組換え的に改変されたプラスミン
組換え的に改変されたプラスミン（オーゲン）分子に関するポリヌクレオチドおよびポリペプチドが提供される。プラスミン（オーゲン）分子は、外来配列が存在しないように組み合わされた、天然ヒトプラスミノーゲン分子に存在する活性化部位に対してＮ末端の単一のクリングルドメインを有し、そしてリシン結合および天然酵素と関連する有意な酵素特性を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
本願は、引用することにより本明細書に組み込まれる、２００７年１１月２９日に出願された米国仮出願６０／９９１，１４８に対する３５ ＵＳＣ §１１９の下で優先権を請求する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトプラスミノーゲンは、７９１アミノ酸残基を含有する１本鎖タンパク質である。プラスミンへのプラスミノーゲンの活性化は、チモーゲンにおけるＡｒｇ５６１−Ｖａｌ５６２ペプチド結合の単一切断によって起こる。得られるプラスミン分子は、トリプシン様特異性（ＬｙｓおよびＡｒｇの後で切断する）を有する２本鎖のジスルフィド結合したセリンプロテアーゼである。
【０００３】
プラスミンのアミノ末端重鎖（残基１〜５６１、〜６０ｋＤａ）は、各々約８０アミノ酸残基を含有する５個のクリングルドメインからなる。クリングルドメインは、活性化阻害剤、例えばＣｌ−１イオンとの：活性化刺激剤、例えばε−アミノカプロン酸との；哺乳類および細菌細胞との；そしてプラスミン生理的基質フィブリンおよびプラスミン阻害剤α２−抗プラスミンのような他のタンパク質との相互作用のような、プラスミノーゲンの調節特性に関与する。全ての５個のクリングルのうち、クリングル１は最も多機能性の１つであり：そのリシン結合活性はα２−抗プラスミンおよびフィブリンとのプラスミン相互作用に関与することが示されている。非特許文献１；および非特許文献２を参照。
【０００４】
プラスミンのＣ末端軽鎖（残基５６２〜７９１、〜２５ｋＤａ）は、トリプシンに相同なそして古典的なセリンプロテアーゼ触媒トライアド：Ｈｉｓ６０３、Ａｓｐ６４６およびＳｅｒ７４１を含有する典型的なセリンプロテアーゼである。プラスミノーゲンは、２４個のジスルフィド架橋ならびにＡｓｎ２８９およびＴｈｒ３４６上の２個のグリコシル化部位を含有する。
【０００５】
エラスターゼによるプラスミノーゲンの限定タンパク質分解は、３つの主要フラグメントをもたらすことが示されている（非特許文献３）。第一のフラグメント、Ｋ１−３は最初の３個のクリングルを含み、そして２つのバージョン、Ｔｙｒ８０−Ｖａｌ３３８およびＴｙｒ８０−Ｖａｌ３５４において単離することができる。第二のフラグメント、Ｋ４は４番目のクリングルに対応し、そして残基Ｖａｌ３５５−Ａｌａ４４０を含む。最後のＣ末端フラグメント（いわゆる、ミニ−プラスミノーゲン）は残基Ｖａｌ４４３−Ａｓｎ７９１を含み、そして５番目のクリングルおよびセリンプロテアーゼドメインからなる。ミニ−プラスミノーゲンは、プラスミノーゲンと同じように活性化することができ、ミニ−プラスミンを生成せしめる。
【０００６】
全長プラスミノーゲン分子の複雑な構造のために、細菌発現系は組換えプラスミノーゲン生産に有用であると判明していない。プラスミノーゲンは不溶性の封入体の形態において生産され、そしてその状態からリフォールディングできない。さらに、哺乳類細胞におけるプラスミノーゲンの発現は、プラスミンへのプラスミノーゲンの細胞内活性化および結果として生じる細胞毒性により複雑化される。昆虫細胞を用いた完全に活性のプラスミノーゲンの生産は可能であり、しかしながら、この系は低収率のために大規模生産に適していない。さらに、任意の組換えタンパク質スキームのように、治療用組換えタンパク質を与えられる患者において免疫原性問題に直面する可能性がある。
【０００７】
免疫原性は、ある種の組換えタンパク質治療スキームの有効なそして／もしくは効率の良い利用に対する障害であり得る。免疫原性は外来と認識される物質（例えば、アミノ酸配列を包含するタンパク質の化学構造）に対する複雑な一連の反応であり、そして中和および非中和抗体の生産、免疫複合体の形成、補体活性化、マスト細胞活性化、炎症ならびにアナフィラキシーを包含することができる。免疫原性は、多様にタンパク質治療の効能および安全性を限定し得る。効能は、中和抗体の形成により直接的に減少され得る。中和もしくは非中和抗体のいずれかへの結合は典型的に血清からの迅速なクリアランスをもたらすので、効能はまた間接的にも減少され得る。免疫反応が引き起こされると重度の副作用および死亡さえ起こり得る。中和抗体が内在性タンパク質と交差反応しそしてその機能を阻止するとある特定のクラスの副作用が起こる。
【０００８】
従って、プラスミン／プラスミノーゲンの望ましい特性（例えば、天然様化学構造を有する領域）を保有し、一方である種の負の特性を欠きそして相当量で細菌細胞を包含する組換えタンパク質発現系において生産することができる改変された組換えタンパク質が望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｗｉｍａｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５７９：１４２−１５４（１９７９）
【非特許文献２】Ｌｕｃａｓ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：４２４９−４２５６（１９８３）
【非特許文献３】Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｌ．，３：１９１−２０９（１９７８）
【発明の概要】
【００１０】
発明の要約
１つの態様において、本発明は
ａ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン、ここで、クリングルドメイン内の最後の４個のアミノ酸残基はＶ、Ｐ、ＱおよびＣである；および
ｂ）ヒトプラスミノーゲンにおける対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメイン
を有するポリペプチド（ここで、該ポリペプチドは固定化リシンに結合する）をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを提供する。
【００１１】
別の態様において、本発明は：
ａ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン、ここで、クリングルドメイン内の最後の４個のアミノ酸残基はＶ、Ｐ、ＱおよびＣである；および
ｂ）ヒトプラスミノーゲンにおける対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメイン
を含んでなるポリペプチド（ここで、該ポリペプチドは固定化リシンに結合する）を提供する。
【００１２】
他の態様において、本発明は本発明のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを提供する。１つの態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：１に示されるようなヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１３】
ある態様において、本発明は本発明のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを含
んでなる培養細胞を提供する。１つの態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：１に示されるようなヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様において、培養細胞は原核生物である。１つの態様において、原核生物はエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００１４】
１つの態様において、本発明は１つもしくはそれ以上の組換えプラスミンポリペプチドを製造する方法を提供する。該方法は：
ａ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン（ここで、クリングルドメイン内の最後の４個のアミノ酸残基はＶ、Ｐ、ＱおよびＣである）；ならびにヒトプラスミノーゲンにおける対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを有するポリペプチド（ここで、該ポリペプチドは固定化リシンに結合する）を提供すること；ならびに
ｂ）段階ａ）において提供されるポリペプチドを１つもしくはそれ以上のペプチド結合を切断するために十分な条件下でプロテアーゼと接触させ、それにより１つもしくはそれ以上の組換えプラスミンポリペプチドを生成せしめること
を含んでなる。１つの態様において、提供することは適当な宿主において配列番号：１に示されるような配列に対応する配列もしくはその縮重バリアントを有するオープンリーディングフレームを発現させることを含んでなる。別の態様において、ポリペプチドは配列番号：２に示されるようなアミノ酸配列を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、タンパク質分解切断による活性化後の天然プラスミンの略図である。Ｋ１〜Ｋ５はクリングル領域１〜５であり；そしてＳＰはセリンプロテアーゼドメインである。「α２−ＡＰ」はクリングル１上のα２−抗プラスミン結合部位である。
【図２】図１におけるのと同じ用語を用いる、そしてＫ２〜５の欠失を示す本発明のプラスミノーゲン欠失突然変異体の略図である。
【図３】−１９〜−１として番号が付けられた１９残基リーダー配列、および残基１〜７９１（配列番号：３、ヒトプラスミノーゲンのｃＤＮＡ配列；および図３に示されるような、配列番号：４、コードされるアミノ酸配列を参照）として示されるプラスミノーゲン配列を示すヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列を示す。以下のもの：（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン配列の１つの態様（網掛け）；クリングルドメイン１〜５（二重下線）；グリコシル化部位Ａｓｎ２８９およびＴｈｒ３４６（ボールド体）；Ａｒｇ−Ｖａｌ活性化部位（ボールド体のＲ５６１Ｖ５６２）；ならびにクリングル１におけるリシン結合部位（下線のそして特定位置番号付けを有する）を包含する多数の特徴が示される。
【図４】天然ヒトプラスミン（オーゲン）（ｐｌａｓｍｉｎ（ｏｇｅｎ））の５個のクリングルドメイン（１〜５）間のポリペプチド配列比較（すなわち、ギャップアラインメント）を示す。クリングル１における同じ相対的位置のものと同一であるアミノ酸残基は下線で示される。
【図５】血漿由来のプラスミン（レーン１＝非還元（ＮＲ）：レーン２＝還元（Ｒ））および（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（レーン３＝非還元（ＮＲ）：レーン４＝還元（Ｒ））調製物の８〜２５％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。それぞれ、天然プラスミンおよび組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミンへの血漿由来のプラスミノーゲンおよび（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンのストレプトキナーゼ活性化は、クリングルおよびセリンプロテアーゼドメインに対応する２本のバンドの形成をもたらす。従って、電気泳動の前の還元剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）とのインキュベーションの後に、非還元ゲル上で単一バンドである血漿由来のプラスミンおよび（ＴＡＬ６００３）−プラスミンは、同じ非還元ゲルにおいてクリングル１（下側のバンド）およびセリンプロテアーゼドメイン（上側のバンド）に対応する２本のバンドに還元する。
【図６】ストレプトキナーゼによる（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの活性化のグラフ表示である。
【図７】リシン−セファロース４Ｂへの（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの結合を示すクロマトグラムである：０．５ｍｇの精製された（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンをＴｒｉｓ緩衝食塩水、ｐＨ７．４で平衡化したリシン−セファロース４Ｂカラム（１ｘ３ｃｍ）上にかけた。結合タンパク質は、単一ピークとしてε−アミノカプロン酸（ε−ＡＣＡ）の０〜２０ｍＭ勾配によりカラムから溶出された。流出容量の関数として、２８０ｎｍでの吸光度およびε−ＡＣＡの濃度をグラフ上に提示する。
【図８】ｔＰＡによるその後の活性化および結果として起こる血栓溶解により評価した場合のフィブリンへの（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの結合を示す。
【図９】血漿由来のプラスミンと（ＴＡＬ６００３）−プラスミンとの血栓溶解効能のインビトロ比較を示す。
【図１０】（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（配列番号：２）のジスルフィド結合パターンを例示する。図において、（Ｘ）はアミノ酸配列ＲＤＶＶＬＦＥＫを表す。
【００１６】
発明の記述
本発明者等は、その構造からの４個のクリングルの欠失にもかかわらず天然プラスミノーゲン様特性を有する（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンと本明細書において呼ばれる新規組換えプラスミノーゲンポリペプチドもしくはそのバリアントを見出した。これらの（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンもしくはそのバリアントは、チモーゲンのクリングルドメインとセリンプロテアーゼドメインとの間に位置するＡｒｇ−Ｖａｌペプチド結合のタンパク質分解切断を少なくとも伴う活性化事象の後に機能性プラスミン酵素（本明細書において（ＴＡＬ６００３）−プラスミンと呼ばれる）に活性化されるようになることができるチモーゲンである。
【００１７】
本発明の（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンもしくはそのバリアントは、全長天然ヒトプラスミノーゲンのフィブリンおよび抗プラスミン結合ならびに活性化特性を有する。さらに、（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは、組換え生産における高レベル発現およびヒト血漿由来のプラスミノーゲンの天然に存在する形態と同一であるかもしくは非常に類似したある種のタンパク質化学構造を包含する多数の新規のそして望ましい特性を有する。
【００１８】
本発明の（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（オーゲン）は、少なくとも下記の事項を特徴とすることができる：
ｉ）（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの活性化後に生成される（ＴＡＬ６００３）−プラスミンのより低い分子量（例えば、１つの態様において約３６，９１１〜約３７，０３９Ｄａ）は、増加した比活性（タンパク質のｍｇ当たり）をもたらす；
ｉｉ）比較的低い分子量と合わせて、天然タンパク質に存在する少なくとも２個のグリコシル化部位（図３参照、すなわち、Ｎ２８９およびＴ３４６）の欠如は、比較的安価な細菌および酵母発現系を用いたこのタンパク質の組換え生産を容易にする；
ｉｉｉ）（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは、プラスミノーゲンアクチベーターｔＰＡ、ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼにより活性化することができる；
ｉｖ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリング
ルドメインの存在は、血栓溶解効能に重要であるプラスミンのフィブリン結合特性を維持する；
ｖ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン上のα２−抗プラスミン結合部位の存在は、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンがプラスミンのこの生理的阻害剤により迅速に阻害されることを可能にする（出血を防ぐことができる特性）；
ｖｉ）（ＴＡＬ６００３）−プラスミンのより小さいサイズは、α２−マクログロブリンによるそれらの阻害を容易にし、さらに天然プラスミンと比較して出血性合併症の機会を減らすことができる。特定の態様において、完全な消化されていないフィブリン（オーゲン）（ｆｉｂｒｉｎ（ｏｇｅｎ））の主要結合部位を保持するクリングル５の欠如は、循環するフィブリノーゲンの減少した枯渇を伴って（ＴＡＬ６００３）−プラスミンの使用を可能にすることができる；
ｖｉｉ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン（ここで、クリングルドメイン内の最後の４個のアミノ酸残基はＶ、Ｐ、ＱおよびＣである）の存在は、セリンプロテアーゼドメインへの天然様連結（すなわち、ヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメインとセリンプロテアーゼドメインとの間の天然に存在するドメイン連結点と同様の連結）を提供する；そして
ｖｉｉｉ）組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの発現後に、そのＮ末端を切断し戻して（ｃｌｅａｖｅｄ ｂａｃｋ）（例えば、活性化中に切断し戻して）天然様Ｎ末端を提供し得る。
【００１９】
一般に、本発明は、ミニ−プラスミン（オーゲン）と比較してある種の利点を有する、活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインに対してＮ末端の単一のクリングル領域を有する組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（オーゲン）ポリペプチドを提供する。本発明の（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは活性化部位に対してＮ末端のそのようなものとして１個のクリングルドメインのみを有するが、ある態様には活性化部位に対してＮ末端の追加の配列が包含される。追加のＮ末端配列は、プラスミノーゲンの天然クリングル領域のもの由来であることができる。
【００２０】
本発明のＮ末端クリングルドメインは、天然プラスミン（オーゲン）のクリングル１および４のクリングル配列ならびにその機能的同等物を含む。特に、リシン結合に関与するかもしくは影響を与える残基の維持を包含する、ポリペプチドバリアントにおける機能の維持に関するガイダンスを提供する以下の説明を参照。
【００２１】
さらに、本発明のポリペプチドの特定の態様は、天然様構造のために減少した免疫原性を示すことができる。例えば、ある態様において、本発明の組換えプラスミノーゲンはヒト血漿由来のプラスミノーゲンの天然に存在する形態の１つのものと同一のＮ末端を有し、それはストレプトキナーゼによる活性化の際に、天然様Ｎ末端を含んでなるプラスミンポリペプチドを生成する。従って、本発明の新規ポリペプチドは、天然に存在するヒトプラスミンにおけるクリングル５とＳＰドメインとの間の連結点と同様のクリングルとセリンプロテアーゼドメインとの間の配列を有する。
【００２２】
定義
他にそれに反して示されない限り、ポリペプチドの「ドメイン」および「領域」という用語は、本明細書において用いる場合に一般に同義語である。「クリングル」もしくは「セリンプロテアーゼ」などのようなよく認識された構造もしくは機能表示と一緒に列挙される場合、そのような用語はそのような表示に対応するポリペプチド構造と関連すると一般に認識されそして理解される少なくともいくつかの特徴（１つもしくは複数）に関連するポリペプチド特性を導入する。
【００２３】
「培養宿主細胞」は、本明細書において用いる場合、任意の手段、例えば電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、微量注入、形質転換、ウイルス感染などにより細胞中に導入されている異種ＤＮＡを含有する原核もしくは真核細胞をさす。
【００２４】
「異種の」は、本明細書において用いる場合、「異なる天然起源のもの」もしくは非天然状態を表すことを意味する。例えば、培養宿主細胞が別の生物由来の、特に別の種由来のＤＮＡもしくは遺伝子で形質転換される場合、その遺伝子はその培養宿主細胞に関してそしてまたその遺伝子を保有する培養宿主細胞の子孫に関しても異種である。同様に、「異種の」は同じ天然の元の細胞タイプに由来しそして挿入されるが、非天然状態、例えば異なるコピー数においてもしくは異なる調節要素の制御下で存在するヌクレオチド配列をさす。さらに、核酸もしくはアミノ酸配列との関連で用いる場合、「異種の」という用語はまた同じ配列の別の領域と異なる天然起源のものである配列の任意の領域をさすこともできる。例えば、組換えタンパク質がアポリポタンパク質（ａ）由来のクリングルドメインおよびプラスミノーゲン由来のセリンプロテアーゼドメインを含んでなる場合、特に各ドメインが異なる種もしくは生物由来である場合、クリングルドメインおよびセリンプロテアーゼドメインは相互に対して「異種」である。
【００２５】
「ベクター」分子は、異種核酸を挿入することができ、それを次に適切な培養宿主細胞に導入することができる核酸分子である。ベクターは好ましくは１つもしくはそれ以上の複製起点、および組換えＤＮＡを挿入することができる１つもしくはそれ以上の部位を有する。ベクターは、ベクターを有する細胞を有さないものから選択することができる都合のよい手段を有することが多く、例えば、それらは薬剤耐性遺伝子をコードする。一般的なベクターにはプラスミド、ウイルスゲノムおよび（主に酵母および細菌における）「人工染色体」が包含される。
【００２６】
本明細書において用いる場合、「転写制御配列」という用語はそれらが操作可能に連結される核酸配列をコードするタンパク質の転写を誘導するか、抑制するかもしくはそうでなければ制御する、イニシエーター配列、エンハンサー配列およびプロモーター配列のような核酸配列をさす。
【００２７】
「ポリペプチド」という用語は、「ペプチド」および「タンパク質」という用語と互換可能に本明細書において用いられる。
【００２８】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は互換可能に本明細書において用いられ、そして文脈により示される目的のために必要な情報を含有する任意の核酸をさすことができる。すなわち、ポリマーが例えばコードされるペプチドに関して適切な情報を表すことができそして相補的な配列、例えば核酸ポリマーのセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むことができる限り、核酸は一本鎖もしくは二本鎖のいずれかのＤＮＡもしくはＲＮＡ、または他の核酸であることができる。
【００２９】
ポリペプチドの「バリアント」という用語は、１つもしくはそれ以上のアミノ酸により改変されるアミノ酸配列をさす。バリアントは「保存的」変化を有することができ、ここで、置換されたアミノ酸は類似構造もしくは化学特性を有する、例えばイソロイシンでのロイシンの置換。あるいはまた、バリアントは「非保存的」変化を有することができる、例えばトリプトファンでのグリシンの置換。類似したわずかなバリエーションにはまた、アミノ酸欠失もしくは挿入、または両方を包含することもできる。「バリアント」ポリペプチドの特定の形態は「機能的に同等な」ポリペプチド、すなわち、以下にさらに詳細に記述されるように、本発明のポリペプチドの例と実質的に同様のインビボもしくはインビトロ活性を示すポリペプチドである。生物学的もしくは免疫学的活性を除かずにどのアミノ酸残基を置換するか、挿入するか、もしくは欠失させるかを決定することにおけるガイ
ダンスは、当該技術分野において周知であるコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて見出すことができる。さらに、引用することにより本明細書に完全に組み込まれる引用文献内に提供されるものを包含する、特定のガイダンスが以下に提供される。
【００３０】
「Ｎ末端の」および「Ｃ末端の」という用語は、それらが適用される任意のアミノ酸配列またはポリペプチドドメインもしくは構造の相対的位置を示すために本明細書において用いられる。相対的位置決めは、文脈から明らかである。すなわち、「Ｎ末端の」特徴は、同じ文脈において説明される別の特徴（第一の特徴に対して「Ｃ末端の」と呼ばれる可能性がある他の特徴）よりポリペプチド分子のＮ末端に少なくとも近く位置している。同様に、「５’−」および「３’−」という用語はポリヌクレオチドの特徴の相対的位置を示すために本明細書において用いることができる。
【００３１】
「天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な」Ｎ末端ドメインを有すると本明細書において呼ばれるポリペプチドは、プラスミノーゲンの天然クリングルドメインと同様の構造および機能特性を示す。さらに、「クリングル１に相同な」Ｎ末端ドメインを有すると本明細書において呼ばれるポリペプチドは、少なくともポリペプチドがクリングル５よりω−アミノカルボン酸（およびトランス−４−アミノメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、環状酸のような機能的ホモログ）に対して高い親和性を有することができる程度に、天然クリングル１と同様の特性を示す。５−アミノペンタン酸（５−ＡＰｎＡ）；ε−アミノカプロン酸（εＡＣＡ）としても知られている６−アミノヘキサン酸（６−ＡＨｘＡ）；７−アミノヘプタン酸（７−ＡＨｐＡ）；およびトランス−４−アミノメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸（ｔ−ＡＭＣＨＡ）への単離されたクリングルドメインポリペプチドの結合の比較のための条件およびプロトコルについては、例えば、引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：３２５８−３２７１（１９９８）を参照。
【００３２】
「クリングル４に相同な」クリングルドメインへの言及は、「クリングル１に相同な」という語句に関する上記の通り、同様に定義される。すなわち、それらは上記に説明したような天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル４と同様の機能特性を示す。これらのポリペプチドはまた。上記のように固定化リシンにも結合する。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、固定化リシンに結合する。本明細書において用いる場合、「固定化リシンに結合する」という語句は、そのように特性化されるポリペプチドが、クロマトグラフィー媒質としてリシン−セファロースを用いてカラムクロマトグラフィーに供される場合にミニ−プラスミノーゲンと比較してそれらの進行が停滞することを意味する。典型的に、本発明のポリペプチドは、溶離剤として特定のリガンド、例えばεＡＣＡを含有する溶液を用いてそのようなクロマトグラフィー媒質（リシン親和性樹脂）から溶出することができる。
【００３４】
さらに、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，上記に加えて、保存的もしくは非保存的置換、欠失もしくは付加によりどの残基を変えることができるかを決定するために当業者は他の参考文献を調べて本発明の範囲内の欠失突然変異体を生成せしめることができる。例えば、以下の参考文献は、ωアミノカルボン酸の結合に重要であり得る天然クリングルドメインの特定の残基に関する情報を提供する：全てそれらの全部が引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｊｉ，ｅｔ ａｌへの米国特許第６，５３８，１０３号；Ｓｕｚｕｋｉへの米国特許第６，２１８，５１７号；Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｊ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１（１０）：３３０２−１０（２００２）；Ｚａｊｉｃｅｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０１（２）：３３３−４７（２０００）；Ｌｅｅ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３７
５（２）：３５９−６３（２０００）；Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ，Ｆ．ａｎｄ Ｓ．ＭｃＣａｎｃｅ，Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ．２１２：４６−６０（１９９７）；ＭｃＣａｎｃｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：３２４０５−３２４１０（１９９４）；Ｒｅｊａｎｔｅ，Ｍ．Ｒ．ａｎｄ Ｍ．Ｌｌｉｎａｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２１（３）：９３９−４９（１９９４）；Ｗｕ，Ｔ．Ｐ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，５（２）：１５７−６６（１９９４）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｃ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２（４１）：１０９３６−４３（１９９３）；Ｍｅｎｈａｒｔ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：８７９９−８８０６（１９９３）；Ｔｈｅｗｅｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５（７）：３９０６−３９１５（１９９０）；Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ．，５３（３）：２４３−５２（１９８９）；Ｍｏｔｔａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６（１３）：３８２７−３６（１９８７）；Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７９：２１５−２３２（１９８４）；Ｌｅｒｃｈ，Ｐ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７（１）：７−１３（１９８０）；Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｌ．，３：１９１−２０９（１９７８）；およびＷｉｍａｎ，Ｂ．ａｎｄ Ｄ．Ｃｏｌｌｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２７２，５４９−５４５（１９７８）。
【００３５】
（１つには、本明細書に記載の通り固定化リシンの結合について試験することにより評価することができる）有益な機能特性を有する単一のＮ末端クリングルドメインを有して有益な簡素化プラスミン（オーゲン）分子を製造できることを本発明者等は認識しているので、本発明には活性化部位に対してＮ末端の他のフィブリン結合ドメインもしくは領域を包含することができる。例えば、本発明には、ヒトプラスミノーゲンのクリングル４、ｔＰＡのクリングル２もしくはアポリポタンパク質（ａ）のクリングルが包含されるがこれらに限定されるものではない群から選択されるフィブリン結合クリングルにプラスミンのセリンプロテアーゼドメインが結合しているポリペプチドを包含することができる。さらに、本発明には、ｔＰＡもしくはフィブロネクチンの「フィンガー」ドメイン、またはフィブリン特異的ＩｇＧのＦＡＢフラグメントのような任意の他の既知のフィブリン結合モジュールにプラスミンのセリンプロテアーゼドメインが結合しているポリペプチドを包含することができる。
【００３６】
ある態様において、本発明のポリペプチドは、ヒト血漿由来のプラスミン（オーゲン）の天然に存在する形態に存在する化学構造と同一であるタンパク質化学構造（例えば、天然様Ｎ末端およびクリングルとセリンプロテアーゼドメインとの間の天然様連結点）を有する。特定の理論にとらわれずに、そのアミノ酸配列が包含されるがそれに限定されるものではない、タンパク質のある種の特徴はその免疫原性の一因となり得ると考えられる。従って、本発明は、天然ヒトプラスミノーゲン配列に似ているアミノ酸配列の導入によって（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの潜在的免疫原性を先制的に減らすことにより組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンに基づく有効なタンパク質治療法を提供する。
【００３７】
１つの態様において、本発明の組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドは、ａ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン、ここで、クリングルドメイン内の最後の４個のアミノ酸残基はＶ、Ｐ、ＱおよびＣである；およびｂ）ヒトプラスミノーゲンにおける対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを含んでなり；ここで、該ポリペプチドは固定化リシンに結合する。１つの態様において、単一のＮ末端クリングルドメインは天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４に相同である
。ある態様において、固定化リシンはリシン−アガロース、リシン−ヒドロゲル、リシン−架橋アガロースよりなる群から選択される固体支持マトリックスに結合したリシンである。別の態様において、固定化リシンはリシン架橋アガロースである。
【００３８】
本発明の組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドは、当業者により活性化されて（ＴＡＬ６００３）−プラスミンポリペプチドを提供することができる。１つの態様において、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンポリペプチドは、α２−抗プラスミンによるミニ−プラスミンの線維素溶解活性の阻害の速度より少なくとも約５倍速い阻害の速度でα２−抗プラスミンにより阻害される線維素溶解活性を示す。別の態様において、阻害の速度はミニ−プラスミンの阻害の速度より少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍もしくは４０倍速い。
【００３９】
１つの態様において、組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドは配列番号：２に示される配列と少なくとも９０％もしくは９５％、または９８％同一である。別の態様において、単一のＮ末端クリングルドメインは天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４ドメインと少なくとも９０％同一であり；そしてＣ末端ドメインはヒトプラスミノーゲンの活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインと少なくとも９０％同一である。ある態様において、ポリペプチドは配列番号：２に示されるようなアミノ酸配列およびその保存的置換を有する。他の態様において、ポリペプチドは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列の位置８５のものと同様の相対的位置でアルギニン残基を有する。
【００４０】
さらなる態様において、単一のＮ末端クリングルドメインは天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル５とよりも天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４と少なくとも1残基大きいアミノ酸配列同一性を有し、そしてここで、ヒトプラスミノーゲンのクリングル１および４の天然配列に対する単一のＮ末端クリングルドメインの保存的置換は、クリングル５との同一性比較の目的のために天然配列と異なると見なされない。
【００４１】
例えば、本発明において記述される（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは単一のクリングルドメインとセリンプロテアーゼドメインを連結する連結領域にアミノ酸残基改変を利用する。従って、これら２つのドメイン間のこの連結点は、ヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメインとセリンプロテアーゼドメインとの間の天然に存在する連結点に一層酷似している。
【００４２】
別の態様において、本発明において記述される（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは天然様Ｎ末端配列をさらに含んでなる。組換え的に製造された（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは活性化の際に切断されて天然様Ｎ末端も有する組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミンポリペプチドを提供することができる。
【００４３】
特定の態様において、（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの単一のＮ末端クリングルドメインのある位置の残基は、天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１に対して保存される。これらはジスルフィド架橋およびリシン結合と関連する位置の残基であることができ、そしてそれぞれ、Ｃｙｓ８４、Ｃｙｓ１０５、Ｃｙｓ１３３、Ｃｙｓ１４５、Ｃｙｓ１５７およびＣｙｓ１６２、ならびにＰｒｏ１３６−Ｐｒｏ１４０、Ｐｒｏ１４３−Ｔｙｒ１４６およびＡｒｇ１５３−Ｔｙｒ１５６が包含される（図３に示されるように番号付けられた位置）。従って、本発明の特定の態様は、同様のドメイン組成（すなわち、クリングル−セリンプロテアーゼ（Ｋ−ＳＰ）（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌ．３，（Ｅｄｓ：Ｊ．Ｆ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ
，ｅｔ ａｌ．）Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７８）を参照）を有するが、とりわけ、配列番号：２に示されるアミノ酸配列の位置８５のものと同様の相対的位置でアルギニン（Ａｒｇ）を欠くミニ−プラスミン（オーゲン）との対照によって化学的に特性化することができる。ある態様において、本発明の（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列の位置８５のものと同様の相対的位置でＡｒｇ残基を含んでなる単一のＮ末端クリングルドメインを含んでなる。配列番号：２に示されるアミノ酸配列の位置８５のものと同様の相対的位置の限定されない例には、配列番号：４に示されるアミノ酸配列のＡｒｇ（１５３）、Ａｒｇ（２３４）、Ａｒｇ（３２４）およびＡｒｇ（４２６）位置が包含される。
【００４４】
他の態様において、指定残基の特定の位置は、構造的にそして機能的に同様な位置（すなわち、Ｎ末端ドメインのクリングル構造に対して；上記に説明したようなＣｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．を参照）でポリペプチドに依然として存在しながらいくらか異なることができる。ある態様において、（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（オーゲン）ポリペプチドの単一のＮ末端クリングルドメインは天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル５とよりも天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４と少なくとも１残基大きい同一性パーセントを有する。
【００４５】
さらに、本発明の特定の態様はミニ−プラスミン（オーゲン）との対照によって機能的に特性化することができる。好ましい態様において、本発明の（ＴＡＬ６００３）−プラスミンはα２−抗プラスミンによる例えばミニ−プラスミンの阻害の速度より約１もしくは２桁分速い程度の増加した阻害速度を示す。さらに、特定の態様において、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンは固定化リシン（例えば、リシン−セファロース）に結合する。
【００４６】
「Ｎ末端」としての（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの単一のＮ末端クリングルドメインの特性化は、該ドメインが活性化部位に対してＮ末端に存在することのみを意味し、そしてドメイン自体に対してＮ末端の追加のアミノ酸残基が存在しないことを意味しない。さらに、単一のＮ末端クリングルドメインの最もＣ末端のシステイン残基（すなわち、図４に示される最もＣ末端のＣｙｓ残基）とプラスミノーゲンの活性化部位との間に入る残基の数および同一性は、本発明の範囲からそれずに変えることができる。当業者は、本明細書における開示ならびにクリングル１機能および構造に関するガイダンスのために本明細書に引用される参考文献に基づいて過度の実験なしに本発明の利益（欠失突然変異体のサイズの実質的な増加もしくは潜在的に問題のあるグリコシル化部位の導入なしに、ωアミノカルボン酸のクリングル１様結合）を得るこれらのバリエーションを決定することができる。
【００４７】
従って、本発明はポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチドを製造するための組換え方法、ポリヌクレオチドを含有するベクター、ポリペプチドを製造するための発現系、およびそのような発現系を含んでなる培養宿主細胞に関する。
【００４８】
記載の通り、１つの態様において、本発明は本明細書に開示されるポリペプチドもしくはその保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。「保存的」アミノ酸置換の選択に関するガイダンスは、以下にさらに詳細に提供される。１つの態様において、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。
【００４９】
別の態様において、本発明はベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入することを含んでなるベクターを製造する方法に関する。別の態様において、本発明は本発明の方法により製造されるベクターに関する。
【００５０】
別の態様において、本発明は培養宿主細胞に本発明のベクターを導入することを含んで
なる培養宿主細胞を製造する方法に関する。別の態様において、本発明は本発明の方法により製造される培養宿主細胞に関する。
【００５１】
別の態様において、本発明は：（ａ）培養宿主細胞にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターを導入すること；（ｂ）該宿主細胞を培養すること；および（ｃ）ポリペプチドを回収することを含んでなる方法により製造される本発明の単離されたポリペプチドに関する。別の態様において、本発明は：（ａ）ベクターが発現される条件下で本発明の宿主細胞を培養すること；および（ｂ）ポリペプチドを回収することを含んでなるポリペプチドを製造する方法に関する。
【００５２】
別の態様において、本発明は本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有する細胞に関する。
【００５３】
１つの態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：１に示されるようなヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：１に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド４〜１０３２を含んでなる。他の態様において、ポリペプチドは配列番号：２に示されるようなアミノ酸配列を含んでなる。
【００５４】
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドには、1個もしくはそれ以上のヌクレオチドを伴い得る置換、欠失および／もしくは付加を有するバリアントが包含される。バリアントは、コーディング領域、非コーディング領域もしくは両方において改変することができる。コーディング領域における改変は、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失もしくは付加をもたらすことができる。これらの中で特に好ましいのは、（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（オーゲン）タンパク質もしくはその一部の特性および活性を改変しない、サイレント置換、付加および欠失である。またこれに関して特に好ましいのは保存的置換である（以下を参照）。
【００５５】
本発明のさらなる態様には、（ａ）配列番号：２における完全なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号：２におけるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（ｃ）上記の（ａ）もしくは（ｂ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一である、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含んでなる核酸分子が包含される。
【００５６】
１つの態様において、本発明の核酸分子は配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含んでなる。他の態様において、核酸分子は配列番号：１に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドもしくはその縮重バリアントを含んでなる。
【００５７】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンをコードする参照ヌクレオチド配列に少なくとも例えば９５％「同一である」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチド配列が（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり５個までの点突然変異を含むことができることを除いてポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列におけるヌクレオチドの５％までを欠失させるかもしくは別のヌクレオチドで置換することができ、または参照配列における全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチドの数を参照配列に挿入することができる
。参照配列のこれらの突然変異は、参照配列におけるヌクレオチド間で個々にまたは参照配列内の1つもしくはそれ以上の隣接する群において散在して、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置もしくはこれらの末端位置の間のどこかに存在することができる。
【００５８】
上記の通り、２つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列はそれらの同一性パーセントを決定することにより比較することができる。同様に２つもしくはそれ以上のアミノ酸配列はそれらの同一性パーセントを決定することにより比較することができる。２つの配列の同一性パーセントは、核酸配列であろうとペプチド配列であろうと、短い方の配列の長さで割りそして１００を掛けた２つの整列配列間の完全な一致の数として一般に記述される。核酸配列の近似アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡにより開発され、そしてＧｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により正規化されたスコアリングマトリックスを用いてペプチド配列での使用に拡張することができる。核酸およびペプチド配列についてのこのアルゴリズムの実施は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によりそれらのＢＥＳＴＦＩＴ実用アプリケーションにおいて提供される。この方法のデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能）に記述される。
【００５９】
例えば、遺伝暗号の縮重のために、配列番号：１に示される核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である配列を有する多数の核酸分子が（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドをコードすることを当業者は即座に認識する。実際に、これらのヌクレオチド配列の縮重バリアントは全て同じポリペプチドをコードするので、本明細書に記述される任意の機能アッセイもしくは測定を行わずともこれは当業者に明らかである。縮重バリアントではないような核酸分子について、妥当な数もまた（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードすることが当該技術分野においてさらに認識される。これは、タンパク質機能に有意に影響を及ぼす可能性が低いかもしくは可能性があまりないアミノ酸置換（例えば、ある脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸で置換すること）を当業者は完全に認識しているからである。
【００６０】
最近、より長いポリヌクレオチド配列の合成製造における進歩により、伝統的なクローニング技術を使用せずに有意により長いポリペプチドをコードする核酸の合成製造が可能になっている。そのようなサービスの商業的供給業者には、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｌｕｅｈｅｒｏｎｂｉｏ．ｃｏｍ）が包含される。Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．により利用される技術は、全て引用することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６６４，１１２号；第６，６２３，９２８号；第６，６１３，５０８号；第６，４４４，４２２号；第６，３１２，８９３号；第４，６５２，６３９号；米国公開特許出願第２００２０１１９４５６Ａ１号；第２００２００７７４７１Ａ１号；および公開国際特許出願（公開番号）ＷＯ０３０５４２３２Ａ３；ＷＯ０１９４３６６Ａ１；ＷＯ９７２７３３１Ａ２；およびＷＯ９９０５３２２Ａ１に記述される。
【００６１】
もちろん、分子生物学、微生物学および組換え核酸の伝統的な技術もまた本発明のポリヌクレオチドを製造するために用いることができる。これらの技術は周知であり、そして全て引用することにより本明細書に組み込まれる、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｅｂｅｌ，ｅｄ．，Ｖｏｌｓ．Ｉ，ＩＩおよびＩＩＩ（１９９７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．，Ｖｏｌｓ．ＩおよびＩＩ（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”；シリーズ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８４）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）；ならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｗｕ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｕ，ｅｄｓ．，それぞれ、Ｖｏｌｓ．１５４および１５５において説明される。
【００６２】
ベクターおよび培養宿主細胞
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作される培養宿主細胞および組換え技術による（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（オーゲン）ポリペプチドの製造にも関する。
【００６３】
組換え構築物は、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション、電気穿孔および形質転換のような周知の技術を用いて培養宿主細胞に導入することができる。ベクターは、例えばファージ、プラスミド、ウイルスもしくはレトロウイルスベクターであることができる。レトロウイルスベクターは複数可能もしくは複製欠損であることができる。後者の場合、ウイルス増殖は一般に相補培養宿主細胞においてのみ起こる。
【００６４】
ポリヌクレオチドは、培養宿主における増殖に関して選択可能なマーカーを含有するベクターに連結することができる。一般に、プラスミドベクターはリン酸カルシウム沈殿のような沈殿においてもしくは荷電脂質との複合体において導入される。ベクターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞系を用いてそれをインビトロでパッケージングし、そして次に培養宿主細胞に形質導入することができる。
【００６５】
好ましいのは、興味のあるポリヌクレオチドにシスに作用する制御領域を含んでなるベクターである。適切なトランスに作用する因子は、培養宿主により供給されるか、相補ベクターにより供給されるかもしくは培養宿主への導入の際にベクター自体により供給されることができる。
【００６６】
これに関するある態様において、ベクターは、誘導できそして／もしくは細胞タイプ特異的であることができる特異的発現をもたらす。そのようなベクターの中で特に好ましいのは、温度および栄養素添加物のような、操作するのが容易な環境因子により誘誘できるものである。
【００６７】
本発明において有用な発現ベクターには、染色体由来の、エピソーム由来のおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス由来のベクター、ならびにコスミドおよびファージミドのようなその組み合わせ由来のベクターが包含される。
【００６８】
ＤＮＡインサートは、数例を挙げると、ファージラムダＰＬプロモーター、エシェリキア・コリｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターのような適切なプロモーターに操作可能に連結されるべきである。他の適当なプロモーターは当業者に既知である。発現構築物は転写開始、終結のための部位および転写領域において翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有する。構築物により発現される成熟転写産物のコーディング部分は、翻訳されるポリペプチドの最初に翻訳開始そして最後に適切に位置する終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡもしくはＵＡＧ）を含むことができる。
【００６９】
示されるように、発現ベクターは好ましくは少なくとも１つの選択可能なマーカーを含む。そのようなマーカーには、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素もしくはネオマイシン耐性ならびにエシェリキア・コリおよび他の細菌における培養のためのテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性遺伝子が包含される。適切な培養宿主の代表例には細菌細胞、例えばエシェリキア・コリ、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳおよびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が包含されるがこれらに限定されるものではない。上記の培養宿主細胞用の適切な培養培地および条件は、当該技術分野において既知である。
【００７０】
細菌における使用に好ましいベクターの中には、例えば、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能なｐＥＴ２４ｂもしくはｐＥＴ２２ｂ（それぞれ、ｐＥＴ−２４ｂ（＋）およびｐＥＴ−２２ｂ（＋）＝ｐＥＴ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ２４ｂ（カタログ番号６９７５０）および２２ｂ（カタログ番号７０７６５）、ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｇｅｎ Ｂｒａｎｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；ベクターに関する詳細についてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ ｐＥＴ−２４ｂおよびｐＥＴ−２２ｂに関する製品情報セクションを参照）、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡから入手可能なｐＢＳベクター、ＰＨＡＧＥＳＣＲＩＰＴベクター、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａ（今はＰｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が包含される。好ましい真核生物ベクターの中には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがある。他の適当なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【００７１】
本発明における使用に適当な細菌プロモーターには、エシェリキア・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲおよびＰＬプロモーター、ならびにｔｒｐプロモーターが包含される。適当な真核生物
プロモーターには、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のもののようなレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターが包含される。
【００７２】
培養宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染もしくは他の方法によりもたらすことができる。そのような方法は、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（１９９５）のような多数の標準的な実験室マニュアルに記述される。
【００７３】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加することができる。エンハンサーは、既定の培養宿主細胞タイプにおいてプロモーターの転写活性を増加するように働く通常は約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシスに作用する要素である。エンハンサーの例には、ｂｐ１００〜２７０で複製起点の後期側上に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが包含される。
【００７４】
小胞体の内腔への、ペリプラズムへのもしくは細胞外環境への翻訳タンパク質の分泌のために、適切な分泌シグナルを発現ポリペプチドに導入することができる。シグナルはポリペプチドに内因性であることができ、もしくはそれらは異種シグナルであることができる。
【００７５】
ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態において発現することができ、そして分泌シグナルだけでなく追加の異種機能領域も含むことができる。例えば、精製中にもしくはその後の取り扱いおよび貯蔵中に、培養宿主細胞における安定性および持続を改善するためにポリペプチドの例えばＮ末端に追加のアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を付加することができる。また、精製を容易にするためにポリペプチドにペプチド部分を付加することもできる。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に取り除くことができる。とりわけ、分泌もしくは排出を引き起こすための、安定性を改善するためのそして精製を容易にするためのポリペプチドへのペプチド部分の付加は、当該技術分野においてよく知られておりそして日常的な技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質を可溶化するために有用である免疫グロブリンからの異種領域を含んでなる。例えば、ＥＰ ０ ４６４ ５３３ Ａ１（カナダの対応物、２，０４５，８６９）は、別のヒトタンパク質もしくはその一部と一緒に免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分を含んでなる融合タンパク質を開示する。多くの場合において、融合タンパク質におけるＦｃ部分は治療および診断における使用にとって全く好都合であり、従って、例えば改善された薬物動態特性をもたらす。一方、ある用途には、融合タンパク質が記載の都合の良い方法において発現され、検出されそして精製された後にＦｃ部分を取り除くことができることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が治療および診断において使用するために障害であると判明する場合に、例えば融合タンパク質が免疫のための抗原として用いられる場合に当てはまる。例えば創薬において、ヒトタンパク質はハイスループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されている（ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するために、ｈＩＬ５受容体のような）。Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，８：５２−５８（１９９５）およびＪｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１６）：９４５９−９４７１（１９９５）を参照。
【００７６】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは、本明細書の実施例に特に記述されるものを包含する周知の方法により組換え細胞培養物から回収しそして精製することができる。本発明のポリペプチドには天然精製産物、化学合成方法の産物、ならびに例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞を包含する原核生物もしくは真核生物培養宿主から組換え技術により製造される産物が包含される。さらに、本発明のポリペプチドはまた、ある場合において宿主媒介過程の結果として、最初の修飾されたメチオニン残基を含むこともできる。
【００７７】
ポリペプチド
本発明のポリヌクレオチドには、本発明のポリペプチドのバリエーションおよび特定の例をコードするものが包含される。例えば、表現型の上でサイレントのアミノ酸置換を行う方法に関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供され、ここで、著者等はタンパク質がアミノ酸置換に驚くほど寛容であることを示す。本発明の範囲内の置換のいくつでもそのような一般的原理の適用により得ることができるが、置換に関する特定のガイダンスには、クリングル１ドメインの構造および機能に関して本明細書に引用される参考文献を当業者は調べることができる。
【００７８】
使用する基準により、（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンのクリングル、活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインの正確な「位置」もしくは配列は、本発明の範囲内の特定のバリエーションにおいてわずかに異なり得ることがさらに理解される。例えば、活性化部位に対するクリングルドメインの正確な位置はわずかに異なることができ、そして／もしくはクリングルドメインに対してＮ末端の配列は長さが異なることができる。従って、本発明には本明細書に開示されるような（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチド活性を示す（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドのそのようなバリエーションが包含される。そのようなバリアントは、欠失、挿入、逆位、反復および置換を含む。上記に示されるように、どのアミノ酸変化が表現型の上でサイレントであると思われるかに関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見出すことができる。
【００７９】
従って、配列番号：２のポリペプチドのフラグメント、誘導体もしくはアナログは、（ｉ）アミノ酸残基の１つもしくはそれ以上（例えば、３、５、８、１０、１５もしくは２０残基）が保存的もしくは非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されるもの（そのような置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号によりコードされるものであるかもしくはそうでない可能性がある）、あるいは（ｉｉ）アミノ酸残基の１つもしくはそれ以上が置換基を含むもの（例えば、３、５、８、１０、１５もしくは２０）、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減期を増加するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合しているもの、あるいは（ｉｖ）ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダーもしくは分泌配列または成熟ポリペプチドの精製に用いられる配列または前駆タンパク質配列のような、追加のアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであることができる。そのようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書における教示から当業者の範囲内であると考えられる。
【００８０】
示されるように、変化は好ましくはタンパク質のフォールディングもしくは活性に有意に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換のようなわずかな性質のものである。もちろん、熟練した技術者が行うアミノ酸置換の数は上記のものを包含する多数の因子により決まる
。一般的に言えば、任意の既定の（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドの置換の数は５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５もしくは３より多くない。
【００８１】
機能に必須である本発明の（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンにおけるアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発もしくはアラニン走査突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））のような当該技術分野において既知である方法により同定することができる。後者の方法は、分子におけるあらゆる残基で単一のアラニン突然変異を導入する。次に、得られる突然変異体分子は、例えば本明細書に提供される実施例において示されるように、生物学的活性について試験される。リガンド結合に重要である部位もまた、結晶化、核磁気共鳴もしくは光親和性標識（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：３９９−９０４（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））のような構造解析により決定することができる。タンパク質のＮ末端からの１個もしくはそれ以上のアミノ酸の欠失がタンパク質の１つもしくはそれ以上の生物学的機能の改変もしくは喪失をたとえもたらしても、他の生物学的活性を依然として保持することができる。
【００８２】
本発明の「単離されたポリペプチド」の製造において有用なポリペプチドは固相合成法により製造できることもまた意図される。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）；およびＨｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）への米国特許第４，６３１，２１１号を参照。
【００８３】
本発明のポリペプチドは、単離された形態において提供することができる。「単離されたポリペプチド」により、その天然環境から取り除かれたポリペプチドが意図される。従って、組換え培養宿主細胞内で生産されそして／もしくは含有されるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されたと見なされる。また「単離されたポリペプチド」として意図されるのは、組換え培養宿主から部分的にもしくは実質的に精製されているポリペプチドである。
【００８４】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドの参照アミノ酸配列に対して示される同一性パーセントのアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリヌクレオチドに関して上記に示されるコンピューター支援方法を包含する方法を用いて決定することができる。前述の説明におけるヌクレオチド配列と同様にポリペプチドアミノ酸配列を調べそして比較する。当業者は、ポリペプチド分析のためのそのような方法およびプログラムの対応する使用を考える場合にポリヌクレオチドについて説明した分子終点のような概念が直接的アナログを有することを認識する。例えば、ポリヌクレオチドに関して説明した手動補正は核酸の５’および３’終点をさすが、同じ説明はポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に適用可能と認識される。
【００８５】
本発明には、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ／ｂｌｏｃｋｉｎｇ）基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子もしくは他の細胞リガンドへの連結などにより、翻訳中もしくは後に異なって修飾される（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドが包含される。多数の化学修飾のいずれも、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；などが包含されるがこれらに限定されるものではない既知の技術により実施することができる。
【００８６】
例えば、本発明により包含されるさらなる翻訳後修飾には、例えばＮ結合型もしくはＯ
結合型炭水化物鎖、Ｎ末端もしくはＣ末端終端のプロセシング、アミノ酸バックボーンへの化学部分の連結、Ｎ結合型もしくはＯ結合型炭水化物鎖の化学修飾、ならびに原核生物培養宿主細胞における（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドの発現に適応させたベクターおよび構築物の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加が包含される。ポリペプチドはまた、タンパク質の検出および単離を可能にするために酵素、蛍光、同位体もしくは親和性標識のような検出可能な標識で修飾することもできる。
【００８７】
製薬学的組成物および処置の方法
（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（オーゲン）は、両方とも引用することにより本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１０／１４３，１１２号；およびＮｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１（５）：１０３４−４１（２００３）に記述される方法および組成物に従って治療用途に調合することができる。例えば、低ｐＨ（約２．５〜約４）、低緩衝能バッファーを（ＴＡＬ６００３）−プラスミンの調合に用いることができる。さらに、プラスミン、ミニ−プラスミンおよび／もしくはミクロ−プラスミンで実施されるような、当業者に既知である他の方法および調合を治療的投与用の本発明の（ＴＡＬ６００３）−プラスミンを調合するために用いることができる。
【００８８】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（オーゲン）は、例えば、全て引用することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３５５，２４３号、第６，９６４，７６４号および第６，９６９，５１５号に記述されるような方法に従って、様々な血栓性疾患もしくは症状を処置するために用いることができる。この場合もやはり、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンに適用できる可能な製薬学的製剤のように、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンはまた当該技術分野において既知である方法、例えばプラスミン、ミニ−プラスミンおよび／もしくはミクロ−プラスミンで現在実施することができるものにより治療的に投与することもできる。
【実施例】
【００８９】
発現ベクター設計
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンのアミノ酸配列を配列番号：２に示す。（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドをエシェリキア・コリ発現およびｍＲＮＡ安定性のためにコドンを最適化して配列番号：１に示されるようなＤＮＡ配列を提供した。このポリヌクレオチドをエシェリキア・コリ発現ベクターｐＥＴ２４ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＮｄｅＩおよびＢａｍＨ１部位にクローン化して細胞質タンパク質を生成せしめた。
【００９０】
表１に例示されるように、細菌（例えばエシェリキア・コリ）における発現は、配列番号：２に示されるようなアミノ酸配列を有する組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチド（すなわち、配列番号：４（例えば図３もまた参照）に示される天然ヒトプラスミノーゲンアミノ酸配列の位置７０のアルギニン（すなわち、Ｒ７０）に対応するアルギニンアミノ酸残基（すなわち、Ｒ２）の直前にＮ末端メチオニン（すなわち、Ｍ１）を有する組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン）をもたらした。そのような組換え産物はさらなる切断を受けやすく天然ヒトプラスミノーゲンの位置７８のリシン（すなわち、Ｋ７８）もしくは位置７９のバリン（すなわち、Ｖ７９）にそれぞれ対応するＮ末端リシン（すなわち、Ｋ１０）もしくはバリン（すなわち、Ｖ１１）を有するタンパク質を包含する異なるＮ末端を有するさらなるタンパク質を生成せしめた。
【００９１】
【表１】
【００９２】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン発現および精製
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンをコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ＢＬ２１（ＤＥ３）（遺伝子型：Ｆ−ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ ｄｃｍ（ＤＥ３））（ＥＭＢ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＢＬＲ（ＤＥ３）（遺伝子型：Ｆ−ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ ｄｃｍ（ＤＥ３）Δ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ））を包含する様々な細胞に形質転換し、そして１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）による誘導後のタンパク質過剰発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。発現概算は、振盪フラスコにおける１Ｌの細胞培養物当たり少なくとも約２５０ｍｇであった。
【００９３】
細胞タイプＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬをＡｒｇ、ＩｌｅおよびＬｅｕをコードするまれなエシェリキア・コリｔＲＮＡを発現するように設計する。さらに、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＬＲ（ＤＥ３）は両方とも、毒性および定着因子がないことに基づいてヒトおよび動物に対して非病原性と分類されるＢ株エシェリキア・コリである。ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞はＤＮＡ組換えのためのｒｅｃＡ遺伝子を欠き、そしてラムダファージの誘導はこれらの細胞で報告されていない。ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞における（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン構築物の研究用細胞バンクを製造し、そしてＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）で純度、同一性およびバクテリオファージの誘導について試験した。試験により研究用細胞バンクの同一性および純度が確認され、そしてファージは認められずに細胞はファージ誘導試験を通過した（データは示されない）。
【００９４】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン（すなわち、配列番号：２に基づく）の生産は、細胞を溶解しそして可溶性タンパク質および精製された封入体の両方をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより調べるより大規模の発現において確かめられた。
【００９５】
以下の典型的なプロトコルは、（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの発現に用いられている：
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンベクターを含有するエシェリキア・コリ細胞（例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ、ＢＬ２１（ＤＥ３）もしくはＢＬＲ（ＤＥ３））の単一コロニーを用いて５ｍｌのＬＢ／カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）に接種し、そして振盪器上で３７℃で８時間インキュベーションした。その後で、新しい培地におけるさらなる培養用に５０μｌのアリコートを培養細菌懸濁液から取った。６ｍｌの細菌培養物および２５０ｍｌの培地で１６時間後に該手順を繰り返した。培養物を振盪しながら３７℃で〜１．０のＯＤ６００ｎｍまで培養し、そしてＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度になるように加えた。培養物をさらに５時間培養した。細胞を５，０００ｘｇで遠心分離により採取し、そして細胞ペレットを２０ｍＭのＥＤＴＡを含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０に溶解し、そして−８０℃で凍結させた。
【００９６】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンを精製するために、細胞ペレットを融解し、そして溶液容量が最初の細胞培養物容量の約１／２０になるまでバッファーを加えた。その後に、リゾチームを０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように加え、そして細胞を４℃で１０〜１５分間急速に撹拌した。次に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１％の最終濃度になるように加え、そして撹拌をさらに１０分間続けた。ＤＮＡｓｅＩ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）およびＭｇＣｌ２（２．５ｍＭ）を加え、そして撹拌を４℃で３０分間もしくは溶液がもはや粘性でなくなるまで続けた。最終溶液を１５，０００ｘｇで４℃で３０分間遠心分離し、そして上清を捨てた。
【００９７】
細胞ペレットを洗浄溶液（１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００および０．５Ｍ尿素を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、そして最終ペレットを４０ｍｌの抽出バッファー（１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＤＴＴおよび６Ｍグアニジン−ＨＣｌを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）に溶解し、そして４℃で一晩保存した。１６時間後に、溶液を１５，０００ｘｇで３０分間遠心分離して固体を除き、そして上清を４℃で撹拌しながらリフォールディング溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３．５ＭグアニジンＨＣｌ、０．５ＭアルギニンＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、３ｍＭ ＧＳＨ、０．３ｍＭ ＧＳＳＧ）にゆっくりと加えた。リフォールディング方法は、約０．２９ｇ／Ｌのタンパク質濃度で実施した。
【００９８】
リフォールディング溶液をそのままにして４℃で２日間維持し、そして次にバッファー溶液を頻繁に変えながら８〜１０時間の期間にわたって、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍアルギニン−ＨＣｌを含有する８倍容量の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０に対して透析した。
【００９９】
次に、タンパク質溶液を透析から取り出し、そして約１０〜２０ｍｌまで１０ｋＤａの膜カットオフを有するＡＭＩＣＯＮフィルターを用いて濃縮し、そして１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する１００倍容量の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に対して一晩透析した。この物質を遠心分離して微粒子を除き、次にリシン親和性樹脂（リシン−セファロース４Ｂ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上に通した。０．２Ｍイプシロンアミノカプロン酸（εＡＣＡ）を含有するＴｒｉｓ緩衝食塩水、ｐＨ８．０を用いて（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンを樹脂から溶出した。
【０１００】
典型的に、１リットルの細胞培養物から８０ｍｇの封入体を単離することができ、そしてリシン−セファロースクロマトグラフィー工程において４０ｍｇを溶出することができ
た。
【０１０１】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの特性
精製された（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは、還元（ジチオスレイトールで処理する）および非還元タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により３５〜４０ｋＤａ領域におけるバンドとして現れた。ＭＡＬＤＩ質量分析により決定されるその分子量は約３８，１４０Ｄａであり、それは予想される値に近い。
【０１０２】
ストレプトキナーゼによる（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの活性化の速度を決定するために、１ｍｇ／ｍｌの組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンを１：１００の（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン：ストレプトキナーゼの比率でストレプトキナーゼと混合し、ｐＨ７で室温でインキュベーションした。様々な時間点で、サンプルを取り除き、ＳＤＳ−Ｐａｇｅバッファーでクエンチし、そして還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてデンシトメトリー上で分析して２本鎖（ＴＡＬ６００３）−プラスミンへの１本鎖（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの転化を測定した。ストレプトキナーゼによる（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの活性化パーセントは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した場合の経時的な全長（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの喪失として図６に示される。
【０１０３】
クリングル１の機能性を確かめるために、リシン−セファロース４ＢへのＴＡＬ６００３−プラスミノーゲンの結合を測定した。図７に示されるように、（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンはリシン−セファロースに結合し、そして約４ｍＭで単一ピークとして０〜２０ｍＭのεＡＣＡ勾配によりカラムから溶出することができた。リフォールデインングした（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンのリシン−セファロースに結合する能力は、該分子のクリングルドメインが適切にフォールディングされそしてリシン結合部位が完全に活性であることを示す。
【０１０４】
クリングル１の機能性をさらに確かめるために、（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンへのεＡＣＡの結合を、全て引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｍａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９０：９３−９７（１９９０）およびＤｏｕｇｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：３３０２−３３１０（２００２）により記述されるようにタンパク質蛍光の付随する変化をモニターすることにより測定した。（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンのクリングル１へのεＡＣＡの結合は、おそらくリシン結合部位の一部であるトリプトファン残基の消光のために、蛍光の減少をもたらす。
【０１０５】
この過程をモニターするために、εＡＣＡの濃縮溶液の４μｌ〜１６μｌアリコートを２０ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓバッファー、ｐＨ８．０、２５℃中５μＭの（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン２ｍｌに加えた。ＦＬＵＯＲＯＭＡＸ蛍光分光光度計（Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）において２９８ｎｍの励起波長および３４０ｎｍの発光波長で蛍光をモニターし；εＡＣＡの各添加後に、蛍光のさらなる変化が認められなくなるまで溶液を平衡化させた。
【０１０６】
得られる蛍光値を希釈に関して補正し、そして０〜５０μＭのεＡＣＡの範囲にわたってεＡＣＡの濃度に対してプロットした。データを非線形回帰により適合させて約１９μＭのＫｄを得た。
【０１０７】
プラスミノーゲンの１つの特性は、フィブリンに結合するその能力である。（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンがフィブリンと相互作用する能力を保持するかどうかを決定するために、フィブリンへの（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの結合をｔＰＡによ
るその後の活性化および結果として起こる血栓溶解により評価するマイクロタイタープレートアッセイにおいてそのフィブリン結合特性を試験した。この目的のために、１００μｌの５ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲンをマイクロタイタープレートの各ウェルにおいてトロンビンで重合させた。様々な濃度の（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンをフィブリン血栓の上部に加え、そして３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳで十分に洗浄し、その間にフィブリン血栓は依然として完全なままでありそしてウェルに結合している。洗浄した後に、ｔＰＡの０．１ｍｇ／ｍｌ溶液を各ウェルに加え、そしてプレートを３７℃で２時間インキュベーションした。結果として、血栓のいくらかは完全に溶解され、そしていくらかは部分的に溶解され、一方、非常に少量の（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンを有するウェルおよびコントロールウェルは実質的に元のままであった。線維素溶解の程度は、１ＭのＮａＯＨにおいて再構成した最初の血栓の残りの２８０ｎｍの吸光度を測定することによりモニターした。吸光度値を（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン濃度の関数としてプロットした。
【０１０８】
図８に示されるように、フィブリンへの（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの結合は古典的なＳ字形結合曲線をたどった。このアッセイを用いて、（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは全長プラスミノーゲンのものに匹敵する親和性でフィブリンに結合しそしてこの相互作用のＣ５０（〜０．３μＭ）は全長プラスミノーゲンのフィブリン結合のＫｄに匹敵することが見出された。
【０１０９】
これらの実験は、（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンがフィブリンに結合できることを示す。さらに、少なくともリシン−セファロースと（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンとの相互作用、予想されるＫｄでεＡＣＡに結合するその能力、フィブリンに結合するその能力、そしてプラスミノーゲンアクチベーターにより活性化されるその能力は全て、この分子が完全に機能性形態においてエシェリキア・コリ系で生産されることを示した。
【０１１０】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミン精製および製剤
精製された（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン溶液へのＳＫの添加は、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンへの（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの転化をもたらす。タンパク質を２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、そして５０％グリセロールで１：１に希釈して２５％グリセロール中１ｍｇ／ｍｌの溶液を生成せしめた。溶液を室温にし、そしてストレプトキナーゼを１：１００のモル比のＳＫ：（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンで加えた。反応物を撹拌せずに室温で４．５ｈｒインキュベーションした。次に、０．５Ｍの最終濃度になるようにＮａＣｌを加えて反応を遅くした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる活性化の分析により、９０％の収率の活性化タンパク質が示された。
【０１１１】
活性化（ＴＡＬ６００３）−プラスミンをベンズアミジンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ベンズアミジンアフィニティー精製の目的は、活性（ＴＡＬ６００３）−プラスミンからの、（ＴＡＬ６００３）−プラスミン分解産物を包含する、非活性化（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンおよび不純物の分離であった。平衡化したベンズアミジン−セファロース４ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗカラムにＳＫ活性化溶液をかけた。短縮されたそして完全な両方の（ＴＡＬ６００３）−プラスミンは親和性樹脂により捕獲され、一方、上記の不純物はカラムを通過した。２８０ｎｍでの吸光度がベースラインに到達するまでカラムを平衡化バッファーで洗浄した。次に、結合した（ＴＡＬ６００３）−プラスミンを低ｐＨのεＡＣＡ段階を用いて溶出してカラムから全ての残留タンパク質を剥離した。発色性プラスミン効能アッセイにより測定した場合に９５％活性であるタンパク質で、典型的な収率は７５％であった。
【０１１２】
全長プラスミンと同様に、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンは生理的ｐＨで自己分解す
る傾向があるので、最終製剤にはｐＨ３．６を選択した（酢酸−食塩水で酸性化した）。引用することにより組み込まれる、Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．，１（５）：１０３４−４１（２００３）によりプラスミンについて以前に示され、そして（ＴＡＬ６００３）−プラスミンでの実験において確かめられるように、この低緩衝能、低ｐＨ製剤は長期間にわたる活性プラスミンの安全な貯蔵を可能にするだけでなく、これらの直接的血栓溶解剤の非経口投与とも適合する。血漿もしくは中性ｐＨバッファーと混合すると、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンは迅速に再活性化される。
【０１１３】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミンの酵素特性
プラスミン基質Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２５１）（ＤｉａＰｈａｒｍａ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＯＨ）を用いて（ＴＡＬ６００３）−プラスミンのアミド分解活性を調べた。
【０１１４】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミンについて、ＰＢＳバッファー中ｐＨ７．４、２５℃で、Ｓ−２２５１のミカエリス・メンテン定数（ＫＭ）が同様に１４１μＭであることが見出された（表３）。製剤のｋｃａｔは、約７２５ｍｉｎ−１であることが見出された。４−グアニジノ安息香酸４−ニトロフェニル塩酸塩（ｐＮＰＧＢ）滴定（Ｃｈａｓｅ，Ｔ．ａｎｄ Ｅ．Ｓｈａｗ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９７：２０−２７（１９７０））を用いて、機能活性部位のパーセントは６７％であることが見出された。活性部位パーセントについてｋｃａｔを補正して、約７２５ｍｉｎ−１のｋｃａｔが決定された。この値は、全長プラスミンについて（８２０＋／−２３ｍｉｎ−１）そしてミクロ−プラスミン（全ての５個のクリングルを欠く）について（７９５＋／−２４ｍｉｎ−１）同じアッセイにおいて決定された値に非常に近かった。これらのデータは、クリングルの存在もしくは不在がセリンプロテアーゼドメインの触媒活性に影響を及ぼさないことを示す。
【０１１５】
【表２】
【０１１６】
α２−抗プラスミンによる（ＴＡＬ６００３）−プラスミンの阻害の速度は、プラスミンおよびα２−抗プラスミンを混合し次に特定の時間点でＳ−２２５１活性についてアッセイするＷｉｍａｎおよびＣｏｌｌｅｎの方法（Ｗｉｍａｎ，Ｂ．ａｎｄ Ｄ．Ｃｏｌｌｅｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８４：５７３−５７８（１９７８））を用いて１．８±０．０６ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１であると決定された（表４）。この値は、２．５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１のプラスミンについて報告された値（Ａｎｏｎｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．５９：４４９（１９９０）から）に匹敵する。
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
ミクロ−プラスミンで行った同じ実験により、２つの別個の実験において１．８ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１および３．１ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１のα２−抗プラスミン阻害速度が示された。ミニ−プラスミン（ミニ−プラスミンドメイン組成、Ｋ５−ＳＰ）のα２−抗プラスミン阻害の速度は、２．４ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１であると決定された。これらのデータはミクロ−およびミニ−プラスミンの文献値と合理的に一致し、そしてα２−抗プラスミンによる（ＴＡＬ６００３）−プラスミンの阻害がミクロ−プラスミンもしくはミニ−プラスミンのいずれかの阻害より４０倍速いことを示す。従って、これらの結果は、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンがその構造におけるクリングル１の存在のためにα２−抗プラスミンにより迅速に阻害されるはずであることを示す。全体として、この節に提示されるデータは、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンの酵素および阻害特性が全長プラスミンと同様であることを示す。
【０１１９】
文献値は、Ａｎｏｎｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．５９：４４９（１９９０）から取られる。全ての速度は、Ａｎｏｎｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．に公開される方法に従って測定した。
【０１２０】
インビトロ線維素溶解効能
（ＴＡＬ６００３）−プラスミンの線維素溶解効能は、以下の実験プロトコルを用いて血栓溶解アッセイのインビトロモデルにおいて試験した。
【０１２１】
血漿由来のプラスミンと（ＴＡＬ６００３）−プラスミンとの血栓溶解効能のインビトロ比較。等モル量の血漿由来のプラスミン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）および（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（０．１１ｍｇ／ｍｌ）を試験管において血栓と混合し、そして血栓溶解の程度を血栓から遊離される物質のＡ２８０吸光度によりモニターした。
【０１２２】
フィブリンの存在下で血漿阻害剤に打ち勝ちそして血栓溶解を開始するために必要なプラスミンもしくは（ＴＡＬ６００３）−プラスミンの濃度を図９に示す。
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
本願は、引用することにより本明細書に組み込まれる、２００７年１１月２９日に出願された米国仮出願６０／９９１，１４８に対する３５ ＵＳＣ §１１９の下で優先権を請求する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトプラスミノーゲンは、７９１アミノ酸残基を含有する１本鎖タンパク質である。プラスミンへのプラスミノーゲンの活性化は、チモーゲンにおけるＡｒｇ５６１−Ｖａｌ５６２ペプチド結合の単一切断によって起こる。得られるプラスミン分子は、トリプシン様特異性（ＬｙｓおよびＡｒｇの後で切断する）を有する２本鎖のジスルフィド結合したセリンプロテアーゼである。
【０００３】
プラスミンのアミノ末端重鎖（残基１〜５６１、〜６０ｋＤａ）は、各々約８０アミノ酸残基を含有する５個のクリングルドメインからなる。クリングルドメインは、活性化阻害剤、例えばＣｌ−１イオンとの：活性化刺激剤、例えばε−アミノカプロン酸との；哺乳類および細菌細胞との；そしてプラスミン生理的基質フィブリンおよびプラスミン阻害剤α２−抗プラスミンのような他のタンパク質との相互作用のような、プラスミノーゲンの調節特性に関与する。全ての５個のクリングルのうち、クリングル１は最も多機能性の１つであり：そのリシン結合活性はα２−抗プラスミンおよびフィブリンとのプラスミン相互作用に関与することが示されている。非特許文献１；および非特許文献２を参照。
【０００４】
プラスミンのＣ末端軽鎖（残基５６２〜７９１、〜２５ｋＤａ）は、トリプシンに相同なそして古典的なセリンプロテアーゼ触媒トライアド：Ｈｉｓ６０３、Ａｓｐ６４６およびＳｅｒ７４１を含有する典型的なセリンプロテアーゼである。プラスミノーゲンは、２４個のジスルフィド架橋ならびにＡｓｎ２８９およびＴｈｒ３４６上の２個のグリコシル化部位を含有する。
【０００５】
エラスターゼによるプラスミノーゲンの限定タンパク質分解は、３つの主要フラグメントをもたらすことが示されている（非特許文献３）。第一のフラグメント、Ｋ１−３は最初の３個のクリングルを含み、そして２つのバージョン、Ｔｙｒ８０−Ｖａｌ３３８およびＴｙｒ８０−Ｖａｌ３５４において単離することができる。第二のフラグメント、Ｋ４は４番目のクリングルに対応し、そして残基Ｖａｌ３５５−Ａｌａ４４０を含む。最後のＣ末端フラグメント（いわゆる、ミニ−プラスミノーゲン）は残基Ｖａｌ４４３−Ａｓｎ７９１を含み、そして５番目のクリングルおよびセリンプロテアーゼドメインからなる。ミニ−プラスミノーゲンは、プラスミノーゲンと同じように活性化することができ、ミニ−プラスミンを生成せしめる。
【０００６】
全長プラスミノーゲン分子の複雑な構造のために、細菌発現系は組換えプラスミノーゲン生産に有用であると判明していない。プラスミノーゲンは不溶性の封入体の形態において生産され、そしてその状態からリフォールディングできない。さらに、哺乳類細胞におけるプラスミノーゲンの発現は、プラスミンへのプラスミノーゲンの細胞内活性化および結果として生じる細胞毒性により複雑化される。昆虫細胞を用いた完全に活性のプラスミノーゲンの生産は可能であり、しかしながら、この系は低収率のために大規模生産に適していない。さらに、任意の組換えタンパク質スキームのように、治療用組換えタンパク質を与えられる患者において免疫原性問題に直面する可能性がある。
【０００７】
免疫原性は、ある種の組換えタンパク質治療スキームの有効なそして／もしくは効率の良い利用に対する障害であり得る。免疫原性は外来と認識される物質（例えば、アミノ酸配列を包含するタンパク質の化学構造）に対する複雑な一連の反応であり、そして中和および非中和抗体の生産、免疫複合体の形成、補体活性化、マスト細胞活性化、炎症ならびにアナフィラキシーを包含することができる。免疫原性は、多様にタンパク質治療の効能および安全性を限定し得る。効能は、中和抗体の形成により直接的に減少され得る。中和もしくは非中和抗体のいずれかへの結合は典型的に血清からの迅速なクリアランスをもたらすので、効能はまた間接的にも減少され得る。免疫反応が引き起こされると重度の副作用および死亡さえ起こり得る。中和抗体が内在性タンパク質と交差反応しそしてその機能を阻止するとある特定のクラスの副作用が起こる。
【０００８】
従って、プラスミン／プラスミノーゲンの望ましい特性（例えば、天然様化学構造を有する領域）を保有し、一方である種の負の特性を欠きそして相当量で細菌細胞を包含する組換えタンパク質発現系において生産することができる改変された組換えタンパク質が望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｗｉｍａｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５７９：１４２−１５４（１９７９）
【非特許文献２】Ｌｕｃａｓ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：４２４９−４２５６（１９８３）
【非特許文献３】Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｌ．，３：１９１−２０９（１９７８）
【発明の概要】
【００１０】
発明の要約
１つの態様において、本発明は
ａ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン、ここで、クリングルドメイン内の最後の４個のアミノ酸残基はＶ、Ｐ、ＱおよびＣである；および
ｂ）ヒトプラスミノーゲンにおける対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメイン
を有するポリペプチド（ここで、該ポリペプチドは固定化リシンに結合する）をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを提供する。
【００１１】
別の態様において、本発明は：
ａ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン、ここで、クリングルドメイン内の最後の４個のアミノ酸残基はＶ、Ｐ、ＱおよびＣである；および
ｂ）ヒトプラスミノーゲンにおける対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメイン
を含んでなるポリペプチド（ここで、該ポリペプチドは固定化リシンに結合する）を提供する。
【００１２】
他の態様において、本発明は本発明のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを提供する。１つの態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：１に示されるようなヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１３】
ある態様において、本発明は本発明のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを含
んでなる培養細胞を提供する。１つの態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：１に示されるようなヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様において、培養細胞は原核生物である。１つの態様において、原核生物はエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００１４】
１つの態様において、本発明は１つもしくはそれ以上の組換えプラスミンポリペプチドを製造する方法を提供する。該方法は：
ａ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン（ここで、クリングルドメイン内の最後の４個のアミノ酸残基はＶ、Ｐ、ＱおよびＣである）；ならびにヒトプラスミノーゲンにおける対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを有するポリペプチド（ここで、該ポリペプチドは固定化リシンに結合する）を提供すること；ならびに
ｂ）段階ａ）において提供されるポリペプチドを１つもしくはそれ以上のペプチド結合を切断するために十分な条件下でプロテアーゼと接触させ、それにより１つもしくはそれ以上の組換えプラスミンポリペプチドを生成せしめること
を含んでなる。１つの態様において、提供することは適当な宿主において配列番号：１に示されるような配列に対応する配列もしくはその縮重バリアントを有するオープンリーディングフレームを発現させることを含んでなる。別の態様において、ポリペプチドは配列番号：２に示されるようなアミノ酸配列を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、タンパク質分解切断による活性化後の天然プラスミンの略図である。Ｋ１〜Ｋ５はクリングル領域１〜５であり；そしてＳＰはセリンプロテアーゼドメインである。「α２−ＡＰ」はクリングル１上のα２−抗プラスミン結合部位である。
【図２】図１におけるのと同じ用語を用いる、そしてＫ２〜５の欠失を示す本発明のプラスミノーゲン欠失突然変異体の略図である。
【図３】−１９〜−１として番号が付けられた１９残基リーダー配列、および残基１〜７９１（配列番号：３、ヒトプラスミノーゲンのｃＤＮＡ配列；および図３に示されるような、配列番号：４、コードされるアミノ酸配列を参照）として示されるプラスミノーゲン配列を示すヒトプラスミノーゲンのアミノ酸配列を示す。以下のもの：（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン配列の１つの態様（網掛け）；クリングルドメイン１〜５（二重下線）；グリコシル化部位Ａｓｎ２８９およびＴｈｒ３４６（ボールド体）；Ａｒｇ−Ｖａｌ活性化部位（ボールド体のＲ５６１Ｖ５６２）；ならびにクリングル１におけるリシン結合部位（下線のそして特定位置番号付けを有する）を包含する多数の特徴が示される。
【図４】天然ヒトプラスミン（オーゲン）（ｐｌａｓｍｉｎ（ｏｇｅｎ））の５個のクリングルドメイン（１〜５）間のポリペプチド配列比較（すなわち、ギャップアラインメント）を示す。クリングル１における同じ相対的位置のものと同一であるアミノ酸残基は下線で示される。
【図５】血漿由来のプラスミン（レーン１＝非還元（ＮＲ）：レーン２＝還元（Ｒ））および（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（レーン３＝非還元（ＮＲ）：レーン４＝還元（Ｒ））調製物の８〜２５％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。それぞれ、天然プラスミンおよび組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミンへの血漿由来のプラスミノーゲンおよび（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンのストレプトキナーゼ活性化は、クリングルおよびセリンプロテアーゼドメインに対応する２本のバンドの形成をもたらす。従って、電気泳動の前の還元剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）とのインキュベーションの後に、非還元ゲル上で単一バンドである血漿由来のプラスミンおよび（ＴＡＬ６００３）−プラスミンは、同じ非還元ゲルにおいてクリングル１（下側のバンド）およびセリンプロテアーゼドメイン（上側のバンド）に対応する２本のバンドに還元する。
【図６】ストレプトキナーゼによる（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの活性化のグラフ表示である。
【図７】リシン−セファロース４Ｂへの（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの結合を示すクロマトグラムである：０．５ｍｇの精製された（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンをＴｒｉｓ緩衝食塩水、ｐＨ７．４で平衡化したリシン−セファロース４Ｂカラム（１ｘ３ｃｍ）上にかけた。結合タンパク質は、単一ピークとしてε−アミノカプロン酸（ε−ＡＣＡ）の０〜２０ｍＭ勾配によりカラムから溶出された。流出容量の関数として、２８０ｎｍでの吸光度およびε−ＡＣＡの濃度をグラフ上に提示する。
【図８】ｔＰＡによるその後の活性化および結果として起こる血栓溶解により評価した場合のフィブリンへの（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの結合を示す。
【図９】血漿由来のプラスミンと（ＴＡＬ６００３）−プラスミンとの血栓溶解効能のインビトロ比較を示す。
【図１０】（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（配列番号：２）のジスルフィド結合パターンを例示する。図において、（Ｘ）はアミノ酸配列ＲＤＶＶＬＦＥＫを表す。
【００１６】
発明の記述
本発明者等は、その構造からの４個のクリングルの欠失にもかかわらず天然プラスミノーゲン様特性を有する（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンと本明細書において呼ばれる新規組換えプラスミノーゲンポリペプチドもしくはそのバリアントを見出した。これらの（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンもしくはそのバリアントは、チモーゲンのクリングルドメインとセリンプロテアーゼドメインとの間に位置するＡｒｇ−Ｖａｌペプチド結合のタンパク質分解切断を少なくとも伴う活性化事象の後に機能性プラスミン酵素（本明細書において（ＴＡＬ６００３）−プラスミンと呼ばれる）に活性化されるようになることができるチモーゲンである。
【００１７】
本発明の（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンもしくはそのバリアントは、全長天然ヒトプラスミノーゲンのフィブリンおよび抗プラスミン結合ならびに活性化特性を有する。さらに、（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは、組換え生産における高レベル発現およびヒト血漿由来のプラスミノーゲンの天然に存在する形態と同一であるかもしくは非常に類似したある種のタンパク質化学構造を包含する多数の新規のそして望ましい特性を有する。
【００１８】
本発明の（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（オーゲン）は、少なくとも下記の事項を特徴とすることができる：
ｉ）（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの活性化後に生成される（ＴＡＬ６００３）−プラスミンのより低い分子量（例えば、１つの態様において約３６，９１１〜約３７，０３９Ｄａ）は、増加した比活性（タンパク質のｍｇ当たり）をもたらす；
ｉｉ）比較的低い分子量と合わせて、天然タンパク質に存在する少なくとも２個のグリコシル化部位（図３参照、すなわち、Ｎ２８９およびＴ３４６）の欠如は、比較的安価な細菌および酵母発現系を用いたこのタンパク質の組換え生産を容易にする；
ｉｉｉ）（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは、プラスミノーゲンアクチベーターｔＰＡ、ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼにより活性化することができる；
ｉｖ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリング
ルドメインの存在は、血栓溶解効能に重要であるプラスミンのフィブリン結合特性を維持する；
ｖ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン上のα２−抗プラスミン結合部位の存在は、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンがプラスミンのこの生理的阻害剤により迅速に阻害されることを可能にする（出血を防ぐことができる特性）；
ｖｉ）（ＴＡＬ６００３）−プラスミンのより小さいサイズは、α２−マクログロブリンによるそれらの阻害を容易にし、さらに天然プラスミンと比較して出血性合併症の機会を減らすことができる。特定の態様において、完全な消化されていないフィブリン（オーゲン）（ｆｉｂｒｉｎ（ｏｇｅｎ））の主要結合部位を保持するクリングル５の欠如は、循環するフィブリノーゲンの減少した枯渇を伴って（ＴＡＬ６００３）−プラスミンの使用を可能にすることができる；
ｖｉｉ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン（ここで、クリングルドメイン内の最後の４個のアミノ酸残基はＶ、Ｐ、ＱおよびＣである）の存在は、セリンプロテアーゼドメインへの天然様連結（すなわち、ヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメインとセリンプロテアーゼドメインとの間の天然に存在するドメイン連結点と同様の連結）を提供する；そして
ｖｉｉｉ）組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの発現後に、そのＮ末端を切断し戻して（ｃｌｅａｖｅｄ ｂａｃｋ）（例えば、活性化中に切断し戻して）天然様Ｎ末端を提供し得る。
【００１９】
一般に、本発明は、ミニ−プラスミン（オーゲン）と比較してある種の利点を有する、活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインに対してＮ末端の単一のクリングル領域を有する組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（オーゲン）ポリペプチドを提供する。本発明の（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは活性化部位に対してＮ末端のそのようなものとして１個のクリングルドメインのみを有するが、ある態様には活性化部位に対してＮ末端の追加の配列が包含される。追加のＮ末端配列は、プラスミノーゲンの天然クリングル領域のもの由来であることができる。
【００２０】
本発明のＮ末端クリングルドメインは、天然プラスミン（オーゲン）のクリングル１および４のクリングル配列ならびにその機能的同等物を含む。特に、リシン結合に関与するかもしくは影響を与える残基の維持を包含する、ポリペプチドバリアントにおける機能の維持に関するガイダンスを提供する以下の説明を参照。
【００２１】
さらに、本発明のポリペプチドの特定の態様は、天然様構造のために減少した免疫原性を示すことができる。例えば、ある態様において、本発明の組換えプラスミノーゲンはヒト血漿由来のプラスミノーゲンの天然に存在する形態の１つのものと同一のＮ末端を有し、それはストレプトキナーゼによる活性化の際に、天然様Ｎ末端を含んでなるプラスミンポリペプチドを生成する。従って、本発明の新規ポリペプチドは、天然に存在するヒトプラスミンにおけるクリングル５とＳＰドメインとの間の連結点と同様のクリングルとセリンプロテアーゼドメインとの間の配列を有する。
【００２２】
定義
他にそれに反して示されない限り、ポリペプチドの「ドメイン」および「領域」という用語は、本明細書において用いる場合に一般に同義語である。「クリングル」もしくは「セリンプロテアーゼ」などのようなよく認識された構造もしくは機能表示と一緒に列挙される場合、そのような用語はそのような表示に対応するポリペプチド構造と関連すると一般に認識されそして理解される少なくともいくつかの特徴（１つもしくは複数）に関連するポリペプチド特性を導入する。
【００２３】
「培養宿主細胞」は、本明細書において用いる場合、任意の手段、例えば電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、微量注入、形質転換、ウイルス感染などにより細胞中に導入されている異種ＤＮＡを含有する原核もしくは真核細胞をさす。
【００２４】
「異種の」は、本明細書において用いる場合、「異なる天然起源のもの」もしくは非天然状態を表すことを意味する。例えば、培養宿主細胞が別の生物由来の、特に別の種由来のＤＮＡもしくは遺伝子で形質転換される場合、その遺伝子はその培養宿主細胞に関してそしてまたその遺伝子を保有する培養宿主細胞の子孫に関しても異種である。同様に、「異種の」は同じ天然の元の細胞タイプに由来しそして挿入されるが、非天然状態、例えば異なるコピー数においてもしくは異なる調節要素の制御下で存在するヌクレオチド配列をさす。さらに、核酸もしくはアミノ酸配列との関連で用いる場合、「異種の」という用語はまた同じ配列の別の領域と異なる天然起源のものである配列の任意の領域をさすこともできる。例えば、組換えタンパク質がアポリポタンパク質（ａ）由来のクリングルドメインおよびプラスミノーゲン由来のセリンプロテアーゼドメインを含んでなる場合、特に各ドメインが異なる種もしくは生物由来である場合、クリングルドメインおよびセリンプロテアーゼドメインは相互に対して「異種」である。
【００２５】
「ベクター」分子は、異種核酸を挿入することができ、それを次に適切な培養宿主細胞に導入することができる核酸分子である。ベクターは好ましくは１つもしくはそれ以上の複製起点、および組換えＤＮＡを挿入することができる１つもしくはそれ以上の部位を有する。ベクターは、ベクターを有する細胞を有さないものから選択することができる都合のよい手段を有することが多く、例えば、それらは薬剤耐性遺伝子をコードする。一般的なベクターにはプラスミド、ウイルスゲノムおよび（主に酵母および細菌における）「人工染色体」が包含される。
【００２６】
本明細書において用いる場合、「転写制御配列」という用語はそれらが操作可能に連結される核酸配列をコードするタンパク質の転写を誘導するか、抑制するかもしくはそうでなければ制御する、イニシエーター配列、エンハンサー配列およびプロモーター配列のような核酸配列をさす。
【００２７】
「ポリペプチド」という用語は、「ペプチド」および「タンパク質」という用語と互換可能に本明細書において用いられる。
【００２８】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は互換可能に本明細書において用いられ、そして文脈により示される目的のために必要な情報を含有する任意の核酸をさすことができる。すなわち、ポリマーが例えばコードされるペプチドに関して適切な情報を表すことができそして相補的な配列、例えば核酸ポリマーのセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むことができる限り、核酸は一本鎖もしくは二本鎖のいずれかのＤＮＡもしくはＲＮＡ、または他の核酸であることができる。
【００２９】
ポリペプチドの「バリアント」という用語は、１つもしくはそれ以上のアミノ酸により改変されるアミノ酸配列をさす。バリアントは「保存的」変化を有することができ、ここで、置換されたアミノ酸は類似構造もしくは化学特性を有する、例えばイソロイシンでのロイシンの置換。あるいはまた、バリアントは「非保存的」変化を有することができる、例えばトリプトファンでのグリシンの置換。類似したわずかなバリエーションにはまた、アミノ酸欠失もしくは挿入、または両方を包含することもできる。「バリアント」ポリペプチドの特定の形態は「機能的に同等な」ポリペプチド、すなわち、以下にさらに詳細に記述されるように、本発明のポリペプチドの例と実質的に同様のインビボもしくはインビトロ活性を示すポリペプチドである。生物学的もしくは免疫学的活性を除かずにどのアミノ酸残基を置換するか、挿入するか、もしくは欠失させるかを決定することにおけるガイ
ダンスは、当該技術分野において周知であるコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて見出すことができる。さらに、引用することにより本明細書に完全に組み込まれる引用文献内に提供されるものを包含する、特定のガイダンスが以下に提供される。
【００３０】
「Ｎ末端の」および「Ｃ末端の」という用語は、それらが適用される任意のアミノ酸配列またはポリペプチドドメインもしくは構造の相対的位置を示すために本明細書において用いられる。相対的位置決めは、文脈から明らかである。すなわち、「Ｎ末端の」特徴は、同じ文脈において説明される別の特徴（第一の特徴に対して「Ｃ末端の」と呼ばれる可能性がある他の特徴）よりポリペプチド分子のＮ末端に少なくとも近く位置している。同様に、「５’−」および「３’−」という用語はポリヌクレオチドの特徴の相対的位置を示すために本明細書において用いることができる。
【００３１】
「天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な」Ｎ末端ドメインを有すると本明細書において呼ばれるポリペプチドは、プラスミノーゲンの天然クリングルドメインと同様の構造および機能特性を示す。さらに、「クリングル１に相同な」Ｎ末端ドメインを有すると本明細書において呼ばれるポリペプチドは、少なくともポリペプチドがクリングル５よりω−アミノカルボン酸（およびトランス−４−アミノメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、環状酸のような機能的ホモログ）に対して高い親和性を有することができる程度に、天然クリングル１と同様の特性を示す。５−アミノペンタン酸（５−ＡＰｎＡ）；ε−アミノカプロン酸（εＡＣＡ）としても知られている６−アミノヘキサン酸（６−ＡＨｘＡ）；７−アミノヘプタン酸（７−ＡＨｐＡ）；およびトランス−４−アミノメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸（ｔ−ＡＭＣＨＡ）への単離されたクリングルドメインポリペプチドの結合の比較のための条件およびプロトコルについては、例えば、引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：３２５８−３２７１（１９９８）を参照。
【００３２】
「クリングル４に相同な」クリングルドメインへの言及は、「クリングル１に相同な」という語句に関する上記の通り、同様に定義される。すなわち、それらは上記に説明したような天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル４と同様の機能特性を示す。これらのポリペプチドはまた。上記のように固定化リシンにも結合する。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、固定化リシンに結合する。本明細書において用いる場合、「固定化リシンに結合する」という語句は、そのように特性化されるポリペプチドが、クロマトグラフィー媒質としてリシン−セファロースを用いてカラムクロマトグラフィーに供される場合にミニ−プラスミノーゲンと比較してそれらの進行が停滞することを意味する。典型的に、本発明のポリペプチドは、溶離剤として特定のリガンド、例えばεＡＣＡを含有する溶液を用いてそのようなクロマトグラフィー媒質（リシン親和性樹脂）から溶出することができる。
【００３４】
さらに、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，上記に加えて、保存的もしくは非保存的置換、欠失もしくは付加によりどの残基を変えることができるかを決定するために当業者は他の参考文献を調べて本発明の範囲内の欠失突然変異体を生成せしめることができる。例えば、以下の参考文献は、ωアミノカルボン酸の結合に重要であり得る天然クリングルドメインの特定の残基に関する情報を提供する：全てそれらの全部が引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｊｉ，ｅｔ ａｌへの米国特許第６，５３８，１０３号；Ｓｕｚｕｋｉへの米国特許第６，２１８，５１７号；Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｊ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１（１０）：３３０２−１０（２００２）；Ｚａｊｉｃｅｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０１（２）：３３３−４７（２０００）；Ｌｅｅ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３７
５（２）：３５９−６３（２０００）；Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ，Ｆ．ａｎｄ Ｓ．ＭｃＣａｎｃｅ，Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ．２１２：４６−６０（１９９７）；ＭｃＣａｎｃｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：３２４０５−３２４１０（１９９４）；Ｒｅｊａｎｔｅ，Ｍ．Ｒ．ａｎｄ Ｍ．Ｌｌｉｎａｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２１（３）：９３９−４９（１９９４）；Ｗｕ，Ｔ．Ｐ．，ｅｔ
ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，５（２）：１５７−６６（１９９４）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｃ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２（４１）：１０９３６−４３（１９９３）；Ｍｅｎｈａｒｔ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：８７９９−８８０６（１９９３）；Ｔｈｅｗｅｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５（７）：３９０６−３９１５（１９９０）；Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ．，５３（３）：２４３−５２（１９８９）；Ｍｏｔｔａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６（１３）：３８２７−３６（１９８７）；Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７９：２１５−２３２（１９８４）；Ｌｅｒｃｈ，Ｐ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７（１）：７−１３（１９８０）；Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｌ．，３：１９１−２０９（１９７８）；およびＷｉｍａｎ，Ｂ．ａｎｄ Ｄ．Ｃｏｌｌｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２７２，５４９−５４５（１９７８）。
【００３５】
（１つには、本明細書に記載の通り固定化リシンの結合について試験することにより評価することができる）有益な機能特性を有する単一のＮ末端クリングルドメインを有して有益な簡素化プラスミン（オーゲン）分子を製造できることを本発明者等は認識しているので、本発明には活性化部位に対してＮ末端の他のフィブリン結合ドメインもしくは領域を包含することができる。例えば、本発明には、ヒトプラスミノーゲンのクリングル４、ｔＰＡのクリングル２もしくはアポリポタンパク質（ａ）のクリングルが包含されるがこれらに限定されるものではない群から選択されるフィブリン結合クリングルにプラスミンのセリンプロテアーゼドメインが結合しているポリペプチドを包含することができる。さらに、本発明には、ｔＰＡもしくはフィブロネクチンの「フィンガー」ドメイン、またはフィブリン特異的ＩｇＧのＦＡＢフラグメントのような任意の他の既知のフィブリン結合モジュールにプラスミンのセリンプロテアーゼドメインが結合しているポリペプチドを包含することができる。
【００３６】
ある態様において、本発明のポリペプチドは、ヒト血漿由来のプラスミン（オーゲン）の天然に存在する形態に存在する化学構造と同一であるタンパク質化学構造（例えば、天然様Ｎ末端およびクリングルとセリンプロテアーゼドメインとの間の天然様連結点）を有する。特定の理論にとらわれずに、そのアミノ酸配列が包含されるがそれに限定されるものではない、タンパク質のある種の特徴はその免疫原性の一因となり得ると考えられる。従って、本発明は、天然ヒトプラスミノーゲン配列に似ているアミノ酸配列の導入によって（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの潜在的免疫原性を先制的に減らすことにより組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンに基づく有効なタンパク質治療法を提供する。
【００３７】
１つの態様において、本発明の組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドは、ａ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン、ここで、クリングルドメイン内の最後の４個のアミノ酸残基はＶ、Ｐ、ＱおよびＣである；およびｂ）ヒトプラスミノーゲンにおける対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを含んでなり；ここで、該ポリペプチドは固定化リシンに結合する。１つの態様において、単一のＮ末端クリングルドメインは天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４に相同である
。ある態様において、固定化リシンはリシン−アガロース、リシン−ヒドロゲル、リシン−架橋アガロースよりなる群から選択される固体支持マトリックスに結合したリシンである。別の態様において、固定化リシンはリシン架橋アガロースである。
【００３８】
本発明の組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドは、当業者により活性化されて（ＴＡＬ６００３）−プラスミンポリペプチドを提供することができる。１つの態様において、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンポリペプチドは、α２−抗プラスミンによるミニ−プラスミンの線維素溶解活性の阻害の速度より少なくとも約５倍速い阻害の速度でα２−抗プラスミンにより阻害される線維素溶解活性を示す。別の態様において、阻害の速度はミニ−プラスミンの阻害の速度より少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍もしくは４０倍速い。
【００３９】
１つの態様において、組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドは配列番号：２に示される配列と少なくとも９０％もしくは９５％、または９８％同一である。別の態様において、単一のＮ末端クリングルドメインは天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４ドメインと少なくとも９０％同一であり；そしてＣ末端ドメインはヒトプラスミノーゲンの活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインと少なくとも９０％同一である。ある態様において、ポリペプチドは配列番号：２に示されるようなアミノ酸配列およびその保存的置換を有する。他の態様において、ポリペプチドは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列の位置８５のものと同様の相対的位置でアルギニン残基を有する。
【００４０】
さらなる態様において、単一のＮ末端クリングルドメインは天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル５とよりも天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４と少なくとも1残基大きいアミノ酸配列同一性を有し、そしてここで、ヒトプラスミノーゲンのクリングル１および４の天然配列に対する単一のＮ末端クリングルドメインの保存的置換は、クリングル５との同一性比較の目的のために天然配列と異なると見なされない。
【００４１】
例えば、本発明において記述される（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは単一のクリングルドメインとセリンプロテアーゼドメインを連結する連結領域にアミノ酸残基改変を利用する。従って、これら２つのドメイン間のこの連結点は、ヒトプラスミノーゲンのクリングル５ドメインとセリンプロテアーゼドメインとの間の天然に存在する連結点に一層酷似している。
【００４２】
別の態様において、本発明において記述される（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは天然様Ｎ末端配列をさらに含んでなる。組換え的に製造された（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは活性化の際に切断されて天然様Ｎ末端も有する組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミンポリペプチドを提供することができる。
【００４３】
特定の態様において、（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの単一のＮ末端クリングルドメインのある位置の残基は、天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１に対して保存される。これらはジスルフィド架橋およびリシン結合と関連する位置の残基であることができ、そしてそれぞれ、Ｃｙｓ８４、Ｃｙｓ１０５、Ｃｙｓ１３３、Ｃｙｓ１４５、Ｃｙｓ１５７およびＣｙｓ１６２、ならびにＰｒｏ１３６−Ｐｒｏ１４０、Ｐｒｏ１４３−Ｔｙｒ１４６およびＡｒｇ１５３−Ｔｙｒ１５６が包含される（図３に示されるように番号付けられた位置）。従って、本発明の特定の態様は、同様のドメイン組成（すなわち、クリングル−セリンプロテアーゼ（Ｋ−ＳＰ）（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌ．３，（Ｅｄｓ：Ｊ．Ｆ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ
，ｅｔ ａｌ．）Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７８）を参照）を有するが、とりわけ、配列番号：２に示されるアミノ酸配列の位置８５のものと同様の相対的位置でアルギニン（Ａｒｇ）を欠くミニ−プラスミン（オーゲン）との対照によって化学的に特性化することができる。ある態様において、本発明の（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列の位置８５のものと同様の相対的位置でＡｒｇ残基を含んでなる単一のＮ末端クリングルドメインを含んでなる。配列番号：２に示されるアミノ酸配列の位置８５のものと同様の相対的位置の限定されない例には、配列番号：４に示されるアミノ酸配列のＡｒｇ（１５３）、Ａｒｇ（２３４）、Ａｒｇ（３２４）およびＡｒｇ（４２６）位置が包含される。
【００４４】
他の態様において、指定残基の特定の位置は、構造的にそして機能的に同様な位置（すなわち、Ｎ末端ドメインのクリングル構造に対して；上記に説明したようなＣｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．を参照）でポリペプチドに依然として存在しながらいくらか異なることができる。ある態様において、（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（オーゲン）ポリペプチドの単一のＮ末端クリングルドメインは天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル５とよりも天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４と少なくとも１残基大きい同一性パーセントを有する。
【００４５】
さらに、本発明の特定の態様はミニ−プラスミン（オーゲン）との対照によって機能的に特性化することができる。好ましい態様において、本発明の（ＴＡＬ６００３）−プラスミンはα２−抗プラスミンによる例えばミニ−プラスミンの阻害の速度より約１もしくは２桁分速い程度の増加した阻害速度を示す。さらに、特定の態様において、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンは固定化リシン（例えば、リシン−セファロース）に結合する。
【００４６】
「Ｎ末端」としての（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの単一のＮ末端クリングルドメインの特性化は、該ドメインが活性化部位に対してＮ末端に存在することのみを意味し、そしてドメイン自体に対してＮ末端の追加のアミノ酸残基が存在しないことを意味しない。さらに、単一のＮ末端クリングルドメインの最もＣ末端のシステイン残基（すなわち、図４に示される最もＣ末端のＣｙｓ残基）とプラスミノーゲンの活性化部位との間に入る残基の数および同一性は、本発明の範囲からそれずに変えることができる。当業者は、本明細書における開示ならびにクリングル１機能および構造に関するガイダンスのために本明細書に引用される参考文献に基づいて過度の実験なしに本発明の利益（欠失突然変異体のサイズの実質的な増加もしくは潜在的に問題のあるグリコシル化部位の導入なしに、ωアミノカルボン酸のクリングル１様結合）を得るこれらのバリエーションを決定することができる。
【００４７】
従って、本発明はポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチドを製造するための組換え方法、ポリヌクレオチドを含有するベクター、ポリペプチドを製造するための発現系、およびそのような発現系を含んでなる培養宿主細胞に関する。
【００４８】
記載の通り、１つの態様において、本発明は本明細書に開示されるポリペプチドもしくはその保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。「保存的」アミノ酸置換の選択に関するガイダンスは、以下にさらに詳細に提供される。１つの態様において、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。
【００４９】
別の態様において、本発明はベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入することを含んでなるベクターを製造する方法に関する。別の態様において、本発明は本発明の方法により製造されるベクターに関する。
【００５０】
別の態様において、本発明は培養宿主細胞に本発明のベクターを導入することを含んで
なる培養宿主細胞を製造する方法に関する。別の態様において、本発明は本発明の方法により製造される培養宿主細胞に関する。
【００５１】
別の態様において、本発明は：（ａ）培養宿主細胞にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターを導入すること；（ｂ）該宿主細胞を培養すること；および（ｃ）ポリペプチドを回収することを含んでなる方法により製造される本発明の単離されたポリペプチドに関する。別の態様において、本発明は：（ａ）ベクターが発現される条件下で本発明の宿主細胞を培養すること；および（ｂ）ポリペプチドを回収することを含んでなるポリペプチドを製造する方法に関する。
【００５２】
別の態様において、本発明は本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有する細胞に関する。
【００５３】
１つの態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：１に示されるようなヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：１に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド４〜１０３２を含んでなる。他の態様において、ポリペプチドは配列番号：２に示されるようなアミノ酸配列を含んでなる。
【００５４】
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドには、1個もしくはそれ以上のヌクレオチドを伴い得る置換、欠失および／もしくは付加を有するバリアントが包含される。バリアントは、コーディング領域、非コーディング領域もしくは両方において改変することができる。コーディング領域における改変は、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失もしくは付加をもたらすことができる。これらの中で特に好ましいのは、（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（オーゲン）タンパク質もしくはその一部の特性および活性を改変しない、サイレント置換、付加および欠失である。またこれに関して特に好ましいのは保存的置換である（以下を参照）。
【００５５】
本発明のさらなる態様には、（ａ）配列番号：２における完全なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号：２におけるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（ｃ）上記の（ａ）もしくは（ｂ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一である、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含んでなる核酸分子が包含される。
【００５６】
１つの態様において、本発明の核酸分子は配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含んでなる。他の態様において、核酸分子は配列番号：１に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドもしくはその縮重バリアントを含んでなる。
【００５７】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンをコードする参照ヌクレオチド配列に少なくとも例えば９５％「同一である」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチド配列が（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり５個までの点突然変異を含むことができることを除いてポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列におけるヌクレオチドの５％までを欠失させるかもしくは別のヌクレオチドで置換することができ、または参照配列における全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチドの数を参照配列に挿入することができる
。参照配列のこれらの突然変異は、参照配列におけるヌクレオチド間で個々にまたは参照配列内の1つもしくはそれ以上の隣接する群において散在して、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置もしくはこれらの末端位置の間のどこかに存在することができる。
【００５８】
上記の通り、２つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列はそれらの同一性パーセントを決定することにより比較することができる。同様に２つもしくはそれ以上のアミノ酸配列はそれらの同一性パーセントを決定することにより比較することができる。２つの配列の同一性パーセントは、核酸配列であろうとペプチド配列であろうと、短い方の配列の長さで割りそして１００を掛けた２つの整列配列間の完全な一致の数として一般に記述される。核酸配列の近似アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡにより開発され、そしてＧｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により正規化されたスコアリングマトリックスを用いてペプチド配列での使用に拡張することができる。核酸およびペプチド配列についてのこのアルゴリズムの実施は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によりそれらのＢＥＳＴＦＩＴ実用アプリケーションにおいて提供される。この方法のデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能）に記述される。
【００５９】
例えば、遺伝暗号の縮重のために、配列番号：１に示される核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である配列を有する多数の核酸分子が（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドをコードすることを当業者は即座に認識する。実際に、これらのヌクレオチド配列の縮重バリアントは全て同じポリペプチドをコードするので、本明細書に記述される任意の機能アッセイもしくは測定を行わずともこれは当業者に明らかである。縮重バリアントではないような核酸分子について、妥当な数もまた（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードすることが当該技術分野においてさらに認識される。これは、タンパク質機能に有意に影響を及ぼす可能性が低いかもしくは可能性があまりないアミノ酸置換（例えば、ある脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸で置換すること）を当業者は完全に認識しているからである。
【００６０】
最近、より長いポリヌクレオチド配列の合成製造における進歩により、伝統的なクローニング技術を使用せずに有意により長いポリペプチドをコードする核酸の合成製造が可能になっている。そのようなサービスの商業的供給業者には、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｌｕｅｈｅｒｏｎｂｉｏ．ｃｏｍ）が包含される。Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．により利用される技術は、全て引用することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６６４，１１２号；第６，６２３，９２８号；第６，６１３，５０８号；第６，４４４，４２２号；第６，３１２，８９３号；第４，６５２，６３９号；米国公開特許出願第２００２０１１９４５６Ａ１号；第２００２００７７４７１Ａ１号；および公開国際特許出願（公開番号）ＷＯ０３０５４２３２Ａ３；ＷＯ０１９４３６６Ａ１；ＷＯ９７２７３３１Ａ２；およびＷＯ９９０５３２２Ａ１に記述される。
【００６１】
もちろん、分子生物学、微生物学および組換え核酸の伝統的な技術もまた本発明のポリヌクレオチドを製造するために用いることができる。これらの技術は周知であり、そして全て引用することにより本明細書に組み込まれる、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｅｂｅｌ，ｅｄ．，Ｖｏｌｓ．Ｉ，ＩＩおよびＩＩＩ（１９９７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．，Ｖｏｌｓ．ＩおよびＩＩ（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”；シリーズ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８４）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）；ならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｗｕ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｕ，ｅｄｓ．，それぞれ、Ｖｏｌｓ．１５４および１５５において説明される。
【００６２】
ベクターおよび培養宿主細胞
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作される培養宿主細胞および組換え技術による（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（オーゲン）ポリペプチドの製造にも関する。
【００６３】
組換え構築物は、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクション、電気穿孔および形質転換のような周知の技術を用いて培養宿主細胞に導入することができる。ベクターは、例えばファージ、プラスミド、ウイルスもしくはレトロウイルスベクターであることができる。レトロウイルスベクターは複数可能もしくは複製欠損であることができる。後者の場合、ウイルス増殖は一般に相補培養宿主細胞においてのみ起こる。
【００６４】
ポリヌクレオチドは、培養宿主における増殖に関して選択可能なマーカーを含有するベクターに連結することができる。一般に、プラスミドベクターはリン酸カルシウム沈殿のような沈殿においてもしくは荷電脂質との複合体において導入される。ベクターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞系を用いてそれをインビトロでパッケージングし、そして次に培養宿主細胞に形質導入することができる。
【００６５】
好ましいのは、興味のあるポリヌクレオチドにシスに作用する制御領域を含んでなるベクターである。適切なトランスに作用する因子は、培養宿主により供給されるか、相補ベクターにより供給されるかもしくは培養宿主への導入の際にベクター自体により供給されることができる。
【００６６】
これに関するある態様において、ベクターは、誘導できそして／もしくは細胞タイプ特異的であることができる特異的発現をもたらす。そのようなベクターの中で特に好ましいのは、温度および栄養素添加物のような、操作するのが容易な環境因子により誘誘できるものである。
【００６７】
本発明において有用な発現ベクターには、染色体由来の、エピソーム由来のおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス由来のベクター、ならびにコスミドおよびファージミドのようなその組み合わせ由来のベクターが包含される。
【００６８】
ＤＮＡインサートは、数例を挙げると、ファージラムダＰＬプロモーター、エシェリキア・コリｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターのような適切なプロモーターに操作可能に連結されるべきである。他の適当なプロモーターは当業者に既知である。発現構築物は転写開始、終結のための部位および転写領域において翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有する。構築物により発現される成熟転写産物のコーディング部分は、翻訳されるポリペプチドの最初に翻訳開始そして最後に適切に位置する終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡもしくはＵＡＧ）を含むことができる。
【００６９】
示されるように、発現ベクターは好ましくは少なくとも１つの選択可能なマーカーを含む。そのようなマーカーには、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素もしくはネオマイシン耐性ならびにエシェリキア・コリおよび他の細菌における培養のためのテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性遺伝子が包含される。適切な培養宿主の代表例には細菌細胞、例えばエシェリキア・コリ、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳおよびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が包含されるがこれらに限定されるものではない。上記の培養宿主細胞用の適切な培養培地および条件は、当該技術分野において既知である。
【００７０】
細菌における使用に好ましいベクターの中には、例えば、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能なｐＥＴ２４ｂもしくはｐＥＴ２２ｂ（それぞれ、ｐＥＴ−２４ｂ（＋）およびｐＥＴ−２２ｂ（＋）＝ｐＥＴ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ２４ｂ（カタログ番号６９７５０）および２２ｂ（カタログ番号７０７６５）、ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｇｅｎ Ｂｒａｎｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；ベクターに関する詳細についてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ ｐＥＴ−２４ｂおよびｐＥＴ−２２ｂに関する製品情報セクションを参照）、Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡから入手可能なｐＢＳベクター、ＰＨＡＧＥＳＣＲＩＰＴベクター、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａ（今はＰｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が包含される。好ましい真核生物ベクターの中には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがある。他の適当なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【００７１】
本発明における使用に適当な細菌プロモーターには、エシェリキア・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲおよびＰＬプロモーター、ならびにｔｒｐプロモーターが包含される。適当な真核生物
プロモーターには、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のもののようなレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターが包含される。
【００７２】
培養宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染もしくは他の方法によりもたらすことができる。そのような方法は、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（１９９５）のような多数の標準的な実験室マニュアルに記述される。
【００７３】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加することができる。エンハンサーは、既定の培養宿主細胞タイプにおいてプロモーターの転写活性を増加するように働く通常は約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシスに作用する要素である。エンハンサーの例には、ｂｐ１００〜２７０で複製起点の後期側上に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが包含される。
【００７４】
小胞体の内腔への、ペリプラズムへのもしくは細胞外環境への翻訳タンパク質の分泌のために、適切な分泌シグナルを発現ポリペプチドに導入することができる。シグナルはポリペプチドに内因性であることができ、もしくはそれらは異種シグナルであることができる。
【００７５】
ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態において発現することができ、そして分泌シグナルだけでなく追加の異種機能領域も含むことができる。例えば、精製中にもしくはその後の取り扱いおよび貯蔵中に、培養宿主細胞における安定性および持続を改善するためにポリペプチドの例えばＮ末端に追加のアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を付加することができる。また、精製を容易にするためにポリペプチドにペプチド部分を付加することもできる。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に取り除くことができる。とりわけ、分泌もしくは排出を引き起こすための、安定性を改善するためのそして精製を容易にするためのポリペプチドへのペプチド部分の付加は、当該技術分野においてよく知られておりそして日常的な技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質を可溶化するために有用である免疫グロブリンからの異種領域を含んでなる。例えば、ＥＰ ０ ４６４ ５３３ Ａ１（カナダの対応物、２，０４５，８６９）は、別のヒトタンパク質もしくはその一部と一緒に免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分を含んでなる融合タンパク質を開示する。多くの場合において、融合タンパク質におけるＦｃ部分は治療および診断における使用にとって全く好都合であり、従って、例えば改善された薬物動態特性をもたらす。一方、ある用途には、融合タンパク質が記載の都合の良い方法において発現され、検出されそして精製された後にＦｃ部分を取り除くことができることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が治療および診断において使用するために障害であると判明する場合に、例えば融合タンパク質が免疫のための抗原として用いられる場合に当てはまる。例えば創薬において、ヒトタンパク質はハイスループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されている（ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するために、ｈＩＬ５受容体のような）。Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，８：５２−５８（１９９５）およびＪｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１６）：９４５９−９４７１（１９９５）を参照。
【００７６】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは、本明細書の実施例に特に記述されるものを包含する周知の方法により組換え細胞培養物から回収しそして精製することができる。本発明のポリペプチドには天然精製産物、化学合成方法の産物、ならびに例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞を包含する原核生物もしくは真核生物培養宿主から組換え技術により製造される産物が包含される。さらに、本発明のポリペプチドはまた、ある場合において宿主媒介過程の結果として、最初の修飾されたメチオニン残基を含むこともできる。
【００７７】
ポリペプチド
本発明のポリヌクレオチドには、本発明のポリペプチドのバリエーションおよび特定の例をコードするものが包含される。例えば、表現型の上でサイレントのアミノ酸置換を行う方法に関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供され、ここで、著者等はタンパク質がアミノ酸置換に驚くほど寛容であることを示す。本発明の範囲内の置換のいくつでもそのような一般的原理の適用により得ることができるが、置換に関する特定のガイダンスには、クリングル１ドメインの構造および機能に関して本明細書に引用される参考文献を当業者は調べることができる。
【００７８】
使用する基準により、（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンのクリングル、活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインの正確な「位置」もしくは配列は、本発明の範囲内の特定のバリエーションにおいてわずかに異なり得ることがさらに理解される。例えば、活性化部位に対するクリングルドメインの正確な位置はわずかに異なることができ、そして／もしくはクリングルドメインに対してＮ末端の配列は長さが異なることができる。従って、本発明には本明細書に開示されるような（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチド活性を示す（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドのそのようなバリエーションが包含される。そのようなバリアントは、欠失、挿入、逆位、反復および置換を含む。上記に示されるように、どのアミノ酸変化が表現型の上でサイレントであると思われるかに関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見出すことができる。
【００７９】
従って、配列番号：２のポリペプチドのフラグメント、誘導体もしくはアナログは、（ｉ）アミノ酸残基の１つもしくはそれ以上（例えば、３、５、８、１０、１５もしくは２０残基）が保存的もしくは非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されるもの（そのような置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号によりコードされるものであるかもしくはそうでない可能性がある）、あるいは（ｉｉ）アミノ酸残基の１つもしくはそれ以上が置換基を含むもの（例えば、３、５、８、１０、１５もしくは２０）、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドがポリペプチドの半減期を増加するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合しているもの、あるいは（ｉｖ）ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダーもしくは分泌配列または成熟ポリペプチドの精製に用いられる配列または前駆タンパク質配列のような、追加のアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであることができる。そのようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書における教示から当業者の範囲内であると考えられる。
【００８０】
示されるように、変化は好ましくはタンパク質のフォールディングもしくは活性に有意に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換のようなわずかな性質のものである。もちろん、熟練した技術者が行うアミノ酸置換の数は上記のものを包含する多数の因子により決まる
。一般的に言えば、任意の既定の（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドの置換の数は５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５もしくは３より多くない。
【００８１】
機能に必須である本発明の（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンにおけるアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発もしくはアラニン走査突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））のような当該技術分野において既知である方法により同定することができる。後者の方法は、分子におけるあらゆる残基で単一のアラニン突然変異を導入する。次に、得られる突然変異体分子は、例えば本明細書に提供される実施例において示されるように、生物学的活性について試験される。リガンド結合に重要である部位もまた、結晶化、核磁気共鳴もしくは光親和性標識（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：３９９−９０４（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））のような構造解析により決定することができる。タンパク質のＮ末端からの１個もしくはそれ以上のアミノ酸の欠失がタンパク質の１つもしくはそれ以上の生物学的機能の改変もしくは喪失をたとえもたらしても、他の生物学的活性を依然として保持することができる。
【００８２】
本発明の「単離されたポリペプチド」の製造において有用なポリペプチドは固相合成法により製造できることもまた意図される。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）；およびＨｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）への米国特許第４，６３１，２１１号を参照。
【００８３】
本発明のポリペプチドは、単離された形態において提供することができる。「単離されたポリペプチド」により、その天然環境から取り除かれたポリペプチドが意図される。従って、組換え培養宿主細胞内で生産されそして／もしくは含有されるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されたと見なされる。また「単離されたポリペプチド」として意図されるのは、組換え培養宿主から部分的にもしくは実質的に精製されているポリペプチドである。
【００８４】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドの参照アミノ酸配列に対して示される同一性パーセントのアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリヌクレオチドに関して上記に示されるコンピューター支援方法を包含する方法を用いて決定することができる。前述の説明におけるヌクレオチド配列と同様にポリペプチドアミノ酸配列を調べそして比較する。当業者は、ポリペプチド分析のためのそのような方法およびプログラムの対応する使用を考える場合にポリヌクレオチドについて説明した分子終点のような概念が直接的アナログを有することを認識する。例えば、ポリヌクレオチドに関して説明した手動補正は核酸の５’および３’終点をさすが、同じ説明はポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に適用可能と認識される。
【００８５】
本発明には、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ／ｂｌｏｃｋｉｎｇ）基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子もしくは他の細胞リガンドへの連結などにより、翻訳中もしくは後に異なって修飾される（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドが包含される。多数の化学修飾のいずれも、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；などが包含されるがこれらに限定されるものではない既知の技術により実施することができる。
【００８６】
例えば、本発明により包含されるさらなる翻訳後修飾には、例えばＮ結合型もしくはＯ
結合型炭水化物鎖、Ｎ末端もしくはＣ末端終端のプロセシング、アミノ酸バックボーンへの化学部分の連結、Ｎ結合型もしくはＯ結合型炭水化物鎖の化学修飾、ならびに原核生物培養宿主細胞における（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチドの発現に適応させたベクターおよび構築物の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加が包含される。ポリペプチドはまた、タンパク質の検出および単離を可能にするために酵素、蛍光、同位体もしくは親和性標識のような検出可能な標識で修飾することもできる。
【００８７】
製薬学的組成物および処置の方法
（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（オーゲン）は、両方とも引用することにより本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１０／１４３，１１２号；およびＮｏｖｏｋｈａｔｎｙ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１（５）：１０３４−４１（２００３）に記述される方法および組成物に従って治療用途に調合することができる。例えば、低ｐＨ（約２．５〜約４）、低緩衝能バッファーを（ＴＡＬ６００３）−プラスミンの調合に用いることができる。さらに、プラスミン、ミニ−プラスミンおよび／もしくはミクロ−プラスミンで実施されるような、当業者に既知である他の方法および調合を治療的投与用の本発明の（ＴＡＬ６００３）−プラスミンを調合するために用いることができる。
【００８８】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（オーゲン）は、例えば、全て引用することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３５５，２４３号、第６，９６４，７６４号および第６，９６９，５１５号に記述されるような方法に従って、様々な血栓性疾患もしくは症状を処置するために用いることができる。この場合もやはり、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンに適用できる可能な製薬学的製剤のように、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンはまた当該技術分野において既知である方法、例えばプラスミン、ミニ−プラスミンおよび／もしくはミクロ−プラスミンで現在実施することができるものにより治療的に投与することもできる。
【実施例】
【００８９】
発現ベクター設計
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンのアミノ酸配列を配列番号：２に示す。（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドをエシェリキア・コリ発現およびｍＲＮＡ安定性のためにコドンを最適化して配列番号：１に示されるようなＤＮＡ配列を提供した。このポリヌクレオチドをエシェリキア・コリ発現ベクターｐＥＴ２４ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＮｄｅＩおよびＢａｍＨ１部位にクローン化して細胞質タンパク質を生成せしめた。
【００９０】
表１に例示されるように、細菌（例えばエシェリキア・コリ）における発現は、配列番号：２に示されるようなアミノ酸配列を有する組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンポリペプチド（すなわち、配列番号：４（例えば図３もまた参照）に示される天然ヒトプラスミノーゲンアミノ酸配列の位置７０のアルギニン（すなわち、Ｒ７０）に対応するアルギニンアミノ酸残基（すなわち、Ｒ２）の直前にＮ末端メチオニン（すなわち、Ｍ１）を有する組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン）をもたらした。そのような組換え産物はさらなる切断を受けやすく天然ヒトプラスミノーゲンの位置７８のリシン（すなわち、Ｋ７８）もしくは位置７９のバリン（すなわち、Ｖ７９）にそれぞれ対応するＮ末端リシン（すなわち、Ｋ１０）もしくはバリン（すなわち、Ｖ１１）を有するタンパク質を包含する異なるＮ末端を有するさらなるタンパク質を生成せしめた。
【００９１】
【表１】
【００９２】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン発現および精製
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンをコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ＢＬ２１（ＤＥ３）（遺伝子型：Ｆ−ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ ｄｃｍ（ＤＥ３））（ＥＭＢ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＢＬＲ（ＤＥ３）（遺伝子型：Ｆ−ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ ｄｃｍ（ＤＥ３）Δ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ））を包含する様々な細胞に形質転換し、そして１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）による誘導後のタンパク質過剰発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。発現概算は、振盪フラスコにおける１Ｌの細胞培養物当たり少なくとも約２５０ｍｇであった。
【００９３】
細胞タイプＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬをＡｒｇ、ＩｌｅおよびＬｅｕをコードするまれなエシェリキア・コリｔＲＮＡを発現するように設計する。さらに、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＬＲ（ＤＥ３）は両方とも、毒性および定着因子がないことに基づいてヒトおよび動物に対して非病原性と分類されるＢ株エシェリキア・コリである。ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞はＤＮＡ組換えのためのｒｅｃＡ遺伝子を欠き、そしてラムダファージの誘導はこれらの細胞で報告されていない。ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞における（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン構築物の研究用細胞バンクを製造し、そしてＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）で純度、同一性およびバクテリオファージの誘導について試験した。試験により研究用細胞バンクの同一性および純度が確認され、そしてファージは認められずに細胞はファージ誘導試験を通過した（データは示されない）。
【００９４】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン（すなわち、配列番号：２に基づく）の生産は、細胞を溶解しそして可溶性タンパク質および精製された封入体の両方をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより調べるより大規模の発現において確かめられた。
【００９５】
以下の典型的なプロトコルは、（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの発現に用いられている：
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンベクターを含有するエシェリキア・コリ細胞（例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ、ＢＬ２１（ＤＥ３）もしくはＢＬＲ（ＤＥ３））の単一コロニーを用いて５ｍｌのＬＢ／カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）に接種し、そして振盪器上で３７℃で８時間インキュベーションした。その後で、新しい培地におけるさらなる培養用に５０μｌのアリコートを培養細菌懸濁液から取った。６ｍｌの細菌培養物および２５０ｍｌの培地で１６時間後に該手順を繰り返した。培養物を振盪しながら３７℃で〜１．０のＯＤ６００ｎｍまで培養し、そしてＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度になるように加えた。培養物をさらに５時間培養した。細胞を５，０００ｘｇで遠心分離により採取し、そして細胞ペレットを２０ｍＭのＥＤＴＡを含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０に溶解し、そして−８０℃で凍結させた。
【００９６】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンを精製するために、細胞ペレットを融解し、そして溶液容量が最初の細胞培養物容量の約１／２０になるまでバッファーを加えた。その後に、リゾチームを０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように加え、そして細胞を４℃で１０〜１５分間急速に撹拌した。次に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１％の最終濃度になるように加え、そして撹拌をさらに１０分間続けた。ＤＮＡｓｅＩ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）およびＭｇＣｌ２（２．５ｍＭ）を加え、そして撹拌を４℃で３０分間もしくは溶液がもはや粘性でなくなるまで続けた。最終溶液を１５，０００ｘｇで４℃で３０分間遠心分離し、そして上清を捨てた。
【００９７】
細胞ペレットを洗浄溶液（１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００および０．５Ｍ尿素を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、そして最終ペレットを４０ｍｌの抽出バッファー（１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＤＴＴおよび６Ｍグアニジン−ＨＣｌを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）に溶解し、そして４℃で一晩保存した。１６時間後に、溶液を１５，０００ｘｇで３０分間遠心分離して固体を除き、そして上清を４℃で撹拌しながらリフォールディング溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３．５ＭグアニジンＨＣｌ、０．５ＭアルギニンＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、３ｍＭ ＧＳＨ、０．３ｍＭ ＧＳＳＧ）にゆっくりと加えた。リフォールディング方法は、約０．２９ｇ／Ｌのタンパク質濃度で実施した。
【００９８】
リフォールディング溶液をそのままにして４℃で２日間維持し、そして次にバッファー溶液を頻繁に変えながら８〜１０時間の期間にわたって、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍアルギニン−ＨＣｌを含有する８倍容量の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０に対して透析した。
【００９９】
次に、タンパク質溶液を透析から取り出し、そして約１０〜２０ｍｌまで１０ｋＤａの膜カットオフを有するＡＭＩＣＯＮフィルターを用いて濃縮し、そして１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する１００倍容量の０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に対して一晩透析した。この物質を遠心分離して微粒子を除き、次にリシン親和性樹脂（リシン−セファロース４Ｂ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上に通した。０．２Ｍイプシロンアミノカプロン酸（εＡＣＡ）を含有するＴｒｉｓ緩衝食塩水、ｐＨ８．０を用いて（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンを樹脂から溶出した。
【０１００】
典型的に、１リットルの細胞培養物から８０ｍｇの封入体を単離することができ、そしてリシン−セファロースクロマトグラフィー工程において４０ｍｇを溶出することができ
た。
【０１０１】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの特性
精製された（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは、還元（ジチオスレイトールで処理する）および非還元タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により３５〜４０ｋＤａ領域におけるバンドとして現れた。ＭＡＬＤＩ質量分析により決定されるその分子量は約３８，１４０Ｄａであり、それは予想される値に近い。
【０１０２】
ストレプトキナーゼによる（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの活性化の速度を決定するために、１ｍｇ／ｍｌの組換え（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンを１：１００の（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン：ストレプトキナーゼの比率でストレプトキナーゼと混合し、ｐＨ７で室温でインキュベーションした。様々な時間点で、サンプルを取り除き、ＳＤＳ−Ｐａｇｅバッファーでクエンチし、そして還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてデンシトメトリー上で分析して２本鎖（ＴＡＬ６００３）−プラスミンへの１本鎖（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの転化を測定した。ストレプトキナーゼによる（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの活性化パーセントは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した場合の経時的な全長（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの喪失として図６に示される。
【０１０３】
クリングル１の機能性を確かめるために、リシン−セファロース４ＢへのＴＡＬ６００３−プラスミノーゲンの結合を測定した。図７に示されるように、（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンはリシン−セファロースに結合し、そして約４ｍＭで単一ピークとして０〜２０ｍＭのεＡＣＡ勾配によりカラムから溶出することができた。リフォールデインングした（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンのリシン−セファロースに結合する能力は、該分子のクリングルドメインが適切にフォールディングされそしてリシン結合部位が完全に活性であることを示す。
【０１０４】
クリングル１の機能性をさらに確かめるために、（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンへのεＡＣＡの結合を、全て引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｍａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９０：９３−９７（１９９０）およびＤｏｕｇｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：３３０２−３３１０（２００２）により記述されるようにタンパク質蛍光の付随する変化をモニターすることにより測定した。（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンのクリングル１へのεＡＣＡの結合は、おそらくリシン結合部位の一部であるトリプトファン残基の消光のために、蛍光の減少をもたらす。
【０１０５】
この過程をモニターするために、εＡＣＡの濃縮溶液の４μｌ〜１６μｌアリコートを２０ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓバッファー、ｐＨ８．０、２５℃中５μＭの（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン２ｍｌに加えた。ＦＬＵＯＲＯＭＡＸ蛍光分光光度計（Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）において２９８ｎｍの励起波長および３４０ｎｍの発光波長で蛍光をモニターし；εＡＣＡの各添加後に、蛍光のさらなる変化が認められなくなるまで溶液を平衡化させた。
【０１０６】
得られる蛍光値を希釈に関して補正し、そして０〜５０μＭのεＡＣＡの範囲にわたってεＡＣＡの濃度に対してプロットした。データを非線形回帰により適合させて約１９μＭのＫｄを得た。
【０１０７】
プラスミノーゲンの１つの特性は、フィブリンに結合するその能力である。（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンがフィブリンと相互作用する能力を保持するかどうかを決定するために、フィブリンへの（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの結合をｔＰＡによ
るその後の活性化および結果として起こる血栓溶解により評価するマイクロタイタープレートアッセイにおいてそのフィブリン結合特性を試験した。この目的のために、１００μｌの５ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲンをマイクロタイタープレートの各ウェルにおいてトロンビンで重合させた。様々な濃度の（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンをフィブリン血栓の上部に加え、そして３７℃で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳで十分に洗浄し、その間にフィブリン血栓は依然として完全なままでありそしてウェルに結合している。洗浄した後に、ｔＰＡの０．１ｍｇ／ｍｌ溶液を各ウェルに加え、そしてプレートを３７℃で２時間インキュベーションした。結果として、血栓のいくらかは完全に溶解され、そしていくらかは部分的に溶解され、一方、非常に少量の（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンを有するウェルおよびコントロールウェルは実質的に元のままであった。線維素溶解の程度は、１ＭのＮａＯＨにおいて再構成した最初の血栓の残りの２８０ｎｍの吸光度を測定することによりモニターした。吸光度値を（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン濃度の関数としてプロットした。
【０１０８】
図８に示されるように、フィブリンへの（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの結合は古典的なＳ字形結合曲線をたどった。このアッセイを用いて、（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンは全長プラスミノーゲンのものに匹敵する親和性でフィブリンに結合しそしてこの相互作用のＣ５０（〜０．３μＭ）は全長プラスミノーゲンのフィブリン結合のＫｄに匹敵することが見出された。
【０１０９】
これらの実験は、（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンがフィブリンに結合できることを示す。さらに、少なくともリシン−セファロースと（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンとの相互作用、予想されるＫｄでεＡＣＡに結合するその能力、フィブリンに結合するその能力、そしてプラスミノーゲンアクチベーターにより活性化されるその能力は全て、この分子が完全に機能性形態においてエシェリキア・コリ系で生産されることを示した。
【０１１０】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミン精製および製剤
精製された（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲン溶液へのＳＫの添加は、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンへの（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンの転化をもたらす。タンパク質を２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、そして５０％グリセロールで１：１に希釈して２５％グリセロール中１ｍｇ／ｍｌの溶液を生成せしめた。溶液を室温にし、そしてストレプトキナーゼを１：１００のモル比のＳＫ：（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンで加えた。反応物を撹拌せずに室温で４．５ｈｒインキュベーションした。次に、０．５Ｍの最終濃度になるようにＮａＣｌを加えて反応を遅くした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる活性化の分析により、９０％の収率の活性化タンパク質が示された。
【０１１１】
活性化（ＴＡＬ６００３）−プラスミンをベンズアミジンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ベンズアミジンアフィニティー精製の目的は、活性（ＴＡＬ６００３）−プラスミンからの、（ＴＡＬ６００３）−プラスミン分解産物を包含する、非活性化（ＴＡＬ６００３）−プラスミノーゲンおよび不純物の分離であった。平衡化したベンズアミジン−セファロース４ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗカラムにＳＫ活性化溶液をかけた。短縮されたそして完全な両方の（ＴＡＬ６００３）−プラスミンは親和性樹脂により捕獲され、一方、上記の不純物はカラムを通過した。２８０ｎｍでの吸光度がベースラインに到達するまでカラムを平衡化バッファーで洗浄した。次に、結合した（ＴＡＬ６００３）−プラスミンを低ｐＨのεＡＣＡ段階を用いて溶出してカラムから全ての残留タンパク質を剥離した。発色性プラスミン効能アッセイにより測定した場合に９５％活性であるタンパク質で、典型的な収率は７５％であった。
【０１１２】
全長プラスミンと同様に、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンは生理的ｐＨで自己分解す
る傾向があるので、最終製剤にはｐＨ３．６を選択した（酢酸−食塩水で酸性化した）。引用することにより組み込まれる、Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．，１（５）：１０３４−４１（２００３）によりプラスミンについて以前に示され、そして（ＴＡＬ６００３）−プラスミンでの実験において確かめられるように、この低緩衝能、低ｐＨ製剤は長期間にわたる活性プラスミンの安全な貯蔵を可能にするだけでなく、これらの直接的血栓溶解剤の非経口投与とも適合する。血漿もしくは中性ｐＨバッファーと混合すると、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンは迅速に再活性化される。
【０１１３】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミンの酵素特性
プラスミン基質Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２５１）（ＤｉａＰｈａｒｍａ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＯＨ）を用いて（ＴＡＬ６００３）−プラスミンのアミド分解活性を調べた。
【０１１４】
（ＴＡＬ６００３）−プラスミンについて、ＰＢＳバッファー中ｐＨ７．４、２５℃で、Ｓ−２２５１のミカエリス・メンテン定数（ＫＭ）が同様に１４１μＭであることが見出された（表３）。製剤のｋｃａｔは、約７２５ｍｉｎ−１であることが見出された。４−グアニジノ安息香酸４−ニトロフェニル塩酸塩（ｐＮＰＧＢ）滴定（Ｃｈａｓｅ，Ｔ．ａｎｄ Ｅ．Ｓｈａｗ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９７：２０−２７（１９７０））を用いて、機能活性部位のパーセントは６７％であることが見出された。活性部位パーセントについてｋｃａｔを補正して、約７２５ｍｉｎ−１のｋｃａｔが決定された。この値は、全長プラスミンについて（８２０＋／−２３ｍｉｎ−１）そしてミクロ−プラスミン（全ての５個のクリングルを欠く）について（７９５＋／−２４ｍｉｎ−１）同じアッセイにおいて決定された値に非常に近かった。これらのデータは、クリングルの存在もしくは不在がセリンプロテアーゼドメインの触媒活性に影響を及ぼさないことを示す。
【０１１５】
【表２】
【０１１６】
α２−抗プラスミンによる（ＴＡＬ６００３）−プラスミンの阻害の速度は、プラスミンおよびα２−抗プラスミンを混合し次に特定の時間点でＳ−２２５１活性についてアッセイするＷｉｍａｎおよびＣｏｌｌｅｎの方法（Ｗｉｍａｎ，Ｂ．ａｎｄ Ｄ．Ｃｏｌｌｅｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８４：５７３−５７８（１９７８））を用いて１．８±０．０６ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１であると決定された（表４）。この値は、２．５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１のプラスミンについて報告された値（Ａｎｏｎｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．５９：４４９（１９９０）から）に匹敵する。
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
ミクロ−プラスミンで行った同じ実験により、２つの別個の実験において１．８ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１および３．１ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１のα２−抗プラスミン阻害速度が示された。ミニ−プラスミン（ミニ−プラスミンドメイン組成、Ｋ５−ＳＰ）のα２−抗プラスミン阻害の速度は、２．４ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１であると決定された。これらのデータはミクロ−およびミニ−プラスミンの文献値と合理的に一致し、そしてα２−抗プラスミンによる（ＴＡＬ６００３）−プラスミンの阻害がミクロ−プラスミンもしくはミニ−プラスミンのいずれかの阻害より４０倍速いことを示す。従って、これらの結果は、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンがその構造におけるクリングル１の存在のためにα２−抗プラスミンにより迅速に阻害されるはずであることを示す。全体として、この節に提示されるデータは、（ＴＡＬ６００３）−プラスミンの酵素および阻害特性が全長プラスミンと同様であることを示す。
【０１１９】
文献値は、Ａｎｏｎｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．５９：４４９（１９９０）から取られる。全ての速度は、Ａｎｏｎｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．に公開される方法に従って測定した。
【０１２０】
インビトロ線維素溶解効能
（ＴＡＬ６００３）−プラスミンの線維素溶解効能は、以下の実験プロトコルを用いて血栓溶解アッセイのインビトロモデルにおいて試験した。
【０１２１】
血漿由来のプラスミンと（ＴＡＬ６００３）−プラスミンとの血栓溶解効能のインビトロ比較。等モル量の血漿由来のプラスミン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）および（ＴＡＬ６００３）−プラスミン（０．１１ｍｇ／ｍｌ）を試験管において血栓と混合し、そして血栓溶解の程度を血栓から遊離される物質のＡ２８０吸光度によりモニターした。
【０１２２】
フィブリンの存在下で血漿阻害剤に打ち勝ちそして血栓溶解を開始するために必要なプラスミンもしくは（ＴＡＬ６００３）−プラスミンの濃度を図９に示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン、ここで、クリングルドメイン内の最後の４個のアミノ酸残基はＶ、Ｐ、ＱおよびＣである；および
ｂ）ヒトプラスミノーゲンにおける対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメイン
を有するポリペプチド（ここで、該ポリペプチドは固定化リシンに結合する）をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
単一のＮ末端クリングルドメインが天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４に相同である請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項３】
コードされるポリペプチドが配列番号：２に示される配列と少なくとも９０％もしくは９５％、または９８％同一である請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項４】
コードされるポリペプチドが配列番号：２に示される配列と少なくとも９８％同一である請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項５】
コードされるポリペプチドが配列番号：２に示される配列である請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号：１に示される配列もしくはその縮重バリアントである請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項７】
単一のＮ末端クリングルドメインが天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４と少なくとも９０％同一であり；そしてＣ末端ドメインがヒトプラスミノーゲンの活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインと少なくとも９０％同一である請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項８】
固定化リシンがリシン−アガロース、リシン−ヒドロゲル、リシン−架橋アガロースよりなる群から選択される固体支持マトリックスに結合したリシンである請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項９】
固定化リシンがリシン−架橋アガロースである請求項８のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ポリペプチドがミニ−プラスミンのフィブリノーゲンに対する結合親和性より低いフィブノーゲンに対する結合親和性を示す請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ポリペプチドがミニ−プラスミンの部分的に切断されたフィブリンに対する結合親和性より高い部分的に切断されたフィブリンに対する結合親和性を示す請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ポリペプチドが参照ポリペプチドと比較した場合に減少した免疫原性を有し、参照ポリペプチドがポリペプチドの一次アミノ酸配列と同一の一次アミノ酸配列を有し、ただし、参照ポリペプチドの単一のＮ末端クリングルドメインの最後の４個のアミノ酸残基がＶ、Ｐ、ＱおよびＣではない請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
ａ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン、ここで、クリングルドメイン内の最後の４個のアミノ酸残基はＶ、Ｐ、Ｑおよ
びＣである；および
ｂ）ヒトプラスミノーゲンにおける対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメイン
を含んでなるポリペプチド（ここで、該ポリペプチドは固定化リシンに結合する）。
【請求項１４】
単一のＮ末端クリングルドメインが天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４に相同である請求項１３のポリペプチド。
【請求項１５】
ポリペプチドがα２−抗プラスミンによるミニ−プラスミンの線維素溶解活性の阻害の速度より少なくとも約５倍速い阻害の速度でα２−抗プラスミンにより阻害される線維素溶解活性を示す請求項１３のポリペプチド。
【請求項１６】
阻害の速度がミニ−プラスミンの阻害の速度より少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍もしくは４０倍速い請求項１５のポリペプチド。
【請求項１７】
ポリペプチドが配列番号：２に示される配列と少なくとも９０％もしくは９５％、または９８％同一である請求項１３のポリペプチド。
【請求項１８】
単一のＮ末端クリングルドメインが天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４と少なくとも９０％同一であり；そしてＣ末端ドメインがヒトプラスミノーゲンの活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインと少なくとも９０％同一である請求項１３のポリペプチド。
【請求項１９】
単一のＮ末端クリングルドメインが天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル５とよりも天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４と少なくとも１残基大きいアミノ酸配列同一性を有し、そしてヒトプラスミノーゲンのクリングル１および４の天然配列に対する単一のＮ末端クリングルドメインの保存的置換がクリングル５との同一性比較の目的のために天然配列と異なると見なされない請求項１３のポリペプチド。
【請求項２０】
ポリペプチドが配列番号：２に示されるようなアミノ酸配列およびその保存的置換を有する請求項１３のポリペプチド。
【請求項２１】
ポリペプチドが配列番号：２に示されるアミノ酸配列の位置８５のものと同様の相対的位置でアルギニン残基を有する請求項１３のポリペプチド。
【請求項２２】
ポリペプチドが参照ポリペプチドと比較した場合に減少した免疫原性を有し、参照ポリペプチドがポリペプチドの一次アミノ酸配列と同一の一次アミノ酸配列を有し、ただし、参照ポリペプチドの単一のＮ末端クリングルドメインの最後の４個のアミノ酸残基がＶ、Ｐ、ＱおよびＣではない請求項１３のポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３の発現ベクターを含んでなる培養細胞。
【請求項２５】
ａ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン（ここで、クリングルドメイン内の最後の４個のアミノ酸残基はＶ、Ｐ、ＱおよびＣである）；ならびにヒトプラスミノーゲンにおける対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを有するポリペプチドを提供すること；ここで、ポリペプチドは固定化リシンに結合する
ｂ）段階ａ）において提供されるポリペプチドを１個もしくはそれ以上のペプチド結合
を切断するために十分な条件下でプロテーゼと接触させ、それにより異なるＮ末端を有する１つもしくはそれ以上の組換えプラスミンポリペプチドを生成せしめること
を含んでなる、異なるＮ末端を有する１つもしくはそれ以上の組換えプラスミンポリペプチドを製造する方法。
【請求項２６】
ポリペプチドが配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する請求項２５の方法。
【請求項２７】
提供することがエシェリキア・コリにおいて配列番号：１に示されるＤＮＡ配列もしくはその縮重バリアントを発現させることを含んでなる請求項２５の方法。
【請求項１】
ａ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン、ここで、クリングルドメイン内の最後の４個のアミノ酸残基はＶ、Ｐ、ＱおよびＣである；および
ｂ）ヒトプラスミノーゲンにおける対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメイン
を有するポリペプチド（ここで、該ポリペプチドは固定化リシンに結合する）をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
単一のＮ末端クリングルドメインが天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４に相同である請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項３】
コードされるポリペプチドが配列番号：２に示される配列と少なくとも９０％もしくは９５％、または９８％同一である請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項４】
コードされるポリペプチドが配列番号：２に示される配列と少なくとも９８％同一である請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項５】
コードされるポリペプチドが配列番号：２に示される配列である請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号：１に示される配列もしくはその縮重バリアントである請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項７】
単一のＮ末端クリングルドメインが天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４と少なくとも９０％同一であり；そしてＣ末端ドメインがヒトプラスミノーゲンの活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインと少なくとも９０％同一である請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項８】
固定化リシンがリシン−アガロース、リシン−ヒドロゲル、リシン−架橋アガロースよりなる群から選択される固体支持マトリックスに結合したリシンである請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項９】
固定化リシンがリシン−架橋アガロースである請求項８のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ポリペプチドがミニ−プラスミンのフィブリノーゲンに対する結合親和性より低いフィブノーゲンに対する結合親和性を示す請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ポリペプチドがミニ−プラスミンの部分的に切断されたフィブリンに対する結合親和性より高い部分的に切断されたフィブリンに対する結合親和性を示す請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ポリペプチドが参照ポリペプチドと比較した場合に減少した免疫原性を有し、参照ポリペプチドがポリペプチドの一次アミノ酸配列と同一の一次アミノ酸配列を有し、ただし、参照ポリペプチドの単一のＮ末端クリングルドメインの最後の４個のアミノ酸残基がＶ、Ｐ、ＱおよびＣではない請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
ａ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン、ここで、クリングルドメイン内の最後の４個のアミノ酸残基はＶ、Ｐ、Ｑおよ
びＣである；および
ｂ）ヒトプラスミノーゲンにおける対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメイン
を含んでなるポリペプチド（ここで、該ポリペプチドは固定化リシンに結合する）。
【請求項１４】
単一のＮ末端クリングルドメインが天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４に相同である請求項１３のポリペプチド。
【請求項１５】
ポリペプチドがα２−抗プラスミンによるミニ−プラスミンの線維素溶解活性の阻害の速度より少なくとも約５倍速い阻害の速度でα２−抗プラスミンにより阻害される線維素溶解活性を示す請求項１３のポリペプチド。
【請求項１６】
阻害の速度がミニ−プラスミンの阻害の速度より少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍もしくは４０倍速い請求項１５のポリペプチド。
【請求項１７】
ポリペプチドが配列番号：２に示される配列と少なくとも９０％もしくは９５％、または９８％同一である請求項１３のポリペプチド。
【請求項１８】
単一のＮ末端クリングルドメインが天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４と少なくとも９０％同一であり；そしてＣ末端ドメインがヒトプラスミノーゲンの活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインと少なくとも９０％同一である請求項１３のポリペプチド。
【請求項１９】
単一のＮ末端クリングルドメインが天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル５とよりも天然ヒトプラスミノーゲンのクリングル１もしくはクリングル４と少なくとも１残基大きいアミノ酸配列同一性を有し、そしてヒトプラスミノーゲンのクリングル１および４の天然配列に対する単一のＮ末端クリングルドメインの保存的置換がクリングル５との同一性比較の目的のために天然配列と異なると見なされない請求項１３のポリペプチド。
【請求項２０】
ポリペプチドが配列番号：２に示されるようなアミノ酸配列およびその保存的置換を有する請求項１３のポリペプチド。
【請求項２１】
ポリペプチドが配列番号：２に示されるアミノ酸配列の位置８５のものと同様の相対的位置でアルギニン残基を有する請求項１３のポリペプチド。
【請求項２２】
ポリペプチドが参照ポリペプチドと比較した場合に減少した免疫原性を有し、参照ポリペプチドがポリペプチドの一次アミノ酸配列と同一の一次アミノ酸配列を有し、ただし、参照ポリペプチドの単一のＮ末端クリングルドメインの最後の４個のアミノ酸残基がＶ、Ｐ、ＱおよびＣではない請求項１３のポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３の発現ベクターを含んでなる培養細胞。
【請求項２５】
ａ）天然ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメインに相同な単一のＮ末端クリングルドメイン（ここで、クリングルドメイン内の最後の４個のアミノ酸残基はＶ、Ｐ、ＱおよびＣである）；ならびにヒトプラスミノーゲンにおける対応するドメインに相同なＣ末端ドメイン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを有するポリペプチドを提供すること；ここで、ポリペプチドは固定化リシンに結合する
ｂ）段階ａ）において提供されるポリペプチドを１個もしくはそれ以上のペプチド結合
を切断するために十分な条件下でプロテーゼと接触させ、それにより異なるＮ末端を有する１つもしくはそれ以上の組換えプラスミンポリペプチドを生成せしめること
を含んでなる、異なるＮ末端を有する１つもしくはそれ以上の組換えプラスミンポリペプチドを製造する方法。
【請求項２６】
ポリペプチドが配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する請求項２５の方法。
【請求項２７】
提供することがエシェリキア・コリにおいて配列番号：１に示されるＤＮＡ配列もしくはその縮重バリアントを発現させることを含んでなる請求項２５の方法。
【図４】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図７】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図７】
【公表番号】特表２０１１−５０５１４０（Ｐ２０１１−５０５１４０Ａ）
【公表日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３６１１７（Ｐ２０１０−５３６１１７）
【出願日】平成２０年１１月２５日（２００８．１１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８４６４５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７３４７１
【国際公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【出願人】（５０６０７４４８４）タレクリス・バイオセラピユーテイクス・インコーポレーテツド (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２５日（２００８．１１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８４６４５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７３４７１
【国際公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【出願人】（５０６０７４４８４）タレクリス・バイオセラピユーテイクス・インコーポレーテツド (10)
【Ｆターム（参考）】
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