肺炎連鎖球菌のタンパク質及び核酸分子
【課題】肺炎連鎖球菌由来の新規なタンパク質抗原、それらをコードする核酸配列、ワクチン及びスクリーニング法の提供。
【解決手段】特定の配列を有する肺炎連鎖球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ）に由来するタンパク質、該タンパク質をコードする核酸分子、該核酸分子及び／又はタンパク質の抗原及び／又は免疫原としての使用及び検出／診断における使用、並びに潜在的な抗微生物標的としての該タンパク質／核酸配列をスクリーニングする。
【解決手段】特定の配列を有する肺炎連鎖球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ）に由来するタンパク質、該タンパク質をコードする核酸分子、該核酸分子及び／又はタンパク質の抗原及び／又は免疫原としての使用及び検出／診断における使用、並びに潜在的な抗微生物標的としての該タンパク質／核酸配列をスクリーニングする。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
［発明の詳細な説明］
本発明は肺炎連鎖球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ）に由来するタンパク質、該タンパク質をコードする核酸分子、該核酸分子及び／又はタンパク質の抗原及び／又は免疫原としての使用及び検出／診断における使用、並びに潜在的な抗微生物標的としての該タンパク質／核酸配列をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
一般に肺炎球菌と呼ばれる肺炎連鎖球菌は重要な病原性生物である。発展途上国及び先進国におけるヒトの疾患に関する肺炎連鎖球菌の感染の更なる重要性は権威ある概説にまとめられている（ファイバー，ジー．アール．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：１３８５−１３８７（１９９４）、非特許文献１）。これは、世界的な規模で、この生物が急性の呼吸系感染の最も一般的な原因細菌であると考えられており、且つ主に発展途上国で毎年百万人の子供が死に至ると見積られていることを示している（スタンスフィールド，エス．ケイ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，６：６２２（１９８７）、非特許文献２）。アメリカ合衆国では、肺炎球菌が現在でも細菌性肺炎の最も一般的な原因であり、且つ罹患率が幼児、年配者、並びに無脾症、心臓、肺及び腎臓の疾患、糖尿病、アルコール中毒などに罹りやすい状態の患者又は免疫抑制障害、特にＡＩＤＳの患者にとりわけ高いことが示唆されてきた（ブライマンら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１５０：１４０１（１９９０）、非特許文献３）。これらの群は、肺炎球菌敗血症、従って髄膜炎の危険性がより高く、従って、肺炎球菌の感染により死亡する危険性がより大きい。肺炎球菌は中耳炎及び副鼻腔炎の主要原因でもある。これは、先進国の子供に流行る感染であり且つ相当な費用を費やしている。
【０００３】
最近のペニシリン耐性肺炎球菌の出現により、肺炎球菌の感染に対する有効な予防戦略の必要性が強調されている。１２の州における１３の米国の病院において肺炎球菌の単離体の６．６％がペニシリンに対して耐性であることが見出され、且つ単離体の中には第三世代（？）のシクロスポリンを含む他の抗生物質にも耐性があったと報告されている（シャペルト，エス．エム．、Ｖｉｔａｌ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｅｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、２１４：１（１９９２）、非特許文献４）。幾つかの病院ではペニシリン耐性の割合がより高い（２０％まで）ことがある（ブライマンら、Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．、２７１：１８３１（１９９４）、非特許文献５）。肺炎球菌のペニシリン耐性は、ペニシリンが有効な治療であった数十年の後、最近且つ突然に発達しているため、これらの発見は警鐘と考えられる。
【０００４】
上記の理由から、肺炎球菌の疾患を予防、制御、診断又は治療する手段の改良を検討する抗し難い理由がある。
【０００５】
肺炎球菌の感染を予防するためのワクチンを提供するために種々のアプローチが採られてきた。困難は、例えば、該生物を取り囲む多糖類莢膜の構造に基づく血清型の種類（少なくとも９０）から生じる。個々の血清型に対するワクチンは他の血清型に対して有効でなく、これは大部分の症例に有効であるためにワクチンが全範囲の血清型から得られる多糖類抗原を含まなければならないことを意味する。精製されワクチンとして使用される場合、莢膜多糖類（その各々が血清型を決定し主要な防御抗原である）は、侵襲性の肺炎球菌の感染及び髄膜炎の最も高い発生を被る年齢群である二歳以下の子供に防御抗体応答を確実に誘発するものではないことが見出されたため、更なる問題が生じている。
【０００６】
莢膜抗原を用いるアプローチの変形は、特に、免疫応答にＴ細胞依存性の特性を付与することにより強化された該応答を誘導するために、該多糖類をタンパク質に結合させることによる。このアプローチはヘモフィラス・インフルエンザエに対するワクチンの開発に用いられてきた。多重多糖類ワクチンに関する費用及び結合体に基づく費用の両方に問題がある。
【非特許文献１】ファイバー，ジー．アール．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：１３８５−１３８７（１９９４）
【非特許文献２】スタンスフィールド，エス．ケイ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，６：６２２（１９８７）
【非特許文献３】ブライマンら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１５０：１４０１（１９９０）
【非特許文献４】シャペルト，エス．エム．、Ｖｉｔａｌ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｅｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、２１４：１（１９９２）
【非特許文献５】ブライマンら、Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．、２７１：１８３１（１９９４）
【発明の開示】
【０００７】
第三のアプローチは、ワクチンの候補となるための潜在能力を付与する他の抗原性の構成要素を探すことである。本出願において、本発明者らは分泌／放出された（exported) タンパク質であるタンパク質抗原の群を提供する。
【０００８】
従って、第一の側面において、本発明は、本明細書の表２に示される配列群から選択される１配列を有する肺炎連鎖球菌のタンパク質又はポリペプチドを提供する。
【０００９】
本発明のタンパク質又はポリペプチドは実質的に純粋な形で提供されうる。例えば、他のタンパク質を実質的に含まない形で提供されうる。
【００１０】
好ましい実施態様においては、表３に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はポリペプチドが提供される。
【００１１】
本発明は、本明細書の表１に示される核酸配列によりコードされる任意のタンパク質を包含する。
【００１２】
本明細書で論議されるように、本発明のタンパク質及びポリペプチドは抗原性物質として有用である。このような物質は「抗原性」及び／又は「免疫原性」であり得る。一般的に、「抗原性」は、該タンパク質又はポリペプチドが抗体を生産するために用いることができること又は実際に患者に抗体応答を誘導できることを意味すると解される。「免疫原性」は、該タンパク質又はポリペプチドが被験者に防御免疫応答を誘発できることを意味すると解される。従って、後者の場合、該タンパク質又はポリペプチドは、抗体応答だけでなく更に抗体に基づかない免疫応答を引き起こすことができうる。
【００１３】
熟練者は、本発明のタンパク質又はポリペプチドの同族体又は誘導体も本発明の文脈における使用、即ち抗原性／免疫原性の物質としての使用を見出しうることを理解するであろう。従って、例えば、一つ以上の付加、欠失、置換等を含むタンパク質又はポリペプチドが本発明に包含される。さらに、一アミノ酸を他の同類の「型」で置換できうる。例えば、一つの疎水性アミノ酸を他のもので置換する。アミノ酸配列を比較するためにＣＬＵＳＴＡＬプログラムなどのプログラムを使用できる。このプログラムは、アミノ酸配列を比較し、どちらかの配列に適切にスペースを挿入することにより最適な整列を見出す。最適な整列についてのアミノ酸の同一性又は類似性（アミノ酸型の同一性プラス保存性）を計算できる。ＢＬＡＳＴｘなどのプログラムは最長の類似配列を整列させ、その適合性に数値を割り当てる。従って、各々が異なる点数を有する幾つかの類似領域が見出される場合には、比較を得ることができる。本発明において、両タイプの分析が意図される。
【００１４】
同族体及び誘導体の場合、本明細書に記載されるタンパク質又はポリペプチドとの同一性の程度は、この同族体又は誘導体が肺炎連鎖球菌に対する抗原性又は免疫原性を保持することほどには重要でない。しかしながら、本明細書に記載されるタンパク質又はポリペプチドと少なくとも６０％の（上述の）類似性を有する同族体又は誘導体が提供されることが相応しい。好ましくは少なくとも７０％の類似性、より好ましくは少なくとも８０％の類似性を有する同族体又は誘導体が提供される。少なくとも９０％又は更に９５％の類似性を有する同族体又は誘導体が提供されることが最も好ましい。
【００１５】
代わりのアプローチにおいては、該同族体又は誘導体は、例えば所望のタンパク質又はポリペプチドを効果的にタグ化することにより精製を容易にする部分を組み入れた融合タンパク質でありうる。「タグ」を除去することが必要であっても良く、又はこの融合タンパク質自体が有用である程に十分な抗原性を保持する場合もあろう。
【００１６】
本発明のさらなる側面において、本発明のタンパク質若しくはポリペプチド又はそれらの同族体若しくは誘導体の抗原性断片が提供される。
【００１７】
本明細書に記載されるタンパク質若しくはポリペプチド又はそれらの同族体若しくは誘導体の断片について、状況は若干異なる。エピトープ領域、即ちタンパク質又はポリペプチドの抗原性又は免疫原性の原因となる領域を同定するために該抗原性のタンパク質又はポリペプチドをスクリーニングできることは周知である。このようなスクリーニングの実施方法は当分野では周知である。従って、本発明の断片は、これらの抗原性／免疫原性の性質を保持するために、一つ以上の該エピトープ領域を含むか又は該領域に十分に類似しているべきである。従って、本発明の断片についての同一性の程度はおそらく見当違いであり、なぜなら本明細書に記載されるタンパク質若しくはポリペプチド、同族体又は誘導体の特定部分に１００％同一でありうるためである。再度であるが、重要な点は該断片が抗原性／免疫原性の性質を保持することである。
【００１８】
従って、同族体、誘導体及び断片について重要なことは、これらが由来するタンパク質又はポリペプチドの抗原性／免疫原性の少なくともある程度を保有することである。
【００１９】
実質的に純粋な形態で本発明のタンパク質を提供するために遺伝子クローニング手法が用いられてもよい。これらの手法は、例えば、ジェイ．サムブルックら、分子クローニング、第二版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１９８９）に開示されている。従って、第四の側面において、本発明は、下記の１配列を含む又は下記の１配列からなる核酸分子を提供する。
(i) 表１に示されるＤＮＡ配列群又はそれらのＲＮＡ等価物のいずれか、
(ii) (i) の配列いずれかに相補的な配列、
(iii) (i) 又は(ii)の配列と同じタンパク質又はポリペプチドをコードする配列、
(iv) (i) 、(ii)及び(iii) の配列群のいずれかと実質的な同一性を有する配列、
(v) 表１で定義されるタンパク質の同族体、誘導体又は断片をコードする配列。
【００２０】
第五の側面において、本発明は、下記の１配列を含む又は下記の１配列からなる核酸分子を提供する。
(i) 表４に示されるＤＮＡ配列群又はそれらのＲＮＡ等価物のいずれか、
(ii) (i) の配列いずれかに相補的な配列、
(iii) (i) 又は(ii)の配列と同じタンパク質又はポリペプチドをコードする配列、
(iv) (i) 、(ii)及び(iii) の配列群のいずれかと実質的な同一性を有する配列、
(v) 表４で定義されるタンパク質の同族体、誘導体又は断片をコードする配列。
【００２１】
本発明の核酸分子は複数の該配列及び／又は断片を含んでもよい。熟練者は、本発明が本明細書で例示される特定の新規な核酸分子の新たな変異型を含み得ることを理解するであろう。このような変異型は本発明に包含される。これらは例えば株の変異により自然界で生じうる。例えば、付加、置換及び／又は欠失が含まれる。さらに、とりわけ微生物の発現系を利用する場合、発現に用いられる特定の生物において既知の好ましいコドン用語を活用することにより該核酸配列の設計を企ててもよい。従って、合成又は非天然産の変異型も本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
上記で用いられた際の「ＲＮＡ等価物」という用語は、所与のＲＮＡ分子が（ＲＮＡの「Ｕ」が遺伝コードでは「Ｔ」に置き換わるという事実を考慮して）所与のＤＮＡ分子の配列に相補的な配列を有することを示している。
【００２３】
相同性又は同一性の程度を決定するために核酸配列を比較する際に、ＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰ（双方ともウィスコンシン・ジェネティックス・コンピューター・グループ（ＧＣＧ）ソフトウェア・パッケージから得られる）等のプログラムを使用できる。ＢＥＳＴＦＩＴは、例えば二つの配列を比較し最も類似したセグメントの最適な整列を作成する。ＧＡＰは配列をその全長に沿って整列させることができ、どちらかの配列に適切にスペースを挿入することにより最適な整列を見出す。核酸配列の同一性を論じる際には本発明の文脈において、該比較は配列の全長に沿ったそれらの整列によりなされることが好ましい。
【００２４】
実質的な同一性を有する配列は、該配列と好ましくは少なくとも５０％の配列同一性、望ましくは少なくとも７５％の配列同一性、並びにより望ましくは少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列同一性を有する。この配列同一性が９９％以上でありうる場合もある。
【００２５】
用語「実質的な同一性」とは、該配列が先行技術の核酸配列とよりも本明細書に記載される任意の配列とより高い程度の同一性を有することを示すことが望ましい。
【００２６】
しかし、本発明の核酸配列が新規な遺伝子産物の少なくとも一部をコードする場合、本発明はその範囲内において該遺伝子産物又はその新規な部分をコードするあらゆる可能な配列を含むことに注意すべきである。
【００２７】
この核酸分子は単離型又は組換え型であってもよい。ベクターに組込まれてもよく、ベクターは宿主に組込まれてもよい。このようなベクター及び適切な宿主は本発明のさらなる側面を形成する。
【００２８】
従って、例えば本明細書に記載される該核酸配列に基づくプローブを用いることにより、肺炎連鎖球菌の遺伝子が同定できる。次いで、該遺伝子は制限酵素を用いて切出しベクターにクローニングできる。該ベクターは発現用の適切な宿主に導入できる。
【００２９】
本発明の核酸分子は、該核酸分子の配列の一部に相補的な適切なプローブを用いることにより肺炎連鎖球菌から得られうる。プローブ用に相応しい長さの断片を得るために制限酵素又は超音波処理の手法が使用できる。
【００３０】
代わりに、ＰＣＲ法が所望の核酸配列を増幅するために用いられてもよい。従って、本明細書に記載される配列データはＰＣＲで用いる二つのプライマーを設計するために用いることができるため、遺伝子全体又はその断片を含む所望の配列が標的化でき、次いで高度に増幅できる。一方のプライマーは通常一つのＤＮＡ分子鎖上に位置する第一配列に対して高度の特異性を示し、他方のプライマーは通常該ＤＮＡ配列の相補鎖に位置する第二配列に対して高度の特異性を示し該第一配列の相補的配列から一定の間隔が置かれている。
【００３１】
典型的には、プライマーは少なくとも１５〜２５ヌクレオチドの長さであろう。
【００３２】
更なる代替手段として、化学合成が用いられてもよい。これは自動化されていてもよい。比較的短い配列は化学合成し互いに連結しより長い配列を提供してもよい。
【００３３】
さらなる側面において、本発明は表２〜４に示される配列、又はそれらの同族体若しくは誘導体、及び／又はこれらの任意の断片から選択されるタンパク質又はポリペプチドの一つ以上を含む免疫原性／抗原性の組成物を提供する。好ましい実施態様において、この免疫原性／抗原性の組成物はワクチンであり又は診断検定に用いられる。
【００３４】
ワクチンの場合、適切な補足の賦形剤、希釈剤、アジュバント等が含まれてもよい。これらの多数の例が当分野ではよく知られている。
【００３５】
いわゆるＤＮＡワクチンの調製において表１に示される核酸配列を利用することもできる。従って、本発明は本明細書で定義される一つ以上の核酸配列を含むワクチン組成物も提供する。このようなＤＮＡワクチンの使用は当分野に記されている。例えば、ドネリーら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５：６１７−６４８（１９９７）を参照。
【００３６】
本明細書で既に論議したように、本明細書に記載されるタンパク質又はポリペプチド、それらの同族体又は誘導体、及び／又はこれらの任意の断片は肺炎連鎖球菌の検出方法／診断方法に用いることができる。このような方法は、被験者に存在しうる該タンパク質に対する抗体の検出に基づく。従って、本発明は、本明細書に記載されるタンパク質、又はその同族体、誘導体若しくは断片の少なくとも一つと検査試料を接触させる工程を含む肺炎連鎖球菌の検出方法／診断方法を提供する。該試料は、検査される被験者から得られる組織試料又は血液若しくは唾液の試料などの生物試料が適切である。
【００３７】
代わりのアプローチにおいては、本明細書に記載されるタンパク質、それらの同族体、誘導体、及び／又は断片は抗体を生産するために用いることができ、次いで該抗体は該抗原、従って肺炎連鎖球菌を検出するために使用できる。このような抗体は本発明の他の側面を形成する。本発明の範囲内の抗体はモノクローナル又はポリクローナルでありうる。
【００３８】
ポリクローナル抗体は、本明細書に記載されるタンパク質、又はその同族体、誘導体若しくは断片が適切な動物宿主（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ又はサル）に注射されると、該動物中で該抗体の生産を刺激することにより生じ得る。必要なときは、アジュバントが該タンパク質とともに投与されても良い。周知のアジュバントはフロイントのアジュバント（完全及び不完全）及び水酸化アルミニウムを含む。次いで、該抗体は本明細書に記載されるタンパク質に結合することで精製できる。
【００３９】
モノクローナル抗体はハイブリドーマから生産され得る。これらは、不死細胞系を形成させるために骨髄腫細胞と所望の抗体を生産する脾臓細胞を融合することにより形成できる。従って、周知のコーラー＆ミルスタイン手法（Ｎａｔｕｒｅ、２５６（１９７５））又はこの手法に基づく一連の変法が使用できる。
【００４０】
特定のポリペプチド及び／又はタンパク質に結合するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の生産法は当分野でよく開発されている。これらは、例えばロイットら、免疫学第二版（１９８９）、チャーチル リビングストーン、ロンドンなどの標準的な免疫学の教科書で論じられている。
【００４１】
完全な抗体に加えて、本発明は本明細書に記載されるタンパク質等に結合できるそれらの誘導体を含む。従って、本発明は抗体断片及び合成構築物を含む。抗体断片及び合成構築物の例は、ドガールら、Ｔｉｂｔｅｃｈ、１２、３７２−３７９（１９９４年９月）に記載されている。
【００４２】
抗体断片には、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2及びＦｖ断片が含まれる。Ｆａｂ断片（これらはロイットら（前出）で論じられている）。Ｆｖ断片は単鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）分子として知られる合成構築物を生産するために改変できる。これは該分子の安定性に寄与するＶh領域とＶl領域よ共有結合するペプチドリンカーを含む。使用できる他の合成構築物にはＣＤＲペプチドが含まれる。これらは抗原結合決定基を含む合成ペプチドである。ペプチド擬似体も使用されうる。通常、これらの分子はＣＤＲループの構造を模倣し且つ抗原と相互作用する側鎖を含むコンフォメーションが限定された有機環である。
【００４３】
合成構築物はキメラ分子を含む。従って、例えばヒト化（霊長類化）抗体又はその誘導体は本発明の範囲内にある。ヒト化抗体の例はヒトのフレームワーク領域を有するが、げっ歯類の超可変領域を有する抗体である。キメラ抗体の生産方法は、例えばモリソンら、ＰＮＡＳ、８１、６８５１−６８５５（１９８４）及びタケダら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４、４５２−４５４（１９８５）により論じられている。
【００４４】
合成構築物には、抗原結合に加えて幾つかの望ましい性質をもつ分子を提供する付加的部分を含む分子も含まれる。例えば、該部分は標識（例えば蛍光標識又は放射性標識）であってもよい。または薬学的に活性な薬剤であってもよい。
【００４５】
抗体又はその誘導体は肺炎連鎖球菌の検出／診断で使用される。従って、他の側面において、本発明は、本明細書に記載される一つ以上のタンパク質、又はその同族体、誘導体及び／又は断片に結合できる抗体と検査試料を接触させる工程を含む肺炎連鎖球菌の検出方法／診断方法を提供する。
【００４６】
さらに、いわゆる「アフィボディ（Affibodies）」が利用されうる。これらは細菌のアルファ−らせんの受容体ドメイン（ノードら）のコンビナトリアルライブラリーから選択される結合タンパク質である。従って、異なる標的タンパク質に特異的に結合できる小タンパク質ドメインがコンビナトリアルアプローチを用いて選択できる。
【００４７】
本明細書に記載される核酸配列が肺炎連鎖球菌を検出及び／又は診断するために使用されうることも明白である。従って、さらなる側面において、本発明は本明細書に記載される少なくとも一つの核酸配列と検査試料を接触させる工程を含む肺炎連鎖球菌の検出方法／診断方法を提供する。この試料は、検査される被験者から得られる組織試料又は血液若しくは唾液の試料などの生物試料が適切である。このような試料は本発明の方法に使用する前に前処理してもよい。従って、例えば試料はＤＮＡを抽出するため処理してもよい。次いで、本明細書に記載される核酸配列に基づくＤＮＡプローブ（即ち、通常該配列の断片）は肺炎連鎖球菌の核酸を検出するために用いてもよい。
【００４８】
更なる側面において、本発明は、
（ａ）本発明のタンパク質若しくはポリペプチド、又はその誘導体、同族体若しくは断片、又は本発明の免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む被験者に肺炎連鎖球菌に対するワクチンを注射する方法、
（ｂ）本明細書で定義される核酸分子を被験者に投与する工程を含む被験者に肺炎連鎖球菌に対するワクチンを注射する方法、
（ｃ）本発明のタンパク質若しくはポリペプチド、又はその誘導体、同族体若しくは断片、又は本発明の免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む肺炎連鎖球菌の感染の予防方法又は治療方法、
（ｄ）本明細書で定義される核酸分子を被験者に投与する工程を含む肺炎連鎖球菌の感染の予防方法又は治療方法、
（ｅ）本発明の一つ以上タンパク質若しくはポリペプチド、又はその同族体、誘導体若しくは断片、又は本発明の免疫原性組成物を含む肺炎連鎖球菌の感染を検出／診断する際に使用するキット、並びに
（ｆ）本明細書で定義される一つ以上の核酸分子を含む肺炎連鎖球菌の感染を検出／診断する際に使用するキット、
を提供する。
【００４９】
本発明者らが重要なタンパク質の群を同定したということであれば、このようなタンパク質は抗微生物治療の潜在的な標的である。しかしながら、個々の各タンパク質が該生物の生存能力に必須であるか否かを決定することが必要である。従って、本発明は、本明細書に記載されるタンパク質又はポリペプチドが潜在的な抗微生物標的に相当するか否かを決定する方法であって、該タンパク質を不活性化する工程及び肺炎連鎖球菌がインビトロ又はインビボでまだ生存しているか否かを決定する工程を含む方法も提供する。
【００５０】
該タンパク質を不活性化する適切な方法は選択された遺伝子のノックアウトを成し遂げることであり、即ち該タンパク質の発現を妨げ、これが致死的な変化をもたらすか否かを決定することである。このような遺伝子ノックアウトの適当な実施方法は、リーら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．、９４：１３２５１−１３２５６（１９９７）に記載されている。
【００５１】
最後の側面において、本発明は、肺炎連鎖球菌の感染の治療又は予防に使用される医薬の製造における、本発明のタンパク質又はポリペプチドの機能又は発現と拮抗し、これを阻害又は他の方法で妨害できる作用物質の使用を提供する。
【００５２】
本発明は、以下の実施例を参照して以下に記載する。この実施例は本発明を如何なる意味でも限定するものと解釈されるべきでない。
【００５３】
実施例１
４型肺炎連鎖球菌のゲノム配列決定はインスティチュート・フォ・ジェノミック・リサーチ（ＴＩＧＲ、ロックビル、メリーランド州、米国）で進行中である。現在のところ、全配列は完了又は発表されていない。１９９７年１１月２１日に、ＴＩＧＲセンターは終了した配列を正確に反映していないコンティグ（contigs)としての幾つかのＤＮＡ配列を公開した。これらのコンティグはウェブスター（ｗｗｗ＠ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）からダウンロードできる。本発明者らはこれらのコンティグをダウンロードし、ＧＣＧＴｏＢＬＡＳＴ（ウィスコンシンパッケージ９．１版、ジェネティックス・コンピュータ・グループ（ＧＣＧ）、マディソン、米国）アプリケーションを用いてローカルデータベースを作成した。このデータベースは（ピアソンとリップマンの方法（ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８５：２４４４−２４４８（１９８８））を用いる）ＦａｓｔＡ及びＴｆａｓｔＡの手法で検索できる。
【００５４】
ＦａｓｔＡ及びＴｆａｓｔＡの手法を用いて、推定的リーダー配列又はアンカー配列の性質についてこの肺炎球菌のローカルデータベースを検索した。相対的に新規な配列について応答信号を送らせるために関連のある配列を使用した。これらは、
（i) 既に記載されている肺炎連鎖球菌のリーダー配列群（タンパク質ＮａｎＡ、ＮａｎＢ、ＬｙｔＡ、ＰａｐＡ、ｐｃｐＡ、ＰｓａＡ、及びＰｓｐＡに由来する）、
（ii） ラクトコッカス・ラクティスから得られる分泌タンパク質であるＵｓｐ４５のリーダー配列、
（iii) （i)及び（ii）の検索から演繹される新規な仮定的リーダー配列、
（iv） ソルターゼ（Sortase)複合タンパク質に関わる機構により固定される多数のグラム陽性細菌表面タンパク質に共通する性質であるアンカーモチーフＬＰｘＴＧ、である。
【００５５】
このアプローチの例は該データベースから得られる配列（表１参照）に関して以下に示す。
【００５６】
[外１]
【００５７】
この異なる既知の放出タンパク質のタンパク質リーダー配列は、上述した肺炎球菌のローカルデータベースを検索する開始点として用いた。この検索で見出された仮定的タンパク質は次いでＥＭＢＬ、スイスプロット等の一般的なデータベースでＢｌａｓｔ検索にかけた。肺炎球菌で未だ知られていないタンパク質は残し注釈を施す。次に、新規な潜在的タンパク質リーダー配列をプローブとして用いて、ＴｆａｓｔＡ手法により、この検索を再度実施する。
【００５８】
実施例２：ＤＮＡワクチンの試行
ＤＮＡワクチンベクターとしてのｐｃＤＮＡ３．１＋
ｐｃＤＮＡ３．１＋
ＤＮＡワクチンベクターとして使用するために選択したベクターはｐｃＤＮＡ３．１（インビトロゲン社）（実際はｐｃＤＮＡ３．１＋、全場合でこの正方向を用いたが本明細書ではｐｃＤＮＡ３．１と呼ぶ）であった。このベクターは、この文献（ザングら、クラ−ルとスプリッター、アンダーソンら）の病原体から防御するワクチン候補遺伝子を試験するための宿主ベクターとして広く並びに首尾よく使用されてきた。このベクターは哺乳類細胞における高レベルに安定で複製しない一過性の発現用に設計された。ｐｃＤＮＡ３．１は大腸菌で簡便に高いコピー数の複製と増殖ができるＣｏｌＥ１複製起点を含む。次に、これは多数の遺伝子の迅速で効率のよいクローニングと試験ができる。このｐｃＤＮＡ３．１ベクターは、多数のクローニング部位を有し、クローニング選別を手助けするアンピシリン耐性をコードする遺伝子並びに該組換えタンパク質を効率よく高レベルに発現させるヒトのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の直初期プロモーター／エンハンサーも含む。このＣＭＶプロモーターは、筋細胞及び免疫（抗原提示）細胞の両方を含む広範囲の細胞タイプにおける強力なウイルスプロモーターである。インビボで防御応答を生じる際にどの細胞タイプが最も重要であるかに関してまだ分かっていないため、これは最適な免疫応答に重要である。この多クローニング部位の上流にあるＴ７プロモーターは目的の修飾挿入物を効率よく発現させ、インビトロでクローニング遺伝子をセンス方向で転写できる。
【００５９】
ザング, ディー．、ヤング, エックス．、ベリー, ジェイ．、シェン, シー．、マックラルティー，ジー．、及びブランハム, アール．シー．（１９９７）、「主要な外膜タンパク質遺伝子によるＤＮＡワクチン注射はクラミジア・トラコマティス（マウスの肺炎）の感染に対する後天的免疫を誘導する」、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１７６、１０３５−４０。
【００６０】
クラ−ル, イー．とスプリッター, ジー．エイ．（１９９７）、「ブルセラ・アボルタスのリボソームＬ７／Ｌ１２遺伝子の核酸ワクチン接種は免疫応答を誘発する」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１５、１８５１−５７。
【００６１】
アンダーソン, アール．、ガオ, エックス．−エム．、パパコンスタンティノパウロ, エイ．、ロバート, エム．とドーガン, ジー．（１９９６）、「破傷風毒素の断片ＣをコードするＤＮＡによる免疫後のマウスにおける免疫応答」、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６４、３１６８−３１７３。
【００６２】
ＤＮＡワクチンの調製
オリゴヌクレオチドプライマーはＬＥＥＰ系を用いて誘導された目的の各遺伝子について設計した。各遺伝子は徹底的に調べ、可能ならば、プライマーは該遺伝子タンパク質の成熟部分のみコードすると考えられる遺伝子部分を標的とするように設計された。哺乳類細胞で発現させた場合、標的遺伝子タンパク質の成熟部分のみをコードする配列の発現がその正しい折りたたみを容易にすると記載された。例えば、プライマーは、通例、推定的Ｎ末端シグナルペプチド配列がｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターにクローニングされる最終の増幅産物に含まれないよう設計した。このシグナルペプチドはタンパク質放出経路を介して該ポリペプチド前駆体を細胞膜に向かわせる。この経路では該ペプチドは通常シグナルペプチダーゼＩ（又はリポタンパク質の場合シグナルペプチダーゼＩＩ）により切断される。従って、成熟タンパク質が細菌表面上に提示されるか分泌されるかに関わらず、このシグナルペプチドは該成熟タンパク質のどの部分も構成しない。Ｎ末端リーダーペプチド配列は直ちに明白ではなかった場合、プライマーはクローニング用及び最終的にはｐｃＤＮＡ３．１の発現用に該遺伝子配列の全体を標的とするよう設計した。
【００６３】
そうは言うものの、しかしながら、タンパク質の他の補足的な特性も可溶性タンパク質の発現及び提示に影響を及ぼしうる。目的のタンパク質をコードする遺伝子における該特性をコードするＤＮＡ配列はオリゴヌクレオチドの設計中に排除した。これらの特性には以下のものが含まれた。
１ ＬＰＸＴＧ細胞壁固定モチーフ。
２ ＬＸＸＣリポタンパク質付着部位。
３ 疎水性のＣ末端ドメイン。
４ Ｎ末端シグナルペプチド又はＬＸＸＣがなかった場合、開始コドンは排除した。
５ 疎水性のＣ末端ドメイン又はＬＰＸＴＧモチーフがなかった場合、終止コドンは除去した。
【００６４】
目的の各遺伝子について適切なＰＣＲプライマーを設計し、これらのプライマーを設計する際に上記の特性をコードする任意領域及び全領域は該遺伝子から除去した。プライマーは、適切な酵素制限部位及びその後に、保存されたコザックのヌクレオチド配列（（全例で）ＧＣＣＡＣＣを用いた。このコザック配列は、真核性リボソームによるイニシエーター配列の認識を容易にする。）及び目的の遺伝子挿入物の上流にあるＡＴＧ開始コドンを持つものを設計した。例えば、ＢａｍＨＩ部位を用いる前向きプライマーの場合、このプライマーはＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧで始まり目的遺伝子の５’末端の小セクションに続く。この逆向きプライマーは該前方向プライマーと適合するように、そして全例で５’末端にＮｏｔＩ制限部位を備えるように（この部位はＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ）設計した。
【００６５】
ＰＣＲプライマー
以下のＰＣＲプライマーを設計し先端の欠けた目的の遺伝子を増幅するために用いた。
【００６６】
ＩＤ２１０
前向きプライマー
５’ＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＡＡＴＧＡＡＴＣＴＧＣＣＧＡＴＧ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＴＴＴＡＧＡＴＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴＡＡＡＧＡＣＴＴ３’
４１７２．５
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＡＴＴＴＧＧＡＧＧ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＧＴＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＣＴ３’
ＩＤ２１１
前向きプライマー
５’ＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＧＡＴＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＡＣＧＣ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴＧＡＣＴＣＣＴ３’
４１９７．４
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＧＡＣＡＴＡＴＴＧＧＴＧＧＡＡＡＣ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＴＴＧＡＧＣＡＡＡＣＴＧＡＡＴＣＣ３’
４１２２．１
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＧＡＣＧＴＡＧＴＣＴＣＣＧＣＣ３’
４１２６．７
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＴＴＧＧＡＡＣＴＴＴＣＴＡＣＴＡＴＣＡＡＴ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＴＴＣＧＴＣＣＣＴＴＴＴＴＧＧ３’
【００６７】
４１８８．１１
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＡＴＴＣＴＧＧＣＧＧＡＡ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＴＴＴＣＡＴＡＧＣＴＴＴＴＴＴＧＡＴＴＧＴＴ３’
ＩＤ２０９
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＡＴＡＣＧＡＡＡＴＧＣＡＧＧＧ３’
逆向きプライマー５’
ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＡＴＡＡＴＣＴＡＧＴＡＡＡＴＡＡＧＣＧＴＡＧＣＣ３’
ＩＤ２１５
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＡＡＴＴＴＴＣ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＴＣＧＴＴＴＴＴＧＡＡＣＴＡＧＴＴＧＣＴ３’
４１７０．４
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＣＡＴＧ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＣＴＴＧ３’
４１９３．１
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＡＡＣＣＧＣＴＣＴＴＣＴＣＧＴＡＡＣ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＴＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＴＴＴＴＡＧＣ３’
【００６８】
クローニング
上記のフランキング特性をもつ挿入物は、ナショナル コレクション オブ タイプ カルチャーから入手した４型肺炎連鎖球菌株１１８８６の単離されたゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ産物は適切な制限酵素で切断し常套な分子生物学的技法を用いてｐｃＤＮＡ３．１の多クローニング部位にクローニングした。適切に位置付けられた目的遺伝子のクローンを培養し、このプラスミドはプラスミドメガキット（キアーゲン社）を用いて大量に（＞１．５ｍｇ）単離した。遺伝子のクローニング及び維持の成功は、各構築物の各大量調製物の制限地図の作成並びに５’クローニング連結による約７００塩基対の配列決定により確認した。
【００６９】
株の確認
肺炎連鎖球菌ゲノムが配列決定された株である４型株を、クローニング及び攻撃法で使用した。４型肺炎連鎖球菌株ＮＣＴＣ１１８８６の均一な実験株の凍結乾燥されたアンプルを、ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・ストレインズから入手した。このアンプルを開封し、培養菌を０．５ｍＬのトリプティック・ソイ・ブロス（０．５％グルコース、５％血液）に再懸濁した。この懸濁液は１０ｍＬのトリプシンダイズ培地（０．５％グルコース、５％血液）で継代培養し３７℃で一晩静置してインキュベートした。この培養菌は５％血液寒天プレート上に塗布し、汚染を調べ、生存を確認し、血液寒天斜面上へ移した。残りの該培養菌は２０％グリセロールストックを作製するために使用した。この斜面は、４型の血清型を確認するためパブリック・ヘルス・ラボラトリー・サービスに送った。
【００７０】
ＮＣＴＣ１１８８６のグリセロールストックは５％血液寒天プレート上に塗布し、３７℃で一晩ＣＯ２ガス槽中でインキュベートした。新鮮な塗布菌が生成し、オプトヒン感受性を確認した。
【００７１】
肺炎球菌による攻撃
１ｘ肺炎連鎖球菌の培養をマウスで継代培養し感染動物の血液から採取することにより、４型肺炎連鎖球菌の標準接種原を調製し凍結した。該接種原は培地中約１０9ｃｆｕ／ｍＬの所定の生菌数まで凍結前に増殖させた。この調製はフローチャートにより以下に示す。
肺炎球菌の培養を塗布し同一性を確認する
↓
上記プレート上で４〜５コロニーからの一晩培養菌を増殖させる
↓
肺炎球菌培養菌を動物継代培養する
（採取された心臓採血の腹膜腔内注射）
↓
動物継代培養した肺炎球菌から一晩培養を増殖させる
↓
動物継代培養の一晩培養を（所定の光学密度まで）一日増殖させ −７０℃で凍結する−これは標準的な最低値である
↓
標準接種原の１本の部分標本を解凍し生菌数を計数する
↓
標準接種原を用いて有効用量を測定する
（ビルレンス試験と呼ばれる）
↓
その後の全ての攻撃（標準接種原を有効用量まで用いる）
【００７２】
標準接種原の部分標本は、５００倍にＰＢＳで希釈してマウスに接種するために用いた。
【００７３】
マウスはハロタンで軽く麻酔をかけた後、１．４ｘ１０5ｃｆｕの用量の肺炎球菌を各マウスの鼻に適用した。この摂取はマウスの通常の呼吸により促進された。マウスは放置して元に回復させた。
【００７４】
肺炎連鎖球菌のワクチン試行
マウスのワクチン試行は６週齢のＣＢＡ／ｃａマウス（ハーラン、英国）にＤＮＡを投与することにより実施した。ワクチン注射されるマウスは６つの群に分け、各群は目的の特定の標的遺伝子配列を含む組換えｐｃＤＮＡ３．１＋プラスミドＤＮＡを用いて免疫した。ダルベッコのＰＢＳ（シグマ社）中総量１００μｇのＤＮＡを両足の前脛骨筋中に筋内注射した（各足に５０μＬ）。４週間後に同じ手法でブーストを行った。比較のため、対照群を全ワクチン試行に含めた。これらの対照群は、非ワクチン接種動物であるか、上述した同じ時間経過で非組換えｐｃＤＮＡ３．１＋ＤＮＡ（偽ワクチン接種）のみを投与された動物であった。二回目の免疫の３週間後、全てのマウス群は致死量の血清型４肺炎連鎖球菌（ＮＣＴＣ１１８８６株）を鼻腔内に攻撃した。投与された細菌数は、連続希釈の接種原を５％血液寒天プレート上に塗布することにより測定した。鼻腔内免疫の問題は、該接種原が泡立ち鼻孔外にあふれてしまうマウスがいることであり、これは結果表に記録し計算時に考慮した。不明な問題は各マウスが一定量の該接種原を嚥下しうることである。この量は各マウスで同じであり菌接種の間中で平均化されると推定される。しかしながら、使用した試料サイズは小さく、この課題は幾つかの実験で有意な結果を有しうる。攻撃後に生存している全てのマウスは感染の３又は４日後に屠殺した。感染過程の間、攻撃されたマウスは、肺炎連鎖球菌に誘発される疾患の発症に伴う症状の進展について調べられた。典型的な徴候には、適当な順序で、立毛、猫背の増大、眼からの分泌、嗜眠の増加及び動きへの抵抗が含まれる。この後者の症状は通常さらなる苦痛を回避するためにマウスを淘汰する段階である瀕死状態の形成と一致した。これらのマウスは死の瀬戸際にあると考えられ、この淘汰の時間を統計学的分析用に生存期間を測定するために用いた。マウスの死が発見された場合、この生存期間はマウスの存命が観察された最後の時点とされた。
【００７５】
結果の解釈
陽性の結果は、クローニングされ上述の攻撃実験に用いた任意のＤＮＡ配列が該攻撃に対する防御を付与したものと解した。防御は、該ＤＮＡ配列が統計学的に有意な防御（９５％の信頼レベル（ｐ＜０．０５））を付与するもの、マン−ウィットニーを用いてぎりぎり有意であるか若しくは有意に近いもの、又は、一匹以上の範囲外のマウスが存在するとか、例えば最初の死に至る時間が延びたためなどという幾つかの防御特性を示すもの、と解した。これらの結果の中には鼻腔内感染の投与に伴う問題により明瞭性があいまいであると考えられる場合、限界に近い結果又は有意性のない結果を潜在的な陽性とみなすことが許容される。
【００７６】
ワクチン試行２、７及び８の結果（図１参照）
【００７７】
[外２]
【００７８】
＊−投与時に泡立ったため全接種原を受容していないかもしれない。
Ｔ−感染の症状がなく実験の最後で終了させた。
括弧内の数−不完全な投与と考え、生存期間を無視した。
ｐ値１はワクチン接種していない対照と比較した有意検定を指す。
【００７９】
統計学的分析
試行２−ＩＤ２１０でワクチン注射した群もワクチン注射していない対照より平均生存期間が長かったが、本結果は統計学的に有意でない。
試行７−４１７２．５でワクチン注射した群はワクチン注射していない対照より非常に長い生存期間を示したが、差異は統計学的に有意でなかった。
試行８−ＩＤ２１１でワクチン注射した群はワクチン注射していない対照より有意に長く生存した。４１９７．４、４１２２．１及び４１２６．７のワクチン注射した群はワクチン注射していない群より長い平均生存期間を示したが、本結果は統計学的に有意でなかった。４１９７．４及び４１２６．７の群は最初の死に至る時間の延びも示し、４１２２．１群は一つの範囲外の結果を示した。
【００８０】
肺炎球菌の攻撃とＤＮＡワクチン試行９〜１１の結果（図２参照）
【００８１】
[外３]
【００８２】
＊−投与時に泡立ったため全接種原を受容していないかもしれない。
Ｔ−感染の症状がなく実験の最後に終了させた。
括弧内の数−不完全な投与と考え、生存期間を無視した。
ｐ値１はワクチン注射していない対照と比較した有意検定を指す。
ｐ値２はｐｃＤＮＡ３．１＋でワクチン注射した対照と比較した有意検定を指す。
【００８３】
統計学的分析
試行９−統計学的に有意でないが、４１８８．１１とＩＤ２０９でワクチン注射した群はワクチン注射していない対照より平均生存期間が顕著に長かった。
試行１０−ワクチン注射していない対照群はｐｃＤＮＡ３．１＋でワクチン注射した群より有意に長い期間生存した。ＩＤ２１５と４１７０．４でワクチン注射した群は偽ワクチン注射群と比較して統計学的に有意に長い生存期間を示した（ｐ＝０．０１６８と０．０３１６）が、ワクチン注射していない群と比較した場合はそうではなかった。
試験１１−４１９３．１でワクチン注射した群は最も有望であり、ｐｃＤＮＡ３．１＋でワクチン注射した群より平均６．５時間長く、ワクチン注射していない群より６時間長く生存したが、本結果は統計学的に有意でなかった。
【００８４】
[外４]
【００８５】
[外５]
【００８６】
[外６]
【００８７】
[外７]
【００８８】
[外８]
【００８９】
[外９]
【００９０】
[外１０]
【００９１】
[外１１]
【００９２】
[外１２]
【００９３】
[外１３]
【００９４】
[外１４]
【００９５】
[外１５]
【００９６】
[外１６]
【００９７】
[外１７]
【００９８】
[外１８]
【００９９】
[外１９]
【０１００】
[外２０]
【０１０１】
[外２１]
【０１０２】
[外２２]
【０１０３】
[外２３]
【０１０４】
[外２４]
【０１０５】
[外２５]
【０１０６】
[外２６]
【０１０７】
[外２７]
【０１０８】
[外２８]
【０１０９】
[外２９]
【０１１０】
[外３０]
【０１１１】
[外３１]
【０１１２】
[外３２]
【０１１３】
[外３３]
【０１１４】
[外３４]
【０１１５】
[外３５]
【０１１６】
[外３６]
【０１１７】
[外３７]
【０１１８】
[外３８]
【０１１９】
[外３９]
【０１２０】
[外４０]
【０１２１】
[外４１]
【０１２２】
[外４２]
【０１２３】
[外４３]
【０１２４】
[外４４]
【０１２５】
[外４５]
【０１２６】
[外４６]
【０１２７】
[外４７]
【０１２８】
[外４８]
【０１２９】
[外４９]
【０１３０】
[外５０]
【０１３１】
[外５１]
【０１３２】
[外５２]
【０１３３】
[外５３]
【０１３４】
[外５４]
【０１３５】
[外５５]
【０１３６】
[外５６]
【０１３７】
[外５７]
【０１３８】
[外５８]
【０１３９】
[外５９]
【０１４０】
[外６０]
【０１４１】
[外６１]
【０１４２】
[外６２]
【０１４３】
[外６３]
【０１４４】
[外６４]
【０１４５】
[外６５]
【０１４６】
[外６６]
【０１４７】
[外６７]
【０１４８】
[外６８]
【０１４９】
[外６９]
【０１５０】
[外７０]
【０１５１】
[外７１]
【０１５２】
[外７２]
【０１５３】
[外７３]
【０１５４】
[外７４]
【０１５５】
[外７５]
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は種々のＤＮＡワクチン試験の結果を示す。
【図２】図２はさらなるＤＮＡワクチン試験の結果を示す。
【背景技術】
【０００１】
［発明の詳細な説明］
本発明は肺炎連鎖球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ）に由来するタンパク質、該タンパク質をコードする核酸分子、該核酸分子及び／又はタンパク質の抗原及び／又は免疫原としての使用及び検出／診断における使用、並びに潜在的な抗微生物標的としての該タンパク質／核酸配列をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
一般に肺炎球菌と呼ばれる肺炎連鎖球菌は重要な病原性生物である。発展途上国及び先進国におけるヒトの疾患に関する肺炎連鎖球菌の感染の更なる重要性は権威ある概説にまとめられている（ファイバー，ジー．アール．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：１３８５−１３８７（１９９４）、非特許文献１）。これは、世界的な規模で、この生物が急性の呼吸系感染の最も一般的な原因細菌であると考えられており、且つ主に発展途上国で毎年百万人の子供が死に至ると見積られていることを示している（スタンスフィールド，エス．ケイ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，６：６２２（１９８７）、非特許文献２）。アメリカ合衆国では、肺炎球菌が現在でも細菌性肺炎の最も一般的な原因であり、且つ罹患率が幼児、年配者、並びに無脾症、心臓、肺及び腎臓の疾患、糖尿病、アルコール中毒などに罹りやすい状態の患者又は免疫抑制障害、特にＡＩＤＳの患者にとりわけ高いことが示唆されてきた（ブライマンら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１５０：１４０１（１９９０）、非特許文献３）。これらの群は、肺炎球菌敗血症、従って髄膜炎の危険性がより高く、従って、肺炎球菌の感染により死亡する危険性がより大きい。肺炎球菌は中耳炎及び副鼻腔炎の主要原因でもある。これは、先進国の子供に流行る感染であり且つ相当な費用を費やしている。
【０００３】
最近のペニシリン耐性肺炎球菌の出現により、肺炎球菌の感染に対する有効な予防戦略の必要性が強調されている。１２の州における１３の米国の病院において肺炎球菌の単離体の６．６％がペニシリンに対して耐性であることが見出され、且つ単離体の中には第三世代（？）のシクロスポリンを含む他の抗生物質にも耐性があったと報告されている（シャペルト，エス．エム．、Ｖｉｔａｌ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｅｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、２１４：１（１９９２）、非特許文献４）。幾つかの病院ではペニシリン耐性の割合がより高い（２０％まで）ことがある（ブライマンら、Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．、２７１：１８３１（１９９４）、非特許文献５）。肺炎球菌のペニシリン耐性は、ペニシリンが有効な治療であった数十年の後、最近且つ突然に発達しているため、これらの発見は警鐘と考えられる。
【０００４】
上記の理由から、肺炎球菌の疾患を予防、制御、診断又は治療する手段の改良を検討する抗し難い理由がある。
【０００５】
肺炎球菌の感染を予防するためのワクチンを提供するために種々のアプローチが採られてきた。困難は、例えば、該生物を取り囲む多糖類莢膜の構造に基づく血清型の種類（少なくとも９０）から生じる。個々の血清型に対するワクチンは他の血清型に対して有効でなく、これは大部分の症例に有効であるためにワクチンが全範囲の血清型から得られる多糖類抗原を含まなければならないことを意味する。精製されワクチンとして使用される場合、莢膜多糖類（その各々が血清型を決定し主要な防御抗原である）は、侵襲性の肺炎球菌の感染及び髄膜炎の最も高い発生を被る年齢群である二歳以下の子供に防御抗体応答を確実に誘発するものではないことが見出されたため、更なる問題が生じている。
【０００６】
莢膜抗原を用いるアプローチの変形は、特に、免疫応答にＴ細胞依存性の特性を付与することにより強化された該応答を誘導するために、該多糖類をタンパク質に結合させることによる。このアプローチはヘモフィラス・インフルエンザエに対するワクチンの開発に用いられてきた。多重多糖類ワクチンに関する費用及び結合体に基づく費用の両方に問題がある。
【非特許文献１】ファイバー，ジー．アール．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：１３８５−１３８７（１９９４）
【非特許文献２】スタンスフィールド，エス．ケイ．、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，６：６２２（１９８７）
【非特許文献３】ブライマンら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１５０：１４０１（１９９０）
【非特許文献４】シャペルト，エス．エム．、Ｖｉｔａｌ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｅｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、２１４：１（１９９２）
【非特許文献５】ブライマンら、Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．、２７１：１８３１（１９９４）
【発明の開示】
【０００７】
第三のアプローチは、ワクチンの候補となるための潜在能力を付与する他の抗原性の構成要素を探すことである。本出願において、本発明者らは分泌／放出された（exported) タンパク質であるタンパク質抗原の群を提供する。
【０００８】
従って、第一の側面において、本発明は、本明細書の表２に示される配列群から選択される１配列を有する肺炎連鎖球菌のタンパク質又はポリペプチドを提供する。
【０００９】
本発明のタンパク質又はポリペプチドは実質的に純粋な形で提供されうる。例えば、他のタンパク質を実質的に含まない形で提供されうる。
【００１０】
好ましい実施態様においては、表３に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質又はポリペプチドが提供される。
【００１１】
本発明は、本明細書の表１に示される核酸配列によりコードされる任意のタンパク質を包含する。
【００１２】
本明細書で論議されるように、本発明のタンパク質及びポリペプチドは抗原性物質として有用である。このような物質は「抗原性」及び／又は「免疫原性」であり得る。一般的に、「抗原性」は、該タンパク質又はポリペプチドが抗体を生産するために用いることができること又は実際に患者に抗体応答を誘導できることを意味すると解される。「免疫原性」は、該タンパク質又はポリペプチドが被験者に防御免疫応答を誘発できることを意味すると解される。従って、後者の場合、該タンパク質又はポリペプチドは、抗体応答だけでなく更に抗体に基づかない免疫応答を引き起こすことができうる。
【００１３】
熟練者は、本発明のタンパク質又はポリペプチドの同族体又は誘導体も本発明の文脈における使用、即ち抗原性／免疫原性の物質としての使用を見出しうることを理解するであろう。従って、例えば、一つ以上の付加、欠失、置換等を含むタンパク質又はポリペプチドが本発明に包含される。さらに、一アミノ酸を他の同類の「型」で置換できうる。例えば、一つの疎水性アミノ酸を他のもので置換する。アミノ酸配列を比較するためにＣＬＵＳＴＡＬプログラムなどのプログラムを使用できる。このプログラムは、アミノ酸配列を比較し、どちらかの配列に適切にスペースを挿入することにより最適な整列を見出す。最適な整列についてのアミノ酸の同一性又は類似性（アミノ酸型の同一性プラス保存性）を計算できる。ＢＬＡＳＴｘなどのプログラムは最長の類似配列を整列させ、その適合性に数値を割り当てる。従って、各々が異なる点数を有する幾つかの類似領域が見出される場合には、比較を得ることができる。本発明において、両タイプの分析が意図される。
【００１４】
同族体及び誘導体の場合、本明細書に記載されるタンパク質又はポリペプチドとの同一性の程度は、この同族体又は誘導体が肺炎連鎖球菌に対する抗原性又は免疫原性を保持することほどには重要でない。しかしながら、本明細書に記載されるタンパク質又はポリペプチドと少なくとも６０％の（上述の）類似性を有する同族体又は誘導体が提供されることが相応しい。好ましくは少なくとも７０％の類似性、より好ましくは少なくとも８０％の類似性を有する同族体又は誘導体が提供される。少なくとも９０％又は更に９５％の類似性を有する同族体又は誘導体が提供されることが最も好ましい。
【００１５】
代わりのアプローチにおいては、該同族体又は誘導体は、例えば所望のタンパク質又はポリペプチドを効果的にタグ化することにより精製を容易にする部分を組み入れた融合タンパク質でありうる。「タグ」を除去することが必要であっても良く、又はこの融合タンパク質自体が有用である程に十分な抗原性を保持する場合もあろう。
【００１６】
本発明のさらなる側面において、本発明のタンパク質若しくはポリペプチド又はそれらの同族体若しくは誘導体の抗原性断片が提供される。
【００１７】
本明細書に記載されるタンパク質若しくはポリペプチド又はそれらの同族体若しくは誘導体の断片について、状況は若干異なる。エピトープ領域、即ちタンパク質又はポリペプチドの抗原性又は免疫原性の原因となる領域を同定するために該抗原性のタンパク質又はポリペプチドをスクリーニングできることは周知である。このようなスクリーニングの実施方法は当分野では周知である。従って、本発明の断片は、これらの抗原性／免疫原性の性質を保持するために、一つ以上の該エピトープ領域を含むか又は該領域に十分に類似しているべきである。従って、本発明の断片についての同一性の程度はおそらく見当違いであり、なぜなら本明細書に記載されるタンパク質若しくはポリペプチド、同族体又は誘導体の特定部分に１００％同一でありうるためである。再度であるが、重要な点は該断片が抗原性／免疫原性の性質を保持することである。
【００１８】
従って、同族体、誘導体及び断片について重要なことは、これらが由来するタンパク質又はポリペプチドの抗原性／免疫原性の少なくともある程度を保有することである。
【００１９】
実質的に純粋な形態で本発明のタンパク質を提供するために遺伝子クローニング手法が用いられてもよい。これらの手法は、例えば、ジェイ．サムブルックら、分子クローニング、第二版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１９８９）に開示されている。従って、第四の側面において、本発明は、下記の１配列を含む又は下記の１配列からなる核酸分子を提供する。
(i) 表１に示されるＤＮＡ配列群又はそれらのＲＮＡ等価物のいずれか、
(ii) (i) の配列いずれかに相補的な配列、
(iii) (i) 又は(ii)の配列と同じタンパク質又はポリペプチドをコードする配列、
(iv) (i) 、(ii)及び(iii) の配列群のいずれかと実質的な同一性を有する配列、
(v) 表１で定義されるタンパク質の同族体、誘導体又は断片をコードする配列。
【００２０】
第五の側面において、本発明は、下記の１配列を含む又は下記の１配列からなる核酸分子を提供する。
(i) 表４に示されるＤＮＡ配列群又はそれらのＲＮＡ等価物のいずれか、
(ii) (i) の配列いずれかに相補的な配列、
(iii) (i) 又は(ii)の配列と同じタンパク質又はポリペプチドをコードする配列、
(iv) (i) 、(ii)及び(iii) の配列群のいずれかと実質的な同一性を有する配列、
(v) 表４で定義されるタンパク質の同族体、誘導体又は断片をコードする配列。
【００２１】
本発明の核酸分子は複数の該配列及び／又は断片を含んでもよい。熟練者は、本発明が本明細書で例示される特定の新規な核酸分子の新たな変異型を含み得ることを理解するであろう。このような変異型は本発明に包含される。これらは例えば株の変異により自然界で生じうる。例えば、付加、置換及び／又は欠失が含まれる。さらに、とりわけ微生物の発現系を利用する場合、発現に用いられる特定の生物において既知の好ましいコドン用語を活用することにより該核酸配列の設計を企ててもよい。従って、合成又は非天然産の変異型も本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
上記で用いられた際の「ＲＮＡ等価物」という用語は、所与のＲＮＡ分子が（ＲＮＡの「Ｕ」が遺伝コードでは「Ｔ」に置き換わるという事実を考慮して）所与のＤＮＡ分子の配列に相補的な配列を有することを示している。
【００２３】
相同性又は同一性の程度を決定するために核酸配列を比較する際に、ＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰ（双方ともウィスコンシン・ジェネティックス・コンピューター・グループ（ＧＣＧ）ソフトウェア・パッケージから得られる）等のプログラムを使用できる。ＢＥＳＴＦＩＴは、例えば二つの配列を比較し最も類似したセグメントの最適な整列を作成する。ＧＡＰは配列をその全長に沿って整列させることができ、どちらかの配列に適切にスペースを挿入することにより最適な整列を見出す。核酸配列の同一性を論じる際には本発明の文脈において、該比較は配列の全長に沿ったそれらの整列によりなされることが好ましい。
【００２４】
実質的な同一性を有する配列は、該配列と好ましくは少なくとも５０％の配列同一性、望ましくは少なくとも７５％の配列同一性、並びにより望ましくは少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列同一性を有する。この配列同一性が９９％以上でありうる場合もある。
【００２５】
用語「実質的な同一性」とは、該配列が先行技術の核酸配列とよりも本明細書に記載される任意の配列とより高い程度の同一性を有することを示すことが望ましい。
【００２６】
しかし、本発明の核酸配列が新規な遺伝子産物の少なくとも一部をコードする場合、本発明はその範囲内において該遺伝子産物又はその新規な部分をコードするあらゆる可能な配列を含むことに注意すべきである。
【００２７】
この核酸分子は単離型又は組換え型であってもよい。ベクターに組込まれてもよく、ベクターは宿主に組込まれてもよい。このようなベクター及び適切な宿主は本発明のさらなる側面を形成する。
【００２８】
従って、例えば本明細書に記載される該核酸配列に基づくプローブを用いることにより、肺炎連鎖球菌の遺伝子が同定できる。次いで、該遺伝子は制限酵素を用いて切出しベクターにクローニングできる。該ベクターは発現用の適切な宿主に導入できる。
【００２９】
本発明の核酸分子は、該核酸分子の配列の一部に相補的な適切なプローブを用いることにより肺炎連鎖球菌から得られうる。プローブ用に相応しい長さの断片を得るために制限酵素又は超音波処理の手法が使用できる。
【００３０】
代わりに、ＰＣＲ法が所望の核酸配列を増幅するために用いられてもよい。従って、本明細書に記載される配列データはＰＣＲで用いる二つのプライマーを設計するために用いることができるため、遺伝子全体又はその断片を含む所望の配列が標的化でき、次いで高度に増幅できる。一方のプライマーは通常一つのＤＮＡ分子鎖上に位置する第一配列に対して高度の特異性を示し、他方のプライマーは通常該ＤＮＡ配列の相補鎖に位置する第二配列に対して高度の特異性を示し該第一配列の相補的配列から一定の間隔が置かれている。
【００３１】
典型的には、プライマーは少なくとも１５〜２５ヌクレオチドの長さであろう。
【００３２】
更なる代替手段として、化学合成が用いられてもよい。これは自動化されていてもよい。比較的短い配列は化学合成し互いに連結しより長い配列を提供してもよい。
【００３３】
さらなる側面において、本発明は表２〜４に示される配列、又はそれらの同族体若しくは誘導体、及び／又はこれらの任意の断片から選択されるタンパク質又はポリペプチドの一つ以上を含む免疫原性／抗原性の組成物を提供する。好ましい実施態様において、この免疫原性／抗原性の組成物はワクチンであり又は診断検定に用いられる。
【００３４】
ワクチンの場合、適切な補足の賦形剤、希釈剤、アジュバント等が含まれてもよい。これらの多数の例が当分野ではよく知られている。
【００３５】
いわゆるＤＮＡワクチンの調製において表１に示される核酸配列を利用することもできる。従って、本発明は本明細書で定義される一つ以上の核酸配列を含むワクチン組成物も提供する。このようなＤＮＡワクチンの使用は当分野に記されている。例えば、ドネリーら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５：６１７−６４８（１９９７）を参照。
【００３６】
本明細書で既に論議したように、本明細書に記載されるタンパク質又はポリペプチド、それらの同族体又は誘導体、及び／又はこれらの任意の断片は肺炎連鎖球菌の検出方法／診断方法に用いることができる。このような方法は、被験者に存在しうる該タンパク質に対する抗体の検出に基づく。従って、本発明は、本明細書に記載されるタンパク質、又はその同族体、誘導体若しくは断片の少なくとも一つと検査試料を接触させる工程を含む肺炎連鎖球菌の検出方法／診断方法を提供する。該試料は、検査される被験者から得られる組織試料又は血液若しくは唾液の試料などの生物試料が適切である。
【００３７】
代わりのアプローチにおいては、本明細書に記載されるタンパク質、それらの同族体、誘導体、及び／又は断片は抗体を生産するために用いることができ、次いで該抗体は該抗原、従って肺炎連鎖球菌を検出するために使用できる。このような抗体は本発明の他の側面を形成する。本発明の範囲内の抗体はモノクローナル又はポリクローナルでありうる。
【００３８】
ポリクローナル抗体は、本明細書に記載されるタンパク質、又はその同族体、誘導体若しくは断片が適切な動物宿主（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ又はサル）に注射されると、該動物中で該抗体の生産を刺激することにより生じ得る。必要なときは、アジュバントが該タンパク質とともに投与されても良い。周知のアジュバントはフロイントのアジュバント（完全及び不完全）及び水酸化アルミニウムを含む。次いで、該抗体は本明細書に記載されるタンパク質に結合することで精製できる。
【００３９】
モノクローナル抗体はハイブリドーマから生産され得る。これらは、不死細胞系を形成させるために骨髄腫細胞と所望の抗体を生産する脾臓細胞を融合することにより形成できる。従って、周知のコーラー＆ミルスタイン手法（Ｎａｔｕｒｅ、２５６（１９７５））又はこの手法に基づく一連の変法が使用できる。
【００４０】
特定のポリペプチド及び／又はタンパク質に結合するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の生産法は当分野でよく開発されている。これらは、例えばロイットら、免疫学第二版（１９８９）、チャーチル リビングストーン、ロンドンなどの標準的な免疫学の教科書で論じられている。
【００４１】
完全な抗体に加えて、本発明は本明細書に記載されるタンパク質等に結合できるそれらの誘導体を含む。従って、本発明は抗体断片及び合成構築物を含む。抗体断片及び合成構築物の例は、ドガールら、Ｔｉｂｔｅｃｈ、１２、３７２−３７９（１９９４年９月）に記載されている。
【００４２】
抗体断片には、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2及びＦｖ断片が含まれる。Ｆａｂ断片（これらはロイットら（前出）で論じられている）。Ｆｖ断片は単鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）分子として知られる合成構築物を生産するために改変できる。これは該分子の安定性に寄与するＶh領域とＶl領域よ共有結合するペプチドリンカーを含む。使用できる他の合成構築物にはＣＤＲペプチドが含まれる。これらは抗原結合決定基を含む合成ペプチドである。ペプチド擬似体も使用されうる。通常、これらの分子はＣＤＲループの構造を模倣し且つ抗原と相互作用する側鎖を含むコンフォメーションが限定された有機環である。
【００４３】
合成構築物はキメラ分子を含む。従って、例えばヒト化（霊長類化）抗体又はその誘導体は本発明の範囲内にある。ヒト化抗体の例はヒトのフレームワーク領域を有するが、げっ歯類の超可変領域を有する抗体である。キメラ抗体の生産方法は、例えばモリソンら、ＰＮＡＳ、８１、６８５１−６８５５（１９８４）及びタケダら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４、４５２−４５４（１９８５）により論じられている。
【００４４】
合成構築物には、抗原結合に加えて幾つかの望ましい性質をもつ分子を提供する付加的部分を含む分子も含まれる。例えば、該部分は標識（例えば蛍光標識又は放射性標識）であってもよい。または薬学的に活性な薬剤であってもよい。
【００４５】
抗体又はその誘導体は肺炎連鎖球菌の検出／診断で使用される。従って、他の側面において、本発明は、本明細書に記載される一つ以上のタンパク質、又はその同族体、誘導体及び／又は断片に結合できる抗体と検査試料を接触させる工程を含む肺炎連鎖球菌の検出方法／診断方法を提供する。
【００４６】
さらに、いわゆる「アフィボディ（Affibodies）」が利用されうる。これらは細菌のアルファ−らせんの受容体ドメイン（ノードら）のコンビナトリアルライブラリーから選択される結合タンパク質である。従って、異なる標的タンパク質に特異的に結合できる小タンパク質ドメインがコンビナトリアルアプローチを用いて選択できる。
【００４７】
本明細書に記載される核酸配列が肺炎連鎖球菌を検出及び／又は診断するために使用されうることも明白である。従って、さらなる側面において、本発明は本明細書に記載される少なくとも一つの核酸配列と検査試料を接触させる工程を含む肺炎連鎖球菌の検出方法／診断方法を提供する。この試料は、検査される被験者から得られる組織試料又は血液若しくは唾液の試料などの生物試料が適切である。このような試料は本発明の方法に使用する前に前処理してもよい。従って、例えば試料はＤＮＡを抽出するため処理してもよい。次いで、本明細書に記載される核酸配列に基づくＤＮＡプローブ（即ち、通常該配列の断片）は肺炎連鎖球菌の核酸を検出するために用いてもよい。
【００４８】
更なる側面において、本発明は、
（ａ）本発明のタンパク質若しくはポリペプチド、又はその誘導体、同族体若しくは断片、又は本発明の免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む被験者に肺炎連鎖球菌に対するワクチンを注射する方法、
（ｂ）本明細書で定義される核酸分子を被験者に投与する工程を含む被験者に肺炎連鎖球菌に対するワクチンを注射する方法、
（ｃ）本発明のタンパク質若しくはポリペプチド、又はその誘導体、同族体若しくは断片、又は本発明の免疫原性組成物を被験者に投与する工程を含む肺炎連鎖球菌の感染の予防方法又は治療方法、
（ｄ）本明細書で定義される核酸分子を被験者に投与する工程を含む肺炎連鎖球菌の感染の予防方法又は治療方法、
（ｅ）本発明の一つ以上タンパク質若しくはポリペプチド、又はその同族体、誘導体若しくは断片、又は本発明の免疫原性組成物を含む肺炎連鎖球菌の感染を検出／診断する際に使用するキット、並びに
（ｆ）本明細書で定義される一つ以上の核酸分子を含む肺炎連鎖球菌の感染を検出／診断する際に使用するキット、
を提供する。
【００４９】
本発明者らが重要なタンパク質の群を同定したということであれば、このようなタンパク質は抗微生物治療の潜在的な標的である。しかしながら、個々の各タンパク質が該生物の生存能力に必須であるか否かを決定することが必要である。従って、本発明は、本明細書に記載されるタンパク質又はポリペプチドが潜在的な抗微生物標的に相当するか否かを決定する方法であって、該タンパク質を不活性化する工程及び肺炎連鎖球菌がインビトロ又はインビボでまだ生存しているか否かを決定する工程を含む方法も提供する。
【００５０】
該タンパク質を不活性化する適切な方法は選択された遺伝子のノックアウトを成し遂げることであり、即ち該タンパク質の発現を妨げ、これが致死的な変化をもたらすか否かを決定することである。このような遺伝子ノックアウトの適当な実施方法は、リーら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．、９４：１３２５１−１３２５６（１９９７）に記載されている。
【００５１】
最後の側面において、本発明は、肺炎連鎖球菌の感染の治療又は予防に使用される医薬の製造における、本発明のタンパク質又はポリペプチドの機能又は発現と拮抗し、これを阻害又は他の方法で妨害できる作用物質の使用を提供する。
【００５２】
本発明は、以下の実施例を参照して以下に記載する。この実施例は本発明を如何なる意味でも限定するものと解釈されるべきでない。
【００５３】
実施例１
４型肺炎連鎖球菌のゲノム配列決定はインスティチュート・フォ・ジェノミック・リサーチ（ＴＩＧＲ、ロックビル、メリーランド州、米国）で進行中である。現在のところ、全配列は完了又は発表されていない。１９９７年１１月２１日に、ＴＩＧＲセンターは終了した配列を正確に反映していないコンティグ（contigs)としての幾つかのＤＮＡ配列を公開した。これらのコンティグはウェブスター（ｗｗｗ＠ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）からダウンロードできる。本発明者らはこれらのコンティグをダウンロードし、ＧＣＧＴｏＢＬＡＳＴ（ウィスコンシンパッケージ９．１版、ジェネティックス・コンピュータ・グループ（ＧＣＧ）、マディソン、米国）アプリケーションを用いてローカルデータベースを作成した。このデータベースは（ピアソンとリップマンの方法（ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８５：２４４４−２４４８（１９８８））を用いる）ＦａｓｔＡ及びＴｆａｓｔＡの手法で検索できる。
【００５４】
ＦａｓｔＡ及びＴｆａｓｔＡの手法を用いて、推定的リーダー配列又はアンカー配列の性質についてこの肺炎球菌のローカルデータベースを検索した。相対的に新規な配列について応答信号を送らせるために関連のある配列を使用した。これらは、
（i) 既に記載されている肺炎連鎖球菌のリーダー配列群（タンパク質ＮａｎＡ、ＮａｎＢ、ＬｙｔＡ、ＰａｐＡ、ｐｃｐＡ、ＰｓａＡ、及びＰｓｐＡに由来する）、
（ii） ラクトコッカス・ラクティスから得られる分泌タンパク質であるＵｓｐ４５のリーダー配列、
（iii) （i)及び（ii）の検索から演繹される新規な仮定的リーダー配列、
（iv） ソルターゼ（Sortase)複合タンパク質に関わる機構により固定される多数のグラム陽性細菌表面タンパク質に共通する性質であるアンカーモチーフＬＰｘＴＧ、である。
【００５５】
このアプローチの例は該データベースから得られる配列（表１参照）に関して以下に示す。
【００５６】
[外１]
【００５７】
この異なる既知の放出タンパク質のタンパク質リーダー配列は、上述した肺炎球菌のローカルデータベースを検索する開始点として用いた。この検索で見出された仮定的タンパク質は次いでＥＭＢＬ、スイスプロット等の一般的なデータベースでＢｌａｓｔ検索にかけた。肺炎球菌で未だ知られていないタンパク質は残し注釈を施す。次に、新規な潜在的タンパク質リーダー配列をプローブとして用いて、ＴｆａｓｔＡ手法により、この検索を再度実施する。
【００５８】
実施例２：ＤＮＡワクチンの試行
ＤＮＡワクチンベクターとしてのｐｃＤＮＡ３．１＋
ｐｃＤＮＡ３．１＋
ＤＮＡワクチンベクターとして使用するために選択したベクターはｐｃＤＮＡ３．１（インビトロゲン社）（実際はｐｃＤＮＡ３．１＋、全場合でこの正方向を用いたが本明細書ではｐｃＤＮＡ３．１と呼ぶ）であった。このベクターは、この文献（ザングら、クラ−ルとスプリッター、アンダーソンら）の病原体から防御するワクチン候補遺伝子を試験するための宿主ベクターとして広く並びに首尾よく使用されてきた。このベクターは哺乳類細胞における高レベルに安定で複製しない一過性の発現用に設計された。ｐｃＤＮＡ３．１は大腸菌で簡便に高いコピー数の複製と増殖ができるＣｏｌＥ１複製起点を含む。次に、これは多数の遺伝子の迅速で効率のよいクローニングと試験ができる。このｐｃＤＮＡ３．１ベクターは、多数のクローニング部位を有し、クローニング選別を手助けするアンピシリン耐性をコードする遺伝子並びに該組換えタンパク質を効率よく高レベルに発現させるヒトのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の直初期プロモーター／エンハンサーも含む。このＣＭＶプロモーターは、筋細胞及び免疫（抗原提示）細胞の両方を含む広範囲の細胞タイプにおける強力なウイルスプロモーターである。インビボで防御応答を生じる際にどの細胞タイプが最も重要であるかに関してまだ分かっていないため、これは最適な免疫応答に重要である。この多クローニング部位の上流にあるＴ７プロモーターは目的の修飾挿入物を効率よく発現させ、インビトロでクローニング遺伝子をセンス方向で転写できる。
【００５９】
ザング, ディー．、ヤング, エックス．、ベリー, ジェイ．、シェン, シー．、マックラルティー，ジー．、及びブランハム, アール．シー．（１９９７）、「主要な外膜タンパク質遺伝子によるＤＮＡワクチン注射はクラミジア・トラコマティス（マウスの肺炎）の感染に対する後天的免疫を誘導する」、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１７６、１０３５−４０。
【００６０】
クラ−ル, イー．とスプリッター, ジー．エイ．（１９９７）、「ブルセラ・アボルタスのリボソームＬ７／Ｌ１２遺伝子の核酸ワクチン接種は免疫応答を誘発する」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１５、１８５１−５７。
【００６１】
アンダーソン, アール．、ガオ, エックス．−エム．、パパコンスタンティノパウロ, エイ．、ロバート, エム．とドーガン, ジー．（１９９６）、「破傷風毒素の断片ＣをコードするＤＮＡによる免疫後のマウスにおける免疫応答」、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６４、３１６８−３１７３。
【００６２】
ＤＮＡワクチンの調製
オリゴヌクレオチドプライマーはＬＥＥＰ系を用いて誘導された目的の各遺伝子について設計した。各遺伝子は徹底的に調べ、可能ならば、プライマーは該遺伝子タンパク質の成熟部分のみコードすると考えられる遺伝子部分を標的とするように設計された。哺乳類細胞で発現させた場合、標的遺伝子タンパク質の成熟部分のみをコードする配列の発現がその正しい折りたたみを容易にすると記載された。例えば、プライマーは、通例、推定的Ｎ末端シグナルペプチド配列がｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターにクローニングされる最終の増幅産物に含まれないよう設計した。このシグナルペプチドはタンパク質放出経路を介して該ポリペプチド前駆体を細胞膜に向かわせる。この経路では該ペプチドは通常シグナルペプチダーゼＩ（又はリポタンパク質の場合シグナルペプチダーゼＩＩ）により切断される。従って、成熟タンパク質が細菌表面上に提示されるか分泌されるかに関わらず、このシグナルペプチドは該成熟タンパク質のどの部分も構成しない。Ｎ末端リーダーペプチド配列は直ちに明白ではなかった場合、プライマーはクローニング用及び最終的にはｐｃＤＮＡ３．１の発現用に該遺伝子配列の全体を標的とするよう設計した。
【００６３】
そうは言うものの、しかしながら、タンパク質の他の補足的な特性も可溶性タンパク質の発現及び提示に影響を及ぼしうる。目的のタンパク質をコードする遺伝子における該特性をコードするＤＮＡ配列はオリゴヌクレオチドの設計中に排除した。これらの特性には以下のものが含まれた。
１ ＬＰＸＴＧ細胞壁固定モチーフ。
２ ＬＸＸＣリポタンパク質付着部位。
３ 疎水性のＣ末端ドメイン。
４ Ｎ末端シグナルペプチド又はＬＸＸＣがなかった場合、開始コドンは排除した。
５ 疎水性のＣ末端ドメイン又はＬＰＸＴＧモチーフがなかった場合、終止コドンは除去した。
【００６４】
目的の各遺伝子について適切なＰＣＲプライマーを設計し、これらのプライマーを設計する際に上記の特性をコードする任意領域及び全領域は該遺伝子から除去した。プライマーは、適切な酵素制限部位及びその後に、保存されたコザックのヌクレオチド配列（（全例で）ＧＣＣＡＣＣを用いた。このコザック配列は、真核性リボソームによるイニシエーター配列の認識を容易にする。）及び目的の遺伝子挿入物の上流にあるＡＴＧ開始コドンを持つものを設計した。例えば、ＢａｍＨＩ部位を用いる前向きプライマーの場合、このプライマーはＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧで始まり目的遺伝子の５’末端の小セクションに続く。この逆向きプライマーは該前方向プライマーと適合するように、そして全例で５’末端にＮｏｔＩ制限部位を備えるように（この部位はＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ）設計した。
【００６５】
ＰＣＲプライマー
以下のＰＣＲプライマーを設計し先端の欠けた目的の遺伝子を増幅するために用いた。
【００６６】
ＩＤ２１０
前向きプライマー
５’ＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＡＡＴＧＡＡＴＣＴＧＣＣＧＡＴＧ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＴＴＴＡＧＡＴＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴＡＡＡＧＡＣＴＴ３’
４１７２．５
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＡＴＴＴＧＧＡＧＧ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＧＴＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＣＴ３’
ＩＤ２１１
前向きプライマー
５’ＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＧＡＴＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＡＣＧＣ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴＧＡＣＴＣＣＴ３’
４１９７．４
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＧＡＣＡＴＡＴＴＧＧＴＧＧＡＡＡＣ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＴＴＧＡＧＣＡＡＡＣＴＧＡＡＴＣＣ３’
４１２２．１
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＧＡＣＧＴＡＧＴＣＴＣＣＧＣＣ３’
４１２６．７
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＴＴＧＧＡＡＣＴＴＴＣＴＡＣＴＡＴＣＡＡＴ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＴＴＣＧＴＣＣＣＴＴＴＴＴＧＧ３’
【００６７】
４１８８．１１
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＡＴＴＣＴＧＧＣＧＧＡＡ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＴＴＴＣＡＴＡＧＣＴＴＴＴＴＴＧＡＴＴＧＴＴ３’
ＩＤ２０９
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＡＴＡＣＧＡＡＡＴＧＣＡＧＧＧ３’
逆向きプライマー５’
ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＡＴＡＡＴＣＴＡＧＴＡＡＡＴＡＡＧＣＧＴＡＧＣＣ３’
ＩＤ２１５
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＡＡＴＴＴＴＣ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＴＣＧＴＴＴＴＴＧＡＡＣＴＡＧＴＴＧＣＴ３’
４１７０．４
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＣＡＴＧ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＡＣＣＴＴＧＴＴＣＴＴＧ３’
４１９３．１
前向きプライマー
５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＡＡＣＣＧＣＴＣＴＴＣＴＣＧＴＡＡＣ３’
逆向きプライマー
５’ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＴＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＴＴＴＴＡＧＣ３’
【００６８】
クローニング
上記のフランキング特性をもつ挿入物は、ナショナル コレクション オブ タイプ カルチャーから入手した４型肺炎連鎖球菌株１１８８６の単離されたゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ産物は適切な制限酵素で切断し常套な分子生物学的技法を用いてｐｃＤＮＡ３．１の多クローニング部位にクローニングした。適切に位置付けられた目的遺伝子のクローンを培養し、このプラスミドはプラスミドメガキット（キアーゲン社）を用いて大量に（＞１．５ｍｇ）単離した。遺伝子のクローニング及び維持の成功は、各構築物の各大量調製物の制限地図の作成並びに５’クローニング連結による約７００塩基対の配列決定により確認した。
【００６９】
株の確認
肺炎連鎖球菌ゲノムが配列決定された株である４型株を、クローニング及び攻撃法で使用した。４型肺炎連鎖球菌株ＮＣＴＣ１１８８６の均一な実験株の凍結乾燥されたアンプルを、ナショナル・コレクション・オブ・タイプ・ストレインズから入手した。このアンプルを開封し、培養菌を０．５ｍＬのトリプティック・ソイ・ブロス（０．５％グルコース、５％血液）に再懸濁した。この懸濁液は１０ｍＬのトリプシンダイズ培地（０．５％グルコース、５％血液）で継代培養し３７℃で一晩静置してインキュベートした。この培養菌は５％血液寒天プレート上に塗布し、汚染を調べ、生存を確認し、血液寒天斜面上へ移した。残りの該培養菌は２０％グリセロールストックを作製するために使用した。この斜面は、４型の血清型を確認するためパブリック・ヘルス・ラボラトリー・サービスに送った。
【００７０】
ＮＣＴＣ１１８８６のグリセロールストックは５％血液寒天プレート上に塗布し、３７℃で一晩ＣＯ２ガス槽中でインキュベートした。新鮮な塗布菌が生成し、オプトヒン感受性を確認した。
【００７１】
肺炎球菌による攻撃
１ｘ肺炎連鎖球菌の培養をマウスで継代培養し感染動物の血液から採取することにより、４型肺炎連鎖球菌の標準接種原を調製し凍結した。該接種原は培地中約１０9ｃｆｕ／ｍＬの所定の生菌数まで凍結前に増殖させた。この調製はフローチャートにより以下に示す。
肺炎球菌の培養を塗布し同一性を確認する
↓
上記プレート上で４〜５コロニーからの一晩培養菌を増殖させる
↓
肺炎球菌培養菌を動物継代培養する
（採取された心臓採血の腹膜腔内注射）
↓
動物継代培養した肺炎球菌から一晩培養を増殖させる
↓
動物継代培養の一晩培養を（所定の光学密度まで）一日増殖させ −７０℃で凍結する−これは標準的な最低値である
↓
標準接種原の１本の部分標本を解凍し生菌数を計数する
↓
標準接種原を用いて有効用量を測定する
（ビルレンス試験と呼ばれる）
↓
その後の全ての攻撃（標準接種原を有効用量まで用いる）
【００７２】
標準接種原の部分標本は、５００倍にＰＢＳで希釈してマウスに接種するために用いた。
【００７３】
マウスはハロタンで軽く麻酔をかけた後、１．４ｘ１０5ｃｆｕの用量の肺炎球菌を各マウスの鼻に適用した。この摂取はマウスの通常の呼吸により促進された。マウスは放置して元に回復させた。
【００７４】
肺炎連鎖球菌のワクチン試行
マウスのワクチン試行は６週齢のＣＢＡ／ｃａマウス（ハーラン、英国）にＤＮＡを投与することにより実施した。ワクチン注射されるマウスは６つの群に分け、各群は目的の特定の標的遺伝子配列を含む組換えｐｃＤＮＡ３．１＋プラスミドＤＮＡを用いて免疫した。ダルベッコのＰＢＳ（シグマ社）中総量１００μｇのＤＮＡを両足の前脛骨筋中に筋内注射した（各足に５０μＬ）。４週間後に同じ手法でブーストを行った。比較のため、対照群を全ワクチン試行に含めた。これらの対照群は、非ワクチン接種動物であるか、上述した同じ時間経過で非組換えｐｃＤＮＡ３．１＋ＤＮＡ（偽ワクチン接種）のみを投与された動物であった。二回目の免疫の３週間後、全てのマウス群は致死量の血清型４肺炎連鎖球菌（ＮＣＴＣ１１８８６株）を鼻腔内に攻撃した。投与された細菌数は、連続希釈の接種原を５％血液寒天プレート上に塗布することにより測定した。鼻腔内免疫の問題は、該接種原が泡立ち鼻孔外にあふれてしまうマウスがいることであり、これは結果表に記録し計算時に考慮した。不明な問題は各マウスが一定量の該接種原を嚥下しうることである。この量は各マウスで同じであり菌接種の間中で平均化されると推定される。しかしながら、使用した試料サイズは小さく、この課題は幾つかの実験で有意な結果を有しうる。攻撃後に生存している全てのマウスは感染の３又は４日後に屠殺した。感染過程の間、攻撃されたマウスは、肺炎連鎖球菌に誘発される疾患の発症に伴う症状の進展について調べられた。典型的な徴候には、適当な順序で、立毛、猫背の増大、眼からの分泌、嗜眠の増加及び動きへの抵抗が含まれる。この後者の症状は通常さらなる苦痛を回避するためにマウスを淘汰する段階である瀕死状態の形成と一致した。これらのマウスは死の瀬戸際にあると考えられ、この淘汰の時間を統計学的分析用に生存期間を測定するために用いた。マウスの死が発見された場合、この生存期間はマウスの存命が観察された最後の時点とされた。
【００７５】
結果の解釈
陽性の結果は、クローニングされ上述の攻撃実験に用いた任意のＤＮＡ配列が該攻撃に対する防御を付与したものと解した。防御は、該ＤＮＡ配列が統計学的に有意な防御（９５％の信頼レベル（ｐ＜０．０５））を付与するもの、マン−ウィットニーを用いてぎりぎり有意であるか若しくは有意に近いもの、又は、一匹以上の範囲外のマウスが存在するとか、例えば最初の死に至る時間が延びたためなどという幾つかの防御特性を示すもの、と解した。これらの結果の中には鼻腔内感染の投与に伴う問題により明瞭性があいまいであると考えられる場合、限界に近い結果又は有意性のない結果を潜在的な陽性とみなすことが許容される。
【００７６】
ワクチン試行２、７及び８の結果（図１参照）
【００７７】
[外２]
【００７８】
＊−投与時に泡立ったため全接種原を受容していないかもしれない。
Ｔ−感染の症状がなく実験の最後で終了させた。
括弧内の数−不完全な投与と考え、生存期間を無視した。
ｐ値１はワクチン接種していない対照と比較した有意検定を指す。
【００７９】
統計学的分析
試行２−ＩＤ２１０でワクチン注射した群もワクチン注射していない対照より平均生存期間が長かったが、本結果は統計学的に有意でない。
試行７−４１７２．５でワクチン注射した群はワクチン注射していない対照より非常に長い生存期間を示したが、差異は統計学的に有意でなかった。
試行８−ＩＤ２１１でワクチン注射した群はワクチン注射していない対照より有意に長く生存した。４１９７．４、４１２２．１及び４１２６．７のワクチン注射した群はワクチン注射していない群より長い平均生存期間を示したが、本結果は統計学的に有意でなかった。４１９７．４及び４１２６．７の群は最初の死に至る時間の延びも示し、４１２２．１群は一つの範囲外の結果を示した。
【００８０】
肺炎球菌の攻撃とＤＮＡワクチン試行９〜１１の結果（図２参照）
【００８１】
[外３]
【００８２】
＊−投与時に泡立ったため全接種原を受容していないかもしれない。
Ｔ−感染の症状がなく実験の最後に終了させた。
括弧内の数−不完全な投与と考え、生存期間を無視した。
ｐ値１はワクチン注射していない対照と比較した有意検定を指す。
ｐ値２はｐｃＤＮＡ３．１＋でワクチン注射した対照と比較した有意検定を指す。
【００８３】
統計学的分析
試行９−統計学的に有意でないが、４１８８．１１とＩＤ２０９でワクチン注射した群はワクチン注射していない対照より平均生存期間が顕著に長かった。
試行１０−ワクチン注射していない対照群はｐｃＤＮＡ３．１＋でワクチン注射した群より有意に長い期間生存した。ＩＤ２１５と４１７０．４でワクチン注射した群は偽ワクチン注射群と比較して統計学的に有意に長い生存期間を示した（ｐ＝０．０１６８と０．０３１６）が、ワクチン注射していない群と比較した場合はそうではなかった。
試験１１−４１９３．１でワクチン注射した群は最も有望であり、ｐｃＤＮＡ３．１＋でワクチン注射した群より平均６．５時間長く、ワクチン注射していない群より６時間長く生存したが、本結果は統計学的に有意でなかった。
【００８４】
[外４]
【００８５】
[外５]
【００８６】
[外６]
【００８７】
[外７]
【００８８】
[外８]
【００８９】
[外９]
【００９０】
[外１０]
【００９１】
[外１１]
【００９２】
[外１２]
【００９３】
[外１３]
【００９４】
[外１４]
【００９５】
[外１５]
【００９６】
[外１６]
【００９７】
[外１７]
【００９８】
[外１８]
【００９９】
[外１９]
【０１００】
[外２０]
【０１０１】
[外２１]
【０１０２】
[外２２]
【０１０３】
[外２３]
【０１０４】
[外２４]
【０１０５】
[外２５]
【０１０６】
[外２６]
【０１０７】
[外２７]
【０１０８】
[外２８]
【０１０９】
[外２９]
【０１１０】
[外３０]
【０１１１】
[外３１]
【０１１２】
[外３２]
【０１１３】
[外３３]
【０１１４】
[外３４]
【０１１５】
[外３５]
【０１１６】
[外３６]
【０１１７】
[外３７]
【０１１８】
[外３８]
【０１１９】
[外３９]
【０１２０】
[外４０]
【０１２１】
[外４１]
【０１２２】
[外４２]
【０１２３】
[外４３]
【０１２４】
[外４４]
【０１２５】
[外４５]
【０１２６】
[外４６]
【０１２７】
[外４７]
【０１２８】
[外４８]
【０１２９】
[外４９]
【０１３０】
[外５０]
【０１３１】
[外５１]
【０１３２】
[外５２]
【０１３３】
[外５３]
【０１３４】
[外５４]
【０１３５】
[外５５]
【０１３６】
[外５６]
【０１３７】
[外５７]
【０１３８】
[外５８]
【０１３９】
[外５９]
【０１４０】
[外６０]
【０１４１】
[外６１]
【０１４２】
[外６２]
【０１４３】
[外６３]
【０１４４】
[外６４]
【０１４５】
[外６５]
【０１４６】
[外６６]
【０１４７】
[外６７]
【０１４８】
[外６８]
【０１４９】
[外６９]
【０１５０】
[外７０]
【０１５１】
[外７１]
【０１５２】
[外７２]
【０１５３】
[外７３]
【０１５４】
[外７４]
【０１５５】
[外７５]
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は種々のＤＮＡワクチン試験の結果を示す。
【図２】図２はさらなるＤＮＡワクチン試験の結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表２に示される配列群から選択される１配列を有する肺炎連鎖球菌のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項２】
表４に示される配列群から選択される１配列を有する肺炎連鎖球菌のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項３】
実質的に純粋な形態で提供される請求項１又は請求項２記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のタンパク質又はポリペプチドと実質的に同一なタンパク質又はポリペプチド。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のタンパク質又はポリペプチドの同族体又は誘導体。
【請求項６】
表２〜表４で定義されるタンパク質又はポリペプチドの抗原性及び／又は免疫原性の断片。
【請求項７】
下記の１配列、すなわち
(i) 表１に示されるＤＮＡ配列群又はそれらのＲＮＡ等価物のいずれか、
(ii) (i) の配列いずれかに相補的な配列、
(iii) (i) 又は(ii)の配列と同じタンパク質又はポリペプチドをコードする配列、
(iv) (i) 、(ii)及び(iii) の配列群のいずれかと実質的に同一な配列、
(v) 表１で定義されるタンパク質の同族体、誘導体又は断片をコードする配列、
を含む核酸分子又は該配列からなる核酸分子。
【請求項８】
下記の１配列、すなわち
(i) 表４に示されるＤＮＡ配列群又はそれらのＲＮＡ等価物のいずれか、
(ii) (i) の配列いずれかに相補的な配列、
(iii) (i) 又は(ii)の配列と同じタンパク質又はポリペプチドをコードする配列、
(iv) (i) 、(ii)及び(iii) の配列群のいずれかと実質的に同一な配列、
(v) 表４で定義されるタンパク質の同族体、誘導体又は断片をコードする配列、
を含む核酸分子又は該配列からなる核酸分子。
【請求項９】
表２〜表４に示される配列、又はそれらの同族体、誘導体及び／又は断片から選択される配列を有するタンパク質又はポリペプチドの免疫原及び／又は抗原としての使用。
【請求項１０】
配列が表２〜表４に示されるタンパク質若しくはポリペプチドから選択される一つ以上のタンパク質若しくはポリペプチド、又はそれらの同族体若しくは誘導体、及び／又はこれらのいずれかの断片を含む免疫原性及び／又は抗原性の組成物。
【請求項１１】
ワクチンであるか又は診断検定に用いられる請求項１０記載の免疫原性及び／又は抗原性の組成物。
【請求項１２】
賦形剤、希釈剤、アジュバント等から選択される一つ以上の補足的構成要素を含む請求項１１記載のワクチン。
【請求項１３】
表１、表３又は表４に定義される核酸配列の一つ以上を含むワクチン組成物。
【請求項１４】
表２〜表４に定義される少なくとも一つのタンパク質若しくはポリペプチド、又はその同族体、誘導体若しくは断片と検査試料を接触させる工程を含む肺炎連鎖球菌の検出方法／診断方法。
【請求項１５】
表２〜表４に定義されるタンパク質若しくはポリペプチド、又はその同族体、誘導体若しくは断片に結合できる抗体。
【請求項１６】
モノクローナル抗体である請求項１５記載の抗体。
【請求項１７】
検査試料と請求項１５又は請求項１６に記載の少なくとも一つの抗体とを接触させる工程を含む肺炎連鎖球菌の検出方法／診断方法。
【請求項１８】
検査試料と請求項７又は請求項８に記載の少なくとも一つの核酸配列とを接触させる工程を含む肺炎連鎖球菌の検出方法／診断方法。
【請求項１９】
表２〜表４に定義されるタンパク質又はポリペプチドが潜在的な抗微生物標的であるか否かを決定する方法であって、該タンパク質又は該ポリペプチドを不活性化する工程及び肺炎連鎖球菌がインビトロ又はインビボでまだ生存しているか否かを決定する工程を含む方法。
【請求項２０】
肺炎連鎖球菌感染の治療又は予防に使用される医薬の製造における、表２〜表４に定義されるタンパク質又はポリペプチドの機能又は発現と拮抗、阻害又は妨害できる作用物質の使用。
【請求項１】
表２に示される配列群から選択される１配列を有する肺炎連鎖球菌のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項２】
表４に示される配列群から選択される１配列を有する肺炎連鎖球菌のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項３】
実質的に純粋な形態で提供される請求項１又は請求項２記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のタンパク質又はポリペプチドと実質的に同一なタンパク質又はポリペプチド。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のタンパク質又はポリペプチドの同族体又は誘導体。
【請求項６】
表２〜表４で定義されるタンパク質又はポリペプチドの抗原性及び／又は免疫原性の断片。
【請求項７】
下記の１配列、すなわち
(i) 表１に示されるＤＮＡ配列群又はそれらのＲＮＡ等価物のいずれか、
(ii) (i) の配列いずれかに相補的な配列、
(iii) (i) 又は(ii)の配列と同じタンパク質又はポリペプチドをコードする配列、
(iv) (i) 、(ii)及び(iii) の配列群のいずれかと実質的に同一な配列、
(v) 表１で定義されるタンパク質の同族体、誘導体又は断片をコードする配列、
を含む核酸分子又は該配列からなる核酸分子。
【請求項８】
下記の１配列、すなわち
(i) 表４に示されるＤＮＡ配列群又はそれらのＲＮＡ等価物のいずれか、
(ii) (i) の配列いずれかに相補的な配列、
(iii) (i) 又は(ii)の配列と同じタンパク質又はポリペプチドをコードする配列、
(iv) (i) 、(ii)及び(iii) の配列群のいずれかと実質的に同一な配列、
(v) 表４で定義されるタンパク質の同族体、誘導体又は断片をコードする配列、
を含む核酸分子又は該配列からなる核酸分子。
【請求項９】
表２〜表４に示される配列、又はそれらの同族体、誘導体及び／又は断片から選択される配列を有するタンパク質又はポリペプチドの免疫原及び／又は抗原としての使用。
【請求項１０】
配列が表２〜表４に示されるタンパク質若しくはポリペプチドから選択される一つ以上のタンパク質若しくはポリペプチド、又はそれらの同族体若しくは誘導体、及び／又はこれらのいずれかの断片を含む免疫原性及び／又は抗原性の組成物。
【請求項１１】
ワクチンであるか又は診断検定に用いられる請求項１０記載の免疫原性及び／又は抗原性の組成物。
【請求項１２】
賦形剤、希釈剤、アジュバント等から選択される一つ以上の補足的構成要素を含む請求項１１記載のワクチン。
【請求項１３】
表１、表３又は表４に定義される核酸配列の一つ以上を含むワクチン組成物。
【請求項１４】
表２〜表４に定義される少なくとも一つのタンパク質若しくはポリペプチド、又はその同族体、誘導体若しくは断片と検査試料を接触させる工程を含む肺炎連鎖球菌の検出方法／診断方法。
【請求項１５】
表２〜表４に定義されるタンパク質若しくはポリペプチド、又はその同族体、誘導体若しくは断片に結合できる抗体。
【請求項１６】
モノクローナル抗体である請求項１５記載の抗体。
【請求項１７】
検査試料と請求項１５又は請求項１６に記載の少なくとも一つの抗体とを接触させる工程を含む肺炎連鎖球菌の検出方法／診断方法。
【請求項１８】
検査試料と請求項７又は請求項８に記載の少なくとも一つの核酸配列とを接触させる工程を含む肺炎連鎖球菌の検出方法／診断方法。
【請求項１９】
表２〜表４に定義されるタンパク質又はポリペプチドが潜在的な抗微生物標的であるか否かを決定する方法であって、該タンパク質又は該ポリペプチドを不活性化する工程及び肺炎連鎖球菌がインビトロ又はインビボでまだ生存しているか否かを決定する工程を含む方法。
【請求項２０】
肺炎連鎖球菌感染の治療又は予防に使用される医薬の製造における、表２〜表４に定義されるタンパク質又はポリペプチドの機能又は発現と拮抗、阻害又は妨害できる作用物質の使用。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−２６３９６８（Ｐ２００８−２６３９６８Ａ）
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８０９２３（Ｐ２００８−８０９２３）
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【分割の表示】特願２０００−５６２５１９（Ｐ２０００−５６２５１９）の分割
【原出願日】平成１１年７月２７日（１９９９．７．２７）
【出願人】（５０７３８５０１７）サノフィ パスツール リミテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【分割の表示】特願２０００−５６２５１９（Ｐ２０００−５６２５１９）の分割
【原出願日】平成１１年７月２７日（１９９９．７．２７）
【出願人】（５０７３８５０１７）サノフィ パスツール リミテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
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