肝カルボキシルエステラーゼ１を含有する肝癌診断用血漿バイオマーカー及び肝癌スクリニング方法
本発明は、肝癌診断用血漿バイオマーカーに関し、２次元ゲル蛍光電気泳動、免疫沈降法、ナノ液体クロマトグラフィー質量分析装置などプロテオミクス技術を用いて今まで報告されていない血漿内のタンパク質の発見に関する。本発明のタンパク質マーカーに対して血漿内でその存在を実証し、健常者より肝癌患者の血漿で発現量が増加する差異を確認することによって、肝癌診断スクリニング方法に利用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝癌（肝細胞癌：ＨＣＣ）診断用血漿バイオマーカー関し、特に、２次元蛍光ゲル電気泳動（２−Ｄ ＤＩＧＥ）、免疫沈降法及びナノ液体クロマトグラフィー質量分析（ナノ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）装置を用いて、健常者に比べて肝癌患者の組織でその発現量が変化するタンパク質を分析し、バイオマーカータンパク質の血漿分泌量を測定し、それを肝癌早期バイオマーカーとして利用する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓細胞癌（ＨＣＣ）は、世界的に６番目に発病される主要癌と知られていて、その死亡率は４番目に高い。主にアフリカやアジアなどで多く発病する主な癌種類の１つであって、肺癌、胃癌、乳癌などとは異なって、癌の診断後に、患者の９５％以上が５年以内に死亡すると知られている。
【０００３】
肝癌症状がよく知られていて、肝癌に対する研究が続いて進められているが、この疾患を早期診断することが困難であり、且つ、肝癌の診断後の生存率が３％〜５％と非常に低いため、これを早期診断することができる癌バイオマーカーの重要性が大きな課題となっている。
【０００４】
最近、コンピュータ断層撮影（computed tomography；ＣＴ）や磁気共鳴映像法（magnetic resonance imaging；ＭＲＩ）を使用する組織検査以外にも、肝癌を診断することができる臨床試料として、血漿のような体液でのタンパク質分析を同時に測定し、肝癌存在または発病可能性可否を判断している。
【０００５】
現在、肝癌患者識別方法として、アルファ−フェトプロテイン（alpha-fetoprotein；ＡＦＰ）、デス−ガンマ−カルボキシプロトロンビン（Des-gamma carboxyprothrombin；ＤＣＰ）、グリピカン−３（Glypican-3；ＧＰＣ３）、アルファ−１−フコシダーゼ及び形質転換成長因子−ｂ１のようなバイオマーカーの単一または複合測定方法が使用されている。上記バイオマーカーが肝癌識別に最も有用なバイオマーカーとして知られているが、低い検出感度と癌特異性を有している。例えば、肝癌血清バイオマーカーとして知られているＡＦＰの場合、７６％〜９４％の高い癌特異性を有するが、３９％〜６５％の低い検出感度を有する。したがって、現在までも新しいバイオマーカーの研究開発が要求されている。
【０００６】
これより、本発明者らは、肝癌患者と健常者の血漿臨床試料に対するタンパク質変化様相が癌進行と関連あるタンパク質合成後変形（Post-translational modification）の１つであるＮ型糖鎖結合タンパク質（N-linked glycosylated protein）を中心に２次元ゲル電気泳動を用いて分離し、変化したタンパク質を同定した後、生物情報学的技術（bioinformatic tool）を利用して肝癌特異的なタンパク質マーカーを見出した。
【０００７】
肝癌バイオマーカー候補タンパク質として、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１（human liver carboxylesterase 1）は、肝、肺、心臓、脳、前立腺、卵巣などほぼすべての組織で発現され、特に肝癌組織では、正常組織より発現量が減少することが知られている。しかし、ヒト体液である血漿においてヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在及び存在量は、明らかに確認されていない。
【０００８】
ヒト血漿内のヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在観点で研究された論文において、カルボキシルエステラーゼをセファロース親和性クロマトグラフィーで精製し、その加水分解活性を基質であるトリオレインまたはｐ−ニトロフェニルアセテートを使用してそのタンパク質の存在を確認した論文が報告されたが、最近の論文において、このような活性は、血漿に存在するブチリルコリンエステラーゼ、パラオキソナーゼ、アルブミンのエステラーゼ活性であると報告され、特異的阻害剤であるビス−ｐ−ニトロフェニルホスフェート（bis-p-nitrophenylphosphate；ＢＮＰＰ）を使用したにも関わらず、その活性が抑制されていないので、ヒト血漿には、このタンパク質が存在しないと報告された。
【０００９】
ヒト肝カルボキシルエステラーゼが血漿内に存在するという多くの文献は、大部分非特異的な基質を使用した酵素活性測定法で研究されたものであり、本発明者らは、血漿内の存在を確認するために、国際的論文に報告された血漿タンパク質データベース（http//www.plasmaproteomedatabase.org）を通じてヒト肝カルボキシルエステラーゼ１を調査したが、発見されなかった。
【００１０】
このような点から、本発明者らは、従来、ヒト血漿でヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在について不明な事実を、プロテオーム接近法に基づいて２次元蛍光電気泳動を含めて抗体免疫沈降法及びナノ液体クロマトグラフィー質量分析装置を用いて当該タンパク質の存在と健常者と肝癌患者の血漿で存在比率を実証することによって、肝癌診断用バイオマーカーとしての可能性を提供することができるようになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、血漿から肝癌患者を効果的に識別することができるヒト肝カルボキシルエステラーゼ１を含有する新しい診断用バイオマーカーを提供することにある。
【００１２】
また、本発明は、ヒト血液試料からプロテオーム技術を用いて肝癌診断用バイオマーカーとしてヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在を確認する段階と、血漿の採取、免疫沈降法、免疫ブロッティング、ナノ液体クロマトグラフィー質量分析装置を用いてヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在及び相対的比較量から健常者と肝癌患者を識別する段階とを含む肝癌スクリニング方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために、本発明は、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１のタンパク質が肝癌組織で減少する変化を２次元蛍光ゲル電気泳動と免疫ブロッティングを結果として提供する。
【００１４】
また、本発明は、従来の未知の血漿タンパク質の存在を、ナノ液体クロマトグラフィー質量分析装置を用いて実証する。また、本発明は、上記タンパク質が肝癌患者の血漿において健常者より平均２〜５倍増加することを示す。
【００１５】
ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１は、Ｎ結合型糖タンパク質（N-linked glycoprotein）なので、本発明では、正常肝組織と肝癌組織の分析において、糖タンパク質分離用にレクチン親和性カラムを使用し、２次元蛍光電気泳動を行い、分子量約６２ｋＤａとｐＩ ４．５−５．３部分で位置を確認した。
【００１６】
ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１は、正常肝組織で発現量が肝癌組織より顕著に増加することを確認し、既存の論文と同様の結果を得た。血液でのヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質は、未だ確かに確認されなかった。これより、本発明者らは、プロテオーム技術接近法を使用してその存在を確認した。
【００１７】
その方法として、抗体を固定させる表面積が広いため、抗原を回収する効率的な電磁ビーズ（Dynabead, Invitrogen）を使用した免疫沈降法と高感度のナノ液体クロマトグラフィー質量分析装置を使用してヒト肝カルボキシルエステラーゼ１が血漿に存在することを実証した。また、ダイナビーズ（Dynabead）の使用量と血漿濃度の条件を確立することによって、健常者と肝癌患者の血漿からヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在量を免疫ブロッティングを用いて比較分析することができることを明らかにした。
【００１８】
本発明において、プロテオーム技術を利用したヒト血漿内のヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在確認方法は、次のような段階を含む方法によりヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在を確認することができる。
【００１９】
１）血液サンプルを、エチレンジアミン四酢酸ジカリウム（Dipotassium ethylenediamine tetraacetic acid；Ｋ２ＥＤＴＡ）が含まれているチューブ内に採取し、３０分間常温に放置した後、２，４００ｘｇで１５分間遠心分離し、上澄み液血漿を得る。
２）抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１抗体４００μｇと電磁ビーズ１０ｍｇを結合させた後、それらのうち５００μｇを取って、健常者又は肝癌患者の血漿８ｍｇと一緒に１ｍＬチューブで２時間培養してヒト肝カルボキシルエステラーゼ１を免疫沈降させた後、これを残りの血漿タンパク質から分離する。
３）第２段階で分離した健常者と肝癌患者のそれぞれの試料液を、溶解緩衝溶液でタンパク質変形させた後、１次元ゲル電気泳動で分離する。
４）約６２ｋＤａ位置のゲルバンドを切り取り、トリプシンを用いてタンパク質をペプチドに消化する。
５）高感度のナノ液体クロマトグラフィーを使用して消化されたペプチドを分析して、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質を確認する（図６及び図７参照）。
【００２０】
また、本発明において、ヒト血漿に分泌されたヒト肝カルボキシルエステラーゼ１を測定し、次のような段階を含む方法から肝癌患者と健常者を識別することができるバイオマーカーとして使用することができる。
【００２１】
１）２次蛍光ゲル電気泳動及び免疫ブロッティングを用いて、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１は肝癌患者の肝癌組織において正常組織より顕著に減少することを確認する。
２）上記ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在確認方法第１及び第２段階のように血漿サンプルを免疫沈降させて、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の溶液を得る。
３）抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１抗体を利用する免疫ブロティングで、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１のシグナルを確認する。
４）健常者の血漿より肝癌患者の血漿がヒト肝カルボキシルエステラーゼ１のシグナルが高いことを確認する（図８及び図９参照）。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、肝癌患者の肝臓非腫瘍組織から分画された糖タンパク質の２次元ゲル電気泳動イメージを示す写真である；ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の位置を示してある。
【図２】図２は、肝癌患者の肝臓腫瘍組織から分画された糖タンパク質の２次元ゲル電気泳動イメージを示す写真である；ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の位置を示してある
【図３】図３は、１０名の追加肝癌患者の非腫瘍及び腫瘍肝臓組織のペアーサンプルにおけるヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の発現量変化を示す写真である。 Ｎ：非腫瘍肝臓組織 Ｔ：腫瘍肝臓組織
【図４】図４は、ｈＣＥ１発現のレベルを示す、ＨＣＣを有する４７名の患者の非腫瘍性及び腫瘍性肝の切片から構築された免疫組織化学的に染色され、パラフィン−浸漬された組織アレイの写真である。
【図５】図５は、ＨＣＣを有する患者の非腫瘍性及び腫瘍性肝の切片で免疫組織化学的染色によって測定された染色程度の頻度分布を示すグラフである。結果は、非腫瘍性肝の切片と比較すると、腫瘍性肝の切片においてｈＣＥ１発現が特異的に減少していることを示している。
【図６】図６は、血漿内のヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在を実証するために用いられる、ナノ液体クロマトグラフィー質量分析装置を利用して健常者と肝癌患者の血漿で各々測定されたヒト肝カルボキシルエステラーゼ１のトリプシン消化ペプチドを示す。
【図７】図７は、図６に示されている代表的な共通ペプチドに対するナノ液体クロマトグラフである。
【図８】図８は、代表的な３名の健常者と肝癌患者血漿のヒト肝カルボキシルエステラーゼ１レベルの相違を免疫沈降後、免疫ブロッティング分析で確認した結果を示す写真である。 Ｎｐ：健常者血漿 Ｔｐ：肝癌患者血漿
【図９】図９は、８名の健常者と８名の肝癌患者血漿のヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在量を比較しているグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を実施例により詳しく説明する。実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲はこれに限定されない。
【実施例】
【００２４】
実施例１：臨床組織と血漿の採取
病理学的に患者の個別情報が確保された肝癌組織と、同一患者から分取された正常肝組織は、延世医科大学病理学研究室から提供された。陰性コントロールとして用いるため健常者の血漿の適切性を評価するために以下の検査を用いた；肝癌指標標準検査要素である免疫欠乏ウイルス（ＨＩＶ）来由のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２抗体；ＨＩＶ−１抗原；Ｂ型肝炎表面抗原；Ｂ型肝炎核抗原；Ｃ型肝炎ウイルス；Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩ）抗原；及び梅毒トレポネーマ。血漿を世界人間プロテオーム機構（ＨＵＰＯ）で公式的に標準化された試料分離方法で得た。
【００２５】
健康な男性１名と閉経後の女性１名の血液４ｍＬは、ＥＤＴＡＥカリウム（Ｋ２ＥＤＴＡ）が含まれているチューブに３０分間常温に放置した後、２，４００ｘｇで１５分間遠心分離し、上澄み液の血漿を得た。肝組織、肝癌組織及び血漿試料は、−７０℃で実験前まで保管して使用した。肝組織及び血漿の入手は、延世医大癌研究所（Yonsei medical center）の臨床試験委員会（ＩＲＢ）規定による。
【００２６】
実施例２：正常肝組織及び肝癌組織における糖タンパク質分離
各組織１００ｍｇを、細胞溶解ＲＩＰＡ緩衝溶液［５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０．２５％デオキシコレートナトリウム、ｐＨ７．４］中、４℃で均質化した。糖タンパク質は、５種のアガロース結合レクチン：コンカナバリンＡ、小麦胚芽レクチン、ジャカリン（Jacakin）、セイヨウニワトコ（Sambucus nigra）及びヒイロチャワンタケ（Aleuria aurantia）：の混合物を使用するレクチン−親和性クロマトグラフィーで分離した。異なった糖成分を有する糖タンパク質に対して結合特異性を有する、これらのレクチン混合物を、ＰＤ−１０カラム（Pierce）に最終２ｍＬとなるように充填した。糖タンパク質を含有しているサンプルを、結合用緩衝溶液［２０ｍＭトリス、１ｍＭ塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、１ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、ｐＨ７．４］中でこのカラムに付して、３０分間カラムに結合させた。結合した糖タンパク質を、糖組成に基づいて糖たんぱく質を移動する分離用緩衝溶液［０．２Ｍメチル−Ｄ−マンノピロサイド、０．２Ｍメチル−Ｄ−グルコピロサイド、０．２Ｍ Ｎ−アセチルグルコサミン、０．２Ｍガラクトース、０．１Ｍラクトース、０．１Ｍフコース、２０ｍＭトリス、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０］を使用して溶出した。溶出した糖タンパク質を５ｋＤａ膜濾過紙で濃縮し、５０％卜リクロロ酢酸と１００％アセトンで沈殿させた。沈殿物を、２−Ｄ溶解緩衝溶液［７Ｍウレア、２Ｍチオウレア、４％ＣＨＡＰＳ、３０ｍＭトリス、ｐＨ８．５］に溶解した。得られたタンパク質溶液を、ｐＨ８．５に調整し、タンパク質濃度を、２Ｄ Ｑｕａｎｔ ｋｉｔ（GE Healthcare）を使用して測定した。
【００２７】
実施例３：２次元蛍光ゲル電気泳動（２−Ｄ ＤＩＧＥ）
５名の患者由来の１０個の試料（５個の非腫瘍肝組織および５個の腫瘍肝組織）を、２−Ｄ ＤＩＧＥ用の分析サンプル（それぞれ５０μｇ）を調整するために用いた。分析サンプル及び対応するプールされている標準サンプルを、蛍光染料であるＣｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ２（４００ｐｍｏｌ：GE Healthcare）で暗条件で３０分間それぞれ標識した。
１μＬの１０ｍＭリシンで反応を停止させた。各標識された３個の試料を混合して、最終容量が４５０μＬとなるように、試料緩衝溶液［６Ｍウレア、２Ｍチオウレア、４％ＣＨＡＰＳ、６０ｍＭジチオトレイトール（dithiothreitol；ＤＴＴ）、３０ｍＭトリス、ｐＨ８．５］を添加し、２％ＩＰＧ３−１０ＮＬ緩衝溶液とともに常温で１６時間培養して再水和した。
等電点電気泳動法（isoelectric focusing；ＩＥＦ）を、イモビリンドライストリップ（Immobiline Dry Strip）ｐＨ３−１０ＮＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＭｕｌｔｉＰｈｏｒＩＩ電気泳動システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で最適条件下（９５，０００Ｖ）で実施した。次いで、ドライストリップを培養して、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）緩衝溶液［６Ｍウレア、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、３０ｍＭトリス、２０％グリセロール、２．５％アクリルアミド溶液、５ｍＭトリブチルホスフィン］中で２５分間ワン−ステップ還元及びアルキル化した。
【００２８】
還元及びアルキル化を行った後、ＥｔｔａｎＤａｌｔ−ｔｗｅｌｖｅ電気泳動システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、９％〜１６％グラジエントポリアクリルアミドゲル上の電気泳動で、目的とするタンパク質を２次元で分離した。Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）スキャナを利用して、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５に該当する波長でそれぞれのゲルをスキャンした。各ゲルのイメージを、ＤｅＣｙｄｅｒ２−Ｄ分析ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用して分析した。
【００２９】
実施例４：２次元蛍光ゲル電気泳動で分離したタンパク質の同定
イメージを分析した後、有意に特異的に発現したタンパク質を、クマシブルー染料で染色されたゲルから切り取り、脱色してトリプシンで切断（digestion）した。切断したペプチドを、ポロス（Poros）Ｒ２及びオリゴＲ３レジン混合物を使用して脱塩した。タンパク質を、４８００ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Applied Biosystem）で分析して、スペクトルを、ＭＡＳＣＯＴデータベースを利用して同定した。
【００３０】
実施例５：組織内肝癌バイオマーカー発現量の検証；ウェスタンブロッティング分析
患者１０名の非腫瘍肝臓組織と腫瘍肝臓組織の間における肝癌バイオマーカータンパク質濃度の差異をウェスタンブロッティング分析で検証した。各サンプルから得た等量のタンパク質５μｇを、１０％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
タンパク質をニトロセルロース（nitrocellulose；ＮＣ）膜に転換した後、５％脱脂乳が含まれたＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液［２０ｍＭトリス、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．６］中で、１時間室温で培養して、ブロッキングした。膜を、抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１抗体（ＣＥ１、Ａｂｃａｍ；１：１００００；５％脱脂乳が含まれたＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液中）と室温で１時間培養した。陽性対照群として、マウスベータアクチン抗体（SantaCruz）を用いた。
５％脱脂乳が含まれたＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で洗浄した後、膜を２次抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（SantaCruz；１：２００００倍希釈）と室温で１時間培養した。免疫反応性タンパク質を、ＥＣＬ Ｐｌｕｓウェスタンブロット試薬（GE Healthcare）で検出して、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００スキャナでスキャンして分析した。
【００３１】
実施例６：免疫組織化学的染色法を利用した組織内のＨＣＣバイオマーカー発現レベルの検証
ＨＣＣを有する４７名の患者の非腫瘍性及び腫瘍性肝の切片から構築されたパラフィン−浸漬された組織アレイを免疫組織化学的染色法に使用した。キシレン及びアルコールでスライドを脱パラフィン化させ、脱水させた後、０．６％過酸化水素で処理した。抗−ｈＣＥ１抗体（１：１００）をスライドに塗布し、３０分間インキュベートした。ｈＣＥ１−結合抗体の色相をＣｈｅｍＭａｔｅ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ＤＡＫＯ）で発現させ、ヘマトシリン（対照染色薬として使用）で３０分間可視化した。染色の強度は、染色されていない場合に対して“−“で，弱い染色に対して“＋”で、そして強い染色に対して“＋＋”で点数を付けた。
【００３２】
実施例７：ヒト血漿内肝癌バイオマーカータンパク質分泌量の検証；免疫沈降法及び抗体−免疫ブロッティング
電磁ビーズである‘Ｄｙｎａｂｅａｄ ＭｙＯｎｅＴＭ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ’（Invitrogen）を、製造会社のマニュアルによって抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１抗体でコーティングした。１０ｍｇのビーズと４００μｇの抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１抗体を混合して、結合緩衝溶液［０．１Ｍホウ酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ９．５］中で３７℃で１６時間培養して、５％脱脂乳が含まれたＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で更に１６時間追加にブロッキングした。抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１抗体が結合されたビーズ５０0μｇを、健常者と肝癌患者の血漿８ｍｇと一緒に１ｍＬチューブに移して２時間培養して、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１を免疫沈降させた。
ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液をｐＨ２に調整して抗体に結合したタンパク質を溶出した。免疫ブロッティングを行い、健常者と肝癌患者の間の血漿内のヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の変化を分析した。この時、使用した抗体は、実施例５で使用した抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の１次抗体（Abcam；１：１０００）、及び２次抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（SantaCruz；１：５０００）である。
【００３３】
実施例８：ヒト血漿内のヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質の検証；ナノ液体クロマトグラフィー質量分析
実施例７で実施した免疫ブロッティングで測定したヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の該当ゲルバンドを切り取り、ジチオトリエトール(dithiothrietol；ＤＴＴ）／ヨード酢酸（iodoacetic acid；ＩＡＡ）処理を通じてタンパク質還元とアルキル化を行い、トリプシンで処理してペプチドに切断した後、ナノ液体クロマトグラフィー質量分析装置と線形トラップ四重極（ＬＴＱ）検出装置を利用してゲル内のヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質を確認した。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
以上説明したように、本発明から得られる新しい肝癌診断用バイオマーカーは、血漿内の該当タンパク質の発現量を確認することによって、肝癌の早期診断を可能にする要素として作用し、肝癌患者の生存率を向上させることに寄与できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝癌（肝細胞癌：ＨＣＣ）診断用血漿バイオマーカー関し、特に、２次元蛍光ゲル電気泳動（２−Ｄ ＤＩＧＥ）、免疫沈降法及びナノ液体クロマトグラフィー質量分析（ナノ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）装置を用いて、健常者に比べて肝癌患者の組織でその発現量が変化するタンパク質を分析し、バイオマーカータンパク質の血漿分泌量を測定し、それを肝癌早期バイオマーカーとして利用する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓細胞癌（ＨＣＣ）は、世界的に６番目に発病される主要癌と知られていて、その死亡率は４番目に高い。主にアフリカやアジアなどで多く発病する主な癌種類の１つであって、肺癌、胃癌、乳癌などとは異なって、癌の診断後に、患者の９５％以上が５年以内に死亡すると知られている。
【０００３】
肝癌症状がよく知られていて、肝癌に対する研究が続いて進められているが、この疾患を早期診断することが困難であり、且つ、肝癌の診断後の生存率が３％〜５％と非常に低いため、これを早期診断することができる癌バイオマーカーの重要性が大きな課題となっている。
【０００４】
最近、コンピュータ断層撮影（computed tomography；ＣＴ）や磁気共鳴映像法（magnetic resonance imaging；ＭＲＩ）を使用する組織検査以外にも、肝癌を診断することができる臨床試料として、血漿のような体液でのタンパク質分析を同時に測定し、肝癌存在または発病可能性可否を判断している。
【０００５】
現在、肝癌患者識別方法として、アルファ−フェトプロテイン（alpha-fetoprotein；ＡＦＰ）、デス−ガンマ−カルボキシプロトロンビン（Des-gamma carboxyprothrombin；ＤＣＰ）、グリピカン−３（Glypican-3；ＧＰＣ３）、アルファ−１−フコシダーゼ及び形質転換成長因子−ｂ１のようなバイオマーカーの単一または複合測定方法が使用されている。上記バイオマーカーが肝癌識別に最も有用なバイオマーカーとして知られているが、低い検出感度と癌特異性を有している。例えば、肝癌血清バイオマーカーとして知られているＡＦＰの場合、７６％〜９４％の高い癌特異性を有するが、３９％〜６５％の低い検出感度を有する。したがって、現在までも新しいバイオマーカーの研究開発が要求されている。
【０００６】
これより、本発明者らは、肝癌患者と健常者の血漿臨床試料に対するタンパク質変化様相が癌進行と関連あるタンパク質合成後変形（Post-translational modification）の１つであるＮ型糖鎖結合タンパク質（N-linked glycosylated protein）を中心に２次元ゲル電気泳動を用いて分離し、変化したタンパク質を同定した後、生物情報学的技術（bioinformatic tool）を利用して肝癌特異的なタンパク質マーカーを見出した。
【０００７】
肝癌バイオマーカー候補タンパク質として、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１（human liver carboxylesterase 1）は、肝、肺、心臓、脳、前立腺、卵巣などほぼすべての組織で発現され、特に肝癌組織では、正常組織より発現量が減少することが知られている。しかし、ヒト体液である血漿においてヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在及び存在量は、明らかに確認されていない。
【０００８】
ヒト血漿内のヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在観点で研究された論文において、カルボキシルエステラーゼをセファロース親和性クロマトグラフィーで精製し、その加水分解活性を基質であるトリオレインまたはｐ−ニトロフェニルアセテートを使用してそのタンパク質の存在を確認した論文が報告されたが、最近の論文において、このような活性は、血漿に存在するブチリルコリンエステラーゼ、パラオキソナーゼ、アルブミンのエステラーゼ活性であると報告され、特異的阻害剤であるビス−ｐ−ニトロフェニルホスフェート（bis-p-nitrophenylphosphate；ＢＮＰＰ）を使用したにも関わらず、その活性が抑制されていないので、ヒト血漿には、このタンパク質が存在しないと報告された。
【０００９】
ヒト肝カルボキシルエステラーゼが血漿内に存在するという多くの文献は、大部分非特異的な基質を使用した酵素活性測定法で研究されたものであり、本発明者らは、血漿内の存在を確認するために、国際的論文に報告された血漿タンパク質データベース（http//www.plasmaproteomedatabase.org）を通じてヒト肝カルボキシルエステラーゼ１を調査したが、発見されなかった。
【００１０】
このような点から、本発明者らは、従来、ヒト血漿でヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在について不明な事実を、プロテオーム接近法に基づいて２次元蛍光電気泳動を含めて抗体免疫沈降法及びナノ液体クロマトグラフィー質量分析装置を用いて当該タンパク質の存在と健常者と肝癌患者の血漿で存在比率を実証することによって、肝癌診断用バイオマーカーとしての可能性を提供することができるようになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、血漿から肝癌患者を効果的に識別することができるヒト肝カルボキシルエステラーゼ１を含有する新しい診断用バイオマーカーを提供することにある。
【００１２】
また、本発明は、ヒト血液試料からプロテオーム技術を用いて肝癌診断用バイオマーカーとしてヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在を確認する段階と、血漿の採取、免疫沈降法、免疫ブロッティング、ナノ液体クロマトグラフィー質量分析装置を用いてヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在及び相対的比較量から健常者と肝癌患者を識別する段階とを含む肝癌スクリニング方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために、本発明は、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１のタンパク質が肝癌組織で減少する変化を２次元蛍光ゲル電気泳動と免疫ブロッティングを結果として提供する。
【００１４】
また、本発明は、従来の未知の血漿タンパク質の存在を、ナノ液体クロマトグラフィー質量分析装置を用いて実証する。また、本発明は、上記タンパク質が肝癌患者の血漿において健常者より平均２〜５倍増加することを示す。
【００１５】
ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１は、Ｎ結合型糖タンパク質（N-linked glycoprotein）なので、本発明では、正常肝組織と肝癌組織の分析において、糖タンパク質分離用にレクチン親和性カラムを使用し、２次元蛍光電気泳動を行い、分子量約６２ｋＤａとｐＩ ４．５−５．３部分で位置を確認した。
【００１６】
ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１は、正常肝組織で発現量が肝癌組織より顕著に増加することを確認し、既存の論文と同様の結果を得た。血液でのヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質は、未だ確かに確認されなかった。これより、本発明者らは、プロテオーム技術接近法を使用してその存在を確認した。
【００１７】
その方法として、抗体を固定させる表面積が広いため、抗原を回収する効率的な電磁ビーズ（Dynabead, Invitrogen）を使用した免疫沈降法と高感度のナノ液体クロマトグラフィー質量分析装置を使用してヒト肝カルボキシルエステラーゼ１が血漿に存在することを実証した。また、ダイナビーズ（Dynabead）の使用量と血漿濃度の条件を確立することによって、健常者と肝癌患者の血漿からヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在量を免疫ブロッティングを用いて比較分析することができることを明らかにした。
【００１８】
本発明において、プロテオーム技術を利用したヒト血漿内のヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在確認方法は、次のような段階を含む方法によりヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在を確認することができる。
【００１９】
１）血液サンプルを、エチレンジアミン四酢酸ジカリウム（Dipotassium ethylenediamine tetraacetic acid；Ｋ２ＥＤＴＡ）が含まれているチューブ内に採取し、３０分間常温に放置した後、２，４００ｘｇで１５分間遠心分離し、上澄み液血漿を得る。
２）抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１抗体４００μｇと電磁ビーズ１０ｍｇを結合させた後、それらのうち５００μｇを取って、健常者又は肝癌患者の血漿８ｍｇと一緒に１ｍＬチューブで２時間培養してヒト肝カルボキシルエステラーゼ１を免疫沈降させた後、これを残りの血漿タンパク質から分離する。
３）第２段階で分離した健常者と肝癌患者のそれぞれの試料液を、溶解緩衝溶液でタンパク質変形させた後、１次元ゲル電気泳動で分離する。
４）約６２ｋＤａ位置のゲルバンドを切り取り、トリプシンを用いてタンパク質をペプチドに消化する。
５）高感度のナノ液体クロマトグラフィーを使用して消化されたペプチドを分析して、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質を確認する（図６及び図７参照）。
【００２０】
また、本発明において、ヒト血漿に分泌されたヒト肝カルボキシルエステラーゼ１を測定し、次のような段階を含む方法から肝癌患者と健常者を識別することができるバイオマーカーとして使用することができる。
【００２１】
１）２次蛍光ゲル電気泳動及び免疫ブロッティングを用いて、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１は肝癌患者の肝癌組織において正常組織より顕著に減少することを確認する。
２）上記ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在確認方法第１及び第２段階のように血漿サンプルを免疫沈降させて、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の溶液を得る。
３）抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１抗体を利用する免疫ブロティングで、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１のシグナルを確認する。
４）健常者の血漿より肝癌患者の血漿がヒト肝カルボキシルエステラーゼ１のシグナルが高いことを確認する（図８及び図９参照）。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、肝癌患者の肝臓非腫瘍組織から分画された糖タンパク質の２次元ゲル電気泳動イメージを示す写真である；ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の位置を示してある。
【図２】図２は、肝癌患者の肝臓腫瘍組織から分画された糖タンパク質の２次元ゲル電気泳動イメージを示す写真である；ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の位置を示してある
【図３】図３は、１０名の追加肝癌患者の非腫瘍及び腫瘍肝臓組織のペアーサンプルにおけるヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の発現量変化を示す写真である。 Ｎ：非腫瘍肝臓組織 Ｔ：腫瘍肝臓組織
【図４】図４は、ｈＣＥ１発現のレベルを示す、ＨＣＣを有する４７名の患者の非腫瘍性及び腫瘍性肝の切片から構築された免疫組織化学的に染色され、パラフィン−浸漬された組織アレイの写真である。
【図５】図５は、ＨＣＣを有する患者の非腫瘍性及び腫瘍性肝の切片で免疫組織化学的染色によって測定された染色程度の頻度分布を示すグラフである。結果は、非腫瘍性肝の切片と比較すると、腫瘍性肝の切片においてｈＣＥ１発現が特異的に減少していることを示している。
【図６】図６は、血漿内のヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在を実証するために用いられる、ナノ液体クロマトグラフィー質量分析装置を利用して健常者と肝癌患者の血漿で各々測定されたヒト肝カルボキシルエステラーゼ１のトリプシン消化ペプチドを示す。
【図７】図７は、図６に示されている代表的な共通ペプチドに対するナノ液体クロマトグラフである。
【図８】図８は、代表的な３名の健常者と肝癌患者血漿のヒト肝カルボキシルエステラーゼ１レベルの相違を免疫沈降後、免疫ブロッティング分析で確認した結果を示す写真である。 Ｎｐ：健常者血漿 Ｔｐ：肝癌患者血漿
【図９】図９は、８名の健常者と８名の肝癌患者血漿のヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在量を比較しているグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を実施例により詳しく説明する。実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲はこれに限定されない。
【実施例】
【００２４】
実施例１：臨床組織と血漿の採取
病理学的に患者の個別情報が確保された肝癌組織と、同一患者から分取された正常肝組織は、延世医科大学病理学研究室から提供された。陰性コントロールとして用いるため健常者の血漿の適切性を評価するために以下の検査を用いた；肝癌指標標準検査要素である免疫欠乏ウイルス（ＨＩＶ）来由のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２抗体；ＨＩＶ−１抗原；Ｂ型肝炎表面抗原；Ｂ型肝炎核抗原；Ｃ型肝炎ウイルス；Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩ）抗原；及び梅毒トレポネーマ。血漿を世界人間プロテオーム機構（ＨＵＰＯ）で公式的に標準化された試料分離方法で得た。
【００２５】
健康な男性１名と閉経後の女性１名の血液４ｍＬは、ＥＤＴＡＥカリウム（Ｋ２ＥＤＴＡ）が含まれているチューブに３０分間常温に放置した後、２，４００ｘｇで１５分間遠心分離し、上澄み液の血漿を得た。肝組織、肝癌組織及び血漿試料は、−７０℃で実験前まで保管して使用した。肝組織及び血漿の入手は、延世医大癌研究所（Yonsei medical center）の臨床試験委員会（ＩＲＢ）規定による。
【００２６】
実施例２：正常肝組織及び肝癌組織における糖タンパク質分離
各組織１００ｍｇを、細胞溶解ＲＩＰＡ緩衝溶液［５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０．２５％デオキシコレートナトリウム、ｐＨ７．４］中、４℃で均質化した。糖タンパク質は、５種のアガロース結合レクチン：コンカナバリンＡ、小麦胚芽レクチン、ジャカリン（Jacakin）、セイヨウニワトコ（Sambucus nigra）及びヒイロチャワンタケ（Aleuria aurantia）：の混合物を使用するレクチン−親和性クロマトグラフィーで分離した。異なった糖成分を有する糖タンパク質に対して結合特異性を有する、これらのレクチン混合物を、ＰＤ−１０カラム（Pierce）に最終２ｍＬとなるように充填した。糖タンパク質を含有しているサンプルを、結合用緩衝溶液［２０ｍＭトリス、１ｍＭ塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、１ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、ｐＨ７．４］中でこのカラムに付して、３０分間カラムに結合させた。結合した糖タンパク質を、糖組成に基づいて糖たんぱく質を移動する分離用緩衝溶液［０．２Ｍメチル−Ｄ−マンノピロサイド、０．２Ｍメチル−Ｄ−グルコピロサイド、０．２Ｍ Ｎ−アセチルグルコサミン、０．２Ｍガラクトース、０．１Ｍラクトース、０．１Ｍフコース、２０ｍＭトリス、０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０］を使用して溶出した。溶出した糖タンパク質を５ｋＤａ膜濾過紙で濃縮し、５０％卜リクロロ酢酸と１００％アセトンで沈殿させた。沈殿物を、２−Ｄ溶解緩衝溶液［７Ｍウレア、２Ｍチオウレア、４％ＣＨＡＰＳ、３０ｍＭトリス、ｐＨ８．５］に溶解した。得られたタンパク質溶液を、ｐＨ８．５に調整し、タンパク質濃度を、２Ｄ Ｑｕａｎｔ ｋｉｔ（GE Healthcare）を使用して測定した。
【００２７】
実施例３：２次元蛍光ゲル電気泳動（２−Ｄ ＤＩＧＥ）
５名の患者由来の１０個の試料（５個の非腫瘍肝組織および５個の腫瘍肝組織）を、２−Ｄ ＤＩＧＥ用の分析サンプル（それぞれ５０μｇ）を調整するために用いた。分析サンプル及び対応するプールされている標準サンプルを、蛍光染料であるＣｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ２（４００ｐｍｏｌ：GE Healthcare）で暗条件で３０分間それぞれ標識した。
１μＬの１０ｍＭリシンで反応を停止させた。各標識された３個の試料を混合して、最終容量が４５０μＬとなるように、試料緩衝溶液［６Ｍウレア、２Ｍチオウレア、４％ＣＨＡＰＳ、６０ｍＭジチオトレイトール（dithiothreitol；ＤＴＴ）、３０ｍＭトリス、ｐＨ８．５］を添加し、２％ＩＰＧ３−１０ＮＬ緩衝溶液とともに常温で１６時間培養して再水和した。
等電点電気泳動法（isoelectric focusing；ＩＥＦ）を、イモビリンドライストリップ（Immobiline Dry Strip）ｐＨ３−１０ＮＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＭｕｌｔｉＰｈｏｒＩＩ電気泳動システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で最適条件下（９５，０００Ｖ）で実施した。次いで、ドライストリップを培養して、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）緩衝溶液［６Ｍウレア、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、３０ｍＭトリス、２０％グリセロール、２．５％アクリルアミド溶液、５ｍＭトリブチルホスフィン］中で２５分間ワン−ステップ還元及びアルキル化した。
【００２８】
還元及びアルキル化を行った後、ＥｔｔａｎＤａｌｔ−ｔｗｅｌｖｅ電気泳動システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、９％〜１６％グラジエントポリアクリルアミドゲル上の電気泳動で、目的とするタンパク質を２次元で分離した。Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）スキャナを利用して、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５に該当する波長でそれぞれのゲルをスキャンした。各ゲルのイメージを、ＤｅＣｙｄｅｒ２−Ｄ分析ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用して分析した。
【００２９】
実施例４：２次元蛍光ゲル電気泳動で分離したタンパク質の同定
イメージを分析した後、有意に特異的に発現したタンパク質を、クマシブルー染料で染色されたゲルから切り取り、脱色してトリプシンで切断（digestion）した。切断したペプチドを、ポロス（Poros）Ｒ２及びオリゴＲ３レジン混合物を使用して脱塩した。タンパク質を、４８００ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Applied Biosystem）で分析して、スペクトルを、ＭＡＳＣＯＴデータベースを利用して同定した。
【００３０】
実施例５：組織内肝癌バイオマーカー発現量の検証；ウェスタンブロッティング分析
患者１０名の非腫瘍肝臓組織と腫瘍肝臓組織の間における肝癌バイオマーカータンパク質濃度の差異をウェスタンブロッティング分析で検証した。各サンプルから得た等量のタンパク質５μｇを、１０％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
タンパク質をニトロセルロース（nitrocellulose；ＮＣ）膜に転換した後、５％脱脂乳が含まれたＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液［２０ｍＭトリス、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．６］中で、１時間室温で培養して、ブロッキングした。膜を、抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１抗体（ＣＥ１、Ａｂｃａｍ；１：１００００；５％脱脂乳が含まれたＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液中）と室温で１時間培養した。陽性対照群として、マウスベータアクチン抗体（SantaCruz）を用いた。
５％脱脂乳が含まれたＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で洗浄した後、膜を２次抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（SantaCruz；１：２００００倍希釈）と室温で１時間培養した。免疫反応性タンパク質を、ＥＣＬ Ｐｌｕｓウェスタンブロット試薬（GE Healthcare）で検出して、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００スキャナでスキャンして分析した。
【００３１】
実施例６：免疫組織化学的染色法を利用した組織内のＨＣＣバイオマーカー発現レベルの検証
ＨＣＣを有する４７名の患者の非腫瘍性及び腫瘍性肝の切片から構築されたパラフィン−浸漬された組織アレイを免疫組織化学的染色法に使用した。キシレン及びアルコールでスライドを脱パラフィン化させ、脱水させた後、０．６％過酸化水素で処理した。抗−ｈＣＥ１抗体（１：１００）をスライドに塗布し、３０分間インキュベートした。ｈＣＥ１−結合抗体の色相をＣｈｅｍＭａｔｅ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ＤＡＫＯ）で発現させ、ヘマトシリン（対照染色薬として使用）で３０分間可視化した。染色の強度は、染色されていない場合に対して“−“で，弱い染色に対して“＋”で、そして強い染色に対して“＋＋”で点数を付けた。
【００３２】
実施例７：ヒト血漿内肝癌バイオマーカータンパク質分泌量の検証；免疫沈降法及び抗体−免疫ブロッティング
電磁ビーズである‘Ｄｙｎａｂｅａｄ ＭｙＯｎｅＴＭ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ’（Invitrogen）を、製造会社のマニュアルによって抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１抗体でコーティングした。１０ｍｇのビーズと４００μｇの抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１抗体を混合して、結合緩衝溶液［０．１Ｍホウ酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ９．５］中で３７℃で１６時間培養して、５％脱脂乳が含まれたＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で更に１６時間追加にブロッキングした。抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１抗体が結合されたビーズ５０0μｇを、健常者と肝癌患者の血漿８ｍｇと一緒に１ｍＬチューブに移して２時間培養して、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１を免疫沈降させた。
ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液をｐＨ２に調整して抗体に結合したタンパク質を溶出した。免疫ブロッティングを行い、健常者と肝癌患者の間の血漿内のヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の変化を分析した。この時、使用した抗体は、実施例５で使用した抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の１次抗体（Abcam；１：１０００）、及び２次抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（SantaCruz；１：５０００）である。
【００３３】
実施例８：ヒト血漿内のヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質の検証；ナノ液体クロマトグラフィー質量分析
実施例７で実施した免疫ブロッティングで測定したヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の該当ゲルバンドを切り取り、ジチオトリエトール(dithiothrietol；ＤＴＴ）／ヨード酢酸（iodoacetic acid；ＩＡＡ）処理を通じてタンパク質還元とアルキル化を行い、トリプシンで処理してペプチドに切断した後、ナノ液体クロマトグラフィー質量分析装置と線形トラップ四重極（ＬＴＱ）検出装置を利用してゲル内のヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質を確認した。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
以上説明したように、本発明から得られる新しい肝癌診断用バイオマーカーは、血漿内の該当タンパク質の発現量を確認することによって、肝癌の早期診断を可能にする要素として作用し、肝癌患者の生存率を向上させることに寄与できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質を有効成分として含有する肝癌診断用血漿バイオマーカー組成物。
【請求項２】
当該ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質が肝癌患者の血漿において健常者より増加することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
当該ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質が肝癌患者の血漿において健常者より平均２〜５倍増加することを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ヒト血液試料からプロテオーム技術を用いて肝癌診断用血漿バイオマーカーとしてヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在を確認する第１段階と、免疫沈降法、免疫ブロッティング、ナノ液体クロマトグラフィー質量分析装置を用いてヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在及び相対的比較量から健常者と肝癌患者を識別する第２段階と、を含む肝癌スクリーニング方法。
【請求項５】
当該第１段階が、
１）血液サンプルを、エチレンジアミン四酢酸ジカリウムを含むチューブに採取し、３０分間常温に放置した後、２，４００ｘｇで１５分間遠心分離し、上澄み液血漿を得る段階と、
２）抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１抗体４００μｇと電磁ビーズ１０ｍｇを結合させた後、それらのうち５００μｇを取って、健常者と肝癌患者の血漿８ｍｇと一緒に１ｍＬチューブで２時間培養して、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質を免疫沈降させる段階と、
３）当該２）段階の健常者と肝癌患者のサンプルを、溶解緩衝溶液でタンパク質変形させた後、１次元ゲル電気泳動で分離する段階と、
４）ほぼ６２ｋＤａ位置のゲルバンドを切り取り、トリプシン処理によってタンパク質をペプチドに切断する段階と、
５）高感度のナノ液体クロマトグラフィーを使用してヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質を確認する段階と、を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
当該第２段階が、
１）２次蛍光ゲル電気泳動、免疫ブロッティング及び免疫組織化学的染色の結果から、肝癌患者の肝癌組織におけるヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の発現レベルが正常組織より顕著に減少することを確認する段階と、
２）血漿サンプルを免疫沈降させて、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１溶液を得る段階と、
３）免疫ブロッティングで抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１抗体を利用してヒト肝カルボキシルエステラーゼ１のシグナルを確認する段階と、
４）正常血漿より肝癌血漿がヒト肝カルボキシルエステラーゼ１のシグナルが高いことを確認する段階と、を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
当該ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質のレベルが肝癌患者の血漿において健常者より高いことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
当該ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質のレベルが肝癌患者の血漿において健常者より平均２〜５倍増加することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１】
ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質を有効成分として含有する肝癌診断用血漿バイオマーカー組成物。
【請求項２】
当該ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質が肝癌患者の血漿において健常者より増加することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
当該ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質が肝癌患者の血漿において健常者より平均２〜５倍増加することを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ヒト血液試料からプロテオーム技術を用いて肝癌診断用血漿バイオマーカーとしてヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在を確認する第１段階と、免疫沈降法、免疫ブロッティング、ナノ液体クロマトグラフィー質量分析装置を用いてヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の存在及び相対的比較量から健常者と肝癌患者を識別する第２段階と、を含む肝癌スクリーニング方法。
【請求項５】
当該第１段階が、
１）血液サンプルを、エチレンジアミン四酢酸ジカリウムを含むチューブに採取し、３０分間常温に放置した後、２，４００ｘｇで１５分間遠心分離し、上澄み液血漿を得る段階と、
２）抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１抗体４００μｇと電磁ビーズ１０ｍｇを結合させた後、それらのうち５００μｇを取って、健常者と肝癌患者の血漿８ｍｇと一緒に１ｍＬチューブで２時間培養して、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質を免疫沈降させる段階と、
３）当該２）段階の健常者と肝癌患者のサンプルを、溶解緩衝溶液でタンパク質変形させた後、１次元ゲル電気泳動で分離する段階と、
４）ほぼ６２ｋＤａ位置のゲルバンドを切り取り、トリプシン処理によってタンパク質をペプチドに切断する段階と、
５）高感度のナノ液体クロマトグラフィーを使用してヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質を確認する段階と、を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
当該第２段階が、
１）２次蛍光ゲル電気泳動、免疫ブロッティング及び免疫組織化学的染色の結果から、肝癌患者の肝癌組織におけるヒト肝カルボキシルエステラーゼ１の発現レベルが正常組織より顕著に減少することを確認する段階と、
２）血漿サンプルを免疫沈降させて、ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１溶液を得る段階と、
３）免疫ブロッティングで抗−ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１抗体を利用してヒト肝カルボキシルエステラーゼ１のシグナルを確認する段階と、
４）正常血漿より肝癌血漿がヒト肝カルボキシルエステラーゼ１のシグナルが高いことを確認する段階と、を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
当該ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質のレベルが肝癌患者の血漿において健常者より高いことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
当該ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１タンパク質のレベルが肝癌患者の血漿において健常者より平均２〜５倍増加することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１１−５１７３９９（Ｐ２０１１−５１７３９９Ａ）
【公表日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５５０５８０（Ｐ２０１０−５５０５８０）
【出願日】平成２０年１０月１日（２００８．１０．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００５７６２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１３７５８
【国際公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【出願人】（５１０２４７３８６）シンテカバイオ カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１日（２００８．１０．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００５７６２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１３７５８
【国際公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【出願人】（５１０２４７３８６）シンテカバイオ カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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