肝障害の処置剤
【課題】 Ｎ原子に置換基を有するトコフェロールアミノアルキルカルボン酸エステル及び／又はその塩を含有する肝障害の処置剤を提供する。
【解決手段】 Ｎ原子に置換基を有するトコフェロールアミノアルキルカルボン酸エステル及び／又はその塩が、肝細胞の変性死に対して改善効果を示し、また、肝の肉眼所見および組織所見においても肝障害改善効果を示すことを見出し、肝障害の処置剤として有用であり、これらを用いることにより上記課題を解決した。
【解決手段】 Ｎ原子に置換基を有するトコフェロールアミノアルキルカルボン酸エステル及び／又はその塩が、肝細胞の変性死に対して改善効果を示し、また、肝の肉眼所見および組織所見においても肝障害改善効果を示すことを見出し、肝障害の処置剤として有用であり、これらを用いることにより上記課題を解決した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ原子に置換基を有するトコフェロールアミノアルキルカルボン酸エステル及び／又はその塩を含有する肝障害の処置剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、非アルコール性脂肪肝やＣ型肝炎等の肝疾患において、酸化ストレスが肝細胞障害を引き起こす重要な原因の一つと考えられている。つまり、活性酸素の発生機構と抗酸化機構のバランスが崩れることで炎症や線維化が引き起こされ、肝組織障害の進展、ひいては肝硬変、肝癌につながると考えられる。
【０００３】
一方、ビタミンＥ欠乏動物の各種組織で脂質過酸化反応が亢進すること、高級不飽和脂肪酸の摂取量が多い場合にビタミンＥ要求性が高まることなどが知られている。不飽和脂肪酸の自動酸化は連鎖反応的に他の不飽和脂肪酸の過酸化反応を引き起こしていくもので、その中間生成物の各種ラジカル・脂質過酸化物は生体内では細胞機能に障害を与える。生体はこれら過酸化中間体、活性酸素の消去系として、ＳＯＤ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、ビタミンＥ、カロテノイドなどを有している。この観点から、ビタミンＥ製剤などの抗酸化作用を有する薬剤が臨床で使用されてきた。
【０００４】
ビタミンＥは脂溶性ビタミンの一種で、天然のビタミンＥは、側鎖に二重結合がないトコフェロールと二重結合があるトコトリエノールに大別され、芳香環上のメチル基の数と位置によりそれぞれα−、β−、γ−、δ−の４種類の異性体に区別されている。特に Ｄ−α−トコフェロールは自然界に最も広く普遍的に存在し、植物、藻類、藍藻などの光合成生物により合成され、生物活性も一番高いとされている。トコフェロール及びその誘導体である酢酸トコフェロール及びニコチン酸トコフェロール等は、抗酸化作用、生体膜安定化作用、免疫賦活作用、血行促進作用等の効能効果を有する化合物として知られており、疾病の治療、栄養の補給、食品添加物の酸化防止剤として古くから医薬品、化粧品、飼料等に配合されている。
【０００５】
例えば、酢酸α−トコフェロールは、多くの国々で、カプセルや錠剤などの栄養補助食品の素材として使用されるとともに、栄養強化の目的で主にジュース類、ダイエット果汁飲料、スポーツ飲料などの各種飲料や、パン、ヨーグルト、キャンディーなどの一般食品にも使用されている。米国やＥＵ諸国では、酢酸α−トコフェロールは、食品成分扱いとされている。
また、酢酸α−トコフェロールは、医療分野においては、ＥＰ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ：欧州薬局方）及びＵＳＰ（ＵＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：米国薬局方）に収載されており、医薬品として使用されている。我が国では、ｄｌ 体は日本薬局方に、ｄ 体は日本薬局方外医薬品規格に収載されており、一般用医薬品及び医療用医薬品として使用されている（食品安全委員会、「酢酸α−トコフェロール」、２００６年９月、を引用）。
【０００６】
しかしこれらは粘性の高い油状物質であり、水溶液やエマルジョンに均一に分散することは困難な油溶性である。また、医薬品、化粧品、食品等において可溶化状態またはエマルジョン状態として調製する場合、一般的に非イオン性界面活性剤を用いれば均一に分散することが可能であるが、非イオン性界面活性剤のなかには刺激性の高いものや環境汚染の原因物質となるものもあり、安全性の面などからも好ましくないと考えられ、その改良が望まれていた。
【０００７】
また、トコフェロール類は単体では酸化されやすく不安定であるため、多くの場合、酢酸エステルや、ニコチン酸エステル、コハク酸エステル等の有機酸エステルの誘導体として用いられる。しかし、これらが生体内でトコフェロールとしての生理活性を発現するにはエステル結合の部分がエステラーゼ等の酵素により加水分解される必要があるが、その変換速度は必ずしも十分ではなく組織内濃度を高める効果は低かった。
【０００８】
これらの事情に鑑み、トコフェロール類の誘導体の開発は古くから行われており、例えば、古くは特許文献１にビタミンＥ−アミノ酸エステル類が記載されている。そして、特定のトコフェロールアミノアルキルカルボン酸エステルが、皮膚外用剤（特許文献２、３）あるいは放射線防護剤（特許文献４）として有用であることが開示されている。また、γ−ＴＤＭＧ (γ−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｙｌ Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）の脳梗塞予防効果と脳梗塞治療効果が明らかにされている（非特許文献１）。
【０００９】
しかし、これらを通じても、トコフェロール類又はそれらの誘導体を肝臓疾患へ適用した例は限られている。すなわち、肝臓の疾患、特に、初期胆汁性肝硬変に有効な、無機セレン、α−トコフェロールなどを共配合した医薬処方（特許文献５）、肝疾患から肝臓がんへの進行予防効果を有する、カロテノイド類とα−トコフェロールを含有する製剤（特許文献６）、ナトリウム排泄疾患としての肝臓硬変症の治療又は予防用薬剤としてのトコフェロール類又はそれらの誘導体の使用（特許文献７）、等が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特願昭５８−２０３９８２号公報
【特許文献２】特開２００４−００２２７８号公報
【特許文献３】特開２００７−２３１０１３号公報
【特許文献４】特開２００８−１３７９４２号公報
【特許文献５】特開平１１−１９９４７７号公報
【特許文献６】特開２００４−１９６７８２号公報
【特許文献７】特表２００２−５３２４２１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｍ．ｆｕｋｕｏｋａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｆｕ８４４／ｈｏｍｅ２／Ｒｏｎｓｏ／Ｙａｋｕｇａｋｕ／Ｐ９−１／Ｐ０９０１＿００１３．ｐｄｆ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、肝臓疾患に対しては、上記のように、トコフェロール類又はそれらの誘導体単独で有効な技術は開示されていないのが実情である。唯一、単一化合物での効果が開示されている前記特許文献７のナトリウム排泄疾患の治療・予防効果においても、ビタミンＥ欠乏ラットに対し、ビタミンＥ補充を行うという当たり前の実施例による効果が開示されているに過ぎず、その効果は決して十分なものとは言えない。また、対象の肝臓疾患としても、肝臓がん、初期胆汁性肝硬変、ナトリウム排泄性肝硬変と限定されたものであって、広く肝臓障害に有効なトコフェロール誘導体は未だ見出されていないのが実情である。
本発明の目的は、トコフェロール誘導体として単剤で肝障害に対し有効な処置剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記事情に鑑み、γ-トコフェロールの薬物送達上の問題を克服し、肝細胞への高い集積性とγ-トコフェロールの高い生物学的利用能が確認されている化合物であるγ−ＴＤＭＧ（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４３，２１９６−２２０４（２００２））に着目し、Ｎ原子に置換基を有するトコフェロールアミノアルキルカルボン酸エステルの臨床的効果を、ＣＣｌ４誘発性肝障害モデル動物を用いて明らかにし、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、ＣＣｌ４による急性肝障害モデル動物は、肝細胞の変性壊死に対する薬物の抑制効果及びその作用機序の解析に広く用いられている。
ＣＣｌ４は、小胞体薬物代謝酵素により、活性代謝物（トリクロルメチルラジカル・ＣＣｌ３）になり、これが肝細胞のタンパク質、脂質等と共有結合してその部分に可逆的な変化を与え、膜脂質の過酸化を招来し、最終的に肝細胞の変性壊死に至らせると考えられている。
【００１５】
今日ではＣＣｌ４の活性化にはＰ４５０の存在が必要であり、ＣＣｌ４を活性化する分子種はＣＹＰ２Ｅ１やＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ２Ｂ２であることも判っている。また前記酵素存在下では、・ＣＣｌ３はより反応性の高いペルオキシラジカル（・ＯＯＣＣｌ３）に変換され、脂質過酸化を促進しやすくなることも明らかとなっている。更に生化学的あるいは病理学的にその病態は比較的詳細に検討されており、ＣＣｌ４は最も一般的な肝障害作成法として広く利用されている。
【００１６】
本発明は、このように最も一般的で広く利用されているＣＣｌ４誘発性肝障害モデル動物を用いて達成した発明である。
【００１７】
すなわち、本発明は、一般式（Ｉ）で表される化合物及び／又はその塩を含有する肝障害の処置剤である。
【化１】
（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルキル基を表し、Ｒ２は低級アルキル基を表し、Ｒ３は水素原子又は低級アルキル基を表し、Ｒ４、Ｒ５は同一又は異なって水素原子又はメチル基を表し、ｍは０または１である。）
【００１８】
本発明にかかる肝障害の処置剤は、肝障害の予防目的で使用することを特徴とする肝障害の処置剤である。また、本発明にかかる肝障害の処置剤は、肝障害の治療目的で使用することを特徴とする肝障害の処置剤である。
【００１９】
本発明にかかる肝障害の処置剤は、肝細胞の変性壊死に対して有効であることを特徴とする肝障害の処置剤である。
【００２０】
本発明にかかる肝障害の処置剤に含有される一般式（Ｉ）の化合物においては、ｍが０であることが好ましい。また、Ｒ１、Ｒ２が共にメチル基であることが好ましい。また、Ｒ３が水素原子であることが好ましい。さらには、Ｒ４がメチル基、Ｒ５が水素原子であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の肝障害の処置剤は、上記一般式（Ｉ）で表されるＮ原子に置換基を有するトコフェロールアミノアルキルカルボン酸エステルの、肝細胞への高い集積性と高い生物学的利用能に着目して完成された発明であり、該化合物を含有する処置剤は、肝障害の処置剤として広く医薬品等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、γ−ＴＤＭＧの腹腔内投与による効果：血清中のＡＬＴ値の変動（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図２】ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、γ−ＴＤＭＧの腹腔内投与による効果：ラット肝臓の肉眼による外観変化（ＣＣｌ４投与４８時間後）。
【図３】ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、γ−ＴＤＭＧの腹腔内投与による効果：ラット肝組織のＨＥ染色による病理学的所見（ＣＣｌ４投与４８時間後）、（Ａ）正常肝（無処置）、（Ｂ）Ｃｏｎｔｒｏｌ（０．５％メチルセルロース＋ＣＣｌ４）、（Ｃ）γ−ＴＤＭＧ（γ−ＴＤＭＧ＋ＣＣｌ４）
【図４】ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、γ−ＴＤＭＧの腹腔内投与による効果：ラット肝ホモジネート中の過酸化脂質量（ＣＣｌ４投与４８時間後）。
【図５】ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、γ−ＴＤＭＧの経口投与による効果：血清中のＡＬＴ値の変動（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について詳述する。
本発明の肝障害の処置剤に含有される化合物は、下記の一般式（Ｉ）で示される化合物及び／又はその塩である。
【化２】
（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルキル基を表し、Ｒ２は低級アルキル基を表し、Ｒ３は水素原子又は低級アルキル基を表し、Ｒ４、Ｒ５は同一又は異なって水素原子又はメチル基を表し、ｍは０または１である。）
【００２４】
これらのトコフェロール誘導体は、クロマノール環の２位の不斉炭素に由来する立体異性体が存在することになるが、本発明は、これらの異性体の何れをも含むものであり、また、これら異性体の混合物であっても良い。
【００２５】
上記一般式（Ｉ）におけるＲ１、Ｒ２、及びＲ３における低級アルキル基とは、炭素数１〜４の直鎖状、分枝状、もしくは環状の飽和炭化水素基である。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、
シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基などが挙げられる。好ましくはメチル基である。
【００２６】
Ｒ３が低級アルキル基の場合、Ｒ３の結合している炭素の不斉に起因する立体異性体が存在することになるが、本発明は、これらの異性体の何れをも含むものであり、また、これら異性体の混合物であっても良い。
【００２７】
本発明の上記一般式（Ｉ）の化合物の代表的な製造方法を下記に例示するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下の製造方法において、特に明記しない限り、Ｒ１〜Ｒ５、及びｍは前記定義の通りである。また、化合物を光学活性体として得るためには、光学活性な原料、試薬又は触媒等を用いればよく、また、適切な段階で、クロマトグラフィー、分別結晶等の分離操作を行なえばよい。また、官能基が分子内に存在し、この官能基が反応の妨害となる、あるはその恐れのある場合には、適切な保護基を用いて効率的に反応を進行させることが好ましい。保護基の利用は、例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ著、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」等に従って実施できる。また、特に問題のない限り、各反応の条件や各工程の順序を変更することも可能であり、より適切な方法を選択することができる。
【００２８】
すなわち、下記一般式（ＩＩ）
【化３】
（式中、Ｒ４、Ｒ５は同一又は異なって水素原子又はメチル基を表す。）
で表されるトコフェロ−ルと、下記一般式（ＩＩＩ）
【００２９】
【化４】
（式中、Ｒ１は水素原子、低級アルキル基、又はＮ原子の保護基を表し、Ｒ２は低級アルキル基を表し、Ｒ３は水素原子又は低級アルキル基を表し、ｍは０または１である。）
で表されるＮ置換アミノアルキルカルボン酸とから、混合酸無水物法、酸塩化物法、ＤＣＣ法、ＣＤＩ法あるいはアジド法等の公知のエステル結合形成反応により製造することができる。
【００３０】
遊離のＮ置換アミノアルキルカルボン酸を用いて直接、エステル化を行う際は、通常、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ−ジサクシニミドオキザレートなどの活性エステル化試薬の存在下で反応を行うことが好ましい。この際の溶媒としてはピリジンが好ましい。
【００３１】
また、反応性酸誘導体を用いる方法においては、酸ハライド、とりわけ酸塩化物を用いる方法が好ましい。
【００３２】
また、必要に応じて、Ｎ置換アミノアルキルカルボン酸は、例えば、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）または２−ニトロベンゼンスルホニル基などでアミノ基を保護したアミノアルキルカルボン酸を用い、反応終了後、脱保護基化して目的物を得ても良い。
【００３３】
なお、本発明のＮ原子に置換基を有するトコフェロールアミノアルキルカルボン酸エステルの塩を製造する場合は、一旦エステル体を製造し、その後、常法により酸を加えて所望の塩としてもよいし、あらかじめ、出発物質としてＮ置換アミノアルキルカルボン酸の塩を用いて上記のようにエステル化反応を行ってもよい。
【００３４】
例えば、γ−ＴＤＭＧ塩酸塩（Ｒ１＝Ｒ２＝ＣＨ３、Ｒ３＝Ｈ、Ｒ４＝ＣＨ３、Ｒ５＝Ｈ、ｍ＝０、塩酸塩）は、γ−トコフェロールと１．２倍モルのＮ，Ｎ−ジメチルグリシン塩酸塩、およびジシクロヘキシルカルボジイミドを無水ピリジン中、室温で反応させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィにて単離精製した後、塩酸−ジオキサンにて塩酸塩とし、再結晶によって得られる。
【００３５】
また、γ−トコフェリル Ｎ−メチルアラニネート塩酸塩（Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＣＨ３、Ｒ３＝ＣＨ３、Ｒ４＝ＣＨ３、Ｒ５＝Ｈ、ｍ＝０、塩酸塩）の場合は、先ず、γ−トコフェロールと１．２倍モルのＮ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチルアラニン塩酸塩、およびジシクロヘキシルカルボジイミドを無水ピリジン中、室温で反応させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィにて単離精製してγ−トコフェリル Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチルアラニネートを得る。次いで、本化合物を塩酸−ジオキサン中、室温で反応させてＢｏｃ基を除去することにより、塩酸塩として目的物を得ることができる。
【００３６】
本発明の上記一般式（Ｉ）の化合物は、必要に応じて、通常の方法により所望の酸付加塩へと変換することができる。酸付加塩の酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、乳酸、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、メタンスルホン酸等の有機酸が挙げられる。好ましくは塩酸塩である。
【００３７】
本発明の上記一般式（Ｉ）の化合物は、肝障害に対し優れた予防又は／及び治療効果を有するので、肝障害の処置剤として、経口、非経口、局所等何れの方法でも投与することができる。投与量は、対象（哺乳動物、特にはヒト）、年齢、性別、個人差、症状などによって適宜調整されるので特に限定されないが、例えば、本発明の上記一般式（Ｉ）の化合物として０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｋｇの用量を経口、非経口投与にて１日１回又は数回に分けて投与することができる。
【００３８】
本発明の上記一般式（Ｉ）の化合物は多様な製剤形態で投与できる。製剤中の有効成分の量は特に限定されるものではないが、通常０．０１％〜７０質量％、好ましくは０．１〜５０質量％とすることができる。製剤化の際は、通常の製剤担体を用いて常法により製造するが、必要により薬理学的に許容し得る添加物を加えてもよい。すなわち、経口用固形製剤を調製する場合には、主薬に賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤等を加え、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などとする。
【００３９】
賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素、リン酸カルシウム、グリシン等が、結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ポリビニルピロリドン等が、崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、デキストリン、ペクチン、アルギン酸等が、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリン酸ナトリウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油などが、着色剤としては医薬品に添加することが許されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香酸、ハッカ油、龍脳、桂皮末などが用いられる。また、錠剤、顆粒剤等は、糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングすることが可能である。
【００４０】
経口用液剤とする場合には、有効成分を矯味矯臭剤、着色剤、乳化剤、沈殿防止剤、希釈剤等を加えて、水性懸濁剤、エリキシル剤、シロップ剤等とすることができる。
【００４１】
注射剤（筋肉内、腹腔内、関節内、皮下、静脈内注射等）としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。また、必要に応じて、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤のような補助剤を含有してもよい。注射剤は通常、濾過（バクテリア保留フィルター等）、殺菌剤の配合又はγ線照射によって無菌化されるか、又はこれらの処理をした後、凍結乾燥等の方法により固体組成物とし、使用直前に無菌水又は無菌の注射用希釈剤を加えて使用される。また、坐剤などとして非経口的に投与することも可能である。
【００４２】
また、局所投与における外用剤として用いる場合は、本発明の上記一般式（Ｉ）の化合物の他に、本発明の効果を損なわない範囲において、通常、医薬品等に用いられる他の成分、例えば、粉末成分、液体油脂、固体油脂、ロウ、炭化水素、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル、シリコーン、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、保湿剤、水溶性高分子、増粘剤、皮膜剤、紫外線吸収剤、金属イオン封鎖剤、低級アルコール、多価アルコール、糖、アミノ酸、有機アミン、高分子エマルジョン、ｐＨ調整剤、皮膚栄養剤、ビタミン、酸化防止剤、酸化防止助剤、香料、水等を必要に応じて適宜配合し、目的とする剤形に応じて常法により製造することが出来る。
【実施例】
【００４３】
本発明について以下に実施例を挙げてさらに詳述するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
＜ＣＣｌ４誘発性肝障害モデル動物を用いたγ−ＴＤＭＧの腹腔内投与による有用性の検討＞
以下の実験動物の飼育、保全、使用に関するすべての行為は、福岡大学・動物実験委員会により制定された福岡大学動物実験規程を遵守して実施した。
５週齢の雄性ＳＤラット、各群１６匹を用いた。実験動物は室温２３±２℃、絶対湿度６０±２％および１２時間の明暗サイクル（ＡＭ７：００点灯）の動物舎にて１頭／ケージで飼育し、水は自由摂取とした。γ−ＴＤＭＧは０．５％メチルセルロース水溶液を用いて溶解し、γ−ＴＤＭＧ２５ｍｇ／２ｍｌ溶液となるように調製した。肝障害誘発物質であるＣＣｌ４は、ＣＣｌ４をオリーブオイルに溶解し、ＣＣｌ４０．６ｍｌ／２ｍｌ溶液となるように調製した。
【００４５】
ＣＣｌ４投与に先立つ１６時間前に、前記ラットを絶食状態にした。ＣＣｌ４投与１２時間前に、γ−ＴＤＭＧ溶液２ｍｌ／ｋｇ（γ−ＴＤＭＧ２５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。ＣＣｌ４投与１時間前に摂食を開始した。
コントロール群においては、ＣＣｌ４投与１２時間前に、γ−ＴＤＭＧの代わりに、０．５％メチルセルロース水溶液２ｍｌ／ｋｇを腹腔内投与した。その他の操作は全く同様に行った。
【００４６】
上記の各群ラットに対し、ＣＣｌ４溶液２ｍｌ／ｋｇ（ＣＣｌ４０．６ｍｌ／ｋｇ）を経口投与した。ＣＣｌ４投与後４８時間飼育し、各群ラットを腹部大動脈切除により脱血し、肝臓を採取し、ラット肝臓の肉眼所見、ラット肝組織のヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）及びラット肝組織内過酸化脂質量の測定（ＴＢＡ法）を実施した。併せて、ＣＣｌ４投与０時間後、２４時間後、及び３６時間後に、エーテル麻酔下で外頸静脈より採血（０．３ｍｌ）し、血清中のＡＬＴ値の測定を行った。
【００４７】
＜血清中ＡＬＴ値の測定＞：ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、γ−ＴＤＭＧの効果として、ＡＬＴ値の変動を、富士ドライケムシステムを用いて測定した。有意差検定は分散分析（Ｓｃｈｅｆｆｅ ｔｅｓｔ）で行った。
【００４８】
図１から明らかなように、ＣＣｌ４誘発性肝障害モデルラットに対してγ−ＴＤＭＧ腹腔内投与群では、非投与群と比較して、血清ＡＬＴ値の上昇が有意に抑制された。ＡＬＴは肝細胞が障害を受けると細胞が壊れて血中に漏れ出る酵素であることから、ＣＣｌ４で惹起された肝細胞の変性死に対し、γ−ＴＤＭＧは有効性を示した。
【００４９】
＜肝外観の肉眼的変化＞：ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、ＣＣｌ４投与４８時間後におけるγ−ＴＤＭＧの効果を、ラット肝臓外観の肉眼所見によって判定した。
【００５０】
図２から明らかなように、ＣＣｌ４投与４８時間後における肝の肉眼所見において、γ−ＴＤＭＧ非投与群では肝臓表面が凹凸顆粒状でやや黄白色調に変化していたのに対し、γ−ＴＤＭＧ腹腔内投与群では正常肝に近かった。すなわち、ＣＣｌ４で惹起された肝細胞の障害に対し、γ−ＴＤＭＧは有効性を示した。
【００５１】
＜組織染色＞：ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、ＣＣｌ４投与４８時間後におけるγ−ＴＤＭＧの効果を、ラット肝組織のＨＥ染色による病理学的所見にて判定した。すなわち、採取した肝臓を１０％リン酸緩衝ホルマリン液で固定しパラフィン包埋した。次いで、薄切し、ＨＥ染色を行い光学顕微鏡下で観察した。
【００５２】
図３から明らかなように、ＣＣｌ４投与４８時間後における肝の組織所見（ＨＥ染色）において、γ−ＴＤＭＧ非投与群（Ｂ）では、グリソン鞘および中心静脈周辺にリンパ球の増殖と、中心静脈周囲に広範な出血性細胞壊死が観察された。
一方、γ−ＴＤＭＧ腹腔内投与群（Ｃ）では、 中心静脈周辺にいずれも軽度な炎症細胞の増殖と細胞の壊死がみられた。すなわち、ＣＣｌ４で惹起された肝細胞の障害に対し、γ−ＴＤＭＧは有効性を示した。
【００５３】
＜肝ホモジネート中の過酸化脂質量の測定（ＴＢＡ法）＞：ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、ＣＣｌ４投与４８時間後におけるγ−ＴＤＭＧの効果を、ラット肝ホモジネート中の過酸化脂質（ＭＤＡ）を定量することにより判定した。すなわち、
（１）肝臓切片の湿重量を測定し、ガラス瓶に移し肝臓切片に９倍量（１ｇにつき９ｍｌ）の１．１５％ＫＣｌを加える。
（２）ホモジナイザーで肝臓組織のホモジネートを得る。
（３）ホモジネート０．２ｍｌを試験管に入れる。
（４）０．２ｍｌの８．１％ＳＤＳを試験管に加える。
（５）１．５ｍｌの２０％の酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）を試験管に加える。
（６）１．５ｍｌの０．８％ＴＢＡ試薬を試験管に加える。
（７）９５℃の温浴で６０分間加熱する。
（８）加熱後、氷冷水浴槽に試験管を入れ速やかに室温まで冷却する。
（９）１ｍｌの蒸留水を試験管に加える。
（１０）５ｍｌのｎ−ブタノールピリジン溶液（１５：１、ｖ/ｖ）を試験管に加えてよく振り混ぜ抽出する。
（１１）遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）後ブタノール槽（上層）を取る。
（１２）５３５ｎｍの吸光度を測定する。
【００５４】
図４から明らかなように、ＣＣｌ４投与４８時間後における肝ホモジネート中の過酸化脂質量は、γ−ＴＤＭＧ腹腔内投与群とγ−ＴＤＭＧ非投与群との比較において有意差が認められなかった。
【実施例２】
【００５５】
＜ＣＣｌ４誘発性肝障害モデル動物を用いたγ−ＴＤＭＧの経口投与による有用性の検討＞
５週齢の雄性ＳＤラットを、コントロール群４匹、γ−ＴＤＭＧ投与群各１０匹を用いて実施した。実験動物は室温２３±２℃、絶対湿度６０±２％および１２時間の明暗サイクル（ＡＭ７：００点灯）の動物舎にて１頭／ケージで飼育し、水は自由摂取とした。γ−ＴＤＭＧは０．５％メチルセルロース水溶液を用いて溶解し、γ−ＴＤＭＧ２５ｍｇ／２ｍｌ溶液、及び、γ−ＴＤＭＧ１００ｍｇ／２ｍｌ溶液を各々調製した。肝障害誘発物質であるＣＣｌ４は、ＣＣｌ４をオリーブオイルに溶解し、ＣＣｌ４０．６ｍｌ／２ｍｌ溶液となるように調製した。
【００５６】
ＣＣｌ４投与に先立つ１６時間前に、前記ラットを絶食状態にした。ＣＣｌ４投与１２時間前に、γ−ＴＤＭＧ溶液２ｍｌ／ｋｇ（γ−ＴＤＭＧ２５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。ＣＣｌ４投与１時間前に摂食を開始した。
コントロール群においては、ＣＣｌ４投与１２時間前に、γ−ＴＤＭＧの代わりに、０．５％メチルセルロース水溶液２ｍｌ／ｋｇを経口投与した。その他の操作は全く同様に行った。
【００５７】
上記の各群ラットに対し、ＣＣｌ４溶液２ｍｌ／ｋｇ（ＣＣｌ４０．６ｍｌ／ｋｇ）を経口投与した。ＣＣｌ４投与０時間後、２４時間後、及び３６時間後に、エーテル麻酔下で外頸静脈より採血（０．３ｍｌ）し、血清中のＡＬＴ値の測定を行った。
【００５８】
＜血清中ＡＬＴ値の測定＞：ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、γ−ＴＤＭＧの効果として、ＡＬＴ値の変動を、富士ドライケムシステムを用いて測定した。有意差検定は分散分析（Ｓｃｈｅｆｆｅ ｔｅｓｔ）で行った。
【００５９】
図５から明らかなように、ＣＣｌ４誘発性肝障害モデルラットに対してγ−ＴＤＭＧ経口投与群では、γ−ＴＤＭＧ２５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのいずれの投与量においても、非投与群と比較して、血清中のＡＬＴ値の上昇が有意に抑制された。すなわち、ＣＣｌ４で惹起された肝細胞の変性死に対し、γ−ＴＤＭＧは経口投与でも有効性を示した。
【００６０】
以上、γ−ＴＤＭＧの腹腔内投与（１２時間前）により、ＣＣｌ４誘発性肝障害モデルラットの血清ＡＬＴ値の上昇を有意に抑制することができた。すなわち、ＣＣｌ４で惹起される肝細胞の変性死に対し、γ−ＴＤＭＧは有効性を示した。更に、採取した肝組織中の過酸化脂質量においては、非投与群と比較して有意な差が認められなかったにも拘らず、肉眼所見および組織所見においては肝障害改善傾向が認められた。γ−ＴＤＭＧの経口投与（１２時間前）においても同様に、血清ＡＬＴ値の上昇を有意に抑制することが認められた。これらの実験事実により、γ−ＴＤＭＧの肝障害抑制効果が実証された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ原子に置換基を有するトコフェロールアミノアルキルカルボン酸エステル及び／又はその塩を含有する肝障害の処置剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、非アルコール性脂肪肝やＣ型肝炎等の肝疾患において、酸化ストレスが肝細胞障害を引き起こす重要な原因の一つと考えられている。つまり、活性酸素の発生機構と抗酸化機構のバランスが崩れることで炎症や線維化が引き起こされ、肝組織障害の進展、ひいては肝硬変、肝癌につながると考えられる。
【０００３】
一方、ビタミンＥ欠乏動物の各種組織で脂質過酸化反応が亢進すること、高級不飽和脂肪酸の摂取量が多い場合にビタミンＥ要求性が高まることなどが知られている。不飽和脂肪酸の自動酸化は連鎖反応的に他の不飽和脂肪酸の過酸化反応を引き起こしていくもので、その中間生成物の各種ラジカル・脂質過酸化物は生体内では細胞機能に障害を与える。生体はこれら過酸化中間体、活性酸素の消去系として、ＳＯＤ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、ビタミンＥ、カロテノイドなどを有している。この観点から、ビタミンＥ製剤などの抗酸化作用を有する薬剤が臨床で使用されてきた。
【０００４】
ビタミンＥは脂溶性ビタミンの一種で、天然のビタミンＥは、側鎖に二重結合がないトコフェロールと二重結合があるトコトリエノールに大別され、芳香環上のメチル基の数と位置によりそれぞれα−、β−、γ−、δ−の４種類の異性体に区別されている。特に Ｄ−α−トコフェロールは自然界に最も広く普遍的に存在し、植物、藻類、藍藻などの光合成生物により合成され、生物活性も一番高いとされている。トコフェロール及びその誘導体である酢酸トコフェロール及びニコチン酸トコフェロール等は、抗酸化作用、生体膜安定化作用、免疫賦活作用、血行促進作用等の効能効果を有する化合物として知られており、疾病の治療、栄養の補給、食品添加物の酸化防止剤として古くから医薬品、化粧品、飼料等に配合されている。
【０００５】
例えば、酢酸α−トコフェロールは、多くの国々で、カプセルや錠剤などの栄養補助食品の素材として使用されるとともに、栄養強化の目的で主にジュース類、ダイエット果汁飲料、スポーツ飲料などの各種飲料や、パン、ヨーグルト、キャンディーなどの一般食品にも使用されている。米国やＥＵ諸国では、酢酸α−トコフェロールは、食品成分扱いとされている。
また、酢酸α−トコフェロールは、医療分野においては、ＥＰ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ：欧州薬局方）及びＵＳＰ（ＵＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：米国薬局方）に収載されており、医薬品として使用されている。我が国では、ｄｌ 体は日本薬局方に、ｄ 体は日本薬局方外医薬品規格に収載されており、一般用医薬品及び医療用医薬品として使用されている（食品安全委員会、「酢酸α−トコフェロール」、２００６年９月、を引用）。
【０００６】
しかしこれらは粘性の高い油状物質であり、水溶液やエマルジョンに均一に分散することは困難な油溶性である。また、医薬品、化粧品、食品等において可溶化状態またはエマルジョン状態として調製する場合、一般的に非イオン性界面活性剤を用いれば均一に分散することが可能であるが、非イオン性界面活性剤のなかには刺激性の高いものや環境汚染の原因物質となるものもあり、安全性の面などからも好ましくないと考えられ、その改良が望まれていた。
【０００７】
また、トコフェロール類は単体では酸化されやすく不安定であるため、多くの場合、酢酸エステルや、ニコチン酸エステル、コハク酸エステル等の有機酸エステルの誘導体として用いられる。しかし、これらが生体内でトコフェロールとしての生理活性を発現するにはエステル結合の部分がエステラーゼ等の酵素により加水分解される必要があるが、その変換速度は必ずしも十分ではなく組織内濃度を高める効果は低かった。
【０００８】
これらの事情に鑑み、トコフェロール類の誘導体の開発は古くから行われており、例えば、古くは特許文献１にビタミンＥ−アミノ酸エステル類が記載されている。そして、特定のトコフェロールアミノアルキルカルボン酸エステルが、皮膚外用剤（特許文献２、３）あるいは放射線防護剤（特許文献４）として有用であることが開示されている。また、γ−ＴＤＭＧ (γ−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｙｌ Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎａｔｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）の脳梗塞予防効果と脳梗塞治療効果が明らかにされている（非特許文献１）。
【０００９】
しかし、これらを通じても、トコフェロール類又はそれらの誘導体を肝臓疾患へ適用した例は限られている。すなわち、肝臓の疾患、特に、初期胆汁性肝硬変に有効な、無機セレン、α−トコフェロールなどを共配合した医薬処方（特許文献５）、肝疾患から肝臓がんへの進行予防効果を有する、カロテノイド類とα−トコフェロールを含有する製剤（特許文献６）、ナトリウム排泄疾患としての肝臓硬変症の治療又は予防用薬剤としてのトコフェロール類又はそれらの誘導体の使用（特許文献７）、等が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特願昭５８−２０３９８２号公報
【特許文献２】特開２００４−００２２７８号公報
【特許文献３】特開２００７−２３１０１３号公報
【特許文献４】特開２００８−１３７９４２号公報
【特許文献５】特開平１１−１９９４７７号公報
【特許文献６】特開２００４−１９６７８２号公報
【特許文献７】特表２００２−５３２４２１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｍ．ｆｕｋｕｏｋａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｆｕ８４４／ｈｏｍｅ２／Ｒｏｎｓｏ／Ｙａｋｕｇａｋｕ／Ｐ９−１／Ｐ０９０１＿００１３．ｐｄｆ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、肝臓疾患に対しては、上記のように、トコフェロール類又はそれらの誘導体単独で有効な技術は開示されていないのが実情である。唯一、単一化合物での効果が開示されている前記特許文献７のナトリウム排泄疾患の治療・予防効果においても、ビタミンＥ欠乏ラットに対し、ビタミンＥ補充を行うという当たり前の実施例による効果が開示されているに過ぎず、その効果は決して十分なものとは言えない。また、対象の肝臓疾患としても、肝臓がん、初期胆汁性肝硬変、ナトリウム排泄性肝硬変と限定されたものであって、広く肝臓障害に有効なトコフェロール誘導体は未だ見出されていないのが実情である。
本発明の目的は、トコフェロール誘導体として単剤で肝障害に対し有効な処置剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記事情に鑑み、γ-トコフェロールの薬物送達上の問題を克服し、肝細胞への高い集積性とγ-トコフェロールの高い生物学的利用能が確認されている化合物であるγ−ＴＤＭＧ（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４３，２１９６−２２０４（２００２））に着目し、Ｎ原子に置換基を有するトコフェロールアミノアルキルカルボン酸エステルの臨床的効果を、ＣＣｌ４誘発性肝障害モデル動物を用いて明らかにし、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、ＣＣｌ４による急性肝障害モデル動物は、肝細胞の変性壊死に対する薬物の抑制効果及びその作用機序の解析に広く用いられている。
ＣＣｌ４は、小胞体薬物代謝酵素により、活性代謝物（トリクロルメチルラジカル・ＣＣｌ３）になり、これが肝細胞のタンパク質、脂質等と共有結合してその部分に可逆的な変化を与え、膜脂質の過酸化を招来し、最終的に肝細胞の変性壊死に至らせると考えられている。
【００１５】
今日ではＣＣｌ４の活性化にはＰ４５０の存在が必要であり、ＣＣｌ４を活性化する分子種はＣＹＰ２Ｅ１やＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ２Ｂ２であることも判っている。また前記酵素存在下では、・ＣＣｌ３はより反応性の高いペルオキシラジカル（・ＯＯＣＣｌ３）に変換され、脂質過酸化を促進しやすくなることも明らかとなっている。更に生化学的あるいは病理学的にその病態は比較的詳細に検討されており、ＣＣｌ４は最も一般的な肝障害作成法として広く利用されている。
【００１６】
本発明は、このように最も一般的で広く利用されているＣＣｌ４誘発性肝障害モデル動物を用いて達成した発明である。
【００１７】
すなわち、本発明は、一般式（Ｉ）で表される化合物及び／又はその塩を含有する肝障害の処置剤である。
【化１】
（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルキル基を表し、Ｒ２は低級アルキル基を表し、Ｒ３は水素原子又は低級アルキル基を表し、Ｒ４、Ｒ５は同一又は異なって水素原子又はメチル基を表し、ｍは０または１である。）
【００１８】
本発明にかかる肝障害の処置剤は、肝障害の予防目的で使用することを特徴とする肝障害の処置剤である。また、本発明にかかる肝障害の処置剤は、肝障害の治療目的で使用することを特徴とする肝障害の処置剤である。
【００１９】
本発明にかかる肝障害の処置剤は、肝細胞の変性壊死に対して有効であることを特徴とする肝障害の処置剤である。
【００２０】
本発明にかかる肝障害の処置剤に含有される一般式（Ｉ）の化合物においては、ｍが０であることが好ましい。また、Ｒ１、Ｒ２が共にメチル基であることが好ましい。また、Ｒ３が水素原子であることが好ましい。さらには、Ｒ４がメチル基、Ｒ５が水素原子であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の肝障害の処置剤は、上記一般式（Ｉ）で表されるＮ原子に置換基を有するトコフェロールアミノアルキルカルボン酸エステルの、肝細胞への高い集積性と高い生物学的利用能に着目して完成された発明であり、該化合物を含有する処置剤は、肝障害の処置剤として広く医薬品等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、γ−ＴＤＭＧの腹腔内投与による効果：血清中のＡＬＴ値の変動（＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図２】ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、γ−ＴＤＭＧの腹腔内投与による効果：ラット肝臓の肉眼による外観変化（ＣＣｌ４投与４８時間後）。
【図３】ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、γ−ＴＤＭＧの腹腔内投与による効果：ラット肝組織のＨＥ染色による病理学的所見（ＣＣｌ４投与４８時間後）、（Ａ）正常肝（無処置）、（Ｂ）Ｃｏｎｔｒｏｌ（０．５％メチルセルロース＋ＣＣｌ４）、（Ｃ）γ−ＴＤＭＧ（γ−ＴＤＭＧ＋ＣＣｌ４）
【図４】ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、γ−ＴＤＭＧの腹腔内投与による効果：ラット肝ホモジネート中の過酸化脂質量（ＣＣｌ４投与４８時間後）。
【図５】ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、γ−ＴＤＭＧの経口投与による効果：血清中のＡＬＴ値の変動（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について詳述する。
本発明の肝障害の処置剤に含有される化合物は、下記の一般式（Ｉ）で示される化合物及び／又はその塩である。
【化２】
（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルキル基を表し、Ｒ２は低級アルキル基を表し、Ｒ３は水素原子又は低級アルキル基を表し、Ｒ４、Ｒ５は同一又は異なって水素原子又はメチル基を表し、ｍは０または１である。）
【００２４】
これらのトコフェロール誘導体は、クロマノール環の２位の不斉炭素に由来する立体異性体が存在することになるが、本発明は、これらの異性体の何れをも含むものであり、また、これら異性体の混合物であっても良い。
【００２５】
上記一般式（Ｉ）におけるＲ１、Ｒ２、及びＲ３における低級アルキル基とは、炭素数１〜４の直鎖状、分枝状、もしくは環状の飽和炭化水素基である。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、
シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基などが挙げられる。好ましくはメチル基である。
【００２６】
Ｒ３が低級アルキル基の場合、Ｒ３の結合している炭素の不斉に起因する立体異性体が存在することになるが、本発明は、これらの異性体の何れをも含むものであり、また、これら異性体の混合物であっても良い。
【００２７】
本発明の上記一般式（Ｉ）の化合物の代表的な製造方法を下記に例示するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下の製造方法において、特に明記しない限り、Ｒ１〜Ｒ５、及びｍは前記定義の通りである。また、化合物を光学活性体として得るためには、光学活性な原料、試薬又は触媒等を用いればよく、また、適切な段階で、クロマトグラフィー、分別結晶等の分離操作を行なえばよい。また、官能基が分子内に存在し、この官能基が反応の妨害となる、あるはその恐れのある場合には、適切な保護基を用いて効率的に反応を進行させることが好ましい。保護基の利用は、例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ著、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」等に従って実施できる。また、特に問題のない限り、各反応の条件や各工程の順序を変更することも可能であり、より適切な方法を選択することができる。
【００２８】
すなわち、下記一般式（ＩＩ）
【化３】
（式中、Ｒ４、Ｒ５は同一又は異なって水素原子又はメチル基を表す。）
で表されるトコフェロ−ルと、下記一般式（ＩＩＩ）
【００２９】
【化４】
（式中、Ｒ１は水素原子、低級アルキル基、又はＮ原子の保護基を表し、Ｒ２は低級アルキル基を表し、Ｒ３は水素原子又は低級アルキル基を表し、ｍは０または１である。）
で表されるＮ置換アミノアルキルカルボン酸とから、混合酸無水物法、酸塩化物法、ＤＣＣ法、ＣＤＩ法あるいはアジド法等の公知のエステル結合形成反応により製造することができる。
【００３０】
遊離のＮ置換アミノアルキルカルボン酸を用いて直接、エステル化を行う際は、通常、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ−ジサクシニミドオキザレートなどの活性エステル化試薬の存在下で反応を行うことが好ましい。この際の溶媒としてはピリジンが好ましい。
【００３１】
また、反応性酸誘導体を用いる方法においては、酸ハライド、とりわけ酸塩化物を用いる方法が好ましい。
【００３２】
また、必要に応じて、Ｎ置換アミノアルキルカルボン酸は、例えば、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）または２−ニトロベンゼンスルホニル基などでアミノ基を保護したアミノアルキルカルボン酸を用い、反応終了後、脱保護基化して目的物を得ても良い。
【００３３】
なお、本発明のＮ原子に置換基を有するトコフェロールアミノアルキルカルボン酸エステルの塩を製造する場合は、一旦エステル体を製造し、その後、常法により酸を加えて所望の塩としてもよいし、あらかじめ、出発物質としてＮ置換アミノアルキルカルボン酸の塩を用いて上記のようにエステル化反応を行ってもよい。
【００３４】
例えば、γ−ＴＤＭＧ塩酸塩（Ｒ１＝Ｒ２＝ＣＨ３、Ｒ３＝Ｈ、Ｒ４＝ＣＨ３、Ｒ５＝Ｈ、ｍ＝０、塩酸塩）は、γ−トコフェロールと１．２倍モルのＮ，Ｎ−ジメチルグリシン塩酸塩、およびジシクロヘキシルカルボジイミドを無水ピリジン中、室温で反応させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィにて単離精製した後、塩酸−ジオキサンにて塩酸塩とし、再結晶によって得られる。
【００３５】
また、γ−トコフェリル Ｎ−メチルアラニネート塩酸塩（Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＣＨ３、Ｒ３＝ＣＨ３、Ｒ４＝ＣＨ３、Ｒ５＝Ｈ、ｍ＝０、塩酸塩）の場合は、先ず、γ−トコフェロールと１．２倍モルのＮ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチルアラニン塩酸塩、およびジシクロヘキシルカルボジイミドを無水ピリジン中、室温で反応させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィにて単離精製してγ−トコフェリル Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチルアラニネートを得る。次いで、本化合物を塩酸−ジオキサン中、室温で反応させてＢｏｃ基を除去することにより、塩酸塩として目的物を得ることができる。
【００３６】
本発明の上記一般式（Ｉ）の化合物は、必要に応じて、通常の方法により所望の酸付加塩へと変換することができる。酸付加塩の酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、乳酸、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、メタンスルホン酸等の有機酸が挙げられる。好ましくは塩酸塩である。
【００３７】
本発明の上記一般式（Ｉ）の化合物は、肝障害に対し優れた予防又は／及び治療効果を有するので、肝障害の処置剤として、経口、非経口、局所等何れの方法でも投与することができる。投与量は、対象（哺乳動物、特にはヒト）、年齢、性別、個人差、症状などによって適宜調整されるので特に限定されないが、例えば、本発明の上記一般式（Ｉ）の化合物として０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｋｇの用量を経口、非経口投与にて１日１回又は数回に分けて投与することができる。
【００３８】
本発明の上記一般式（Ｉ）の化合物は多様な製剤形態で投与できる。製剤中の有効成分の量は特に限定されるものではないが、通常０．０１％〜７０質量％、好ましくは０．１〜５０質量％とすることができる。製剤化の際は、通常の製剤担体を用いて常法により製造するが、必要により薬理学的に許容し得る添加物を加えてもよい。すなわち、経口用固形製剤を調製する場合には、主薬に賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤等を加え、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などとする。
【００３９】
賦形剤としては、例えば乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素、リン酸カルシウム、グリシン等が、結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ポリビニルピロリドン等が、崩壊剤としては、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、デキストリン、ペクチン、アルギン酸等が、滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリン酸ナトリウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油などが、着色剤としては医薬品に添加することが許されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香酸、ハッカ油、龍脳、桂皮末などが用いられる。また、錠剤、顆粒剤等は、糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングすることが可能である。
【００４０】
経口用液剤とする場合には、有効成分を矯味矯臭剤、着色剤、乳化剤、沈殿防止剤、希釈剤等を加えて、水性懸濁剤、エリキシル剤、シロップ剤等とすることができる。
【００４１】
注射剤（筋肉内、腹腔内、関節内、皮下、静脈内注射等）としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。また、必要に応じて、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤のような補助剤を含有してもよい。注射剤は通常、濾過（バクテリア保留フィルター等）、殺菌剤の配合又はγ線照射によって無菌化されるか、又はこれらの処理をした後、凍結乾燥等の方法により固体組成物とし、使用直前に無菌水又は無菌の注射用希釈剤を加えて使用される。また、坐剤などとして非経口的に投与することも可能である。
【００４２】
また、局所投与における外用剤として用いる場合は、本発明の上記一般式（Ｉ）の化合物の他に、本発明の効果を損なわない範囲において、通常、医薬品等に用いられる他の成分、例えば、粉末成分、液体油脂、固体油脂、ロウ、炭化水素、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル、シリコーン、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、保湿剤、水溶性高分子、増粘剤、皮膜剤、紫外線吸収剤、金属イオン封鎖剤、低級アルコール、多価アルコール、糖、アミノ酸、有機アミン、高分子エマルジョン、ｐＨ調整剤、皮膚栄養剤、ビタミン、酸化防止剤、酸化防止助剤、香料、水等を必要に応じて適宜配合し、目的とする剤形に応じて常法により製造することが出来る。
【実施例】
【００４３】
本発明について以下に実施例を挙げてさらに詳述するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
＜ＣＣｌ４誘発性肝障害モデル動物を用いたγ−ＴＤＭＧの腹腔内投与による有用性の検討＞
以下の実験動物の飼育、保全、使用に関するすべての行為は、福岡大学・動物実験委員会により制定された福岡大学動物実験規程を遵守して実施した。
５週齢の雄性ＳＤラット、各群１６匹を用いた。実験動物は室温２３±２℃、絶対湿度６０±２％および１２時間の明暗サイクル（ＡＭ７：００点灯）の動物舎にて１頭／ケージで飼育し、水は自由摂取とした。γ−ＴＤＭＧは０．５％メチルセルロース水溶液を用いて溶解し、γ−ＴＤＭＧ２５ｍｇ／２ｍｌ溶液となるように調製した。肝障害誘発物質であるＣＣｌ４は、ＣＣｌ４をオリーブオイルに溶解し、ＣＣｌ４０．６ｍｌ／２ｍｌ溶液となるように調製した。
【００４５】
ＣＣｌ４投与に先立つ１６時間前に、前記ラットを絶食状態にした。ＣＣｌ４投与１２時間前に、γ−ＴＤＭＧ溶液２ｍｌ／ｋｇ（γ−ＴＤＭＧ２５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。ＣＣｌ４投与１時間前に摂食を開始した。
コントロール群においては、ＣＣｌ４投与１２時間前に、γ−ＴＤＭＧの代わりに、０．５％メチルセルロース水溶液２ｍｌ／ｋｇを腹腔内投与した。その他の操作は全く同様に行った。
【００４６】
上記の各群ラットに対し、ＣＣｌ４溶液２ｍｌ／ｋｇ（ＣＣｌ４０．６ｍｌ／ｋｇ）を経口投与した。ＣＣｌ４投与後４８時間飼育し、各群ラットを腹部大動脈切除により脱血し、肝臓を採取し、ラット肝臓の肉眼所見、ラット肝組織のヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）及びラット肝組織内過酸化脂質量の測定（ＴＢＡ法）を実施した。併せて、ＣＣｌ４投与０時間後、２４時間後、及び３６時間後に、エーテル麻酔下で外頸静脈より採血（０．３ｍｌ）し、血清中のＡＬＴ値の測定を行った。
【００４７】
＜血清中ＡＬＴ値の測定＞：ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、γ−ＴＤＭＧの効果として、ＡＬＴ値の変動を、富士ドライケムシステムを用いて測定した。有意差検定は分散分析（Ｓｃｈｅｆｆｅ ｔｅｓｔ）で行った。
【００４８】
図１から明らかなように、ＣＣｌ４誘発性肝障害モデルラットに対してγ−ＴＤＭＧ腹腔内投与群では、非投与群と比較して、血清ＡＬＴ値の上昇が有意に抑制された。ＡＬＴは肝細胞が障害を受けると細胞が壊れて血中に漏れ出る酵素であることから、ＣＣｌ４で惹起された肝細胞の変性死に対し、γ−ＴＤＭＧは有効性を示した。
【００４９】
＜肝外観の肉眼的変化＞：ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、ＣＣｌ４投与４８時間後におけるγ−ＴＤＭＧの効果を、ラット肝臓外観の肉眼所見によって判定した。
【００５０】
図２から明らかなように、ＣＣｌ４投与４８時間後における肝の肉眼所見において、γ−ＴＤＭＧ非投与群では肝臓表面が凹凸顆粒状でやや黄白色調に変化していたのに対し、γ−ＴＤＭＧ腹腔内投与群では正常肝に近かった。すなわち、ＣＣｌ４で惹起された肝細胞の障害に対し、γ−ＴＤＭＧは有効性を示した。
【００５１】
＜組織染色＞：ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、ＣＣｌ４投与４８時間後におけるγ−ＴＤＭＧの効果を、ラット肝組織のＨＥ染色による病理学的所見にて判定した。すなわち、採取した肝臓を１０％リン酸緩衝ホルマリン液で固定しパラフィン包埋した。次いで、薄切し、ＨＥ染色を行い光学顕微鏡下で観察した。
【００５２】
図３から明らかなように、ＣＣｌ４投与４８時間後における肝の組織所見（ＨＥ染色）において、γ−ＴＤＭＧ非投与群（Ｂ）では、グリソン鞘および中心静脈周辺にリンパ球の増殖と、中心静脈周囲に広範な出血性細胞壊死が観察された。
一方、γ−ＴＤＭＧ腹腔内投与群（Ｃ）では、 中心静脈周辺にいずれも軽度な炎症細胞の増殖と細胞の壊死がみられた。すなわち、ＣＣｌ４で惹起された肝細胞の障害に対し、γ−ＴＤＭＧは有効性を示した。
【００５３】
＜肝ホモジネート中の過酸化脂質量の測定（ＴＢＡ法）＞：ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、ＣＣｌ４投与４８時間後におけるγ−ＴＤＭＧの効果を、ラット肝ホモジネート中の過酸化脂質（ＭＤＡ）を定量することにより判定した。すなわち、
（１）肝臓切片の湿重量を測定し、ガラス瓶に移し肝臓切片に９倍量（１ｇにつき９ｍｌ）の１．１５％ＫＣｌを加える。
（２）ホモジナイザーで肝臓組織のホモジネートを得る。
（３）ホモジネート０．２ｍｌを試験管に入れる。
（４）０．２ｍｌの８．１％ＳＤＳを試験管に加える。
（５）１．５ｍｌの２０％の酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）を試験管に加える。
（６）１．５ｍｌの０．８％ＴＢＡ試薬を試験管に加える。
（７）９５℃の温浴で６０分間加熱する。
（８）加熱後、氷冷水浴槽に試験管を入れ速やかに室温まで冷却する。
（９）１ｍｌの蒸留水を試験管に加える。
（１０）５ｍｌのｎ−ブタノールピリジン溶液（１５：１、ｖ/ｖ）を試験管に加えてよく振り混ぜ抽出する。
（１１）遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）後ブタノール槽（上層）を取る。
（１２）５３５ｎｍの吸光度を測定する。
【００５４】
図４から明らかなように、ＣＣｌ４投与４８時間後における肝ホモジネート中の過酸化脂質量は、γ−ＴＤＭＧ腹腔内投与群とγ−ＴＤＭＧ非投与群との比較において有意差が認められなかった。
【実施例２】
【００５５】
＜ＣＣｌ４誘発性肝障害モデル動物を用いたγ−ＴＤＭＧの経口投与による有用性の検討＞
５週齢の雄性ＳＤラットを、コントロール群４匹、γ−ＴＤＭＧ投与群各１０匹を用いて実施した。実験動物は室温２３±２℃、絶対湿度６０±２％および１２時間の明暗サイクル（ＡＭ７：００点灯）の動物舎にて１頭／ケージで飼育し、水は自由摂取とした。γ−ＴＤＭＧは０．５％メチルセルロース水溶液を用いて溶解し、γ−ＴＤＭＧ２５ｍｇ／２ｍｌ溶液、及び、γ−ＴＤＭＧ１００ｍｇ／２ｍｌ溶液を各々調製した。肝障害誘発物質であるＣＣｌ４は、ＣＣｌ４をオリーブオイルに溶解し、ＣＣｌ４０．６ｍｌ／２ｍｌ溶液となるように調製した。
【００５６】
ＣＣｌ４投与に先立つ１６時間前に、前記ラットを絶食状態にした。ＣＣｌ４投与１２時間前に、γ−ＴＤＭＧ溶液２ｍｌ／ｋｇ（γ−ＴＤＭＧ２５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。ＣＣｌ４投与１時間前に摂食を開始した。
コントロール群においては、ＣＣｌ４投与１２時間前に、γ−ＴＤＭＧの代わりに、０．５％メチルセルロース水溶液２ｍｌ／ｋｇを経口投与した。その他の操作は全く同様に行った。
【００５７】
上記の各群ラットに対し、ＣＣｌ４溶液２ｍｌ／ｋｇ（ＣＣｌ４０．６ｍｌ／ｋｇ）を経口投与した。ＣＣｌ４投与０時間後、２４時間後、及び３６時間後に、エーテル麻酔下で外頸静脈より採血（０．３ｍｌ）し、血清中のＡＬＴ値の測定を行った。
【００５８】
＜血清中ＡＬＴ値の測定＞：ＣＣｌ４誘発性肝障害に対する、γ−ＴＤＭＧの効果として、ＡＬＴ値の変動を、富士ドライケムシステムを用いて測定した。有意差検定は分散分析（Ｓｃｈｅｆｆｅ ｔｅｓｔ）で行った。
【００５９】
図５から明らかなように、ＣＣｌ４誘発性肝障害モデルラットに対してγ−ＴＤＭＧ経口投与群では、γ−ＴＤＭＧ２５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇのいずれの投与量においても、非投与群と比較して、血清中のＡＬＴ値の上昇が有意に抑制された。すなわち、ＣＣｌ４で惹起された肝細胞の変性死に対し、γ−ＴＤＭＧは経口投与でも有効性を示した。
【００６０】
以上、γ−ＴＤＭＧの腹腔内投与（１２時間前）により、ＣＣｌ４誘発性肝障害モデルラットの血清ＡＬＴ値の上昇を有意に抑制することができた。すなわち、ＣＣｌ４で惹起される肝細胞の変性死に対し、γ−ＴＤＭＧは有効性を示した。更に、採取した肝組織中の過酸化脂質量においては、非投与群と比較して有意な差が認められなかったにも拘らず、肉眼所見および組織所見においては肝障害改善傾向が認められた。γ−ＴＤＭＧの経口投与（１２時間前）においても同様に、血清ＡＬＴ値の上昇を有意に抑制することが認められた。これらの実験事実により、γ−ＴＤＭＧの肝障害抑制効果が実証された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）で表される化合物及び／又はその塩を含有する肝障害の処置剤。
【化１】
（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルキル基を表し、Ｒ２は低級アルキル基を表し、Ｒ３は水素原子又は低級アルキル基を表し、Ｒ４、Ｒ５は同一又は異なって水素原子又はメチル基を表し、ｍは０または１である。）
【請求項２】
請求項１に記載の肝障害の処置剤で、肝障害の予防目的で使用することを特徴とする肝障害の処置剤。
【請求項３】
請求項１に記載の肝障害の処置剤で、肝障害の治療目的で使用することを特徴とする肝障害の処置剤。
【請求項４】
請求項１〜３に記載の肝障害の処置剤で、肝細胞の変性壊死に対して有効であることを特徴とする肝障害の処置剤。
【請求項５】
請求項１〜４に記載の肝障害の処置剤で、ｍが０であることを特徴とする肝障害の処置剤。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の肝障害の処置剤で、Ｒ１、Ｒ２が共にメチル基であることを特徴とする肝障害の処置剤。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の肝障害の処置剤で、Ｒ３が水素原子であることを特徴とする肝障害の処置剤。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の肝障害の処置剤で、Ｒ４がメチル基、Ｒ５が水素原子であることを特徴とする肝障害の処置剤。
【請求項１】
一般式（Ｉ）で表される化合物及び／又はその塩を含有する肝障害の処置剤。
【化１】
（式中、Ｒ１は水素原子又は低級アルキル基を表し、Ｒ２は低級アルキル基を表し、Ｒ３は水素原子又は低級アルキル基を表し、Ｒ４、Ｒ５は同一又は異なって水素原子又はメチル基を表し、ｍは０または１である。）
【請求項２】
請求項１に記載の肝障害の処置剤で、肝障害の予防目的で使用することを特徴とする肝障害の処置剤。
【請求項３】
請求項１に記載の肝障害の処置剤で、肝障害の治療目的で使用することを特徴とする肝障害の処置剤。
【請求項４】
請求項１〜３に記載の肝障害の処置剤で、肝細胞の変性壊死に対して有効であることを特徴とする肝障害の処置剤。
【請求項５】
請求項１〜４に記載の肝障害の処置剤で、ｍが０であることを特徴とする肝障害の処置剤。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の肝障害の処置剤で、Ｒ１、Ｒ２が共にメチル基であることを特徴とする肝障害の処置剤。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の肝障害の処置剤で、Ｒ３が水素原子であることを特徴とする肝障害の処置剤。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の肝障害の処置剤で、Ｒ４がメチル基、Ｒ５が水素原子であることを特徴とする肝障害の処置剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−７２０７４（Ｐ２０１２−７２０７４Ａ）
【公開日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２１６７３６（Ｐ２０１０−２１６７３６）
【出願日】平成２２年９月２８日（２０１０．９．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第３項適用申請有り 日本薬学会 第１３０年会（岡山）、社団法人 日本薬学会、平成２２年３月２８日
【出願人】（５９８０１５０８４）学校法人福岡大学 (114)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２８日（２０１０．９．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第３項適用申請有り 日本薬学会 第１３０年会（岡山）、社団法人 日本薬学会、平成２２年３月２８日
【出願人】（５９８０１５０８４）学校法人福岡大学 (114)
【Ｆターム（参考）】
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