組換え微生物
【課題】タンパク質又はポリペプチドの生産性がより向上された微生物、及び当該微生物を利用して、目的のタンパク質又はポリペプチドを製造する方法を提供すること。
【解決手段】枯草菌のsigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子又はこれら各遺伝子に相当する８遺伝子をゲノムから欠失又は不活性化された微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
【解決手段】枯草菌のsigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子又はこれら各遺伝子に相当する８遺伝子をゲノムから欠失又は不活性化された微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。ゲノム情報の公開されている産業的に有用な宿主微生物としては、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（非特許文献１）、大腸菌Escherichia coli K-12 MG1655（非特許文献２）、コリネバクテリウムCorynebacterium glutamicum ATCC132032などが挙げられ、これらのゲノム情報を利用し、改良を加えた菌株が開発されている。しかしながら、このような取り組みにも拘わらず、生産効率は必ずしも満足できるものではない。
【０００４】
最近、ある種の微生物について、胞子形成初期に関わる遺伝子を欠失又は不活性化した菌株が構築され、タンパク質やポリペプチドの生産性向上効果が得られている。
例えば、枯草菌のsigE遺伝子 、sigF遺伝子、spoIIE遺伝子、spoIISB遺伝子、sigG遺伝子、又は、spoIVCB遺伝子からspoIIIC遺伝子までの領域に含まれる遺伝子群を欠失した宿主菌株を用いることによって、セルラーゼなどの分泌生産性が向上することが報告されている（特許文献１）。
【０００５】
また、バチルス属細菌は、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットとしてプロモーター配列の認識に関与するシグマ因子を複数有している。異なるプロモーターを認識するシグマ因子が、シグマ因子以外の複数サブユニットから成るＲＮＡポリメラーゼコア複合体に結合することによって異なる遺伝子が転写され、これによって、ゲノム上に数千個存在する遺伝子について、状況に応じた遺伝子の発現制御を行っていると考えられている。
例えば、バチルス属細菌のうち、枯草菌については１７個のシグマ因子が同定されており、栄養増殖期において生育に必須な遺伝子の転写に関与する主要シグマ因子（ハウスキーピングシグマ因子）であるSigAをはじめ、胞子形成過程を制御するシグマ因子SigH、SigF、SigE、SigG、SigK、べん毛形成や細胞壁溶解を制御するシグマ因子SigD、ある種のアミノ酸や糖の代謝を制御するシグマ因子SigL、環境変化への対応を制御するシグマ因子SigBやECF（extracytoplasmic function）シグマと呼ばれるシグマ因子等の存在が知られている。
【０００６】
枯草菌は７個のECFシグマ因子をコードしている。枯草菌のsigＭ遺伝子は、抗生物質により誘発される細胞外被ストレスや、酸、エタノール、超酸化物ストレスにより活性化されるＥＣＦシグマ因子σＭをコードする（非特許文献３）。sigＸ遺伝子は、ペプチドグリカンの代謝回転や細胞表層電荷を調節する遺伝子などを制御するσＸをコードする（非特許文献４,５）。sigＷ遺伝子は、細胞壁で活性を示す抗生物質の存在下で活性化する遺伝子群などを制御するσＷをコードする（非特許文献６-８）。sigＶ遺伝子は、σＸやσＷにより活性化される遺伝子などを制御することが示唆されているσＶをコードしている（非特許文献９）。sigＹ遺伝子は、毒性ペプチドをコードすると推論されているオペロンや、抗菌ペプチドに対して免疫機能を示すと推定されるタンパク質をコードするybgBを制御するσＹをコードする（非特許文献１０,１１）。sigＺ遺伝子は、機能未知のシグマ因子σＺをコードする。ylaC遺伝子は、酸化ストレス耐性に寄与すると示唆されているσYlaCをコードする（非特許文献１２）。
【０００７】
また、xpf遺伝子は、欠陥プロファージＰＢＳＸ配列上にコードされるＲＮＡポリメラーゼシグマ因子Xpfをコードする（非特許文献１３）。
【０００８】
しかしながら、ＥＣＦシグマ因子をコードする遺伝子及びXpfをコードする遺伝子を複数同時に欠失又は不活性化した微生物はこれまでに知られていない。
【０００９】
【特許文献１】特開２００３−４７４９０号公報
【特許文献２】特表２００１−５１００４６号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／０１５７６４２号明細書
【非特許文献１】Nature,390,249,1997
【非特許文献２】Science,277,1453,1997
【非特許文献３】Mol Microbiol，67,830,2008
【非特許文献４】J Mol Biol 279,165,1998
【非特許文献５】J Bacteriol，186，1136，2004
【非特許文献６】J Mol Biol，316，443，2002
【非特許文献７】Mol Microbiol，45，1267，2002
【非特許文献８】Sci Prog，89，243，2006
【非特許文献９】FEMS Microbiol Lett，253: 221-229.
【非特許文献１０】J Bacteriol，185，2003
【非特許文献１１】J Biochem(Tokyo),134,935,2003
【非特許文献１２】J Microbiol, 44,206,2006
【非特許文献１３】J Bacteriol, 176,5820,1994
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの生産性がより向上された微生物、及び当該微生物を利用して、目的のタンパク質又はポリペプチドを製造する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、微生物ゲノム上にコードされる各種遺伝子において、有用なセルラーゼの生産に影響を及ぼす遺伝子を探索したところ、枯草菌のSigM、SigV、SigW、SigX、SigY、SigZ、YlaC、XpfをそれぞれコードするsigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子又はこれら各遺伝子に相当する８遺伝子をゲノム上から欠失又は不活性化した後、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した場合に、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性が、当該遺伝子の欠失又は不活性化前と比較して向上することを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
（１）枯草菌のsigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子又はこれら各遺伝子に相当する８遺伝子をゲノムから欠失又は不活性化された微生物株。
（２）当該微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの生産方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の組換え微生物は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性が高いものである。よって、これを用いて目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産を行えば、当該物質の生産に必要な時間やコストを削減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１５】
本明細書において、転写開始制御領域は、プロモーター及び転写開始点を含む領域であり、リボソーム結合部位は、開始コドンと共に翻訳開始制御領域を形成するShine-Dalgarno（SD）配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)）に相当する部位である。
【００１６】
本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
本発明の微生物を構築するための親微生物としては、枯草菌のSigM、SigV、SigW、SigX、SigY、SigZ、YlaC、XpfのそれぞれをコードするsigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子又はこれら各遺伝子に相当する８遺伝子を有するものであればよく、これらは野生型のものでも変異を施したものでもよい。具体的には、バチルス（Bacillus）属細菌や、クロストリジウム(Clostridium)属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス（Bacillus）属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。
【００１７】
本発明において欠失又は不活性化の対象となる枯草菌のsigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子は、それぞれ枯草菌のECF（extracytoplasmic function）ファミリーに属するシグマ因子であるSigM、SigV、SigW、SigX、SigY、SigZ、YlaCをコードする遺伝子である。
枯草菌については１７個のシグマ因子が同定されており、栄養増殖期において生育に必須な遺伝子の転写に関与する主要シグマ因子（ハウスキーピングシグマ因子）であるSigAをはじめ、胞子形成過程を制御するシグマ因子SigH、SigF、SigE、SigG、SigK、べん毛形成や細胞壁溶解を制御するシグマ因子SigD、ある種のアミノ酸や糖の代謝を制御するシグマ因子SigL、環境変化への対応を制御するシグマ因子SigBやECFシグマと呼ばれるシグマ因子等の存在が知られている。
栄養増殖期には主としてSigAがＲＮＡポリメラーゼコア複合体と会合してSigAが認識するプロモーターを有する遺伝子、またはオペロンの転写を誘導しているが、細胞周囲の環境が変化するとECFシグマ因子のひとつであるSigXが活性化することで、SigXが認識するプロモーターを有する遺伝子、またはオペロンの転写を誘導し、環境変化に対応するといわれている（American Society for Microbiology, pp289, (2002)）。
【００１８】
また、本発明において欠失又は不活性化の対象となる枯草菌のxpf遺伝子は、欠陥プロファージＰＢＳＸ配列上にコードされるＲＮＡポリメラーゼシグマ因子Xpfをコードする（非特許文献１３）。Xpfは、ＰＢＳＸの後期プロモーターによる遺伝子発現に必要であることが知られている（非特許文献１３）。
【００１９】
斯かる遺伝子の産物SigM、SigV、SigW、SigX、SigY、SigZ、YlaC、Xpfは、表１に記載されているようにそれぞれ各種機能を有する。
【００２０】
【表１】
【００２１】
また、表１に示される枯草菌の各遺伝子と同じ機能を有する、及び／又は表１の各遺伝子と塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する、他の微生物由来、好ましくはバチルス（Bacillus）属細菌由来の遺伝子は、これら遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明において欠失、不活性化すべき遺伝子に含まれる。
【００２２】
欠失又は不活性化する遺伝子は、上記に示す、sigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子又はこれら各遺伝子に相当する８遺伝子であればよく、具体的には、sigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子の欠失又は不活性化が挙げられる。
尚、遺伝子の欠失や不活性化には、当該遺伝子中の全部又は一部の塩基の置換・欠失の他、当該遺伝子中への塩基の挿入が含まれる。
【００２３】
本発明遺伝子の不活性化は、当該遺伝子中に他のDNA断片を挿入する、或いは当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行うことができるが、好適には、標的遺伝子を物理的に欠失させる方がより望ましい。
【００２４】
本発明遺伝子の欠失又は不活性化の手順としては、表１に示した、sigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子の８遺伝子又はこれら各遺伝子に相当する８遺伝子（標的遺伝子）を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。
【００２５】
標的遺伝子を欠失又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である。或いは、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活性化した標的遺伝子、又は図１のように標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片等をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又は標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失或いは不活性化した遺伝子断片と置換することが可能である。
【００２６】
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol.Gen.Genet.,223,268,1990等)、こうした方法を繰り返すことによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。
【００２７】
また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化についてもランダムにクローニングしたDNA断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射すること等によっても実施可能である。
【００２８】
以下に、具体例を挙げて、SOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989)によって調製される欠失用DNA断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明する。
【００２９】
ここで用いる欠失用ＤＮＡ断片は、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約０．６〜１．０ｋｂ断片と、同じく下流に隣接する約０．６〜１．０ｋｂ断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、１回目のＰＣＲによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側１０〜３０塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側１０〜３０塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
【００３０】
次いで、１回目に調製した３種類のＰＣＲ断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて２回目のＰＣＲを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列に於いて、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、ＰＣＲ増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したＤＮＡ断片を得ることができる（図１）。
【００３１】
薬剤耐性マーカー遺伝子として、クロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、例えば表２に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989)等に示される通常の条件によりSOE−PCRを行うことによって、各遺伝子の欠失用DNA断片が得られる。
【００３２】
かくして得られた遺伝子欠失用ＤＮＡ断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のある欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、標的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換した細胞、或いは標的遺伝子内に薬剤耐性遺伝子が挿入された細胞が薬剤耐性マーカーによる選択によって分離できる（図１）。即ち、後記表２に示したプライマーセットを用いて調製した欠失用ＤＮＡ断片を導入した場合、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法などによってゲノム上の目的遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換されていることを確認すれば良い。
【００３３】
以下に、ゲノム上の欠失対象遺伝子と置換されたクロラムフェニコール耐性遺伝子を除去する方法について説明する。
【００３４】
薬剤耐性マーカー遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を用いる場合、欠失対象遺伝子を欠失したＤＮＡコンストラクトを有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドを構築する。つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ゲノム上の欠失対象遺伝子の上流に隣接する約０．６〜１．０ｋｂ断片、及び、下流に隣接する約０．６〜１．０ｋｂ断片をそれぞれ調製し、ＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって２断片を結合させる。この断片を例えばｐＣＨＥ１１（Mol Microbiol. 67(2), 291-304（2008））などのカナマイシン耐性温度感受性プラスミドに挿入する。この欠失対象遺伝子の上流と下流の断片を有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドを用いて、ゲノム上の欠失対象遺伝子とクロラムフェニコール耐性遺伝子が置換された株をコンピテント法により形質転換を行い、３０℃においてカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離できる。得られたカナマイシン耐性形質転換体のうちいくつかのコロニーは、用いたプラスミドの欠失対象遺伝子の上流と下流の断片からなるＤＮＡコンストラクトと、ゲノム上の欠失対象遺伝子とクロラムフェニコール耐性遺伝子が置換された株の欠失対象遺伝子の上流配列および下流配列との相同組換えにより置換したクロラムフェニコール感受性株となる。したがって、カナマイシン耐性でクロラムフェニコール感受性の形質転換体を選抜用の抗生物質を含まないＬＢ培地で３７℃において培養してプラスミドが脱落した株を取得できる。ＰＣＲによってクロラムフェニコール耐性遺伝子が削除された遺伝子欠失株を確認することができる。
【００３５】
あるいは、致死遺伝子を利用した方法（特願2008-076008号参照）により遺伝子を欠失して選抜マーカー遺伝子をゲノム上から除去することもできる。
【００３６】
本発明の微生物は、かくして作製された微生物に、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって作製することができる。
ここで、「目的タンパク質又はポリペプチド」は、製造又は精製が目的の一つであるタンパク質又はポリペプチドをいう。また、「目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を有する微生物」において、遺伝子とは、その微生物が本来有する遺伝子を含むのみならず、その微生物は本来有しない遺伝子、すなわち外来の遺伝子を含む意である。
【００３７】
目的タンパク質又は目的ポリペプチドは特に限定されず、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や生理活性ペプチドなどが含まれるが、産業用酵素が好ましい。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase)、転移酵素(Transferase)、加水分解酵素(Hydrolase)、脱離酵素(Lyase)、異性化酵素(Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。
【００３８】
本発明の組換え微生物を用いて生産されるセルラーゼとしては、多糖加水分解酵素の分類（Biochem.J.,280,309,1991）中でファミリー5に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバチルス（Bacillus）属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。例えば、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）、やバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-64株（FERM BP-2886）由来のアルカリセルラーゼが挙げられ、更に好適な例としては、配列番号２のアミノ酸番号１〜７９５のアミノ酸配列からなるバチルス（Bacillus）属細菌由来のアルカリセルラーゼ、又は配列番号４のアミノ酸番号１〜７９３のアミノ酸配列からなるバチルス（Bacillus）属細菌由来のアルカリセルラーゼ、或いは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
【００３９】
プロテアーゼとしては、微生物由来、好ましくはバチルス（Bacillus）属細菌由来、より好ましくはバチルス クラウジ（Bacillus clausii） KSM-K16株（FERM BP-3376）由来のプロテアーゼが挙げられる。バチルス クラウジ（Bacillus clausii） KSM-K16株株由来のアルカリプロテアーゼのより具体的な例としては、配列番号６のアミノ酸番号１〜３８０のアミノ酸配列からなるバチルス（Bacillus）属細菌由来のアルカリプロテアーゼや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。
【００４０】
また、α-アミラーゼとしては、微生物由来、好ましくはバチルス（Bacillus）属細菌由来、より好ましくはバチルス エスピー（Bacillus sp.） KSM-K38株由来のα-アミラーゼが挙げられる。
【００４１】
本発明の微生物に導入される目的タンパク質又は目的ポリペプチドの遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域由来であるものが、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているバチルス（Bacillus）属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。
より具体的には配列番号１で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号２で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、或いは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているＤＮＡ断片を意味する。
【００４２】
上記の目的タンパク質又は目的ポリペプチドの遺伝子を含むＤＮＡ断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法を用いて宿主微生物細胞に取り込ませることによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。また、当該ＤＮＡ断片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合したＤＮＡ断片を用い、宿主微生物ゲノムに直接組み込むことによっても本発明の組換え微生物を得ることができる。
【００４３】
本発明の組換え微生物を用いた目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、目的タンパク質又は目的ポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。そして、後記実施例に示すように、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性は、sigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子、xpf遺伝子を欠失又は不活性化していない微生物を用いた場合と比較して、その向上が達成されている。
【００４４】
以下に、本発明の組換え微生物の構築方法及び当該組換え微生物を用いたセルラーゼの生産方法について具体的に説明する。
【実施例】
【００４５】
以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmol及びPyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。
【００４６】
以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
【００４７】
また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域を示す。
【００４８】
枯草菌の形質転換は以下の様に行った。
すなわち、枯草菌株をSPI培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.02% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/mL トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.01% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/mL トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μLに各種DNA断片を含む溶液(SOE-PCRの反応液等)5μLを添加し、37℃で1時間振盪培養後、適切な薬剤を含むLB寒天培地(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、1.5%寒天)に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。
【００４９】
セルラーゼ活性測定については、1/7.5M リン酸緩衝液(pH7.4 和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。
【００５０】
〔実施例１〕
本実施例では、枯草菌１６８株からsigY遺伝子、sigZ遺伝子、sigV遺伝子、ylaC遺伝子、sigX遺伝子、sigM遺伝子、sigW遺伝子及びxpf遺伝子を欠失した枯草菌株を、以下のようにして作製した。また、以下の手順において使用するプライマー名及びその塩基配列を表２、表３および表４に纏めて示した。
【００５１】
【表２】
【００５２】
【表３】
【００５３】
【表４】
【００５４】
第1段階として、sigY遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子に置換するためのＤＮＡ断片であるcmカセットを、表２に示したプライマーを使用したSOE−PCRにより構築した。
枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したsigY-AfとsigY-Ar、及びsigY-BfとsigY-Brの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigY遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｙ−Ａ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｙ−Ｂ）をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpC194（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）のクロラムフェニコール耐性遺伝子をプラスミドｐＵＣ１８のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ切断点に挿入した組換えプラスミドpCBB31を鋳型とし、表２に示したCmFとCmRプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む１ｋｂ断片（Ｃ）を調製した。次に、得られた（Ｙ−Ａ）（Ｙ−Ｂ）（Ｃ）３断片を混合して鋳型とし、表のプライマーsigY-AfとsigY-Brを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｙ−Ａ）（Ｃ）（Ｙ−Ｂ）の順になる様に結合させ、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た（図参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法により枯草菌１６８株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、ＰＣＲによってsigY遺伝子が欠失され、クロラムフェニコール耐性遺伝子に置換していることを確認した。
【００５５】
第2段階として、表３に示したプライマーを用いてsigY遺伝子を欠失したDNAコンストラクトを有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11(ΔsigY) を構築した。つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示したsigY5'FとsigY5'R及びsigY3'FとsigY3'Rの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigY遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｙ−Ｄ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｙ−Ｅ）をそれぞれ調製した。表３のsigY5'FとsigY3'Rのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、（Ｙ−Ｄ）（Ｙ−Ｅ）の２断片を結合させ、１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片を制限酵素BamHIで切断してカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11（Mol Microbiol. 67(2), 291-304（2008））のBamHI部位に挿入した。このプラスミドpCHE11(ΔsigY)を用いて第1段階で得られたsigY::cm株をコンピテント法により形質転換を行い、30℃においてカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られたカナマイシン耐性形質転換体のうちいくつかのコロニーは、pCHE11(ΔsigY)上のΔsigYとsigY::cm株染色体上のsigY::cm との相同組換えによりクロラムフェニコール感受性となった。KmrCms形質転換体を選抜用の抗生物質を含まないＬＢ培地で37℃において培養してプラスミドが脱落したΔsigY株を取得した。ＰＣＲによってクロラムフェニコール耐性遺伝子が削除されたΔsigYを確認した。
【００５６】
次に、以上のsigYについて行った第1段階と第2段階の操作を、ΔsigY株のsigZ遺伝子について行い、sigY遺伝子及びsigZ遺伝子を欠失した２重欠失株を構築した。
つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したsigZ-AfとsigZ-Ar、及びsigZ-BfとsigZ-Brの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigZ遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｚ−Ａ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｚ−Ｂ）をそれぞれ調製した。次に、得られた（Ｚ−Ａ）、（Ｚ−Ｂ）及び前述のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む１ｋｂ断片（Ｃ）の３断片を混合して鋳型とし、表のプライマーsigZ-AfとsigZ-Brを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｚ−Ａ）（Ｃ）（Ｚ−Ｂ）の順になる様に結合させ、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た（図参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法によりΔsigY株の形質転換を行い、ΔsigY sigZ::cm株を取得した。
【００５７】
第2段階として、表３に示したプライマーを用いてsigZ遺伝子を欠失したDNAコンストラクトを有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11(ΔsigZ) を構築した。つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示したsigZ5'FとsigZ5'R及びsigZ3'FとsigZ3'Rの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigZ遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｚ−Ｄ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｚ−Ｅ）をそれぞれ調製した。表３のsigZ5'FとsigZ3'Rのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、（Ｚ−Ｄ）（Ｚ−Ｅ）の２断片を結合させ、１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片を制限酵素BamHIで切断してカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11のBamHI部位に挿入した。このプラスミドpCHE11(ΔsigZ)を用いて第1段階で得られたΔsigY sigZ::cm株をコンピテント法により形質転換を行い、前述と同様の方法によりΔsigYΔsigZ株を取得した。
【００５８】
更に、第1段階と第2段階の操作を、ΔsigYΔsigZ株のsigV遺伝子について行い、sigY遺伝子、sigZ遺伝子及びsigV遺伝子を欠失した３重欠失株を構築した。
つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したsigV-AfとsigV-Ar、及びsigV-BfとsigV-Brの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigV遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｖ−Ａ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｖ−Ｂ）をそれぞれ調製した。次に、得られた（Ｖ−Ａ）、（Ｖ−Ｂ）及び前述のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む１ｋｂ断片（Ｃ）の３断片を混合して鋳型とし、表のプライマーsigV-AfとsigV-Brを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｖ−Ａ）（Ｃ）（Ｖ−Ｂ）の順になる様に結合させ、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た（図参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法によりΔsigYΔsigZ株の形質転換を行い、ΔsigYΔsigZ sigV::cm株を取得した。
【００５９】
第2段階として、表３に示したプライマーを用いてsigV遺伝子を欠失したDNAコンストラクトを有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11(ΔsigV) を構築した。つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示したsigV5'FとsigV5'R及びsigV3'FとsigV3'Rの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigV遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｖ−Ｄ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｖ−Ｅ）をそれぞれ調製した。表３のsigV5'FとsigV3'Rのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、（Ｖ−Ｄ）（Ｖ−Ｅ）の２断片を結合させ、１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片を制限酵素BamHIで切断してカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11のBamHI部位に挿入した。このプラスミドpCHE11(ΔsigV)を用いて第1段階で得られたΔsigYΔsigZ sigV::cm株をコンピテント法により形質転換を行い、前述と同様の方法によりΔsigYΔsigZΔsigV株を取得した。
【００６０】
更に、第1段階と第2段階の操作を、ΔsigYΔsigZΔsigV株のylaC遺伝子について行い、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、sigV遺伝子、及びylaC遺伝子を欠失した４重欠失株を構築した。
つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したylaC-AfとylaC-Ar、及びylaC-BfとylaC-Brの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のylaC遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｃ−Ａ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｃ−Ｂ）をそれぞれ調製した。次に、得られた（Ｃ−Ａ）、（Ｃ−Ｂ）及び前述のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む１ｋｂ断片（Ｃ）の３断片を混合して鋳型とし、表のプライマーylaC-AfとylaC-Brを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｃ−Ａ）（Ｃ）（Ｃ−Ｂ）の順になる様に結合させ、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た（図参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法によりΔsigYΔsigZΔsigV株の形質転換を行い、ΔsigYΔsigZΔsigV ylaC::cm株を取得した。
【００６１】
第2段階として、表３に示したプライマーを用いてylaC遺伝子を欠失したDNAコンストラクトを有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11(ylaC) を構築した。つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示したylaC5'FとylaC5'R及びylaC3'FとylaC3'Rの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のylaC遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｃ−Ｄ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｃ−Ｅ）をそれぞれ調製した。表３のylaC5'FとylaC3'Rのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、（Ｃ−Ｄ）（Ｃ−Ｅ）の２断片を結合させ、１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片を制限酵素BamHIで切断してカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11のBamHI部位に挿入した。このプラスミドpCHE11(ΔylaC)を用いて第1段階で得られたΔsigYΔsigZΔsigV ylaC::cm株をコンピテント法により形質転換を行い、前述と同様の方法によりΔsigYΔsigZΔsigVΔylaC株を取得した。
【００６２】
更に、第1段階と第2段階の操作を、ΔsigYΔsigZΔsigVΔylaC株のsigX遺伝子について行い、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、sigV遺伝子、ylaC遺伝子、及びsigX遺伝子を欠失した５重欠失株を構築した。
つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したsigX-AfとsigX-Ar、及びsigX-BfとsigX-Brの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigX遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｘ−Ａ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｘ−Ｂ）をそれぞれ調製した。次に、得られた（Ｘ−Ａ）、（Ｘ−Ｂ）及び前述のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む１ｋｂ断片（Ｃ）の３断片を混合して鋳型とし、表のプライマーsigX-AfとsigX-Brを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｘ−Ａ）（Ｃ）（Ｘ−Ｂ）の順になる様に結合させ、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た（図参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法によりΔsigYΔsigZΔsigVΔylaC株の形質転換を行い、ΔsigYΔsigZΔsigVΔylaC sigX::cm株を取得した。
【００６３】
第2段階として、表３に示したプライマーを用いてsigX遺伝子を欠失したDNAコンストラクトを有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11(ΔsigX) を構築した。つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示したsigX5'FとsigX5'R及びsigX3'FとsigX3'Rの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigX遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｘ−Ｄ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｘ−Ｅ）をそれぞれ調製した。表３のsigX5'FとsigX3'Rのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、（Ｘ−Ｄ）（Ｘ−Ｅ）の２断片を結合させ、１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片を制限酵素BamHIで切断してカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11のBamHI部位に挿入した。このプラスミドpCHE11(ΔsigX)を用いて第1段階で得られたΔsigYΔsigZΔsigVΔylaC sigX::cm株をコンピテント法により形質転換を行い、前述と同様な方法によりΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigX株を取得した。
【００６４】
更に、第1段階と第2段階の操作を、ΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigX株のsigM遺伝子について行い、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、sigV遺伝子、ylaC遺伝子、sigX及びsigM遺伝子を欠失した６重欠失株を構築した。
つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したsigM-AfとsigM-Ar、及びsigM-BfとsigM-Brの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigM遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｍ−Ａ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｍ−Ｂ）をそれぞれ調製した。次に、得られた（Ｍ−Ａ）、（Ｍ−Ｂ）及び前述のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む１ｋｂ断片（Ｃ）の３断片を混合して鋳型とし、表のプライマーsigM-AfとsigM-Brを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｍ−Ａ）（Ｃ）（Ｍ−Ｂ）の順になる様に結合させ、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た（図参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法によりΔsigYΔsigZΔsigVΔylaC株の形質転換を行い、ΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigX sigM::cm株を取得した。
【００６５】
第2段階として、表３に示したプライマーを用いてsigM遺伝子を欠失したDNAコンストラクトを有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11(ΔsigM) を構築した。つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示したsigM5'FとsigM5'R及びsigM3'FとsigM3'Rの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigM遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｍ−Ｄ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｍ−Ｅ）をそれぞれ調製した。表３のsigM5'FとsigM3'Rのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、（Ｍ−Ｄ）（Ｍ−Ｅ）の２断片を結合させ、１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片を制限酵素BamHIで切断してカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11のBamHI部位に挿入した。このプラスミドpCHE11(ΔsigM)を用いて第1段階で得られたΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigX sigM::cm株をコンピテント法により形質転換を行い、前述と同様の方法によりΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigXΔsigM株を取得した。
【００６６】
更に、第1段階と第2段階の操作を、ΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigXΔsigM株のsigW遺伝子について行い、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、sigV遺伝子、ylaC遺伝子、sigX遺伝子、sigM遺伝子、及びsigW遺伝子を欠失した７重欠失株を構築した。
つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したsigW-AfとsigW-Ar、及びsigW-BfとsigW-Brの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigW遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｗ−Ａ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｗ−Ｂ）をそれぞれ調製した。次に、得られた（Ｗ−Ａ）、（Ｗ−Ｂ）及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む１ｋｂ断片（Ｃ）の３断片を混合して鋳型とし、表のプライマーsigW-AfとsigW-Brを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｗ−Ａ）（Ｃ）（Ｗ−Ｂ）の順になる様に結合させ、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た（図参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法によりΔsigYΔsigZΔsigVΔylaC株の形質転換を行い、ΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigXΔsigM sigW::cm株を取得した。
【００６７】
第2段階として、表３に示したプライマーを用いてsigW遺伝子を欠失したDNAコンストラクトを有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11(ΔsigW) を構築した。つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示したsigW5'FとsigW5'R及びsigW3'FとsigW3'Rの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigW遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｗ−Ｄ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｗ−Ｅ）をそれぞれ調製した。表３のsigW5'FとsigW3'Rのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、（Ｗ−Ｄ）（Ｗ−Ｅ）の２断片を結合させ、１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片を制限酵素BamHIで切断してカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11のBamHI部位に挿入した。このプラスミドpCHE11(ΔsigW)を用いて第1段階で得られたΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigXΔsigM sigW::cm株をコンピテント法により形質転換を行い、前述と同様の方法によりΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigXΔsigMΔsigW株を取得した。
更に、ΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigXΔsigMΔsigW株のxpf遺伝子を以下のように削除し、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、sigV遺伝子、ylaC遺伝子、sigX遺伝子、sigM遺伝子、sigW遺伝子、及びxpf遺伝子を欠失した8重欠失株を構築した。
【００６８】
先ず、枯草菌168株aprE遺伝子領域にスペクチノマイシン耐性遺伝子、lacI遺伝子、Pspac-chpA遺伝子を含むDNA断片を挿入した168 (aprE::spec, lacI, Pspac-chpA) 株（特願2008-076008 ）の染色体DNAを鋳型として、表４に示したAPNC-FプライマーとchpA-R(Bam)プライマーを用いてPCRにより増幅した。増幅したDNA断片を選択マーカー遺伝子カセット（断片F）と称する。
また、枯草菌168株の染色体DNAを鋳型として、xpf遺伝子の5'外側領域（断片Ｇ）、3'外側領域（断片Ｈ）及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｉ）を、それぞれ表４に示したxpf-DF1とxpf-DR1、xpf-DF2とxpf-DR2及びxpf-IFとxpf-IRを用いてPCRにより増幅した。次に、これらPCRによって得られた選択マーカー遺伝子カセット（断片F）、5'外側領域（断片Ｇ）、3'外側領域（断片Ｈ）及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｉ）並びにxpf-DF1とxpf-IRを用いてSOE-PCR法（Gene,77,61 (1989)）を行った。これにより、5'外側領域（断片Ｇ）、3'外側領域（断片Ｈ）、選択マーカー遺伝子カセット（断片F）及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｉ）がこの順で配置したDNA断片を取得した。このDNA断片を供与体DNAとして使用した。
【００６９】
このように取得された供与体DNAを用いてΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigXΔsigMΔsigW株を形質転換し、スペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。この培養によれば、第１相同組み換えによって供与体DNAが組み込まれてスペクチノマイシン耐性を示す枯草菌のみが生育することとなる。
【００７０】
次に、スペクチノマイシン耐性を指標として選択された形質転換体をLB液体培地で一晩培養し、希釈した培養液を1mM IPTGを入れたLB寒天プレートに塗布した。chpA遺伝子は、大腸菌におけるトキシンの一種であるmazFをコードする遺伝子として知られている。IPTGにより誘導されてPspac-chpA遺伝子が発現すると、細胞は増殖できず死滅する。IPTG含有LB寒天プレート上に生育した形質転換枯草菌は、第２相同組み換えによって、欠失対象領域とともに供与体DNAが宿主DNAから欠失したΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigXΔsigMΔsigWΔxpf株と考えられる。ＰＣＲによってスペクチノマイシン耐性遺伝子が削除されたことを確認した。
【００７１】
また、同様にして表５に示す各遺伝子を欠失した株を構築した。表５中のＭ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｃ及びｘｐｆは、それぞれ、sigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子である。
【００７２】
〔実施例２〕
実施例１にて得られた各遺伝子欠失株、及び対照として枯草菌１６８株に、バチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開２０００-２１００８１号公報）をコードするＤＮＡ断片（３．１ｋｂ、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域を含む）がシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＢａｍＨＩ制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を、プロトプラスト形質転換法によってそれぞれ導入した。これによって得られた菌株を１０mLのＬＢ培地で一夜３０℃で振盪培養を行い、更にこの培養液０．０５mLを５０mLの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃で３日間、振盪培養を行った。培養後、細胞の密度として培養液のOD600を測定し、次に、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量、及び、細胞当たりのアルカリセルラーゼ分泌生産量を求めた。結果を表５に示す。
【００７３】
表５中のＭ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｃ及びｘｐｆは、それぞれ、sigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子である。
表５に示されるように、sigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子及びylaC遺伝子欠損株並びにsigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子欠損株において細胞当たりのアルカリセルラーゼ分泌生産量が増加しており、セルラーゼの生産性向上に有用であることがわかる。中でもsigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子欠損株は細胞当たりのアルカリセルラーゼ分泌生産量が特に高く、セルラーゼの生産性向上に特に有用である。
【００７４】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】SOE−PCRによる遺伝子欠失用DNA断片の調製、及び当該DNA断片を用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法を模式的に示したものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。ゲノム情報の公開されている産業的に有用な宿主微生物としては、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（非特許文献１）、大腸菌Escherichia coli K-12 MG1655（非特許文献２）、コリネバクテリウムCorynebacterium glutamicum ATCC132032などが挙げられ、これらのゲノム情報を利用し、改良を加えた菌株が開発されている。しかしながら、このような取り組みにも拘わらず、生産効率は必ずしも満足できるものではない。
【０００４】
最近、ある種の微生物について、胞子形成初期に関わる遺伝子を欠失又は不活性化した菌株が構築され、タンパク質やポリペプチドの生産性向上効果が得られている。
例えば、枯草菌のsigE遺伝子 、sigF遺伝子、spoIIE遺伝子、spoIISB遺伝子、sigG遺伝子、又は、spoIVCB遺伝子からspoIIIC遺伝子までの領域に含まれる遺伝子群を欠失した宿主菌株を用いることによって、セルラーゼなどの分泌生産性が向上することが報告されている（特許文献１）。
【０００５】
また、バチルス属細菌は、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットとしてプロモーター配列の認識に関与するシグマ因子を複数有している。異なるプロモーターを認識するシグマ因子が、シグマ因子以外の複数サブユニットから成るＲＮＡポリメラーゼコア複合体に結合することによって異なる遺伝子が転写され、これによって、ゲノム上に数千個存在する遺伝子について、状況に応じた遺伝子の発現制御を行っていると考えられている。
例えば、バチルス属細菌のうち、枯草菌については１７個のシグマ因子が同定されており、栄養増殖期において生育に必須な遺伝子の転写に関与する主要シグマ因子（ハウスキーピングシグマ因子）であるSigAをはじめ、胞子形成過程を制御するシグマ因子SigH、SigF、SigE、SigG、SigK、べん毛形成や細胞壁溶解を制御するシグマ因子SigD、ある種のアミノ酸や糖の代謝を制御するシグマ因子SigL、環境変化への対応を制御するシグマ因子SigBやECF（extracytoplasmic function）シグマと呼ばれるシグマ因子等の存在が知られている。
【０００６】
枯草菌は７個のECFシグマ因子をコードしている。枯草菌のsigＭ遺伝子は、抗生物質により誘発される細胞外被ストレスや、酸、エタノール、超酸化物ストレスにより活性化されるＥＣＦシグマ因子σＭをコードする（非特許文献３）。sigＸ遺伝子は、ペプチドグリカンの代謝回転や細胞表層電荷を調節する遺伝子などを制御するσＸをコードする（非特許文献４,５）。sigＷ遺伝子は、細胞壁で活性を示す抗生物質の存在下で活性化する遺伝子群などを制御するσＷをコードする（非特許文献６-８）。sigＶ遺伝子は、σＸやσＷにより活性化される遺伝子などを制御することが示唆されているσＶをコードしている（非特許文献９）。sigＹ遺伝子は、毒性ペプチドをコードすると推論されているオペロンや、抗菌ペプチドに対して免疫機能を示すと推定されるタンパク質をコードするybgBを制御するσＹをコードする（非特許文献１０,１１）。sigＺ遺伝子は、機能未知のシグマ因子σＺをコードする。ylaC遺伝子は、酸化ストレス耐性に寄与すると示唆されているσYlaCをコードする（非特許文献１２）。
【０００７】
また、xpf遺伝子は、欠陥プロファージＰＢＳＸ配列上にコードされるＲＮＡポリメラーゼシグマ因子Xpfをコードする（非特許文献１３）。
【０００８】
しかしながら、ＥＣＦシグマ因子をコードする遺伝子及びXpfをコードする遺伝子を複数同時に欠失又は不活性化した微生物はこれまでに知られていない。
【０００９】
【特許文献１】特開２００３−４７４９０号公報
【特許文献２】特表２００１−５１００４６号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／０１５７６４２号明細書
【非特許文献１】Nature,390,249,1997
【非特許文献２】Science,277,1453,1997
【非特許文献３】Mol Microbiol，67,830,2008
【非特許文献４】J Mol Biol 279,165,1998
【非特許文献５】J Bacteriol，186，1136，2004
【非特許文献６】J Mol Biol，316，443，2002
【非特許文献７】Mol Microbiol，45，1267，2002
【非特許文献８】Sci Prog，89，243，2006
【非特許文献９】FEMS Microbiol Lett，253: 221-229.
【非特許文献１０】J Bacteriol，185，2003
【非特許文献１１】J Biochem(Tokyo),134,935,2003
【非特許文献１２】J Microbiol, 44,206,2006
【非特許文献１３】J Bacteriol, 176,5820,1994
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの生産性がより向上された微生物、及び当該微生物を利用して、目的のタンパク質又はポリペプチドを製造する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、微生物ゲノム上にコードされる各種遺伝子において、有用なセルラーゼの生産に影響を及ぼす遺伝子を探索したところ、枯草菌のSigM、SigV、SigW、SigX、SigY、SigZ、YlaC、XpfをそれぞれコードするsigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子又はこれら各遺伝子に相当する８遺伝子をゲノム上から欠失又は不活性化した後、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した場合に、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性が、当該遺伝子の欠失又は不活性化前と比較して向上することを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
（１）枯草菌のsigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子又はこれら各遺伝子に相当する８遺伝子をゲノムから欠失又は不活性化された微生物株。
（２）当該微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの生産方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の組換え微生物は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性が高いものである。よって、これを用いて目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産を行えば、当該物質の生産に必要な時間やコストを削減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１５】
本明細書において、転写開始制御領域は、プロモーター及び転写開始点を含む領域であり、リボソーム結合部位は、開始コドンと共に翻訳開始制御領域を形成するShine-Dalgarno（SD）配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)）に相当する部位である。
【００１６】
本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
本発明の微生物を構築するための親微生物としては、枯草菌のSigM、SigV、SigW、SigX、SigY、SigZ、YlaC、XpfのそれぞれをコードするsigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子又はこれら各遺伝子に相当する８遺伝子を有するものであればよく、これらは野生型のものでも変異を施したものでもよい。具体的には、バチルス（Bacillus）属細菌や、クロストリジウム(Clostridium)属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス（Bacillus）属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。
【００１７】
本発明において欠失又は不活性化の対象となる枯草菌のsigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子は、それぞれ枯草菌のECF（extracytoplasmic function）ファミリーに属するシグマ因子であるSigM、SigV、SigW、SigX、SigY、SigZ、YlaCをコードする遺伝子である。
枯草菌については１７個のシグマ因子が同定されており、栄養増殖期において生育に必須な遺伝子の転写に関与する主要シグマ因子（ハウスキーピングシグマ因子）であるSigAをはじめ、胞子形成過程を制御するシグマ因子SigH、SigF、SigE、SigG、SigK、べん毛形成や細胞壁溶解を制御するシグマ因子SigD、ある種のアミノ酸や糖の代謝を制御するシグマ因子SigL、環境変化への対応を制御するシグマ因子SigBやECFシグマと呼ばれるシグマ因子等の存在が知られている。
栄養増殖期には主としてSigAがＲＮＡポリメラーゼコア複合体と会合してSigAが認識するプロモーターを有する遺伝子、またはオペロンの転写を誘導しているが、細胞周囲の環境が変化するとECFシグマ因子のひとつであるSigXが活性化することで、SigXが認識するプロモーターを有する遺伝子、またはオペロンの転写を誘導し、環境変化に対応するといわれている（American Society for Microbiology, pp289, (2002)）。
【００１８】
また、本発明において欠失又は不活性化の対象となる枯草菌のxpf遺伝子は、欠陥プロファージＰＢＳＸ配列上にコードされるＲＮＡポリメラーゼシグマ因子Xpfをコードする（非特許文献１３）。Xpfは、ＰＢＳＸの後期プロモーターによる遺伝子発現に必要であることが知られている（非特許文献１３）。
【００１９】
斯かる遺伝子の産物SigM、SigV、SigW、SigX、SigY、SigZ、YlaC、Xpfは、表１に記載されているようにそれぞれ各種機能を有する。
【００２０】
【表１】
【００２１】
また、表１に示される枯草菌の各遺伝子と同じ機能を有する、及び／又は表１の各遺伝子と塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する、他の微生物由来、好ましくはバチルス（Bacillus）属細菌由来の遺伝子は、これら遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明において欠失、不活性化すべき遺伝子に含まれる。
【００２２】
欠失又は不活性化する遺伝子は、上記に示す、sigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子又はこれら各遺伝子に相当する８遺伝子であればよく、具体的には、sigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子の欠失又は不活性化が挙げられる。
尚、遺伝子の欠失や不活性化には、当該遺伝子中の全部又は一部の塩基の置換・欠失の他、当該遺伝子中への塩基の挿入が含まれる。
【００２３】
本発明遺伝子の不活性化は、当該遺伝子中に他のDNA断片を挿入する、或いは当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行うことができるが、好適には、標的遺伝子を物理的に欠失させる方がより望ましい。
【００２４】
本発明遺伝子の欠失又は不活性化の手順としては、表１に示した、sigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子の８遺伝子又はこれら各遺伝子に相当する８遺伝子（標的遺伝子）を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。
【００２５】
標的遺伝子を欠失又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である。或いは、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活性化した標的遺伝子、又は図１のように標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片等をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又は標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失或いは不活性化した遺伝子断片と置換することが可能である。
【００２６】
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol.Gen.Genet.,223,268,1990等)、こうした方法を繰り返すことによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。
【００２７】
また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化についてもランダムにクローニングしたDNA断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射すること等によっても実施可能である。
【００２８】
以下に、具体例を挙げて、SOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989)によって調製される欠失用DNA断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明する。
【００２９】
ここで用いる欠失用ＤＮＡ断片は、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約０．６〜１．０ｋｂ断片と、同じく下流に隣接する約０．６〜１．０ｋｂ断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、１回目のＰＣＲによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側１０〜３０塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側１０〜３０塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
【００３０】
次いで、１回目に調製した３種類のＰＣＲ断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて２回目のＰＣＲを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列に於いて、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、ＰＣＲ増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したＤＮＡ断片を得ることができる（図１）。
【００３１】
薬剤耐性マーカー遺伝子として、クロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、例えば表２に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989)等に示される通常の条件によりSOE−PCRを行うことによって、各遺伝子の欠失用DNA断片が得られる。
【００３２】
かくして得られた遺伝子欠失用ＤＮＡ断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のある欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、標的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換した細胞、或いは標的遺伝子内に薬剤耐性遺伝子が挿入された細胞が薬剤耐性マーカーによる選択によって分離できる（図１）。即ち、後記表２に示したプライマーセットを用いて調製した欠失用ＤＮＡ断片を導入した場合、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法などによってゲノム上の目的遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換されていることを確認すれば良い。
【００３３】
以下に、ゲノム上の欠失対象遺伝子と置換されたクロラムフェニコール耐性遺伝子を除去する方法について説明する。
【００３４】
薬剤耐性マーカー遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を用いる場合、欠失対象遺伝子を欠失したＤＮＡコンストラクトを有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドを構築する。つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ゲノム上の欠失対象遺伝子の上流に隣接する約０．６〜１．０ｋｂ断片、及び、下流に隣接する約０．６〜１．０ｋｂ断片をそれぞれ調製し、ＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって２断片を結合させる。この断片を例えばｐＣＨＥ１１（Mol Microbiol. 67(2), 291-304（2008））などのカナマイシン耐性温度感受性プラスミドに挿入する。この欠失対象遺伝子の上流と下流の断片を有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドを用いて、ゲノム上の欠失対象遺伝子とクロラムフェニコール耐性遺伝子が置換された株をコンピテント法により形質転換を行い、３０℃においてカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離できる。得られたカナマイシン耐性形質転換体のうちいくつかのコロニーは、用いたプラスミドの欠失対象遺伝子の上流と下流の断片からなるＤＮＡコンストラクトと、ゲノム上の欠失対象遺伝子とクロラムフェニコール耐性遺伝子が置換された株の欠失対象遺伝子の上流配列および下流配列との相同組換えにより置換したクロラムフェニコール感受性株となる。したがって、カナマイシン耐性でクロラムフェニコール感受性の形質転換体を選抜用の抗生物質を含まないＬＢ培地で３７℃において培養してプラスミドが脱落した株を取得できる。ＰＣＲによってクロラムフェニコール耐性遺伝子が削除された遺伝子欠失株を確認することができる。
【００３５】
あるいは、致死遺伝子を利用した方法（特願2008-076008号参照）により遺伝子を欠失して選抜マーカー遺伝子をゲノム上から除去することもできる。
【００３６】
本発明の微生物は、かくして作製された微生物に、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって作製することができる。
ここで、「目的タンパク質又はポリペプチド」は、製造又は精製が目的の一つであるタンパク質又はポリペプチドをいう。また、「目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を有する微生物」において、遺伝子とは、その微生物が本来有する遺伝子を含むのみならず、その微生物は本来有しない遺伝子、すなわち外来の遺伝子を含む意である。
【００３７】
目的タンパク質又は目的ポリペプチドは特に限定されず、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や生理活性ペプチドなどが含まれるが、産業用酵素が好ましい。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase)、転移酵素(Transferase)、加水分解酵素(Hydrolase)、脱離酵素(Lyase)、異性化酵素(Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。
【００３８】
本発明の組換え微生物を用いて生産されるセルラーゼとしては、多糖加水分解酵素の分類（Biochem.J.,280,309,1991）中でファミリー5に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバチルス（Bacillus）属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。例えば、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）、やバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-64株（FERM BP-2886）由来のアルカリセルラーゼが挙げられ、更に好適な例としては、配列番号２のアミノ酸番号１〜７９５のアミノ酸配列からなるバチルス（Bacillus）属細菌由来のアルカリセルラーゼ、又は配列番号４のアミノ酸番号１〜７９３のアミノ酸配列からなるバチルス（Bacillus）属細菌由来のアルカリセルラーゼ、或いは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
【００３９】
プロテアーゼとしては、微生物由来、好ましくはバチルス（Bacillus）属細菌由来、より好ましくはバチルス クラウジ（Bacillus clausii） KSM-K16株（FERM BP-3376）由来のプロテアーゼが挙げられる。バチルス クラウジ（Bacillus clausii） KSM-K16株株由来のアルカリプロテアーゼのより具体的な例としては、配列番号６のアミノ酸番号１〜３８０のアミノ酸配列からなるバチルス（Bacillus）属細菌由来のアルカリプロテアーゼや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。
【００４０】
また、α-アミラーゼとしては、微生物由来、好ましくはバチルス（Bacillus）属細菌由来、より好ましくはバチルス エスピー（Bacillus sp.） KSM-K38株由来のα-アミラーゼが挙げられる。
【００４１】
本発明の微生物に導入される目的タンパク質又は目的ポリペプチドの遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域由来であるものが、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているバチルス（Bacillus）属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。
より具体的には配列番号１で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号２で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、或いは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているＤＮＡ断片を意味する。
【００４２】
上記の目的タンパク質又は目的ポリペプチドの遺伝子を含むＤＮＡ断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法を用いて宿主微生物細胞に取り込ませることによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。また、当該ＤＮＡ断片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合したＤＮＡ断片を用い、宿主微生物ゲノムに直接組み込むことによっても本発明の組換え微生物を得ることができる。
【００４３】
本発明の組換え微生物を用いた目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、目的タンパク質又は目的ポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。そして、後記実施例に示すように、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性は、sigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子、xpf遺伝子を欠失又は不活性化していない微生物を用いた場合と比較して、その向上が達成されている。
【００４４】
以下に、本発明の組換え微生物の構築方法及び当該組換え微生物を用いたセルラーゼの生産方法について具体的に説明する。
【実施例】
【００４５】
以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmol及びPyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。
【００４６】
以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
【００４７】
また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域を示す。
【００４８】
枯草菌の形質転換は以下の様に行った。
すなわち、枯草菌株をSPI培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.02% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/mL トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.01% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/mL トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μLに各種DNA断片を含む溶液(SOE-PCRの反応液等)5μLを添加し、37℃で1時間振盪培養後、適切な薬剤を含むLB寒天培地(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、1.5%寒天)に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。
【００４９】
セルラーゼ活性測定については、1/7.5M リン酸緩衝液(pH7.4 和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに0.4mM p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を50μL加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を420nmにおける吸光度(OD420nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。
【００５０】
〔実施例１〕
本実施例では、枯草菌１６８株からsigY遺伝子、sigZ遺伝子、sigV遺伝子、ylaC遺伝子、sigX遺伝子、sigM遺伝子、sigW遺伝子及びxpf遺伝子を欠失した枯草菌株を、以下のようにして作製した。また、以下の手順において使用するプライマー名及びその塩基配列を表２、表３および表４に纏めて示した。
【００５１】
【表２】
【００５２】
【表３】
【００５３】
【表４】
【００５４】
第1段階として、sigY遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子に置換するためのＤＮＡ断片であるcmカセットを、表２に示したプライマーを使用したSOE−PCRにより構築した。
枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したsigY-AfとsigY-Ar、及びsigY-BfとsigY-Brの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigY遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｙ−Ａ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｙ−Ｂ）をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpC194（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）のクロラムフェニコール耐性遺伝子をプラスミドｐＵＣ１８のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ切断点に挿入した組換えプラスミドpCBB31を鋳型とし、表２に示したCmFとCmRプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む１ｋｂ断片（Ｃ）を調製した。次に、得られた（Ｙ−Ａ）（Ｙ−Ｂ）（Ｃ）３断片を混合して鋳型とし、表のプライマーsigY-AfとsigY-Brを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｙ−Ａ）（Ｃ）（Ｙ−Ｂ）の順になる様に結合させ、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た（図参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法により枯草菌１６８株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、ＰＣＲによってsigY遺伝子が欠失され、クロラムフェニコール耐性遺伝子に置換していることを確認した。
【００５５】
第2段階として、表３に示したプライマーを用いてsigY遺伝子を欠失したDNAコンストラクトを有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11(ΔsigY) を構築した。つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示したsigY5'FとsigY5'R及びsigY3'FとsigY3'Rの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigY遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｙ−Ｄ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｙ−Ｅ）をそれぞれ調製した。表３のsigY5'FとsigY3'Rのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、（Ｙ−Ｄ）（Ｙ−Ｅ）の２断片を結合させ、１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片を制限酵素BamHIで切断してカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11（Mol Microbiol. 67(2), 291-304（2008））のBamHI部位に挿入した。このプラスミドpCHE11(ΔsigY)を用いて第1段階で得られたsigY::cm株をコンピテント法により形質転換を行い、30℃においてカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られたカナマイシン耐性形質転換体のうちいくつかのコロニーは、pCHE11(ΔsigY)上のΔsigYとsigY::cm株染色体上のsigY::cm との相同組換えによりクロラムフェニコール感受性となった。KmrCms形質転換体を選抜用の抗生物質を含まないＬＢ培地で37℃において培養してプラスミドが脱落したΔsigY株を取得した。ＰＣＲによってクロラムフェニコール耐性遺伝子が削除されたΔsigYを確認した。
【００５６】
次に、以上のsigYについて行った第1段階と第2段階の操作を、ΔsigY株のsigZ遺伝子について行い、sigY遺伝子及びsigZ遺伝子を欠失した２重欠失株を構築した。
つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したsigZ-AfとsigZ-Ar、及びsigZ-BfとsigZ-Brの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigZ遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｚ−Ａ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｚ−Ｂ）をそれぞれ調製した。次に、得られた（Ｚ−Ａ）、（Ｚ−Ｂ）及び前述のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む１ｋｂ断片（Ｃ）の３断片を混合して鋳型とし、表のプライマーsigZ-AfとsigZ-Brを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｚ−Ａ）（Ｃ）（Ｚ−Ｂ）の順になる様に結合させ、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た（図参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法によりΔsigY株の形質転換を行い、ΔsigY sigZ::cm株を取得した。
【００５７】
第2段階として、表３に示したプライマーを用いてsigZ遺伝子を欠失したDNAコンストラクトを有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11(ΔsigZ) を構築した。つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示したsigZ5'FとsigZ5'R及びsigZ3'FとsigZ3'Rの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigZ遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｚ−Ｄ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｚ−Ｅ）をそれぞれ調製した。表３のsigZ5'FとsigZ3'Rのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、（Ｚ−Ｄ）（Ｚ−Ｅ）の２断片を結合させ、１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片を制限酵素BamHIで切断してカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11のBamHI部位に挿入した。このプラスミドpCHE11(ΔsigZ)を用いて第1段階で得られたΔsigY sigZ::cm株をコンピテント法により形質転換を行い、前述と同様の方法によりΔsigYΔsigZ株を取得した。
【００５８】
更に、第1段階と第2段階の操作を、ΔsigYΔsigZ株のsigV遺伝子について行い、sigY遺伝子、sigZ遺伝子及びsigV遺伝子を欠失した３重欠失株を構築した。
つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したsigV-AfとsigV-Ar、及びsigV-BfとsigV-Brの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigV遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｖ−Ａ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｖ−Ｂ）をそれぞれ調製した。次に、得られた（Ｖ−Ａ）、（Ｖ−Ｂ）及び前述のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む１ｋｂ断片（Ｃ）の３断片を混合して鋳型とし、表のプライマーsigV-AfとsigV-Brを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｖ−Ａ）（Ｃ）（Ｖ−Ｂ）の順になる様に結合させ、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た（図参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法によりΔsigYΔsigZ株の形質転換を行い、ΔsigYΔsigZ sigV::cm株を取得した。
【００５９】
第2段階として、表３に示したプライマーを用いてsigV遺伝子を欠失したDNAコンストラクトを有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11(ΔsigV) を構築した。つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示したsigV5'FとsigV5'R及びsigV3'FとsigV3'Rの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigV遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｖ−Ｄ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｖ−Ｅ）をそれぞれ調製した。表３のsigV5'FとsigV3'Rのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、（Ｖ−Ｄ）（Ｖ−Ｅ）の２断片を結合させ、１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片を制限酵素BamHIで切断してカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11のBamHI部位に挿入した。このプラスミドpCHE11(ΔsigV)を用いて第1段階で得られたΔsigYΔsigZ sigV::cm株をコンピテント法により形質転換を行い、前述と同様の方法によりΔsigYΔsigZΔsigV株を取得した。
【００６０】
更に、第1段階と第2段階の操作を、ΔsigYΔsigZΔsigV株のylaC遺伝子について行い、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、sigV遺伝子、及びylaC遺伝子を欠失した４重欠失株を構築した。
つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したylaC-AfとylaC-Ar、及びylaC-BfとylaC-Brの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のylaC遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｃ−Ａ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｃ−Ｂ）をそれぞれ調製した。次に、得られた（Ｃ−Ａ）、（Ｃ−Ｂ）及び前述のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む１ｋｂ断片（Ｃ）の３断片を混合して鋳型とし、表のプライマーylaC-AfとylaC-Brを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｃ−Ａ）（Ｃ）（Ｃ−Ｂ）の順になる様に結合させ、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た（図参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法によりΔsigYΔsigZΔsigV株の形質転換を行い、ΔsigYΔsigZΔsigV ylaC::cm株を取得した。
【００６１】
第2段階として、表３に示したプライマーを用いてylaC遺伝子を欠失したDNAコンストラクトを有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11(ylaC) を構築した。つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示したylaC5'FとylaC5'R及びylaC3'FとylaC3'Rの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のylaC遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｃ−Ｄ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｃ−Ｅ）をそれぞれ調製した。表３のylaC5'FとylaC3'Rのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、（Ｃ−Ｄ）（Ｃ−Ｅ）の２断片を結合させ、１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片を制限酵素BamHIで切断してカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11のBamHI部位に挿入した。このプラスミドpCHE11(ΔylaC)を用いて第1段階で得られたΔsigYΔsigZΔsigV ylaC::cm株をコンピテント法により形質転換を行い、前述と同様の方法によりΔsigYΔsigZΔsigVΔylaC株を取得した。
【００６２】
更に、第1段階と第2段階の操作を、ΔsigYΔsigZΔsigVΔylaC株のsigX遺伝子について行い、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、sigV遺伝子、ylaC遺伝子、及びsigX遺伝子を欠失した５重欠失株を構築した。
つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したsigX-AfとsigX-Ar、及びsigX-BfとsigX-Brの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigX遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｘ−Ａ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｘ−Ｂ）をそれぞれ調製した。次に、得られた（Ｘ−Ａ）、（Ｘ−Ｂ）及び前述のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む１ｋｂ断片（Ｃ）の３断片を混合して鋳型とし、表のプライマーsigX-AfとsigX-Brを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｘ−Ａ）（Ｃ）（Ｘ−Ｂ）の順になる様に結合させ、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た（図参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法によりΔsigYΔsigZΔsigVΔylaC株の形質転換を行い、ΔsigYΔsigZΔsigVΔylaC sigX::cm株を取得した。
【００６３】
第2段階として、表３に示したプライマーを用いてsigX遺伝子を欠失したDNAコンストラクトを有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11(ΔsigX) を構築した。つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示したsigX5'FとsigX5'R及びsigX3'FとsigX3'Rの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigX遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｘ−Ｄ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｘ−Ｅ）をそれぞれ調製した。表３のsigX5'FとsigX3'Rのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、（Ｘ−Ｄ）（Ｘ−Ｅ）の２断片を結合させ、１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片を制限酵素BamHIで切断してカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11のBamHI部位に挿入した。このプラスミドpCHE11(ΔsigX)を用いて第1段階で得られたΔsigYΔsigZΔsigVΔylaC sigX::cm株をコンピテント法により形質転換を行い、前述と同様な方法によりΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigX株を取得した。
【００６４】
更に、第1段階と第2段階の操作を、ΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigX株のsigM遺伝子について行い、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、sigV遺伝子、ylaC遺伝子、sigX及びsigM遺伝子を欠失した６重欠失株を構築した。
つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したsigM-AfとsigM-Ar、及びsigM-BfとsigM-Brの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigM遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｍ−Ａ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｍ−Ｂ）をそれぞれ調製した。次に、得られた（Ｍ−Ａ）、（Ｍ−Ｂ）及び前述のクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む１ｋｂ断片（Ｃ）の３断片を混合して鋳型とし、表のプライマーsigM-AfとsigM-Brを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｍ−Ａ）（Ｃ）（Ｍ−Ｂ）の順になる様に結合させ、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た（図参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法によりΔsigYΔsigZΔsigVΔylaC株の形質転換を行い、ΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigX sigM::cm株を取得した。
【００６５】
第2段階として、表３に示したプライマーを用いてsigM遺伝子を欠失したDNAコンストラクトを有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11(ΔsigM) を構築した。つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示したsigM5'FとsigM5'R及びsigM3'FとsigM3'Rの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigM遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｍ−Ｄ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｍ−Ｅ）をそれぞれ調製した。表３のsigM5'FとsigM3'Rのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、（Ｍ−Ｄ）（Ｍ−Ｅ）の２断片を結合させ、１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片を制限酵素BamHIで切断してカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11のBamHI部位に挿入した。このプラスミドpCHE11(ΔsigM)を用いて第1段階で得られたΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigX sigM::cm株をコンピテント法により形質転換を行い、前述と同様の方法によりΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigXΔsigM株を取得した。
【００６６】
更に、第1段階と第2段階の操作を、ΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigXΔsigM株のsigW遺伝子について行い、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、sigV遺伝子、ylaC遺伝子、sigX遺伝子、sigM遺伝子、及びsigW遺伝子を欠失した７重欠失株を構築した。
つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したsigW-AfとsigW-Ar、及びsigW-BfとsigW-Brの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigW遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｗ−Ａ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｗ−Ｂ）をそれぞれ調製した。次に、得られた（Ｗ−Ａ）、（Ｗ−Ｂ）及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む１ｋｂ断片（Ｃ）の３断片を混合して鋳型とし、表のプライマーsigW-AfとsigW-Brを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｗ−Ａ）（Ｃ）（Ｗ−Ｂ）の順になる様に結合させ、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た（図参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法によりΔsigYΔsigZΔsigVΔylaC株の形質転換を行い、ΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigXΔsigM sigW::cm株を取得した。
【００６７】
第2段階として、表３に示したプライマーを用いてsigW遺伝子を欠失したDNAコンストラクトを有するカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11(ΔsigW) を構築した。つまり、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示したsigW5'FとsigW5'R及びsigW3'FとsigW3'Rの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のsigW遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｗ−Ｄ）、及び、下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｗ−Ｅ）をそれぞれ調製した。表３のsigW5'FとsigW3'Rのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、（Ｗ−Ｄ）（Ｗ−Ｅ）の２断片を結合させ、１．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。この断片を制限酵素BamHIで切断してカナマイシン耐性温度感受性プラスミドpCHE11のBamHI部位に挿入した。このプラスミドpCHE11(ΔsigW)を用いて第1段階で得られたΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigXΔsigM sigW::cm株をコンピテント法により形質転換を行い、前述と同様の方法によりΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigXΔsigMΔsigW株を取得した。
更に、ΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigXΔsigMΔsigW株のxpf遺伝子を以下のように削除し、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、sigV遺伝子、ylaC遺伝子、sigX遺伝子、sigM遺伝子、sigW遺伝子、及びxpf遺伝子を欠失した8重欠失株を構築した。
【００６８】
先ず、枯草菌168株aprE遺伝子領域にスペクチノマイシン耐性遺伝子、lacI遺伝子、Pspac-chpA遺伝子を含むDNA断片を挿入した168 (aprE::spec, lacI, Pspac-chpA) 株（特願2008-076008 ）の染色体DNAを鋳型として、表４に示したAPNC-FプライマーとchpA-R(Bam)プライマーを用いてPCRにより増幅した。増幅したDNA断片を選択マーカー遺伝子カセット（断片F）と称する。
また、枯草菌168株の染色体DNAを鋳型として、xpf遺伝子の5'外側領域（断片Ｇ）、3'外側領域（断片Ｈ）及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｉ）を、それぞれ表４に示したxpf-DF1とxpf-DR1、xpf-DF2とxpf-DR2及びxpf-IFとxpf-IRを用いてPCRにより増幅した。次に、これらPCRによって得られた選択マーカー遺伝子カセット（断片F）、5'外側領域（断片Ｇ）、3'外側領域（断片Ｈ）及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｉ）並びにxpf-DF1とxpf-IRを用いてSOE-PCR法（Gene,77,61 (1989)）を行った。これにより、5'外側領域（断片Ｇ）、3'外側領域（断片Ｈ）、選択マーカー遺伝子カセット（断片F）及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｉ）がこの順で配置したDNA断片を取得した。このDNA断片を供与体DNAとして使用した。
【００６９】
このように取得された供与体DNAを用いてΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigXΔsigMΔsigW株を形質転換し、スペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。この培養によれば、第１相同組み換えによって供与体DNAが組み込まれてスペクチノマイシン耐性を示す枯草菌のみが生育することとなる。
【００７０】
次に、スペクチノマイシン耐性を指標として選択された形質転換体をLB液体培地で一晩培養し、希釈した培養液を1mM IPTGを入れたLB寒天プレートに塗布した。chpA遺伝子は、大腸菌におけるトキシンの一種であるmazFをコードする遺伝子として知られている。IPTGにより誘導されてPspac-chpA遺伝子が発現すると、細胞は増殖できず死滅する。IPTG含有LB寒天プレート上に生育した形質転換枯草菌は、第２相同組み換えによって、欠失対象領域とともに供与体DNAが宿主DNAから欠失したΔsigYΔsigZΔsigVΔylaCΔsigXΔsigMΔsigWΔxpf株と考えられる。ＰＣＲによってスペクチノマイシン耐性遺伝子が削除されたことを確認した。
【００７１】
また、同様にして表５に示す各遺伝子を欠失した株を構築した。表５中のＭ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｃ及びｘｐｆは、それぞれ、sigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子である。
【００７２】
〔実施例２〕
実施例１にて得られた各遺伝子欠失株、及び対照として枯草菌１６８株に、バチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開２０００-２１００８１号公報）をコードするＤＮＡ断片（３．１ｋｂ、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域を含む）がシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＢａｍＨＩ制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を、プロトプラスト形質転換法によってそれぞれ導入した。これによって得られた菌株を１０mLのＬＢ培地で一夜３０℃で振盪培養を行い、更にこの培養液０．０５mLを５０mLの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃で３日間、振盪培養を行った。培養後、細胞の密度として培養液のOD600を測定し、次に、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量、及び、細胞当たりのアルカリセルラーゼ分泌生産量を求めた。結果を表５に示す。
【００７３】
表５中のＭ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｃ及びｘｐｆは、それぞれ、sigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子である。
表５に示されるように、sigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子及びylaC遺伝子欠損株並びにsigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子欠損株において細胞当たりのアルカリセルラーゼ分泌生産量が増加しており、セルラーゼの生産性向上に有用であることがわかる。中でもsigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子欠損株は細胞当たりのアルカリセルラーゼ分泌生産量が特に高く、セルラーゼの生産性向上に特に有用である。
【００７４】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】SOE−PCRによる遺伝子欠失用DNA断片の調製、及び当該DNA断片を用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法を模式的に示したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌（Bacillus subtilis）のsigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子又はこれら各遺伝子に相当する８遺伝子をゲノムから欠失又は不活性化された微生物。
【請求項２】
微生物がバチルス（Bacillus）属細菌である請求項１記載の微生物。
【請求項３】
バチルス（Bacillus）属細菌が枯草菌（Bacillus subtilis）である請求項２記載の微生物。
【請求項４】
組換え微生物株が、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入したものである請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物。
【請求項５】
目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌用シグナル領域のいずれか１以上の領域を結合した請求項４記載の微生物。
【請求項６】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を結合した請求項５記載の微生物。
【請求項７】
分泌シグナル領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域由来のものである請求項６記載の微生物。
【請求項８】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号１で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと７０％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片である請求項６又は７記載の微生物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの生産方法。
【請求項１】
枯草菌（Bacillus subtilis）のsigM遺伝子、sigV遺伝子、sigW遺伝子、sigX遺伝子、sigY遺伝子、sigZ遺伝子、ylaC遺伝子及びxpf遺伝子又はこれら各遺伝子に相当する８遺伝子をゲノムから欠失又は不活性化された微生物。
【請求項２】
微生物がバチルス（Bacillus）属細菌である請求項１記載の微生物。
【請求項３】
バチルス（Bacillus）属細菌が枯草菌（Bacillus subtilis）である請求項２記載の微生物。
【請求項４】
組換え微生物株が、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入したものである請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物。
【請求項５】
目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌用シグナル領域のいずれか１以上の領域を結合した請求項４記載の微生物。
【請求項６】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域を結合した請求項５記載の微生物。
【請求項７】
分泌シグナル領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域由来のものである請求項６記載の微生物。
【請求項８】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号１で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと７０％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片である請求項６又は７記載の微生物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの生産方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−１３６６８９（Ｐ２０１０−１３６６８９Ａ）
【公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３１６８６９（Ｐ２００８−３１６８６９）
【出願日】平成２０年１２月１２日（２００８．１２．１２）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【出願人】（５０４１９０５４８）国立大学法人埼玉大学 (292)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１２日（２００８．１２．１２）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【出願人】（５０４１９０５４８）国立大学法人埼玉大学 (292)
【Ｆターム（参考）】
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