肝炎ＣウイルスＥ１Ｅ２複合体に対する抗体、ＨＣＶ粒子の組成物及び医薬組成物
本発明は、ＨＣＶに対する新規な立体配座抗体、更に詳しくは、モノクローナル抗体に関する。本発明は、該抗体により認識され易い粒子の組成物、及びそれらを含有する医薬組成物にも関する。本発明は、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子又は精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子及びそれらを製造する方法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＣＶに対する新規な立体配座抗体（conformational antibodies）、更に詳しくはモノクローナル抗体に関する。本発明、該抗体により認識される傾向がある粒子の組成物及びそれらを含有する医薬組成物にも関する。本発明は、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子（HCV enveloped subviral particles）又は精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子（HCV enveloped complete virus particles）及びそれらを製造する方法にも関する。
【０００２】
肝炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）感染は、慢性肝炎及び硬変の主要な原因であり、そして肝細胞癌をもたらすことがある。世界中で約２００万人の人々がＨＣＶに慢性的に感染しており、この疾患は深刻な世界的健康問題となった。ＨＣＶは、フラビウイルス科（Flaviridae family）のHepacivirus属に属するエンベロープドＲＮＡウイルスである。そのゲノムは、内部リボソームエントリー部位（internal ribosome entry sites）として機能する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、約３，０００アミノ酸のポリタンパク質をコードする単一オープンリーディングフレーム及び３’ＵＴＲを有する正の極性の９．６ｋｂの一本鎖ＲＮＡである（Bartenschlager et al., 2000）。このポリタンパク質は、翻訳と同時に又は翻訳後に、宿主細胞ペプチダーゼにより開裂されてコアタンパク質並びにエンベロープ糖タンパク質Ｅ１及びＥ２を含む構造タンパク質を生じ、そしてウイルスプロテアーゼにより開裂されて非構造タンパク質（ＮＳ）２〜５Ｂを発生する（Bartenschlager et al., 2000）。関連したプラス鎖ＲＮＡウイルスから類推して、複製はマイナス鎖ＲＮＡ中間体によって行われ、そして細胞質膜に会合したレプリカーゼ複合体を形成するＮＳタンパク質により触媒される。
【０００３】
患者血漿サンプル中に存在するＨＣＶ粒子の低いレベル及び有効なＨＣＶ複製又は粒子アセンブリーを支持する細胞培養システムの欠如は、ビリオンと会合した糖タンパク質
の特徴付けを妨害してきた。ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質に関する最近の知見は、ウイルス若しくは非ウイルス発現ベクターによる細胞培養一過性発現アッセイに基づいている。これらの研究は、Ｅ１及びＥ２糖タンパク質が相互作用して複合体を形成することを示した（Dubuisson, 2000に概観されている）。非イオン洗剤の存在下に、２つの形態のＥ１Ｅ２複合体が検出される：非共有結合相互作用により安定化されたＥ１Ｅ２ヘテロニ量体及びミスフォールディングされた複合体を表すと考えられる不均一なジスルフィド連結された集合体（aggregate）。以前に、エンベロープ糖タンパク質特異的抗体が合成ペプチド又は組換え抗原による免疫化により得られた。しかしながら、ＨＣＶ糖タンパク質ヘテロ二量体のネイティブ前出芽形態（native prebudding form）と考えられる非共有結合により連結されたＥ１Ｅ２ヘテロ二量体を認識する立体配座感受性Ｅ２−反応性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｈ２）は、血清由来のＨＣＶ ＲＮＡポジティブ粒子と反応しない（Deleersynder et al., 1997）。更に、ＷＯ９２／０７００１は、感染したチンパンジーから抽出したＨＣＶ粒子の調製物によるマウスの免疫化により調製された抗体を開示しているが、これらの抗体は天然のＨＣＶ粒子（即ち、感染した患者由来の）に対して試験されていない。更に、ＷＯ００／０５２６６は、感染した患者のＢ細胞から調製された抗体を開示しているが、これらの抗体は組換えＥ２タンパク質に結合する能力に従って選ばれている。ゆえに、すべてのこれらの抗体は、診断目的又は治療若しくは予防目的の限定された用途である。何故ならば、それらは非自然のＨＣＶ又はその一部により産生されているか又は選ばれており、そして天然のＨＣＶ粒子と相互作用することが示されていないからである。
【０００４】
十分な量及び濃度で天然のエンベロープドＨＣＶ粒子を含有するＨＣＶ調製物の欠如は、天然ＨＣＶ粒子を認識する傾向がある（liable to recognize）抗体をこれまで得ることができなかった理由の１つである。事実、血漿サンプル中のＨＣＶ粒子の低いレベルは、このウイルスの特徴付け及び可視化を困難にした。以前に、天然に感染した患者の血漿からの感染の急性期の間に回収されたウイルスは、ショ糖における約１．０６g/mlの浮遊密度を有していることが示された（Hijikata et al., 1993）。反対に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ複製後の細胞培養物から回収されたＨＣＶはショ糖における１．１２g/mlの浮遊密度を有する（Yoshikura et al., 1996）。最後に、慢性的に感染している個体から回収されたＨＣＶはショ糖における約１．１７g/mlの浮遊密度を有している（Hijikata et al., 1993）。血清由来のウイルスの低い密度は、血清低密度リポタンパク質とのその会合のせいであるとされた（Thomssen etal., 1992）。高密度ウイルスは、抗原−抗体複合体中のウイルスに結合した抗体と会合していることが示された（Kanto et al., 1995）。これらのデータにもかかわらず、これらの異なるＨＣＶ母集団のタンパク質組成に関する指示及び低密度画分（＜１．０g/ml）が完全なビリオンとしてエンベロープ、ＲＮＡ及びヌクレオカプシドを含有するかどうかに関する指示はまだない。
【０００５】
ゆえに、本発明の目的は、天然のＨＣＶ粒子と反応する抗体を提供することである。
【０００６】
本発明の他の観点は、抗体産生動物の有効な免疫化を可能とするのに十分な量及び濃度で天然のＨＣＶ粒子の組成物を提供することである。
【０００７】
本発明の他の観点は、医薬組成物の活性物質として使用されやすい、感染のない特異的）ＨＣＶ組成物を提供することである。
発明の詳細な説明
【０００８】
本発明は、天然のＨＣＶウイルスエンベロープに特異的に結合することができる立体配座抗体に関する。
【０００９】
「立体配座抗体」という表現は、その分子環境により規定された三次元構造を有するエピトープを認識する抗体を示す。
【００１０】
「特異的に結合する」という表現は、天然のＨＣＶウイルスエンベロープを形成するエレメントの実質的に１つのみに見出されるエピトープに抗体が結合すること、即ち、天然のＨＣＶエンベロープを形成するエレメント以外のエレメントとの抗体の結合が実質的にないということを意味する。例えば、抗体の結合特異性は、当業者に周知の方法、例えば、生物学的サンプルをゲル上で電気泳動により移動させ、次いで膜に転写しそして前記抗体と共インキュベーションし、次いでこれを二次抗体により検出するウエスタンブロット実験により試験することができる。該抗体は、検出された電気泳動バンドの実質的すべてが標的化合物又はその一部を含有するならば、該生物学的サンプル中に含有された標的化合物に「特異的に結合している」と言われる。
【００１１】
「ＨＣＶ」は、「肝炎Ｃウイルス」を意味し、それはChoo et al., (1989, 1991）に特に記載されている。ＨＣＶは、特に、ＲＮＡ、コアタンパク質から作られたカプシド並びに脂質及びタンパク質、特に糖タンパク質を含むエンベロープを含む。
【００１２】
「ＨＣＶウイルスエンベロープ」は、脂質及びタンパク質、特に糖タンパク質、例えば、ＨＣＶタンパク質Ｅ１及びＥ２から作られる（Clarke, 1997）。
【００１３】
「天然の」とは、ＨＣＶ又はその一部が生物学的サンプル中に見いだされたままでありそして場合により単離されたままであり、そして必要ならば、生物学的サンプルから精製されたままであることを意味する。このようなサンプルはＨＣＶにより感染した患者の血液、血漿又は血清であることができる。特に、「天然の」は、組換え法により又は細胞系若しくは動物を使用することにより産生されたものではなく、そして例えば、Schalich et al.(1996), Blanchard et al., (2002）又はＷＯ９２／０７００１に記載のＨＣＶエメントとは異なるＨＣＶ又はその一部を指す。
【００１４】
本発明は、更に詳しくは、天然のＨＣＶ Ｅ２タンパク質に特異的に結合することができる立体配座抗体に関する。
【００１５】
ＨＣＶ Ｅ２は、特にDubuisson(2000）及びOp De Beeck et al.(2000）に記載されている。それは、開裂されてＥ２（アミノ酸３８４〜７１４）を生じるポリタンパク質（３０１２アミノ酸）として産生される。
【００１６】
「特異的に結合する」という表現は、抗体が、実質的にＨＣＶ Ｅ２タンパク質にのみ見いだされるエピトープ又はその一部に結合することを意味する。特に、抗体は、抗体−Ｅ２複合体が他のタンパク質と一緒に存在する競合試験においてＨＣＶ Ｅ２タンパク質から引き離される（detached）ことはできない。
【００１７】
「天然のＨＣＶ Ｅ２タンパク質」という表現は、タンパク質がＨＣＶにより感染した
患者の生物学的サンプルにおいて見いだされるままであること、特に天然のＨＣＶ Ｅ２タンパク質は組換えタンパク質ではないことを意味する。
【００１８】
本発明は、患者におけるＨＣＶ感染を中和することができる、上記したとおりの立体配座抗体に関する。
【００１９】
「ＨＣＶ感染を中和する」とは、抗体が、例えば、血液、血漿又は血清中に検出されるＨＣＶの減少により証明されうるとおり、ＨＣＶにより感染した患者の健康を改善することができること、又は個体がＨＣＶによる感染されるのを抗体が阻止することができることを意味する。
【００２０】
該抗体のＨＣＶ感染中和能力は、ＨＣＶにより慢性的に感染しているか又は該抗体の存在下にＨＣＶにより初めに感染される（primo-infected）モデル動物、例えば、チンパンジー又はマウス、特にヒトに適合したマウス（humanized mice）において監視することができる。監視された抗体は、それぞれ、ＨＣＶ関連ウイルス血症の減少を誘発するか又はＨＣＶによる感染を阻止することができるべきである。
【００２１】
本発明は、共有結合形態又は非共有結合形態下のＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体を沈殿させることができる上記した立体配座抗体に関する。
【００２２】
ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体は、非共有結合であることができる、即ち、Ｅ１及びＥ２は、弱い結合、例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス結合又は疎水性結合によって会合しているか、又は共有結合であることができる、即ち、Ｅ１及びＥ２は共有結合、例えば、ジスルフィド結合によって会合している。Ｅ１Ｅ２複合体の共有結合形態及び非共有結合形態は特にDeleersnyder et al.(1997）に記載又は示唆されている。
【００２３】
「沈殿する」とは、抗体が ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体を不溶性にすることができることを意味する。沈殿は、例えばDubuisson and Rice(1996）により記載のとおりに行うことができる。
【００２４】
本発明は、天然のＥＣＶ Ｅ１タンパク質に特異的に結合することができる上記した立体配座抗体に関する。
【００２５】
ＨＣＶ Ｅ１は、特にDubuisson(2000）及びOp De Beeck et al.(2000）に記載されている。それは、開裂されてＥ１（アミノ酸１９２〜３８３）を生じるポリタンパク質（３０１２アミノ酸）として産生される。
【００２６】
「特異的に結合する」という表現は、抗体が、実質的にＨＣＶ Ｅ１タンパク質上にのみ見いだされるエピトープ又はその一部に結合することを意味する。特に、抗体は、抗体−Ｅ１複合体が他のタンパク質と一緒に存在する競合試験においてＨＣＶ Ｅ１タンパク質から引き離されることはできない。
【００２７】
「天然のＨＣＶ Ｅ１タンパク質」という表現は、タンパク質がＨＣＶにより感染した
患者の生物学的サンプルにおいて見いだされたままであること、特に天然のＨＣＶ Ｅ１タンパク質は組換えタンパク質ではないことを意味する。
【００２８】
本発明は、更に詳しくは、天然のＨＣＶ Ｅ１タンパク質、天然のＨＣＶ Ｅ２タンパク質に特異的に結合することができ、そして共有結合形態又は非共有結合形態下のＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体を沈殿させることができる立体配座抗体に関する。
【００２９】
本発明は、下記の配列：
ＨＣＶタンパク質Ｅ１のアミノ酸２９７〜３０６、
ＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸４８０〜４９４、
ＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸６１３〜６２１、
の少なくとも１つからなるエピトープに特異的に結合することができる上記した立体配座抗体に関する。
【００３０】
本発明に従う抗体は、
−下記の配列：ＲＨＷＴＴＱＧＣＮＣ（配列番号１）に相当するＨＣＶタンパク質Ｅ１のアミノ酸２９７〜３０６を含むペプチドを提示する分子；及び／又は
−下記の配列：ＰＤＱＲＰＹＣＷＨＹＰＰＫＰＣ（配列番号２）に相当するＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸４８０〜４９４を含むペプチドを提示する分子；及び／又は
−下記の配列：ＹＲＬＷＨＹＰＣＴ（配列番号３）に相当するＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸６１３〜６２１を含むペプチドを提示する分子、
に結合することができる。
【００３１】
前記配列の少なくとも１つへの該抗体の結合は、前記配列のいずれかを含有するペプチドを合成し、そして当業者により周知された方法、例えば、ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡにより該合成されたペプチドに対する抗体結合能力をアッセイすることにより試験することができる。
【００３２】
頭字語「ＥＬＩＳＡ」は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）を意味する。
【００３３】
頭字語「ＥＩＡ」は、エンザイムイムノアッセイを意味する。
【００３４】
本発明は、下記の配列：
ＨＣＶタンパク質Ｅ１のアミノ酸２９７〜３０６、
ＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸４８０〜４９４、
ＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸６１３〜６２１、
の各々からなるエピトープに特異的に結合することができる上記した立体配座抗体に関する。
【００３５】
本発明に従う抗体は、
−下記の配列：ＲＨＷＴＴＱＧＣＮＣ（配列番号１）に相当するＨＣＶタンパク質Ｅ１のアミノ酸２９７〜３０６を含むペプチド、及び
−下記の配列：ＰＤＱＲＰＹＣＷＨＹＰＰＫＰＣ（配列番号２）に相当するＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸４８０〜４９４を含むペプチド、及び
−下記の配列：ＹＲＬＷＨＹＰＣＴ（配列番号３）に相当するＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸６１３〜６２１を含むペプチド、
を含むエピトープを提示する分子に結合することができる。
【００３６】
前記の配列の各々を含むエピトープへの該抗体の結合は、分子、特に配列ＲＨＷＴＴＱＧＣＮＣ（配列番号１）を含むタンパク質、及び分子、特に配列ＰＤＱＲＰＹＣＷＨＹＰＰＫＰＣ（配列番号２）を含むタンパク質、及び分子、特に、配列 ＹＲＬＷＨＹＰＣＴ（配列番号３）を含むタンパク質に対する抗体結合能力を、当業者に周知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡによりアッセイすることによって試験することができる。
【００３７】
本発明は、モノクローナル抗体である前記した立体配座抗体に関する。
【００３８】
「モノクローナル抗体」という表現は、抗体が実質的に１つのエピトープ又は該エピトープの一部に結合することを意味する。
【００３９】
モノクローナル抗体は、不死化された抗体分泌細胞、例えばハイブリドーマ由来のモノクローナル細胞系から得ることができる。
【００４０】
モノクローナル細胞系は、独特の細胞の培養から誘導される。
【００４１】
ハイブリドーマは、例えば、Kohler and Milstein(1975）又はButtin et al.(1978）に従って、抗体分泌細胞、例えばＢ細胞と不死化された細胞との融合により産生することができる。
【００４２】
本発明の他の観点に従えば、上記したモノクローナル抗体は、受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９８３の下で２００３年３月１９日に、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France）にブタペスト条約の下で寄託されたハイブリドーマにより分泌される。
【００４３】
該モノクローナル抗体は、特に、天然のＨＣＶウイルスエンベロープ、天然のＨＣＶ Ｅ２タンパク質、天然のＨＣＶ Ｅ１タンパク質に結合し、そして共有結合形態又は非共有結合形態下のＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体を沈殿させることができ、そして上記した配列の少なくとも１つ又はすべてからなるエピトープに結合することができる。該モノクローナル抗体は、特に今後Ｄ３２．１０と呼ばれる。
【００４４】
本発明の他の観点に従えば、上記したモノクローナル抗体は、受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９８２の下で２００３年３月１９日に、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France）にブタペスト条約の下で寄託されたハイブリドーマにより分泌される。
【００４５】
該モノクローナル抗体は、特に、天然のＨＣＶウイルスエンベロープ及びＨＣＶ Ｅ２タンパク質に結合する。該モノクローナル抗体は、特に今後Ｄ４．１２．９と呼ばれる。
【００４６】
本発明は、本発明に従う抗体の断片又は誘導体にも関する。本発明の抗体の断片は、特に、当業者に周知されているＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）断片を包含する。本発明の抗体の誘導体は、もし適当ならば、ヒトに適合した抗体（humanized antibodies）を含む。ヒトに適合した抗体は、例えば、もし適当ならば、本発明に従う抗体の一部がヒト抗体の対応する部分、例えば、Ｆｃ断片により置換されているキメラ抗体であることができる。替わるものとして、本発明に従う抗体の複合決定領域（complex determining region）（ＣＤＲ）を、例えば、US patent number 5, 824, 307に記載の如きヒト抗体に移植させることができる。
【００４７】
他の態様に従えば、本発明は、受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９８３の下で２００３年３月１９日に、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France）にブタペスト条約の下で寄託されたハイブリドーマに関する。
【００４８】
他の態様に従えば、本発明は、受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９８２の下で２００３年３月１９日に、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France）にブタペスト条約の下で寄託されたハイブリドーマに関する。
【００４９】
他の態様に従えば、本発明は、活性物質として上記した抗体の少なくとも１つ及び薬学的に許容されうるベヒクルを含む医薬組成物に関する。
【００５０】
薬学的に許容されうるベヒクルは、特に、Remington's Pharmaceutical Science 16thed./Mack Publishing Coに定義されているとおりである。
【００５１】
他の化合物、特に抗ウイルス化合物、例えば、他の抗ＨＣＶ抗体及びその断片又は誘導体、インターフェロン、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤又はヘリカーゼ阻害剤を上記した組成物中に含ませることができる。
【００５２】
上記した医薬組成物は、１回投与（single dose）又は繰り返し投与（multiple doses）で投与することができる。１回投与の場合には、組成物は、体重１kg当り抗体約０．１mg〜体重１kg当り抗体約１g、特に約１mg／kg〜約１００mg／kgを含むことができる。繰り返し投与の場合には、組成物は、１日当り体重１kg当り抗体約０．１mg〜１日当り体重１kg当り抗体約１g、特に約１mg／kg／日〜約１００mg／kg／日の投与量で投与することができる。
【００５３】
他の態様に従えば、本発明は、ＨＣＶ感染の診断、予防又は治療のための医薬を製造するための、上記した抗体の少なくとも１つの使用に関する。
【００５４】
本発明に従う抗体は、ＨＣＶを含有する傾向がある生物学的サンプル中のＨＣＶウイルス粒子の検出のために使用することができる。このようなサンプルは、ＨＣＶにより感染した患者又はＨＣＶにより感染される危険がある患者から得ることができ、そして特に、血液、血漿又は血清のサンプルを含む。抗体によるウイルスの検出のための当業者の周知した方法、例えばＥＬＩＳＡ又はＥＩＡのどれも、本発明の抗体に関して適用することができる。
【００５５】
本発明に従う抗体は、ＨＣＶに感染した患者又は感染していない患者に投与してＨＣＶ感染を中和する医薬の製造のために使用することができる。ＨＣＶ感染中和は、例えば、抗体を標的細胞膜受容体に結合するエンベロープ分子、例えばＥ１又はＥ２に結合させることによりＨＣＶが標的細胞に接触するのを阻止し、それによりＨＣＶ−標的細胞結合を阻止することによつて進行させることができる。
【００５６】
抗体は、ＨＣＶにより感染した患者に投与して、ＨＣＶウイルス粒子が細胞、特に肝細胞に感染するのを阻止するか、又は免疫系の細胞による該抗体で覆われたＨＣＶの捕捉を促進することができる。
【００５７】
抗体は、特に、移植された器官、特に肝臓を受け取るべき患者に、移植手術の前、移植手術期間中又は移植手術の後に投与して、移植された器官中に含有されることがあるＨＣＶウイルス粒子を中和することができる。
【００５８】
本発明は、上記した抗体の少なくとも１つに結合することができるエンベロープドウイルス粒子にも関する。
【００５９】
「エンベロープドウイルス粒子」という表現は、特にＨＣＶビリオン、又はエンベロープを含有するＨＣＶビリオンの一部を表し、該エンベロープは脂質及び／又はタンパク質、特に小葉（leaflets）において会合した糖タンパク質を含む。
【００６０】
本発明は、上記した抗体の少なくとも１つに結合することができるエンベロープドウイルス粒子に結合する抗体にも関する。
【００６１】
他の態様に従えば、本発明は、ヒト、血液、血漿又は血清の初めのサンプル（initial samples）由来のＨＣＶウイルス粒子の組成物であって、ＨＣＶ ＲＮＡコピーの濃度が、それが由来するヒト、血液、血漿又は血清の初めのサンプル中のＨＣＶ ＲＮＡコピーの濃度より約１００〜１０００倍高い、特に約１０7コピー／mlより高い、組成物に関する。
【００６２】
本発明に従う組成物の高い濃度は、該組成物による動物の有効な免疫化を可能とする。
【００６３】
ＨＣＶ ＲＮＡは特にＨＣＶゲノムＲＮＡである。
【００６４】
サンプルのＨＣＶ ＲＮＡ含有率は、ＲＴ−ＰＣＲ、特に、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、例えば、Ａｍｐｌｉｃｏｒ（登録商標）ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ（登録商標）、Roche Diagnostics（Young et al., 1999）を使用して測定することができる。
【００６５】
別法として、サンプルのＨＣＶ ＲＮＡ含有率は、ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）技術（Damen et al., 1999)）を使用して測定することもできる。
【００６６】
サンプルのＨＣＶ ＲＮＡ含有率は、該サンプル中のＨＣＶ ＲＮＡ分子のコピーの数として表すことができ、ここで１コピーは１国際単位（UI）と同等である。
【００６７】
サンプルのＨＣＶ ＲＮＡ含有率は、該サンプル中に含有されたＨＣＶビリオンの量を示す。
【００６８】
約１０7コピー／mlより多くのＨＣＶ ＲＮＡを含有する組成物は、該組成物による動物の有効な免疫化を可能とする。
【００６９】
本発明は、更に詳しくは、ＨＣＶ ＲＮＡコピーの数がタンパク質mg当り約１０8〜約１０9UIである、上記した組成物に関する。
【００７０】
組成物のタンパク質含有率は、当業者に周知の方法により評価され、特にＬｏｗｒｙアッセイ（lowry et al., 1951）、例えば、Ｂｉｏｒａｄタンパク質アッセイ（Biorad Laboratories）により評価される。
【００７１】
この目安は組成物の特異的活性を表し、それは組成物の純度を示し、タンパク質mg当りＨＣＶ ＲＮＡコピーの数が高ければ高いほど、ＨＣＶ含有組成物の純度は高い。
【００７２】
本発明は、更に、該組成物の容積が約０．１ml〜約１０mlである上記した組成物に関する。
【００７３】
約０．１ml〜約１０mlの組成物容積は、少なくとも１０6ＨＣＶ ＲＮＡコピーを含有する上記した組成物に対応する。
【００７４】
このような組成物は動物の免疫化に有用である。例えば、マウスの有効な免疫化は、実施例で記載のとおり、約１０6より多くのＨＣＶ ＲＮＡコピーを含有するＨＣＶウイルス粒子組成物の投与を必要とする。
【００７５】
他の態様に従えば、本発明は、ＨＣＶ ＲＮＡ及びＨＣＶコアタンパク質を実質的に欠いている単離されたＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子（isolated HCV enveloped subviral particle）に関する。
【００７６】
「単離された」という用語は、粒子がその天然の環境から抽出されたこと、それが、特にＨＣＶ ＲＮＡ及び／又はＨＣＶコアタンパク質を含有する他のＨＣＶウイルス粒子又はその一部から分離されたことを意味する。
【００７７】
「ＨＣＶ ＲＮＡ及びＨＣＶコアタンパク質を実質的に欠いている」という表現は、上記したサブウイルス粒子を含有する溶液が、Ａｍｐｌｉｃｏｒ（登録商標）ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ（登録商標），Roche Diagnostics（Young et al., 1993）により測定して１０4UI／mlより少ないＨＣＶ ＲＮＡを含有し、そしてOrtho-Clinical Diagnostics test(Aoyagi et al., 1999）により測定して１pg／mlより少ないコアタンパク質を含有することを意味する。
【００７８】
エンベロープの存在は、以後Ｄ３２．１０と呼ばれる受託番号Ｉ−２９８３の下でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマにより分泌された抗体又は、以後Ｄ４．１２．９と呼ばれる受託番号Ｉ−２９８２の下でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマにより分泌された抗体によって、例えば、ＥＬＡ又はＥＬＩＳＡ試験により評価されうる。
【００７９】
「ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子」という表現は、粒子が、実質的にＨＣＶビリオンのエンベロープ部分のみ、即ち、脂質及び／又はタンパク質、特に小葉（leaflets）において会合した糖タンパク質を含有することを意味する。今までに単離されたＨＣＶウイルス粒子は、ＨＣＶ ＲＮＡ及び／又はＨＣＶコアタンパク質を含有していた。
【００８０】
本発明は、更に詳しくは、上記した抗体のいずれかに結合する傾向がある、上記の単離されたＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子に関する。
【００８１】
本発明の抗体への上記したサブウイルス粒子の結合は、当業者に周知のいくつかの方法、例えば、免疫沈澱、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ又はウエスタンブロットにより評価されうる。
【００８２】
他の態様に従えば、本発明は、ＨＣＶ ＲＮＡ、ＨＣＶコアタンパク質及ＨＣＶ
エンベロープを含有しそして上記した抗体のいずれかに結合する傾向のある精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子を含む組成物に関する。
【００８３】
本発明は、更に詳しくは、精製された天然のＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子を含む組成物に関する。
【００８４】
「ＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子」という表現は、ＨＣＶビリオンがＨＣＶゲノムＲＮＡ、ＨＣＶコアタンパク質及びＨＣＶエンベロープを含有することを意味する。これらの３つの成分を含有するＨＣＶウイルス粒子の報告は先行技術にはなかった。
【００８５】
ＨＣＶ ＲＮＡ、ＨＣＶコアタンパク質及びＨＣＶエンベロープの存在は、上記した方法を使用することにより評価されうる。
【００８６】
「精製した」という用語は、上記したＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子が他の化合物、例えば、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子から分離されていることを意味する。特に、組成物がＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子よりも９０％少ないＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を含有することは、例えば、電子顕微鏡法により評価されうる。
【００８７】
本発明に従う抗体への上記したＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の結合は、当業者に周知のいくつかの方法、例えば、免疫沈澱、ＥＬＩＳＡ、ＥＩ又はウエスタンブロットにより評価されうる。
【００８８】
他の態様に従えば、本発明は、下記の段階：
ＨＣＶ感染患者の清澄化血漿分離交換法（clarified plasmapheresis）から生じるサンプルを少なくとも２回超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得、
該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させてＨＣＶウイルス粒子の組成物を得る、
段階を含む、ＨＣＶウイルス粒子の組成物を製造する方法に関する。
【００８９】
超遠心は、例えば、約１９０，０００g〜約２２０，０００g、好ましくは２１０，０００gの速度で、約３時間〜約５時間、好ましくは、４時間の期間行うことができる。
【００９０】
好ましい遠心条件は、ウイルス粒子、例えばＨＣＶウイルス粒子を沈殿させるが、清澄化血漿中に含有される他の化合物は沈殿されない。
【００９１】
「血漿分離交換」という用語は、患者の血液をろ過して血漿を得るが、血液の残りは患者に再注入されたことを意味する。
【００９２】
「清澄化された」という用語は、血漿分離交換から得られた血漿が低い速度、特に３０００gで３０分間遠心されたことを意味する。
【００９３】
超遠心の前の血漿分離交換の初期容積は、有利には約１リットルである。
【００９４】
他の態様に従えば、本発明は、ＨＣＶウイルス粒子の組成物を製造するための上記した方法に従って得られる如きＨＣＶウイルス粒子の組成物に関する。
【００９５】
他の態様に従えば、本発明は、下記の段階：
ＨＣＶ感染患者の清澄化された血漿分離交換法から生じるサンプルを少なくとも２回超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得、
該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させ、
該再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットをショ糖密度勾配において超遠心して、再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットのエレメントをそれらの密度に従って画分に分離し、
ＨＣＶ ＲＮＡを実質的に含有せず、ＨＣＶコアタンパク質を実質的に含有せず、そしてＤ３２．１０又はＤ４．１２．９として前記したモノクローナル抗体に結合することができる粒子を含有する画分を回収して、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物を得る、
段階を含む、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物を製造する方法に関する。
【００９６】
再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットのショ糖密度勾配での超遠心は、約１９０，０００g〜約２２０，０００g、好ましくは２１０，０００gで、約４０時間〜約５０時間、好ましくは、４８時間の期間行うことができ、ショ糖勾配は、有利には、約１０％〜約６０％重量／重量、約２０〜約５０％重量／重量、約２５％〜約４５％重量／重量又は約３０％〜約４５％重量／重量であることができる。
【００９７】
得られたすべての画分は、ＨＣＶ ＲＮＡ、ＨＣＶコアタンパク質及び／又はＤ３２．１０若しくはＤ４．１２．９に結合することができる粒子の存在について試験される。
【００９８】
画分は、Ａｍｐｌｉｃｏｒ（登録商標）ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ（登録商標），Roche Diagnostics（Young et al., 1993）により測定したＨＣＶ ＲＮＡの含有率が約１０4UI／mlより小さい場合には、ＨＣＶ ＲＮＡを実質的に含有しないと言われる。
【００９９】
画分は、Ortho-Clinical Diagnostics test（Aoyagi et al., 1999）により測定したＨＣＶコアタンパク質の含有率が約１pg／mlより少ない場合には、ＨＣＶコアタンパク質を実質的に含有しないと言われる。
【０１００】
使用されるモノクローナル抗体は、特に、受託番号Ｉ−２９８３の下でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体Ｄ３２．１０である。
【０１０１】
粒子は、それらが下記のＥＩＡ試験で試験の結果ポジティブでありうるならば、上記したモノクローナル抗体に結合することができると言われる。
【０１０２】
９６ウエルのポリスチレンプレート（Falcon; Becton Dickinson France S.A, Le Pont de Claix）を１０−1〜１０−4に希釈した種々の画分でコーティングした。プレートを４℃で一夜インキュベーションし、次いで５％（重量／容積）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するトリス−ＨＣｌ（ＴＮ）緩衝液（２０mMトリス−ＨＣｌ，pH７．５及び１００mM ＮａＣｌ）で飽和させる。ＴＮ／ＢＳＡ緩衝液と５０％正常ヒト血清（ＮＨＳ）の混合物中に希釈された５μg/mlの濃度のｍＡｂＤ３２．１０を各ウエルに加えそして３７℃で２時間インキュベーションする。結合した抗体を、抗マウス免疫グロブリンのセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）−コンジュゲーテッドＦ（ａｂ’）２断片（１／５０００に希釈；Immunotech）、及び基質としてオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）及び過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）により検出する。光学密度（ＯＤ）を、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＭＲＸ，Ｄｙｎｅｘ）により４５０nm又は４９０nmで決定する。結果は、ネガティブコントロールの平均の掛ける２．１に相当するカットオフより上であるならば、ポジティブであると考えられる。
【０１０３】
回収された画分は、特に、約１．１３〜１．１５g/mlのショ糖密度を有する。
【０１０４】
別法として、画分をＤ３２．１０及び／又はＤ４．１２．９に結合することができる粒子の存在について最初に試験し、もしこのような粒子が実質的に存在しないならば、他の試験を行わず、もしこのような粒子が存在するならば、ＨＣＶ ＲＮＡ試験及び／又はＨＣＶコアタンパク質試験を行う。
【０１０５】
他の態様に従えば、本発明は、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物を製造するための上記の方法に従って得られるようなＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物に関する。
【０１０６】
他の態様に従えば、本発明は、下記の段階：
ＨＣＶ感染患者の清澄化された血漿分離交換法から生じるサンプルを少なくとも２回超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得、
該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させ、
該再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットをショ糖密度勾配において超遠心して、再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットのエレメントをそれらの密度にしたがって画分に分離し、
約５．１０5〜約１０6UI／mlのＨＣＶ ＲＮＡ、約５０〜約１００pg／mlのＨＣＶコアタンパク質を含有しそしてＤ３２．１０又はＤ４．１２．９として前記したモノクローナル抗体に結合することができる粒子を含有する画分を回収して、精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物を得る、
段階を含む、精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物を製造する方法に関する。
【０１０７】
再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットのショ糖密度勾配における超遠心は、約１９０，０００g〜約２２０，０００g、好ましくは２１０，０００gで、約４０時間〜約５０時間、好ましくは、４８時間の期間行うことができ、ショ糖勾配は、有利には、約１０％〜約６０％重量／重量、約２０〜約５０％重量／重量、約２５％〜約４５％重量／重量又は約３０％〜約４５％重量／重量であることができる。
【０１０８】
ＨＣＶ ＲＮＡ含有率、ＨＣＶコアタンパク質含有率及び粒子の結合能力を上記のように測定する。
【０１０９】
使用されたモノクローナル抗体は、受託番号Ｉ−２９８３の下でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体Ｄ３２．１０である。
【０１１０】
この方法により得られた組成物は、特に精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子を含有し、そして特にＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を実質的に欠いている。特に、組成物がＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子よりも９０％少ないＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を含有することが、例えば、電子顕微鏡法により評価されうる。
【０１１１】
回収された画分は、特に、約１．１７〜１．２１g/ml、更に詳しくは約１．１７〜１．２０g/ml、約１．１９〜１．２１g/ml、約１．１７〜１．１９g/ml又は１．１９〜１．２０g/mlのショ糖密度を有する。
【０１１２】
別法として、画分を、最初にＨＣＶ ＲＮＡの存在について試験し、１０5コピー／mlより多くのＨＣＶ ＲＮＡが存在するならば、ＨＣＶコアタンパク質試験を行い、もし５０pg／mlより多くのコアタンパク質が存在するならば、Ｄ３２．１０及び／又はＤ４．１２．９に結合することができる粒子の存在を試験し、もし１０5コピー／mlより少ないＨＣＶ ＲＮＡが存在するならば、他の試験を行わない。
【０１１３】
他の態様に従えば、本発明は、上記の対応する方法に従って得られるような精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物に関する。
【０１１４】
本発明は、下記の段階：
−動物、特に哺乳動物を本発明のＨＣＶウイルス粒子の組成物又は本発明に従って製造されるようなものにより免疫化し、そして発生した抗体を回収し、
−発生した抗体のなかで、ＨＣＶウイルス粒子の上記した組成物中に含有されたＨＣＶウイルス粒子に結合する能力に基づいてモノクローナル抗体を選ぶ、
段階を含む、受託番号Ｉ−２９８３の下でＣＮＣＭに受託されたハイブリドーマにより分泌されたモノクローナル抗体を製造する方法に関する。
【０１１５】
ＨＣＶウイルス粒子の組成物は、下記のようにして得ることができる：
−ＨＣＶ感染患者の清澄化された血漿分離交換から生じるサンプルを少なくとも２階超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得；
−該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させてＨＣＶウイルス粒子の組成物を得る。
【０１１６】
発生した抗体の選択は、プレートを本発明のＨＣＶウイルス粒子の組成物によりコーティングして、上記した間接ＥＩＡ試験により行うことができる。
【０１１７】
他の態様に従えば、本発明は、下記の段階：
−動物、特に哺乳動物を本発明の精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物又は本発明に従って製造されるようなものにより免疫化し、そして発生した抗体を回収し、
−発生した抗体のなかで、精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の上記した組成物中に含有された精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子に結合する能力に基づいてモノクローナル抗体を選ぶ、
段階を含む、受託番号にＩ−２９８２の下でＣＮＣＭに受託されたハイブリドーマにより分泌されたモノクローナル抗体を製造する方法に関する。
【０１１８】
精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物は、下記のようにして得ることができる：
ＨＣＶ感染患者の清澄化された血漿分離交換法から生じるサンプルを少なくとも２回超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得、
該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させ、
該再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットをショ糖密度勾配において超遠心して、再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットのエレメントをそれらの密度に従って画分に分離し、
約５．１０5〜約１０6UI／mlのＨＣＶ ＲＮＡ、約５０〜約１００pg／mlのＨＣＶコアタンパク質を含有しそしてＤ３２．１０又はＤ４．１２．９として前記したモノクローナル抗体に結合することができる粒子を含有する画分を回収して、精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物を得る。
【０１１９】
選択段階は前記のように行うことができる。
【０１２０】
他の態様に従えば、本発明は、下記の段階：
−動物、特に哺乳動物を本発明の又は本発明に従って製造されるＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物により免疫化し、そして発生した抗体を回収し、
−発生した抗体のなかで、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の上記した組成物中に含有されたＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子に結合する能力に基づいてモノクローナル抗体を選ぶ、
段階を含む、ＨＣＶ、特に、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子に対するモノクローナル抗体を製造する方法に関する。
【０１２１】
ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物は、下記のようにして得ることができる：
−ＨＣＶ感染患者の清澄化された血漿分離交換法から生じるサンプルを少なくとも２回超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得、
−該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させ、
−該再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットをショ糖密度勾配において超遠心して、再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットのエレメントをそれらの密度に従って画分に分離し、
−ＨＣＶ ＲＮＡを実質的に含有せず、ＨＣＶコアタンパク質を実質的に含有せずそしてＤ３２．１０又はＤ４．１２．９として前記したモノクローナル抗体に結合することができる粒子を含有する画分を回収して、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物を得る。
【０１２２】
選択段階は上記のように進めることができる。
【０１２３】
本発明は、更に詳しくは、本発明のＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子に対する抗体に関する。
【０１２４】
本発明は、活性物質としてＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子に対する少なくとも１つの抗体及び薬学的に許容されうるベヒクルを含む医薬組成物にも関する。
【０１２５】
他の態様に従えば、本発明は、活性物質として上記したＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を、又は上記したＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を含む組成物、及び薬学的に許容されうるベヒクルを含む医薬組成物に関する。
【０１２６】
更に、Remington's Pharmaceutical Science 16thed./ Mark Publishing Coに定義されているようなアジュバントを、医薬組成物に加えることができ、該アジュバントは、例えば不完全フロイントアジュバント、アルミニウム塩又は水酸化アルミニウムであることができる。
【０１２７】
組成物は、例えば、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子１mg〜１gを含む単一投与量（single dose）で投与することができる。
【０１２８】
他の態様に従えは、本発明は、上記したＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子又は上記したＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を含む組成物の使用であって、該ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子に対する免疫反応又は上記したＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子に対する免疫反応を誘発するための使用に関する。
【０１２９】
「免疫反応を誘発する」という表現は、ＨＣＶウイルス粒子に対する抗体を分泌するＢ細胞を活性化することができること又はＨＣＶにより感染した細胞を殺すT細胞を活性化することができることを意味する。
【０１３０】
他の態様に従えば、本発明は、ＨＣＶ感染の診断、予防又は治療用の医薬を製造するための、上記したＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子又は上記したＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を含む組成物の使用に関する。
【０１３１】
ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子は当業者に周知された方法、例えばＥＩＡ、ＥＬＩＳＡに従うイムノアッセイにおいてＨＣＶに対する抗体の存在を評価するのに使用することができる。
【０１３２】
ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子は、肝炎Ｃに対するワクチン、特に治療ワクチンの製造のために使用することができる。
【０１３３】
「治療ワクチン」という表現は、ワクチンがＨＣＶにより感染した患者の状態を、例えば、ＨＣＶに対する抗体の産生を誘発することにより改善することができることを意味する。
【０１３４】
実施例１
天然のＨＣＶウイルスエンベロープに対するモノクローナル抗体の取得
ＨＣＶウイルス粒子の調製
良好な供給においてウイルス物質を得るために、ＨＣＶウイルス粒子の精製を血漿分離交換から行った。選ばれた患者は、Ｃウイルス硬変のための部分的肝臓移植後に慢性の活性肝炎Ｃを発生し、そして１２ヶ月後、血漿交換の原因である高ガンマグロブリン血症と関連した多発性骨髄腫を発生した。患者は、異常に高い血清アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ／ＡＳＴ）レベルを示しそして抗ＨＣＶ抗体についてポジティブであった。患者はすべてのＨＢＶ及びＨＩＶマーカーについてネガティブであった。初めの材料のＨＣＶ ＲＮＡ含有率は、６×１０5コピー／ml（Ａｍｐｌｉｃｏｒ（登録商標）ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ（登録商標）、Roche Diagnostics, Meylan, France）であり、そして遺伝子型１ｂ（ＩＮＮＯ−ＬＩＰＡアッセイ，Innogenetics, Gent, Belgium）であった。
【０１３５】
清澄化血漿分離交換を使用して、２１０，０００gで４℃で４時間の２回の引き続く超遠心によりＨＣＶに富んだペレットを調製した。最終ペレットをトリス−ＮａＣｌ−ＥＤＴＡ（ＴＮＦ）緩衝液（２０ミリモル／L トリス−ＨＣｌ、pH７．５、１００ミリモル／L ＮａＣｌ、１ミリモル／L ＥＤＴＡ）（濃度２４０倍）１ml中に再懸濁させ、そして−８０℃で貯蔵した。この材料のＨＣＶ ＲＮＡ含有率は３×１０7コピー／mlであり（Monitor, Roche）、そしてタンパク質濃度は５mg/ml（即ち、約１０7コピーのＨＣＶ ＲＮＡ／タンパク質１mg）であった。
【０１３６】
ハイブリドーマ調製
モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を発生させるために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、完全フロイントアジュバント中のＨＣＶペレット化材料１００μg（ＨＣＶ ＲＮＡ１０6コピー）を接種し、続いて１週間後に不完全フロイントアジュバント中のウイルス１００μgを接種した。３匹の免疫化されたマウスは、間接エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）により検出されたＨＣＶに対する高い血清抗体力価を発生した。３週間後、マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のウイルス５０μgでブーストした。５日後、注射を繰り返し、そして３日後、脾臓を取り出して、Ｂuttin et al.(1978)により記載された方法によりＸ６３骨髄腫細胞と融合させた。固相として免疫原（５μg/ml）を使用しそして顕色第二抗体（Petit et al., 1987）として抗マウス免疫グロブリンのペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッドＦ（ａｂ’）２断片（Amersham, France）を使用する間接ＥＩＡによって、ハイブリドーマ培養上澄液を、ＨＣＶ特異的抗体の存在についてスクリーニングした。希釈剤は、５０％の正常なヒト血清（ＮＨＳ）を含有していて、ＨＣＶウイルス粒子と場合により会合したＮＨＳタンパク質に対する非特異的反応性を除去した。次いで、限界希釈することにより、ＨＣＶに対する最も強いシグナル（Ｐ／Ｎ＞１０）を与えるハイブリッドを再クローニングし、そしてそれらの特異性を更に決定した。７つのクローン（（Ｃ９．１９．１６、Ｃ２．２２．１、Ｄ３２．１０、Ｄ３．２０．１２、Ｃ７．２４．１９、Ｃ７．１４．４１及びＣ１．９．３）を選択し、そして４つのクローン（Ｄ３２．１０、Ｃ２．２２．１、Ｃ９．１９．１６及びＤ．３．２０．１２）を、プリスタンでプライミングしたＢＡＬＢ／ｃマウスに注射することにより増殖させて腹水液を産生させ、次いで５０％飽和（ＮＨ4）2ＳＯ4で沈殿させること、次いでセファロース−プロテインＧ（Pharmacia, France）におけるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。アイソタイプを、当業者に周知の方法によってＥＬＩＳＡにより決定した。分析した７つのクローンはＩｇＧ１アイソタイプの抗体を与えた。
【０１３７】
モノクローナル抗体特徴付け
間接ＥＩＡを使用して、上記したモノクローナル抗体とウイルス粒子との相互作用を評価した。９６ウエルのポリスチレンプレート（Falcon; Becton Dickinson France S.A, Le Pont de Claix）を、１０−1〜１０−6（１００μg/ml〜１ng/mlに相当する）に希釈されたＨＣＶ調製物（１mgタンパク質/ml）でコーティングした。プレートを４℃で一夜インキュベーションし、次いで５％（重量／容量）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するトリス−ＮａＣｌ（ＴＮ）緩衝液（２０mMトリス−ＨＣｌ、pH７．５及び１００mM ＮａＣｌ）で飽和させた。ＴＮ／ＢＳＡ緩衝液及び５０％正常ヒト血清（ＮＨＳ）の混合物中に５μg/mlの濃度に希釈されたｍＡｂＤ３２．１０を、各ウエルに加えそして３７℃で２時間インキュベーションした。結合した抗体を、抗マウス免疫グロブリン（１／５，０００に希釈された；Immunotech）のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）−コンジュゲーテッドＦ（ａｂ’）２断片及び基質としてオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）及び過酸化水素により検出した。光学密度（ＯＤ）をＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＭＲＸ，Ｄｙｎａｘ）により４５０nmで側定した。結果は、ネガティブコントロールの平均の掛ける２．１に相当するカットオフより上である場合にポジティブであると考えられた。得られた７つの抗体はウイルス粒子を認識した。
【０１３８】
ｍＡｂｓのネイティブポリペプチド特異性を確立するために、抗原性プローブ（Petit et al., 1987）として免疫原を使用するイムノブロッティングを行った。１２．５％ゲルでのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を還元条件下に（２％ＳＤＳ＋５％２−ＭＥ）行った。ＰＶＤＦ膜へのタンパク質移行の後、ｍＡｂｓ（２〜５μg/ml）を一次抗体として試験し、５０％ＮＨＳ中に希釈し、そして結合したＩｇＧｓを、二次抗体として抗マウス免疫グロブリンのペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッドＦ（ａｂ’）２断片（１／１０，０００に希釈された；ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ）とのインキュベーションにより検出した。バンドをAmershamからの高められた化学発光（ＦＣＬ＋）システムにより可視化した。
【０１３９】
Ｄ３２．１０を除くすべての試験したｍＡｂｓは、還元条件下にＨＣＶポリペプチドとのネガティブ反応を与えた。選ばれたｍＡｂｓは、ＥＩＡにおいてヒトＩｇＧと弱く反応した（ネガティブ値の約５倍）Ｃ１．９．３及びＣ７．２４．１９を除いて、ヒト血清アルブミン又は免疫グロブリン（Ｉｇ）のγ鎖若しくはμ鎖と反応性ではなかったことは注目に値する。
【０１４０】
７つの抗体のポリペプチド特異性も免疫沈澱により検査した。ＨＣＶタンパク質（Ｅ１、Ｅ２又はＥ１Ｅ２）を発現するワクシニアウイルス組換え体により感染したＨｅｐＧ２細胞を、前記したように、35S-Translabel（ＩＣＮ）で代謝的に標識した（Dubuisson et al., 1996）。細胞を、１０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．５）、１５０mM ＮａＣｌ及び２mM ＥＤＴＡ中の０．５％ＮＰ−４０により細胞溶解した。沈殿をＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液で処理し、そして還元条件又は非還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１）。試験したモノクローナル抗体は、Ｃ９．１９．１６（＞２００kDa）、Ｄ３．２０．１２（７０、５０及び４６kDaにおける３つの強いバンド）及びより弱くは、Ｃ２．２２．１（７０、５０、４６kDa）及びＤ３２．１０（多数の非常に弱いバンド）（図１Ａ、コントロールベクター）を除いて、細胞成分に対する非特異的反応性を示さなかった。すべての抗体は、２つのＨＣＶ糖タンパク質が別々に発現される場合には、Ｅ１（図１Ｂ）及びＥ２（図１Ｃ）を特異的に免疫沈殿させ、そしてこれらのタンパク質が共発現される場合には、Ｅ１Ｅ２ヘテロ二量体（図１Ｄ）を特異的に免疫沈殿させた。興味深いことに、パターンは、非還元条件及び還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥの後異なっていた（図１Ｄ、図１Ｅ）。すべてはジスルフィドで連結されたＥ１Ｅ２集合体を認識したが、これは非還元条件下にゲルの上部において検出された（図１Ｅ）。１つのｍＡｂ、Ｄ３２．１０は、大抵集合体と反応しそして非共有結合連結された成熟複合体Ｅ１Ｅ２とも反応する（図１Ｅ、非還元条件）ことが見出された。すべてのｍＡｂｓは、異種システムにおいて発現された変性された組換えＥ１又はＥ２タンパク質をウエスタンブロットにより認識しなかったが、これは、それらがＨＣＶウイルス粒子上の立体配座エピトープを認識したことを示唆している。集約すると、これらの結果は、これらのｍＡｂｓは天然の血清由来のＨＣＶウイルス粒子の表面に発現されたジスルフィドで連結されたＥ１Ｅ２複合体を特異的に認識することを示している。それらはＥ１タンパク質とＥ２タンパク質との間の共有された立体配座エピトープと反応することは極めて確かである。共有結合形態又は非共有結合形態下のＥ１Ｅ２複合体と相互作用するモノクローナル抗体Ｄ３２．１０が更なる研究のために選ばれた。
【０１４１】
モノクローナル抗体Ｄ３２．１０抗原マッピング
Ｄ３２．１０のＨＣＶ型特異性を試験するために、４つの異なるＨＣＶ調製物（ml当り１mgのタンパク質）を１０−1〜１０−6（１００μg/ml〜１ng/mlに相当する）に希釈して、既に記載した方法に従って、間接ＥＩＡを行った。免疫原ＨＣＶ調製物に加えて、同じ患者から得られた調製物を使用し、そして慢性肝炎Ｃを有する２人の異なる患者から得られた２つの他の調製物を使用したが、患者の１人は血清において２つの異なる遺伝子型、即ちＨＣＶ１ａ及びＨＣＶ２ａ、を有することが見出された。Ｄ３２．１０は、ＨＣＶ調製物のすべての４つを認識することができることが見出され、それによりそれは免疫原の１ｂ遺伝子型に拘束されない決定基を認識することができることを示す。
【０１４２】
Ｄ３２．１０のネイティブポリペプチド特異性を評価するために、ウエスタンブロット分析を行った。未処理のＨＣＶに富んだペレットを、０．１から１mg/mlまで変わる種々の濃度で抗原フローブとして使用した。抗原を還元条件又は非還元条件（２％ＳＤＳ±５％２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）下に１２．５％ゲルでのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付した。ＰＶＤＦ膜へのタンパク質移行の後、５０％ＮＨＳ中に希釈された一次抗体としてｍＡｂＤ３２．１０（２〜５μg/ml）を使用してイムノブロッティングを行った。次いで結合したマウスＩｇＧｓを、二次抗体として抗マウス免疫グロブリンのペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッドＦ（ａｂ’）２断片（１／１０，０００に希釈された；ＤＡＫＯ）とのインキュベーションにより検出した。タンパク質バンドをAmershamからの高められた化学発光（ＥＣＬ＋）により可視化した。循環しているＨＣＶビリオンに対してSato et al.(1993）により今までに記載されたとおりにグリコシダーゼ消化を行った。ＨＣＶに富んだペレット（ＨＣＶ−Ｌ、４μg）を、１００mMクエン酸塩／リン酸塩緩衝液（pH６．０）中のグリコシダーゼＡ（ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＡ又はＰＮＧアーゼＡ；ＲＯＣＨＥ）５、１０又は２０mU／mlで３７℃にて１８時間処理した。エンドグリコシダーゼＨ（ｅｎｄｏＨ、５mU／ml、Rocheから）、２０mMジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含有する５０mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH５．５）中で３７℃で一夜インキュベーションすることにより、精製されたＨＣＶウイルス粒子の脱グリコシル化も行った。酵素を省いたことを除いては、ＰＧＮアーゼＡ消化又はｅｎｄｏＨ消化の場合と同じ条件を使用してコントロール消化を行った。次いでサンプルを、還元剤を含有する電気泳動サンプル緩衝液で処理しそしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１４３】
ウエスタンブロット実験の結果を図２に示される。同じサンプルの２つの濃度（それぞれ、２．５及び５μg、レーン２及び３）が還元条件（２％ＳＤＳ／５％２−ＭＥ）下に分析されるとき、ｍＡｂＤ３２．１０は、それぞれＥ２及びＥ１に対応する６８kDaの主要バンド及び３１kDaの他のバンドを認識した。しかしながら、非還元条件下では、ｍＡｂ３２．１０は、ゲルの上部に回収されたジスルフィドで連結された複合体（＞２００kDa）を認識した。これらの高分子量バンド（図２、レーン１）はヘテロ二量体Ｅ１Ｅ２複合体に対応することは極めて確かである。
【０１４４】
アスパラギンで連結された複合体型糖鎖は、ＨＣＶのネイティブビリオンの表面に存在することが示され（Sato et al., 1993）、かくして種々の濃度（２０、１０及び５mU／ml）のグリコシダーゼ（ＰＮＧアーゼＡ）によるＨＣＶ調製物の処理後のＨＣＶ特異的タンパク質を認識するＤ３２．１０ｍＡｂの能力を検査した。図３Ａ（それぞれ、レーン１、２及び３）に示されたとおり、Ｄ３２．１０は、酵素の最も高い濃度で蓄積したＥ１の脱グリコシル化形態、特に２５kDa種と反応した。Ｅ１関連産物は脱グリコシル化後にＤ３２．１０により明らかに検出することができたが、Ｅ２関連産物は処理後明白には同定されなかった。エンドグリコシダーゼＨ（ｅｎｄｏＨ）消化は、天然のＨＣＶウイルス粒子上に発現されたＥ１Ｅ２複合体のｅｎｄｏＨ開裂に対する感受性の調査を可能とした。図３Ｂに示されたとおり、分子量のシフトが、Ｅ２（６８〜４２kDa）及びＥ１（３４〜２４kDa）タンパク質で観察され、これはＥ１及びＥ２が、部分的ｅｎｄｏＨ抵抗性の主な原因である、血清由来のネイティブＨＣＶウイルス粒子における複合グリコシル化（complex glycosylation）、例えば、ｅｎｄｏＨ抵抗性複合グリカンと感受性形態の混合物を有することを示唆する。
【０１４５】
Ｄ３２．１０エピトープマッピング
ａ．ペプチドライブラリーのスクリーニング
ｍＡｂＤ３２．１０により認識されたエピトープを更に特徴付けるために、抗体を使用してドデカペプチドファージディスプレーライブリーをスクリーニングした。
【０１４６】
Ｐｈ．Ｄ−１２（登録商標）ファージディスプレイペプチドライブラリーキットをNew England Biolabs Incから得た。これは、Ｍ１３ファージの少量コートタンパク質（ｐＩＩＩ）に融合したコンビナトリアルペプチド１２量体（１２−ｍｅｒｓ）である。ディスプレイされたペプチド１２量体はｐＩＩＩのＮ末端で発現される。ライブラリーは、約１．９×１０9個のエレクトロポレーションされた配列からなり、これらは一旦増幅されると供給されたファージ１０μlにおいて各配列約２０コピーを生じる。いくらかの修正を伴って製造者の取扱説明書に従って３回のバイオパンニング（biopannings）を行った。簡単に言えば、ビオチニル化ｍＡｂｓＤ３２．１０の１０μgを、ストレプトアビジン４０μgでコーティングされた３５mmポリスチレンペトリ皿（Falcon）にカップリングさせた。皿を４℃で一夜インキュベーションし、そして０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含有する５０mMトリス、１５０mM ＮａＣｌ、pH７．５（ＴＢＳ）で６回洗浄した。第１回の選択では、最初のライブラリーからの４×１０10個のファージをロッキング条件（rocking condition）下に４℃で４時間皿に結合したＩｇＧと反応させた。結合しなかったファージをＴＢＳ−Ｔによる繰り返し洗浄により除去した。次いで、結合したファージを溶離緩衝液（０．１Ｎ ＨＣｌ、グリシンにより２．２に調節されたpH、１mg/mlＢＳＡ）４００μlで皿から溶離させた。７５μlの１Ｍトリス−ＨＣｌ pH９．１で中和した後、次いで溶離したファージを、取扱説明書に推奨されたとおりに、Ｅ．ｃｏｌｉＥＲ２５３７（ｒｅｃＡ＋株細胞）の一夜の培養物の１：１００希釈物２０mlに感染させることにより増幅した。培養物を激しく振とうしながら、３７℃で４．５時間インキュベーションした。上澄液を得、そして前に記載されたとおり（Scott et al., 1990）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により沈殿させた。第２及び第３回の選択では、先の回からの増幅されたファージの２０％をそれぞれ１０及び１nMの最終濃度でビオチニル化ｍＡｂＤ３２．１０と４℃で一夜予備インキュベーションし、次いでストレプトアビジン１０μgでコーティングされた３５mmポリスチレンペトリ皿に加えた。次いで処置は第１回と同じであった。次いで第３バイオパンニング溶離物からのファージをクローニングしそしてＤＮＡ配列決定及びイムノ分析のために増幅した。
【０１４７】
ＤＮＡ配列決定のために、Sambrook et al.(1982）により記載されたとおり精製したファージから一本鎖ＤＮＡを調製した。ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット（Perkin-Elmer）を使用してApplied Biosystems ＤＮＡシーケンサー（Ｍｏｄｅｌ３７７Ａ）によりSangerの改変された方法（Sanger et al., 1977）に従って、遺伝子ＩＩＩインサートのヌクレオチド配列を決定した。ｐＩＩＩ遺伝子配列に対応するプライマー５’ＨＯ−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−ＯＨ３’（配列番号４）によりサイクルシーケンス法を行った。インサートのアミノ酸配列をヌクレオチド配列から推定した。
【０１４８】
上澄液ファージに対するＥＬＩＳＡのために、ＥＬＩＳＡプレートウエルの列を、０．１MＮａＨＣＯ3緩衝液（pH８．６）中の１００μg/mlの最終濃度のｍＡｂＤ３２．１０又は無関係のｍＡｂ １００μlでコーティングした。プレートを４℃で一夜インキュベーションし、次いでＢＳＡ５mg/mlを含有する０．１M ＮａＨＣＯ3緩衝液（pH８．６）でブロックした。４℃で２時間インキュベーションの後、プレートを０．５％Ｔｗｅｅｎを含有するＴＢＳで６回洗浄した。各ファージクローンの４倍逐次希釈物を、ＴＢＳ−Ｔ１００μlの最終容積においてマイクロタイタープレートの各ウエルに加え、列の第１ウエル中の１０12個のビリオンで出発しそして第１２ウエル中の２×１０5個のビリオンで終わる。プレートを、攪拌しながら室温で２時間インキュベーションし、次いで上記したＴＢＳ−Ｔで６回洗浄した。結合したファージを、１：５，０００希釈率のセイヨウワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッド抗Ｍ１３ｍＡｂ（Pharmacia）を使用してサンドイッチアッセイにおいて検出した。プレートを、ＯＰＤ及びＨ2Ｏ2を含有する市販のカラーキット（bioMerieux）を使用して顕色した。１０分のインキュベーションの後、プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９２nmで読み取った。各ファージクローン希釈物について、結果を、試験した抗ＨＣＶｍＡｂで得られた値と無関係のｍＡｂで得られた値との差として表した。次いで、結果を免疫反応性クローンの最適希釈物を３回反復して試験することにより確認した。
【０１４９】
配列分析のために、ペプチドのアミノ酸配列を、Mac Vector, Ver.4.5ソフトウエア（Kodak）の使用によりＨＣＶＥ１及びＥ２タンパク質配列と比較した。基本的に、最も高い類似性の領域を、最善の位置確認を試験的に調査するＬＦＡＳＴＡプログラム（Pearson and Lipman, 1988）で検出した。
【０１５０】
第３回の選択の後、ファージインプットの４％が、特異的に結合したファージの増幅を示す溶離物において見出された。かくして、８８クローンを、ランダムに単離し、それらのＤＮＡを配列決定しそしてインサートのアミノ酸配列を推定した。４８の異なる配列が得られそしてそれらのいくらかはいくつかの実施例で見出された。しかしながら、Ｄ３２．１０とのそれらの免疫反応性についてＥＬＩＳＡ試験で試験すると、それらのいずれもポジティブシグナルを与えなかったが、これは、結合アフィニティが検出することができるのにはあまりにも低すぎることを示す。４８クローン配列をＨＣＶＥ１及びＥ２の配列と比較した。５及び３の配列は、それぞれ２９２〜３０５領域及び３４７〜３５６領域に位置したＥ１の残基との類似性を示したが（類似性は表１にボールド体に示される）、これに対して７、４及び２の配列は、それぞれ領域４８１〜５０１、６１０〜６３１及び６８５〜６９８に位置しているＥ２の残基とのいくらかの類似性を共有していた（類似性は表２のボールド体で示されている）。
【０１５１】
【表１】
【０１５２】
【表２】
【０１５３】
ｂ．ペプチド合成
Ｅ１及びＥ２配列に関するこれらの異なる局在化の意義を評価するために、Ｅ１の領域２９１〜３１５及び３４７〜３５６並びにＥ２の領域４７３〜４９８、６０７〜６２７及び６８６〜６９７を１つだけずれた重なり合っている合成ペンタデカペプチドとして再現しそしてＤ３２．１０とのそれらの免疫反応性について試験した。
【０１５４】
９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノ酸化学（Frank, 1988）を使用してニトロセルロース膜で、種々のペプチド配列の同時合成を行った。
【０１５５】
各ペプチドを免疫学的検出に適当なナノモル量で発生させた。膜に結合したペプチドに対する抗体反応性を、先に記載された（Jolivet-Reynaud, 1998）間接比色イムノアッセイにより分析した。抗体反応性を有するペプチドに対応するスポットは、ポジティブブルーシグナルを生じた。スポットの強度を可視化により評価しそして０〜５の範囲のスケールで相対的強度として表した。
【０１５６】
２９２〜３０５Ｅ１領域に対応するペプチドで強いポジティブシグナルが得られ、これに対して３４７〜３５６Ｅ１領域はＤ３２．１０により認識されなかった。それぞれＥ２領域４８２〜４９９及６１２〜６２６に対応するペプチドもＤ３２．１０と免疫反応性であり、そしてＥ２領域６８６〜６９７ではシグナルは検出されなかった。ペンタデカペプチドとしてＥ１の領域２９２〜３０６並びにＥ２の領域４８０〜４９４及び６０８〜６２２は、ＥＬＩＳＡにおいてＤ３２．１０と相互作用した。
【０１５７】
重なり合っているオクタペプチドを使用することにより、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質の297ＲＨＷＴＴＱＧＣＮＣ306（配列番号１）領域並びにＨＣＶ Ｅ２タンパク質の613ＹＲＬＷＨＹＰＣＴ621（配列番号３）及び480ＰＤＱＲＰＹＣＷＨＹＰＰＫＰＣ494（配列番号２）領域の両方がＤ３２．１０と反応性であった。Ｅ２において同定された２つの領域は、Ｅ１Ｅ２のヘテロ二量化に関与していることがYagnik et al.(2000）により示唆された同じモチーフＷＨＹＰを含有する。実際に、これらの領域を識別するのは困難であるが、２つのオーバーラッピングしていないゾーンとして：479ＧＰＤＱＲＰＹＣ486（配列番号２６）及び487ＷＨＹＰＰＫＰＣ494（配列番号２７）はＤ３２．１０に別々に結合し、これは、Ｄ３２．１０が各オクタペプチドを特異的に認識すること、それゆえ完全な配列（４８０〜４９４）を特異的に認識することを示唆する。
【０１５８】
実施例２
血清由来のＨＣＶウイルス粒子の特徴付け及び精製
種々のＨＣＶ母集団を分離するために、最終のＨＣＶに富んだペレットをショ糖密度勾配（１０〜６０％、重量／重量）における等密度遠心（４℃で４８時間２１０，０００g）に付した。画分（０．６ml）を集め、そして各々の密度を屈折率測定法により側定した。ＨＣＶ ＲＮＡ含有率を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Amplicor Monitor, Roche）により分析し、ＨＣＶコアタンパク質含有率をOrtho-Clinical Diagnostics試験で測定し、そしてｍＡｂＤ３２．１０に対するＨＣＶウイルス粒子抗原反応性を間接ＥＩＡにより測定した。
【０１５９】
ウエルを１０−1〜１０−4に希釈した種々の画分でコーティングすることを除いて間接ＥＩＡを上記したとおりに行った。
【０１６０】
３つの異なる母集団を同定した（図４）。１つの母集団（画分３〜５）は１．０６〜１．０８g/mlのショ糖密度に階層区分されており（banded）、そしてＤ３２．１０による間接ＥＩＡにより得られたネガティブな結果により証明されるとおりウイルスエンベロープを実質的に欠いているが、ＨＣＶ ＲＮＡ（約２．１０5UI／ml）及びＨＣＶコアタンパク質（約２〜４pg／ml）を含有していた。これらは、エンベロープのないウイルス粒子であると思われる。他の母集団（図の画分８〜１０）は１．１４〜１．１５g/mlのショ糖密度に階層区分されており、そしてＨＣＶ ＲＮＡを実質的に欠いており（約１０4〜１０5UI／ml）そしてＨＣＶコアタンパク質を実質的に欠いている（約１pg／ml）が、Ｄ３２．１０に応答する高いレベルの粒子（約１〜３．８ＯＤ450nm単位）を含有していた。これらのＨＣＶサブウイルス粒子はＨＣＶウイルスエンベロープのみを含有するようである。第３母集団（画分１１〜１４）は１．２０〜１．２１g/mlのショ糖密度に階層区分されており、そして高いレベルのＨＣＶ ＲＮＡ（約５．１０5〜１０6UI／ml）及びＨＣＶコアタンパク質（約２．５〜８pg／ml）を有しそしてＤ３２．１０に応答する（約０．５〜１．５ＯＤ450nm単位）粒子を含有していた。このゆえに、この母集団は実質的に精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子のみを含有する。
【０１６１】
ＨＣＶに富んだペレット（図５Ａ）及び第２（図５Ｃ）及び第３母集団（図５Ｂ）に含有されているウイルス粒子を、Ｄ３２．１０により免疫沈殿させそして電子顕微鏡法により観察した。ＨＣＶウイルス粒子のいくつかの調製物をこの方法により分析した。ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子は約３０nm（３３．０８nm）の平均直径を有する球状粒子として現れる（図５Ｃ）が、これに対してＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子は、約５０nm（４８．７２nm）の平均直径を有することを除いては同じく球状に見える（図５Ｂ）。
【０１６２】
実施例２の２
血清由来のＨＣＶウイルス粒子の特徴付け及び精製
感染した患者の血漿中に存在するＨＣＶウイルス粒子の母集団の他の分析も本発明者により行われた。
【０１６３】
血清由来のＨＣＶ粒子の精製
実施例１で得られたＨＣＶに富んだペレット（ＨＣＶ−Ｌ）を、物理化学的、免疫学的及び形態学的研究のために使用し、そして規則的な血漿交換を必要とする重い皮膚脈管炎（cutaneous vascularitis）と関連したタイプＩＩクリオグロブリン血症を有する慢性肝炎Ｃ（ＣＨ−Ｃ）を示した他の患者（ＨＣＶ−Ｆａｎ、遺伝子型１ａ／２ａ）の血漿分離交換由来のペレットを使用した。ＨＣＶ−Ｌ患者の場合と同じく、後者のＨＣＶ−Ｆａｎ患者は、異常に高い血清アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ／ＡＳＴ）レベルを示し、抗ＨＣＶ抗体に対してポジティブであり、そしてすべてのＨＢＶ及びＨＩＶマーカーに対してネガティブであった。
【０１６４】
かくして、７つの血清調製物を特徴付けた。それらは定量的Ａｍｐｌｉｃｏｒ ＨＣＶ ＲＮＡ Ｍｏｎｉｔｏｒ試験（Roche）において、２．５×１０6コピ―／ml〜５〜７．５×１０7コピー／mlに対応する、１０6UI／ml〜２〜３×１０7UI／ml（ＨＣＶ−Ｆａｎ、ＨＣＶ−Ｌ）でＨＣＶ ＲＮＡに対してポジティブであった。
【０１６５】
異なるＨＣＶ母集団を分離するために、最終のＨＣＶに富んだペレットをショ糖密度勾配（１０〜６０％又は３０〜４５％、重量／重量）において等密度遠心（４℃で４８時間２００，０００g）に付した。画分（０．６ml）を、集めそして各々の密度を屈折率測定法により側定した。ＨＣＶ ＲＮＡ含有率を定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Amplicor Monitor, Roche）により監視した。固相上に種々の希釈率（１／１０〜１／１００００）で各画分をコーティングした後、上記したとおり間接ＥＩＡによりＭＡｂＤ３２．１０を使用してＨＣＶエンベロープ（ｅｎｖ）反応性を検出した。抗コアモノクローナル抗体の混合物（７Ｇ１２Ａ８、２Ｇ９Ａ７及び１９Ｄ９Ｄ６）（Jolivet-Reynaud et al., 1998; Menez et al., 2003）を使用して定量的Ｏｒｔｈｏアッセイ及びウエスタンブロットを使用することにより、ＨＣＶコア抗原をアッセイした。
【０１６６】
簡単に言えば、ＨＣＶに富んだペレット及びショ糖勾配から集めた各画分中のトータルＨＣＶコア抗原の測定を、OrthoR trak-C（登録商標）アッセイ（Ortho-Clinical Diagnostics, Inc）を使用して行った。OrthoR trak-C（登録商標）アッセイは、ＨＣＶコア抗原の種々の領域に対する特異性を有するいくつかのモノクローナル抗体を使用する定量的イムノキャプチャーアッセイである。この方法は、サンプル調製物を遊離させるための予備処理段階を使用し、免疫複合化させそしてアッセイに利用可能なビリオン会合抗原を使用する（Aoyagi et al., 1999）。ＨＣＶ ＲＮＡを、Roche Molecular System（Meylan, France）により開発された定量的ＲＴ−ＰＣＲ、Amplicon（登録商標）ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ（登録商標）により評価した。増幅段階は、単一管、単一酵素（rTth DNA polymerase）、単一プライマー対を組み合わせた逆転写及びＤＮＡポリメリゼーション（Colucci and Gutekunst, 1997）を伴なう。検出を、比色マイクロウエルプレートアッセイにより行った。ＰＣＲキャリーオーバーコンタミネーション（PCR carryover contamination）のコントロールは、汚染している増幅ＤＮＡを不活性化するためにアッセイに組み込まれたＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）を含んでいた（Longo et al., 1990）。
【０１６７】
ＨＣＶに富んだペレットを、最初にショ糖密度勾配（１０％〜６０％）における等密度遠心に付した。Ｅ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性を示すエンベロープドウイルス粒子の存在を、抗Ｅ１Ｅ２ＭＡｂＤ３２．１０（その特異性は実施例１に先に明瞭に述べられた）を使用して上記した間接ＥＩＡ法（図１４Ａ及び図１４Ｃ）及びウエスタンブロット（図１４Ｂ及び図１４Ｄ）により調べた。図１４Ａ及び図１４Ｃに示されたとおり、１．１２g/mlと１．１７g/mlとの間にピークを有しそして１．１８g/ml〜１．２３g/mlの「ショルダー」を有する、ＥＩＡにおけるＥ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性（１／１００００に希釈された画分）を、画分９（１．１２g/mlの密度）〜画分１６（１．２３g/mlの密度）から回収した。全然ないか又は非常に低いＤ３２．１０反応性（１／１０に希釈された画分）を、低密度複合体（１．００６〜１．１０g/ml）に対応する画分において検出した。同様な結果が、遺伝子型１ｂの単離ＨＣＶ−Ｌ（図１４Ａ）及び遺伝子型１ａ／２ａの単離ＨＣＶ−Ｆａｎ（図１４Ｃ）で得られた。単離ＨＣＶ−Ｌのいくらかの画分（６、８、１０、１２、１４）（図１４Ｂ）及び単離ＨＣＶ−Ｆａｎのすべての画分（４〜１８）を、ＭＡｂＤ３２．１０によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットに付した。Ｅ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性が、画分８（密度#１．１０g/ml）から勾配の底部まで明らかに現れた。注目すべきことに、最も強いＥ１Ｅ２反応性が、１．１７〜１．２０g/mlの密度に対応する画分１１、１２及び１３（図１４Ｄ）において観察された。より高い分子量（ＨＭＷ）のバンドをこれらの画分において検出することができたが、これは多分このような密度に階層区分されるウイルス粒子の表面に存在するＥ１及びＥ２エンベロープ糖タンパク質のオリゴマー形態に対応する。Ｅ１及びＥ２の両方に対する他の強い反応性は、ＥＩＡにおけるピークに対応する画分９（１．１３g/mlの密度）において観察された（図１４Ｃ）。すべての血清由来のＨＣＶ調製物は、ショ糖密度勾配（１０〜６０％）におけるＥ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性の同じ平衡階層区分プロフィル（equilibrium banding profiles）を与えた。
【０１６８】
エンベロープドＨＣＶ母集団をさらに特徴付けるために、ＨＣＶ−Ｆａｎペレットを、タイプ１の３０〜４５％ショ糖勾配（３０％２ml、３５％３ml、４０％３ml、４５％２ml）における等密度遠心に付した。これらの実験条件下に、Ｅ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性の２つのピークは、図１５Ａに示されたとおり、明白に個別化することができた。間接ＥＩＡは、約１．１５g/mlの密度の第１の狭いピーク（ピーク１）及び約１．１８g/ml〜１．２２g/mlの密度の第２の大きいピーク（ピーク２）を示した。ショ糖勾配（３０〜４５％）ピーク１（画分８）及び２（画分１２及び１３）からの粒子を個々に第２平衡遠心に付した。ピーク１を３０〜４５％のタイプ２のショ糖勾配（３０％３ml、３５％３ml、４０％２ml、４５％２ml）において遠心した（図１５Ｂ）。唯一の狭いＥ１Ｅ２抗原ピーク（ピーク１）は、１．１３〜１．１４g/ml（約３２％ショ糖、画分５及び６）の密度に移行した。ピーク２を、タイプ３の３０〜４５％ショ糖勾配（３０％２ml、３５％２ml、４０％３ml、４５％３ml）において遠心した（図１５Ｃ）。主要ピーク（ピーク２）ははるかに速く沈降し、約１．１８g/ml（４０％スクロースに対応する）の密度で最大Ｅ１Ｅ２抗原性を示した。後者のＥ１Ｅ２抗原ピーク（ピーク２）は、非対称的に現れ、より低い密度を前方に移動させ、そして１．１４g/mlのショ糖密度に階層区分されるＥ１Ｅ２母集団（ピーク１）と僅かに重なり合っており、前者のＥ１Ｅ２抗原ピーク（ピーク１）より大きい不均一性を示唆する（図１５Ｂ、１５Ｃ）。
【０１６９】
Ｅ１Ｅ２エンベロープドウイルス粒子の２つの母集団（ピーク１及び２）間の浮遊密度の差を解明するために、上記したタイプ１の３０〜４５％ショ糖勾配からの画分を、Ｏｒｔｈｏ ＨＣＶコアアッセイ（図９Ａ）及びウエスタンブロット（図１５Ｂ）によりＨＣＶコア抗原について試験した。
【０１７０】
簡単に言えば、ポリペプチド特異性を、抗原プローブ（１〜５μg/ml）としてＨＣＶサンプルを使用するイムノブロッティングにより決定した。１２．５％ゲルでのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を還元条件（２％ＳＤＳ＋５％２−ＭＥ）下に行った。ＰＶＤＦへのタンパク質移行後に、抗Ｅ１Ｅ２ＭＡｂＤ３２．１０（２〜５μg/ml）又は抗コアＭＡｂｓ７Ｇ１２Ａ８、２Ｇ９Ａ７及び１９Ｄ９Ｄ６（各々５μg/ml）を一次抗体として使用し、５０％ＮＨＳ中に希釈し、次いで、第二抗体として抗マウス免疫グロブリンのＨＲＰＯ−コンジュゲーテッドＦ（ａｂ’）２断片（１／１０，０００に希釈された、Immunotechから購入した）とのインキュベーションにより、結合したＩｇＧｓを検出した。ブロットをAmershamからの高められた化学発光（ＥＣＬ Ｐｌｕｓ）システムで顕色させた。
【０１７１】
両実験アプローチは、約１．１７〜１．１９g/ml（４０％ショ糖）の密度で第２Ｅ１Ｅ２抗原ピーク（ピーク２）において最大ＨＣＶコア抗原反応性が回収されることを示した。ウエスタンブロットにおける分析（図９Ｂ）により、２５kDaのＨＣＶコアタンパク質を、初めの材料（ＨＣＶ−Ｆａｎペレット）及び画分８〜１３において同定した。５０、７５及び１５０kDaにおけるバンドも検出され、これはＨＣＶコア遺伝子コード化産物のオリゴマーに対応することができた。ＨＣＶ ＲＮＡを、最初の１０〜６０％ショ糖勾配からのすべての画分において定量的ＲＴ−ＰＣＲ Ｍｏｎｉｔｏｒ試験（Roche）により分析した（図１０）。ウイルスＲＮＡの２つのピークは１．０５５〜１．０７５g/mlの密度及び１．１６〜１．２１g/mlの密度で生じた。後者のピークの総力価は１０6UI／mlであり、そして第２Ｅ１Ｅ２抗原ピーク（ピーク２）に対応していた。対照的に、ピーク１に対応する画分９（１．１３g/mlの密度）は、最も低い力価のＨＣＶＲＮＡを含有していた。かくして、ピーク２（約１．１７〜１．２０g/ml）は、Ｅ１Ｅ２複合体、ＨＣＶコアタンパク質、高い力価のＨＣＶ ＲＮＡを含有しており、そして完全なビリオンを示しているようである。ピーク１（１．１３〜１．１５g/ml）は、主としてＥ１Ｅ２複合体を含有しておりそしてサブウイルス粒子（ＳＶＰｓ）を示しているようである。低密度複合体（１．００６〜１．１０g/ml）は、裸のヌクレオカプシドに相当するコア及びＨＣＶ ＲＮＡのみを含有していた。
【０１７２】
かくして、本発明のＤ３２．１０モノクローナル抗体を使用して、慢性肝炎Ｃ患者の血清中に見出された最も優勢なタイプのエンベロープドウイルス粒子を分析した。濃縮したウイルス材料のショ糖勾配における沈降、定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＨＣＶ ＲＮＡの監視とカップリングしたイムノアッセイ及びイムノブロッティングによるタンパク質組成（コア及びエンベロープタンパク質）の分析により、１．１３〜１．１５g/ml及び１．１７〜１．２１g/mlの２つの異なる密度で沈降したＥ１Ｅ２エンベロープド粒子の２つの母集団をそれぞれ同定した。第１母集団は、Ｅ１及びＥ２エンベロープタンパク質を含有するがヌクレオカプシドを欠いているサブウイルス粒子（ＳＶＰｓ）に対応していた。第２母集団はＨＣＶビリオンに対応することができた。何故ならば、これらの粒子はＥ１及びＥ２エンベロープタンパク質、コアタンパク質及び高力価のＨＣＶ ＲＮＡを含有していたからである。
【０１７３】
血清由来のＨＣＶ粒子の形態学的特徴付け
Ｅ１Ｅ２（Ｄ３２．１０）特異的モノクローナル抗体による免疫沈殿後のＨＣＶ−Ｆａｎペレットの電子顕微鏡法（免疫電子顕微鏡法又はＩＥＭ）を、下記の方法に従って行った。
【０１７４】
簡単に言えば、血清由来のＨＣＶ調製物（２、２０又は２００μg）又は勾配からの画分（０．１ml）をＭＡｂＤ３２．１０の０．１ml（５μg）又は同じアイソタイプ（ＩｇＧ１）の無関係のモノクローナル抗体（Ｆ３５．２５，ＨＢＶ抗ｐｒｅＳ１）（Petit et al.,1989）と混合した。３７℃で１時間、次いで４℃で１６時間インキュベーションを行った。次いで混合物をＴＮＦ緩衝液１０ml中に希釈しそして４８，０００gで１時間遠心した。ペレットをＴＮＥ緩衝液０．１mlに懸濁させた。Ｄ３２．１０−免疫沈殿したＨＣＶ粒子を、グロー放電したＦｏｒｍｖａｒ／カーボンコーテッドキュプロングリッド（glow-discharged Formvar/ carbon-coated cupron grids）へ５分間吸収させそして１％酢酸ウラニル（pH４．５）により４分間染色した。次いでＪＥＯＬ １００ＣＸ電子顕微鏡を使用して調製物を可視化した（Imaging facility, Laennec Faculty, Lyon, France）。間接免疫金標識化のために、グリッドを、第二抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ−コロイド状金粒子（１０nm直径；BioCell Research Laboratories）の１：５０希釈物とインキュベーションした。
【０１７５】
コントロール実験は、調製物のサイズ不均一性が抗原：抗体比と共に変わることを示した（結果は示されていない）。形態学的統合性（morphological integrity）を保存するために、ＨＣＶ粒子の単離方法は沈殿及びショ糖勾配遠心のみを伴なった。このような実験条件下に、図１１Ａに示されたとおり、相対的に明確な輪郭の粒度分布が得られた。非対称ピークは約３５nmに中心を有していた。このサイズの粒子（３０〜４０nm）が優性であった（５６％）。本質的に、粒子の大部分（８０％）は３０nmより大きい直径を有し、平均値は３８．２８nm（１５６粒子の中から１２５）であり、粒子の２０％は４０〜５０nm（平均値＝４３．６１nm）でありそして４％が５０〜６０nm（平均値＝５５．６９nm）である。すべての粒子の２０％のみが３０nmよりも小さい直径を有していた（平均値＝２６．３５nm）。電子顕微鏡（図１１Ｂ）は、ＨＣＶ粒子が相対的に規則的な滑らかな表面により特徴付けられることを示した。図１１Ｂ、パネルａ及びｂは、ＨＣＶエンベロープド粒子のサイズの不均一性を示す。図１１Ｂ、パネルｃは５０nmの直径を有する粒子を示し、そしてパネルｄは３５nmの直径を有する粒子を示す。極めて均一なより高い密度が３５nmの粒子の表面に現れたが（図１１Ｂ、パネルｄ）、これに対してより低い密度のより軽い区域を５０nmの直径を有する粒子の中心に明白に観察することができた（図１１Ｂ、パネルｃ）。無関係な一次モノクローナル抗体を使用する場合は粒子はＩＥＭにより可視化されなかった（図１１Ｂ、パネルｅ）。ショ糖勾配ピーク１及び２からの粒子を、免疫沈殿させ、染色しそしてＩＥＭによっても分析した（図１２Ａ〜１２Ｂ）。図１２Ａに示されたとおり、ピーク１の優勢な種（８５．４％）は、約２０nm（４１粒子の中から３５、平均値＝２０．６nm）の直径を有する球状粒子であった。粒子の１４．６％のみが３０nmより大きい直径を有していたが、これは多分ピーク２との重なりに対応する。ピーク２は、ピーク１の材料よりもサイズが幾分より不均一に見えた（図１２Ｂ）。しかしながら、この母集団中の最も主要な形態（７７．５％）は、約４１nm（８９粒子の中から６９、平均値＝４１．１５nm）の平均直径を有しており、これは全ＨＣＶビリオン（whole HCV virion）の直径に対応することができる。少数のより小さい３０nm直径の粒子（１３．５％）をこの調製物において見ることができたが、これは多分ピーク１との重なりから生じたものである。不均一な主要なより速く沈降するピーク（ピーク２）は、主として３５及び５０nmの直径の大きな粒子からなり、これに対して均一な少量のより遅く沈降するピーク（ピーク１）は、約２０nmの直径の小さな粒子からなっていた。ひっくるめると、形態学的研究は、２つのサイズクラスのＥ１Ｅ２エンベロープドＨＣＶ粒子が感染患者の血清中に共存することを示す。間接免疫金標識化（図１３）によれば、先にＩＥＭにより同定されたすべての球状エンベロープド粒子は、１０nm金標識された二次抗体を特異的に固定した。
【０１７６】
かくして、ＭＡｂＤ３２．１０による免疫電子顕微鏡法により、トータルエンベロープド母集団（total enveloped population）（ＨＣＶに富んだペレット）及び各Ｅ１Ｅ２母集団の相対的に明確な輪郭の粒度分布を別々に決定した。エンベロープドＨＣＶ粒子は、サイズが不均一であるが、２つの異なるサイズクラスの粒子を容易に同定することができた。主要な種は、多分エンベロープの格子構造に依存して、３５nmから５０nmまで変わる直径を有する大きな粒子からなっていたが、これは完全なカプシド含有エンベロープド粒子に対応する。他のより均一な種は、カプシドのないＳＶＰｓに対応する、約２０nmの直径を有する小さな粒子からなっていた。ＭＡｂＤ３２．１０に結合したすべてのこれらの粒子をさらに同定しそして抗マウスＩｇＧ−金粒子による間接標識化を使用して電子顕微鏡法により可視化した。
【０１７７】
感染性ビリオンに加えて、非感染性ＳＶＰｓの形成は、フラビウイルス感染の共通の特徴である（Russel et al., 1990）。これらはカプシドのない空のウイルスエンベロープを表すことが示唆された（Mason et al., 1991）。それは肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）で感染した細胞においても起こり、そして分泌されたＳＶＰｓはエンベロープタンパク質のみの発現により産生される（Laub et al., 1983）。これらの粒子は、ビリオンより小さい。これは、これらのタンパク質が、コアの存在下又は不存在下に特異的粒状構造を固有に自己形成することができることを証明する。これらの粒子はアセンブルされ、そしてグリコシル化及び炭水化物プロセッシングを含む、全ビリオン（whole virions）と同じ成熟プロセスを受ける。このような組換えエンベロープＳＶＰｓによる免疫化は、動物モデル（Konishi et al., 1992; Heinz et al., 1995）及びヒト（Leroux-Roels et al., 1994）においてそれらが優れた予防性免疫原であることを示す。
【０１７８】
完全なビリオン（complete virions）及びＳＶＰｓのＭＡｂＤ３２．１０との反応性は、Ｅ１（２９７〜３０６）−Ｅ２（４８０〜４９４）（６１３〜６２１）立体配座エピトープが、ＨＣＶビリオン及びＳＶＰｓの表面に本質的に同じ方法で提示されることを示す。しかしながら、血清由来のビリオン及びＳＶＰｓ上に検出されたこのようなエピトープは、遺伝子組換えにより得られたそして異種システム：バキュロウイルス／昆虫細胞（Baumert et al., 1999）又はレトロウイルス／２９３Ｔ細胞（Bartosch et al., 2003）において産生された粒子上には欠けており、これは、この複合部位が、これらの組換えＨＣＶ粒子の表面に存在しないか及び／又はこれらの組換えＨＣＶ粒子の表面の離れた近づきがたい領域（inaccessible regions）に存在することを示唆する。前者のＨＣＶ様粒子（ＨＣＶ−ＬＰｓ）はＥＲに保持されそして後者のＨＣＶ擬粒子（ＨＣＶｐｐ）の小さな画分（small fraction）のみが細胞表面に達した。ＭＡｂＤ３２．１０はＨＳＡ又は免疫グロブリンのγ鎖若しくはμ鎖と反応性ではないことは注目する価値がある。それは、Ｅ１、Ｅ２の２つのタンパク質がＨｅｐＧ２細胞でワクシニアウイルス組換え体により別々に又は一緒に発現される場合には、Ｅ１、Ｅ２及びＥ１Ｅ２ヘテロ二量体を特異的に免疫沈殿させることができる。かくして、それは、大抵ジスルフィド結合で連結された集合体と反応しそしてＥ１Ｅ２非共有結合連結された成熟複合体とはより弱く反応する。しかしながら、それは、このような異種システムで発現された変性された組換えＥ１又はＥ２タンパク質をブロッティング分析により認識しない。これは、血清由来のウイルス表面におけるＥ１、Ｅ２及びＥ１Ｅ２のアレンジメント（arrangement）が組換えＨＣＶ粒子において見いだされるものとは異なるというのに味方する。天然の構造は、アセンブリー条件に依存する。独特な構造の形成を調節する条件が異種システムに存在していないならば、ＶＬＰｓ及びＨＣＶｐｐにおける二量体アレンジメントは類似しておらず、ＳＶＰｓ及びビリオンが感染患者の血清から単離される場合の、ＳＶＰｓ及びビリオン表面の類似性とは対照的である。組換えサブウイルス粒子（ＲＳＰｓ）及びビリオンにおいて、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）を含むフラビウイルスのエンベロープタンパク質（Ｅ）のパッキングの１つの特に注目に値する特徴は、それらがヘッドツーテイル方位（head-to-tail orientation）においてウイルス表面に平坦な状態にあるということである（Ferlengi et al., 2001）。Ｉｇ様フォールド（Ig-like fold）を有しそして受容体結合に関係している、ドメインＩＩＩの外側表面（lateral surface）は近接可能である（accessible）が、融合ペプチドはインターナルループである（Rey et al., 1995）。それゆえ、フラビウイルスは受容体媒介エンドサイトーシス及びエンドソームにおける低pHで誘発される融合により細胞に入る（Rice, 1996）。アセンブルしている粒子は、ＥＲの膜又は早期分泌経路の中間区画を経る出芽（budding）によりそのエンベロープを取得すると考えられる。次いで粒子はトランスゴルジ網（ＴＧＮ）を通して形質膜に輸送され、成熟し、そうして複合糖を取得する。すべてのこれらの段階はウイルスアセンブリーに極めて重要でありそして複製サイクルの多くの相において重要な役割を果たす。
【０１７９】
意外にも、すべてのＨＣＶ粒子は、それらの起源が何であれ、同様な生物物理的性質を示すようである。昆虫細胞でアセンブルされ、株ＨＣＶ−ＪｃＤＮＡから誘導された又は感染性クローンＨ７７ｃから誘導された、ＨＣＶ−ＬＰｓのショ糖勾配沈降パターンは、ショ糖平衡勾配において１．１４〜１．２０g/mlであった（Wellnitz et al., 2002）。粒子の大部分は４０〜６０nmの直径を有していた。しかしながら、ＨＣＶ−ＬＰｓの外側表面のＥ１及びＥ２エクトドメイン（ectodomains）に提示されたすべてのエピトープ（Wellnitz et al., 2002）は、ＭＡｂＤ３２．１０のＥ１及びＥ２特異性とは異なる。それゆえ、たとえ粒子がショ糖において同じ密度で沈降するとしても、それらは異なる免疫反応性を有し、これは不適切な輸送及び／又はフォールディングと関連していることがあり、そして明らかに、細胞結合及び感染性に関して、異なる機能的性質をもたらすであろう。
【０１８０】
血清エンベロープドＨＣＶ粒子とは反対に、ＨＣＶに感染した個体の血漿から単離したＨＣＶコア粒子は昆虫細胞において産生されたヌクレオカプシド様粒子と類似していると思われる．ＨＣＶヌクレオカプシドは、ＣｓＣｌ勾配において１．３２〜１．３４g/mlの密度に階層区分されそして直径が３８〜６２mmで、サイズが極めて不均一であった（Maillard et al., 2001）。すべてのこれらの粒子は、抗コアＭＡｂｓと反応性であるが、組換えタンパク質による免疫化により産生された抗Ｅ１及び抗Ｅ２ＭＡｂｓと反応性ではない（Deleersnyder et al., 1997; Dubuisson et al., 1994）。
【０１８１】
それゆえ、種々のタイプのＨＣＶ関連粒子（ＨＣＶ−ＬＰｓ、血清ＨＣＶヌクレオカプシド、血清ＨＣＶビリオン）は、サイズ及び／又は密度においていくらかの類似性を有するが、異なる抗原的性質（Ｅ１Ｅ２複合体の不適切な又は適切なフォールディング、エンベロープドビリオン又は非エンベロープドヌクレオカプシド）を示す。それゆえ、要するに、これは、ＨＣＶ粒子の真の抗原的性質を分析するため、そして、天然のＨＣＶビリオンを同定するための良好な免疫学的ツールを有することが決定的に重要であることを証明している。
【０１８２】
これらのデータ及び他のデータを考慮に入れて（Andre et al., Maillard et al., 2001）、慢性肝炎Ｃ患者の血清中で循環している種々の形態のＨＣＶ関連粒子の完全なスペクトルのより良好な知識を得ることができた。ショ糖勾配における低密度画分（１．０６g/ml）は、カプシド様構造であって、リポタンパク質と会合して脂質−ウイルス粒子（lipo-viro-particles）（ＬＶＰ）を形成しそして個々の変動に依存してＨＣＶ ＲＮＡ及び免疫グロブリンと会合した（Andre et al., 2002）カプシド様構造を含有していた。ＬＶＰは、直径が１００nmより多くの大きい粒子として現われ、そしてＬＤＬ受容体（Andre et al., 2002）を介して肝細胞系に結合した。洗剤で処理した血清から単離された非エンベロープドＨＣＶヌクレオカプシドは、ＣｓＣｌにおける１．３２〜１．３４g/mlの浮遊密度を有しており、サイズが不均一であり（Meillard et al., 2001）そして最近ＦγＲ様活性を有することが示され（(Meillard et al., 2004)、これはショ糖勾配における高密度（１．２８〜１．３５g/ml）のＨＣＶコア−ＩｇＧ複合体として、ＨＣＶ ＲＮＡ含有粒子の「非免疫」抗体（"non-immune" antibodies）との会合を説明することができた。１．１３〜１．２１g/mlの中間密度の画分は、ここではＥ１Ｅ２エンベロープドＨＣＶ粒子として同定された。ヌクレオカプシド、脂質膜及び２つのＥ１及びＥ２エンベロープ糖タンパク質からなる推定上の全ＨＣＶビリオン（entire HCV virion）の平均密度（１．１８〜１．２０g/ml）は、フラビウイルスの密度に類似している（Bradley et al., 1991）。ＭＡｂＤ３２．１０の精密な特異性から推定された外側エンベロープタンパク質相互作用の仮定も、ＴＢＥＶ及び全ウイルス粒子からの組換えＳＶＰｓのエンベロープの組織化に類似している（Schalich et al., 1996）。最後に、異なる沈降性質（１．１３〜１．１５g/ml）及び異なる粒度（≒２０nm）を示すが全ウイルス粒子と同様な抗原特性を示す、Ｅ１Ｅ２エンベロープタンパク質のみを含有するＳＶＰｓがＨＣＶ感染患者の血清中に存在することは、ＨＣＶとフラビウイルスとのいくらかの類似性を支持する。
【０１８３】
要するに、新規なＭＡｂＤ３２．１０を使用することにより、初めて下記のものが同定された：
（ｉ）ＨＣＶ ＲＮＡ及びコア抗原の両方を含有し、そして３５〜５０nmの直径を有しそして１．１７〜１．２１g/mlに階層区分される「大きな粒子」としてＥ１Ｅ２エンベロープ複合体をその表面に発現する、ＨＣＶ完全ビリオン；
（ii）２０〜３０nmの直径を有しそして１．１３〜１．１５g/mlに階層区分される、カプシド及びＨＣＶ ＲＮＡを欠いている「小さな粒子」としてのエンベロープＳＶＰｓのＨＣＶ母集団。
【０１８４】
ゆえに、このようなエンベロープド粒子は、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質構造−機能関係を調べるための適切なモデル及び予防接種法のための優れた候補を表す。更に、異なるグループの患者において及びＨＣＶ関連疾患の種々の段階で循環しているＨＣＶ粒子のスペクトルを追跡することは興味深いであろう。
【０１８５】
実施例３
精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子に対するモノクローナル抗体の取得
精製したＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子を含有するショ糖密度勾配における糖密度遠心に付した上記したＨＣＶに富んだペレットの画分を使用して、モノクローナル抗体を調製した。この画分を使用して、マウスを免疫化しそして上記したようにハイブリドーマを単離した。かくして、１つのモノクローナル抗体、（Ｄ４．１２．９）を得、これはウエスタンブロット実験において天然のＨＣＶ Ｅ２タンパク質を特異的に認識し（図６）及び実施例２で証明された天然のＨＣＶウイルス粒子を特異的に認識すること（図７）が示された。実際に、図７は、Ｄ４．１２．９が、Ｄ３２．１０と同様に、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子（画分８〜１１）及びＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子（画分１１〜１４）の両方を認識することを示す。
【０１８６】
実施例４
感染患者由来の抗ＨＣＶ抗体のエピトープ特徴付け
ＨＣＶ感染患者の血清に対するＤ３２．１０（実施例１）と反応性のＥ１及びＥ２由来のペプチド配列の免疫反応性を、それらを包含するペプチドを使用することにより評価した。
【０１８７】
Ｅ１（アミノ酸２９０〜３１７）及びＥ２（アミノ酸４７１〜５００及び６０５〜６２９）配列を、健康な個体からの１１の血清及びＨＣＶ感染患者からの４４の血清（Ａ１〜Ａ４４という番号を付けられた）によってＥＬＩＳＡにより試験されるべきビオチニル化合成ペプチドとして産生させた。
【０１８８】
マイクロタイトレーションプレートのウエルを、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（pH９．６）中の１０μg/mlの濃度のストレプトアビジン１００μlで４℃で一夜コーティングし、そして１０％ヤギ血清を含有するＰＢＳで３７℃で１時間ブロックした。次いで、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した後、ビオチニル化ペプチド溶液（ＰＢＳ中の１０μg/ml）１００μlを３７℃で２時間加えた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで新たな洗浄の後、１０％ヤギ血清を含有するＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に１：５０に希釈された試験された血清１００μlを加えそして３７℃で２時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで再び洗浄した。次いで、二次抗体、ペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッドヤギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson Immune Research laboratories）をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−ヤギ血清中に１：５０００希釈率で加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベーションし、次いでＰＢＳ−ｔｗｅｅｎでもう１回洗浄した。プレートを、ｏ−フェニレンジアミン及び過酸化水素を含有するBiomeriux カラーキットを使用して顕色した。１０分のインキュベーションの後、プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９２nmで読み取った。報告された値は３回反復の平均ＯＤである。
【０１８９】
カットオフ認識を、各ペプチドについて計算した（ＨＣＶネガティブ血清＋３標準偏差で得られた値の平均）。それは、Ｅ１（アミノ酸２９０〜３１７）に対して４４のＨＣＶ−ポジティブ血清の中からの６つ（図８Ａ）、Ｅ２（アミノ酸４７１〜５００）に対する４４の中からの６つ（図８Ｂ）及びＥ２（アミノ酸６０５〜６２９）に対する４４の中からの１６（図８ｃ）とのポジティブ反応を証明することを可能とした。血清Ａ７、Ａ１４、Ａ２１、Ａ３３、Ａ３９及びＡ４０は、３つのペプチドとのポジティブシグナルを与え、これに対して、Ｅ２（６０５〜６２９）も１０のより多くの血清により認識された。
【０１９０】
ＨＣＶ感染患者の血清中に、Ｄ３２．１０ｍＡｂにより認識されたＥ１及びＥ２の３つの領域と同時に反応することができる特異的抗体が存在することは、循環しているエンベロープドＨＣＶウイルス粒子の表面におけるそれらの並置（juxtaposition）及びマウス及びヒトにおけるそれらの免疫原性を強く支持する。
【０１９１】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１Ａ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物（antibody precipitated lysates）のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を表す。レーン１、２、３、４、５、６及び７は、それぞれ、抗体Ｃ９．１９．１６、Ｃ２．２２．１、Ｄ３２．１０、Ｄ３．２０．１２、Ｃ７、２４．１９、Ｃ７．１４．４１及びＣ１．９．３に対応する。ＭＷは、分子量マーカーに対応する。分子量マーカーに対応するバンドのサイズは、ゲルの右に表される。可能ならば、バンドは、Ｅ１、Ｅ２又はＡｇｇ（集合体の場合）としてゲルの左に確認される。 図１Ａは、還元条件における、35Ｓ標識されたコントロール細胞の抗体で沈殿させた溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す。
【図１Ｂ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物（antibody precipitated lysates）のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を表す。レーン１、２、３、４、５、６及び７は、それぞれ、抗体Ｃ９．１９．１６、Ｃ２．２２．１、Ｄ３２．１０、Ｄ３．２０．１２、Ｃ７、２４．１９、Ｃ７．１４．４１及びＣ１．９．３に対応する。ＭＷは、分子量マーカーに対応する。分子量マーカーに対応するバンドのサイズは、ゲルの右に表される。可能ならば、バンドは、Ｅ１、Ｅ２又はＡｇｇ（集合体の場合）としてゲルの左に確認される。 図１Ｂは、還元条件における、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質を発現する35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す。
【図１Ｃ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物（antibody precipitated lysates）のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を表す。レーン１、２、３、４、５、６及び７は、それぞれ、抗体Ｃ９．１９．１６、Ｃ２．２２．１、Ｄ３２．１０、Ｄ３．２０．１２、Ｃ７、２４．１９、Ｃ７．１４．４１及びＣ１．９．３に対応する。ＭＷは、分子量マーカーに対応する。分子量マーカーに対応するバンドのサイズは、ゲルの右に表される。可能ならば、バンドは、Ｅ１、Ｅ２又はＡｇｇ（集合体の場合）としてゲルの左に確認される。 図１Ｃは、還元条件における、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質を発現する35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す。
【図１Ｄ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物（antibody precipitated lysates）のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を表す。レーン１、２、３、４、５、６及び７は、それぞれ、抗体Ｃ９．１９．１６、Ｃ２．２２．１、Ｄ３２．１０、Ｄ３．２０．１２、Ｃ７、２４．１９、Ｃ７．１４．４１及びＣ１．９．３に対応する。ＭＷは、分子量マーカーに対応する。分子量マーカーに対応するバンドのサイズは、ゲルの右に表される。可能ならば、バンドは、Ｅ１、Ｅ２又はＡｇｇ（集合体の場合）としてゲルの左に確認される。 図１Ｄは、還元条件における、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２タンパク質を発現する35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す。
【図１Ｅ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物（antibody precipitated lysates）のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を表す。レーン１、２、３、４、５、６及び７は、それぞれ、抗体Ｃ９．１９．１６、Ｃ２．２２．１、Ｄ３２．１０、Ｄ３．２０．１２、Ｃ７、２４．１９、Ｃ７．１４．４１及びＣ１．９．３に対応する。ＭＷは、分子量マーカーに対応する。分子量マーカーに対応するバンドのサイズは、ゲルの右に表される。可能ならば、バンドは、Ｅ１、Ｅ２又はＡｇｇ（集合体の場合）としてゲルの左に確認される。 図１Ｅは、非還元条件における、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２タンパク質を発現する35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す。
【図２】図２は、非還元条件及び還元条件下にＤ３２．１０モノクローナル抗体を使用するＨＣＶウイルス粒子のウエスタンブロットを表す。左から右へ、Ｍは非還元条件下に分子量マーカーを表し、そのバンドのサイズは、ゲルの左に示され（kDaにおいて）、レーン１は非還元条件下にＤ３２．１０モノクローナル抗体を使用するＨＣＶウイルス粒子のウエスタンブロットを表し、第２レーンＭは還元条件下の分子量マーカーを表し、レーン２は、還元条件下にＤ３２．１０モノクローナル抗体を使用するＨＣＶウイルス粒子２．５μgのウエスタンブロットを表し、レーン３は、還元条件下にＤ３２．１０モノクローナル抗体を使用するＨＣＶウイルス粒子５μgのウエスタンブロットを表す。ゲルの右に、レーン３のいくつかのバンドのサイズが示され（kDaで）、いくらかはＨＣＶタンパク質Ｅ２（６０及び６８）又はＨＣＶタンパク質Ｅ１（３４及び３１）に対応する。
【図３Ａ】図３Ａ及び図３Ｂは、グリコシダーゼＡによる脱グリコシル化（図３Ａ）及びエンドグリコシダーゼＨによる脱グリコシル化（図３Ｂ）に付されたＨＣＶウイルス粒子のウエスタンブロットを表す。 図３Ａにおいて、レーンＭは分子量マーカーを表し、そのバンドの３つのサイズは、ゲルの左に示され（kDaで）；レーン１、２、３及び４はそれぞれ、２０、１０、５及び０mU／mlのグリコシダーゼ濃度を表す。ゲルの右に、ＨＣＶタンパク質Ｅ２及びＥ１の位置が示され、そしてタンパク質Ｅ１の主要な脱グリコシル化形態の位置（Ｅ１＊）及びＥ１又はＥ２の脱グリコシル化形態に対応するいつかのバンドのサイズ（kDaで）、並びにＥ２の主要な脱グリコシル化形態（４１＊）が示される。
【図３Ｂ】図３Ａ及び図３Ｂは、グリコシダーゼＡによる脱グリコシル化（図３Ａ）及びエンドグリコシダーゼＨによる脱グリコシル化（図３Ｂ）に付されたＨＣＶウイルス粒子のウエスタンブロットを表す。 図３Ｂにおいて、レーンＭは分子量マーカーを表し、そのバンドの４つのサイズがゲルの左に示され（kDaで）；レーン１及び２は、それぞれ、エンドグリコシダーゼＨなしに行われたコントロール脱グリコシル化実験及びエンドグリコシダーゼＨの存在下に行われる脱グリコシル化実験を表す。ゲルの右には、Ｅ２及びＥ１の完全グリコシル化形態及びＥ２の脱グリコシル化形態（５０、４８、４６及び４２kDa）及びＥ１の脱グリコシル化形態（２８及び２４kDa）に対応する主要バンドが示される。Ｅ２の主要な脱グリコシル化形態（５０＊）及びＥ１の主要な脱グリコシル化形態（２８＊）は星によりマークを付けられている。
【図４】図４は、ＨＣＶウイルス粒子調製物のショ糖密度勾配での遠心により得られた画分の特徴付けを示す。３つのパラメーター、ＨＣＶ ＲＮＡ含有率、ＨＣＶコアタンパク質含有率及びＤ３２．１０モノクローナル抗体に対する反応性、を測定した。水平軸は特徴付けに付された画分の数を表す。左垂直軸はＨＣＶ ＲＮＡ濃度（×１０5UI／ml）及び間接ＥＩＡ（４５０nmでのＯＤ）により測定されたＤ３２．１０に対する反応性の目安を表す。右垂直軸はＨＣＶコアタンパク質濃度（pg／mlでの）を表す。黒点に対応する曲線はＤ３２．１０に対する画分の反応性を表し、白三角形に対応する曲線はコアタンパク質の画分含有率を表し、そしてドット付きバーはＨＣＶ ＲＮＡの画分含有率を表す。
【図５Ａ】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、それぞれ、ＨＣＶウイルス粒子調製物、ＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子調製物及びＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子調製物の透過型電子顕微鏡写真を表す。 図５Ａでは、水平バーは長さ２００nmのスケールを表す。より大きい円形要素はＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子を表しそしてより小さい円形要素はＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を表す。
【図５Ｂ】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、それぞれ、ＨＣＶウイルス粒子調製物、ＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子調製物及びＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子調製物の透過型電子顕微鏡写真を表す。 図５Ｂでは、水平バーは長さ５０nmのスケールを表す。円形要素はＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子を表す。
【図５Ｃ】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、それぞれ、ＨＣＶウイルス粒子調製物、ＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子調製物及びＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子調製物の透過型電子顕微鏡写真を表す。 図５Ｃでは、水平バーは長さ５０nmのスケールを表す。円形要素はＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を表す。
【図６】図６はＤ４．１２．９モノクローナル抗体を使用するＨＣＶウイルス粒子のウエスタンブロットを表す。レーンＭは分子量マーカーを表し、そのバンドの４つのサイズ（７５、５０、３７、２５）はゲルの左側及び右側に示される（kDaで）。レーン１及び２は、それぞれ、グリコシダーゼＡ及びエンドグリコシダーゼＨによるＨＣＶウイルス粒子の消化の結果を表し、レーン３及び４はプロテアーゼトリプシン及びＶ８によるＨＣＶウイルス粒子のタンパク分解消化の結果を表し、レーン５はＮＰ−４０による細胞溶解（lysis）の結果を表し、そしてレーン６では前処理は行われなかった。ゲルの右側には、消化されなかったＥ２タンパク質（６８及び４８）の２つの主要な形態が示され（kDaで）そしてゲルの左側にはＥ２の主要な脱グリコシル化形態（Ｅ２＊）が示される。
【図７】図７は、ＨＣＶウイルス粒子調製物のショ糖密度勾配での遠心により得られた画分のＤ４．１２．９に基づく特徴付けを表す。Ｄ４．１２．９に対する画分反応性に加えて、コアタンパク質の画分含有率も測定した。水平軸は、特徴付けに付された画分の数を表す。右垂直軸はＥＩＡ（４５０nmでのＯＤ）により測定されたＤ４．１２．９に対する反応性の目安を表す。左垂直軸は、ＨＣＶコアタンパク質濃度（pg／mlで）を表す。黒四角形に対応する曲線はＤ４．１２．９に対する画分の反応性を表し、黒菱形に対応する曲線はコアタンパク質の画分含有率を表す。
【図８Ａ】図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、健康な個体（水平軸上にＴ１〜Ｔ１１の番号を付けられている１１の血清）及びＨＣＶ感染患者（水平軸上でＡ１〜Ａ４４の番号を付けられている４４の血清）の５５の血清に対するそれぞれアミノ酸２９０〜３１７（図８Ａ）、アミノ酸４７１〜５００（図８Ｂ）及びアミノ酸６０５〜６２９（図８Ｃ）を含む３つのビオチニル化ペプチドの免疫反応性を表す。垂直軸は、ＥＬＩＳＡ（４９２nmにおけるＯＤ×１０００）により測定された３つのペプチドに対する血清の反応性を表す。白のバーは健康な個体の血清の反応性を表しそしてグレーのバーは感染患者の血清の反応性を表す。水平線は、カットオフ値を表し、それより上の血清応答はポジティブと考えられる。図８Ａでは、カットオフ値は０．６９１であり、図８Ｂでは０．５７２でありそして図８Ｃでは０．３２１である。
【図８Ｂ】図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、健康な個体（水平軸上にＴ１〜Ｔ１１の番号を付けられている１１の血清）及びＨＣＶ感染患者（水平軸上でＡ１〜Ａ４４の番号を付けられている４４の血清）の５５の血清に対するそれぞれアミノ酸２９０〜３１７（図８Ａ）、アミノ酸４７１〜５００（図８Ｂ）及びアミノ酸６０５〜６２９（図８Ｃ）を含む３つのビオチニル化ペプチドの免疫反応性を表す。垂直軸は、ＥＬＩＳＡ（４９２nmにおけるＯＤ×１０００）により測定された３つのペプチドに対する血清の反応性を表す。白のバーは健康な個体の血清の反応性を表しそしてグレーのバーは感染患者の血清の反応性を表す。水平線は、カットオフ値を表し、それより上の血清応答はポジティブと考えられる。図８Ｂでは、カットオフ値は０．５７２である。
【図８Ｃ】図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、健康な個体（水平軸上にＴ１〜Ｔ１１の番号を付けられている１１の血清）及びＨＣＶ感染患者（水平軸上でＡ１〜Ａ４４の番号を付けられている４４の血清）の５５の血清に対するそれぞれアミノ酸２９０〜３１７（図８Ａ）、アミノ酸４７１〜５００（図８Ｂ）及びアミノ酸６０５〜６２９（図８Ｃ）を含む３つのビオチニル化ペプチドの免疫反応性を表す。垂直軸は、ＥＬＩＳＡ（４９２nmにおけるＯＤ×１０００）により測定された３つのペプチドに対する血清の反応性を表す。白のバーは健康な個体の血清の反応性を表しそしてグレーのバーは感染患者の血清の反応性を表す。水平線は、カットオフ値を表し、それより上の血清応答はポジティブと考えられる。図８Ｃでは０．３２１である。
【図９Ａ】ＨＣＶコアタンパク質は、Ortho Clinical DiagnosticsからのトータルＨＣＶコア抗原アッセイ（図９Ａ）により定量されそしてＨＣＶ−Ｆａｎペレット及び上記したタイプ１の３０〜４５％ショ糖勾配からの画分におけるウエスタンブロット（図９Ｂ）により分析された。（図９Ａ）すべての画分を１：２の希釈率で試験した。ＨＣＶ−Ｆａｎペレットは、希釈率１：２５、１：５０及び１：１００で試験し、そして３３２pg／mlを含有することが見出された。すべての希釈はＴＮＥ緩衝液で行った。カットオフ値は１．４pg／mlであった。
【図９Ｂ】ＨＣＶコアタンパク質は、Ortho Clinical DiagnosticsからのトータルＨＣＶコア抗原アッセイ（図９Ａ）により定量されそしてＨＣＶ−Ｆａｎペレット及び上記したタイプ１の３０〜４５％ショ糖勾配からの画分におけるウエスタンブロット（図９Ｂ）により分析された。（図９Ｂ）ＨＣＶ−Ｆａｎペレット及び３０％〜４５％ショ糖勾配からの画分４、８、１２及び１３をＳＤＳ−１２．５％ＰＡＧＥに付した。ＨＣＶコアタンパク質を、モノクローナル抗体抗コア７Ｇ１２Ａ８、２Ｇ９Ａ７及び１９Ｄ９Ｄ６（各々について５μg/ml）の混合物を使用して検出した。AmershamからのＥＣＬ Ｐｌｕｓシステムを使用してブロットを顕色した。左の数は、キロダルトン（kDa）でのマーカー（Ｍ）の分子量を示し、そしてＨＣＶコアタンパク質は右に示された。
【図１０】最初の１０〜６０％ショ糖勾配からのすべての画分における定量的RT-PCR Amplicor HCV Monitor試験バージョン２．０（Roche Diagnostics）によりＨＣＶ ＲＮＡを分析した。製造者の取扱説明書に従って試験を行った。各ロットに対して特異的なＱＳ国際単位（ＩＵ）／ＰＣＲを使用することにより結果を計算し、そしてＩＵ ＨＣＶＲＮＡ／mlで表した。
【図１１Ａ】電子顕微鏡法（ＥＭ）による血清由来のＨＣＶエンベロープド粒子の分析。ＭＡｂＤ３２．１０（５μg）（パネルａ、ｂ、ｃ及びｄ）又は無関係のＭＡｂ（パネルｅ）を使用すことによりＨＣＶ−Ｆａｎペレット（２μg）を免疫沈殿させ、そして超遠心によるペレット化後の免疫複合体をグリッドに吸着させそして１％酢酸ウラニル（pH４．５）で染色した。調製物をＪＥＯＬ １００ＣＸ電子顕微鏡を使用して可視化した。（図１１Ａ）粒子は幾分直径（nmで表された）が変わり、そして１５６ウイルス粒子（ＶＰｓ）に関してヒストグラムを作成した。粒度分布は３５nmに中心のあるピークを示す。
【図１１Ｂ】電子顕微鏡法（ＥＭ）による血清由来のＨＣＶエンベロープド粒子の分析。ＭＡｂＤ３２．１０（５μg）（パネルａ、ｂ、ｃ及びｄ）又は無関係のＭＡｂ（パネルｅ）を使用すことによりＨＣＶ−Ｆａｎペレット（２μg）を免疫沈殿させ、そして超遠心によるペレット化後の免疫複合体をグリッドに吸着させそして１％酢酸ウラニル（pH４．５）で染色した。調製物をＪＥＯＬ １００ＣＸ電子顕微鏡を使用して可視化した。（図１１Ｂ）電子顕微鏡写真。パネルａ、ｂ、ｃ及びｄのバーは５０nmを示す。
【図１２Ａ】Ｄ３２．１０による免疫沈殿、グリッドへの吸着及び染色後のショ糖勾配ピーク１（図１２Ａ）及び２（図１２Ｂ）からのＨＣＶ−Ｆａｎ粒子の電子顕微鏡法による分析。（図１２Ａ）４１のウイルス粒子についてヒストグラムを作成した。ピーク１における主要な種（８５．４％）は約２０nmの直径を有する球状粒子、いわゆる＜＜小さな粒子＞＞であった。
【図１２Ｂ】Ｄ３２．１０による免疫沈殿、グリッドへの吸着及び染色後のショ糖勾配ピーク１（図１２Ａ）及び２（図１２Ｂ）からのＨＣＶ−Ｆａｎ粒子の電子顕微鏡法による分析。（図１２Ｂ）８９のウイルス粒子についてヒストグラムを作成した。ピーク２における最も優勢な形態（７７．５％）は、約４１nmの平均直径を有していた。ピーク２は、サイズが幾分より不均一であるようであり、そして主として３５及び５０nm直径粒子、いわゆる＜＜大きな粒子＞＞からなっていた。バー、５０nm。
【図１３】エンベロープドＨＣＶ粒子の間接免疫金標識化（indirect immuno-gold labeling）。Ｄ３２．１０−免疫複合体（ＨＣＶペレット、２０μg；ＭＡｂＤ３２．１０，５μg）でコーティングされた顕微鏡グリッドを、第２抗体としてのヤギ抗マウスＩｇＧ−コンジュゲーテッドコロイド金粒子（１０nm）の１：５０希釈物とインキュベーションした。ＩｇＧの立体障害（ＥＭにおいて約１５nm）にしたがって、少数の金粒子のみが、抗体結合を確認することができた。金粒子はウイルス粒子の外側には観察されなかった。すべてのパネルのバーは２０nmを示す。
【図１４Ａ】図１４Ａ及び図１４Ｂは、遺伝子型１ｂの単離ＨＣＶ−ＬからのＨＣＶに富んだペレットのショ糖密度勾配（１０％〜６０％）における等密度遠心（isopycnic centrifugation）の結果を表す。 図１４Ａは、遠心後に得られた画分（水平軸）の密度（左水平軸、g/ml）及びＥ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性（右垂直軸、Ａ490nm）を表す。 ＥＩＡでは、各画分を１／１００００に希釈し（図４Ａ及び４Ｃ）そしてウエスタンブロットでは、選ばれた画分５μl／レーンを使用した（図４Ｂ及び４Ｄ）。画分の密度は屈折率測定法により測定されそしてg/mlで表される。吸光度（Ａ）は４９０nmで側定された。ＥＩＡの結果は、ネガティブコントロール（少なくとも３つの値）の平均の掛ける２．１に相当するカットオフより上になる場合にはポジティブと考えられた。AmershamからのＥＣＬ Ｐｌｕｓシステムを使用してブロットを顕色した。
【図１４Ｂ】図１Ａ及び図１４Ｂは、遺伝子型１ｂの単離ＨＣＶ−ＬからのＨＣＶに富んだペレットのショ糖密度勾配（１０％〜６０％）における等密度遠心（isopycnic centrifugation）の結果を表す。 図１４Ｂは、抗Ｅ１Ｅ２ＭＡｂＤ３２．１０を使用する、画分６、８、１０，１２及び１４のウエスタンブロットを表す。左の数は、キロダルトン（kDa）におけるマーカー（Ｍ）の分子量を示し、そしてＨＣＶＥ１及びＥ２タンパク質は右に示された。 ＥＩＡでは、各画分を１／１００００に希釈し（図４Ａ及び４Ｃ）そしてウエスタンブロットでは、選ばれた画分５μl／レーンを使用した（図４Ｂ及び４Ｄ）。画分の密度は屈折率測定法により測定されそしてg/mlで表される。吸光度（Ａ）は４９０nmで側定された。ＥＩＡの結果は、ネガティブコントロール（少なくとも３つの値）の平均×２．１に相当するカットオフより上になる場合にはポジティブと考えられた。AmershamからのＥＣＬ Ｐｌｕｓシステムを使用してブロットを顕色した。
【図１４Ｃ】図１４Ｃ及び図１４Ｄは、遺伝子型１ａ／２ａの単離ＨＣＶ−ＦａｎからのＨＣＶに富んだペレットのショ糖密度勾配（１０％〜６０％）における等密度遠心の結果を示す。 図１４Ｃは、遠心後に得られた画分（水平軸）の密度（左水平軸、g/ml）及びＥ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性（右垂直軸、Ａ490nm）を表す。 ＥＩＡでは、各画分を１／１００００に希釈し（図４Ａ及び４Ｃ）そしてウエスタンブロットでは、選ばれた画分５μl／レーンを使用した（図４Ｂ及び４Ｄ）。画分の密度は屈折率測定法により測定されそしてg/mlで表される。吸光度（Ａ）は４９０nmで側定された。ＥＩＡの結果は、ネガティブコントロール（少なくとも３つの値）の平均×２．１に相当するカットオフより上になる場合にはポジティブと考えられた。AmershamからのＥＣＬ Ｐｌｕｓシステムを使用してブロットを顕色した。
【図１４Ｄ】図１４Ｃ及び図１４Ｄは、遺伝子型１ａ／２ａの単離ＨＣＶ−ＦａｎからのＨＣＶに富んだペレットのショ糖密度勾配（１０％〜６０％）における等密度遠心の結果を示す。 図１４Ｄは、抗Ｅ１Ｅ２ＭＡｂＤ３２．１０を使用する、画分６、８、１０、１２及び１４のウエスタンブロットを表す。 ＥＩＡでは、各画分を１／１００００に希釈し（図４Ａ及び４Ｃ）そしてウエスタンブロットでは、選ばれた画分５μl／レーンを使用した（図４Ｂ及び４Ｄ）。画分の密度は屈折率測定法により測定されそしてg/mlで表される。吸光度（Ａ）は４９０nmで側定された。ＥＩＡの結果は、ネガティブコントロール（少なくとも３つの値）の平均×２．１に相当するカットオフより上になる場合にはポジティブと考えられた。AmershamからのＥＣＬ Ｐｌｕｓシステムを使用してブロットを顕色した。
【図１５Ａ】ＨＣＶ−Ｆａｎペレットのタイプ１の３０〜４５％ショ糖勾配（３０％２ml、３５％３ml、４０％３ml、４５％２ml）における等密度遠心（図１５Ａ）。屈折率測定法により側定された画分の密度はg/mlで表した。Ｅ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性を前記のように間接ＥＩＡにより分析した。
【図１５Ｂ】ショ糖勾配（３０〜４５％）ピーク１（画分８）及び２（画分１２及び１３）からの粒子を個々に第２平衡遠心に付した（それぞれ、図１５Ｂ及び１５Ｃ）。ピーク１をタイプ２の３０〜４５％ショ糖勾配（３０％３ml、３５％３ml、４０％２ml、４５％２ml）において遠心した（図１５Ｂ）。屈折率測定法により側定された画分の密度はg/mlで表した。Ｅ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性を前記のように間接ＥＩＡにより分析した。
【図１５Ｃ】ショ糖勾配（３０〜４５％）ピーク１（画分８）及び２（画分１２及び１３）からの粒子を個々に第２平衡遠心に付した（それぞれ、図１５Ｂ及び１５Ｃ）。ピーク２をタイプ３の３０〜４５％ショ糖勾配（３０％２ml、３５％２ml、４０％３ml、４５％３ml）において遠心した（図１５Ｃ）。屈折率測定法により側定された画分の密度はg/mlで表した。Ｅ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性を前記のように間接ＥＩＡにより分析した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＣＶに対する新規な立体配座抗体（conformational antibodies）、更に詳しくはモノクローナル抗体に関する。本発明、該抗体により認識される傾向がある粒子の組成物及びそれらを含有する医薬組成物にも関する。本発明は、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子（HCV enveloped subviral particles）又は精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子（HCV enveloped complete virus particles）及びそれらを製造する方法にも関する。
【０００２】
肝炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）感染は、慢性肝炎及び硬変の主要な原因であり、そして肝細胞癌をもたらすことがある。世界中で約２００万人の人々がＨＣＶに慢性的に感染しており、この疾患は深刻な世界的健康問題となった。ＨＣＶは、フラビウイルス科（Flaviridae family）のHepacivirus属に属するエンベロープドＲＮＡウイルスである。そのゲノムは、内部リボソームエントリー部位（internal ribosome entry sites）として機能する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、約３，０００アミノ酸のポリタンパク質をコードする単一オープンリーディングフレーム及び３’ＵＴＲを有する正の極性の９．６ｋｂの一本鎖ＲＮＡである（Bartenschlager et al., 2000）。このポリタンパク質は、翻訳と同時に又は翻訳後に、宿主細胞ペプチダーゼにより開裂されてコアタンパク質並びにエンベロープ糖タンパク質Ｅ１及びＥ２を含む構造タンパク質を生じ、そしてウイルスプロテアーゼにより開裂されて非構造タンパク質（ＮＳ）２〜５Ｂを発生する（Bartenschlager et al., 2000）。関連したプラス鎖ＲＮＡウイルスから類推して、複製はマイナス鎖ＲＮＡ中間体によって行われ、そして細胞質膜に会合したレプリカーゼ複合体を形成するＮＳタンパク質により触媒される。
【０００３】
患者血漿サンプル中に存在するＨＣＶ粒子の低いレベル及び有効なＨＣＶ複製又は粒子アセンブリーを支持する細胞培養システムの欠如は、ビリオンと会合した糖タンパク質
の特徴付けを妨害してきた。ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質に関する最近の知見は、ウイルス若しくは非ウイルス発現ベクターによる細胞培養一過性発現アッセイに基づいている。これらの研究は、Ｅ１及びＥ２糖タンパク質が相互作用して複合体を形成することを示した（Dubuisson, 2000に概観されている）。非イオン洗剤の存在下に、２つの形態のＥ１Ｅ２複合体が検出される：非共有結合相互作用により安定化されたＥ１Ｅ２ヘテロニ量体及びミスフォールディングされた複合体を表すと考えられる不均一なジスルフィド連結された集合体（aggregate）。以前に、エンベロープ糖タンパク質特異的抗体が合成ペプチド又は組換え抗原による免疫化により得られた。しかしながら、ＨＣＶ糖タンパク質ヘテロ二量体のネイティブ前出芽形態（native prebudding form）と考えられる非共有結合により連結されたＥ１Ｅ２ヘテロ二量体を認識する立体配座感受性Ｅ２−反応性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｈ２）は、血清由来のＨＣＶ ＲＮＡポジティブ粒子と反応しない（Deleersynder et al., 1997）。更に、ＷＯ９２／０７００１は、感染したチンパンジーから抽出したＨＣＶ粒子の調製物によるマウスの免疫化により調製された抗体を開示しているが、これらの抗体は天然のＨＣＶ粒子（即ち、感染した患者由来の）に対して試験されていない。更に、ＷＯ００／０５２６６は、感染した患者のＢ細胞から調製された抗体を開示しているが、これらの抗体は組換えＥ２タンパク質に結合する能力に従って選ばれている。ゆえに、すべてのこれらの抗体は、診断目的又は治療若しくは予防目的の限定された用途である。何故ならば、それらは非自然のＨＣＶ又はその一部により産生されているか又は選ばれており、そして天然のＨＣＶ粒子と相互作用することが示されていないからである。
【０００４】
十分な量及び濃度で天然のエンベロープドＨＣＶ粒子を含有するＨＣＶ調製物の欠如は、天然ＨＣＶ粒子を認識する傾向がある（liable to recognize）抗体をこれまで得ることができなかった理由の１つである。事実、血漿サンプル中のＨＣＶ粒子の低いレベルは、このウイルスの特徴付け及び可視化を困難にした。以前に、天然に感染した患者の血漿からの感染の急性期の間に回収されたウイルスは、ショ糖における約１．０６g/mlの浮遊密度を有していることが示された（Hijikata et al., 1993）。反対に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ複製後の細胞培養物から回収されたＨＣＶはショ糖における１．１２g/mlの浮遊密度を有する（Yoshikura et al., 1996）。最後に、慢性的に感染している個体から回収されたＨＣＶはショ糖における約１．１７g/mlの浮遊密度を有している（Hijikata et al., 1993）。血清由来のウイルスの低い密度は、血清低密度リポタンパク質とのその会合のせいであるとされた（Thomssen etal., 1992）。高密度ウイルスは、抗原−抗体複合体中のウイルスに結合した抗体と会合していることが示された（Kanto et al., 1995）。これらのデータにもかかわらず、これらの異なるＨＣＶ母集団のタンパク質組成に関する指示及び低密度画分（＜１．０g/ml）が完全なビリオンとしてエンベロープ、ＲＮＡ及びヌクレオカプシドを含有するかどうかに関する指示はまだない。
【０００５】
ゆえに、本発明の目的は、天然のＨＣＶ粒子と反応する抗体を提供することである。
【０００６】
本発明の他の観点は、抗体産生動物の有効な免疫化を可能とするのに十分な量及び濃度で天然のＨＣＶ粒子の組成物を提供することである。
【０００７】
本発明の他の観点は、医薬組成物の活性物質として使用されやすい、感染のない特異的）ＨＣＶ組成物を提供することである。
発明の詳細な説明
【０００８】
本発明は、天然のＨＣＶウイルスエンベロープに特異的に結合することができる立体配座抗体に関する。
【０００９】
「立体配座抗体」という表現は、その分子環境により規定された三次元構造を有するエピトープを認識する抗体を示す。
【００１０】
「特異的に結合する」という表現は、天然のＨＣＶウイルスエンベロープを形成するエレメントの実質的に１つのみに見出されるエピトープに抗体が結合すること、即ち、天然のＨＣＶエンベロープを形成するエレメント以外のエレメントとの抗体の結合が実質的にないということを意味する。例えば、抗体の結合特異性は、当業者に周知の方法、例えば、生物学的サンプルをゲル上で電気泳動により移動させ、次いで膜に転写しそして前記抗体と共インキュベーションし、次いでこれを二次抗体により検出するウエスタンブロット実験により試験することができる。該抗体は、検出された電気泳動バンドの実質的すべてが標的化合物又はその一部を含有するならば、該生物学的サンプル中に含有された標的化合物に「特異的に結合している」と言われる。
【００１１】
「ＨＣＶ」は、「肝炎Ｃウイルス」を意味し、それはChoo et al., (1989, 1991）に特に記載されている。ＨＣＶは、特に、ＲＮＡ、コアタンパク質から作られたカプシド並びに脂質及びタンパク質、特に糖タンパク質を含むエンベロープを含む。
【００１２】
「ＨＣＶウイルスエンベロープ」は、脂質及びタンパク質、特に糖タンパク質、例えば、ＨＣＶタンパク質Ｅ１及びＥ２から作られる（Clarke, 1997）。
【００１３】
「天然の」とは、ＨＣＶ又はその一部が生物学的サンプル中に見いだされたままでありそして場合により単離されたままであり、そして必要ならば、生物学的サンプルから精製されたままであることを意味する。このようなサンプルはＨＣＶにより感染した患者の血液、血漿又は血清であることができる。特に、「天然の」は、組換え法により又は細胞系若しくは動物を使用することにより産生されたものではなく、そして例えば、Schalich et al.(1996), Blanchard et al., (2002）又はＷＯ９２／０７００１に記載のＨＣＶエメントとは異なるＨＣＶ又はその一部を指す。
【００１４】
本発明は、更に詳しくは、天然のＨＣＶ Ｅ２タンパク質に特異的に結合することができる立体配座抗体に関する。
【００１５】
ＨＣＶ Ｅ２は、特にDubuisson(2000）及びOp De Beeck et al.(2000）に記載されている。それは、開裂されてＥ２（アミノ酸３８４〜７１４）を生じるポリタンパク質（３０１２アミノ酸）として産生される。
【００１６】
「特異的に結合する」という表現は、抗体が、実質的にＨＣＶ Ｅ２タンパク質にのみ見いだされるエピトープ又はその一部に結合することを意味する。特に、抗体は、抗体−Ｅ２複合体が他のタンパク質と一緒に存在する競合試験においてＨＣＶ Ｅ２タンパク質から引き離される（detached）ことはできない。
【００１７】
「天然のＨＣＶ Ｅ２タンパク質」という表現は、タンパク質がＨＣＶにより感染した
患者の生物学的サンプルにおいて見いだされるままであること、特に天然のＨＣＶ Ｅ２タンパク質は組換えタンパク質ではないことを意味する。
【００１８】
本発明は、患者におけるＨＣＶ感染を中和することができる、上記したとおりの立体配座抗体に関する。
【００１９】
「ＨＣＶ感染を中和する」とは、抗体が、例えば、血液、血漿又は血清中に検出されるＨＣＶの減少により証明されうるとおり、ＨＣＶにより感染した患者の健康を改善することができること、又は個体がＨＣＶによる感染されるのを抗体が阻止することができることを意味する。
【００２０】
該抗体のＨＣＶ感染中和能力は、ＨＣＶにより慢性的に感染しているか又は該抗体の存在下にＨＣＶにより初めに感染される（primo-infected）モデル動物、例えば、チンパンジー又はマウス、特にヒトに適合したマウス（humanized mice）において監視することができる。監視された抗体は、それぞれ、ＨＣＶ関連ウイルス血症の減少を誘発するか又はＨＣＶによる感染を阻止することができるべきである。
【００２１】
本発明は、共有結合形態又は非共有結合形態下のＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体を沈殿させることができる上記した立体配座抗体に関する。
【００２２】
ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体は、非共有結合であることができる、即ち、Ｅ１及びＥ２は、弱い結合、例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス結合又は疎水性結合によって会合しているか、又は共有結合であることができる、即ち、Ｅ１及びＥ２は共有結合、例えば、ジスルフィド結合によって会合している。Ｅ１Ｅ２複合体の共有結合形態及び非共有結合形態は特にDeleersnyder et al.(1997）に記載又は示唆されている。
【００２３】
「沈殿する」とは、抗体が ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体を不溶性にすることができることを意味する。沈殿は、例えばDubuisson and Rice(1996）により記載のとおりに行うことができる。
【００２４】
本発明は、天然のＥＣＶ Ｅ１タンパク質に特異的に結合することができる上記した立体配座抗体に関する。
【００２５】
ＨＣＶ Ｅ１は、特にDubuisson(2000）及びOp De Beeck et al.(2000）に記載されている。それは、開裂されてＥ１（アミノ酸１９２〜３８３）を生じるポリタンパク質（３０１２アミノ酸）として産生される。
【００２６】
「特異的に結合する」という表現は、抗体が、実質的にＨＣＶ Ｅ１タンパク質上にのみ見いだされるエピトープ又はその一部に結合することを意味する。特に、抗体は、抗体−Ｅ１複合体が他のタンパク質と一緒に存在する競合試験においてＨＣＶ Ｅ１タンパク質から引き離されることはできない。
【００２７】
「天然のＨＣＶ Ｅ１タンパク質」という表現は、タンパク質がＨＣＶにより感染した
患者の生物学的サンプルにおいて見いだされたままであること、特に天然のＨＣＶ Ｅ１タンパク質は組換えタンパク質ではないことを意味する。
【００２８】
本発明は、更に詳しくは、天然のＨＣＶ Ｅ１タンパク質、天然のＨＣＶ Ｅ２タンパク質に特異的に結合することができ、そして共有結合形態又は非共有結合形態下のＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体を沈殿させることができる立体配座抗体に関する。
【００２９】
本発明は、下記の配列：
ＨＣＶタンパク質Ｅ１のアミノ酸２９７〜３０６、
ＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸４８０〜４９４、
ＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸６１３〜６２１、
の少なくとも１つからなるエピトープに特異的に結合することができる上記した立体配座抗体に関する。
【００３０】
本発明に従う抗体は、
−下記の配列：ＲＨＷＴＴＱＧＣＮＣ（配列番号１）に相当するＨＣＶタンパク質Ｅ１のアミノ酸２９７〜３０６を含むペプチドを提示する分子；及び／又は
−下記の配列：ＰＤＱＲＰＹＣＷＨＹＰＰＫＰＣ（配列番号２）に相当するＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸４８０〜４９４を含むペプチドを提示する分子；及び／又は
−下記の配列：ＹＲＬＷＨＹＰＣＴ（配列番号３）に相当するＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸６１３〜６２１を含むペプチドを提示する分子、
に結合することができる。
【００３１】
前記配列の少なくとも１つへの該抗体の結合は、前記配列のいずれかを含有するペプチドを合成し、そして当業者により周知された方法、例えば、ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡにより該合成されたペプチドに対する抗体結合能力をアッセイすることにより試験することができる。
【００３２】
頭字語「ＥＬＩＳＡ」は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）を意味する。
【００３３】
頭字語「ＥＩＡ」は、エンザイムイムノアッセイを意味する。
【００３４】
本発明は、下記の配列：
ＨＣＶタンパク質Ｅ１のアミノ酸２９７〜３０６、
ＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸４８０〜４９４、
ＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸６１３〜６２１、
の各々からなるエピトープに特異的に結合することができる上記した立体配座抗体に関する。
【００３５】
本発明に従う抗体は、
−下記の配列：ＲＨＷＴＴＱＧＣＮＣ（配列番号１）に相当するＨＣＶタンパク質Ｅ１のアミノ酸２９７〜３０６を含むペプチド、及び
−下記の配列：ＰＤＱＲＰＹＣＷＨＹＰＰＫＰＣ（配列番号２）に相当するＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸４８０〜４９４を含むペプチド、及び
−下記の配列：ＹＲＬＷＨＹＰＣＴ（配列番号３）に相当するＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸６１３〜６２１を含むペプチド、
を含むエピトープを提示する分子に結合することができる。
【００３６】
前記の配列の各々を含むエピトープへの該抗体の結合は、分子、特に配列ＲＨＷＴＴＱＧＣＮＣ（配列番号１）を含むタンパク質、及び分子、特に配列ＰＤＱＲＰＹＣＷＨＹＰＰＫＰＣ（配列番号２）を含むタンパク質、及び分子、特に、配列 ＹＲＬＷＨＹＰＣＴ（配列番号３）を含むタンパク質に対する抗体結合能力を、当業者に周知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡによりアッセイすることによって試験することができる。
【００３７】
本発明は、モノクローナル抗体である前記した立体配座抗体に関する。
【００３８】
「モノクローナル抗体」という表現は、抗体が実質的に１つのエピトープ又は該エピトープの一部に結合することを意味する。
【００３９】
モノクローナル抗体は、不死化された抗体分泌細胞、例えばハイブリドーマ由来のモノクローナル細胞系から得ることができる。
【００４０】
モノクローナル細胞系は、独特の細胞の培養から誘導される。
【００４１】
ハイブリドーマは、例えば、Kohler and Milstein(1975）又はButtin et al.(1978）に従って、抗体分泌細胞、例えばＢ細胞と不死化された細胞との融合により産生することができる。
【００４２】
本発明の他の観点に従えば、上記したモノクローナル抗体は、受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９８３の下で２００３年３月１９日に、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France）にブタペスト条約の下で寄託されたハイブリドーマにより分泌される。
【００４３】
該モノクローナル抗体は、特に、天然のＨＣＶウイルスエンベロープ、天然のＨＣＶ Ｅ２タンパク質、天然のＨＣＶ Ｅ１タンパク質に結合し、そして共有結合形態又は非共有結合形態下のＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体を沈殿させることができ、そして上記した配列の少なくとも１つ又はすべてからなるエピトープに結合することができる。該モノクローナル抗体は、特に今後Ｄ３２．１０と呼ばれる。
【００４４】
本発明の他の観点に従えば、上記したモノクローナル抗体は、受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９８２の下で２００３年３月１９日に、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France）にブタペスト条約の下で寄託されたハイブリドーマにより分泌される。
【００４５】
該モノクローナル抗体は、特に、天然のＨＣＶウイルスエンベロープ及びＨＣＶ Ｅ２タンパク質に結合する。該モノクローナル抗体は、特に今後Ｄ４．１２．９と呼ばれる。
【００４６】
本発明は、本発明に従う抗体の断片又は誘導体にも関する。本発明の抗体の断片は、特に、当業者に周知されているＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）断片を包含する。本発明の抗体の誘導体は、もし適当ならば、ヒトに適合した抗体（humanized antibodies）を含む。ヒトに適合した抗体は、例えば、もし適当ならば、本発明に従う抗体の一部がヒト抗体の対応する部分、例えば、Ｆｃ断片により置換されているキメラ抗体であることができる。替わるものとして、本発明に従う抗体の複合決定領域（complex determining region）（ＣＤＲ）を、例えば、US patent number 5, 824, 307に記載の如きヒト抗体に移植させることができる。
【００４７】
他の態様に従えば、本発明は、受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９８３の下で２００３年３月１９日に、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France）にブタペスト条約の下で寄託されたハイブリドーマに関する。
【００４８】
他の態様に従えば、本発明は、受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９８２の下で２００３年３月１９日に、ＣＮＣＭ（Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France）にブタペスト条約の下で寄託されたハイブリドーマに関する。
【００４９】
他の態様に従えば、本発明は、活性物質として上記した抗体の少なくとも１つ及び薬学的に許容されうるベヒクルを含む医薬組成物に関する。
【００５０】
薬学的に許容されうるベヒクルは、特に、Remington's Pharmaceutical Science 16thed./Mack Publishing Coに定義されているとおりである。
【００５１】
他の化合物、特に抗ウイルス化合物、例えば、他の抗ＨＣＶ抗体及びその断片又は誘導体、インターフェロン、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤又はヘリカーゼ阻害剤を上記した組成物中に含ませることができる。
【００５２】
上記した医薬組成物は、１回投与（single dose）又は繰り返し投与（multiple doses）で投与することができる。１回投与の場合には、組成物は、体重１kg当り抗体約０．１mg〜体重１kg当り抗体約１g、特に約１mg／kg〜約１００mg／kgを含むことができる。繰り返し投与の場合には、組成物は、１日当り体重１kg当り抗体約０．１mg〜１日当り体重１kg当り抗体約１g、特に約１mg／kg／日〜約１００mg／kg／日の投与量で投与することができる。
【００５３】
他の態様に従えば、本発明は、ＨＣＶ感染の診断、予防又は治療のための医薬を製造するための、上記した抗体の少なくとも１つの使用に関する。
【００５４】
本発明に従う抗体は、ＨＣＶを含有する傾向がある生物学的サンプル中のＨＣＶウイルス粒子の検出のために使用することができる。このようなサンプルは、ＨＣＶにより感染した患者又はＨＣＶにより感染される危険がある患者から得ることができ、そして特に、血液、血漿又は血清のサンプルを含む。抗体によるウイルスの検出のための当業者の周知した方法、例えばＥＬＩＳＡ又はＥＩＡのどれも、本発明の抗体に関して適用することができる。
【００５５】
本発明に従う抗体は、ＨＣＶに感染した患者又は感染していない患者に投与してＨＣＶ感染を中和する医薬の製造のために使用することができる。ＨＣＶ感染中和は、例えば、抗体を標的細胞膜受容体に結合するエンベロープ分子、例えばＥ１又はＥ２に結合させることによりＨＣＶが標的細胞に接触するのを阻止し、それによりＨＣＶ−標的細胞結合を阻止することによつて進行させることができる。
【００５６】
抗体は、ＨＣＶにより感染した患者に投与して、ＨＣＶウイルス粒子が細胞、特に肝細胞に感染するのを阻止するか、又は免疫系の細胞による該抗体で覆われたＨＣＶの捕捉を促進することができる。
【００５７】
抗体は、特に、移植された器官、特に肝臓を受け取るべき患者に、移植手術の前、移植手術期間中又は移植手術の後に投与して、移植された器官中に含有されることがあるＨＣＶウイルス粒子を中和することができる。
【００５８】
本発明は、上記した抗体の少なくとも１つに結合することができるエンベロープドウイルス粒子にも関する。
【００５９】
「エンベロープドウイルス粒子」という表現は、特にＨＣＶビリオン、又はエンベロープを含有するＨＣＶビリオンの一部を表し、該エンベロープは脂質及び／又はタンパク質、特に小葉（leaflets）において会合した糖タンパク質を含む。
【００６０】
本発明は、上記した抗体の少なくとも１つに結合することができるエンベロープドウイルス粒子に結合する抗体にも関する。
【００６１】
他の態様に従えば、本発明は、ヒト、血液、血漿又は血清の初めのサンプル（initial samples）由来のＨＣＶウイルス粒子の組成物であって、ＨＣＶ ＲＮＡコピーの濃度が、それが由来するヒト、血液、血漿又は血清の初めのサンプル中のＨＣＶ ＲＮＡコピーの濃度より約１００〜１０００倍高い、特に約１０7コピー／mlより高い、組成物に関する。
【００６２】
本発明に従う組成物の高い濃度は、該組成物による動物の有効な免疫化を可能とする。
【００６３】
ＨＣＶ ＲＮＡは特にＨＣＶゲノムＲＮＡである。
【００６４】
サンプルのＨＣＶ ＲＮＡ含有率は、ＲＴ−ＰＣＲ、特に、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、例えば、Ａｍｐｌｉｃｏｒ（登録商標）ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ（登録商標）、Roche Diagnostics（Young et al., 1999）を使用して測定することができる。
【００６５】
別法として、サンプルのＨＣＶ ＲＮＡ含有率は、ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）技術（Damen et al., 1999)）を使用して測定することもできる。
【００６６】
サンプルのＨＣＶ ＲＮＡ含有率は、該サンプル中のＨＣＶ ＲＮＡ分子のコピーの数として表すことができ、ここで１コピーは１国際単位（UI）と同等である。
【００６７】
サンプルのＨＣＶ ＲＮＡ含有率は、該サンプル中に含有されたＨＣＶビリオンの量を示す。
【００６８】
約１０7コピー／mlより多くのＨＣＶ ＲＮＡを含有する組成物は、該組成物による動物の有効な免疫化を可能とする。
【００６９】
本発明は、更に詳しくは、ＨＣＶ ＲＮＡコピーの数がタンパク質mg当り約１０8〜約１０9UIである、上記した組成物に関する。
【００７０】
組成物のタンパク質含有率は、当業者に周知の方法により評価され、特にＬｏｗｒｙアッセイ（lowry et al., 1951）、例えば、Ｂｉｏｒａｄタンパク質アッセイ（Biorad Laboratories）により評価される。
【００７１】
この目安は組成物の特異的活性を表し、それは組成物の純度を示し、タンパク質mg当りＨＣＶ ＲＮＡコピーの数が高ければ高いほど、ＨＣＶ含有組成物の純度は高い。
【００７２】
本発明は、更に、該組成物の容積が約０．１ml〜約１０mlである上記した組成物に関する。
【００７３】
約０．１ml〜約１０mlの組成物容積は、少なくとも１０6ＨＣＶ ＲＮＡコピーを含有する上記した組成物に対応する。
【００７４】
このような組成物は動物の免疫化に有用である。例えば、マウスの有効な免疫化は、実施例で記載のとおり、約１０6より多くのＨＣＶ ＲＮＡコピーを含有するＨＣＶウイルス粒子組成物の投与を必要とする。
【００７５】
他の態様に従えば、本発明は、ＨＣＶ ＲＮＡ及びＨＣＶコアタンパク質を実質的に欠いている単離されたＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子（isolated HCV enveloped subviral particle）に関する。
【００７６】
「単離された」という用語は、粒子がその天然の環境から抽出されたこと、それが、特にＨＣＶ ＲＮＡ及び／又はＨＣＶコアタンパク質を含有する他のＨＣＶウイルス粒子又はその一部から分離されたことを意味する。
【００７７】
「ＨＣＶ ＲＮＡ及びＨＣＶコアタンパク質を実質的に欠いている」という表現は、上記したサブウイルス粒子を含有する溶液が、Ａｍｐｌｉｃｏｒ（登録商標）ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ（登録商標），Roche Diagnostics（Young et al., 1993）により測定して１０4UI／mlより少ないＨＣＶ ＲＮＡを含有し、そしてOrtho-Clinical Diagnostics test(Aoyagi et al., 1999）により測定して１pg／mlより少ないコアタンパク質を含有することを意味する。
【００７８】
エンベロープの存在は、以後Ｄ３２．１０と呼ばれる受託番号Ｉ−２９８３の下でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマにより分泌された抗体又は、以後Ｄ４．１２．９と呼ばれる受託番号Ｉ−２９８２の下でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマにより分泌された抗体によって、例えば、ＥＬＡ又はＥＬＩＳＡ試験により評価されうる。
【００７９】
「ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子」という表現は、粒子が、実質的にＨＣＶビリオンのエンベロープ部分のみ、即ち、脂質及び／又はタンパク質、特に小葉（leaflets）において会合した糖タンパク質を含有することを意味する。今までに単離されたＨＣＶウイルス粒子は、ＨＣＶ ＲＮＡ及び／又はＨＣＶコアタンパク質を含有していた。
【００８０】
本発明は、更に詳しくは、上記した抗体のいずれかに結合する傾向がある、上記の単離されたＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子に関する。
【００８１】
本発明の抗体への上記したサブウイルス粒子の結合は、当業者に周知のいくつかの方法、例えば、免疫沈澱、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ又はウエスタンブロットにより評価されうる。
【００８２】
他の態様に従えば、本発明は、ＨＣＶ ＲＮＡ、ＨＣＶコアタンパク質及ＨＣＶ
エンベロープを含有しそして上記した抗体のいずれかに結合する傾向のある精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子を含む組成物に関する。
【００８３】
本発明は、更に詳しくは、精製された天然のＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子を含む組成物に関する。
【００８４】
「ＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子」という表現は、ＨＣＶビリオンがＨＣＶゲノムＲＮＡ、ＨＣＶコアタンパク質及びＨＣＶエンベロープを含有することを意味する。これらの３つの成分を含有するＨＣＶウイルス粒子の報告は先行技術にはなかった。
【００８５】
ＨＣＶ ＲＮＡ、ＨＣＶコアタンパク質及びＨＣＶエンベロープの存在は、上記した方法を使用することにより評価されうる。
【００８６】
「精製した」という用語は、上記したＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子が他の化合物、例えば、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子から分離されていることを意味する。特に、組成物がＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子よりも９０％少ないＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を含有することは、例えば、電子顕微鏡法により評価されうる。
【００８７】
本発明に従う抗体への上記したＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の結合は、当業者に周知のいくつかの方法、例えば、免疫沈澱、ＥＬＩＳＡ、ＥＩ又はウエスタンブロットにより評価されうる。
【００８８】
他の態様に従えば、本発明は、下記の段階：
ＨＣＶ感染患者の清澄化血漿分離交換法（clarified plasmapheresis）から生じるサンプルを少なくとも２回超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得、
該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させてＨＣＶウイルス粒子の組成物を得る、
段階を含む、ＨＣＶウイルス粒子の組成物を製造する方法に関する。
【００８９】
超遠心は、例えば、約１９０，０００g〜約２２０，０００g、好ましくは２１０，０００gの速度で、約３時間〜約５時間、好ましくは、４時間の期間行うことができる。
【００９０】
好ましい遠心条件は、ウイルス粒子、例えばＨＣＶウイルス粒子を沈殿させるが、清澄化血漿中に含有される他の化合物は沈殿されない。
【００９１】
「血漿分離交換」という用語は、患者の血液をろ過して血漿を得るが、血液の残りは患者に再注入されたことを意味する。
【００９２】
「清澄化された」という用語は、血漿分離交換から得られた血漿が低い速度、特に３０００gで３０分間遠心されたことを意味する。
【００９３】
超遠心の前の血漿分離交換の初期容積は、有利には約１リットルである。
【００９４】
他の態様に従えば、本発明は、ＨＣＶウイルス粒子の組成物を製造するための上記した方法に従って得られる如きＨＣＶウイルス粒子の組成物に関する。
【００９５】
他の態様に従えば、本発明は、下記の段階：
ＨＣＶ感染患者の清澄化された血漿分離交換法から生じるサンプルを少なくとも２回超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得、
該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させ、
該再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットをショ糖密度勾配において超遠心して、再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットのエレメントをそれらの密度に従って画分に分離し、
ＨＣＶ ＲＮＡを実質的に含有せず、ＨＣＶコアタンパク質を実質的に含有せず、そしてＤ３２．１０又はＤ４．１２．９として前記したモノクローナル抗体に結合することができる粒子を含有する画分を回収して、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物を得る、
段階を含む、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物を製造する方法に関する。
【００９６】
再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットのショ糖密度勾配での超遠心は、約１９０，０００g〜約２２０，０００g、好ましくは２１０，０００gで、約４０時間〜約５０時間、好ましくは、４８時間の期間行うことができ、ショ糖勾配は、有利には、約１０％〜約６０％重量／重量、約２０〜約５０％重量／重量、約２５％〜約４５％重量／重量又は約３０％〜約４５％重量／重量であることができる。
【００９７】
得られたすべての画分は、ＨＣＶ ＲＮＡ、ＨＣＶコアタンパク質及び／又はＤ３２．１０若しくはＤ４．１２．９に結合することができる粒子の存在について試験される。
【００９８】
画分は、Ａｍｐｌｉｃｏｒ（登録商標）ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ（登録商標），Roche Diagnostics（Young et al., 1993）により測定したＨＣＶ ＲＮＡの含有率が約１０4UI／mlより小さい場合には、ＨＣＶ ＲＮＡを実質的に含有しないと言われる。
【００９９】
画分は、Ortho-Clinical Diagnostics test（Aoyagi et al., 1999）により測定したＨＣＶコアタンパク質の含有率が約１pg／mlより少ない場合には、ＨＣＶコアタンパク質を実質的に含有しないと言われる。
【０１００】
使用されるモノクローナル抗体は、特に、受託番号Ｉ−２９８３の下でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体Ｄ３２．１０である。
【０１０１】
粒子は、それらが下記のＥＩＡ試験で試験の結果ポジティブでありうるならば、上記したモノクローナル抗体に結合することができると言われる。
【０１０２】
９６ウエルのポリスチレンプレート（Falcon; Becton Dickinson France S.A, Le Pont de Claix）を１０−1〜１０−4に希釈した種々の画分でコーティングした。プレートを４℃で一夜インキュベーションし、次いで５％（重量／容積）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するトリス−ＨＣｌ（ＴＮ）緩衝液（２０mMトリス−ＨＣｌ，pH７．５及び１００mM ＮａＣｌ）で飽和させる。ＴＮ／ＢＳＡ緩衝液と５０％正常ヒト血清（ＮＨＳ）の混合物中に希釈された５μg/mlの濃度のｍＡｂＤ３２．１０を各ウエルに加えそして３７℃で２時間インキュベーションする。結合した抗体を、抗マウス免疫グロブリンのセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）−コンジュゲーテッドＦ（ａｂ’）２断片（１／５０００に希釈；Immunotech）、及び基質としてオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）及び過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）により検出する。光学密度（ＯＤ）を、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＭＲＸ，Ｄｙｎｅｘ）により４５０nm又は４９０nmで決定する。結果は、ネガティブコントロールの平均の掛ける２．１に相当するカットオフより上であるならば、ポジティブであると考えられる。
【０１０３】
回収された画分は、特に、約１．１３〜１．１５g/mlのショ糖密度を有する。
【０１０４】
別法として、画分をＤ３２．１０及び／又はＤ４．１２．９に結合することができる粒子の存在について最初に試験し、もしこのような粒子が実質的に存在しないならば、他の試験を行わず、もしこのような粒子が存在するならば、ＨＣＶ ＲＮＡ試験及び／又はＨＣＶコアタンパク質試験を行う。
【０１０５】
他の態様に従えば、本発明は、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物を製造するための上記の方法に従って得られるようなＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物に関する。
【０１０６】
他の態様に従えば、本発明は、下記の段階：
ＨＣＶ感染患者の清澄化された血漿分離交換法から生じるサンプルを少なくとも２回超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得、
該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させ、
該再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットをショ糖密度勾配において超遠心して、再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットのエレメントをそれらの密度にしたがって画分に分離し、
約５．１０5〜約１０6UI／mlのＨＣＶ ＲＮＡ、約５０〜約１００pg／mlのＨＣＶコアタンパク質を含有しそしてＤ３２．１０又はＤ４．１２．９として前記したモノクローナル抗体に結合することができる粒子を含有する画分を回収して、精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物を得る、
段階を含む、精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物を製造する方法に関する。
【０１０７】
再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットのショ糖密度勾配における超遠心は、約１９０，０００g〜約２２０，０００g、好ましくは２１０，０００gで、約４０時間〜約５０時間、好ましくは、４８時間の期間行うことができ、ショ糖勾配は、有利には、約１０％〜約６０％重量／重量、約２０〜約５０％重量／重量、約２５％〜約４５％重量／重量又は約３０％〜約４５％重量／重量であることができる。
【０１０８】
ＨＣＶ ＲＮＡ含有率、ＨＣＶコアタンパク質含有率及び粒子の結合能力を上記のように測定する。
【０１０９】
使用されたモノクローナル抗体は、受託番号Ｉ−２９８３の下でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体Ｄ３２．１０である。
【０１１０】
この方法により得られた組成物は、特に精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子を含有し、そして特にＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を実質的に欠いている。特に、組成物がＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子よりも９０％少ないＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を含有することが、例えば、電子顕微鏡法により評価されうる。
【０１１１】
回収された画分は、特に、約１．１７〜１．２１g/ml、更に詳しくは約１．１７〜１．２０g/ml、約１．１９〜１．２１g/ml、約１．１７〜１．１９g/ml又は１．１９〜１．２０g/mlのショ糖密度を有する。
【０１１２】
別法として、画分を、最初にＨＣＶ ＲＮＡの存在について試験し、１０5コピー／mlより多くのＨＣＶ ＲＮＡが存在するならば、ＨＣＶコアタンパク質試験を行い、もし５０pg／mlより多くのコアタンパク質が存在するならば、Ｄ３２．１０及び／又はＤ４．１２．９に結合することができる粒子の存在を試験し、もし１０5コピー／mlより少ないＨＣＶ ＲＮＡが存在するならば、他の試験を行わない。
【０１１３】
他の態様に従えば、本発明は、上記の対応する方法に従って得られるような精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物に関する。
【０１１４】
本発明は、下記の段階：
−動物、特に哺乳動物を本発明のＨＣＶウイルス粒子の組成物又は本発明に従って製造されるようなものにより免疫化し、そして発生した抗体を回収し、
−発生した抗体のなかで、ＨＣＶウイルス粒子の上記した組成物中に含有されたＨＣＶウイルス粒子に結合する能力に基づいてモノクローナル抗体を選ぶ、
段階を含む、受託番号Ｉ−２９８３の下でＣＮＣＭに受託されたハイブリドーマにより分泌されたモノクローナル抗体を製造する方法に関する。
【０１１５】
ＨＣＶウイルス粒子の組成物は、下記のようにして得ることができる：
−ＨＣＶ感染患者の清澄化された血漿分離交換から生じるサンプルを少なくとも２階超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得；
−該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させてＨＣＶウイルス粒子の組成物を得る。
【０１１６】
発生した抗体の選択は、プレートを本発明のＨＣＶウイルス粒子の組成物によりコーティングして、上記した間接ＥＩＡ試験により行うことができる。
【０１１７】
他の態様に従えば、本発明は、下記の段階：
−動物、特に哺乳動物を本発明の精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物又は本発明に従って製造されるようなものにより免疫化し、そして発生した抗体を回収し、
−発生した抗体のなかで、精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の上記した組成物中に含有された精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子に結合する能力に基づいてモノクローナル抗体を選ぶ、
段階を含む、受託番号にＩ−２９８２の下でＣＮＣＭに受託されたハイブリドーマにより分泌されたモノクローナル抗体を製造する方法に関する。
【０１１８】
精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物は、下記のようにして得ることができる：
ＨＣＶ感染患者の清澄化された血漿分離交換法から生じるサンプルを少なくとも２回超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得、
該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させ、
該再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットをショ糖密度勾配において超遠心して、再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットのエレメントをそれらの密度に従って画分に分離し、
約５．１０5〜約１０6UI／mlのＨＣＶ ＲＮＡ、約５０〜約１００pg／mlのＨＣＶコアタンパク質を含有しそしてＤ３２．１０又はＤ４．１２．９として前記したモノクローナル抗体に結合することができる粒子を含有する画分を回収して、精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物を得る。
【０１１９】
選択段階は前記のように行うことができる。
【０１２０】
他の態様に従えば、本発明は、下記の段階：
−動物、特に哺乳動物を本発明の又は本発明に従って製造されるＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物により免疫化し、そして発生した抗体を回収し、
−発生した抗体のなかで、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の上記した組成物中に含有されたＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子に結合する能力に基づいてモノクローナル抗体を選ぶ、
段階を含む、ＨＣＶ、特に、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子に対するモノクローナル抗体を製造する方法に関する。
【０１２１】
ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物は、下記のようにして得ることができる：
−ＨＣＶ感染患者の清澄化された血漿分離交換法から生じるサンプルを少なくとも２回超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得、
−該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させ、
−該再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットをショ糖密度勾配において超遠心して、再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットのエレメントをそれらの密度に従って画分に分離し、
−ＨＣＶ ＲＮＡを実質的に含有せず、ＨＣＶコアタンパク質を実質的に含有せずそしてＤ３２．１０又はＤ４．１２．９として前記したモノクローナル抗体に結合することができる粒子を含有する画分を回収して、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物を得る。
【０１２２】
選択段階は上記のように進めることができる。
【０１２３】
本発明は、更に詳しくは、本発明のＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子に対する抗体に関する。
【０１２４】
本発明は、活性物質としてＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子に対する少なくとも１つの抗体及び薬学的に許容されうるベヒクルを含む医薬組成物にも関する。
【０１２５】
他の態様に従えば、本発明は、活性物質として上記したＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を、又は上記したＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を含む組成物、及び薬学的に許容されうるベヒクルを含む医薬組成物に関する。
【０１２６】
更に、Remington's Pharmaceutical Science 16thed./ Mark Publishing Coに定義されているようなアジュバントを、医薬組成物に加えることができ、該アジュバントは、例えば不完全フロイントアジュバント、アルミニウム塩又は水酸化アルミニウムであることができる。
【０１２７】
組成物は、例えば、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子１mg〜１gを含む単一投与量（single dose）で投与することができる。
【０１２８】
他の態様に従えは、本発明は、上記したＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子又は上記したＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を含む組成物の使用であって、該ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子に対する免疫反応又は上記したＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子に対する免疫反応を誘発するための使用に関する。
【０１２９】
「免疫反応を誘発する」という表現は、ＨＣＶウイルス粒子に対する抗体を分泌するＢ細胞を活性化することができること又はＨＣＶにより感染した細胞を殺すT細胞を活性化することができることを意味する。
【０１３０】
他の態様に従えば、本発明は、ＨＣＶ感染の診断、予防又は治療用の医薬を製造するための、上記したＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子又は上記したＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を含む組成物の使用に関する。
【０１３１】
ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子は当業者に周知された方法、例えばＥＩＡ、ＥＬＩＳＡに従うイムノアッセイにおいてＨＣＶに対する抗体の存在を評価するのに使用することができる。
【０１３２】
ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子は、肝炎Ｃに対するワクチン、特に治療ワクチンの製造のために使用することができる。
【０１３３】
「治療ワクチン」という表現は、ワクチンがＨＣＶにより感染した患者の状態を、例えば、ＨＣＶに対する抗体の産生を誘発することにより改善することができることを意味する。
【０１３４】
実施例１
天然のＨＣＶウイルスエンベロープに対するモノクローナル抗体の取得
ＨＣＶウイルス粒子の調製
良好な供給においてウイルス物質を得るために、ＨＣＶウイルス粒子の精製を血漿分離交換から行った。選ばれた患者は、Ｃウイルス硬変のための部分的肝臓移植後に慢性の活性肝炎Ｃを発生し、そして１２ヶ月後、血漿交換の原因である高ガンマグロブリン血症と関連した多発性骨髄腫を発生した。患者は、異常に高い血清アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ／ＡＳＴ）レベルを示しそして抗ＨＣＶ抗体についてポジティブであった。患者はすべてのＨＢＶ及びＨＩＶマーカーについてネガティブであった。初めの材料のＨＣＶ ＲＮＡ含有率は、６×１０5コピー／ml（Ａｍｐｌｉｃｏｒ（登録商標）ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ（登録商標）、Roche Diagnostics, Meylan, France）であり、そして遺伝子型１ｂ（ＩＮＮＯ−ＬＩＰＡアッセイ，Innogenetics, Gent, Belgium）であった。
【０１３５】
清澄化血漿分離交換を使用して、２１０，０００gで４℃で４時間の２回の引き続く超遠心によりＨＣＶに富んだペレットを調製した。最終ペレットをトリス−ＮａＣｌ−ＥＤＴＡ（ＴＮＦ）緩衝液（２０ミリモル／L トリス−ＨＣｌ、pH７．５、１００ミリモル／L ＮａＣｌ、１ミリモル／L ＥＤＴＡ）（濃度２４０倍）１ml中に再懸濁させ、そして−８０℃で貯蔵した。この材料のＨＣＶ ＲＮＡ含有率は３×１０7コピー／mlであり（Monitor, Roche）、そしてタンパク質濃度は５mg/ml（即ち、約１０7コピーのＨＣＶ ＲＮＡ／タンパク質１mg）であった。
【０１３６】
ハイブリドーマ調製
モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を発生させるために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、完全フロイントアジュバント中のＨＣＶペレット化材料１００μg（ＨＣＶ ＲＮＡ１０6コピー）を接種し、続いて１週間後に不完全フロイントアジュバント中のウイルス１００μgを接種した。３匹の免疫化されたマウスは、間接エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）により検出されたＨＣＶに対する高い血清抗体力価を発生した。３週間後、マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のウイルス５０μgでブーストした。５日後、注射を繰り返し、そして３日後、脾臓を取り出して、Ｂuttin et al.(1978)により記載された方法によりＸ６３骨髄腫細胞と融合させた。固相として免疫原（５μg/ml）を使用しそして顕色第二抗体（Petit et al., 1987）として抗マウス免疫グロブリンのペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッドＦ（ａｂ’）２断片（Amersham, France）を使用する間接ＥＩＡによって、ハイブリドーマ培養上澄液を、ＨＣＶ特異的抗体の存在についてスクリーニングした。希釈剤は、５０％の正常なヒト血清（ＮＨＳ）を含有していて、ＨＣＶウイルス粒子と場合により会合したＮＨＳタンパク質に対する非特異的反応性を除去した。次いで、限界希釈することにより、ＨＣＶに対する最も強いシグナル（Ｐ／Ｎ＞１０）を与えるハイブリッドを再クローニングし、そしてそれらの特異性を更に決定した。７つのクローン（（Ｃ９．１９．１６、Ｃ２．２２．１、Ｄ３２．１０、Ｄ３．２０．１２、Ｃ７．２４．１９、Ｃ７．１４．４１及びＣ１．９．３）を選択し、そして４つのクローン（Ｄ３２．１０、Ｃ２．２２．１、Ｃ９．１９．１６及びＤ．３．２０．１２）を、プリスタンでプライミングしたＢＡＬＢ／ｃマウスに注射することにより増殖させて腹水液を産生させ、次いで５０％飽和（ＮＨ4）2ＳＯ4で沈殿させること、次いでセファロース−プロテインＧ（Pharmacia, France）におけるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。アイソタイプを、当業者に周知の方法によってＥＬＩＳＡにより決定した。分析した７つのクローンはＩｇＧ１アイソタイプの抗体を与えた。
【０１３７】
モノクローナル抗体特徴付け
間接ＥＩＡを使用して、上記したモノクローナル抗体とウイルス粒子との相互作用を評価した。９６ウエルのポリスチレンプレート（Falcon; Becton Dickinson France S.A, Le Pont de Claix）を、１０−1〜１０−6（１００μg/ml〜１ng/mlに相当する）に希釈されたＨＣＶ調製物（１mgタンパク質/ml）でコーティングした。プレートを４℃で一夜インキュベーションし、次いで５％（重量／容量）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するトリス−ＮａＣｌ（ＴＮ）緩衝液（２０mMトリス−ＨＣｌ、pH７．５及び１００mM ＮａＣｌ）で飽和させた。ＴＮ／ＢＳＡ緩衝液及び５０％正常ヒト血清（ＮＨＳ）の混合物中に５μg/mlの濃度に希釈されたｍＡｂＤ３２．１０を、各ウエルに加えそして３７℃で２時間インキュベーションした。結合した抗体を、抗マウス免疫グロブリン（１／５，０００に希釈された；Immunotech）のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）−コンジュゲーテッドＦ（ａｂ’）２断片及び基質としてオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）及び過酸化水素により検出した。光学密度（ＯＤ）をＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＭＲＸ，Ｄｙｎａｘ）により４５０nmで側定した。結果は、ネガティブコントロールの平均の掛ける２．１に相当するカットオフより上である場合にポジティブであると考えられた。得られた７つの抗体はウイルス粒子を認識した。
【０１３８】
ｍＡｂｓのネイティブポリペプチド特異性を確立するために、抗原性プローブ（Petit et al., 1987）として免疫原を使用するイムノブロッティングを行った。１２．５％ゲルでのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を還元条件下に（２％ＳＤＳ＋５％２−ＭＥ）行った。ＰＶＤＦ膜へのタンパク質移行の後、ｍＡｂｓ（２〜５μg/ml）を一次抗体として試験し、５０％ＮＨＳ中に希釈し、そして結合したＩｇＧｓを、二次抗体として抗マウス免疫グロブリンのペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッドＦ（ａｂ’）２断片（１／１０，０００に希釈された；ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ）とのインキュベーションにより検出した。バンドをAmershamからの高められた化学発光（ＦＣＬ＋）システムにより可視化した。
【０１３９】
Ｄ３２．１０を除くすべての試験したｍＡｂｓは、還元条件下にＨＣＶポリペプチドとのネガティブ反応を与えた。選ばれたｍＡｂｓは、ＥＩＡにおいてヒトＩｇＧと弱く反応した（ネガティブ値の約５倍）Ｃ１．９．３及びＣ７．２４．１９を除いて、ヒト血清アルブミン又は免疫グロブリン（Ｉｇ）のγ鎖若しくはμ鎖と反応性ではなかったことは注目に値する。
【０１４０】
７つの抗体のポリペプチド特異性も免疫沈澱により検査した。ＨＣＶタンパク質（Ｅ１、Ｅ２又はＥ１Ｅ２）を発現するワクシニアウイルス組換え体により感染したＨｅｐＧ２細胞を、前記したように、35S-Translabel（ＩＣＮ）で代謝的に標識した（Dubuisson et al., 1996）。細胞を、１０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．５）、１５０mM ＮａＣｌ及び２mM ＥＤＴＡ中の０．５％ＮＰ−４０により細胞溶解した。沈殿をＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液で処理し、そして還元条件又は非還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１）。試験したモノクローナル抗体は、Ｃ９．１９．１６（＞２００kDa）、Ｄ３．２０．１２（７０、５０及び４６kDaにおける３つの強いバンド）及びより弱くは、Ｃ２．２２．１（７０、５０、４６kDa）及びＤ３２．１０（多数の非常に弱いバンド）（図１Ａ、コントロールベクター）を除いて、細胞成分に対する非特異的反応性を示さなかった。すべての抗体は、２つのＨＣＶ糖タンパク質が別々に発現される場合には、Ｅ１（図１Ｂ）及びＥ２（図１Ｃ）を特異的に免疫沈殿させ、そしてこれらのタンパク質が共発現される場合には、Ｅ１Ｅ２ヘテロ二量体（図１Ｄ）を特異的に免疫沈殿させた。興味深いことに、パターンは、非還元条件及び還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥの後異なっていた（図１Ｄ、図１Ｅ）。すべてはジスルフィドで連結されたＥ１Ｅ２集合体を認識したが、これは非還元条件下にゲルの上部において検出された（図１Ｅ）。１つのｍＡｂ、Ｄ３２．１０は、大抵集合体と反応しそして非共有結合連結された成熟複合体Ｅ１Ｅ２とも反応する（図１Ｅ、非還元条件）ことが見出された。すべてのｍＡｂｓは、異種システムにおいて発現された変性された組換えＥ１又はＥ２タンパク質をウエスタンブロットにより認識しなかったが、これは、それらがＨＣＶウイルス粒子上の立体配座エピトープを認識したことを示唆している。集約すると、これらの結果は、これらのｍＡｂｓは天然の血清由来のＨＣＶウイルス粒子の表面に発現されたジスルフィドで連結されたＥ１Ｅ２複合体を特異的に認識することを示している。それらはＥ１タンパク質とＥ２タンパク質との間の共有された立体配座エピトープと反応することは極めて確かである。共有結合形態又は非共有結合形態下のＥ１Ｅ２複合体と相互作用するモノクローナル抗体Ｄ３２．１０が更なる研究のために選ばれた。
【０１４１】
モノクローナル抗体Ｄ３２．１０抗原マッピング
Ｄ３２．１０のＨＣＶ型特異性を試験するために、４つの異なるＨＣＶ調製物（ml当り１mgのタンパク質）を１０−1〜１０−6（１００μg/ml〜１ng/mlに相当する）に希釈して、既に記載した方法に従って、間接ＥＩＡを行った。免疫原ＨＣＶ調製物に加えて、同じ患者から得られた調製物を使用し、そして慢性肝炎Ｃを有する２人の異なる患者から得られた２つの他の調製物を使用したが、患者の１人は血清において２つの異なる遺伝子型、即ちＨＣＶ１ａ及びＨＣＶ２ａ、を有することが見出された。Ｄ３２．１０は、ＨＣＶ調製物のすべての４つを認識することができることが見出され、それによりそれは免疫原の１ｂ遺伝子型に拘束されない決定基を認識することができることを示す。
【０１４２】
Ｄ３２．１０のネイティブポリペプチド特異性を評価するために、ウエスタンブロット分析を行った。未処理のＨＣＶに富んだペレットを、０．１から１mg/mlまで変わる種々の濃度で抗原フローブとして使用した。抗原を還元条件又は非還元条件（２％ＳＤＳ±５％２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）下に１２．５％ゲルでのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付した。ＰＶＤＦ膜へのタンパク質移行の後、５０％ＮＨＳ中に希釈された一次抗体としてｍＡｂＤ３２．１０（２〜５μg/ml）を使用してイムノブロッティングを行った。次いで結合したマウスＩｇＧｓを、二次抗体として抗マウス免疫グロブリンのペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッドＦ（ａｂ’）２断片（１／１０，０００に希釈された；ＤＡＫＯ）とのインキュベーションにより検出した。タンパク質バンドをAmershamからの高められた化学発光（ＥＣＬ＋）により可視化した。循環しているＨＣＶビリオンに対してSato et al.(1993）により今までに記載されたとおりにグリコシダーゼ消化を行った。ＨＣＶに富んだペレット（ＨＣＶ−Ｌ、４μg）を、１００mMクエン酸塩／リン酸塩緩衝液（pH６．０）中のグリコシダーゼＡ（ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＡ又はＰＮＧアーゼＡ；ＲＯＣＨＥ）５、１０又は２０mU／mlで３７℃にて１８時間処理した。エンドグリコシダーゼＨ（ｅｎｄｏＨ、５mU／ml、Rocheから）、２０mMジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含有する５０mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH５．５）中で３７℃で一夜インキュベーションすることにより、精製されたＨＣＶウイルス粒子の脱グリコシル化も行った。酵素を省いたことを除いては、ＰＧＮアーゼＡ消化又はｅｎｄｏＨ消化の場合と同じ条件を使用してコントロール消化を行った。次いでサンプルを、還元剤を含有する電気泳動サンプル緩衝液で処理しそしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１４３】
ウエスタンブロット実験の結果を図２に示される。同じサンプルの２つの濃度（それぞれ、２．５及び５μg、レーン２及び３）が還元条件（２％ＳＤＳ／５％２−ＭＥ）下に分析されるとき、ｍＡｂＤ３２．１０は、それぞれＥ２及びＥ１に対応する６８kDaの主要バンド及び３１kDaの他のバンドを認識した。しかしながら、非還元条件下では、ｍＡｂ３２．１０は、ゲルの上部に回収されたジスルフィドで連結された複合体（＞２００kDa）を認識した。これらの高分子量バンド（図２、レーン１）はヘテロ二量体Ｅ１Ｅ２複合体に対応することは極めて確かである。
【０１４４】
アスパラギンで連結された複合体型糖鎖は、ＨＣＶのネイティブビリオンの表面に存在することが示され（Sato et al., 1993）、かくして種々の濃度（２０、１０及び５mU／ml）のグリコシダーゼ（ＰＮＧアーゼＡ）によるＨＣＶ調製物の処理後のＨＣＶ特異的タンパク質を認識するＤ３２．１０ｍＡｂの能力を検査した。図３Ａ（それぞれ、レーン１、２及び３）に示されたとおり、Ｄ３２．１０は、酵素の最も高い濃度で蓄積したＥ１の脱グリコシル化形態、特に２５kDa種と反応した。Ｅ１関連産物は脱グリコシル化後にＤ３２．１０により明らかに検出することができたが、Ｅ２関連産物は処理後明白には同定されなかった。エンドグリコシダーゼＨ（ｅｎｄｏＨ）消化は、天然のＨＣＶウイルス粒子上に発現されたＥ１Ｅ２複合体のｅｎｄｏＨ開裂に対する感受性の調査を可能とした。図３Ｂに示されたとおり、分子量のシフトが、Ｅ２（６８〜４２kDa）及びＥ１（３４〜２４kDa）タンパク質で観察され、これはＥ１及びＥ２が、部分的ｅｎｄｏＨ抵抗性の主な原因である、血清由来のネイティブＨＣＶウイルス粒子における複合グリコシル化（complex glycosylation）、例えば、ｅｎｄｏＨ抵抗性複合グリカンと感受性形態の混合物を有することを示唆する。
【０１４５】
Ｄ３２．１０エピトープマッピング
ａ．ペプチドライブラリーのスクリーニング
ｍＡｂＤ３２．１０により認識されたエピトープを更に特徴付けるために、抗体を使用してドデカペプチドファージディスプレーライブリーをスクリーニングした。
【０１４６】
Ｐｈ．Ｄ−１２（登録商標）ファージディスプレイペプチドライブラリーキットをNew England Biolabs Incから得た。これは、Ｍ１３ファージの少量コートタンパク質（ｐＩＩＩ）に融合したコンビナトリアルペプチド１２量体（１２−ｍｅｒｓ）である。ディスプレイされたペプチド１２量体はｐＩＩＩのＮ末端で発現される。ライブラリーは、約１．９×１０9個のエレクトロポレーションされた配列からなり、これらは一旦増幅されると供給されたファージ１０μlにおいて各配列約２０コピーを生じる。いくらかの修正を伴って製造者の取扱説明書に従って３回のバイオパンニング（biopannings）を行った。簡単に言えば、ビオチニル化ｍＡｂｓＤ３２．１０の１０μgを、ストレプトアビジン４０μgでコーティングされた３５mmポリスチレンペトリ皿（Falcon）にカップリングさせた。皿を４℃で一夜インキュベーションし、そして０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含有する５０mMトリス、１５０mM ＮａＣｌ、pH７．５（ＴＢＳ）で６回洗浄した。第１回の選択では、最初のライブラリーからの４×１０10個のファージをロッキング条件（rocking condition）下に４℃で４時間皿に結合したＩｇＧと反応させた。結合しなかったファージをＴＢＳ−Ｔによる繰り返し洗浄により除去した。次いで、結合したファージを溶離緩衝液（０．１Ｎ ＨＣｌ、グリシンにより２．２に調節されたpH、１mg/mlＢＳＡ）４００μlで皿から溶離させた。７５μlの１Ｍトリス−ＨＣｌ pH９．１で中和した後、次いで溶離したファージを、取扱説明書に推奨されたとおりに、Ｅ．ｃｏｌｉＥＲ２５３７（ｒｅｃＡ＋株細胞）の一夜の培養物の１：１００希釈物２０mlに感染させることにより増幅した。培養物を激しく振とうしながら、３７℃で４．５時間インキュベーションした。上澄液を得、そして前に記載されたとおり（Scott et al., 1990）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により沈殿させた。第２及び第３回の選択では、先の回からの増幅されたファージの２０％をそれぞれ１０及び１nMの最終濃度でビオチニル化ｍＡｂＤ３２．１０と４℃で一夜予備インキュベーションし、次いでストレプトアビジン１０μgでコーティングされた３５mmポリスチレンペトリ皿に加えた。次いで処置は第１回と同じであった。次いで第３バイオパンニング溶離物からのファージをクローニングしそしてＤＮＡ配列決定及びイムノ分析のために増幅した。
【０１４７】
ＤＮＡ配列決定のために、Sambrook et al.(1982）により記載されたとおり精製したファージから一本鎖ＤＮＡを調製した。ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット（Perkin-Elmer）を使用してApplied Biosystems ＤＮＡシーケンサー（Ｍｏｄｅｌ３７７Ａ）によりSangerの改変された方法（Sanger et al., 1977）に従って、遺伝子ＩＩＩインサートのヌクレオチド配列を決定した。ｐＩＩＩ遺伝子配列に対応するプライマー５’ＨＯ−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−ＯＨ３’（配列番号４）によりサイクルシーケンス法を行った。インサートのアミノ酸配列をヌクレオチド配列から推定した。
【０１４８】
上澄液ファージに対するＥＬＩＳＡのために、ＥＬＩＳＡプレートウエルの列を、０．１MＮａＨＣＯ3緩衝液（pH８．６）中の１００μg/mlの最終濃度のｍＡｂＤ３２．１０又は無関係のｍＡｂ １００μlでコーティングした。プレートを４℃で一夜インキュベーションし、次いでＢＳＡ５mg/mlを含有する０．１M ＮａＨＣＯ3緩衝液（pH８．６）でブロックした。４℃で２時間インキュベーションの後、プレートを０．５％Ｔｗｅｅｎを含有するＴＢＳで６回洗浄した。各ファージクローンの４倍逐次希釈物を、ＴＢＳ−Ｔ１００μlの最終容積においてマイクロタイタープレートの各ウエルに加え、列の第１ウエル中の１０12個のビリオンで出発しそして第１２ウエル中の２×１０5個のビリオンで終わる。プレートを、攪拌しながら室温で２時間インキュベーションし、次いで上記したＴＢＳ−Ｔで６回洗浄した。結合したファージを、１：５，０００希釈率のセイヨウワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッド抗Ｍ１３ｍＡｂ（Pharmacia）を使用してサンドイッチアッセイにおいて検出した。プレートを、ＯＰＤ及びＨ2Ｏ2を含有する市販のカラーキット（bioMerieux）を使用して顕色した。１０分のインキュベーションの後、プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９２nmで読み取った。各ファージクローン希釈物について、結果を、試験した抗ＨＣＶｍＡｂで得られた値と無関係のｍＡｂで得られた値との差として表した。次いで、結果を免疫反応性クローンの最適希釈物を３回反復して試験することにより確認した。
【０１４９】
配列分析のために、ペプチドのアミノ酸配列を、Mac Vector, Ver.4.5ソフトウエア（Kodak）の使用によりＨＣＶＥ１及びＥ２タンパク質配列と比較した。基本的に、最も高い類似性の領域を、最善の位置確認を試験的に調査するＬＦＡＳＴＡプログラム（Pearson and Lipman, 1988）で検出した。
【０１５０】
第３回の選択の後、ファージインプットの４％が、特異的に結合したファージの増幅を示す溶離物において見出された。かくして、８８クローンを、ランダムに単離し、それらのＤＮＡを配列決定しそしてインサートのアミノ酸配列を推定した。４８の異なる配列が得られそしてそれらのいくらかはいくつかの実施例で見出された。しかしながら、Ｄ３２．１０とのそれらの免疫反応性についてＥＬＩＳＡ試験で試験すると、それらのいずれもポジティブシグナルを与えなかったが、これは、結合アフィニティが検出することができるのにはあまりにも低すぎることを示す。４８クローン配列をＨＣＶＥ１及びＥ２の配列と比較した。５及び３の配列は、それぞれ２９２〜３０５領域及び３４７〜３５６領域に位置したＥ１の残基との類似性を示したが（類似性は表１にボールド体に示される）、これに対して７、４及び２の配列は、それぞれ領域４８１〜５０１、６１０〜６３１及び６８５〜６９８に位置しているＥ２の残基とのいくらかの類似性を共有していた（類似性は表２のボールド体で示されている）。
【０１５１】
【表１】
【０１５２】
【表２】
【０１５３】
ｂ．ペプチド合成
Ｅ１及びＥ２配列に関するこれらの異なる局在化の意義を評価するために、Ｅ１の領域２９１〜３１５及び３４７〜３５６並びにＥ２の領域４７３〜４９８、６０７〜６２７及び６８６〜６９７を１つだけずれた重なり合っている合成ペンタデカペプチドとして再現しそしてＤ３２．１０とのそれらの免疫反応性について試験した。
【０１５４】
９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノ酸化学（Frank, 1988）を使用してニトロセルロース膜で、種々のペプチド配列の同時合成を行った。
【０１５５】
各ペプチドを免疫学的検出に適当なナノモル量で発生させた。膜に結合したペプチドに対する抗体反応性を、先に記載された（Jolivet-Reynaud, 1998）間接比色イムノアッセイにより分析した。抗体反応性を有するペプチドに対応するスポットは、ポジティブブルーシグナルを生じた。スポットの強度を可視化により評価しそして０〜５の範囲のスケールで相対的強度として表した。
【０１５６】
２９２〜３０５Ｅ１領域に対応するペプチドで強いポジティブシグナルが得られ、これに対して３４７〜３５６Ｅ１領域はＤ３２．１０により認識されなかった。それぞれＥ２領域４８２〜４９９及６１２〜６２６に対応するペプチドもＤ３２．１０と免疫反応性であり、そしてＥ２領域６８６〜６９７ではシグナルは検出されなかった。ペンタデカペプチドとしてＥ１の領域２９２〜３０６並びにＥ２の領域４８０〜４９４及び６０８〜６２２は、ＥＬＩＳＡにおいてＤ３２．１０と相互作用した。
【０１５７】
重なり合っているオクタペプチドを使用することにより、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質の297ＲＨＷＴＴＱＧＣＮＣ306（配列番号１）領域並びにＨＣＶ Ｅ２タンパク質の613ＹＲＬＷＨＹＰＣＴ621（配列番号３）及び480ＰＤＱＲＰＹＣＷＨＹＰＰＫＰＣ494（配列番号２）領域の両方がＤ３２．１０と反応性であった。Ｅ２において同定された２つの領域は、Ｅ１Ｅ２のヘテロ二量化に関与していることがYagnik et al.(2000）により示唆された同じモチーフＷＨＹＰを含有する。実際に、これらの領域を識別するのは困難であるが、２つのオーバーラッピングしていないゾーンとして：479ＧＰＤＱＲＰＹＣ486（配列番号２６）及び487ＷＨＹＰＰＫＰＣ494（配列番号２７）はＤ３２．１０に別々に結合し、これは、Ｄ３２．１０が各オクタペプチドを特異的に認識すること、それゆえ完全な配列（４８０〜４９４）を特異的に認識することを示唆する。
【０１５８】
実施例２
血清由来のＨＣＶウイルス粒子の特徴付け及び精製
種々のＨＣＶ母集団を分離するために、最終のＨＣＶに富んだペレットをショ糖密度勾配（１０〜６０％、重量／重量）における等密度遠心（４℃で４８時間２１０，０００g）に付した。画分（０．６ml）を集め、そして各々の密度を屈折率測定法により側定した。ＨＣＶ ＲＮＡ含有率を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Amplicor Monitor, Roche）により分析し、ＨＣＶコアタンパク質含有率をOrtho-Clinical Diagnostics試験で測定し、そしてｍＡｂＤ３２．１０に対するＨＣＶウイルス粒子抗原反応性を間接ＥＩＡにより測定した。
【０１５９】
ウエルを１０−1〜１０−4に希釈した種々の画分でコーティングすることを除いて間接ＥＩＡを上記したとおりに行った。
【０１６０】
３つの異なる母集団を同定した（図４）。１つの母集団（画分３〜５）は１．０６〜１．０８g/mlのショ糖密度に階層区分されており（banded）、そしてＤ３２．１０による間接ＥＩＡにより得られたネガティブな結果により証明されるとおりウイルスエンベロープを実質的に欠いているが、ＨＣＶ ＲＮＡ（約２．１０5UI／ml）及びＨＣＶコアタンパク質（約２〜４pg／ml）を含有していた。これらは、エンベロープのないウイルス粒子であると思われる。他の母集団（図の画分８〜１０）は１．１４〜１．１５g/mlのショ糖密度に階層区分されており、そしてＨＣＶ ＲＮＡを実質的に欠いており（約１０4〜１０5UI／ml）そしてＨＣＶコアタンパク質を実質的に欠いている（約１pg／ml）が、Ｄ３２．１０に応答する高いレベルの粒子（約１〜３．８ＯＤ450nm単位）を含有していた。これらのＨＣＶサブウイルス粒子はＨＣＶウイルスエンベロープのみを含有するようである。第３母集団（画分１１〜１４）は１．２０〜１．２１g/mlのショ糖密度に階層区分されており、そして高いレベルのＨＣＶ ＲＮＡ（約５．１０5〜１０6UI／ml）及びＨＣＶコアタンパク質（約２．５〜８pg／ml）を有しそしてＤ３２．１０に応答する（約０．５〜１．５ＯＤ450nm単位）粒子を含有していた。このゆえに、この母集団は実質的に精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子のみを含有する。
【０１６１】
ＨＣＶに富んだペレット（図５Ａ）及び第２（図５Ｃ）及び第３母集団（図５Ｂ）に含有されているウイルス粒子を、Ｄ３２．１０により免疫沈殿させそして電子顕微鏡法により観察した。ＨＣＶウイルス粒子のいくつかの調製物をこの方法により分析した。ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子は約３０nm（３３．０８nm）の平均直径を有する球状粒子として現れる（図５Ｃ）が、これに対してＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子は、約５０nm（４８．７２nm）の平均直径を有することを除いては同じく球状に見える（図５Ｂ）。
【０１６２】
実施例２の２
血清由来のＨＣＶウイルス粒子の特徴付け及び精製
感染した患者の血漿中に存在するＨＣＶウイルス粒子の母集団の他の分析も本発明者により行われた。
【０１６３】
血清由来のＨＣＶ粒子の精製
実施例１で得られたＨＣＶに富んだペレット（ＨＣＶ−Ｌ）を、物理化学的、免疫学的及び形態学的研究のために使用し、そして規則的な血漿交換を必要とする重い皮膚脈管炎（cutaneous vascularitis）と関連したタイプＩＩクリオグロブリン血症を有する慢性肝炎Ｃ（ＣＨ−Ｃ）を示した他の患者（ＨＣＶ−Ｆａｎ、遺伝子型１ａ／２ａ）の血漿分離交換由来のペレットを使用した。ＨＣＶ−Ｌ患者の場合と同じく、後者のＨＣＶ−Ｆａｎ患者は、異常に高い血清アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ／ＡＳＴ）レベルを示し、抗ＨＣＶ抗体に対してポジティブであり、そしてすべてのＨＢＶ及びＨＩＶマーカーに対してネガティブであった。
【０１６４】
かくして、７つの血清調製物を特徴付けた。それらは定量的Ａｍｐｌｉｃｏｒ ＨＣＶ ＲＮＡ Ｍｏｎｉｔｏｒ試験（Roche）において、２．５×１０6コピ―／ml〜５〜７．５×１０7コピー／mlに対応する、１０6UI／ml〜２〜３×１０7UI／ml（ＨＣＶ−Ｆａｎ、ＨＣＶ−Ｌ）でＨＣＶ ＲＮＡに対してポジティブであった。
【０１６５】
異なるＨＣＶ母集団を分離するために、最終のＨＣＶに富んだペレットをショ糖密度勾配（１０〜６０％又は３０〜４５％、重量／重量）において等密度遠心（４℃で４８時間２００，０００g）に付した。画分（０．６ml）を、集めそして各々の密度を屈折率測定法により側定した。ＨＣＶ ＲＮＡ含有率を定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Amplicor Monitor, Roche）により監視した。固相上に種々の希釈率（１／１０〜１／１００００）で各画分をコーティングした後、上記したとおり間接ＥＩＡによりＭＡｂＤ３２．１０を使用してＨＣＶエンベロープ（ｅｎｖ）反応性を検出した。抗コアモノクローナル抗体の混合物（７Ｇ１２Ａ８、２Ｇ９Ａ７及び１９Ｄ９Ｄ６）（Jolivet-Reynaud et al., 1998; Menez et al., 2003）を使用して定量的Ｏｒｔｈｏアッセイ及びウエスタンブロットを使用することにより、ＨＣＶコア抗原をアッセイした。
【０１６６】
簡単に言えば、ＨＣＶに富んだペレット及びショ糖勾配から集めた各画分中のトータルＨＣＶコア抗原の測定を、OrthoR trak-C（登録商標）アッセイ（Ortho-Clinical Diagnostics, Inc）を使用して行った。OrthoR trak-C（登録商標）アッセイは、ＨＣＶコア抗原の種々の領域に対する特異性を有するいくつかのモノクローナル抗体を使用する定量的イムノキャプチャーアッセイである。この方法は、サンプル調製物を遊離させるための予備処理段階を使用し、免疫複合化させそしてアッセイに利用可能なビリオン会合抗原を使用する（Aoyagi et al., 1999）。ＨＣＶ ＲＮＡを、Roche Molecular System（Meylan, France）により開発された定量的ＲＴ−ＰＣＲ、Amplicon（登録商標）ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ（登録商標）により評価した。増幅段階は、単一管、単一酵素（rTth DNA polymerase）、単一プライマー対を組み合わせた逆転写及びＤＮＡポリメリゼーション（Colucci and Gutekunst, 1997）を伴なう。検出を、比色マイクロウエルプレートアッセイにより行った。ＰＣＲキャリーオーバーコンタミネーション（PCR carryover contamination）のコントロールは、汚染している増幅ＤＮＡを不活性化するためにアッセイに組み込まれたＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）を含んでいた（Longo et al., 1990）。
【０１６７】
ＨＣＶに富んだペレットを、最初にショ糖密度勾配（１０％〜６０％）における等密度遠心に付した。Ｅ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性を示すエンベロープドウイルス粒子の存在を、抗Ｅ１Ｅ２ＭＡｂＤ３２．１０（その特異性は実施例１に先に明瞭に述べられた）を使用して上記した間接ＥＩＡ法（図１４Ａ及び図１４Ｃ）及びウエスタンブロット（図１４Ｂ及び図１４Ｄ）により調べた。図１４Ａ及び図１４Ｃに示されたとおり、１．１２g/mlと１．１７g/mlとの間にピークを有しそして１．１８g/ml〜１．２３g/mlの「ショルダー」を有する、ＥＩＡにおけるＥ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性（１／１００００に希釈された画分）を、画分９（１．１２g/mlの密度）〜画分１６（１．２３g/mlの密度）から回収した。全然ないか又は非常に低いＤ３２．１０反応性（１／１０に希釈された画分）を、低密度複合体（１．００６〜１．１０g/ml）に対応する画分において検出した。同様な結果が、遺伝子型１ｂの単離ＨＣＶ−Ｌ（図１４Ａ）及び遺伝子型１ａ／２ａの単離ＨＣＶ−Ｆａｎ（図１４Ｃ）で得られた。単離ＨＣＶ−Ｌのいくらかの画分（６、８、１０、１２、１４）（図１４Ｂ）及び単離ＨＣＶ−Ｆａｎのすべての画分（４〜１８）を、ＭＡｂＤ３２．１０によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットに付した。Ｅ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性が、画分８（密度#１．１０g/ml）から勾配の底部まで明らかに現れた。注目すべきことに、最も強いＥ１Ｅ２反応性が、１．１７〜１．２０g/mlの密度に対応する画分１１、１２及び１３（図１４Ｄ）において観察された。より高い分子量（ＨＭＷ）のバンドをこれらの画分において検出することができたが、これは多分このような密度に階層区分されるウイルス粒子の表面に存在するＥ１及びＥ２エンベロープ糖タンパク質のオリゴマー形態に対応する。Ｅ１及びＥ２の両方に対する他の強い反応性は、ＥＩＡにおけるピークに対応する画分９（１．１３g/mlの密度）において観察された（図１４Ｃ）。すべての血清由来のＨＣＶ調製物は、ショ糖密度勾配（１０〜６０％）におけるＥ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性の同じ平衡階層区分プロフィル（equilibrium banding profiles）を与えた。
【０１６８】
エンベロープドＨＣＶ母集団をさらに特徴付けるために、ＨＣＶ−Ｆａｎペレットを、タイプ１の３０〜４５％ショ糖勾配（３０％２ml、３５％３ml、４０％３ml、４５％２ml）における等密度遠心に付した。これらの実験条件下に、Ｅ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性の２つのピークは、図１５Ａに示されたとおり、明白に個別化することができた。間接ＥＩＡは、約１．１５g/mlの密度の第１の狭いピーク（ピーク１）及び約１．１８g/ml〜１．２２g/mlの密度の第２の大きいピーク（ピーク２）を示した。ショ糖勾配（３０〜４５％）ピーク１（画分８）及び２（画分１２及び１３）からの粒子を個々に第２平衡遠心に付した。ピーク１を３０〜４５％のタイプ２のショ糖勾配（３０％３ml、３５％３ml、４０％２ml、４５％２ml）において遠心した（図１５Ｂ）。唯一の狭いＥ１Ｅ２抗原ピーク（ピーク１）は、１．１３〜１．１４g/ml（約３２％ショ糖、画分５及び６）の密度に移行した。ピーク２を、タイプ３の３０〜４５％ショ糖勾配（３０％２ml、３５％２ml、４０％３ml、４５％３ml）において遠心した（図１５Ｃ）。主要ピーク（ピーク２）ははるかに速く沈降し、約１．１８g/ml（４０％スクロースに対応する）の密度で最大Ｅ１Ｅ２抗原性を示した。後者のＥ１Ｅ２抗原ピーク（ピーク２）は、非対称的に現れ、より低い密度を前方に移動させ、そして１．１４g/mlのショ糖密度に階層区分されるＥ１Ｅ２母集団（ピーク１）と僅かに重なり合っており、前者のＥ１Ｅ２抗原ピーク（ピーク１）より大きい不均一性を示唆する（図１５Ｂ、１５Ｃ）。
【０１６９】
Ｅ１Ｅ２エンベロープドウイルス粒子の２つの母集団（ピーク１及び２）間の浮遊密度の差を解明するために、上記したタイプ１の３０〜４５％ショ糖勾配からの画分を、Ｏｒｔｈｏ ＨＣＶコアアッセイ（図９Ａ）及びウエスタンブロット（図１５Ｂ）によりＨＣＶコア抗原について試験した。
【０１７０】
簡単に言えば、ポリペプチド特異性を、抗原プローブ（１〜５μg/ml）としてＨＣＶサンプルを使用するイムノブロッティングにより決定した。１２．５％ゲルでのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を還元条件（２％ＳＤＳ＋５％２−ＭＥ）下に行った。ＰＶＤＦへのタンパク質移行後に、抗Ｅ１Ｅ２ＭＡｂＤ３２．１０（２〜５μg/ml）又は抗コアＭＡｂｓ７Ｇ１２Ａ８、２Ｇ９Ａ７及び１９Ｄ９Ｄ６（各々５μg/ml）を一次抗体として使用し、５０％ＮＨＳ中に希釈し、次いで、第二抗体として抗マウス免疫グロブリンのＨＲＰＯ−コンジュゲーテッドＦ（ａｂ’）２断片（１／１０，０００に希釈された、Immunotechから購入した）とのインキュベーションにより、結合したＩｇＧｓを検出した。ブロットをAmershamからの高められた化学発光（ＥＣＬ Ｐｌｕｓ）システムで顕色させた。
【０１７１】
両実験アプローチは、約１．１７〜１．１９g/ml（４０％ショ糖）の密度で第２Ｅ１Ｅ２抗原ピーク（ピーク２）において最大ＨＣＶコア抗原反応性が回収されることを示した。ウエスタンブロットにおける分析（図９Ｂ）により、２５kDaのＨＣＶコアタンパク質を、初めの材料（ＨＣＶ−Ｆａｎペレット）及び画分８〜１３において同定した。５０、７５及び１５０kDaにおけるバンドも検出され、これはＨＣＶコア遺伝子コード化産物のオリゴマーに対応することができた。ＨＣＶ ＲＮＡを、最初の１０〜６０％ショ糖勾配からのすべての画分において定量的ＲＴ−ＰＣＲ Ｍｏｎｉｔｏｒ試験（Roche）により分析した（図１０）。ウイルスＲＮＡの２つのピークは１．０５５〜１．０７５g/mlの密度及び１．１６〜１．２１g/mlの密度で生じた。後者のピークの総力価は１０6UI／mlであり、そして第２Ｅ１Ｅ２抗原ピーク（ピーク２）に対応していた。対照的に、ピーク１に対応する画分９（１．１３g/mlの密度）は、最も低い力価のＨＣＶＲＮＡを含有していた。かくして、ピーク２（約１．１７〜１．２０g/ml）は、Ｅ１Ｅ２複合体、ＨＣＶコアタンパク質、高い力価のＨＣＶ ＲＮＡを含有しており、そして完全なビリオンを示しているようである。ピーク１（１．１３〜１．１５g/ml）は、主としてＥ１Ｅ２複合体を含有しておりそしてサブウイルス粒子（ＳＶＰｓ）を示しているようである。低密度複合体（１．００６〜１．１０g/ml）は、裸のヌクレオカプシドに相当するコア及びＨＣＶ ＲＮＡのみを含有していた。
【０１７２】
かくして、本発明のＤ３２．１０モノクローナル抗体を使用して、慢性肝炎Ｃ患者の血清中に見出された最も優勢なタイプのエンベロープドウイルス粒子を分析した。濃縮したウイルス材料のショ糖勾配における沈降、定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＨＣＶ ＲＮＡの監視とカップリングしたイムノアッセイ及びイムノブロッティングによるタンパク質組成（コア及びエンベロープタンパク質）の分析により、１．１３〜１．１５g/ml及び１．１７〜１．２１g/mlの２つの異なる密度で沈降したＥ１Ｅ２エンベロープド粒子の２つの母集団をそれぞれ同定した。第１母集団は、Ｅ１及びＥ２エンベロープタンパク質を含有するがヌクレオカプシドを欠いているサブウイルス粒子（ＳＶＰｓ）に対応していた。第２母集団はＨＣＶビリオンに対応することができた。何故ならば、これらの粒子はＥ１及びＥ２エンベロープタンパク質、コアタンパク質及び高力価のＨＣＶ ＲＮＡを含有していたからである。
【０１７３】
血清由来のＨＣＶ粒子の形態学的特徴付け
Ｅ１Ｅ２（Ｄ３２．１０）特異的モノクローナル抗体による免疫沈殿後のＨＣＶ−Ｆａｎペレットの電子顕微鏡法（免疫電子顕微鏡法又はＩＥＭ）を、下記の方法に従って行った。
【０１７４】
簡単に言えば、血清由来のＨＣＶ調製物（２、２０又は２００μg）又は勾配からの画分（０．１ml）をＭＡｂＤ３２．１０の０．１ml（５μg）又は同じアイソタイプ（ＩｇＧ１）の無関係のモノクローナル抗体（Ｆ３５．２５，ＨＢＶ抗ｐｒｅＳ１）（Petit et al.,1989）と混合した。３７℃で１時間、次いで４℃で１６時間インキュベーションを行った。次いで混合物をＴＮＦ緩衝液１０ml中に希釈しそして４８，０００gで１時間遠心した。ペレットをＴＮＥ緩衝液０．１mlに懸濁させた。Ｄ３２．１０−免疫沈殿したＨＣＶ粒子を、グロー放電したＦｏｒｍｖａｒ／カーボンコーテッドキュプロングリッド（glow-discharged Formvar/ carbon-coated cupron grids）へ５分間吸収させそして１％酢酸ウラニル（pH４．５）により４分間染色した。次いでＪＥＯＬ １００ＣＸ電子顕微鏡を使用して調製物を可視化した（Imaging facility, Laennec Faculty, Lyon, France）。間接免疫金標識化のために、グリッドを、第二抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ−コロイド状金粒子（１０nm直径；BioCell Research Laboratories）の１：５０希釈物とインキュベーションした。
【０１７５】
コントロール実験は、調製物のサイズ不均一性が抗原：抗体比と共に変わることを示した（結果は示されていない）。形態学的統合性（morphological integrity）を保存するために、ＨＣＶ粒子の単離方法は沈殿及びショ糖勾配遠心のみを伴なった。このような実験条件下に、図１１Ａに示されたとおり、相対的に明確な輪郭の粒度分布が得られた。非対称ピークは約３５nmに中心を有していた。このサイズの粒子（３０〜４０nm）が優性であった（５６％）。本質的に、粒子の大部分（８０％）は３０nmより大きい直径を有し、平均値は３８．２８nm（１５６粒子の中から１２５）であり、粒子の２０％は４０〜５０nm（平均値＝４３．６１nm）でありそして４％が５０〜６０nm（平均値＝５５．６９nm）である。すべての粒子の２０％のみが３０nmよりも小さい直径を有していた（平均値＝２６．３５nm）。電子顕微鏡（図１１Ｂ）は、ＨＣＶ粒子が相対的に規則的な滑らかな表面により特徴付けられることを示した。図１１Ｂ、パネルａ及びｂは、ＨＣＶエンベロープド粒子のサイズの不均一性を示す。図１１Ｂ、パネルｃは５０nmの直径を有する粒子を示し、そしてパネルｄは３５nmの直径を有する粒子を示す。極めて均一なより高い密度が３５nmの粒子の表面に現れたが（図１１Ｂ、パネルｄ）、これに対してより低い密度のより軽い区域を５０nmの直径を有する粒子の中心に明白に観察することができた（図１１Ｂ、パネルｃ）。無関係な一次モノクローナル抗体を使用する場合は粒子はＩＥＭにより可視化されなかった（図１１Ｂ、パネルｅ）。ショ糖勾配ピーク１及び２からの粒子を、免疫沈殿させ、染色しそしてＩＥＭによっても分析した（図１２Ａ〜１２Ｂ）。図１２Ａに示されたとおり、ピーク１の優勢な種（８５．４％）は、約２０nm（４１粒子の中から３５、平均値＝２０．６nm）の直径を有する球状粒子であった。粒子の１４．６％のみが３０nmより大きい直径を有していたが、これは多分ピーク２との重なりに対応する。ピーク２は、ピーク１の材料よりもサイズが幾分より不均一に見えた（図１２Ｂ）。しかしながら、この母集団中の最も主要な形態（７７．５％）は、約４１nm（８９粒子の中から６９、平均値＝４１．１５nm）の平均直径を有しており、これは全ＨＣＶビリオン（whole HCV virion）の直径に対応することができる。少数のより小さい３０nm直径の粒子（１３．５％）をこの調製物において見ることができたが、これは多分ピーク１との重なりから生じたものである。不均一な主要なより速く沈降するピーク（ピーク２）は、主として３５及び５０nmの直径の大きな粒子からなり、これに対して均一な少量のより遅く沈降するピーク（ピーク１）は、約２０nmの直径の小さな粒子からなっていた。ひっくるめると、形態学的研究は、２つのサイズクラスのＥ１Ｅ２エンベロープドＨＣＶ粒子が感染患者の血清中に共存することを示す。間接免疫金標識化（図１３）によれば、先にＩＥＭにより同定されたすべての球状エンベロープド粒子は、１０nm金標識された二次抗体を特異的に固定した。
【０１７６】
かくして、ＭＡｂＤ３２．１０による免疫電子顕微鏡法により、トータルエンベロープド母集団（total enveloped population）（ＨＣＶに富んだペレット）及び各Ｅ１Ｅ２母集団の相対的に明確な輪郭の粒度分布を別々に決定した。エンベロープドＨＣＶ粒子は、サイズが不均一であるが、２つの異なるサイズクラスの粒子を容易に同定することができた。主要な種は、多分エンベロープの格子構造に依存して、３５nmから５０nmまで変わる直径を有する大きな粒子からなっていたが、これは完全なカプシド含有エンベロープド粒子に対応する。他のより均一な種は、カプシドのないＳＶＰｓに対応する、約２０nmの直径を有する小さな粒子からなっていた。ＭＡｂＤ３２．１０に結合したすべてのこれらの粒子をさらに同定しそして抗マウスＩｇＧ−金粒子による間接標識化を使用して電子顕微鏡法により可視化した。
【０１７７】
感染性ビリオンに加えて、非感染性ＳＶＰｓの形成は、フラビウイルス感染の共通の特徴である（Russel et al., 1990）。これらはカプシドのない空のウイルスエンベロープを表すことが示唆された（Mason et al., 1991）。それは肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）で感染した細胞においても起こり、そして分泌されたＳＶＰｓはエンベロープタンパク質のみの発現により産生される（Laub et al., 1983）。これらの粒子は、ビリオンより小さい。これは、これらのタンパク質が、コアの存在下又は不存在下に特異的粒状構造を固有に自己形成することができることを証明する。これらの粒子はアセンブルされ、そしてグリコシル化及び炭水化物プロセッシングを含む、全ビリオン（whole virions）と同じ成熟プロセスを受ける。このような組換えエンベロープＳＶＰｓによる免疫化は、動物モデル（Konishi et al., 1992; Heinz et al., 1995）及びヒト（Leroux-Roels et al., 1994）においてそれらが優れた予防性免疫原であることを示す。
【０１７８】
完全なビリオン（complete virions）及びＳＶＰｓのＭＡｂＤ３２．１０との反応性は、Ｅ１（２９７〜３０６）−Ｅ２（４８０〜４９４）（６１３〜６２１）立体配座エピトープが、ＨＣＶビリオン及びＳＶＰｓの表面に本質的に同じ方法で提示されることを示す。しかしながら、血清由来のビリオン及びＳＶＰｓ上に検出されたこのようなエピトープは、遺伝子組換えにより得られたそして異種システム：バキュロウイルス／昆虫細胞（Baumert et al., 1999）又はレトロウイルス／２９３Ｔ細胞（Bartosch et al., 2003）において産生された粒子上には欠けており、これは、この複合部位が、これらの組換えＨＣＶ粒子の表面に存在しないか及び／又はこれらの組換えＨＣＶ粒子の表面の離れた近づきがたい領域（inaccessible regions）に存在することを示唆する。前者のＨＣＶ様粒子（ＨＣＶ−ＬＰｓ）はＥＲに保持されそして後者のＨＣＶ擬粒子（ＨＣＶｐｐ）の小さな画分（small fraction）のみが細胞表面に達した。ＭＡｂＤ３２．１０はＨＳＡ又は免疫グロブリンのγ鎖若しくはμ鎖と反応性ではないことは注目する価値がある。それは、Ｅ１、Ｅ２の２つのタンパク質がＨｅｐＧ２細胞でワクシニアウイルス組換え体により別々に又は一緒に発現される場合には、Ｅ１、Ｅ２及びＥ１Ｅ２ヘテロ二量体を特異的に免疫沈殿させることができる。かくして、それは、大抵ジスルフィド結合で連結された集合体と反応しそしてＥ１Ｅ２非共有結合連結された成熟複合体とはより弱く反応する。しかしながら、それは、このような異種システムで発現された変性された組換えＥ１又はＥ２タンパク質をブロッティング分析により認識しない。これは、血清由来のウイルス表面におけるＥ１、Ｅ２及びＥ１Ｅ２のアレンジメント（arrangement）が組換えＨＣＶ粒子において見いだされるものとは異なるというのに味方する。天然の構造は、アセンブリー条件に依存する。独特な構造の形成を調節する条件が異種システムに存在していないならば、ＶＬＰｓ及びＨＣＶｐｐにおける二量体アレンジメントは類似しておらず、ＳＶＰｓ及びビリオンが感染患者の血清から単離される場合の、ＳＶＰｓ及びビリオン表面の類似性とは対照的である。組換えサブウイルス粒子（ＲＳＰｓ）及びビリオンにおいて、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）を含むフラビウイルスのエンベロープタンパク質（Ｅ）のパッキングの１つの特に注目に値する特徴は、それらがヘッドツーテイル方位（head-to-tail orientation）においてウイルス表面に平坦な状態にあるということである（Ferlengi et al., 2001）。Ｉｇ様フォールド（Ig-like fold）を有しそして受容体結合に関係している、ドメインＩＩＩの外側表面（lateral surface）は近接可能である（accessible）が、融合ペプチドはインターナルループである（Rey et al., 1995）。それゆえ、フラビウイルスは受容体媒介エンドサイトーシス及びエンドソームにおける低pHで誘発される融合により細胞に入る（Rice, 1996）。アセンブルしている粒子は、ＥＲの膜又は早期分泌経路の中間区画を経る出芽（budding）によりそのエンベロープを取得すると考えられる。次いで粒子はトランスゴルジ網（ＴＧＮ）を通して形質膜に輸送され、成熟し、そうして複合糖を取得する。すべてのこれらの段階はウイルスアセンブリーに極めて重要でありそして複製サイクルの多くの相において重要な役割を果たす。
【０１７９】
意外にも、すべてのＨＣＶ粒子は、それらの起源が何であれ、同様な生物物理的性質を示すようである。昆虫細胞でアセンブルされ、株ＨＣＶ−ＪｃＤＮＡから誘導された又は感染性クローンＨ７７ｃから誘導された、ＨＣＶ−ＬＰｓのショ糖勾配沈降パターンは、ショ糖平衡勾配において１．１４〜１．２０g/mlであった（Wellnitz et al., 2002）。粒子の大部分は４０〜６０nmの直径を有していた。しかしながら、ＨＣＶ−ＬＰｓの外側表面のＥ１及びＥ２エクトドメイン（ectodomains）に提示されたすべてのエピトープ（Wellnitz et al., 2002）は、ＭＡｂＤ３２．１０のＥ１及びＥ２特異性とは異なる。それゆえ、たとえ粒子がショ糖において同じ密度で沈降するとしても、それらは異なる免疫反応性を有し、これは不適切な輸送及び／又はフォールディングと関連していることがあり、そして明らかに、細胞結合及び感染性に関して、異なる機能的性質をもたらすであろう。
【０１８０】
血清エンベロープドＨＣＶ粒子とは反対に、ＨＣＶに感染した個体の血漿から単離したＨＣＶコア粒子は昆虫細胞において産生されたヌクレオカプシド様粒子と類似していると思われる．ＨＣＶヌクレオカプシドは、ＣｓＣｌ勾配において１．３２〜１．３４g/mlの密度に階層区分されそして直径が３８〜６２mmで、サイズが極めて不均一であった（Maillard et al., 2001）。すべてのこれらの粒子は、抗コアＭＡｂｓと反応性であるが、組換えタンパク質による免疫化により産生された抗Ｅ１及び抗Ｅ２ＭＡｂｓと反応性ではない（Deleersnyder et al., 1997; Dubuisson et al., 1994）。
【０１８１】
それゆえ、種々のタイプのＨＣＶ関連粒子（ＨＣＶ−ＬＰｓ、血清ＨＣＶヌクレオカプシド、血清ＨＣＶビリオン）は、サイズ及び／又は密度においていくらかの類似性を有するが、異なる抗原的性質（Ｅ１Ｅ２複合体の不適切な又は適切なフォールディング、エンベロープドビリオン又は非エンベロープドヌクレオカプシド）を示す。それゆえ、要するに、これは、ＨＣＶ粒子の真の抗原的性質を分析するため、そして、天然のＨＣＶビリオンを同定するための良好な免疫学的ツールを有することが決定的に重要であることを証明している。
【０１８２】
これらのデータ及び他のデータを考慮に入れて（Andre et al., Maillard et al., 2001）、慢性肝炎Ｃ患者の血清中で循環している種々の形態のＨＣＶ関連粒子の完全なスペクトルのより良好な知識を得ることができた。ショ糖勾配における低密度画分（１．０６g/ml）は、カプシド様構造であって、リポタンパク質と会合して脂質−ウイルス粒子（lipo-viro-particles）（ＬＶＰ）を形成しそして個々の変動に依存してＨＣＶ ＲＮＡ及び免疫グロブリンと会合した（Andre et al., 2002）カプシド様構造を含有していた。ＬＶＰは、直径が１００nmより多くの大きい粒子として現われ、そしてＬＤＬ受容体（Andre et al., 2002）を介して肝細胞系に結合した。洗剤で処理した血清から単離された非エンベロープドＨＣＶヌクレオカプシドは、ＣｓＣｌにおける１．３２〜１．３４g/mlの浮遊密度を有しており、サイズが不均一であり（Meillard et al., 2001）そして最近ＦγＲ様活性を有することが示され（(Meillard et al., 2004)、これはショ糖勾配における高密度（１．２８〜１．３５g/ml）のＨＣＶコア−ＩｇＧ複合体として、ＨＣＶ ＲＮＡ含有粒子の「非免疫」抗体（"non-immune" antibodies）との会合を説明することができた。１．１３〜１．２１g/mlの中間密度の画分は、ここではＥ１Ｅ２エンベロープドＨＣＶ粒子として同定された。ヌクレオカプシド、脂質膜及び２つのＥ１及びＥ２エンベロープ糖タンパク質からなる推定上の全ＨＣＶビリオン（entire HCV virion）の平均密度（１．１８〜１．２０g/ml）は、フラビウイルスの密度に類似している（Bradley et al., 1991）。ＭＡｂＤ３２．１０の精密な特異性から推定された外側エンベロープタンパク質相互作用の仮定も、ＴＢＥＶ及び全ウイルス粒子からの組換えＳＶＰｓのエンベロープの組織化に類似している（Schalich et al., 1996）。最後に、異なる沈降性質（１．１３〜１．１５g/ml）及び異なる粒度（≒２０nm）を示すが全ウイルス粒子と同様な抗原特性を示す、Ｅ１Ｅ２エンベロープタンパク質のみを含有するＳＶＰｓがＨＣＶ感染患者の血清中に存在することは、ＨＣＶとフラビウイルスとのいくらかの類似性を支持する。
【０１８３】
要するに、新規なＭＡｂＤ３２．１０を使用することにより、初めて下記のものが同定された：
（ｉ）ＨＣＶ ＲＮＡ及びコア抗原の両方を含有し、そして３５〜５０nmの直径を有しそして１．１７〜１．２１g/mlに階層区分される「大きな粒子」としてＥ１Ｅ２エンベロープ複合体をその表面に発現する、ＨＣＶ完全ビリオン；
（ii）２０〜３０nmの直径を有しそして１．１３〜１．１５g/mlに階層区分される、カプシド及びＨＣＶ ＲＮＡを欠いている「小さな粒子」としてのエンベロープＳＶＰｓのＨＣＶ母集団。
【０１８４】
ゆえに、このようなエンベロープド粒子は、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質構造−機能関係を調べるための適切なモデル及び予防接種法のための優れた候補を表す。更に、異なるグループの患者において及びＨＣＶ関連疾患の種々の段階で循環しているＨＣＶ粒子のスペクトルを追跡することは興味深いであろう。
【０１８５】
実施例３
精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子に対するモノクローナル抗体の取得
精製したＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子を含有するショ糖密度勾配における糖密度遠心に付した上記したＨＣＶに富んだペレットの画分を使用して、モノクローナル抗体を調製した。この画分を使用して、マウスを免疫化しそして上記したようにハイブリドーマを単離した。かくして、１つのモノクローナル抗体、（Ｄ４．１２．９）を得、これはウエスタンブロット実験において天然のＨＣＶ Ｅ２タンパク質を特異的に認識し（図６）及び実施例２で証明された天然のＨＣＶウイルス粒子を特異的に認識すること（図７）が示された。実際に、図７は、Ｄ４．１２．９が、Ｄ３２．１０と同様に、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子（画分８〜１１）及びＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子（画分１１〜１４）の両方を認識することを示す。
【０１８６】
実施例４
感染患者由来の抗ＨＣＶ抗体のエピトープ特徴付け
ＨＣＶ感染患者の血清に対するＤ３２．１０（実施例１）と反応性のＥ１及びＥ２由来のペプチド配列の免疫反応性を、それらを包含するペプチドを使用することにより評価した。
【０１８７】
Ｅ１（アミノ酸２９０〜３１７）及びＥ２（アミノ酸４７１〜５００及び６０５〜６２９）配列を、健康な個体からの１１の血清及びＨＣＶ感染患者からの４４の血清（Ａ１〜Ａ４４という番号を付けられた）によってＥＬＩＳＡにより試験されるべきビオチニル化合成ペプチドとして産生させた。
【０１８８】
マイクロタイトレーションプレートのウエルを、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（pH９．６）中の１０μg/mlの濃度のストレプトアビジン１００μlで４℃で一夜コーティングし、そして１０％ヤギ血清を含有するＰＢＳで３７℃で１時間ブロックした。次いで、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した後、ビオチニル化ペプチド溶液（ＰＢＳ中の１０μg/ml）１００μlを３７℃で２時間加えた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで新たな洗浄の後、１０％ヤギ血清を含有するＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に１：５０に希釈された試験された血清１００μlを加えそして３７℃で２時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで再び洗浄した。次いで、二次抗体、ペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッドヤギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson Immune Research laboratories）をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−ヤギ血清中に１：５０００希釈率で加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベーションし、次いでＰＢＳ−ｔｗｅｅｎでもう１回洗浄した。プレートを、ｏ−フェニレンジアミン及び過酸化水素を含有するBiomeriux カラーキットを使用して顕色した。１０分のインキュベーションの後、プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９２nmで読み取った。報告された値は３回反復の平均ＯＤである。
【０１８９】
カットオフ認識を、各ペプチドについて計算した（ＨＣＶネガティブ血清＋３標準偏差で得られた値の平均）。それは、Ｅ１（アミノ酸２９０〜３１７）に対して４４のＨＣＶ−ポジティブ血清の中からの６つ（図８Ａ）、Ｅ２（アミノ酸４７１〜５００）に対する４４の中からの６つ（図８Ｂ）及びＥ２（アミノ酸６０５〜６２９）に対する４４の中からの１６（図８ｃ）とのポジティブ反応を証明することを可能とした。血清Ａ７、Ａ１４、Ａ２１、Ａ３３、Ａ３９及びＡ４０は、３つのペプチドとのポジティブシグナルを与え、これに対して、Ｅ２（６０５〜６２９）も１０のより多くの血清により認識された。
【０１９０】
ＨＣＶ感染患者の血清中に、Ｄ３２．１０ｍＡｂにより認識されたＥ１及びＥ２の３つの領域と同時に反応することができる特異的抗体が存在することは、循環しているエンベロープドＨＣＶウイルス粒子の表面におけるそれらの並置（juxtaposition）及びマウス及びヒトにおけるそれらの免疫原性を強く支持する。
【０１９１】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１Ａ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物（antibody precipitated lysates）のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を表す。レーン１、２、３、４、５、６及び７は、それぞれ、抗体Ｃ９．１９．１６、Ｃ２．２２．１、Ｄ３２．１０、Ｄ３．２０．１２、Ｃ７、２４．１９、Ｃ７．１４．４１及びＣ１．９．３に対応する。ＭＷは、分子量マーカーに対応する。分子量マーカーに対応するバンドのサイズは、ゲルの右に表される。可能ならば、バンドは、Ｅ１、Ｅ２又はＡｇｇ（集合体の場合）としてゲルの左に確認される。 図１Ａは、還元条件における、35Ｓ標識されたコントロール細胞の抗体で沈殿させた溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す。
【図１Ｂ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物（antibody precipitated lysates）のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を表す。レーン１、２、３、４、５、６及び７は、それぞれ、抗体Ｃ９．１９．１６、Ｃ２．２２．１、Ｄ３２．１０、Ｄ３．２０．１２、Ｃ７、２４．１９、Ｃ７．１４．４１及びＣ１．９．３に対応する。ＭＷは、分子量マーカーに対応する。分子量マーカーに対応するバンドのサイズは、ゲルの右に表される。可能ならば、バンドは、Ｅ１、Ｅ２又はＡｇｇ（集合体の場合）としてゲルの左に確認される。 図１Ｂは、還元条件における、ＨＣＶ Ｅ１タンパク質を発現する35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す。
【図１Ｃ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物（antibody precipitated lysates）のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を表す。レーン１、２、３、４、５、６及び７は、それぞれ、抗体Ｃ９．１９．１６、Ｃ２．２２．１、Ｄ３２．１０、Ｄ３．２０．１２、Ｃ７、２４．１９、Ｃ７．１４．４１及びＣ１．９．３に対応する。ＭＷは、分子量マーカーに対応する。分子量マーカーに対応するバンドのサイズは、ゲルの右に表される。可能ならば、バンドは、Ｅ１、Ｅ２又はＡｇｇ（集合体の場合）としてゲルの左に確認される。 図１Ｃは、還元条件における、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質を発現する35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す。
【図１Ｄ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物（antibody precipitated lysates）のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を表す。レーン１、２、３、４、５、６及び７は、それぞれ、抗体Ｃ９．１９．１６、Ｃ２．２２．１、Ｄ３２．１０、Ｄ３．２０．１２、Ｃ７、２４．１９、Ｃ７．１４．４１及びＣ１．９．３に対応する。ＭＷは、分子量マーカーに対応する。分子量マーカーに対応するバンドのサイズは、ゲルの右に表される。可能ならば、バンドは、Ｅ１、Ｅ２又はＡｇｇ（集合体の場合）としてゲルの左に確認される。 図１Ｄは、還元条件における、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２タンパク質を発現する35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す。
【図１Ｅ】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び１Ｅは、35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物（antibody precipitated lysates）のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を表す。レーン１、２、３、４、５、６及び７は、それぞれ、抗体Ｃ９．１９．１６、Ｃ２．２２．１、Ｄ３２．１０、Ｄ３．２０．１２、Ｃ７、２４．１９、Ｃ７．１４．４１及びＣ１．９．３に対応する。ＭＷは、分子量マーカーに対応する。分子量マーカーに対応するバンドのサイズは、ゲルの右に表される。可能ならば、バンドは、Ｅ１、Ｅ２又はＡｇｇ（集合体の場合）としてゲルの左に確認される。 図１Ｅは、非還元条件における、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２タンパク質を発現する35Ｓ標識された細胞の抗体で沈殿させた溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す。
【図２】図２は、非還元条件及び還元条件下にＤ３２．１０モノクローナル抗体を使用するＨＣＶウイルス粒子のウエスタンブロットを表す。左から右へ、Ｍは非還元条件下に分子量マーカーを表し、そのバンドのサイズは、ゲルの左に示され（kDaにおいて）、レーン１は非還元条件下にＤ３２．１０モノクローナル抗体を使用するＨＣＶウイルス粒子のウエスタンブロットを表し、第２レーンＭは還元条件下の分子量マーカーを表し、レーン２は、還元条件下にＤ３２．１０モノクローナル抗体を使用するＨＣＶウイルス粒子２．５μgのウエスタンブロットを表し、レーン３は、還元条件下にＤ３２．１０モノクローナル抗体を使用するＨＣＶウイルス粒子５μgのウエスタンブロットを表す。ゲルの右に、レーン３のいくつかのバンドのサイズが示され（kDaで）、いくらかはＨＣＶタンパク質Ｅ２（６０及び６８）又はＨＣＶタンパク質Ｅ１（３４及び３１）に対応する。
【図３Ａ】図３Ａ及び図３Ｂは、グリコシダーゼＡによる脱グリコシル化（図３Ａ）及びエンドグリコシダーゼＨによる脱グリコシル化（図３Ｂ）に付されたＨＣＶウイルス粒子のウエスタンブロットを表す。 図３Ａにおいて、レーンＭは分子量マーカーを表し、そのバンドの３つのサイズは、ゲルの左に示され（kDaで）；レーン１、２、３及び４はそれぞれ、２０、１０、５及び０mU／mlのグリコシダーゼ濃度を表す。ゲルの右に、ＨＣＶタンパク質Ｅ２及びＥ１の位置が示され、そしてタンパク質Ｅ１の主要な脱グリコシル化形態の位置（Ｅ１＊）及びＥ１又はＥ２の脱グリコシル化形態に対応するいつかのバンドのサイズ（kDaで）、並びにＥ２の主要な脱グリコシル化形態（４１＊）が示される。
【図３Ｂ】図３Ａ及び図３Ｂは、グリコシダーゼＡによる脱グリコシル化（図３Ａ）及びエンドグリコシダーゼＨによる脱グリコシル化（図３Ｂ）に付されたＨＣＶウイルス粒子のウエスタンブロットを表す。 図３Ｂにおいて、レーンＭは分子量マーカーを表し、そのバンドの４つのサイズがゲルの左に示され（kDaで）；レーン１及び２は、それぞれ、エンドグリコシダーゼＨなしに行われたコントロール脱グリコシル化実験及びエンドグリコシダーゼＨの存在下に行われる脱グリコシル化実験を表す。ゲルの右には、Ｅ２及びＥ１の完全グリコシル化形態及びＥ２の脱グリコシル化形態（５０、４８、４６及び４２kDa）及びＥ１の脱グリコシル化形態（２８及び２４kDa）に対応する主要バンドが示される。Ｅ２の主要な脱グリコシル化形態（５０＊）及びＥ１の主要な脱グリコシル化形態（２８＊）は星によりマークを付けられている。
【図４】図４は、ＨＣＶウイルス粒子調製物のショ糖密度勾配での遠心により得られた画分の特徴付けを示す。３つのパラメーター、ＨＣＶ ＲＮＡ含有率、ＨＣＶコアタンパク質含有率及びＤ３２．１０モノクローナル抗体に対する反応性、を測定した。水平軸は特徴付けに付された画分の数を表す。左垂直軸はＨＣＶ ＲＮＡ濃度（×１０5UI／ml）及び間接ＥＩＡ（４５０nmでのＯＤ）により測定されたＤ３２．１０に対する反応性の目安を表す。右垂直軸はＨＣＶコアタンパク質濃度（pg／mlでの）を表す。黒点に対応する曲線はＤ３２．１０に対する画分の反応性を表し、白三角形に対応する曲線はコアタンパク質の画分含有率を表し、そしてドット付きバーはＨＣＶ ＲＮＡの画分含有率を表す。
【図５Ａ】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、それぞれ、ＨＣＶウイルス粒子調製物、ＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子調製物及びＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子調製物の透過型電子顕微鏡写真を表す。 図５Ａでは、水平バーは長さ２００nmのスケールを表す。より大きい円形要素はＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子を表しそしてより小さい円形要素はＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を表す。
【図５Ｂ】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、それぞれ、ＨＣＶウイルス粒子調製物、ＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子調製物及びＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子調製物の透過型電子顕微鏡写真を表す。 図５Ｂでは、水平バーは長さ５０nmのスケールを表す。円形要素はＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子を表す。
【図５Ｃ】図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、それぞれ、ＨＣＶウイルス粒子調製物、ＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子調製物及びＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子調製物の透過型電子顕微鏡写真を表す。 図５Ｃでは、水平バーは長さ５０nmのスケールを表す。円形要素はＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子を表す。
【図６】図６はＤ４．１２．９モノクローナル抗体を使用するＨＣＶウイルス粒子のウエスタンブロットを表す。レーンＭは分子量マーカーを表し、そのバンドの４つのサイズ（７５、５０、３７、２５）はゲルの左側及び右側に示される（kDaで）。レーン１及び２は、それぞれ、グリコシダーゼＡ及びエンドグリコシダーゼＨによるＨＣＶウイルス粒子の消化の結果を表し、レーン３及び４はプロテアーゼトリプシン及びＶ８によるＨＣＶウイルス粒子のタンパク分解消化の結果を表し、レーン５はＮＰ−４０による細胞溶解（lysis）の結果を表し、そしてレーン６では前処理は行われなかった。ゲルの右側には、消化されなかったＥ２タンパク質（６８及び４８）の２つの主要な形態が示され（kDaで）そしてゲルの左側にはＥ２の主要な脱グリコシル化形態（Ｅ２＊）が示される。
【図７】図７は、ＨＣＶウイルス粒子調製物のショ糖密度勾配での遠心により得られた画分のＤ４．１２．９に基づく特徴付けを表す。Ｄ４．１２．９に対する画分反応性に加えて、コアタンパク質の画分含有率も測定した。水平軸は、特徴付けに付された画分の数を表す。右垂直軸はＥＩＡ（４５０nmでのＯＤ）により測定されたＤ４．１２．９に対する反応性の目安を表す。左垂直軸は、ＨＣＶコアタンパク質濃度（pg／mlで）を表す。黒四角形に対応する曲線はＤ４．１２．９に対する画分の反応性を表し、黒菱形に対応する曲線はコアタンパク質の画分含有率を表す。
【図８Ａ】図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、健康な個体（水平軸上にＴ１〜Ｔ１１の番号を付けられている１１の血清）及びＨＣＶ感染患者（水平軸上でＡ１〜Ａ４４の番号を付けられている４４の血清）の５５の血清に対するそれぞれアミノ酸２９０〜３１７（図８Ａ）、アミノ酸４７１〜５００（図８Ｂ）及びアミノ酸６０５〜６２９（図８Ｃ）を含む３つのビオチニル化ペプチドの免疫反応性を表す。垂直軸は、ＥＬＩＳＡ（４９２nmにおけるＯＤ×１０００）により測定された３つのペプチドに対する血清の反応性を表す。白のバーは健康な個体の血清の反応性を表しそしてグレーのバーは感染患者の血清の反応性を表す。水平線は、カットオフ値を表し、それより上の血清応答はポジティブと考えられる。図８Ａでは、カットオフ値は０．６９１であり、図８Ｂでは０．５７２でありそして図８Ｃでは０．３２１である。
【図８Ｂ】図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、健康な個体（水平軸上にＴ１〜Ｔ１１の番号を付けられている１１の血清）及びＨＣＶ感染患者（水平軸上でＡ１〜Ａ４４の番号を付けられている４４の血清）の５５の血清に対するそれぞれアミノ酸２９０〜３１７（図８Ａ）、アミノ酸４７１〜５００（図８Ｂ）及びアミノ酸６０５〜６２９（図８Ｃ）を含む３つのビオチニル化ペプチドの免疫反応性を表す。垂直軸は、ＥＬＩＳＡ（４９２nmにおけるＯＤ×１０００）により測定された３つのペプチドに対する血清の反応性を表す。白のバーは健康な個体の血清の反応性を表しそしてグレーのバーは感染患者の血清の反応性を表す。水平線は、カットオフ値を表し、それより上の血清応答はポジティブと考えられる。図８Ｂでは、カットオフ値は０．５７２である。
【図８Ｃ】図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、健康な個体（水平軸上にＴ１〜Ｔ１１の番号を付けられている１１の血清）及びＨＣＶ感染患者（水平軸上でＡ１〜Ａ４４の番号を付けられている４４の血清）の５５の血清に対するそれぞれアミノ酸２９０〜３１７（図８Ａ）、アミノ酸４７１〜５００（図８Ｂ）及びアミノ酸６０５〜６２９（図８Ｃ）を含む３つのビオチニル化ペプチドの免疫反応性を表す。垂直軸は、ＥＬＩＳＡ（４９２nmにおけるＯＤ×１０００）により測定された３つのペプチドに対する血清の反応性を表す。白のバーは健康な個体の血清の反応性を表しそしてグレーのバーは感染患者の血清の反応性を表す。水平線は、カットオフ値を表し、それより上の血清応答はポジティブと考えられる。図８Ｃでは０．３２１である。
【図９Ａ】ＨＣＶコアタンパク質は、Ortho Clinical DiagnosticsからのトータルＨＣＶコア抗原アッセイ（図９Ａ）により定量されそしてＨＣＶ−Ｆａｎペレット及び上記したタイプ１の３０〜４５％ショ糖勾配からの画分におけるウエスタンブロット（図９Ｂ）により分析された。（図９Ａ）すべての画分を１：２の希釈率で試験した。ＨＣＶ−Ｆａｎペレットは、希釈率１：２５、１：５０及び１：１００で試験し、そして３３２pg／mlを含有することが見出された。すべての希釈はＴＮＥ緩衝液で行った。カットオフ値は１．４pg／mlであった。
【図９Ｂ】ＨＣＶコアタンパク質は、Ortho Clinical DiagnosticsからのトータルＨＣＶコア抗原アッセイ（図９Ａ）により定量されそしてＨＣＶ−Ｆａｎペレット及び上記したタイプ１の３０〜４５％ショ糖勾配からの画分におけるウエスタンブロット（図９Ｂ）により分析された。（図９Ｂ）ＨＣＶ−Ｆａｎペレット及び３０％〜４５％ショ糖勾配からの画分４、８、１２及び１３をＳＤＳ−１２．５％ＰＡＧＥに付した。ＨＣＶコアタンパク質を、モノクローナル抗体抗コア７Ｇ１２Ａ８、２Ｇ９Ａ７及び１９Ｄ９Ｄ６（各々について５μg/ml）の混合物を使用して検出した。AmershamからのＥＣＬ Ｐｌｕｓシステムを使用してブロットを顕色した。左の数は、キロダルトン（kDa）でのマーカー（Ｍ）の分子量を示し、そしてＨＣＶコアタンパク質は右に示された。
【図１０】最初の１０〜６０％ショ糖勾配からのすべての画分における定量的RT-PCR Amplicor HCV Monitor試験バージョン２．０（Roche Diagnostics）によりＨＣＶ ＲＮＡを分析した。製造者の取扱説明書に従って試験を行った。各ロットに対して特異的なＱＳ国際単位（ＩＵ）／ＰＣＲを使用することにより結果を計算し、そしてＩＵ ＨＣＶＲＮＡ／mlで表した。
【図１１Ａ】電子顕微鏡法（ＥＭ）による血清由来のＨＣＶエンベロープド粒子の分析。ＭＡｂＤ３２．１０（５μg）（パネルａ、ｂ、ｃ及びｄ）又は無関係のＭＡｂ（パネルｅ）を使用すことによりＨＣＶ−Ｆａｎペレット（２μg）を免疫沈殿させ、そして超遠心によるペレット化後の免疫複合体をグリッドに吸着させそして１％酢酸ウラニル（pH４．５）で染色した。調製物をＪＥＯＬ １００ＣＸ電子顕微鏡を使用して可視化した。（図１１Ａ）粒子は幾分直径（nmで表された）が変わり、そして１５６ウイルス粒子（ＶＰｓ）に関してヒストグラムを作成した。粒度分布は３５nmに中心のあるピークを示す。
【図１１Ｂ】電子顕微鏡法（ＥＭ）による血清由来のＨＣＶエンベロープド粒子の分析。ＭＡｂＤ３２．１０（５μg）（パネルａ、ｂ、ｃ及びｄ）又は無関係のＭＡｂ（パネルｅ）を使用すことによりＨＣＶ−Ｆａｎペレット（２μg）を免疫沈殿させ、そして超遠心によるペレット化後の免疫複合体をグリッドに吸着させそして１％酢酸ウラニル（pH４．５）で染色した。調製物をＪＥＯＬ １００ＣＸ電子顕微鏡を使用して可視化した。（図１１Ｂ）電子顕微鏡写真。パネルａ、ｂ、ｃ及びｄのバーは５０nmを示す。
【図１２Ａ】Ｄ３２．１０による免疫沈殿、グリッドへの吸着及び染色後のショ糖勾配ピーク１（図１２Ａ）及び２（図１２Ｂ）からのＨＣＶ−Ｆａｎ粒子の電子顕微鏡法による分析。（図１２Ａ）４１のウイルス粒子についてヒストグラムを作成した。ピーク１における主要な種（８５．４％）は約２０nmの直径を有する球状粒子、いわゆる＜＜小さな粒子＞＞であった。
【図１２Ｂ】Ｄ３２．１０による免疫沈殿、グリッドへの吸着及び染色後のショ糖勾配ピーク１（図１２Ａ）及び２（図１２Ｂ）からのＨＣＶ−Ｆａｎ粒子の電子顕微鏡法による分析。（図１２Ｂ）８９のウイルス粒子についてヒストグラムを作成した。ピーク２における最も優勢な形態（７７．５％）は、約４１nmの平均直径を有していた。ピーク２は、サイズが幾分より不均一であるようであり、そして主として３５及び５０nm直径粒子、いわゆる＜＜大きな粒子＞＞からなっていた。バー、５０nm。
【図１３】エンベロープドＨＣＶ粒子の間接免疫金標識化（indirect immuno-gold labeling）。Ｄ３２．１０−免疫複合体（ＨＣＶペレット、２０μg；ＭＡｂＤ３２．１０，５μg）でコーティングされた顕微鏡グリッドを、第２抗体としてのヤギ抗マウスＩｇＧ−コンジュゲーテッドコロイド金粒子（１０nm）の１：５０希釈物とインキュベーションした。ＩｇＧの立体障害（ＥＭにおいて約１５nm）にしたがって、少数の金粒子のみが、抗体結合を確認することができた。金粒子はウイルス粒子の外側には観察されなかった。すべてのパネルのバーは２０nmを示す。
【図１４Ａ】図１４Ａ及び図１４Ｂは、遺伝子型１ｂの単離ＨＣＶ−ＬからのＨＣＶに富んだペレットのショ糖密度勾配（１０％〜６０％）における等密度遠心（isopycnic centrifugation）の結果を表す。 図１４Ａは、遠心後に得られた画分（水平軸）の密度（左水平軸、g/ml）及びＥ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性（右垂直軸、Ａ490nm）を表す。 ＥＩＡでは、各画分を１／１００００に希釈し（図４Ａ及び４Ｃ）そしてウエスタンブロットでは、選ばれた画分５μl／レーンを使用した（図４Ｂ及び４Ｄ）。画分の密度は屈折率測定法により測定されそしてg/mlで表される。吸光度（Ａ）は４９０nmで側定された。ＥＩＡの結果は、ネガティブコントロール（少なくとも３つの値）の平均の掛ける２．１に相当するカットオフより上になる場合にはポジティブと考えられた。AmershamからのＥＣＬ Ｐｌｕｓシステムを使用してブロットを顕色した。
【図１４Ｂ】図１Ａ及び図１４Ｂは、遺伝子型１ｂの単離ＨＣＶ−ＬからのＨＣＶに富んだペレットのショ糖密度勾配（１０％〜６０％）における等密度遠心（isopycnic centrifugation）の結果を表す。 図１４Ｂは、抗Ｅ１Ｅ２ＭＡｂＤ３２．１０を使用する、画分６、８、１０，１２及び１４のウエスタンブロットを表す。左の数は、キロダルトン（kDa）におけるマーカー（Ｍ）の分子量を示し、そしてＨＣＶＥ１及びＥ２タンパク質は右に示された。 ＥＩＡでは、各画分を１／１００００に希釈し（図４Ａ及び４Ｃ）そしてウエスタンブロットでは、選ばれた画分５μl／レーンを使用した（図４Ｂ及び４Ｄ）。画分の密度は屈折率測定法により測定されそしてg/mlで表される。吸光度（Ａ）は４９０nmで側定された。ＥＩＡの結果は、ネガティブコントロール（少なくとも３つの値）の平均×２．１に相当するカットオフより上になる場合にはポジティブと考えられた。AmershamからのＥＣＬ Ｐｌｕｓシステムを使用してブロットを顕色した。
【図１４Ｃ】図１４Ｃ及び図１４Ｄは、遺伝子型１ａ／２ａの単離ＨＣＶ−ＦａｎからのＨＣＶに富んだペレットのショ糖密度勾配（１０％〜６０％）における等密度遠心の結果を示す。 図１４Ｃは、遠心後に得られた画分（水平軸）の密度（左水平軸、g/ml）及びＥ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性（右垂直軸、Ａ490nm）を表す。 ＥＩＡでは、各画分を１／１００００に希釈し（図４Ａ及び４Ｃ）そしてウエスタンブロットでは、選ばれた画分５μl／レーンを使用した（図４Ｂ及び４Ｄ）。画分の密度は屈折率測定法により測定されそしてg/mlで表される。吸光度（Ａ）は４９０nmで側定された。ＥＩＡの結果は、ネガティブコントロール（少なくとも３つの値）の平均×２．１に相当するカットオフより上になる場合にはポジティブと考えられた。AmershamからのＥＣＬ Ｐｌｕｓシステムを使用してブロットを顕色した。
【図１４Ｄ】図１４Ｃ及び図１４Ｄは、遺伝子型１ａ／２ａの単離ＨＣＶ−ＦａｎからのＨＣＶに富んだペレットのショ糖密度勾配（１０％〜６０％）における等密度遠心の結果を示す。 図１４Ｄは、抗Ｅ１Ｅ２ＭＡｂＤ３２．１０を使用する、画分６、８、１０、１２及び１４のウエスタンブロットを表す。 ＥＩＡでは、各画分を１／１００００に希釈し（図４Ａ及び４Ｃ）そしてウエスタンブロットでは、選ばれた画分５μl／レーンを使用した（図４Ｂ及び４Ｄ）。画分の密度は屈折率測定法により測定されそしてg/mlで表される。吸光度（Ａ）は４９０nmで側定された。ＥＩＡの結果は、ネガティブコントロール（少なくとも３つの値）の平均×２．１に相当するカットオフより上になる場合にはポジティブと考えられた。AmershamからのＥＣＬ Ｐｌｕｓシステムを使用してブロットを顕色した。
【図１５Ａ】ＨＣＶ−Ｆａｎペレットのタイプ１の３０〜４５％ショ糖勾配（３０％２ml、３５％３ml、４０％３ml、４５％２ml）における等密度遠心（図１５Ａ）。屈折率測定法により側定された画分の密度はg/mlで表した。Ｅ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性を前記のように間接ＥＩＡにより分析した。
【図１５Ｂ】ショ糖勾配（３０〜４５％）ピーク１（画分８）及び２（画分１２及び１３）からの粒子を個々に第２平衡遠心に付した（それぞれ、図１５Ｂ及び１５Ｃ）。ピーク１をタイプ２の３０〜４５％ショ糖勾配（３０％３ml、３５％３ml、４０％２ml、４５％２ml）において遠心した（図１５Ｂ）。屈折率測定法により側定された画分の密度はg/mlで表した。Ｅ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性を前記のように間接ＥＩＡにより分析した。
【図１５Ｃ】ショ糖勾配（３０〜４５％）ピーク１（画分８）及び２（画分１２及び１３）からの粒子を個々に第２平衡遠心に付した（それぞれ、図１５Ｂ及び１５Ｃ）。ピーク２をタイプ３の３０〜４５％ショ糖勾配（３０％２ml、３５％２ml、４０％３ml、４５％３ml）において遠心した（図１５Ｃ）。屈折率測定法により側定された画分の密度はg/mlで表した。Ｅ１Ｅ２−Ｄ３２．１０反応性を前記のように間接ＥＩＡにより分析した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然のＨＣＶウイルスエンベロープに特異的に結合することができる立体配座抗体。
【請求項２】
天然のＨＣＶ Ｅ２タンパク質に特異的に結合することができる、請求項１に記載の立体配座抗体。
【請求項３】
患者のＨＣＶ感染を中和することができる、請求項１又は２に記載の立体配座抗体。
【請求項４】
共有結合形態又は非共有結合形態下のＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体を沈殿させることができる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の立体配座抗体。
【請求項５】
天然のＨＣＶ Ｅ１タンパク質に特異的に結合することができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の立体配座抗体。
【請求項６】
天然のＨＣＶ Ｅ１タンパク質、天然のＨＣＶ Ｅ２タンパク質に特異的に結合することができ、そして共有結合形態又は非共有結合形態下のＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体を沈殿させることができる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の立体配座抗体。
【請求項７】
下記の配列：
ＨＣＶタンパク質Ｅ１のアミノ酸２９７〜３０６（配列番号１）、
ＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸４８０〜４９４（配列番号２）、
ＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸６１３〜６２１（配列番号３）、
の少なくとも１つからなるエピトープに特異的に結合することができる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の立体配座抗体。
【請求項８】
下記の配列：
ＨＣＶタンパク質Ｅ１のアミノ酸２９７〜３０６（配列番号１）、
ＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸４８０〜４９４（配列番号２）、
ＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸６１３〜６２１（配列番号３）、
の各々からなるエピトープに特異的に結合することができる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の立体配座抗体。
【請求項９】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の立体配座抗体。
【請求項１０】
受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９８３の下で２００３年３月１９日にＣＮＣＭ（Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France）に寄託されたハイブリドーマにより分泌される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の立体配座抗体。
【請求項１１】
受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９８２の下で２００３年３月１９日にＣＮＣＭ（Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France）に寄託されたハイブリドーマにより分泌される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の立体配座抗体。
【請求項１２】
受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９８３の下で２００３年３月１９日にＣＮＣＭ（Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France）に寄託されたハイブリドーマ。
【請求項１３】
受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９８２の下で２００３年３月１９日にＣＮＣＭ（Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France）に寄託されたハイブリドーマ。
【請求項１４】
活性物質として請求項１〜１１に記載の抗体の少なくとも１つ及び薬学的に許容されうるベヒクルを含む医薬組成物。
【請求項１５】
ＨＣＶ感染の診断、予防又は治療のための医薬を製造するための、請求項１〜１１に記載の抗体の少なくとも１つの使用。
【請求項１６】
請求項１０又は１１の抗体の少なくとも１つに結合することができるエンベロープドウイルス粒子。
【請求項１７】
請求項１６エンベロープドウイルス粒子に結合する抗体。
【請求項１８】
ヒトの血液、血漿又は血清の初めのサンプル由来のＨＣＶウイルス粒子の組成物であって、ＨＣＶ ＲＮＡコピーの濃度が、それが由来するヒトの血液、血漿又は血清の初めのサンプル中のＨＣＶ ＲＮＡコピーの濃度より約１００〜１０００倍高い、特に約１０7コピー／mlより高い、組成物。
【請求項１９】
ＨＣＶ ＲＮＡコピーの数がタンパク質mg当り約１０8〜約１０9UIである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
該組成物の容積が約０．１ml〜約１０mlである、請求項１８又は１９に記載の組成物。
【請求項２１】
ＨＣＶ ＲＮＡ及びＨＣＶコアタンパク質を実質的に欠いている単離されたＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子。
【請求項２２】
該サブウイルス粒子が、請求項１〜１１に記載の抗体のいずれかに結合する傾向がある、請求項２１に記載の単離されたＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子。
【請求項２３】
ＨＣＶ ＲＮＡ、ＨＣＶコアタンパク質及ＨＣＶエンベロープを含有しそして請求項１〜１１に記載の抗体のいずれかに結合する傾向がある精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子を含む組成物。
【請求項２４】
下記の段階：
−ＨＣＶ感染患者の清澄化された血漿分離交換法から生じるサンプルを少なくとも２回超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得、
−該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させてＨＣＶウイルス粒子の組成物を得る、
段階を含む、ＨＣＶウイルス粒子の組成物を製造する方法。
【請求項２５】
請求項２４の方法に従って得られる如きＨＣＶウイルス粒子の組成物。
【請求項２６】
下記の段階：
−ＨＣＶ感染患者の清澄化された血漿分離交換法から生じるサンプルを少なくとも２回超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得、
−該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させ、
−該再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットをショ糖密度勾配において超遠心して、再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットのエレメントをそれらの密度に従って画分に分離し、
−ＨＣＶ ＲＮＡを実質的に含有せず、ＨＣＶコアタンパク質を実質的に含有せず、そして請求項１０又は１１のモノクローナル抗体に結合することができる粒子を含有する画分、特に、約１．１３〜１．１５g/mlのショ糖密度を有する画分を回収して、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物を得る、
段階を含む、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物を製造する方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法に従って得られる如きＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物。
【請求項２８】
下記の段階：
−ＨＣＶ感染患者の清澄化された血漿分離交換法から生じるサンプルを少なくとも２回超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得、
−該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させ、
−該再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットをショ糖密度勾配において超遠心して、再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットのエレメントをそれらの密度に従って画分に分離し、
−約５．１０5〜約１０6UI／mlのＨＣＶ ＲＮＡ、約５０〜約１００pg／mlのＨＣＶコアタンパク質を含有しそして請求項１０又は１１のモノクローナル抗体に結合することができる粒子を含有する画分、特に、約１．１７〜１．２１g/mlのショ糖密度を有する画分を回収して、精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物を得る、
段階を含む、精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物を製造する方法。
【請求項２９】
請求項２８の方法に従って得られる如き精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物。
【請求項３０】
下記の段階：
−動物、特に哺乳動物を請求項１８に記載のＨＣＶウイルス粒子の組成物又は請求項２４に従って製造されるようなものにより免疫化し、そして発生した抗体を回収し、
−発生した抗体の中で、ＨＣＶウイルス粒子の上記した組成物中に含有されたＨＣＶウイルス粒子に結合する能力に基づいてモノクローナル抗体を選ぶ、
段階を含む、請求項１０に記載のモノクローナル抗体を製造する方法。
【請求項３１】
下記の段階：
−動物、特に哺乳動物を請求項２３に記載の精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物又は請求項２８に従って製造されるようなものにより免疫化し、そして発生した抗体を回収し、
−発生した抗体の中で、精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の上記した組成物中に含有された精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子に結合する能力に基づいてモノクローナル抗体を選ぶ、
段階を含む、請求項１１のモノクローナル抗体を製造する方法。
【請求項３２】
活性物質として請求項２１若しくは２２のサブウイルス粒子又は請求項２７の組成物、及び薬学的に許容されうるベヒクルを含む医薬組成物。
【請求項３３】
ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子に対する又は請求項２２に記載のＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子に対する免疫反応を誘発するための、請求項２１若しくは２２のＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子又は請求項２７の組成物の使用。
【請求項３４】
ＨＣＶ感染の診断、予防又は治療用の医薬を製造するための、請求項２１若しくは２２のＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子又は請求項２７の組成物の使用。
【請求項１】
天然のＨＣＶウイルスエンベロープに特異的に結合することができる立体配座抗体。
【請求項２】
天然のＨＣＶ Ｅ２タンパク質に特異的に結合することができる、請求項１に記載の立体配座抗体。
【請求項３】
患者のＨＣＶ感染を中和することができる、請求項１又は２に記載の立体配座抗体。
【請求項４】
共有結合形態又は非共有結合形態下のＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体を沈殿させることができる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の立体配座抗体。
【請求項５】
天然のＨＣＶ Ｅ１タンパク質に特異的に結合することができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の立体配座抗体。
【請求項６】
天然のＨＣＶ Ｅ１タンパク質、天然のＨＣＶ Ｅ２タンパク質に特異的に結合することができ、そして共有結合形態又は非共有結合形態下のＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体を沈殿させることができる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の立体配座抗体。
【請求項７】
下記の配列：
ＨＣＶタンパク質Ｅ１のアミノ酸２９７〜３０６（配列番号１）、
ＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸４８０〜４９４（配列番号２）、
ＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸６１３〜６２１（配列番号３）、
の少なくとも１つからなるエピトープに特異的に結合することができる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の立体配座抗体。
【請求項８】
下記の配列：
ＨＣＶタンパク質Ｅ１のアミノ酸２９７〜３０６（配列番号１）、
ＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸４８０〜４９４（配列番号２）、
ＨＣＶタンパク質Ｅ２のアミノ酸６１３〜６２１（配列番号３）、
の各々からなるエピトープに特異的に結合することができる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の立体配座抗体。
【請求項９】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の立体配座抗体。
【請求項１０】
受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９８３の下で２００３年３月１９日にＣＮＣＭ（Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France）に寄託されたハイブリドーマにより分泌される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の立体配座抗体。
【請求項１１】
受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９８２の下で２００３年３月１９日にＣＮＣＭ（Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France）に寄託されたハイブリドーマにより分泌される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の立体配座抗体。
【請求項１２】
受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９８３の下で２００３年３月１９日にＣＮＣＭ（Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France）に寄託されたハイブリドーマ。
【請求項１３】
受託番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９８２の下で２００３年３月１９日にＣＮＣＭ（Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, France）に寄託されたハイブリドーマ。
【請求項１４】
活性物質として請求項１〜１１に記載の抗体の少なくとも１つ及び薬学的に許容されうるベヒクルを含む医薬組成物。
【請求項１５】
ＨＣＶ感染の診断、予防又は治療のための医薬を製造するための、請求項１〜１１に記載の抗体の少なくとも１つの使用。
【請求項１６】
請求項１０又は１１の抗体の少なくとも１つに結合することができるエンベロープドウイルス粒子。
【請求項１７】
請求項１６エンベロープドウイルス粒子に結合する抗体。
【請求項１８】
ヒトの血液、血漿又は血清の初めのサンプル由来のＨＣＶウイルス粒子の組成物であって、ＨＣＶ ＲＮＡコピーの濃度が、それが由来するヒトの血液、血漿又は血清の初めのサンプル中のＨＣＶ ＲＮＡコピーの濃度より約１００〜１０００倍高い、特に約１０7コピー／mlより高い、組成物。
【請求項１９】
ＨＣＶ ＲＮＡコピーの数がタンパク質mg当り約１０8〜約１０9UIである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
該組成物の容積が約０．１ml〜約１０mlである、請求項１８又は１９に記載の組成物。
【請求項２１】
ＨＣＶ ＲＮＡ及びＨＣＶコアタンパク質を実質的に欠いている単離されたＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子。
【請求項２２】
該サブウイルス粒子が、請求項１〜１１に記載の抗体のいずれかに結合する傾向がある、請求項２１に記載の単離されたＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子。
【請求項２３】
ＨＣＶ ＲＮＡ、ＨＣＶコアタンパク質及ＨＣＶエンベロープを含有しそして請求項１〜１１に記載の抗体のいずれかに結合する傾向がある精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子を含む組成物。
【請求項２４】
下記の段階：
−ＨＣＶ感染患者の清澄化された血漿分離交換法から生じるサンプルを少なくとも２回超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得、
−該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させてＨＣＶウイルス粒子の組成物を得る、
段階を含む、ＨＣＶウイルス粒子の組成物を製造する方法。
【請求項２５】
請求項２４の方法に従って得られる如きＨＣＶウイルス粒子の組成物。
【請求項２６】
下記の段階：
−ＨＣＶ感染患者の清澄化された血漿分離交換法から生じるサンプルを少なくとも２回超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得、
−該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させ、
−該再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットをショ糖密度勾配において超遠心して、再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットのエレメントをそれらの密度に従って画分に分離し、
−ＨＣＶ ＲＮＡを実質的に含有せず、ＨＣＶコアタンパク質を実質的に含有せず、そして請求項１０又は１１のモノクローナル抗体に結合することができる粒子を含有する画分、特に、約１．１３〜１．１５g/mlのショ糖密度を有する画分を回収して、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物を得る、
段階を含む、ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物を製造する方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法に従って得られる如きＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子の組成物。
【請求項２８】
下記の段階：
−ＨＣＶ感染患者の清澄化された血漿分離交換法から生じるサンプルを少なくとも２回超遠心してＨＣＶに富んだペレットを得、
−該ＨＣＶに富んだペレットを水性溶液中に再懸濁させ、
−該再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットをショ糖密度勾配において超遠心して、再懸濁させたＨＣＶに富んだペレットのエレメントをそれらの密度に従って画分に分離し、
−約５．１０5〜約１０6UI／mlのＨＣＶ ＲＮＡ、約５０〜約１００pg／mlのＨＣＶコアタンパク質を含有しそして請求項１０又は１１のモノクローナル抗体に結合することができる粒子を含有する画分、特に、約１．１７〜１．２１g/mlのショ糖密度を有する画分を回収して、精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物を得る、
段階を含む、精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物を製造する方法。
【請求項２９】
請求項２８の方法に従って得られる如き精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物。
【請求項３０】
下記の段階：
−動物、特に哺乳動物を請求項１８に記載のＨＣＶウイルス粒子の組成物又は請求項２４に従って製造されるようなものにより免疫化し、そして発生した抗体を回収し、
−発生した抗体の中で、ＨＣＶウイルス粒子の上記した組成物中に含有されたＨＣＶウイルス粒子に結合する能力に基づいてモノクローナル抗体を選ぶ、
段階を含む、請求項１０に記載のモノクローナル抗体を製造する方法。
【請求項３１】
下記の段階：
−動物、特に哺乳動物を請求項２３に記載の精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の組成物又は請求項２８に従って製造されるようなものにより免疫化し、そして発生した抗体を回収し、
−発生した抗体の中で、精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子の上記した組成物中に含有された精製されたＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子に結合する能力に基づいてモノクローナル抗体を選ぶ、
段階を含む、請求項１１のモノクローナル抗体を製造する方法。
【請求項３２】
活性物質として請求項２１若しくは２２のサブウイルス粒子又は請求項２７の組成物、及び薬学的に許容されうるベヒクルを含む医薬組成物。
【請求項３３】
ＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子に対する又は請求項２２に記載のＨＣＶエンベロープド完全ウイルス粒子に対する免疫反応を誘発するための、請求項２１若しくは２２のＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子又は請求項２７の組成物の使用。
【請求項３４】
ＨＣＶ感染の診断、予防又は治療用の医薬を製造するための、請求項２１若しくは２２のＨＣＶエンベロープドサブウイルス粒子又は請求項２７の組成物の使用。
【図２】
【図４】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図１３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図１３】
【公表番号】特表２００７−５２８３５０（Ｐ２００７−５２８３５０Ａ）
【公表日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０４９３１（Ｐ２００６−５０４９３１）
【出願日】平成１６年３月３１日（２００４．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００３４１２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８７７６０
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（５００３６６５９８）インセルム（アンスティチュ・ナショナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル） (17)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＥＲＭ（ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬＥ）
【出願人】（５０３１４８４４３）ビオメリュー・ソシエテ・アノニム (3)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ ＳＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月３１日（２００４．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００３４１２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８７７６０
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（５００３６６５９８）インセルム（アンスティチュ・ナショナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル） (17)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＥＲＭ（ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬＥ）
【出願人】（５０３１４８４４３）ビオメリュー・ソシエテ・アノニム (3)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ ＳＡ
【Ｆターム（参考）】
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