結晶成長用容器、液滴調製器具および結晶取得方法
【課題】微小液滴中に少なくとも１個の結晶を効率よく取得する。
【解決手段】結晶成長用容器２では、その内部に、結晶化させる物質を含む溶液の微小液滴１０が配置されている。微小液滴１０は、その最長部の長さが、結晶化させる物質の自然拡散により移動できる最大距離を示す移動可能最大距離Ｒｃ以下となるような大きさに調製されている。
【解決手段】結晶成長用容器２では、その内部に、結晶化させる物質を含む溶液の微小液滴１０が配置されている。微小液滴１０は、その最長部の長さが、結晶化させる物質の自然拡散により移動できる最大距離を示す移動可能最大距離Ｒｃ以下となるような大きさに調製されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小液滴中に少なくとも１個の結晶を取得する結晶成長用容器、液滴調製器具および結晶取得方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質に代表される物質の単結晶化と、その構造解析による立体構造の決定とにおいては、液滴中に少なくとも１個の結晶を生成させること、または個々の結晶を離れた場所に生成することが求められている。すなわち、個々の結晶が合体せずに離れていることが求められている。これは、Ｘ線を用いた構造解析装置などの高性能化（例えば、結晶に照射されるＸ線の高出力化、当該結晶で散乱したＸ線を検出する検出器の高性能化など）に起因している。なお、この解析においては、対象となる結晶が必ずしも大きいことは要求されない。
【０００３】
例えば非特許文献１には、このような結晶化を達成する環境としては、宇宙等の微小重力下での結晶化法が報告されている。微小重力環境下では、速度論的条件と物質の輸送とが絶妙に制御されることにより、タンパク質の結晶が成長するので、結果として拡散律速による結晶成長が可能となっている。そのため、一般的に、宇宙で得られる単結晶は大きく、結晶格子の完全性が高い。すなわち、宇宙等の微小重力環境は、結晶成長にとって好都合であるといえる。
【０００４】
また、上記のように、少なくとも１個の結晶を得る技術としては、例えば非特許文献２〜４が挙げられる。非特許文献２では理論的制御によって、非特許文献３では速度論的制御によって、それぞれ「少なくとも１個の核発生」を達成したことが報告されている。また、非特許文献４では、マイクロ流体の技術（例えばマイクロリアクター）を用いて、核発生とその成長とを分離して制御することにより、液滴中に少なくとも１個の結晶を得たことが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】F. Rosenberger, P. G. Vekilov, M. Muschol and B. R. Thomas, J. Crystal Growth, 1996, 168, 1-27
【非特許文献２】D. Kashchiev, D. Clausse, C. Jolivet-Dalmazzone, Journal Colloid and Interface Science 1994, 165, 148-153
【非特許文献３】P. Laval, J. Salmon, M. Joanicot, Journal of Crystal Growth 2007, 303, 622-628.
【非特許文献４】J. Shim, G. Cristobal, D. R. Link, T. Thorsen, S. Fraden, Crystal Growth & Design 2007, 7, 2192-2194.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１には、微小重力環境である宇宙などでの実験を行うことで拡散律速による結晶成長を達成可能であると開示されている。しかし、宇宙に行って当該実験を行うことは、費用面などの問題から容易ではない。また、宇宙にて当該実験を行うことができたとしても、その実験の時間は制限され、十分な実験を行うことができない可能性がある。それゆえ、シミュレーション、または、微小重力の代替環境での実験のような、低額でかつ容易に、上記拡散律速による結晶成長を達成する手法が要求されている。
【０００７】
また、非特許文献２〜４の手法または技術では、液滴中に少なくとも１個の結晶を成長させることについては開示されているが、拡散律速による結晶成長については何ら開示されていない。さらに、これらの手法または技術では、当該手法または技術を適用できる物質に制限があり、また、複雑な処理を要していた。
【０００８】
また、非特許文献１〜４の技術では、地上などの重力環境下において、そのような結晶成長を達成することを目的としていなかった。なお、拡散律速による結晶成長でなければ、微小液滴内に少なくとも１個の結晶を成長させるときの当該微小液滴の大きさを定義（推定）することができない。
【０００９】
一方、本発明の発明者は、重力環境下における微小液滴の内部における物質の挙動（内部流体挙動）と、微小重力下における液滴の内部流体挙動との類似性に着目し、地上において微小液滴を用いての拡散律速による結晶成長を達成するに至った。当然ながら、本発明の発明者によって初めて、その微小液滴の大きさを定義した上で、上記の拡散律速による結晶成長を達成させる技術が見出された。
【００１０】
本発明は、上記の問題を解決するためになされたもので、その目的は、微小液滴中に少なくとも１個の結晶を効率よく取得することが可能な結晶成長用容器、液滴調製器具および結晶取得方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る結晶成長用容器は、上記の課題を解決するために、物質の結晶を成長させるための結晶成長用容器であって、上記結晶成長用容器の内部には、結晶化させる物質を含む溶液の微小液滴が配置されており、上記微小液滴は、上記微小液滴の最長部の長さが、上記結晶化させる物質の自然拡散により移動できる最大距離を示す移動可能最大距離以下となるような大きさに調製されていることを特徴としている。
【００１２】
上記構成によれば、結晶成長用容器には微小液滴が配置されているので、その微小液滴中の密度差によって駆動される対流が抑制される。これにより、拡散律速による結晶成長を達成することができる。そして、この結晶成長の達成により、上記結晶成長用容器の内部に配置された微小液滴中において、物質が自然拡散でしか移動しない環境が整うことになる。そのため、その微小液滴中に物質の結晶を拡散律速により発生させることができる。
【００１３】
また、結晶成長用容器の内部に配置される微小液滴は、その最長部の長さが最大可能移動距離以下となるような大きさに調製されているので、微小液滴中に物質の結晶を確実に成長させ、かつその個数を少なくとも１個に抑制することができる。すなわち、本発明の結晶成長用容器では、微小液滴中に少なくとも１個の物質の結晶を、効率よく成長させることができる。
【００１４】
さらに、本発明に係る結晶成長用容器では、上記微小液滴の周囲は、当該微小液滴とは相溶でない媒体物質で満たされていることが好ましい。
【００１５】
上記構成によれば、微小液滴が、外部と物質の出入りのない孤立した状態となるため、結晶成長用容器を乱暴に扱わない限り、その微小液滴中で成長する結晶が、他の微小液滴あるいはその他の物質と合体することがない。そのため、結晶の解析を容易に行うことができる。
【００１６】
さらに、本発明に係る結晶成長用容器では、上記微小液滴の大きさは、その微小液滴中の密度差によって駆動される対流が抑制される大きさであることが好ましい。
【００１７】
上記構成によれば、微小液滴が、密度差によって駆動される対流が抑制される大きさに調製されていることにより、拡散律速による結晶成長を生じさせることができる。
【００１８】
さらに、本発明に係る結晶成長用容器では、上記微小液滴が配置される上記内部の最短部の長さが、上記微小液滴の最長部の長さと同一であることが好ましい。
【００１９】
上記構成によれば、結晶成長用容器の内部に、確実に微小液滴を配置することができる。
【００２０】
さらに、本発明に係る結晶成長用容器では、上記結晶化させる物質は、タンパク質であることが好ましい。
【００２１】
上記構成によれば、タンパク質の拡散定数を用いて求められる移動可能最大距離は、微小液滴中の対流を効率よく抑制できる値に近い。すなわち、拡散定数を用いて移動可能最大距離が求められる場合、微小液滴中に結晶化させる物質としてタンパク質を用いることにより、上記対流を効率よく抑制でき、拡散律速による結晶成長を達成しやすくすることができる。
【００２２】
さらに、本発明に係る結晶成長用容器は、円筒状のキャピラリーであることが好ましい。
【００２３】
上記構成によれば、結晶成長用容器が、一般的に用いられる結晶構造解析装置と親和性の高いキャピラリーにより実現されるので、汎用性が高い容器を提供できる。
【００２４】
さらに、本発明に係る結晶成長用容器は、微小液滴中に成長させた、上記結晶化させる物質の結晶を、結晶の構造を解析する結晶構造解析装置の解析対象とすることが好ましい。
【００２５】
上記構成によれば、結晶成長用器具において結晶化させた物質の結晶を、結晶構造解析装置の解析対象にしている。すなわち、物質の結晶を成長させた結晶成長用容器を、結晶解析構造装置が備える試料台にそのままセットすることが可能となる。それゆえ、従来のように、結晶を成長させた器具から取り出して、結晶解析構造装置の試料台にセットするといった手間を省くことができる。
【００２６】
さらに、本発明に係る液滴調製器具は、上記に記載の結晶成長用容器に接続され、上記微小液滴を調製して、当該結晶成長用容器に送液することが好ましい。
【００２７】
上記構成によれば、液滴調製器具は、結晶化させる物質を結晶としてその内部に成長させることが可能な微小液滴を調製し、結晶成長用容器に、その調製された微小液滴を送液する。それゆえ、結晶化させる物質を含む、その大きさが制限された微小液滴を、結晶成長用容器に配置することができる。
【００２８】
さらに、本発明に係る結晶取得方法は、物質の結晶を取得するための結晶取得方法であって、上記物質が、微小液滴中を自然拡散により移動できる最大距離を示す移動可能最大距離を、下記（１）、（２）、および（３）に示すパラメータから推定する推定工程と、（１）上記物質の結晶が成長することにより、上記物質を含む溶液中の当該物質が消費される速度である物質消費速度；（２）上記物質の拡散が開始されたときの、上記微小液滴に対する上記物質の濃度である物質初期濃度；（３）上記物質の拡散定数；上記推定工程により推定された上記移動可能最大距離に基づく大きさとなるように、上記微小液滴を調製する調製工程と、上記調製工程により調製された上記微小液滴中に、上記物質の結晶を少なくとも１個成長させる成長工程と、を含むことを特徴としている。
【００２９】
上記構成によれば、その微小液滴中の密度差によって駆動される対流が抑制される。これにより、拡散律速による結晶成長を達成することができる。そして、この結晶成長の達成により、物質が自然拡散でしか移動しない環境が整うため、上記のような物質の移動可能最大距離の推定を行うことができる。
【００３０】
また、上記の推定工程により、拡散律速による結晶成長の対象となる物質ごとに（物質の制限なく）、単純かつ汎用的に上記の移動可能最大距離を推定することができるので、上記結晶の取得を容易に行うことを可能とする。
【００３１】
そして、上記の推定工程により得られた移動可能最大距離に基づく大きさの微小液滴を調製し、その微小液滴中に少なくとも１個の結晶を成長させることにより、微小液滴中に結晶を効率よく成長させることができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明に係る結晶成長用容器は、以上のように、上記結晶成長用容器の内部には、結晶化させる物質を含む溶液の微小液滴が配置されており、上記微小液滴の最長部の長さが、上記結晶化させる物質の自然拡散により移動できる最大距離を示す移動可能最大距離以下となるような大きさに調製されている構成である。
【００３３】
また、本発明に係る結晶成長方法は、以上のように、上記物質が、微小液滴中を自然拡散により移動できる最大距離を示す移動可能最大距離を、下記（１）、（２）、および（３）に示すパラメータから推定する推定工程と、（１）上記物質の結晶が成長することにより、上記物質を含む溶液中の当該物質が消費される速度である物質消費速度；（２）上記物質の拡散が開始されたときの、上記微小液滴に対する上記物質の濃度である物質初期濃度；（３）上記物質の拡散定数；上記推定工程により推定された上記移動可能最大距離に基づく大きさとなるように、上記微小液滴を調製する調製工程と、上記調製工程により調製された上記微小液滴中に、上記物質の結晶を少なくとも１個成長させる成長工程と、を含む方法である。
【００３４】
それゆえ、本発明の結晶成長用容器および結晶取得方法では、微小液滴中に少なくとも１個の物質の結晶を、効率よく成長させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の一実施形態に係る結晶成長用容器の一例を示すものであり、その内部に、成長した物質の結晶を含む微小液滴が配置された様子を示す図である。
【図２】上記結晶成長用容器に接続される液滴調製器具の一例を示す図である。
【図３】上記液滴調製器具の主流路および副流路の構成の一例を示す模式図である。
【図４】上記結晶成長用容器に配置された微小液滴中にソーマチンの結晶を成長させたときの、当該結晶の個数についての実験結果の一例を示すものであり、（ａ）は、上記結晶成長用容器の内径が３６０μｍであるときの実験結果の一例を示すものであり、（ｂ）は、上記結晶成長用容器の内径が２００μｍであるときの実験結果の一例を示すものであり、（ｃ）は、上記結晶成長用容器の内径が１３０μｍであるときの実験結果の一例を示すものである。
【図５】上記結晶成長用容器に配置された微小液滴中にリゾチームの結晶を成長させたときの、当該結晶の個数についての実験結果の一例を示すものであり、（ａ）は、上記結晶成長用容器の内径が３６０μｍであるときの実験結果の一例を示すものであり、（ｂ）は、上記結晶成長用容器の内径が２００μｍであるときの実験結果の一例を示すものである。
【図６】本実施形態に係る結晶取得装置の構成の一例を示すブロック図である。
【図７】本実施形態に係る結晶取得方法において微小液滴の大きさの推定するときのモデルとなる微小球殻の一例を示す図である。
【図８】本実施形態に係る結晶取得装置における処理を含む結晶取得方法の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明の実施の一形態について図１〜図８に基づいて説明すれば、以下のとおりである。説明の便宜上、図面に示した部材と同一の機能を有する部材については、同一の符号を付し、その説明を省略する。
【００３７】
〔本発明の概要〕
＜本発明に至った背景＞
本実施形態の結晶成長用容器に配置される微小液滴は、様々な用途に活用される。特に、ドラッグデリバリー、あるいはその他のバイオメディカルの分野において用いられている。これは、例えば、微小液滴をテンプレートとして用いることで、大きさの均一性が高いリポソームを調製したり、高い内包化効率を達成したりするなど、リポソームを高度に制御することができるためである。上記の分野では、このように高度に制御されたリポソームが必要不可欠である。また、微小液滴は、小さな拡散距離、および大きな比表面積という特性を有しているので、その微小液滴中で物質の化学反応を効率よく行わせることができることも、様々な用途に利用される一因である。
【００３８】
なお、微小液滴を上記の用途に用いるためには、高度に制御された微小液滴を大量に調製する必要がある。このような調製には、単分散で大きさが制御された微小液滴を再現性よく大量に作るための道具として、マイクロ流体の技術（例えばマイクロリアクター）が有用である。
【００３９】
また、微小液滴は、その強い表面張力により、その内部では、密度差によって駆動される対流（密度差駆動対流）ではなく、マランゴニ対流が支配的な内部流動となるという特徴的な内部流体挙動を示す。
【００４０】
微小重力環境下では、密度差駆動対流が起こらないため、微小液滴の内部ではマランゴニ対流だけが起こる。そのため、微小重力環境下では、速度論的条件と物質の輸送とが絶妙に制御された環境が物質の結晶成長にもたらされ、結果として、拡散律速による結晶成長が可能となる。そのため、一般的に、宇宙などの微小重力環境下では、大きくて結晶格子の完全性が高い結晶（単結晶）を成長させることが可能である。
【００４１】
しかし、微小重力環境は、結晶成長にとって好都合なものではあるが、当該環境に簡単に行くことが可能であるわけでもなく、当該環境では、結晶成長に係る実験の時間も制限される。それゆえ、シミュレーション、または、微小重力の代替環境での実験のような、低額でかつ容易に、上記拡散律速による結晶成長を達成する手法が要求されていた。
【００４２】
＜本発明の概要＞
そこで、本発明者は、地上などの重力環境下での微小液滴と、宇宙などの微小重力下での液滴（必ずしも「微小」ではない）との内部流体挙動の類似性（すなわち、微小液滴中の密度差によって駆動される対流が抑制される点）に着目し、重力環境下において微小重力環境を再現する技術の可能性について研究を行った。その結果、大きくて格子の完全性が高い結晶を得ることが可能な拡散律速による結晶成長を、重力環境下において微小液滴を用いることで成功した。
【００４３】
なお、微小液滴を用いた結晶化方法としては、例えば、表面拡散法、二層流体、容器中での拡散法などが報告されているが、これらの方法では、地上などの重力環境下において、拡散律速による結晶成長を達成することを目的としていなかった。
【００４４】
これらの検討を踏まえ、本発明者は、微小液滴の最長部の長さが、結晶化させる物質の自然拡散により移動できる最大距離を示す移動可能最大距離以下となるように調製された微小液滴を配置した結晶成長用容器を実現するに至った。
【００４５】
これにより、この結晶成長用容器の内部には、最長部の長さが最大可能移動距離以下である微小液滴が配置されることになるため、微小液滴中に物質の結晶を効率よく成長させ、かつその個数を少なくとも１個（例えば、１〜３個程度）に抑制することができる。
【００４６】
また、上記結晶成長用容器においては、拡散律速による結晶成長を達成するために、その微小液滴の大きさが、その微小液滴中の密度差によって駆動される対流が抑制される大きさとなるように調製されている。
【００４７】
さらに、本発明者は、外部と物質の出入りのない「孤立した」微小液滴中での結晶化の背景について理論的な研究を行った。すなわち、本発明者は、上述した微小液滴の内部流体挙動の理論的な考察によって、外部との物質のやり取りのない「孤立した」微小液滴の内部に、少なくとも１個だけ結晶を得ることに注目した。これを実現すべく、本実施形態に係る結晶成長用容器においては、微小液滴の周囲が、当該微小液滴とは相溶でない媒体物質で満たされるように、当該微小液滴が配置されている。
【００４８】
また、本発明者は、１つの微小液滴中に１つの結晶を得るための当該結晶の大きさの見積もり（推定）を行い、その結果、その見積もられた大きさと、実際の実験で得られた微小液滴の大きさとが概ね一致することを確認した。
【００４９】
この検討を踏まえ、本発明者は、上記移動可能最大距離を、
（１）上記物質の結晶が成長することにより、上記物質を含む溶液中の当該物質が消費される速度である物質消費速度
（２）上記物質の拡散が開始されたときの、上記微小液滴に対する上記物質の濃度である物質初期濃度
（３）上記物質の拡散定数
に示すパラメータから推定し、その推定した移動可能最大距離に基づく大きさとなるように、微小液滴を調製し、当該微小液滴中に、物質の結晶を少なくとも１個成長させる結晶取得方法を実現するに至った。これにより、単純かつ汎用的に上記移動可能最大距離を推定することができるので、上記結晶の取得を容易に行うことを可能とする。そして、その推定された移動可能最大距離に基づく大きさの微小液滴を調製し、その微小液滴中に少なくとも１個の結晶を成長させることにより、微小液滴中に結晶を効率よく成長させることができる。
【００５０】
また、本発明者は、上記結晶成長用容器に配置した微小液滴中に成長させた、結晶化させる物質の結晶を、結晶の構造を解析する結晶構造解析装置の解析対象とする結晶成長用容器を実現するに至った。
【００５１】
一般に、結晶構造解析装置において決定されるタンパクの立体構造は、分子生物学または創薬の分野では、最も基本的で重要な情報源となる。その立体構造の決定の前段階として、結晶を成長させる工程を必要とする。従来は、その結晶を成長させた後、成長させた容器からその結晶を取り出して、結晶構造解析装置の試料台（ゴニオステージ）に載置するという手作業が生じていた。
【００５２】
しかし、本実施形態では、上記のように成長させた結晶を含む結晶成長用容器を、結晶構造解析装置の解析対象とすることにより、結晶を取り出すという工程を生じさせることなく、最終的な解析対象である結晶を、結晶構造解析装置に提供することができる。すなわち、微小液滴中に少なくとも１個だけ結晶を成長させ、その結晶を結晶成長用容器から取り出さずにそのまま結晶構造解析装置に提供することが可能となる。
【００５３】
また、結晶構造解析において、少なくとも１個の結晶が成長した微小液滴が配置された結晶成長用容器から、当該結晶を取り出さなくてもよいので、当該結晶成長用容器を、その構造解析にも対応可能な「結晶構造解析支援器具」として用いることができる。
【００５４】
なお、本実施形態の結晶成長用容器に配置された、その大きさが調整された微小液滴では、物質が自然拡散でしか移動しない環境が整うことになる。そのため、その微小液滴の内部で最初の１個の核発生後、物質の濃度勾配を生じさせることができ、その結果、「制御された」過飽和状態の解消を実現することができる。それゆえ、拡散律速により、微小液滴中に結晶を成長させるときに、その微小液滴中に当該結晶を「１個だけ」成長させることも可能となる。
【００５５】
〔実験系〕
＜液滴調製器具＞
次に、図２および図３を用いて、本実施形態に係る結晶成長用容器２に配置される微小液滴１０を調製する液滴調製器具１について説明する。図２は、結晶成長用容器２に接続される液滴調製器具１の一例を示す図である。また、図３は、液滴調製器具１の主流路１ａおよび副流路１ｂの構成の一例を示す模式図である。
【００５６】
図２に示すように、液滴調製器具１は、例えば、結晶成長用容器２（キャピラリー）に接続され、微小液滴１０（図１参照）を調製して、当該結晶成長用容器２に送液するものである。液滴調製器具１では、微小液滴１０を所定の大きさ（移動可能最大距離Ｒｃ以下となるような大きさ）に調製するために、その内部に送液される物質の種類、濃度、流速などが制御される。
【００５７】
液滴調製器具１は、例えば、マイクロ流路デバイスにより実現されている。本実施形態では、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなるマイクロ流路デバイスが使用される。その構造は、従来から用いられているマイクロ流路デバイスと同様であるので、ここではその具体的な説明は省略する。
【００５８】
また、図３に示すように、液滴調製器具１は、少なくとも主流路１ａおよび副流路１ｂを備えている。物質の結晶１１（図１参照）をその内部に少なくとも１つ成長させることが可能な微小液滴１０を調製するために、副流路１ｂから、結晶化させる物質を含む溶液、沈殿剤溶液およびフッ化物系オイルが送液される。結晶化させる物質を含む溶液および沈殿剤溶液は、互いに相溶であり、合体することにより微小液滴１０が調製される。また、フッ化物系オイルは、微小液滴１０とは相溶でない媒体物質として機能する。このため、フッ化物系オイルは、調製された微小液滴１０の周囲を取り囲むことができ、微小液滴１０を「孤立した」状態で結晶成長用容器２の内部に配置することを可能にする。
【００５９】
具体的には、複数の副流路１ｂのうち、結晶成長用容器２に接続される側の副流路１ｂからフッ化物系オイルが送液され、結晶成長用容器２に接続される側から離れた位置に設けられている副流路１ｂから、上記結晶化される溶液および沈殿剤溶液が送液される。図３に示す例では、当該溶液としてはタンパク質溶液が送液されている。
【００６０】
なお、上記の微小液滴１０と相溶でない媒体物質は、微小液滴１０の「孤立した」状態を実現可能であれば、フッ化物系オイルに限られないが、上記結晶化される溶液および沈殿剤溶液と極端に大きな密度差がないことが好ましい。
【００６１】
複数の副流路１ｂは、主流路１ａに接続され、その主流路１ａの一端が結晶成長用容器２に接続される。これにより、副流路１ｂから各種材料（各種溶液）が送液されることにより、主流路１ａにおいて微小液滴１０が調製される。なお、本実施形態では、微小液滴１０が液滴調製器具１の内部で所定の大きさになる調整され、結晶成長用容器２に送液されるものとして説明するが、これに限らず、液滴調製器具１に接続された結晶成長用容器２において、微小液滴１０が所定の大きさとなるまで調製されてもよい。
【００６２】
図３に示す例では、主流路１ａの断面（各種材料が流れる方向に対して垂直な面）は、結晶成長用容器２に接続される一端の断面が１００μｍ×２００μｍの長方形、それ以外の部分が１００μｍ×１００μｍの正方形となっている。また、副流路１ｂの断面も、１００μｍ×１００μｍの正方形となっている。結晶成長用容器２に接続される一端の断面が、それ以外の部分の断面に比べて大きいのは、各種材料の結晶成長用容器２への送液を容易にするためである。
【００６３】
なお、副流路１ｂの設け方、副流路１ｂの個数、副流路１ｂと送液される材料との関係（どの副流路１ｂからどの材料が送液されるか）、並びに、主流路１ａおよび副流路１ｂの寸法は、あくまで一例であって、物質の結晶１１をその内部に少なくとも１つ成長させることが可能な微小液滴１０を調製できる構成であれば、これらに限定されない。
【００６４】
＜結晶成長用容器＞
次に、図１を用いて、本実施形態に係る結晶成長用容器２について説明する。図１は、結晶成長用容器２の一例を示すものであり、その内部に、成長した物質の結晶１１を含む微小液滴１０が配置された様子を示す図である。
【００６５】
結晶成長用容器２は、物質の結晶１１を成長させるためのものであって、その内部に、結晶化させる物質を含む溶液の微小液滴１０が配置（配列）されているものである。また、配置された微小液滴１０の最長部の長さが、移動可能最大距離Ｒｃ以下となるような大きさに調製されている。
【００６６】
本実施形態では、結晶成長用容器２は、テフロン（登録商標）からなるキャピラリー（テフロンキャピラリーチューブ）であり、図１に示す例では、その内径が２００μｍである。以下の実験例では、４つの異なる内径（１３０、２００、３６０および５００μｍ）を有する円筒状のキャピラリーが結晶成長用容器２として用いられている。なお、どの内径を有する結晶成長用容器２を用いたとしても、接続される液滴調製器具１の大きさは共通である。
【００６７】
また、図１に示す例では、３つの微小液滴１０が配置されている。また、その形状は略「真球」であり、結晶成長用容器２の内径と略同一の直径を有している。すなわち、微小液滴１０が配置される、結晶成長用容器２の内部の最短部の長さは、微小液滴１０の最長部の長さと同一となっている。そして、その微小液滴１０の内部には、結晶１１が成長している。
【００６８】
なお、その形状は、真球に限られることはなく、細長い形状であってもよい。なお、本実施形態に係る「移動可能最大距離Ｒｃ」は、真球の微小液滴１０に対して定義される場合、その「直径」ではなく「半径」を指すものとなる。
【００６９】
＜実施例＞
次に、上述した液滴調製器具１および結晶成長用容器２を用いて、微小液滴１０が調製され、その内部に結晶１１を成長させたときの一実施例（実験例）を説明する。なお、以下に説明する実施例は、あくまで一実施例であって、本実施形態の液滴調製器具１、結晶成長用容器２およびこれらを利用した結晶取得方法を限定的に解釈させるものではない。また、以下では、液滴調製器具１と結晶成長用容器２とが接続されているものとして説明する。
【００７０】
この実施例では、結晶化させる物質として、タンパク質が用いられる。タンパク質の拡散定数Ｄを用いて（すなわち、後述の式（６）を用いて）推定される移動可能最大距離Ｒｃは、微小液滴１０中の密度差駆動対流を効率よく抑制できる値に近い。それゆえ、結晶化させる物質としてタンパク質を用いた場合、上記推定値から微小液滴１０を調製することができるので、タンパク質の、微小液滴１０中での上記対流を効率よく抑制でき、拡散律速による結晶成長を達成しやすくすることができる。そして、タンパク質に関する実験は、特にバイオメディカルの分野において数多く行われている。それゆえ、結晶成長用容器２は、特にバイオメディカルの分野において有効に適用することができる。
【００７１】
この実験では、ソーマチンというタンパク質をモデルとしている。これは、ソーマチンが典型的に当該モデルとして多用され、マクロスケールでの結晶化、その速度論解析などにおいて、非常によく研究されているためである。また、液滴調製器具１としては、ＰＤＭＳからなるマイクロ流体デバイス、結晶成長用容器２としては、テフロンキャピラリーチューブを使用した。テフロンキャピラリーチューブは、４つの異なる内径（１３０、２００、３６０および５００μｍ）を有するものを準備することにより、その４つの異なる内径にあわせて「真球の」微小液滴１０が調製された。
【００７２】
また、液滴調製器具１の副流路１ｂから、タンパク質溶液および沈殿剤溶液が送液され、主流路１ａから、フッ化物系オイルが送液される。タンパク質溶液は、２０ｍｇ／ｍＬの濃度のソーマチンを、１００ｍＭのＮ−（２−アセトアミド）イミノ２酢酸（ＡＤＡ）緩衝溶液（ｐＨ６．５）に溶解したものである。沈殿剤溶液は、１．６Ｍの酒石酸カリウムナトリウムを、５０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝溶液（ｐＨ７．０）に溶解したものである。また、フッ化物系オイルは、フッ素系不活性液体（住友スリーエム製のフロリナート（登録商標））と、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロ−１−オクタノールとを、１０：１の体積比で混合したものである。
【００７３】
副流路１ｂから送液されたタンパク質溶液と沈殿剤溶液とは、主流路１ａにおいて合流し、互いに混ざり合って、当該主流路１ａ中で１つの微小液滴１０となる。タンパク溶液と沈殿剤溶液とは略同一の流速となるように制御される。また、フッ化物系オイルは、調製される微小液滴１０の周囲を取り囲み、当該微小液滴１０の「孤立した」状態を実現するために、タンパク質溶液および沈殿剤溶液が送液される副流路１ｂとは異なる２つの副流路１ｂから送液される。フッ化物系オイルについても、上記流速と略同一の流速となるように制御される。そして、これらの流速を微調整することにより、真球の微小液滴１０を調製した。
【００７４】
所定の大きさに調製された微小液滴１０が結晶成長用容器２に送液される、あるいは結晶成長用容器２にて所定の大きさの微小液滴１０が調製されることにより、結晶成長用容器２の内部に配置される。所定の大きさの微小液滴１０が配置された後、上記材料の送液を中止し、結晶成長用容器２を液滴調製器具１から取り外し、その両端をワックスにて封止した。そして、微小液滴１０が配置された結晶成長用容器２を約４℃で保管し、当該微小液滴１０中でタンパク質の結晶成長が完了するまでの間、撮像装置による撮像を行うことで、当該結晶成長の過程を観察した。
【００７５】
＜実験結果＞
上記実験において調製された微小液滴１０は、その強い表面張力により、自然に歪んで潰れてしまうようなことはなかった。また、結晶成長用容器２の内部に微小液滴１０が配置され、結晶１１が成長し始めてから、その成長が止まるまで、おおよそ数時間かかった。
【００７６】
ここで、上記実験は、上記４つの結晶成長用容器２について行われた。それぞれの結晶成長用容器２に配置された、１００〜２００個の微小液滴１０を観察し、その微小液滴１０中で成長した結晶１１の数を数えた。その結果が表１に示されている。なお、表１においては、結晶１１の数を、上記複数の微小液滴１０で観察された数の平均値±標準偏差で示している。
【００７７】
【表１】
【００７８】
表１に示すように、３６０μｍ、２００μｍ、１３０μｍの内径を有する結晶成長用容器２のそれぞれに配置された微小液滴１０中（この実験では、当該内径と微小液滴１０の直径とが略同一）には、およそ１個の結晶１１を確認できた。一方、５００μｍの内径を有する結晶成長用容器２に配置された微小液滴１０中には、およそ２個の結晶１１を確認できた。
【００７９】
＜アブラミの式による結晶成長の検討＞
ここで、結晶成長の機構を検討するため、結晶成長の速度論解析に用いられるアブラミの式による解析を行った。ここで、式（１）において、αは結晶１１の成長割合（α＝１は結晶成長終了、α＝０は結晶１１が生じる前、すなわちすべてのタンパク質が溶液中に溶けている状態）、ｋは結晶化の速度定数、ｔは結晶成長にかかる時間を示す。また、アブラミ指数ｍは、核発生と結晶成長との基本的な情報を反映するものである。
【００８０】
【数１】
【００８１】
この検討においては、３６０μｍの直径を有する微小液滴１０、２００μｍの直径を有する微小液滴１０、１３０μｍの直径を有する微小液滴１０について、それぞれ約１０個の微小液滴１０中における結晶成長の過程を観察した。そして、結晶成長にかかった時間と結晶１１の大きさとから、アブラミ指数ｍを求めた。その結果、アブラミ指数ｍは、微小液滴１０がいずれの直径の場合であっても、１．５程度となった。
【００８２】
上述のソーマチンを用いた実験では、微小液滴１０中で成長した結晶１１が、見た目で明らかに３次元的なものであったことから、ｍ≒１．５が示す意味は、核発生速度が無限大であること、かつ拡散律速による結晶成長であることを意味する。「核発生速度が無限大である」という結果は、１つの結晶１１が１つの微小液滴１０中に発生し、成長するという結果と一致している。また、「拡散律速による結晶成長」という結果は、微小液滴１０中の密度差による対流が十分に抑えられていることを意味する。
【００８３】
＜更なる実験例＞
（ソーマチンの場合）
次に、図４を用いて、結晶化させる物質としてソーマチンを用いた場合の更なる実験結果の一例について説明する。図４の（ａ）は、結晶成長用容器２の内径が３６０μｍであるときの実験結果の一例、（ｂ）は、結晶成長用容器２の内径が２００μｍであるときの実験結果の一例、（ｃ）は、結晶成長用容器２の内径が１３０μｍであるときの実験結果の一例を、それぞれ示すものである。
【００８４】
図４は、上記表１と同様、１個の微小液滴１０中で成長する結晶１１の個数と、微小液滴１０の大きさに関する値とを示すものである。更なる実験例についても、上述した実験例と同様の手順で実験を行ったが、微小液滴１０の形状が真球形状に限らず、非真球形状（細長い形状）となるように調製されたものも含まれる。
【００８５】
例えば、図４の（ａ）では、実験結果（ア）〜（オ）を得た。実験結果（ア）の場合、微小液滴１０の体積が最も大きく、横長（細長い形状）の微小液滴１０が確認できた。そして、その微小液滴１０中の結晶１１の個数は約３個であった。一方、実験結果（オ）の場合、微小液滴１０の体積が最も小さく、略真球の微小液滴１０を確認できた。そして、その微小液滴１０中の結晶１１の個数は約１個であった。
【００８６】
つまり、真球に近い形状に微小液滴１０ほど、その体積が小さい、すなわち移動可能最大距離Ｒｃよりも小さな液滴であるがゆえ、微小液滴１０中に１個の結晶１１を成長させやすいといえる。微小液滴１０それぞれは、「孤立した」状態で結晶成長用容器２に配置されているので、その微小液滴１０に１個の結晶１１だけが成長している状態であれば、それだけ結晶１１の解析を容易に行うことができる。一方、微小液滴１０中に結晶１１が例えば２〜３個（すなわち、複数個）含まれていても、結晶１１の解析に支障がない場合には、微小液滴１０の体積を大きく（すなわち、非真球形状に）成長させてもよい。
【００８７】
また、上記表１の結果は、内径５００μｍの結晶成長用容器２においてその内径にあわせて微小液滴１０が調製された場合、真球の微小液滴１０を得ることはできなかったことを示している。これは、短軸の長さが５００μｍを超える液滴では、比表面積の減少により、相対的に表面張力が減少し、自重によって液滴がひずむため、真球形状の液滴を得ることができなかったためと考えられる。したがって、この結果は、その長さが５００μｍを超えるような微小液滴１０においては、真球の微小液滴１０を得ることはできないことを意味する。
【００８８】
また、図４（ｂ）および（ｃ）に示すように、２００μｍおよび１３０μｍの内径を有する結晶成長用容器２のそれぞれについても、上記と同様、その内部に配置された微小液滴１０の体積が大きければ、その内部で成長する結晶１１の個数が多くなる（図４の（ｂ）および（ｃ）それぞれの実験結果（ア）を参照）。一方、微小液滴１０の体積が小さくなるほど、その内部で成長する個数も減り、真球に近い形状である場合には、その内部に成長する結晶１１の個数を約１個に制御することができる（図４の（ｂ）の実験結果（コ）、（ｃ）の実験結果（イ）を参照）。
【００８９】
（リゾチームの場合）
次に、図５を用いて、結晶化させる物質としてリゾチームを用いた場合の更なる実験結果の一例について説明する。
【００９０】
図５は、上記ソーマチンと同様、１個の微小液滴１０中で成長する結晶１１の個数と、微小液滴１０の大きさに関する値とを示すものである。また、図５は、ソーマチンと同様の手順で実験を行った場合の実験結果を示している。
【００９１】
例えば、図５の（ａ）（内径が３６０μｍの場合）では、実験結果（ア）および（イ）を得た。両結果とも、微小液滴１０の体積が小さく、略真球の微小液滴１０を確認できた。そして、その微小液滴１０中の結晶１１の個数は約１〜２個であった。また、図５の（ｂ）（内径が２００μｍの場合）では、実験結果（ア）および（イ）を得た。実験結果（ア）では、微小液滴１０中の結晶１１の個数は約１〜２個であり、実験結果（イ）では、その微小液滴１０中の結晶１１の個数は約１個に満たなかった。
【００９２】
この結果から、ソーマチンと同様、所定の大きさ（少なくとも直径２００〜３６０μｍの大きさ）の微小液滴１０中に約１個の結晶１１を成長させることができるがわかる。すなわち、本実施形態の結晶成長用容器２は、ソーマチン以外の物質の結晶化においても、所定の大きさを有する微小液滴１０を配置することにより、密度差駆動対流が抑制された結果としての拡散律速による結晶成長を実現することができるとともに、その微小液滴１０中に少なくとも１個の物質の結晶を成長させることができる。
【００９３】
〔結晶取得装置および結晶取得方法〕
次に、図６および図７を用いて、結晶取得装置３の構成について説明する。図６は、本実施形態に係る結晶取得装置３の構成の一例を示すブロック図である。また、図７は、微小液滴１０の大きさの推定するときのモデルとなる微小球殻の一例を示す図である。
【００９４】
図６に示すように、結晶取得装置３は、物質の結晶１１を取得するための装置であり、例えば、制御部４、記憶部５および操作部６を備えている。結晶取得装置３は、液滴調製器具１および結晶成長用容器２とともに、物質の結晶１１を取得するための結晶取得システム２０に含まれ、液滴調製器具１と接続され、各種溶液の流速などを調整することにより、当該溶液への液滴調製器具１の送液を制御するものである。
【００９５】
制御部４は、例えば制御プログラムを実行することにより、結晶取得装置３を構成する部材を制御するものである。制御部４は、記憶部５に格納されているプログラムを、例えばＲＡＭ（Random Access Memory）等で構成される一次記憶部（不図示）に読み出して実行することにより、例えば、微小液滴１０の移動可能最大距離Ｒｃの算出処理などの各種処理を行う。なお、移動可能最大距離Ｒｃは、最大距離推定部４２により推定される値である。
【００９６】
記憶部５は、制御部４が実行する（１）各部の制御プログラム、（２）ＯＳプログラム、（３）アプリケーションプログラム、および、（４）これらプログラムを実行するときに読み出す各種データを記録するものである。制御部４は、例えばＲＯＭ（Read Only Memory）フラッシュメモリなどの不揮発性の記憶装置によって構成されるものである。なお、上述した一次記憶部は、ＲＡＭなどの揮発性の記憶装置によって構成されているが、本実施形態では、記憶部５が一次記憶部の機能も備えているものとして説明する場合もある。記憶部５は、例えば、移動可能最大距離Ｒｃを算出するときに使用する数式などの各種データを格納している。
【００９７】
操作部６は、結晶成長用容器２に配置された微小液滴１０中に物質の結晶１１を取得するために、結晶取得装置３を操作する操作者が、結晶取得装置３に必要なデータを入力するために用いられるものであり、例えばキーボード、マウスなどで実現されている。その必要なデータとしては、例えば、最大距離推定部４２にて用いられる各種パラメータの値が挙げられる。
【００９８】
なお、操作部６は、結晶取得装置３とは異なる外部装置によって実現されていてもよい。この場合、結晶取得装置３のパラメータ取得部４１は、操作部６を介して取得した各種パラメータの値を、無線または有線通信媒体を介して取得してもよい。
【００９９】
次に、制御部４の構成について説明する。制御部４は、主として、パラメータ取得部４１、最大距離推定部４２および液滴調製制御部４３を備えている。
【０１００】
パラメータ取得部４１は、最大距離推定部４２が移動可能最大距離Ｒｃを推定する（算出する）際に用いる各種パラメータを取得するものである。例えば、パラメータ取得部４１が取得する各種パラメータの値は、制御部４が、その推定に必要となる各種パラメータの入力を促す入力画面を表示部（不図示）に表示させ、その入力画面に操作者が入力したものである。パラメータ取得部４１は、これらの値を記憶部５に一時保存する。
【０１０１】
パラメータ取得部４１が取得する各種パラメータとしては、
（１）物質の結晶１１が成長することにより、物質を含む溶液中で当該物質が消費される速度である物質消費速度ｑ
（２）物質の拡散が開始されたときの、微小液滴１０に対する物質の濃度である物質初期濃度Ｃ０
（３）物質の拡散定数Ｄ
の３つが挙げられる。上記（１）〜（３）のパラメータは、あくまで一例であって、例えば、最大距離推定部４２が、以下に示す方法以外の方法にて移動可能最大距離Ｒｃを推定する場合には、他のパラメータが取得されてもよい。例えば、パラメータ取得部４１は、物質消費速度として、一定値としての物質消費速度（以下の式（６）の「ｑ」）ではなく、実際の物質消費速度−ｒｐ、および結晶成長にかかった時間を取得してもよい。
【０１０２】
最大距離推定部４２は、パラメータ取得部４１が取得した各種パラメータを記憶部５から読み出し、その各種パラメータから移動可能最大距離Ｒｃを推定する。具体的には、以下のように得られる式（６）を用いて、移動可能最大距離Ｒｃを推定する。この推定においては、１個の微小液滴１０中に１個の結晶１１を得る場合を想定している。また、この推定では、真球の微小液滴１０の中心に結晶核が発生し、その核が成長していくという結晶成長過程を仮定している。この場合、結晶１１のごく近傍の物質の濃度は、その周辺部の物質の濃度よりも低い。このため、溶液中の物質の分子は、自然拡散によって結晶１１の表面まで移動し、その後結晶１１に吸収される。
【０１０３】
なお、以下では、物質がタンパク質であるものとして説明する。上述のように、タンパク質の拡散定数Ｄを用いて求められる移動可能最大距離Ｒｃは、微小液滴１０中の密度差駆動対流を効率よく抑制できる値に近いからである。この点を考慮しないのであれば、結晶化される物質がタンパク質である必要は必ずしもない。
【０１０４】
ここで、図７に示すような、半径Ｒの微小液滴１０中の、半径ｒの円と半径（ｒ＋ｄｒ）の円とで囲まれた微小球殻を仮定する。フィックの第一法則は、次の式（２）で示される。ここで、式（２）において、Ｎはタンパク質の拡散流束、Ｄはタンパク質の拡散係数、Ｃは微小液滴１０に対するタンパク質の濃度である。結晶核、および、結晶成長の初期段階における結晶１１の大きさは、結晶１１を成長させる微小液滴１０の大きさに対して十分に小さく無視できる。
【０１０５】
【数２】
【０１０６】
また、タンパク質についての物質収支式は、次の式（３）で表わされる。ここで、式（３）において、タンパク質の消費速度、すなわち、たんぱく質の結晶１１が成長することにより、タンパク質を含む溶液中で当該タンパク質が消費される速度を−ｒｐとする。
【０１０７】
【数３】
【０１０８】
そして、この式（３）は、次の式（４）に示すように整理される。
【０１０９】
【数４】
【０１１０】
ここで、以下の境界条件を考慮する。ここで、Ｃ０はタンパクの初期濃度である。
【０１１１】
【数５】
【０１１２】
本実施形態におけるタンパク質の結晶成長では、タンパク質の結晶１１の近傍における、微小液滴１０に対するタンパク質の濃度が十分に低く、タンパク質の結晶化が拡散律速により進む（上記アブラミの式（１）を用いた検討において、ｍ≒１．５の値が得られている）ことから、この結晶化は０次反応とみなすことができる。すなわち、タンパク質の消費濃度−ｒｐは、半径ｒに依存しない値であるため、一定値ｑと置くことができる。そのため、式（４）は、次の式（５）に示すように書き換えられる。
【０１１３】
【数６】
【０１１４】
微小液滴１０の半径Ｒ、およびタンパク質の初期濃度Ｃ０は正の値となる。それゆえ、この式（５）を解くと、１個の微小液滴１０中に１個の結晶１１を得るための移動可能最大距離（微小液滴１０の「臨界」サイズ）Ｒｃは、次の式（６）で表わされる。
【０１１５】
【数７】
【０１１６】
すなわち、最大距離推定部４２は、タンパク質の物質消費速度ｑ、物質初期濃度Ｃ０、および拡散定数Ｄというパラメータ（パラメータ取得部４１が取得したパラメータ）から、移動可能最大距離Ｒｃを推定する。そして、最大距離推定部４２は、推定した結果である最大距離推定結果を、記憶部５に一時保存する。
【０１１７】
なお、パラメータ取得部４１が、物質消費速度として、実際の物質消費速度−ｒｐ、および結晶成長にかかった時間を取得している場合には、最大距離推定部４２は、これらの２つのパラメータから、上記式（６）に使用する物質消費速度ｑを求めてもよい。
【０１１８】
また、上記では、式（６）を用いて移動可能最大距離Ｒｃが推定されているが、これに限らず、例えば、上記の境界条件を異なる条件としたり、物質消費濃度−ｒｐを一定値ｑに置換しないで上記推定を行ってもよい。この場合、微小液滴１０中に複数個の結晶１１を成長させるための当該微小液滴１０の大きさを推定することができる。
【０１１９】
さらに、最大距離推定部４２は、パラメータ取得部４１が取得した各種パラメータ、および上記式（６）を用いて推定を行うものであるが、これに限らず、例えば、上述した式（２）から式（６）を得るまでの処理を、最大距離推定部４２が行ってもよい。
【０１２０】
液滴調製制御部４３は、主として、最大距離推定部４２が推定した移動可能最大距離Ｒｃを記憶部５から読み出し、その移動可能最大距離Ｒｃと同一、あるいはそれよりも小さく微小液滴１０が調製されるように、液滴調製器具１に送液される各種溶液（結晶化させる物質を含む溶液、沈殿剤溶液、フッ化物系オイルなど）の流速を決定するものである。そして、その決定した流速にしたがって、液滴調製器具１に各種溶液の送液を制御する。
【０１２１】
微小液滴１０をどの程度の大きさに調製するかは、例えば、（１）移動可能最大距離Ｒｃまで調製する、（２）移動可能最大距離Ｒｃの数十％（例えば８０％（設定値））に調製する、（３）移動可能最大距離Ｒｃを上限として、結晶取得装置３の操作者に、その値を入力させるといった方法のいずれかで決定される。
【０１２２】
また、液滴調製制御部４３は、微小液滴１０が調製される過程を監視することによって、その微小液滴１０の形状を、所望の形状（例えば、真球形状）となるように、決定した各種溶液の流速の微調整を行ってもよい。この場合、液滴調製制御部４３は、例えば、調製過程にある微小液滴１０を、撮像装置（不図示）により撮像し、その撮像画像を解析することにより、その調整過程にある微小液滴１０の形状を認識する。その後、記憶部５に格納された所望の形状を示すデータ（例えば、モデルとなる画像データ）と比較することで、当該微小液滴１０が所望の形状となっているか否かを判定し、所望の形状になっていないと判定した場合には、その認識された形状から流速の再決定を行う。
【０１２３】
なお、調製過程における微小液滴１０の形状が所望の形状でない場合に、その形状から所望の形状を得るための流速は、経験則から把握されるものである。そのため、その経験則に基づいて、どの形状のときに、決定された流速をどの程度高める、または低めるのかが決定できるように、例えばその形状と流速変化率とが対応付けて記憶部５に格納されている。
【０１２４】
そして、液滴調製制御部４３は、微小液滴１０が移動可能最大距離Ｒｃ以下の所定の大きさに調製されたと判定した場合、各種溶液の送液を停止させる。その後、微小液滴１０が、液滴調製器具１から結晶成長用容器２に送液され、その微小液滴１０中に、物質の結晶１１が少なくとも１個成長していく。この結晶成長は、結晶成長用容器２を静置しておくことにより実現される。
【０１２５】
すなわち、図８に示すような流れを経て、物質の結晶１１の取得が実現される。図８は、本実施形態に係る結晶取得装置３における処理を含む結晶取得方法の一例を示す図である。
【０１２６】
結晶取得装置３では、パラメータ取得部４１が各種パラメータ（結晶化させる物質の物質消費速度ｑ、物質初期濃度Ｃ０および拡散定数Ｄ）の値を取得した後（Ｓ１）、最大距離推定部４２が、そのパラメータの値から、移動可能最大距離Ｒｃを推定する（Ｓ２：推定工程）。
【０１２７】
そして、液滴調製制御部４３が、その移動可能最大距離Ｒｃに基づく大きさとなるように、微小液滴１０を調製し（Ｓ３：調製工程）、その後、当該微小液滴１０がその内部に配置された結晶成長用容器２が静置されることにより、当該微小液滴１０中に、少なくとも１個の結晶１１が成長する（Ｓ４：成長工程）。
【０１２８】
なお、Ｓ３では、液滴調製制御部４３が微小液滴１０を所定の大きさになるように、各種溶液の流速を制御しているが、これに限られない。例えば、最大距離推定部４２によって推定された移動可能最大距離Ｒｃを表示部（不図示）に表示し、その移動可能最大距離Ｒｃを確認した操作者によって、液滴調製器具１に送液される各種溶液の流速が決定されてもよい。また、例えば、上記の画像または顕微鏡などによって、操作者が、調製過程にある微小液滴１０の形状を随時監視することにより、上記流速の微調整を行ってもよい。
【０１２９】
〔移動可能最大距離の推定値と、実験による微小液滴の大きさとの比較〕
次に、上記移動可能最大距離Ｒｃの推定値と、上記実験によって得られた微小液滴１０の大きさとの比較を行う。
【０１３０】
上記では、タンパク質（ソーマチン）の物質初期濃度Ｃ０が１０ｍｇ／ｍＬである。また、結晶成長にかかった時間が６０００秒としたときのタンパク質の物質消費速度ｑは、ｑ≒１／６×１０-2ｍｇ／ｍＬ・ｓと計算される。また、ソーマチンの拡散定数Ｄは約１０-11ｍ2／ｓである。最大距離推定部４２は、これらのパラメータの値を式（６）に代入することにより、移動可能最大距離Ｒｃ≒約６００μｍと算出する。
【０１３１】
この値は、理論値であり、実際の値はこれよりも小さくなると考えられる。これは、結晶１１の核発生が必ずしも微小液滴１０の中心で生じるとは限らず、また、結晶成長に伴う結晶１１自体の大きさを無視できなくなるためである。これを考慮すれば、この値は、実際の実験結果（表１）とおおよそ一致していると言える。それゆえ、結晶取得装置３による移動可能最大距離Ｒｃの推定は、微小液滴１０中に結晶１１を効率よく発生させることを可能とする。特に、その推定値よりも小さい値の半径を有する、真球の微小液滴１０を調製する場合には、その微小液滴１０中に結晶１１を１個だけ成長させることができる。つまり、微小液滴１０中に１個の結晶１１を成長させたい場合には、上記推定値は特に有効であるといえる。
【０１３２】
なお、上述の結晶１１の核発生が必ずしも微小液滴１０の中心で生じるとは限らない、結晶成長に伴う結晶１１自体の大きさを無視できない、という理由から、表１に示すように、３６０μｍおよび２００μｍの微小液滴１０では、１個の微小液滴１０中に得られる平均結晶個数が１個よりもやや多くなっている。これは、タンパク質の高濃度部分が、成長中の結晶１１から離れた場所に維持され、結果として２個目の核発生とその成長の機会とを生じさせることになるからである。
【０１３３】
〔ソフトウェアによる実現例〕
最後に、結晶取得装置３の各ブロック、特に制御部４のパラメータ取得部４１、最大距離推定部４２および液滴調製制御部４３は、ハードウェアロジックによって構成してもよいし、次のようにＣＰＵを用いてソフトウェアによって実現してもよい。
【０１３４】
すなわち、結晶取得装置３は、各機能を実現する制御プログラムの命令を実行するＣＰＵ（central processing unit）、前記プログラムを格納したＲＯＭ（read only memory）、前記プログラムを展開するＲＡＭ（random access memory）、前記プログラムおよび各種データを格納するメモリ等の記憶装置（記録媒体）などを備えている。そして、本発明の目的は、上述した機能を実現するソフトウェアである結晶取得装置３の制御プログラムのプログラムコード（実行形式プログラム、中間コードプログラム、ソースプログラム）をコンピュータで読み取り可能に記録した記録媒体を、前記結晶取得装置３に供給し、そのコンピュータ（又はＣＰＵやＭＰＵ）が記録媒体に記録されているプログラムコードを読み出し実行することによっても、達成可能である。
【０１３５】
前記記録媒体としては、例えば、磁気テープやカセットテープ等のテープ系、フロッピー（登録商標）ディスク／ハードディスク等の磁気ディスクやコンパクトディスク−ＲＯＭ／ＭＯ／ＭＤ／デジタルビデオデイスク／コンパクトディスク−Ｒ等の光ディスクを含むディスク系、ＩＣカード（メモリカードを含む）／光カード等のカード系、あるいはマスクＲＯＭ／ＥＰＲＯＭ／ＥＥＰＲＯＭ／フラッシュＲＯＭ等の半導体メモリ系などを用いることができる。
【０１３６】
また、結晶取得装置３を通信ネットワークと接続可能に構成し、前記プログラムコードを通信ネットワークを介して供給してもよい。この通信ネットワークとしては、特に限定されず、例えば、インターネット、イントラネット、エキストラネット、ＬＡＮ、ＩＳＤＮ、ＶＡＮ、ＣＡＴＶ通信網、仮想専用網（virtual private network）、電話回線網、移動体通信網、衛星通信網等が利用可能である。また、通信ネットワークを構成する伝送媒体としては、特に限定されず、例えば、ＩＥＥＥ１３９４、ＵＳＢ、電力線搬送、ケーブルＴＶ回線、電話線、ＡＤＳＬ回線等の有線でも、ＩｒＤＡやリモコンのような赤外線、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、８０２．１１無線、ＨＤＲ、携帯電話網、衛星回線、地上波デジタル網等の無線でも利用可能である。なお、本発明は、前記プログラムコードが電子的な伝送で具現化された、搬送波に埋め込まれたコンピュータデータ信号の形態でも実現され得る。
【０１３７】
〔本発明の別表現〕
本発明は、以下のようにも表現できる。
【０１３８】
本発明の方法は、微小液滴の内部流体挙動が、微小重力下でのそれに似ていることを利用して、地上で微小重力代替実験環境として用いるものである。
【０１３９】
また、本発明の方法は、そのような微小重力代替実験環境としての微小液滴の性質を利用して、単結晶を得る方法である。
【０１４０】
また、本発明の方法は、単結晶を成長させる方法であって、その方法では、その微小液滴内での単結晶の成長が拡散律速である。
【０１４１】
また、本発明の方法は、前記微小液滴の内部流体挙動の特殊性を利用し、１つの液滴中に、１個もしくは少数の単結晶のみを生じさせる方法である。
【０１４２】
また、本発明の方法は、１つの液滴中に、１個もしくは少数の単結晶のみを得ることができる微小液滴の半径を、単結晶としたい物質について、溶液中の物質消費速度、物質初期濃度、物質の拡散定数から求めるものである。
【０１４３】
また、本発明の器具は、前記の微小液滴を用いることで、１つの液滴中に、１個もしくは少数の単結晶を得ることを可能とする器具である。
【０１４４】
また、本発明の器具は、キャピラリー状の円筒管である。
【０１４５】
また、本発明の方法および器具では、結晶化させたい対象物質がタンパクである。
【０１４６】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明は、重力環境下での微小液滴と、微小重力下での液滴との内部流体挙動の類似性に着目し、微小液滴中に少なくとも１個の結晶を得る技術である。この技術は、特に、Ｘ線による結晶構造解析に好適である。また、現状では、バッチ法により多数の結晶が生じる状況下において結晶化条件の探索を行っているゆえ、その結晶化条件を自動探索するロボットに、上記の結晶取得装置および結晶取得方法を組み込むことも可能である。
【符号の説明】
【０１４８】
１ 液滴調製器具
２ 結晶成長用容器（キャピラリー）
１０ 微小液滴
１１ 結晶
ｑ 物質消費速度
Ｃ０ 物質初期濃度
Ｄ 拡散定数
Ｒｃ 移動可能最大距離
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小液滴中に少なくとも１個の結晶を取得する結晶成長用容器、液滴調製器具および結晶取得方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質に代表される物質の単結晶化と、その構造解析による立体構造の決定とにおいては、液滴中に少なくとも１個の結晶を生成させること、または個々の結晶を離れた場所に生成することが求められている。すなわち、個々の結晶が合体せずに離れていることが求められている。これは、Ｘ線を用いた構造解析装置などの高性能化（例えば、結晶に照射されるＸ線の高出力化、当該結晶で散乱したＸ線を検出する検出器の高性能化など）に起因している。なお、この解析においては、対象となる結晶が必ずしも大きいことは要求されない。
【０００３】
例えば非特許文献１には、このような結晶化を達成する環境としては、宇宙等の微小重力下での結晶化法が報告されている。微小重力環境下では、速度論的条件と物質の輸送とが絶妙に制御されることにより、タンパク質の結晶が成長するので、結果として拡散律速による結晶成長が可能となっている。そのため、一般的に、宇宙で得られる単結晶は大きく、結晶格子の完全性が高い。すなわち、宇宙等の微小重力環境は、結晶成長にとって好都合であるといえる。
【０００４】
また、上記のように、少なくとも１個の結晶を得る技術としては、例えば非特許文献２〜４が挙げられる。非特許文献２では理論的制御によって、非特許文献３では速度論的制御によって、それぞれ「少なくとも１個の核発生」を達成したことが報告されている。また、非特許文献４では、マイクロ流体の技術（例えばマイクロリアクター）を用いて、核発生とその成長とを分離して制御することにより、液滴中に少なくとも１個の結晶を得たことが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】F. Rosenberger, P. G. Vekilov, M. Muschol and B. R. Thomas, J. Crystal Growth, 1996, 168, 1-27
【非特許文献２】D. Kashchiev, D. Clausse, C. Jolivet-Dalmazzone, Journal Colloid and Interface Science 1994, 165, 148-153
【非特許文献３】P. Laval, J. Salmon, M. Joanicot, Journal of Crystal Growth 2007, 303, 622-628.
【非特許文献４】J. Shim, G. Cristobal, D. R. Link, T. Thorsen, S. Fraden, Crystal Growth & Design 2007, 7, 2192-2194.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１には、微小重力環境である宇宙などでの実験を行うことで拡散律速による結晶成長を達成可能であると開示されている。しかし、宇宙に行って当該実験を行うことは、費用面などの問題から容易ではない。また、宇宙にて当該実験を行うことができたとしても、その実験の時間は制限され、十分な実験を行うことができない可能性がある。それゆえ、シミュレーション、または、微小重力の代替環境での実験のような、低額でかつ容易に、上記拡散律速による結晶成長を達成する手法が要求されている。
【０００７】
また、非特許文献２〜４の手法または技術では、液滴中に少なくとも１個の結晶を成長させることについては開示されているが、拡散律速による結晶成長については何ら開示されていない。さらに、これらの手法または技術では、当該手法または技術を適用できる物質に制限があり、また、複雑な処理を要していた。
【０００８】
また、非特許文献１〜４の技術では、地上などの重力環境下において、そのような結晶成長を達成することを目的としていなかった。なお、拡散律速による結晶成長でなければ、微小液滴内に少なくとも１個の結晶を成長させるときの当該微小液滴の大きさを定義（推定）することができない。
【０００９】
一方、本発明の発明者は、重力環境下における微小液滴の内部における物質の挙動（内部流体挙動）と、微小重力下における液滴の内部流体挙動との類似性に着目し、地上において微小液滴を用いての拡散律速による結晶成長を達成するに至った。当然ながら、本発明の発明者によって初めて、その微小液滴の大きさを定義した上で、上記の拡散律速による結晶成長を達成させる技術が見出された。
【００１０】
本発明は、上記の問題を解決するためになされたもので、その目的は、微小液滴中に少なくとも１個の結晶を効率よく取得することが可能な結晶成長用容器、液滴調製器具および結晶取得方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る結晶成長用容器は、上記の課題を解決するために、物質の結晶を成長させるための結晶成長用容器であって、上記結晶成長用容器の内部には、結晶化させる物質を含む溶液の微小液滴が配置されており、上記微小液滴は、上記微小液滴の最長部の長さが、上記結晶化させる物質の自然拡散により移動できる最大距離を示す移動可能最大距離以下となるような大きさに調製されていることを特徴としている。
【００１２】
上記構成によれば、結晶成長用容器には微小液滴が配置されているので、その微小液滴中の密度差によって駆動される対流が抑制される。これにより、拡散律速による結晶成長を達成することができる。そして、この結晶成長の達成により、上記結晶成長用容器の内部に配置された微小液滴中において、物質が自然拡散でしか移動しない環境が整うことになる。そのため、その微小液滴中に物質の結晶を拡散律速により発生させることができる。
【００１３】
また、結晶成長用容器の内部に配置される微小液滴は、その最長部の長さが最大可能移動距離以下となるような大きさに調製されているので、微小液滴中に物質の結晶を確実に成長させ、かつその個数を少なくとも１個に抑制することができる。すなわち、本発明の結晶成長用容器では、微小液滴中に少なくとも１個の物質の結晶を、効率よく成長させることができる。
【００１４】
さらに、本発明に係る結晶成長用容器では、上記微小液滴の周囲は、当該微小液滴とは相溶でない媒体物質で満たされていることが好ましい。
【００１５】
上記構成によれば、微小液滴が、外部と物質の出入りのない孤立した状態となるため、結晶成長用容器を乱暴に扱わない限り、その微小液滴中で成長する結晶が、他の微小液滴あるいはその他の物質と合体することがない。そのため、結晶の解析を容易に行うことができる。
【００１６】
さらに、本発明に係る結晶成長用容器では、上記微小液滴の大きさは、その微小液滴中の密度差によって駆動される対流が抑制される大きさであることが好ましい。
【００１７】
上記構成によれば、微小液滴が、密度差によって駆動される対流が抑制される大きさに調製されていることにより、拡散律速による結晶成長を生じさせることができる。
【００１８】
さらに、本発明に係る結晶成長用容器では、上記微小液滴が配置される上記内部の最短部の長さが、上記微小液滴の最長部の長さと同一であることが好ましい。
【００１９】
上記構成によれば、結晶成長用容器の内部に、確実に微小液滴を配置することができる。
【００２０】
さらに、本発明に係る結晶成長用容器では、上記結晶化させる物質は、タンパク質であることが好ましい。
【００２１】
上記構成によれば、タンパク質の拡散定数を用いて求められる移動可能最大距離は、微小液滴中の対流を効率よく抑制できる値に近い。すなわち、拡散定数を用いて移動可能最大距離が求められる場合、微小液滴中に結晶化させる物質としてタンパク質を用いることにより、上記対流を効率よく抑制でき、拡散律速による結晶成長を達成しやすくすることができる。
【００２２】
さらに、本発明に係る結晶成長用容器は、円筒状のキャピラリーであることが好ましい。
【００２３】
上記構成によれば、結晶成長用容器が、一般的に用いられる結晶構造解析装置と親和性の高いキャピラリーにより実現されるので、汎用性が高い容器を提供できる。
【００２４】
さらに、本発明に係る結晶成長用容器は、微小液滴中に成長させた、上記結晶化させる物質の結晶を、結晶の構造を解析する結晶構造解析装置の解析対象とすることが好ましい。
【００２５】
上記構成によれば、結晶成長用器具において結晶化させた物質の結晶を、結晶構造解析装置の解析対象にしている。すなわち、物質の結晶を成長させた結晶成長用容器を、結晶解析構造装置が備える試料台にそのままセットすることが可能となる。それゆえ、従来のように、結晶を成長させた器具から取り出して、結晶解析構造装置の試料台にセットするといった手間を省くことができる。
【００２６】
さらに、本発明に係る液滴調製器具は、上記に記載の結晶成長用容器に接続され、上記微小液滴を調製して、当該結晶成長用容器に送液することが好ましい。
【００２７】
上記構成によれば、液滴調製器具は、結晶化させる物質を結晶としてその内部に成長させることが可能な微小液滴を調製し、結晶成長用容器に、その調製された微小液滴を送液する。それゆえ、結晶化させる物質を含む、その大きさが制限された微小液滴を、結晶成長用容器に配置することができる。
【００２８】
さらに、本発明に係る結晶取得方法は、物質の結晶を取得するための結晶取得方法であって、上記物質が、微小液滴中を自然拡散により移動できる最大距離を示す移動可能最大距離を、下記（１）、（２）、および（３）に示すパラメータから推定する推定工程と、（１）上記物質の結晶が成長することにより、上記物質を含む溶液中の当該物質が消費される速度である物質消費速度；（２）上記物質の拡散が開始されたときの、上記微小液滴に対する上記物質の濃度である物質初期濃度；（３）上記物質の拡散定数；上記推定工程により推定された上記移動可能最大距離に基づく大きさとなるように、上記微小液滴を調製する調製工程と、上記調製工程により調製された上記微小液滴中に、上記物質の結晶を少なくとも１個成長させる成長工程と、を含むことを特徴としている。
【００２９】
上記構成によれば、その微小液滴中の密度差によって駆動される対流が抑制される。これにより、拡散律速による結晶成長を達成することができる。そして、この結晶成長の達成により、物質が自然拡散でしか移動しない環境が整うため、上記のような物質の移動可能最大距離の推定を行うことができる。
【００３０】
また、上記の推定工程により、拡散律速による結晶成長の対象となる物質ごとに（物質の制限なく）、単純かつ汎用的に上記の移動可能最大距離を推定することができるので、上記結晶の取得を容易に行うことを可能とする。
【００３１】
そして、上記の推定工程により得られた移動可能最大距離に基づく大きさの微小液滴を調製し、その微小液滴中に少なくとも１個の結晶を成長させることにより、微小液滴中に結晶を効率よく成長させることができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明に係る結晶成長用容器は、以上のように、上記結晶成長用容器の内部には、結晶化させる物質を含む溶液の微小液滴が配置されており、上記微小液滴の最長部の長さが、上記結晶化させる物質の自然拡散により移動できる最大距離を示す移動可能最大距離以下となるような大きさに調製されている構成である。
【００３３】
また、本発明に係る結晶成長方法は、以上のように、上記物質が、微小液滴中を自然拡散により移動できる最大距離を示す移動可能最大距離を、下記（１）、（２）、および（３）に示すパラメータから推定する推定工程と、（１）上記物質の結晶が成長することにより、上記物質を含む溶液中の当該物質が消費される速度である物質消費速度；（２）上記物質の拡散が開始されたときの、上記微小液滴に対する上記物質の濃度である物質初期濃度；（３）上記物質の拡散定数；上記推定工程により推定された上記移動可能最大距離に基づく大きさとなるように、上記微小液滴を調製する調製工程と、上記調製工程により調製された上記微小液滴中に、上記物質の結晶を少なくとも１個成長させる成長工程と、を含む方法である。
【００３４】
それゆえ、本発明の結晶成長用容器および結晶取得方法では、微小液滴中に少なくとも１個の物質の結晶を、効率よく成長させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の一実施形態に係る結晶成長用容器の一例を示すものであり、その内部に、成長した物質の結晶を含む微小液滴が配置された様子を示す図である。
【図２】上記結晶成長用容器に接続される液滴調製器具の一例を示す図である。
【図３】上記液滴調製器具の主流路および副流路の構成の一例を示す模式図である。
【図４】上記結晶成長用容器に配置された微小液滴中にソーマチンの結晶を成長させたときの、当該結晶の個数についての実験結果の一例を示すものであり、（ａ）は、上記結晶成長用容器の内径が３６０μｍであるときの実験結果の一例を示すものであり、（ｂ）は、上記結晶成長用容器の内径が２００μｍであるときの実験結果の一例を示すものであり、（ｃ）は、上記結晶成長用容器の内径が１３０μｍであるときの実験結果の一例を示すものである。
【図５】上記結晶成長用容器に配置された微小液滴中にリゾチームの結晶を成長させたときの、当該結晶の個数についての実験結果の一例を示すものであり、（ａ）は、上記結晶成長用容器の内径が３６０μｍであるときの実験結果の一例を示すものであり、（ｂ）は、上記結晶成長用容器の内径が２００μｍであるときの実験結果の一例を示すものである。
【図６】本実施形態に係る結晶取得装置の構成の一例を示すブロック図である。
【図７】本実施形態に係る結晶取得方法において微小液滴の大きさの推定するときのモデルとなる微小球殻の一例を示す図である。
【図８】本実施形態に係る結晶取得装置における処理を含む結晶取得方法の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明の実施の一形態について図１〜図８に基づいて説明すれば、以下のとおりである。説明の便宜上、図面に示した部材と同一の機能を有する部材については、同一の符号を付し、その説明を省略する。
【００３７】
〔本発明の概要〕
＜本発明に至った背景＞
本実施形態の結晶成長用容器に配置される微小液滴は、様々な用途に活用される。特に、ドラッグデリバリー、あるいはその他のバイオメディカルの分野において用いられている。これは、例えば、微小液滴をテンプレートとして用いることで、大きさの均一性が高いリポソームを調製したり、高い内包化効率を達成したりするなど、リポソームを高度に制御することができるためである。上記の分野では、このように高度に制御されたリポソームが必要不可欠である。また、微小液滴は、小さな拡散距離、および大きな比表面積という特性を有しているので、その微小液滴中で物質の化学反応を効率よく行わせることができることも、様々な用途に利用される一因である。
【００３８】
なお、微小液滴を上記の用途に用いるためには、高度に制御された微小液滴を大量に調製する必要がある。このような調製には、単分散で大きさが制御された微小液滴を再現性よく大量に作るための道具として、マイクロ流体の技術（例えばマイクロリアクター）が有用である。
【００３９】
また、微小液滴は、その強い表面張力により、その内部では、密度差によって駆動される対流（密度差駆動対流）ではなく、マランゴニ対流が支配的な内部流動となるという特徴的な内部流体挙動を示す。
【００４０】
微小重力環境下では、密度差駆動対流が起こらないため、微小液滴の内部ではマランゴニ対流だけが起こる。そのため、微小重力環境下では、速度論的条件と物質の輸送とが絶妙に制御された環境が物質の結晶成長にもたらされ、結果として、拡散律速による結晶成長が可能となる。そのため、一般的に、宇宙などの微小重力環境下では、大きくて結晶格子の完全性が高い結晶（単結晶）を成長させることが可能である。
【００４１】
しかし、微小重力環境は、結晶成長にとって好都合なものではあるが、当該環境に簡単に行くことが可能であるわけでもなく、当該環境では、結晶成長に係る実験の時間も制限される。それゆえ、シミュレーション、または、微小重力の代替環境での実験のような、低額でかつ容易に、上記拡散律速による結晶成長を達成する手法が要求されていた。
【００４２】
＜本発明の概要＞
そこで、本発明者は、地上などの重力環境下での微小液滴と、宇宙などの微小重力下での液滴（必ずしも「微小」ではない）との内部流体挙動の類似性（すなわち、微小液滴中の密度差によって駆動される対流が抑制される点）に着目し、重力環境下において微小重力環境を再現する技術の可能性について研究を行った。その結果、大きくて格子の完全性が高い結晶を得ることが可能な拡散律速による結晶成長を、重力環境下において微小液滴を用いることで成功した。
【００４３】
なお、微小液滴を用いた結晶化方法としては、例えば、表面拡散法、二層流体、容器中での拡散法などが報告されているが、これらの方法では、地上などの重力環境下において、拡散律速による結晶成長を達成することを目的としていなかった。
【００４４】
これらの検討を踏まえ、本発明者は、微小液滴の最長部の長さが、結晶化させる物質の自然拡散により移動できる最大距離を示す移動可能最大距離以下となるように調製された微小液滴を配置した結晶成長用容器を実現するに至った。
【００４５】
これにより、この結晶成長用容器の内部には、最長部の長さが最大可能移動距離以下である微小液滴が配置されることになるため、微小液滴中に物質の結晶を効率よく成長させ、かつその個数を少なくとも１個（例えば、１〜３個程度）に抑制することができる。
【００４６】
また、上記結晶成長用容器においては、拡散律速による結晶成長を達成するために、その微小液滴の大きさが、その微小液滴中の密度差によって駆動される対流が抑制される大きさとなるように調製されている。
【００４７】
さらに、本発明者は、外部と物質の出入りのない「孤立した」微小液滴中での結晶化の背景について理論的な研究を行った。すなわち、本発明者は、上述した微小液滴の内部流体挙動の理論的な考察によって、外部との物質のやり取りのない「孤立した」微小液滴の内部に、少なくとも１個だけ結晶を得ることに注目した。これを実現すべく、本実施形態に係る結晶成長用容器においては、微小液滴の周囲が、当該微小液滴とは相溶でない媒体物質で満たされるように、当該微小液滴が配置されている。
【００４８】
また、本発明者は、１つの微小液滴中に１つの結晶を得るための当該結晶の大きさの見積もり（推定）を行い、その結果、その見積もられた大きさと、実際の実験で得られた微小液滴の大きさとが概ね一致することを確認した。
【００４９】
この検討を踏まえ、本発明者は、上記移動可能最大距離を、
（１）上記物質の結晶が成長することにより、上記物質を含む溶液中の当該物質が消費される速度である物質消費速度
（２）上記物質の拡散が開始されたときの、上記微小液滴に対する上記物質の濃度である物質初期濃度
（３）上記物質の拡散定数
に示すパラメータから推定し、その推定した移動可能最大距離に基づく大きさとなるように、微小液滴を調製し、当該微小液滴中に、物質の結晶を少なくとも１個成長させる結晶取得方法を実現するに至った。これにより、単純かつ汎用的に上記移動可能最大距離を推定することができるので、上記結晶の取得を容易に行うことを可能とする。そして、その推定された移動可能最大距離に基づく大きさの微小液滴を調製し、その微小液滴中に少なくとも１個の結晶を成長させることにより、微小液滴中に結晶を効率よく成長させることができる。
【００５０】
また、本発明者は、上記結晶成長用容器に配置した微小液滴中に成長させた、結晶化させる物質の結晶を、結晶の構造を解析する結晶構造解析装置の解析対象とする結晶成長用容器を実現するに至った。
【００５１】
一般に、結晶構造解析装置において決定されるタンパクの立体構造は、分子生物学または創薬の分野では、最も基本的で重要な情報源となる。その立体構造の決定の前段階として、結晶を成長させる工程を必要とする。従来は、その結晶を成長させた後、成長させた容器からその結晶を取り出して、結晶構造解析装置の試料台（ゴニオステージ）に載置するという手作業が生じていた。
【００５２】
しかし、本実施形態では、上記のように成長させた結晶を含む結晶成長用容器を、結晶構造解析装置の解析対象とすることにより、結晶を取り出すという工程を生じさせることなく、最終的な解析対象である結晶を、結晶構造解析装置に提供することができる。すなわち、微小液滴中に少なくとも１個だけ結晶を成長させ、その結晶を結晶成長用容器から取り出さずにそのまま結晶構造解析装置に提供することが可能となる。
【００５３】
また、結晶構造解析において、少なくとも１個の結晶が成長した微小液滴が配置された結晶成長用容器から、当該結晶を取り出さなくてもよいので、当該結晶成長用容器を、その構造解析にも対応可能な「結晶構造解析支援器具」として用いることができる。
【００５４】
なお、本実施形態の結晶成長用容器に配置された、その大きさが調整された微小液滴では、物質が自然拡散でしか移動しない環境が整うことになる。そのため、その微小液滴の内部で最初の１個の核発生後、物質の濃度勾配を生じさせることができ、その結果、「制御された」過飽和状態の解消を実現することができる。それゆえ、拡散律速により、微小液滴中に結晶を成長させるときに、その微小液滴中に当該結晶を「１個だけ」成長させることも可能となる。
【００５５】
〔実験系〕
＜液滴調製器具＞
次に、図２および図３を用いて、本実施形態に係る結晶成長用容器２に配置される微小液滴１０を調製する液滴調製器具１について説明する。図２は、結晶成長用容器２に接続される液滴調製器具１の一例を示す図である。また、図３は、液滴調製器具１の主流路１ａおよび副流路１ｂの構成の一例を示す模式図である。
【００５６】
図２に示すように、液滴調製器具１は、例えば、結晶成長用容器２（キャピラリー）に接続され、微小液滴１０（図１参照）を調製して、当該結晶成長用容器２に送液するものである。液滴調製器具１では、微小液滴１０を所定の大きさ（移動可能最大距離Ｒｃ以下となるような大きさ）に調製するために、その内部に送液される物質の種類、濃度、流速などが制御される。
【００５７】
液滴調製器具１は、例えば、マイクロ流路デバイスにより実現されている。本実施形態では、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなるマイクロ流路デバイスが使用される。その構造は、従来から用いられているマイクロ流路デバイスと同様であるので、ここではその具体的な説明は省略する。
【００５８】
また、図３に示すように、液滴調製器具１は、少なくとも主流路１ａおよび副流路１ｂを備えている。物質の結晶１１（図１参照）をその内部に少なくとも１つ成長させることが可能な微小液滴１０を調製するために、副流路１ｂから、結晶化させる物質を含む溶液、沈殿剤溶液およびフッ化物系オイルが送液される。結晶化させる物質を含む溶液および沈殿剤溶液は、互いに相溶であり、合体することにより微小液滴１０が調製される。また、フッ化物系オイルは、微小液滴１０とは相溶でない媒体物質として機能する。このため、フッ化物系オイルは、調製された微小液滴１０の周囲を取り囲むことができ、微小液滴１０を「孤立した」状態で結晶成長用容器２の内部に配置することを可能にする。
【００５９】
具体的には、複数の副流路１ｂのうち、結晶成長用容器２に接続される側の副流路１ｂからフッ化物系オイルが送液され、結晶成長用容器２に接続される側から離れた位置に設けられている副流路１ｂから、上記結晶化される溶液および沈殿剤溶液が送液される。図３に示す例では、当該溶液としてはタンパク質溶液が送液されている。
【００６０】
なお、上記の微小液滴１０と相溶でない媒体物質は、微小液滴１０の「孤立した」状態を実現可能であれば、フッ化物系オイルに限られないが、上記結晶化される溶液および沈殿剤溶液と極端に大きな密度差がないことが好ましい。
【００６１】
複数の副流路１ｂは、主流路１ａに接続され、その主流路１ａの一端が結晶成長用容器２に接続される。これにより、副流路１ｂから各種材料（各種溶液）が送液されることにより、主流路１ａにおいて微小液滴１０が調製される。なお、本実施形態では、微小液滴１０が液滴調製器具１の内部で所定の大きさになる調整され、結晶成長用容器２に送液されるものとして説明するが、これに限らず、液滴調製器具１に接続された結晶成長用容器２において、微小液滴１０が所定の大きさとなるまで調製されてもよい。
【００６２】
図３に示す例では、主流路１ａの断面（各種材料が流れる方向に対して垂直な面）は、結晶成長用容器２に接続される一端の断面が１００μｍ×２００μｍの長方形、それ以外の部分が１００μｍ×１００μｍの正方形となっている。また、副流路１ｂの断面も、１００μｍ×１００μｍの正方形となっている。結晶成長用容器２に接続される一端の断面が、それ以外の部分の断面に比べて大きいのは、各種材料の結晶成長用容器２への送液を容易にするためである。
【００６３】
なお、副流路１ｂの設け方、副流路１ｂの個数、副流路１ｂと送液される材料との関係（どの副流路１ｂからどの材料が送液されるか）、並びに、主流路１ａおよび副流路１ｂの寸法は、あくまで一例であって、物質の結晶１１をその内部に少なくとも１つ成長させることが可能な微小液滴１０を調製できる構成であれば、これらに限定されない。
【００６４】
＜結晶成長用容器＞
次に、図１を用いて、本実施形態に係る結晶成長用容器２について説明する。図１は、結晶成長用容器２の一例を示すものであり、その内部に、成長した物質の結晶１１を含む微小液滴１０が配置された様子を示す図である。
【００６５】
結晶成長用容器２は、物質の結晶１１を成長させるためのものであって、その内部に、結晶化させる物質を含む溶液の微小液滴１０が配置（配列）されているものである。また、配置された微小液滴１０の最長部の長さが、移動可能最大距離Ｒｃ以下となるような大きさに調製されている。
【００６６】
本実施形態では、結晶成長用容器２は、テフロン（登録商標）からなるキャピラリー（テフロンキャピラリーチューブ）であり、図１に示す例では、その内径が２００μｍである。以下の実験例では、４つの異なる内径（１３０、２００、３６０および５００μｍ）を有する円筒状のキャピラリーが結晶成長用容器２として用いられている。なお、どの内径を有する結晶成長用容器２を用いたとしても、接続される液滴調製器具１の大きさは共通である。
【００６７】
また、図１に示す例では、３つの微小液滴１０が配置されている。また、その形状は略「真球」であり、結晶成長用容器２の内径と略同一の直径を有している。すなわち、微小液滴１０が配置される、結晶成長用容器２の内部の最短部の長さは、微小液滴１０の最長部の長さと同一となっている。そして、その微小液滴１０の内部には、結晶１１が成長している。
【００６８】
なお、その形状は、真球に限られることはなく、細長い形状であってもよい。なお、本実施形態に係る「移動可能最大距離Ｒｃ」は、真球の微小液滴１０に対して定義される場合、その「直径」ではなく「半径」を指すものとなる。
【００６９】
＜実施例＞
次に、上述した液滴調製器具１および結晶成長用容器２を用いて、微小液滴１０が調製され、その内部に結晶１１を成長させたときの一実施例（実験例）を説明する。なお、以下に説明する実施例は、あくまで一実施例であって、本実施形態の液滴調製器具１、結晶成長用容器２およびこれらを利用した結晶取得方法を限定的に解釈させるものではない。また、以下では、液滴調製器具１と結晶成長用容器２とが接続されているものとして説明する。
【００７０】
この実施例では、結晶化させる物質として、タンパク質が用いられる。タンパク質の拡散定数Ｄを用いて（すなわち、後述の式（６）を用いて）推定される移動可能最大距離Ｒｃは、微小液滴１０中の密度差駆動対流を効率よく抑制できる値に近い。それゆえ、結晶化させる物質としてタンパク質を用いた場合、上記推定値から微小液滴１０を調製することができるので、タンパク質の、微小液滴１０中での上記対流を効率よく抑制でき、拡散律速による結晶成長を達成しやすくすることができる。そして、タンパク質に関する実験は、特にバイオメディカルの分野において数多く行われている。それゆえ、結晶成長用容器２は、特にバイオメディカルの分野において有効に適用することができる。
【００７１】
この実験では、ソーマチンというタンパク質をモデルとしている。これは、ソーマチンが典型的に当該モデルとして多用され、マクロスケールでの結晶化、その速度論解析などにおいて、非常によく研究されているためである。また、液滴調製器具１としては、ＰＤＭＳからなるマイクロ流体デバイス、結晶成長用容器２としては、テフロンキャピラリーチューブを使用した。テフロンキャピラリーチューブは、４つの異なる内径（１３０、２００、３６０および５００μｍ）を有するものを準備することにより、その４つの異なる内径にあわせて「真球の」微小液滴１０が調製された。
【００７２】
また、液滴調製器具１の副流路１ｂから、タンパク質溶液および沈殿剤溶液が送液され、主流路１ａから、フッ化物系オイルが送液される。タンパク質溶液は、２０ｍｇ／ｍＬの濃度のソーマチンを、１００ｍＭのＮ−（２−アセトアミド）イミノ２酢酸（ＡＤＡ）緩衝溶液（ｐＨ６．５）に溶解したものである。沈殿剤溶液は、１．６Ｍの酒石酸カリウムナトリウムを、５０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝溶液（ｐＨ７．０）に溶解したものである。また、フッ化物系オイルは、フッ素系不活性液体（住友スリーエム製のフロリナート（登録商標））と、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロ−１−オクタノールとを、１０：１の体積比で混合したものである。
【００７３】
副流路１ｂから送液されたタンパク質溶液と沈殿剤溶液とは、主流路１ａにおいて合流し、互いに混ざり合って、当該主流路１ａ中で１つの微小液滴１０となる。タンパク溶液と沈殿剤溶液とは略同一の流速となるように制御される。また、フッ化物系オイルは、調製される微小液滴１０の周囲を取り囲み、当該微小液滴１０の「孤立した」状態を実現するために、タンパク質溶液および沈殿剤溶液が送液される副流路１ｂとは異なる２つの副流路１ｂから送液される。フッ化物系オイルについても、上記流速と略同一の流速となるように制御される。そして、これらの流速を微調整することにより、真球の微小液滴１０を調製した。
【００７４】
所定の大きさに調製された微小液滴１０が結晶成長用容器２に送液される、あるいは結晶成長用容器２にて所定の大きさの微小液滴１０が調製されることにより、結晶成長用容器２の内部に配置される。所定の大きさの微小液滴１０が配置された後、上記材料の送液を中止し、結晶成長用容器２を液滴調製器具１から取り外し、その両端をワックスにて封止した。そして、微小液滴１０が配置された結晶成長用容器２を約４℃で保管し、当該微小液滴１０中でタンパク質の結晶成長が完了するまでの間、撮像装置による撮像を行うことで、当該結晶成長の過程を観察した。
【００７５】
＜実験結果＞
上記実験において調製された微小液滴１０は、その強い表面張力により、自然に歪んで潰れてしまうようなことはなかった。また、結晶成長用容器２の内部に微小液滴１０が配置され、結晶１１が成長し始めてから、その成長が止まるまで、おおよそ数時間かかった。
【００７６】
ここで、上記実験は、上記４つの結晶成長用容器２について行われた。それぞれの結晶成長用容器２に配置された、１００〜２００個の微小液滴１０を観察し、その微小液滴１０中で成長した結晶１１の数を数えた。その結果が表１に示されている。なお、表１においては、結晶１１の数を、上記複数の微小液滴１０で観察された数の平均値±標準偏差で示している。
【００７７】
【表１】
【００７８】
表１に示すように、３６０μｍ、２００μｍ、１３０μｍの内径を有する結晶成長用容器２のそれぞれに配置された微小液滴１０中（この実験では、当該内径と微小液滴１０の直径とが略同一）には、およそ１個の結晶１１を確認できた。一方、５００μｍの内径を有する結晶成長用容器２に配置された微小液滴１０中には、およそ２個の結晶１１を確認できた。
【００７９】
＜アブラミの式による結晶成長の検討＞
ここで、結晶成長の機構を検討するため、結晶成長の速度論解析に用いられるアブラミの式による解析を行った。ここで、式（１）において、αは結晶１１の成長割合（α＝１は結晶成長終了、α＝０は結晶１１が生じる前、すなわちすべてのタンパク質が溶液中に溶けている状態）、ｋは結晶化の速度定数、ｔは結晶成長にかかる時間を示す。また、アブラミ指数ｍは、核発生と結晶成長との基本的な情報を反映するものである。
【００８０】
【数１】
【００８１】
この検討においては、３６０μｍの直径を有する微小液滴１０、２００μｍの直径を有する微小液滴１０、１３０μｍの直径を有する微小液滴１０について、それぞれ約１０個の微小液滴１０中における結晶成長の過程を観察した。そして、結晶成長にかかった時間と結晶１１の大きさとから、アブラミ指数ｍを求めた。その結果、アブラミ指数ｍは、微小液滴１０がいずれの直径の場合であっても、１．５程度となった。
【００８２】
上述のソーマチンを用いた実験では、微小液滴１０中で成長した結晶１１が、見た目で明らかに３次元的なものであったことから、ｍ≒１．５が示す意味は、核発生速度が無限大であること、かつ拡散律速による結晶成長であることを意味する。「核発生速度が無限大である」という結果は、１つの結晶１１が１つの微小液滴１０中に発生し、成長するという結果と一致している。また、「拡散律速による結晶成長」という結果は、微小液滴１０中の密度差による対流が十分に抑えられていることを意味する。
【００８３】
＜更なる実験例＞
（ソーマチンの場合）
次に、図４を用いて、結晶化させる物質としてソーマチンを用いた場合の更なる実験結果の一例について説明する。図４の（ａ）は、結晶成長用容器２の内径が３６０μｍであるときの実験結果の一例、（ｂ）は、結晶成長用容器２の内径が２００μｍであるときの実験結果の一例、（ｃ）は、結晶成長用容器２の内径が１３０μｍであるときの実験結果の一例を、それぞれ示すものである。
【００８４】
図４は、上記表１と同様、１個の微小液滴１０中で成長する結晶１１の個数と、微小液滴１０の大きさに関する値とを示すものである。更なる実験例についても、上述した実験例と同様の手順で実験を行ったが、微小液滴１０の形状が真球形状に限らず、非真球形状（細長い形状）となるように調製されたものも含まれる。
【００８５】
例えば、図４の（ａ）では、実験結果（ア）〜（オ）を得た。実験結果（ア）の場合、微小液滴１０の体積が最も大きく、横長（細長い形状）の微小液滴１０が確認できた。そして、その微小液滴１０中の結晶１１の個数は約３個であった。一方、実験結果（オ）の場合、微小液滴１０の体積が最も小さく、略真球の微小液滴１０を確認できた。そして、その微小液滴１０中の結晶１１の個数は約１個であった。
【００８６】
つまり、真球に近い形状に微小液滴１０ほど、その体積が小さい、すなわち移動可能最大距離Ｒｃよりも小さな液滴であるがゆえ、微小液滴１０中に１個の結晶１１を成長させやすいといえる。微小液滴１０それぞれは、「孤立した」状態で結晶成長用容器２に配置されているので、その微小液滴１０に１個の結晶１１だけが成長している状態であれば、それだけ結晶１１の解析を容易に行うことができる。一方、微小液滴１０中に結晶１１が例えば２〜３個（すなわち、複数個）含まれていても、結晶１１の解析に支障がない場合には、微小液滴１０の体積を大きく（すなわち、非真球形状に）成長させてもよい。
【００８７】
また、上記表１の結果は、内径５００μｍの結晶成長用容器２においてその内径にあわせて微小液滴１０が調製された場合、真球の微小液滴１０を得ることはできなかったことを示している。これは、短軸の長さが５００μｍを超える液滴では、比表面積の減少により、相対的に表面張力が減少し、自重によって液滴がひずむため、真球形状の液滴を得ることができなかったためと考えられる。したがって、この結果は、その長さが５００μｍを超えるような微小液滴１０においては、真球の微小液滴１０を得ることはできないことを意味する。
【００８８】
また、図４（ｂ）および（ｃ）に示すように、２００μｍおよび１３０μｍの内径を有する結晶成長用容器２のそれぞれについても、上記と同様、その内部に配置された微小液滴１０の体積が大きければ、その内部で成長する結晶１１の個数が多くなる（図４の（ｂ）および（ｃ）それぞれの実験結果（ア）を参照）。一方、微小液滴１０の体積が小さくなるほど、その内部で成長する個数も減り、真球に近い形状である場合には、その内部に成長する結晶１１の個数を約１個に制御することができる（図４の（ｂ）の実験結果（コ）、（ｃ）の実験結果（イ）を参照）。
【００８９】
（リゾチームの場合）
次に、図５を用いて、結晶化させる物質としてリゾチームを用いた場合の更なる実験結果の一例について説明する。
【００９０】
図５は、上記ソーマチンと同様、１個の微小液滴１０中で成長する結晶１１の個数と、微小液滴１０の大きさに関する値とを示すものである。また、図５は、ソーマチンと同様の手順で実験を行った場合の実験結果を示している。
【００９１】
例えば、図５の（ａ）（内径が３６０μｍの場合）では、実験結果（ア）および（イ）を得た。両結果とも、微小液滴１０の体積が小さく、略真球の微小液滴１０を確認できた。そして、その微小液滴１０中の結晶１１の個数は約１〜２個であった。また、図５の（ｂ）（内径が２００μｍの場合）では、実験結果（ア）および（イ）を得た。実験結果（ア）では、微小液滴１０中の結晶１１の個数は約１〜２個であり、実験結果（イ）では、その微小液滴１０中の結晶１１の個数は約１個に満たなかった。
【００９２】
この結果から、ソーマチンと同様、所定の大きさ（少なくとも直径２００〜３６０μｍの大きさ）の微小液滴１０中に約１個の結晶１１を成長させることができるがわかる。すなわち、本実施形態の結晶成長用容器２は、ソーマチン以外の物質の結晶化においても、所定の大きさを有する微小液滴１０を配置することにより、密度差駆動対流が抑制された結果としての拡散律速による結晶成長を実現することができるとともに、その微小液滴１０中に少なくとも１個の物質の結晶を成長させることができる。
【００９３】
〔結晶取得装置および結晶取得方法〕
次に、図６および図７を用いて、結晶取得装置３の構成について説明する。図６は、本実施形態に係る結晶取得装置３の構成の一例を示すブロック図である。また、図７は、微小液滴１０の大きさの推定するときのモデルとなる微小球殻の一例を示す図である。
【００９４】
図６に示すように、結晶取得装置３は、物質の結晶１１を取得するための装置であり、例えば、制御部４、記憶部５および操作部６を備えている。結晶取得装置３は、液滴調製器具１および結晶成長用容器２とともに、物質の結晶１１を取得するための結晶取得システム２０に含まれ、液滴調製器具１と接続され、各種溶液の流速などを調整することにより、当該溶液への液滴調製器具１の送液を制御するものである。
【００９５】
制御部４は、例えば制御プログラムを実行することにより、結晶取得装置３を構成する部材を制御するものである。制御部４は、記憶部５に格納されているプログラムを、例えばＲＡＭ（Random Access Memory）等で構成される一次記憶部（不図示）に読み出して実行することにより、例えば、微小液滴１０の移動可能最大距離Ｒｃの算出処理などの各種処理を行う。なお、移動可能最大距離Ｒｃは、最大距離推定部４２により推定される値である。
【００９６】
記憶部５は、制御部４が実行する（１）各部の制御プログラム、（２）ＯＳプログラム、（３）アプリケーションプログラム、および、（４）これらプログラムを実行するときに読み出す各種データを記録するものである。制御部４は、例えばＲＯＭ（Read Only Memory）フラッシュメモリなどの不揮発性の記憶装置によって構成されるものである。なお、上述した一次記憶部は、ＲＡＭなどの揮発性の記憶装置によって構成されているが、本実施形態では、記憶部５が一次記憶部の機能も備えているものとして説明する場合もある。記憶部５は、例えば、移動可能最大距離Ｒｃを算出するときに使用する数式などの各種データを格納している。
【００９７】
操作部６は、結晶成長用容器２に配置された微小液滴１０中に物質の結晶１１を取得するために、結晶取得装置３を操作する操作者が、結晶取得装置３に必要なデータを入力するために用いられるものであり、例えばキーボード、マウスなどで実現されている。その必要なデータとしては、例えば、最大距離推定部４２にて用いられる各種パラメータの値が挙げられる。
【００９８】
なお、操作部６は、結晶取得装置３とは異なる外部装置によって実現されていてもよい。この場合、結晶取得装置３のパラメータ取得部４１は、操作部６を介して取得した各種パラメータの値を、無線または有線通信媒体を介して取得してもよい。
【００９９】
次に、制御部４の構成について説明する。制御部４は、主として、パラメータ取得部４１、最大距離推定部４２および液滴調製制御部４３を備えている。
【０１００】
パラメータ取得部４１は、最大距離推定部４２が移動可能最大距離Ｒｃを推定する（算出する）際に用いる各種パラメータを取得するものである。例えば、パラメータ取得部４１が取得する各種パラメータの値は、制御部４が、その推定に必要となる各種パラメータの入力を促す入力画面を表示部（不図示）に表示させ、その入力画面に操作者が入力したものである。パラメータ取得部４１は、これらの値を記憶部５に一時保存する。
【０１０１】
パラメータ取得部４１が取得する各種パラメータとしては、
（１）物質の結晶１１が成長することにより、物質を含む溶液中で当該物質が消費される速度である物質消費速度ｑ
（２）物質の拡散が開始されたときの、微小液滴１０に対する物質の濃度である物質初期濃度Ｃ０
（３）物質の拡散定数Ｄ
の３つが挙げられる。上記（１）〜（３）のパラメータは、あくまで一例であって、例えば、最大距離推定部４２が、以下に示す方法以外の方法にて移動可能最大距離Ｒｃを推定する場合には、他のパラメータが取得されてもよい。例えば、パラメータ取得部４１は、物質消費速度として、一定値としての物質消費速度（以下の式（６）の「ｑ」）ではなく、実際の物質消費速度−ｒｐ、および結晶成長にかかった時間を取得してもよい。
【０１０２】
最大距離推定部４２は、パラメータ取得部４１が取得した各種パラメータを記憶部５から読み出し、その各種パラメータから移動可能最大距離Ｒｃを推定する。具体的には、以下のように得られる式（６）を用いて、移動可能最大距離Ｒｃを推定する。この推定においては、１個の微小液滴１０中に１個の結晶１１を得る場合を想定している。また、この推定では、真球の微小液滴１０の中心に結晶核が発生し、その核が成長していくという結晶成長過程を仮定している。この場合、結晶１１のごく近傍の物質の濃度は、その周辺部の物質の濃度よりも低い。このため、溶液中の物質の分子は、自然拡散によって結晶１１の表面まで移動し、その後結晶１１に吸収される。
【０１０３】
なお、以下では、物質がタンパク質であるものとして説明する。上述のように、タンパク質の拡散定数Ｄを用いて求められる移動可能最大距離Ｒｃは、微小液滴１０中の密度差駆動対流を効率よく抑制できる値に近いからである。この点を考慮しないのであれば、結晶化される物質がタンパク質である必要は必ずしもない。
【０１０４】
ここで、図７に示すような、半径Ｒの微小液滴１０中の、半径ｒの円と半径（ｒ＋ｄｒ）の円とで囲まれた微小球殻を仮定する。フィックの第一法則は、次の式（２）で示される。ここで、式（２）において、Ｎはタンパク質の拡散流束、Ｄはタンパク質の拡散係数、Ｃは微小液滴１０に対するタンパク質の濃度である。結晶核、および、結晶成長の初期段階における結晶１１の大きさは、結晶１１を成長させる微小液滴１０の大きさに対して十分に小さく無視できる。
【０１０５】
【数２】
【０１０６】
また、タンパク質についての物質収支式は、次の式（３）で表わされる。ここで、式（３）において、タンパク質の消費速度、すなわち、たんぱく質の結晶１１が成長することにより、タンパク質を含む溶液中で当該タンパク質が消費される速度を−ｒｐとする。
【０１０７】
【数３】
【０１０８】
そして、この式（３）は、次の式（４）に示すように整理される。
【０１０９】
【数４】
【０１１０】
ここで、以下の境界条件を考慮する。ここで、Ｃ０はタンパクの初期濃度である。
【０１１１】
【数５】
【０１１２】
本実施形態におけるタンパク質の結晶成長では、タンパク質の結晶１１の近傍における、微小液滴１０に対するタンパク質の濃度が十分に低く、タンパク質の結晶化が拡散律速により進む（上記アブラミの式（１）を用いた検討において、ｍ≒１．５の値が得られている）ことから、この結晶化は０次反応とみなすことができる。すなわち、タンパク質の消費濃度−ｒｐは、半径ｒに依存しない値であるため、一定値ｑと置くことができる。そのため、式（４）は、次の式（５）に示すように書き換えられる。
【０１１３】
【数６】
【０１１４】
微小液滴１０の半径Ｒ、およびタンパク質の初期濃度Ｃ０は正の値となる。それゆえ、この式（５）を解くと、１個の微小液滴１０中に１個の結晶１１を得るための移動可能最大距離（微小液滴１０の「臨界」サイズ）Ｒｃは、次の式（６）で表わされる。
【０１１５】
【数７】
【０１１６】
すなわち、最大距離推定部４２は、タンパク質の物質消費速度ｑ、物質初期濃度Ｃ０、および拡散定数Ｄというパラメータ（パラメータ取得部４１が取得したパラメータ）から、移動可能最大距離Ｒｃを推定する。そして、最大距離推定部４２は、推定した結果である最大距離推定結果を、記憶部５に一時保存する。
【０１１７】
なお、パラメータ取得部４１が、物質消費速度として、実際の物質消費速度−ｒｐ、および結晶成長にかかった時間を取得している場合には、最大距離推定部４２は、これらの２つのパラメータから、上記式（６）に使用する物質消費速度ｑを求めてもよい。
【０１１８】
また、上記では、式（６）を用いて移動可能最大距離Ｒｃが推定されているが、これに限らず、例えば、上記の境界条件を異なる条件としたり、物質消費濃度−ｒｐを一定値ｑに置換しないで上記推定を行ってもよい。この場合、微小液滴１０中に複数個の結晶１１を成長させるための当該微小液滴１０の大きさを推定することができる。
【０１１９】
さらに、最大距離推定部４２は、パラメータ取得部４１が取得した各種パラメータ、および上記式（６）を用いて推定を行うものであるが、これに限らず、例えば、上述した式（２）から式（６）を得るまでの処理を、最大距離推定部４２が行ってもよい。
【０１２０】
液滴調製制御部４３は、主として、最大距離推定部４２が推定した移動可能最大距離Ｒｃを記憶部５から読み出し、その移動可能最大距離Ｒｃと同一、あるいはそれよりも小さく微小液滴１０が調製されるように、液滴調製器具１に送液される各種溶液（結晶化させる物質を含む溶液、沈殿剤溶液、フッ化物系オイルなど）の流速を決定するものである。そして、その決定した流速にしたがって、液滴調製器具１に各種溶液の送液を制御する。
【０１２１】
微小液滴１０をどの程度の大きさに調製するかは、例えば、（１）移動可能最大距離Ｒｃまで調製する、（２）移動可能最大距離Ｒｃの数十％（例えば８０％（設定値））に調製する、（３）移動可能最大距離Ｒｃを上限として、結晶取得装置３の操作者に、その値を入力させるといった方法のいずれかで決定される。
【０１２２】
また、液滴調製制御部４３は、微小液滴１０が調製される過程を監視することによって、その微小液滴１０の形状を、所望の形状（例えば、真球形状）となるように、決定した各種溶液の流速の微調整を行ってもよい。この場合、液滴調製制御部４３は、例えば、調製過程にある微小液滴１０を、撮像装置（不図示）により撮像し、その撮像画像を解析することにより、その調整過程にある微小液滴１０の形状を認識する。その後、記憶部５に格納された所望の形状を示すデータ（例えば、モデルとなる画像データ）と比較することで、当該微小液滴１０が所望の形状となっているか否かを判定し、所望の形状になっていないと判定した場合には、その認識された形状から流速の再決定を行う。
【０１２３】
なお、調製過程における微小液滴１０の形状が所望の形状でない場合に、その形状から所望の形状を得るための流速は、経験則から把握されるものである。そのため、その経験則に基づいて、どの形状のときに、決定された流速をどの程度高める、または低めるのかが決定できるように、例えばその形状と流速変化率とが対応付けて記憶部５に格納されている。
【０１２４】
そして、液滴調製制御部４３は、微小液滴１０が移動可能最大距離Ｒｃ以下の所定の大きさに調製されたと判定した場合、各種溶液の送液を停止させる。その後、微小液滴１０が、液滴調製器具１から結晶成長用容器２に送液され、その微小液滴１０中に、物質の結晶１１が少なくとも１個成長していく。この結晶成長は、結晶成長用容器２を静置しておくことにより実現される。
【０１２５】
すなわち、図８に示すような流れを経て、物質の結晶１１の取得が実現される。図８は、本実施形態に係る結晶取得装置３における処理を含む結晶取得方法の一例を示す図である。
【０１２６】
結晶取得装置３では、パラメータ取得部４１が各種パラメータ（結晶化させる物質の物質消費速度ｑ、物質初期濃度Ｃ０および拡散定数Ｄ）の値を取得した後（Ｓ１）、最大距離推定部４２が、そのパラメータの値から、移動可能最大距離Ｒｃを推定する（Ｓ２：推定工程）。
【０１２７】
そして、液滴調製制御部４３が、その移動可能最大距離Ｒｃに基づく大きさとなるように、微小液滴１０を調製し（Ｓ３：調製工程）、その後、当該微小液滴１０がその内部に配置された結晶成長用容器２が静置されることにより、当該微小液滴１０中に、少なくとも１個の結晶１１が成長する（Ｓ４：成長工程）。
【０１２８】
なお、Ｓ３では、液滴調製制御部４３が微小液滴１０を所定の大きさになるように、各種溶液の流速を制御しているが、これに限られない。例えば、最大距離推定部４２によって推定された移動可能最大距離Ｒｃを表示部（不図示）に表示し、その移動可能最大距離Ｒｃを確認した操作者によって、液滴調製器具１に送液される各種溶液の流速が決定されてもよい。また、例えば、上記の画像または顕微鏡などによって、操作者が、調製過程にある微小液滴１０の形状を随時監視することにより、上記流速の微調整を行ってもよい。
【０１２９】
〔移動可能最大距離の推定値と、実験による微小液滴の大きさとの比較〕
次に、上記移動可能最大距離Ｒｃの推定値と、上記実験によって得られた微小液滴１０の大きさとの比較を行う。
【０１３０】
上記では、タンパク質（ソーマチン）の物質初期濃度Ｃ０が１０ｍｇ／ｍＬである。また、結晶成長にかかった時間が６０００秒としたときのタンパク質の物質消費速度ｑは、ｑ≒１／６×１０-2ｍｇ／ｍＬ・ｓと計算される。また、ソーマチンの拡散定数Ｄは約１０-11ｍ2／ｓである。最大距離推定部４２は、これらのパラメータの値を式（６）に代入することにより、移動可能最大距離Ｒｃ≒約６００μｍと算出する。
【０１３１】
この値は、理論値であり、実際の値はこれよりも小さくなると考えられる。これは、結晶１１の核発生が必ずしも微小液滴１０の中心で生じるとは限らず、また、結晶成長に伴う結晶１１自体の大きさを無視できなくなるためである。これを考慮すれば、この値は、実際の実験結果（表１）とおおよそ一致していると言える。それゆえ、結晶取得装置３による移動可能最大距離Ｒｃの推定は、微小液滴１０中に結晶１１を効率よく発生させることを可能とする。特に、その推定値よりも小さい値の半径を有する、真球の微小液滴１０を調製する場合には、その微小液滴１０中に結晶１１を１個だけ成長させることができる。つまり、微小液滴１０中に１個の結晶１１を成長させたい場合には、上記推定値は特に有効であるといえる。
【０１３２】
なお、上述の結晶１１の核発生が必ずしも微小液滴１０の中心で生じるとは限らない、結晶成長に伴う結晶１１自体の大きさを無視できない、という理由から、表１に示すように、３６０μｍおよび２００μｍの微小液滴１０では、１個の微小液滴１０中に得られる平均結晶個数が１個よりもやや多くなっている。これは、タンパク質の高濃度部分が、成長中の結晶１１から離れた場所に維持され、結果として２個目の核発生とその成長の機会とを生じさせることになるからである。
【０１３３】
〔ソフトウェアによる実現例〕
最後に、結晶取得装置３の各ブロック、特に制御部４のパラメータ取得部４１、最大距離推定部４２および液滴調製制御部４３は、ハードウェアロジックによって構成してもよいし、次のようにＣＰＵを用いてソフトウェアによって実現してもよい。
【０１３４】
すなわち、結晶取得装置３は、各機能を実現する制御プログラムの命令を実行するＣＰＵ（central processing unit）、前記プログラムを格納したＲＯＭ（read only memory）、前記プログラムを展開するＲＡＭ（random access memory）、前記プログラムおよび各種データを格納するメモリ等の記憶装置（記録媒体）などを備えている。そして、本発明の目的は、上述した機能を実現するソフトウェアである結晶取得装置３の制御プログラムのプログラムコード（実行形式プログラム、中間コードプログラム、ソースプログラム）をコンピュータで読み取り可能に記録した記録媒体を、前記結晶取得装置３に供給し、そのコンピュータ（又はＣＰＵやＭＰＵ）が記録媒体に記録されているプログラムコードを読み出し実行することによっても、達成可能である。
【０１３５】
前記記録媒体としては、例えば、磁気テープやカセットテープ等のテープ系、フロッピー（登録商標）ディスク／ハードディスク等の磁気ディスクやコンパクトディスク−ＲＯＭ／ＭＯ／ＭＤ／デジタルビデオデイスク／コンパクトディスク−Ｒ等の光ディスクを含むディスク系、ＩＣカード（メモリカードを含む）／光カード等のカード系、あるいはマスクＲＯＭ／ＥＰＲＯＭ／ＥＥＰＲＯＭ／フラッシュＲＯＭ等の半導体メモリ系などを用いることができる。
【０１３６】
また、結晶取得装置３を通信ネットワークと接続可能に構成し、前記プログラムコードを通信ネットワークを介して供給してもよい。この通信ネットワークとしては、特に限定されず、例えば、インターネット、イントラネット、エキストラネット、ＬＡＮ、ＩＳＤＮ、ＶＡＮ、ＣＡＴＶ通信網、仮想専用網（virtual private network）、電話回線網、移動体通信網、衛星通信網等が利用可能である。また、通信ネットワークを構成する伝送媒体としては、特に限定されず、例えば、ＩＥＥＥ１３９４、ＵＳＢ、電力線搬送、ケーブルＴＶ回線、電話線、ＡＤＳＬ回線等の有線でも、ＩｒＤＡやリモコンのような赤外線、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、８０２．１１無線、ＨＤＲ、携帯電話網、衛星回線、地上波デジタル網等の無線でも利用可能である。なお、本発明は、前記プログラムコードが電子的な伝送で具現化された、搬送波に埋め込まれたコンピュータデータ信号の形態でも実現され得る。
【０１３７】
〔本発明の別表現〕
本発明は、以下のようにも表現できる。
【０１３８】
本発明の方法は、微小液滴の内部流体挙動が、微小重力下でのそれに似ていることを利用して、地上で微小重力代替実験環境として用いるものである。
【０１３９】
また、本発明の方法は、そのような微小重力代替実験環境としての微小液滴の性質を利用して、単結晶を得る方法である。
【０１４０】
また、本発明の方法は、単結晶を成長させる方法であって、その方法では、その微小液滴内での単結晶の成長が拡散律速である。
【０１４１】
また、本発明の方法は、前記微小液滴の内部流体挙動の特殊性を利用し、１つの液滴中に、１個もしくは少数の単結晶のみを生じさせる方法である。
【０１４２】
また、本発明の方法は、１つの液滴中に、１個もしくは少数の単結晶のみを得ることができる微小液滴の半径を、単結晶としたい物質について、溶液中の物質消費速度、物質初期濃度、物質の拡散定数から求めるものである。
【０１４３】
また、本発明の器具は、前記の微小液滴を用いることで、１つの液滴中に、１個もしくは少数の単結晶を得ることを可能とする器具である。
【０１４４】
また、本発明の器具は、キャピラリー状の円筒管である。
【０１４５】
また、本発明の方法および器具では、結晶化させたい対象物質がタンパクである。
【０１４６】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明は、重力環境下での微小液滴と、微小重力下での液滴との内部流体挙動の類似性に着目し、微小液滴中に少なくとも１個の結晶を得る技術である。この技術は、特に、Ｘ線による結晶構造解析に好適である。また、現状では、バッチ法により多数の結晶が生じる状況下において結晶化条件の探索を行っているゆえ、その結晶化条件を自動探索するロボットに、上記の結晶取得装置および結晶取得方法を組み込むことも可能である。
【符号の説明】
【０１４８】
１ 液滴調製器具
２ 結晶成長用容器（キャピラリー）
１０ 微小液滴
１１ 結晶
ｑ 物質消費速度
Ｃ０ 物質初期濃度
Ｄ 拡散定数
Ｒｃ 移動可能最大距離
【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質の結晶を成長させるための結晶成長用容器であって、
上記結晶成長用容器の内部には、結晶化させる物質を含む溶液の微小液滴が配置されており、
上記微小液滴は、上記微小液滴の最長部の長さが、上記結晶化させる物質の自然拡散により移動できる最大距離を示す移動可能最大距離以下となるような大きさに調製されていることを特徴とする結晶成長用容器。
【請求項２】
上記微小液滴の周囲は、当該微小液滴とは相溶でない媒体物質で満たされていることを特徴とする請求項１に記載の結晶成長用容器。
【請求項３】
上記微小液滴の大きさは、その微小液滴中の密度差によって駆動される対流が抑制される大きさであることを特徴とする請求項１または２に記載の結晶成長用容器。
【請求項４】
上記微小液滴が配置される上記内部の最短部の長さが、上記微小液滴の最長部の長さと同一であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の結晶成長用容器。
【請求項５】
上記結晶化させる物質は、タンパク質であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の結晶成長用容器。
【請求項６】
円筒状のキャピラリーであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の結晶成長用容器。
【請求項７】
微小液滴中に成長させた、上記結晶化させる物質の結晶を、結晶の構造を解析する結晶構造解析装置の解析対象とすることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の結晶成長用容器。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の結晶成長用容器に接続され、上記微小液滴を調製して、当該結晶成長用容器に送液することを特徴とする液滴調製器具。
【請求項９】
物質の結晶を取得するための結晶取得方法であって、
上記物質が、微小液滴中を自然拡散により移動できる最大距離を示す移動可能最大距離を、下記（１）、（２）、および（３）に示すパラメータから推定する推定工程と、
（１）上記物質の結晶が成長することにより、上記物質を含む溶液中で当該物質が消費される速度である物質消費速度；
（２）上記物質の拡散が開始されたときの、上記微小液滴に対する上記物質の濃度である物質初期濃度；
（３）上記物質の拡散定数；
上記推定工程により推定された上記移動可能最大距離に基づく大きさとなるように、上記微小液滴を調製する調製工程と、
上記調製工程により調製された上記微小液滴中に、上記物質の結晶を少なくとも１個成長させる成長工程と、を含むことを特徴とする結晶取得方法。
【請求項１】
物質の結晶を成長させるための結晶成長用容器であって、
上記結晶成長用容器の内部には、結晶化させる物質を含む溶液の微小液滴が配置されており、
上記微小液滴は、上記微小液滴の最長部の長さが、上記結晶化させる物質の自然拡散により移動できる最大距離を示す移動可能最大距離以下となるような大きさに調製されていることを特徴とする結晶成長用容器。
【請求項２】
上記微小液滴の周囲は、当該微小液滴とは相溶でない媒体物質で満たされていることを特徴とする請求項１に記載の結晶成長用容器。
【請求項３】
上記微小液滴の大きさは、その微小液滴中の密度差によって駆動される対流が抑制される大きさであることを特徴とする請求項１または２に記載の結晶成長用容器。
【請求項４】
上記微小液滴が配置される上記内部の最短部の長さが、上記微小液滴の最長部の長さと同一であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の結晶成長用容器。
【請求項５】
上記結晶化させる物質は、タンパク質であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の結晶成長用容器。
【請求項６】
円筒状のキャピラリーであることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の結晶成長用容器。
【請求項７】
微小液滴中に成長させた、上記結晶化させる物質の結晶を、結晶の構造を解析する結晶構造解析装置の解析対象とすることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の結晶成長用容器。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の結晶成長用容器に接続され、上記微小液滴を調製して、当該結晶成長用容器に送液することを特徴とする液滴調製器具。
【請求項９】
物質の結晶を取得するための結晶取得方法であって、
上記物質が、微小液滴中を自然拡散により移動できる最大距離を示す移動可能最大距離を、下記（１）、（２）、および（３）に示すパラメータから推定する推定工程と、
（１）上記物質の結晶が成長することにより、上記物質を含む溶液中で当該物質が消費される速度である物質消費速度；
（２）上記物質の拡散が開始されたときの、上記微小液滴に対する上記物質の濃度である物質初期濃度；
（３）上記物質の拡散定数；
上記推定工程により推定された上記移動可能最大距離に基づく大きさとなるように、上記微小液滴を調製する調製工程と、
上記調製工程により調製された上記微小液滴中に、上記物質の結晶を少なくとも１個成長させる成長工程と、を含むことを特徴とする結晶取得方法。
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１３−１１２５４５（Ｐ２０１３−１１２５４５Ａ）
【公開日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２５８１９４（Ｐ２０１１−２５８１９４）
【出願日】平成２３年１１月２５日（２０１１．１１．２５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、独立行政法人科学技術振興機構「マイクロ空間場によるナノ粒子の超精密合成」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月２５日（２０１１．１１．２５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１８年度、独立行政法人科学技術振興機構「マイクロ空間場によるナノ粒子の超精密合成」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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