経皮薬剤の試験方法と装置
本発明は、経皮投与薬剤の試験のための装置と方法に関し、膜浸透セル内において試験される試料が、セルの開放式試料コンパートメント内に存在し、温度、空気流、光、空気湿度などの環境要因に曝された中で、吸収および浸透試験を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経皮投与薬剤からの有効成分の放出を、生体外で行うモデリングのための試験方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内での薬物放出、および吸収−浸透現象を含む生物学的事象をモデリングするのに適する生体外的方法は、美容ならびに製薬分野の研究において、強い関心を集めている。
【０００３】
皮膚科学において、薬剤有効成分の吸収と最終結果は、皮膚内においてのみ確認されるが、それには多大の困難を伴うので、皮膚用すなわち経皮用薬剤の開発段階では、生体外方式が非常に重要である。その治療効果の定量的な特性付けもまた、複雑困難な課題である。動物愛護に関する法的倫理的規範が社会全般に受け入れられているため、動物検体の使用が急激に減少している。しかし、有効成分を定常定量的に皮膚経由投与することを目的とする薬剤の場合には、その有効成分の放出試験をすることが非常に重要である。
【０００４】
有効成分の放出に関する試験は、下記の分野で非常に重要な意味を持っている。
− 薬剤投与形態の開発と薬剤組成の最適化。
− 多種成分の経皮投与薬剤を製造する段階における、設定された目標の監視（例え
ば、制御の変更、製造技術または製剤組成の改変のため）。
− 工程内制御および放出制御。
− 生物学的同等性の研究。
【０００５】
半流動体投与形態の製剤と前臨床評価において、1992年以降、吸収性軟膏の浸透試験の役割が増大している。
【０００６】
軟膏又はその他の経皮薬剤を治療用に使用する時、３段階の過程が、順次にまたは同時に起こる。即ち、（1）有効成分の媒体の放出;（2）有効成分の皮膚の外層への浸透;（3）生体皮膚内部への有効成分の透過後、または時によっては透過に引き続いて、吸収されて生体組織内の循環。製剤の使用目的が、局所的または経皮の場合には、通常、上記最後の工程は望ましくないが、その製剤が全身作用を目的としている場合は、非常に重要な役割を果たすことができる。
【０００７】
経皮薬剤からの有効成分放出のモデリングに適した生体外試験方式は、幾つかの特長によって分類されている。ニューベルト（NEUBERT）とその共同研究者は、その放出と吸収方式を識別した（非特許文献１）。ファーレス（FARES）およびザッツ（ZATZ）は、拡散または溶解に基づいて、その方式を差別化した（非特許文献２）。多数の生体外方式を分類すると、下記の通りに集約される。
【０００８】
１．膜無しの方法
1.1 反極性を持つ液体間での分配
1.2 開放タンク方式
1.3 ゲル拡散方式（寒天、ゼラチン）
【０００９】
２．律速方式／膜方式
2.1 装置による分類
2.1.1. セル内平衡拡散方式
2.1.2. 流下式セル方式
2.2 膜のタイプによる分類
2.2.1 天然の膜
2.2.1.1 人体皮膚からの膜
2.2.2. 合成膜
【００１０】
第1グループの方法では、膜は使われない。一方、薬剤試料と収容容器室との間で天然膜または合成膜を使用する方式は、第２グループに属する。
【００１１】
有効成分の放出および浸透には、膜無し方式が適している。
【００１２】
膜無し方式には３種類がある。すなわち、(１)反極性を持つ異相間の隔壁の試験、(２)開放容器方法、及び(３)ゼラチンまたは寒天内への浸透速度を測定するゲル浸透方式 がある。
【００１３】
最後の試験方法は、受容体の中へ浸透する有効成分の分析に基づいている。試験用調製剤の上に位置するフィルターは、拡散速度をコントロールする手段と言うよりも、むしろ障害壁として作用する。
【００１４】
膜を使用する試験方法は、これら３段階の方式、すなわち、有効成分の放出、浸透、および透過の全ての方式に適している。その試験装置においては、供与体相と受容体相の間が膜によって隔てられている。通常、膜は、無極性で生物学的バリヤーのモデリングに適するものである。サンプルは、供与体相の中に含まれている。受容体相は、通常蒸留水または水溶液（塩水又は緩衝液で界面活性剤または輸送タンパク質−例えばアルブミン−を含む）である。
【００１５】
膜を使用する方法は、通常、膜の材質（例えば、人体皮膚またはその一部、他の生物の膜、または人工膜）、試験化合物（例えば、同位元素標識を施した物質）、または分析方法によって分類される。この試験方式においては、有効成分の放出および浸透は、膜内へ進入することに相当するが、一方、透過は、水溶性受容体相の中へ拡散することとして見なされる。
【００１６】
製剤から有効成分が放出されること、及びその後に起る生物学的事象は、次のような物理化学的な現象：(１)有効成分の媒体内溶解;(２)溶解物質の拡散;(３)異種極性相間の隔離、――に起因するものということが出来る。
【００１７】
有効成分の溶解は、主として有効成分の温度、濃度、及びその分散性（粒子径、形状、粒子径分布）によって変容する。
【００１８】
配分工程は、主として有効成分の溶解度によって支配される。溶解媒体および配給媒体の特性、溶解性向上補助剤、溶解の温度および溶解方法などの要因は、このプロセスにおいて重要な役割を演じる。
【００１９】
拡散工程は、主として媒質の粘度、ゲルの構造、および物理化学的構造、および有効成分の性質とその調製方法によって、コントロールされる。
【００２０】
最新技術による膜装置では、平衡拡散を起こすのに適するセルが使われる。これらのセルは、嘗てのフローセルを置き換えたもので、生体内条件の最高度のシミュレーションに適している。
【００２１】
平衡拡散のモデリングの原則は、予め設定した一定期間の後、サンプルを採取、分析し、放出された有効成分の量を測定することにある。同様に、膜を通じて拡散した有効成分の割合を測定することが可能である。このようにして、有効成分の放出と浸透を、時間の関数として調べることが可能になる。
【００２２】
フロ−セル方式では、受容体相の継続的な流れを、ポンプで作り出す。この受容体相が膜に接触し、予め設定した一定期間の後、サンプルとして採取されるか、又はその有効成分濃度が、オンラインで連続的に計測分析される（例えば、フローセルに装備されている分光光度計を使用して）。
【００２３】
生体外方式の中では、ハンソン（Hanson）が設計製作したマイクロエッテ（Microette、商標） 経皮拡散セルが、 再現性が最も高く、概して生体内条件のモデリング用に最適であると考えられる。この装置では、試験サンプルが入っている区画（ドナーコンパートメント）は、特別の膜で受容体相から隔離されている。膜の配置は、垂直か水平であり、攪拌セルの容積や表面積は、幾通りかのオプションから選ぶことが出来る。数基のセルを同時に使用することも可能である。受容体相のサンプル採取と流量制御は自動化されており、各セルで同時並行して行われる。溶解度と拡散定数は、温度に対して依存関係にあるので、セルの温度を一定に保持しておけば良い。同様に、受容体相の流量は、自動温度調節器で調節される。このようなセルはフランツ（Franz）セルとして知られている（非特許文献３）。このセルの構造を、図１に示す。
【００２４】
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】ニューベルト、アール（Neubert, R.）,ウォールラブ、ダブリュ（Wohlrab, W.）：アクタ・ファーマシューチカル・テクノロジー（Acta Pharm, Techn.）36,197-206(1990):（局所用調剤の生物薬剤学的評価のための生体外試験方法）
【非特許文献２】ファーレス、エッチ エム（Fares, H. M.）, ザッツ、ジェイ エル（Zatz, J. L.）,: ファーマシューチカル・テクノロジー（Pharm. Technol.） 19,(1) 52-58 (1995)
【非特許文献３】フランツ、ティー（Franz, T.）: カレント・プロブレム・ダーマトロジー（Curr. Probl. Dermatol.） 7, 58-68 (1978)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明は、最新技術による公知の方法と装置を駆使しても、皮膚に付けた時の製剤の挙動のモデリングはできないとの認識に基づく。皮膚に付けた製剤の挙動には、環境要因が影響することが分かっている。従って、環境上の可変要因の影響は、試験用製剤を入れたコンパートメントが大気に開放されている膜方式で、モデル化することが出来る。開放使用の平衡拡散装置や、その他の種類の膜拡散セルについて、技術の開示が為されているが、最新技術でも、開放式試料コンパートメントを備える膜拡散セルからなる浸透装置については、言及されていない。従来、環境条件制御を組み込んだ開放式試料コンパートメントの装置については開示されていない。
【００２７】
更に、最新技術による方法でも、試験用製剤の性質と組成は、試験期間中一定ではなく幾つもの環境要因の関数として変化するという事実を考慮していない。その様な要因には、試験製剤を塗布した皮膚面積の品質（例えば、顔と手は、通常光と空気流に曝されている、腹部や鼠径部は通常衣類で覆われており、従って空気流や光から隔離されている）、；露出した皮膚の付近の空気の流速と湿度、および皮膚と、その周囲の空気との温度差、皮膚露光の強度、露光時間、光の波長などがある。
【００２８】
このように、試験製剤の使用目的箇所の身体表面への環境条件（例えば、顔は大概空気と光に曝され；腹部や鼠径部は、空気と光から隔離されている）の影響を考慮して、モデル化することが可能となっている。
【００２９】
多くの場合について、これらの関係を詳細に研究することが必要である。例えば、目的とする治療法の開発過程において、（例えば、日除け止め・炎症予防のためのクリームが、低温強風下の冬季スキー、または高温無風状態の熱帯性夏季の日光浴など、極端な環境や気象条件の下で、その機能があるか否か）、および特殊用途を目的とする製剤の開発（耐候性製剤の開発）などの場合である。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
われわれの研究開発の目的は、可変的環境条件の下で、開放コンパートメント式膜浸透法を使って、可変的環境条件の下で、皮膚に使用する医薬製剤の試験に供することが出来る新しい試験装置と試験方法を開発することであった。
【００３１】
そのために、装置、詳細には、開放式試料コンパートメント付き膜浸透型セルを作った。
【００３２】
本発明による装置は、経皮方式医薬製剤の生体内性質を予見するのに適している。この装置は、人体皮膚の生物学的状態を概数化するのに適しており、経皮型医薬組成物を、リアルタイムで適用する時の条件と類似の環境条件下で試験することが出来る。本発明に基づく装置を使用することにより、経皮型調剤の適用時中の表面効果を調べることが可能となる。本発明の方法によれば、あらゆる経皮型調剤の試験、および生体外モデリング（例えば、ゲル、エマルジョン、外用薬溶液、懸濁液、粉剤、エーロゾル剤など、高濃度の揮発性成分を有する組成物を含むが、それらに限定しない）を行うことができる。
【００３３】
本発明による装置の仕組みと接続を、図４に示す。膜浸透システムは、開放式試料コンパートメント（Ｃ１）を有する膜浸透セルと、環境条件を制御するシステムと、受容体相流(１)のための供給システムと、サンプル採取及び分析システム(３)とから構成される。この装置は、ブロック式またはマイクロプロセッサー式制御器(４)で制御されている。
【００３４】
本発明の更なる局面として、試験製剤のための開放式試料コンパートメントを備える膜浸透セルが提供される。本発明によるセルは、受容体相と試験調剤の性質を考慮して、最新技術で知られる公知の適当な不活性材料、例えば鋼鉄でつくることが出来る。膜は、セル体の上部に設けられる。膜は、固定のため適当な手段、例えば 糸を通した固定用リング、または弾性体締めリングで固定される。受容体相用の容器には、入口と出口が設けられ、また場合によっては、温度調整制御のための液体温度自動調節器を取り付けるジャケットが設けられる（図２、図３）。また、場合により、セル体の外側に断熱材が設けられる。セル体の膜側の断面積は、寸法測定および／または較正により、正確に求められる。具象化されたセルの一例を、図２に示す。同じセルでクリーム状の試料を充填した場合を、図３に示す。
【００３５】
図４は、本発明による装置の一例のフローチャートであり、各側面にガラスの扉が取り付けられた箱型容器の中に、開放式試料コンパートメントを備える膜浸透セルが納められている。セルは、セルボディ（C1）と、そこに取り付けられた膜、および弾性体締めリング、および受容体相の入口と出口に繋がる流体接続から構成されている。セルボディ（C1）は、AISI グレード36 のステンレススチールからなっているが、センサー取付け用の孔が開けられている。セルボディは、洗浄消毒のために装置から取り外すことが出来る。セルの重量は、約500g で、従来の公知のセルの重量に比べてかなり重い。比較的大きな重量ではあるが、熱容量的には、コンパクトな設計であり、流体温度は、入り口で既にセル温度に同調するので、受容体相用の独立した温度制御は不要である。セルの断面積と容積（それぞれ10.00 cm2 、3,00 cm3）は、正確に定められているので、結果の計算は容易である。
【００３６】
セルの温度は、熱媒を液体温度自動調節器(C4)で加熱冷却する方式の、ニッケルメッキ した真鍮製の対流式ラジエーター（C3）で制御される。熱媒は不凍液である。温度自動調節器は、電気加熱式であるが、冷却のためには、外部の冷却ユニットを使用する。温度設定制御は、0.1度Ｃの精度で可能である。温度センサー(C2)は、セルの内部に位置している。セルの温度に比例した信号が、制御回路（図４、Ｃ）に送られる。システムの制御速度は非常に速い（時定数は30秒以下）。加熱は、可変幅方形波信号（variable width square wave signal）によって制御される。加熱エレメントのスイッチは、半導体継電器である。冷却が必要な時は、予冷した熱媒を、必要に応じて所定の温度を維持するまで加温して行く。
【００３７】
この装置において、ラボール-ミン（LABOR-MIN）ウルトラサンモスタット (C4, Labor MIN, Esztergom, Hungary) を使用する場合、熱媒として、２リットルのグリセリン−蒸留水溶液（容積比 50:50）を使用する。温度センサー（C2）にはニベルコ（NIVELCO）CTFP-121-1 （ハンガリー・ブタペスト・ニベルコ社）Pt/100/B プラチナ熱センサを使用し、温度制御（図４、Ｃ）には、
ブロック型の日本製オムロンE5CSV-R1 T-500 温度制御器を使用する。
【００３８】
試験目的に適した膜であれば、どのようなものでも、本発明による装置に使うことが出来る。膜としては、天然膜（例えば、人体からのもの、哺乳動物‐ブタ、ネズミ、ウサギの皮膚、又はそれらを貼り合わせた物、細胞増殖により得られる膜など）、または生物学的に作られた人工膜、または、例えば、ポリシロキサン（Silastic）、セルローズ、又はその誘導体、ビニルアセテート、またはアクリレートのポリマー類など、合成化学的に作られた膜などを使うことが出来る。本発明による装置は、皮膚膜または皮膚を幾層か貼り合せて出来た膜（例えば、表皮、上層真皮、層角質など）を皮膚化処理、加熱処理、化学・酵素処理などによって調製し使用するのに適している。吸収−浸透の研究用に適する膜の調製は、最新の技術を応用した公知の方法により行われる。
【００３９】
皮膚、またはその他の生物学的隔壁のモデリングのために使う膜の上部表面に、試験用調剤のサンプルを塗布する。サンプルの塗布量は、膜の面積に対して約0.001 ・ 0.1 g/cm2である。
【００４０】
本発明により、サンプルは制御された流速と温度の、さらに必要ならば、一定に制御した湿度の空気の流れに接触させることが出来る。本発明による装置は、所定の流速、所定の温度、および湿度で空気を供給するのに適しており、それは、空気供給システム（圧搾空気ボンベ、または中央空気圧搾機、換気扇、HVAC装置など）、また場合により、空気洗浄手段、温度制御システム、および湿度制御システムなどによって行われる。また、装置から排出される空気の熱容量や湿度を、計測し、記録することも、公知の方法により可能である。
【００４１】
本発明を具体化した一例により、制御電圧、可変回転速度、低電圧換気扇によって、空気の流れをつくりだすことが出来る（A1）。流れる空気の温度は、電気式加熱ユニット、気温センサー(A2)、および温度制御システム（図４、Ａ）によって制御される。冷却は、換気扇に冷気を送り、併せて予冷した空気流を、上記の方法で加温することにより行われる。空気流の温度の急速制御は、可変パルス‐幅方形波制御と、低電圧加熱方式加熱エレメントによって行われる。（時定数 30秒以下）。
【００４２】
空気の流れ速度は、換気扇の電圧を、0.5から2.5 m/s の間で調整することにより制御される。空気流は、膜面にかかる制御電圧の関数として検量される。
【００４３】
加熱エレメント(A3)の温度は、温度センサー (A2, ニベルコ（NIVELCO）CTFP-121-1 Pt/100/B プラチナヒートセンサ) の信号によって制御される。制御器(Ｃ) は、オムロン（OMRON）E5CSV-R1 T-500 ユニットである。空気の流れは、LM7815 電圧制御器付きの INC A199411 (R=40mm)の換気扇によってつくり出される。この換気扇の電圧は、３ボルトから15 ボルトの間で連続的に調節することが出来る。ある実施例では、装置に進入する空気の相対湿度は、大気の湿度と全く同じである。しかし、空気の湿度は、一般的な公知の方法により制御することもできる。
【００４４】
膜面に適用する試料は、光に露出しても差し支えない。露光により、試料内でも、物理的化学的変化が起きていることを観察することが出来る。ある方法では、太陽光のスペクトル (YOLDAL YZ-WS5S20, Sunny-White, max light intensity 11,000 mcd)と同様の発光スペクトルを持つ発光ダイオード(L-1) により発光させている。露光をセンサー（L2）で測定しながら、L1 の発光をそれにあわせて制御する。光の強度は、自家製制御器を使って、L1 の励振電圧の周波数制御により調整することができる。このようにすれば、LEDの発光スペクトルは、光の強度に影響されない。
【００４５】
これらの場合において、試験製剤を、異なった強度の光、あるいは通常の太陽光とは異なる発光スペクトルに露光させる場合（例えば、紫外線強度が海抜ゼロメートル地帯よりも異常に高い高高度地点で試験製剤を使用する時など）には、実際の生活環境で予想されるものに近い発光スペクトルや強度を持つ発光源と置き換えることが可能である。
【００４６】
環境要因に曝した結果、試験製剤の調製変更が望ましい場合は、後の評価用表示方法を用いて、同時に、又は選択的に目視検査に切り替えて記録を行うことができる。
【００４７】
浸透の測定においては、定常状態の流速、組成、温度の受容体相の流れを浸透セル内に流して、開放式試料コンパートメントを持つ膜浸透セルから離れる排出液に含まれる試験製剤中の有効成分、または特徴的組成物の濃度を、受容体相の容積と時間の関数として決定する（図４）。
【００４８】
試験製剤の有効成分の濃度、またはその特徴的組成物の濃度測定は、検体濃度をオンライン分析システム（３）、例えば、流動キュベットを装備した装置を用いる吸光度測定法によって実施する。あるいは、この検体分析は、排出される受容体相の流れから、所定の時間又は所定量のサンプルを採取し、任意の分析方法（図４）によって検体濃度を分析決定することもできる。液相分析法が好んで行われる。また、好ましくは、検体を選択的に分析する方法が良い。クロマトグラフ法を好ましく採用することができる。
【００４９】
オンライン分析を目的とするサンプル採取の時、セルの出口と膜の高さを同じ高さに保つ事が、膜に圧力が加わるのを防止するために重要である。
【００５０】
受容体相の供給は、ポンプ輸送するのが好ましい。そのために、受容体相を、必要な流速で、かつ希望する精度で輸液するのに適した任意のポンプを使用する。浸透試験運転時の受容体相の流速は、人の体液、例えば血液の流れの流速範囲におおよそ入る。しかし、受容体相の流速は、試験時に使われる膜の圧力抵抗によって影響されることがある。実験中の受容体相の流速は、通常0.5ないし３ml／分であるが、好ましくは0.1ないし0.5ml／分である。流速の揺れは、実際の流速に対して1％を超えてはならない。容積置換ポンプを使用するのが好ましい。セルの入口孔と出口孔には、適切なねじ山を切って、ロウデッドボリュームチュービング（low dead volume tubing）と、高性能液体クロマトグラフィシステム用に開発したコネクターを使用できるようにするのが良い。
【００５１】
例えば、液体クロマトグラフィシステムの部分的構成要素を、受容体相の供給のために使用しても良い。また受容体相用の貯液槽として、溶離液タンク（E1) を使用しても良い。好ましくは、耐熱耐薬品性ガラスビン、例えばTORAXガラスビン、を使用するのが良い。受容体相は、液体クロマトグラフィシステムの高圧ポンプで浸透セルに供給される。高性能液体クロマトグラフィシステムで使われるポンプ（E2）は、その精密度の高さと、小さな流れ変動性のために、有利に使用することができる（図４）。
【００５２】
圧力の差は、膜拡散プロセスの障害となるので、セル内に圧力が加わるのを防止することは、特に重要である。このために、入口チュービングの断面積は、出口チュービングよりも小さく抑えられており、好ましくは、入口チューブの断面積は出口チューブの1/4 である。
【００５３】
受容体相は、通常生理用液のモデリングに適した溶液である。適切な受容体相とは、純水、生理食塩水、リン酸塩緩衝液、またはリンゲル液である。
【００５４】
受容体相は、使用前に、公知の方法、例えば超音波処理、又はガス抜きなどの何れかの方法で脱ガス処理される。アルゴンパージの方法によるのが好ましい。可能ならば、高性能液体クロマトグラフ装置のオンライン脱ガスモジュールを使用するのが良い。
【００５５】
この発明の発明者は、溶離液供給モジュールとして、シマズ（Shimadzu）LC-6A Liquid Chromatograph、又は、RMA ERC-3312 に付属する高圧ポンプアジレント（Agilent） (Hewlett Packard) HP G 1311A, 又は、受容体相供給用に適した脱ガスユニットアジレント（Agilent） (Hewlett Packard) G 1322 A を使用した。
【００５６】
検体のオンライン分析のための手段として、液体クロマトグラフィ用につくられたフローセル付きの検知器（Ｓ１）を使用することもできる（図４）。発明者は、Agilent (Hewlett Packard) G1315A photodiode array detector, または Shimadzu UV-Spectrophotometric Detector, またはBeckman Fluorescent Detector を、この目的のために好ましく使用した。検体の性質に従って、検出波長や励起／放射の波長 などの検出パラメータ を選択することが出来る。検体で特定の検出手段が無い場合は、質量感応性検出器（例えば、屈折率検出器または蒸発性光散乱検出器）を使用することが出来る。収集した検出信号は、コンピュータ化したデータ収集システムを使って評価する。
【００５７】
装置の制御は、個別に電子式又は電気機械式の制御方式を使うよりも、コンピュータ化された工程管理システムを随時に使って、限界パラメータの制御、データの収集および分析を含めてすべての制御を行うことが出来る。
【００５８】
また、多数基のセルをつくって、個々のセルでのサンプル採取／分析システムを一つの装置に集約すると、個々の試験が同時併行的に実施可能となる。
【００５９】
本発明の更なる特徴として、製薬用または美容用の調剤から、有効成分を放出させる生体外モデリング用の方法、特に吸収・浸透プロセスのモデリング方法が提供される。
【００６０】
この方法は、次のように実施される。受容体相を濾過、脱ガスする。セルを脱ガスした後、そこに膜を取り付ける。流速、温度、空気流、および光の強度安定状態になるのを待って（通常１ないし24時間）、試験用調剤を１〜３秒の間に均質化するように膜面に移す。調剤の量は、好ましくはリアルタイム状態で使う量、または試験時に使う調剤の１回分単位量である。
【００６１】
その後、受容体相の流れを元通りに戻し、オンライン分析の場合は、調剤の有効成分の濃度、あるいは調剤の特徴ある組成物の濃度を記録する。実際の濃度の計算は、受容体相量または経過時間の関数として外挿法で行う。これらのデータから、溶解速度を決定する。オフライン分析の場合は、少量のサンプルを何回か採取して、その夫々を然るべき公知の分析法により分析する。これらのデータから、採取サンプル中の検体の量を決定し、溶解速度を計算する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】非特許文献３で開示されているセルの構造を示す図。
【図２】本発明のセルの一例を示す写真。
【図３】図２のセルにクリーム状の試料を充填した状態を示す写真。
【図４】本発明による装置を使用するシステムのフローチャート。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
（実施例１）
トロキセルチン5％ゲルの膜浸透試験
試験用調剤は、有効成分として5％トロキセルチンを含んでいる。この試験では、塩化ナトリウム0.9重量％の溶液を、受容体相として用いる。受容体相の流速は、１mm／分である。この試験で使用した膜は、幅10cm、長さ10cmのセロファンである。セルの温度は、34度Cである。セルは、昼間の自然光に曝されている。1回目の試験（I）では、人工的な空気流を起こしていない。2回目の試験（II ）での、空気流の線速度は、２メートル／秒である。有効成分の濃度は、波長349 nmの紫外線分光分析法によってオンラインで測定する。
【００６４】
膜は装置とともに、60分間安定化させる。その後、分析精度で計量した試験用調剤300 mg を膜面上に移し、２〜３秒で均質化させる。その後、受容体相の流れを元通りに戻し、溶解した有効成分の濃度を記録する。
【００６５】
試験(I）と試験(2) で溶解させた有効成分の量を（膜面に移した有効成分の量に対しての相対的数値で）表１に示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
（実施例２）
セロファン膜および人体皮膚膜使用時のpiroxicam含有クリームの膜浸透比較試験
試験用調剤は有効成分として1％piroxicam を含有する。この試験において、受容体相は0.9重量％の塩化ナトリウム溶液を含有する。受容体相の流速は0.3 m/分である。
一回目の試験（I）ではセロファン膜を使用、二回目の試験（II）では人体皮膚膜を使用した。セルの温度を34度Cに保った。試験時の間、セルは天然太陽光に露光させた。人工的には空気流をつくらなかった。
【００６８】
膜を安定化のため 60分間静置した。
【００６９】
安定化期間の後、300ないし400 mg の試験用調剤を分析精度で検量し、２−３秒で膜面に均等に塗布する。受容体相の流れを元通りに戻して、排出液を各30分間採取する。Piroxicam と nipagin Mについて、各少量液の濃度を 高性能液体クロマトグラフィによって測定する。各検体の容積と濃度を測定し、各分液内のpiroxicam と Nipagin M の含有量を計算する。逆相システムにおいて、外的標準法を用い、高性能液体クロマトグラフィ分析を実施する。Nucleosil C18 (250 mm x 4,6 mm i.d.) コラムと緩衝液-アセトニトリル-メタノール(1000:660:340, v/v/v)溶離液を用いて分離を行う。分離は、40度Cの温度で行う。溶離液の流速は1.0 ml/分とする。紫外線フォトダイオードアレー検出器を用いて波長範囲250−450 nmの範囲内で検出を行う。試験（I）および 試験（II）において放出された piroxicam および Napagin M (methyl-4-hydroxybenzoate)の、夫々の膜塗付量に対する相対比率を表２に示す。
【００７０】
【表２】
【符号の説明】
【００７１】
１ 溶離液供給システム
２ 膜浸透システム
３ 試料分析システム（又は、検体濃度オンライン分析システム）
４ ブロック式又はマイクロプロセッサー制御システム
Ａ 空気温度制御システム
Ａ１ 可変速度換気扇
Ａ２ 気温センサー
Ａ３ 加熱ユニット（又は、加熱エレメント）
Ｃ セル温度制御システム
Ｃ１ 膜浸透セル、セルボディ
Ｃ２ 温度センサー
Ｃ３ 加熱ユニット（又は、対流式ラジエーター）
Ｃ４ 液体温度自動調節器
Ｅ１ 溶離液タンク
Ｅ２ 液体クロマトグラフィ用ポンプ
Ｌ 光強度制御システム
Ｌ１ 発光ダイオード
Ｌ２ 光センサー
Ｓ１ 紫外／可視波長域蛍光-分光分析器
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経皮投与薬剤からの有効成分の放出を、生体外で行うモデリングのための試験方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内での薬物放出、および吸収−浸透現象を含む生物学的事象をモデリングするのに適する生体外的方法は、美容ならびに製薬分野の研究において、強い関心を集めている。
【０００３】
皮膚科学において、薬剤有効成分の吸収と最終結果は、皮膚内においてのみ確認されるが、それには多大の困難を伴うので、皮膚用すなわち経皮用薬剤の開発段階では、生体外方式が非常に重要である。その治療効果の定量的な特性付けもまた、複雑困難な課題である。動物愛護に関する法的倫理的規範が社会全般に受け入れられているため、動物検体の使用が急激に減少している。しかし、有効成分を定常定量的に皮膚経由投与することを目的とする薬剤の場合には、その有効成分の放出試験をすることが非常に重要である。
【０００４】
有効成分の放出に関する試験は、下記の分野で非常に重要な意味を持っている。
− 薬剤投与形態の開発と薬剤組成の最適化。
− 多種成分の経皮投与薬剤を製造する段階における、設定された目標の監視（例え
ば、制御の変更、製造技術または製剤組成の改変のため）。
− 工程内制御および放出制御。
− 生物学的同等性の研究。
【０００５】
半流動体投与形態の製剤と前臨床評価において、1992年以降、吸収性軟膏の浸透試験の役割が増大している。
【０００６】
軟膏又はその他の経皮薬剤を治療用に使用する時、３段階の過程が、順次にまたは同時に起こる。即ち、（1）有効成分の媒体の放出;（2）有効成分の皮膚の外層への浸透;（3）生体皮膚内部への有効成分の透過後、または時によっては透過に引き続いて、吸収されて生体組織内の循環。製剤の使用目的が、局所的または経皮の場合には、通常、上記最後の工程は望ましくないが、その製剤が全身作用を目的としている場合は、非常に重要な役割を果たすことができる。
【０００７】
経皮薬剤からの有効成分放出のモデリングに適した生体外試験方式は、幾つかの特長によって分類されている。ニューベルト（NEUBERT）とその共同研究者は、その放出と吸収方式を識別した（非特許文献１）。ファーレス（FARES）およびザッツ（ZATZ）は、拡散または溶解に基づいて、その方式を差別化した（非特許文献２）。多数の生体外方式を分類すると、下記の通りに集約される。
【０００８】
１．膜無しの方法
1.1 反極性を持つ液体間での分配
1.2 開放タンク方式
1.3 ゲル拡散方式（寒天、ゼラチン）
【０００９】
２．律速方式／膜方式
2.1 装置による分類
2.1.1. セル内平衡拡散方式
2.1.2. 流下式セル方式
2.2 膜のタイプによる分類
2.2.1 天然の膜
2.2.1.1 人体皮膚からの膜
2.2.2. 合成膜
【００１０】
第1グループの方法では、膜は使われない。一方、薬剤試料と収容容器室との間で天然膜または合成膜を使用する方式は、第２グループに属する。
【００１１】
有効成分の放出および浸透には、膜無し方式が適している。
【００１２】
膜無し方式には３種類がある。すなわち、(１)反極性を持つ異相間の隔壁の試験、(２)開放容器方法、及び(３)ゼラチンまたは寒天内への浸透速度を測定するゲル浸透方式 がある。
【００１３】
最後の試験方法は、受容体の中へ浸透する有効成分の分析に基づいている。試験用調製剤の上に位置するフィルターは、拡散速度をコントロールする手段と言うよりも、むしろ障害壁として作用する。
【００１４】
膜を使用する試験方法は、これら３段階の方式、すなわち、有効成分の放出、浸透、および透過の全ての方式に適している。その試験装置においては、供与体相と受容体相の間が膜によって隔てられている。通常、膜は、無極性で生物学的バリヤーのモデリングに適するものである。サンプルは、供与体相の中に含まれている。受容体相は、通常蒸留水または水溶液（塩水又は緩衝液で界面活性剤または輸送タンパク質−例えばアルブミン−を含む）である。
【００１５】
膜を使用する方法は、通常、膜の材質（例えば、人体皮膚またはその一部、他の生物の膜、または人工膜）、試験化合物（例えば、同位元素標識を施した物質）、または分析方法によって分類される。この試験方式においては、有効成分の放出および浸透は、膜内へ進入することに相当するが、一方、透過は、水溶性受容体相の中へ拡散することとして見なされる。
【００１６】
製剤から有効成分が放出されること、及びその後に起る生物学的事象は、次のような物理化学的な現象：(１)有効成分の媒体内溶解;(２)溶解物質の拡散;(３)異種極性相間の隔離、――に起因するものということが出来る。
【００１７】
有効成分の溶解は、主として有効成分の温度、濃度、及びその分散性（粒子径、形状、粒子径分布）によって変容する。
【００１８】
配分工程は、主として有効成分の溶解度によって支配される。溶解媒体および配給媒体の特性、溶解性向上補助剤、溶解の温度および溶解方法などの要因は、このプロセスにおいて重要な役割を演じる。
【００１９】
拡散工程は、主として媒質の粘度、ゲルの構造、および物理化学的構造、および有効成分の性質とその調製方法によって、コントロールされる。
【００２０】
最新技術による膜装置では、平衡拡散を起こすのに適するセルが使われる。これらのセルは、嘗てのフローセルを置き換えたもので、生体内条件の最高度のシミュレーションに適している。
【００２１】
平衡拡散のモデリングの原則は、予め設定した一定期間の後、サンプルを採取、分析し、放出された有効成分の量を測定することにある。同様に、膜を通じて拡散した有効成分の割合を測定することが可能である。このようにして、有効成分の放出と浸透を、時間の関数として調べることが可能になる。
【００２２】
フロ−セル方式では、受容体相の継続的な流れを、ポンプで作り出す。この受容体相が膜に接触し、予め設定した一定期間の後、サンプルとして採取されるか、又はその有効成分濃度が、オンラインで連続的に計測分析される（例えば、フローセルに装備されている分光光度計を使用して）。
【００２３】
生体外方式の中では、ハンソン（Hanson）が設計製作したマイクロエッテ（Microette、商標） 経皮拡散セルが、 再現性が最も高く、概して生体内条件のモデリング用に最適であると考えられる。この装置では、試験サンプルが入っている区画（ドナーコンパートメント）は、特別の膜で受容体相から隔離されている。膜の配置は、垂直か水平であり、攪拌セルの容積や表面積は、幾通りかのオプションから選ぶことが出来る。数基のセルを同時に使用することも可能である。受容体相のサンプル採取と流量制御は自動化されており、各セルで同時並行して行われる。溶解度と拡散定数は、温度に対して依存関係にあるので、セルの温度を一定に保持しておけば良い。同様に、受容体相の流量は、自動温度調節器で調節される。このようなセルはフランツ（Franz）セルとして知られている（非特許文献３）。このセルの構造を、図１に示す。
【００２４】
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】ニューベルト、アール（Neubert, R.）,ウォールラブ、ダブリュ（Wohlrab, W.）：アクタ・ファーマシューチカル・テクノロジー（Acta Pharm, Techn.）36,197-206(1990):（局所用調剤の生物薬剤学的評価のための生体外試験方法）
【非特許文献２】ファーレス、エッチ エム（Fares, H. M.）, ザッツ、ジェイ エル（Zatz, J. L.）,: ファーマシューチカル・テクノロジー（Pharm. Technol.） 19,(1) 52-58 (1995)
【非特許文献３】フランツ、ティー（Franz, T.）: カレント・プロブレム・ダーマトロジー（Curr. Probl. Dermatol.） 7, 58-68 (1978)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明は、最新技術による公知の方法と装置を駆使しても、皮膚に付けた時の製剤の挙動のモデリングはできないとの認識に基づく。皮膚に付けた製剤の挙動には、環境要因が影響することが分かっている。従って、環境上の可変要因の影響は、試験用製剤を入れたコンパートメントが大気に開放されている膜方式で、モデル化することが出来る。開放使用の平衡拡散装置や、その他の種類の膜拡散セルについて、技術の開示が為されているが、最新技術でも、開放式試料コンパートメントを備える膜拡散セルからなる浸透装置については、言及されていない。従来、環境条件制御を組み込んだ開放式試料コンパートメントの装置については開示されていない。
【００２７】
更に、最新技術による方法でも、試験用製剤の性質と組成は、試験期間中一定ではなく幾つもの環境要因の関数として変化するという事実を考慮していない。その様な要因には、試験製剤を塗布した皮膚面積の品質（例えば、顔と手は、通常光と空気流に曝されている、腹部や鼠径部は通常衣類で覆われており、従って空気流や光から隔離されている）、；露出した皮膚の付近の空気の流速と湿度、および皮膚と、その周囲の空気との温度差、皮膚露光の強度、露光時間、光の波長などがある。
【００２８】
このように、試験製剤の使用目的箇所の身体表面への環境条件（例えば、顔は大概空気と光に曝され；腹部や鼠径部は、空気と光から隔離されている）の影響を考慮して、モデル化することが可能となっている。
【００２９】
多くの場合について、これらの関係を詳細に研究することが必要である。例えば、目的とする治療法の開発過程において、（例えば、日除け止め・炎症予防のためのクリームが、低温強風下の冬季スキー、または高温無風状態の熱帯性夏季の日光浴など、極端な環境や気象条件の下で、その機能があるか否か）、および特殊用途を目的とする製剤の開発（耐候性製剤の開発）などの場合である。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
われわれの研究開発の目的は、可変的環境条件の下で、開放コンパートメント式膜浸透法を使って、可変的環境条件の下で、皮膚に使用する医薬製剤の試験に供することが出来る新しい試験装置と試験方法を開発することであった。
【００３１】
そのために、装置、詳細には、開放式試料コンパートメント付き膜浸透型セルを作った。
【００３２】
本発明による装置は、経皮方式医薬製剤の生体内性質を予見するのに適している。この装置は、人体皮膚の生物学的状態を概数化するのに適しており、経皮型医薬組成物を、リアルタイムで適用する時の条件と類似の環境条件下で試験することが出来る。本発明に基づく装置を使用することにより、経皮型調剤の適用時中の表面効果を調べることが可能となる。本発明の方法によれば、あらゆる経皮型調剤の試験、および生体外モデリング（例えば、ゲル、エマルジョン、外用薬溶液、懸濁液、粉剤、エーロゾル剤など、高濃度の揮発性成分を有する組成物を含むが、それらに限定しない）を行うことができる。
【００３３】
本発明による装置の仕組みと接続を、図４に示す。膜浸透システムは、開放式試料コンパートメント（Ｃ１）を有する膜浸透セルと、環境条件を制御するシステムと、受容体相流(１)のための供給システムと、サンプル採取及び分析システム(３)とから構成される。この装置は、ブロック式またはマイクロプロセッサー式制御器(４)で制御されている。
【００３４】
本発明の更なる局面として、試験製剤のための開放式試料コンパートメントを備える膜浸透セルが提供される。本発明によるセルは、受容体相と試験調剤の性質を考慮して、最新技術で知られる公知の適当な不活性材料、例えば鋼鉄でつくることが出来る。膜は、セル体の上部に設けられる。膜は、固定のため適当な手段、例えば 糸を通した固定用リング、または弾性体締めリングで固定される。受容体相用の容器には、入口と出口が設けられ、また場合によっては、温度調整制御のための液体温度自動調節器を取り付けるジャケットが設けられる（図２、図３）。また、場合により、セル体の外側に断熱材が設けられる。セル体の膜側の断面積は、寸法測定および／または較正により、正確に求められる。具象化されたセルの一例を、図２に示す。同じセルでクリーム状の試料を充填した場合を、図３に示す。
【００３５】
図４は、本発明による装置の一例のフローチャートであり、各側面にガラスの扉が取り付けられた箱型容器の中に、開放式試料コンパートメントを備える膜浸透セルが納められている。セルは、セルボディ（C1）と、そこに取り付けられた膜、および弾性体締めリング、および受容体相の入口と出口に繋がる流体接続から構成されている。セルボディ（C1）は、AISI グレード36 のステンレススチールからなっているが、センサー取付け用の孔が開けられている。セルボディは、洗浄消毒のために装置から取り外すことが出来る。セルの重量は、約500g で、従来の公知のセルの重量に比べてかなり重い。比較的大きな重量ではあるが、熱容量的には、コンパクトな設計であり、流体温度は、入り口で既にセル温度に同調するので、受容体相用の独立した温度制御は不要である。セルの断面積と容積（それぞれ10.00 cm2 、3,00 cm3）は、正確に定められているので、結果の計算は容易である。
【００３６】
セルの温度は、熱媒を液体温度自動調節器(C4)で加熱冷却する方式の、ニッケルメッキ した真鍮製の対流式ラジエーター（C3）で制御される。熱媒は不凍液である。温度自動調節器は、電気加熱式であるが、冷却のためには、外部の冷却ユニットを使用する。温度設定制御は、0.1度Ｃの精度で可能である。温度センサー(C2)は、セルの内部に位置している。セルの温度に比例した信号が、制御回路（図４、Ｃ）に送られる。システムの制御速度は非常に速い（時定数は30秒以下）。加熱は、可変幅方形波信号（variable width square wave signal）によって制御される。加熱エレメントのスイッチは、半導体継電器である。冷却が必要な時は、予冷した熱媒を、必要に応じて所定の温度を維持するまで加温して行く。
【００３７】
この装置において、ラボール-ミン（LABOR-MIN）ウルトラサンモスタット (C4, Labor MIN, Esztergom, Hungary) を使用する場合、熱媒として、２リットルのグリセリン−蒸留水溶液（容積比 50:50）を使用する。温度センサー（C2）にはニベルコ（NIVELCO）CTFP-121-1 （ハンガリー・ブタペスト・ニベルコ社）Pt/100/B プラチナ熱センサを使用し、温度制御（図４、Ｃ）には、
ブロック型の日本製オムロンE5CSV-R1 T-500 温度制御器を使用する。
【００３８】
試験目的に適した膜であれば、どのようなものでも、本発明による装置に使うことが出来る。膜としては、天然膜（例えば、人体からのもの、哺乳動物‐ブタ、ネズミ、ウサギの皮膚、又はそれらを貼り合わせた物、細胞増殖により得られる膜など）、または生物学的に作られた人工膜、または、例えば、ポリシロキサン（Silastic）、セルローズ、又はその誘導体、ビニルアセテート、またはアクリレートのポリマー類など、合成化学的に作られた膜などを使うことが出来る。本発明による装置は、皮膚膜または皮膚を幾層か貼り合せて出来た膜（例えば、表皮、上層真皮、層角質など）を皮膚化処理、加熱処理、化学・酵素処理などによって調製し使用するのに適している。吸収−浸透の研究用に適する膜の調製は、最新の技術を応用した公知の方法により行われる。
【００３９】
皮膚、またはその他の生物学的隔壁のモデリングのために使う膜の上部表面に、試験用調剤のサンプルを塗布する。サンプルの塗布量は、膜の面積に対して約0.001 ・ 0.1 g/cm2である。
【００４０】
本発明により、サンプルは制御された流速と温度の、さらに必要ならば、一定に制御した湿度の空気の流れに接触させることが出来る。本発明による装置は、所定の流速、所定の温度、および湿度で空気を供給するのに適しており、それは、空気供給システム（圧搾空気ボンベ、または中央空気圧搾機、換気扇、HVAC装置など）、また場合により、空気洗浄手段、温度制御システム、および湿度制御システムなどによって行われる。また、装置から排出される空気の熱容量や湿度を、計測し、記録することも、公知の方法により可能である。
【００４１】
本発明を具体化した一例により、制御電圧、可変回転速度、低電圧換気扇によって、空気の流れをつくりだすことが出来る（A1）。流れる空気の温度は、電気式加熱ユニット、気温センサー(A2)、および温度制御システム（図４、Ａ）によって制御される。冷却は、換気扇に冷気を送り、併せて予冷した空気流を、上記の方法で加温することにより行われる。空気流の温度の急速制御は、可変パルス‐幅方形波制御と、低電圧加熱方式加熱エレメントによって行われる。（時定数 30秒以下）。
【００４２】
空気の流れ速度は、換気扇の電圧を、0.5から2.5 m/s の間で調整することにより制御される。空気流は、膜面にかかる制御電圧の関数として検量される。
【００４３】
加熱エレメント(A3)の温度は、温度センサー (A2, ニベルコ（NIVELCO）CTFP-121-1 Pt/100/B プラチナヒートセンサ) の信号によって制御される。制御器(Ｃ) は、オムロン（OMRON）E5CSV-R1 T-500 ユニットである。空気の流れは、LM7815 電圧制御器付きの INC A199411 (R=40mm)の換気扇によってつくり出される。この換気扇の電圧は、３ボルトから15 ボルトの間で連続的に調節することが出来る。ある実施例では、装置に進入する空気の相対湿度は、大気の湿度と全く同じである。しかし、空気の湿度は、一般的な公知の方法により制御することもできる。
【００４４】
膜面に適用する試料は、光に露出しても差し支えない。露光により、試料内でも、物理的化学的変化が起きていることを観察することが出来る。ある方法では、太陽光のスペクトル (YOLDAL YZ-WS5S20, Sunny-White, max light intensity 11,000 mcd)と同様の発光スペクトルを持つ発光ダイオード(L-1) により発光させている。露光をセンサー（L2）で測定しながら、L1 の発光をそれにあわせて制御する。光の強度は、自家製制御器を使って、L1 の励振電圧の周波数制御により調整することができる。このようにすれば、LEDの発光スペクトルは、光の強度に影響されない。
【００４５】
これらの場合において、試験製剤を、異なった強度の光、あるいは通常の太陽光とは異なる発光スペクトルに露光させる場合（例えば、紫外線強度が海抜ゼロメートル地帯よりも異常に高い高高度地点で試験製剤を使用する時など）には、実際の生活環境で予想されるものに近い発光スペクトルや強度を持つ発光源と置き換えることが可能である。
【００４６】
環境要因に曝した結果、試験製剤の調製変更が望ましい場合は、後の評価用表示方法を用いて、同時に、又は選択的に目視検査に切り替えて記録を行うことができる。
【００４７】
浸透の測定においては、定常状態の流速、組成、温度の受容体相の流れを浸透セル内に流して、開放式試料コンパートメントを持つ膜浸透セルから離れる排出液に含まれる試験製剤中の有効成分、または特徴的組成物の濃度を、受容体相の容積と時間の関数として決定する（図４）。
【００４８】
試験製剤の有効成分の濃度、またはその特徴的組成物の濃度測定は、検体濃度をオンライン分析システム（３）、例えば、流動キュベットを装備した装置を用いる吸光度測定法によって実施する。あるいは、この検体分析は、排出される受容体相の流れから、所定の時間又は所定量のサンプルを採取し、任意の分析方法（図４）によって検体濃度を分析決定することもできる。液相分析法が好んで行われる。また、好ましくは、検体を選択的に分析する方法が良い。クロマトグラフ法を好ましく採用することができる。
【００４９】
オンライン分析を目的とするサンプル採取の時、セルの出口と膜の高さを同じ高さに保つ事が、膜に圧力が加わるのを防止するために重要である。
【００５０】
受容体相の供給は、ポンプ輸送するのが好ましい。そのために、受容体相を、必要な流速で、かつ希望する精度で輸液するのに適した任意のポンプを使用する。浸透試験運転時の受容体相の流速は、人の体液、例えば血液の流れの流速範囲におおよそ入る。しかし、受容体相の流速は、試験時に使われる膜の圧力抵抗によって影響されることがある。実験中の受容体相の流速は、通常0.5ないし３ml／分であるが、好ましくは0.1ないし0.5ml／分である。流速の揺れは、実際の流速に対して1％を超えてはならない。容積置換ポンプを使用するのが好ましい。セルの入口孔と出口孔には、適切なねじ山を切って、ロウデッドボリュームチュービング（low dead volume tubing）と、高性能液体クロマトグラフィシステム用に開発したコネクターを使用できるようにするのが良い。
【００５１】
例えば、液体クロマトグラフィシステムの部分的構成要素を、受容体相の供給のために使用しても良い。また受容体相用の貯液槽として、溶離液タンク（E1) を使用しても良い。好ましくは、耐熱耐薬品性ガラスビン、例えばTORAXガラスビン、を使用するのが良い。受容体相は、液体クロマトグラフィシステムの高圧ポンプで浸透セルに供給される。高性能液体クロマトグラフィシステムで使われるポンプ（E2）は、その精密度の高さと、小さな流れ変動性のために、有利に使用することができる（図４）。
【００５２】
圧力の差は、膜拡散プロセスの障害となるので、セル内に圧力が加わるのを防止することは、特に重要である。このために、入口チュービングの断面積は、出口チュービングよりも小さく抑えられており、好ましくは、入口チューブの断面積は出口チューブの1/4 である。
【００５３】
受容体相は、通常生理用液のモデリングに適した溶液である。適切な受容体相とは、純水、生理食塩水、リン酸塩緩衝液、またはリンゲル液である。
【００５４】
受容体相は、使用前に、公知の方法、例えば超音波処理、又はガス抜きなどの何れかの方法で脱ガス処理される。アルゴンパージの方法によるのが好ましい。可能ならば、高性能液体クロマトグラフ装置のオンライン脱ガスモジュールを使用するのが良い。
【００５５】
この発明の発明者は、溶離液供給モジュールとして、シマズ（Shimadzu）LC-6A Liquid Chromatograph、又は、RMA ERC-3312 に付属する高圧ポンプアジレント（Agilent） (Hewlett Packard) HP G 1311A, 又は、受容体相供給用に適した脱ガスユニットアジレント（Agilent） (Hewlett Packard) G 1322 A を使用した。
【００５６】
検体のオンライン分析のための手段として、液体クロマトグラフィ用につくられたフローセル付きの検知器（Ｓ１）を使用することもできる（図４）。発明者は、Agilent (Hewlett Packard) G1315A photodiode array detector, または Shimadzu UV-Spectrophotometric Detector, またはBeckman Fluorescent Detector を、この目的のために好ましく使用した。検体の性質に従って、検出波長や励起／放射の波長 などの検出パラメータ を選択することが出来る。検体で特定の検出手段が無い場合は、質量感応性検出器（例えば、屈折率検出器または蒸発性光散乱検出器）を使用することが出来る。収集した検出信号は、コンピュータ化したデータ収集システムを使って評価する。
【００５７】
装置の制御は、個別に電子式又は電気機械式の制御方式を使うよりも、コンピュータ化された工程管理システムを随時に使って、限界パラメータの制御、データの収集および分析を含めてすべての制御を行うことが出来る。
【００５８】
また、多数基のセルをつくって、個々のセルでのサンプル採取／分析システムを一つの装置に集約すると、個々の試験が同時併行的に実施可能となる。
【００５９】
本発明の更なる特徴として、製薬用または美容用の調剤から、有効成分を放出させる生体外モデリング用の方法、特に吸収・浸透プロセスのモデリング方法が提供される。
【００６０】
この方法は、次のように実施される。受容体相を濾過、脱ガスする。セルを脱ガスした後、そこに膜を取り付ける。流速、温度、空気流、および光の強度安定状態になるのを待って（通常１ないし24時間）、試験用調剤を１〜３秒の間に均質化するように膜面に移す。調剤の量は、好ましくはリアルタイム状態で使う量、または試験時に使う調剤の１回分単位量である。
【００６１】
その後、受容体相の流れを元通りに戻し、オンライン分析の場合は、調剤の有効成分の濃度、あるいは調剤の特徴ある組成物の濃度を記録する。実際の濃度の計算は、受容体相量または経過時間の関数として外挿法で行う。これらのデータから、溶解速度を決定する。オフライン分析の場合は、少量のサンプルを何回か採取して、その夫々を然るべき公知の分析法により分析する。これらのデータから、採取サンプル中の検体の量を決定し、溶解速度を計算する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】非特許文献３で開示されているセルの構造を示す図。
【図２】本発明のセルの一例を示す写真。
【図３】図２のセルにクリーム状の試料を充填した状態を示す写真。
【図４】本発明による装置を使用するシステムのフローチャート。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
（実施例１）
トロキセルチン5％ゲルの膜浸透試験
試験用調剤は、有効成分として5％トロキセルチンを含んでいる。この試験では、塩化ナトリウム0.9重量％の溶液を、受容体相として用いる。受容体相の流速は、１mm／分である。この試験で使用した膜は、幅10cm、長さ10cmのセロファンである。セルの温度は、34度Cである。セルは、昼間の自然光に曝されている。1回目の試験（I）では、人工的な空気流を起こしていない。2回目の試験（II ）での、空気流の線速度は、２メートル／秒である。有効成分の濃度は、波長349 nmの紫外線分光分析法によってオンラインで測定する。
【００６４】
膜は装置とともに、60分間安定化させる。その後、分析精度で計量した試験用調剤300 mg を膜面上に移し、２〜３秒で均質化させる。その後、受容体相の流れを元通りに戻し、溶解した有効成分の濃度を記録する。
【００６５】
試験(I）と試験(2) で溶解させた有効成分の量を（膜面に移した有効成分の量に対しての相対的数値で）表１に示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
（実施例２）
セロファン膜および人体皮膚膜使用時のpiroxicam含有クリームの膜浸透比較試験
試験用調剤は有効成分として1％piroxicam を含有する。この試験において、受容体相は0.9重量％の塩化ナトリウム溶液を含有する。受容体相の流速は0.3 m/分である。
一回目の試験（I）ではセロファン膜を使用、二回目の試験（II）では人体皮膚膜を使用した。セルの温度を34度Cに保った。試験時の間、セルは天然太陽光に露光させた。人工的には空気流をつくらなかった。
【００６８】
膜を安定化のため 60分間静置した。
【００６９】
安定化期間の後、300ないし400 mg の試験用調剤を分析精度で検量し、２−３秒で膜面に均等に塗布する。受容体相の流れを元通りに戻して、排出液を各30分間採取する。Piroxicam と nipagin Mについて、各少量液の濃度を 高性能液体クロマトグラフィによって測定する。各検体の容積と濃度を測定し、各分液内のpiroxicam と Nipagin M の含有量を計算する。逆相システムにおいて、外的標準法を用い、高性能液体クロマトグラフィ分析を実施する。Nucleosil C18 (250 mm x 4,6 mm i.d.) コラムと緩衝液-アセトニトリル-メタノール(1000:660:340, v/v/v)溶離液を用いて分離を行う。分離は、40度Cの温度で行う。溶離液の流速は1.0 ml/分とする。紫外線フォトダイオードアレー検出器を用いて波長範囲250−450 nmの範囲内で検出を行う。試験（I）および 試験（II）において放出された piroxicam および Napagin M (methyl-4-hydroxybenzoate)の、夫々の膜塗付量に対する相対比率を表２に示す。
【００７０】
【表２】
【符号の説明】
【００７１】
１ 溶離液供給システム
２ 膜浸透システム
３ 試料分析システム（又は、検体濃度オンライン分析システム）
４ ブロック式又はマイクロプロセッサー制御システム
Ａ 空気温度制御システム
Ａ１ 可変速度換気扇
Ａ２ 気温センサー
Ａ３ 加熱ユニット（又は、加熱エレメント）
Ｃ セル温度制御システム
Ｃ１ 膜浸透セル、セルボディ
Ｃ２ 温度センサー
Ｃ３ 加熱ユニット（又は、対流式ラジエーター）
Ｃ４ 液体温度自動調節器
Ｅ１ 溶離液タンク
Ｅ２ 液体クロマトグラフィ用ポンプ
Ｌ 光強度制御システム
Ｌ１ 発光ダイオード
Ｌ２ 光センサー
Ｓ１ 紫外／可視波長域蛍光-分光分析器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
経皮投与を目的とする美容および製薬用製剤の試験用装置であって、受容体相の調整および供給システム、浸透セル、および好ましくは、開放式試料コンパートメント膜浸透セル、試料採取システムおよび任意的に分析システムと制御システムを含む装置。
【請求項２】
開放式試料コンパートメントを備える浸透セル、温度制御システム、および、膜浸透セルの開放式試料コンパートメントの表面において、１つ又はそれ以上の数の環境要因を調整制御するのに適した手段を併せ持つ浸透セルを包含する膜浸透システム。
【請求項３】
膜浸透セルの開放式試料コンパートメントにおいて、光の強度と波長、空気の流速、気温および湿度など、環境に関わる調整可能かつ制御可能な変数が選択されることを特徴とする請求項２に記載の膜浸透システム。
【請求項４】
受容体相の供給と排出のための入口と出口、セル体、膜、および選択的に温度制御可能なジャケットと断熱材を有する開放式試料コンパートメントを備える浸透セル。
【請求項５】
容積と膜側表面の横断面積が、高い精度で定められていることを特徴とする請求項４に記載のセル。
【請求項６】
経皮投与を目的とする美容用および治療薬用製剤の試験方法であって、請求項３に従って、浸透セルの表面に装着した膜に試料を移し、該試料を予め選択管理された環境要因に曝し、同時に一定温度一定流速の受容体相をセル体経由で供給しながら、排出液中に含まれる試験試料の薬学的有効成分又は特徴ある組成物の濃度を測定する方法。
【請求項７】
１項目又はそれ以上の項目の環境要因を、温度、光の強度と波長、空気の流速、気温、湿度の中から選び、膜浸透セル開放表面において、さらには任意に、膜浸透セルの付近にて制御することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
受容体相として、水、塩水、リンゲル液、リン酸緩衝生理食塩水、界面活性剤水溶液、または、たんぱく質、好ましくは、人体血清アルブミンを使用する請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
試験を恒温状態で行う、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
開放式試料コンパートメント膜浸透セルを使用する、請求項１又は２に記載の装置。
【請求項１】
経皮投与を目的とする美容および製薬用製剤の試験用装置であって、受容体相の調整および供給システム、浸透セル、および好ましくは、開放式試料コンパートメント膜浸透セル、試料採取システムおよび任意的に分析システムと制御システムを含む装置。
【請求項２】
開放式試料コンパートメントを備える浸透セル、温度制御システム、および、膜浸透セルの開放式試料コンパートメントの表面において、１つ又はそれ以上の数の環境要因を調整制御するのに適した手段を併せ持つ浸透セルを包含する膜浸透システム。
【請求項３】
膜浸透セルの開放式試料コンパートメントにおいて、光の強度と波長、空気の流速、気温および湿度など、環境に関わる調整可能かつ制御可能な変数が選択されることを特徴とする請求項２に記載の膜浸透システム。
【請求項４】
受容体相の供給と排出のための入口と出口、セル体、膜、および選択的に温度制御可能なジャケットと断熱材を有する開放式試料コンパートメントを備える浸透セル。
【請求項５】
容積と膜側表面の横断面積が、高い精度で定められていることを特徴とする請求項４に記載のセル。
【請求項６】
経皮投与を目的とする美容用および治療薬用製剤の試験方法であって、請求項３に従って、浸透セルの表面に装着した膜に試料を移し、該試料を予め選択管理された環境要因に曝し、同時に一定温度一定流速の受容体相をセル体経由で供給しながら、排出液中に含まれる試験試料の薬学的有効成分又は特徴ある組成物の濃度を測定する方法。
【請求項７】
１項目又はそれ以上の項目の環境要因を、温度、光の強度と波長、空気の流速、気温、湿度の中から選び、膜浸透セル開放表面において、さらには任意に、膜浸透セルの付近にて制御することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
受容体相として、水、塩水、リンゲル液、リン酸緩衝生理食塩水、界面活性剤水溶液、または、たんぱく質、好ましくは、人体血清アルブミンを使用する請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
試験を恒温状態で行う、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
開放式試料コンパートメント膜浸透セルを使用する、請求項１又は２に記載の装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１２−５１７５８９（Ｐ２０１２−５１７５８９Ａ）
【公表日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４８７９０（Ｐ２０１１−５４８７９０）
【出願日】平成２２年２月８日（２０１０．２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＨＵ２０１０／００００１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８９６１９
【国際公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【出願人】（５９１０１００７７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月８日（２０１０．２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＨＵ２０１０／００００１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８９６１９
【国際公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【出願人】（５９１０１００７７）
【Ｆターム（参考）】
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