組換えフィブリノゲン
本発明は、フィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖をコードするヌクレオチド配列に関する。配列は、真核細胞培養系での発現に最適化されている。このような最適化されたヌクレオチド配列は、インタクト形態の組換えフィブリノゲンやその変異体の真核細胞培養系での効率的な発現を可能にする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えフィブリノゲン、それを哺乳動物細胞において高レベルで産生する方法、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィブリノゲンは、主に肝実質細胞によりヒト体内で合成される可溶性の血漿糖タンパク質である。これは、ジスルフィド架橋で繋がれた、Ａα、Ｂβ、およびγと表される３つのポリペプチド鎖２対からなる二量体分子である。この３つのポリペプチド鎖は、３つの別々の遺伝子によってコードされている。野生型Ａα鎖は、６２５アミノ酸の前駆体として合成され、６１０アミノ酸のタンパク質として血漿中に存在し、Ｂβは４６１個のアミノ酸を含み、γ鎖は４１１個のアミノ酸を含む。３つのポリペプチドは、３つのｍＲＮＡから個別に合成される。３つの構成要素鎖（Ａα、Ｂβ、およびγ）の６本鎖２量体（Ａα、Ｂβ、γ）２としてのその最終形態への会合は、小胞体（ＥＲ）の内腔で起こる。
【０００３】
フィブリノゲンは、高濃度（１〜２ｇ／Ｌ）で血液中を循環し、高い不均一性を示す。変動は、遺伝的多型、グリコシル化やリン酸化の違い、Ａα鎖のカルボキシ末端部分の（部分的）タンパク質分解、および選択的スプライシングにより生じる（総説については、Ｄｅ ＭａａｔおよびＶｅｒｓｃｈｕｕｒ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１２，３７７；Ｌａｕｒｅｎｓら（２００６）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．４，９３２；Ｈｅｎｓｃｈｅｎ−Ｅｄｍａｎ（２００１）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３６，５８０を参照されたい）。各個体で約１００万個の異なるフィブリノゲン分子が循環していると推測されている。フィブリノゲン全体のごく一部（ほとんどの場合、数パーセント以下）を占めるに過ぎない、これらの変異体のほとんどは、機能と構造が異なる。Ａα鎖のカルボキシ末端部分のタンパク質分解により、明白に異なる分子量を有する３つの主な循環型フィブリノゲンが生じる。フィブリノゲンは、高分子量型（ＨＭＷ；分子量３４０ｋＤａ；循環中の優勢型のＡα鎖は、６１０個のアミノ酸を含む）で合成される。Ａα鎖のうちの１つが分解されると、低分子量型（ＬＭＷ；ＭＷ＝３０５ｋＤａ）が生じ、ＬＭＷ’型（２７０ｋＤａ）は、両方のＡα鎖がカルボキシ末端で部分分解された変異体である。正常血液中では、フィブリノゲンの５０〜７０％がＨＭＷであり、２０〜５０％が１つまたは２つの分解されたＡα鎖を有するフィブリノゲンである（ｄｅ ＭａａｔおよびＶｅｒｓｃｈｕｕｒ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１２，３７７）。ＨＭＷ変異体とＬＭＷ’変異体は、凝固時間とフィブリンポリマーの構造に明確な相違を示す（Ｈａｓｅｇａｗａ Ｎ，Ｓａｓａｋｉ Ｓ．（１９９０）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．５７，１８３）。
【０００４】
選択的スプライシングの結果であるよく知られた変異体は、いわゆるγ’変異体とＦｉｂ４２０変異体である。
【０００５】
γ’変異体は、γ鎖全体の約８％に相当する。これは、最も豊富に存在するγ鎖に対する４１１個のアミノ酸ではなく、４２７個のアミノ酸からなり、４個のＣ末端アミノ酸（ＡＧＤＶ）は、２個の硫酸化チロシンを含む２０個のアミノ酸に置き換わっている。フィブリノゲンγ’鎖は、血小板凝集の調節に極めて重要である血小板フィブリノゲン受容体ＩＩｂβ３に結合することができない。
【０００６】
４２０ｋＤａの分子量を有するＦｉｂ４２０変異体は、循環フィブリノゲン全体の１〜３％を占める（ｄｅ ＭａａｔおよびＶｅｒｓｃｈｕｕｒ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１２，３７７）。選択的スプライシングにより、余分なオープンリーディングフレームがＡα鎖のＣ末端に含まれ、その結果、Ａα鎖が２３７アミノ酸伸長する。追加のアミノ酸はノジュール構造を形成する。
【０００７】
血漿由来フィブリノゲンは、止血するためにおよび血液や体液の損失を減らすために外科的介入時に臨床適用される市販のフィブリンシーラントの重要な成分である。さらに、これは、フィブリンの凝集特性を用いて組織の接着を促進するためにおよび創傷治癒を改善するために使用される。フィブリノゲンは、遺伝性フィブリノゲン血症患者や後天性フィブリノゲン欠損症患者のフィブリノゲン欠損を補うためにも臨床的に使用されている。高投薬量のフィブリノゲン（３〜１０グラム）の静脈内投与は、血液凝固を正常化させ、様々な臨床的状況における重篤な出血を止めるまたは防ぐことが示されている。
【０００８】
組換えによるヒトフィブリノゲン産生は、野生型（ＨＭＷ）フォーマットであれ、変異体として（例えば、Ｆｉｂ４２０として）であれ、血漿由来材料の使用に優る多くの利点を有する。これらの利点には、その好ましい安全性プロファイル、混ざりけがない形で変異体を作製することができる可能性、および無制限の供給が含まれる。しかしながら、これを経済的に実行可能な形で産生するためには、インタクトで機能的なフィブリノゲンの高い発現レベルが必要となる。さらに、特定の用途（例えば、静脈（ＩＶ）止血剤としてのフィブリノゲンの使用）のために、適切な翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）が必要となる。
【０００９】
翻訳後修飾のため、哺乳動物系での発現が好ましい。それゆえ、生物活性のある組換えフィブリノゲンが、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）（例えば、Ｆａｒｒｅｌｌら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，９４１４）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、Ｌｏｒｄ（米国特許第６０３７４５７号）、Ｂｉｎｎｉｅら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２，１０７）、またはアフリカミドリザル由来ＣＯＳ細胞（例えば、Ｒｏｙら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，４７５８）などの、様々な細胞で発現されている。しかしながら、これらの発現レベルは、わずか１〜１５μｇ／ｍｌ程度であり、臨床現場で必要とされる大量の血漿フィブリノゲンの代わりにするには不十分であると考えられる。さらに、酵母のピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）でヒトフィブリノゲンを発現させると８μｇ／ｍｌ生産されたが、これも商業的製造に十分ではない（Ｔｏｊｏら（２００８）Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．ａｎｄ Ｐｕｒｉｆ．５９，２８９）。
【００１０】
欧州特許第１６６１９８９号では、少なくとも１００ｍｇ／Ｌの生産量が実行可能な商業的生産に必要であると報告されている。この出願では、スピナーフラスコ中のＣＨＯ細胞による最大６３１．５ｍｇ／Ｌのレベルが報告されている。しかしながら、そのようなレベルに到達するために、細胞は、バキュロウイルスのＰ３５抗アポトーシスタンパク質を共発現しなければならず、ベクターを増幅するために、代謝拮抗物質のメトトレキサートを使用しなければならない。細胞密度は、この業界で標準とされているもの（例えば、Ｗｕｒｍ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４）２２，１３９３）は、３〜４日の継代培養で２×１０６細胞／ｍｌの日常的な細胞密度を報告している）と比較して相対的に低い（スピナーフラスコでの最大値、１５日間で９．４×１０５細胞／ｍｌ）。
【００１１】
組換えフィブリノゲン産生の成功にとって最も重要な問題は、インタクトで、適切に会合した、十分な高純度の生物活性産物をどのようにして作製するかということである。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、真核細胞培養系での発現に最適化されたフィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖をコードするヌクレオチド配列に関する。本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、インタクト形態の組換えフィブリノゲンの真核細胞培養系での効率的な発現を可能にする。最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質配列は、対応する最適化されていないヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質配列と同一である。
【００１３】
本発明の文脈において、「フィブリノゲン」という用語は、任意の形態のフィブリノゲンを指すことができ、遺伝的多型、グリコシル化やリン酸化の違い、Ａα鎖のカルボキシ末端部分の（部分的）タンパク質分解、および選択的スプライシングにより生じる変異体を含む。本発明の文脈において、「アルファ鎖」および「Ａα鎖」という用語は互換的に使用される。これらの用語は、アルファ鎖の野生型と変異体の両方を指すことができ、これらには、シグナル配列を含む６４４アミノ酸のフィブリノゲンアルファ鎖（配列番号８）、シグナル配列を含まない６２５アミノ酸の前駆体フィブリノゲンアルファ鎖（配列番号８のアミノ酸２０〜６４４）、循環中に見られる６１０アミノ酸の切断型フィブリノゲンアルファ鎖（配列番号８のアミノ酸２０〜６２９）、およびシグナル配列を含む８６６アミノ酸のＦｉｂ４２０変異体アルファ鎖（配列番号１１）またはシグナル配列を含まないＦｉｂ４２０変異体アルファ鎖（配列番号１１のアミノ酸２０〜８６６）が含まれる。
【００１４】
本発明の文脈において、「ベータ鎖」および「Ｂβ鎖」という用語は互換的に使用される。これらの用語は、ベータ鎖の野生型と変異体の両方を指すことができ、これらには、シグナル配列を含む４９１アミノ酸のフィブリノゲンベータ鎖（配列番号９）およびシグナル配列を含まない４６１アミノ酸のフィブリノゲンベータ鎖（配列番号９のアミノ酸３１〜４９１）が含まれる。
【００１５】
本発明の文脈において、「ガンマ鎖」および「γ鎖」という用語は互換的に使用される。これらの用語は、ガンマ鎖の野生型と変異体の両方を指すことができ、これらには、シグナル配列を含む４３７アミノ酸のフィブリノゲンガンマ鎖（配列番号１０）、シグナル配列を含まない４１１アミノ酸のフィブリノゲンガンマ鎖（配列番号１０のアミノ酸２７〜４３７）、シグナル配列を含むガンマプライム鎖である４５３アミノ酸のフィブリノゲンガンマ鎖（配列番号１３）、およびシグナル配列を含まないガンマプライム鎖である４２７アミノ酸のフィブリノゲンガンマ鎖（配列番号１３のアミノ酸２７〜４５３）が含まれる。
【００１６】
本発明の文脈において、フィブリノゲンまたはフィブリノゲン鎖は、アミノ酸配列が、ヌクレオチド配列によってコードされた全てのアミノ酸（場合により、通常の細胞（分泌）プロセシングの間に除去されるアミノ酸は含まない）を含む場合、「インタクト形態」である。それゆえ、６４４個、６２５個、または６１０個のアミノ酸を有するアルファ鎖は、インタクト形態のアルファ鎖の例である。
【００１７】
本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも５５％、好ましくは少なくとも５８％、より好ましくは少なくとも６０または６５％のＧＣ含有量を有する。一実施形態では、本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、約５５〜７０％の範囲のＧＣ含有量を有する。別の実施形態では、本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、約６０〜６５％の範囲のＧＣ含有量を有する。
【００１８】
フィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、およびガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、真核細胞培養系での発現に最適化されている。好ましくは、これらは、哺乳動物細胞培養系での発現、例えば、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＨＥＫ２９３細胞での発現、または昆虫細胞培養系での発現に最適化されている。より好ましくは、ヌクレオチド配列は、ヒト細胞培養系での発現、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはＨＥＫ２９３細胞培養系での発現に最適化されている。
【００１９】
本発明の最適化は、少なくとも０．９０、好ましくは少なくとも０．９５、より好ましくは少なくとも０．９７のコドン適応指数を有する。一実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、少なくとも０．９５のコドン適応指数で、コドン使用頻度をＣＨＯ細胞に適応させることにより最適化される。
【００２０】
本発明のヌクレオチド配列は、任意のタイプのフィブリノゲン鎖をコードし得る。好ましくは、これらは哺乳動物フィブリノゲン鎖をコードし、より好ましくは、これらは霊長類フィブリノゲン鎖をコードし、最も好ましくは、これらはヒトフィブリノゲン鎖をコードする。例えば、２つまたは１つの齧歯類フィブリノゲン鎖と組み合わせた１つまたは２つの哺乳動物フィブリノゲン鎖などの、組合せも可能である。最適化されるヌクレオチド配列は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。好ましくは、これはｃＤＮＡである。
【００２１】
フィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、そのそれぞれの最適化されていない対応物と少なくとも７０％の同一性を示す。一実施形態では、フィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、およびガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、そのそれぞれの最適化されていない対応物と７０〜８０％の同一性を示す。好ましくは、フィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、スプライス部位やポリ（Ａ）シグナルなどの、ｃｉｓ作用部位を含まない。
【００２２】
フィブリノゲンアルファ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、ヒトフィブリノゲンのアルファ鎖をコードする遺伝子に通常存在する３９塩基対の直列反復配列を含まない。アルファ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列において、反復配列は、コードされるタンパク質配列を変化させることなく改変されている。
【００２３】
好ましい実施形態では、アルファ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号４または７の配列を含む。フィブリノゲンアルファ鎖をコードするヌクレオチド配列およびこれらの配列の部分を含むヌクレオチド配列も本発明により包含される。一実施形態では、本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド６０〜１９３２を含む。別の実施形態では、本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド６０〜１８８７を含む。さらに別の実施形態では、本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号７のヌクレオチド６０〜２５９８を含む。配列番号４または７と少なくとも８５％、少なくとも８７％または少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、少なくとも９４％、９６％、最も好ましくは少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり、かつフィブリノゲンアルファ鎖、例えば、配列番号８もしくは１１の配列またはこれらの配列の部分（例えば、上で例示されたもの）を有するフィブリノゲンアルファ鎖をコードする配列を含むヌクレオチド配列も本発明により包含される。
【００２４】
好ましい実施形態では、ベータ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号５の配列を含む。フィブリノゲンベータ鎖をコードするヌクレオチド配列およびこの配列の部分を含むヌクレオチド配列も本発明により包含される。一実施形態では、本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド９３〜１４７３を含む。配列番号５と少なくとも８５％、少なくとも８７％または少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、少なくとも９４％、９６％、最も好ましくは少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり、かつフィブリノゲンベータ鎖、例えば、配列番号９の配列またはこの配列の部分（例えば、配列番号９のアミノ酸３１〜４９１）を有するフィブリノゲンベータ鎖をコードする配列を含むヌクレオチド配列も本発明により包含される。
【００２５】
好ましい実施形態では、フィブリノゲンガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号６の配列を含む。フィブリノゲンガンマ鎖をコードするヌクレオチド配列およびこの配列の部分を含むヌクレオチド配列も本発明により包含される。一実施形態では、フィブリノゲンガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド８１〜１３１１を含む。配列番号６と少なくとも８５％、少なくとも８７％または少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、少なくとも９４％、９６％、最も好ましくは少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり、かつフィブリノゲンガンマ鎖、例えば、配列番号１０の配列またはこの配列の部分（例えば、配列番号１０のアミノ酸２７〜４３７）を有するフィブリノゲンガンマ鎖をコードする配列を含むヌクレオチド配列も本発明により包含される。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、フィブリノゲンガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１２の配列を含む。フィブリノゲンガンマ鎖をコードするヌクレオチド配列およびこの配列の部分を含むヌクレオチド配列も本発明により包含される。一実施形態では、フィブリノゲンガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１２のヌクレオチド８１〜１３５９を含む。配列番号１２と少なくとも８５％、少なくとも８７％または少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、少なくとも９４％、９６％、最も好ましくは少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり、かつフィブリノゲンガンマ鎖、例えば、配列番号１３の配列またはこの配列の部分（例えば、配列番号１３のアミノ酸２７〜４５３）を有するフィブリノゲンガンマ鎖をコードする配列を含むヌクレオチド配列も本発明により包含される。
【００２７】
別の態様では、本発明は、フィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列を含むヌクレオチドコンストラクトに関する。ヌクレオチドコンストラクトは、フィブリノゲン鎖の発現に影響を及ぼす調節配列を含んでいてもよく、これらには、プロモーター、ターミネーター、およびエンハンサーが含まれる。一実施形態では、ヌクレオチドコンストラクトは、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターなどの、ベクターである。ヌクレオチドコンストラクトはまた、選択マーカーを含んでいてもよい。
【００２８】
別の態様では、本発明は、フィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列を含む細胞に関する。細胞内で、本発明のヌクレオチドは、それ自体として、またはコンストラクト中に、例えば、発現ベクターもしくはクローニングベクター中に存在していてもよい。細胞は、典型的には、フィブリノゲンの産生に使用される宿主細胞である。本発明のヌクレオチド配列を含む細胞は、好ましくは哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞の好適な例としては、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、およびＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。
【００２９】
本発明の細胞は、大量のインタクトな生物活性のあるフィブリノゲンを産生する。細胞は、典型的には、細胞株の部分である。この文脈において、「大量のインタクトなフィブリノゲンを産生する細胞または細胞株」という語句は、８５％よりも多く、好ましくは９０％、９５％、または９９％よりも多くのインタクトな産物を産生する細胞または細胞株を指す。これは、１０、２０、または３０回の集団倍加の間、より好ましくは４０または５０回の集団倍加の間、測定されることが好ましい。本発明の文脈において、「生物活性のある」フィブリノゲンは、トロンビンの存在下でフィブリンへと重合するフィブリノゲンを指す。このような細胞または細胞株も本発明により包含される。好ましい実施形態では、本発明の細胞株は、少なくとも３ピコグラム／細胞／日、より好ましくは少なくとも４または５ピコグラム／細胞／日、さらにより好ましくは少なくとも７または１０ピコグラム／細胞／日のレベルでインタクトな組換えフィブリノゲンを産生する。３０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度の反応器では、３ピコグラム／細胞／日は、フィブリノゲン９０ｍｇ／リットル反応器容量／日に相当し、５ピコグラム／細胞／日は、フィブリノゲン１５０ｍｇ／リットル／日に相当し、７ピコグラム／細胞／日は、フィブリノゲン２１０ｍｇ／リットル／日に相当する。好ましくは細胞集団の少なくとも５０％、より好ましくは細胞集団の少なくとも６０％、７０％、または８０％、最も好ましくは細胞集団の少なくとも９０％、９５％、または９９％が、少なくとも３ピコグラム／細胞／日、より好ましくは少なくとも５ピコグラム／細胞／日、さらにより好ましくは少なくとも７ピコグラム／細胞／日を産生する。
【００３０】
大量のインタクトなフィブリノゲンを産生する細胞または細胞株の選択は、プロテアーゼ阻害因子を発現させることなく行なわれることが好ましい。一実施形態では、選択は、抗体、好ましくはアルファ鎖のインタクトなＮ末端およびアルファ鎖のインタクトなＣ末端に結合するモノクローナル抗体を用いて行なわれる。このような抗体の好適な市販例としては、Ｋｏｐｐｅｒｔら（１９８５）Ｂｌｏｏｄ ６６，５０３によって記載されているＹ１８抗体およびＨｏｅｇｅｅ−ｄｅ Ｎｏｂｅｌら（１９８８）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６０（３）４１５によって記載されているＧ８抗体が挙げられる。この選択は、無血清環境で行なわれることが好ましい。インタクトなフィブリノゲンを産生する細胞株のこうした選択方法も本発明の一部である。
【００３１】
別の態様では、本発明は、真核細胞培養系でフィブリノゲンを産生する方法に関する。本方法は、フィブリノゲンが産生される条件下で本発明の宿主細胞または宿主細胞株を培養することを含む。任意で、産生されたフィブリノゲンを回収する。最適化された鎖と最適化されていない鎖を組み合わせてもよい。最適化されていない鎖は、遺伝子工学によってまたは合成によって得られてもよく、最適化された鎖と異なる源に由来するものであってもよい。一実施形態では、フィブリノゲン１分子当たり１つの鎖だけが、本発明のコドンが最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるが、２つの他の鎖は、最適化されていない２つのヌクレオチド配列によってコードされる。別の実施形態では、フィブリノゲン１分子当たり３つのフィブリノゲン鎖のうちの２つが、本発明のコドンが最適化されたヌクレオチド配列によってコードされる。好ましい実施形態では、３つ全てのフィブリノゲン鎖が、最適化されたヌクレオチド配列によってコードされる。血漿由来フィブリノゲンとは対照的に、本方法により産生されるフィブリノゲン製剤は、特定のフィブリノゲン鎖が産生されるために、かなり均質である。本方法は、血漿中にわずかな量でしか存在しない、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％よりも多く、好ましくは９５％、９８％、または９９％よりも多くの変異体から構成されるフィブリノゲン製剤の産生を可能にする。
【００３２】
別の態様では、本発明は、いくつかの医療用途用のフィブリノゲンの調製における本発明のヌクレオチド配列の使用に関する。１つの用途では、本発明のヌクレオチド配列は、止血するためにおよび血液や体液の損失を減らすために外科的介入時に臨床適用されるフィブリンシーラントに使用されるフィブリノゲンを調製するために使用される。別の用途では、本発明のヌクレオチド配列は、フィブリンの凝集特性を用いて組織の接着を促進するためのおよび創傷治癒を改善するためのフィブリノゲンを調製するために使用され得る。また別の用途では、本発明のヌクレオチド配列は、フィブリノゲンの静脈内投与によって先天性または後天性（例えば、外傷後もしくは手術中の出血による）のフィブリノゲン欠損症患者の急性出血症状を治療するために臨床的に使用されるフィブリノゲンを調製するために使用され得る。市販の血漿由来フィブリノゲン製剤は、Ｒｉａｓｔａｐ（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＬＬＣ；米国で市販）およびＨａｅｍｏｃｏｍｐｌｅｔｔａｎ（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ；欧州で市販）である。組換えフィブリノゲン製剤は、血漿由来製剤に優るいくつかの利点を有し、これには、好ましい安全性プロファイル、無制限の供給、およびこうした特定の適応に対する好ましい活性プロファイルを有するフィブリノゲン変異体を混ざりけがない形で製造することができる可能性が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】Ａα鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖をコードする野生型コンストラクトならびにＡα鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖をコードするコドンが最適化されたコンストラクトをＣＨＯ細胞にトランスフェトしてから１、２、３、および６日後の組換えヒトフィブリノゲン発現のレベル。実験は２回１組で行なわれた。（ｏｐｔ）最適化された配列；（ｗｔ）野生型配列。
【図２】Ａα鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖をコードする、コドンが最適化されたコンストラクトならびにコドンが最適化されたコンストラクト（Ａα（ｏｐｔ）＋Ｂβ（ｏｐｔ）＋γ（ｏｐｔ）と表示）であって、Ａα伸長鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖を含むコンストラクト（Ａα−ｅｘｔ．（ｏｐｔ）＋Ｂβ（ｏｐｔ）＋γ（ｏｐｔ）と表示）をＣＨＯ細胞にトランスフェクトしてから１、２、３、および６日後の組換えヒトフィブリノゲン発現のレベル。実験は２回１組で行なわれた。
【図３】組換えヒトフィブリノゲンを発現するクローンＭ２１、Ｍ２５、およびＭ５７のバッチ処理から得られた培養上清のウェスタンブロット解析。対照レーン（ｃｏｎｔｒ）は、血漿由来の野生型フィブリノゲン（ＦＩＢ３、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む。矢印は、Ａα鎖の分解産物を示す。
【図４】伸長型Ａα鎖を有する変異体ヒトフィブリノゲン（Ｆｉｂ４２０）を発現するクローンＰ４０のバッチ処理から得られた培養上清のウェスタンブロット解析。レーン１は、血漿由来の野生型フィブリノゲン（ＦＩＢ３、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む対照である。レーン２および３は、それぞれ、バッチ処理４日目および７日目に採取された、クローンＰ４０ Ａα伸長型の培養上清を含む。
【図５】γ’を含むヒトフィブリノゲンを一過性にトランスフェクトしたＰＥＲ．Ｃ６細胞の培養上清のウェスタンブロット解析（詳細は実施例９に記載）。レーン１は、組換えγ’フィブリノゲンを発現するＰＥＲ．Ｃ６細胞の培養上清を含む。レーン２は、血漿由来の野生型フィブリノゲン（ＦＩＢ３、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む対照である。
【図６】ＰＮＧアーゼＦ処理とその後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によるフィブリノゲンのＮ−グリコシル化の解析。 レーンには次のものを充填した。 ＭＷ：分子量マーカー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。 ＥＲＬ ＦＩＢ３：ＰＮＧアーゼＦ処理された（＋）またはＰＮＧアーゼＦ処理されていない（−）、血漿由来フィブリノゲン（ＥＲＬ）。 ＰＥＲ．Ｃ６ ｆｂｇ：ＰＮＧアーゼＦ処理された（＋）またはＰＮＧアーゼＦ処理されていない（−）、ＰＥＲ．Ｃ６由来フィブリノゲン。 各レーンにフィブリノゲン２μｇを充填し、クマシーブルーを用いて染色を行なった。 解析は、還元１０％ＢｉｓＴｒｉｓゲル（ＮｕＰａｇｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行なった。
【図７】ＲＯＴＥＭ解析：凝固時間。 凝固時間をＲＯＴＥＭ解析で測定した。プール正常（クエン酸）血漿２００μｌまたはＨａｅｍｏｃｏｍｐｌｅｔｔａｎ（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＧｍｂＨ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）もしくはＰＥＲ．Ｃ６フィブリノゲン（両方ともＴＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌ）と１：１で混合したプール正常（クエン酸）血漿１００μｌ。 ＣａＣｌ２を最終濃度１７ｍＭになるまで添加した。凝固を開始させるために、α−トロンビンを最終濃度１ＩＵ／ｍｌになるまで添加した。合計の反応容量は、２４０μｌであった。図は、フィブリノゲンと１：１で混合した血漿の凝固時間（秒）を示す。 １．血漿由来フィブリノゲン（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ） ２．ＰＥＲ．Ｃ６由来フィブリノゲン 全ての測定を２回１組で行なった。
【図８】ＲＯＴＥＭ解析：凝血塊の硬度。凝血塊の硬度をＲＯＴＥＭ解析で測定した。図は、フィブリノゲンと１：１で混合した血漿の１０分の時点での凝血塊の硬度であるＡ１０値（ｍｍ）を表す。実験の詳細は、図７の説明に記載されているものと同じである。 １．血漿由来フィブリノゲン（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ） ２．ＰＥＲ．Ｃ６由来フィブリノゲン 全ての測定を２回１組で行なった。
【図９】ＲＯＴＥＭ解析：凝血塊の形成時間。健康個体由来のクエン酸血を乳酸リンゲル（Ｂａｘｔｅｒ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で希釈するかまたは希釈しないかのいずれかにした。その後、乳酸リンゲルで希釈した血液に血漿由来フィブリノゲンまたは組換えフィブリノゲンを補充するかまたは補充しない（対照）かのいずれかにした。 図は、次のものを示す。 １．血液３００μｌ ２．血液１５０μｌ、乳酸リンゲル（ＲＬ） １００μｌ、ＴＢＳ ５０μｌ ３．血液１５０μｌ、ＲＬ １００μｌ、Ｈａｅｍｏｃｏｍｐｌｅｔｔａｎ（６．５ｍｇ／ｍｌ） ５０μｌ（最終濃度１．１ｍｇ／ｍｌ） ４．血液１５０μｌ、ＲＬ １００μｌ、組換えｈＦｂｇ（６．５ｍｇ／ｍｌ） ５０μｌ（最終濃度１．１ｍｇ／ｍｌ） 全ての条件において、凝固を開始させるために、ｓｔａｒ−ＴＥＭ試薬２０μｌおよびｅｘ−ＴＥＭ試薬２０μｌ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。 正常範囲（３５〜１６０秒）は健康個体に見られる値である。１６０〜２２０秒のＣＦＴ値は、通常止血は損なわれていないが、貯蔵が減少している患者に見られる。
【図１０】ＲＯＴＥＭ解析：凝血塊の硬度。健康個体由来のクエン酸血を乳酸リンゲル（Ｂａｘｔｅｒ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で希釈するかまたは希釈しないかのいずれかにした。その後、乳酸リンゲルで希釈した血液に血漿由来フィブリノゲンまたは組換えフィブリノゲンを補充するかまたは補充しない（対照）かのいずれかにした。 測定条件は、次の通りであった。 １．血液３００μｌ ２．血液１５０μｌ、乳酸リンゲル（ＲＬ） １００μｌ、ＴＢＳ ５０μｌ ３．血液１５０μｌ、ＲＬ １００μｌ、Ｈａｅｍｏｃｏｍｐｌｅｔｔａｎ（６．５ｍｇ／ｍｌ） ５０μｌ（最終濃度１．１ｍｇ／ｍｌ） ４．血液１５０μｌ、ＲＬ １００μｌ、組換えｈＦｂｇ（６．５ｍｇ／ｍｌ） ５０μｌ（最終濃度１．１ｍｇ／ｍｌ） 全ての条件において、凝固を開始させるために、ｓｔａｒ−ＴＥＭ試薬２０μｌおよびｅｘ−ＴＥＭ試薬２０μｌ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。 正常範囲（５３〜７２ｍｍ）は凝固障害がない健康患者に見られる値である。患者に見られる４５〜４０ｍｍのＭＣＦ値は、出血リスクを示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３４】
実施例１ 最適化されたｃＤＮＡコンストラクトの調製
ヒトフィブリノゲンポリペプチド鎖Ａα、Ｂβ、γ、Ａα伸長型（Ｆｉｂ４２０）、およびγ’をコードするｃＤＮＡは、野生型フォーマット（本実施例中では、最適化されていないフォーマットと呼ぶ）およびコドンが最適化されたフォーマットの両方でＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成された。（ｉ）ｃｉｓ作用部位（スプライス部位、ポリ（Ａ）シグナル）を除去し、（ｉｉ）Ａα鎖の反復配列を修飾し、（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ半減期を延長するためにＧＣ含有量を増大させ、（ｉｖ）コドン使用頻度をＣＨＯに適応させた（コドン適応指数−ＣＡＩ− ＞０．９５）。使用された野生型参照は、アルファ鎖についてはＮＭ＿０２１８７１、ベータ鎖についてはＮＭ＿００５１４１、およびガンマ鎖についてはＮＭ＿０００５０９であった。
【００３５】
野生型フォーマットのＡα鎖（配列番号１）、Ｂβ鎖（配列番号２）、およびγ（配列番号３）鎖をコードするｃＤＮＡならびに最適化されたＡα（配列番号４）、Ｂβ（配列番号５）、およびγ（配列番号６）をコードするｃＤＮＡを比較した。結果を表１に示す。最適化されたＡα伸長型（Ｆｉｂ４２０）配列（配列番号７）およびγ’配列（配列番号１２）も表１に示す。
【００３６】
野生型のアルファ鎖（配列番号１）、ベータ鎖（配列番号２）、およびガンマ鎖（配列番号３）のｃＤＮＡならびに最適化されたアルファ鎖（配列番号４）、ベータ鎖（配列番号５）、およびガンマ鎖（配列番号６）のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１誘導体にサブクローニングした。両方（野生型と最適化型）のＡα鎖と両方のＡα伸長型（Ｆｉｂ４２０）をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｎｅｏに、両方のＢβ鎖をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｈｙｇｒｏに、ならびに両方のγ鎖をｐｃＤＮＡ３．１（−）ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）にサブクローニングした。最適化されたγ’鎖をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｈｙｇｒｏにサブクローニングした。
【表１】
【００３７】
実施例２ コドンが最適化されたフィブリノゲン配列および野生型フィブリノゲン配列のＣＨＯ細胞における一過性発現
最適化された配列がタンパク質発現を向上させるかどうかを検証するために、製造元の指示に従って、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）で一過性トランスフェクションを行なった。簡潔に述べると、トランスフェクション前日に、８ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培養培地中に０．６×１０６細胞／ｍｌでＣＨＯ−Ｓ細胞を播種した。トランスフェクション当日に、１２５ｍｌの振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）中の１５ｍｌの培地に１×１０６細胞／ｍｌの濃度になるまで細胞を希釈した。合計１８．７５μｇの発現プラスミド（各々の個々の鎖について６．２５μｇ）を０．３ｍｌのＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭと混合した。その後、０．３ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸトランスフェクション試薬（１６×、ＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭに希釈）を添加して、穏やかに混合した。室温で１０分間のインキュベーションの後、振盪フラスコをゆっくりと撹拌しながら、ＤＮＡ−ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ混合液をＣＨＯ−Ｓ細胞に穏やかに添加した。実験は２回１組で行なった。
【００３８】
トランスフェクトした細胞を、１２５ｒｐｍで回転するオービタルシェーカープラットフォーム上、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。トランスフェクションの１、２、３、および６日後、組換えフィブリノゲン発現を測定するために試料を回収した。
【００３９】
タンパク質発現は、ヒトフィブリノゲンに特異的なＥＬＩＳＡで測定した。品質保証済みのＭａｘｉｓｏｒｂ Ｅｌｉｓａプレート（Ｎｕｎｃ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、４℃で一晩、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のヒトフィブリノゲンに対する１０μｇ／ｍｌのＧ８モノクローナル抗体（Ｈｏｅｇｅｅ−ｄｅ Ｎｏｂｅｌら（１９８８）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６０（３）４１５）（ＴＮＯ ＫｖＬ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）１００μｌでコーティングした。次に、プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０錠剤、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＥＭＤ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＵＳＡ）で洗浄し、１００μｌの培養上清試料またはフィブリノゲン標準品のいずれかを添加した。フィブリノゲン標準品には、以下の濃度、すなわち、１００−７５−５０−２５−１２．５−６．２５−３．１２５−０ｎｇ／ｍｌでＰＢＳＴに溶解および希釈したフィブリノゲン（ＦＩＢ３ヒトフィブリノゲン，Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＥＲＬ），Ｓｗａｎｓｅａ，ＵＫ）が含まれていた。組織培養上清試料は、１：１０〜１：５００でＰＢＳＴに希釈した。室温で１時間のインキュベーションの後、プレートを１ウェル当たり２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、ペーパータオル上で軽く叩いて乾燥させた。次に、１：１０，０００でＰＢＳＴに希釈した１００μｌのＨＲＰコンジュゲートＹ１８モノクローナル抗体（ＴＮＯ ＫｖＬ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を添加した。これを室温で１時間インキュベートした後、プレートを１ウェル当たり２００μｌのＰＢＳＴで４回洗浄し、各洗浄工程の後、プレートをペーパータオル上で軽く叩いて乾燥させた。次に、１００μｌのＴＭＢ Ｕｌｔｒａ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を各ウェルに添加し、その後、室温で４〜３０分間インキュベートした。各ウェルに２ＭのＨ２ＳＯ４（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１００μｌ添加することにより反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いてＯＤ４５０を測定した。
【００４０】
結果を図１に示す。データは、試料が解析された全ての時点で、最適化された配列がフィブリノゲン発現を劇的に向上させることを明白に示している。最適化されたコンストラクトの発現レベルの増加は、７．９〜１０．５倍の範囲である。
【００４１】
実施例３ コドンが最適化されたフィブリノゲン４２０の無血清培養ＣＨＯ細胞における一過性発現
トランスフェクションと解析は、実施例２に記載した通りに行なった。本実験で使用された伸長型Ａα鎖ｃＤＮＡ配列は、最適化された伸長型Ａα配列（配列番号７）であり、８４７アミノ酸の分泌型ポリペプチド（配列番号１１）をコードしている。
【００４２】
結果を図２に示す。これは、フィブリノゲン変異体（この場合、伸長型Ａα鎖を有するＦｉｂ４２０変異体）の発現レベルは、最適化された「野生型」Ａα鎖変異体の増強レベルと同じ範囲にあることを明白に示している。
【００４３】
実施例４ コドンが最適化されたフィブリノゲンｃＤＮＡから無血清条件下でヒトフィブリノゲンを安定に発現するＣＨＯ細胞の作製
本報告に記載の細胞株を作製するために、配列が最適化されたｐｃＤＮＡ３．１由来プラスミドを実施例１に記載した通りに使用した。簡潔に述べると、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の指示に従って、８ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に植え継いだ。ごく普通に、１０％（ｖ／ｖ）培養培地（＝１２．５ｍｌ）を含む１２５ｍｌの振盪フラスコフォーマットで細胞を培養した。１２５ｒｐｍの水平振盪プラットフォーム上の３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターに培養物を入れた。製造元の指示に従って、ＣＨＯ−Ｓ細胞（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のトランスフェクションを行なった。トランスフェクション後、１２５ｒｐｍの水平振盪プラットフォーム上の３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで培養物を一晩インキュベートした。
【００４４】
トランスフェクション翌日、細胞を計数し、８ｍＭのＬグルタミンと選択薬剤のジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（両方とも最終濃度５００μｇ／ｍｌ）を補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地（これ以降、「選択培地」）中で９６ウェルプレート（播種密度２００細胞／ウェル）に播種した。各ウェルの培養容量は、１００〜２００μｌであった。静止状態の３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにプレートを入れた。週に２回、培地を１００μｌの選択培地と交換した。プレートを顕微鏡で細胞増殖についてスクリーニングした。１０日後、耐性クローンが出現し始めた。これらのクローンを、５００μｌの選択培地を含む４８ウェルプレートに移した。
【００４５】
クローンが約５０％コンフルエンスに達した時に、培地をサンプリングし、フィブリノゲン発現レベルについてのＥＬＩＳＡ解析を行なうまで−２０℃で保存した（実施例２参照）。ＥＬＩＳＡ結果に基づいて、フィブリノゲン陽性のクローンを６ウェルプレートに植え継いだ。再び約５０％コンフルエンスで、各クローンの培地をサンプリングし、ＥＬＩＳＡで発現を解析した。ＥＬＩＳＡデータに基づいて、選択された高発現クローンをＴ２５フラスコに移し、３〜５日後にＴ７５ｃｍ２フラスコに移した。次に、細胞をシェーカー培養液に移し、この培養液中で、１２．５ｍｌの選択培地を含む１２５ｍｌの振盪フラスコ中に０．２×１０６生細胞／ｍｌの濃度で細胞を播種した。３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中の１２５ｒｐｍのＥＬＭＩ水平シェーカー上にフラスコを置いた。０．５×１０６生細胞／ｍｌを上回る細胞密度に達した後、再現性のある増殖特性が確立するまで（通常２週間以内）、週に３回、新鮮培地を含む新しい１２５ｍｌ振盪フラスコ中に０．２×１０６生細胞／ｍｌの播種濃度で細胞を植え継いだ。選択クローンの培養物を選択培地中で維持した。
【００４６】
バッチ試験のために、８ｍＭのＬ−グルタミンを補充した１２．５ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地を含む１２５ｍｌの振盪フラスコ中で、選択クローンのシェーカー培養を開始した。培養物を０．２×１０６生細胞／ｍｌで播種した。３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中の１２５ｒｐｍのＤＯＳ−１０−ＥＬＭＩ水平シェーカー上にフラスコを置いた。播種してから１、２、３、４、および７日後に試料を回収し、全体の細胞数と生存率（トリパンブルー染色による）を測定した。３００×ｇの遠心分離で細胞から試料を取り除き、フィブリノゲン濃度の測定が可能になるまで上清を−２０℃で保存した。
【００４７】
ウェスタンブロッティングのために、フィブリノゲンを含む試料を、５μｌの４×濃縮ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）および２μｌの１０×濃縮ＮｕＰＡＧＥ試料還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。最終容量を脱イオン水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）で２０μｌに合わせた。試料を７０℃で１０分間加熱し、製造元の指示に従って、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘゲル（１０％；Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｍｉｎｉゲル，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に充填した。ゲルを２００ボルトで１時間泳動した。４４ｍｌの２５×Ｎｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ−グリシン転写緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、８３６ｍｌの脱塩水、および２２０ｍｌのメタノール（Ｍｅｒｃｋ）を混合することにより、ブロッティング緩衝液を調製した。この溶液を−２０℃で最低３０分間予冷した。１枚のＰＶＤＦメンブレン（Ｐｉｅｒｃｅ）をメタノール中で約１５秒間活性化する。次に、このメンブレンと６枚のゲルブロッティング紙と２枚のブロッティングパッドを、数分間、ブロット緩衝液中でインキュベートした。−２０℃で凍らせたコールドパックを入れたブロッティングチャンバー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ）に置かれたブロットカセット中のゲルの上にメンブレンを置いた。タンパク質の転写は、ゲル／メンブレンアセンブリを挟んで１００ボルトで１時間行なった。
【００４８】
メンブレン上のフィブリノゲンバンドを可視化するために、プラットフォームシェーカー上の５０ｍｌのブロッティング緩衝液（ＰＢＳ中３％の低脂肪粉乳（Ｅｌｋ，Ｃａｍｐｉｎａ，Ｍｅｐｐｅｌ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））中で、ブロットをインキュベートした。次に、このブロットを５０ｍｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）中で１０分間洗浄し、１／２０００希釈のＨＲＰコンジュゲートモノクローナル抗体Ｙ１８／ＰＯ（Ｋｏｐｐｅｒｔら（１９８５）６６，５０３）を含む１０ｍｌのブロッティング緩衝液とともに１時間インキュベートした。次に、このブロットを、５０ｍｌの洗浄緩衝液中で、短く（１分未満）２回、１５分間１回、および５分間３回洗浄し、その後、５０ｍｌのＰＢＳ中で１０分間インキュベートした。
【００４９】
バンドをＥＣＬ（カタログ＃３２２０９，Ｐｉｅｒｃｅ）で可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ−ＩＴ画像撮影システム（ＵＶＰ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳ）を用いて画像を取得した。
【００５０】
安定クローンの作製を複数回行なった。７日間のバッチ培養で３ピコグラム／細胞／日（ｐｃｄ）よりも多くを産生するクローンのみを回収した。いくつかのクローンは、７日間のバッチ培養で５ｐｃｄよりも多くを産生した。
【００５１】
先に示したように、フィブリノゲン産生と産生されたフィブリノゲンの品質の両方について、クローンを試験した。高レベルのインタクトなフィブリノゲンを産生するクローンもあれば、インタクトな産物を産生するだけでなく、分解産物も示すクローンもあった。Ａα鎖は、Ｂβやγと比較して、タンパク質分解に最も感受性があるので、スクリーニングツールによる主なスクリーニングは、第一に、Ａα鎖の完全性を試験することに重点を置いた。典型的な例を図３に示す。図中、クローンＭ２１がＡα鎖の分解を明白に示しているのに対し、Ｍ２５とＭ５７はＡα鎖の分解を示していない。これらの試料のＢβとγの完全性についてのウェスタンブロット解析により、Ａα鎖がタンパク質分解による分解を示す場合でも、これらの鎖はインタクトなままであることが示された。
【００５２】
実施例５ ヒト変異体Ｆｉｂ４２０を発現する安定細胞株の作製
ヒトフィブリノゲンの変異体、すなわち、伸長型Ａα鎖（６２５アミノ酸ではなく８４７アミノ酸）を有するＦｉｂ４２０変異体を発現する安定細胞株を作製した。コドンが最適化されたコンストラクト（配列番号７）を使用し、実施例５に記載した通りに、無血清条件下でクローンを作製した。
【００５３】
７日間のバッチ培養で３ｐｃｄよりも多くを産生する２つの陽性クローンの上清を、インタクトな伸長型Ａα鎖（Ｆｉｂ４２０）について、ウェスタンブロット解析を用いて検討した。高産生クローンでも、Ｆｉｂ４２０のＡα鎖は伸長しており、かつインタクトであることが明らかとなった（図４）。
【００５４】
実施例６ コドンが最適化されたフィブリノゲンｃＤＮＡから無血清条件下でヒトフィブリノゲンを安定に発現するＰＥＲ．Ｃ６細胞の作製
ＰＥＲ．Ｃ６細胞（Ｆａｌｌａｕｘら（１９９８）Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．９（１３）１９０９）を組換えヒトフィブリノゲン発現のための宿主として使用した。簡潔に述べると、ＰＥＲ．Ｃ６細胞をｍＡｂ培地（ＳＡＦＣ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）中で懸濁培養し、ＡＭＡＸＡ（Ｌｏｎｚａ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ヌクレオフェクション装置（プログラムＡ−２７）を用いて、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＴを用いて、ヒトフィブリノゲンタンパク質の３つの異なる鎖（Ａα鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖）をコードする３つのベクターならびに最適化されたｃＤＮＡ鎖（それぞれ、配列番号４、配列番号５、および配列番号６）を含む３つのベクターをトランスフェクトした。
【００５５】
ヌクレオフェクション後、細胞をＴ−フラスコ中で１日間培養し、その後、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ａｌｐｈｅｎ ａ／ｄ Ｒｉｊｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に１０００〜３０００細胞／ウェルの密度で播種した。次に、１２５μｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むｍＡｂ培地を添加した。約３週間後、９６ウェルプレートの個々のウェルの約１０〜３０％を占めるクローンが現れ、その後、これらのクローンを４８ウェルプレート、２４ウェルプレート、および６ウェルプレートに拡大し、次に、Ｔ２５培養フラスコとＴ８０培養フラスコに植え継いだ。拡大期間中、ヒトフィブリノゲンの発現レベルについて培養物をスクリーニングした。発現が少ない細胞と発現していない細胞は廃棄した。その後、細胞を振盪フラスコ（１２５ｍｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で培養した。
【００５６】
全体で、５７９個のクローンが９６ウェルプレート中で同定された。拡大期間中のフィブリノゲン発現レベルに基づいて、４３個のクローンを選択し、振盪フラスコに植え継いだ。増殖特性と産生特性に基づいて、これら４３個の組換えヒトフィブリノゲン産生ＰＥＲ．Ｃ６細胞株のうちの１０個を最初のバッチ試験用に選択した。６個の選択されたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株のＶＰＲＯ培地（ＳＡＦＣ）中でのバッチ試験により、容量産生レベルが最大２７９ｍｇ／Ｌ組換えヒトフィブリノゲンであり、具体的な生産性が１９．８ｐｃｄであることが示された。最後に、サンプリングの時点で培地交換をしてＶＰＲＯ培地中でのバッチ培養を行ない、これにより、累積的容量産生レベルが最大５１５ｍｇ／Ｌ組換えヒトフィブリノゲンとなった。
【００５７】
実施例７ ６１０アミノ酸のＡα鎖を有するヒトフィブリノゲンを発現する安定なＰＥＲ．Ｃ６細胞株の作製
血液循環中の優勢型の血漿フィブリノゲンのＡα６１０をコードする発現プラスミドを作製するために、Ａα鎖のアミノ酸１〜６１０をコードする、先に記載したように最適化されたｃＤＮＡ断片（配列番号８）を、標準的な手順に従って、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｎｅｏにクローニングした。組換えヒトフィブリノゲンを産生するＰＥＲ．Ｃ６細胞株の作製は、先に記載したものと同様である（実施例６参照）。Ａα鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖に用いた配列は、それぞれ、配列番号８、配列番号５、および配列番号６である。
【００５８】
ＰＥＲ．Ｃ６細胞のトランスフェクションと９６ウェルプレートへのプレーティングの後、３１０個のクローンを移し、４８ウェルプレート中でスクリーニングした。拡大コースの最後に、これら３１０個のうちの２４個をシェーカーフラスコに移し、そのうちの８個を、最初のバッチ試験の後に、バッチ培養での安定性試験と生産性試験のために選択した。
【００５９】
バッチ培養での生産量は、６２５アミノ酸フォーマットのＡα鎖を発現する細胞株で得られる生産量と同様であり、６１０アミノ形態をコードするｃＤＮＡからのＡα鎖の発現によって発現レベルが損なわれないことが明白に示された。
【００６０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティング解析を用いたタンパク質解析により、組換えフィブリノゲンはインタクトなフォーマットで産生されることが示された。
【００６１】
実施例８ 伸長型Ａα鎖ベースの組換えヒトフィブリノゲン（Ｆｉｂ４２０変異体）を発現するＰＥＲ．Ｃ６細胞株
組換えヒトフィブリノゲンを産生するＰＥＲ．Ｃ６細胞株の作製は、先に記載したものと同様である（実施例６および７参照）。手短に述べると、Ａα鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖に用いた配列は、それぞれ、配列番号７、配列番号５、および配列番号６である。
【００６２】
トランスフェクションと９６ウェルプレートへのプレーティングの後、３２５個のクローンを移し、４８ウェルプレート中でスクリーニングした。拡大コースの最後に、２４個のクローンをシェーカーフラスコに移し、そのうちの８個を、継続的なバッチ培養試験での安定性解析と発現解析のために選択した。
【００６３】
バッチ培養での生産量は、６１０または６２５アミノ酸フォーマットのＡα鎖を発現する細胞株で得られる生産量と同様であり、Ａα鎖の伸長によって発現レベルが損なわれないことが示された。血漿由来フィブリノゲンは、６１０／６２５Ａα鎖を含むフィブリノゲンと比較して、１〜３％の伸長型Ａα鎖しか含まないので、これは事前に予想されなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティング解析を用いたタンパク質解析により、組換えフィブリノゲンはインタクトなフォーマットで産生され、α鎖は予想されるサイズ（図４に示される、ＣＨＯにより産生されるＦｉｂ４２０由来Ａα鎖と類似している）を有することが示されている。
【００６４】
実施例９ γ’コドンが最適化されたフィブリノゲンの無血清培養ＣＨＯ細胞における一過性発現
一過性トランスフェクションと解析は、実施例２に記載した通りに行なった。本実験で使用された伸長型γ’鎖ｃＤＮＡ配列は、最適化された伸長型γ’配列（配列番号１２）であり、４５３アミノ酸のポリペプチドをコードしている。シグナル配列の除去後、４２７アミノ酸の分泌型ポリペプチド（配列番号１３のアミノ酸２７〜４５３）。
【００６５】
結果は、γ’鎖を有するフィブリノゲン変異体の発現レベルは、最適化された「野生型」変異体の増強レベルと同じ範囲にあることを示した。培養上清をウェスタンブロッティング解析で解析した。結果(図５)は、レーン１のγ’鎖組換えフィブリノゲンが、レーン２の「野生型」フィブリノゲンよりもゆっくりと泳動することを示している。このことは、組換えフィブリノゲン中のγ’鎖は、血漿由来フィブリノゲン中のγ鎖と比較して伸長していること、およびγ’鎖はインタクトであり、分解されていないことを示している。
【００６６】
実施例１０ 組換えヒトフィブリノゲンの精製
実施例６の組換えヒトフィブリノゲンを、標準的な方法に従って、細胞培養上清から精製した。簡潔に述べると、（ＮＨ４）２ＳＯ４を４０％飽和になるまで培養上清に添加し、沈殿を遠心分離により回収した。その後、沈殿をＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解し、ローディング緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、０．５Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４）に希釈し（１０倍）、ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＦＦ（２０ｍｌ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）に充填した。結合タンパク質を、２０カラム容量中０．５−０Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４の（ＮＨ４）２ＳＯ４勾配を含むローディング緩衝液で溶出した。ＨＩＣ精製のピーク画分を、ＴＭＡＥローディング緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）に対する透析により緩衝液交換にかけ、その後、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（ｍ） ４０−９０μｍ（２０ｍｌ）（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）イオン交換カラムに充填した。その後、２０カラム容量中０−１ＭのＮａＣｌの連続塩勾配を用いて、組換えヒトフィブリノゲンを溶出した。（ＮＨ４）２ＳＯ４を４０％飽和になるまで添加することにより、ピーク画分中の組換えヒトフィブリノゲンを再び沈殿させ、遠心分離により回収した。最後に、この物質をＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解し、ＴＢＳに対して透析して、残りの（ＮＨ４）２ＳＯ４を全て除去した。
【００６７】
実施例１１ 組換えフィブリノゲンの機能性
品質と機能性を評価するためにおよび血漿由来フィブリノゲンと比較するために、実施例６で作製された細胞株により産生された、精製組換えＰＥＲ．Ｃ６フィブリノゲンをいくつかの試験にかけた。フィブリノゲンのＮ−グリコシル化は、Ｎ−結合型の糖質構造をタンパク質から除去するアミダーゼ（Ｍａｌｅｙ，Ｆら（１９８９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８０，１９５）である、ＰＮＧアーゼＦでフィブリノゲンを処理することにより試験した。ＰＥＲ．Ｃ６培養物に由来する精製フィブリノゲンと血漿由来フィブリノゲン（ＦＩＢ３ヒトフィブリノゲン、ＥＲＬ）の試料を、製造元の指示に従って、ＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳ）で処理した。
【００６８】
結果（図６）は、ＰＮＧアーゼＦ処理により、血漿由来ＦＩＢ３（ＥＲＬ）とＰＥＲ．Ｃ６ベースのフィブリノゲンの両方について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定されるように、Ｂβ鎖とγ鎖の分子量が減少することを示している。これは、両方の鎖がＮ−グリコシル化部位を１つ含むという事実（Ｈｅｎｓｃｈｅｎ−Ｅｄｍａｎ（２００１）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３６，５８０）と一致している。データは、ＰＮＧアーゼＦ処理の前と後の両方で、Ｂβ鎖とγ鎖の両方について、はっきりと異なる単一バンドが見られることを示している。これは、血漿由来フィブリノゲンに関して、組換えフィブリノゲン中のこれらの鎖の全てがグリコシル化されていることを示している。ヒトフィブリノゲンのＡα鎖はＮ−グリカンを含まないので、分子量はＰＮＧアーゼＦ処理で変化しない。結論として、これらのデータは、ＰＥＲ．Ｃ６ベースのフィブリノゲンのＮ−グリコシル化パターンが血漿由来の対応物と同様であることを示している。
【００６９】
ＰＥＲ．Ｃ６由来フィブリノゲンの生物活性を、Ｋｏｏｐｍａｎら（１９９２）Ｂｌｏｏｄ ８０（８）：１９７２に記載の通りに実行される、重合アッセイでさらに試験した。得られた結果は、ＣＨＯ由来ヒトフィブリノゲンで得られた結果と同様であった。このアッセイは、フィブリノゲンがトロンビン作用下で重合してフィブリンを形成するのを測定する。重合は、時間内にＯＤ３５０ｎｍを記録することにより測定する。血漿中の組換えＰＥＲ．Ｃ６フィブリノゲンの重合は、血漿由来フィブリノゲンやＣＨＯ由来フィブリノゲンと同等であった。
【００７０】
記載したように精製されたＰＥＲ．Ｃ６由来フィブリノゲンの凝固能は、α−トロンビン（７．５ＩＵ／ｍｌ）（ＥＲＬ，Ｓｗａｎｓｅａ，ＵＫ）とＣａＣｌ２（最終濃度２ｍＭ）を添加し、その後、３７℃で１時間インキュベートすることにより試験した。次に、得られた凝血塊をエッペンドルフバイアル中で遠心分離により回収した（１５分、５０００ｒｐｍ、エッペンドルフ遠心分離機）。上清を新しいチューブに移し、凝血塊をアルカリ尿素に溶解した。タンパク質をＡ２８０測定により上清中と凝血塊中で測定した。上清のフィブリノゲン含有量をＥＬＩＳＡ（Ｇ８−Ｙ１８抗体)で測定した。結果は、血漿由来フィブリノゲンとＰＥＲ．Ｃ６由来フィブリノゲンについて同じであり、それぞれ、タンパク質の９７％と９４％が、溶解した凝血塊中で測定された（上清中に５％と８％）。フィブリノゲンをＥＬＩＳＡで上清中に検出することができなかった。これらの結果は、血漿由来フィブリノゲンと組換えヒトフィブリノゲンの生物学的類似性をさらに裏付ける。
【００７１】
組換えフィブリノゲンと血漿由来フィブリノゲンの凝固時間や凝血塊硬度を、ＲＯＴＥＭ解析を用いて測定した。ＲＯＴＥＭ（登録商標）（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、ＲＯｔａｔｉｏｎ ＴｈｒｏｍｂｏＥｌａｓｔｏＭｅｔｒｙ（回転血栓弾性測定法）を表す。この技術は、使い捨てキュベット中の(血液)試料に浸した回転軸を利用する。様々な凝固条件下での弾性変化が軸の回転の変化を生じさせ、この変化を、機械的な凝血塊パラメータを反映するトロンボエラストグラムで可視化する（例えば、Ｌｕｄｄｉｎｇｔｏｎ Ｒ．Ｊ．（２００５）Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００５ ２７（２）：８１を参照されたい）。プール正常（クエン酸）血漿を、Ｈａｅｍｏｃｏｍｐｌｅｔｔａｎ（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＧｍｂＨ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＰＥＲ．Ｃ６フィブリノゲン（両方ともＴＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌ）と１：１で混合した。ＣａＣｌ２を最終濃度１７ｍＭになるまで添加した。凝固を開始させるために、α−トロンビンを最終濃度１ＩＵ／ｍlになるまで添加した。凝固時間と凝血塊強度をＲＯＴＥＭで解析した。
【００７２】
クエン酸血漿を希釈すると、凝固時間と凝血塊硬度の両方が低下した。この結果は、精製フィブリノゲンの添加によって希釈血漿中のフィブリノゲンレベルを回復させると、凝固時間（図７）と凝血塊強度（図８）の両方が、血漿由来フィブリノゲンや組換えフィブリノゲンと同じ程度にまで回復することを示している。同様のデータは、ＣＨＯベースの組換えフィブリノゲンでも得られた。
【００７３】
これらの結果は、組換えヒトフィブリノゲンが遺伝性フィブリノゲン血症患者や後天性フィブリノゲン欠損症患者のフィブリノゲン欠損を補うための優れた代替物であることを示している。
【００７４】
実施例１２ ヒト血液でのＲＯＴＥＭ解析
組換えヒトフィブリノゲンをフィブリノゲン欠損症患者の治療に使用することができることをさらに示すために、健康なヒト個体由来の血液で実験を行なった。血液を乳酸リンゲル（Ｂａｘｔｅｒ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と１：１に希釈することにより、フィブリノゲン欠損を模倣した。次に、実施例１１に記載されたＲＯＴＥＭ解析を用いて、凝血塊形成時間と凝血塊硬度を測定した。乳酸リンゲルで１：１に希釈した血液中のフィブリノゲンレベルを回復させるために、血漿由来フィブリノゲンまたは組換えフィブリノゲンのいずれかを添加した。
【００７５】
データ（図９）は、低いフィブリノゲンレベルを有する患者の臨床症状と同様に、乳酸リンゲルで希釈した血液の凝血塊形成時間が正常範囲から外れていたことを示している。組換えフィブリノゲンまたは血漿由来フィブリノゲンのいずれかを添加すると、凝血塊形成時間が正常範囲内のレベルにまで回復した。これは、フィブリノゲンレベルの低い患者の静脈内治療に対する組換えフィブリノゲンの可能性を示している。
【００７６】
血液を乳酸リンゲルで希釈した場合、最大凝血塊硬度（ＭＣＦ）は、患者の出血リスクと関連するレベルにまで低下した（図１０）。フィブリノゲンレベルを血漿由来フィブリノゲンまたは組換えフィブリノゲンで補った場合、ＭＣＦは正常レベルにまで回復し、それにより、フィブリノゲンレベルの低い患者の静脈内治療に対する組換えフィブリノゲン使用の可能性が強調される。米国でのＲｉａｓｔａｐの承認に関して、臨床的有効性は代用エンドポイントに基づくものであり、これがトロンボエラストグラフィーで測定される最大凝血塊硬度であったことに注目すべきである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えフィブリノゲン、それを哺乳動物細胞において高レベルで産生する方法、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィブリノゲンは、主に肝実質細胞によりヒト体内で合成される可溶性の血漿糖タンパク質である。これは、ジスルフィド架橋で繋がれた、Ａα、Ｂβ、およびγと表される３つのポリペプチド鎖２対からなる二量体分子である。この３つのポリペプチド鎖は、３つの別々の遺伝子によってコードされている。野生型Ａα鎖は、６２５アミノ酸の前駆体として合成され、６１０アミノ酸のタンパク質として血漿中に存在し、Ｂβは４６１個のアミノ酸を含み、γ鎖は４１１個のアミノ酸を含む。３つのポリペプチドは、３つのｍＲＮＡから個別に合成される。３つの構成要素鎖（Ａα、Ｂβ、およびγ）の６本鎖２量体（Ａα、Ｂβ、γ）２としてのその最終形態への会合は、小胞体（ＥＲ）の内腔で起こる。
【０００３】
フィブリノゲンは、高濃度（１〜２ｇ／Ｌ）で血液中を循環し、高い不均一性を示す。変動は、遺伝的多型、グリコシル化やリン酸化の違い、Ａα鎖のカルボキシ末端部分の（部分的）タンパク質分解、および選択的スプライシングにより生じる（総説については、Ｄｅ ＭａａｔおよびＶｅｒｓｃｈｕｕｒ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１２，３７７；Ｌａｕｒｅｎｓら（２００６）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．４，９３２；Ｈｅｎｓｃｈｅｎ−Ｅｄｍａｎ（２００１）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３６，５８０を参照されたい）。各個体で約１００万個の異なるフィブリノゲン分子が循環していると推測されている。フィブリノゲン全体のごく一部（ほとんどの場合、数パーセント以下）を占めるに過ぎない、これらの変異体のほとんどは、機能と構造が異なる。Ａα鎖のカルボキシ末端部分のタンパク質分解により、明白に異なる分子量を有する３つの主な循環型フィブリノゲンが生じる。フィブリノゲンは、高分子量型（ＨＭＷ；分子量３４０ｋＤａ；循環中の優勢型のＡα鎖は、６１０個のアミノ酸を含む）で合成される。Ａα鎖のうちの１つが分解されると、低分子量型（ＬＭＷ；ＭＷ＝３０５ｋＤａ）が生じ、ＬＭＷ’型（２７０ｋＤａ）は、両方のＡα鎖がカルボキシ末端で部分分解された変異体である。正常血液中では、フィブリノゲンの５０〜７０％がＨＭＷであり、２０〜５０％が１つまたは２つの分解されたＡα鎖を有するフィブリノゲンである（ｄｅ ＭａａｔおよびＶｅｒｓｃｈｕｕｒ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１２，３７７）。ＨＭＷ変異体とＬＭＷ’変異体は、凝固時間とフィブリンポリマーの構造に明確な相違を示す（Ｈａｓｅｇａｗａ Ｎ，Ｓａｓａｋｉ Ｓ．（１９９０）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．５７，１８３）。
【０００４】
選択的スプライシングの結果であるよく知られた変異体は、いわゆるγ’変異体とＦｉｂ４２０変異体である。
【０００５】
γ’変異体は、γ鎖全体の約８％に相当する。これは、最も豊富に存在するγ鎖に対する４１１個のアミノ酸ではなく、４２７個のアミノ酸からなり、４個のＣ末端アミノ酸（ＡＧＤＶ）は、２個の硫酸化チロシンを含む２０個のアミノ酸に置き換わっている。フィブリノゲンγ’鎖は、血小板凝集の調節に極めて重要である血小板フィブリノゲン受容体ＩＩｂβ３に結合することができない。
【０００６】
４２０ｋＤａの分子量を有するＦｉｂ４２０変異体は、循環フィブリノゲン全体の１〜３％を占める（ｄｅ ＭａａｔおよびＶｅｒｓｃｈｕｕｒ（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１２，３７７）。選択的スプライシングにより、余分なオープンリーディングフレームがＡα鎖のＣ末端に含まれ、その結果、Ａα鎖が２３７アミノ酸伸長する。追加のアミノ酸はノジュール構造を形成する。
【０００７】
血漿由来フィブリノゲンは、止血するためにおよび血液や体液の損失を減らすために外科的介入時に臨床適用される市販のフィブリンシーラントの重要な成分である。さらに、これは、フィブリンの凝集特性を用いて組織の接着を促進するためにおよび創傷治癒を改善するために使用される。フィブリノゲンは、遺伝性フィブリノゲン血症患者や後天性フィブリノゲン欠損症患者のフィブリノゲン欠損を補うためにも臨床的に使用されている。高投薬量のフィブリノゲン（３〜１０グラム）の静脈内投与は、血液凝固を正常化させ、様々な臨床的状況における重篤な出血を止めるまたは防ぐことが示されている。
【０００８】
組換えによるヒトフィブリノゲン産生は、野生型（ＨＭＷ）フォーマットであれ、変異体として（例えば、Ｆｉｂ４２０として）であれ、血漿由来材料の使用に優る多くの利点を有する。これらの利点には、その好ましい安全性プロファイル、混ざりけがない形で変異体を作製することができる可能性、および無制限の供給が含まれる。しかしながら、これを経済的に実行可能な形で産生するためには、インタクトで機能的なフィブリノゲンの高い発現レベルが必要となる。さらに、特定の用途（例えば、静脈（ＩＶ）止血剤としてのフィブリノゲンの使用）のために、適切な翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）が必要となる。
【０００９】
翻訳後修飾のため、哺乳動物系での発現が好ましい。それゆえ、生物活性のある組換えフィブリノゲンが、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）（例えば、Ｆａｒｒｅｌｌら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，９４１４）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、Ｌｏｒｄ（米国特許第６０３７４５７号）、Ｂｉｎｎｉｅら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２，１０７）、またはアフリカミドリザル由来ＣＯＳ細胞（例えば、Ｒｏｙら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，４７５８）などの、様々な細胞で発現されている。しかしながら、これらの発現レベルは、わずか１〜１５μｇ／ｍｌ程度であり、臨床現場で必要とされる大量の血漿フィブリノゲンの代わりにするには不十分であると考えられる。さらに、酵母のピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）でヒトフィブリノゲンを発現させると８μｇ／ｍｌ生産されたが、これも商業的製造に十分ではない（Ｔｏｊｏら（２００８）Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．ａｎｄ Ｐｕｒｉｆ．５９，２８９）。
【００１０】
欧州特許第１６６１９８９号では、少なくとも１００ｍｇ／Ｌの生産量が実行可能な商業的生産に必要であると報告されている。この出願では、スピナーフラスコ中のＣＨＯ細胞による最大６３１．５ｍｇ／Ｌのレベルが報告されている。しかしながら、そのようなレベルに到達するために、細胞は、バキュロウイルスのＰ３５抗アポトーシスタンパク質を共発現しなければならず、ベクターを増幅するために、代謝拮抗物質のメトトレキサートを使用しなければならない。細胞密度は、この業界で標準とされているもの（例えば、Ｗｕｒｍ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４）２２，１３９３）は、３〜４日の継代培養で２×１０６細胞／ｍｌの日常的な細胞密度を報告している）と比較して相対的に低い（スピナーフラスコでの最大値、１５日間で９．４×１０５細胞／ｍｌ）。
【００１１】
組換えフィブリノゲン産生の成功にとって最も重要な問題は、インタクトで、適切に会合した、十分な高純度の生物活性産物をどのようにして作製するかということである。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、真核細胞培養系での発現に最適化されたフィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖をコードするヌクレオチド配列に関する。本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、インタクト形態の組換えフィブリノゲンの真核細胞培養系での効率的な発現を可能にする。最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質配列は、対応する最適化されていないヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質配列と同一である。
【００１３】
本発明の文脈において、「フィブリノゲン」という用語は、任意の形態のフィブリノゲンを指すことができ、遺伝的多型、グリコシル化やリン酸化の違い、Ａα鎖のカルボキシ末端部分の（部分的）タンパク質分解、および選択的スプライシングにより生じる変異体を含む。本発明の文脈において、「アルファ鎖」および「Ａα鎖」という用語は互換的に使用される。これらの用語は、アルファ鎖の野生型と変異体の両方を指すことができ、これらには、シグナル配列を含む６４４アミノ酸のフィブリノゲンアルファ鎖（配列番号８）、シグナル配列を含まない６２５アミノ酸の前駆体フィブリノゲンアルファ鎖（配列番号８のアミノ酸２０〜６４４）、循環中に見られる６１０アミノ酸の切断型フィブリノゲンアルファ鎖（配列番号８のアミノ酸２０〜６２９）、およびシグナル配列を含む８６６アミノ酸のＦｉｂ４２０変異体アルファ鎖（配列番号１１）またはシグナル配列を含まないＦｉｂ４２０変異体アルファ鎖（配列番号１１のアミノ酸２０〜８６６）が含まれる。
【００１４】
本発明の文脈において、「ベータ鎖」および「Ｂβ鎖」という用語は互換的に使用される。これらの用語は、ベータ鎖の野生型と変異体の両方を指すことができ、これらには、シグナル配列を含む４９１アミノ酸のフィブリノゲンベータ鎖（配列番号９）およびシグナル配列を含まない４６１アミノ酸のフィブリノゲンベータ鎖（配列番号９のアミノ酸３１〜４９１）が含まれる。
【００１５】
本発明の文脈において、「ガンマ鎖」および「γ鎖」という用語は互換的に使用される。これらの用語は、ガンマ鎖の野生型と変異体の両方を指すことができ、これらには、シグナル配列を含む４３７アミノ酸のフィブリノゲンガンマ鎖（配列番号１０）、シグナル配列を含まない４１１アミノ酸のフィブリノゲンガンマ鎖（配列番号１０のアミノ酸２７〜４３７）、シグナル配列を含むガンマプライム鎖である４５３アミノ酸のフィブリノゲンガンマ鎖（配列番号１３）、およびシグナル配列を含まないガンマプライム鎖である４２７アミノ酸のフィブリノゲンガンマ鎖（配列番号１３のアミノ酸２７〜４５３）が含まれる。
【００１６】
本発明の文脈において、フィブリノゲンまたはフィブリノゲン鎖は、アミノ酸配列が、ヌクレオチド配列によってコードされた全てのアミノ酸（場合により、通常の細胞（分泌）プロセシングの間に除去されるアミノ酸は含まない）を含む場合、「インタクト形態」である。それゆえ、６４４個、６２５個、または６１０個のアミノ酸を有するアルファ鎖は、インタクト形態のアルファ鎖の例である。
【００１７】
本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、少なくとも５５％、好ましくは少なくとも５８％、より好ましくは少なくとも６０または６５％のＧＣ含有量を有する。一実施形態では、本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、約５５〜７０％の範囲のＧＣ含有量を有する。別の実施形態では、本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、約６０〜６５％の範囲のＧＣ含有量を有する。
【００１８】
フィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、およびガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、真核細胞培養系での発現に最適化されている。好ましくは、これらは、哺乳動物細胞培養系での発現、例えば、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＨＥＫ２９３細胞での発現、または昆虫細胞培養系での発現に最適化されている。より好ましくは、ヌクレオチド配列は、ヒト細胞培養系での発現、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはＨＥＫ２９３細胞培養系での発現に最適化されている。
【００１９】
本発明の最適化は、少なくとも０．９０、好ましくは少なくとも０．９５、より好ましくは少なくとも０．９７のコドン適応指数を有する。一実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、少なくとも０．９５のコドン適応指数で、コドン使用頻度をＣＨＯ細胞に適応させることにより最適化される。
【００２０】
本発明のヌクレオチド配列は、任意のタイプのフィブリノゲン鎖をコードし得る。好ましくは、これらは哺乳動物フィブリノゲン鎖をコードし、より好ましくは、これらは霊長類フィブリノゲン鎖をコードし、最も好ましくは、これらはヒトフィブリノゲン鎖をコードする。例えば、２つまたは１つの齧歯類フィブリノゲン鎖と組み合わせた１つまたは２つの哺乳動物フィブリノゲン鎖などの、組合せも可能である。最適化されるヌクレオチド配列は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。好ましくは、これはｃＤＮＡである。
【００２１】
フィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、そのそれぞれの最適化されていない対応物と少なくとも７０％の同一性を示す。一実施形態では、フィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、およびガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、そのそれぞれの最適化されていない対応物と７０〜８０％の同一性を示す。好ましくは、フィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、スプライス部位やポリ（Ａ）シグナルなどの、ｃｉｓ作用部位を含まない。
【００２２】
フィブリノゲンアルファ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、ヒトフィブリノゲンのアルファ鎖をコードする遺伝子に通常存在する３９塩基対の直列反復配列を含まない。アルファ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列において、反復配列は、コードされるタンパク質配列を変化させることなく改変されている。
【００２３】
好ましい実施形態では、アルファ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号４または７の配列を含む。フィブリノゲンアルファ鎖をコードするヌクレオチド配列およびこれらの配列の部分を含むヌクレオチド配列も本発明により包含される。一実施形態では、本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド６０〜１９３２を含む。別の実施形態では、本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド６０〜１８８７を含む。さらに別の実施形態では、本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号７のヌクレオチド６０〜２５９８を含む。配列番号４または７と少なくとも８５％、少なくとも８７％または少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、少なくとも９４％、９６％、最も好ましくは少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり、かつフィブリノゲンアルファ鎖、例えば、配列番号８もしくは１１の配列またはこれらの配列の部分（例えば、上で例示されたもの）を有するフィブリノゲンアルファ鎖をコードする配列を含むヌクレオチド配列も本発明により包含される。
【００２４】
好ましい実施形態では、ベータ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号５の配列を含む。フィブリノゲンベータ鎖をコードするヌクレオチド配列およびこの配列の部分を含むヌクレオチド配列も本発明により包含される。一実施形態では、本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド９３〜１４７３を含む。配列番号５と少なくとも８５％、少なくとも８７％または少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、少なくとも９４％、９６％、最も好ましくは少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり、かつフィブリノゲンベータ鎖、例えば、配列番号９の配列またはこの配列の部分（例えば、配列番号９のアミノ酸３１〜４９１）を有するフィブリノゲンベータ鎖をコードする配列を含むヌクレオチド配列も本発明により包含される。
【００２５】
好ましい実施形態では、フィブリノゲンガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号６の配列を含む。フィブリノゲンガンマ鎖をコードするヌクレオチド配列およびこの配列の部分を含むヌクレオチド配列も本発明により包含される。一実施形態では、フィブリノゲンガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド８１〜１３１１を含む。配列番号６と少なくとも８５％、少なくとも８７％または少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、少なくとも９４％、９６％、最も好ましくは少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり、かつフィブリノゲンガンマ鎖、例えば、配列番号１０の配列またはこの配列の部分（例えば、配列番号１０のアミノ酸２７〜４３７）を有するフィブリノゲンガンマ鎖をコードする配列を含むヌクレオチド配列も本発明により包含される。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、フィブリノゲンガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１２の配列を含む。フィブリノゲンガンマ鎖をコードするヌクレオチド配列およびこの配列の部分を含むヌクレオチド配列も本発明により包含される。一実施形態では、フィブリノゲンガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１２のヌクレオチド８１〜１３５９を含む。配列番号１２と少なくとも８５％、少なくとも８７％または少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、少なくとも９４％、９６％、最も好ましくは少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり、かつフィブリノゲンガンマ鎖、例えば、配列番号１３の配列またはこの配列の部分（例えば、配列番号１３のアミノ酸２７〜４５３）を有するフィブリノゲンガンマ鎖をコードする配列を含むヌクレオチド配列も本発明により包含される。
【００２７】
別の態様では、本発明は、フィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列を含むヌクレオチドコンストラクトに関する。ヌクレオチドコンストラクトは、フィブリノゲン鎖の発現に影響を及ぼす調節配列を含んでいてもよく、これらには、プロモーター、ターミネーター、およびエンハンサーが含まれる。一実施形態では、ヌクレオチドコンストラクトは、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターなどの、ベクターである。ヌクレオチドコンストラクトはまた、選択マーカーを含んでいてもよい。
【００２８】
別の態様では、本発明は、フィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖をコードする本発明の最適化されたヌクレオチド配列を含む細胞に関する。細胞内で、本発明のヌクレオチドは、それ自体として、またはコンストラクト中に、例えば、発現ベクターもしくはクローニングベクター中に存在していてもよい。細胞は、典型的には、フィブリノゲンの産生に使用される宿主細胞である。本発明のヌクレオチド配列を含む細胞は、好ましくは哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞の好適な例としては、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、およびＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。
【００２９】
本発明の細胞は、大量のインタクトな生物活性のあるフィブリノゲンを産生する。細胞は、典型的には、細胞株の部分である。この文脈において、「大量のインタクトなフィブリノゲンを産生する細胞または細胞株」という語句は、８５％よりも多く、好ましくは９０％、９５％、または９９％よりも多くのインタクトな産物を産生する細胞または細胞株を指す。これは、１０、２０、または３０回の集団倍加の間、より好ましくは４０または５０回の集団倍加の間、測定されることが好ましい。本発明の文脈において、「生物活性のある」フィブリノゲンは、トロンビンの存在下でフィブリンへと重合するフィブリノゲンを指す。このような細胞または細胞株も本発明により包含される。好ましい実施形態では、本発明の細胞株は、少なくとも３ピコグラム／細胞／日、より好ましくは少なくとも４または５ピコグラム／細胞／日、さらにより好ましくは少なくとも７または１０ピコグラム／細胞／日のレベルでインタクトな組換えフィブリノゲンを産生する。３０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度の反応器では、３ピコグラム／細胞／日は、フィブリノゲン９０ｍｇ／リットル反応器容量／日に相当し、５ピコグラム／細胞／日は、フィブリノゲン１５０ｍｇ／リットル／日に相当し、７ピコグラム／細胞／日は、フィブリノゲン２１０ｍｇ／リットル／日に相当する。好ましくは細胞集団の少なくとも５０％、より好ましくは細胞集団の少なくとも６０％、７０％、または８０％、最も好ましくは細胞集団の少なくとも９０％、９５％、または９９％が、少なくとも３ピコグラム／細胞／日、より好ましくは少なくとも５ピコグラム／細胞／日、さらにより好ましくは少なくとも７ピコグラム／細胞／日を産生する。
【００３０】
大量のインタクトなフィブリノゲンを産生する細胞または細胞株の選択は、プロテアーゼ阻害因子を発現させることなく行なわれることが好ましい。一実施形態では、選択は、抗体、好ましくはアルファ鎖のインタクトなＮ末端およびアルファ鎖のインタクトなＣ末端に結合するモノクローナル抗体を用いて行なわれる。このような抗体の好適な市販例としては、Ｋｏｐｐｅｒｔら（１９８５）Ｂｌｏｏｄ ６６，５０３によって記載されているＹ１８抗体およびＨｏｅｇｅｅ−ｄｅ Ｎｏｂｅｌら（１９８８）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６０（３）４１５によって記載されているＧ８抗体が挙げられる。この選択は、無血清環境で行なわれることが好ましい。インタクトなフィブリノゲンを産生する細胞株のこうした選択方法も本発明の一部である。
【００３１】
別の態様では、本発明は、真核細胞培養系でフィブリノゲンを産生する方法に関する。本方法は、フィブリノゲンが産生される条件下で本発明の宿主細胞または宿主細胞株を培養することを含む。任意で、産生されたフィブリノゲンを回収する。最適化された鎖と最適化されていない鎖を組み合わせてもよい。最適化されていない鎖は、遺伝子工学によってまたは合成によって得られてもよく、最適化された鎖と異なる源に由来するものであってもよい。一実施形態では、フィブリノゲン１分子当たり１つの鎖だけが、本発明のコドンが最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるが、２つの他の鎖は、最適化されていない２つのヌクレオチド配列によってコードされる。別の実施形態では、フィブリノゲン１分子当たり３つのフィブリノゲン鎖のうちの２つが、本発明のコドンが最適化されたヌクレオチド配列によってコードされる。好ましい実施形態では、３つ全てのフィブリノゲン鎖が、最適化されたヌクレオチド配列によってコードされる。血漿由来フィブリノゲンとは対照的に、本方法により産生されるフィブリノゲン製剤は、特定のフィブリノゲン鎖が産生されるために、かなり均質である。本方法は、血漿中にわずかな量でしか存在しない、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％よりも多く、好ましくは９５％、９８％、または９９％よりも多くの変異体から構成されるフィブリノゲン製剤の産生を可能にする。
【００３２】
別の態様では、本発明は、いくつかの医療用途用のフィブリノゲンの調製における本発明のヌクレオチド配列の使用に関する。１つの用途では、本発明のヌクレオチド配列は、止血するためにおよび血液や体液の損失を減らすために外科的介入時に臨床適用されるフィブリンシーラントに使用されるフィブリノゲンを調製するために使用される。別の用途では、本発明のヌクレオチド配列は、フィブリンの凝集特性を用いて組織の接着を促進するためのおよび創傷治癒を改善するためのフィブリノゲンを調製するために使用され得る。また別の用途では、本発明のヌクレオチド配列は、フィブリノゲンの静脈内投与によって先天性または後天性（例えば、外傷後もしくは手術中の出血による）のフィブリノゲン欠損症患者の急性出血症状を治療するために臨床的に使用されるフィブリノゲンを調製するために使用され得る。市販の血漿由来フィブリノゲン製剤は、Ｒｉａｓｔａｐ（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＬＬＣ；米国で市販）およびＨａｅｍｏｃｏｍｐｌｅｔｔａｎ（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ；欧州で市販）である。組換えフィブリノゲン製剤は、血漿由来製剤に優るいくつかの利点を有し、これには、好ましい安全性プロファイル、無制限の供給、およびこうした特定の適応に対する好ましい活性プロファイルを有するフィブリノゲン変異体を混ざりけがない形で製造することができる可能性が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】Ａα鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖をコードする野生型コンストラクトならびにＡα鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖をコードするコドンが最適化されたコンストラクトをＣＨＯ細胞にトランスフェトしてから１、２、３、および６日後の組換えヒトフィブリノゲン発現のレベル。実験は２回１組で行なわれた。（ｏｐｔ）最適化された配列；（ｗｔ）野生型配列。
【図２】Ａα鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖をコードする、コドンが最適化されたコンストラクトならびにコドンが最適化されたコンストラクト（Ａα（ｏｐｔ）＋Ｂβ（ｏｐｔ）＋γ（ｏｐｔ）と表示）であって、Ａα伸長鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖を含むコンストラクト（Ａα−ｅｘｔ．（ｏｐｔ）＋Ｂβ（ｏｐｔ）＋γ（ｏｐｔ）と表示）をＣＨＯ細胞にトランスフェクトしてから１、２、３、および６日後の組換えヒトフィブリノゲン発現のレベル。実験は２回１組で行なわれた。
【図３】組換えヒトフィブリノゲンを発現するクローンＭ２１、Ｍ２５、およびＭ５７のバッチ処理から得られた培養上清のウェスタンブロット解析。対照レーン（ｃｏｎｔｒ）は、血漿由来の野生型フィブリノゲン（ＦＩＢ３、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む。矢印は、Ａα鎖の分解産物を示す。
【図４】伸長型Ａα鎖を有する変異体ヒトフィブリノゲン（Ｆｉｂ４２０）を発現するクローンＰ４０のバッチ処理から得られた培養上清のウェスタンブロット解析。レーン１は、血漿由来の野生型フィブリノゲン（ＦＩＢ３、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む対照である。レーン２および３は、それぞれ、バッチ処理４日目および７日目に採取された、クローンＰ４０ Ａα伸長型の培養上清を含む。
【図５】γ’を含むヒトフィブリノゲンを一過性にトランスフェクトしたＰＥＲ．Ｃ６細胞の培養上清のウェスタンブロット解析（詳細は実施例９に記載）。レーン１は、組換えγ’フィブリノゲンを発現するＰＥＲ．Ｃ６細胞の培養上清を含む。レーン２は、血漿由来の野生型フィブリノゲン（ＦＩＢ３、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む対照である。
【図６】ＰＮＧアーゼＦ処理とその後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によるフィブリノゲンのＮ−グリコシル化の解析。 レーンには次のものを充填した。 ＭＷ：分子量マーカー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。 ＥＲＬ ＦＩＢ３：ＰＮＧアーゼＦ処理された（＋）またはＰＮＧアーゼＦ処理されていない（−）、血漿由来フィブリノゲン（ＥＲＬ）。 ＰＥＲ．Ｃ６ ｆｂｇ：ＰＮＧアーゼＦ処理された（＋）またはＰＮＧアーゼＦ処理されていない（−）、ＰＥＲ．Ｃ６由来フィブリノゲン。 各レーンにフィブリノゲン２μｇを充填し、クマシーブルーを用いて染色を行なった。 解析は、還元１０％ＢｉｓＴｒｉｓゲル（ＮｕＰａｇｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行なった。
【図７】ＲＯＴＥＭ解析：凝固時間。 凝固時間をＲＯＴＥＭ解析で測定した。プール正常（クエン酸）血漿２００μｌまたはＨａｅｍｏｃｏｍｐｌｅｔｔａｎ（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＧｍｂＨ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）もしくはＰＥＲ．Ｃ６フィブリノゲン（両方ともＴＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌ）と１：１で混合したプール正常（クエン酸）血漿１００μｌ。 ＣａＣｌ２を最終濃度１７ｍＭになるまで添加した。凝固を開始させるために、α−トロンビンを最終濃度１ＩＵ／ｍｌになるまで添加した。合計の反応容量は、２４０μｌであった。図は、フィブリノゲンと１：１で混合した血漿の凝固時間（秒）を示す。 １．血漿由来フィブリノゲン（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ） ２．ＰＥＲ．Ｃ６由来フィブリノゲン 全ての測定を２回１組で行なった。
【図８】ＲＯＴＥＭ解析：凝血塊の硬度。凝血塊の硬度をＲＯＴＥＭ解析で測定した。図は、フィブリノゲンと１：１で混合した血漿の１０分の時点での凝血塊の硬度であるＡ１０値（ｍｍ）を表す。実験の詳細は、図７の説明に記載されているものと同じである。 １．血漿由来フィブリノゲン（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ） ２．ＰＥＲ．Ｃ６由来フィブリノゲン 全ての測定を２回１組で行なった。
【図９】ＲＯＴＥＭ解析：凝血塊の形成時間。健康個体由来のクエン酸血を乳酸リンゲル（Ｂａｘｔｅｒ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で希釈するかまたは希釈しないかのいずれかにした。その後、乳酸リンゲルで希釈した血液に血漿由来フィブリノゲンまたは組換えフィブリノゲンを補充するかまたは補充しない（対照）かのいずれかにした。 図は、次のものを示す。 １．血液３００μｌ ２．血液１５０μｌ、乳酸リンゲル（ＲＬ） １００μｌ、ＴＢＳ ５０μｌ ３．血液１５０μｌ、ＲＬ １００μｌ、Ｈａｅｍｏｃｏｍｐｌｅｔｔａｎ（６．５ｍｇ／ｍｌ） ５０μｌ（最終濃度１．１ｍｇ／ｍｌ） ４．血液１５０μｌ、ＲＬ １００μｌ、組換えｈＦｂｇ（６．５ｍｇ／ｍｌ） ５０μｌ（最終濃度１．１ｍｇ／ｍｌ） 全ての条件において、凝固を開始させるために、ｓｔａｒ−ＴＥＭ試薬２０μｌおよびｅｘ−ＴＥＭ試薬２０μｌ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。 正常範囲（３５〜１６０秒）は健康個体に見られる値である。１６０〜２２０秒のＣＦＴ値は、通常止血は損なわれていないが、貯蔵が減少している患者に見られる。
【図１０】ＲＯＴＥＭ解析：凝血塊の硬度。健康個体由来のクエン酸血を乳酸リンゲル（Ｂａｘｔｅｒ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で希釈するかまたは希釈しないかのいずれかにした。その後、乳酸リンゲルで希釈した血液に血漿由来フィブリノゲンまたは組換えフィブリノゲンを補充するかまたは補充しない（対照）かのいずれかにした。 測定条件は、次の通りであった。 １．血液３００μｌ ２．血液１５０μｌ、乳酸リンゲル（ＲＬ） １００μｌ、ＴＢＳ ５０μｌ ３．血液１５０μｌ、ＲＬ １００μｌ、Ｈａｅｍｏｃｏｍｐｌｅｔｔａｎ（６．５ｍｇ／ｍｌ） ５０μｌ（最終濃度１．１ｍｇ／ｍｌ） ４．血液１５０μｌ、ＲＬ １００μｌ、組換えｈＦｂｇ（６．５ｍｇ／ｍｌ） ５０μｌ（最終濃度１．１ｍｇ／ｍｌ） 全ての条件において、凝固を開始させるために、ｓｔａｒ−ＴＥＭ試薬２０μｌおよびｅｘ−ＴＥＭ試薬２０μｌ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。 正常範囲（５３〜７２ｍｍ）は凝固障害がない健康患者に見られる値である。患者に見られる４５〜４０ｍｍのＭＣＦ値は、出血リスクを示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３４】
実施例１ 最適化されたｃＤＮＡコンストラクトの調製
ヒトフィブリノゲンポリペプチド鎖Ａα、Ｂβ、γ、Ａα伸長型（Ｆｉｂ４２０）、およびγ’をコードするｃＤＮＡは、野生型フォーマット（本実施例中では、最適化されていないフォーマットと呼ぶ）およびコドンが最適化されたフォーマットの両方でＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成された。（ｉ）ｃｉｓ作用部位（スプライス部位、ポリ（Ａ）シグナル）を除去し、（ｉｉ）Ａα鎖の反復配列を修飾し、（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ半減期を延長するためにＧＣ含有量を増大させ、（ｉｖ）コドン使用頻度をＣＨＯに適応させた（コドン適応指数−ＣＡＩ− ＞０．９５）。使用された野生型参照は、アルファ鎖についてはＮＭ＿０２１８７１、ベータ鎖についてはＮＭ＿００５１４１、およびガンマ鎖についてはＮＭ＿０００５０９であった。
【００３５】
野生型フォーマットのＡα鎖（配列番号１）、Ｂβ鎖（配列番号２）、およびγ（配列番号３）鎖をコードするｃＤＮＡならびに最適化されたＡα（配列番号４）、Ｂβ（配列番号５）、およびγ（配列番号６）をコードするｃＤＮＡを比較した。結果を表１に示す。最適化されたＡα伸長型（Ｆｉｂ４２０）配列（配列番号７）およびγ’配列（配列番号１２）も表１に示す。
【００３６】
野生型のアルファ鎖（配列番号１）、ベータ鎖（配列番号２）、およびガンマ鎖（配列番号３）のｃＤＮＡならびに最適化されたアルファ鎖（配列番号４）、ベータ鎖（配列番号５）、およびガンマ鎖（配列番号６）のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１誘導体にサブクローニングした。両方（野生型と最適化型）のＡα鎖と両方のＡα伸長型（Ｆｉｂ４２０）をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｎｅｏに、両方のＢβ鎖をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｈｙｇｒｏに、ならびに両方のγ鎖をｐｃＤＮＡ３．１（−）ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）にサブクローニングした。最適化されたγ’鎖をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｈｙｇｒｏにサブクローニングした。
【表１】
【００３７】
実施例２ コドンが最適化されたフィブリノゲン配列および野生型フィブリノゲン配列のＣＨＯ細胞における一過性発現
最適化された配列がタンパク質発現を向上させるかどうかを検証するために、製造元の指示に従って、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）で一過性トランスフェクションを行なった。簡潔に述べると、トランスフェクション前日に、８ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培養培地中に０．６×１０６細胞／ｍｌでＣＨＯ−Ｓ細胞を播種した。トランスフェクション当日に、１２５ｍｌの振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）中の１５ｍｌの培地に１×１０６細胞／ｍｌの濃度になるまで細胞を希釈した。合計１８．７５μｇの発現プラスミド（各々の個々の鎖について６．２５μｇ）を０．３ｍｌのＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭと混合した。その後、０．３ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸトランスフェクション試薬（１６×、ＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭに希釈）を添加して、穏やかに混合した。室温で１０分間のインキュベーションの後、振盪フラスコをゆっくりと撹拌しながら、ＤＮＡ−ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ混合液をＣＨＯ−Ｓ細胞に穏やかに添加した。実験は２回１組で行なった。
【００３８】
トランスフェクトした細胞を、１２５ｒｐｍで回転するオービタルシェーカープラットフォーム上、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。トランスフェクションの１、２、３、および６日後、組換えフィブリノゲン発現を測定するために試料を回収した。
【００３９】
タンパク質発現は、ヒトフィブリノゲンに特異的なＥＬＩＳＡで測定した。品質保証済みのＭａｘｉｓｏｒｂ Ｅｌｉｓａプレート（Ｎｕｎｃ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、４℃で一晩、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のヒトフィブリノゲンに対する１０μｇ／ｍｌのＧ８モノクローナル抗体（Ｈｏｅｇｅｅ−ｄｅ Ｎｏｂｅｌら（１９８８）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６０（３）４１５）（ＴＮＯ ＫｖＬ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）１００μｌでコーティングした。次に、プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０錠剤、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＥＭＤ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＵＳＡ）で洗浄し、１００μｌの培養上清試料またはフィブリノゲン標準品のいずれかを添加した。フィブリノゲン標準品には、以下の濃度、すなわち、１００−７５−５０−２５−１２．５−６．２５−３．１２５−０ｎｇ／ｍｌでＰＢＳＴに溶解および希釈したフィブリノゲン（ＦＩＢ３ヒトフィブリノゲン，Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＥＲＬ），Ｓｗａｎｓｅａ，ＵＫ）が含まれていた。組織培養上清試料は、１：１０〜１：５００でＰＢＳＴに希釈した。室温で１時間のインキュベーションの後、プレートを１ウェル当たり２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、ペーパータオル上で軽く叩いて乾燥させた。次に、１：１０，０００でＰＢＳＴに希釈した１００μｌのＨＲＰコンジュゲートＹ１８モノクローナル抗体（ＴＮＯ ＫｖＬ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を添加した。これを室温で１時間インキュベートした後、プレートを１ウェル当たり２００μｌのＰＢＳＴで４回洗浄し、各洗浄工程の後、プレートをペーパータオル上で軽く叩いて乾燥させた。次に、１００μｌのＴＭＢ Ｕｌｔｒａ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を各ウェルに添加し、その後、室温で４〜３０分間インキュベートした。各ウェルに２ＭのＨ２ＳＯ４（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１００μｌ添加することにより反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いてＯＤ４５０を測定した。
【００４０】
結果を図１に示す。データは、試料が解析された全ての時点で、最適化された配列がフィブリノゲン発現を劇的に向上させることを明白に示している。最適化されたコンストラクトの発現レベルの増加は、７．９〜１０．５倍の範囲である。
【００４１】
実施例３ コドンが最適化されたフィブリノゲン４２０の無血清培養ＣＨＯ細胞における一過性発現
トランスフェクションと解析は、実施例２に記載した通りに行なった。本実験で使用された伸長型Ａα鎖ｃＤＮＡ配列は、最適化された伸長型Ａα配列（配列番号７）であり、８４７アミノ酸の分泌型ポリペプチド（配列番号１１）をコードしている。
【００４２】
結果を図２に示す。これは、フィブリノゲン変異体（この場合、伸長型Ａα鎖を有するＦｉｂ４２０変異体）の発現レベルは、最適化された「野生型」Ａα鎖変異体の増強レベルと同じ範囲にあることを明白に示している。
【００４３】
実施例４ コドンが最適化されたフィブリノゲンｃＤＮＡから無血清条件下でヒトフィブリノゲンを安定に発現するＣＨＯ細胞の作製
本報告に記載の細胞株を作製するために、配列が最適化されたｐｃＤＮＡ３．１由来プラスミドを実施例１に記載した通りに使用した。簡潔に述べると、ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の指示に従って、８ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に植え継いだ。ごく普通に、１０％（ｖ／ｖ）培養培地（＝１２．５ｍｌ）を含む１２５ｍｌの振盪フラスコフォーマットで細胞を培養した。１２５ｒｐｍの水平振盪プラットフォーム上の３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターに培養物を入れた。製造元の指示に従って、ＣＨＯ−Ｓ細胞（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のトランスフェクションを行なった。トランスフェクション後、１２５ｒｐｍの水平振盪プラットフォーム上の３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで培養物を一晩インキュベートした。
【００４４】
トランスフェクション翌日、細胞を計数し、８ｍＭのＬグルタミンと選択薬剤のジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（両方とも最終濃度５００μｇ／ｍｌ）を補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地（これ以降、「選択培地」）中で９６ウェルプレート（播種密度２００細胞／ウェル）に播種した。各ウェルの培養容量は、１００〜２００μｌであった。静止状態の３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにプレートを入れた。週に２回、培地を１００μｌの選択培地と交換した。プレートを顕微鏡で細胞増殖についてスクリーニングした。１０日後、耐性クローンが出現し始めた。これらのクローンを、５００μｌの選択培地を含む４８ウェルプレートに移した。
【００４５】
クローンが約５０％コンフルエンスに達した時に、培地をサンプリングし、フィブリノゲン発現レベルについてのＥＬＩＳＡ解析を行なうまで−２０℃で保存した（実施例２参照）。ＥＬＩＳＡ結果に基づいて、フィブリノゲン陽性のクローンを６ウェルプレートに植え継いだ。再び約５０％コンフルエンスで、各クローンの培地をサンプリングし、ＥＬＩＳＡで発現を解析した。ＥＬＩＳＡデータに基づいて、選択された高発現クローンをＴ２５フラスコに移し、３〜５日後にＴ７５ｃｍ２フラスコに移した。次に、細胞をシェーカー培養液に移し、この培養液中で、１２．５ｍｌの選択培地を含む１２５ｍｌの振盪フラスコ中に０．２×１０６生細胞／ｍｌの濃度で細胞を播種した。３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中の１２５ｒｐｍのＥＬＭＩ水平シェーカー上にフラスコを置いた。０．５×１０６生細胞／ｍｌを上回る細胞密度に達した後、再現性のある増殖特性が確立するまで（通常２週間以内）、週に３回、新鮮培地を含む新しい１２５ｍｌ振盪フラスコ中に０．２×１０６生細胞／ｍｌの播種濃度で細胞を植え継いだ。選択クローンの培養物を選択培地中で維持した。
【００４６】
バッチ試験のために、８ｍＭのＬ−グルタミンを補充した１２．５ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地を含む１２５ｍｌの振盪フラスコ中で、選択クローンのシェーカー培養を開始した。培養物を０．２×１０６生細胞／ｍｌで播種した。３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中の１２５ｒｐｍのＤＯＳ−１０−ＥＬＭＩ水平シェーカー上にフラスコを置いた。播種してから１、２、３、４、および７日後に試料を回収し、全体の細胞数と生存率（トリパンブルー染色による）を測定した。３００×ｇの遠心分離で細胞から試料を取り除き、フィブリノゲン濃度の測定が可能になるまで上清を−２０℃で保存した。
【００４７】
ウェスタンブロッティングのために、フィブリノゲンを含む試料を、５μｌの４×濃縮ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）および２μｌの１０×濃縮ＮｕＰＡＧＥ試料還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。最終容量を脱イオン水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）で２０μｌに合わせた。試料を７０℃で１０分間加熱し、製造元の指示に従って、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘゲル（１０％；Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｍｉｎｉゲル，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に充填した。ゲルを２００ボルトで１時間泳動した。４４ｍｌの２５×Ｎｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ−グリシン転写緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、８３６ｍｌの脱塩水、および２２０ｍｌのメタノール（Ｍｅｒｃｋ）を混合することにより、ブロッティング緩衝液を調製した。この溶液を−２０℃で最低３０分間予冷した。１枚のＰＶＤＦメンブレン（Ｐｉｅｒｃｅ）をメタノール中で約１５秒間活性化する。次に、このメンブレンと６枚のゲルブロッティング紙と２枚のブロッティングパッドを、数分間、ブロット緩衝液中でインキュベートした。−２０℃で凍らせたコールドパックを入れたブロッティングチャンバー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ）に置かれたブロットカセット中のゲルの上にメンブレンを置いた。タンパク質の転写は、ゲル／メンブレンアセンブリを挟んで１００ボルトで１時間行なった。
【００４８】
メンブレン上のフィブリノゲンバンドを可視化するために、プラットフォームシェーカー上の５０ｍｌのブロッティング緩衝液（ＰＢＳ中３％の低脂肪粉乳（Ｅｌｋ，Ｃａｍｐｉｎａ，Ｍｅｐｐｅｌ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））中で、ブロットをインキュベートした。次に、このブロットを５０ｍｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）中で１０分間洗浄し、１／２０００希釈のＨＲＰコンジュゲートモノクローナル抗体Ｙ１８／ＰＯ（Ｋｏｐｐｅｒｔら（１９８５）６６，５０３）を含む１０ｍｌのブロッティング緩衝液とともに１時間インキュベートした。次に、このブロットを、５０ｍｌの洗浄緩衝液中で、短く（１分未満）２回、１５分間１回、および５分間３回洗浄し、その後、５０ｍｌのＰＢＳ中で１０分間インキュベートした。
【００４９】
バンドをＥＣＬ（カタログ＃３２２０９，Ｐｉｅｒｃｅ）で可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ−ＩＴ画像撮影システム（ＵＶＰ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳ）を用いて画像を取得した。
【００５０】
安定クローンの作製を複数回行なった。７日間のバッチ培養で３ピコグラム／細胞／日（ｐｃｄ）よりも多くを産生するクローンのみを回収した。いくつかのクローンは、７日間のバッチ培養で５ｐｃｄよりも多くを産生した。
【００５１】
先に示したように、フィブリノゲン産生と産生されたフィブリノゲンの品質の両方について、クローンを試験した。高レベルのインタクトなフィブリノゲンを産生するクローンもあれば、インタクトな産物を産生するだけでなく、分解産物も示すクローンもあった。Ａα鎖は、Ｂβやγと比較して、タンパク質分解に最も感受性があるので、スクリーニングツールによる主なスクリーニングは、第一に、Ａα鎖の完全性を試験することに重点を置いた。典型的な例を図３に示す。図中、クローンＭ２１がＡα鎖の分解を明白に示しているのに対し、Ｍ２５とＭ５７はＡα鎖の分解を示していない。これらの試料のＢβとγの完全性についてのウェスタンブロット解析により、Ａα鎖がタンパク質分解による分解を示す場合でも、これらの鎖はインタクトなままであることが示された。
【００５２】
実施例５ ヒト変異体Ｆｉｂ４２０を発現する安定細胞株の作製
ヒトフィブリノゲンの変異体、すなわち、伸長型Ａα鎖（６２５アミノ酸ではなく８４７アミノ酸）を有するＦｉｂ４２０変異体を発現する安定細胞株を作製した。コドンが最適化されたコンストラクト（配列番号７）を使用し、実施例５に記載した通りに、無血清条件下でクローンを作製した。
【００５３】
７日間のバッチ培養で３ｐｃｄよりも多くを産生する２つの陽性クローンの上清を、インタクトな伸長型Ａα鎖（Ｆｉｂ４２０）について、ウェスタンブロット解析を用いて検討した。高産生クローンでも、Ｆｉｂ４２０のＡα鎖は伸長しており、かつインタクトであることが明らかとなった（図４）。
【００５４】
実施例６ コドンが最適化されたフィブリノゲンｃＤＮＡから無血清条件下でヒトフィブリノゲンを安定に発現するＰＥＲ．Ｃ６細胞の作製
ＰＥＲ．Ｃ６細胞（Ｆａｌｌａｕｘら（１９９８）Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．９（１３）１９０９）を組換えヒトフィブリノゲン発現のための宿主として使用した。簡潔に述べると、ＰＥＲ．Ｃ６細胞をｍＡｂ培地（ＳＡＦＣ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）中で懸濁培養し、ＡＭＡＸＡ（Ｌｏｎｚａ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ヌクレオフェクション装置（プログラムＡ−２７）を用いて、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＴを用いて、ヒトフィブリノゲンタンパク質の３つの異なる鎖（Ａα鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖）をコードする３つのベクターならびに最適化されたｃＤＮＡ鎖（それぞれ、配列番号４、配列番号５、および配列番号６）を含む３つのベクターをトランスフェクトした。
【００５５】
ヌクレオフェクション後、細胞をＴ−フラスコ中で１日間培養し、その後、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ａｌｐｈｅｎ ａ／ｄ Ｒｉｊｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に１０００〜３０００細胞／ウェルの密度で播種した。次に、１２５μｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むｍＡｂ培地を添加した。約３週間後、９６ウェルプレートの個々のウェルの約１０〜３０％を占めるクローンが現れ、その後、これらのクローンを４８ウェルプレート、２４ウェルプレート、および６ウェルプレートに拡大し、次に、Ｔ２５培養フラスコとＴ８０培養フラスコに植え継いだ。拡大期間中、ヒトフィブリノゲンの発現レベルについて培養物をスクリーニングした。発現が少ない細胞と発現していない細胞は廃棄した。その後、細胞を振盪フラスコ（１２５ｍｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で培養した。
【００５６】
全体で、５７９個のクローンが９６ウェルプレート中で同定された。拡大期間中のフィブリノゲン発現レベルに基づいて、４３個のクローンを選択し、振盪フラスコに植え継いだ。増殖特性と産生特性に基づいて、これら４３個の組換えヒトフィブリノゲン産生ＰＥＲ．Ｃ６細胞株のうちの１０個を最初のバッチ試験用に選択した。６個の選択されたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株のＶＰＲＯ培地（ＳＡＦＣ）中でのバッチ試験により、容量産生レベルが最大２７９ｍｇ／Ｌ組換えヒトフィブリノゲンであり、具体的な生産性が１９．８ｐｃｄであることが示された。最後に、サンプリングの時点で培地交換をしてＶＰＲＯ培地中でのバッチ培養を行ない、これにより、累積的容量産生レベルが最大５１５ｍｇ／Ｌ組換えヒトフィブリノゲンとなった。
【００５７】
実施例７ ６１０アミノ酸のＡα鎖を有するヒトフィブリノゲンを発現する安定なＰＥＲ．Ｃ６細胞株の作製
血液循環中の優勢型の血漿フィブリノゲンのＡα６１０をコードする発現プラスミドを作製するために、Ａα鎖のアミノ酸１〜６１０をコードする、先に記載したように最適化されたｃＤＮＡ断片（配列番号８）を、標準的な手順に従って、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｎｅｏにクローニングした。組換えヒトフィブリノゲンを産生するＰＥＲ．Ｃ６細胞株の作製は、先に記載したものと同様である（実施例６参照）。Ａα鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖に用いた配列は、それぞれ、配列番号８、配列番号５、および配列番号６である。
【００５８】
ＰＥＲ．Ｃ６細胞のトランスフェクションと９６ウェルプレートへのプレーティングの後、３１０個のクローンを移し、４８ウェルプレート中でスクリーニングした。拡大コースの最後に、これら３１０個のうちの２４個をシェーカーフラスコに移し、そのうちの８個を、最初のバッチ試験の後に、バッチ培養での安定性試験と生産性試験のために選択した。
【００５９】
バッチ培養での生産量は、６２５アミノ酸フォーマットのＡα鎖を発現する細胞株で得られる生産量と同様であり、６１０アミノ形態をコードするｃＤＮＡからのＡα鎖の発現によって発現レベルが損なわれないことが明白に示された。
【００６０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティング解析を用いたタンパク質解析により、組換えフィブリノゲンはインタクトなフォーマットで産生されることが示された。
【００６１】
実施例８ 伸長型Ａα鎖ベースの組換えヒトフィブリノゲン（Ｆｉｂ４２０変異体）を発現するＰＥＲ．Ｃ６細胞株
組換えヒトフィブリノゲンを産生するＰＥＲ．Ｃ６細胞株の作製は、先に記載したものと同様である（実施例６および７参照）。手短に述べると、Ａα鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖に用いた配列は、それぞれ、配列番号７、配列番号５、および配列番号６である。
【００６２】
トランスフェクションと９６ウェルプレートへのプレーティングの後、３２５個のクローンを移し、４８ウェルプレート中でスクリーニングした。拡大コースの最後に、２４個のクローンをシェーカーフラスコに移し、そのうちの８個を、継続的なバッチ培養試験での安定性解析と発現解析のために選択した。
【００６３】
バッチ培養での生産量は、６１０または６２５アミノ酸フォーマットのＡα鎖を発現する細胞株で得られる生産量と同様であり、Ａα鎖の伸長によって発現レベルが損なわれないことが示された。血漿由来フィブリノゲンは、６１０／６２５Ａα鎖を含むフィブリノゲンと比較して、１〜３％の伸長型Ａα鎖しか含まないので、これは事前に予想されなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティング解析を用いたタンパク質解析により、組換えフィブリノゲンはインタクトなフォーマットで産生され、α鎖は予想されるサイズ（図４に示される、ＣＨＯにより産生されるＦｉｂ４２０由来Ａα鎖と類似している）を有することが示されている。
【００６４】
実施例９ γ’コドンが最適化されたフィブリノゲンの無血清培養ＣＨＯ細胞における一過性発現
一過性トランスフェクションと解析は、実施例２に記載した通りに行なった。本実験で使用された伸長型γ’鎖ｃＤＮＡ配列は、最適化された伸長型γ’配列（配列番号１２）であり、４５３アミノ酸のポリペプチドをコードしている。シグナル配列の除去後、４２７アミノ酸の分泌型ポリペプチド（配列番号１３のアミノ酸２７〜４５３）。
【００６５】
結果は、γ’鎖を有するフィブリノゲン変異体の発現レベルは、最適化された「野生型」変異体の増強レベルと同じ範囲にあることを示した。培養上清をウェスタンブロッティング解析で解析した。結果(図５)は、レーン１のγ’鎖組換えフィブリノゲンが、レーン２の「野生型」フィブリノゲンよりもゆっくりと泳動することを示している。このことは、組換えフィブリノゲン中のγ’鎖は、血漿由来フィブリノゲン中のγ鎖と比較して伸長していること、およびγ’鎖はインタクトであり、分解されていないことを示している。
【００６６】
実施例１０ 組換えヒトフィブリノゲンの精製
実施例６の組換えヒトフィブリノゲンを、標準的な方法に従って、細胞培養上清から精製した。簡潔に述べると、（ＮＨ４）２ＳＯ４を４０％飽和になるまで培養上清に添加し、沈殿を遠心分離により回収した。その後、沈殿をＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解し、ローディング緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、０．５Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４）に希釈し（１０倍）、ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＦＦ（２０ｍｌ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）に充填した。結合タンパク質を、２０カラム容量中０．５−０Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４の（ＮＨ４）２ＳＯ４勾配を含むローディング緩衝液で溶出した。ＨＩＣ精製のピーク画分を、ＴＭＡＥローディング緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）に対する透析により緩衝液交換にかけ、その後、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ（ｍ） ４０−９０μｍ（２０ｍｌ）（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）イオン交換カラムに充填した。その後、２０カラム容量中０−１ＭのＮａＣｌの連続塩勾配を用いて、組換えヒトフィブリノゲンを溶出した。（ＮＨ４）２ＳＯ４を４０％飽和になるまで添加することにより、ピーク画分中の組換えヒトフィブリノゲンを再び沈殿させ、遠心分離により回収した。最後に、この物質をＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解し、ＴＢＳに対して透析して、残りの（ＮＨ４）２ＳＯ４を全て除去した。
【００６７】
実施例１１ 組換えフィブリノゲンの機能性
品質と機能性を評価するためにおよび血漿由来フィブリノゲンと比較するために、実施例６で作製された細胞株により産生された、精製組換えＰＥＲ．Ｃ６フィブリノゲンをいくつかの試験にかけた。フィブリノゲンのＮ−グリコシル化は、Ｎ−結合型の糖質構造をタンパク質から除去するアミダーゼ（Ｍａｌｅｙ，Ｆら（１９８９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８０，１９５）である、ＰＮＧアーゼＦでフィブリノゲンを処理することにより試験した。ＰＥＲ．Ｃ６培養物に由来する精製フィブリノゲンと血漿由来フィブリノゲン（ＦＩＢ３ヒトフィブリノゲン、ＥＲＬ）の試料を、製造元の指示に従って、ＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳ）で処理した。
【００６８】
結果（図６）は、ＰＮＧアーゼＦ処理により、血漿由来ＦＩＢ３（ＥＲＬ）とＰＥＲ．Ｃ６ベースのフィブリノゲンの両方について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定されるように、Ｂβ鎖とγ鎖の分子量が減少することを示している。これは、両方の鎖がＮ−グリコシル化部位を１つ含むという事実（Ｈｅｎｓｃｈｅｎ−Ｅｄｍａｎ（２００１）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３６，５８０）と一致している。データは、ＰＮＧアーゼＦ処理の前と後の両方で、Ｂβ鎖とγ鎖の両方について、はっきりと異なる単一バンドが見られることを示している。これは、血漿由来フィブリノゲンに関して、組換えフィブリノゲン中のこれらの鎖の全てがグリコシル化されていることを示している。ヒトフィブリノゲンのＡα鎖はＮ−グリカンを含まないので、分子量はＰＮＧアーゼＦ処理で変化しない。結論として、これらのデータは、ＰＥＲ．Ｃ６ベースのフィブリノゲンのＮ−グリコシル化パターンが血漿由来の対応物と同様であることを示している。
【００６９】
ＰＥＲ．Ｃ６由来フィブリノゲンの生物活性を、Ｋｏｏｐｍａｎら（１９９２）Ｂｌｏｏｄ ８０（８）：１９７２に記載の通りに実行される、重合アッセイでさらに試験した。得られた結果は、ＣＨＯ由来ヒトフィブリノゲンで得られた結果と同様であった。このアッセイは、フィブリノゲンがトロンビン作用下で重合してフィブリンを形成するのを測定する。重合は、時間内にＯＤ３５０ｎｍを記録することにより測定する。血漿中の組換えＰＥＲ．Ｃ６フィブリノゲンの重合は、血漿由来フィブリノゲンやＣＨＯ由来フィブリノゲンと同等であった。
【００７０】
記載したように精製されたＰＥＲ．Ｃ６由来フィブリノゲンの凝固能は、α−トロンビン（７．５ＩＵ／ｍｌ）（ＥＲＬ，Ｓｗａｎｓｅａ，ＵＫ）とＣａＣｌ２（最終濃度２ｍＭ）を添加し、その後、３７℃で１時間インキュベートすることにより試験した。次に、得られた凝血塊をエッペンドルフバイアル中で遠心分離により回収した（１５分、５０００ｒｐｍ、エッペンドルフ遠心分離機）。上清を新しいチューブに移し、凝血塊をアルカリ尿素に溶解した。タンパク質をＡ２８０測定により上清中と凝血塊中で測定した。上清のフィブリノゲン含有量をＥＬＩＳＡ（Ｇ８−Ｙ１８抗体)で測定した。結果は、血漿由来フィブリノゲンとＰＥＲ．Ｃ６由来フィブリノゲンについて同じであり、それぞれ、タンパク質の９７％と９４％が、溶解した凝血塊中で測定された（上清中に５％と８％）。フィブリノゲンをＥＬＩＳＡで上清中に検出することができなかった。これらの結果は、血漿由来フィブリノゲンと組換えヒトフィブリノゲンの生物学的類似性をさらに裏付ける。
【００７１】
組換えフィブリノゲンと血漿由来フィブリノゲンの凝固時間や凝血塊硬度を、ＲＯＴＥＭ解析を用いて測定した。ＲＯＴＥＭ（登録商標）（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、ＲＯｔａｔｉｏｎ ＴｈｒｏｍｂｏＥｌａｓｔｏＭｅｔｒｙ（回転血栓弾性測定法）を表す。この技術は、使い捨てキュベット中の(血液)試料に浸した回転軸を利用する。様々な凝固条件下での弾性変化が軸の回転の変化を生じさせ、この変化を、機械的な凝血塊パラメータを反映するトロンボエラストグラムで可視化する（例えば、Ｌｕｄｄｉｎｇｔｏｎ Ｒ．Ｊ．（２００５）Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００５ ２７（２）：８１を参照されたい）。プール正常（クエン酸）血漿を、Ｈａｅｍｏｃｏｍｐｌｅｔｔａｎ（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＧｍｂＨ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＰＥＲ．Ｃ６フィブリノゲン（両方ともＴＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌ）と１：１で混合した。ＣａＣｌ２を最終濃度１７ｍＭになるまで添加した。凝固を開始させるために、α−トロンビンを最終濃度１ＩＵ／ｍlになるまで添加した。凝固時間と凝血塊強度をＲＯＴＥＭで解析した。
【００７２】
クエン酸血漿を希釈すると、凝固時間と凝血塊硬度の両方が低下した。この結果は、精製フィブリノゲンの添加によって希釈血漿中のフィブリノゲンレベルを回復させると、凝固時間（図７）と凝血塊強度（図８）の両方が、血漿由来フィブリノゲンや組換えフィブリノゲンと同じ程度にまで回復することを示している。同様のデータは、ＣＨＯベースの組換えフィブリノゲンでも得られた。
【００７３】
これらの結果は、組換えヒトフィブリノゲンが遺伝性フィブリノゲン血症患者や後天性フィブリノゲン欠損症患者のフィブリノゲン欠損を補うための優れた代替物であることを示している。
【００７４】
実施例１２ ヒト血液でのＲＯＴＥＭ解析
組換えヒトフィブリノゲンをフィブリノゲン欠損症患者の治療に使用することができることをさらに示すために、健康なヒト個体由来の血液で実験を行なった。血液を乳酸リンゲル（Ｂａｘｔｅｒ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と１：１に希釈することにより、フィブリノゲン欠損を模倣した。次に、実施例１１に記載されたＲＯＴＥＭ解析を用いて、凝血塊形成時間と凝血塊硬度を測定した。乳酸リンゲルで１：１に希釈した血液中のフィブリノゲンレベルを回復させるために、血漿由来フィブリノゲンまたは組換えフィブリノゲンのいずれかを添加した。
【００７５】
データ（図９）は、低いフィブリノゲンレベルを有する患者の臨床症状と同様に、乳酸リンゲルで希釈した血液の凝血塊形成時間が正常範囲から外れていたことを示している。組換えフィブリノゲンまたは血漿由来フィブリノゲンのいずれかを添加すると、凝血塊形成時間が正常範囲内のレベルにまで回復した。これは、フィブリノゲンレベルの低い患者の静脈内治療に対する組換えフィブリノゲンの可能性を示している。
【００７６】
血液を乳酸リンゲルで希釈した場合、最大凝血塊硬度（ＭＣＦ）は、患者の出血リスクと関連するレベルにまで低下した（図１０）。フィブリノゲンレベルを血漿由来フィブリノゲンまたは組換えフィブリノゲンで補った場合、ＭＣＦは正常レベルにまで回復し、それにより、フィブリノゲンレベルの低い患者の静脈内治療に対する組換えフィブリノゲン使用の可能性が強調される。米国でのＲｉａｓｔａｐの承認に関して、臨床的有効性は代用エンドポイントに基づくものであり、これがトロンボエラストグラフィーで測定される最大凝血塊硬度であったことに注目すべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞培養系での発現に最適化されたフィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２】
ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０、またはヒト細胞培養系での発現に最適化された、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはＨＥＫ２９３細胞培養系での発現に最適化された、請求項１または２に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
好ましくは少なくとも０．９５のコドン適応指数で、コドン使用頻度をＣＨＯ細胞に適応させるにことより最適化された、請求項１〜３に記載のヌクレオチド配列。
【請求項５】
少なくとも５５％のＧＣ含有量を有する、請求項１〜４に記載のヌクレオチド配列。
【請求項６】
そのそれぞれの最適化されていない対応物と少なくとも７０％の同一性を示す、請求項１〜５に記載のヌクレオチド配列。
【請求項７】
コドンが最適化されたフィブリノゲン鎖がｃｉｓ作用部位を含まない、請求項１〜６に記載のヌクレオチド配列
【請求項８】
配列番号４もしくは７のヌクレオチド配列、もしくはその部分、または配列番号４もしくは７と少なくとも８５％同一な配列を有し、かつフィブリノゲンアルファ鎖をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１〜７に記載のヌクレオチド配列。
【請求項９】
配列番号５もしくは８のヌクレオチド配列、もしくはその部分、または配列番号５と少なくとも８５％同一な配列を有し、かつフィブリノゲンベータ鎖をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１〜７に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１０】
配列番号６もしくは１２のヌクレオチド配列、もしくはその部分、または配列番号６もしくは１２と少なくとも８５％同一な配列を有し、かつフィブリノゲンガンマ鎖をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１〜７に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドコンストラクト。
【請求項１２】
請求項１〜１０に記載のヌクレオチド配列または請求項１１に記載のヌクレオチドコンストラクトを含む細胞。
【請求項１３】
インタクトな組換えフィブリノゲンを少なくとも３ピコグラム／細胞／日のレベルで産生する細胞または細胞株。
【請求項１４】
真核細胞培養系でフィブリノゲンを産生する方法であって、フィブリノゲンが産生される条件下で請求項１２または１３に記載の細胞または請求項１３に記載の細胞株を培養すること、および任意で、産生された該フィブリノゲンを回収することを含む、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法により調製されるフィブリノゲン製剤。
【請求項１６】
前記アルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖の１０％よりも多くが変異体型であるフィブリノゲン製剤。
【請求項１７】
前記変異体型がガンマプライム鎖またはアルファ伸長鎖である、請求項１６に記載のフィブリノゲン製剤。
【請求項１８】
医薬品として、組織シーラントとして、または組織の接着を促進するために使用される、請求項１４〜１７に記載のフィブリノゲン製剤。
【請求項１９】
フィブリノゲン欠損症の治療または予防用の医薬品を調製するための請求項１４〜１８に記載のフィブリノゲン製剤の使用。
【請求項２０】
前記フィブリノゲンの８５％よりも多くがインタクト形態である、組換え技術により産生されるフィブリノゲン製剤。
【請求項２１】
インタクトな組換えフィブリノゲンを産生する細胞または細胞株を選択する方法であって、２つの抗体の使用を含み、ここで、一方の抗体が前記アルファ鎖のインタクトなＮ末端に選択的に結合し、もう一方の抗体が前記アルファ鎖のインタクトなＣ末端に選択的に結合する、方法。
【請求項１】
哺乳動物細胞培養系での発現に最適化されたフィブリノゲンアルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２】
ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０、またはヒト細胞培養系での発現に最適化された、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはＨＥＫ２９３細胞培養系での発現に最適化された、請求項１または２に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
好ましくは少なくとも０．９５のコドン適応指数で、コドン使用頻度をＣＨＯ細胞に適応させるにことより最適化された、請求項１〜３に記載のヌクレオチド配列。
【請求項５】
少なくとも５５％のＧＣ含有量を有する、請求項１〜４に記載のヌクレオチド配列。
【請求項６】
そのそれぞれの最適化されていない対応物と少なくとも７０％の同一性を示す、請求項１〜５に記載のヌクレオチド配列。
【請求項７】
コドンが最適化されたフィブリノゲン鎖がｃｉｓ作用部位を含まない、請求項１〜６に記載のヌクレオチド配列
【請求項８】
配列番号４もしくは７のヌクレオチド配列、もしくはその部分、または配列番号４もしくは７と少なくとも８５％同一な配列を有し、かつフィブリノゲンアルファ鎖をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１〜７に記載のヌクレオチド配列。
【請求項９】
配列番号５もしくは８のヌクレオチド配列、もしくはその部分、または配列番号５と少なくとも８５％同一な配列を有し、かつフィブリノゲンベータ鎖をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１〜７に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１０】
配列番号６もしくは１２のヌクレオチド配列、もしくはその部分、または配列番号６もしくは１２と少なくとも８５％同一な配列を有し、かつフィブリノゲンガンマ鎖をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１〜７に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドコンストラクト。
【請求項１２】
請求項１〜１０に記載のヌクレオチド配列または請求項１１に記載のヌクレオチドコンストラクトを含む細胞。
【請求項１３】
インタクトな組換えフィブリノゲンを少なくとも３ピコグラム／細胞／日のレベルで産生する細胞または細胞株。
【請求項１４】
真核細胞培養系でフィブリノゲンを産生する方法であって、フィブリノゲンが産生される条件下で請求項１２または１３に記載の細胞または請求項１３に記載の細胞株を培養すること、および任意で、産生された該フィブリノゲンを回収することを含む、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法により調製されるフィブリノゲン製剤。
【請求項１６】
前記アルファ鎖、ベータ鎖、またはガンマ鎖の１０％よりも多くが変異体型であるフィブリノゲン製剤。
【請求項１７】
前記変異体型がガンマプライム鎖またはアルファ伸長鎖である、請求項１６に記載のフィブリノゲン製剤。
【請求項１８】
医薬品として、組織シーラントとして、または組織の接着を促進するために使用される、請求項１４〜１７に記載のフィブリノゲン製剤。
【請求項１９】
フィブリノゲン欠損症の治療または予防用の医薬品を調製するための請求項１４〜１８に記載のフィブリノゲン製剤の使用。
【請求項２０】
前記フィブリノゲンの８５％よりも多くがインタクト形態である、組換え技術により産生されるフィブリノゲン製剤。
【請求項２１】
インタクトな組換えフィブリノゲンを産生する細胞または細胞株を選択する方法であって、２つの抗体の使用を含み、ここで、一方の抗体が前記アルファ鎖のインタクトなＮ末端に選択的に結合し、もう一方の抗体が前記アルファ鎖のインタクトなＣ末端に選択的に結合する、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１１−５２７１９０（Ｐ２０１１−５２７１９０Ａ）
【公表日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１７１６１（Ｐ２０１１−５１７１６１）
【出願日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５８７５４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００４００４
【国際公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【出願人】（５１１００６２１４）プロフィブリックス ビーブイ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５８７５４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００４００４
【国際公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【出願人】（５１１００６２１４）プロフィブリックス ビーブイ (3)
【Ｆターム（参考）】
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