組み換え微生物を利用した（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルの製造方法
本発明は、変異微生物を利用した光学活性（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルの合成方法に関し、さらに詳細には、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用変異微生物；上記変異微生物を利用した（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造方法；β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子、アシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子及びリパーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸エステル製造用変異微生物及び上記変異微生物を利用した（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルの製造方法に関する。本発明によれば、微生物の該当過程によって生成されたアセチルＣｏＡを高価の金属触媒や基質を使用せず、微生物に導入された組換え遺伝子によって代謝経路を操作することによって、工程が簡単であり、光学純度が高い（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸を生産することができる。また、リパーゼを利用して本発明による方法で生産された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸から簡単に（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステル及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルのラクトンを生産することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換え微生物を利用した光学活性（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルの合成方法に関し、さらに詳細には、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物；上記組み換え微生物を利用した（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造方法；β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子、アシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子及びリパーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸エステル製造用組み換え微生物及び上記組み換え微生物を利用した（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルは、プラスチック材料、芳香剤、医薬品、農薬など活用範囲が非常に広いキラル中間体としてその効用性が非常に大きい（Speciality Chemicals Magazine, April: 39, 2004）。例えば、エチル（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートを還元して多様な抗生剤とフェロモンなどを作る中間体物質である（Ｓ）−１、３−ブタンジオールを合成することができ（T. Ferreira et al., Tetrahedron, 46: 6311, 1990）、除草剤である（Ｓ）−スルカトールの前駆体として利用され（K. mori et al., Tetrahedron, 37: 1341, 1981）、ｂ−ラクタム系の抗生剤であるカルバペネムの前駆体としても利用され（T. Chiba et al., Chemistry letters, 16: 2187, 1987）、類似ビタミン（vitamin-like nutrient）であるＬ−カルニチンの前駆体としても利用される（B. -N. Zhou et al., Journal of American Chemical society, 105: 5925, 1983）。
【０００３】
既存のエステルの製造方法としては、プロキラル前駆体である３−ケトエステルを利用して触媒ジホスフィン−ルテニウム（diphosphine-ruthenium）で還元的不斉水素化（asymmetric reductive hydrogenation）する方法があるが（R. Noyori et al., Journal of the American Chemical Society, 109: 5856, 1987）、使用する金属触媒が非常に高価であり、純粋な基質を必要とし、水素化反応は、非常に高圧の反応器を必要とするという短所がある。また、酵母を全細胞触媒として使用してｂ−ケトエステルを生体触媒による還元（biocatalytic reduction）し、収率５８％、光学純度９４％ｅｅのエチル（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートを生産する方法は、微生物内に存在する多様なオキシドレダクターゼによって光学活性が低くなるという短所がある（Tetrahedron Letters, 34: 3949, 1993）。
【０００４】
微生物の代謝経路を操作してブドウ糖から生合成された光学活性（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカン酸を生産する報告は知られている（Lee et al., Biotechnol Bioeng, 65: 363, 1999;Lee and Lee., Appl Environ Microbiol, 69: 1295, 2003;Gao et al., FEMS Microbiol Lett, 213: 59, 2002）。（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカン酸を生産する経路は、大きく２つに分けることができる。第一に、生分解性高分子であるポリヒドロキシアルカン酸の自己分解を利用したこと（Lee et al., Biotechnol Bioeng, 65: 363, 1999;Lee and Lee., Appl Environ Microbiol, 69: 1295, 2003）、第二に、生分解性高分子の自己分解ではなく、ブドウ糖から、まず（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカノイルＣｏＡを生産し、生産された（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカノイルＣｏＡからＣｏＡを除去した後、（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカン酸を生産することである（Gao et al., FEMS Microbiol Lett, 213: 59, 2002）。第二の方法の場合、ブドウ糖からβ−ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）と、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）を利用してまず（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生産し、生産された（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＣｏＡ除去することは、ホスホトランスブチラーぜ（ｐｔｂ）とブチリルキナーゼ（ＢｕＫ）を利用する（Gao et al., FEMS Microbiol Lett, 213: 59, 2002）。
【０００５】
光学活性（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートを生産する化学的経路と、生触媒経路が知られているが、微生物の代謝経路を操作してブドウ糖から生合成された光学活性（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステル生産することは未だ報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】T. Ferreira et al., Tetrahedron, 46: 6311, 1990
【非特許文献２】K. mori et al., Tetrahedron, 37: 1341, 1981
【非特許文献３】T. Chiba et al., Chemistry letters, 16: 2187, 1987
【非特許文献４】B. -N. Zhou et al., Journal of American Chemical society, 105: 5925, 1983
【非特許文献５】R. Noyori et al., Journal of the American Chemical Society, 109: 5856, 1987
【非特許文献６】Lee et al., Biotechnol Bioeng, 65: 363, 1999
【非特許文献７】Lee and Lee., Appl Environ Microbiol, 69: 1295, 2003
【非特許文献８】Gao et al., FEMS Microbiol Lett, 213: 59, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これより、本発明者は、光学活性（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルを生合成するために鋭意努力した結果、微生物の該当過程によって生成されたアセチルＣｏＡを高価の金属触媒や基質を使用せず、微生物に導入された組換え遺伝子によって代謝経路を操作することによって、工程が簡単であり、光学純度が高い（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルが生合成されることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明の主な目的は、（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物、及び上記組み換え微生物を培養することを含む（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステル製造用組み換え微生物、及び上記組み換え微生物を培養することを含む（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物を提供する。
【００１１】
また、本発明は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びホスホトランスブチラーぜをコーディングする遺伝子（ｐｔｂ）及びブチレートキナーゼをコーディングする遺伝子（Ｂｕｋ）で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、上記組み換え微生物を培養することを特徴とする（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、上記組み換え微生物の培養液または菌株抽出液をアセチル−ＣｏＡ、アセトアセチルＣｏＡ及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡで構成された群から選択される基質と反応させることを特徴とする（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子、アシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子及びリパーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸エステル製造用組み換え微生物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、上記組み換え微生物を培養することを特徴とする（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸エステルの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、微生物の該当過程によって生成されたアセチルＣｏＡを高価の金属触媒や基質を使用せず、微生物に導入された組換え遺伝子によって代謝経路を操作することによって、工程が簡単であり、光学純度が高い（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルの生合成方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】（Ｓ）−３−ＨＢ生合成経路を示す図である。
【図２】（Ｓ）−３−ＨＢ生合成経路を示す図である。
【図３】（Ｓ）−３−ＨＢエステルを合成する経路を示す図である。
【図４】ｐＴａｃＲｅＡ−ｈｂｄベクターの切断地図を示す図である。
【図５】ｐＥＴ２１ａＢＣＨベクターの切断地図を示す図である。
【図６】ｐＫ２８ＢＣＨ、ｐＥＴ２８ｂＢＣＨベクターの切断地図を示す図である。
【図７】ｐＥＴ２１ａＨＢＤ、ｐＫ２１ＨＢＤベクターの切断地図を示す図である。
【図８】本発明によって生産された（Ｓ）−３−ＨＢをメチル化させて分析したＧＣ−ＭＳＤ分析結果である。
【図９】本発明によって生産された（Ｓ）−３−ＨＢをメチル化させてキラリティーを分析した結果である。
【図１０】本発明による流加培養を用いた（Ｓ）−３−ＨＢを生産する時の時間プロファイル結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の方法によって製造される（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸は、化学式１に示されたように、（Ｒ）−３−ビドロキシ酪酸とは異なるキラリティーを有する光学活性化合物である。
【００１９】
【化１】
【００２０】
上記（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造のために、本発明は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された組み換え微生物を提供する。
【００２１】
本発明によるβ−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された組み換え微生物は、図１に示した生合成経路を経て（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸を生産する。
【００２２】
まず、ブドウ糖から該当過程を通じてアセチルＣｏＡが生成されれば、アセチルＣｏＡは、β−ケトチオラーゼによってアセトアセチルＣｏＡに転換され、上記アセトアセチルＣｏＡは、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼによって（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換され、最終的に、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡは、アシルＣｏＡヒドロラーゼによって（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸に転換されるようになる。
【００２３】
また、本発明は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びホスホトランスブチラーぜをコーディングする遺伝子（ｐｔｂ）及びブチレートキナーゼをコーディングする遺伝子（Ｂｕｋ）で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物を提供する。
【００２４】
本発明によるβ−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びホスホトランスブチラーぜをコーディングする遺伝子（ｐｔｂ）及びブチレートキナーゼをコーディングする遺伝子（Ｂｕｋ）で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物は、上記図２に示した経路を通じて（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸を生産するようになる。
【００２５】
ブドウ糖から該当過程を通じてアセチルＣｏＡが生成されれば、アセチルＣｏＡは、β−ケトチオラーゼによってアセトアセチルＣｏＡに転換され、上記アセトアセチルＣｏＡは、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼによって（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換され、上記（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡは、ホスホトランスブチラーぜ（Ｐｔｂ）またはホスホトランスアセチラーゼ（Ｐｔａ）によって（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルホスフェートに転換されて、上記（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルホスフェートは、ブチレートキナーゼ（ＢｕＫ）またはプロピオネートキナーゼ（Ｐｕｋ）によって最終的に（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸に転換されるようになる（図２）。
【００２６】
本発明の一具体例において、上記（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で構成された群のうち１つ以上の遺伝子を含有する１つ以上の組換えベクターによって形質転換されたものであることができる。
【００２７】
例えば、上記（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子を含有する組換えベクター、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を含有する組換えベクター及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子を含有する組換えベクターによって形質転換されたものであることができる。他の例において、上記（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を含有する組換えベクター及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子を含有する組換えベクターによって形質転換されたものであることができる。
【００２８】
本発明の一具体例において、上記β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子は、（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物の染色体に挿入されているものであることができる。
【００２９】
また、本発明は、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルの製造のために、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子、アシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子及びリパーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された組み換え微生物を提供する。
【００３０】
本発明による、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子、アシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子及びリパーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された組み換え微生物は、図３に示したように、上記図１の（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の生合成経路を経て生産された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸がリパーゼによってエステル化しながら、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルを生成するようになる。
【００３１】
本発明において、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子、アシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子及びリパーゼをコーディングする遺伝子は、上記酵素をコーディングする遺伝子なら特別な制限なくいずれのものでも利用可能である。下記実施例においては、特定の遺伝子を利用しているが、本発明の遺伝子が実施例に開示された特定の遺伝子に限定されるものではないことは当業者に自明であろう。
【００３２】
本発明の一具体例において、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子は、配列番号１の塩基配列で表示されるものであることができる。
【００３３】
本発明の一具体例において、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子は、配列番号２または配列番号３の塩基配列で表示されるものであることができる。
【００３４】
本発明の一具体例において、アシルＣｏＡヒドロラーゼは、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼであることができる。本発明の一具体例において、上記（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼは、配列番号４の塩基配列によってコーディングされるものであることができる。
【００３５】
本発明において、ベクターは、適当な宿主内でＤＮＡを発現させることができる適当な発現調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または簡単に潜在的ゲノム挿入物であることができる。適当な宿主で形質転換されれば、ベクターは、宿主ゲノムと関係なく複製し機能することができるか、または一部の場合に、ゲノムその自体に統合されることができる。プラスミドが現在ベクターの最も通常的に使用される形態なので、本発明において、「プラスミド」及び「ベクター」は、時々に相互交換的に使用される。しかし、本発明は、当業界に知られた、または知られるようになることと同等な機能を有するベクターの他の形態をも含む。
【００３６】
「発現調節配列（expression control sequence）」という表現は、特定の宿主生物で作動可能に連結されたコーディング配列の発現に必須なＤＮＡ配列を意味する。このような調節配列は、転写を実施するためのプロモータ、転写を調節するための任意のオペレータ配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列、及び転写及び解読の終決を調節する配列を含む。例えば、原核生物に適した調節配列は、プロモータ、任意のオペレータ配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーがこれに含まれる。プラスミドにおいて遺伝子の発現量に最も影響を及ぼす因子は、プロモータである。高発現用のプロモータとして、ＳＲαプロモータ、サイトメガロウイルス来由プロモータなどが好ましく使用されることができる。
【００３７】
本発明のＤＮＡ配列を発現させるために、非常に多様な発現調節配列のうちいずれのものでもベクターに使用されることができる。有用な発現調節配列の例として、例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期及び後期プロモータ、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣまたはＴＲＣシステム、Ｔ３及びＴ７プロモータ、ファージラムダの主要オペレータ及びプロモータ領域、ｆｄコードタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他のグリコール分解酵素に対するプロモータ、上記ホスファターゼのプロモータ、例えばＰｈｏ５、酵母アルファ−交配システムのプロモータ及び原核細胞または真核細胞またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節するものとして知られた構成と誘導のその他の配列及びこれらの様々な組合が含まれる。
【００３８】
核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置されるとき、「作動可能に連結（operably linked）」される。適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）は、調節配列に結合されるとき、遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列であることができる。例えば、前配列（pre-sequence）または分泌リーダー（leader）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加する全タンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモータまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されるか；またはリボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されるか；またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コーディング配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また、分泌リーダーの場合、接触し、リーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは、接触する必要がない。これら配列の連結は、便利な制限酵素部位でライゲーション（連結）によって行われる。このような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（oligonucleotide adaptor）またはリンカー（linker）を使用する。
【００３９】
本願発明において使用された用語「発現ベクター」は、通常、異種のＤＮＡ断片が挿入された組換えキャリア（recombinant carrier）であって、一般的に、二重鎖のＤＮＡ断片を意味する。ここで、異種のＤＮＡは、宿主細胞で天然的に発見されないＤＮＡである異形ＤＮＡを意味する。発現ベクターは、宿主細胞内にあれば、宿主染色体ＤＮＡと関係なく複製することができ、ベクターの数個のコピー及びその挿入された（異種）ＤＮＡが生成されることができる。
【００４０】
当業界に周知のように、宿主細胞で形質感染遺伝子の発現水準を高めるためには、当該遺伝子が選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び解読発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは、発現調節配列及び当該遺伝子は、細菌選択マーカー及び複製起点（replication origin）を一緒に含んでいる１つの発現ベクター内に含まれるようになる。発現宿主が真核細胞の場合には、発現ベクターは、真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含まなければならない。
【００４１】
本発明において、組換えベクターとしては、プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミドベクター、ＹＡＣ（Yeast Artificial Chromosome）ベクターなどを含む多様なベクターが導入されることができる。例えば、プラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たり数百個のプラスミドベクターを含むように複製が効率的に行われるようにする複製起点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞が選ばれるようにする抗生剤耐性遺伝子及び（ｃ）外来ＤＮＡ断片が挿入されることができる制限酵素切断部位を含む構造を有することができる。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用すれば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーション（ligation）することができる。
【００４２】
本発明による組換えベクターは、適切な宿主細胞で通常の方法によって形質転換することができる。宿主細胞としては、バクテリア、酵母、かびなどが可能であるが、これらに限定されるものではない。本発明に好ましく使用される宿主細胞は、原核細胞であり、大膓菌が好ましい。適当な原核宿主細胞の例として、Ｅ.ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１、Ｅ.ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５ａ、Ｅ.ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０１、Ｅ.ｃｏｌｉ Ｋ１２菌株２９４、Ｅ.ｃｏｌｉ菌株Ｗ３１１０、Ｅ.ｃｏｌｉ菌株Ｘ１７７６、Ｅ.ｃｏｌｉ ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｅ.ｃｏｌｉ Ｂなどを含む。しかし、ＦＭＢ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８及びＮＭ５３９のようなＥ.ｃｏｌｉ菌株及び他の原核生物の種及び属なども使用されることができる。前述のＥ.ｃｏｌｉに加えて、アグロバクテリウムＡ４のようなアグロバクテリウム属菌株、枯草菌（Bacillus subtilis）のようなバシラス（bacilli）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）または セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）のような他の腸内細菌及び多様なシュードモナス（Pseudomonas）属菌株が宿主細胞として利用されることができ、本発明は、上記記述した例示に制限されるものではない。
【００４３】
また、原核細胞の形質転換は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａの１．８２セクションに記述されたカルシウムクロライド方法を使用して容易に達成されることができる。選択的に、電気穿孔法（Neumann et al., EMBO J., 1: 841(1982))も、このような細胞を形質転換するのに使用されることができる。
【００４４】
また、本発明は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された組み換え微生物を製造し、上記組み換え微生物を培養することを含む（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造方法を提供する。上記培養は、適当な炭素源を含む培地で行われることができる。
【００４５】
また、本発明は、上記組み換え微生物の培養液または菌株抽出液をアセチル−ＣｏＡ、アセトアセチルＣｏＡ及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡで構成された群から選択される基質と反応させることを特徴とする（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造方法を提供する。
【００４６】
また、本発明は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子、アシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子及びリパーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸エステル製造用組み換え微生物を製造し、上記組み換え微生物を培養することを含む（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸エステルの製造方法を提供する。
【００４７】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
実施例１：β−ケトチオラーゼ及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を含有する組換えベクター（ｐＴａｃＲｅＡ−ＨＢＤ）の製作
まず、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６菌株（ＡＴＣＣ１７６９９）をＬＢ液体培地３ｍＬに１８時間培養した後、培養液を遠心分離して細胞を収得し、１０ｍＬバッファーを利用して洗浄した後、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を利用して菌株の染色体を分離した。
【００４９】
次に、上記分離した染色体をＲｅＡｆ−ＥｃｏＲＩプライマー（配列番号５）及びＲｅＡｂ１２５９プライマー（配列番号６）を使用して上記分離された染色体を鋳型にしてＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ菌株のβ−ケトチオラーゼ遺伝子（配列番号１）を増幅した。ＰＣＲ反応混合物１００μＬは、ｄＮＴＰ ２５０μＭ、プライマー各々２０ｐｍｏｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０バッファ １０μＬ、ＤＮＡ鋳型１００ｎｇ、ｐｆｕポリメラーゼ５ｕｎｉｔｓを添加し、９５℃で５分間初期変性過程を進行した後、９５℃で１分間変性、５０℃で１分間アニーリング及び７２℃で１分間重合過程を２５回繰り返した。
【００５０】
ＲｅＡｆ−ＥｃｏＲＩ：５′−ｇｇａａｔｔｃ ＡＴＧＡＣＴＧＡＣＧＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＡＴＣＣ−３′（配列番号５）
ＲｅＡｂ１２５９：５′−ｇｔｃ ｃａｃ ｔｃｃ ｔｔｇ ａｔｔ ｇｇｃ ｔｔｃ ｇ−３′（配列番号６）
【００５１】
また、同一の条件でＣａｈｂｄｆプライマー（配列番号７）、Ｃａｈｂｄｂ−ＸｂａＩプライマー（配列番号８）を利用してクロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）菌株（ＡＴＣＣ８２４）の（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子（配列番号２）を増幅した。
【００５２】
Ｃａｈｂｄｆ：５′−ＧＡＡ ＧＣＣ ＡＡＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧＡＡＡＡＡＧＧＴＡＴＧＴＧＴＴＡＴＡＧＧ−３′（配列番号７）
Ｃａｈｂｄｂ−ＸｂａＩ：５′−ｇｃ ｔｃｔａｇａ ｔｔａ ｔｔｔ ｔｇａ ａｔａ ａｔｃ ｇｔａ ｇａａ ａｃｃ−３′（配列番号８）
【００５３】
増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで精製し、これら２つの遺伝子をＰＣＲ反応を利用して融合（fusion）させた。まず、各々１ｐｍｏｌ濃度で２つの遺伝子を混合してＰＣＲのための鋳型として利用し、他の条件は、上記とすべて同一であり、重合過程を２．５分にして増幅を行った。増幅された遺伝子は、１％アガロースゲルで精製し、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ制限酵素でＤＮＡ断片を切断し、同一の制限酵素で切断したｐＴａｃ９９Ａベクター（Park and Lee, J.Bacteriol.185, 5391-5397, 2003)にライゲーションし、ｐＴａｃＲｅＡ−ＨＢＤを製作した（図４）。
【００５４】
実施例２：（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子を含有する組換えベクター（ｐＥＴ２１ａＢＣＨ、ｐＥＴ２８ｂＢＣＨ及びｐＫ２８ＢＣＨ）の製作
まず、セレウス菌（Bacillus cereus）（ＡＴＣＣ１４５７９）菌株をＬＢ液体培地で１８時間培養した後、実施例１と同一の方法で染色体を分離した。分離した染色体を鋳型にしてＡＣＨ＿ＮｄｅＩプライマー（配列番号９）及びＡＣＨ＿ＢａｍＨＩプライマー（配列番号１０）を利用して実施例１と同一の条件でＰＣＲを利用して３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ（ＢＣＨ）遺伝子（配列番号４）を増幅した。
【００５５】
ＡＣＨ＿ＮｄｅＩ５′−ＣＧＣ ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＣＴ ＧＡＡ ＣＡＡ ＧＴＴ ＴＴＡＴＴＴ−３′（配列番号９）
ＡＣＨ＿ＢａｍＨＩ５′−ＡＴＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＴＧＣ ＡＴＴ ＡＡＧ ＴＡＡ ＧＴＴ ＡＡＡ Ｇ−３′（配列番号１０）
【００５６】
増幅した遺伝子を実施例１と同一の条件に精製し、制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩを利用して切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）、ｐｅＥＴ２８Ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）及びｐＫ２８に各々ライゲーションし、ｐＥＴ２１ａＢＣＨ、ｐＥＴ２８ｂＢＣＨ及びｐＫ２８ＢＣＨを製作した（図５）。
【００５７】
上記ｐＫ２１ベクターは、ＰＥＴ２１ａベクターを制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩ制限酵素で切断した後、ＥＺ：：ＴＮ＜ＫＡＮ＞２トランスポゾン（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、ＵＳＡ；Ｃａｔ＃：ＭＯＤ １５０３）のプロモータ疑心部位をＫＡＮ２ Ｐ−ｂｇｌ ＩＩプライマー（配列番号１１）及びＫＡＮ２−Ｐ−ＸｂａＩプライマー（配列番号１２）を利用してＰＣＲで増幅した後、同一の制限酵素で切断した後にライゲーションして自体製作した。増幅したＤＮＡ配列は、配列番号１３に示した。
【００５８】
ＫＡＮ２ Ｐ−ｂｇｌ ＩＩ：ＴＡＴＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＡＡ ＣＣＡ ＴＣＡ ＴＣＧ ＡＴＧ ＡＡＴ ＴＧＴ（配列番号１１）
ＫＡＮ２−Ｐ−ＸｂａＩ：ＴＡＴ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＡＣ ＡＣＣ ＣＣＴ ＴＧＴ ＡＴＴ ＡＣＴ ＧＴＴ（配列番号１２）
ＥＺ：：ＴＮＫＡＮ２トランスポゾン：５′−ＴＡＣＡＣＡＴＣＴＣＡＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＧＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＴＴＡＣＡＴＴＧＣＡＣＡＡＧＡＴＡＡＡＡＡＴＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＧＡＡＣＡＡＴＡＡＡＡＣＴＧＴＣＴＧＣＴＴＡＣＡＴＡＡＡＣＡ ＧＴＡＡＴＡＣＡＡＧ ＧＧＧＴＧＴＴ−３′（配列番号１３）
【００５９】
実施例３：（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を含有する組換えベクター（ｐＥＴ２１ａＨＢＤ及びｐＫ２１ＨＢＤ）の製作
まず、実施例１で分離したクロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）（ＡＴＣＣ８２４）染色体を鋳型としてｈｂｄ＿ＮｄｅＩプライマー（配列番号１４）及びｈｂｄ＿ＢａｍＨＩプライマー（配列番号１５）を利用して実施例１と同一の条件で（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子（配列番号２）を増幅した。
【００６０】
ｈｂｄ＿ＮｄｅＩ：５′−ＡＴＡ ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＡＧ ＧＴＡ ＴＧＴ ＧＴＴ ＡＴＡ ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＧＴ−３′（配列番号１４）
ｈｂｄ＿ＢａｍＨＩ５′−ＡＴＡ ＧＧＡ ＴＴＣ ＴＴＡ ＴＴＴ ＴＧＡ ＡＴＡ ＡＴＣ ＧＴＡ ＧＡＡ ＡＣＣ ＴＴＴ−３′（配列番号１５）
【００６１】
増幅された遺伝子は、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＥＴ２１ａベクターとｐＫ２１ベクターとライゲーションし、ｐＥＴ２１ａＨＢＤ及びｐＫ２１ＨＢＤを製作した（図６）。
【００６２】
実施例４：（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＨＢＤ）遺伝子の活性確認
実施例３で製作したｐＥＴ２１ａＨＢＤを電気穿孔法を利用して大膓菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して形質転換し、ＬＢアンピシリン平板培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。培養されたコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ液体培地３ｍＬに接種し、振とう培養器（Jeio Tech社、韓国）で２００ｒｐｍ、３７℃、ＯＤ６００値が０．５になるまで培養した後、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加してタンパク質発現を誘導させた後、一晩培養した。その後、培養液を遠心分離して菌体を収得した後、超音波処理して細胞を破砕した後、遠心分離して無細胞抽出液（cell free extract）を確保した。このように確保した無細胞抽出液を酵素活性確認試料として利用した。
【００６３】
試料の（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性は、１ｍＭアセトアセチルＣｏＡ、３ｍＭ ＮＡＤＨ及び５ｍｇ／ｍＬ 無細胞抽出液２０μＬが含有された反応液を５分間３７℃で反応させた後、生成された（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡをＨＰＬＣ（ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）を利用して確認した。
【００６４】
ＨＰＬＣ条件は、移動相として水とアセトニトリルを９７：３割合で５分間流してから、アセトニトリルの割合を１５％まで２５分間増加させながら分析した。溶媒の流速は、１ｍＬ／ｍｉｎであり、Ｃ１８ Ｃａｐｃｅｌ ＰＡＫカラム（Ｓｈｉｓｈｅｉｄｏ、Ｊａｐａｎ）を利用し、生成される（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡは、２１０ｎｍで検出した。
【００６５】
その結果、表１に示されたように、実施例３で製造された（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する組換えベクターで形質転換された大膓菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は、活性型（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼを生産することを確認することができた。
【００６６】
【表１】
【００６７】
実施例５：（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼ（ＢＣＨ）遺伝子の活性確認
実施例２で製作したｐＥＴ２１ａＢＣＨを実施例４と同一の方法で大膓菌ＢＬ２１に形質転換させた後に培養して、無細胞抽出液を確保し、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ活性の確認に利用した。
【００６８】
３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ活性は、１ｍＭ（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ及び５ｍｇ／ｍＬ無細胞抽出液２０μＬが含有された反応液を３０分間３７℃で反応させた後、生成された３−ビドロキシ酪酸をＨＰＬＣ（ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）を利用して確認した。ＨＰＬＣは、実施例４と同一の条件で行った。
【００６９】
その結果、表２に示されたように、実施例２で製造された（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子を含有する組換えベクターで形質転換された大膓菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は、活性型３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼを生産することを確認することができた。
【００７０】
【表２】
【００７１】
実施例６：β−ケトチオラーゼ、ＨＢＤ及びＢＣＨ遺伝子を含有するベクターで形質転換された微生物の細胞抽出液を利用した（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造
実施例１乃至実施例３で製作したｐＴａｃＲｅＡ−ＨＢＤ、ｐＥＴ２１ａＢＣＨ及びｐＫ２８ＢＣＨを電気穿孔法を利用して同時に大膓菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させ、実施例４と同一の方法で無細胞抽出液を収得し、酵素活性の確認に利用した。
【００７２】
（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の生成は、１ｍＭアセチルＣｏＡ、３ｍＭ ＮＡＤＨ、及び５ｍｇ／ｍＬ無細胞抽出液２０μＬが含有された反応液を３０分間３７℃で反応させた溶液をＨＰＬＣ（ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）を利用して確認した。
【００７３】
分析は、実施例５と同一の方法で行い、加水分解されて生成されたＣｏＡを検出して測定した。
【００７４】
その結果、表３に示されたように、ｐＴａｃＲｅＡ−ＨＢＤ、ｐＥＴ２１ａＢＣＨ及びｐＫ２８ＢＣＨで形質転換された大膓菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は、活性型β−ケトチオラーゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼを生産することを確認することができた。
【００７５】
【表３】
【００７６】
実施例７：β−ケトチオラーゼ、ＨＢＤ、ＢＣＨ遺伝子を含有するベクター、上記組換えベクターで形質転換された微生物及びこれを利用した（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造（Ｉｎ−ｖｉｖｏ）
実施例１及び実施例２で製作したｐＴａｃＲｅＡ−ＨＢＤ及びｐＥＴ２８ｂＢＣＨを電気穿孔法を利用して大膓菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に同時に形質転換させ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬとカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ平板培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。培養されたコロニー２個を１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ液体培地３ｍＬが含まれた１５ｍＬチューブ（Ｆａｌｃｏｎ、ＵＳＡ）に接種し、３７℃で２００ｒｐｍに一晩振とう培養して種菌を培養した。このように培養された種菌をさらに５０ｍＬ２％グルコース及びアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ液体培地に接種し、３７℃で２００ｒｐｍで振とう培養して、ＯＤ６００が０．５になった時、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加してタンパク質発現を誘導した後、一晩培養した。
【００７７】
その後、培養液を遠心分離した後、上澄み液を収得し、ＨＰＬＣ分析を通じて生成された３−ビドロキシ酪酸を定量分析した。ＨＰＬＣ条件は、移動相として０．０１Ｎ硫酸を含有する水を利用し、流速は、０．６ｍＬ／ｍｉｎであった。カラムは、Ａｍｉｎｅｘ８７Ｈ（Ｂｉｏ−ｒａｄ、ＵＳＡ）を利用し、生成される３−ビドロキシ酪酸は、ＲＩ（Refractive Index）検出器を利用して測定し、その結果を表４に示した。
【００７８】
【表４】
【００７９】
また、さらに正確な定性分析及び定量分析のために、生成された３−ビドロキシ酪酸を含有する培養液を凍結乾燥した後、生成物をメチル化させ、メチル（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートのＧＣ−ＭＳＤ（質量分析）及びキラリティー分析を行った。分析は、ガスクロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を利用し、分析条件は、表４に示した。質量分析も行い、その結果でも、生成された産物が３−ビドロキシ酪酸であることを確認することができ、上記結果は、図８及び図９に示した。キラリティーの分析結果、光学純度９９．９％ｅｅ以上の（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸が生産されたことを確認し、鏡像体過剰率（Enantiomeric excess）（ｅｅ）値は、下記数式（１）から求めた。
【００８０】
【数１】
【００８１】
【表５】
【００８２】
実施例８：ｐＥＴ２１ａＢＣＨ−ＲｅＡ−ＨＢＤ、ｐＥＴ２１ａＢＣＨ−ＲｅＡ−ＲｅＨＢＤベクターの製作
実施例１と同一の方法でＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ来由のＨＢＤ（ＲｅＨＢＤ）遺伝子（配列番号３）をＲｅＨＢＤ−ＲＢＳ−ＵＰプライマー及びＲｅＨＢＤ−ＤＮ−ＸｈｏＩプライマーを利用して増幅した。
【００８３】
ＲｅＨＢＤ−ＲＢＳ−ＵＰ：５′−ＧＡＡＧＣＣＡＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧ−３′（配列番号１６）
ＲｅＨＢＤ−ＤＮ−ＸｈｏＩ：５′−ＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＡＣＧＴＡＣＡＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣ−３′（配列番号１７）
【００８４】
実施例１と同一の条件でＲｅＡｆ−ＥｃｏＲＩプライマー（配列番号５）とＲｅＨＢＤ−ＤＮ−ＸｈｏＩプライマー（配列番号１７）を利用してＲｅＡ遺伝子とＲｅＨＢＤ遺伝子を融合（fusion）してＲｅＡＲｅＨＢＤ遺伝子を完成した。また、実施例１で製作したｐＴａｃＲｅＡ−ＨＢＤベクターを鋳型として上記ＲｅＡｆ−ＥｃｏＲＩプライマーと上記ＲｅＨＢＤ−ＤＮ−ＸｈｏＩプライマーを利用してＲｅＡ−ＨＢＤ遺伝子を増幅した。上記融合して増幅された２つの遺伝子をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ制限酵素で処理し、実施例２で製作したｐＥＴ２１ａＢＣＨも同一の制限酵素で切断した後に精製してライゲーションし、ｐＥＴ２１ａＢＣＨ−ＲｅＡ−ＨＢＤ及びｐＥＴ２１ａＢＣＨ−ＲｅＡ−ＲｅＨＢＤを完成した。
【００８５】
ＨＢＤ−ＤＮ−ＸｈｏＩ：５′−ＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＴＡＡＴＣＧＴＡＧＡＡＡＣＣＴＴＴＴＣＣＴＧ−３′（配列番号１８）
【００８６】
実施例９：ｐＥＴ２１ａＢＣＨ−ＲｅＡ−ＨＢＤ、ｐＥＴ２１ａＢＣＨ−ＲｅＡ−ＲｅＨＢＤベクターで形質転換された大膓菌を利用した（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造
実施例８で製作したｐＥＴ２１ａＢＣＨ−ＲｅＡ−ＨＢＤ及びｐＥＴ２１ａ−ＢＣＨ−ＲｅＡ−ＲｅＨＢＤを電気穿孔法を利用して大膓菌Ｃｏｄｏｎ Ｐｌｕｓ（ＤＥ３）に各々形質転換させ、ＬＢ／アンピシリン平板培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。培養されたコロニー２個をＬＢ／アンピシリン培地３ｍＬが含まれた１５ｍＬ使い捨てチューブ（Ｆａｌｃｏｎ、ＵＳＡ）に接種し、３７℃で２００ｒｐｍで振とう培養して一晩培養した。培養された種菌をさらに１００ｍＬ２％グルコースを含有するＭＲ液体培地に接種し、３７℃で２００ｒｐｍで１０時間振とう培養して、１．５Ｌ発酵槽に接種して培養を開始した。培養開始後、ＯＤが１２０になった時、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加してタンパク質発現を誘導した後、２時間ごとに生成される（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸を実施例７と同一の方法で分析し、その結果、約１０ｇ／Ｌの（Ｓ）−３−ＨＢが生成された（図１０及び表６）。
【００８７】
【表６】
【００８８】
以上より、本発明内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は、ただ好ましい実施例に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものではないことは自明であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義される。
【００８９】
本発明の単純な変形乃至変更は、この分野における通常の知識を有する者によって容易に利用されることができ、このような変形や変更は、すべて本発明の領域に含まれるものと解すべきである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換え微生物を利用した光学活性（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルの合成方法に関し、さらに詳細には、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物；上記組み換え微生物を利用した（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造方法；β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子、アシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子及びリパーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸エステル製造用組み換え微生物及び上記組み換え微生物を利用した（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルは、プラスチック材料、芳香剤、医薬品、農薬など活用範囲が非常に広いキラル中間体としてその効用性が非常に大きい（Speciality Chemicals Magazine, April: 39, 2004）。例えば、エチル（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートを還元して多様な抗生剤とフェロモンなどを作る中間体物質である（Ｓ）−１、３−ブタンジオールを合成することができ（T. Ferreira et al., Tetrahedron, 46: 6311, 1990）、除草剤である（Ｓ）−スルカトールの前駆体として利用され（K. mori et al., Tetrahedron, 37: 1341, 1981）、ｂ−ラクタム系の抗生剤であるカルバペネムの前駆体としても利用され（T. Chiba et al., Chemistry letters, 16: 2187, 1987）、類似ビタミン（vitamin-like nutrient）であるＬ−カルニチンの前駆体としても利用される（B. -N. Zhou et al., Journal of American Chemical society, 105: 5925, 1983）。
【０００３】
既存のエステルの製造方法としては、プロキラル前駆体である３−ケトエステルを利用して触媒ジホスフィン−ルテニウム（diphosphine-ruthenium）で還元的不斉水素化（asymmetric reductive hydrogenation）する方法があるが（R. Noyori et al., Journal of the American Chemical Society, 109: 5856, 1987）、使用する金属触媒が非常に高価であり、純粋な基質を必要とし、水素化反応は、非常に高圧の反応器を必要とするという短所がある。また、酵母を全細胞触媒として使用してｂ−ケトエステルを生体触媒による還元（biocatalytic reduction）し、収率５８％、光学純度９４％ｅｅのエチル（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートを生産する方法は、微生物内に存在する多様なオキシドレダクターゼによって光学活性が低くなるという短所がある（Tetrahedron Letters, 34: 3949, 1993）。
【０００４】
微生物の代謝経路を操作してブドウ糖から生合成された光学活性（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカン酸を生産する報告は知られている（Lee et al., Biotechnol Bioeng, 65: 363, 1999;Lee and Lee., Appl Environ Microbiol, 69: 1295, 2003;Gao et al., FEMS Microbiol Lett, 213: 59, 2002）。（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカン酸を生産する経路は、大きく２つに分けることができる。第一に、生分解性高分子であるポリヒドロキシアルカン酸の自己分解を利用したこと（Lee et al., Biotechnol Bioeng, 65: 363, 1999;Lee and Lee., Appl Environ Microbiol, 69: 1295, 2003）、第二に、生分解性高分子の自己分解ではなく、ブドウ糖から、まず（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカノイルＣｏＡを生産し、生産された（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカノイルＣｏＡからＣｏＡを除去した後、（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカン酸を生産することである（Gao et al., FEMS Microbiol Lett, 213: 59, 2002）。第二の方法の場合、ブドウ糖からβ−ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）と、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）を利用してまず（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを生産し、生産された（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＣｏＡ除去することは、ホスホトランスブチラーぜ（ｐｔｂ）とブチリルキナーゼ（ＢｕＫ）を利用する（Gao et al., FEMS Microbiol Lett, 213: 59, 2002）。
【０００５】
光学活性（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートを生産する化学的経路と、生触媒経路が知られているが、微生物の代謝経路を操作してブドウ糖から生合成された光学活性（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステル生産することは未だ報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】T. Ferreira et al., Tetrahedron, 46: 6311, 1990
【非特許文献２】K. mori et al., Tetrahedron, 37: 1341, 1981
【非特許文献３】T. Chiba et al., Chemistry letters, 16: 2187, 1987
【非特許文献４】B. -N. Zhou et al., Journal of American Chemical society, 105: 5925, 1983
【非特許文献５】R. Noyori et al., Journal of the American Chemical Society, 109: 5856, 1987
【非特許文献６】Lee et al., Biotechnol Bioeng, 65: 363, 1999
【非特許文献７】Lee and Lee., Appl Environ Microbiol, 69: 1295, 2003
【非特許文献８】Gao et al., FEMS Microbiol Lett, 213: 59, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これより、本発明者は、光学活性（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルを生合成するために鋭意努力した結果、微生物の該当過程によって生成されたアセチルＣｏＡを高価の金属触媒や基質を使用せず、微生物に導入された組換え遺伝子によって代謝経路を操作することによって、工程が簡単であり、光学純度が高い（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルが生合成されることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明の主な目的は、（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物、及び上記組み換え微生物を培養することを含む（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステル製造用組み換え微生物、及び上記組み換え微生物を培養することを含む（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物を提供する。
【００１１】
また、本発明は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びホスホトランスブチラーぜをコーディングする遺伝子（ｐｔｂ）及びブチレートキナーゼをコーディングする遺伝子（Ｂｕｋ）で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、上記組み換え微生物を培養することを特徴とする（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、上記組み換え微生物の培養液または菌株抽出液をアセチル−ＣｏＡ、アセトアセチルＣｏＡ及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡで構成された群から選択される基質と反応させることを特徴とする（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子、アシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子及びリパーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸エステル製造用組み換え微生物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、上記組み換え微生物を培養することを特徴とする（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸エステルの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、微生物の該当過程によって生成されたアセチルＣｏＡを高価の金属触媒や基質を使用せず、微生物に導入された組換え遺伝子によって代謝経路を操作することによって、工程が簡単であり、光学純度が高い（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルの生合成方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】（Ｓ）−３−ＨＢ生合成経路を示す図である。
【図２】（Ｓ）−３−ＨＢ生合成経路を示す図である。
【図３】（Ｓ）−３−ＨＢエステルを合成する経路を示す図である。
【図４】ｐＴａｃＲｅＡ−ｈｂｄベクターの切断地図を示す図である。
【図５】ｐＥＴ２１ａＢＣＨベクターの切断地図を示す図である。
【図６】ｐＫ２８ＢＣＨ、ｐＥＴ２８ｂＢＣＨベクターの切断地図を示す図である。
【図７】ｐＥＴ２１ａＨＢＤ、ｐＫ２１ＨＢＤベクターの切断地図を示す図である。
【図８】本発明によって生産された（Ｓ）−３−ＨＢをメチル化させて分析したＧＣ−ＭＳＤ分析結果である。
【図９】本発明によって生産された（Ｓ）−３−ＨＢをメチル化させてキラリティーを分析した結果である。
【図１０】本発明による流加培養を用いた（Ｓ）−３−ＨＢを生産する時の時間プロファイル結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の方法によって製造される（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸は、化学式１に示されたように、（Ｒ）−３−ビドロキシ酪酸とは異なるキラリティーを有する光学活性化合物である。
【００１９】
【化１】
【００２０】
上記（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造のために、本発明は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された組み換え微生物を提供する。
【００２１】
本発明によるβ−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された組み換え微生物は、図１に示した生合成経路を経て（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸を生産する。
【００２２】
まず、ブドウ糖から該当過程を通じてアセチルＣｏＡが生成されれば、アセチルＣｏＡは、β−ケトチオラーゼによってアセトアセチルＣｏＡに転換され、上記アセトアセチルＣｏＡは、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼによって（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換され、最終的に、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡは、アシルＣｏＡヒドロラーゼによって（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸に転換されるようになる。
【００２３】
また、本発明は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びホスホトランスブチラーぜをコーディングする遺伝子（ｐｔｂ）及びブチレートキナーゼをコーディングする遺伝子（Ｂｕｋ）で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物を提供する。
【００２４】
本発明によるβ−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びホスホトランスブチラーぜをコーディングする遺伝子（ｐｔｂ）及びブチレートキナーゼをコーディングする遺伝子（Ｂｕｋ）で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物は、上記図２に示した経路を通じて（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸を生産するようになる。
【００２５】
ブドウ糖から該当過程を通じてアセチルＣｏＡが生成されれば、アセチルＣｏＡは、β−ケトチオラーゼによってアセトアセチルＣｏＡに転換され、上記アセトアセチルＣｏＡは、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼによって（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに転換され、上記（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡは、ホスホトランスブチラーぜ（Ｐｔｂ）またはホスホトランスアセチラーゼ（Ｐｔａ）によって（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルホスフェートに転換されて、上記（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルホスフェートは、ブチレートキナーゼ（ＢｕＫ）またはプロピオネートキナーゼ（Ｐｕｋ）によって最終的に（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸に転換されるようになる（図２）。
【００２６】
本発明の一具体例において、上記（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で構成された群のうち１つ以上の遺伝子を含有する１つ以上の組換えベクターによって形質転換されたものであることができる。
【００２７】
例えば、上記（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子を含有する組換えベクター、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を含有する組換えベクター及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子を含有する組換えベクターによって形質転換されたものであることができる。他の例において、上記（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を含有する組換えベクター及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子を含有する組換えベクターによって形質転換されたものであることができる。
【００２８】
本発明の一具体例において、上記β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子は、（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物の染色体に挿入されているものであることができる。
【００２９】
また、本発明は、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルの製造のために、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子、アシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子及びリパーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された組み換え微生物を提供する。
【００３０】
本発明による、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子、アシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子及びリパーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された組み換え微生物は、図３に示したように、上記図１の（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の生合成経路を経て生産された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸がリパーゼによってエステル化しながら、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートエステルを生成するようになる。
【００３１】
本発明において、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子、アシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子及びリパーゼをコーディングする遺伝子は、上記酵素をコーディングする遺伝子なら特別な制限なくいずれのものでも利用可能である。下記実施例においては、特定の遺伝子を利用しているが、本発明の遺伝子が実施例に開示された特定の遺伝子に限定されるものではないことは当業者に自明であろう。
【００３２】
本発明の一具体例において、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子は、配列番号１の塩基配列で表示されるものであることができる。
【００３３】
本発明の一具体例において、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子は、配列番号２または配列番号３の塩基配列で表示されるものであることができる。
【００３４】
本発明の一具体例において、アシルＣｏＡヒドロラーゼは、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼであることができる。本発明の一具体例において、上記（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼは、配列番号４の塩基配列によってコーディングされるものであることができる。
【００３５】
本発明において、ベクターは、適当な宿主内でＤＮＡを発現させることができる適当な発現調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または簡単に潜在的ゲノム挿入物であることができる。適当な宿主で形質転換されれば、ベクターは、宿主ゲノムと関係なく複製し機能することができるか、または一部の場合に、ゲノムその自体に統合されることができる。プラスミドが現在ベクターの最も通常的に使用される形態なので、本発明において、「プラスミド」及び「ベクター」は、時々に相互交換的に使用される。しかし、本発明は、当業界に知られた、または知られるようになることと同等な機能を有するベクターの他の形態をも含む。
【００３６】
「発現調節配列（expression control sequence）」という表現は、特定の宿主生物で作動可能に連結されたコーディング配列の発現に必須なＤＮＡ配列を意味する。このような調節配列は、転写を実施するためのプロモータ、転写を調節するための任意のオペレータ配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列、及び転写及び解読の終決を調節する配列を含む。例えば、原核生物に適した調節配列は、プロモータ、任意のオペレータ配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーがこれに含まれる。プラスミドにおいて遺伝子の発現量に最も影響を及ぼす因子は、プロモータである。高発現用のプロモータとして、ＳＲαプロモータ、サイトメガロウイルス来由プロモータなどが好ましく使用されることができる。
【００３７】
本発明のＤＮＡ配列を発現させるために、非常に多様な発現調節配列のうちいずれのものでもベクターに使用されることができる。有用な発現調節配列の例として、例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期及び後期プロモータ、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣまたはＴＲＣシステム、Ｔ３及びＴ７プロモータ、ファージラムダの主要オペレータ及びプロモータ領域、ｆｄコードタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他のグリコール分解酵素に対するプロモータ、上記ホスファターゼのプロモータ、例えばＰｈｏ５、酵母アルファ−交配システムのプロモータ及び原核細胞または真核細胞またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節するものとして知られた構成と誘導のその他の配列及びこれらの様々な組合が含まれる。
【００３８】
核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置されるとき、「作動可能に連結（operably linked）」される。適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）は、調節配列に結合されるとき、遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列であることができる。例えば、前配列（pre-sequence）または分泌リーダー（leader）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加する全タンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモータまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されるか；またはリボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されるか；またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コーディング配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また、分泌リーダーの場合、接触し、リーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは、接触する必要がない。これら配列の連結は、便利な制限酵素部位でライゲーション（連結）によって行われる。このような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（oligonucleotide adaptor）またはリンカー（linker）を使用する。
【００３９】
本願発明において使用された用語「発現ベクター」は、通常、異種のＤＮＡ断片が挿入された組換えキャリア（recombinant carrier）であって、一般的に、二重鎖のＤＮＡ断片を意味する。ここで、異種のＤＮＡは、宿主細胞で天然的に発見されないＤＮＡである異形ＤＮＡを意味する。発現ベクターは、宿主細胞内にあれば、宿主染色体ＤＮＡと関係なく複製することができ、ベクターの数個のコピー及びその挿入された（異種）ＤＮＡが生成されることができる。
【００４０】
当業界に周知のように、宿主細胞で形質感染遺伝子の発現水準を高めるためには、当該遺伝子が選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び解読発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは、発現調節配列及び当該遺伝子は、細菌選択マーカー及び複製起点（replication origin）を一緒に含んでいる１つの発現ベクター内に含まれるようになる。発現宿主が真核細胞の場合には、発現ベクターは、真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含まなければならない。
【００４１】
本発明において、組換えベクターとしては、プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミドベクター、ＹＡＣ（Yeast Artificial Chromosome）ベクターなどを含む多様なベクターが導入されることができる。例えば、プラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たり数百個のプラスミドベクターを含むように複製が効率的に行われるようにする複製起点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞が選ばれるようにする抗生剤耐性遺伝子及び（ｃ）外来ＤＮＡ断片が挿入されることができる制限酵素切断部位を含む構造を有することができる。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用すれば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーション（ligation）することができる。
【００４２】
本発明による組換えベクターは、適切な宿主細胞で通常の方法によって形質転換することができる。宿主細胞としては、バクテリア、酵母、かびなどが可能であるが、これらに限定されるものではない。本発明に好ましく使用される宿主細胞は、原核細胞であり、大膓菌が好ましい。適当な原核宿主細胞の例として、Ｅ.ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１、Ｅ.ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５ａ、Ｅ.ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０１、Ｅ.ｃｏｌｉ Ｋ１２菌株２９４、Ｅ.ｃｏｌｉ菌株Ｗ３１１０、Ｅ.ｃｏｌｉ菌株Ｘ１７７６、Ｅ.ｃｏｌｉ ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｅ.ｃｏｌｉ Ｂなどを含む。しかし、ＦＭＢ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８及びＮＭ５３９のようなＥ.ｃｏｌｉ菌株及び他の原核生物の種及び属なども使用されることができる。前述のＥ.ｃｏｌｉに加えて、アグロバクテリウムＡ４のようなアグロバクテリウム属菌株、枯草菌（Bacillus subtilis）のようなバシラス（bacilli）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）または セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）のような他の腸内細菌及び多様なシュードモナス（Pseudomonas）属菌株が宿主細胞として利用されることができ、本発明は、上記記述した例示に制限されるものではない。
【００４３】
また、原核細胞の形質転換は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａの１．８２セクションに記述されたカルシウムクロライド方法を使用して容易に達成されることができる。選択的に、電気穿孔法（Neumann et al., EMBO J., 1: 841(1982))も、このような細胞を形質転換するのに使用されることができる。
【００４４】
また、本発明は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された組み換え微生物を製造し、上記組み換え微生物を培養することを含む（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造方法を提供する。上記培養は、適当な炭素源を含む培地で行われることができる。
【００４５】
また、本発明は、上記組み換え微生物の培養液または菌株抽出液をアセチル−ＣｏＡ、アセトアセチルＣｏＡ及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡで構成された群から選択される基質と反応させることを特徴とする（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造方法を提供する。
【００４６】
また、本発明は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子、アシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子及びリパーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸エステル製造用組み換え微生物を製造し、上記組み換え微生物を培養することを含む（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸エステルの製造方法を提供する。
【００４７】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
実施例１：β−ケトチオラーゼ及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を含有する組換えベクター（ｐＴａｃＲｅＡ−ＨＢＤ）の製作
まず、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６菌株（ＡＴＣＣ１７６９９）をＬＢ液体培地３ｍＬに１８時間培養した後、培養液を遠心分離して細胞を収得し、１０ｍＬバッファーを利用して洗浄した後、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を利用して菌株の染色体を分離した。
【００４９】
次に、上記分離した染色体をＲｅＡｆ−ＥｃｏＲＩプライマー（配列番号５）及びＲｅＡｂ１２５９プライマー（配列番号６）を使用して上記分離された染色体を鋳型にしてＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ菌株のβ−ケトチオラーゼ遺伝子（配列番号１）を増幅した。ＰＣＲ反応混合物１００μＬは、ｄＮＴＰ ２５０μＭ、プライマー各々２０ｐｍｏｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０バッファ １０μＬ、ＤＮＡ鋳型１００ｎｇ、ｐｆｕポリメラーゼ５ｕｎｉｔｓを添加し、９５℃で５分間初期変性過程を進行した後、９５℃で１分間変性、５０℃で１分間アニーリング及び７２℃で１分間重合過程を２５回繰り返した。
【００５０】
ＲｅＡｆ−ＥｃｏＲＩ：５′−ｇｇａａｔｔｃ ＡＴＧＡＣＴＧＡＣＧＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＡＴＣＣ−３′（配列番号５）
ＲｅＡｂ１２５９：５′−ｇｔｃ ｃａｃ ｔｃｃ ｔｔｇ ａｔｔ ｇｇｃ ｔｔｃ ｇ−３′（配列番号６）
【００５１】
また、同一の条件でＣａｈｂｄｆプライマー（配列番号７）、Ｃａｈｂｄｂ−ＸｂａＩプライマー（配列番号８）を利用してクロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）菌株（ＡＴＣＣ８２４）の（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子（配列番号２）を増幅した。
【００５２】
Ｃａｈｂｄｆ：５′−ＧＡＡ ＧＣＣ ＡＡＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧＡＡＡＡＡＧＧＴＡＴＧＴＧＴＴＡＴＡＧＧ−３′（配列番号７）
Ｃａｈｂｄｂ−ＸｂａＩ：５′−ｇｃ ｔｃｔａｇａ ｔｔａ ｔｔｔ ｔｇａ ａｔａ ａｔｃ ｇｔａ ｇａａ ａｃｃ−３′（配列番号８）
【００５３】
増幅された遺伝子を１％アガロースゲルで精製し、これら２つの遺伝子をＰＣＲ反応を利用して融合（fusion）させた。まず、各々１ｐｍｏｌ濃度で２つの遺伝子を混合してＰＣＲのための鋳型として利用し、他の条件は、上記とすべて同一であり、重合過程を２．５分にして増幅を行った。増幅された遺伝子は、１％アガロースゲルで精製し、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ制限酵素でＤＮＡ断片を切断し、同一の制限酵素で切断したｐＴａｃ９９Ａベクター（Park and Lee, J.Bacteriol.185, 5391-5397, 2003)にライゲーションし、ｐＴａｃＲｅＡ−ＨＢＤを製作した（図４）。
【００５４】
実施例２：（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子を含有する組換えベクター（ｐＥＴ２１ａＢＣＨ、ｐＥＴ２８ｂＢＣＨ及びｐＫ２８ＢＣＨ）の製作
まず、セレウス菌（Bacillus cereus）（ＡＴＣＣ１４５７９）菌株をＬＢ液体培地で１８時間培養した後、実施例１と同一の方法で染色体を分離した。分離した染色体を鋳型にしてＡＣＨ＿ＮｄｅＩプライマー（配列番号９）及びＡＣＨ＿ＢａｍＨＩプライマー（配列番号１０）を利用して実施例１と同一の条件でＰＣＲを利用して３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ（ＢＣＨ）遺伝子（配列番号４）を増幅した。
【００５５】
ＡＣＨ＿ＮｄｅＩ５′−ＣＧＣ ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＣＴ ＧＡＡ ＣＡＡ ＧＴＴ ＴＴＡＴＴＴ−３′（配列番号９）
ＡＣＨ＿ＢａｍＨＩ５′−ＡＴＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＴＧＣ ＡＴＴ ＡＡＧ ＴＡＡ ＧＴＴ ＡＡＡ Ｇ−３′（配列番号１０）
【００５６】
増幅した遺伝子を実施例１と同一の条件に精製し、制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩを利用して切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）、ｐｅＥＴ２８Ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）及びｐＫ２８に各々ライゲーションし、ｐＥＴ２１ａＢＣＨ、ｐＥＴ２８ｂＢＣＨ及びｐＫ２８ＢＣＨを製作した（図５）。
【００５７】
上記ｐＫ２１ベクターは、ＰＥＴ２１ａベクターを制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩ制限酵素で切断した後、ＥＺ：：ＴＮ＜ＫＡＮ＞２トランスポゾン（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、ＵＳＡ；Ｃａｔ＃：ＭＯＤ １５０３）のプロモータ疑心部位をＫＡＮ２ Ｐ−ｂｇｌ ＩＩプライマー（配列番号１１）及びＫＡＮ２−Ｐ−ＸｂａＩプライマー（配列番号１２）を利用してＰＣＲで増幅した後、同一の制限酵素で切断した後にライゲーションして自体製作した。増幅したＤＮＡ配列は、配列番号１３に示した。
【００５８】
ＫＡＮ２ Ｐ−ｂｇｌ ＩＩ：ＴＡＴＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＣＡＡ ＣＣＡ ＴＣＡ ＴＣＧ ＡＴＧ ＡＡＴ ＴＧＴ（配列番号１１）
ＫＡＮ２−Ｐ−ＸｂａＩ：ＴＡＴ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＡＣ ＡＣＣ ＣＣＴ ＴＧＴ ＡＴＴ ＡＣＴ ＧＴＴ（配列番号１２）
ＥＺ：：ＴＮＫＡＮ２トランスポゾン：５′−ＴＡＣＡＣＡＴＣＴＣＡＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＧＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＴＣＴＣＴＧＡＴＧＴＴＡＣＡＴＴＧＣＡＣＡＡＧＡＴＡＡＡＡＡＴＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＧＡＡＣＡＡＴＡＡＡＡＣＴＧＴＣＴＧＣＴＴＡＣＡＴＡＡＡＣＡ ＧＴＡＡＴＡＣＡＡＧ ＧＧＧＴＧＴＴ−３′（配列番号１３）
【００５９】
実施例３：（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を含有する組換えベクター（ｐＥＴ２１ａＨＢＤ及びｐＫ２１ＨＢＤ）の製作
まず、実施例１で分離したクロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）（ＡＴＣＣ８２４）染色体を鋳型としてｈｂｄ＿ＮｄｅＩプライマー（配列番号１４）及びｈｂｄ＿ＢａｍＨＩプライマー（配列番号１５）を利用して実施例１と同一の条件で（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子（配列番号２）を増幅した。
【００６０】
ｈｂｄ＿ＮｄｅＩ：５′−ＡＴＡ ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＡＧ ＧＴＡ ＴＧＴ ＧＴＴ ＡＴＡ ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＧＴ−３′（配列番号１４）
ｈｂｄ＿ＢａｍＨＩ５′−ＡＴＡ ＧＧＡ ＴＴＣ ＴＴＡ ＴＴＴ ＴＧＡ ＡＴＡ ＡＴＣ ＧＴＡ ＧＡＡ ＡＣＣ ＴＴＴ−３′（配列番号１５）
【００６１】
増幅された遺伝子は、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で切断した後、同一の制限酵素で切断したｐＥＴ２１ａベクターとｐＫ２１ベクターとライゲーションし、ｐＥＴ２１ａＨＢＤ及びｐＫ２１ＨＢＤを製作した（図６）。
【００６２】
実施例４：（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＨＢＤ）遺伝子の活性確認
実施例３で製作したｐＥＴ２１ａＨＢＤを電気穿孔法を利用して大膓菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して形質転換し、ＬＢアンピシリン平板培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。培養されたコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ液体培地３ｍＬに接種し、振とう培養器（Jeio Tech社、韓国）で２００ｒｐｍ、３７℃、ＯＤ６００値が０．５になるまで培養した後、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加してタンパク質発現を誘導させた後、一晩培養した。その後、培養液を遠心分離して菌体を収得した後、超音波処理して細胞を破砕した後、遠心分離して無細胞抽出液（cell free extract）を確保した。このように確保した無細胞抽出液を酵素活性確認試料として利用した。
【００６３】
試料の（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性は、１ｍＭアセトアセチルＣｏＡ、３ｍＭ ＮＡＤＨ及び５ｍｇ／ｍＬ 無細胞抽出液２０μＬが含有された反応液を５分間３７℃で反応させた後、生成された（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡをＨＰＬＣ（ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）を利用して確認した。
【００６４】
ＨＰＬＣ条件は、移動相として水とアセトニトリルを９７：３割合で５分間流してから、アセトニトリルの割合を１５％まで２５分間増加させながら分析した。溶媒の流速は、１ｍＬ／ｍｉｎであり、Ｃ１８ Ｃａｐｃｅｌ ＰＡＫカラム（Ｓｈｉｓｈｅｉｄｏ、Ｊａｐａｎ）を利用し、生成される（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡは、２１０ｎｍで検出した。
【００６５】
その結果、表１に示されたように、実施例３で製造された（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する組換えベクターで形質転換された大膓菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は、活性型（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼを生産することを確認することができた。
【００６６】
【表１】
【００６７】
実施例５：（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼ（ＢＣＨ）遺伝子の活性確認
実施例２で製作したｐＥＴ２１ａＢＣＨを実施例４と同一の方法で大膓菌ＢＬ２１に形質転換させた後に培養して、無細胞抽出液を確保し、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ活性の確認に利用した。
【００６８】
３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ活性は、１ｍＭ（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ及び５ｍｇ／ｍＬ無細胞抽出液２０μＬが含有された反応液を３０分間３７℃で反応させた後、生成された３−ビドロキシ酪酸をＨＰＬＣ（ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）を利用して確認した。ＨＰＬＣは、実施例４と同一の条件で行った。
【００６９】
その結果、表２に示されたように、実施例２で製造された（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子を含有する組換えベクターで形質転換された大膓菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は、活性型３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼを生産することを確認することができた。
【００７０】
【表２】
【００７１】
実施例６：β−ケトチオラーゼ、ＨＢＤ及びＢＣＨ遺伝子を含有するベクターで形質転換された微生物の細胞抽出液を利用した（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造
実施例１乃至実施例３で製作したｐＴａｃＲｅＡ−ＨＢＤ、ｐＥＴ２１ａＢＣＨ及びｐＫ２８ＢＣＨを電気穿孔法を利用して同時に大膓菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させ、実施例４と同一の方法で無細胞抽出液を収得し、酵素活性の確認に利用した。
【００７２】
（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の生成は、１ｍＭアセチルＣｏＡ、３ｍＭ ＮＡＤＨ、及び５ｍｇ／ｍＬ無細胞抽出液２０μＬが含有された反応液を３０分間３７℃で反応させた溶液をＨＰＬＣ（ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）を利用して確認した。
【００７３】
分析は、実施例５と同一の方法で行い、加水分解されて生成されたＣｏＡを検出して測定した。
【００７４】
その結果、表３に示されたように、ｐＴａｃＲｅＡ−ＨＢＤ、ｐＥＴ２１ａＢＣＨ及びｐＫ２８ＢＣＨで形質転換された大膓菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は、活性型β−ケトチオラーゼ、３−ヒドロキシイソブチリルＣｏＡヒドロラーゼ及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼを生産することを確認することができた。
【００７５】
【表３】
【００７６】
実施例７：β−ケトチオラーゼ、ＨＢＤ、ＢＣＨ遺伝子を含有するベクター、上記組換えベクターで形質転換された微生物及びこれを利用した（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造（Ｉｎ−ｖｉｖｏ）
実施例１及び実施例２で製作したｐＴａｃＲｅＡ−ＨＢＤ及びｐＥＴ２８ｂＢＣＨを電気穿孔法を利用して大膓菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に同時に形質転換させ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬとカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ平板培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。培養されたコロニー２個を１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ液体培地３ｍＬが含まれた１５ｍＬチューブ（Ｆａｌｃｏｎ、ＵＳＡ）に接種し、３７℃で２００ｒｐｍに一晩振とう培養して種菌を培養した。このように培養された種菌をさらに５０ｍＬ２％グルコース及びアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ液体培地に接種し、３７℃で２００ｒｐｍで振とう培養して、ＯＤ６００が０．５になった時、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加してタンパク質発現を誘導した後、一晩培養した。
【００７７】
その後、培養液を遠心分離した後、上澄み液を収得し、ＨＰＬＣ分析を通じて生成された３−ビドロキシ酪酸を定量分析した。ＨＰＬＣ条件は、移動相として０．０１Ｎ硫酸を含有する水を利用し、流速は、０．６ｍＬ／ｍｉｎであった。カラムは、Ａｍｉｎｅｘ８７Ｈ（Ｂｉｏ−ｒａｄ、ＵＳＡ）を利用し、生成される３−ビドロキシ酪酸は、ＲＩ（Refractive Index）検出器を利用して測定し、その結果を表４に示した。
【００７８】
【表４】
【００７９】
また、さらに正確な定性分析及び定量分析のために、生成された３−ビドロキシ酪酸を含有する培養液を凍結乾燥した後、生成物をメチル化させ、メチル（Ｓ）−３−ヒドロキシブチレートのＧＣ−ＭＳＤ（質量分析）及びキラリティー分析を行った。分析は、ガスクロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を利用し、分析条件は、表４に示した。質量分析も行い、その結果でも、生成された産物が３−ビドロキシ酪酸であることを確認することができ、上記結果は、図８及び図９に示した。キラリティーの分析結果、光学純度９９．９％ｅｅ以上の（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸が生産されたことを確認し、鏡像体過剰率（Enantiomeric excess）（ｅｅ）値は、下記数式（１）から求めた。
【００８０】
【数１】
【００８１】
【表５】
【００８２】
実施例８：ｐＥＴ２１ａＢＣＨ−ＲｅＡ−ＨＢＤ、ｐＥＴ２１ａＢＣＨ−ＲｅＡ−ＲｅＨＢＤベクターの製作
実施例１と同一の方法でＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ来由のＨＢＤ（ＲｅＨＢＤ）遺伝子（配列番号３）をＲｅＨＢＤ−ＲＢＳ−ＵＰプライマー及びＲｅＨＢＤ−ＤＮ−ＸｈｏＩプライマーを利用して増幅した。
【００８３】
ＲｅＨＢＤ−ＲＢＳ−ＵＰ：５′−ＧＡＡＧＣＣＡＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧ−３′（配列番号１６）
ＲｅＨＢＤ−ＤＮ−ＸｈｏＩ：５′−ＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＡＣＧＴＡＣＡＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣ−３′（配列番号１７）
【００８４】
実施例１と同一の条件でＲｅＡｆ−ＥｃｏＲＩプライマー（配列番号５）とＲｅＨＢＤ−ＤＮ−ＸｈｏＩプライマー（配列番号１７）を利用してＲｅＡ遺伝子とＲｅＨＢＤ遺伝子を融合（fusion）してＲｅＡＲｅＨＢＤ遺伝子を完成した。また、実施例１で製作したｐＴａｃＲｅＡ−ＨＢＤベクターを鋳型として上記ＲｅＡｆ−ＥｃｏＲＩプライマーと上記ＲｅＨＢＤ−ＤＮ−ＸｈｏＩプライマーを利用してＲｅＡ−ＨＢＤ遺伝子を増幅した。上記融合して増幅された２つの遺伝子をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ制限酵素で処理し、実施例２で製作したｐＥＴ２１ａＢＣＨも同一の制限酵素で切断した後に精製してライゲーションし、ｐＥＴ２１ａＢＣＨ−ＲｅＡ−ＨＢＤ及びｐＥＴ２１ａＢＣＨ−ＲｅＡ−ＲｅＨＢＤを完成した。
【００８５】
ＨＢＤ−ＤＮ−ＸｈｏＩ：５′−ＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＴＡＡＴＣＧＴＡＧＡＡＡＣＣＴＴＴＴＣＣＴＧ−３′（配列番号１８）
【００８６】
実施例９：ｐＥＴ２１ａＢＣＨ−ＲｅＡ−ＨＢＤ、ｐＥＴ２１ａＢＣＨ−ＲｅＡ−ＲｅＨＢＤベクターで形質転換された大膓菌を利用した（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造
実施例８で製作したｐＥＴ２１ａＢＣＨ−ＲｅＡ−ＨＢＤ及びｐＥＴ２１ａ−ＢＣＨ−ＲｅＡ−ＲｅＨＢＤを電気穿孔法を利用して大膓菌Ｃｏｄｏｎ Ｐｌｕｓ（ＤＥ３）に各々形質転換させ、ＬＢ／アンピシリン平板培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。培養されたコロニー２個をＬＢ／アンピシリン培地３ｍＬが含まれた１５ｍＬ使い捨てチューブ（Ｆａｌｃｏｎ、ＵＳＡ）に接種し、３７℃で２００ｒｐｍで振とう培養して一晩培養した。培養された種菌をさらに１００ｍＬ２％グルコースを含有するＭＲ液体培地に接種し、３７℃で２００ｒｐｍで１０時間振とう培養して、１．５Ｌ発酵槽に接種して培養を開始した。培養開始後、ＯＤが１２０になった時、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加してタンパク質発現を誘導した後、２時間ごとに生成される（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸を実施例７と同一の方法で分析し、その結果、約１０ｇ／Ｌの（Ｓ）−３−ＨＢが生成された（図１０及び表６）。
【００８７】
【表６】
【００８８】
以上より、本発明内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は、ただ好ましい実施例に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものではないことは自明であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義される。
【００８９】
本発明の単純な変形乃至変更は、この分野における通常の知識を有する者によって容易に利用されることができ、このような変形や変更は、すべて本発明の領域に含まれるものと解すべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物。
【請求項２】
β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子は、配列番号１の塩基配列で表示される、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項３】
（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子は、配列番号２または配列番号３の塩基配列で表示される、 請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項４】
アシルＣｏＡヒドロラーゼは、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼである、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項５】
（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼは、配列番号４の塩基配列によってコーディングされる 請求項４に記載の組み換え微生物。
【請求項６】
上記組み換え微生物は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で構成された群のうち１つ以上の遺伝子を含有する１つ以上の組換えベクターによって形質転換されたものである、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項７】
β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された組み換え微生物を製造する工程、ならびに
上記組み換え微生物を培養する工程を含む、（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造方法。
【請求項８】
β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された組み換え微生物の培養液または菌株抽出液を、アセチル−ＣｏＡ、アセトアセチルＣｏＡ及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからなる群から選択される基質と反応させる工程を含む（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造方法。
【請求項９】
β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子、アシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子及びリパーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸エステル製造用組み換え微生物。
【請求項１０】
β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子、アシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子及びリパーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸エステル製造用組み換え微生物を製造する工程、
上記組み換え微生物を培養する工程を含む、（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【請求項１】
β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸製造用組み換え微生物。
【請求項２】
β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子は、配列番号１の塩基配列で表示される、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項３】
（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子は、配列番号２または配列番号３の塩基配列で表示される、 請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項４】
アシルＣｏＡヒドロラーゼは、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼである、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項５】
（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡヒドロラーゼは、配列番号４の塩基配列によってコーディングされる 請求項４に記載の組み換え微生物。
【請求項６】
上記組み換え微生物は、β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で構成された群のうち１つ以上の遺伝子を含有する１つ以上の組換えベクターによって形質転換されたものである、請求項１に記載の組み換え微生物。
【請求項７】
β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された組み換え微生物を製造する工程、ならびに
上記組み換え微生物を培養する工程を含む、（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造方法。
【請求項８】
β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子及びアシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された組み換え微生物の培養液または菌株抽出液を、アセチル−ＣｏＡ、アセトアセチルＣｏＡ及び（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからなる群から選択される基質と反応させる工程を含む（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸の製造方法。
【請求項９】
β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子、アシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子及びリパーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸エステル製造用組み換え微生物。
【請求項１０】
β−ケトチオラーゼをコーディングする遺伝子、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子、アシルＣｏＡヒドロラーゼをコーディングする遺伝子及びリパーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸エステル製造用組み換え微生物を製造する工程、
上記組み換え微生物を培養する工程を含む、（Ｓ）−３−ビドロキシ酪酸エステルの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１０−５３５４９７（Ｐ２０１０−５３５４９７Ａ）
【公表日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１９８５２（Ｐ２０１０−５１９８５２）
【出願日】平成２０年６月１０日（２００８．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００３２１７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２０２７９
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５００２３９８２３）エルジー・ケム・リミテッド (1,221)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１０日（２００８．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００３２１７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２０２７９
【国際公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【出願人】（５００２３９８２３）エルジー・ケム・リミテッド (1,221)
【Ｆターム（参考）】
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