結晶性レボホリン酸及びその調製方法
【課題】６Ｓジアステレオマー型としての安定な結晶性(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸（一般にレボホリン酸といわれる）、及びその調製方法の提供。
【解決手段】可溶性レボホリン酸塩の、ｐＨ値が４．５より高い、第一の水溶液又はヒドロアルコール溶液を調製する工程、第一の溶液と第二の酸とを水又はヒドロアルコール混合物の前記バッチに加えることによって第二の溶液を形成する工程、このようにして形成された第二の溶液を、レボホリン酸の結晶化が起こっている間、該溶液を温度３０〜６０℃に保ち、ｐＨを監視し且つｐＨを安定に保つために前記第二の酸を継続して加えながら、前記第二の酸の更なる添加が必要なくてもｐＨ値が安定になり、レボホリン酸の結晶化の終わりを示すまで、攪拌する工程と；・このようにして形成された結晶性レボホリン酸を回収する工程とを含む方法。
【解決手段】可溶性レボホリン酸塩の、ｐＨ値が４．５より高い、第一の水溶液又はヒドロアルコール溶液を調製する工程、第一の溶液と第二の酸とを水又はヒドロアルコール混合物の前記バッチに加えることによって第二の溶液を形成する工程、このようにして形成された第二の溶液を、レボホリン酸の結晶化が起こっている間、該溶液を温度３０〜６０℃に保ち、ｐＨを監視し且つｐＨを安定に保つために前記第二の酸を継続して加えながら、前記第二の酸の更なる添加が必要なくてもｐＨ値が安定になり、レボホリン酸の結晶化の終わりを示すまで、攪拌する工程と；・このようにして形成された結晶性レボホリン酸を回収する工程とを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定な結晶形での化合物(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸、及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ホリン酸は、薬物メトトレキサートを含む治療の副作用に対抗するため、癌化学療法において、又は化学療法薬剤５−フルオロウラシルとの相乗的な組み合わせにおいて使用される。ホリン酸は、一般に、そのカルシウム塩又はナトリウム塩の形で投与される。
【０００３】
ホリン酸は、以下の構造式においてキラルとして特定される炭素原子でのＲ又はＳ配置に応じたジアステレオマー形態で存在する：
【化１】
【０００４】
グルタミン酸部分のキラル炭素原子は、天然アミノ酸の構造を保つ。他のキラル中心は、上記式中において６と特定された炭素原子である；最も生物学的な鏡像異性体分子にはあるように、この炭素での配置がＳである形態のみ、即ち化合物(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸が、生物学的に活性がある。この酸の形態は、一般に、当該分野においてレボホリン酸と呼ばれ、その塩はレボホリン酸塩と呼ばれており、該用語は、以下に続く説明及び請求の範囲中で採用される。
【０００５】
レボホリン酸のジアステレオマーとして豊富な又は純粋な形態は、一般的に、結晶化を介し、薬学的に許容できる塩の形態として直接生成される。
【０００６】
かかる方法の例は、米国特許第５，１３４，２３５号に与えられており、ラセミ混合物と比べて豊富な形態としてレボホリン酸のアルカリ土類塩の生成が開示されている。
【０００７】
特許出願ＵＳ２００８／０１５３８４９Ａ１は、結晶形態でのデクストロホリン酸とレボホリン酸のラセミ混合物、又は非晶質形態での純粋なレボホリン酸を調製することが可能な方法を開示する。
【０００８】
現在のところ、結晶形態での本質的に純粋なレボホリン酸の調製を提供する方法は、まだ知られていない；ジアステレオマーとして純粋な形態でのこの化合物の生成は、純粋な６Ｓ体での該酸の薬学的な塩を生成するのに便利な方法を提供し、また、先の塩の調製を必要とせず新規な医薬製剤に直接使用することもあり得るため、望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，１３４，２３５号
【特許文献２】特許出願ＵＳ２００８／０１５３８４９Ａ１
【発明の概要】
【００１０】
そこで、本発明の目的は、ジアステレオマーとして純粋で安定な結晶形態の化合物(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロホリン酸と、その調製方法とを提供することにある。
【００１１】
それら目的は、本発明によって達成され、該発明は、一の態様において、本質的に純粋な６Ｓ体での結晶性ホリン酸の調製方法であって、
・可溶性レボホリン酸塩の、ｐＨ値が４．５より高い、第一の水溶液又はヒドロアルコール溶液を調製する工程と；
・温度３０〜６０℃にて予熱した、水の又はアルコールを６０％ｖ／ｖ以下含有するヒドロアルコール混合物のバッチを提供する工程と；
・前記第一の溶液と第二の酸とを水又はヒドロアルコール混合物の前記バッチに加えることによって第二の溶液を形成する工程であって、該第二の溶液中のレボホリン酸塩濃度が４％ｗ／ｖを決して超えず、該第二の溶液のｐＨ値が常に３．０〜４．５の範囲内にあり、該第二の溶液の温度が常に３０〜６０℃の範囲内にあるように操作する工程と；
・前記第一の溶液の水又はヒドロアルコール混合物の前記バッチへの添加が完了し、このようにして形成された第二の溶液を、レボホリン酸の沈殿が起こっている間、該溶液を温度３０〜６０℃に保ち、ｐＨを監視し且つｐＨを安定に保つために前記第二の酸を継続して加えながら、前記第二の酸の更なる添加が必要なくてもｐＨ値が安定になり、レボホリン酸の結晶化の終わりを示すまで、攪拌する工程と；
・このようにして形成された結晶性レボホリン酸を回収する工程と
を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に従って調製されたレボホリン酸のＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】本発明に従って調製されたレボホリン酸の粉末に対して得られたＸＲＤパターンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
「本質的に純粋な」との用語に関しては、本テキスト及び請求の範囲において使用されるように、それは、少なくとも９８％のジアステレオマー純度を有するレボホリン酸を意味する。ｗ／ｖパーセンテージとして報告される濃度値は、溶液１００ｃｃ当たりの溶質のグラム数を示す。
【００１４】
本発明の方法の第一の工程は、可溶性レボホリン酸塩の第一の水溶液又はヒドロアルコール溶液を調製することと、そのｐＨ値を４．５より高い値に制御することにある。ヒドロアルコール溶液を使用する場合、好ましいアルコールは、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール及びそれらの混合物である。
【００１５】
上記第一の溶液は、水中又は水−アルコール混合物中で上記酸の可溶性塩を直接可溶性にすることによって得ることができる。最も可溶性の塩は、アルカリ金属塩、好ましくはナトリウム塩である；レボホリン酸のアルカリ金属塩は、室温にて、約３０％ｗ／ｖの濃度に至るまで、水中に溶解できる。また、上記第一の溶液は、アルカリ土類金属塩、典型的にはカルシウム塩から出発して調製できる；それら塩は水又はヒドロアルコール混合物中で溶解度が低下するため、この場合、約８０℃以下の比較的高い温度にて、保護雰囲気下（例えば窒素）、作業することが好ましい。最後に、アルカリ土類金属塩の水性又はヒドロアルコール懸濁液を、該塩がほとんど溶解できない温度（例えば室温）にて、形成することが可能である；次いで、その塩は、例えば炭酸ナトリウムを加えることによる、カチオンの交換によって可溶性にされる；これらの条件において、アルカリ土類金属の炭酸塩が形成され、沈殿し、例えば遠心分離及び／又はろ過によって分離される；その結果物が、レボホリン酸ナトリウム溶液である。
【００１６】
別に、少なくとも３０℃で且つ６０℃以下の温度で予熱された水の又はヒドロアルコール混合物のバッチがすでに作られている；好ましくは、バッチ温度が約４５℃である。ヒドロアルコール混合物を使用する場合、これは、アルコール（又は複数のアルコール）に応じて、６０％ｖ／ｖ以下のアルコールを含有することができ、好ましくは、アルコールの含有量は、５〜１０％である。この場合も同様に、ヒドロアルコール混合物の調製には、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール又はそれらの混合物が好ましい。
【００１７】
次いで、上記第一の溶液を水の又はヒドロアルコール混合物のバッチにゆっくり加え、このようにして第二の溶液を形成する。この工程において、レボホリン酸は、形成された溶液から晶出する。それ故に、上記第二の溶液は、母液によって構成され、該母液から、生成物を結晶化させる。この母液の動的特性は、上記方法の制御にとって興味深い。前述のバッチに第一の溶液を加えることは、第二の溶液中のレボホリン酸濃度が決して４％ｗ／ｖの濃度を超えず、理想的には、レボホリン酸が該溶液から晶出する間、１〜２．５％ｗ／ｖにとどまるように行われる必要がある。この操作は、常に３．０〜４．５の範囲内に保たなければならない第二の溶液のｐＨ制御下で、行われる。この段階中、レボホリン酸塩アニオンは、第二の溶液に存在するＨ＋イオンと再結合し、その提案されたｐＨ範囲において水中又はヒドロアルコール混合物中にほとんど溶解しない結晶性レボホリン酸を形成する。
【００１８】
Ｈ＋イオンとの再結合は、ｐＨの増加を引き起こすが、それは、ｐＨを示した範囲に維持するため、適切な第二の酸、例えば希塩酸を加えることによって補正される必要がある。上記方法のこの工程を制御する他の方法は、第一の溶液を加えている間、第二の溶液を観察することである。実際、第一の溶液の速すぎる添加のせいでレボホリン酸の濃度が４％ｗ／ｖの上限を超えた場合、第二の溶液は濁り、非晶質形態のレボホリン酸が沈殿する。
【００１９】
第二の溶液が常に澄みきったままであるように操作することは、前述の４％の限界より下のままである条件を満たすことを確実にする。
【００２０】
この工程は、上記第一の溶液と、ｐＨ値を示した範囲に保つのに必要である第二の酸の両方を、水又はヒドロアルコールバッチに、ゆっくりと連続して又はその後少しずつ加えて行うことができる。使用できる酸は、非酸化性の酸、及びレボホリン酸又はその塩と反応しない酸である；Ｈ２ＳＯ４、Ｈ３ＰＯ４等の鉱酸が好ましく、特にはＨＣｌが好ましい。
【００２１】
水又はヒドロアルコール混合物のバッチに第一の溶液を少しずつ加える場合、それぞれの添加の後で、レボホリン酸塩アニオンを本質的に完全に結晶性の酸に転換したとき、ｐＨの増加が停止し、次に、ある量の第一の溶液を加えることを行ってもよい。
【００２２】
また、この工程は、温度制御下で行わなければならず、３０〜６０℃の範囲にするか又はその範囲で維持する必要がある。
【００２３】
レボホリン酸塩濃度、ｐＨ及びＴの制御は、例えば米国特許第６，４４１，１６８号において考察されるように、レボホリン酸が不安定な化合物であり、ｐＨが３．０より低くなったり又はｐＨを下げている間に温度が６０℃又はもっと高い値に達したりすると容易に副生成物に転換されるため、必要である。
【００２４】
水又はヒドロアルコールバッチに第一の溶液を連続して又はその後少しずつ完全に加えたとき、このようにして得られる第二の溶液を、ｐＨの動向を監視し且つそれを第二の酸を加えることにより制御しながら、攪拌下で３０〜６０℃の範囲の温度にて維持する；ｐＨ値が第二の酸の更なる添加を必要とせずに安定したとき、結晶性レボホリン酸の形成は、完結している。
【００２５】
最後に、その結晶性固体を、遠心分離及び／又はろ過等の既知の手段を用いて回収することができ、その後に、例えば減圧下での微量の溶媒の除去による、生成物の乾燥が続く。
【００２６】
安定な結晶形としての化合物(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸は、本発明の更なる態様である。この安定な結晶形の化合物は、先行技術において報告されていない。該化合物の結晶形は、ＸＲＤ図において、以下に示す２θ角の値でのピークによって特徴付けられる（２θ値は、±０．２°の近似で与えられる）：
１４．４
１７．３
１７．７
１８．３
１９．７
２０．０
２２．１
２３．３
２７．３
【００２７】
本発明は、以下に示す例によって更に説明される。
【実施例】
【００２８】
例１
結晶性レボホリン酸の製造
レボホリン酸カルシウム五水和物１００ｋｇ（１６６ｍｏｌ）を精製水５００リットル（Ｌ）中に懸濁させる。その懸濁液を４０℃に加熱し、次いで、炭酸ナトリウム２５ｋｇ（２３６ｍｏｌ）を加えることにより脱灰する；酢酸を加え、そのシステムのｐＨを約８．０の値に維持する。形成された炭酸カルシウムを遠心分離によって除去し、得られたレボホリン酸ナトリウム溶液を精密ろ過によって透明にする。そのろ過された溶液を水で８５０Ｌの量に希釈し、それにイソプロパノール５１Ｌを加え、このようにして第一の溶液が形成される。次いで、４５℃に予熱した水３５０Ｌ及びイソプロパノール３５Ｌより形成されるヒドロアルコールバッチへ、攪拌下で１時間の間に、上記第一の溶液を徐々に加える。この添加の間、ｐＨを監視し、ＨＣｌの２５％ｂ．ｗ．溶液５０Ｌを徐々に加えることで３．５〜４．０の範囲に保つ；温度は、その順番において、ゆっくりと３５℃まで低下する。添加の段階（即ち、ヒドロアルコールバッチに第一の溶液を加える操作）が終わり、得られた溶液を、先に使用したのと同じＨＣｌ溶液を更に加えることでｐＨを制御しながら、４．０の安定な値に達するまで、攪拌下で３５℃にて保つ；合計５０リットルのＨＣｌ溶液が二段階で加えられる。レボホリン酸は、添加の段階とその後の攪拌期間の間に、得られた溶液から晶出する。次いで、結晶化したレボホリン酸を遠心分離により単離し、水を用いて洗浄し、減圧下で乾燥させる。８０ｋｇの生成物が得られる。
【００２９】
このようにして得られた生成物の第一試験片は、４００ＭＨｚの１Ｈ−Ｄ２Ｏ ＮＭＲ解析を受ける；該生成物バッチの第二試験片は、ＸＲＤ解析を受ける。得られたスペクトルをそれぞれ図１及び図２に報告し、ＮＭＲスペクトルにおけるシグナルの同定を以下の表１に報告する。
【００３０】
【表１】
【００３１】
例２
例１において得られた生成物の２つの試験片は、それぞれ加速安定性試験及び長期安定性試験を受ける；その試験は、ＩＣＨ条件に従って行われる。
加速：４０±２℃，相対湿度７５±５％
長期：２５±２℃，相対湿度６０±５％
【００３２】
安定性調査試験に用いた解析法は、欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）のレボホリン酸カルシウムモノグラフに記載されている。加速試験の結果を表２に報告し、長期試験の結果を表３に報告する。表２及び３の両方において、「ｎ．ｔ．」は、試験していないこと（ｎｏｔ ｔｅｓｔｅｄ）を表す；１）は、面積％が２８０ｎｍでのホリン酸吸収に基づいて計算されたことを示す；２）は、レボホリン酸のアッセイが無水及び無溶媒を基準に計算されたことを示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
結果の考察
図１に報告されたＮＭＲスペクトル及び表１に与えられた図１のシグナルの帰属は、例１の手順に従って得られた生成物がレボホリン酸であることを確認する。
【００３６】
図２に報告されたＸＲＤ図は、上記生成物が完全な結晶質であることを確認する。
【００３７】
表２及び３中の「レボホリン酸のアッセイ」列の記載は、得られた生成物が実際に望ましいものであることを確認し、一方、同一の表中における一部の「詳述」の値は、生成物が本質的に純粋なものとして得られ、本質的に純粋な６Ｓジアステレオマー型である（微量のデクストロホリン酸が存在するだけである）ことを確認する。
【００３８】
最後に、表２及び３の安定性データは、驚くべきことに、本発明に従って得られた純粋な結晶性レボホリン酸が安定であり、最大３年までの保存寿命の間、変わらずに耐え得ることを示す；この点において、本発明の生成物は、既知の技術のレボホリン酸カルシウムと比べて又は米国特許第５，１３４，２３５号に記載されるように得られた非晶質レボホリン酸と比べて、良好な特性を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定な結晶形での化合物(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸、及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ホリン酸は、薬物メトトレキサートを含む治療の副作用に対抗するため、癌化学療法において、又は化学療法薬剤５−フルオロウラシルとの相乗的な組み合わせにおいて使用される。ホリン酸は、一般に、そのカルシウム塩又はナトリウム塩の形で投与される。
【０００３】
ホリン酸は、以下の構造式においてキラルとして特定される炭素原子でのＲ又はＳ配置に応じたジアステレオマー形態で存在する：
【化１】
【０００４】
グルタミン酸部分のキラル炭素原子は、天然アミノ酸の構造を保つ。他のキラル中心は、上記式中において６と特定された炭素原子である；最も生物学的な鏡像異性体分子にはあるように、この炭素での配置がＳである形態のみ、即ち化合物(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸が、生物学的に活性がある。この酸の形態は、一般に、当該分野においてレボホリン酸と呼ばれ、その塩はレボホリン酸塩と呼ばれており、該用語は、以下に続く説明及び請求の範囲中で採用される。
【０００５】
レボホリン酸のジアステレオマーとして豊富な又は純粋な形態は、一般的に、結晶化を介し、薬学的に許容できる塩の形態として直接生成される。
【０００６】
かかる方法の例は、米国特許第５，１３４，２３５号に与えられており、ラセミ混合物と比べて豊富な形態としてレボホリン酸のアルカリ土類塩の生成が開示されている。
【０００７】
特許出願ＵＳ２００８／０１５３８４９Ａ１は、結晶形態でのデクストロホリン酸とレボホリン酸のラセミ混合物、又は非晶質形態での純粋なレボホリン酸を調製することが可能な方法を開示する。
【０００８】
現在のところ、結晶形態での本質的に純粋なレボホリン酸の調製を提供する方法は、まだ知られていない；ジアステレオマーとして純粋な形態でのこの化合物の生成は、純粋な６Ｓ体での該酸の薬学的な塩を生成するのに便利な方法を提供し、また、先の塩の調製を必要とせず新規な医薬製剤に直接使用することもあり得るため、望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，１３４，２３５号
【特許文献２】特許出願ＵＳ２００８／０１５３８４９Ａ１
【発明の概要】
【００１０】
そこで、本発明の目的は、ジアステレオマーとして純粋で安定な結晶形態の化合物(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロホリン酸と、その調製方法とを提供することにある。
【００１１】
それら目的は、本発明によって達成され、該発明は、一の態様において、本質的に純粋な６Ｓ体での結晶性ホリン酸の調製方法であって、
・可溶性レボホリン酸塩の、ｐＨ値が４．５より高い、第一の水溶液又はヒドロアルコール溶液を調製する工程と；
・温度３０〜６０℃にて予熱した、水の又はアルコールを６０％ｖ／ｖ以下含有するヒドロアルコール混合物のバッチを提供する工程と；
・前記第一の溶液と第二の酸とを水又はヒドロアルコール混合物の前記バッチに加えることによって第二の溶液を形成する工程であって、該第二の溶液中のレボホリン酸塩濃度が４％ｗ／ｖを決して超えず、該第二の溶液のｐＨ値が常に３．０〜４．５の範囲内にあり、該第二の溶液の温度が常に３０〜６０℃の範囲内にあるように操作する工程と；
・前記第一の溶液の水又はヒドロアルコール混合物の前記バッチへの添加が完了し、このようにして形成された第二の溶液を、レボホリン酸の沈殿が起こっている間、該溶液を温度３０〜６０℃に保ち、ｐＨを監視し且つｐＨを安定に保つために前記第二の酸を継続して加えながら、前記第二の酸の更なる添加が必要なくてもｐＨ値が安定になり、レボホリン酸の結晶化の終わりを示すまで、攪拌する工程と；
・このようにして形成された結晶性レボホリン酸を回収する工程と
を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に従って調製されたレボホリン酸のＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】本発明に従って調製されたレボホリン酸の粉末に対して得られたＸＲＤパターンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
「本質的に純粋な」との用語に関しては、本テキスト及び請求の範囲において使用されるように、それは、少なくとも９８％のジアステレオマー純度を有するレボホリン酸を意味する。ｗ／ｖパーセンテージとして報告される濃度値は、溶液１００ｃｃ当たりの溶質のグラム数を示す。
【００１４】
本発明の方法の第一の工程は、可溶性レボホリン酸塩の第一の水溶液又はヒドロアルコール溶液を調製することと、そのｐＨ値を４．５より高い値に制御することにある。ヒドロアルコール溶液を使用する場合、好ましいアルコールは、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール及びそれらの混合物である。
【００１５】
上記第一の溶液は、水中又は水−アルコール混合物中で上記酸の可溶性塩を直接可溶性にすることによって得ることができる。最も可溶性の塩は、アルカリ金属塩、好ましくはナトリウム塩である；レボホリン酸のアルカリ金属塩は、室温にて、約３０％ｗ／ｖの濃度に至るまで、水中に溶解できる。また、上記第一の溶液は、アルカリ土類金属塩、典型的にはカルシウム塩から出発して調製できる；それら塩は水又はヒドロアルコール混合物中で溶解度が低下するため、この場合、約８０℃以下の比較的高い温度にて、保護雰囲気下（例えば窒素）、作業することが好ましい。最後に、アルカリ土類金属塩の水性又はヒドロアルコール懸濁液を、該塩がほとんど溶解できない温度（例えば室温）にて、形成することが可能である；次いで、その塩は、例えば炭酸ナトリウムを加えることによる、カチオンの交換によって可溶性にされる；これらの条件において、アルカリ土類金属の炭酸塩が形成され、沈殿し、例えば遠心分離及び／又はろ過によって分離される；その結果物が、レボホリン酸ナトリウム溶液である。
【００１６】
別に、少なくとも３０℃で且つ６０℃以下の温度で予熱された水の又はヒドロアルコール混合物のバッチがすでに作られている；好ましくは、バッチ温度が約４５℃である。ヒドロアルコール混合物を使用する場合、これは、アルコール（又は複数のアルコール）に応じて、６０％ｖ／ｖ以下のアルコールを含有することができ、好ましくは、アルコールの含有量は、５〜１０％である。この場合も同様に、ヒドロアルコール混合物の調製には、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール又はそれらの混合物が好ましい。
【００１７】
次いで、上記第一の溶液を水の又はヒドロアルコール混合物のバッチにゆっくり加え、このようにして第二の溶液を形成する。この工程において、レボホリン酸は、形成された溶液から晶出する。それ故に、上記第二の溶液は、母液によって構成され、該母液から、生成物を結晶化させる。この母液の動的特性は、上記方法の制御にとって興味深い。前述のバッチに第一の溶液を加えることは、第二の溶液中のレボホリン酸濃度が決して４％ｗ／ｖの濃度を超えず、理想的には、レボホリン酸が該溶液から晶出する間、１〜２．５％ｗ／ｖにとどまるように行われる必要がある。この操作は、常に３．０〜４．５の範囲内に保たなければならない第二の溶液のｐＨ制御下で、行われる。この段階中、レボホリン酸塩アニオンは、第二の溶液に存在するＨ＋イオンと再結合し、その提案されたｐＨ範囲において水中又はヒドロアルコール混合物中にほとんど溶解しない結晶性レボホリン酸を形成する。
【００１８】
Ｈ＋イオンとの再結合は、ｐＨの増加を引き起こすが、それは、ｐＨを示した範囲に維持するため、適切な第二の酸、例えば希塩酸を加えることによって補正される必要がある。上記方法のこの工程を制御する他の方法は、第一の溶液を加えている間、第二の溶液を観察することである。実際、第一の溶液の速すぎる添加のせいでレボホリン酸の濃度が４％ｗ／ｖの上限を超えた場合、第二の溶液は濁り、非晶質形態のレボホリン酸が沈殿する。
【００１９】
第二の溶液が常に澄みきったままであるように操作することは、前述の４％の限界より下のままである条件を満たすことを確実にする。
【００２０】
この工程は、上記第一の溶液と、ｐＨ値を示した範囲に保つのに必要である第二の酸の両方を、水又はヒドロアルコールバッチに、ゆっくりと連続して又はその後少しずつ加えて行うことができる。使用できる酸は、非酸化性の酸、及びレボホリン酸又はその塩と反応しない酸である；Ｈ２ＳＯ４、Ｈ３ＰＯ４等の鉱酸が好ましく、特にはＨＣｌが好ましい。
【００２１】
水又はヒドロアルコール混合物のバッチに第一の溶液を少しずつ加える場合、それぞれの添加の後で、レボホリン酸塩アニオンを本質的に完全に結晶性の酸に転換したとき、ｐＨの増加が停止し、次に、ある量の第一の溶液を加えることを行ってもよい。
【００２２】
また、この工程は、温度制御下で行わなければならず、３０〜６０℃の範囲にするか又はその範囲で維持する必要がある。
【００２３】
レボホリン酸塩濃度、ｐＨ及びＴの制御は、例えば米国特許第６，４４１，１６８号において考察されるように、レボホリン酸が不安定な化合物であり、ｐＨが３．０より低くなったり又はｐＨを下げている間に温度が６０℃又はもっと高い値に達したりすると容易に副生成物に転換されるため、必要である。
【００２４】
水又はヒドロアルコールバッチに第一の溶液を連続して又はその後少しずつ完全に加えたとき、このようにして得られる第二の溶液を、ｐＨの動向を監視し且つそれを第二の酸を加えることにより制御しながら、攪拌下で３０〜６０℃の範囲の温度にて維持する；ｐＨ値が第二の酸の更なる添加を必要とせずに安定したとき、結晶性レボホリン酸の形成は、完結している。
【００２５】
最後に、その結晶性固体を、遠心分離及び／又はろ過等の既知の手段を用いて回収することができ、その後に、例えば減圧下での微量の溶媒の除去による、生成物の乾燥が続く。
【００２６】
安定な結晶形としての化合物(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸は、本発明の更なる態様である。この安定な結晶形の化合物は、先行技術において報告されていない。該化合物の結晶形は、ＸＲＤ図において、以下に示す２θ角の値でのピークによって特徴付けられる（２θ値は、±０．２°の近似で与えられる）：
１４．４
１７．３
１７．７
１８．３
１９．７
２０．０
２２．１
２３．３
２７．３
【００２７】
本発明は、以下に示す例によって更に説明される。
【実施例】
【００２８】
例１
結晶性レボホリン酸の製造
レボホリン酸カルシウム五水和物１００ｋｇ（１６６ｍｏｌ）を精製水５００リットル（Ｌ）中に懸濁させる。その懸濁液を４０℃に加熱し、次いで、炭酸ナトリウム２５ｋｇ（２３６ｍｏｌ）を加えることにより脱灰する；酢酸を加え、そのシステムのｐＨを約８．０の値に維持する。形成された炭酸カルシウムを遠心分離によって除去し、得られたレボホリン酸ナトリウム溶液を精密ろ過によって透明にする。そのろ過された溶液を水で８５０Ｌの量に希釈し、それにイソプロパノール５１Ｌを加え、このようにして第一の溶液が形成される。次いで、４５℃に予熱した水３５０Ｌ及びイソプロパノール３５Ｌより形成されるヒドロアルコールバッチへ、攪拌下で１時間の間に、上記第一の溶液を徐々に加える。この添加の間、ｐＨを監視し、ＨＣｌの２５％ｂ．ｗ．溶液５０Ｌを徐々に加えることで３．５〜４．０の範囲に保つ；温度は、その順番において、ゆっくりと３５℃まで低下する。添加の段階（即ち、ヒドロアルコールバッチに第一の溶液を加える操作）が終わり、得られた溶液を、先に使用したのと同じＨＣｌ溶液を更に加えることでｐＨを制御しながら、４．０の安定な値に達するまで、攪拌下で３５℃にて保つ；合計５０リットルのＨＣｌ溶液が二段階で加えられる。レボホリン酸は、添加の段階とその後の攪拌期間の間に、得られた溶液から晶出する。次いで、結晶化したレボホリン酸を遠心分離により単離し、水を用いて洗浄し、減圧下で乾燥させる。８０ｋｇの生成物が得られる。
【００２９】
このようにして得られた生成物の第一試験片は、４００ＭＨｚの１Ｈ−Ｄ２Ｏ ＮＭＲ解析を受ける；該生成物バッチの第二試験片は、ＸＲＤ解析を受ける。得られたスペクトルをそれぞれ図１及び図２に報告し、ＮＭＲスペクトルにおけるシグナルの同定を以下の表１に報告する。
【００３０】
【表１】
【００３１】
例２
例１において得られた生成物の２つの試験片は、それぞれ加速安定性試験及び長期安定性試験を受ける；その試験は、ＩＣＨ条件に従って行われる。
加速：４０±２℃，相対湿度７５±５％
長期：２５±２℃，相対湿度６０±５％
【００３２】
安定性調査試験に用いた解析法は、欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）のレボホリン酸カルシウムモノグラフに記載されている。加速試験の結果を表２に報告し、長期試験の結果を表３に報告する。表２及び３の両方において、「ｎ．ｔ．」は、試験していないこと（ｎｏｔ ｔｅｓｔｅｄ）を表す；１）は、面積％が２８０ｎｍでのホリン酸吸収に基づいて計算されたことを示す；２）は、レボホリン酸のアッセイが無水及び無溶媒を基準に計算されたことを示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
結果の考察
図１に報告されたＮＭＲスペクトル及び表１に与えられた図１のシグナルの帰属は、例１の手順に従って得られた生成物がレボホリン酸であることを確認する。
【００３６】
図２に報告されたＸＲＤ図は、上記生成物が完全な結晶質であることを確認する。
【００３７】
表２及び３中の「レボホリン酸のアッセイ」列の記載は、得られた生成物が実際に望ましいものであることを確認し、一方、同一の表中における一部の「詳述」の値は、生成物が本質的に純粋なものとして得られ、本質的に純粋な６Ｓジアステレオマー型である（微量のデクストロホリン酸が存在するだけである）ことを確認する。
【００３８】
最後に、表２及び３の安定性データは、驚くべきことに、本発明に従って得られた純粋な結晶性レボホリン酸が安定であり、最大３年までの保存寿命の間、変わらずに耐え得ることを示す；この点において、本発明の生成物は、既知の技術のレボホリン酸カルシウムと比べて又は米国特許第５，１３４，２３５号に記載されるように得られた非晶質レボホリン酸と比べて、良好な特性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定な結晶性の(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸を、本質的にジアステレオマーとして純粋な６Ｓ体で、調製する方法であって、
・可溶性レボホリン酸塩の、ｐＨ値が４．５より高い、第一の水溶液又はヒドロアルコール溶液を調製する工程と；
・温度３０〜６０℃にて予熱した、水の又はアルコールを６０％ｖ／ｖ以下含有するヒドロアルコール混合物のバッチを提供する工程と；
・前記第一の溶液と第二の酸とを水又はヒドロアルコール混合物の前記バッチに加えることによって第二の溶液を形成する工程であって、該第二の溶液中のレボホリン酸塩濃度が４％ｗ／ｖを決して超えず、該第二の溶液のｐＨ値が常に３．０〜４．５の範囲内にあり、該第二の溶液の温度が常に３０〜６０℃の範囲内にあるように操作する工程と；
・前記第一の溶液の水又はヒドロアルコール混合物の前記バッチへの添加が完了し、このようにして形成された第二の溶液を、レボホリン酸の結晶化が起こっている間、該溶液を温度３０〜６０℃に保ち、ｐＨを監視し且つｐＨを安定に保つために前記第二の酸を継続して加えながら、前記第二の酸の更なる添加が必要なくてもｐＨ値が安定になり、レボホリン酸の結晶化の終わりを示すまで、攪拌する工程と；
・このようにして形成された結晶性レボホリン酸を回収する工程と
を含む方法。
【請求項２】
ヒドロアルコール溶液又はヒドロアルコール混合物を用いる場合、使用されるアルコールは、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール又はそれらの混合物の中から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒドロアルコール混合物がアルコールを５〜１０％ｖ／ｖ含有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一の溶液が、水中又はヒドロアルコール混合物中に濃度が３０％ｗ／ｖ以下のアルカリ金属レボホリン酸塩を溶解することによって調製される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記第一の溶液が、８０℃以下に加熱することにより可溶性にした、アルカリ土類金属レボホリン酸塩を用いて調製される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記第一の溶液が、アルカリ土類金属レボホリン酸塩を、アルカリ金属カチオンとアニオンとにより形成された塩が溶解されている水性溶媒又はヒドロアルコール溶媒中に、前記アルカリ土類金属との不溶性塩を生じさせつつ、懸濁させ；前記不溶性塩を沈殿させ；このようにして得られたアルカリ金属レボホリン酸塩の溶液から沈殿した塩を分離除去することによる、陽イオン交換を介して調製される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記第二の溶液は、第二の溶液中のレボホリン酸塩濃度が常に１〜２．５％ｗ／ｖ含まれるように操作して形成される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記第二の酸は、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、Ｈ３ＰＯ４の中から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
レボホリン酸の回収が、遠心分離及び／又はろ過によって行われる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
減圧下で微量の溶媒を除去することによって、生成物を乾燥させることを更に含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
図２に示されるＸＲＤ図を有することを特徴とする、本質的にジアステレオマーとして純粋な６Ｓ体での、安定な結晶性の(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸。
【請求項１２】
対応するＸ線粉末回折図が、以下に示す特徴的な２θ角の値（±０．２°）：
１４．４
１７．３
１７．７
１８．３
１９．７
２０．０
２２．１
２３．３
２７．３
を有することを特徴とする、本質的にジアステレオマーとして純粋な６Ｓ体での、安定な結晶性の(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の本質的にジアステレオマーとして純粋な６Ｓ体での安定な結晶性の(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸を含む医薬品。
【請求項１４】
・ヒト及び／又は動物の腫瘍を治療及び／又は制御するための；及び／又は
・癌制御化合物の影響を相乗的に発揮するための；及び／又は
・癌制御化合物の毒性を低減するための；及び／又は
・ビタミン製剤を産生するための
栄養補助食品又は薬剤を調製するための、請求項１１又は１２に記載の本質的にジアステレオマーとして純粋な６Ｓ体での安定な結晶性の(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸の使用。
【請求項１】
安定な結晶性の(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸を、本質的にジアステレオマーとして純粋な６Ｓ体で、調製する方法であって、
・可溶性レボホリン酸塩の、ｐＨ値が４．５より高い、第一の水溶液又はヒドロアルコール溶液を調製する工程と；
・温度３０〜６０℃にて予熱した、水の又はアルコールを６０％ｖ／ｖ以下含有するヒドロアルコール混合物のバッチを提供する工程と；
・前記第一の溶液と第二の酸とを水又はヒドロアルコール混合物の前記バッチに加えることによって第二の溶液を形成する工程であって、該第二の溶液中のレボホリン酸塩濃度が４％ｗ／ｖを決して超えず、該第二の溶液のｐＨ値が常に３．０〜４．５の範囲内にあり、該第二の溶液の温度が常に３０〜６０℃の範囲内にあるように操作する工程と；
・前記第一の溶液の水又はヒドロアルコール混合物の前記バッチへの添加が完了し、このようにして形成された第二の溶液を、レボホリン酸の結晶化が起こっている間、該溶液を温度３０〜６０℃に保ち、ｐＨを監視し且つｐＨを安定に保つために前記第二の酸を継続して加えながら、前記第二の酸の更なる添加が必要なくてもｐＨ値が安定になり、レボホリン酸の結晶化の終わりを示すまで、攪拌する工程と；
・このようにして形成された結晶性レボホリン酸を回収する工程と
を含む方法。
【請求項２】
ヒドロアルコール溶液又はヒドロアルコール混合物を用いる場合、使用されるアルコールは、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール又はそれらの混合物の中から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒドロアルコール混合物がアルコールを５〜１０％ｖ／ｖ含有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一の溶液が、水中又はヒドロアルコール混合物中に濃度が３０％ｗ／ｖ以下のアルカリ金属レボホリン酸塩を溶解することによって調製される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記第一の溶液が、８０℃以下に加熱することにより可溶性にした、アルカリ土類金属レボホリン酸塩を用いて調製される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記第一の溶液が、アルカリ土類金属レボホリン酸塩を、アルカリ金属カチオンとアニオンとにより形成された塩が溶解されている水性溶媒又はヒドロアルコール溶媒中に、前記アルカリ土類金属との不溶性塩を生じさせつつ、懸濁させ；前記不溶性塩を沈殿させ；このようにして得られたアルカリ金属レボホリン酸塩の溶液から沈殿した塩を分離除去することによる、陽イオン交換を介して調製される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記第二の溶液は、第二の溶液中のレボホリン酸塩濃度が常に１〜２．５％ｗ／ｖ含まれるように操作して形成される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記第二の酸は、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４、Ｈ３ＰＯ４の中から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
レボホリン酸の回収が、遠心分離及び／又はろ過によって行われる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
減圧下で微量の溶媒を除去することによって、生成物を乾燥させることを更に含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
図２に示されるＸＲＤ図を有することを特徴とする、本質的にジアステレオマーとして純粋な６Ｓ体での、安定な結晶性の(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸。
【請求項１２】
対応するＸ線粉末回折図が、以下に示す特徴的な２θ角の値（±０．２°）：
１４．４
１７．３
１７．７
１８．３
１９．７
２０．０
２２．１
２３．３
２７．３
を有することを特徴とする、本質的にジアステレオマーとして純粋な６Ｓ体での、安定な結晶性の(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の本質的にジアステレオマーとして純粋な６Ｓ体での安定な結晶性の(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸を含む医薬品。
【請求項１４】
・ヒト及び／又は動物の腫瘍を治療及び／又は制御するための；及び／又は
・癌制御化合物の影響を相乗的に発揮するための；及び／又は
・癌制御化合物の毒性を低減するための；及び／又は
・ビタミン製剤を産生するための
栄養補助食品又は薬剤を調製するための、請求項１１又は１２に記載の本質的にジアステレオマーとして純粋な６Ｓ体での安定な結晶性の(６Ｓ)−Ｎ(５)−ホルミル−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸の使用。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−１９７２７５（Ｐ２０１２−１９７２７５Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−６３８５７（Ｐ２０１２−６３８５７）
【出願日】平成２４年３月２１日（２０１２．３．２１）
【出願人】（５０４２８２６６９）ジーエムティー ファイン ケミカルズ ソシエテ アノニム (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−６３８５７（Ｐ２０１２−６３８５７）
【出願日】平成２４年３月２１日（２０１２．３．２１）
【出願人】（５０４２８２６６９）ジーエムティー ファイン ケミカルズ ソシエテ アノニム (1)
【Ｆターム（参考）】
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