肝細胞癌細胞に特異的なペプチドおよびその適用
肝細胞癌(HCC)は世界中で癌死の第4番目の主要な原因である。分子腫瘍学についての増加した知識に由来する新しい治療戦略が、この病気を治療するために絶えず開発されている。ここでは、我々は、HCC細胞と特異的に結合する(SP94)を含む新しいペプチドを特定するために、ファージディスプレイを使用した。インビトロでファージクローンPC94は、HCC細胞株と結合する。インビボで、PC94は、ヒトHCC異種移植片を担持するSCIDマウスで、特異的に腫瘍組織に帰巣したが、正常な内臓器官には帰巣しなかった。帰巣能力は、合成ペプチド、SP94によって競合的に阻害されることができた。PC94は、腫瘍組織に局在したが、SP94競合腫瘍組織または正常な器官では検出できなかった。さらにPC94は、HCC患者からの外科的標本において61.3%(19/31)の陽性率で腫瘍組織を認識したが、非腫瘍組織は認識しなかった。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
(優先権の主張)
本出願は、2007年11月20日に出願された仮出願番号第60/996,488号に対する優先権を主張するものであり、その全ては参照することにより組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
(本発明の背景)
世界的に、肝細胞癌(HCC)は、10番目に致命的な癌関連の死因である。手術、放射線および化学療法の進歩と併用をもってしても、HCCの予後は依然としてよくない(非特許文献1)。アメリカ合衆国における肝臓癌である個人についての5年生存率は、従来の積極的な療法にもかかわらず、わずか8.9%であり、この悪性腫瘍は、膵管腺癌(5年で4.4%の生存率)に次ぐ2番目に致命的な癌である(非特許文献2)。2005年には、肝臓癌の新しい症例が世界中で667,000件を超えたが、そのうちアジアとサハラ以南のアフリカで80%を占めた(非特許文献3)。分子腫瘍学の分野での非常にすばらしい進展とともに、新しい治療戦略が、この病気を治療する試みにおいて絶えず開発されている。
【0003】
腫瘍細胞とそれに対応する両性細胞との間に改善された区別をする、癌に対する標的治療学の開発は、現在の抗癌研究の主要な目的のうちの1つである。大部分の化学療法剤は、腫瘍部位に優先的に蓄積しない。実際に、腫瘍に達する用量は、正常な器官に蓄積する用量の5〜10%とわずかである(非特許文献4)。毒性の副作用は、抗癌剤の用量増加をしばしば制限し、不完全な腫瘍応答、疾患の早期再発、そして最後には薬剤耐性の発症をもたらす。抗癌剤を送達系に封入することや(非特許文献5)、癌細胞で過剰発現もしくは特異的に発現される抗原もしくは受容体に結合するモノクローナル抗体(非特許文献6、非特許文献7)またはペプチドリガンド(非特許文献8、非特許文献9)を介して抗癌剤を標的とするなどの抗癌剤の選択的な毒性を改善するいくつかのアプローチが開発された。
【0004】
脂質または高分子系の抗癌性ナノ医療などの薬物送達系(DDS)が、研究されてきた(非特許文献10)。DDSは、通常、リポソームや、ミセル、脂質エマルジョン、および脂質−薬剤複合体などの他の脂質系担体を含む200nm以下の直径のナノ粒子および微粒子を意味する;また、高分子−薬剤複合体および免疫複合体などの様々なリガンド標的生成物も含まれる(非特許文献11)。腫瘍脈管構造の透過亢進は、高分子系の癌療法による標的化の成功を左右する鍵となる要因のうちの1つである(非特許文献12)。静脈内投与の後、100〜600nmの平均孔径を有すると推定される血管新生腫瘍脈管構造の「漏出」(非特許文献13)は、腫瘍組織での複合体の選択的な血管外漏出を許容する。その上、腫瘍組織は、効果的なリンパドレナージをしばしば欠き、それはその後、高分子保持を促進する。これらの要因の組み合わせは、腫瘍組織での複合体の蓄積に至る−Maedaによって「強化された透過性と保持性(EPR)効果」として命名された受動的標的化現象(非特許文献14)。リポソームによるEPR媒介受動的腫瘍標的化は、薬剤を含まずに得られるものと比較して、固形腫瘍で薬剤濃度の数倍の増加をもたらすことができる(非特許文献15)。
【0005】
DDSの特有の効力は、それらの関連治療剤の薬物動態と生体内分布を変えるそれらの可能性である(非特許文献5)。様々な治療的分子へのポリエチレングリコール(PEG)または他の不活性高分子の結合は、腎臓および細網内皮系(RES)による薬物クリアランスを減少させ得る(非特許文献16)。リポソームや高分子−薬物複合体などのより大きな粒子の担体については、正常な器官に対するより低い悪影響で低、主に血液コンパートメントを制限する。
【0006】
非経口投与のために現在承認された大多数のDDSは、リポソーム系または脂質系製剤、および例えば、ペグ化リポソームドキソルビシンなどのPEGに連結された治療的分子を含み、それは、43%と59%の全体的な応答率で、エイズに関連するカポジ肉腫などの高血管新生の腫瘍を治療するのに用いられた(非特許文献17、18)。しかし、粒子のDDSは、肝臓、脾臓、および骨髄の単核性食細胞系の細胞において薬剤の蓄積増加を引き起こし、これらの組織に対して毒性が増加する可能性がある(非特許文献19)。さらに、粒子DDSの増加した循環時間と制限により、好中球減少症、血小板減少症、および白血球減少症などの血液学的な毒性も明らかとなった(非特許文献20)。腫瘍細胞および腫瘍脈管構造表面抗原または受容体を標的とするリガンドとそれらを結合することにより、DDSの部位特異的作用を増強する努力がなされ、これは、活性型−またはリガンド−媒介標的化と呼ばれるプロセスである(非特許文献8、21)。さらに、親和性標的化による腫瘍組織への化学療法剤の送達が研究されている(非特許文献22、23)。
【0007】
モノクローナル抗体は、腫瘍標的化剤として臨床的な可能性を示したが、それらのサイズのために抗体の弱い腫瘍透過性、および非特異的抗体取り込みに起因する肝臓/骨髄毒性は、抗体療法の2つの主要な制約である。ペプチド−標的化剤は、抗体癌治療に関連している問題を緩和し得る(非特許文献24)。微生物上で提示されたコンビナトリアルライブラリーは、腫瘍特異的標的化リガンドを同定するための可能な戦略である。
【0008】
ファージディスプレイ技術は、B細胞エピトープ(非特許文献25〜27)を同定するために、腫瘍細胞(非特許文献8、28、29)および腫瘍脈管構造特異的ペプチド(非特許文献30〜33)を発見するために適用された。DDSと腫瘍特異性ペプチドとの組み合わせは、ほんの少しの標的化リガンド分子を介して腫瘍細胞に送達される数千の抗癌剤分子にまで至らしめる。腫瘍部位での抗癌剤分子の徐放は、また、治療的な利点を有し得る(非特許文献8、34)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Thomas,M.B.,and Zhu,A.X.(2005)Hepatocellular carcinoma:the need for progress.J Clin Oncol 23,2892−2899.
【非特許文献2】Farazi,P.A.,and DePinho,R. A. (2006)Hepatocellular carcinoma pathogenesis:from genes to environment. Nat Rev Cancer 6,674−687.
【非特許文献3】Jemal,A.,Murray,T.,Ward,E., Samuels,A.,Tiwari,R.C,Ghafoor,A.,Feuer,E.J.,and Thun,M.J.(2005)Cancer statistics,2005.CA Cancer J Clin 55,10−30.
【非特許文献4】Bosslet,K.,Straub,R.,Blumrich,M.,Czech,J.,Gerken,M.,Sperker,B., Kroemer,H.K.,Gesson,J.P.,Koch,M.,and Monneret,C.(1998)Elucidation of the mechanism enabling tumor selective prodrug monotherapy.Cancer Res 58,1195−1201.
【非特許文献5】Allen,T.M.,and Cullis,P.R.(2004)Drug delivery systems:entering the mainstream.Science 303,1818−1822.
【非特許文献6】Allen,T.M.,Mumbengegwi,D.R., and Charrois,G.J.(2005)Anti−CD 19−targeted liposomal doxorubicin improves the therapeutic efficacy in murine B−cell lymphoma and ameliorates the toxicity of liposomes with varying drug release rates.Clin Cancer Res 11,3567−3573.
【非特許文献7】MacDiarmid,J.A.,Mugridge,N.B.,Weiss,J.C,Phillips,L.,Burn,A.L.,Paulin,R.P.,Haasdyk,J.E.,Dickson,K.A.,Brahmbhatt,V.N.,Pattison,S.T.,James,A.C,Al Bakri,G,,Straw,R.C,Stillman,B.,Graham,R.M.,and Brahmbhatt,H.(2007)Bacterially derived 400 nm particles for encapsulation and cancer cell targeting of chemotherapeutics.Cancer Cell 11,431−445.
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【非特許文献9】Xiong,X.B.,Huang,Y.,Lu,W.L., Zhang,X.,Zhang,H.,Nagai,T.,and Zhang,Q.(2005)Enhanced intracellular delivery and improved antitumor efficacy of doxorubicin by sterically stabilized liposomes modified with a synthetic RGD mimetic.J Control Release 107,262−275.
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【非特許文献30】Arap,W.,Pasqualini,R.,and Ruoslahti,E.(1998)Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model.Science 279,377−380.
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【非特許文献33】Lee,T.Y.,Lin,C.T.,Kuo,S.Y., K., C.D.,and Wu,H.C.(2007)Tumor−homing peptides with targeting to tumor blood vessels of lung cancer for drug delivery.Cancer Research 67,10958−10965.
【非特許文献34】Pastorino,F.,Brignole,C,Di Paolo,D.,Nico,B.,Pezzolo,A.,Marimpietri,D.,Pagnan,G.,Piccardi,F.,Cilli,M.,Longhi,R.,Ribatti,D.,Corti,A.,Allen,T. M.,and Ponzoni,M.(2006)Targeting liposomal chemotherapy via both tumor cell−specific and tumor vasculature−specific ligands potentiates therapeutic efficacy.Cancer Res 66,10073−10082.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
本開示は、特に以下のものを単独で、あるいは組み合わせて具備する:
本開示は、ポリヌクレオチドまたはその変異体を提供し、前記ポリヌクレオチドが、肝細胞癌細胞に特異的なペプチドをコードし、前記ポリヌクレオチドが、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号;13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、および配列番号:29から選択される配列を具備する。
【0011】
本開示は、ポリヌクレオチドまたはその変異体を提供し、前記ポリヌクレオチドが、肝細胞癌細胞に特異的であり、前記ポリヌクレオチドが、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号;14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、および配列番号:30から選択される配列を具備する。1つの実施形態では、前記ポリペプチドは、SP94(配列番号:2)、またはその変異体を具備する。別の実施形態では、前記ポリペプチドは、SP94(配列番号:2)を具備する。別の実施形態では、前記ポリペプチドは、隣接するアミノ酸PILPを具備する。
【0012】
本開示は、第2ポリペプチドに融合した第1ポリペプチドを具備する融合タンパク質を提供し、前記第1ポリペプチドが肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドおよび第2ペプチドを具備する。1つの実施形態では、前記第2ポリペプチドは、肝細胞癌細胞に特異的な1つ以上のポリペプチドを具備する(例えば、前記ポリペプチドは、ホモ2量体、ヘテロ2量体、または他の多量体である)。別の実施形態では、前記第2ポリペプチドは、グルタチオンS−転移酵素(GST)領域を具備する。別の実施形態では、前記第2ポリペプチドは、GFPを具備する。別の実施形態では、前記第2ポリペプチドは、免疫学的タグを具備する。別の実施形態では、前記第2ポリペプチドは、抗体ドメインを具備する。別の実施形態では、前記抗体ドメインは、抗体のFc領域である。
【0013】
本開示は、ポリペプチドまたはその変異体を提供し、前記ポリペプチドは、肝細胞癌細胞に特異的であり、前記ポリペプチドまたはその変異体は、1つ以上の薬剤と共役化されている。1つの実施形態では、前記薬剤は、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗VEGFアプタマー、および放射性分子から選択される。
【0014】
本開示は、肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたはその変異体と結合する抗体を提供する。
【0015】
本開示は、肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたはその変異体を具備するリポソームを提供する。1つの実施形態では、前記リポソームは、SP94(配列番号:2)またはその変異体を具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、SP94(配列番号:2)を具備する。別の実施形態では、本開示のリポソームは、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗VEGFアプタマー、および放射性分子から選択される少なくとも1つの薬剤をさらに具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、ドキソルビシンを具備する。
【0016】
本開示は、治療を必要とする哺乳動物に、肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたはその変異体の治療有効量を投与するステップを具備する哺乳動物の病気を治療する方法を提供し、前記ポリペプチドまたはその変異体が、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗VEGFアプタマー、および放射性分子から選択される1つ以上の薬剤と共役化されている。1つの実施形態では、前記哺乳動物は、ヒトである。
【0017】
本開示は、治療を必要とする哺乳動物に、1つ以上の薬剤と肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたはその変異体を具備するリポソームの治療有効量を投与するステップを具備する哺乳動物の病気を治療する方法を提供する。1つの実施形態では、前記リポソームは、配列番号:2を具備するポリペプチド、またはその変異体を具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、配列番号:2を具備するポリペプチドを具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗VEGFアプタマー、および放射性分子を含む1つ以上の薬剤を具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、ドキソルビシンを具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、配列番号:2、またはその変異体、およびドキソルビシンを具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、配列番号:2およびドキソルビシンを具備する。別の実施形態では、前記病気は癌である。別の実施形態では、前記癌は肝臓癌である。別の実施形態では、前記肝臓癌は肝細胞癌である。別の実施形態では、前記哺乳動物はヒトである。
【0018】
本開示は、
a)ポリペプチドが肝臓癌細胞に結合するのを可能とする条件下で、検体を肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたはその変異体と接触させるステップ、および
b)前記ポリペプチドに結合する抗体を用いて、前記ポリペプチドの結合を検出するステップ、
を具備する検体での肝臓癌を検出する方法を提供する。1つの実施形態では、ポリペプチドまたはその変異体は、肝細胞癌に特異的なポリペプチドと、エピトープを具備する別の配列とを具備する融合ポリペプチドを具備する。前記融合ポリペプチドの肝細胞癌細胞への結合は、エピトープに結合する抗体を用いて検出され得る。
【0019】
本開示は、
a)ポリペプチドまたはその変異体と分子を具備する複合体の形成を可能とする条件下で、細胞抽出物をポリペプチドまたはその変異体と接触させるステップ、および
b)細胞分子を同定するために複合体を分析するステップ、
を具備する肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたは変異体に結合する細胞分子を同定する方法を提供する。
【0020】
本開示は、変異体のポリヌクレオチドが、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号;13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、および配列番号:29から選択されるポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズする、本開示のポリヌクレオチドの変異体を提供する。1つの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【0021】
本開示は、変異体のポリペプチドが、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号;13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、および配列番号:29から選択されるポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、本開示のポリヌクレオチドの変異体を提供する。1つの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【0022】
本開示は、ポリペプチドが標識を具備する本開示のポリペプチドを対象に投与し、対象での癌へのポリペプチドの結合を検出するステップを具備する、対象での癌の検出方法を提供する。1つの実施形態では、前記標識は、放射性分子を具備する。別の実施形態では、前記癌は肝臓癌である。別の実施形態では、前記肝臓癌は肝細胞癌である。別の実施形態では、前記対象は哺乳動物である。別の実施形態では、前記哺乳動物はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【0023】
特許または出願ファイルは、カラー仕上げされた少なくとも1つの図面を含む。カラー図面(複数を含む)を有する特許または特許出願刊行物のコピーは、要請と必要な料金の支払いにより特許庁から提供されるであろう。
【図1】図1は、インビトロでのファージディスプレイを用いたHCC細胞特異的ファージの単離を示す。
【図2A】図2A〜Dは、HCC細胞株とヒトHCC生検標本へのPC94の結合活性を示す。
【図2B】図2A〜Dは、HCC細胞株とヒトHCC生検標本へのPC94の結合活性を示す。
【図2C】図2A〜Dは、HCC細胞株とヒトHCC生検標本へのPC94の結合活性を示す。
【図2D】図2A〜Dは、HCC細胞株とヒトHCC生検標本へのPC94の結合活性を示す。
【図3】図3A〜Cは、インビボでのPC94の腫瘍帰巣性の実証を示す。
【図4】図4は、標的化ペプチドSP94の共役は、治療効力を高め、HCC異種移植片モデルでのリポソームドキソルビシンの血液学的な毒性を減少させることを示す。
【図5】図5A〜Dは、SP94−Lipo−Dox処置HCC異種移植片の組織病理学的検査を示す。
【図6A】図6は、大きなHCC異種移植片を担持するSCIDマウスのSP94−Lipo−Doxによる処置を示す。
【図6B】図6は、大きなHCC異種移植片を担持するSCIDマウスのSP94−Lipo−Doxによる処置を示す。
【図6C】図6は、大きなHCC異種移植片を担持するSCIDマウスのSP94−Lipo−Doxによる処置を示す。
【図6D】図6は、大きなHCC異種移植片を担持するSCIDマウスのSP94−Lipo−Doxによる処置を示す。
【図6E】図6は、大きなHCC異種移植片を担持するSCIDマウスのSP94−Lipo−Doxによる処置を示す。
【図7】図7は、FACSによる選択されたファージクローンの結合活性の用量依存性分析。
【図8】図8は、インビボでのPC88および94の腫瘍帰巣性の実証を示す。
【発明を実施するための形態】
【0024】
表1は、Mahlavu細胞から選択されたファージ由来のファージディスプレイされたポリペプチド配列を提供する。
【0025】
表2は、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【0026】
(発明の詳細な説明)
HCCは5番目に一般的な癌であり、世界中の癌死亡の4番目の主な原因として格付けされる(1)。唯一の治療的処置は、外科的切除または肝臓移植であり、ほんの少しの患者だけがこれらの処置に適している(36)。進行した段階で現れる大多数のHCCsは、治療処置が及ばない。進行したHCCsに対する単剤療法または併用療法としての全身的化学療法は、過去30年間、広範囲に研究されてきており、無効であることが広く認められている(36)。全身治療における効果を改善すること、および恩恵を受けるそうした患者を選択することは、依然として大きな挑戦である。我々は、ファージディスプレイ・スクリーニングを介して特定される新しい標的化ペプチド、つまり肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチド、および前記ペプチドを用いたHCCに対する標的薬物送達の開発を報告する。
【0027】
最初に、我々は、インビトロおよびインビボの両方でHCC細胞と特異的に結合することができる新規ペプチドを特定するためにファージディスプレイされたペプチドライブラリーを使用した。そのようなペプチドの1つは、SP94である。さらに、SP94をコードするファージPC94は、腫瘍組織表面を認識するが、HCC患者からの外科的標本での正常な対応する部位は認識しない。標的化ペプチドSP94およびドキソルビシンを含むリポソームは、HCC異種移植片モデルで治療有効性を改善した。このように、SP94ペプチドは、進行したHCCsの全身的な処置を改善することができる。
【0028】
I.定義
本明細書で使用される用語は、以下に説明されるように、それらにおける通常の意味を有し、明細書の文脈でさらに理解することができる。
【0029】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を意味するために本明細書では互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および/またはそれらの類似体または誘導体を具備することができる。本明細書で示されるヌクレオチド配列は、5’から3’方向へ記載される。
【0030】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸の重合形態を意味するために本明細書では互換的に使用される。
【0031】
「変異体」という用語は、本開示のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列における挿入、付加、欠失、または置換を含み、前記変異体は、肝細胞癌細胞に特異的である。
【0032】
「実質的に同一な」、「実質的に類似の」という語句は、関連したアミノ酸またはヌクレオチド配列が、開示された配列と比較して、同一であるか、あるいは、実質的でない違い(保存されたアミノ酸置換により)を有することを意味する。
【0033】
ポリペプチドに関して、少なくとも10、20、30、50、100、またはそれを超えるアミノ酸が、もとのポリペプチドと実質的に同じである変異体ポリペプチドとの間で比較される。核酸については、少なくとも30、40、50、100、150、300、またはそれを超えるヌクレオチドが、もとの核酸と実質的に同じである変異体核酸との間で比較される。従って、変異体は、領域または複数の領域で実質的に同一であることができ、「実質的に同一」の定義を依然として満たしながら、他の領域で異なることができる。2つの配列間のパーセント同一性は、例えば、Altschul et al.,J.MoI.Biol.,215:403−410(1990)に記載されたBasic Local Alignment Tool(BLAST)、Needleman et al.,J.MoI.Biol.,48:444−453(1970)のアルゴリズム、またはMeyers et al.,Comput.Appl.Biosci.,4:11−17(1988)のアルゴリズムなどの標準的なアラインメントアルゴリズムにより決定される。
【0034】
「リポソーム」という用語は、内部の水性スペースを囲む外側の脂質の2層または多層の膜を具備する組成物を意味する。前記用語は、一般に約1〜約10μmの範囲の直径を有し、水相である層と交互に2〜数百の同心である範囲で脂質2重層を具備する多層状のリポソームを含む。この用語は、単一の脂質層から構成され、約20〜約400ナノメートル(nm)、約50〜約300nm、約300〜約400nm、または約100〜約200nmの範囲の直径を一般に有する単層小胞を含む。前記用語は、また、約65nmから約75nmの直径を有するリポソームを含む。
【0035】
「抗体」という用語は、免疫グロブリンまたはその断片を意味し、抗原結合断片または抗原結合ドメインを具備するどのようなポリペプチドも包含する。前記用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異的抗体、多特異的抗体、非特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組み換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、移植抗体,およびインビトロ生成抗体を含むが、これらに限定されない。「完全な」という言葉が先行しない限り、「抗体」は、Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、dAb、および抗原結合機能を保持する他の抗体断片などの抗体断片を含む。一般的に、そのような断片は、抗原結合ドメインを具備するであろう。
【0036】
「抗原結合ドメイン」および「抗原結合断片」という用語は、抗体と抗原の間の特異的結合を担うアミノ酸を具備する抗体分子の一部を意味する。抗体によって特異的に認識されて、結合する抗原の部分は、「エピトープ」と呼ばれ、これは、ポリペプチドのアミノ酸残基の連続した配列であっても、なくてもよく、他の化学構造を有する糖類および/または分子を具備し得る。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域(VL)と抗体重鎖可変領域(VH)を具備し得る;しかし、それは両方を具備する必要はない。Fd断片は、例えば、2つのVH領域を有し、完全な抗原結合ドメインのいくつかの抗原結合機能を保持する。抗体の抗原結合断片の例は、(1)VL、VH、CL、およびCHIドメインを有する1価の断片であるFab断片;(2)ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された2つの断片を有する2価の断片であるF(ab’)2;(3)2つのVHおよびCHIドメインを有するFd断片;(4)抗体の単一アームのVLおよびVHドメインを有するFV断片;(5)VHドメインを有するdAb断片(Ward et al.,(1989)Nature 341:544−546);および(6)単離された相補性決定領域(CDR)を含む。さらに、Fv断片の2つのドメインVLとVHは、別々の遺伝子でコード化されるが、それらは、組み換え法を使用して、それらをVLとVH領域が1対となり1価の分子を形成する(単一鎖FV(scFV)として知られる)単一のタンパク鎖として作製されるのを可能にする合成リンカーで結合することができる;例えば、Bird et al.(1988)Science 242:423−426;およびHuston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883を参照のこと。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して得ることができ、断片は、完全な抗体の場合と同様に有用性についてスクリーニングされる。
【0037】
「特異的にハイブリダイズする」という用語は、ポリヌクレオチドの文脈において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼ−ションを意味する。DNA/DNAとDNA/RNAのハイブリダイゼ−ション反応のストリンジェンシーを増やす条件は、広く知られており、当技術分野で公表されている。ストリンジェントなハイブリダイゼ−ション条件の例は、約65〜70℃での4×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)におけるハイブリダイゼ−ション、または約42〜50℃での4×SSC+50%ホルムアミドにおけるハイブリダイゼ−ション、次いで、約65〜70℃での1×SSC中の1回以上の洗浄を含む。
【0038】
ペプチドが肝細胞癌細胞と結合または相互作用するが、他の細胞と特異的に結合または相互作用しないとき、ペプチドは、肝細胞癌細胞に対して「特異的」である。
【0039】
「リガンド」という用語は、受容体を含む別の分子と結合する分子を意味する。
【0040】
「宿主細胞」は、任意の組み換えベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであることができるか、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物である。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、その子孫は、自然突然変異、偶発的突然変異または意図的突然変異および/または変化によりもとの親細胞と必ずしも完全に同一(形態学で、または全DNA相補体で)であるというわけではない。宿主細胞は、インビトロまたはインビボで、本開示の組み換えベクターまたはポリヌクレオチドによりトランスフェクションされたか、または感染させられた細胞を含む。本開示の組み換えベクターを具備する宿主細胞は、「組み換え宿主細胞」と呼ばれる場合がある。
【0041】
「標本」は、患者に由来する任意の生物学的検体である。前記用語は、生物学的起源の細胞や組織だけでなく、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ液、透析液、洗浄液,精液、および他の液体サンプルなどの生物学的液体を含むが、これに限定されるものではない。前記用語は、また、細胞またはそれから誘導される細胞とその子孫を含み、それは培養細胞、細胞上澄み液、および細胞溶解物も含む。それは器官または組織培養由来の液体、組織生検サンプル、腫瘍生検サンプル、検便サンプル、および生理的組織から抽出された液体のみならず、同様に固体組織から分散した細胞、組織切片、および細胞溶解物をさらに含む。この定義は、それらの調達の後で試薬による処理、可溶化、またはポリヌクレオチドやポリペプチドなどの特定の成分に対する富化などの任意の方法で操作されたサンプルを包含する。この定義は、また、患者のサンプルの派生物および断片もこの用語に含まれる。患者のサンプルは、診断検査、予後検査、または他のモニタリング検査において使うことが可能である。この用語は、また、ヒト以外の哺乳動物からの生物学的検体にもあてはまる。標本は、ヒトの患者またはヒト以外の哺乳動物由来であることができる。
【0042】
「治療」は、本明細書で使用されるように、ヒトを含む哺乳動物の病気に対する医薬の任意の投与または適用を含み、例えば、後退させる、失われた、無くなった、または不完全な機能を回復または修復すること、あるいは能率が悪いプロセスを刺激することによって病気を阻害すること、その進展を抑制すること、または病気を軽減することを含む。前記用語は、ヒトを含む哺乳動物で病的状態または障害のいかなる治療にも及び、望ましい薬理的効果および/または生理的効果を得ることを含む。その効果は、障害またはその徴候を完全に、または部分的に防止する観点から予防する場合があり、病気および/または障害に起因する副作用の部分的または完全な治療に関して治療的である場合がある。従って、本開示は、治療と予防の両方を提供する。それは、(1)障害を患うかもしれないが、まだその徴候が無い対象でその障害の発生または再発を防止すること、(2)その進行を抑えることなどの障害を抑制すること、(3)例えば、失われた、無くなった、または不完全な機能を回復もしくは修復すること、または能率が悪いプロセスを刺激することによって障害またはその徴候の後退をもたらすことにより、宿主が障害またはその徴候にもはや苦しまないようにするために、障害またはそれに関連した少なくとも徴候を阻止するか終わらせること、または(4)障害またはそれに関連した徴候を緩和すること、軽減すること、または改善すること(ここで、改善することは、広義には、炎症、疼痛および/または腫瘍サイズなどのパラメータの大きさの減少について言及するのに使用される)を含む。
【0043】
「医薬的に許容される担体」は、非毒性の固体、半固体、もしくは液体の充填剤、希釈剤、封入材、製剤助剤、または任意の従来タイプの賦形剤を意味する。医薬的に許容される担体は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、製剤の他の成分と相容性である。
【0044】
本明細書での「組成物」は、当技術分野で慣行の医薬的に許容される担体または賦形剤などの担体を通常含む混合物であり、それは、治療目的、診断目的または予防目的のために対象に投与するのに適している。それは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが細胞または培地に存在する細胞培養物を含み得る。例えば、経口投与のための組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤、口腔内洗浄剤、または散剤を形成することができる。
【0045】
「病気」は、医学的介入が必要である、または医学的介入が望ましい任意の状態、感染、障害、または徴候をも意味する。そのような医学的介入は治療、診断、および/または、防止を含むことができる。
【0046】
「癌」は、悪性であるか、前悪性であるか、または非悪性であるかにかかわらず、任意の異常な細胞または組織の増殖、例えば、腫瘍を意味する。それは、周囲組織に侵入するかもしれないし、しないかもしれないため、新しい身体部位に転移するかもしれないし、しないかもしれない細胞の制御されない増殖によって特徴づけられる。癌は、癌腫を包含し、それは上皮細胞癌であり、癌腫は、扁平上皮癌、腺癌、黒色腫、および肝癌を含む。癌はまた、肉腫を包含し、それは間葉起源の腫瘍であり、肉腫は、骨原性肉種、白血病、およびリンパ腫を含む。癌は、1つ以上の新生細胞型を含み得る。癌という用語は、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、および口腔癌を含む。
【0047】
II.肝細胞癌細胞に特異的な本開示のポリペプチド
本開示は、ポリヌクレオチドまたはその変異体を提供し、前記ポリヌクレオチドが、肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドをコードし、前記ポリヌクレオチドが、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号;13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、および配列番号:29から選択される配列を具備する。
【0048】
本開示は、ポリペプチドまたはその変異体を提供し、前記ポリペプチドが、肝細胞癌細胞に特異的であり、前記ポリペプチドが、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号;14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、および配列番号:30から選択される配列を具備する。1つの実施形態では、ポリペプチドは、SP94(配列番号:2)、またはその変異体を具備する。別の実施形態では、ポリペプチドは、SP94(配列番号:2)を具備する。
【0049】
A.変異体
変異体は、ペプチドの生物学的に活性な変異体を含み、ここで、構造が実質的に類似であるか、または実質的に同じである変異体を含む。ペプチド配列の変異体は、対象ペプチドと比較して、挿入、付加、欠失、または置換を含み得る。ポリペプチド配列の変異体は、生物学的に活性な多形変異体を含む。
【0050】
本開示のヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体は、例えば、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%が、開示された核酸分子およびポリペプチドに対する配列において同一であるものを含む。
【0051】
本開示のヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体は、例えば、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%が、開示された核酸分子およびポリペプチドに対する配列において類似しているものを含む。
【0052】
本開示のポリペプチドの変異体は、表1の配列と比較して、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれを超える挿入、付加、欠失、または置換を有する変異体を含む。1つの実施形態では、変異体は、表1で提供される配列と比較して、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれを超える挿入、付加、欠失、または置換を具備し、ここで、前記の挿入、付加、欠失、または置換は、その配列に対して表1に太字で示されたアミノ酸を変更しない。別の実施形態では、変異体は、表1に太字で示された単一配列からのアミノ酸を具備する。
【0053】
本開示のポリヌクレオチドの変異体は、表2で提供される配列と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17または18の挿入、付加、欠失、または置換を含む。1つの実施形態では、変異体は、表2で提供される配列と比較して、挿入、付加、欠失または置換を具備し、ここで、前記の挿入、付加、欠失または置換は、その配列に対して表1に太字で示されたアミノ酸をコードするヌクレオチドを変更しない。別の実施形態では、変異体は、表1に太字で示された単一配列からのアミノ酸をコードするヌクレオチドを具備する。
【0054】
ペプチド変異体は、コード化された、またはコード化されないアミノ酸、化学的にまたは生化学的に改変された、誘導体化された、または設計されたアミノ酸、アミノ酸類似体、ペプチド模倣体、およびデプシペプチド、ならびに改変された、環状の、2環式の、デプシ環状の、またはデプシ2環式のペプチド骨格を含み得る。変異体は、多量体と同様に、単鎖タンパク質を含む。
【0055】
本開示のペプチドの変異体は、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸を含むことができる。変異体は、特別な性質を伝えるために、D−アミノ酸、D−とL−アミノ酸の組み合わせ、および様々な「設計」または「合成」のアミノ酸(例えば、β−メチルアミノ酸、Cα−メチルアミノ酸、およびNα−メチルアミノ酸など)を具備することができる。さらに、変異体は環状であることができる。変異体は、特定の構造モチーフを導入するために、非古典的なアミノ酸を含むことができる。任意の既知の非古典的なアミノ酸を使用することができる。アミノ酸類似体およびペプチド模倣体は、特定の2次構造を誘導または支持するためにペプチドに組み込まれることができ、それらは、LL−Acp(LL−3−アミノ−2−プロペニドン−6−カルボン酸)、β−ターン誘導ジペプチド類似体、β−シート誘導類似体、β−ターン誘導類似体、α−ヘリックス誘導類似体、γ−ターン誘導類似体、GIy−Ala回転類似体、アミド結合等電子体、またはテトラゾールなどを含むが、これらに限定されない。
【0056】
末端アミノまたはカルボキシル基が存在しないように、デスアミノ残基またはデカルボキシ残基を変異体の末端に組み入れて、プロテアーゼに対する感受性を低下させるか、あるいは立体構造を制約することができる。C端の官能基としては、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ(低級アルキル)、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、およびその低級エステル誘導体、ならびにその医薬的に許容される塩などが挙げられる。
【0057】
さらに、望まれる場合は、非古典的なアミノ酸または化学的なアミノ酸類似体は、ポリペプチド配列に置換または付加として導入することができる。非古典的なアミノ酸は、一般的なアミノ酸のD−異性体、2、4−ジアミノ酪酸、a−アミノイソ酪酸、4−アミノ酪酸、Abu、2−アミノ酪酸、g−Abu、e−Ahx、6−アミノヘキサン酸、Aib、2−アミノイソ酪酸、3−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアミン、b−アラニン、フルオロ−アミノ酸、設計アミノ酸、例えば、b−メチルアミノ酸、Ca−メチルアミノ酸、およびNa−メチルアミノ酸など、ならびに一般的にアミノ酸類似体を含むことができるが、これに限定されない。さらにまた、アミノ酸は、D型(右旋性の)またはL型(左旋性の)であることができる。
【0058】
変異体は,本開示のペプチドに実質的に類似しているポリヌクレオチド配列を含む。そのような変異体は、本開示のポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイする核酸によってコード化され得る。
【0059】
B.融合タンパク質
本開示は、第2ポリペプチドに融合した第1ポリペプチドを具備する融合タンパク質を提供し、ここで、前記第1ポリペプチドは、肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドおよび第2ポリペプチドを具備する。前記第2ポリペプチドは、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、相同性および非相同性のリーダー配列を有する生物発光性タンパク質などの異種アミノ酸配列、例えば、ルシフェリン、またはイクオリン(緑色蛍光タンパク質)から選択されるが、これに限定されない。前記融合タンパク質は、N−末端メチオニン残基、ペグ化タンパク質、および免疫学的にタグ化されたタンパク質、またはHIS−タグ化タンパク質を具備し得る。そのような融合タンパク質は、また、エピトープへの融合を含む。そのような融合タンパク質は、本開示のペプチドの多量体、例えば、ホモダイマーまたはホモ多量体、ならびにヘテロダイマーおよびヘテロ多量体を具備することができる。
【0060】
本開示のペプチドは、限定されるものではないが、FITC、ビオチン、ならびに64Cu、67Cu、90Y、99mTc、111In、124I、125I、131I、137Cs、186Re、211At、212Bi、213Bi、223Ra、241Amおよび244Cmなど(ただしこれらに限定されない)の放射性同位体などの標識、検出可能な生成物(例えば、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど)を有する酵素、蛍光剤および蛍光標識、蛍光放射金属、例えば152Euまたはランタン系列の別の元素、電気化学発光化合物、化学発光化合物、例えば、ルミノール、イソルミノールまたはアクリジニウム塩、特異的結合分子、例えば、磁性粒子、ミクロスフェア、ナノスフェアなどと共役され得る。本開示のペプチドは、ビノレルビン、シスプラチン、ゲムシタビン、パクリタキセル、エトポシド、Novantrone(ミトキサントロン)、アクチノマイシンD、カンプトテシン(それの水溶性誘導体)、メトトレキサート、マイトマイシン類(例えば、マイトマイシンC)、ダカルバジン(DTIC)、シクロホスファミド、ドキソルビシンやダウノマイシンなどの抗新生物抗生物質、または例えば、(De Vita et al,2001)に記載された他のものなどの治療薬と共役し得る。また、ペプチドは、細胞傷害性薬物、オリゴヌクレオチド、毒素、および放射性分子、または(Ng et al 2006)に記載された抗VEGFアプタマーなどの化合物と共役し得る。
【0061】
III.肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドを作製する方法
本開示のペプチドは、当技術分野で公知の方法を用いて製造することができる。細胞系の方法および無細胞系の方法は、本開示のペプチドの生成に好適である。細胞系の方法は、一般に、核酸を宿主細胞にインビトロで導入すること、および発現に好適な条件下で宿主細胞を培養すること、次いでペプチドを培地からもしくは例えば、宿主細胞を破砕することによって宿主細胞から、または両方からペプチドを採取することを含む。好適な宿主細胞は、例えば、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、および哺乳動物の細胞を含む、原核生物細胞または真核生物細胞を含む。
【0062】
また、本開示は、当技術分野で周知の無細胞インビトロ転写/翻訳方法を用いてペプチドを生成する方法も提供する。
【0063】
通常、異種ペプチドは、改変または未改変であろうと、上述したように、それ自体で、または融合タンパク質として発現されることができ、分泌シグナルだけでなく、分泌リーダー配列も含み得る。本開示の分泌リーダー配列は、ある種のタンパク質を小胞体(ER)に誘導することができる。ERは、膜結合タンパク質を別のタンパク質から分離する。タンパク質は、ERに置かれると、分泌小胞を含めた小胞、原形質膜、リソソームおよび別の細胞小器官への分布のためにさらにゴルジ装置に誘導されることができる。
【0064】
さらに、ペプチド部分および/または精製タグをペプチドに付加することが可能である。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製前に除去し得る。とりわけ、分泌または排出を引き起こし、安定性を改善し、および精製を容易化するために、ペプチド部分をポリペプチドに付加することは、当技術分野ではよく知られたルーチン技術である。好適な精製タグとしては、例えば、V5、ポリヒスチジン、アビジン、およびビオチンが挙げられる。ビオチンなどの化合物とペプチドの共役は、当技術分野で周知の技術を用いて実施することができる。(Hermanson ed.(1996)Bioconjugate Techniques;Academic Press)。ペプチドは、当技術分野で公知の技術を用いて、放射性同位体、毒素、酵素、蛍光標識、コロイド状金、核酸、ビノレルビン、およびドキソルビシンと共役することもできる。(Hermanson ed.(1996)Bioconjugate Techniques;Academic Press;Stefano etal.(2006)。毒素は、免疫毒素を含む。Kreitman and Pastan, Immunotoxins in the treatment of hematologic malignancies.Curr Drug Targets.7:1301−11(2006)。
【0065】
本開示での使用に好適な融合パートナーとしては、例えば、フェチュイン、ヒト血清アルブミン、Fc、および/またはその断片の1個以上が挙げられる。ポリエチレングリコール複合体などの複合タンパク質も提供される。
【0066】
本開示のペプチドは、当技術分野で公知の技術を用いて化学合成することもできる(例えば、Hunkapiller etal.,Nature,310:105 111(1984)、Grant ed.(1992)Synthetic Peptides,A Users Guide,W.H.Freeman andCo.;米国特許第6,974,884号)を参照のこと)。例えば、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドは、ペプチド合成装置を用いて、または当技術分野で公知の固相方法を使用して合成することができる。
【0067】
本開示のポリペプチドは、化学合成および組換え細胞培養物から標準方法によって回収および精製することができる。標準方法としては、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィおよびレクチンクロマトグラフィが挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィ(「HPLC」)を精製に使用する。ポリペプチドが単離および/または精製中に変性するときには、周知のタンパク質再折りたたみ技術によって、活性な立体構造を再生するために使用され得る。
【0068】
本開示のペプチドまたはペプチド模倣体は、種々の親水性ポリマーの1種類以上を用いて改変して、または種々の親水性ポリマーの1種類以上と共有結合させて、ペプチドの溶解性および循環半減期を増加させることができる。ペプチドとのカップリングに好適な非タンパク質親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールによって例示されるポリアルキルエーテル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、そのような親水性ポリマーは、約500〜約100,000ダルトン、約2,000〜約40,000ダルトン、または約5,000〜約20,000ダルトンの範囲の平均分子量を有する。ペプチドは、Zallipsky,S.(1995)Bioconjugate Chem.,6:150−165;Monfardini,C.,etal.(1995)Bioconjugate Chem.6:62−69;米国特許第4,640,835号;同4,496,689号;同4,301,144号;同4,670,417号;同4,791,192号;同4,179,337号、またはWO95/34326号に記載の方法のいずれかにより、そのようなポリマーを用いて誘導体化すること、またはそのようなポリマーに結合させることができる。
【0069】
IV.抗体の生成
本開示の単離したタンパク質は、一般に、当技術分野で公知の抗体産生の方法を使用して、モノクローナルまたはポリクローナルのどちらかの抗体を生成するために使用することが可能である。従って、本開示は、肝細胞癌細胞に特異的なペプチドに対する抗体も含む。抗体は、活性を妨げる抗体と活性を妨げない抗体の両方を含む。
【0070】
抗体は、例えば、伝統的なハイブリドーマ技術(Kohler and Milstein,Nature 256:495−499(1975))、組み換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号)、または抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ技術(Clackson et al.,Nature 352:624−628(1991);Marks et al.,J.MoI.Biol.222:581−597(1991))で作ることができる。様々な抗体生産技術については、Antibodies:A Laboratory Manual,eds. Harlow et al.,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)を参照されたい。
【0071】
本開示の抗体は、以下に記載される病気の治療に使用し得る。また、抗体は、説明されたアッセイおよび検出方法でも使用できる。
【0072】
V.リポソーム調製
リポソームを調製するための様々な方法が、当技術分野で公知であり、それらのいくつかは、Methods of Biochemical Analysis,Volume 33,337−462(1988)中にLichtenbergおよびBarenholzにより記述されている。小さな単層小胞(SUV、サイズ<100nm)は、先に説明されたように(Tseng et al.,1999)、薄膜水和と繰返し押出しの標準方法の組み合わせにより調製できる。リポソームによるDNAの封入を特に伴う調製法、およびリポソーム媒介移入への直接適用を有する方法は、Hug and Sleight et al.,(1991)によって記述されている。また、リポソームを作る方法は、米国特許第6,355,267号および米国特許第6,663,885号に開示されている。リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG−誘導化ホスファチジルエタノールアミン(PEG−PE)を具備する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により生成することができる。リポソームは、希望の直径を有するリポソームをもたらすために、確定した孔径のフィルタを通して押出される。
【0073】
また、リポソームは、Taiwan Liposome Company(台湾台北)などの供給元から商業的に入手可能である。さらに商業的に入手可能なリポソームとしては、TLC−D99、Lipo−Dox、Doxil、DaunoXome、AmBisome、ABELCET、transfectace(DDAB/DOPE)、DOTAP/DOPE、およびLipofectinが挙げられる。
【0074】
本開示のリポソームは、リン脂質から最も頻繁に調製されるが、疎水性部分および親水性部分を有する、類似した分子形状および寸法の他の分子を使用することができる。本開示の目的のために、そのようなすべての好適なリポソーム形成分子は、本明細書では脂質を意味する。1つ以上の天然および/または合成の脂質化合物が、リポソームの調製に使用され得る。
【0075】
リポソームは、親水性基の選択によって、陰イオン性、陽イオン性または中性であり得る。例えば、ホスファート基またはスルファート基を有する化合物が使用される場合、得られるリポソームは、陰イオン性になる。アミノを含む脂質が使用される場合、リポソームは、陽電荷を有し、陽イオン性リポソームとなる。
【0076】
本開示で有用な初期リポソームを形成するための代表的で好適なリン脂質または脂質化合物は、限定されるものではないが、ホスファチジルコリン(レシチン)、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノール−アミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン(セファリン)、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスファート、ホスファチジルコリン、およびジパルミトイル−ホスファチジルグリセロールなどの脂質関連材料を含む。さらなる非リン酸含有脂質は、限定されるものではないが、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシル−アミン、パルミチン酸アセチル、リシノレイン酸グリセリル、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、ジアシルグリセロールスクシネートなどを含む。
【0077】
本開示で使用するためのリポソーム製剤は、陽イオン性(正に帯電)製剤、アニオン性(負に帯電)製剤、および中性製剤を含む。
【0078】
リポソームへの化合物の遠隔負荷は、膜貫通勾配の形成を利用する(Ceh and Lasic,1995)。この方法は、リポソームに負荷すべき化合物 とボロン酸化合物を、懸濁されたリポソームとインキュベーションし、その結果、化合物のリポソーム内への蓄積を達成することを含む(Zalipsky et al.,1998;Ceh B.and Lasic D.D.、1995;Zalipsky et al.,1998;米国特許第6,051,251号)。
【0079】
リポソーム濃度を決定するためにリン酸アッセイを使用できる。1つのリン酸アッセイは、モリブデン酸塩とマラカイトグリーン染料との相互作用に基づく。主な原理は、酸性条件下で還元されると青色の複合体に変換される無色の未還元のリンモリブデン酸塩複合体を形成するために。無機のリン酸塩をモリブデン酸塩と反応させることを含む。リンモリブデン酸塩は、マラカイトグリーンで共役すると、20倍または30倍強い色を与える。最終生成物の還元された緑色の可溶性の複合体は、620nmでのその吸光度により測定され、溶液中の無機リン酸塩の直接測定である。
【0080】
VI.医薬組成物の調製
本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体は、癌の治療および血管新生の阻害で使われてきた広範囲の1つ以上の薬剤を具備することが可能であり、限定されるものではないが、ビノレルビン、シスプラチン、ゲムシタビン、パクリタキセル、エトポシド、Novantrone(ミトキサントロン)、アクチノマイシンD、カンプトテシン(またはそれの水溶性誘導体)、メトトレキサート、マイトマイシン類(例えば、マイトマイシンC)、ダカルバジン(DTIC)、シクロホスファミド、およびドキソルビシンやダウノマイシンなどの抗新生物抗生物質、または例えば、(De Vita et al,2001)に記載された他のものなどを含む。また、リポソーム、ペプチド、および抗体は、細胞傷害性薬物、オリゴヌクレオチド、毒素、および放射性分子を具備することができる。リポソーム、ペプチド、および抗体は、(Ng et al.,2006)に記載された抗VEGFアプタマーなどの化合物も具備し得る。
【0081】
いくつかの実施形態では、リポソーム、ペプチド、および抗体は、当技術分野で公知である多種多様な医薬的に許容される担体、賦形剤および希釈剤を有する処方で提供される。これらの医薬担体、賦形剤、および希釈剤としては、USP pharmaceutical excipients listing.USP and NF Excipients, Listed by Categories,p.2404−2406, USP 24 NF 19, United States Pharmacopeial Convention Inc.,Rockville,Md.(ISBN 1−889788−03−1)に記載のものが挙げられる。ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤などの医薬的に許容される賦形剤は、一般の人々に容易に入手可能である。さらに、pH調節/緩衝剤、浸透圧調節剤、安定剤、湿潤剤などの医薬的に許容される補助物質も、一般の人々に容易に入手可能である。
【0082】
好適な担体としては、水、デキストロース、グリセリン、生理食塩水、エタノール、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらだけに限定されない。担体は、湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤、または製剤の有効性を高めるアジュバントなどの追加の薬剤を含むことができる。局所用担体としては、液体鉱油、パルミチン酸イソプロピル、ポリエチレングリコール、エタノール(95%)、モノラウリン酸ポリオキシエチレン(5%)水溶液、またはラウリル硫酸ナトリウム(5%)水溶液などが挙げられる。抗酸化剤、湿潤剤、粘度安定剤、および類似薬剤などの他の材料も必要に応じて添加することができる。Azoneなどの皮膚浸透促進剤も含めることができる。
【0083】
医薬剤形においては、本開示の組成物は、医薬的に許容される塩の形態で投与することができ、または単独でもしくは他の医薬的活性化合物との好適な会合および組合せで使用することもできる。対象の組成物は、可能な投与方法に従って処方される。
【0084】
本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体は、植物油または他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸エステル、プロピレングリコールなどの水性溶媒または非水性溶媒にそれらを溶解、懸濁または乳化することによって、必要に応じて、可溶化剤、等張化剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、防腐剤などの慣用的添加剤と一緒に、注射剤中に処方することができる。当技術分野で慣行の別の経口または非経口送達用の製剤を使用することもできる。
【0085】
VII.治療方法
A.投与方法、投与量、および投与頻度
治療薬剤を具備する本開示のペプチドまたはリポソームは、治療を必要とする対象に、静脈注射などの全身的注入により、あるいは腫瘍への直接注入などの関連部位への注入もしくは適用により、あるいは部位が手術で露出している場合の部位への直接的用により、あるいは障害が例えば、皮膚である場合などの局所的用により投与し得る。治療を必要とする対象は、HCCまたは肝臓癌を含む癌などの病気に罹患している対象を含む。
【0086】
本開示のペプチドは、治療のために癌に対する抗体を標的とするのに使用され得る。1つの実施形態では、本開示のペプチドは、治療を必要とする対象に投与され、続いてペプチドに特異的に結合する抗体が投与される。標的抗体は、抗体依存性細胞傷害性または相補体依存性細胞障害性を媒介することが可能であるし、または標的分子の基本的な機能を改変する可能性がある。そのような抗体は、標的組織に対する治療効果を有する薬剤を直接に送達するために、抗体複合体の形態で使用することができる。こうした薬剤としては、放射性核種、毒素、化学療法剤、抗VEGFアプタマーおよび抗血管新生化合物が挙げられる。
【0087】
投与は、経口投与、頬側投与、経鼻投与、経腸投与、非経口投与、腹腔内投与、皮内投与、経皮投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、心臓内投与、脳室内投与、頭蓋内投与、気管内投与、および髄腔内投与、または他に移植もしくは吸入による投与など、種々の方法で投与することができる。従って、対象の組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、およびエアロゾル剤などの固体、半固体、液体、またはガス状の形態の製剤中に処方することができる。以下の方法および賦形剤は、単なる例示に過ぎず、決して限定的なものではない。
【0088】
好適な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなど、およびこれらの組み合わせである。また、必要に応じて、ビヒクルは、湿潤剤または乳化剤またはpH緩衝剤などのわずかな量の補助的物質を含むことができる。このような剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか、または明らかである。投与する組成物または製剤は、いずれにしても、治療対象において所望の状態を得るのに十分な量の薬剤を含む。
【0089】
一般に、本開示の組成物は、患者に、約1μg/kg〜約20mg/kg、約1μg/kg〜約10mg/kg、約1μg/kg〜約1mg/kg、約10μg/kg〜約1mg/kg、約10μg/kg〜約100μg/kg、約100μg/kg〜約1mg/kg、または500μg/kg〜約1mg/kgの範囲の用量で投与される。抗体は、患者に抗体を投与後に抗体が患者の身体を循環できる時間の間隔を最大にするために、ボーラス投与量として投与される。また、持続的注入が、初期ボーラス投与後に使用され得る。投与は、単回投与量、または1日に1回、1週間に1回、あるいは1カ月に1回などの間隔を置いてすることが可能である。投与計画は、例えば、肝細胞癌細胞に対するポリペプチドの親和性、ポリペプチドの半減期、および患者の状態の重症度に基づいて調整できる。
【0090】
B.併用療法
本開示のペプチドまたはリポソームは、単剤療法として使用できる。あるいはまた、本開示のペプチドまたはリポソームは、癌を治療するために標準の化学療法と放射線療法とを組み合わせて使用することができる。
【0091】
癌治療で使われる薬剤は、細胞障害性または細胞増殖抑制性の効果を癌細胞に対して有し得るか、または悪性細胞の増殖を低下させ得る。本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体は、放射線療法と併用できる。本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体は、De Vita,et al.,eds.(2001)に記載された治療的なアプローチと共に使用され得る。本開示のリポソーム、ペプチド、または抗体と第2抗癌剤が癌細胞に対して相乗効果を発揮するこうした併用に関しては、第2薬剤の投与量は、単独で投与された場合の第2薬剤の標準的な投与量と比べて、減少させることが可能である。癌細胞の感受性を増加させるための方法は、本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体を、癌細胞の感受性を高めるのに有効な化学療法抗癌剤の量と併用投与することを具備する。併用投与は、同時投与であってもよく、または、非同時投与であってもよい。本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体は、治療計画の過程で、他の治療薬と共に投与され得る。1つの実施形態では、本開示のリポソーム、ペプチド、または抗体と他の治療剤の投与は、連続的である。好適な時間経過は、患者の病気の性質、および患者の容体などの要因に従って、医師によって選択され得る。
【0092】
VIII.診断方法
病気に特異的なバイオマーカーの検出は、効果的なスクリーニング戦略を提供する。早期発見は、早期診断を提供するのみならず、癌の症例では、多型を選別する能力を提供して、腫瘍再発の早期指標である、手術後の残存腫瘍細胞および潜在性転移を検出できる。病気に特異的なバイオマーカーの検出は、治療を受けている患者や癌の寛解期の患者に比べて、診断前の患者の生存率を改善することができる。
【0093】
本開示のペプチドは、癌を含む病気に対する診断または予後検診に使用できる。ペプチドは、ELISA、ウエスタンブロット、蛍光、免疫蛍光、免疫組織化学、またはオートラジオグラフィを含むがこれに限定されない多くの方法で診断薬として使用できる。
【0094】
また、本開示の抗体は、肝臓癌を検出するために、本開示のペプチドと組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、アッセイは、肝細胞癌細胞などの肝細胞癌に結合する本開示のペプチドと抗体の結合を検出する結合アッセイである。対象のポリペプチドまたは抗体は、固定されることができ、一方、対象のポリペプチドおよび/または抗体は、検出可能に標識化されることができる。例えば、抗体は、直接標識化することができ、あるいは標識化2次抗体で検出できる。すなわち、抗体のための好適で、検出可能な標識は、目的とするタンパク質に抗体を標識する直接的な標識、および目的とするタンパク質に対する抗体を認識する抗体を標識する間接的な標識を含む。別の実施形態では、ペプチドは、標識を具備し、組織へのペプチドの結合は、標識の存在を分析することによって検出される。
【0095】
IX.スクリーニング法
本開示は、本開示のペプチドと結合する生体分子を同定するための方法を提供する。そのような分子は、分子に結合する治療薬または診断薬のための標的として役立ち得る細胞表面分子であり得る。例えば、分子または分子に結合す抗体に特異的なペプチドは、細胞がその分子を産生する患者を治療または診断するために使用され得る。
【0096】
1つの方法では、本開示のペプチドは、本開示のペプチドに結合するか、または本開示のペプチドと相互作用する他のタンパク質を同定するために、2−ハイブリッドアッセイまたは3−ハイブリッドアッセイでの「ベイトタンパク質」として使用することができる(参照:例えば、米国特許第5,283,317号;Zervos et al.(1993);Madura et al.(1993);Bartel et al.(1993);Iwabuchi et al.(1993);およびSuter et al.(2006))。
【0097】
別の方法では、本開示のペプチドは、本開示のペプチドと結合する生体分子を同定するために、細胞抽出物とインキュベーションされる。1つの方法では、本開示のペプチドは、HPLCカラムなどの固形支持体に固定化され、細胞抽出物は、標的分子に本開示のペプチドが結合するのを容易にする条件下で固定化ペプチドに曝される。結合分子は、溶出され、質量分析などの標準的な方法によって同定される。
【実施例】
【0098】
明細書は、明細書内に引用された参考文献の教示を考慮して最も完全に理解される。明細書の以下の実施例は、本開示の実施形態の説明であり、本開示の範囲を制限するものとして解釈すべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本開示により包含されることを容易に認識する。
【0099】
I.実施例1.ファージディスプレイ・ペプチドライブラリーとバイオパンニング
A.細胞株と細胞培養
全てヒト肝細胞癌細胞株である59T、Changliver、HA22T、Hep3B、HepG2、J5、NTUBL、MahlavuおよびSKHeplとヒト初代培養正常鼻粘膜上皮のNNM(8)を使用した。HCC細胞は、Dr.Hsiao M.(Genomic Research Center,Academia Sinica,Taiwan)博士の好意で入手した。全てのヒトHCC細胞株とNNMを、空気中5%または10%CO2の加湿環境下において37℃で、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)および10%胎児ウシ血清(FBS)に維持した。
【0100】
さらなる有用な細胞株は、ヒト肺扁平上皮癌株A549、高転移性ヒト肺腺癌株CL1−5、ヒト肺腺癌株H23、ヒト肺大細胞癌株H460、ヒト肺癌株PC13、ヒト鼻咽頭癌株NPC−TW01、ヒト口腔扁平細胞癌株SAS、ヒト膵臓癌PaCa、結腸(HCT116)、乳房(BT483)、前立腺(PC3)、NNM、ヒト正常鼻粘膜上皮、および線維芽細胞を含む。A549、H23、H460、PC13、PaCa、HCT116、PC3、MahlavuおよびSASは、American Type Culture Collectionから入手できる。CL1−5とNPC−TW01細胞株は、(Chu et al.,1997)および(Lin et al.,1990)により、それぞれ確立した。
【0101】
B.HCC細胞に結合するファージの単離
ファージディスプレイ・ランダムペプチドライブラリーを、HCC、Mahlavu、細胞特異的ファージを選別するために使用した。ファージディスプレイ・ランダムペプチドライブラリー(RPLs)Ph.D.−12キット(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)を我々の実験に使用した。バイオパンニング手順は、先の研究(35)に従って、若干修正して実行した。簡潔に述べると、Mahlavu細胞を、70〜80%コンフルエンスまで増殖させ、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、PBS中5mMのEDTAで採取し、1%のBSAを含む無血清培地で回収した。細胞懸濁液をファージディスプレイ・ランダムペプチドライブラリーの1.5×1011プラーク形成単位(pfu)に添加する前に、4℃で冷却した。反応混合物を4℃で1時間インキュベーションし、非混和性の有機溶媒(フタル酸ジブチル:シクロヘキサン=9:1(Sigma−Aldrich,Saint Louis,MO,USA)の上層に移し、遠心分離した。ファージ結合細胞ペレットをLB培地で再懸濁し、ファージを増幅し、Escherichia coli ER2738培養物(New England Biolabs,pswich,MA,USA)で滴定した。採取されたファージを、Mahlavu細胞によるバイオパニングの追加ラウンドに付した。第5ラウンドのファージ溶出液を、ファージクローン同定のためのLB/IPTG/X−Galプレート上で滴定した。親和性選択(バイオパニング)の5ラウンド後、第5ラウンドの回収率は、第1ラウンドで観察されたそれに対して3.5倍に増加した(図1)。
【0102】
C.ELISAによるファージクローンの同定
96のファージクローンを無作為に分離し、ELISAアッセイによりHCC細胞および正常な上皮細胞(NNM)と反応させるのに用いた。約1×104 Mahlavu細胞とNNM細胞を、96ウェルELISAプレートに別々に播種し、一晩増殖させた。プレートを無血清DMEMで洗浄し、1%BSAを含む無血清DMEM培地で4℃においてブロッキングした。次いで、個々のファージクローンの109pfuを添加し、4℃で1時間インキュベーションした。プレートをPBSで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)−複合抗M13抗体(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA)を添加し、4℃で1時間インキュベーションした。プレートをPBSで洗浄し、続いてペルオキシダーゼ基質o−フェニレンジアミン2塩酸塩(OPD;Sigma−Aldrich,Saint Louis,MO,USA)と共にインキュベーションした。反応を3NのHClで終了させ、光学密度をマイクロプレートリーダを使って490nmで測定した。
【0103】
II.実施例2.フローサイトメトリおよび生検分析
A.HCC細胞に特異的に結合するファージクローンの同定
HCC細胞に特異的に結合するファージクローンを分析するために、フローサイトメトリ分析が実施された。HCC細胞を70〜80%コンフルエンスまで増殖させ、PBS中5mMのEDTAで採取した。HCC細胞をFACS緩衝液(1%FBSを有するPBS)に再懸濁し、タンパク質をそれぞれコードしないPC94または対照ファージと共に4℃で1時間インキュベーションした。FACS緩衝液で洗浄後、HCC細胞をモノクローナルの抗M13抗体と共に4℃で1時間インキュベーションし、続いてR−フィコエリスリンに共役した抗マウス抗体(Southern Biotech,Birmingham,AL,USA)と30分間インキュベーションした。CellQuestソフトウェア(BD Bioscience,San Jose,CA,USA)を使って、FACS−Caliburで分析した。
【0104】
その結果は、ファージクローン94(PC94)が、HCC細胞に最も良い反応性を有し、他方、ファージクローンの残りは、HCC細胞に対して適度の結合活性を示したことを明らかにした(図2A)。(A)HCC細胞へのそれぞれの選択されたファージの表面結合活性は、フローサイトメトリで測定された(2番目:細胞は、R−フィコエリスリン共役化抗マウスIgGにより染色された。C:細胞は、対照ファージとインキュベーションされた)。
【0105】
PC94の結合活性は、ファージの異なる用量をHCC細胞と共にインキュベーションすることによりさらに確証され、FACSにより分析された。その結果は、PC94のHCC細胞への結合は、用量依存性の様式で起こることを示した(図2B)。さらに、反応性は、対照ヘルパーファージでは見られなかったし、PC94をNNMと共にインキュベーションした際にも見られなかった(図2B)。これらの結果は、HCCのMahlavu細胞が、PC94に提示されたペプチドにより認識できる未知分子を発現することを明らかにする。
【0106】
他のHCC細胞がPC94により認識できるか否かを研究するために、9つのHCC細胞株が、PC94と共にインキュベーションされ、FACSによって分析された。その結果は、9つのHCC細胞株のうちの6つ(Mahlavu、59T、Hep3B、HepG2、NTUBL、およびSKHepl)が、強力(47〜81.2%)にPC94と反応し、他方、他のHCC細胞株(ChangliverおよびJ5)は、適度の反応性(25.7〜31.9%)を有し、HA22T細胞株は、わずかに弱い反応性(19.1%)であることを示す(図2C)。各HCC細胞株へのPC94の表面結合活性が分析された(黄色:R−フィコエリスリン共役化抗マウスIgGで染色;オレンジ:対照ファージとのインキュベーションされた細胞)。その結果は、これらの細胞株のすべてが、PC94−提示ペプチドで認識できる標的分子を発現することを示す(図2C)。
【0107】
PC94のHCC細胞に対する結合特異性は、HCC患者からの外科的標本を使用して免疫組織化学によりさらに試験された。その結果は、PC94がHCCの外科的標本における腫瘍細胞(図2D、aおよびb)を認識できるが、それらの正常な対応部分(図2D、d)は認識できないことを示している。対照ファージは、HCCの外科的標本の腫瘍組織での免疫反応性を何ら示さない(図2D、c)。PC94または対照ファージとインキュベーションされたHCC患者由来の生検標本は、HRP共役化抗M13抗体を用いて検出された。PC94の免疫反応性は、腫瘍組織(D、aおよびb)で見られたが、しかし、それらの正常な対応部分(D、d)では見られなかった。対照ファージは、これらの生検標本(B、c)(Bar、50μm)と結合することができなかった。
【0108】
肝臓癌組織におけるペプチド結合能の局在下のために、ヒト肝細胞癌のパラフィン切片を、ファージ提示ペプチドおよびビオチン標識ペプチドと共にルーチンの免疫組織化学的手順を用いてインキュベーションした。外科的標本は、Institutional Review Board in NTUH(IRB9461702021)の承認を得て、National Taiwan University Hospital(NTUH)の組織バンクから入手した。
【0109】
B.DNA配列とコンピュータ解析
ELISAとフローサイトメトリ(図2A)による高いHCC細胞反応性を有する15のファージクローン(PC1、2、9、12、15、26、42、47、62、72、84、85、86、88、および94)が選択され、配列決定された。ファージDNAをメーカーの指示に従って抽出した。精製ファージのDNA配列は、自動DNAシーケンサー(ABI PRISM 377;Perkin−Elmer,Waltham,MA,USA)を用いて、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法により決定した。配列決定は、−96gIII配列決定用プライマー5’−CCCTCATAGTTAGCGTAACG−3’(配列番号:31)を用いて実行した。ファージ提示ペプチド配列を、Genetic Computer Group(GCG)プログラムを使用して翻訳し、一列に整列した。ファージ提示ペプチド配列を、GCGソフトウェアによって整列し、異なったコンセンサスモチーフ配列(表1)を明らかにした。対応するDNA配列は、表2に記載する。
【0110】
GCGアラインメント(表1)に基づいて、モチーフPro−Ile/Leu−Leu−Leu−Pro(P−I/L−L−P)を提示するPC94およびPC88の両方が選択された。
【0111】
III.実施例3.インビボでの標的化アッセイとペプチド競合的アッセイのための動物モデル
HCCに対する標的薬物送達のための薬物送達ディレクターとして、PC94によりコードされたポリペプチドSP94の可能性を評価するために、いくつかの問題が対処された。最初に、我々は、SP94がインビボでHCC細胞を標的とすることができるかどうかを調べた。我々は、HCC異種移植モデルでのPC94の腫瘍帰巣性とSP94によるその競合的阻害を調べた。インビボの帰巣性実験は、PC94が、対照ファージよりも8倍以上高い結合活性を有して腫瘍組織に対して帰巣性を有することを示した(図3A)。そのうえ、ペプチド競合的阻害実験では、SP94は、腫瘤に結合するPC94を阻害するのに対し、同じ濃度の対照ペプチドでは、そのような阻害効果を全く有しなかった(図3B)。
【0112】
A.PC94標的化ための動物モデル
インビボでのPC94の標的化能を確かめるために、HCC異種移植片(500mm3)由来Mahlavu担持ラットに、尾静脈を通してPC94または対照ファージを注入した。ファージを循環させ、次いで潅流させた。腫瘍組織と正常な内臓器官に結合したファージ粒子を回収した。その結果は、有意に多くのPC94ファージ粒子が、正常な器官より脳(220倍)、心臓(32倍)および肺(23倍)などの腫瘍組織から回収(組織のグラム単位につき標準化)されたことを証明した。しかし、対照ファージは、腫瘍組織でも、正常器官でも何らの帰巣現象を示さなかった(図3A)。
【0113】
5×106のMahlavu細胞をSCIDマウス(4〜6週齢)の背側外側わき腹に皮下的(s.c.)に注入した。PC94の2×109pfuまたは対照ファージをMahlavu由来異種移植片(500mm3)担持マウスに静脈内(i.v.)注入した。潅流後に、器官(脳、心臓、および肺)と腫瘍組織を摘出し、冷たいPBSで洗浄し、計量した。腫瘍組織および器官に結合したファージを、E.coli ER2738培養物によりレスキューした。溶出されたファージ粒子を、LB/IPTG/X−Galプレート上で滴定した。ペプチド競合的阻害実験では、PC94ファージの2×109pfuが、SP94ペプチドの100μgと対照ペプチドで共注入された。腫瘍担持マウスでの標的化ファージの組織分布を、免疫組織化学的染色によって調べた。組織切片を、マウス抗M13抗体と共にインキュベーションし、続いてビオチン化ウマ抗マウス抗体(ABCキット;Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)とインキュベーションし、PBSで洗浄し、次いで、ABC試薬に浸漬した。切片をDAB溶液+0.01%過酸化水素に浸漬し、PBSで洗浄し、PBS中の50%グリセリンを上に乗せた。
【0114】
B.ペプチド競合的アッセイ
ペプチド競合的阻害アッセイ(図3)は、HCC細胞へのPC94の結合活性が、ファージ粒子の他の部分よりむしろPC94ディスプレイペプチドに依存していることを確認した。これらの結果は、これらのHCC細胞の原形質膜が、合成ペプチドSP94およびPC94ディスプレイペプチドの両方で認識することができ、しかし、ファージの他の部分では認識できないタンパク質などの未知の標的分子を発現することを強く示している。
【0115】
1.ペプチド合成および標識化
標的化SP94(SFSIIHTPILPL)(配列番号:2)と対照(FPWFPLPSPYGN)(配列番号:32)ペプチドを合成し、ペプチド合成中心設備(Biological Chemistry Institute、Academia Sinica)での逆相高速液体クロマトグラフィによって>95%純度まで精製した。ビオチン標識ペプチド(ビオチン−SP94およびビオチン−対照−ペプチド)が、ビオチン分子をペプチドアミノ末端へ共役化することにより合成された。質量分析は、予測された質量を確認した。
【0116】
HCC異種移植片担持マウスに、PC94および同系の合成ペプチドSP94を共注入した。その結果は、SP94が腫瘍組織からのファージ粒子の回収を著しく阻害したことを示した。SP94の100マイクログラムが、腫瘍組織に結合しているPC94の88%を阻害したが、対照ペプチド(con−P)の同じ濃度は、そのような阻害効果を何ら有しなかった(図3b)。
【0117】
PC94の組織分布の立証のために、帰巣性実験および競合的実験由来の腫瘍器官と正常器官の組織切片は、抗ファージ抗体によって免疫染色された。腫瘍細胞だけが、免疫反応性(図3C、d、およびe)を明らかにしたが、脳(図3C、a)、心臓(図3C、b)、および肺(図3C、c)などの正常な器官は、免疫反応性を示さないことが分かった。しかし、PC94を同系の合成ペプチドSP94と共注入した場合、免疫反応性が全く腫瘍組織でみられなかった(図3C、j)。腫瘍細胞も正常な器官も対照ファージ(C、f〜i)(棒、50μm)との免疫反応性を有さないことが分かった。
【0118】
SP94が標的薬物の治療指数を増加させることができたかどうかを調べるために、我々は、正常器官ではなく、腫瘍組織に対するSP94の結合特異性を研究した。帰巣性アッセイとペプチド競合的阻害実験の両方では、PC94は、脳や、心臓や、肺などの正常な内臓器官ではなく、腫瘍組織に特異的に結合することが分かった(図3AおよびB)。免疫組織化学的染色は、PC94粒子が腫瘍組織のみに局在し、脳、心臓、および肺の組織(図3C)には局在しないことを証明した。最終的に、我々は、SP94ペプチドが、HCC患者の腫瘍組織によって産生される標的分子を認識できたかどうかを調べた。PC94(図2D)とビオチン標識SP94は、61.3%(19/31)の陽性率でHCC患者からの外科的標本に発現された標的プロテインを認識した。総合して、我々は、SP94が、正常組織ではなくHCC細胞によって生産された未知の標的分子を特異的に認識すると結論する。従って、この分子は、HCCに対する標的薬物送達に対して有用であり、SP94は、この分子を同定するための試薬を提供する。
【0119】
IV.実施例4.インビボでの腫瘍標的治療試験
SP94とペグ化リポソームドキソルビシンの組み合わせ、すなわち活性またはリガンド媒介標的化と呼ばれるプロセスを使用して、この標的DDSの部位特異的作用は、腫瘍効果(図4および6)を高めて、増加する腫瘍アポトーシス(図5A、5B、および6E)を伴い、腫瘍血管新生(図5Cおよび6D)を減少させた。
【0120】
ペグ化リポソームドキソルビシン(Lipo−Dox)製剤の臨床試験において、改善された薬物動態学的特性および減少した全身的毒性が観察された(40)。ここで、我々の結果は、この標的薬物送達系の部位特異的作用により、SP94−Lipo−Doxは、総白血球数(WBC)の減少を回避することによって血液毒性をさらに減少させることができることを明らかにした(図4Cおよび6C)。非標的ペグ化リポソームドキソルビシン(Con−P−Lipo−DoxおよびLipo−Dox)によって観測された総WBC数の減少は、増加した循環時間、血管内の監禁状態、および単核性食細胞系細胞による非特異的な取り込みの機会の増加に依る可能性がある。そのような白血球減少症は、進行したHCC患者に対するペグ化リポソームドキソルビシンの第2相臨床試験で既に報告した(41、42)。
【0121】
ペグ化リポソームドキソルビシンの第2相臨床試験についての先のいくつかの研究は、薬物が進行したHCCでは、最大で0〜14%の奏効率でほとんど活性を示さなかったと報告している(41〜43)。本明細書で記載されるSP94−Lipo−Doxの増強された治療効果は、従って、進行したHCC患者の治療におけるこの標的薬物送達系について重要な臨床的可能性を示す。さらに、SP94と相互作用する標的分子の同定は、HCC腫瘍組織でのその特異的発現の検証を可能にして、HCC療法のための標的としてのその使用を認証するであろう。
【0122】
標的薬物送達系は、抗癌剤、標的リガンドを具備し、さらに担体を具備し得る。ドキソルビシンがHCCで最も一貫した全奏功率(18%)を提供すると報告されており(36)、また、リポソームドキソルビシンが難治療性乳癌および卵巣癌で顕著な活性を有することが証明されたので(37、38)、この薬物を、抗癌剤として選択し、ポリエチレングリコールでコーティングしたリポソーム(ペグ化リポソーム)が担体として選択した。ペグ化リポソームドキソルビシンを、HCCに対する標的薬物送達の有効性を評価するために、SP94(SP94−Lipo−Dox)と結合した。ヒトHCC異種移植片モデルでは、SP94−Lipo−Doxは、対照ペプチド複合Lipo−Dox(Con−P−Lipo−Dox)およびLipo−Dox処置群(図4および6)と比較して、治療効果において改善を示した。
【0123】
いかなる特定のメカニズムによっても制約されることなく、Con−P−Lipo−DoxおよびLipo−Dox処置群は、以下の要素によって説明され得る。最初に、血管新生腫瘍脈管系の漏出は、腫瘍組織での薬物複合体の選択的血管外漏出を可能とする。さらに、薬物複合体は、有効なリンパドレナージの不足のため、腫瘍組織内に保持され得る。これらの要因は、腫瘍組織での薬物複合体の受動的標的化および蓄積をもたらし得る(14)。また、動物試験では、長時間循環するペグ化リポソームドキソルビシンは、腫瘍での受動的な優先的局在化に至り、フリーの薬物により得られる濃度と比べて、腫瘍組織での薬物濃度は、数倍の増加をもたらすことが証明された(15、39)。
【0124】
A.ペプチド−リポソームドキソルビシンの調製と投与
ペプチド−リポソームドキソルビシンの調製のための手順は、記述されている(8)。簡潔に述べると、ペプチドをNHS−PEG−DSPE[N−ヒドロキシスクシンイミド−カルボキシル−PEG(分子量3400)由来ジステアリルホスファチジルエタノールアミン(NOF Corporation,Tokyo,Japan)]に1:1.5のモル比でカップリングした。カップリング反応は、ペプチジル−PEG−DSPEを生成するために、ペプチドのアミノ末端の遊離アミノ基を用いて実施され、トリニトロベンゼンスルホナート試薬(Sigma−Aldrich,Saint Louis,MO,USA)での残存アミノ基の定量化により確認された。ペプチジル−PEG−DSPEを、脂質2重層の転移温度より高い温度で共インキュベーションした後に、予備形成されたペグ化リポソームドキソルビシンに変換した。
【0125】
SCIDマウス(4〜6週齢)に、5×106のMahlavu細胞を背側外側わき腹に皮下的(s.c.)に注入した。腫瘍担持マウス(100mm3)を、異なる処置A:SP94−Lipo−Dox(SP94−LD);B:Con−P−Lipo−Dox(CP−LD);C:Lipo−Dox(LD);およびD:PBSのために無作為に4群(1群あたり6匹のマウス)に群分けした。処置は、尾静脈注射により、1週間に2回、1mg/kgで、連続した4週間、8mg/kgの総用量を投与した。別の実験では、より大きいMahlavu由来異種移植片(550mm3)担持マウスを、記載されたように4群に群分けした。処置は、尾静脈注射により、1週間に1回、5mg/kgで、連続して2週間、10mg/kgの総用量を投与した。体重と腫瘍の大きさは電子天秤とカリパスによって測定した。腫瘍容積は、式:長さ×(幅)2×0.52を使用して計算した。実験の終わりに、各マウスの腫瘍組織および内臓器官を摘出し、3%のホルムアルデヒドで固定化し、さらなる組織病理学検査のためにOCT包埋した。動物の取り扱いは、Academia Sinica、Taiwanのガイドラインに従って行った。
【0126】
処置の終わり(28日目)に、Con−P−Lipo−DoxとLipo−Dox群の腫瘍の大きさは、SP94−Lipo−Dox群のそれより1.5倍大きかった。対照PBS群の腫瘍の大きさは、SP94−Lipo−Dox群のものより3.3倍大きかった。(P<0.01)(図4A)。さらに、SP94−Lipo−Doxの投与を受けた腫瘍担持マウス群は、Con−P−Lipo−DoxとLipo−Dox処置群のそれと比べて、より少ない腫瘍重量、約40%の阻害を有することが分かった(P<0.01)(図4B)。グラフ中のエラーバーは、標準誤差を表し、P値はStudentのt検定で算出された。
【0127】
1.総WBC数
血液を顎下腺の静脈から抜き取って、凝固を防ぐために15%のEDTA溶液と緩やかに混合した。次に、2%酢酸と1%ゲンチアンバイオレット(Sigma−Aldrich,Saint Louis,MO,USA)を含むRBC溶解緩衝液を添加し、室温でインキュベーションした。総WBCは、血球計を使用して計算された。
【0128】
化学療法剤の全身的送達により起こる副作用を評価するために、総WBC数が測定された。その結果は、SP94−Lipo−Dox治療群の総WBC数(1.9×103/mm3)は、Con−P−Lipo−Dox(1.6×103/mm3)およびLipo−Dox(1.6×103/mm3)治療群のそれらより高いが、PBS群(2.6×103/mm3)のそれより低いことを明らかにした(図4C)。体重は、各処置群で有意に変わらなかった(図4D)。 グラフ中のエラーバーは、標準誤差を表し、P値はStudentのt検定によって算出された。
【0129】
V.実施例5.ペプチド−リポソームドキソルビシン療法における組織病理学的検査、腫瘍血管の免疫蛍光検出、およびアポトーシス細胞
A.TUNEL染色
凍結腫瘍組織切片を末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介dUTPニック末端標識(TUNEL)反応混合物(Roche Diagnostic,Grenzacherstrasse,Basel,CHE)と37℃で1時間インキュベーションした。スライドを、Hoechst33258(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)で対比染色し、封入剤(Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)で封入した。次いで、スライドは、蛍光顕微鏡下で視覚化された。
【0130】
B.CD31染色
凍結腫瘍組織切片を、メタノール−アセトン(1:1)により固定化し、PBSで洗浄し、ブロッキング緩衝液(PBS中、1%BSA)中に浸漬し、続いて、ラット抗マウスCD31(BD Pharmingen,San Diego,CA,USA)とインキュベーションした。切片をPBST0.1(PBS中、0.1%のTween−20)で洗浄し、次いで、ウサギ抗ラット抗体(Stressgen,Ann Arbor,MI,USA)とインキュベーションし、ローダミン標識ヤギ抗ウサギ抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,USA)に浸漬した。スライドを、Hoechst33258(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)で対比染色し、封入剤で封入し、蛍光顕微鏡下で視覚化した。
【0131】
各処置群の腫瘍組織の組織病理をH&E染色後に調べた。著しく分散した壊死/アポトーシス領域が、SP94−Lipo−Dox処置異種移植片の全切片に存在したのに対し、適度の壊死/アポトーシス領域が、Lipo−DoxおよびCon−P−Lipo−Dox処置異種移植片で見られた。PBS処置群は、正常なHCC細胞を示した(図5A)。SP94−Lipo−Dox(SP94−LD)処置異種移植片の全切片は、著しく分散した壊死/アポトーシス領域を示すのに対し、Con−P−Lipo−Dox(CP−LD)とLipo−Dox(LD)異種移植片は、適度の壊死/アポトーシス領域を示し、PBS群は、正常なHCC細胞(棒:上側のパネル、500μmおよび下側のパネル、50μm)を示す。
【0132】
切片を、アポトーシス腫瘍細胞(緑色)を視覚化するためにTUNEL標識した。TUNEL陽性腫瘍細胞は、Con−P−Lipo−DoxおよびLipo−Dox群と比較して、SP94−Lipo−Dox処置群で、より均等に分布した。アポトーシス腫瘍細胞は、PBS処置群では見られなかった(棒、100μm)。(図5B)。TUNELを、アポトーシス腫瘍細胞を同定するために使用し、抗CD31抗体を、腫瘍血管を検出するために適用した。腫瘍からの代表的な顕微鏡視野は、Con−P−Lipo−DoxおよびLipo−Dox処置群よりもSP94−Lipo−Dox処置群において、より多くのアポトーシス腫瘍細胞(図5B)と、より低密度の血管(図5C)を示す。
【0133】
切片を、腫瘍血管(赤色)を視覚化するために抗CD31抗体で染色し、H33258(青色)(棒、100μm)で対比染色した。(図5C)。CD31陽性内皮細胞の領域を、低倍率で定量化(n=6)し、CD31陽性内皮細胞の領域を、低倍率下でも定量化(n=6)した。CD31陽性内皮細胞の領域は、PBS対照群でのそれらと比較して、Lipo−DoxおよびCon−P−Lipo−Dox処置群では、著しく減少した(n=6、P<0.05)。CD31陽性内皮細胞の領域は、Con−P−Lipo−DoxおよびLipo−Dox群でのそれらと比較して、SP94−Lipo−Dox処置群でさらに減少した(n=6、P<0.001)(図5D)。PBS処置群では、高い腫瘍血管密度が見られ、アポトーシス細胞は見られなかった(図5BおよびC)。グラフ中のエラーバーは、標準誤差を表し、P値はStudentのt検定で算出した。
【0134】
VI.実施例6.大きいHCC異種移植片腫瘍の治療のためのペプチド−リポソームドキソルビシン療法
大きい異種移植片が、また、SP94−Lipo−Dox処置に応答することができたかどうかを確認するために、大きいHCC異種移植片(550mm3)を担持するラットを、異なる処置:A:SP94−Lipo−Dox(SP94−LD);B:Con−P−Lipo−Dox(CP−LD);C:Lipo−Dox(LD)およびD:PBSのために4群に群分けした。処置の終わり(14日目)に、Con−P−Lipo−DoxとLipo−Dox群の腫瘍サイズは、SP94−Lipo−Dox群のものより1.3倍および1.2倍に徐々に増加した(それぞれP=0.089、P<0.05)。対照PBS群の腫瘍のサイズは、SP94−Lipo−Dox群のそれより1.9倍大きかった(P<0.05)(図6A)。さらに、SP94−Lipo−Doxの投与を受けた腫瘍担持マウスの群は、Con−P−Lipo−Dox、Lipo−Dox、およびPBS群よりも、小さい腫瘍重量を有することが分かった。Con−P−Lipo−Dox、Lipo−Dox、およびPBS群の腫瘍重量は、SP94−Lipo−Dox群のそれよりも、それぞれ1.3倍、1,2倍および2.1倍大きく増加した(P<0.05。)(図6B)。総WBC数は、また、10日目に分析されて、SP94−Lipo−Dox処置群(11.8×103/mm3)の総WBCが、Con−P−Lipo−Dox(8.8×103/mm3)およびLipo−Dox(8.2×103/mm3)処置群のそれらより大きいが、PBS群(13.9×103/mm3)のものより少なかった(図6C)。
【0135】
各処置群における腫瘍組織の組織病理をH&E染色により調べた。著しい壊死/アポトーシス領域が、SP94−Lipo−Dox処置異種移植片からの全切片に存在したが、他方、適度の壊死/アポトーシス領域が、Lipo−DoxおよびCon−P−Lipo−Dox処置異種移植片で見られ、PBS処置群は、正常なHCC細胞を示した(図6E)。各処置群からの腫瘍組織におけるCD31陽性内皮細胞の領域は、低倍率下でも定量化(n=6)された。CD31陽性内皮細胞の領域は、PBS対照群のそれらと比較して、Lipo−DoxおよびCon−P−Lipo−Dox処置群では、わずかに減少した。しかし、CD31陽性内皮細胞の領域は、Con−P−Lipo−DoxおよびLipo−Dox群でのそれらと比較して、SP94−Lipo−Dox処置群で著しく減少した(n=6、P<0.001)(図6D)。(棒:上側のパネル、500μmおよび下側のパネル、50μm)。グラフ中のエラーバーは、標準誤差を表し、P値はStudentのt検定で算出された。
【0136】
本明細書で議論された刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにだけ提供される。本開示が、先願発明によるそのような刊行物に先行する権利を与えられないことを承認するものとして決して理解してはいけない。本明細書での任意の刊行物の引用は、そのような参考文献が本開示に先行するものであることを認めるものではない。さらに、提供された刊行物の日付は、独立して確認される必要があるかもしれない現実の発行日と異なっているかもしれない。
【0137】
X.実施例7:結合におけるPC88とPC94の比較
FACS分析を、PC88とPC94の結合活性を比較するために実施した。Mahlavu細胞を1×109、5×109、7.5×109、および1×1010のTUでそれぞれインキュベーションし、個々のファージクローンの表面結合活性は、実施例2に記載した手順を使ってFACSにより分析した。PC94のMahlavu細胞結合活性は、PC88より良好である(図7)。Con−ファージは、対照ファージを示す。
【0138】
XI.実施例8:インビボでのPC88とPC94の腫瘍帰巣の比較
PC88とPC94の腫瘍帰巣性を、SCIDマウスで比較した。HCC異種移植片を担持するSCIDマウスをPC88、PC94および対照ヘルパーファージで静脈注射し、ファージを、実施例3に記載されたように潅流後に回収した。腫瘍や、脳、心臓、肺などの対照器官から回収されたファージの力価は、LB/IPTG/X−Galプレート上で測定された。PC94の腫瘍帰巣性は、PC88より良好である(図8)。
【0139】
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【0140】
【表1】
【0141】
【表2】
【技術分野】
【0001】
(優先権の主張)
本出願は、2007年11月20日に出願された仮出願番号第60/996,488号に対する優先権を主張するものであり、その全ては参照することにより組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
(本発明の背景)
世界的に、肝細胞癌(HCC)は、10番目に致命的な癌関連の死因である。手術、放射線および化学療法の進歩と併用をもってしても、HCCの予後は依然としてよくない(非特許文献1)。アメリカ合衆国における肝臓癌である個人についての5年生存率は、従来の積極的な療法にもかかわらず、わずか8.9%であり、この悪性腫瘍は、膵管腺癌(5年で4.4%の生存率)に次ぐ2番目に致命的な癌である(非特許文献2)。2005年には、肝臓癌の新しい症例が世界中で667,000件を超えたが、そのうちアジアとサハラ以南のアフリカで80%を占めた(非特許文献3)。分子腫瘍学の分野での非常にすばらしい進展とともに、新しい治療戦略が、この病気を治療する試みにおいて絶えず開発されている。
【0003】
腫瘍細胞とそれに対応する両性細胞との間に改善された区別をする、癌に対する標的治療学の開発は、現在の抗癌研究の主要な目的のうちの1つである。大部分の化学療法剤は、腫瘍部位に優先的に蓄積しない。実際に、腫瘍に達する用量は、正常な器官に蓄積する用量の5〜10%とわずかである(非特許文献4)。毒性の副作用は、抗癌剤の用量増加をしばしば制限し、不完全な腫瘍応答、疾患の早期再発、そして最後には薬剤耐性の発症をもたらす。抗癌剤を送達系に封入することや(非特許文献5)、癌細胞で過剰発現もしくは特異的に発現される抗原もしくは受容体に結合するモノクローナル抗体(非特許文献6、非特許文献7)またはペプチドリガンド(非特許文献8、非特許文献9)を介して抗癌剤を標的とするなどの抗癌剤の選択的な毒性を改善するいくつかのアプローチが開発された。
【0004】
脂質または高分子系の抗癌性ナノ医療などの薬物送達系(DDS)が、研究されてきた(非特許文献10)。DDSは、通常、リポソームや、ミセル、脂質エマルジョン、および脂質−薬剤複合体などの他の脂質系担体を含む200nm以下の直径のナノ粒子および微粒子を意味する;また、高分子−薬剤複合体および免疫複合体などの様々なリガンド標的生成物も含まれる(非特許文献11)。腫瘍脈管構造の透過亢進は、高分子系の癌療法による標的化の成功を左右する鍵となる要因のうちの1つである(非特許文献12)。静脈内投与の後、100〜600nmの平均孔径を有すると推定される血管新生腫瘍脈管構造の「漏出」(非特許文献13)は、腫瘍組織での複合体の選択的な血管外漏出を許容する。その上、腫瘍組織は、効果的なリンパドレナージをしばしば欠き、それはその後、高分子保持を促進する。これらの要因の組み合わせは、腫瘍組織での複合体の蓄積に至る−Maedaによって「強化された透過性と保持性(EPR)効果」として命名された受動的標的化現象(非特許文献14)。リポソームによるEPR媒介受動的腫瘍標的化は、薬剤を含まずに得られるものと比較して、固形腫瘍で薬剤濃度の数倍の増加をもたらすことができる(非特許文献15)。
【0005】
DDSの特有の効力は、それらの関連治療剤の薬物動態と生体内分布を変えるそれらの可能性である(非特許文献5)。様々な治療的分子へのポリエチレングリコール(PEG)または他の不活性高分子の結合は、腎臓および細網内皮系(RES)による薬物クリアランスを減少させ得る(非特許文献16)。リポソームや高分子−薬物複合体などのより大きな粒子の担体については、正常な器官に対するより低い悪影響で低、主に血液コンパートメントを制限する。
【0006】
非経口投与のために現在承認された大多数のDDSは、リポソーム系または脂質系製剤、および例えば、ペグ化リポソームドキソルビシンなどのPEGに連結された治療的分子を含み、それは、43%と59%の全体的な応答率で、エイズに関連するカポジ肉腫などの高血管新生の腫瘍を治療するのに用いられた(非特許文献17、18)。しかし、粒子のDDSは、肝臓、脾臓、および骨髄の単核性食細胞系の細胞において薬剤の蓄積増加を引き起こし、これらの組織に対して毒性が増加する可能性がある(非特許文献19)。さらに、粒子DDSの増加した循環時間と制限により、好中球減少症、血小板減少症、および白血球減少症などの血液学的な毒性も明らかとなった(非特許文献20)。腫瘍細胞および腫瘍脈管構造表面抗原または受容体を標的とするリガンドとそれらを結合することにより、DDSの部位特異的作用を増強する努力がなされ、これは、活性型−またはリガンド−媒介標的化と呼ばれるプロセスである(非特許文献8、21)。さらに、親和性標的化による腫瘍組織への化学療法剤の送達が研究されている(非特許文献22、23)。
【0007】
モノクローナル抗体は、腫瘍標的化剤として臨床的な可能性を示したが、それらのサイズのために抗体の弱い腫瘍透過性、および非特異的抗体取り込みに起因する肝臓/骨髄毒性は、抗体療法の2つの主要な制約である。ペプチド−標的化剤は、抗体癌治療に関連している問題を緩和し得る(非特許文献24)。微生物上で提示されたコンビナトリアルライブラリーは、腫瘍特異的標的化リガンドを同定するための可能な戦略である。
【0008】
ファージディスプレイ技術は、B細胞エピトープ(非特許文献25〜27)を同定するために、腫瘍細胞(非特許文献8、28、29)および腫瘍脈管構造特異的ペプチド(非特許文献30〜33)を発見するために適用された。DDSと腫瘍特異性ペプチドとの組み合わせは、ほんの少しの標的化リガンド分子を介して腫瘍細胞に送達される数千の抗癌剤分子にまで至らしめる。腫瘍部位での抗癌剤分子の徐放は、また、治療的な利点を有し得る(非特許文献8、34)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Thomas,M.B.,and Zhu,A.X.(2005)Hepatocellular carcinoma:the need for progress.J Clin Oncol 23,2892−2899.
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【非特許文献18】Stewart,S.,Jablonowski,H., Goebel,F.D.,Arasteh,K.,Spittle,M.,Rios,A.,Aboulafia,D.,Galleshaw,J.,and Dezube,B.J.(1998)Randomized comparative trial of pegylated liposomal doxorubicin versus bleomycin and vincristine in the treatment of AIDS−related Kaposi’s sarcoma.International Pegylated Liposomal Doxorubicin Study Group.J Clin Oncol 16,683−691.
【非特許文献19】Harrington,K.J.,Mohammadtaghi,S.,Uster,P.S.,Glass,D.,Peters,A.M., Vile,R.G.,and Stewart,J.S.(2001)Effective targeting of solid tumors in patients with locally advanced cancers by radiolabeled pegylated liposomes.Clin Cancer Res 7,243−254.
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【非特許文献30】Arap,W.,Pasqualini,R.,and Ruoslahti,E.(1998)Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model.Science 279,377−380.
【非特許文献31】Hoffman,J.A.,Giraudo,E.,Singh,M.,Zhang,L.,hioue,M.,Porkka,K.,Hanahan,D.,and Ruoslahti,E.(2003)Progressive vascular changes in a transgenic mouse model of squamous cell carcinoma.Cancer Cell 4,383−391.
【非特許文献32】Joyce,J.A.,Laakkonen,P.,Bernasconi,M.,Bergers,G.,Ruoslahti,E.,and Hanahan,D.(2003)Stage−specific vascular markers revealed by phage display in a mouse model of pancreatic islet tumorigenesis.Cancer Cell 4,393−403.
【非特許文献33】Lee,T.Y.,Lin,C.T.,Kuo,S.Y., K., C.D.,and Wu,H.C.(2007)Tumor−homing peptides with targeting to tumor blood vessels of lung cancer for drug delivery.Cancer Research 67,10958−10965.
【非特許文献34】Pastorino,F.,Brignole,C,Di Paolo,D.,Nico,B.,Pezzolo,A.,Marimpietri,D.,Pagnan,G.,Piccardi,F.,Cilli,M.,Longhi,R.,Ribatti,D.,Corti,A.,Allen,T. M.,and Ponzoni,M.(2006)Targeting liposomal chemotherapy via both tumor cell−specific and tumor vasculature−specific ligands potentiates therapeutic efficacy.Cancer Res 66,10073−10082.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
本開示は、特に以下のものを単独で、あるいは組み合わせて具備する:
本開示は、ポリヌクレオチドまたはその変異体を提供し、前記ポリヌクレオチドが、肝細胞癌細胞に特異的なペプチドをコードし、前記ポリヌクレオチドが、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号;13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、および配列番号:29から選択される配列を具備する。
【0011】
本開示は、ポリヌクレオチドまたはその変異体を提供し、前記ポリヌクレオチドが、肝細胞癌細胞に特異的であり、前記ポリヌクレオチドが、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号;14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、および配列番号:30から選択される配列を具備する。1つの実施形態では、前記ポリペプチドは、SP94(配列番号:2)、またはその変異体を具備する。別の実施形態では、前記ポリペプチドは、SP94(配列番号:2)を具備する。別の実施形態では、前記ポリペプチドは、隣接するアミノ酸PILPを具備する。
【0012】
本開示は、第2ポリペプチドに融合した第1ポリペプチドを具備する融合タンパク質を提供し、前記第1ポリペプチドが肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドおよび第2ペプチドを具備する。1つの実施形態では、前記第2ポリペプチドは、肝細胞癌細胞に特異的な1つ以上のポリペプチドを具備する(例えば、前記ポリペプチドは、ホモ2量体、ヘテロ2量体、または他の多量体である)。別の実施形態では、前記第2ポリペプチドは、グルタチオンS−転移酵素(GST)領域を具備する。別の実施形態では、前記第2ポリペプチドは、GFPを具備する。別の実施形態では、前記第2ポリペプチドは、免疫学的タグを具備する。別の実施形態では、前記第2ポリペプチドは、抗体ドメインを具備する。別の実施形態では、前記抗体ドメインは、抗体のFc領域である。
【0013】
本開示は、ポリペプチドまたはその変異体を提供し、前記ポリペプチドは、肝細胞癌細胞に特異的であり、前記ポリペプチドまたはその変異体は、1つ以上の薬剤と共役化されている。1つの実施形態では、前記薬剤は、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗VEGFアプタマー、および放射性分子から選択される。
【0014】
本開示は、肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたはその変異体と結合する抗体を提供する。
【0015】
本開示は、肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたはその変異体を具備するリポソームを提供する。1つの実施形態では、前記リポソームは、SP94(配列番号:2)またはその変異体を具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、SP94(配列番号:2)を具備する。別の実施形態では、本開示のリポソームは、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗VEGFアプタマー、および放射性分子から選択される少なくとも1つの薬剤をさらに具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、ドキソルビシンを具備する。
【0016】
本開示は、治療を必要とする哺乳動物に、肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたはその変異体の治療有効量を投与するステップを具備する哺乳動物の病気を治療する方法を提供し、前記ポリペプチドまたはその変異体が、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗VEGFアプタマー、および放射性分子から選択される1つ以上の薬剤と共役化されている。1つの実施形態では、前記哺乳動物は、ヒトである。
【0017】
本開示は、治療を必要とする哺乳動物に、1つ以上の薬剤と肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたはその変異体を具備するリポソームの治療有効量を投与するステップを具備する哺乳動物の病気を治療する方法を提供する。1つの実施形態では、前記リポソームは、配列番号:2を具備するポリペプチド、またはその変異体を具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、配列番号:2を具備するポリペプチドを具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗VEGFアプタマー、および放射性分子を含む1つ以上の薬剤を具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、ドキソルビシンを具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、配列番号:2、またはその変異体、およびドキソルビシンを具備する。別の実施形態では、前記リポソームは、配列番号:2およびドキソルビシンを具備する。別の実施形態では、前記病気は癌である。別の実施形態では、前記癌は肝臓癌である。別の実施形態では、前記肝臓癌は肝細胞癌である。別の実施形態では、前記哺乳動物はヒトである。
【0018】
本開示は、
a)ポリペプチドが肝臓癌細胞に結合するのを可能とする条件下で、検体を肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたはその変異体と接触させるステップ、および
b)前記ポリペプチドに結合する抗体を用いて、前記ポリペプチドの結合を検出するステップ、
を具備する検体での肝臓癌を検出する方法を提供する。1つの実施形態では、ポリペプチドまたはその変異体は、肝細胞癌に特異的なポリペプチドと、エピトープを具備する別の配列とを具備する融合ポリペプチドを具備する。前記融合ポリペプチドの肝細胞癌細胞への結合は、エピトープに結合する抗体を用いて検出され得る。
【0019】
本開示は、
a)ポリペプチドまたはその変異体と分子を具備する複合体の形成を可能とする条件下で、細胞抽出物をポリペプチドまたはその変異体と接触させるステップ、および
b)細胞分子を同定するために複合体を分析するステップ、
を具備する肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドまたは変異体に結合する細胞分子を同定する方法を提供する。
【0020】
本開示は、変異体のポリヌクレオチドが、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号;13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、および配列番号:29から選択されるポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズする、本開示のポリヌクレオチドの変異体を提供する。1つの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【0021】
本開示は、変異体のポリペプチドが、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号;13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、および配列番号:29から選択されるポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、本開示のポリヌクレオチドの変異体を提供する。1つの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【0022】
本開示は、ポリペプチドが標識を具備する本開示のポリペプチドを対象に投与し、対象での癌へのポリペプチドの結合を検出するステップを具備する、対象での癌の検出方法を提供する。1つの実施形態では、前記標識は、放射性分子を具備する。別の実施形態では、前記癌は肝臓癌である。別の実施形態では、前記肝臓癌は肝細胞癌である。別の実施形態では、前記対象は哺乳動物である。別の実施形態では、前記哺乳動物はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【0023】
特許または出願ファイルは、カラー仕上げされた少なくとも1つの図面を含む。カラー図面(複数を含む)を有する特許または特許出願刊行物のコピーは、要請と必要な料金の支払いにより特許庁から提供されるであろう。
【図1】図1は、インビトロでのファージディスプレイを用いたHCC細胞特異的ファージの単離を示す。
【図2A】図2A〜Dは、HCC細胞株とヒトHCC生検標本へのPC94の結合活性を示す。
【図2B】図2A〜Dは、HCC細胞株とヒトHCC生検標本へのPC94の結合活性を示す。
【図2C】図2A〜Dは、HCC細胞株とヒトHCC生検標本へのPC94の結合活性を示す。
【図2D】図2A〜Dは、HCC細胞株とヒトHCC生検標本へのPC94の結合活性を示す。
【図3】図3A〜Cは、インビボでのPC94の腫瘍帰巣性の実証を示す。
【図4】図4は、標的化ペプチドSP94の共役は、治療効力を高め、HCC異種移植片モデルでのリポソームドキソルビシンの血液学的な毒性を減少させることを示す。
【図5】図5A〜Dは、SP94−Lipo−Dox処置HCC異種移植片の組織病理学的検査を示す。
【図6A】図6は、大きなHCC異種移植片を担持するSCIDマウスのSP94−Lipo−Doxによる処置を示す。
【図6B】図6は、大きなHCC異種移植片を担持するSCIDマウスのSP94−Lipo−Doxによる処置を示す。
【図6C】図6は、大きなHCC異種移植片を担持するSCIDマウスのSP94−Lipo−Doxによる処置を示す。
【図6D】図6は、大きなHCC異種移植片を担持するSCIDマウスのSP94−Lipo−Doxによる処置を示す。
【図6E】図6は、大きなHCC異種移植片を担持するSCIDマウスのSP94−Lipo−Doxによる処置を示す。
【図7】図7は、FACSによる選択されたファージクローンの結合活性の用量依存性分析。
【図8】図8は、インビボでのPC88および94の腫瘍帰巣性の実証を示す。
【発明を実施するための形態】
【0024】
表1は、Mahlavu細胞から選択されたファージ由来のファージディスプレイされたポリペプチド配列を提供する。
【0025】
表2は、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【0026】
(発明の詳細な説明)
HCCは5番目に一般的な癌であり、世界中の癌死亡の4番目の主な原因として格付けされる(1)。唯一の治療的処置は、外科的切除または肝臓移植であり、ほんの少しの患者だけがこれらの処置に適している(36)。進行した段階で現れる大多数のHCCsは、治療処置が及ばない。進行したHCCsに対する単剤療法または併用療法としての全身的化学療法は、過去30年間、広範囲に研究されてきており、無効であることが広く認められている(36)。全身治療における効果を改善すること、および恩恵を受けるそうした患者を選択することは、依然として大きな挑戦である。我々は、ファージディスプレイ・スクリーニングを介して特定される新しい標的化ペプチド、つまり肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチド、および前記ペプチドを用いたHCCに対する標的薬物送達の開発を報告する。
【0027】
最初に、我々は、インビトロおよびインビボの両方でHCC細胞と特異的に結合することができる新規ペプチドを特定するためにファージディスプレイされたペプチドライブラリーを使用した。そのようなペプチドの1つは、SP94である。さらに、SP94をコードするファージPC94は、腫瘍組織表面を認識するが、HCC患者からの外科的標本での正常な対応する部位は認識しない。標的化ペプチドSP94およびドキソルビシンを含むリポソームは、HCC異種移植片モデルで治療有効性を改善した。このように、SP94ペプチドは、進行したHCCsの全身的な処置を改善することができる。
【0028】
I.定義
本明細書で使用される用語は、以下に説明されるように、それらにおける通常の意味を有し、明細書の文脈でさらに理解することができる。
【0029】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を意味するために本明細書では互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および/またはそれらの類似体または誘導体を具備することができる。本明細書で示されるヌクレオチド配列は、5’から3’方向へ記載される。
【0030】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸の重合形態を意味するために本明細書では互換的に使用される。
【0031】
「変異体」という用語は、本開示のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列における挿入、付加、欠失、または置換を含み、前記変異体は、肝細胞癌細胞に特異的である。
【0032】
「実質的に同一な」、「実質的に類似の」という語句は、関連したアミノ酸またはヌクレオチド配列が、開示された配列と比較して、同一であるか、あるいは、実質的でない違い(保存されたアミノ酸置換により)を有することを意味する。
【0033】
ポリペプチドに関して、少なくとも10、20、30、50、100、またはそれを超えるアミノ酸が、もとのポリペプチドと実質的に同じである変異体ポリペプチドとの間で比較される。核酸については、少なくとも30、40、50、100、150、300、またはそれを超えるヌクレオチドが、もとの核酸と実質的に同じである変異体核酸との間で比較される。従って、変異体は、領域または複数の領域で実質的に同一であることができ、「実質的に同一」の定義を依然として満たしながら、他の領域で異なることができる。2つの配列間のパーセント同一性は、例えば、Altschul et al.,J.MoI.Biol.,215:403−410(1990)に記載されたBasic Local Alignment Tool(BLAST)、Needleman et al.,J.MoI.Biol.,48:444−453(1970)のアルゴリズム、またはMeyers et al.,Comput.Appl.Biosci.,4:11−17(1988)のアルゴリズムなどの標準的なアラインメントアルゴリズムにより決定される。
【0034】
「リポソーム」という用語は、内部の水性スペースを囲む外側の脂質の2層または多層の膜を具備する組成物を意味する。前記用語は、一般に約1〜約10μmの範囲の直径を有し、水相である層と交互に2〜数百の同心である範囲で脂質2重層を具備する多層状のリポソームを含む。この用語は、単一の脂質層から構成され、約20〜約400ナノメートル(nm)、約50〜約300nm、約300〜約400nm、または約100〜約200nmの範囲の直径を一般に有する単層小胞を含む。前記用語は、また、約65nmから約75nmの直径を有するリポソームを含む。
【0035】
「抗体」という用語は、免疫グロブリンまたはその断片を意味し、抗原結合断片または抗原結合ドメインを具備するどのようなポリペプチドも包含する。前記用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異的抗体、多特異的抗体、非特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組み換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、移植抗体,およびインビトロ生成抗体を含むが、これらに限定されない。「完全な」という言葉が先行しない限り、「抗体」は、Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、dAb、および抗原結合機能を保持する他の抗体断片などの抗体断片を含む。一般的に、そのような断片は、抗原結合ドメインを具備するであろう。
【0036】
「抗原結合ドメイン」および「抗原結合断片」という用語は、抗体と抗原の間の特異的結合を担うアミノ酸を具備する抗体分子の一部を意味する。抗体によって特異的に認識されて、結合する抗原の部分は、「エピトープ」と呼ばれ、これは、ポリペプチドのアミノ酸残基の連続した配列であっても、なくてもよく、他の化学構造を有する糖類および/または分子を具備し得る。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域(VL)と抗体重鎖可変領域(VH)を具備し得る;しかし、それは両方を具備する必要はない。Fd断片は、例えば、2つのVH領域を有し、完全な抗原結合ドメインのいくつかの抗原結合機能を保持する。抗体の抗原結合断片の例は、(1)VL、VH、CL、およびCHIドメインを有する1価の断片であるFab断片;(2)ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された2つの断片を有する2価の断片であるF(ab’)2;(3)2つのVHおよびCHIドメインを有するFd断片;(4)抗体の単一アームのVLおよびVHドメインを有するFV断片;(5)VHドメインを有するdAb断片(Ward et al.,(1989)Nature 341:544−546);および(6)単離された相補性決定領域(CDR)を含む。さらに、Fv断片の2つのドメインVLとVHは、別々の遺伝子でコード化されるが、それらは、組み換え法を使用して、それらをVLとVH領域が1対となり1価の分子を形成する(単一鎖FV(scFV)として知られる)単一のタンパク鎖として作製されるのを可能にする合成リンカーで結合することができる;例えば、Bird et al.(1988)Science 242:423−426;およびHuston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883を参照のこと。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して得ることができ、断片は、完全な抗体の場合と同様に有用性についてスクリーニングされる。
【0037】
「特異的にハイブリダイズする」という用語は、ポリヌクレオチドの文脈において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼ−ションを意味する。DNA/DNAとDNA/RNAのハイブリダイゼ−ション反応のストリンジェンシーを増やす条件は、広く知られており、当技術分野で公表されている。ストリンジェントなハイブリダイゼ−ション条件の例は、約65〜70℃での4×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)におけるハイブリダイゼ−ション、または約42〜50℃での4×SSC+50%ホルムアミドにおけるハイブリダイゼ−ション、次いで、約65〜70℃での1×SSC中の1回以上の洗浄を含む。
【0038】
ペプチドが肝細胞癌細胞と結合または相互作用するが、他の細胞と特異的に結合または相互作用しないとき、ペプチドは、肝細胞癌細胞に対して「特異的」である。
【0039】
「リガンド」という用語は、受容体を含む別の分子と結合する分子を意味する。
【0040】
「宿主細胞」は、任意の組み換えベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであることができるか、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物である。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、その子孫は、自然突然変異、偶発的突然変異または意図的突然変異および/または変化によりもとの親細胞と必ずしも完全に同一(形態学で、または全DNA相補体で)であるというわけではない。宿主細胞は、インビトロまたはインビボで、本開示の組み換えベクターまたはポリヌクレオチドによりトランスフェクションされたか、または感染させられた細胞を含む。本開示の組み換えベクターを具備する宿主細胞は、「組み換え宿主細胞」と呼ばれる場合がある。
【0041】
「標本」は、患者に由来する任意の生物学的検体である。前記用語は、生物学的起源の細胞や組織だけでなく、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ液、透析液、洗浄液,精液、および他の液体サンプルなどの生物学的液体を含むが、これに限定されるものではない。前記用語は、また、細胞またはそれから誘導される細胞とその子孫を含み、それは培養細胞、細胞上澄み液、および細胞溶解物も含む。それは器官または組織培養由来の液体、組織生検サンプル、腫瘍生検サンプル、検便サンプル、および生理的組織から抽出された液体のみならず、同様に固体組織から分散した細胞、組織切片、および細胞溶解物をさらに含む。この定義は、それらの調達の後で試薬による処理、可溶化、またはポリヌクレオチドやポリペプチドなどの特定の成分に対する富化などの任意の方法で操作されたサンプルを包含する。この定義は、また、患者のサンプルの派生物および断片もこの用語に含まれる。患者のサンプルは、診断検査、予後検査、または他のモニタリング検査において使うことが可能である。この用語は、また、ヒト以外の哺乳動物からの生物学的検体にもあてはまる。標本は、ヒトの患者またはヒト以外の哺乳動物由来であることができる。
【0042】
「治療」は、本明細書で使用されるように、ヒトを含む哺乳動物の病気に対する医薬の任意の投与または適用を含み、例えば、後退させる、失われた、無くなった、または不完全な機能を回復または修復すること、あるいは能率が悪いプロセスを刺激することによって病気を阻害すること、その進展を抑制すること、または病気を軽減することを含む。前記用語は、ヒトを含む哺乳動物で病的状態または障害のいかなる治療にも及び、望ましい薬理的効果および/または生理的効果を得ることを含む。その効果は、障害またはその徴候を完全に、または部分的に防止する観点から予防する場合があり、病気および/または障害に起因する副作用の部分的または完全な治療に関して治療的である場合がある。従って、本開示は、治療と予防の両方を提供する。それは、(1)障害を患うかもしれないが、まだその徴候が無い対象でその障害の発生または再発を防止すること、(2)その進行を抑えることなどの障害を抑制すること、(3)例えば、失われた、無くなった、または不完全な機能を回復もしくは修復すること、または能率が悪いプロセスを刺激することによって障害またはその徴候の後退をもたらすことにより、宿主が障害またはその徴候にもはや苦しまないようにするために、障害またはそれに関連した少なくとも徴候を阻止するか終わらせること、または(4)障害またはそれに関連した徴候を緩和すること、軽減すること、または改善すること(ここで、改善することは、広義には、炎症、疼痛および/または腫瘍サイズなどのパラメータの大きさの減少について言及するのに使用される)を含む。
【0043】
「医薬的に許容される担体」は、非毒性の固体、半固体、もしくは液体の充填剤、希釈剤、封入材、製剤助剤、または任意の従来タイプの賦形剤を意味する。医薬的に許容される担体は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、製剤の他の成分と相容性である。
【0044】
本明細書での「組成物」は、当技術分野で慣行の医薬的に許容される担体または賦形剤などの担体を通常含む混合物であり、それは、治療目的、診断目的または予防目的のために対象に投与するのに適している。それは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが細胞または培地に存在する細胞培養物を含み得る。例えば、経口投与のための組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤、口腔内洗浄剤、または散剤を形成することができる。
【0045】
「病気」は、医学的介入が必要である、または医学的介入が望ましい任意の状態、感染、障害、または徴候をも意味する。そのような医学的介入は治療、診断、および/または、防止を含むことができる。
【0046】
「癌」は、悪性であるか、前悪性であるか、または非悪性であるかにかかわらず、任意の異常な細胞または組織の増殖、例えば、腫瘍を意味する。それは、周囲組織に侵入するかもしれないし、しないかもしれないため、新しい身体部位に転移するかもしれないし、しないかもしれない細胞の制御されない増殖によって特徴づけられる。癌は、癌腫を包含し、それは上皮細胞癌であり、癌腫は、扁平上皮癌、腺癌、黒色腫、および肝癌を含む。癌はまた、肉腫を包含し、それは間葉起源の腫瘍であり、肉腫は、骨原性肉種、白血病、およびリンパ腫を含む。癌は、1つ以上の新生細胞型を含み得る。癌という用語は、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、膵癌、および口腔癌を含む。
【0047】
II.肝細胞癌細胞に特異的な本開示のポリペプチド
本開示は、ポリヌクレオチドまたはその変異体を提供し、前記ポリヌクレオチドが、肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドをコードし、前記ポリヌクレオチドが、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号;13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、および配列番号:29から選択される配列を具備する。
【0048】
本開示は、ポリペプチドまたはその変異体を提供し、前記ポリペプチドが、肝細胞癌細胞に特異的であり、前記ポリペプチドが、配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号;14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、および配列番号:30から選択される配列を具備する。1つの実施形態では、ポリペプチドは、SP94(配列番号:2)、またはその変異体を具備する。別の実施形態では、ポリペプチドは、SP94(配列番号:2)を具備する。
【0049】
A.変異体
変異体は、ペプチドの生物学的に活性な変異体を含み、ここで、構造が実質的に類似であるか、または実質的に同じである変異体を含む。ペプチド配列の変異体は、対象ペプチドと比較して、挿入、付加、欠失、または置換を含み得る。ポリペプチド配列の変異体は、生物学的に活性な多形変異体を含む。
【0050】
本開示のヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体は、例えば、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%が、開示された核酸分子およびポリペプチドに対する配列において同一であるものを含む。
【0051】
本開示のヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体は、例えば、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%が、開示された核酸分子およびポリペプチドに対する配列において類似しているものを含む。
【0052】
本開示のポリペプチドの変異体は、表1の配列と比較して、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれを超える挿入、付加、欠失、または置換を有する変異体を含む。1つの実施形態では、変異体は、表1で提供される配列と比較して、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれを超える挿入、付加、欠失、または置換を具備し、ここで、前記の挿入、付加、欠失、または置換は、その配列に対して表1に太字で示されたアミノ酸を変更しない。別の実施形態では、変異体は、表1に太字で示された単一配列からのアミノ酸を具備する。
【0053】
本開示のポリヌクレオチドの変異体は、表2で提供される配列と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17または18の挿入、付加、欠失、または置換を含む。1つの実施形態では、変異体は、表2で提供される配列と比較して、挿入、付加、欠失または置換を具備し、ここで、前記の挿入、付加、欠失または置換は、その配列に対して表1に太字で示されたアミノ酸をコードするヌクレオチドを変更しない。別の実施形態では、変異体は、表1に太字で示された単一配列からのアミノ酸をコードするヌクレオチドを具備する。
【0054】
ペプチド変異体は、コード化された、またはコード化されないアミノ酸、化学的にまたは生化学的に改変された、誘導体化された、または設計されたアミノ酸、アミノ酸類似体、ペプチド模倣体、およびデプシペプチド、ならびに改変された、環状の、2環式の、デプシ環状の、またはデプシ2環式のペプチド骨格を含み得る。変異体は、多量体と同様に、単鎖タンパク質を含む。
【0055】
本開示のペプチドの変異体は、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸を含むことができる。変異体は、特別な性質を伝えるために、D−アミノ酸、D−とL−アミノ酸の組み合わせ、および様々な「設計」または「合成」のアミノ酸(例えば、β−メチルアミノ酸、Cα−メチルアミノ酸、およびNα−メチルアミノ酸など)を具備することができる。さらに、変異体は環状であることができる。変異体は、特定の構造モチーフを導入するために、非古典的なアミノ酸を含むことができる。任意の既知の非古典的なアミノ酸を使用することができる。アミノ酸類似体およびペプチド模倣体は、特定の2次構造を誘導または支持するためにペプチドに組み込まれることができ、それらは、LL−Acp(LL−3−アミノ−2−プロペニドン−6−カルボン酸)、β−ターン誘導ジペプチド類似体、β−シート誘導類似体、β−ターン誘導類似体、α−ヘリックス誘導類似体、γ−ターン誘導類似体、GIy−Ala回転類似体、アミド結合等電子体、またはテトラゾールなどを含むが、これらに限定されない。
【0056】
末端アミノまたはカルボキシル基が存在しないように、デスアミノ残基またはデカルボキシ残基を変異体の末端に組み入れて、プロテアーゼに対する感受性を低下させるか、あるいは立体構造を制約することができる。C端の官能基としては、アミド、アミド低級アルキル、アミドジ(低級アルキル)、低級アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、およびその低級エステル誘導体、ならびにその医薬的に許容される塩などが挙げられる。
【0057】
さらに、望まれる場合は、非古典的なアミノ酸または化学的なアミノ酸類似体は、ポリペプチド配列に置換または付加として導入することができる。非古典的なアミノ酸は、一般的なアミノ酸のD−異性体、2、4−ジアミノ酪酸、a−アミノイソ酪酸、4−アミノ酪酸、Abu、2−アミノ酪酸、g−Abu、e−Ahx、6−アミノヘキサン酸、Aib、2−アミノイソ酪酸、3−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアミン、b−アラニン、フルオロ−アミノ酸、設計アミノ酸、例えば、b−メチルアミノ酸、Ca−メチルアミノ酸、およびNa−メチルアミノ酸など、ならびに一般的にアミノ酸類似体を含むことができるが、これに限定されない。さらにまた、アミノ酸は、D型(右旋性の)またはL型(左旋性の)であることができる。
【0058】
変異体は,本開示のペプチドに実質的に類似しているポリヌクレオチド配列を含む。そのような変異体は、本開示のポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイする核酸によってコード化され得る。
【0059】
B.融合タンパク質
本開示は、第2ポリペプチドに融合した第1ポリペプチドを具備する融合タンパク質を提供し、ここで、前記第1ポリペプチドは、肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドおよび第2ポリペプチドを具備する。前記第2ポリペプチドは、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、相同性および非相同性のリーダー配列を有する生物発光性タンパク質などの異種アミノ酸配列、例えば、ルシフェリン、またはイクオリン(緑色蛍光タンパク質)から選択されるが、これに限定されない。前記融合タンパク質は、N−末端メチオニン残基、ペグ化タンパク質、および免疫学的にタグ化されたタンパク質、またはHIS−タグ化タンパク質を具備し得る。そのような融合タンパク質は、また、エピトープへの融合を含む。そのような融合タンパク質は、本開示のペプチドの多量体、例えば、ホモダイマーまたはホモ多量体、ならびにヘテロダイマーおよびヘテロ多量体を具備することができる。
【0060】
本開示のペプチドは、限定されるものではないが、FITC、ビオチン、ならびに64Cu、67Cu、90Y、99mTc、111In、124I、125I、131I、137Cs、186Re、211At、212Bi、213Bi、223Ra、241Amおよび244Cmなど(ただしこれらに限定されない)の放射性同位体などの標識、検出可能な生成物(例えば、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど)を有する酵素、蛍光剤および蛍光標識、蛍光放射金属、例えば152Euまたはランタン系列の別の元素、電気化学発光化合物、化学発光化合物、例えば、ルミノール、イソルミノールまたはアクリジニウム塩、特異的結合分子、例えば、磁性粒子、ミクロスフェア、ナノスフェアなどと共役され得る。本開示のペプチドは、ビノレルビン、シスプラチン、ゲムシタビン、パクリタキセル、エトポシド、Novantrone(ミトキサントロン)、アクチノマイシンD、カンプトテシン(それの水溶性誘導体)、メトトレキサート、マイトマイシン類(例えば、マイトマイシンC)、ダカルバジン(DTIC)、シクロホスファミド、ドキソルビシンやダウノマイシンなどの抗新生物抗生物質、または例えば、(De Vita et al,2001)に記載された他のものなどの治療薬と共役し得る。また、ペプチドは、細胞傷害性薬物、オリゴヌクレオチド、毒素、および放射性分子、または(Ng et al 2006)に記載された抗VEGFアプタマーなどの化合物と共役し得る。
【0061】
III.肝細胞癌細胞に特異的なポリペプチドを作製する方法
本開示のペプチドは、当技術分野で公知の方法を用いて製造することができる。細胞系の方法および無細胞系の方法は、本開示のペプチドの生成に好適である。細胞系の方法は、一般に、核酸を宿主細胞にインビトロで導入すること、および発現に好適な条件下で宿主細胞を培養すること、次いでペプチドを培地からもしくは例えば、宿主細胞を破砕することによって宿主細胞から、または両方からペプチドを採取することを含む。好適な宿主細胞は、例えば、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、および哺乳動物の細胞を含む、原核生物細胞または真核生物細胞を含む。
【0062】
また、本開示は、当技術分野で周知の無細胞インビトロ転写/翻訳方法を用いてペプチドを生成する方法も提供する。
【0063】
通常、異種ペプチドは、改変または未改変であろうと、上述したように、それ自体で、または融合タンパク質として発現されることができ、分泌シグナルだけでなく、分泌リーダー配列も含み得る。本開示の分泌リーダー配列は、ある種のタンパク質を小胞体(ER)に誘導することができる。ERは、膜結合タンパク質を別のタンパク質から分離する。タンパク質は、ERに置かれると、分泌小胞を含めた小胞、原形質膜、リソソームおよび別の細胞小器官への分布のためにさらにゴルジ装置に誘導されることができる。
【0064】
さらに、ペプチド部分および/または精製タグをペプチドに付加することが可能である。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製前に除去し得る。とりわけ、分泌または排出を引き起こし、安定性を改善し、および精製を容易化するために、ペプチド部分をポリペプチドに付加することは、当技術分野ではよく知られたルーチン技術である。好適な精製タグとしては、例えば、V5、ポリヒスチジン、アビジン、およびビオチンが挙げられる。ビオチンなどの化合物とペプチドの共役は、当技術分野で周知の技術を用いて実施することができる。(Hermanson ed.(1996)Bioconjugate Techniques;Academic Press)。ペプチドは、当技術分野で公知の技術を用いて、放射性同位体、毒素、酵素、蛍光標識、コロイド状金、核酸、ビノレルビン、およびドキソルビシンと共役することもできる。(Hermanson ed.(1996)Bioconjugate Techniques;Academic Press;Stefano etal.(2006)。毒素は、免疫毒素を含む。Kreitman and Pastan, Immunotoxins in the treatment of hematologic malignancies.Curr Drug Targets.7:1301−11(2006)。
【0065】
本開示での使用に好適な融合パートナーとしては、例えば、フェチュイン、ヒト血清アルブミン、Fc、および/またはその断片の1個以上が挙げられる。ポリエチレングリコール複合体などの複合タンパク質も提供される。
【0066】
本開示のペプチドは、当技術分野で公知の技術を用いて化学合成することもできる(例えば、Hunkapiller etal.,Nature,310:105 111(1984)、Grant ed.(1992)Synthetic Peptides,A Users Guide,W.H.Freeman andCo.;米国特許第6,974,884号)を参照のこと)。例えば、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドは、ペプチド合成装置を用いて、または当技術分野で公知の固相方法を使用して合成することができる。
【0067】
本開示のポリペプチドは、化学合成および組換え細胞培養物から標準方法によって回収および精製することができる。標準方法としては、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィおよびレクチンクロマトグラフィが挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィ(「HPLC」)を精製に使用する。ポリペプチドが単離および/または精製中に変性するときには、周知のタンパク質再折りたたみ技術によって、活性な立体構造を再生するために使用され得る。
【0068】
本開示のペプチドまたはペプチド模倣体は、種々の親水性ポリマーの1種類以上を用いて改変して、または種々の親水性ポリマーの1種類以上と共有結合させて、ペプチドの溶解性および循環半減期を増加させることができる。ペプチドとのカップリングに好適な非タンパク質親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールによって例示されるポリアルキルエーテル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、そのような親水性ポリマーは、約500〜約100,000ダルトン、約2,000〜約40,000ダルトン、または約5,000〜約20,000ダルトンの範囲の平均分子量を有する。ペプチドは、Zallipsky,S.(1995)Bioconjugate Chem.,6:150−165;Monfardini,C.,etal.(1995)Bioconjugate Chem.6:62−69;米国特許第4,640,835号;同4,496,689号;同4,301,144号;同4,670,417号;同4,791,192号;同4,179,337号、またはWO95/34326号に記載の方法のいずれかにより、そのようなポリマーを用いて誘導体化すること、またはそのようなポリマーに結合させることができる。
【0069】
IV.抗体の生成
本開示の単離したタンパク質は、一般に、当技術分野で公知の抗体産生の方法を使用して、モノクローナルまたはポリクローナルのどちらかの抗体を生成するために使用することが可能である。従って、本開示は、肝細胞癌細胞に特異的なペプチドに対する抗体も含む。抗体は、活性を妨げる抗体と活性を妨げない抗体の両方を含む。
【0070】
抗体は、例えば、伝統的なハイブリドーマ技術(Kohler and Milstein,Nature 256:495−499(1975))、組み換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号)、または抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ技術(Clackson et al.,Nature 352:624−628(1991);Marks et al.,J.MoI.Biol.222:581−597(1991))で作ることができる。様々な抗体生産技術については、Antibodies:A Laboratory Manual,eds. Harlow et al.,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)を参照されたい。
【0071】
本開示の抗体は、以下に記載される病気の治療に使用し得る。また、抗体は、説明されたアッセイおよび検出方法でも使用できる。
【0072】
V.リポソーム調製
リポソームを調製するための様々な方法が、当技術分野で公知であり、それらのいくつかは、Methods of Biochemical Analysis,Volume 33,337−462(1988)中にLichtenbergおよびBarenholzにより記述されている。小さな単層小胞(SUV、サイズ<100nm)は、先に説明されたように(Tseng et al.,1999)、薄膜水和と繰返し押出しの標準方法の組み合わせにより調製できる。リポソームによるDNAの封入を特に伴う調製法、およびリポソーム媒介移入への直接適用を有する方法は、Hug and Sleight et al.,(1991)によって記述されている。また、リポソームを作る方法は、米国特許第6,355,267号および米国特許第6,663,885号に開示されている。リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG−誘導化ホスファチジルエタノールアミン(PEG−PE)を具備する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により生成することができる。リポソームは、希望の直径を有するリポソームをもたらすために、確定した孔径のフィルタを通して押出される。
【0073】
また、リポソームは、Taiwan Liposome Company(台湾台北)などの供給元から商業的に入手可能である。さらに商業的に入手可能なリポソームとしては、TLC−D99、Lipo−Dox、Doxil、DaunoXome、AmBisome、ABELCET、transfectace(DDAB/DOPE)、DOTAP/DOPE、およびLipofectinが挙げられる。
【0074】
本開示のリポソームは、リン脂質から最も頻繁に調製されるが、疎水性部分および親水性部分を有する、類似した分子形状および寸法の他の分子を使用することができる。本開示の目的のために、そのようなすべての好適なリポソーム形成分子は、本明細書では脂質を意味する。1つ以上の天然および/または合成の脂質化合物が、リポソームの調製に使用され得る。
【0075】
リポソームは、親水性基の選択によって、陰イオン性、陽イオン性または中性であり得る。例えば、ホスファート基またはスルファート基を有する化合物が使用される場合、得られるリポソームは、陰イオン性になる。アミノを含む脂質が使用される場合、リポソームは、陽電荷を有し、陽イオン性リポソームとなる。
【0076】
本開示で有用な初期リポソームを形成するための代表的で好適なリン脂質または脂質化合物は、限定されるものではないが、ホスファチジルコリン(レシチン)、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノール−アミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン(セファリン)、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスファート、ホスファチジルコリン、およびジパルミトイル−ホスファチジルグリセロールなどの脂質関連材料を含む。さらなる非リン酸含有脂質は、限定されるものではないが、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシル−アミン、パルミチン酸アセチル、リシノレイン酸グリセリル、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、ジアシルグリセロールスクシネートなどを含む。
【0077】
本開示で使用するためのリポソーム製剤は、陽イオン性(正に帯電)製剤、アニオン性(負に帯電)製剤、および中性製剤を含む。
【0078】
リポソームへの化合物の遠隔負荷は、膜貫通勾配の形成を利用する(Ceh and Lasic,1995)。この方法は、リポソームに負荷すべき化合物 とボロン酸化合物を、懸濁されたリポソームとインキュベーションし、その結果、化合物のリポソーム内への蓄積を達成することを含む(Zalipsky et al.,1998;Ceh B.and Lasic D.D.、1995;Zalipsky et al.,1998;米国特許第6,051,251号)。
【0079】
リポソーム濃度を決定するためにリン酸アッセイを使用できる。1つのリン酸アッセイは、モリブデン酸塩とマラカイトグリーン染料との相互作用に基づく。主な原理は、酸性条件下で還元されると青色の複合体に変換される無色の未還元のリンモリブデン酸塩複合体を形成するために。無機のリン酸塩をモリブデン酸塩と反応させることを含む。リンモリブデン酸塩は、マラカイトグリーンで共役すると、20倍または30倍強い色を与える。最終生成物の還元された緑色の可溶性の複合体は、620nmでのその吸光度により測定され、溶液中の無機リン酸塩の直接測定である。
【0080】
VI.医薬組成物の調製
本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体は、癌の治療および血管新生の阻害で使われてきた広範囲の1つ以上の薬剤を具備することが可能であり、限定されるものではないが、ビノレルビン、シスプラチン、ゲムシタビン、パクリタキセル、エトポシド、Novantrone(ミトキサントロン)、アクチノマイシンD、カンプトテシン(またはそれの水溶性誘導体)、メトトレキサート、マイトマイシン類(例えば、マイトマイシンC)、ダカルバジン(DTIC)、シクロホスファミド、およびドキソルビシンやダウノマイシンなどの抗新生物抗生物質、または例えば、(De Vita et al,2001)に記載された他のものなどを含む。また、リポソーム、ペプチド、および抗体は、細胞傷害性薬物、オリゴヌクレオチド、毒素、および放射性分子を具備することができる。リポソーム、ペプチド、および抗体は、(Ng et al.,2006)に記載された抗VEGFアプタマーなどの化合物も具備し得る。
【0081】
いくつかの実施形態では、リポソーム、ペプチド、および抗体は、当技術分野で公知である多種多様な医薬的に許容される担体、賦形剤および希釈剤を有する処方で提供される。これらの医薬担体、賦形剤、および希釈剤としては、USP pharmaceutical excipients listing.USP and NF Excipients, Listed by Categories,p.2404−2406, USP 24 NF 19, United States Pharmacopeial Convention Inc.,Rockville,Md.(ISBN 1−889788−03−1)に記載のものが挙げられる。ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤などの医薬的に許容される賦形剤は、一般の人々に容易に入手可能である。さらに、pH調節/緩衝剤、浸透圧調節剤、安定剤、湿潤剤などの医薬的に許容される補助物質も、一般の人々に容易に入手可能である。
【0082】
好適な担体としては、水、デキストロース、グリセリン、生理食塩水、エタノール、およびこれらの組合せが挙げられるが、これらだけに限定されない。担体は、湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤、または製剤の有効性を高めるアジュバントなどの追加の薬剤を含むことができる。局所用担体としては、液体鉱油、パルミチン酸イソプロピル、ポリエチレングリコール、エタノール(95%)、モノラウリン酸ポリオキシエチレン(5%)水溶液、またはラウリル硫酸ナトリウム(5%)水溶液などが挙げられる。抗酸化剤、湿潤剤、粘度安定剤、および類似薬剤などの他の材料も必要に応じて添加することができる。Azoneなどの皮膚浸透促進剤も含めることができる。
【0083】
医薬剤形においては、本開示の組成物は、医薬的に許容される塩の形態で投与することができ、または単独でもしくは他の医薬的活性化合物との好適な会合および組合せで使用することもできる。対象の組成物は、可能な投与方法に従って処方される。
【0084】
本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体は、植物油または他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸エステル、プロピレングリコールなどの水性溶媒または非水性溶媒にそれらを溶解、懸濁または乳化することによって、必要に応じて、可溶化剤、等張化剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、防腐剤などの慣用的添加剤と一緒に、注射剤中に処方することができる。当技術分野で慣行の別の経口または非経口送達用の製剤を使用することもできる。
【0085】
VII.治療方法
A.投与方法、投与量、および投与頻度
治療薬剤を具備する本開示のペプチドまたはリポソームは、治療を必要とする対象に、静脈注射などの全身的注入により、あるいは腫瘍への直接注入などの関連部位への注入もしくは適用により、あるいは部位が手術で露出している場合の部位への直接的用により、あるいは障害が例えば、皮膚である場合などの局所的用により投与し得る。治療を必要とする対象は、HCCまたは肝臓癌を含む癌などの病気に罹患している対象を含む。
【0086】
本開示のペプチドは、治療のために癌に対する抗体を標的とするのに使用され得る。1つの実施形態では、本開示のペプチドは、治療を必要とする対象に投与され、続いてペプチドに特異的に結合する抗体が投与される。標的抗体は、抗体依存性細胞傷害性または相補体依存性細胞障害性を媒介することが可能であるし、または標的分子の基本的な機能を改変する可能性がある。そのような抗体は、標的組織に対する治療効果を有する薬剤を直接に送達するために、抗体複合体の形態で使用することができる。こうした薬剤としては、放射性核種、毒素、化学療法剤、抗VEGFアプタマーおよび抗血管新生化合物が挙げられる。
【0087】
投与は、経口投与、頬側投与、経鼻投与、経腸投与、非経口投与、腹腔内投与、皮内投与、経皮投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、心臓内投与、脳室内投与、頭蓋内投与、気管内投与、および髄腔内投与、または他に移植もしくは吸入による投与など、種々の方法で投与することができる。従って、対象の組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、およびエアロゾル剤などの固体、半固体、液体、またはガス状の形態の製剤中に処方することができる。以下の方法および賦形剤は、単なる例示に過ぎず、決して限定的なものではない。
【0088】
好適な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなど、およびこれらの組み合わせである。また、必要に応じて、ビヒクルは、湿潤剤または乳化剤またはpH緩衝剤などのわずかな量の補助的物質を含むことができる。このような剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか、または明らかである。投与する組成物または製剤は、いずれにしても、治療対象において所望の状態を得るのに十分な量の薬剤を含む。
【0089】
一般に、本開示の組成物は、患者に、約1μg/kg〜約20mg/kg、約1μg/kg〜約10mg/kg、約1μg/kg〜約1mg/kg、約10μg/kg〜約1mg/kg、約10μg/kg〜約100μg/kg、約100μg/kg〜約1mg/kg、または500μg/kg〜約1mg/kgの範囲の用量で投与される。抗体は、患者に抗体を投与後に抗体が患者の身体を循環できる時間の間隔を最大にするために、ボーラス投与量として投与される。また、持続的注入が、初期ボーラス投与後に使用され得る。投与は、単回投与量、または1日に1回、1週間に1回、あるいは1カ月に1回などの間隔を置いてすることが可能である。投与計画は、例えば、肝細胞癌細胞に対するポリペプチドの親和性、ポリペプチドの半減期、および患者の状態の重症度に基づいて調整できる。
【0090】
B.併用療法
本開示のペプチドまたはリポソームは、単剤療法として使用できる。あるいはまた、本開示のペプチドまたはリポソームは、癌を治療するために標準の化学療法と放射線療法とを組み合わせて使用することができる。
【0091】
癌治療で使われる薬剤は、細胞障害性または細胞増殖抑制性の効果を癌細胞に対して有し得るか、または悪性細胞の増殖を低下させ得る。本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体は、放射線療法と併用できる。本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体は、De Vita,et al.,eds.(2001)に記載された治療的なアプローチと共に使用され得る。本開示のリポソーム、ペプチド、または抗体と第2抗癌剤が癌細胞に対して相乗効果を発揮するこうした併用に関しては、第2薬剤の投与量は、単独で投与された場合の第2薬剤の標準的な投与量と比べて、減少させることが可能である。癌細胞の感受性を増加させるための方法は、本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体を、癌細胞の感受性を高めるのに有効な化学療法抗癌剤の量と併用投与することを具備する。併用投与は、同時投与であってもよく、または、非同時投与であってもよい。本開示のリポソーム、ペプチド、および抗体は、治療計画の過程で、他の治療薬と共に投与され得る。1つの実施形態では、本開示のリポソーム、ペプチド、または抗体と他の治療剤の投与は、連続的である。好適な時間経過は、患者の病気の性質、および患者の容体などの要因に従って、医師によって選択され得る。
【0092】
VIII.診断方法
病気に特異的なバイオマーカーの検出は、効果的なスクリーニング戦略を提供する。早期発見は、早期診断を提供するのみならず、癌の症例では、多型を選別する能力を提供して、腫瘍再発の早期指標である、手術後の残存腫瘍細胞および潜在性転移を検出できる。病気に特異的なバイオマーカーの検出は、治療を受けている患者や癌の寛解期の患者に比べて、診断前の患者の生存率を改善することができる。
【0093】
本開示のペプチドは、癌を含む病気に対する診断または予後検診に使用できる。ペプチドは、ELISA、ウエスタンブロット、蛍光、免疫蛍光、免疫組織化学、またはオートラジオグラフィを含むがこれに限定されない多くの方法で診断薬として使用できる。
【0094】
また、本開示の抗体は、肝臓癌を検出するために、本開示のペプチドと組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、アッセイは、肝細胞癌細胞などの肝細胞癌に結合する本開示のペプチドと抗体の結合を検出する結合アッセイである。対象のポリペプチドまたは抗体は、固定されることができ、一方、対象のポリペプチドおよび/または抗体は、検出可能に標識化されることができる。例えば、抗体は、直接標識化することができ、あるいは標識化2次抗体で検出できる。すなわち、抗体のための好適で、検出可能な標識は、目的とするタンパク質に抗体を標識する直接的な標識、および目的とするタンパク質に対する抗体を認識する抗体を標識する間接的な標識を含む。別の実施形態では、ペプチドは、標識を具備し、組織へのペプチドの結合は、標識の存在を分析することによって検出される。
【0095】
IX.スクリーニング法
本開示は、本開示のペプチドと結合する生体分子を同定するための方法を提供する。そのような分子は、分子に結合する治療薬または診断薬のための標的として役立ち得る細胞表面分子であり得る。例えば、分子または分子に結合す抗体に特異的なペプチドは、細胞がその分子を産生する患者を治療または診断するために使用され得る。
【0096】
1つの方法では、本開示のペプチドは、本開示のペプチドに結合するか、または本開示のペプチドと相互作用する他のタンパク質を同定するために、2−ハイブリッドアッセイまたは3−ハイブリッドアッセイでの「ベイトタンパク質」として使用することができる(参照:例えば、米国特許第5,283,317号;Zervos et al.(1993);Madura et al.(1993);Bartel et al.(1993);Iwabuchi et al.(1993);およびSuter et al.(2006))。
【0097】
別の方法では、本開示のペプチドは、本開示のペプチドと結合する生体分子を同定するために、細胞抽出物とインキュベーションされる。1つの方法では、本開示のペプチドは、HPLCカラムなどの固形支持体に固定化され、細胞抽出物は、標的分子に本開示のペプチドが結合するのを容易にする条件下で固定化ペプチドに曝される。結合分子は、溶出され、質量分析などの標準的な方法によって同定される。
【実施例】
【0098】
明細書は、明細書内に引用された参考文献の教示を考慮して最も完全に理解される。明細書の以下の実施例は、本開示の実施形態の説明であり、本開示の範囲を制限するものとして解釈すべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本開示により包含されることを容易に認識する。
【0099】
I.実施例1.ファージディスプレイ・ペプチドライブラリーとバイオパンニング
A.細胞株と細胞培養
全てヒト肝細胞癌細胞株である59T、Changliver、HA22T、Hep3B、HepG2、J5、NTUBL、MahlavuおよびSKHeplとヒト初代培養正常鼻粘膜上皮のNNM(8)を使用した。HCC細胞は、Dr.Hsiao M.(Genomic Research Center,Academia Sinica,Taiwan)博士の好意で入手した。全てのヒトHCC細胞株とNNMを、空気中5%または10%CO2の加湿環境下において37℃で、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)および10%胎児ウシ血清(FBS)に維持した。
【0100】
さらなる有用な細胞株は、ヒト肺扁平上皮癌株A549、高転移性ヒト肺腺癌株CL1−5、ヒト肺腺癌株H23、ヒト肺大細胞癌株H460、ヒト肺癌株PC13、ヒト鼻咽頭癌株NPC−TW01、ヒト口腔扁平細胞癌株SAS、ヒト膵臓癌PaCa、結腸(HCT116)、乳房(BT483)、前立腺(PC3)、NNM、ヒト正常鼻粘膜上皮、および線維芽細胞を含む。A549、H23、H460、PC13、PaCa、HCT116、PC3、MahlavuおよびSASは、American Type Culture Collectionから入手できる。CL1−5とNPC−TW01細胞株は、(Chu et al.,1997)および(Lin et al.,1990)により、それぞれ確立した。
【0101】
B.HCC細胞に結合するファージの単離
ファージディスプレイ・ランダムペプチドライブラリーを、HCC、Mahlavu、細胞特異的ファージを選別するために使用した。ファージディスプレイ・ランダムペプチドライブラリー(RPLs)Ph.D.−12キット(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)を我々の実験に使用した。バイオパンニング手順は、先の研究(35)に従って、若干修正して実行した。簡潔に述べると、Mahlavu細胞を、70〜80%コンフルエンスまで増殖させ、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、PBS中5mMのEDTAで採取し、1%のBSAを含む無血清培地で回収した。細胞懸濁液をファージディスプレイ・ランダムペプチドライブラリーの1.5×1011プラーク形成単位(pfu)に添加する前に、4℃で冷却した。反応混合物を4℃で1時間インキュベーションし、非混和性の有機溶媒(フタル酸ジブチル:シクロヘキサン=9:1(Sigma−Aldrich,Saint Louis,MO,USA)の上層に移し、遠心分離した。ファージ結合細胞ペレットをLB培地で再懸濁し、ファージを増幅し、Escherichia coli ER2738培養物(New England Biolabs,pswich,MA,USA)で滴定した。採取されたファージを、Mahlavu細胞によるバイオパニングの追加ラウンドに付した。第5ラウンドのファージ溶出液を、ファージクローン同定のためのLB/IPTG/X−Galプレート上で滴定した。親和性選択(バイオパニング)の5ラウンド後、第5ラウンドの回収率は、第1ラウンドで観察されたそれに対して3.5倍に増加した(図1)。
【0102】
C.ELISAによるファージクローンの同定
96のファージクローンを無作為に分離し、ELISAアッセイによりHCC細胞および正常な上皮細胞(NNM)と反応させるのに用いた。約1×104 Mahlavu細胞とNNM細胞を、96ウェルELISAプレートに別々に播種し、一晩増殖させた。プレートを無血清DMEMで洗浄し、1%BSAを含む無血清DMEM培地で4℃においてブロッキングした。次いで、個々のファージクローンの109pfuを添加し、4℃で1時間インキュベーションした。プレートをPBSで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)−複合抗M13抗体(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA)を添加し、4℃で1時間インキュベーションした。プレートをPBSで洗浄し、続いてペルオキシダーゼ基質o−フェニレンジアミン2塩酸塩(OPD;Sigma−Aldrich,Saint Louis,MO,USA)と共にインキュベーションした。反応を3NのHClで終了させ、光学密度をマイクロプレートリーダを使って490nmで測定した。
【0103】
II.実施例2.フローサイトメトリおよび生検分析
A.HCC細胞に特異的に結合するファージクローンの同定
HCC細胞に特異的に結合するファージクローンを分析するために、フローサイトメトリ分析が実施された。HCC細胞を70〜80%コンフルエンスまで増殖させ、PBS中5mMのEDTAで採取した。HCC細胞をFACS緩衝液(1%FBSを有するPBS)に再懸濁し、タンパク質をそれぞれコードしないPC94または対照ファージと共に4℃で1時間インキュベーションした。FACS緩衝液で洗浄後、HCC細胞をモノクローナルの抗M13抗体と共に4℃で1時間インキュベーションし、続いてR−フィコエリスリンに共役した抗マウス抗体(Southern Biotech,Birmingham,AL,USA)と30分間インキュベーションした。CellQuestソフトウェア(BD Bioscience,San Jose,CA,USA)を使って、FACS−Caliburで分析した。
【0104】
その結果は、ファージクローン94(PC94)が、HCC細胞に最も良い反応性を有し、他方、ファージクローンの残りは、HCC細胞に対して適度の結合活性を示したことを明らかにした(図2A)。(A)HCC細胞へのそれぞれの選択されたファージの表面結合活性は、フローサイトメトリで測定された(2番目:細胞は、R−フィコエリスリン共役化抗マウスIgGにより染色された。C:細胞は、対照ファージとインキュベーションされた)。
【0105】
PC94の結合活性は、ファージの異なる用量をHCC細胞と共にインキュベーションすることによりさらに確証され、FACSにより分析された。その結果は、PC94のHCC細胞への結合は、用量依存性の様式で起こることを示した(図2B)。さらに、反応性は、対照ヘルパーファージでは見られなかったし、PC94をNNMと共にインキュベーションした際にも見られなかった(図2B)。これらの結果は、HCCのMahlavu細胞が、PC94に提示されたペプチドにより認識できる未知分子を発現することを明らかにする。
【0106】
他のHCC細胞がPC94により認識できるか否かを研究するために、9つのHCC細胞株が、PC94と共にインキュベーションされ、FACSによって分析された。その結果は、9つのHCC細胞株のうちの6つ(Mahlavu、59T、Hep3B、HepG2、NTUBL、およびSKHepl)が、強力(47〜81.2%)にPC94と反応し、他方、他のHCC細胞株(ChangliverおよびJ5)は、適度の反応性(25.7〜31.9%)を有し、HA22T細胞株は、わずかに弱い反応性(19.1%)であることを示す(図2C)。各HCC細胞株へのPC94の表面結合活性が分析された(黄色:R−フィコエリスリン共役化抗マウスIgGで染色;オレンジ:対照ファージとのインキュベーションされた細胞)。その結果は、これらの細胞株のすべてが、PC94−提示ペプチドで認識できる標的分子を発現することを示す(図2C)。
【0107】
PC94のHCC細胞に対する結合特異性は、HCC患者からの外科的標本を使用して免疫組織化学によりさらに試験された。その結果は、PC94がHCCの外科的標本における腫瘍細胞(図2D、aおよびb)を認識できるが、それらの正常な対応部分(図2D、d)は認識できないことを示している。対照ファージは、HCCの外科的標本の腫瘍組織での免疫反応性を何ら示さない(図2D、c)。PC94または対照ファージとインキュベーションされたHCC患者由来の生検標本は、HRP共役化抗M13抗体を用いて検出された。PC94の免疫反応性は、腫瘍組織(D、aおよびb)で見られたが、しかし、それらの正常な対応部分(D、d)では見られなかった。対照ファージは、これらの生検標本(B、c)(Bar、50μm)と結合することができなかった。
【0108】
肝臓癌組織におけるペプチド結合能の局在下のために、ヒト肝細胞癌のパラフィン切片を、ファージ提示ペプチドおよびビオチン標識ペプチドと共にルーチンの免疫組織化学的手順を用いてインキュベーションした。外科的標本は、Institutional Review Board in NTUH(IRB9461702021)の承認を得て、National Taiwan University Hospital(NTUH)の組織バンクから入手した。
【0109】
B.DNA配列とコンピュータ解析
ELISAとフローサイトメトリ(図2A)による高いHCC細胞反応性を有する15のファージクローン(PC1、2、9、12、15、26、42、47、62、72、84、85、86、88、および94)が選択され、配列決定された。ファージDNAをメーカーの指示に従って抽出した。精製ファージのDNA配列は、自動DNAシーケンサー(ABI PRISM 377;Perkin−Elmer,Waltham,MA,USA)を用いて、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法により決定した。配列決定は、−96gIII配列決定用プライマー5’−CCCTCATAGTTAGCGTAACG−3’(配列番号:31)を用いて実行した。ファージ提示ペプチド配列を、Genetic Computer Group(GCG)プログラムを使用して翻訳し、一列に整列した。ファージ提示ペプチド配列を、GCGソフトウェアによって整列し、異なったコンセンサスモチーフ配列(表1)を明らかにした。対応するDNA配列は、表2に記載する。
【0110】
GCGアラインメント(表1)に基づいて、モチーフPro−Ile/Leu−Leu−Leu−Pro(P−I/L−L−P)を提示するPC94およびPC88の両方が選択された。
【0111】
III.実施例3.インビボでの標的化アッセイとペプチド競合的アッセイのための動物モデル
HCCに対する標的薬物送達のための薬物送達ディレクターとして、PC94によりコードされたポリペプチドSP94の可能性を評価するために、いくつかの問題が対処された。最初に、我々は、SP94がインビボでHCC細胞を標的とすることができるかどうかを調べた。我々は、HCC異種移植モデルでのPC94の腫瘍帰巣性とSP94によるその競合的阻害を調べた。インビボの帰巣性実験は、PC94が、対照ファージよりも8倍以上高い結合活性を有して腫瘍組織に対して帰巣性を有することを示した(図3A)。そのうえ、ペプチド競合的阻害実験では、SP94は、腫瘤に結合するPC94を阻害するのに対し、同じ濃度の対照ペプチドでは、そのような阻害効果を全く有しなかった(図3B)。
【0112】
A.PC94標的化ための動物モデル
インビボでのPC94の標的化能を確かめるために、HCC異種移植片(500mm3)由来Mahlavu担持ラットに、尾静脈を通してPC94または対照ファージを注入した。ファージを循環させ、次いで潅流させた。腫瘍組織と正常な内臓器官に結合したファージ粒子を回収した。その結果は、有意に多くのPC94ファージ粒子が、正常な器官より脳(220倍)、心臓(32倍)および肺(23倍)などの腫瘍組織から回収(組織のグラム単位につき標準化)されたことを証明した。しかし、対照ファージは、腫瘍組織でも、正常器官でも何らの帰巣現象を示さなかった(図3A)。
【0113】
5×106のMahlavu細胞をSCIDマウス(4〜6週齢)の背側外側わき腹に皮下的(s.c.)に注入した。PC94の2×109pfuまたは対照ファージをMahlavu由来異種移植片(500mm3)担持マウスに静脈内(i.v.)注入した。潅流後に、器官(脳、心臓、および肺)と腫瘍組織を摘出し、冷たいPBSで洗浄し、計量した。腫瘍組織および器官に結合したファージを、E.coli ER2738培養物によりレスキューした。溶出されたファージ粒子を、LB/IPTG/X−Galプレート上で滴定した。ペプチド競合的阻害実験では、PC94ファージの2×109pfuが、SP94ペプチドの100μgと対照ペプチドで共注入された。腫瘍担持マウスでの標的化ファージの組織分布を、免疫組織化学的染色によって調べた。組織切片を、マウス抗M13抗体と共にインキュベーションし、続いてビオチン化ウマ抗マウス抗体(ABCキット;Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)とインキュベーションし、PBSで洗浄し、次いで、ABC試薬に浸漬した。切片をDAB溶液+0.01%過酸化水素に浸漬し、PBSで洗浄し、PBS中の50%グリセリンを上に乗せた。
【0114】
B.ペプチド競合的アッセイ
ペプチド競合的阻害アッセイ(図3)は、HCC細胞へのPC94の結合活性が、ファージ粒子の他の部分よりむしろPC94ディスプレイペプチドに依存していることを確認した。これらの結果は、これらのHCC細胞の原形質膜が、合成ペプチドSP94およびPC94ディスプレイペプチドの両方で認識することができ、しかし、ファージの他の部分では認識できないタンパク質などの未知の標的分子を発現することを強く示している。
【0115】
1.ペプチド合成および標識化
標的化SP94(SFSIIHTPILPL)(配列番号:2)と対照(FPWFPLPSPYGN)(配列番号:32)ペプチドを合成し、ペプチド合成中心設備(Biological Chemistry Institute、Academia Sinica)での逆相高速液体クロマトグラフィによって>95%純度まで精製した。ビオチン標識ペプチド(ビオチン−SP94およびビオチン−対照−ペプチド)が、ビオチン分子をペプチドアミノ末端へ共役化することにより合成された。質量分析は、予測された質量を確認した。
【0116】
HCC異種移植片担持マウスに、PC94および同系の合成ペプチドSP94を共注入した。その結果は、SP94が腫瘍組織からのファージ粒子の回収を著しく阻害したことを示した。SP94の100マイクログラムが、腫瘍組織に結合しているPC94の88%を阻害したが、対照ペプチド(con−P)の同じ濃度は、そのような阻害効果を何ら有しなかった(図3b)。
【0117】
PC94の組織分布の立証のために、帰巣性実験および競合的実験由来の腫瘍器官と正常器官の組織切片は、抗ファージ抗体によって免疫染色された。腫瘍細胞だけが、免疫反応性(図3C、d、およびe)を明らかにしたが、脳(図3C、a)、心臓(図3C、b)、および肺(図3C、c)などの正常な器官は、免疫反応性を示さないことが分かった。しかし、PC94を同系の合成ペプチドSP94と共注入した場合、免疫反応性が全く腫瘍組織でみられなかった(図3C、j)。腫瘍細胞も正常な器官も対照ファージ(C、f〜i)(棒、50μm)との免疫反応性を有さないことが分かった。
【0118】
SP94が標的薬物の治療指数を増加させることができたかどうかを調べるために、我々は、正常器官ではなく、腫瘍組織に対するSP94の結合特異性を研究した。帰巣性アッセイとペプチド競合的阻害実験の両方では、PC94は、脳や、心臓や、肺などの正常な内臓器官ではなく、腫瘍組織に特異的に結合することが分かった(図3AおよびB)。免疫組織化学的染色は、PC94粒子が腫瘍組織のみに局在し、脳、心臓、および肺の組織(図3C)には局在しないことを証明した。最終的に、我々は、SP94ペプチドが、HCC患者の腫瘍組織によって産生される標的分子を認識できたかどうかを調べた。PC94(図2D)とビオチン標識SP94は、61.3%(19/31)の陽性率でHCC患者からの外科的標本に発現された標的プロテインを認識した。総合して、我々は、SP94が、正常組織ではなくHCC細胞によって生産された未知の標的分子を特異的に認識すると結論する。従って、この分子は、HCCに対する標的薬物送達に対して有用であり、SP94は、この分子を同定するための試薬を提供する。
【0119】
IV.実施例4.インビボでの腫瘍標的治療試験
SP94とペグ化リポソームドキソルビシンの組み合わせ、すなわち活性またはリガンド媒介標的化と呼ばれるプロセスを使用して、この標的DDSの部位特異的作用は、腫瘍効果(図4および6)を高めて、増加する腫瘍アポトーシス(図5A、5B、および6E)を伴い、腫瘍血管新生(図5Cおよび6D)を減少させた。
【0120】
ペグ化リポソームドキソルビシン(Lipo−Dox)製剤の臨床試験において、改善された薬物動態学的特性および減少した全身的毒性が観察された(40)。ここで、我々の結果は、この標的薬物送達系の部位特異的作用により、SP94−Lipo−Doxは、総白血球数(WBC)の減少を回避することによって血液毒性をさらに減少させることができることを明らかにした(図4Cおよび6C)。非標的ペグ化リポソームドキソルビシン(Con−P−Lipo−DoxおよびLipo−Dox)によって観測された総WBC数の減少は、増加した循環時間、血管内の監禁状態、および単核性食細胞系細胞による非特異的な取り込みの機会の増加に依る可能性がある。そのような白血球減少症は、進行したHCC患者に対するペグ化リポソームドキソルビシンの第2相臨床試験で既に報告した(41、42)。
【0121】
ペグ化リポソームドキソルビシンの第2相臨床試験についての先のいくつかの研究は、薬物が進行したHCCでは、最大で0〜14%の奏効率でほとんど活性を示さなかったと報告している(41〜43)。本明細書で記載されるSP94−Lipo−Doxの増強された治療効果は、従って、進行したHCC患者の治療におけるこの標的薬物送達系について重要な臨床的可能性を示す。さらに、SP94と相互作用する標的分子の同定は、HCC腫瘍組織でのその特異的発現の検証を可能にして、HCC療法のための標的としてのその使用を認証するであろう。
【0122】
標的薬物送達系は、抗癌剤、標的リガンドを具備し、さらに担体を具備し得る。ドキソルビシンがHCCで最も一貫した全奏功率(18%)を提供すると報告されており(36)、また、リポソームドキソルビシンが難治療性乳癌および卵巣癌で顕著な活性を有することが証明されたので(37、38)、この薬物を、抗癌剤として選択し、ポリエチレングリコールでコーティングしたリポソーム(ペグ化リポソーム)が担体として選択した。ペグ化リポソームドキソルビシンを、HCCに対する標的薬物送達の有効性を評価するために、SP94(SP94−Lipo−Dox)と結合した。ヒトHCC異種移植片モデルでは、SP94−Lipo−Doxは、対照ペプチド複合Lipo−Dox(Con−P−Lipo−Dox)およびLipo−Dox処置群(図4および6)と比較して、治療効果において改善を示した。
【0123】
いかなる特定のメカニズムによっても制約されることなく、Con−P−Lipo−DoxおよびLipo−Dox処置群は、以下の要素によって説明され得る。最初に、血管新生腫瘍脈管系の漏出は、腫瘍組織での薬物複合体の選択的血管外漏出を可能とする。さらに、薬物複合体は、有効なリンパドレナージの不足のため、腫瘍組織内に保持され得る。これらの要因は、腫瘍組織での薬物複合体の受動的標的化および蓄積をもたらし得る(14)。また、動物試験では、長時間循環するペグ化リポソームドキソルビシンは、腫瘍での受動的な優先的局在化に至り、フリーの薬物により得られる濃度と比べて、腫瘍組織での薬物濃度は、数倍の増加をもたらすことが証明された(15、39)。
【0124】
A.ペプチド−リポソームドキソルビシンの調製と投与
ペプチド−リポソームドキソルビシンの調製のための手順は、記述されている(8)。簡潔に述べると、ペプチドをNHS−PEG−DSPE[N−ヒドロキシスクシンイミド−カルボキシル−PEG(分子量3400)由来ジステアリルホスファチジルエタノールアミン(NOF Corporation,Tokyo,Japan)]に1:1.5のモル比でカップリングした。カップリング反応は、ペプチジル−PEG−DSPEを生成するために、ペプチドのアミノ末端の遊離アミノ基を用いて実施され、トリニトロベンゼンスルホナート試薬(Sigma−Aldrich,Saint Louis,MO,USA)での残存アミノ基の定量化により確認された。ペプチジル−PEG−DSPEを、脂質2重層の転移温度より高い温度で共インキュベーションした後に、予備形成されたペグ化リポソームドキソルビシンに変換した。
【0125】
SCIDマウス(4〜6週齢)に、5×106のMahlavu細胞を背側外側わき腹に皮下的(s.c.)に注入した。腫瘍担持マウス(100mm3)を、異なる処置A:SP94−Lipo−Dox(SP94−LD);B:Con−P−Lipo−Dox(CP−LD);C:Lipo−Dox(LD);およびD:PBSのために無作為に4群(1群あたり6匹のマウス)に群分けした。処置は、尾静脈注射により、1週間に2回、1mg/kgで、連続した4週間、8mg/kgの総用量を投与した。別の実験では、より大きいMahlavu由来異種移植片(550mm3)担持マウスを、記載されたように4群に群分けした。処置は、尾静脈注射により、1週間に1回、5mg/kgで、連続して2週間、10mg/kgの総用量を投与した。体重と腫瘍の大きさは電子天秤とカリパスによって測定した。腫瘍容積は、式:長さ×(幅)2×0.52を使用して計算した。実験の終わりに、各マウスの腫瘍組織および内臓器官を摘出し、3%のホルムアルデヒドで固定化し、さらなる組織病理学検査のためにOCT包埋した。動物の取り扱いは、Academia Sinica、Taiwanのガイドラインに従って行った。
【0126】
処置の終わり(28日目)に、Con−P−Lipo−DoxとLipo−Dox群の腫瘍の大きさは、SP94−Lipo−Dox群のそれより1.5倍大きかった。対照PBS群の腫瘍の大きさは、SP94−Lipo−Dox群のものより3.3倍大きかった。(P<0.01)(図4A)。さらに、SP94−Lipo−Doxの投与を受けた腫瘍担持マウス群は、Con−P−Lipo−DoxとLipo−Dox処置群のそれと比べて、より少ない腫瘍重量、約40%の阻害を有することが分かった(P<0.01)(図4B)。グラフ中のエラーバーは、標準誤差を表し、P値はStudentのt検定で算出された。
【0127】
1.総WBC数
血液を顎下腺の静脈から抜き取って、凝固を防ぐために15%のEDTA溶液と緩やかに混合した。次に、2%酢酸と1%ゲンチアンバイオレット(Sigma−Aldrich,Saint Louis,MO,USA)を含むRBC溶解緩衝液を添加し、室温でインキュベーションした。総WBCは、血球計を使用して計算された。
【0128】
化学療法剤の全身的送達により起こる副作用を評価するために、総WBC数が測定された。その結果は、SP94−Lipo−Dox治療群の総WBC数(1.9×103/mm3)は、Con−P−Lipo−Dox(1.6×103/mm3)およびLipo−Dox(1.6×103/mm3)治療群のそれらより高いが、PBS群(2.6×103/mm3)のそれより低いことを明らかにした(図4C)。体重は、各処置群で有意に変わらなかった(図4D)。 グラフ中のエラーバーは、標準誤差を表し、P値はStudentのt検定によって算出された。
【0129】
V.実施例5.ペプチド−リポソームドキソルビシン療法における組織病理学的検査、腫瘍血管の免疫蛍光検出、およびアポトーシス細胞
A.TUNEL染色
凍結腫瘍組織切片を末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介dUTPニック末端標識(TUNEL)反応混合物(Roche Diagnostic,Grenzacherstrasse,Basel,CHE)と37℃で1時間インキュベーションした。スライドを、Hoechst33258(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)で対比染色し、封入剤(Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)で封入した。次いで、スライドは、蛍光顕微鏡下で視覚化された。
【0130】
B.CD31染色
凍結腫瘍組織切片を、メタノール−アセトン(1:1)により固定化し、PBSで洗浄し、ブロッキング緩衝液(PBS中、1%BSA)中に浸漬し、続いて、ラット抗マウスCD31(BD Pharmingen,San Diego,CA,USA)とインキュベーションした。切片をPBST0.1(PBS中、0.1%のTween−20)で洗浄し、次いで、ウサギ抗ラット抗体(Stressgen,Ann Arbor,MI,USA)とインキュベーションし、ローダミン標識ヤギ抗ウサギ抗体(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,USA)に浸漬した。スライドを、Hoechst33258(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)で対比染色し、封入剤で封入し、蛍光顕微鏡下で視覚化した。
【0131】
各処置群の腫瘍組織の組織病理をH&E染色後に調べた。著しく分散した壊死/アポトーシス領域が、SP94−Lipo−Dox処置異種移植片の全切片に存在したのに対し、適度の壊死/アポトーシス領域が、Lipo−DoxおよびCon−P−Lipo−Dox処置異種移植片で見られた。PBS処置群は、正常なHCC細胞を示した(図5A)。SP94−Lipo−Dox(SP94−LD)処置異種移植片の全切片は、著しく分散した壊死/アポトーシス領域を示すのに対し、Con−P−Lipo−Dox(CP−LD)とLipo−Dox(LD)異種移植片は、適度の壊死/アポトーシス領域を示し、PBS群は、正常なHCC細胞(棒:上側のパネル、500μmおよび下側のパネル、50μm)を示す。
【0132】
切片を、アポトーシス腫瘍細胞(緑色)を視覚化するためにTUNEL標識した。TUNEL陽性腫瘍細胞は、Con−P−Lipo−DoxおよびLipo−Dox群と比較して、SP94−Lipo−Dox処置群で、より均等に分布した。アポトーシス腫瘍細胞は、PBS処置群では見られなかった(棒、100μm)。(図5B)。TUNELを、アポトーシス腫瘍細胞を同定するために使用し、抗CD31抗体を、腫瘍血管を検出するために適用した。腫瘍からの代表的な顕微鏡視野は、Con−P−Lipo−DoxおよびLipo−Dox処置群よりもSP94−Lipo−Dox処置群において、より多くのアポトーシス腫瘍細胞(図5B)と、より低密度の血管(図5C)を示す。
【0133】
切片を、腫瘍血管(赤色)を視覚化するために抗CD31抗体で染色し、H33258(青色)(棒、100μm)で対比染色した。(図5C)。CD31陽性内皮細胞の領域を、低倍率で定量化(n=6)し、CD31陽性内皮細胞の領域を、低倍率下でも定量化(n=6)した。CD31陽性内皮細胞の領域は、PBS対照群でのそれらと比較して、Lipo−DoxおよびCon−P−Lipo−Dox処置群では、著しく減少した(n=6、P<0.05)。CD31陽性内皮細胞の領域は、Con−P−Lipo−DoxおよびLipo−Dox群でのそれらと比較して、SP94−Lipo−Dox処置群でさらに減少した(n=6、P<0.001)(図5D)。PBS処置群では、高い腫瘍血管密度が見られ、アポトーシス細胞は見られなかった(図5BおよびC)。グラフ中のエラーバーは、標準誤差を表し、P値はStudentのt検定で算出した。
【0134】
VI.実施例6.大きいHCC異種移植片腫瘍の治療のためのペプチド−リポソームドキソルビシン療法
大きい異種移植片が、また、SP94−Lipo−Dox処置に応答することができたかどうかを確認するために、大きいHCC異種移植片(550mm3)を担持するラットを、異なる処置:A:SP94−Lipo−Dox(SP94−LD);B:Con−P−Lipo−Dox(CP−LD);C:Lipo−Dox(LD)およびD:PBSのために4群に群分けした。処置の終わり(14日目)に、Con−P−Lipo−DoxとLipo−Dox群の腫瘍サイズは、SP94−Lipo−Dox群のものより1.3倍および1.2倍に徐々に増加した(それぞれP=0.089、P<0.05)。対照PBS群の腫瘍のサイズは、SP94−Lipo−Dox群のそれより1.9倍大きかった(P<0.05)(図6A)。さらに、SP94−Lipo−Doxの投与を受けた腫瘍担持マウスの群は、Con−P−Lipo−Dox、Lipo−Dox、およびPBS群よりも、小さい腫瘍重量を有することが分かった。Con−P−Lipo−Dox、Lipo−Dox、およびPBS群の腫瘍重量は、SP94−Lipo−Dox群のそれよりも、それぞれ1.3倍、1,2倍および2.1倍大きく増加した(P<0.05。)(図6B)。総WBC数は、また、10日目に分析されて、SP94−Lipo−Dox処置群(11.8×103/mm3)の総WBCが、Con−P−Lipo−Dox(8.8×103/mm3)およびLipo−Dox(8.2×103/mm3)処置群のそれらより大きいが、PBS群(13.9×103/mm3)のものより少なかった(図6C)。
【0135】
各処置群における腫瘍組織の組織病理をH&E染色により調べた。著しい壊死/アポトーシス領域が、SP94−Lipo−Dox処置異種移植片からの全切片に存在したが、他方、適度の壊死/アポトーシス領域が、Lipo−DoxおよびCon−P−Lipo−Dox処置異種移植片で見られ、PBS処置群は、正常なHCC細胞を示した(図6E)。各処置群からの腫瘍組織におけるCD31陽性内皮細胞の領域は、低倍率下でも定量化(n=6)された。CD31陽性内皮細胞の領域は、PBS対照群のそれらと比較して、Lipo−DoxおよびCon−P−Lipo−Dox処置群では、わずかに減少した。しかし、CD31陽性内皮細胞の領域は、Con−P−Lipo−DoxおよびLipo−Dox群でのそれらと比較して、SP94−Lipo−Dox処置群で著しく減少した(n=6、P<0.001)(図6D)。(棒:上側のパネル、500μmおよび下側のパネル、50μm)。グラフ中のエラーバーは、標準誤差を表し、P値はStudentのt検定で算出された。
【0136】
本明細書で議論された刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにだけ提供される。本開示が、先願発明によるそのような刊行物に先行する権利を与えられないことを承認するものとして決して理解してはいけない。本明細書での任意の刊行物の引用は、そのような参考文献が本開示に先行するものであることを認めるものではない。さらに、提供された刊行物の日付は、独立して確認される必要があるかもしれない現実の発行日と異なっているかもしれない。
【0137】
X.実施例7:結合におけるPC88とPC94の比較
FACS分析を、PC88とPC94の結合活性を比較するために実施した。Mahlavu細胞を1×109、5×109、7.5×109、および1×1010のTUでそれぞれインキュベーションし、個々のファージクローンの表面結合活性は、実施例2に記載した手順を使ってFACSにより分析した。PC94のMahlavu細胞結合活性は、PC88より良好である(図7)。Con−ファージは、対照ファージを示す。
【0138】
XI.実施例8:インビボでのPC88とPC94の腫瘍帰巣の比較
PC88とPC94の腫瘍帰巣性を、SCIDマウスで比較した。HCC異種移植片を担持するSCIDマウスをPC88、PC94および対照ヘルパーファージで静脈注射し、ファージを、実施例3に記載されたように潅流後に回収した。腫瘍や、脳、心臓、肺などの対照器官から回収されたファージの力価は、LB/IPTG/X−Galプレート上で測定された。PC94の腫瘍帰巣性は、PC88より良好である(図8)。
【0139】
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【0140】
【表1】
【0141】
【表2】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号;13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、および配列番号:29から選択される配列を具備するポリヌクレオチド、またはその変異体。
【請求項2】
配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号;14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、および配列番号:30から選択される配列を具備するポリペプチド、またはその変異体。
【請求項3】
前記ポリペプチドが、配列番号:2を具備する請求項2に記載のポリペプチド、またはその変異体。
【請求項4】
前記ポリペプチドが、配列番号:2を具備する請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項5】
請求項2に記載のポリペプチドを具備し、第2ポリペプチドに融合した第1ポリペプチドを具備する融合タンパク質。
【請求項6】
前記ポリペプチドが1つ以上の薬剤に共役する請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項7】
1つ以上の薬剤が、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリス
チン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗VEGFアプタマー、および放射性分子から選択される請求項6に記載のポリペプチド。
【請求項8】
請求項2に記載のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項9】
請求項2に記載の少なくとも1つのポリペプチドを具備するリポソーム。
【請求項10】
前記ポリペプチドが、配列番号:2、またはその変異体を具備する請求項9に記載のリポソーム。
【請求項11】
前記ポリペプチドが、配列番号:2を具備する請求項10に記載のリポソーム。
【請求項12】
前記リポソームが、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗VEGFアプタマー、および放射性分子から選択される少なくとも1つ以上の薬剤をさらに具備する請求項11に記載のポリペプチド。
【請求項13】
前記薬剤が、ドキソルビシンである請求項12に記載のリポソーム。
【請求項14】
治療を必要とする哺乳動物に、請求項6に記載のポリペプチドの治療有効量を投与するステップを具備する哺乳動物の病気を治療する方法。
【請求項15】
前記哺乳動物が、ヒトである請求項14に記載の方法。
【請求項16】
治療を必要とする哺乳動物に、1つ以上の薬剤と請求項2に記載の1つ以上のポリペプチドを具備するポリペプチドとを具備するリポソームの治療有効量を投与するステップを具備する哺乳動物の病気を治療する方法。
【請求項17】
前記リポソームが、配列番号:2を具備するポリペプチド、またはそれの変異体を具備する請求項16に記載の方法。
【請求項18】
前記リポソームが、配列番号:2を具備するポリペプチドを具備する請求項17に記載の方法。
【請求項19】
前記の1つ以上の化学療法薬剤が、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗VEGFアプタマー、および放射性分子から選択される請求項16に記載の方法。
【請求項20】
前記の化学療法薬剤が、ドキソルビシンである請求項19に記載の方法。
【請求項21】
前記病気が、癌である請求項16に記載の方法。
【請求項22】
前記癌が、肝臓癌である請求項21に記載の方法。
【請求項23】
前記肝臓癌が、肝細胞癌である請求項22に記載の方法。
【請求項24】
前記哺乳動物が、ヒトである請求項16に記載の方法。
【請求項25】
a)ポリペプチドが肝臓癌細胞に結合するのを可能とする条件下で、検体を請求項2に記載のポリペプチドと接触させるステップ、および
b)請求項8に記載の抗体を用いて、前記ポリペプチドの結合を検出するステップ、
を具備する検体の肝臓癌を検出する方法。
【請求項26】
a)融合ポリペプチドが、肝臓癌細胞に結合するのを可能とする条件下で、検体を請求項5に記載の融合ポリペプチドと接触させるステップ、および
b)前記融合ポリペプチドのエピトープに特異的な抗体を用いて、融合ポリペプチドを検出するステップ、
を具備する検体の肝臓癌を検出する方法。
【請求項27】
a)ポリペプチドと分子を具備する複合体の形成を可能とする条件下で、細胞抽出物を請求項2に記載のポリペプチドと接触させるステップ、および
b)前記分子を同定するために複合体を分析するステップ、
を具備する請求項2に記載のポリペプチドに結合する分子を同定する方法。
【請求項28】
ストリンジェントな条件下で、請求項1に記載のポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項29】
請求項28に記載のポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチド。
【請求項30】
前記ポリペプチドが標識を具備する請求項2に記載のポリペプチドを対象に投与し、対象での癌に対するポリペプチドの結合を検出するステップを具備する対象での癌を検出する方法。
【請求項31】
前記標識が、放射性分子を具備する請求項30に記載の方法。
【請求項32】
前記対象が、ヒトである請求項30に記載の方法。
【請求項1】
配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号;13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、および配列番号:29から選択される配列を具備するポリヌクレオチド、またはその変異体。
【請求項2】
配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号;14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、および配列番号:30から選択される配列を具備するポリペプチド、またはその変異体。
【請求項3】
前記ポリペプチドが、配列番号:2を具備する請求項2に記載のポリペプチド、またはその変異体。
【請求項4】
前記ポリペプチドが、配列番号:2を具備する請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項5】
請求項2に記載のポリペプチドを具備し、第2ポリペプチドに融合した第1ポリペプチドを具備する融合タンパク質。
【請求項6】
前記ポリペプチドが1つ以上の薬剤に共役する請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項7】
1つ以上の薬剤が、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリス
チン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗VEGFアプタマー、および放射性分子から選択される請求項6に記載のポリペプチド。
【請求項8】
請求項2に記載のポリペプチドに結合する抗体。
【請求項9】
請求項2に記載の少なくとも1つのポリペプチドを具備するリポソーム。
【請求項10】
前記ポリペプチドが、配列番号:2、またはその変異体を具備する請求項9に記載のリポソーム。
【請求項11】
前記ポリペプチドが、配列番号:2を具備する請求項10に記載のリポソーム。
【請求項12】
前記リポソームが、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗VEGFアプタマー、および放射性分子から選択される少なくとも1つ以上の薬剤をさらに具備する請求項11に記載のポリペプチド。
【請求項13】
前記薬剤が、ドキソルビシンである請求項12に記載のリポソーム。
【請求項14】
治療を必要とする哺乳動物に、請求項6に記載のポリペプチドの治療有効量を投与するステップを具備する哺乳動物の病気を治療する方法。
【請求項15】
前記哺乳動物が、ヒトである請求項14に記載の方法。
【請求項16】
治療を必要とする哺乳動物に、1つ以上の薬剤と請求項2に記載の1つ以上のポリペプチドを具備するポリペプチドとを具備するリポソームの治療有効量を投与するステップを具備する哺乳動物の病気を治療する方法。
【請求項17】
前記リポソームが、配列番号:2を具備するポリペプチド、またはそれの変異体を具備する請求項16に記載の方法。
【請求項18】
前記リポソームが、配列番号:2を具備するポリペプチドを具備する請求項17に記載の方法。
【請求項19】
前記の1つ以上の化学療法薬剤が、ドキソルビシン、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、ルロテカン、オリゴヌクレオチド、毒素、抗VEGFアプタマー、および放射性分子から選択される請求項16に記載の方法。
【請求項20】
前記の化学療法薬剤が、ドキソルビシンである請求項19に記載の方法。
【請求項21】
前記病気が、癌である請求項16に記載の方法。
【請求項22】
前記癌が、肝臓癌である請求項21に記載の方法。
【請求項23】
前記肝臓癌が、肝細胞癌である請求項22に記載の方法。
【請求項24】
前記哺乳動物が、ヒトである請求項16に記載の方法。
【請求項25】
a)ポリペプチドが肝臓癌細胞に結合するのを可能とする条件下で、検体を請求項2に記載のポリペプチドと接触させるステップ、および
b)請求項8に記載の抗体を用いて、前記ポリペプチドの結合を検出するステップ、
を具備する検体の肝臓癌を検出する方法。
【請求項26】
a)融合ポリペプチドが、肝臓癌細胞に結合するのを可能とする条件下で、検体を請求項5に記載の融合ポリペプチドと接触させるステップ、および
b)前記融合ポリペプチドのエピトープに特異的な抗体を用いて、融合ポリペプチドを検出するステップ、
を具備する検体の肝臓癌を検出する方法。
【請求項27】
a)ポリペプチドと分子を具備する複合体の形成を可能とする条件下で、細胞抽出物を請求項2に記載のポリペプチドと接触させるステップ、および
b)前記分子を同定するために複合体を分析するステップ、
を具備する請求項2に記載のポリペプチドに結合する分子を同定する方法。
【請求項28】
ストリンジェントな条件下で、請求項1に記載のポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項29】
請求項28に記載のポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチド。
【請求項30】
前記ポリペプチドが標識を具備する請求項2に記載のポリペプチドを対象に投与し、対象での癌に対するポリペプチドの結合を検出するステップを具備する対象での癌を検出する方法。
【請求項31】
前記標識が、放射性分子を具備する請求項30に記載の方法。
【請求項32】
前記対象が、ヒトである請求項30に記載の方法。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7】
【図8】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7】
【図8】
【公表番号】特表2011−504361(P2011−504361A)
【公表日】平成23年2月10日(2011.2.10)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−534284(P2010−534284)
【出願日】平成20年11月19日(2008.11.19)
【国際出願番号】PCT/US2008/084043
【国際公開番号】WO2009/067520
【国際公開日】平成21年5月28日(2009.5.28)
【出願人】(596118493)アカデミア シニカ (33)
【氏名又は名称原語表記】ACADEMIA SINICA
【Fターム(参考)】
【公表日】平成23年2月10日(2011.2.10)
【国際特許分類】
【出願日】平成20年11月19日(2008.11.19)
【国際出願番号】PCT/US2008/084043
【国際公開番号】WO2009/067520
【国際公開日】平成21年5月28日(2009.5.28)
【出願人】(596118493)アカデミア シニカ (33)
【氏名又は名称原語表記】ACADEMIA SINICA
【Fターム(参考)】
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