肝癌検出用マーカー
【課題】肝癌の検出用マーカーとなり得る遺伝子および蛋白質を見出し、該遺伝子および／または該蛋白質を測定することを特徴とする肝癌の検出方法を提供し、肝癌の診断に寄与すること。
【解決手段】被験試料、特に血液試料についてＴＭ４ＳＦ４遺伝子および／または該遺伝子によりコードされる蛋白質を検出することを特徴とする肝癌の検出方法、および該肝癌の検出方法に用いる試薬キットを提供し、さらに該肝癌の検出方法および該試薬キットを用いる肝癌の診断方法および診断キットを提供する。
【解決手段】被験試料、特に血液試料についてＴＭ４ＳＦ４遺伝子および／または該遺伝子によりコードされる蛋白質を検出することを特徴とする肝癌の検出方法、および該肝癌の検出方法に用いる試薬キットを提供し、さらに該肝癌の検出方法および該試薬キットを用いる肝癌の診断方法および診断キットを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝癌検出用マーカー、特に肝細胞癌において高い発現が認められる遺伝子からなる肝癌検出用マーカーおよび該遺伝子によりコードされる蛋白質からなる肝癌検出用マーカーに関する。より詳しくは本発明は、血液試料について該マーカーを測定することを特徴とする肝癌の検出方法または診断方法に関する。また、本発明は、肝癌検出用試薬および試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌は原発性肝癌の９０％以上を占め、本邦では肺癌、胃癌、大腸癌に次いで死亡数の多い予後不良な悪性腫瘍である。また、今後約２０年間は肝細胞癌の罹患患者数が増加すると予想されている。
【０００３】
肝細胞癌はＢ型肝炎やＣ型肝炎を背景とした慢性肝炎あるいは肝硬変を発生母地として発癌することが多いとされている。そのためこれら肝炎患者はハイリスク群として認識され、厳重に経過観察される。肝炎患者の経過観察には腹部超音波検査、ＣＴ（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）検査、ＭＲＩ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ）検査などの画像検査を施行することや、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＦＰ Ｌ３分画、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｖｉｔａｍｉｎ−Ｋ Ａｂｓｅｎｃｅ−ＩＩ）などのマーカーを定期的に測定することが推奨されている。しかし、これらマーカーは必ずしも肝癌の発生に伴って陽性になる（高値を示す）とは限らず、また肝硬変に伴って上昇する場合や投与されている薬剤の影響を受ける場合もある。そのため、新しい肝癌検出用マーカーの開発が急務であるといえる。
【０００４】
トランスメンブレン４ スーパーファミリー４（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ４、以下ＴＭ４ＳＦ４と略称する）遺伝子は、肝、腸および膵臓での発現が確認されている（非特許文献１）。ラットの肝切除モデルでは肝切後にＴＭ４ＳＦ４の高発現が認められている（非特許文献２）。またラットの実験肝炎モデルで肝臓の幹細胞であると考えられている卵円形細胞（Ｏｖａｌ ｃｅｌｌ）においてＴＭ４ＳＦ４の発現が認められると報告されている（非特許文献３）。
【０００５】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質はシグナル伝達ドメインを持たず、４つの膜貫通ドメインを有する膜蛋白質であるが、その生体での働きは十分に解明されていない。ＴＭ４ＳＦ４遺伝子および該遺伝子によりコードされる膜蛋白質は、ヒト、ラットおよびマウスにおいてその配列相同性が非常に高い。
【０００６】
【非特許文献１】ワイズマン科学研究所公開データベース（http://genome-www.stanford.edu/cgi-bin/genecards/carddisp.pl?gene=TM4SF4）。
【非特許文献２】リウら（Ｌｉｕ Ｚ．ｅｔ ａｌ．）、「バイオキミカ エ バイオフィジカ アクタ（ＢＩＯＣＨＩＭＩＣＡ ＥＴ ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡ ＡＣＴＡ）」、２００１年３月１９日、第 １５１８号、第１−２号、ｐ．１８３−１８９。
【非特許文献３】キウら（Ｑｉｕ Ｊ．ｅｔ ａｌ．） 、「ジャーナル オブ ヘパトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）」、２００７年２月、第４６巻、第２号、ｐ．２６６−２７５。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、肝癌の検出用マーカーとなり得る遺伝子および蛋白質を見出し、該遺伝子および／または蛋白質をマーカーとして測定することを特徴とする肝癌の検出方法を提供し、肝癌の診断に寄与にすることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、マウス肝発癌モデルでの発癌過程において変化する遺伝子群に着目し、該遺伝子群をマイクロアレーでスクリーニングし、その結果、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現が癌組織で高くなることを見出した。また、本発明者らはマウス肝発癌モデルでＴＭ４ＳＦ４遺伝子が癌細胞に発現することを実証した。
【０００９】
さらに本発明者らは、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子がヒト肝癌患者の肝癌組織において正常肝組織に比べて高発現していることを見出した。
【００１０】
これら結果から、本発明者らはＴＭ４ＳＦ４遺伝子および該遺伝子によりコードされるポリヌクレオチドが肝癌検出用マーカーとして用いることができることを見出した。
【００１１】
さらに本発明者らは、ヒト肝細胞癌患者の末梢血単核球においてＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが検出されるが健常人の末梢血単核球では該ｍＲＮＡが検出されないことを実証した。
【００１２】
上記結果から、血液試料についてＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することにより、肝癌の検出および診断を実施できることを見出し、本発明を達成した。
【００１３】
すなわち本発明は、血液試料におけるＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌の検出方法に関する。
【００１４】
また本発明は、血液試料におけるＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌の検出方法であって、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定を該遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイゼーションするプライマーまたはプローブを用いて実施することを含む方法に関する。
【００１５】
さらに本発明は、血液試料におけるＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌の検出方法であって、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定を下記プライマーセットのうちの少なくともいずれか１を用いて実施することを含む方法に関する：
（１）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセット、
（２）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセット、および
（３）配列表の配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセット。
【００１６】
さらにまた本発明は、血液試料におけるＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌の検出方法であって、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定が下記工程を含むことを特徴とする方法に関する：
（ｉ）ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｃＤＮＡの断片ポリヌクレオチドを配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットにより増幅して一次増幅産物を形成させる工程、
（ｉｉ）該一次増幅産物の断片ポリヌクレオチドを配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットにより増幅して二次増幅産物を形成させる工程、および
（ｉｉｉ）該二次増幅産物を検出する工程。
【００１７】
また本発明は、血液試料におけるＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌の検出方法であって、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定を該遺伝子によりコードされる蛋白質を測定することにより実施することを含む方法に関する。
【００１８】
さらに本発明は、血液試料におけるＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌の検出方法であって、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定を該遺伝子によりコードされる蛋白質を該蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて測定することにより実施することを含む方法に関する。
【００１９】
さらにまた本発明は、血液試料から単核球を調製し、該単核球を試料として用いることを特徴とする上記いずれかの肝癌の検出方法に関する。
【００２０】
また本発明は、配列表の配列番号３から８のいずれか１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドに関する。
【００２１】
さらに本発明は、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、並びに該遺伝子によりコードされる蛋白質に特異的に結合する抗体のうち１つまたは２つ以上を含む肝癌検出用試薬キットに関する。
【００２２】
さらにまた本発明は、配列表の配列番号３から８のいずれか１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうち１つまたは２つ以上を含む肝癌検出用試薬キットに関する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌、特に肝細胞癌の検出方法を提供でき、さらに肝癌、特に肝細胞癌の診断方法を実施できる。本発明に係る肝癌の検出方法または診断方法は、肝組織試料のみならず血液試料を試料として使用して実施できるため、被験対象への侵襲性が極めて少なく且つ容易に実施できる有用な方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、肝癌の検出方法に関する。本発明に係る肝癌の検出方法は、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子および／または該遺伝子によりコードされる蛋白質（以下、ＴＭ４ＳＦ４と称することがある）を肝癌検出用マーカーとして測定することを特徴とする。すなわち、本発明は、調べようとする試料（以下、被験試料と称する）におけるＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌の検出方法に関する。
【００２５】
本発明者らは、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子がヒト肝癌患者の肝癌組織において正常肝組織に比べて高発現していることを見出し、さらに、ヒト肝細胞癌患者の末梢血単核球においてＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが検出されるが健常人の末梢血単核球では該ｍＲＮＡが検出されないことを実証した。ＴＭ４ＳＦ４遺伝子がヒト肝癌患者の肝癌組織や末梢血単核球において高発現していることから、肝癌患者の肝癌組織や末梢血単核球において該遺伝子によりコードされる蛋白質も検出されると考えることができる。
【００２６】
上記実証結果から、本発明者らは、血液試料についてＴＭ４ＳＦ４遺伝子および／または該遺伝子によりコードされる蛋白質を肝癌検出用マーカーとして測定することにより、肝癌、好ましくは肝細胞癌の検出および診断を実施できることを見出した。
【００２７】
本発明において、「遺伝子」という用語は、全長遺伝子、およびその一部分からなるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを意味する総称的用語として使用され、また、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡを含み、ここでその最小サイズは２ヌクレオチドである。
【００２８】
「遺伝子の発現」とは、遺伝子の情報がｍＲＮＡに転写されること、または、ｍＲＮＡに転写され、かつ蛋白質のアミノ酸配列として翻訳されることをいう
【００２９】
「遺伝子の発現を測定すること」には、該遺伝子のｍＲＮＡを測定することおよび該遺伝子によりコードされる蛋白質を測定することが包含される。
【００３０】
「遺伝子のｍＲＮＡを測定すること」には、ｍＲＮＡの有無を検出することおよびｍＲＮＡ量を測定することが包含される。
【００３１】
本発明において、「蛋白質」という用語は、完全長蛋白質、およびその一部分からなるポリヌクレオチドまたはオリゴペプチドを意味する総称的用語として使用され、ここで蛋白質、ポリペプチドまたはオリゴペプチドは最小サイズが２アミノ酸である。
【００３２】
「蛋白質を測定すること」には、蛋白質の有無を検出することおよびその量を測定することが包含される。
【００３３】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子は既に公開されており、例えば公開されたデータベース（ＧｅｎＢａｎｋなど）において、ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子がアクセッション番号ＮＭ＿００４６１７．２（配列番号１）として登録されている。また、ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質は、該アクセッション番号に開示されている（配列番号２）。
【００３４】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに限定されず、該ポリヌクレオチドと配列相同性を有し、且つ該ポリヌクレオチドと同等の組織発現を示すといった特徴を有するポリヌクレオチド、また、これら特徴に加えて配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同等の生物学的機能や構造的特徴を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを包含する。配列相同性は、通常、塩基配列の全体で約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらにより好ましくは約９５％以上であることが望ましい。
【００３５】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の組織発現は、肝、腸および膵臓で認められている。また、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子は、上記のようにヒト肝癌患者の肝癌組織において正常肝組織に比べて高発現している。このように、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子には、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列相同性を有し、且つ肝、腸および膵臓、特に肝でその発現が認められるポリヌクレオチドが包含される。
【００３６】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質の構造的特徴として、そのアミノ酸配列に４つの膜貫通ドメインを有することが知られている。したがって、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子には、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列相同性を有し、肝、腸および膵臓、特に肝でその発現が認められ、且つ４つの膜貫通ドメインを有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドが包含される。
【００３７】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子には、配列番号１で表される塩基配列において１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個〜５個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが包含される。変異の程度およびそれらの位置などは、該変異を有するポリヌクレオチドが、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の組織発現を示すといった特徴を有するポリヌクレオチド、また、該特徴に加えて配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同等の生物学的機能や構造的特徴を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限り特に制限されない。
【００３８】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子には、上記ポリヌクレオチドの塩基配列の指定された領域に存在する部分塩基配列からなるポリヌクレオチドが包含される。上記ポリヌクレオチドの塩基配列の指定された領域に存在する部分塩基配列からなるポリヌクレオチドは、その最小単位として好ましくは該領域において連続する５個以上のヌクレオチド、より好ましくは１０個以上のヌクレオチド、より好ましくは２０個以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームである第２３２番目から第８４０番目までの連続した６０９ヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを例示できる。
【００３９】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子には、また、上記ポリヌクレオチドまたはその一部分にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドが包含される。これらポリヌクレオチドは上記ポリヌクレオチドまたはその一部分にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドであれば相補的配列を有するポリヌクレオチドでなくてもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件はよく知られており、例えば成書に記載の条件（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー、特に１１．４５節“Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ”など）にしたがって決定でき、特に制限されない。ストリンジェントな条件は、塩濃度、温度、およびその他の条件によって決まり、例えば、塩濃度が低いほど、温度が高いほど、ストリンジェンシーは高くなり、ハイブリダイゼーションしにくくなる。塩濃度は、一般に、ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ＋クエン酸三ナトリウム）の濃度を調節することによって調節され、ストリンジェントな塩濃度は、例えば、ＮａＣｌ 約２５０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム 約２５ｍＭ以下である。ストリンジェントな温度は、一般に、完全ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より１５〜２５℃低い温度であり、例えば、約３０℃以上である。溶液に有機溶媒（例えばホルムアミド）を加えることにより、温度を下げることができる。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、およびキャリアーＤＮＡの存否などであり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。好ましい例として、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ クエン酸三ナトリウム、１％ ＳＤＳ、５０％ ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの条件で、４２℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。好ましい例として、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ クエン酸三ナトリウムおよび０．１％ ＳＤＳの条件で、６８℃の温度により洗浄を行う。
【００４０】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに限定されず、該ポリペプチドと配列相同性を有し、且つ該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同等の組織発現を示すポリヌクレオチドによりコードされるといった特徴を有するポリペプチド、また、これら特徴に加えて配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物学的機能や構造的特徴を有する蛋白質をコードするポリペプチドを包含する。配列相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらにより好ましくは約９５％以上であることが望ましい。
【００４１】
ＴＭ４ＳＦ４をコードする遺伝子の組織発現は、肝、腸および膵臓で認められている。また、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子は、上記のようにヒト肝癌患者の肝癌組織において正常肝組織に比べて高発現している。このように、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質には、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列相同性を有し、且つ肝、腸および膵臓、特に肝でその発現が認められるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが包含される。
【００４２】
ＴＭ４ＳＦ４の構造的特徴として、そのアミノ酸配列に４つの膜貫通ドメインを有することが知られている。したがって、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質には、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列相同性を有し、肝、腸および膵臓、特に肝でその発現が認められるポリヌクレオチドによりコードされ、且つ４つの膜貫通ドメインを有するポリペプチドが包含される。
【００４３】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質には、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個〜５個のアミノ酸残基の欠失、置換、付加または挿入といった変異が存するアミノ酸配列で表わされるポリペプチドが包含される。変異の程度およびそれらの位置などは、該変異を有するポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子と同等の組織発現を示すといった特徴を有するポリペプチド、また、該特徴に加えて配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物学的機能や構造的特徴を有する蛋白質をコードするポリペプチドである限り特に制限されない。
【００４４】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質には、上記ポリペプチドのアミノ酸配列の指定された領域に存在する部分アミノ酸配列からなるポリペプチドまたはオリゴペプチドが包含される。上記ポリペプチドのアミノ酸配列の指定された領域に存在する部分アミノ酸配列からなるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、その最小単位として好ましくは該領域において連続する５個以上のアミノ酸残基、より好ましくは１０個以上のアミノ酸残基、より好ましくは２０個以上のアミノ酸残基からなるポリペプチドまたはオリゴペプチドである。
【００４５】
本発明において、「癌マーカー」という用語は、腫瘍マーカーという用語と置換可能に使用される。癌マーカーとは、癌性増殖または癌細胞や癌の存在あるいはその程度を示す指標を意味する。言い換えれば、癌細胞が有する物質若しくは産生する物質であって正常細胞のものと比較して量的に著しく多い若しくは少ないなどの変化を示す物質または変異している物質、あるいは癌細胞と反応して体内の正常細胞が産生する物質のうちで、それらを検出することにより癌の判定が可能になるものを意味する。癌マーカーは、対象とする癌に特異的であることが好ましいが、完全に特異的である必要はなく、癌の検出が可能である限りにおいて、他の疾患や臓器において検出されるものであってもよい。ここで、「対象とする癌に特異的である」とは、対象とする癌を高い感度で検出することができるが、それ以外の癌は検出できないか、あるいは検出感度が著しく低いことを意味する。また、「対象とする癌に完全に特異的である」とは、対象とする癌のみを検出することができ、それ以外の癌は検出できないことを意味する。
【００４６】
本発明において、「癌」という用語は、悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ）という用語と置換可能に使用される。癌は、種々の悪性新生物、すなわち細胞の異常増殖を伴い転移性や浸潤性を示す腫瘍を意味する。転移性とは、原発部位から解剖学的に隔たっている部位へ移動し移動した部位で腫瘍を形成する能力を意味する。浸潤性とは、腫瘍が形成された部位からその周囲の組織に侵入する能力を意味する。悪性新生物は一般的に、それを構成する細胞が正常細胞と比較して形態的に異なり、また、細胞の配列が正常組織と比較して異なるために、正常組織と識別可能な組織塊として形成されることが多い。
【００４７】
「肝癌」とは肝臓に発生する悪性新生物を意味し、原発性肝癌および原発性肝癌から転移した肝癌を含む。原発性肝癌とは、肝臓に発生した悪性新生物であって、他の臓器からの転移によるものではない悪性新生物を意味する。
【００４８】
「肝細胞癌」は原発性肝癌の１種であり、原発性肝癌の９０％以上を占める予後不良な悪性腫瘍である。
【００４９】
「肝癌を検出する」とは、被験試料が肝癌由来の被験試料であるか否かを決定することを意味する。
【００５０】
本発明者らは、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子がヒト肝癌患者の肝癌組織において正常肝組織に比べて高発現していることを見出し、さらに、ヒト肝細胞癌患者の末梢血単核球においてＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが検出されるが健常人の末梢血単核球では該ｍＲＮＡが検出されないことを実証した。ＴＭ４ＳＦ４遺伝子がヒト肝癌患者の肝癌組織や末梢血単核球において高発現していることから、肝癌患者の肝癌組織や末梢血単核球において該遺伝子によりコードされる蛋白質も検出されると考えることができる。
【００５１】
すなわち、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡおよび該遺伝子によりコードされる蛋白質は、肝癌組織において正常肝組織に比べて増加しているといえる。また、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡおよび該遺伝子によりコードされる蛋白質は、肝細胞癌患者の末梢血単核球において、検出可能なレベルで存在するといえる。一方、健常人末梢血単核球においては、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡおよび該遺伝子によりコードされる蛋白質は著しく低レベルまたは検出不可能なレベルで存在するといえる。
【００５２】
したがって、被験試料において、増加したレベルのＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡおよび／または該遺伝子によりコードされる蛋白質が検出された場合、該被験試料は肝癌由来の試料であると決定できる。あるいは、血液試料から調製した細胞、より好ましくは血液試料から調製した単核球において、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡおよび／または該遺伝子によりコードされる蛋白質が検出された場合、該血液試料は肝癌患者由来の血液試料であると決定できる。ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡおよび／または該遺伝子によりコードされる蛋白質が増加したか否かの判断は、正常肝組織や健常人由来の血液試料との比較により実施することができる。あるいは、このような判断は、あらかじめ正常肝組織や健常人由来の血液試料において検出されるＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡおよび／または該遺伝子によりコードされる蛋白質の標準値を測定して決定し、該標準値との比較により実施することができる。
【００５３】
被験試料として血液試料、好ましくは血液試料から調製した細胞、より好ましくは血液試料から調製した単核球を用いる場合、肝細胞癌患者の末梢血単核球においてＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが検出されるが健常人の末梢血単核球では該ｍＲＮＡが検出されなかったことから、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡおよび／または該遺伝子によりコードされる蛋白質が検出された場合、健常人由来の血液試料や上記標準値と比較することなく、該血液試料は肝癌由来の試料であると決定できる。
【００５４】
被験試料は、特に制限されず、例えば、血液、細胞、尿、唾液、髄液、生検組織または剖検材料などの生体生物由来の試料を例示できる。ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質が４つの膜貫通ドメインを有する膜蛋白質であることが知られていることから、被験試料は、細胞を含む試料であることが適当である。本発明者らは、ヒト肝細胞癌患者の末梢血単核球においてＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが検出されるが健常人の末梢血単核球では該ｍＲＮＡが検出されないことを実証した。このことから、被験試料として、好ましくは血液試料、より好ましくは血液試料から調製された細胞、さらに好ましくは血液試料から調製された単核球が適当である。「単核球」とは、単核細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）とも称される単核の間葉系細胞群であり、結合組織、リンパ組織および血流中に広く分布する。単核球は、単球やリンパ球に代表される遊走単核白血球と、組織中に存在するマクロファージに代表される単核貪食系細胞に分類される。被験試料として生検組織も用いられるが、生検組織の採取は患者への侵襲性が高く負担が大きい。これに対し、血液試料の採取は患者への侵襲性が低く且つ容易に実施できるという利点を有する。
【００５５】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定は、公知の遺伝子検出法を用いて実施できる。遺伝子検出法として具体的には、サザンブロット法、ノザンブロット法、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）法、プラークハイブリダイゼーション、またはコロニーハイブリダイゼーションなどを例示できる。また、ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲや ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定を用いることもできる。目的遺伝子の検出に用いることのできる方法は上記方法に限定されず、自体公知の遺伝子検出法がいずれも使用可能である。
【００５６】
遺伝子検出法においては、遺伝子の検出、遺伝子の発現量の測定、および遺伝子の増幅の実施に、プローブとしての性質を有するポリヌクレオチドまたはプライマーとしての性質を有するオリゴヌクレオチドが有用である。
【００５７】
プライマーとしての性質を有するオリゴヌクレオチドとは、目的の遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションして該遺伝子を増幅できる、該遺伝子特有の配列で表されるものを意味する（以下、プライマーと称する）。プローブとしての性質を有するポリヌクレオチドとは、目的の遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションできる、該遺伝子特有の配列で表されるものを意味する（以下、プローブと称する）。ここで、「目的の遺伝子を特異的に増幅できる」とは、目的の遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションして増幅産物を形成できるが、それ以外の遺伝子の増幅産物は形成できないか、あるいは増幅産物量が少ないことを意味する。また、「目的の遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションできる」とは、目的の遺伝子とのハイブリダイゼーション産物を形成できるが、それ以外の遺伝子とのハイブリダイゼーション産物を形成できないか、あるいはハイブリダイゼーション産物量が少ないことを意味する。
【００５８】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の検出、該遺伝子の発現量の測定、および該遺伝子の増幅は、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションするプライマーまたはプローブを用いて実施できる。例えば、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡの検出、該遺伝子のｍＲＮＡ量の測定、および該遺伝子のｍＲＮＡ量の増幅は、該遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイゼーションするプライマーまたはプローブを用いて実施できる。
【００５９】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーは、該遺伝子の少なくとも一部を増幅し得るものであればよい。また、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブは、該遺伝子の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズし得るものであればよい。プライマーおよびプローブは、公知の手法に従ってＴＭ４ＳＦ４遺伝子の配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により得ることができる。プライマーは、塩基配列長が一般的に５〜５０ヌクレオチド程度であるものが好ましく、１０〜３５ヌクレオチド程度であるものがより好ましく、１５〜３０ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。プローブは、塩基配列長が一般的に１５ヌクレオチド以上であるものが好ましく、１５〜１０００ヌクレオチド程度であるものがより好ましく、５０〜５００ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。プローブは、通常は標識化したプローブを用いるが、非標識のものであってもよい。プローブを標識化する方法は、種々の方法が知られており、具体的には、ニックトランスレーション、ランダムプライミングまたはキナーゼ処理を利用する方法を例示できる。適当な標識物質として、ジゴキシゲニン、放射性同位体、ビオチン、蛍光物質、化学発光物質、酵素、タグペプチド、抗体を例示できる。
【００６０】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーとして、具体的には配列番号３〜８のいずれか１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを例示できる。これらプライマーは、好ましくは、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとから構成されるプライマーセット、配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとから構成されるプライマーセット、および配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとから構成されるプライマーセットで使用されることが適当である。これらオリゴヌクレオチドは、配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの配列情報に基づいて設計し合成することにより作成した。
【００６１】
プライマーとしての性質を有するオリゴヌクレオチドまたはプローブとしての性質を有するポリヌクレオチドを用いてそれぞれ増幅反応またはハイブリダイゼーション反応を行い、その増幅産物またはハイブリッド産物を検出することにより、遺伝子の検出を実施できる。
【００６２】
増幅反応またはハイブリダイゼーション反応を行う場合には、通常は、被験試料からポリヌクレオチドを調製することが好ましい。調製するポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれでもよい。被験試料からのポリヌクレオチドの調製は、公知の方法を適宜使用して実施できる。例えば、ＲＮＡを調製する場合は、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、またはチオシアン酸グアニジン−フェノール−クロロホルム（ＡＧＰＣ）法などが、また、ＤＮＡを調製する場合は、フェノール抽出およびエタノール沈殿による方法、ガラスビーズを用いる方法などを利用できる。その他、市販のＲＮＡ抽出試薬やＲＮＡ抽出キット、またはＤＮＡ抽出試薬やＤＮＡ抽出キットを使用して、ＲＮＡやＤＮＡの調製を実施できる。被験試料からＲＮＡを調製した場合、さらに該ＲＮＡをテンプレートとして逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを調製して増幅反応に用いることができる。逆転写反応によるＲＮＡからのｃＤＮＡの調製方法は、周知であり、また、市販のＲＴ−ＰＣＲ用キットなどを用いて実施できる。
【００６３】
増幅反応は、所望のポリヌクレオチドを増幅し得る公知の増幅法を用いて実施できる。増幅法は、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。ＰＣＲは、所望のポリヌクレオチドを特異的に増幅できるプライマーを用いる方法である限り、従来公知の方法のいずれも使用できる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ネスティッドＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、および競合ＰＣＲを用いることができ、その他、当該分野で用いられる種々のＰＣＲの変法を適応できる。その他の増幅法として、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などが知られており、いずれも用いることができる。
【００６４】
ＰＣＲによれば、ＤＮＡをテンプレートとし、ＤＮＡポリメラーゼにより該ＤＮＡの塩基配列中の特定部位のみを繰り返し複製することにより、該特定部位の塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅することができる。このとき、複製反応のプライマーとして、該特定部位の一方の端の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび他方の端の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを該ＤＮＡの塩基配列から設計して作成し、プライマーセットとして用いる。
【００６５】
ＲＴ−ＰＣＲによれば、ＲＮＡをテンプレートとし、逆転写反応酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によりｃＤＮＡを作成し、その後、作成したｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行うことにより、該ｃＤＮＡの該特定部位の塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅することができる。
【００６６】
ネスティッドＰＣＲによれば、ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲで増幅されたポリヌクレオチドをテンプレートとして、該増幅されたポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計し作成されたプライマーセットを用いてＤＮＡポリメラーゼにより複製反応を行うことにより、該増幅されたポリヌクレオチドの特定部位の塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅することができる。ネスティッドＰＣＲは、所望のＤＮＡのみをより確実に増幅する目的で使用される。
【００６７】
リアルタイムＰＣＲによれば、ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲによる増幅を経時的に測定することにより、増幅率に基づいてテンプレートＤＮＡの初期量を定量できる。リアルタイムＰＣＲは蛍光色素を用いて行われ、二種類の方法がある。一方は、互いに干渉しあう２種類の蛍光色素で標識した配列特異的プローブを用いる方法（ＴａｑＭａｎ法）であり、もう一方は二本鎖ＤＮＡにインターカレートしたときのみ蛍光を発する色素、例えばエチジウムブロマイド、ＳＹＢＲＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎなどを用いる方法である。ＴａｑＭａｎ法では、５´末端を蛍光色素（レポーター）で、３´末端を消光剤（クエンチャー）で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするプローブが使用される。プローブは通常の状態ではクエンチャーによりレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子にハイブリダイズさせた状態で、その外側からＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによる伸張反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが５´末端から加水分解され、その結果、レポーター色素が遊離して蛍光を発する。この蛍光の強度を経時的に測定することによりテンプレートＤＮＡの初期量を定量できる。リアルタイムＰＣＲはＲＴ−ＰＣＲと組み合わせて用いること（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）により、少量のｍＲＮＡの定量が可能になる。
【００６８】
競合ＰＣＲによれば、所望のｍＲＮＡを検出するためのプライマーと相補的な配列を有し、分子量あるいは制限酵素切断部位が標的ｍＲＮＡと異なる、既知量の競合テンプレートＲＮＡを試料中に加え、ＲＴ−ＰＣＲ後にＰＣＲを行い、生成した所望のｍＲＮＡ由来増幅産物量および競合鋳型テンプレート由来の増幅産物量を比較することにより、所望のｍＲＮＡを定量することができる。
【００６９】
増幅反応により得られる増幅産物が所望のポリヌクレオチドであるか否かは、該増幅産物を特異的に認識することができる公知の方法を用いて検出できる。例えば、アガロースゲル電気泳動法などを利用して、特定のサイズのポリヌクレオチドが増幅されているか否かを確認することができる。あるいは、増幅反応の過程で増幅産物に取り込まれるデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）に標識物質を標識しておき、増幅産物に取り込まれたｄＮＴＰの標識物質を測定することにより、増幅産物を検出することができる。標識物質としては、蛍光物質、例えばフルオレセイン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＳＲ）およびテトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）など、発光物質、例えばルシフェリンなど、並びに放射性同位体、例えば３２Ｐ、３５Ｓおよび１２１Ｉなどを例示できる。これら標識物質による標識の方法および標識物質の検出方法は、特に制限されることはなく、従来公知の各種方法を適用することができる。
【００７０】
ハイブリダイゼーション反応は、所望のポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションし得るプローブを用いて、プローブが該ポリヌクレオチドと特異的に反応するような条件で行う。プローブが該ポリヌクレオチドと特異的に反応するような条件、すなわちストリンジェントな条件は、上記のようによく知られており、特に制限されない。
【００７１】
ハイブリダイゼーション反応に用いるプローブに標識物質を標識しておき、ハイブリダイゼーション反応後に標識物質を測定することにより、ハイブリダイゼーション産物を検出することができる。標識物質としては、蛍光物質、例えばフルオレセイン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＳＲ）およびテトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）など、発光物質、例えばルシフェリンなど、放射性同位体、例えば３２Ｐ、３５Ｓおよび１２１Ｉなど、酵素、例えばアルカリホスファターゼおよびホースラディシュパーオキシダーゼなど、並びにビオチンを例示できる。これら標識物質による標識の方法および標識物質の検出方法は、特に制限されることはなく、従来公知の各種方法を適用することができる。
【００７２】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子を肝癌検出用マーカーとして測定することを特徴とする肝癌の検出方法の具体例を以下に説明する。まず、血液試料から単核球を調製する。単核球の分離は、公知の方法を用いて行うことができ、例えば比重遠心法などの方法により実施できる。次いで、単核細胞よりＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡをテンプレートとし逆転写反応によりｃＤＮＡを生成する。ＲＮＡの抽出および逆転写反応によるｃＤＮＡの生成は、上記ポリヌクレオチドの調製方法およびｃＤＮＡの生成方法にしたがって実施できる。得られたｃＤＮＡをテンプレートとしてネスティッドＰＣＲによりＴＭ４ＳＦ４ ｃＤＮＡの断片ポリヌクレオチドを増幅して検出する。ネスティッドＰＣＲは、得られたｃＤＮＡをテンプレートとして、例えば配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用いて１ｓｔ ＰＣＲを行い、その後、１ｓｔ ＰＣＲ産物をテンプレートとして、例えば配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用いて２ｎｄ ＰＣＲを行うことにより実施できる。プライマーセットはこれらに制限されず、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の塩基配列に基づいて適宜設計し合成したものを使用できる。２ｎｄ ＰＣＲ産物を電気泳動により分離し、上記プライマーセットを用いてネスティッドＰＣＲにより増幅されると予想されるＴＭ４ＳＦ４ ｃＤＮＡの断片ポリヌクレオチドのサイズに相当する部位のバンドを検出する。このようなバンドが検出された場合、血液試料から調製された単核球にはＴＭ４ＳＦ４遺伝子が発現していると判定でき、さらにＴＭ４ＳＦ４遺伝子が発現していることが確認された血液試料は肝癌由来の血液試料であると判定できる。
【００７３】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子を肝癌検出用マーカーとして測定することを特徴とする肝癌の検出方法はまた、被験試料からＲＮＡを抽出し、該ＲＮＡを用いて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより実施できる。ここで用いるプライマーセットとして、例えば配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを例示できる。プライマーセットはこれらに制限されず、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の塩基配列に基づいて適宜設計し合成したものを使用できる。
【００７４】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質の測定は、この分野における慣用技術による蛋白質検出法あるいは定量法を用いて行うことができる。例えば、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル抗体）を用いて目的蛋白質の検出や定量を実施できる。具体的には、被験試料から蛋白質画分を調製し、目的蛋白質に対する特異抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法またはイムノブロット法で目的蛋白質の解析を行うことにより、上記検出が可能である。また、目的蛋白質に対する抗体を用いて、免疫組織化学的技術によりパラフィンまたは凍結組織切片中の目的蛋白質を検出することができる。あるいは、目的蛋白質に対する抗体を用いて、細胞染色により細胞上の目的蛋白質を検出することができる。目的蛋白質またはその変異体を検出する方法の具体例としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ法、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）、免疫酵素法（ＩＥＭＡ）、競争結合アッセイ、免疫蛍光法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、およびプロテインチップによる解析法などが挙げられる。抗体はＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質あるいは該蛋白質の断片蛋白質を抗原として用いて自体公知の抗体作製法を利用できる。ポリクローナル抗体は、免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得できる。好ましい抗体回収手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が挙げられる。モノクロ−ナル抗体は、免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株などのミエローマ株）への形質転換手段を導入することにより生産できる。
【００７５】
本発明に係る検出方法は、肝癌、好ましくは肝細胞癌の検出に有効である。本発明に係る検出方法を用いて肝癌、好ましくは肝細胞癌の診断を実施できる。したがって、本発明に係る検出方法を用いる肝癌、好ましくは肝細胞癌の診断方法も本発明の範囲に包含される。肝癌の診断を行う場合、本発明に係る検出方法を実施するとともに、従来行われているマーカー、例えばＡＦＰ、ＡＦＰ Ｌ３分画、ＰＩＶＫＡ−ＩＩなどの測定や、血液検査、例えば全血球計算（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｕｎｔ、ＣＢＣ）、肝機能検査、腎機能検査などを実施し、それらの結果と比較検討することにより肝癌の判定ができる。また、摘出標本や細胞診がある場合には、その結果と比較検討することにより肝癌の判定ができる。
【００７６】
本発明はまた、肝癌、好ましくは肝細胞癌の検出に用いる試薬および試薬キットに関する。
【００７７】
本発明に係る試薬として、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子または該遺伝子の断片ポリヌクレオチドを特異的に増幅し得るプライマーとしての性質を有するオリゴヌクレオチド、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子または該遺伝子の断片ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブとしての性質を有するポリヌクレオチド、およびＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質に特異的に結合する抗体を挙げることができる。例えば、本発明に係る試薬として、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを例示できる。具体的には、例えば、本発明に係る試薬として、配列番号３から８のいずれか１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを例示できる。本発明に係る試薬は、標識物質により予め標識されたものであることができる。標識物質として、上述の蛋白質や放射性同位元素を例示できる。本発明に係る試薬は、緩衝液、塩、安定化剤、および／または防腐剤などの物質を含むことができる。製剤化にあたっては、各物質の性質に応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。本発明に係る試薬は、本発明に係る肝癌の検出方法や該検出方法を用いた肝癌の診断方法に使用できる。ここで「ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質に特異的に結合する」とは、該蛋白質に結合するが、それ以外の蛋白質には結合しないか弱く結合することを意味する。
【００７８】
本発明に係る試薬キットとして、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子または該遺伝子の断片ポリヌクレオチドを特異的に増幅し得るプライマーとしての性質を有するオリゴヌクレオチド、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子または該遺伝子の断片ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブとしての性質を有するポリヌクレオチド、およびＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質に特異的に結合する抗体のうちの少なくともいずれか１つを含む試薬キットを挙げることができる。例えば、本発明に係る試薬キットとして、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、並びに該遺伝子によりコードされる蛋白質に特異的に結合する抗体のうちの少なくともいずれか１つを含む試薬キットを例示できる。具体的には、例えば、本発明に係る試薬キットとして、配列番号３から８のいずれか１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを含む試薬キットを例示できる。好ましくは、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとのセット、配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとのセット、および配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとのセットから選ばれるいずれか１つのセットを含む試薬キットを例示できる。より好ましくは、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとのセット、および配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとのセットを含む試薬キットを例示できる。本発明に係る試薬キットは、その他に本発明の検出方法の実施に有用な物質、例えば標識物質、標識物質の検出剤、反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤および反応停止液などを含むことができる。標識物質として、上述の蛋白質や放射性同位元素を例示できる。標識物質は、予めポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、あるいは抗体に付加されていてもよい。本発明に係る試薬キットは、本発明に係る肝癌の検出方法や該検出方法を用いた肝癌の診断方法に使用できる。また、本発明に係る試薬キットは、肝癌、好ましくは肝細胞癌の判定用キットおよび診断用キットとして使用できる。
【００７９】
本発明はまた、肝癌、好ましくは肝細胞癌の検出に用いるＤＮＡチップに関する。本発明において、ＤＮＡチップと言う用語はＤＮＡアレイという用語と置換可能に使用される。本発明に係るＤＮＡチップは、ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡとハイブリダイゼーションし得るポリヌクレオチドをシリコンやガラスなどの基板上に固定化することにより製造できる。ＤＮＡの基板への固定化は、周知方法を用いて実施できる（シェーナ（Ｓｈｅｎａ Ｍ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９５年、第２７０巻、第５２３５号、ｐ．４６７−４７０）。
【実施例１】
【００８０】
マウス肝発癌モデルでの発癌過程において変化する遺伝子群をＤＮＡマイクロアレイを用いてスクリーニングした。
【００８１】
具体的には、ｃ−ｍｙｃ／ＴＧＦ−αダブルトランスジェニックマウス（ムラカミら（Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｈ． ｅｔ．ａｌ．）、「キャンサーリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９３年、第５３巻、第８号、ｐ．１７１９−１７２３）を用い、本モデルマウスにおいて発生した肝腫瘍のうち２０個を採取し、ＴＲＩＺＯＬＴＭにてＲＮＡを抽出した。この時、腫瘍を最大割面で切断して約３ｍｍの厚さの組織切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色標本（ＨＥ標本）を作成した。
【００８２】
ＨＥ標本で確認した癌および腺腫をそれぞれ１０個選択し、それぞれからトータルＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を２０μｇずつ調製し、試料として用いた。癌から調製した試料および腺腫ら調製した試料を、それぞれをＣｙ５およびＣｙ３で標識した。標識はＡｔｌａｓ ｇｌａｓｓ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて行った。標識した試料をＡＴＣ２．６Ｋ ｍｏｕｓｅ Ｏｎｃｏ−ｃｈｉｐ（ＡＴＣ、ＮＣＩ）上でハイブリダイゼーションし、３７℃で４８時間インキュベーションした。ハイブリダイゼーションは、添付のプロトコールにしたがって行った。
【００８３】
その結果、マウス肝発癌モデルにおいて発生した肝癌組織において、肝腺腫組織と比較してＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが高発現となっていることが判明した。
【実施例２】
【００８４】
ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの発現を、マウス肝発癌モデルにおいて発生した肝臓腫瘍と正常マウスの肝組織について比較検討した。本検討においては、各組織におけるＴＭ４ＳＦ４の発現をｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法（ＩＳＨと略称することがある）により検出するとともに、ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡのコピー数をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した。
【００８５】
具体的には、ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの発現を、ｃ−ｍｙｃ／ＴＧＦ−αダブルトランスジェニックマウスにおいて発生した肝臓の異形成巣、肝腺腫および肝癌、並びに野生型マウス（ＷＴと略称することがある）の肝組織を用いて比較検討した。
【００８６】
ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションによる組織発現の検出は、各組織から作成した組織切片を用い、下記のように作成したプローブを用いてノーザンブロット法により実施した。プローブの作成のため、まずマウスＩｍａｇｅ：４２３２０４クローンをＲｅｓＧｅｎ社より購入し、該クローンについてＴ３およびＴ７プライマーを用いてシーケンスを行い、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子が含まれていることを確認した。該クローンをテンプレートとし、配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１０に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、２７９ｂｐのＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物を電気泳動に付し、得られたバンドを切り出して精製し、得られたポリヌクレオチドをプローブ（以下、マウスＴＭ４ＳＦ４プローブと称する）として用いた。各組織よりＲＮＡをＴＲＩＺＯＬＴＭにて抽出し、その１５μｌを電気泳動に付した後にメンブレンに転写し、次いで３２Ｐで標識したマウスＴＭ４ＳＦ４プローブをハイブリダイゼーションさせた。
【００８７】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡのコピー数の測定は、上記組織発現の検出に用いたＲＮＡと同じＲＮＡを用いて行った。まず、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、添付のプロトコールにしたがって１μｇのｔＲＮＡをテンプレートとして逆転写反応を行ってｃＤＮＡを生成した。次いで、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。プライマーセットとして配列番号１１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用いた。本プライマーセットにより、１０２ｂｐのマウスＴＭ４ＳＦ４ ｃＤＮＡ断片が増幅される。
【００８８】
上記検討の結果、ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡのコピー数は、マウス肝発癌モデルにおいて発生した肝癌組織において、異形成巣や肝腺腫組織および野生型マウスの肝組織と比較して有意に増加していることが判明した（図１）。また、ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡは、正常肝組織においてグリソンと中心静脈域に発現しており、肝癌組織においてその発現が増加していることが判明した。
【００８９】
上記結果から、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子は肝腺腫から肝癌へ発癌する過程でその発現が増加する遺伝子であると判定された。
【実施例３】
【００９０】
ヒト肝細胞癌の肝癌組織におけるＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの発現を、該肝癌組織周囲の肝組織および正常肝組織における発現と比較検討した。組織試料として、ヒト肝癌組織ライブラリー（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）の５７症例を用いた。各組織からＲＮＡをＴＲＩＺＯＬＴＭにて抽出し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーセットとして配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用いた。本プライマーセットにより、１０２ｂｐのＴＭ４ＳＦ４ ｃＤＮＡ断片が増幅される。
【００９１】
上記検討の結果、５７症例のヒト肝細胞癌組織中のＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの発現は、該癌組織周囲の肝組織や正常肝組織に比べて有意に増加していることが判明した（図２）。また、当該５７症例のうち４５．３％の症例で、癌組織におけるＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの発現が該癌組織周囲の肝組織に比べて２倍以上亢進していた。
【００９２】
このように、ヒト肝癌症例においても、肝癌組織におけるＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現が該肝癌組織周囲の肝組織や正常肝組織と比較して著しく高いことが明らかになった。これら結果から、本発明者らは、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質は肝癌マーカーとして肝癌の検出に利用できると考えている。
【実施例４】
【００９３】
原発性肝癌症例、転移性肝癌症例および健常者から採取した血液試料を対象にＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を比較検討した。血液試料の採取は、インフォームドコンセントを得た後に実施した。肝細胞癌症例として肝細胞癌症例１９例、転移性肝癌症例として膵癌肝転移症例２例、健常者２例を対象とした。
【００９４】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の検討は、血液試料から分離した単核球試料のＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡ発現を検出することにより実施した。
【００９５】
１．単核球層の分離
まず、１０ｍｌの静脈血（以下、末梢血と称することがある）をＥＤＴＡ（ｅｔｈｉｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ）採血管にて採取し、冷凍保存した。採取後８時間以内に濃度勾配法により血液試料からの単核球層の分離処理を行った。具体的には、採取した血液試料に２５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えて希釈し、５０ｍｌの遠心管に添加した１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ ＰａｑｕｅＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の上に重層した後、１２００ｇ、４℃で３０分間遠心処理を行った。中間層の細胞を採取して新しい５０ｍｌの遠心管に移し、ＰＢＳにより３回洗浄した。洗浄は、まず２５ｍｌのＰＢＳを加えて１２００ｇ、４℃で１０分間遠心処理し、次いでペレットに２５ｍｌのＰＢＳを加えて１２００ｇ、４℃で１０分間遠心処理し、最後に１ｍｌのＰＢＳを加えて単核球をけん濁して２ｍｌの遠心管に移し１２００ｇ、４℃で２分間遠心処理することにより行った。その後、上清を捨て、ペレットのみとして−８０℃で凍結保存した。
【００９６】
２．ＲＮＡの抽出
凍結保存していたペレットからｔＲＮＡを抽出した。ｔＲＮＡの抽出は、ｔＲＮＡ抽出キット、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、添付のプロトコールにしたがって実施した。その後、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔを用いてＤＮａｓｅ処理（Ｑｉａｇｅｎ社製）を行った。得られたＲＮＡの濃度と質を吸光度計を用いて測定した。
【００９７】
３．逆転写酵素反応、Ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ−ＰＣＲ反応
１μｇのｔＲＮＡをテンプレートとして逆転写反応によりｃＤＮＡを生成した。逆転写反応は、Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付のプロトコールにしたがって実施した。
【００９８】
得られたｃＤＮＡをテンプレートとしてＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲにてＴＭ４ＳＦ４ ｃＤＮＡを増幅し検出した。ＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲはＰｌａｔｉｎｕｍＴＭ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付のプロトコールにしたがって実施した。
【００９９】
具体的には、まず、２μｌのｃＤＮＡをテンプレートとし、プライマーセットとして配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用い、アニーリング温度を５５℃とし、３５サイクルでＰＣＲ（１ｓｔ ＰＣＲ）を行った。本プライマーセットにより、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子（配列番号１）の第３９１番目から第７４０番目のヌクレオチドからなる３５０ｂｐに相当するＴＭ４ＳＦ４ ｃＤＮＡ断片が増幅される。
【０１００】
次いで、１ｓｔ ＰＣＲ産物１μｌをテンプレートとし、プライマーセットとして配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用い、アニーリング温度を５５℃とし、３５サイクルでＰＣＲ（２ｎｄ ＰＣＲ）を行った。本プライマーセットにより、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子（配列番号１）の第４２８番目から第５９５番目のヌクレオチドからなる１６３ｂｐに相当するＴＭ４ＳＦ４ ｃＤＮＡ断片が増幅される。
【０１０１】
内部コントロールとしてβ−アクチン遺伝子を採用し、その発現を検出した。β−アクチン遺伝子の発現の検出は、上記生成したｃＤＮＡをテンプレートとして用いてβ−アクチン ｃＤＮＡをＰＣＲにて増幅することにより実施した。ＰＣＲはＳｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付のプロトコールにしたがって実施した。具体的には、上記ｃＤＮＡ １μｌをテンプレートとし、プライマーセットとして配列番号１３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用い、アニーリング温度を６３℃とし、３０サイクルでＰＣＲを行った。本プライマーセットにより、２３４ｂｐのβ−アクチン ｃＤＮＡ断片が増幅される。
【０１０２】
結果を表１にまとめ、また、ＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲにより得られた結果のうち代表的な結果をいくつかの症例について図３に示す。表１および図３において、ＨＣＣ、Ｌｉｖｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、およびＣｏｎｔｒｏｌはそれぞれ、肝細胞癌症例、膵癌肝転移症例、および健常人を示す。
【０１０３】
表１に示すように、肝細胞癌症例では１９症例中１８症例で、末梢血から調製した単核球試料中にＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが検出された。一方、膵癌肝転移症例では２症例中１症例で末梢血から調製した単核球試料中にＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが検出された。これに対し、健常人由来の末梢血から調製した単核球試料中ではＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡは検出されなかった。
【０１０４】
【表１】
【０１０５】
このように、ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡは、健常人由来の末梢血から調製した単核球試料中には検出されず、肝癌症例由来の末梢血から調製した単核球試料中で検出されることが判明した。肝癌症例および健常人由来の各単核球試料中のβアクチン遺伝子の発現量はほぼ同等であることから、肝細胞癌症例由来の単核球試料中のＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの発現は、用いた試料の量の差異などによる人為的な結果ではないことは明らかである。
【０１０６】
上記結果およびＴＭ４ＳＦ４遺伝子の肝臓および膵臓における発現特異性から、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質は肝癌マーカーとして利用できると本発明者らは考えている。また、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質の検出は、血液試料を用いて行うことができるため、簡便で患者への侵襲が少なく、肝癌の検出や診断に有用性が高い。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明により、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子または該遺伝子によりコードされる蛋白質をマーカーとして用い、さらに該マーカーを検出することを特徴とする肝癌、特に肝細胞癌の検出方法または診断方法を実施できる。
【０１０８】
本マーカーの測定は、被検試料として肝組織試料のみならず血液試料を用いて実施できるため、患者への侵襲性が少く且つ簡便に実施でき有用性が高い。さらに本マーカーの測定により、従来判定が困難であった肝癌、特に肝細胞癌の判定がより確度高く且つ容易に実施され得る。
【０１０９】
このように本発明は、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子および／または該遺伝子によりコードされる蛋白質を測定することを特徴とする肝癌、特に肝細胞癌の検出方法または診断方法であって、血液試料を使用して実施できる方法を提供することができるという点において、医薬産業において非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現が、マウス肝発癌モデルにおいて発生した肝癌組織（Ｃａｒｃｉｎｏｍａと表示）において、異形成巣（Ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃと表示）や肝腺腫組織（Ａｄｅｎｏｍａと表示）および野生型マウスの肝組織（ＷＴと表示）と比較して有意に亢進していたことを示す図である。ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの定量はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより実施し、各組織中の該ｍＲＮＡ量を該ｍＲＮＡコピー数で示した。縦軸はＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡコピー数（図中、Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ４と表示）を示す。図中、各カラムの上部に示した数字は検体数を示す。
【図２】ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現が、５７症例のヒト肝細胞癌組織（Ｔｕｍｏｒと表示）において、周囲の正常肝組織（Ｎｏｒｍａｌと表示）や該癌組織周囲の肝組織（Ｎｏｎ−ｔｕｍｏｒと表示）に比べて有意に亢進していたことを示す図である。ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの定量はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより実施し、各組織中の該ｍＲＮＡ量を該ｍＲＮＡコピー数で示した。縦軸はＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡコピー数（図中、Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ４と表示）を示す。図中、各カラムの上部に示した数字は検体数を示す。
【図３】ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが、肝細胞癌症例（ＨＣＣと表示）の末梢血から調製した単核球試料で検出されたが、健常人（Ｃｏｎｔｒｏｌと表示）由来の末梢血から調製した単核球試料中では検出されなかったことを示す図である。一方、ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡは膵癌肝転移症例（Ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓと表示）２例中１例の末梢血から調製した単核球試料で検出された。ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの検出はＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲにより実施した。内部コントロールとしてβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子の発現量を同様に測定したところ、いずれの試料でもほぼ同等の発現量であった。
【配列表フリーテキスト】
【０１１１】
配列番号１：ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子。
配列番号２：ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子（配列番号１）によりコードされる蛋白質。
配列番号３：ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４：ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５：ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号７：ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号８：ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号９：マウスＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１０：マウスＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１１：マウスＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１２：マウスＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１３：ヒトβ−アクチン増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１４：ヒトβ−アクチン増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝癌検出用マーカー、特に肝細胞癌において高い発現が認められる遺伝子からなる肝癌検出用マーカーおよび該遺伝子によりコードされる蛋白質からなる肝癌検出用マーカーに関する。より詳しくは本発明は、血液試料について該マーカーを測定することを特徴とする肝癌の検出方法または診断方法に関する。また、本発明は、肝癌検出用試薬および試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌は原発性肝癌の９０％以上を占め、本邦では肺癌、胃癌、大腸癌に次いで死亡数の多い予後不良な悪性腫瘍である。また、今後約２０年間は肝細胞癌の罹患患者数が増加すると予想されている。
【０００３】
肝細胞癌はＢ型肝炎やＣ型肝炎を背景とした慢性肝炎あるいは肝硬変を発生母地として発癌することが多いとされている。そのためこれら肝炎患者はハイリスク群として認識され、厳重に経過観察される。肝炎患者の経過観察には腹部超音波検査、ＣＴ（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）検査、ＭＲＩ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ）検査などの画像検査を施行することや、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＦＰ Ｌ３分画、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｖｉｔａｍｉｎ−Ｋ Ａｂｓｅｎｃｅ−ＩＩ）などのマーカーを定期的に測定することが推奨されている。しかし、これらマーカーは必ずしも肝癌の発生に伴って陽性になる（高値を示す）とは限らず、また肝硬変に伴って上昇する場合や投与されている薬剤の影響を受ける場合もある。そのため、新しい肝癌検出用マーカーの開発が急務であるといえる。
【０００４】
トランスメンブレン４ スーパーファミリー４（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ４、以下ＴＭ４ＳＦ４と略称する）遺伝子は、肝、腸および膵臓での発現が確認されている（非特許文献１）。ラットの肝切除モデルでは肝切後にＴＭ４ＳＦ４の高発現が認められている（非特許文献２）。またラットの実験肝炎モデルで肝臓の幹細胞であると考えられている卵円形細胞（Ｏｖａｌ ｃｅｌｌ）においてＴＭ４ＳＦ４の発現が認められると報告されている（非特許文献３）。
【０００５】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質はシグナル伝達ドメインを持たず、４つの膜貫通ドメインを有する膜蛋白質であるが、その生体での働きは十分に解明されていない。ＴＭ４ＳＦ４遺伝子および該遺伝子によりコードされる膜蛋白質は、ヒト、ラットおよびマウスにおいてその配列相同性が非常に高い。
【０００６】
【非特許文献１】ワイズマン科学研究所公開データベース（http://genome-www.stanford.edu/cgi-bin/genecards/carddisp.pl?gene=TM4SF4）。
【非特許文献２】リウら（Ｌｉｕ Ｚ．ｅｔ ａｌ．）、「バイオキミカ エ バイオフィジカ アクタ（ＢＩＯＣＨＩＭＩＣＡ ＥＴ ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡ ＡＣＴＡ）」、２００１年３月１９日、第 １５１８号、第１−２号、ｐ．１８３−１８９。
【非特許文献３】キウら（Ｑｉｕ Ｊ．ｅｔ ａｌ．） 、「ジャーナル オブ ヘパトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）」、２００７年２月、第４６巻、第２号、ｐ．２６６−２７５。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、肝癌の検出用マーカーとなり得る遺伝子および蛋白質を見出し、該遺伝子および／または蛋白質をマーカーとして測定することを特徴とする肝癌の検出方法を提供し、肝癌の診断に寄与にすることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、マウス肝発癌モデルでの発癌過程において変化する遺伝子群に着目し、該遺伝子群をマイクロアレーでスクリーニングし、その結果、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現が癌組織で高くなることを見出した。また、本発明者らはマウス肝発癌モデルでＴＭ４ＳＦ４遺伝子が癌細胞に発現することを実証した。
【０００９】
さらに本発明者らは、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子がヒト肝癌患者の肝癌組織において正常肝組織に比べて高発現していることを見出した。
【００１０】
これら結果から、本発明者らはＴＭ４ＳＦ４遺伝子および該遺伝子によりコードされるポリヌクレオチドが肝癌検出用マーカーとして用いることができることを見出した。
【００１１】
さらに本発明者らは、ヒト肝細胞癌患者の末梢血単核球においてＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが検出されるが健常人の末梢血単核球では該ｍＲＮＡが検出されないことを実証した。
【００１２】
上記結果から、血液試料についてＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することにより、肝癌の検出および診断を実施できることを見出し、本発明を達成した。
【００１３】
すなわち本発明は、血液試料におけるＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌の検出方法に関する。
【００１４】
また本発明は、血液試料におけるＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌の検出方法であって、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定を該遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイゼーションするプライマーまたはプローブを用いて実施することを含む方法に関する。
【００１５】
さらに本発明は、血液試料におけるＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌の検出方法であって、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定を下記プライマーセットのうちの少なくともいずれか１を用いて実施することを含む方法に関する：
（１）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセット、
（２）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセット、および
（３）配列表の配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセット。
【００１６】
さらにまた本発明は、血液試料におけるＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌の検出方法であって、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定が下記工程を含むことを特徴とする方法に関する：
（ｉ）ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｃＤＮＡの断片ポリヌクレオチドを配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットにより増幅して一次増幅産物を形成させる工程、
（ｉｉ）該一次増幅産物の断片ポリヌクレオチドを配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットにより増幅して二次増幅産物を形成させる工程、および
（ｉｉｉ）該二次増幅産物を検出する工程。
【００１７】
また本発明は、血液試料におけるＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌の検出方法であって、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定を該遺伝子によりコードされる蛋白質を測定することにより実施することを含む方法に関する。
【００１８】
さらに本発明は、血液試料におけるＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌の検出方法であって、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定を該遺伝子によりコードされる蛋白質を該蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて測定することにより実施することを含む方法に関する。
【００１９】
さらにまた本発明は、血液試料から単核球を調製し、該単核球を試料として用いることを特徴とする上記いずれかの肝癌の検出方法に関する。
【００２０】
また本発明は、配列表の配列番号３から８のいずれか１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドに関する。
【００２１】
さらに本発明は、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、並びに該遺伝子によりコードされる蛋白質に特異的に結合する抗体のうち１つまたは２つ以上を含む肝癌検出用試薬キットに関する。
【００２２】
さらにまた本発明は、配列表の配列番号３から８のいずれか１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうち１つまたは２つ以上を含む肝癌検出用試薬キットに関する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌、特に肝細胞癌の検出方法を提供でき、さらに肝癌、特に肝細胞癌の診断方法を実施できる。本発明に係る肝癌の検出方法または診断方法は、肝組織試料のみならず血液試料を試料として使用して実施できるため、被験対象への侵襲性が極めて少なく且つ容易に実施できる有用な方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、肝癌の検出方法に関する。本発明に係る肝癌の検出方法は、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子および／または該遺伝子によりコードされる蛋白質（以下、ＴＭ４ＳＦ４と称することがある）を肝癌検出用マーカーとして測定することを特徴とする。すなわち、本発明は、調べようとする試料（以下、被験試料と称する）におけるＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌の検出方法に関する。
【００２５】
本発明者らは、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子がヒト肝癌患者の肝癌組織において正常肝組織に比べて高発現していることを見出し、さらに、ヒト肝細胞癌患者の末梢血単核球においてＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが検出されるが健常人の末梢血単核球では該ｍＲＮＡが検出されないことを実証した。ＴＭ４ＳＦ４遺伝子がヒト肝癌患者の肝癌組織や末梢血単核球において高発現していることから、肝癌患者の肝癌組織や末梢血単核球において該遺伝子によりコードされる蛋白質も検出されると考えることができる。
【００２６】
上記実証結果から、本発明者らは、血液試料についてＴＭ４ＳＦ４遺伝子および／または該遺伝子によりコードされる蛋白質を肝癌検出用マーカーとして測定することにより、肝癌、好ましくは肝細胞癌の検出および診断を実施できることを見出した。
【００２７】
本発明において、「遺伝子」という用語は、全長遺伝子、およびその一部分からなるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを意味する総称的用語として使用され、また、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡを含み、ここでその最小サイズは２ヌクレオチドである。
【００２８】
「遺伝子の発現」とは、遺伝子の情報がｍＲＮＡに転写されること、または、ｍＲＮＡに転写され、かつ蛋白質のアミノ酸配列として翻訳されることをいう
【００２９】
「遺伝子の発現を測定すること」には、該遺伝子のｍＲＮＡを測定することおよび該遺伝子によりコードされる蛋白質を測定することが包含される。
【００３０】
「遺伝子のｍＲＮＡを測定すること」には、ｍＲＮＡの有無を検出することおよびｍＲＮＡ量を測定することが包含される。
【００３１】
本発明において、「蛋白質」という用語は、完全長蛋白質、およびその一部分からなるポリヌクレオチドまたはオリゴペプチドを意味する総称的用語として使用され、ここで蛋白質、ポリペプチドまたはオリゴペプチドは最小サイズが２アミノ酸である。
【００３２】
「蛋白質を測定すること」には、蛋白質の有無を検出することおよびその量を測定することが包含される。
【００３３】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子は既に公開されており、例えば公開されたデータベース（ＧｅｎＢａｎｋなど）において、ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子がアクセッション番号ＮＭ＿００４６１７．２（配列番号１）として登録されている。また、ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質は、該アクセッション番号に開示されている（配列番号２）。
【００３４】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに限定されず、該ポリヌクレオチドと配列相同性を有し、且つ該ポリヌクレオチドと同等の組織発現を示すといった特徴を有するポリヌクレオチド、また、これら特徴に加えて配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同等の生物学的機能や構造的特徴を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを包含する。配列相同性は、通常、塩基配列の全体で約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらにより好ましくは約９５％以上であることが望ましい。
【００３５】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の組織発現は、肝、腸および膵臓で認められている。また、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子は、上記のようにヒト肝癌患者の肝癌組織において正常肝組織に比べて高発現している。このように、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子には、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列相同性を有し、且つ肝、腸および膵臓、特に肝でその発現が認められるポリヌクレオチドが包含される。
【００３６】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質の構造的特徴として、そのアミノ酸配列に４つの膜貫通ドメインを有することが知られている。したがって、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子には、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列相同性を有し、肝、腸および膵臓、特に肝でその発現が認められ、且つ４つの膜貫通ドメインを有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドが包含される。
【００３７】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子には、配列番号１で表される塩基配列において１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個〜５個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが包含される。変異の程度およびそれらの位置などは、該変異を有するポリヌクレオチドが、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと同等の組織発現を示すといった特徴を有するポリヌクレオチド、また、該特徴に加えて配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同等の生物学的機能や構造的特徴を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限り特に制限されない。
【００３８】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子には、上記ポリヌクレオチドの塩基配列の指定された領域に存在する部分塩基配列からなるポリヌクレオチドが包含される。上記ポリヌクレオチドの塩基配列の指定された領域に存在する部分塩基配列からなるポリヌクレオチドは、その最小単位として好ましくは該領域において連続する５個以上のヌクレオチド、より好ましくは１０個以上のヌクレオチド、より好ましくは２０個以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームである第２３２番目から第８４０番目までの連続した６０９ヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを例示できる。
【００３９】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子には、また、上記ポリヌクレオチドまたはその一部分にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドが包含される。これらポリヌクレオチドは上記ポリヌクレオチドまたはその一部分にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドであれば相補的配列を有するポリヌクレオチドでなくてもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件はよく知られており、例えば成書に記載の条件（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー、特に１１．４５節“Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ”など）にしたがって決定でき、特に制限されない。ストリンジェントな条件は、塩濃度、温度、およびその他の条件によって決まり、例えば、塩濃度が低いほど、温度が高いほど、ストリンジェンシーは高くなり、ハイブリダイゼーションしにくくなる。塩濃度は、一般に、ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ＋クエン酸三ナトリウム）の濃度を調節することによって調節され、ストリンジェントな塩濃度は、例えば、ＮａＣｌ 約２５０ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム 約２５ｍＭ以下である。ストリンジェントな温度は、一般に、完全ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より１５〜２５℃低い温度であり、例えば、約３０℃以上である。溶液に有機溶媒（例えばホルムアミド）を加えることにより、温度を下げることができる。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、およびキャリアーＤＮＡの存否などであり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。好ましい例として、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ クエン酸三ナトリウム、１％ ＳＤＳ、５０％ ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの条件で、４２℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。好ましい例として、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ クエン酸三ナトリウムおよび０．１％ ＳＤＳの条件で、６８℃の温度により洗浄を行う。
【００４０】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに限定されず、該ポリペプチドと配列相同性を有し、且つ該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同等の組織発現を示すポリヌクレオチドによりコードされるといった特徴を有するポリペプチド、また、これら特徴に加えて配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物学的機能や構造的特徴を有する蛋白質をコードするポリペプチドを包含する。配列相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、さらにより好ましくは約９５％以上であることが望ましい。
【００４１】
ＴＭ４ＳＦ４をコードする遺伝子の組織発現は、肝、腸および膵臓で認められている。また、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子は、上記のようにヒト肝癌患者の肝癌組織において正常肝組織に比べて高発現している。このように、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質には、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列相同性を有し、且つ肝、腸および膵臓、特に肝でその発現が認められるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが包含される。
【００４２】
ＴＭ４ＳＦ４の構造的特徴として、そのアミノ酸配列に４つの膜貫通ドメインを有することが知られている。したがって、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質には、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列相同性を有し、肝、腸および膵臓、特に肝でその発現が認められるポリヌクレオチドによりコードされ、且つ４つの膜貫通ドメインを有するポリペプチドが包含される。
【００４３】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質には、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個〜５個のアミノ酸残基の欠失、置換、付加または挿入といった変異が存するアミノ酸配列で表わされるポリペプチドが包含される。変異の程度およびそれらの位置などは、該変異を有するポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子と同等の組織発現を示すといった特徴を有するポリペプチド、また、該特徴に加えて配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の生物学的機能や構造的特徴を有する蛋白質をコードするポリペプチドである限り特に制限されない。
【００４４】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質には、上記ポリペプチドのアミノ酸配列の指定された領域に存在する部分アミノ酸配列からなるポリペプチドまたはオリゴペプチドが包含される。上記ポリペプチドのアミノ酸配列の指定された領域に存在する部分アミノ酸配列からなるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、その最小単位として好ましくは該領域において連続する５個以上のアミノ酸残基、より好ましくは１０個以上のアミノ酸残基、より好ましくは２０個以上のアミノ酸残基からなるポリペプチドまたはオリゴペプチドである。
【００４５】
本発明において、「癌マーカー」という用語は、腫瘍マーカーという用語と置換可能に使用される。癌マーカーとは、癌性増殖または癌細胞や癌の存在あるいはその程度を示す指標を意味する。言い換えれば、癌細胞が有する物質若しくは産生する物質であって正常細胞のものと比較して量的に著しく多い若しくは少ないなどの変化を示す物質または変異している物質、あるいは癌細胞と反応して体内の正常細胞が産生する物質のうちで、それらを検出することにより癌の判定が可能になるものを意味する。癌マーカーは、対象とする癌に特異的であることが好ましいが、完全に特異的である必要はなく、癌の検出が可能である限りにおいて、他の疾患や臓器において検出されるものであってもよい。ここで、「対象とする癌に特異的である」とは、対象とする癌を高い感度で検出することができるが、それ以外の癌は検出できないか、あるいは検出感度が著しく低いことを意味する。また、「対象とする癌に完全に特異的である」とは、対象とする癌のみを検出することができ、それ以外の癌は検出できないことを意味する。
【００４６】
本発明において、「癌」という用語は、悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ）という用語と置換可能に使用される。癌は、種々の悪性新生物、すなわち細胞の異常増殖を伴い転移性や浸潤性を示す腫瘍を意味する。転移性とは、原発部位から解剖学的に隔たっている部位へ移動し移動した部位で腫瘍を形成する能力を意味する。浸潤性とは、腫瘍が形成された部位からその周囲の組織に侵入する能力を意味する。悪性新生物は一般的に、それを構成する細胞が正常細胞と比較して形態的に異なり、また、細胞の配列が正常組織と比較して異なるために、正常組織と識別可能な組織塊として形成されることが多い。
【００４７】
「肝癌」とは肝臓に発生する悪性新生物を意味し、原発性肝癌および原発性肝癌から転移した肝癌を含む。原発性肝癌とは、肝臓に発生した悪性新生物であって、他の臓器からの転移によるものではない悪性新生物を意味する。
【００４８】
「肝細胞癌」は原発性肝癌の１種であり、原発性肝癌の９０％以上を占める予後不良な悪性腫瘍である。
【００４９】
「肝癌を検出する」とは、被験試料が肝癌由来の被験試料であるか否かを決定することを意味する。
【００５０】
本発明者らは、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子がヒト肝癌患者の肝癌組織において正常肝組織に比べて高発現していることを見出し、さらに、ヒト肝細胞癌患者の末梢血単核球においてＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが検出されるが健常人の末梢血単核球では該ｍＲＮＡが検出されないことを実証した。ＴＭ４ＳＦ４遺伝子がヒト肝癌患者の肝癌組織や末梢血単核球において高発現していることから、肝癌患者の肝癌組織や末梢血単核球において該遺伝子によりコードされる蛋白質も検出されると考えることができる。
【００５１】
すなわち、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡおよび該遺伝子によりコードされる蛋白質は、肝癌組織において正常肝組織に比べて増加しているといえる。また、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡおよび該遺伝子によりコードされる蛋白質は、肝細胞癌患者の末梢血単核球において、検出可能なレベルで存在するといえる。一方、健常人末梢血単核球においては、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡおよび該遺伝子によりコードされる蛋白質は著しく低レベルまたは検出不可能なレベルで存在するといえる。
【００５２】
したがって、被験試料において、増加したレベルのＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡおよび／または該遺伝子によりコードされる蛋白質が検出された場合、該被験試料は肝癌由来の試料であると決定できる。あるいは、血液試料から調製した細胞、より好ましくは血液試料から調製した単核球において、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡおよび／または該遺伝子によりコードされる蛋白質が検出された場合、該血液試料は肝癌患者由来の血液試料であると決定できる。ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡおよび／または該遺伝子によりコードされる蛋白質が増加したか否かの判断は、正常肝組織や健常人由来の血液試料との比較により実施することができる。あるいは、このような判断は、あらかじめ正常肝組織や健常人由来の血液試料において検出されるＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡおよび／または該遺伝子によりコードされる蛋白質の標準値を測定して決定し、該標準値との比較により実施することができる。
【００５３】
被験試料として血液試料、好ましくは血液試料から調製した細胞、より好ましくは血液試料から調製した単核球を用いる場合、肝細胞癌患者の末梢血単核球においてＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが検出されるが健常人の末梢血単核球では該ｍＲＮＡが検出されなかったことから、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡおよび／または該遺伝子によりコードされる蛋白質が検出された場合、健常人由来の血液試料や上記標準値と比較することなく、該血液試料は肝癌由来の試料であると決定できる。
【００５４】
被験試料は、特に制限されず、例えば、血液、細胞、尿、唾液、髄液、生検組織または剖検材料などの生体生物由来の試料を例示できる。ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質が４つの膜貫通ドメインを有する膜蛋白質であることが知られていることから、被験試料は、細胞を含む試料であることが適当である。本発明者らは、ヒト肝細胞癌患者の末梢血単核球においてＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが検出されるが健常人の末梢血単核球では該ｍＲＮＡが検出されないことを実証した。このことから、被験試料として、好ましくは血液試料、より好ましくは血液試料から調製された細胞、さらに好ましくは血液試料から調製された単核球が適当である。「単核球」とは、単核細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）とも称される単核の間葉系細胞群であり、結合組織、リンパ組織および血流中に広く分布する。単核球は、単球やリンパ球に代表される遊走単核白血球と、組織中に存在するマクロファージに代表される単核貪食系細胞に分類される。被験試料として生検組織も用いられるが、生検組織の採取は患者への侵襲性が高く負担が大きい。これに対し、血液試料の採取は患者への侵襲性が低く且つ容易に実施できるという利点を有する。
【００５５】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定は、公知の遺伝子検出法を用いて実施できる。遺伝子検出法として具体的には、サザンブロット法、ノザンブロット法、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）法、プラークハイブリダイゼーション、またはコロニーハイブリダイゼーションなどを例示できる。また、ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲや ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定を用いることもできる。目的遺伝子の検出に用いることのできる方法は上記方法に限定されず、自体公知の遺伝子検出法がいずれも使用可能である。
【００５６】
遺伝子検出法においては、遺伝子の検出、遺伝子の発現量の測定、および遺伝子の増幅の実施に、プローブとしての性質を有するポリヌクレオチドまたはプライマーとしての性質を有するオリゴヌクレオチドが有用である。
【００５７】
プライマーとしての性質を有するオリゴヌクレオチドとは、目的の遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションして該遺伝子を増幅できる、該遺伝子特有の配列で表されるものを意味する（以下、プライマーと称する）。プローブとしての性質を有するポリヌクレオチドとは、目的の遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションできる、該遺伝子特有の配列で表されるものを意味する（以下、プローブと称する）。ここで、「目的の遺伝子を特異的に増幅できる」とは、目的の遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションして増幅産物を形成できるが、それ以外の遺伝子の増幅産物は形成できないか、あるいは増幅産物量が少ないことを意味する。また、「目的の遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションできる」とは、目的の遺伝子とのハイブリダイゼーション産物を形成できるが、それ以外の遺伝子とのハイブリダイゼーション産物を形成できないか、あるいはハイブリダイゼーション産物量が少ないことを意味する。
【００５８】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の検出、該遺伝子の発現量の測定、および該遺伝子の増幅は、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションするプライマーまたはプローブを用いて実施できる。例えば、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡの検出、該遺伝子のｍＲＮＡ量の測定、および該遺伝子のｍＲＮＡ量の増幅は、該遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイゼーションするプライマーまたはプローブを用いて実施できる。
【００５９】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーは、該遺伝子の少なくとも一部を増幅し得るものであればよい。また、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブは、該遺伝子の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズし得るものであればよい。プライマーおよびプローブは、公知の手法に従ってＴＭ４ＳＦ４遺伝子の配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により得ることができる。プライマーは、塩基配列長が一般的に５〜５０ヌクレオチド程度であるものが好ましく、１０〜３５ヌクレオチド程度であるものがより好ましく、１５〜３０ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。プローブは、塩基配列長が一般的に１５ヌクレオチド以上であるものが好ましく、１５〜１０００ヌクレオチド程度であるものがより好ましく、５０〜５００ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。プローブは、通常は標識化したプローブを用いるが、非標識のものであってもよい。プローブを標識化する方法は、種々の方法が知られており、具体的には、ニックトランスレーション、ランダムプライミングまたはキナーゼ処理を利用する方法を例示できる。適当な標識物質として、ジゴキシゲニン、放射性同位体、ビオチン、蛍光物質、化学発光物質、酵素、タグペプチド、抗体を例示できる。
【００６０】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーとして、具体的には配列番号３〜８のいずれか１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを例示できる。これらプライマーは、好ましくは、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとから構成されるプライマーセット、配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとから構成されるプライマーセット、および配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとから構成されるプライマーセットで使用されることが適当である。これらオリゴヌクレオチドは、配列番号１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの配列情報に基づいて設計し合成することにより作成した。
【００６１】
プライマーとしての性質を有するオリゴヌクレオチドまたはプローブとしての性質を有するポリヌクレオチドを用いてそれぞれ増幅反応またはハイブリダイゼーション反応を行い、その増幅産物またはハイブリッド産物を検出することにより、遺伝子の検出を実施できる。
【００６２】
増幅反応またはハイブリダイゼーション反応を行う場合には、通常は、被験試料からポリヌクレオチドを調製することが好ましい。調製するポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれでもよい。被験試料からのポリヌクレオチドの調製は、公知の方法を適宜使用して実施できる。例えば、ＲＮＡを調製する場合は、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、またはチオシアン酸グアニジン−フェノール−クロロホルム（ＡＧＰＣ）法などが、また、ＤＮＡを調製する場合は、フェノール抽出およびエタノール沈殿による方法、ガラスビーズを用いる方法などを利用できる。その他、市販のＲＮＡ抽出試薬やＲＮＡ抽出キット、またはＤＮＡ抽出試薬やＤＮＡ抽出キットを使用して、ＲＮＡやＤＮＡの調製を実施できる。被験試料からＲＮＡを調製した場合、さらに該ＲＮＡをテンプレートとして逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを調製して増幅反応に用いることができる。逆転写反応によるＲＮＡからのｃＤＮＡの調製方法は、周知であり、また、市販のＲＴ−ＰＣＲ用キットなどを用いて実施できる。
【００６３】
増幅反応は、所望のポリヌクレオチドを増幅し得る公知の増幅法を用いて実施できる。増幅法は、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。ＰＣＲは、所望のポリヌクレオチドを特異的に増幅できるプライマーを用いる方法である限り、従来公知の方法のいずれも使用できる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ネスティッドＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、および競合ＰＣＲを用いることができ、その他、当該分野で用いられる種々のＰＣＲの変法を適応できる。その他の増幅法として、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などが知られており、いずれも用いることができる。
【００６４】
ＰＣＲによれば、ＤＮＡをテンプレートとし、ＤＮＡポリメラーゼにより該ＤＮＡの塩基配列中の特定部位のみを繰り返し複製することにより、該特定部位の塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅することができる。このとき、複製反応のプライマーとして、該特定部位の一方の端の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび他方の端の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを該ＤＮＡの塩基配列から設計して作成し、プライマーセットとして用いる。
【００６５】
ＲＴ−ＰＣＲによれば、ＲＮＡをテンプレートとし、逆転写反応酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によりｃＤＮＡを作成し、その後、作成したｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行うことにより、該ｃＤＮＡの該特定部位の塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅することができる。
【００６６】
ネスティッドＰＣＲによれば、ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲで増幅されたポリヌクレオチドをテンプレートとして、該増幅されたポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計し作成されたプライマーセットを用いてＤＮＡポリメラーゼにより複製反応を行うことにより、該増幅されたポリヌクレオチドの特定部位の塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅することができる。ネスティッドＰＣＲは、所望のＤＮＡのみをより確実に増幅する目的で使用される。
【００６７】
リアルタイムＰＣＲによれば、ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲによる増幅を経時的に測定することにより、増幅率に基づいてテンプレートＤＮＡの初期量を定量できる。リアルタイムＰＣＲは蛍光色素を用いて行われ、二種類の方法がある。一方は、互いに干渉しあう２種類の蛍光色素で標識した配列特異的プローブを用いる方法（ＴａｑＭａｎ法）であり、もう一方は二本鎖ＤＮＡにインターカレートしたときのみ蛍光を発する色素、例えばエチジウムブロマイド、ＳＹＢＲＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎなどを用いる方法である。ＴａｑＭａｎ法では、５´末端を蛍光色素（レポーター）で、３´末端を消光剤（クエンチャー）で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするプローブが使用される。プローブは通常の状態ではクエンチャーによりレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子にハイブリダイズさせた状態で、その外側からＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによる伸張反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが５´末端から加水分解され、その結果、レポーター色素が遊離して蛍光を発する。この蛍光の強度を経時的に測定することによりテンプレートＤＮＡの初期量を定量できる。リアルタイムＰＣＲはＲＴ−ＰＣＲと組み合わせて用いること（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）により、少量のｍＲＮＡの定量が可能になる。
【００６８】
競合ＰＣＲによれば、所望のｍＲＮＡを検出するためのプライマーと相補的な配列を有し、分子量あるいは制限酵素切断部位が標的ｍＲＮＡと異なる、既知量の競合テンプレートＲＮＡを試料中に加え、ＲＴ−ＰＣＲ後にＰＣＲを行い、生成した所望のｍＲＮＡ由来増幅産物量および競合鋳型テンプレート由来の増幅産物量を比較することにより、所望のｍＲＮＡを定量することができる。
【００６９】
増幅反応により得られる増幅産物が所望のポリヌクレオチドであるか否かは、該増幅産物を特異的に認識することができる公知の方法を用いて検出できる。例えば、アガロースゲル電気泳動法などを利用して、特定のサイズのポリヌクレオチドが増幅されているか否かを確認することができる。あるいは、増幅反応の過程で増幅産物に取り込まれるデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）に標識物質を標識しておき、増幅産物に取り込まれたｄＮＴＰの標識物質を測定することにより、増幅産物を検出することができる。標識物質としては、蛍光物質、例えばフルオレセイン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＳＲ）およびテトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）など、発光物質、例えばルシフェリンなど、並びに放射性同位体、例えば３２Ｐ、３５Ｓおよび１２１Ｉなどを例示できる。これら標識物質による標識の方法および標識物質の検出方法は、特に制限されることはなく、従来公知の各種方法を適用することができる。
【００７０】
ハイブリダイゼーション反応は、所望のポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションし得るプローブを用いて、プローブが該ポリヌクレオチドと特異的に反応するような条件で行う。プローブが該ポリヌクレオチドと特異的に反応するような条件、すなわちストリンジェントな条件は、上記のようによく知られており、特に制限されない。
【００７１】
ハイブリダイゼーション反応に用いるプローブに標識物質を標識しておき、ハイブリダイゼーション反応後に標識物質を測定することにより、ハイブリダイゼーション産物を検出することができる。標識物質としては、蛍光物質、例えばフルオレセイン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＳＲ）およびテトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）など、発光物質、例えばルシフェリンなど、放射性同位体、例えば３２Ｐ、３５Ｓおよび１２１Ｉなど、酵素、例えばアルカリホスファターゼおよびホースラディシュパーオキシダーゼなど、並びにビオチンを例示できる。これら標識物質による標識の方法および標識物質の検出方法は、特に制限されることはなく、従来公知の各種方法を適用することができる。
【００７２】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子を肝癌検出用マーカーとして測定することを特徴とする肝癌の検出方法の具体例を以下に説明する。まず、血液試料から単核球を調製する。単核球の分離は、公知の方法を用いて行うことができ、例えば比重遠心法などの方法により実施できる。次いで、単核細胞よりＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡをテンプレートとし逆転写反応によりｃＤＮＡを生成する。ＲＮＡの抽出および逆転写反応によるｃＤＮＡの生成は、上記ポリヌクレオチドの調製方法およびｃＤＮＡの生成方法にしたがって実施できる。得られたｃＤＮＡをテンプレートとしてネスティッドＰＣＲによりＴＭ４ＳＦ４ ｃＤＮＡの断片ポリヌクレオチドを増幅して検出する。ネスティッドＰＣＲは、得られたｃＤＮＡをテンプレートとして、例えば配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用いて１ｓｔ ＰＣＲを行い、その後、１ｓｔ ＰＣＲ産物をテンプレートとして、例えば配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用いて２ｎｄ ＰＣＲを行うことにより実施できる。プライマーセットはこれらに制限されず、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の塩基配列に基づいて適宜設計し合成したものを使用できる。２ｎｄ ＰＣＲ産物を電気泳動により分離し、上記プライマーセットを用いてネスティッドＰＣＲにより増幅されると予想されるＴＭ４ＳＦ４ ｃＤＮＡの断片ポリヌクレオチドのサイズに相当する部位のバンドを検出する。このようなバンドが検出された場合、血液試料から調製された単核球にはＴＭ４ＳＦ４遺伝子が発現していると判定でき、さらにＴＭ４ＳＦ４遺伝子が発現していることが確認された血液試料は肝癌由来の血液試料であると判定できる。
【００７３】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子を肝癌検出用マーカーとして測定することを特徴とする肝癌の検出方法はまた、被験試料からＲＮＡを抽出し、該ＲＮＡを用いて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより実施できる。ここで用いるプライマーセットとして、例えば配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを例示できる。プライマーセットはこれらに制限されず、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の塩基配列に基づいて適宜設計し合成したものを使用できる。
【００７４】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質の測定は、この分野における慣用技術による蛋白質検出法あるいは定量法を用いて行うことができる。例えば、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル抗体）を用いて目的蛋白質の検出や定量を実施できる。具体的には、被験試料から蛋白質画分を調製し、目的蛋白質に対する特異抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法またはイムノブロット法で目的蛋白質の解析を行うことにより、上記検出が可能である。また、目的蛋白質に対する抗体を用いて、免疫組織化学的技術によりパラフィンまたは凍結組織切片中の目的蛋白質を検出することができる。あるいは、目的蛋白質に対する抗体を用いて、細胞染色により細胞上の目的蛋白質を検出することができる。目的蛋白質またはその変異体を検出する方法の具体例としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ法、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）、免疫酵素法（ＩＥＭＡ）、競争結合アッセイ、免疫蛍光法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、およびプロテインチップによる解析法などが挙げられる。抗体はＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質あるいは該蛋白質の断片蛋白質を抗原として用いて自体公知の抗体作製法を利用できる。ポリクローナル抗体は、免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得できる。好ましい抗体回収手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が挙げられる。モノクロ−ナル抗体は、免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株などのミエローマ株）への形質転換手段を導入することにより生産できる。
【００７５】
本発明に係る検出方法は、肝癌、好ましくは肝細胞癌の検出に有効である。本発明に係る検出方法を用いて肝癌、好ましくは肝細胞癌の診断を実施できる。したがって、本発明に係る検出方法を用いる肝癌、好ましくは肝細胞癌の診断方法も本発明の範囲に包含される。肝癌の診断を行う場合、本発明に係る検出方法を実施するとともに、従来行われているマーカー、例えばＡＦＰ、ＡＦＰ Ｌ３分画、ＰＩＶＫＡ−ＩＩなどの測定や、血液検査、例えば全血球計算（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｕｎｔ、ＣＢＣ）、肝機能検査、腎機能検査などを実施し、それらの結果と比較検討することにより肝癌の判定ができる。また、摘出標本や細胞診がある場合には、その結果と比較検討することにより肝癌の判定ができる。
【００７６】
本発明はまた、肝癌、好ましくは肝細胞癌の検出に用いる試薬および試薬キットに関する。
【００７７】
本発明に係る試薬として、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子または該遺伝子の断片ポリヌクレオチドを特異的に増幅し得るプライマーとしての性質を有するオリゴヌクレオチド、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子または該遺伝子の断片ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブとしての性質を有するポリヌクレオチド、およびＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質に特異的に結合する抗体を挙げることができる。例えば、本発明に係る試薬として、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを例示できる。具体的には、例えば、本発明に係る試薬として、配列番号３から８のいずれか１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを例示できる。本発明に係る試薬は、標識物質により予め標識されたものであることができる。標識物質として、上述の蛋白質や放射性同位元素を例示できる。本発明に係る試薬は、緩衝液、塩、安定化剤、および／または防腐剤などの物質を含むことができる。製剤化にあたっては、各物質の性質に応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。本発明に係る試薬は、本発明に係る肝癌の検出方法や該検出方法を用いた肝癌の診断方法に使用できる。ここで「ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質に特異的に結合する」とは、該蛋白質に結合するが、それ以外の蛋白質には結合しないか弱く結合することを意味する。
【００７８】
本発明に係る試薬キットとして、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子または該遺伝子の断片ポリヌクレオチドを特異的に増幅し得るプライマーとしての性質を有するオリゴヌクレオチド、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子または該遺伝子の断片ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブとしての性質を有するポリヌクレオチド、およびＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質に特異的に結合する抗体のうちの少なくともいずれか１つを含む試薬キットを挙げることができる。例えば、本発明に係る試薬キットとして、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、並びに該遺伝子によりコードされる蛋白質に特異的に結合する抗体のうちの少なくともいずれか１つを含む試薬キットを例示できる。具体的には、例えば、本発明に係る試薬キットとして、配列番号３から８のいずれか１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを含む試薬キットを例示できる。好ましくは、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとのセット、配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとのセット、および配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとのセットから選ばれるいずれか１つのセットを含む試薬キットを例示できる。より好ましくは、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとのセット、および配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドとのセットを含む試薬キットを例示できる。本発明に係る試薬キットは、その他に本発明の検出方法の実施に有用な物質、例えば標識物質、標識物質の検出剤、反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤および反応停止液などを含むことができる。標識物質として、上述の蛋白質や放射性同位元素を例示できる。標識物質は、予めポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、あるいは抗体に付加されていてもよい。本発明に係る試薬キットは、本発明に係る肝癌の検出方法や該検出方法を用いた肝癌の診断方法に使用できる。また、本発明に係る試薬キットは、肝癌、好ましくは肝細胞癌の判定用キットおよび診断用キットとして使用できる。
【００７９】
本発明はまた、肝癌、好ましくは肝細胞癌の検出に用いるＤＮＡチップに関する。本発明において、ＤＮＡチップと言う用語はＤＮＡアレイという用語と置換可能に使用される。本発明に係るＤＮＡチップは、ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡとハイブリダイゼーションし得るポリヌクレオチドをシリコンやガラスなどの基板上に固定化することにより製造できる。ＤＮＡの基板への固定化は、周知方法を用いて実施できる（シェーナ（Ｓｈｅｎａ Ｍ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９５年、第２７０巻、第５２３５号、ｐ．４６７−４７０）。
【実施例１】
【００８０】
マウス肝発癌モデルでの発癌過程において変化する遺伝子群をＤＮＡマイクロアレイを用いてスクリーニングした。
【００８１】
具体的には、ｃ−ｍｙｃ／ＴＧＦ−αダブルトランスジェニックマウス（ムラカミら（Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｈ． ｅｔ．ａｌ．）、「キャンサーリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９３年、第５３巻、第８号、ｐ．１７１９−１７２３）を用い、本モデルマウスにおいて発生した肝腫瘍のうち２０個を採取し、ＴＲＩＺＯＬＴＭにてＲＮＡを抽出した。この時、腫瘍を最大割面で切断して約３ｍｍの厚さの組織切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色標本（ＨＥ標本）を作成した。
【００８２】
ＨＥ標本で確認した癌および腺腫をそれぞれ１０個選択し、それぞれからトータルＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を２０μｇずつ調製し、試料として用いた。癌から調製した試料および腺腫ら調製した試料を、それぞれをＣｙ５およびＣｙ３で標識した。標識はＡｔｌａｓ ｇｌａｓｓ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて行った。標識した試料をＡＴＣ２．６Ｋ ｍｏｕｓｅ Ｏｎｃｏ−ｃｈｉｐ（ＡＴＣ、ＮＣＩ）上でハイブリダイゼーションし、３７℃で４８時間インキュベーションした。ハイブリダイゼーションは、添付のプロトコールにしたがって行った。
【００８３】
その結果、マウス肝発癌モデルにおいて発生した肝癌組織において、肝腺腫組織と比較してＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが高発現となっていることが判明した。
【実施例２】
【００８４】
ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの発現を、マウス肝発癌モデルにおいて発生した肝臓腫瘍と正常マウスの肝組織について比較検討した。本検討においては、各組織におけるＴＭ４ＳＦ４の発現をｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法（ＩＳＨと略称することがある）により検出するとともに、ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡのコピー数をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した。
【００８５】
具体的には、ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの発現を、ｃ−ｍｙｃ／ＴＧＦ−αダブルトランスジェニックマウスにおいて発生した肝臓の異形成巣、肝腺腫および肝癌、並びに野生型マウス（ＷＴと略称することがある）の肝組織を用いて比較検討した。
【００８６】
ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションによる組織発現の検出は、各組織から作成した組織切片を用い、下記のように作成したプローブを用いてノーザンブロット法により実施した。プローブの作成のため、まずマウスＩｍａｇｅ：４２３２０４クローンをＲｅｓＧｅｎ社より購入し、該クローンについてＴ３およびＴ７プライマーを用いてシーケンスを行い、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子が含まれていることを確認した。該クローンをテンプレートとし、配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１０に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、２７９ｂｐのＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物を電気泳動に付し、得られたバンドを切り出して精製し、得られたポリヌクレオチドをプローブ（以下、マウスＴＭ４ＳＦ４プローブと称する）として用いた。各組織よりＲＮＡをＴＲＩＺＯＬＴＭにて抽出し、その１５μｌを電気泳動に付した後にメンブレンに転写し、次いで３２Ｐで標識したマウスＴＭ４ＳＦ４プローブをハイブリダイゼーションさせた。
【００８７】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡのコピー数の測定は、上記組織発現の検出に用いたＲＮＡと同じＲＮＡを用いて行った。まず、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、添付のプロトコールにしたがって１μｇのｔＲＮＡをテンプレートとして逆転写反応を行ってｃＤＮＡを生成した。次いで、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。プライマーセットとして配列番号１１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用いた。本プライマーセットにより、１０２ｂｐのマウスＴＭ４ＳＦ４ ｃＤＮＡ断片が増幅される。
【００８８】
上記検討の結果、ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡのコピー数は、マウス肝発癌モデルにおいて発生した肝癌組織において、異形成巣や肝腺腫組織および野生型マウスの肝組織と比較して有意に増加していることが判明した（図１）。また、ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡは、正常肝組織においてグリソンと中心静脈域に発現しており、肝癌組織においてその発現が増加していることが判明した。
【００８９】
上記結果から、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子は肝腺腫から肝癌へ発癌する過程でその発現が増加する遺伝子であると判定された。
【実施例３】
【００９０】
ヒト肝細胞癌の肝癌組織におけるＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの発現を、該肝癌組織周囲の肝組織および正常肝組織における発現と比較検討した。組織試料として、ヒト肝癌組織ライブラリー（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）の５７症例を用いた。各組織からＲＮＡをＴＲＩＺＯＬＴＭにて抽出し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーセットとして配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用いた。本プライマーセットにより、１０２ｂｐのＴＭ４ＳＦ４ ｃＤＮＡ断片が増幅される。
【００９１】
上記検討の結果、５７症例のヒト肝細胞癌組織中のＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの発現は、該癌組織周囲の肝組織や正常肝組織に比べて有意に増加していることが判明した（図２）。また、当該５７症例のうち４５．３％の症例で、癌組織におけるＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの発現が該癌組織周囲の肝組織に比べて２倍以上亢進していた。
【００９２】
このように、ヒト肝癌症例においても、肝癌組織におけるＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現が該肝癌組織周囲の肝組織や正常肝組織と比較して著しく高いことが明らかになった。これら結果から、本発明者らは、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質は肝癌マーカーとして肝癌の検出に利用できると考えている。
【実施例４】
【００９３】
原発性肝癌症例、転移性肝癌症例および健常者から採取した血液試料を対象にＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現を比較検討した。血液試料の採取は、インフォームドコンセントを得た後に実施した。肝細胞癌症例として肝細胞癌症例１９例、転移性肝癌症例として膵癌肝転移症例２例、健常者２例を対象とした。
【００９４】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の検討は、血液試料から分離した単核球試料のＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡ発現を検出することにより実施した。
【００９５】
１．単核球層の分離
まず、１０ｍｌの静脈血（以下、末梢血と称することがある）をＥＤＴＡ（ｅｔｈｉｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ）採血管にて採取し、冷凍保存した。採取後８時間以内に濃度勾配法により血液試料からの単核球層の分離処理を行った。具体的には、採取した血液試料に２５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えて希釈し、５０ｍｌの遠心管に添加した１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ ＰａｑｕｅＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の上に重層した後、１２００ｇ、４℃で３０分間遠心処理を行った。中間層の細胞を採取して新しい５０ｍｌの遠心管に移し、ＰＢＳにより３回洗浄した。洗浄は、まず２５ｍｌのＰＢＳを加えて１２００ｇ、４℃で１０分間遠心処理し、次いでペレットに２５ｍｌのＰＢＳを加えて１２００ｇ、４℃で１０分間遠心処理し、最後に１ｍｌのＰＢＳを加えて単核球をけん濁して２ｍｌの遠心管に移し１２００ｇ、４℃で２分間遠心処理することにより行った。その後、上清を捨て、ペレットのみとして−８０℃で凍結保存した。
【００９６】
２．ＲＮＡの抽出
凍結保存していたペレットからｔＲＮＡを抽出した。ｔＲＮＡの抽出は、ｔＲＮＡ抽出キット、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、添付のプロトコールにしたがって実施した。その後、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔを用いてＤＮａｓｅ処理（Ｑｉａｇｅｎ社製）を行った。得られたＲＮＡの濃度と質を吸光度計を用いて測定した。
【００９７】
３．逆転写酵素反応、Ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ−ＰＣＲ反応
１μｇのｔＲＮＡをテンプレートとして逆転写反応によりｃＤＮＡを生成した。逆転写反応は、Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付のプロトコールにしたがって実施した。
【００９８】
得られたｃＤＮＡをテンプレートとしてＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲにてＴＭ４ＳＦ４ ｃＤＮＡを増幅し検出した。ＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲはＰｌａｔｉｎｕｍＴＭ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付のプロトコールにしたがって実施した。
【００９９】
具体的には、まず、２μｌのｃＤＮＡをテンプレートとし、プライマーセットとして配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用い、アニーリング温度を５５℃とし、３５サイクルでＰＣＲ（１ｓｔ ＰＣＲ）を行った。本プライマーセットにより、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子（配列番号１）の第３９１番目から第７４０番目のヌクレオチドからなる３５０ｂｐに相当するＴＭ４ＳＦ４ ｃＤＮＡ断片が増幅される。
【０１００】
次いで、１ｓｔ ＰＣＲ産物１μｌをテンプレートとし、プライマーセットとして配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用い、アニーリング温度を５５℃とし、３５サイクルでＰＣＲ（２ｎｄ ＰＣＲ）を行った。本プライマーセットにより、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子（配列番号１）の第４２８番目から第５９５番目のヌクレオチドからなる１６３ｂｐに相当するＴＭ４ＳＦ４ ｃＤＮＡ断片が増幅される。
【０１０１】
内部コントロールとしてβ−アクチン遺伝子を採用し、その発現を検出した。β−アクチン遺伝子の発現の検出は、上記生成したｃＤＮＡをテンプレートとして用いてβ−アクチン ｃＤＮＡをＰＣＲにて増幅することにより実施した。ＰＣＲはＳｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付のプロトコールにしたがって実施した。具体的には、上記ｃＤＮＡ １μｌをテンプレートとし、プライマーセットとして配列番号１３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットを用い、アニーリング温度を６３℃とし、３０サイクルでＰＣＲを行った。本プライマーセットにより、２３４ｂｐのβ−アクチン ｃＤＮＡ断片が増幅される。
【０１０２】
結果を表１にまとめ、また、ＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲにより得られた結果のうち代表的な結果をいくつかの症例について図３に示す。表１および図３において、ＨＣＣ、Ｌｉｖｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、およびＣｏｎｔｒｏｌはそれぞれ、肝細胞癌症例、膵癌肝転移症例、および健常人を示す。
【０１０３】
表１に示すように、肝細胞癌症例では１９症例中１８症例で、末梢血から調製した単核球試料中にＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが検出された。一方、膵癌肝転移症例では２症例中１症例で末梢血から調製した単核球試料中にＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが検出された。これに対し、健常人由来の末梢血から調製した単核球試料中ではＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡは検出されなかった。
【０１０４】
【表１】
【０１０５】
このように、ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡは、健常人由来の末梢血から調製した単核球試料中には検出されず、肝癌症例由来の末梢血から調製した単核球試料中で検出されることが判明した。肝癌症例および健常人由来の各単核球試料中のβアクチン遺伝子の発現量はほぼ同等であることから、肝細胞癌症例由来の単核球試料中のＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの発現は、用いた試料の量の差異などによる人為的な結果ではないことは明らかである。
【０１０６】
上記結果およびＴＭ４ＳＦ４遺伝子の肝臓および膵臓における発現特異性から、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質は肝癌マーカーとして利用できると本発明者らは考えている。また、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質の検出は、血液試料を用いて行うことができるため、簡便で患者への侵襲が少なく、肝癌の検出や診断に有用性が高い。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明により、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子または該遺伝子によりコードされる蛋白質をマーカーとして用い、さらに該マーカーを検出することを特徴とする肝癌、特に肝細胞癌の検出方法または診断方法を実施できる。
【０１０８】
本マーカーの測定は、被検試料として肝組織試料のみならず血液試料を用いて実施できるため、患者への侵襲性が少く且つ簡便に実施でき有用性が高い。さらに本マーカーの測定により、従来判定が困難であった肝癌、特に肝細胞癌の判定がより確度高く且つ容易に実施され得る。
【０１０９】
このように本発明は、ＴＭ４ＳＦ４遺伝子および／または該遺伝子によりコードされる蛋白質を測定することを特徴とする肝癌、特に肝細胞癌の検出方法または診断方法であって、血液試料を使用して実施できる方法を提供することができるという点において、医薬産業において非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現が、マウス肝発癌モデルにおいて発生した肝癌組織（Ｃａｒｃｉｎｏｍａと表示）において、異形成巣（Ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃと表示）や肝腺腫組織（Ａｄｅｎｏｍａと表示）および野生型マウスの肝組織（ＷＴと表示）と比較して有意に亢進していたことを示す図である。ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの定量はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより実施し、各組織中の該ｍＲＮＡ量を該ｍＲＮＡコピー数で示した。縦軸はＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡコピー数（図中、Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ４と表示）を示す。図中、各カラムの上部に示した数字は検体数を示す。
【図２】ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現が、５７症例のヒト肝細胞癌組織（Ｔｕｍｏｒと表示）において、周囲の正常肝組織（Ｎｏｒｍａｌと表示）や該癌組織周囲の肝組織（Ｎｏｎ−ｔｕｍｏｒと表示）に比べて有意に亢進していたことを示す図である。ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの定量はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより実施し、各組織中の該ｍＲＮＡ量を該ｍＲＮＡコピー数で示した。縦軸はＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡコピー数（図中、Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＴＭ４ＳＦ４と表示）を示す。図中、各カラムの上部に示した数字は検体数を示す。
【図３】ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡが、肝細胞癌症例（ＨＣＣと表示）の末梢血から調製した単核球試料で検出されたが、健常人（Ｃｏｎｔｒｏｌと表示）由来の末梢血から調製した単核球試料中では検出されなかったことを示す図である。一方、ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡは膵癌肝転移症例（Ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓと表示）２例中１例の末梢血から調製した単核球試料で検出された。ＴＭ４ＳＦ４ ｍＲＮＡの検出はＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲにより実施した。内部コントロールとしてβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子の発現量を同様に測定したところ、いずれの試料でもほぼ同等の発現量であった。
【配列表フリーテキスト】
【０１１１】
配列番号１：ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子。
配列番号２：ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子（配列番号１）によりコードされる蛋白質。
配列番号３：ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号４：ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５：ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号７：ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号８：ヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号９：マウスＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１０：マウスＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１１：マウスＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１２：マウスＴＭ４ＳＦ４遺伝子増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１３：ヒトβ−アクチン増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１４：ヒトβ−アクチン増幅プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料におけるトランスメンブレン４ スーパーファミリー４（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ４：ＴＭ４ＳＦ４）遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌の検出方法。
【請求項２】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定を該遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイゼーションするプライマーまたはプローブを用いて実施することを含む請求項１に記載の肝癌の検出方法。
【請求項３】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定を下記プライマーセットのうちの少なくともいずれか１を用いて実施することを含む請求項１に記載の肝癌の検出方法：
（１）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセット、
（２）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセット、および
（３）配列表の配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセット。
【請求項４】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定が下記工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の肝癌の検出方法：
（ｉ）ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｃＤＮＡの断片ポリヌクレオチドを配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットにより増幅して一次増幅産物を形成させる工程、
（ｉｉ）該一次増幅産物の断片ポリヌクレオチドを配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットにより増幅して二次増幅産物を形成させる工程、および
（ｉｉｉ）該二次増幅産物を検出する工程。
【請求項５】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定を、該遺伝子によりコードされる蛋白質を測定することにより実施することを含む請求項１に記載の肝癌の検出方法。
【請求項６】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質の測定を、該蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて実施することを含む請求項５に記載の肝癌の検出方法。
【請求項７】
血液試料から単核球を調製し、該単核球を試料として用いることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の肝癌の検出方法。
【請求項８】
配列表の配列番号３から８のいずれか１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
トランスメンブレン４ スーパーファミリー４（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ４：ＴＭ４ＳＦ４）遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、並びに該遺伝子によりコードされる蛋白質に特異的に結合する抗体のうち１つまたは２つ以上を含む肝癌検出用試薬キット。
【請求項１０】
配列表の配列番号３から８のいずれか１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうち１つまたは２つ以上を含む肝癌検出用試薬キット。
【請求項１】
血液試料におけるトランスメンブレン４ スーパーファミリー４（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ４：ＴＭ４ＳＦ４）遺伝子の発現を測定することを含む、肝癌の検出方法。
【請求項２】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定を該遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイゼーションするプライマーまたはプローブを用いて実施することを含む請求項１に記載の肝癌の検出方法。
【請求項３】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定を下記プライマーセットのうちの少なくともいずれか１を用いて実施することを含む請求項１に記載の肝癌の検出方法：
（１）配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセット、
（２）配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセット、および
（３）配列表の配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセット。
【請求項４】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定が下記工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の肝癌の検出方法：
（ｉ）ＴＭ４ＳＦ４遺伝子のｃＤＮＡの断片ポリヌクレオチドを配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットにより増幅して一次増幅産物を形成させる工程、
（ｉｉ）該一次増幅産物の断片ポリヌクレオチドを配列表の配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドと配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットにより増幅して二次増幅産物を形成させる工程、および
（ｉｉｉ）該二次増幅産物を検出する工程。
【請求項５】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子の発現の測定を、該遺伝子によりコードされる蛋白質を測定することにより実施することを含む請求項１に記載の肝癌の検出方法。
【請求項６】
ＴＭ４ＳＦ４遺伝子によりコードされる蛋白質の測定を、該蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて実施することを含む請求項５に記載の肝癌の検出方法。
【請求項７】
血液試料から単核球を調製し、該単核球を試料として用いることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の肝癌の検出方法。
【請求項８】
配列表の配列番号３から８のいずれか１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
トランスメンブレン４ スーパーファミリー４（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ４：ＴＭ４ＳＦ４）遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、並びに該遺伝子によりコードされる蛋白質に特異的に結合する抗体のうち１つまたは２つ以上を含む肝癌検出用試薬キット。
【請求項１０】
配列表の配列番号３から８のいずれか１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうち１つまたは２つ以上を含む肝癌検出用試薬キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−２８３９４５（Ｐ２００８−２８３９４５Ａ）
【公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１３４５６２（Ｐ２００７−１３４５６２）
【出願日】平成１９年５月２１日（２００７．５．２１）
【出願人】（５０６１２４１７０）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月２７日（２００８．１１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２１日（２００７．５．２１）
【出願人】（５０６１２４１７０）
【Ｆターム（参考）】
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