が意図される。「被験体」によって、哺乳動物、例えば霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどが意図される。好ましくは、本発明の薬学的処方物による処置を受けている被験体は、ヒトである。
【０１２８】
投与が処置の目的のものである場合、投与は、予防または治療の目的のいずれであってもよい。予防的に行う場合は、物質はいずれかの症状よりも先行して提供される。物質の予防的投与は、いずれかの後の症状を防止または減衰させるように働く。治療的に行う場合は、物質は症状の出現のとき（またはその直後）に提供される。物質の治療的投与は、いずれかの実際の症状を減衰させるために働く。
【０１２９】
したがって、例えば、本発明のヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体を含む本発明の薬学的組成物の有効量を含む処方物は、ＩＬ−２を用いた治療に応答する多くの臨床適用症の処置、予防および診断の目的のために使用され得る。本発明のヒトＩＬ−２ムテインおよび生物学的に活性なその改変体を処方して、ネイティブ配列ＩＬ−２またはプロロイキン（登録商標）ＩＬ−２と同じ治療において使用できる。従って、本発明のヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体を含む本発明の処方物は、以下のために有用である：細菌、ウイルス、寄生虫、原虫および真菌の感染症の診断、予防および処置（局所または全身）のため；細胞媒介細胞毒性の増強のため；リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性を刺激するため；リンパ球の免疫機能の回復を媒介するため；同種抗原応答性を増強するため；放射線療法後、または、骨髄または自己幹細胞移植の後またはそれと並行して、癌患者における免疫回復を促進するため；後天性免疫不全の状態における免疫機能の回復を促進するため；高齢のヒトおよび動物における正常な免疫機能の回復のため；酵素増幅、放射標識、放射線画像化および疾患状態におけるＩＬ−２のレベルをモニタリングするための他の当該分野で公知の方法を用いる方法のような診断アッセイの開発において；治療および診断目的のためのインビトロのＴ細胞成長の促進のため；リンホカインに対するレセプター部位をブロックするため；および種々の他の治療、診断および研究用途。ヒトＩＬ−２またはその改変体（例えばＩＬ−２ムテイン）の種々の治療および診断用途が、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８７）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６：８８９−８９７；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８８）Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２０８：１２１−１３５；Ｔｏｐａｌｉａｎら（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．６：８３９−８５３；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８８）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１９：１６７６−１６８０；Ｗｅｂｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０：３３−４０；Ｇｒｉｍｍら（１９８２）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７０（２）：２４８−２５９；Ｍａｚｕｍｄｅｒ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．３（補遺１）：Ｓ３７−４２；ＭａｚｕｍｄｅｒおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５９（２）：４９５−５０７：およびＭａｚｕｍｄｅｒら（１９８３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１５（１）：１−１０において検討され、報告されている。本発明のヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体を含む本発明の処方物は、単一の治療活性薬剤として使用してよく、または、他の免疫学的に関連する細胞または他の治療薬と組み合わせて使用してよい。関連する細胞の例は、Ｂ細胞またはＴ細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞などであり、そしてＩＬ−２またはその改変体と組み合わせて使用され得る例示的治療試薬は、種々のインターフェロン（特に、ガンマインターフェロン）、Ｂ細胞成長因子、ＩＬ−１、および抗体（例えば、抗ＨＥＲ２抗体（例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））、または抗ＣＤ２０抗体（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ；ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８；Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））である。
【０１３０】
投与されるヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体の量は、約０．１〜約１５ｍＩＵ／ｍ^２の間の範囲であり得る。抗癌モノクローナル抗体と組み合わせたＩＬ−２免疫療法のための治療有効量および特定の処置プロトコルは、当該分野で公知である。例えば、同時係属中の、米国特許出願２００３−０１８５７９６（発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａ」）に開示される用量および処置プロトコル、および２００３０２３５５５６（発明の名称「Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ＩＬ−２／Ａｎｔｉ−ＨＥＲ２ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒｓ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨＥＲ２ Ｒｅｃｅｐｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ」）、および２００３年７月３１日出願の代理人事件番号５９５１６−２７８、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ」である、同時係属中の米国特許出願６０／４９１，３７１を参照のこと。腎細胞癌および転移性黒色腫のような適応症に関しては、ヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体は、３００，０００〜８００，０００ＩＵ／ｋｇ／８時間の高用量静脈内ボーラスとして投与してよい。Ｂ細胞リンパ腫、ＨＥＲ２^＋癌（例えば、乳癌およびＣＬＬ）のＩＬ−２免疫療法のための推奨用量については、前述の米国特許出願を参照のこと。
【０１３１】
ＨＩＶ感染の処置のためのＩＬ−２免疫療法の使用もまた、当該分野で公知である。この臨床適応症に関する推奨される用量およびプロトコルについては、例えば、米国特許第６，５７９，５２１号を参照のこと。
【０１３２】
したがって、本発明は、被験体における癌を処置するため、または被験体における免疫応答を調節するための方法を提供する。この方法は、本発明のヒトＩＬ−２ムテインまたは生物学的に活性なその改変体の治療有効量を投与する工程を含む。「治療有効量」とは、許容できない毒性効果を誘導することなく所望の生物学的結果を誘導するために十分な用量レベルを指す。投与量は、薬学的組成物中のヒトＩＬ−２ムテインまたはその改変体の濃度、所望の活性、処置すべき哺乳動物の疾患状態、投薬形態、投与方法、および患者の要因（例えば、年齢、性別および疾患の重症度）により変動し得る。治療有効量は、広範な濃度において提供され、そして被験体は、問題となる障害の兆候、症状または原因を低減および／または軽減するためか、または生物学的系の任意の他の所望の変化をもたらすために必要とされる回数の、治療有効量を投与され得る。一般的に、本発明のＩＬ−２ムテイン薬学的組成物は、プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２について使用されるよりも高い濃度範囲で、ヒトＩＬ−２ムテインまたはその改変体を含む。プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２に対して用量が増大するに従い、被験体は、毒性副作用が出現するかどうかを判定するために緊密にモニタリングされるべきである。このような臨床的実験的分析は、当業者に周知であり、そして例えば、免疫調節および癌治療において使用するためのプロロイキン（登録商標）ＩＬ−２の現在の用量を確立するために使用されている。
【０１３３】
（ヒトＩＬ−２ムテインの機能的活性をモニタリングするためのバイオアッセイ）
本発明はまた、ＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖およびＴＮＦ−α産生、ＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞媒介性細胞毒性、ＩＬ−２誘導性Ｔ細胞増殖、ならびにＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞生存をモニタリングするための、新規バイオアッセイを提供する。これらのアッセイは、耐容性を向上させるための低減した炎症誘発性サイトカイン産生（特に、ＴＮＦ−α）、ならびに改善したＮＫ細胞媒介機能（上記ムテインが、ＮＫ細胞および／もしくはＴ細胞増殖を維持または増大させ、ＮＫ媒介性細胞毒性（ＮＫ、ＬＡＫおよびＡＤＣＣ）を維持または増大させ、そしてＮＫ細胞生存を維持または増大させる能力に反映される）という所望の機能プロフィールに関して、候補ＩＬ−２ムテインをスクリーニングするために開発されている。
【０１３４】
これらのアッセイの最初のものは、本明細書においては、「ＮＫ−９２バイオアッセイ」と称され、ＴＮＦ−α産生のＩＬ−２誘導およびＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖をモニタリングする。このバイオアッセイは、ヒトＮＫ−９２細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２４０７、ＣＭＣＣ ＩＤ＃１１９２５）を利用している。ＮＫ−９２細胞株（最初にＧｏｎｇら（１９９４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ８（４）：６５２−６５８により記載された）は、活性化ＮＫ細胞の表現型および機能プロフィールを示す。ＮＫ−９２の増殖は、ＩＬ−２依存性であり；細胞は７２時間ＩＬ−２の非存在下で培養されれば死滅する。細胞株はまた、ＩＬ−２への曝露後４８〜７２時間以内に、検出可能なレベルのＴＮＦ−αを産生する。
【０１３５】
本発明の方法によれば、候補ＩＬ−２ムテインは、このＮＫ−９２バイオアッセイを用いて、ＴＮＦ−α産生を誘導し、ＮＫ細胞増殖を誘導する相対的な能力についてスクリーニングされ得る。この場合、ＮＫ−９２細胞は、α−ＭＥＭ、１２％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ），８％熱不活性化ウマ血清、０．０２ｍＭ葉酸、０．２ｍＭイノシトール、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールよりなる完全培地（ＮＫ−９２培地）中で培養される。培養物を最小細胞密度１〜３×１０^５細胞／ｍＬで播種し、参照組換えヒトＩＬ−２ムテイン（例えば、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２または参照Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと称される参照ＩＬ−２ムテイン）１０００ＩＵ／ｍＬを補充する。アッセイの調製においては、細胞を新しいＮＫ−９２培地中で最低４８時間維持した後にアッセイに使用する。アッセイの１日前、ＮＫ−９２を３回洗浄し、２４時間ＩＬ−２を補充しないＮＫ−９２培地中に維持する。細胞を遠心分離し、ＮＫ−９２培地（ＩＬ−２無添加）中に懸濁し、９６ウェル平底プレートに、種々の濃度の参照ＩＬ−２ムテイン（例えば、デス−アラニル−１ Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２）、またはＮＫ−９２培地中に希釈した目的の機能プロフィールについてスクリーニングされる種々の濃度の候補ＩＬ−２ムテインとともに、２００μｌ中４×１０^４細胞／ウェルの密度でプレーティングする。３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした後、培養上清の１００μｌアリコートを取り出し、後に行う、市販のＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキット（例えば、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｃｙｔｏｓｃｒｅｅｎ^ＴＭヒトＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキット；Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いたＴＮＦ−αの定量のために凍結する。培地中に残存する細胞については、市販のＭＴＴ色素還元キット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）非放射性細胞増殖アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いて増殖を測定し、そして次に比色読み取りに基づいて刺激指数を計算する。
【０１３６】
本明細書に開示する第２のＩＬ−２バイオアッセイは、候補ＩＬ−２ムテインを、それらがナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性細胞毒性を誘導する能力についてスクリーニングするための方法を提供する。このバイオアッセイは、「ＮＫ３．３細胞毒性バイオアッセイ」と称され、ヒトＮＫ３．３細胞株を利用している。ＮＫ３．３細胞株は、末梢血ＮＫ細胞の表現型および機能特性を示し（Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ（１９８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９（６）：２８３１−２８３７）、そして、Ｆｃレセプター（ＣＤ１６、ＦｃγＲＩＩＩＡ）を介して、抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介し得る。後記する実験のセクションの表２は、このＩＬ−２バイオアッセイで調べたＮＫ３．３細胞の生物学的活性をまとめたものである。
【０１３７】
本発明の方法によれば、候補ＩＬ−２ムテインは、このＮＫ３．３細胞毒性バイオアッセイを用いて、その細胞毒性活性に関してスクリーニングされ得る。この方法によれば、ＮＫ３．３細胞を増殖させ、１５％熱不活性化ウシ胎仔血清、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、およびＩＬ−２供給源として２０％ ヒトＴ−Ｓｔｉｍ^ＴＭｗ／ＰＨＡを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中に維持する。アッセイの調製においては、ＮＫ３．３細胞を、２４時間、ＩＬ−２の非存在下（「飢餓状態」）において培養する。アッセイは、総容量１００μｌの、種々の濃度の参照ＩＬ−２ムテイン（例えば、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン）、または種々の濃度の目的の候補ＩＬ−２ムテインに曝露した、Ｕ底９６ウェルプレートにプレーティングされた５×１０^４個の「飢餓状態」ＮＫ３．３細胞から構成される。１８時間のインキュベートの後、ＩＬ−２刺激ＮＫ３．３エフェクター細胞を、５×１０^３個のカルセインＡＭ標識標的細胞（Ｋ５６２またはＤａｕｄｉ）または抗体コーティングカルセインＡＭ標識標的（最終濃度２μｇ／ｍｌのリツキシマブでコーティングされたＤａｕｄｉ）と共インキュベートすることにより、最終的なエフェクター 対 標的の比、１０：１を達成する（最終容量２００μｌ）。エフェクター細胞と標的細胞とを４時間共インキュベートした後、９６ウェルプレートを短時間遠心分離し；培養上清１００μｌを取り出して、黒色で清浄な平底９６ウェルプレートに入れ、蛍光計によりカルセインＡＭの放出の定量に付す。定量は、パーセント特異的溶解として表され、以下の式：％特異的溶解＝１００×［（平均実験値−平均自発的放出）／（平均最大放出−平均自発的放出）］により計算される。ここで、自発的放出は、標識標的を含有し、エフェクターを含有しないウェルから決定され、そして最大放出は、標識標的および１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するウェルから決定される。
【０１３８】
本明細書に開示した第３のＩＬ−２バイオアッセイは、候補ＩＬ−２ムテインを、それらがＴ細胞増殖を誘導する能力についてスクリーニングするための方法を提供する。この様式においては、Ｔ細胞増殖に関するこのＩＬ−２バイオアッセイは、Ｔ細胞慢性リンパ性白血病の患者に由来するヒトＴ細胞株Ｋｉｔ２２５（ＣＭＣＣ ＩＤ＃１１２３４）を利用する（Ｈｏｒｉら（１９８７）Ｂｌｏｏｄ ７０（４）：１０６９−１０７２）。Ｋｉｔ２２５細胞は、ＩＬ−２レセプター複合体のα、β、γサブユニットを構成的に発現する。Ｋｉｔ２２５の増殖は、ＩＬ−２依存性であり；細胞は長期間ＩＬ−２の非存在下で培養すれば死滅する。
【０１３９】
本発明によれば、アッセイは、２４時間ＩＬ−２の非存在下でＫｉｔ２２５細胞を培養し、その後、種々の濃度の参照ＩＬ−２ムテイン（例えば、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン）、または種々の濃度の目的の候補ＩＬ−２ムテインと共に特定数の細胞をプレーティングすることから構成される。４８時間のインキュベーションの後、増殖は、標準的な市販のＭＴＴ色素還元キットを用いて判定され、そして刺激指数は、比色読み取り値に基づいて計算される。
【０１４０】
本発明の第４のＩＬ−２バイオアッセイは、候補ＩＬ−２ムテインをそれらがＮＫ細胞生存を促進する能力についてスクリーニングするための方法を提供する。この様式において、候補ムテインは、それらがＮＫ細胞生存シグナル伝達を誘導する能力についてスクリーニングされる。プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２（すなわち、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインを含む処方物）は、ＩＬ−２を予め枯渇させたＮＫ３．３においてＡＫＴのリン酸化（「生存シグナル」と考えられる）を誘導する。このバイオアッセイにおいては、ＮＫ３．３細胞を増殖させ、１５％熱不活性化ウシ胎仔血清、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびＩＬ−２供給源として２０％ ヒトＴ−Ｓｔｉｍ^ＴＭｗ／ＰＨＡを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中に維持する。アッセイの調製においては、ＮＫ３．３細胞を、２４時間、ＩＬ−２の非存在下において培養する。細胞生存シグナル伝達の指標として、「飢餓状態」ＮＫ３．３細胞（２×１０^６）を、３０分間、２ｎＭの参照ＩＬ−２ムテイン（例えば、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２）、または２ｎＭの目的の候補ＩＬ−２ムテインを添加することにより刺激する。細胞をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄する。細胞ペレットを、プロテアーゼインヒビターを含有する細胞抽出緩衝液５０μＬ中で溶解し、１回の凍結−解凍サイクルに供する。抽出液を、４℃で１０分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離する。透明な溶解液のアリコートを、ＡＫＴ［ｐＳ４７３］^＊イムノアッセイキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のウェルに１：１０希釈で添加する。製造元のプロトコルに従って、リン酸化ＡＫＴのレベルを定量的ＥＬＩＳＡにより検出する。
【０１４１】
本発明はまた、ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いてＩＬ−２ムテインの機能特性についてそれらをスクリーニングする場合に使用するための、バイオアッセイを提供する。これらのバイオアッセイの第１のものは、増殖／炎症誘発性サイトカイン産生組み合わせバイオアッセイである。ＩＬ−２に曝露されると、ヒトＰＢＭＣは増殖し、用量依存性様式でサイトカインを分泌する。この組み合わせアッセイは、参照ＩＬ−２ムテイン（例えば、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳムテインまたはＣ１２５Ｓムテイン）または目的の候補ＩＬ−２ムテインで７２時間刺激した後に、増殖およびサイトカイン産生のレベルを評価するように設計されている。ＰＢＭＣは、正常ヒトドナー１人以上から、密度勾配分離（例えば、ＡＣＤＡ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴチューブを使用する）により単離される。９６穴組織培養処理プレートにおいて、ウェル当たり２００，０００細胞を、３７℃、７％ＣＯ_２において、完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン／フンジゾン）中で、種々の濃度のＩＬ−２（０．０３９ｎＭ〜１０ｎＭ）と共に、または陰性対照としてＩＬ−２非存在下で、インキュベートする。６６時間のインキュベーションの後、細胞培養上清のアリコートを取り出し、後のサイトカイン検出のために凍結する。細胞を１μＣｉ^３Ｈ−チミジンで６時間パルスし、次に回収して、細胞増殖の尺度としてヌクレオチド取り込みのレベルを測定する（例えば、Ｗａｌｌａｃ Ｔｒｉｌｕｘ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを用いる）。次に市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、ＢｉｏＳｃｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）を用いて製造元のガイドラインに従って、細胞培養上清中のＴＮＦ−αの濃度を検出し得る。個別のドナーの完全なパネル（例えば、６、８または１０ドナー）についてアッセイを繰り返すことにより、「正常集団」におけるＩＬ−２への代表的な増殖応答およびサイトカイン応答の特徴付けが提供される。次いで、データは、図１および後述する実施例１０にさらに記載するように分析され得る。
【０１４２】
第２のＰＢＭＣベースのバイオアッセイは、エフェクター細胞の細胞毒性を媒介する候補ＩＬ−２ムテインの能力についてスクリーニングするために使用され得る。このアッセイにおいて、ヒトＰＢＭＣを密度勾配遠心分離を用いて全血から分離する。ＰＢＭＣを１０ｎＭのＩＬ−２対照または目的のＩＬ−２ムテインの存在下で３日間刺激することにより、現在の技術レベルで一般的に実施されているようにＬＡＫ活性を発生させる（例えば、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＡＫ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１９９６ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃを参照のこと）。得られた細胞集団は、「エフェクター」細胞を含む。これはＮＫまたはＬＡＫに分類され得、そしてそれぞれＫ５６２およびＤａｕｄｉの腫瘍細胞標的を殺傷し得る。これらのエフェクター細胞はまた、ＡＤＣＣを媒介し、これによりエフェクター細胞は、Ｄａｕｄｉ標的細胞に結合している特定の抗体のＦｃ部分を認識する。１つの実施形態において、Ｄａｕｄｉ標的に結合している抗体は、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）である。
【０１４３】
本発明の方法によれば、目的の候補ＩＬ−２ムテインまたは参照ＩＬ−２対照により刺激されているヒトＰＢＭＣ（エフェクター細胞）を、４時間、種々のエフェクター 対 標的細胞（Ｅ：Ｔ比）で、カルセインＡＭ標識標的細胞と共インキュベートする。細胞毒性活性の量は、培養上清中のカルセインＡＭの検出に関係している。定量は、自発的放出および最大放出の対照の測定に基づいて、各Ｅ：Ｔ比における特異的溶解％として表示される。このバイオアッセイは、以下の生物学的活性を調べる：標的がＫ５６２細胞である場合、天然／自発的細胞毒性（ＮＫ）；標的がＤａｕｄｉ細胞である場合、リンホカイン活性化殺傷（ＬＡＫ）；および標的が抗体コーティングＤａｕｄｉ細胞（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）コーティングＤａｕｄｉ細胞）である場合、抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）。
【０１４４】
データは蛍光計から得られ、そして相対蛍光単位（ｒｆｕ）として表示される。このバイオアッセイの対照は、標識標的細胞単独（最小）および１００％溶解（最大）の尺度としての標識標的細胞＋最終濃度１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む。最小 対 最大のパーセントの比は、アッセイの有効性（＞３０％であればアッセイは無効）の尺度として以下の式を用いて計算する。
【０１４５】
％最小 対 最大＝１００×［（平均自発的放出ｒｆｕ）／（平均最大放出ｒｆｕ）］
アッセイが有効であることがわかれば、３つのサンプル点の平均および標準偏差を計算し、その後、以下の式を用いて３つの点の平均からパーセント特異的溶解を求める。
【０１４６】
％溶解＝１００×［（平均実験ｒｆｕ−平均自発的放出ｒｆｕ）／（平均最大放出ｒｆｕ−平均自発的放出ｒｆｕ）］
次にデータを％特異的溶解として報告し；さらに、候補ＩＬ−２ムテイン 対 関連するＩＬ−２参照対照（例えば、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン）を用いて、ヒトＰＢＭＣドナーの混合集団において、ＩＬ−２参照対照に対して細胞毒性活性が維持されているかどうかを判定し得る。
【０１４７】
上記したアッセイは、所望の機能的プロフィールに関して候補ＩＬ−２ムテインライブラリをスクリーニングするために利用され得、ここで、目的の機能的活性としては、以下の１つまたは複数が挙げられる：ＩＬ−２誘導性炎症誘発性サイトカイン産生（特に、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞増殖および／またはＴ細胞増殖、ＩＬ−２誘導性ＮＫ媒介性細胞毒性（ＮＫ、ＬＡＫおよびＡＤＣＣ）、ならびにＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞生存。
【０１４８】
以下の実施例は説明のために提供され、限定するためではない。
【実施例】
【０１４９】
（実験）
ＩＬ−２の治療上の利用性は、発熱、悪寒、低血圧および血管漏出症候群を含むその投与に関連する毒性により妨害される。向上した耐容性およびＩＬ−２媒介性ＮＫ細胞およびＴ細胞のエフェクター機能を有するＩＬ−２ムテインは、よりよい耐容性である同様の治療用量、またはより高い治療用量の投与を可能にし、これにより、このタンパク質のより高値の治療効力に対する潜在能力を増大させる。本明細書に提示される作業の全体的戦略は、特殊化された、中等度スループットの、ヒトＮＫ細胞ベースの免疫アッセイスクリーニング系の包括的パネルを用いて、以下の機能プロフィールを示す新規のヒトＩＬ−２ムテインを選択することであった：耐容性を向上させるための低減した炎症誘発性サイトカイン産生（特に、ＴＮＦ−α）、ならびに向上したＮＫ細胞媒介性機能（上記ムテインがＮＫ細胞増殖および／またはＴ細胞増殖を維持または増大させ、ＮＫ媒介性細胞毒性（ＮＫ、ＬＡＫおよびＡＤＣＣ）を維持または増大させ、そしてＮＫ細胞生存を維持または増大させる能力において反映される）。
【０１５０】
所望の治療プロフィールを有する適当なＩＬ−２ムテインを同定する目的のために、候補組換えヒトＩＬ−２ムテインの生物学的活性を、参照ＩＬ−２ムテインと称されるデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（以下の実施例においては「Ｐｒｏ」と略記する）およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（以下の実施例においては「Ａｌａ−Ｐｒｏ」と略記する）により示されるこれらの生物学的活性と比較した。アルデスロイキンである組換え的にＥ．ｃｏｌｉにより産生されたデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインは、商品名プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）として、処方物として市販されている。プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生されたムテインの非グリコシル化形態を使用した、特異的な凍結乾燥された処方物であり、後述するバイオアッセイで使用するために、蒸留水中で再構成した。ＡＭＥ哺乳動物発現系のＤｒｅｃｔＡＭＥ^ＴＭおよびＥｘｐｒｅｓｓＡＭＥ^ＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を、最初のスクリーニング実験において使用されるＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の組換え産生において利用した。
【０１５１】
以下に記載するヒトＩＬ−２ムテインを宿主哺乳動物２９３Ｔ細胞中で発現させた。参照ＩＬ−２ムテインがＣ１２５ＳヒトＩＬ−２である場合は、宿主細胞を、Ｐｒｏ−１プロモーターに作動可能に連結したＣ１２５Ｓ変異を有するネイティブのヒトＩＬ−２コード配列を含む発現構築物で形質転換した。コード配列は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（すなわち、配列番号７）に対するコード配列において融合した、真性（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）ＩＬ−２シグナル配列およびヒトＩＬ−２のＮ末端アラニンに対するコドン（すなわち、配列番号１のヌクレオチド１〜６３）を含んだ。タンパク質を、２９３Ｔ細胞哺乳動物発現系においてＧＳＨｉｓタグ化タンパク質として発現させ、ＮＩ−ＮＴＡビーズで精製した。
【０１５２】
（実施例１ ヒトＩＬ−２ムテインの初期スクリーニング）
Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２分子（本明細書においては実施例中「Ａｌａ−Ｐｒｏ」と記載する）の全２，５０８個の考えられる単一アミノ酸ムテイン改変体を含むライブラリを、コドンベースの変異誘発技術プラットホーム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて構築した。Ａｌａ−Ｐｒｏは、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインにおいて保持されている天然に存在する成熟ヒトＩＬ−２配列の１位におけるＮ末端Ａｌａ残基を有することにおいて、市販のプロロイキン（登録商標）ＩＬ−２製品において利用されているデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインとは異なる。ＡＭＥ哺乳動物発現系のＤｉｒｅｃｔＡＭＥ^ＴＭおよびＥｘｐｒｅｓｓＡＭＥ^ＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を、Ａｌａ−Ｐｒｏムテインの組換え産生において利用した。
【０１５３】
一次スクリーニングを、炎症誘発性サイトカイン産生（ＴＮＦ−α）、ＮＫ細胞増殖およびＮＫ細胞溶解殺傷（ＮＫ、ＬＡＫおよびＡＤＣＣ）および細胞生存（ｐＡＫＴ）を、ヒトＮＫ３．３細胞株を使用してアッセイした。選択された一次機能の指標としては、以下が挙げられる：（１）Ａｌａ−Ｐｒｏ ＩＬ−２（すなわち、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン）またはプロロイキン（登録商標）ＩＬ−２（すなわち、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン）で観察されるものと比較してヒトＮＫ−９２細胞株により低減した炎症誘発性ＴＮＦ−α産生；（２）これらの２つの参照ＩＬ−２ムテインのいずれかで観察されるものと比較して維持または向上した、ヒトＮＫ−９２細胞株増殖；および３）これらの２つの参照ＩＬ−２ムテインのいずれかで観察されるものと比較して維持または向上した、ヒトＮＫ３．３細胞株媒介性のＮＫ−、ＬＡＫ−およびＡＤＣＣ媒介性細胞溶解殺傷。二次的な機能の指標は、以下であった：これらの２つの参照ＩＬ−２ムテインのいずれかで観察されるものと比較して維持または向上した、ＮＫ３．３細胞株におけるリン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）の誘導、およびＡｌａ−Ｐｒｏ ＩＬ−２（すなわち、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン）またはプロロイキン（登録商標）（すなわち、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインを含む）で観察されるものと比較して維持または向上した、ヒトＫｉｔ２２５ Ｔ細胞株によるＴ細胞増殖。
【０１５４】
初期スクリーニングプロセスは、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン内の１６８個の単一アミノ酸置換を同定した（２００４年５月５日に出願された、発明の名称「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ Ｍｕｔｅｉｎｓ」の同時係属の米国特許出願番号６０／５５０，８６８（代理人事件番号ＰＰ２０３５４．００１（０３５７８４／２６１１６４）を参照のこと）。次いで、これらの置換をＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインのこれらの１６８個の単一アミノ酸改変体の所望の機能プロファイルと合わせるために設計した３つの組み合わせライブラリと組み合わせて、増大した耐容性（すなわち、ＮＫ細胞によるＴＮＦ−α産生のＩＬ−２誘導の低減）および維持または向上したＮＫ細胞エフェクター機能を有するさらなるＩＬ−２ムテインを見出した。上記組み合わせライブラリは、最小の１個の置換から最も多くて６個の可能なアミノ酸置換までに及ぶ、複数のアミノ酸置換（すなわち、天然に存在する成熟ヒトＩＬ−２配列のＣ１２５Ｓ置換に加えて）を有する７５３ ＩＬ−２ムテインからなった。
【０１５５】
これらの３つの組み合わせライブラリから、（デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較して）所望の機能プロファイルを有する３２個の組み合わせムテイン（これらのムテインにおける組み合わせ置換について上記される表１を参照のこと）を、ＩＬ−２依存性ヒトＮＫ細胞株およびＴ細胞株の増殖、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン産生（ＴＮＦ−α）、およびＮＫ媒介性細胞溶解性活性（ＮＫ／ＬＡＫ／ＡＤＣＣ）を定量化するために開発された特殊化されたヒトＮＫ細胞およびＴ細胞ベースの、中等度スループット免疫アッセイスクリーニング系の包括的パネルを用いて、同定した。全ての３２ムテインについてのスクリーニングデータは、本明細書の以下の表７に示される。
【０１５６】
広域な用量応答範囲におけるこれらのムテインのスクリーニングの後の分析から、以下の実施例２〜４に記載するような、改善された臨床的利益を予測する３つの別個の機能クラスを含む特異的なムテインを同定する。選択した全てのＩＬ−２ムテインは、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインと比較した場合に、ＮＫ細胞溶解性機能（ＮＫ／ＬＡＫ／ＡＤＣＣ）を維持する。スクリーニングプロセスにおいて、以下のプロトコルを使用した。
【０１５７】
（ＮＫ細胞増殖／ＴＮＦ−α産生）
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞増殖およびＴＮＦ−α産生に関するＩＬ−２バイオアッセイは、ヒトＮＫ−９２細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２４０７、ＣＭＣＣ ＩＤ＃１１９２５）を利用する。ＮＫ−９２細胞株（最初にＧｏｎｇら（１９９４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ８（４）：６５２−６５８に記載された）は、活性化ＮＫ細胞の表現型および機能特性を示す。ＮＫ−９２の増殖は、ＩＬ−２依存性であり；細胞は、７２時間ＩＬ−２の非存在下で培養すれば死滅する。細胞株はまた、ＩＬ−２への曝露後４８〜７２時間以内に検出可能なレベルのＴＮＦ−αを産生する。
【０１５８】
ＮＫ−９２細胞を、α−ＭＥＭ、１２％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、８％熱不活性化ウマ血清、０．０２ｍＭ葉酸、０．２ｍＭイノシトール、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールからなる完全培地（ＮＫ−９２培地）中で培養した。培養物を、最小密度１〜３×１０^５細胞／ｍｌで播種し、組換えヒトＩＬ−２ムテイン（デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（すなわち、アルデスロイキンまたはプロロイキン（登録商標）ＩＬ−２；Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（上記ＡＭＥの哺乳動物発現系中で組換え産生）、１０００ＩＵ／ｍＬを補充した。アッセイの調製において、細胞を、新しいＮＫ−９２培地中で最低４８時間維持した後にアッセイに使用した。アッセイの１日前、ＮＫ−９２を３回洗浄し、２４時間、ＩＬ−２を添加しないＮＫ−９２培地中に維持した。細胞を遠心分離し、ＮＫ−９２培地（ＩＬ−２無添加）中に懸濁し、９６穴平底プレートに、ＮＫ−９２培地中に希釈した、種々の濃度の参照ＩＬ−２分子としてのデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳもしくはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２、または種々の濃度の本発明のＩＬ−２ムテインと共に、２００μｌ中４×１０^４細胞／ウェルの密度でプレーティングした。３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした後、培養上清の１００μｌアリコートを取り出し、後に行う、市販のＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｃｙｔｏｓｃｒｅｅｎ^ＴＭヒトＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキット；Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いたＴＮＦ−αの定量のために冷凍した。培地中に残存する細胞については、市販のＭＴＴ色素還元キット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）非放射性細胞増殖アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いて増殖を判定し、そして次に比色読み取りに基づいて刺激指数を計算した。
【０１５９】
（ＮＫ細胞媒介性細胞毒性）
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性細胞毒性に関するＩＬ−２バイオアッセイは、ヒトＮＫ３．３細胞株を利用している。ＮＫ３．３細胞株は、末梢血ＮＫ細胞の表現型および機能的特徴を示し（Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ（１９８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９（６）：２８３１−２８３７）、そして、Ｆｃレセプター（ＣＤ１６、ＦｃγＲＩＩＩ）を介して抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介することができる。細胞株は、セントルイス大学の限定的使用許可の合意の下にＪａｃｋｉｅ Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ博士より入手し、ＣＭＣＣ（ＩＤ１２０２２）に寄託されているものである。
【０１６０】
表２はこのＩＬ−２バイオアッセイにより調べたＮＫ３．３細胞の生物学的活性を総括したものである。
【０１６１】
（表２ ＩＬ−２バイオアッセイにより調べたＮＫ３．３細胞の生物学的活性）
【０１６２】
【表２】

ＮＫ３．３細胞を増殖させ、１５％熱不活性化ウシ胎仔血清、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびＩＬ−２供給源として２０％ヒトＴ−Ｓｔｉｍ^ＴＭｗ／ＰＨＡを補充した、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に維持した。アッセイの調製においては、ＮＫ３．３細胞を、２４時間ＩＬ−２非存在下（「飢餓状態」）において培養した。アッセイは、総容量１００μｌの、参照ＩＬ−２分子としての種々の濃度のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２、または、種々の濃度の本発明のＩＬ−２ムテインに曝露した、Ｕ底９６ウェルプレートにプレーティングした５×１０^４「飢餓状態」ＮＫ３．３細胞を用いた。１８時間のインキュベートの後、ＩＬ−２刺激ＮＫ３．３エフェクター細胞を、５×１０^３カルセインＡＭ標識標的細胞（Ｋ５６２またはＤａｕｄｉ）または抗体コーティングカルセインＡＭ標識標的（最終濃度２μｇ／ｍＬのリツキシマブでコーティングされたＤａｕｄｉ）と共インキュベートすることにより、最終的なエフェクター 対 標的比、１０：１を達成した（最終容量２００μＬ）。エフェクター細胞と標的細胞を４時間共インキュベートした後、９６ウェルプレートを短時間遠心分離し；培養上清１００μＬを取り出し、黒色清浄平底９６ウェルプレートに入れ、蛍光計によりカルセインＡＭの放出の定量に供した。定量は、パーセント特異的溶解として表示し、以下の式：％特異的溶解＝１００×［（平均実験値−平均自発的放出）／（平均最大放出−平均自発的放出）］により計算した。ここで自発的放出は、標識標的を含有しエフェクターを含有しないウェルから求め、そして最大放出は、標識標的および１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するウェルから求めた。
【０１６３】
（Ｔ細胞増殖）
Ｔ細胞増殖に関するＩＬ−２バイオアッセイは、Ｔ細胞慢性リンパ性白血病の患者に由来するヒトＴ細胞株Ｋｉｔ２２５（ＣＭＣＣ ＩＤ＃１１２３４）を利用する（Ｈｏｒｉら（１９８７）Ｂｌｏｏｄ ７０（４）：１０６９−１０７２）。Ｋｉｔ２２５細胞は、ＩＬ−２レセプター複合体のα、β、γサブユニットを構成的に発現する。Ｋｉｔ２２５の増殖はＩＬ−２依存性であり；細胞は長期間ＩＬ−２非存在下で培養すれば死滅する。アッセイは、２４時間ＩＬ−２の非存在下でＫｉｔ２２５細胞を培養し、その後、参照ＩＬ−２分子としての種々の濃度のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２、または、種々の濃度の本発明のＩＬ−２ムテインと共に、特定数の細胞をプレーティングすることより構成される。４８時間のインキュベーションの後、増殖を、標準的な市販のＭＴＴ色素還元キットを用いて判定し、そして、刺激指数を、比色読み取り値に基づいて計算した。
【０１６４】
（ＮＫ細胞生存シグナル伝達）
ヒトＩＬ−２ムテインライブラリのサブセットがＮＫ細胞生存シグナル伝達を誘導する能力についてこれらをスクリーニングした。プロロイキン（登録商標）ＩＬ−２（すなわち、アルデスロイキン、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインを含む処方物）はＩＬ−２を予め枯渇させたＮＫ３．３細胞においてＡＫＴのリン酸化を誘導する（「生存シグナル」と考えられる）。ＮＫ３．３細胞を増殖させ、１５％熱不活性化ウシ胎仔児血清、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびＩＬ−２供給源として２０％ヒトＴ−Ｓｔｉｍ^ＴＭｗ／ＰＨＡを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中に維持した。アッセイの調製においては、ＮＫ３．３細胞を２４時間ＩＬ−２非存在下において培養した。細胞生存シグナル伝達の指標として、「飢餓状態」ＮＫ３．３細胞（２×１０^６）を、３０分間、２ｎＭの参照ＩＬ−２分子としてのデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳもしくはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２、または２ｎＭの本発明のＩＬ−２ムテインを添加することにより刺激した。細胞をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞ペレットを、プロテアーゼインヒビターを含有する細胞抽出緩衝液５０μｌ中で溶解し、１回の凍結−解凍サイクルに供した。抽出液を、４℃で１０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。透明な溶解液のアリコートを、ＡＫＴ［ｐＳ４７３］^＊イムノアッセイキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のウェルに１：１０希釈で添加した。製造元のプロトコルに従って、リン酸化されたＡＫＴのレベルを、定量的ＥＬＩＳＡにより検出した。
【０１６５】
（実施例２：ＮＫ細胞によるＴＮＦ−α産生を低減する有益な変異の同定）
ムテインの第１の機能クラスは、改善された耐容性を有することが予測された。このことは、１．０ｎＭにおいてアッセイされた場合に、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインで観察したものの＜６０％である、ＮＫ細胞によるＴＮＦ−α産生の誘導が減じることによって証明される（本明細書中の以下のデータにおいて「Ａｌａ−Ｐｒｏ」と表される）。このクラスのムテインは、２つのカテゴリーに含まれる：
（１）１．０ｎＭのムテイン濃度においてＮＫ細胞によるＴＮＦ−αを低く誘導しＮＫ細胞増殖を維持するが、増殖活性はムテインのより低い濃度に下がるムテインであって、これらとしては、１９Ｄ４０Ｄ、３６Ｄ６１Ｒ、３６Ｄ６５Ｌ、４０Ｄ６１Ｒ、４０Ｄ６５Ｙ、４０Ｇ６５Ｙまたは８１Ｋ９１Ｄの組み合わせ置換をさらに含むデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインが挙げられる。この残基の位置（すなわち、１９、３６、４０、６１、６５、８１または９１）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連し（すなわち、配列番号４に関連する）、以下の表３に示す；ならびに
（２）ＮＫ細胞によるＴＮＦ−α産生を低く誘導し、増殖活性は５０ｐＭまで維持されるムテインであって、さらに、ＮＫ細胞によるＴＮＦ−α産生は、０．０５ｎＭ（すなわち、５０ｐＭ）および０．１ｎＭ（すなわち、１００ｐＭ）におけるＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の産生の＜８０％でなければならない。このサブクラスとしては、４０Ｄ７２Ｎ、８０Ｋ６５Ｙ、８１Ｋ８８Ｄ、８１Ｋ４２Ｅ、８１Ｋ７２Ｎ、１０７Ｈ６５Ｙまたは１０７Ｒ７２Ｎの組み合わせ置換をさらに含むデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインが挙げられる。この残基の位置（すなわち、４０、４２、６５、７２、８０、８１、８８または１０７）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連し（すなわち、配列番号４に関連する）、以下の表４に示す。
【０１６６】
（表３．ＮＫ細胞によるＴＮＦ−α産生の低減された誘導を有するとして同定されたＩＬ−２ムテイン。種々の濃度のＩＬ−２ムテインにおけるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α産生は、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察するものの比（：Ａｌａ−Ｐｒｏ）として表す。種々の濃度のＩＬ−２ムテインにおけるＮＫ細胞増殖（ＮＫ９２−ＭＴＴ）は、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察されるものの比（：Ａｌａ−Ｐｒｏ）として表す）
【０１６７】
【表３】

（表４．ＮＫ細胞によるＴＮＦ−α産生の低減された誘導を有するとして同定されたさらなるＩＬ−２ムテイン。種々の濃度のＩＬ−２ムテインにおけるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α産生は、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察するものの比（：Ａｌａ−Ｐｒｏ）として表す。種々の濃度のＩＬ−２ムテインにおけるＮＫ細胞増殖（ＮＫ９２−ＭＴＴ）は、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察されるものの比（：Ａｌａ−Ｐｒｏ）として表す）
【０１６８】
【表４】

（実施例３：ＮＫ細胞増殖を増強する有益なムテインの同定）
ヒトＩＬ−２ムテインの第２のクラスは、ＴＮＦ−α産生に対して有害な影響を与えることのない（１００ｐＭまたは１ｎＭの濃度において参照ＩＬ−２ムテインについて観察されるものに対して、＜１００％のＴＮＦ−α産生）試験した１以上の濃度（５ｐＭ、２０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭおよび１０００ｐＭ）におけるＣ１２５ＳヒトＩＬ−２と比較して、ＮＫ細胞増殖を＞２００％に増強する。さらに、選択基準としては、試験した少なくとも２種の濃度について参照ＩＬ−２ムテイン（すなわち、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（Ａｌａ−Ｐｒｏ））で観察されるものの１５０％を超える増殖指数を含む。この機能クラスとしては、１９Ｄ８１Ｋ、４０Ｇ３６Ｄまたは８１Ｋ３６Ｄの置換をさらに含むデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２置換が挙げられ、この残基の位置（すなわち、１９、３６、４０または８１）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）。以下の表５を参照のこと。
【０１６９】
（表５．ＮＫ細胞によるＴＮＦ−α産生に負の影響を与えることなく、ＮＫ細胞増殖の誘導の増強を有すると同定したＩＬ−２ムテイン。種々の濃度のＩＬ−２ムテインにおけるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α産生は、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察するものの比（：Ａｌａ−Ｐｒｏ）として表す。種々の濃度のＩＬ−２ムテインにおけるＮＫ細胞増殖（ＮＫ９２−ＭＴＴ）は、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察されるものの比（：Ａｌａ−Ｐｒｏ）として表す）
【０１７０】
【表５】

（実施例４：「二官能性」変異の同定）
ヒトＩＬ−２ムテインの第３のクラスは、増殖活性の増大およびＮＫ細胞によるＴＮＦ−α産生の低減を示す。ここでＴＮＦ−α産生は、１ｎＭにおいて試験した場合、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインについて観察するものの＜７５％であり、ＮＫ細胞の増殖は、試験した任意の１つの濃度（５ｐＭ、２０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭおよび１０００ｐＭ）におけるＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインについて観察されたものの＞１５０％である。この群としては、３６Ｄ４２Ｒ、３６Ｄ８０Ｋ、４０Ｄ８０Ｋ、８１Ｋ６１Ｒ、９１Ｎ９５Ｇ、１０７Ｈ３６Ｄ、１０７Ｒ３６Ｄまたは９１Ｎ９４Ｙ９５Ｇの置換をさらに含むデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインが挙げられる。この残基の位置（すなわち、３６、４０、４２、６１、８０、８１、９１、９４、９５または１０７）は、成熟ヒトＩＬ−２配列に関連する（すなわち、配列番号４に関連する）。以下の表６を参照のこと。
【０１７１】
（表６．ＮＫ細胞増殖の誘導の増強およびＮＫ細胞によるＴＮＦ−α産生の誘導の低減を有すると同定した二官能性ＩＬ−２ムテイン。種々の濃度のＩＬ−２ムテインにおけるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α産生は、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察するものの比（：Ａｌａ−Ｐｒｏ）として表す。種々の濃度のＩＬ−２ムテインにおけるＮＫ細胞増殖（ＮＫ９２−ＭＴＴ）は、Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２について観察されるものの比（：Ａｌａ−Ｐｒｏ）として表す）
【０１７２】
【表６】

以下の表７は、このスクリーニングプロセスにおいて同定した３２の組み合わせムテインの機能プロファイルを要約する。
【０１７３】
【表７−１】

【０１７４】
【表７−２】

（実施例５：正常ヒト末梢血単核細胞における増殖および細胞毒性のレベルを維持または増大しながら炎症誘発性サイトカイン産生を低減する、有益なＩＬ−２変異の同定）
上記３２個のＩＬ−２ムテインの組み合わせアミノ酸置換シリーズから、表８に示すように、小規模発現／精製のために１８個のＩＬ−２ムテインを選択した。これらのＩＬ−２ムテインを、数人の健常ヒト血液ドナーより単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における増大した耐容性および維持された活性という同様の機能プロフィールを生じるその能力について、関連するＩＬ−２対照（デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン（プロロイキン（登録商標）中に存在）および酵母発現デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン（本明細書においては、データ中Ｙ−Ｐｒｏと記載）と比較して、試験した。具体的には、正常ヒトドナーのパネルから誘導したヒトＰＢＭＣを刺激し、増殖および炎症誘発性サイトカイン産生（ＴＮＦ−α）、ならびに天然／自発的細胞毒性（ＮＫ）、リンホカイン活性化殺傷（ＬＡＫ）または抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）により腫瘍細胞標的を殺傷する能力について、アッセイすることによって、精製したＩＬ−２ムテインをスクリーニングした。
【０１７５】
（表８．以下の組み合わせ置換を有するＣ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号６）またはデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（配列番号８）のアミノ酸配列を含むヒトＩＬ−２ムテインを、ヒトＰＢＭＣにおける活性についてスクリーニングした^１）
【０１７６】
【表８】

^１ＩＬ−２ムテインの同定は以下による：配列番号４の成熟ヒトＩＬ−２に対するアミノ酸位置、およびその位置におけるアミノ酸置換。
【０１７７】
以下の一次的な機能の指標を用いた：
１）ＩＬ−２ムテインで刺激されたヒトＰＢＭＣによる、関連するヒトＩＬ−２ムテイン対照と比較して低減した、炎症誘発性サイトカイン産生（ＴＮＦ−α）；
２）ヒトＰＢＭＣにおける、炎症誘発性サイトカイン産生の増大を伴わない、関連するヒトＩＬ−２ムテイン対照と比較して維持されるかまたは向上した、ＩＬ−２誘導増殖；および
３）ＩＬ−２ムテインによりインビトロ刺激されたヒトＰＢＭＣによる、関連するヒトＩＬ−２ムテイン対照と比較して維持されるかまたは向上した、ＮＫ、ＬＡＫおよびＡＤＣＣ媒介性の細胞毒性殺傷。
【０１７８】
（アッセイの説明）
（増殖／炎症誘発性サイトカイン産生複合アッセイの手順）
ＩＬ−２への曝露により、ヒトＰＢＭＣは用量依存的に増殖してサイトカインを分泌する。データアウトプットおよび効力を最大限にするために、参照ＩＬ−２ムテインまたは目的のヒトＩＬ−２ムテインで７２時間刺激した後で増殖およびサイトカインの産生のレベルを評価するための複合アッセイを設計した。アッセイの設定は、正常ヒトドナー１人以上からの密度勾配分離（ＡＣＤＡ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴチューブ）によるＰＢＭＣの単離を包含する。９６穴組織培養処理プレートにおいて、ウェル当たり２００，０００個の細胞を、３７℃、７％ＣＯ_２において、完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン／フンジゾン）中で、種々の濃度のＩＬ−２（０．０３９ｎＭ〜１０ｎＭ）とともに、または陰性対照としてＩＬ−２非存在下で、インキュベートする。６６時間のインキュベーションの後、細胞培養上清のアリコートを取り出し、後のサイトカイン検出のために凍結する。細胞を１μＣｉ^３Ｈ−チミジンで６時間パルスし、次に回収して、細胞増殖の尺度としてヌクレオチド取り込みのレベルを決定する（Ｗａｌｌａｃ Ｔｒｉｌｕｘ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）。市販のＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｃｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて、製造元のガイドラインに従って、細胞培養上清中のＴＮＦ−αのレベルを検出した。個別の６ドナーの完全なパネルについてアッセイを繰り返すことにより、「正常集団」におけるＩＬ−２への代表的な増殖応答およびサイトカイン応答の特徴付けが提供される。
【０１７９】
（データ分析）
ＰＢＭＣサンプルを、再現性評価のために個別の試験プレートに２連でプレーティングした。増殖データは、バックグラウンド増殖（ＰＢＭＣ＋ＩＬ−２なし）を差し引くことにより分析し、そして２連のサンプルの平均を計算した。サイトカインデータを、ＰＢＭＣを含有するアッセイウェルから採取した細胞培養上清から得、プールして２連の設定における平均のサイトカインレベルを得た。ＴＮＦ−αレベルを、ＥＬＩＳＡキットに含まれる精製されたＴＮＦ−αの標準曲線に基づいて、ｐｇ／ｍｌで定量した。データを、図１に示す模式図において概説するように、６人の正常ヒトドナーのパネルについてさらに編集した。
【０１８０】
（細胞毒性アッセイ（ＮＫ／ＬＡＫ／ＡＤＣＣ））
このアッセイにおいては、ＰＢＭＣを密度勾配遠心分離を用いて全血から分離する。ＰＢＭＣを、１０ｎＭのＩＬ−２対照または目的のＩＬ−２ムテインの存在下で３日間刺激し、現在の技術レベルで一般的に実施されているようにＬＡＫ活性を発生させる（例えばＩｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＡＫ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１９９６ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃを参照のこと）。得られた細胞集団は「エフェクター」細胞を含有し、これはＮＫまたはＬＡＫに分類してよく、そしてそれぞれＫ５６２およびＤａｕｄｉの腫瘍細胞標的を殺傷することができる。これらのエフェクター細胞はまたＡＤＣＣを媒介し得、これによりエフェクター細胞はＤａｕｄｉ標的細胞に結合している特定の抗体（この場合はＲｉｔｕｘａｎ（登録商標））のＦｃ部分を認識する。このアッセイでは、４時間、種々のエフェクター 対 標的細胞（Ｅ：Ｔ比）での、カルセインＡＭ標識標的細胞とのエフェクター細胞の共インキュベーションを包含する。細胞毒性活性の量は、培養上清中のカルセインＡＭの検出に関係している。定量は、自発的放出および最大放出の対照の決定に基づいて、各Ｅ：Ｔ比におけるパーセント特異的溶解として表示される。まとめると、アッセイは以下の生物学的活性を試験する。
【０１８１】
【表９】

（データ分析）
データは蛍光計から得られ、そして相対的蛍光単位（ｒｆｕ）として表示される。対照は、標識標的細胞単独（最小）、および１００％溶解（最大）の尺度としての標識標的細胞＋最終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む。パーセント最小 対 最大比は、アッセイの有効性（＞３０％であればアッセイは無効）の尺度として以下の式を用いて計算する：
％最小 対 最大＝１００ｘ［（平均自発的放出ｒｆｕ）／（平均最大放出ｒｆｕ）］
アッセイが有効であることがわかれば、３連のサンプル点の平均および標準偏差を計算し、その後、以下の式を用いて３連の点の平均からパーセント特異的溶解を求める：
％溶解＝１００ｘ［（平均実験ｒｆｕ−平均自発的放出ｒｆｕ）／（平均最大放出ｒｆｕ−平均自発的放出ｒｆｕ）］
データは％特異的溶解として報告し；さらに、ＩＬ−２ムテインの関連ＩＬ−２対照に対する比を用いて、ヒトＰＢＭＣドナーの混合集団における対照ＩＬ−２に対して細胞毒性活性が維持されたかどうかを決定した。
【０１８２】
（結果）
正常ヒトＰＢＭＣにおける増殖および細胞毒性のレベルを維持または増大させながら炎症誘発性サイトカイン産生を低減する、２種の有益な組み合わせＩＬ−２変異を同定した：４０Ｄ７２Ｎおよび４０Ｄ６１Ｒ。以下に示すデータセットについては、関連する対照（すなわち、同じ酵母系において発現され精製されたデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２（Ｙ−Ｐｒｏと称する））と共にＩＬ−２ムテインを試験した。まずＩＬ−２ムテインを、２連で試験した３つの正常血液ドナーＰＢＭＣを各々用いた２つの独立したアッセイ設定において、用量応答曲線（３９ｐＭ〜１０ｎＭ）にわたって増殖／炎症誘発性サイトカイン産生複合アッセイにおいて試験した。データ分析は、個々のドナーのプロフィール、平均±標準偏差、内部ＩＬ−２対照との差の分析、および、細胞当たり産生されたサイトカインの相対レベルを得るための増殖（ｃｐｍ）に対するサイトカイン産生（ｐｇ／ｍｌ）の標準化を含んだ。最後に、ＩＬ−２対照からのＴＮＦ−α産生の％減少を計算した。１０，０００ｐＭにおいて２５％超のＴＮＦ−α産生の減少を示したＩＬ−２ムテインは、増殖のレベルが維持されていれば有益であるとみなされた。表９は、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテイン骨格においてさらなる組み合わせのアミノ酸置換を有していた２種の有益な組み合わせＩＬ−２ムテインに関して観察された、ＴＮＦ−α産生のパーセント減少をまとめるものである。図２および図３は、ヒトＰＢＭＣにおける、それぞれ４０Ｄ７２Ｎおよび４０Ｄ６１Ｒのムテインにより媒介される、増殖およびＴＮＦ−α産生を示す。
【０１８３】
（表９．ＩＬ−２対照からのＴＮＦ−α産生のパーセント減少^１）
【０１８４】
【表１０】

^１値は、６人の正常ヒトＰＢＭＣドナーのパネル由来のＹ−Ｐｒｏ対照からの平均パーセント減少を示す。サイトカインデータは、増殖に対して標準化した。
【０１８５】
一旦、２種の有益なＩＬ−２ムテインが同定されれば、ＩＬ−２ムテインで刺激されたＰＢＭＣが、ＮＫ活性、ＬＡＫ活性およびＡＤＣＣ活性による腫瘍細胞標的を溶解する能力を保持しているかどうかを決定することが重要であった。図４に示す通り、ＬＡＫ活性およびＡＤＣＣ活性による腫瘍標的を溶解する能力においては、４０Ｄ７２Ｎ ＩＬ−２ムテインまたは４０Ｄ６１Ｒ ＩＬ−２ムテインとＩＬ−２ムテインと関連ＩＬ−２対照との間に差は観察されなかった。
【０１８６】
本明細書に示される本発明の多くの変更および他の実施形態は、上記の説明および添付する図面に示した教示の利益を有する本発明が関係する分野の当業者に理解される。したがって、本発明が開示した特定の実施形態に限定されるべきではなく、変更および他の実施形態が本明細書に開示される実施形態の範囲内に包含されることが意図されることが理解されるべきである。本明細書において特定の用語が使用されたが、これらは、一般的かつ説明的な意味においてのみ使用されており、限定する目的で使用されていない。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】図１は、正常ヒトドナーから単離されたＩＬ−２ムテイン刺激のヒトＰＢＭＣと共に使用される、組み合わせの増殖／炎症誘発性サイトカイン生産アッセイ手順の複雑な状況についての概略図の概略を述べる。
【図２】図２は、ヒトＰＢＭＣにおける４０Ｄ７２Ｎ ＩＬ−２ムテインにより媒介される増殖およびＴＮＦ−α生産を示す。
【図３】図３は、ヒトＰＢＭＣにおける４０Ｄ６１Ｒ ＩＬ−２ムテインにより媒介される増殖およびＴＮＦ−α生産を示す。
【図４】図４は、正常ヒトドナーから単離されたＩＬ−２ムテイン刺激のヒトＰＢＭＣに関する、ヒトＮＫ媒介性ＬＡＫおよびＡＤＣＣ活性の維持を示す。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、以下：
ａ）ヒトＩＬ−２のムテインをコードするヌクレオチド配列であって、該ムテインは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９または７１に示されるヌクレオチド配列；
ｃ）ヒトＩＬ−２のムテインをコードするヌクレオチド配列であって、該ムテインは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０および７２からなる群より選択される配列の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列を含む、ヌクレオチド配列；
ｄ）配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９および７１からなる群より選択される配列のヌクレオチド４〜３９９を含む、ヌクレオチド配列；
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列であって、ここで該配列は、アラニンをコードするトリプレットコドンによる、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９または７１のヌクレオチド３７３〜３７５の置換を含む、ヌクレオチド配列；
ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列であって、ここで該配列は、システインをコードするトリプレットコドンによる、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９または７１のヌクレオチド３７３〜３７５の置換を含む、ヌクレオチド配列；ならびに
ｇ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）のヌクレオチド配列であって、ここで該ムテインをコードする１以上のコドンは、目的の宿主細胞における発現について最適化されている、ヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
前記ｇ）のヌクレオチド配列が、配列番号７３の配列、配列番号７３のヌクレオチド４〜３９９、配列番号７４の配列および配列番号７４のヌクレオチド４〜３９９からなる群より選択される、請求項に１記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１または２のいずれかに記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項４】
請求項１または２のいずれかに記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項５】
単離されたポリペプチドであって、以下：
ａ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列；
ｃ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換されたアラニン残基を含む、アミノ酸配列；および
ｄ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換されたシステイン残基を含む、アミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項６】
ヒトＩＬ−２のムテインを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該ムテインは、配列番号４の１２５位のシステインに対して置換されたセリンおよび配列番号４内の少なくとも２つのさらなるのアミノ酸の置換を有する配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、ここで該ムテインは、類似のアッセイ条件下においてデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量と比較した場合、１）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を維持または増強し、そして２）ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産の低減されたレベルを誘導し、ここで該ＮＫ細胞の増殖および該ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産は、ＮＫ−９２バイオアッセイを使用してアッセイされる、単離されたポリペプチド。
【請求項７】
前記ムテインが、配列番号４の１位のアラニンの欠失をさらに含む、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
前記配列番号４内のさらなる置換が、１９Ｄ４０Ｄ、１９Ｄ８１Ｋ、３６Ｄ４２Ｒ、３６Ｄ６１Ｒ、３６Ｄ６５Ｌ、４０Ｄ３６Ｄ、４０Ｄ６１Ｒ、４０Ｄ６５Ｙ、４０Ｄ７２Ｎ、４０Ｄ８０Ｋ、４０Ｇ３６Ｄ、４０Ｇ６５Ｙ、８０Ｋ３６Ｄ、８０Ｋ６５Ｙ、８１Ｋ３６Ｄ、８１Ｋ４２Ｅ ８１Ｋ６１Ｒ、８１Ｋ６５Ｙ、８１Ｋ７２Ｎ、８１Ｋ８８Ｄ、８１Ｋ９１Ｄ、８１Ｋ１０７Ｈ、８１Ｌ１０７Ｈ、９１Ｎ９５Ｇ、１０７Ｈ３６Ｄ、１０７Ｈ４２Ｅ、１０７Ｈ６５Ｙ、１０７Ｒ３６Ｄ、１０７Ｒ７２Ｎ、４０Ｄ８１Ｋ１０７Ｈ、４０Ｇ８１Ｋ１０７Ｈおよび９１Ｎ９４Ｙ９５Ｇの組み合わせ置換からなる群より選択される、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
前記ムテインが、配列番号４の１位のアラニンの欠失をさらに含む、請求項８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
前記炎症誘発性サイトカインがＴＮＦ−αである、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
前記ムテインが、類似のアッセイ条件下におけるデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量について観察されるものと比較して、維持または改善されたヒトＮＫ細胞媒介性ナチュラルキラー細胞毒性、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞毒性、またはＡＤＣＣ媒介性細胞毒性を提供し、ここで該ＮＫ細胞媒介性細胞毒性は、ＮＫ３．３細胞毒性バイオアッセイを用いてアッセイされる、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
前記ムテインにより誘導された前記ＮＫ細胞の増殖が、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導される増殖の１５０％超である、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
前記ムテインにより誘導された前記ＮＫ細胞の増殖が、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導される増殖の１７０％超である、請求項１２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
前記ムテインにより誘導された前記ＮＫ細胞の増殖が、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導される増殖の約２００％〜約２５０％である、請求項１３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
前記ムテインにより誘導された前記ＮＫ細胞の増殖が、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導される増殖より少なくとも１０％増大している、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
前記ムテインにより誘導された前記ＮＫ細胞の増殖が、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導される増殖より少なくとも１５％増大している、請求項１５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
前記ムテインにより誘導された前記炎症誘発性サイトカイン生産が、同様のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２の同様の量により誘導される産生の１００％未満である、請求項１６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
前記ムテインにより誘導された前記炎症誘発性サイトカイン生産が、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２により誘導される産生の７０％未満である、請求項１７に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
ヒトＩＬ−２のムテインを含む単離されたポリペプチドであって、ここで該ムテインは、配列番号４の１２５位のシステインに対して置換されたセリンおよび配列番号４内の少なくとも２つのさらなるアミノ酸置換を有する配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、ここで、該ムテインのＩＬ−２誘導性ＴＮＦ−α生産に対するＩＬ−２誘導性ＮＫ細胞の増殖の比は、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインまたはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２ムテインの同様の量で観察される比より少なくとも１．５倍高く、ここで０．１ｎＭムテインにおけるＮＫ細胞増殖および１．０ｎＭムテインにおけるＴＮＦ−α生産が、ＮＫ−９２バイオアッセイを用いてアッセイされる、ポリペプチド。
【請求項２０】
前記比が、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察される比より少なくとも２．５倍高い、請求項１９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
前記比が、デス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２またはＣ１２５ＳヒトＩＬ−２で観察される比より少なくとも３．０倍高い、請求項１９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
前記ムテインが、配列番号４の１位にアラニンの欠失をさらに含む、請求項１９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
ヒトＩＬ−２のムテインに対するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ここで該ムテインは、配列番号４の１２５位のシステインに対して置換されたセリンおよび少なくとも２つのさらなるアミノ酸置換を有する配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、ここで該さらなる置換は、１９位、３６位、４０位、４２位、６１位、６５位、７２位、８０位、８１位、８８位、９１位、９５位および１０７位からなる群より選択される配列番号４の位置に存在する、ポリペプチド。
【請求項２４】
前記ムテインが、配列番号４の１位にアラニンの欠失をさらに含む、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
前記配列番号４内のさらなる置換が、１９Ｄ４０Ｄ、１９Ｄ８１Ｋ、３６Ｄ４２Ｒ、３６Ｄ６１Ｒ、３６Ｄ６５Ｌ、４０Ｄ３６Ｄ、４０Ｄ６１Ｒ、４０Ｄ６５Ｙ、４０Ｄ７２Ｎ、４０Ｄ８０Ｋ、４０Ｇ３６Ｄ、４０Ｇ６５Ｙ、８０Ｋ３６Ｄ、８０Ｋ６５Ｙ、８１Ｋ３６Ｄ、８１Ｋ４２Ｅ ８１Ｋ６１Ｒ、８１Ｋ６５Ｙ、８１Ｋ７２Ｎ、８１Ｋ８８Ｄ、８１Ｋ９１Ｄ、８１Ｋ１０７Ｈ、８１Ｌ１０７Ｈ、９１Ｎ９５Ｇ、１０７Ｈ３６Ｄ、１０７Ｈ４２Ｅ、１０７Ｈ６５Ｙ、１０７Ｒ３６Ｄ、１０７Ｒ７２Ｎ、４０Ｄ８１Ｋ１０７Ｈ、４０Ｇ８１Ｋ１０７Ｈおよび９１Ｎ９４Ｙ９５Ｇの組み合わせ置換からなる群より選択される、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２６】
前記ムテインが、配列番号４の１位のアラニンの欠失をさらに含む、請求項２５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２７】
ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）のムテインを産生する方法であって、該ムテインは、同様のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ヒトＩＬ−２から選択される参照ヒトＩＬ−２ムテインの同様の量と比較した場合、ＮＫ細胞の増殖を維持または増強することが可能であり、そしてまたＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導し、該ＮＫ細胞の増殖および該炎症誘発性サイトカイン生産が、ＮＫ−９２バイオアッセイを用いてアッセイされる方法であって、該方法は、以下：
ａ）請求項１に記載の核酸分子を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程；
ｂ）ポリペプチドとしての該核酸分子の発現を可能にする条件下で細胞培養培地において該宿主細胞を培養する工程；および
ｃ）該ポリペプチドを単離する工程
を包含する、方法。
【請求項２８】
ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）のムテインを産生する方法であって、該ムテインは、同様のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２から選択される参照ヒトＩＬ−２ムテインの同様の量と比較した場合、ＮＫ細胞の増殖を維持または増強することが可能であり、そしてまたＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導し、ここで該ＮＫ細胞の増殖および該炎症誘発性サイトカイン生産が、ＮＫ−９２バイオアッセイを用いてアッセイされる方法であって、該方法は、以下：
ａ）請求項２３に記載のポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程；
ｂ）ポリペプチドとしての該核酸分子の発現を可能にする条件下で細胞培養培地において該宿主細胞を培養する工程；および
ｃ）該ポリペプチドを単離する工程
を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項５に記載のヒトＩＬ−２ムテインの治療有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項３０】
請求項６に記載のヒトＩＬ−２ムテインの治療有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項３１】
請求項１９に記載のヒトＩＬ−２ムテインの治療有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項３２】
請求項２３に記載のヒトＩＬ−２ムテインの治療有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項３３】
哺乳動物の免疫系を刺激するための方法であって、該方法は、ヒトＩＬ−２ムテインの治療有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで該ムテインは、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２から選択される参照ＩＬ−２分子の同様の量と比較した場合、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導し、そしてＮＫ細胞の増殖を維持または増強し、ここで該ＮＫ細胞の増殖および該炎症誘発性サイトカイン生産が、ＮＫ−９２バイオアッセイを使用してアッセイされる、方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ヒトＩＬ−２ムテインが、以下：
ａ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列；
ｃ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換されたアラニン残基を含む、アミノ酸配列；および
ｄ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換されたシステイン残基を含む、アミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳動物において癌を処置するための方法であって、該方法は、ヒトＩＬ−２ムテインの治療有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで該ムテインは、同様のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２から選択される参照ＩＬ−２ムテインの同様の量と比較した場合、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導し、そしてＮＫ細胞の増殖を維持または増強し、ここで該ＮＫ細胞の増殖および該炎症誘発性サイトカイン生産が、ＮＫ−９２バイオアッセイを用いてアッセイされる、方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ヒトＩＬ−２ムテインが、以下：
ａ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列；
ｃ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換されたアラニン残基を含む、アミノ酸配列；および
ｄ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換されたシステイン残基を含む、アミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
処置プロトコルとしてインターロイキン−２（ＩＬ−２）投与を受けている被験体においてＩＬ−２誘導性毒性症状を低減するための方法であって、該方法は、ＩＬ−２ムテインとして該ＩＬ−２を投与する工程を包含し、ここで該ＩＬ−２ムテインは、以下：
ａ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列；
ｃ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換されたアラニン残基を含む、アミノ酸配列；および
ｄ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換されたシステイン残基を含む、アミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項４０】
哺乳動物の免疫系を刺激するための方法におけるヒトＩＬ−１２ムテインの使用であって、該方法は、該哺乳動物に治療有効量のヒトＩＬ−１２ムテインを投与する工程を包含し、ここで該ムテインは、類似のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２から選択される参照ＩＬ−２ムテインの同様の量と比較してＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導し、そしてＮＫ細胞の増殖を維持または増強し、ここで該ＮＫ細胞の増殖および該炎症誘発性サイトカイン生産が、ＮＫ−９２バイオアッセイを使用してアッセイされる、使用。
【請求項４１】
哺乳動物において癌を処置するための方法におけるヒトＩＬ−２の使用であって、該方法は、該哺乳動物に治療有効量のヒトＩＬ−２ムテインを投与する工程を包含し、該ムテインは、同様のアッセイ条件下のデス−アラニル−１，Ｃ１２５ＳヒトＩＬ−２およびＣ１２５ＳヒトＩＬ−２から選択される参照ＩＬ−２ムテインの同様の濃度と比較して、ＮＫ細胞による炎症誘発性サイトカイン生産のより低いレベルを誘導し、そしてＮＫ細胞の増殖を維持または増強し、ここで該ＮＫ細胞の増殖および該炎症誘発性サイトカイン生産が、ＮＫ−９２バイオアッセイを用いてアッセイされる、使用。
【請求項４２】
処置プロトコルとしてインターロイキン−２（ＩＬ−２）投与を受けている被験体においてＩＬ−２誘導性毒性症状を低減するための方法におけるヒトＩＬ−２ムテインの使用であって、該方法は、ＩＬ−２ムテインとして該ＩＬ−２を投与する工程を包含し、ここで該ＩＬ−２ムテインは、以下：
ａ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の残基２〜１３３を含むアミノ酸配列；
ｃ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換されたアラニン残基を含む、アミノ酸配列；および
ｄ）ａ）またはｂ）のアミノ酸配列であって、ここで該配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０または７２の１２５位のセリン残基に対して置換されたシステイン残基を含む、アミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、使用。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【公表番号】特表２００８−５０９６５１（Ｐ２００８−５０９６５１Ａ）
【公表日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０２０７３（Ｐ２００７−５０２０７３）
【出願日】平成１７年３月７日（２００５．３．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００７３０３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８６７５１
【国際公開日】平成１７年９月２２日（２００５．９．２２）
【出願人】（５０６１７５８２８）カイロン　コーポレーション (7)
【Ｆターム（参考）】