胎児異数性の診断
本発明は、胎児異数性の非侵襲性の早期診断のための方法に関する。特に、本発明は、母体の生体液、例えば母体の血清または羊水において異数性の特徴を示すタンパク質発現パターンを同定することによる、胎児異数性の診断に関する。一態様では、本発明は、母体の生体液の試験試料のプロテオームプロフィールと、同じ種類の生体液の標準または参照プロテオームプロフィールとを比較すること、ならびに前記試験試料のプロテオームプロフィールが前記標準プロテオームプロフィールに存在しないかまたは前記参照プロテオームプロフィールに存在する、表１〜２および５〜６に記載されるバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを表す少なくとも１つの固有の発現サインを示す場合、胎児異数性の存在を決定することを含む、胎児異数性の診断のための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、胎児異数性の非侵襲性の早期診断のための方法に関する。特に、本発明は、母体の生体液、例えば母体血清また羊水において異数性の特徴を示すタンパク質発現パターンを同定することによる、胎児異数性の診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
（プロテオミクス）
タンパク質発現パターンの大規模解析は、現在のＤＮＡクローニングおよび遺伝子プロファイリングアプローチの重要かつ必要な補完技法として浮上している（非特許文献１）。ＤＮＡ配列情報は、ホモロジー法に基づいて何らかの構造上および可能性のあるタンパク質修飾を推論する際に有用であるが、翻訳後修飾、タンパク質分解または区分化によるタンパク質機能の調節に関する情報は得られない。
【０００３】
従来のゲルに基づく方法、例えば一次元および二次元ゲル電気泳動は小型タンパク質（タンパク質＜１，０００）の検出に有用であるが、それには大量の試料を必要とする（非特許文献２）。この制限を克服するためのアプローチとしては、試料中のタンパク質の質量を示すプロフィールを正確に生成するマトリックス支援レーザー脱離イオン化法または表面増強レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩまたはＳＥＬＤＩ）飛行時間型質量分析計が挙げられる。これらのパターンまたはプロフィールを用いると種々の疾患の同定およびモニターができる。同定の２番目の工程は、ペプチドマッピングとタンデム質量分析とを連結させて、ペプチド断片からアミノ酸配列情報を生成することによりもたらされる。これは、例えば、ＭＡＬＤＩ／ＳＥＬＤＩまたはＥＳＩを四重極の飛行時間型ＭＳ（Ｑｑ−ＴＯＦ ＭＳ）と連結させることにより実現することができる。この最後の方法は、特定のペプチドの定量化に用いることもできる（ＩＣＡＴ法）。
【０００４】
（胎児異数性）
胎児異数性は染色体数の異常であり、卵形成または精子形成中の減数分裂の不分離の結果として生ずることが多いが、トリソミー８などの特定の異数性は接合後の減数分裂分離に起因する場合がより多い（非特許文献３）。このような異常には正常な染色体数の減少および増加の両方が含まれ、常染色体ならびに性染色体に関係し得る。異数性の減少の例はターナー症候群で、Ｘ性染色体が１本しか存在しないことが特徴である。染色体数の増加の例としては、ダウン症候群（染色体２１のトリソミー）、パトー症候群（染色体１３のトリソミー）、エドワード症候群（染色体１８のトリソミー）、およびクラインフェルター症候群（性染色体のＸＸＹトリソミー）が挙げられる。異数性は一般に著しい身体的かつ神経学的障害を引き起こし、その結果多くの患者が成人期に達することができない。実際、１３、１８、または２１以外の染色体に関する常染色体異数性を有する胎児は一般に子宮の中で死亡する。しかし、特定の異数性、例えばクラインフェルター症候群は、あまり明白でない表現型を示し、他のトリソミー、例えばＸＸＹおよびＸＸＸの患者は、成熟して生殖能力のある成人となる場合も多い。
【０００５】
ダウン症候群は人間において最も一般的な単一パターンの形成異常であり、出生時に最も多く見られる重大な先天異常の１つであって、生児出生６６０人に１人の割合で起こる（非特許文献４）。妊娠第二期に生存しているダウン症候群の胎児全てのうち約３人に１人はその期間を生き抜くことができない；従って、妊娠第二期のダウン症候群の真の発生率は妊娠５００例中１例に近い（非特許文献５）。ダウン症候群の乳児の多数は、著しい罹患率および死亡率を引き起こす重大な心臓、胃腸、またはその他の異常を有する。さらに、大多数のダウン症候群の乳児のＩＱは５０未満であり、この症候群を米国における精神遅滞の主な原因の１つにしている。米国では毎年約２５００万人の妊娠女性がダウン症候群の血清スクリーニング検査を受けており、スクリーニングがなければ、これらの妊娠のうち約４、０００例がダウン症候群の子を出産する可能性がある（非特許文献６）。
【０００６】
ダウン症候群は生児出産において最も一般的な異数性であるものの、染色体１３、１８、および性染色体の異数性はかなりの数の個体に及んでいる。例えばトリソミー１８の発生率は、出生約７０００対１であり、トリソミー１３の発生率は出生約２９，０００対１である（非特許文献３）。その他の異数性は妊娠中に高い割合で発生するが、胎児が出産予定日になる前、通常妊娠１５週以内に自然流産となる（Ｎｉｃｏｌａｉｄｉｅｓ ＆ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、前掲）。例えば、トリソミー１６は最も一般的な単一のヒトトリソミーであり、認識される全ての妊娠の１．５％に起こると考えられているが、致死性の染色体異常である（非特許文献３）。トリソミー１５および８はより低い割合で発生するが（全ての自然流産のうちそれぞれ約１．４％および０．７％）これも致死性の異常である（非特許文献３）。
【０００７】
（胎児異数性の診断）
最終的な胎児異数性の出生前診断には、羊水穿刺または絨毛膜標本採取（ＣＶＳ）による侵襲的な検査を必要とし、これらの検査は０．５％〜１％の妊娠の喪失という処置に伴うリスクに関連している（非特許文献７）。胎児異数性、例えばダウン症候群に関するスクリーニングは異常のある胎児を妊娠することのリスクについての評価を患者に提供するため、一般に妊娠中に行われている。これらの侵襲的な検査法に関連するリスクのため、非侵襲的な異数性のスクリーニング法に多くの関心が集まっている。
【０００８】
特定の異数性との関連において様々なアプローチ法が用いられているものの、ダウン症候群の場合、スクリーニングは、最初は完全に母体の年齢を基準とし、３５歳という任意の境界で侵襲的な胎児検査の実施に値するハイリスクな女性の母集団を限定していた。このアプローチの結果、ダウン症候群の胎児の検出率は２０％〜３０％、侵襲的な胎児検査の割合は５％〜７％となる。従って、各例のダウン症候群を検出するために約１４０例の羊水穿刺が必要とされ、異常胎児が２人検出されるたびに正常な胎児１人が死亡する（非特許文献８）。
【０００９】
これらの制限のため、検出率を向上させ、侵襲的検査率を低下させるために妊娠第二期の血清スクリーニング法が導入された。現在のダウン症候群のスクリーニングの注意基準は、妊娠１５〜１８週の全ての患者に３種類のマーカー血清検査を行うことを求めており、これを母体の年齢（ＭＡ）とともにリスク判定に用いる。この検査はα−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（βｈＣＧ）、および非結合型エストリオール（ｕＥ３）を検定する。もしこの「３種類スクリーニング」から導かれるリスクが所定の境界より大きければ、患者は胎児核型分析のための侵襲的検査を提案される。最も一般的に用いられるリスク境界は、３８０対１（３５歳女性の出産予定日リスク）であり、この結果ダウン症候群の検出率は６５％〜７０％、侵襲的胎児検査を提案される妊娠母集団は５％〜７％である（非特許文献９）。ＭＡとこの妊娠第二期血清の「３種類スクリーニング」とを組み合わせて用いて１例のダウン症候群を検出するために６０例の羊水穿刺が行われると推測されている（非特許文献８）。
【００１０】
ダウン症候群の血清の「３種類スクリーニング」の現在の注意基準は今「４種類検査」へと発展中であり、この検査では血清マーカーインヒビン−Ａが他の３種類の分析物に加えられる。４種類検査は１９９６年８月からロンドンのＷｏｌｆｓｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ＭｅｄｉｃｉｎｅでＷａｌｄ教授の指揮下で臨床的に提案されてきた。毎日の診療でのインヒビン−Ａの成績は予想通りである。スクリーニングマーカーとしてのインヒビン−Ａの成績の評価は非常に一貫している。公表された６つの研究において、ダウン症候群妊娠の場合の母体の血清インヒビン−Ａレベルは、非罹患妊娠において見出されたレベルよりも平均して１．９倍高かった（非特許文献９）。インヒビン−Ａは、ダウン症候群妊娠の単変量予測因子として、最も強力な単一マーカーであるβｈＣＧとほぼ同程度と評価されている（固定されたスクリーニング陽性率５％で、βｈＣＧの検出率４９％と比較してインヒビン−Ａの検出率は４４％である。）（非特許文献９）。インヒビン−Ａを３種類検査に加えることにより、「３種類スクリーニング」のダウン症候群検出率が７７％から８０％へ、侵襲的な検査の比率は５％〜７％に改善されるであろう（非特許文献９；非特許文献１０）。あるいは、４種類の検査を用いてダウン症候群の検出率７０％を維持する一方で、侵襲的検査率を５％に減らし、実施される羊水穿刺の件数を有意に低下させることもできるであろう。
【００１１】
羊水穿刺の頻度をさらに減らす努力において、妊娠第二期スクリーニング超音波検査がダウン症候群スクリーニングに適用されている。特定の主な胎児の構造上の異常の同定は、ダウン症候群および他の異数性のリスクを著しく増加させ、その結果侵襲的な胎児検査の指標と考えられる。しかし、このアプローチはダウン症候群の集団スクリーニングを改善しない、というのも一般集団における９８％の胎児が構造上の異常を有していないためである。
【００１２】
それ自体は構造上の異常ではなく、標準的な核型の存在下で胎児に何らリスクを与えない異数性の超音波マーカーの役割を評価するさらなる研究が行われている。ダウン症候群スクリーニングに用いられるこのような超音波マーカーとしては、脈絡叢嚢胞、エコー源性腸管、短い大腿骨、短い上腕骨、微小な水腎症、および肥厚した後頚部襞が挙げられる。超音波検査によるアプローチはスクリーニング陽性率５％でダウン症候群の胎児の７３％まで同定する可能性があると何人かの研究者が示唆しているが、これらの研究は全て、既に異数性のリスクの高い母集団から導かれている（非特許文献１１）。これらの検査の成績をハイリスク母集団から一般集団または非選択集団まで正確に推定することは、問題とされる疾患の有病率は著しく減少するものであるため不可能である。従って、この「遺伝子の超音波検査」の価値は、一般集団のスクリーニングに適用された場合大幅に限定される。さらに、この知見の希薄さのため、超音波検査によるスクリーニング法の成績はオペレーターの技術と経験に非常に左右され、３次センターの外部で超音波検査によるスクリーニングを適用する場合は再現できない可能性がある（非特許文献１２）。「遺伝子の超音波検査」は一次スクリーニングツールとしては有用でないように思われるが、最初の陽性スクリーニング検査の後の異数性のリスクの減少に役割を有しうる（非特許文献８）。
【００１３】
ダウン症候群の妊娠第二期スクリーニングに関する主な問題は、それが妊娠１５〜１８週で行われること、続いて、必要であれば妊娠１６〜２０週で羊水穿刺診断が行われることである。このことは、一般的な妊娠期間の上限である妊娠２４週に達する前に妊娠中絶を望む場合、患者および医療提供者に著しい時間的制約をもたらす。さらに、このような後期の妊娠中絶は母体の罹患率の増加に関係する（非特許文献１３）。妊娠第一期を基にする超音波検査による異数性スクリーニングプログラムの価値には、異常が確認された場合の安全な妊娠中絶の方法、ならびに異常が妊娠の初期に検出された場合の患者のプライバシーおよび機密保持の向上が含まれるであろう。
【００１４】
ロンドンのＦｅｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの研究者らは、ＭＡと妊娠第一期の胎児の超音波評価を組み合わせて用いるスクリーニングからダウン症候群の検出率８０％を示した（非特許文献１４；非特許文献１５）。これは、胎児の首の後部とその上を覆う皮膚との間の半透明の空間の測定に頼るもので、その空間がダウン症候群および他の異数性の胎児では大きくなっていることが報告されている。この後頚部透過像（ＮＴ）測定は、妊娠１０〜１４週の間の経腹的または経膣的超音波検査により達成が容易であると報告されている（非特許文献１６）。ダウン症候群の妊娠第一期スクリーニングを裏付ける大部分のデータはロンドンのＦｅｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎからのものである（非特許文献１４；非特許文献１６）。しかし、ダウン症候群の検出率は異なるセンター間で一致しておらず、現在まで、Ｆｅｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎネットワーク以外でかれらの結果を反復したセンターはない。
【００１５】
種々の妊娠関連タンパク質およびホルモンの妊娠第一期の濃度が、染色体的に正常な妊娠と異常な妊娠とで異なることを示すデータもある。ダウン症候群およびエドワード症候群に関する最も有望な２種類の妊娠第一期血清マーカーはＰＡＰＰ−Ａおよび遊離βｈＣＧであると思われる（非特許文献１７）。ＰＡＰＰ−Ａの妊娠第一期血清レベルがダウン症候群において有意に低いこと、およびこの低下が後頚部透過像（ＮＴ）の肥厚とは関係のないことが報告されている（非特許文献１８）。さらに、両方の合計および遊離β−ｈＣＧの妊娠第一期血清レベルがダウン症候群胎児において高いこと、およびこの増加も後頚部透過像（ＮＴ）の肥厚とは関係のないことが示されている（非特許文献１９）。ＰＡＰＰ−Ａおよび遊離βｈＣＧもまた、ダウン症候群スクリーニングに適用した場合、互いに関係がない（非特許文献２０）。多施設プロスペクティブ研究において、ＰＡＰＰ−Ａと遊離βｈＣＧとを組み合せると、ダウン症候群の検出率は６０％、侵襲的検査率は５％となった（非特許文献２１）。数理モデルは、ＭＡ、ＮＴ肥厚、遊離βｈＣＧ血清、およびＰＡＰＰ−Ａ血清を利用する複合妊娠第一期スクリーニングプログラムが、侵襲的検査率５％に対して８０％を超えるダウン症候群胎児を検出できると示唆している（非特許文献２０）。これらの治験およびモデルは最近Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓにより総説されている（非特許文献２２）。
【００１６】
これらのデータは、胎児異数性、例えばダウン症候群の複合妊娠第一期スクリーニングプログラムまたは妊娠第一期および第二期統合スクリーニングプログラムが、標準的な妊娠第二期スクリーニングよりも優れているであろうことを示唆しているが、この仮説は臨床現場ではまだ確認されていない。
【００１７】
ダウン症候群の妊娠第一期スクリーニングの有効性を明確にし、妊娠第一期および第二期スクリーニングの診断能力を比較するため、ＮＩＨは最近多施設の妊娠第一期および第二期リスク評価（Ｆｉｒｓｔ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄ Ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｉｓｋ；ＦＡＳＴＥＲ）試験に資金援助した。このプロスペクティブ研究では、患者がＮＴの超音波検査を受け、妊娠１０週と３日から１３週と６日までにＰＡＰＰ−Ａおよび遊離βｈＣＧのための母体血清を採取され、結果は妊娠１５週〜１８週と６日までの４種類スクリーニング（ＡＦＰ、βｈＣＧ、ｕＥ３、およびインヒビン−Ａ）を含む２次リスクスクリーニング後まで患者に知らされなかった。３８、０００名を超える患者がこの調査を完了し、その中から１１７例の胎児トリソミー２１が同定され、そのうち８７例で妊娠第一期および第二期のデータが揃った。各検査の診断能力は、複合妊娠第一期スクリーニング（ＮＴ／ＰＡＰＰ−Ａ／遊離βｈＣＧ／ＭＡ）；妊娠第二期血清スクリーニング（母体ＡＦＰ／遊離βｈＣＧ／ｕＥ３／インヒビン−Ａ／ＭＡ）；または妊娠第一期および第二期統合スクリーニングを含むスクリーニング法によって分析された。
【００１８】
これらのデータは妊娠第一期、または複合妊娠第一期および第二期統合スクリーニングの有用性を確認するものであるが、重大な制限がある。第一に、これらの検査が妊娠期間に大いに依存していること、および妊娠が進むにつれて差別的でなくなること。第二に、ダウン症候群の検出を最適化するために、これらの検査は全てスクリーニング陽性率が低く（５％）、真の偽陽性率が非常に高く（９０％を上回る）、その結果患者の不安、および遺伝子検査のための不必要な侵襲的な羊水穿刺をもたらす。従って、信頼性があり広い範囲の妊娠期間にわたって強く且つ偽陽性率の低いそれに変わる検査に対して差し迫った必要がある。
【非特許文献１】ＰａｎｄｅｙおよびＭａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ,２０００年,第４０５巻，ｐ．８３７−４６
【非特許文献２】Ｌｉｌｌｅｙ ＫＳ， Ｒａｚｚａｑ Ａ， Ｄｕｐｒｅｅ Ｐ，「Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ．」，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．，２００２年，第６巻，第１号，ｐ．４６−５０
【非特許文献３】ＮｉｃｏｌａｉｄｉｓおよびＰｅｔｅｒｓｅｎ，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，１９９８年，第１３巻，第２号，ｐ．３１３−３１９
【非特許文献４】Ｊｏｎｅｓ，Ｋ．，「Ｄｏｗｎ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ｉｎ Ｓｍｉｔｈ’ｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚａｂｌｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ」，Ｊｏｎｅｓ，Ｋ．編，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１９９７年，ｐ．８−１３
【非特許文献５】Ｃｕｃｋｌｅ，Ｈ．，「Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｏｗｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ， ｉｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｄｏｗｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｔｒｏｍｅｓｔｅｒ」，Ｊ．ＧｒｕｄｚｉｎｋａｓおよびＲ．Ｗａｒｄ編，ＲＣＯＧ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，１９９７年，ｐ．３−１３
【非特許文献６】Ｐａｌｏｍａｋｉ，Ｇ．Ｅ．，ら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．，１９９７年，第１７６巻，第５号，ｐ．１０４６−１０５１
【非特許文献７】Ｄ’Ａｌｔｏｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｓｅｍｉｎ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ，１９９４年，第１８巻，第３号，ｐ．１４０−６２
【非特許文献８】ＶｉｎｔｚｉｅｌｏｓおよびＥｇａｎ，Ａｍ Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ，１９９５年，第１７２巻，第３号，ｐ．８３７−４４
【非特許文献９】Ｗａｌｄら、Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｒｅｅｎ，１９９７年，第４巻，第４号，ｐ．１８１−２４６
【非特許文献１０】Ｗａｌｄら、Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ，１９９６年，第１６巻，第２号，ｐ．１４３−５３
【非特許文献１１】Ｂｅｎａｃｅｒｒａｆら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，１９９４年，第１９３巻，第１号，ｐ．１３５−４０
【非特許文献１２】Ｅｗｉｇｍａｎ、Ｂ．Ｇ．，ら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，１９９３年，第３２９巻，第１２号，ｐ．８２１−７
【非特許文献１３】Ｌａｗｓｏｎ，Ｈ．Ｗ．，ら、Ａｍ Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ，１９９４年，第１７１巻，第５号，ｐ．１３６５−７２
【非特許文献１４】Ｐａｎｄｙａ，Ｐ．Ｐ．ら、Ｂｒ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅａｃｏｌ，１９９５年，第１０２巻，第１２号，ｐ．９５７−６２
【非特許文献１５】Ｓｎｉｊｄｅｒｓ，Ｒ．Ｊ．，ら，Ｌａｎｃｅｔ，１９９８年，第３５２巻，第９１２５号，ｐ．３４３−６
【非特許文献１６】Ｓｎｉｊｄｅｒｓ，Ｒ．Ｊ．，ら，Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ，１９９６年，第７巻，第３号，ｐ．２１６−２６
【非特許文献１７】Ｗａｐｎｅｒ，Ｒ．，ら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２００３年，第３４９巻，第１５号，ｐ．１４０５−１４１３
【非特許文献１８】Ｂｒｉｚｏｔ，Ｍ．Ｌ．，ら，Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ，１９９４年，第８４巻，第６号，ｐ．９１８−２２
【非特許文献１９】Ｂｒｉｚｏｔ，Ｍ．Ｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎａｅｃｏｌ，１９９５年，第１０２巻，第２号，ｐ．１２７−３２
【非特許文献２０】ＷａｌｄおよびＨａｃｋｓｈａｗ，Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ，１９９７年，第１７巻，第９号，ｐ．９２１−９
【非特許文献２１】Ｈａｄｄｏｗ，Ｊ．Ｅ．，ら，Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ，１９９８年，第３３８巻，第１４号，ｐ．９５５−６１
【非特許文献２２】Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｉｎ Ｏｂｓｔｒｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，２００３年，第２１巻，ｐ．３１３−２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
ダウン症候群ならびに他の胎児異数性の診断のための新規で効率的で信頼のおける非侵襲性の方法の開発が特に望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の概要）
一態様では、本発明は、母体の生体液の試験試料のプロテオームプロフィールと、同じ種類の生体液の標準または参照プロテオームプロフィールとを比較すること、ならびに前記試験試料のプロテオームプロフィールが前記標準プロテオームプロフィールに存在しないかまたは前記参照プロテオームプロフィールに存在する、表１〜２および５〜６に記載されるバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを表す少なくとも１つの固有の発現サインを示す場合、胎児異数性の存在を決定することを含む、胎児異数性の診断のための方法に関する。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、母体の生体液の試験試料のプロテオームプロフィールと、同じ種類の生体液の標準または参照プロテオームプロフィールとを比較すること、ならびに前記試験試料のプロテオームプロフィールが前記標準プロテオームプロフィールに存在しないかまたは前記参照プロテオームプロフィールに存在する、表３に記載されるバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを表す少なくとも１つの固有の発現サインを示す場合、胎児異数性の存在を決定することを含む、胎児異数性の診断のための方法に関する。
【００２２】
一実施形態では、本発明は、妊娠ヒト女性から得られた試験試料の使用に関する。
【００２３】
本発明の他の実施形態では、プロテオームプロフィールは質量スペクトルである。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態では、試験試料は母体の血清である。
【００２５】
もう１つの実施形態では、固有の発現サインは、１６〜２０ｋＤａ、３５〜３８ｋＤａ、３８〜４２ｋＤａ、４０〜４５ｋＤａ、５０〜５５ｋＤａ、６０〜６８ｋＤａ、および１２５〜１５０ｋＤａの分子量範囲のうちの１以上にある。
【００２６】
他の実施形態では、試験試料は母体の羊水である。
【００２７】
他の実施形態では、固有の発現サインは６〜７ｋＤａおよび８〜１０ｋＤａの分子量範囲の一方または両方にある。
【００２８】
他の実施形態では、本方法を妊娠の第一期に行う。
【００２９】
他の実施形態では、本方法を妊娠の第二期に行う。
【００３０】
さらなる実施形態では、本方法は、試験試料において胎児異数性の少なくとも１種類のバイオマーカーの転写されたｍＲＮＡのレベルまたは翻訳されたタンパク質のレベルを測定すること、および前記転写されたｍＲＮＡのレベルまたは翻訳されたタンパク質のレベルが、標準生体試料におけるそのレベルに対して異なる場合に、胎児異数性の存在を確認することをさらに含む。
【００３１】
他の実施形態では、診断される胎児異数性は、ダウン症候群、トリソミー１３、トリソミー１８、Ｘ染色体トリソミー、Ｘ染色体モノソミー、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ遺伝子型）、またはＸＹＹ症候群（ＸＹＹ遺伝子型）である。
【００３２】
他の実施形態では、その転写されたｍＲＮＡのレベルまたは翻訳されたタンパク質のレベルを検出されるバイオマーカーは、ＰＡＰＰ−Ａ、ａ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｂｈＣＧ）、非結合型エストリオール（ｕＥ３）、およびインヒビンＡからなる群から選択される。
【００３３】
さらなる実施形態では、本方法は、妊娠ヒト女性を１種類以上のさらなる診断法に付すことをさらに含む。
【００３４】
他の実施形態では、さらなる診断法は、超音波検査、染色体異常を検査するための技法、および後頚部透過像（ＮＴ）測定からなる群から選択される。
【００３５】
さらなる実施形態では、本発明は１種類以上のバイオマーカーの固有の発現サインの比較を伴う。さらに、発現サインの数は２、３、４、５、６、７、８種類、またはそれより多くのバイオマーカーの数であり得る。
【００３６】
さらなる実施形態では、バイオマーカーは、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；妊娠ゾーンタンパク質（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｚｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＰＺＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２０７４１）；アファミン（ＡＦＡＭ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４３６５２）；アンジオテンシノーゲン（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；α−２−ｈｓ−糖タンパク質（Ａ２ＨＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６５）；クラステリン（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）；アポリポタンパク質ＡＩ（ＡＰＡ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４７）；アポリポタンパク質ＡＩＶ（ＡＰＡ４＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０６７２７）；アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ３６９５５）；血清アミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７３５）；ＡＭＢＰタンパク質（ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６０）；血漿レチノール結合タンパク質（ＲＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５３）；血清トランスフェリン前駆体（ＴＲＦＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７８７）；α−１−抗トリプシン前駆体（Ａ１ＡＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１００９）；α−２−マクログロブリン前駆体（Ａ２ＭＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２３）；補体Ｃ３前駆体（ＣＯ３＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２４）；アンジオテンシノーゲン前駆体（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；セルロプラスミン前駆体（ＣＥＲＵ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００４５０）；ハプトグロビン前駆体（ＨＰＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７３８）；抗トロンビン−ＩＩＩ前駆体（ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１００８）；ヘモペキシン前駆体（ＨＥＭＯ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７９０）；α−１−酸性糖タンパク質１前駆体（Ａ１ＡＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６３）；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ前駆体（ＡＰＡ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４７）；α １ｂ−糖タンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４２１７）；キニノゲン前駆体（ＫＮＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０４２−２）；インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ２前駆体（ＩＴＨ２＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１９８２３）；α−２−ｈｓ−糖タンパク質前駆体（Ａ２ＨＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６５）；α−１−抗キモトリプシン前駆体（ＡＡＣＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１１）；インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ４前駆体（ＩＴＨ４＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ１４６２４−２）；補体Ｈ因子前駆体（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３−１）；血漿プロテアーゼＣ１インヒビター前駆体（ＩＣ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０５１５５）；ヘパリン補因子ＩＩ前駆体（ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０５５４６）；補体Ｂ因子前駆体（ＣＦＡＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７５１−１）；α−２−糖タンパク質１、亜鉛（ＺＡ２Ｇ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２５３１１）；ビトロネクチン前駆体（ＶＴＮＣ＿ＨＵＭＡＮ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４００４）；インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１前駆体（ＩＴＨ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１９８２７）；補体成分Ｃ９前駆体（ＣＯ９＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７４８）；フィブリノゲンα／α−Ｅ鎖前駆体（ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６７１−１）；フィブリノゲンβ鎖前駆体（ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６７５）；フィブリノゲンγ鎖前駆体（ＦＩＢＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６７９−１）；プロトロンビン前駆体（ＴＨＲＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７３４）；クラステリン前駆体（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）；α−１Ｂ−糖タンパク質前駆体（Ａ１ＢＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４２１７）；α−１−酸性糖タンパク質２前駆体（Ａ１ＡＨ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１９６５２）；アポリポタンパク質Ｄ前駆体（ＡＰＯＤ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０５０９０）；妊娠ゾーンタンパク質前駆体（ＰＺＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２０７４２）；ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体（ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４１９６）；性ホルモン結合グロブリン前駆体（ＳＨＢＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４２７８−１）；プラスミノゲン前駆体（ＰＬＭＮ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７４７）；アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ前駆体（ＡＰＣ３＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６５６）；ロイシンリッチα−２−糖タンパク質前駆体（Ａ２ＧＬ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５０）；アポリポタンパク質Ｅ前駆体（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；フェチュイン−Ｂ前駆体（ＦＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＵＧＭ５）；ミオシン反応性免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＵＬ８３）；補体Ｃ１Ｓ成分前駆体（Ｃ１Ｓ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０９８７１）；ＡＭＢＰタンパク質前駆体（ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６０）；および補体Ｃ４前駆体（ＣＯ４＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２８）からなる群から選択される。
【００３７】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；および妊娠ゾーンタンパク質（ＰＺＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２０７４１）である。
【００３８】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；およびアファミン（ＡＦＡＭ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４３６５２）である。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、妊娠ゾーンタンパク質（ＰＺＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２０７４１）；およびα−２−ｈｓ−糖タンパク質（Ａ２ＨＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６５）である。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；アンジオテンシノーゲン（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；およびクラステリン（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）である。
【００４１】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；ＡＭＢＰタンパク質（ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６０）；および血漿レチノール結合タンパク質（ＲＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５３）である。
【００４２】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；アファミン（ＡＦＡＭ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４３６５２）；アンジオテンシノーゲン（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；およびクラステリン（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）である。
【００４３】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；アファミン（ＡＦＡＭ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４３６５２）；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ３６９５５）；血清アミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７３５）；アンジオテンシノーゲン（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；およびクラステリン（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）である。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；ＡＭＢＰタンパク質（ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６０）；血漿レチノール結合タンパク質（ＲＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５３）；血清トランスフェリン前駆体（ＴＲＦＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７８７）；α−２−マクログロブリン前駆体（Ａ２ＭＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２３）；およびヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体（ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４１９６）である。
【００４５】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１前駆体（ＩＴＨ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１９８２７）；補体成分Ｃ９前駆体（ＣＯ９＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７４８）；フィブリノゲンα／α−Ｅ鎖前駆体（ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６７１−１）；アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ前駆体（ＡＰＣ３＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６５６）；ロイシンリッチα−２−糖タンパク質前駆体（Ａ２ＧＬ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５０）；アポリポタンパク質Ｅ前駆体（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；フェチュイン−Ｂ前駆体（ＦＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＵＧＭ５）；および補体Ｃ４前駆体（ＣＯ４＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２８）である。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１種類の糖タンパク質を含むプロテオームプロフィールの使用を含む。
【００４７】
特定の実施形態では、本発明は、シアル酸糖タンパク質、マンノース結合糖タンパク質、およびＯ−結合糖タンパク質からなる群から選択されるプロテオームプロフィールに用いられる糖タンパク質を含む。
【００４８】
特定の実施形態では、本発明は、常染色体異数性である、胎児異数性の検出を含む。
【００４９】
さらなる実施形態では、本発明は、染色体１３、１８、または２１のトリソミーの検出を含む。
【００５０】
特定の実施形態では、本発明は、性染色体異数性である、胎児異数性の検出を含む。
【００５１】
さらなる実施形態では、本発明は、Ｘ染色体トリソミー、Ｘ染色体モノソミー、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ遺伝子型）、およびＸＹＹ症候群（ＸＹＹ遺伝子型）からなる群から選択される異数性の検出を含む。
【００５２】
（図表の簡単な説明）
表１． 目的の最初の７領域から同定されたダウン症候群の候補母体血清バイオマーカー（図２）。２Ｄスポットのゲル内消化のタンデムＭＳ／ＭＳ分析に続くデノボシーケンシングおよびＯｐｅｎＳｅａを用いるデータベース検索により、これらの領域における各タンパク質の相対存在量が明らかとなった。
【００５３】
表２． 同定されたダウン症候群の候補母体血清バイオマーカー。２Ｄスポットのゲル内消化のタンデムＭＳ／ＭＳ分析に続いてデノボシーケンシングおよびＯｐｅｎＳｅａを用いるデータベース検索により、これらの領域における各タンパク質の相対存在量が明らかとなった。
【００５４】
表３． 同定されたダウン症候群の候補羊水バイオマーカー。２Ｄスポットのゲル内消化のタンデムＭＳ／ＭＳ分析に続いてデノボシーケンシングおよびＯｐｅｎＳｅａを用いるデータベース検索により、これらの領域における各タンパク質の相対存在量が明らかとなった。
【００５５】
表４． 胎児のダウン症候群の診断に好ましい母体血清および羊水バイオマーカー。
【００５６】
表５． 目的の最初の領域から同定されたダウン症候群の候補母体血清バイオマーカー（図７）。タンデムＭＳ／ＭＳを用いて特異的な候補バイオマーカーを同定した。
【００５７】
表６． 目的の最初の領域から同定されたダウン症候群の候補母体血清バイオマーカー（図８〜１１）。タンデムＭＳ／ＭＳを用いて特異的な候補バイオマーカーを同定した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ａ．定義）
別に定義される場合を除いて、本明細書において用いられる技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４）は、本願で用いられる用語の多くに一般的な指針を当業者に提供する。
【００５９】
本明細書において用いられる用語「プロテオーム」は、所定の時点での生体試料中のタンパク質の大部分を説明するために用いられる。プロテオームの概念は基本的にゲノムとは異なる。ゲノムが実質的に静的なものであるのに対して、プロテオームは内的および外的事象に応じて絶えず変化する。
【００６０】
用語「プロテオームプロフィール」は、所定の時点での生体試料、例えば生体液中の複数のタンパク質の発現パターンの表現をさすために用いられる。プロテオームプロフィールは、例えば質量スペクトルとして表すことができるが、タンパク質、またはその断片の任意の物理化学的または生化学的特性に基づく他の表現も含まれる。従ってプロテオームプロフィールは、例えば、二次元ゲル電気泳動、例えば２−Ｄ ＰＡＧＥにより測定されるタンパク質の電気泳動特性の差異に基づいてよく、例えば二次元電気泳動ゲルでの複数のスポットとして表すことができる。あるいは、プロテオームプロフィールは、二次元液体クロマトグラフィーで測定されるタンパク質の等電点および疎水性に基づいてよく、例えばコンピュータにより生成された仮想二次元マップとして表すことができる。さらに、レクチンに基づくアフィニティー精製を、本明細書に記載される技法と組み合わせて、生体試料中に見出される種々のタンパク質の特異的グリコシル化特性を強調するプロテオームプロフィールを生成することができる。
【００６１】
差次的発現プロフィールは、たとえ特異的に同定されたタンパク質が存在しない場合であっても重要な診断価値を有しうる。例えば免疫ブロット法により、単一のタンパク質スポットまたはクロマトグラフ溶出剤がそれから検出でき、タンパク質マイクロアレイを用いて複数のスポット、溶出剤、またはタンパク質を同定することができる。プロテオームプロフィールは一般に、数ピークから５０以上のピークを表す複合プロフィールまでの範囲であり得る情報を表すかまたは含む。従って、例えば、プロテオームプロフィールは、少なくとも２種類、または少なくとも３種類、または少なくとも４種類、または少なくとも５種類、または少なくとも６種類、または少なくとも７種類、または少なくとも８種類、または少なくとも９種類、または少なくとも１０種類、または少なくとも１５種類、または少なくとも２０種類、または少なくとも２５種類、または少なくとも３０種類、または少なくとも３５種類、または少なくとも４０種類、または少なくとも４５種類、または少なくとも５０種類のタンパク質、および同種類のものを含むかまたは表しうる。
【００６２】
用語「固有の発現サイン」は、統計学的に有意な形で、対応する標準的な（同種の供給源、例えば生体液から得られた）生体試料のプロテオームプロフィールとは異なる、生体試料（例えば参照試料または試験試料）のプロテオームプロフィールの中の固有の特徴またはモチーフを説明するために用いられる。
【００６３】
用語「標準プロテオームプロフィール」は、異数性、または他の染色体異常を有さない胎児を妊娠している妊娠女性から得られた試験試料と同じ種類の母体生体液の生体試料のプロテオームプロフィールをさすために用いられる。
【００６４】
用語「参照プロテオームプロフィール」は、異数性を有する胎児を妊娠している妊娠女性から得られた試験試料と同じ種類の母体生体液の生体試料のプロテオームプロフィールをさすために用いられる。
【００６５】
「患者の応答」は、患者への利益を示す任意のエンドポイントを用いて評価することができ、このエンドポイントとしては、限定されないが、（１）病的状態の進行の（少なくともある程度の）阻害、（２）病的状態の予防、（３）病的状態に関連する１以上の症状の（少なくともある程度の）軽減；（４）処置後の生存期間の増加；および／または（５）処置後の所定の時点での死亡率の低下が挙げられる。
【００６６】
用語「処置」とは、対象が標的病的状態または障害を予防されるかまたは減速される（緩和される）、治療的な処置と予防的手段の両方をさす。処置の必要な者としては、既に障害のある者ならびに障害を有する傾向のある者または障害が予防されている者が挙げられる。
【００６７】
「先天性奇形」は、遺伝性ではないが出生時には存在している異常である。
【００６８】
診断アッセイの「感受性」または「診断感受性」は、疾患を有する人の中から疾患を発見する検査の確率、または検査結果が陽性であって、疾患を有する人の割合として定義される。統計用語では：感受性＝真陽性／（真陽性＋偽陽性）。
【００６９】
用語「１以上の」とは、本明細書においてプロテオミクスプロフィール、タンパク質マーカー、および固有の発現サインとの関連において、任意の順列での、グループ内の任意の１、２、３、４、その他の記載されたメンバーを意味するために用いられる。従って、用語「１以上の」には、グループ内で具体的に記載された任意の２、任意の３、任意の４その他のメンバーが挙げられる。明細書および請求項を通じて具体的な下位群が記載されているが、これらに限定されない。用語「１以上の」は広い意味で用いられ、複数のメンバーを含むグループ内の任意の下位群を示すために用いられるということに重点が置かれる。同様に、用語「少なくとも２」、「少なくとも３」、「少なくとも４」、その他は、組合せの中のメンバーの合計数が少なくとも３、少なくとも３、少なくとも４、その他であるならば、特定のグループ内のメンバーの任意の組合せを網羅する。
【００７０】
Ｂ．詳細な説明
本発明は、母体生体液のプロテオームプロフィールに基づく、胎児ダウン症候群および他の染色体異数性の早期の信用性のある非侵襲性の検査のための方法および手段に関する。本発明は当技術分野で周知のプロテオミクス技術を利用し、例えば、その内容が参照により明示的に本明細書に組み入れられる以下のテキストに記載される：Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ： Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｔａｃｔｉｃｅ），Ｍ．Ｒ．Ｗｉｌｋｉｎｓら、ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１００７；２−Ｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｎｄｒｅｗ Ｌ Ｌｉｎｋ， ｅｄｉｔｏｒ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９；Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ： Ｔｗｏ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｔａｃｔｉｃｅ），Ｔ．Ｒａｂｉｌｌｏｕｄ ｅｄｉｔｏｒ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，２０００；Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｔａｃｔｉｃｅ），Ｐ．Ｊａｍｅｓ ｅｄｉｔｏｒ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，２００１；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｄ．Ｃ．Ｌｉｅｂｌｅｒ ｅｄｉｔｏｒ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２；Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒ．Ｗｅｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２００２。
【００７１】
当業者であれば、本明細書に記載されるものと類似しているかまたは同等である多くの方法および材料を理解するであろうし、それらを本発明の実践に用いてもよい。実際に、本発明は記載される方法および材料に一切限定されない。
【００７２】
（１．生体液中に発現したタンパク質およびポリペプチドの同定）
本発明によれば、生体液のプロテオミクス解析は、当技術分野で公知の種々の方法を用いて行うことができる。
【００７３】
一般に、異なる供給源由来の試料、例えば標準的な生体液（標準試料）および試験生体液（試験試料）のタンパク質パターン（プロテオームマップ）を比較して、疾患において上方制御または下方制御されているタンパク質を検出する。次にこれらのタンパク質を、例えばペプチドマスフィンガープリント法および／または質量分析とシーケンシング法を用いて、同定および完全な特性決定のために摘出するか、あるいは標準および／または疾患特異的プロテオームマップを直接目的の疾患の診断に用いるか、または疾患の存在もしくは不在を確認するために用いることができる。
【００７４】
比較分析では、タンパク質の相対存在量を正確に表し、正確な結果を得るために、標準試料と試験試料を全く同じように扱うことが重要である。必要とされる全タンパク質量は、用いる分析法によって決まり、当業者が容易に決定することができる。生体試料に存在するタンパク質は、一般に、それらのｐＩおよび分子量に従って二次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）で分離される。タンパク質はまず、等電点電気泳動（一次元ゲル電気泳動）を用いてそれらの電荷により分離される。この工程は、例えば、市販されている固定化されたｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップを用いて行うことができる。二次元目は集まったＩＰＧストリップを試料として用いる通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。２−ＤＥ分離後、クーマシーブルーまたは銀染色のような従来型の染料を用いてタンパク質を可視化し、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ ＧＳ８００デンシトメーターおよびＰＤＱＵＥＳＴソフトウェア（両方市販されている）などの既知の技術および装置を用いて画像化することができる。次に個々のスポットをゲルから切り出し、脱染し、トリプシン消化に付す。ペプチド混合物は質量分析（ＭＳ）で解析できる。
【００７５】
比較分析の代替法、およびこれらの種々の方法の組合せも、本発明の範囲内で使用されうる。例えば、生体試料中に存在するタンパク質を、下記実施例ＩＩに記載されるようにそれらの等電点および疎水性に従って二次元液体クロマトグラフィーにより分離してよい。限定されるものではないが、分子量、ｐＨ、または特異的結合親和性、例えば抗体−抗原相互作用に基づいて分離できる材料を含む広範囲の分離材料が当技術分野で周知であるので、当然、クロマトグラフ分離は疎水性に基づく必要はない。さらに、最初の分離工程が完了すると、個々のスポットまたは溶出液試料に存在するペプチドを、キャピラリー高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離し、個別にまたはプールでＭＳにより解析することができる。
【００７６】
実施例ＩＩＩに詳述されるように、グリコシル化は真核生物において重要な翻訳後タンパク質修飾であり、従って生体試料のグリコシル化の状態を分離および同定する系は、タンパク質バイオマーカーを発掘する際の有益な手段であり得る。レクチンに基づくアフィニティー精製は、異なるクラスのグリコシル化タンパク質を、それらの特異的かつ可逆的に糖タンパク質のグリカン部分と結合する能力によって単離するための選択法である。糖タンパク質の主要クラスおよび種類は個別に試験試料から単離することができ、ひとたび分離すると、質量分析を用いて疾患に対して対照を比較するための差次的グリコシル化プロフィールを生成することができる。
【００７７】
下に詳細に考察されるように、幅広い種類のレクチンおよびそれらの特異性が当技術分野で公知である。１種類以上のこれらのレクチン、ならびに任意の順列のこれらのレクチンおよび他のレクチンの可能性のある組合せを本発明の実践に用いることができる。マンノース結合レクチンは、限定されるものではないが、以下を含むことが知られている：分枝α−マンノース構造、高マンノース型、およびハイブリッド型ならびに二分岐複合型Ｎ−グリカンと結合する、タチナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）由来のコンカナバリンＡ；二分岐および三分岐複合型Ｎ−グリカンのフコシル化したコア領域と結合するレンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）由来のレンチルレクチン；ならびにα１−３およびα１−６結合高マンノース構造と結合するスノードロップ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ）由来のスノードロップレクチン。ガラクトース／Ｎ−アセチルガラクトサミン結合レクチンとしては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒと結合するトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）由来のトウゴマ凝集素（ＲＣＡ１２０）；Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｔ抗原）と結合するピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）由来のピーナッツ凝集素；（Ｓｉａ）Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｔ抗原）と結合するジャックフルーツ（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）由来のジャカリン；およびＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｔｎ−抗原）と結合するヘアリーベッチ（Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａ）由来のヘアリーベッチレクチン。シアル酸／Ｎ−アセチルグルコサミン結合レクチンとしては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、およびＮｅｕ５Ａｃ（シアル酸）と結合する小麦胚芽（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来の小麦胚凝集素；Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ（ＮＡｃ）−Ｒと結合するセイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ）由来のエルダーベリーレクチン；Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｇｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒと結合するイヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）由来のイヌエンジュレクチン。フコース結合レクチンとしては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌ−Ｒと結合するハリエニシダ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）由来のハリエニシダ凝集素；Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３／４）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、およびＲ２−ＧｌｃＮＡｃβ１−４（Ｆｕｃα１−６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ１と結合するヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ）由来のヒイロチャワンタケレクチン。
【００７８】
質量分析計は、イオン源、質量分析器、イオン検出器、およびデータ収集ユニットから成る。最初に、イオン源でペプチドをイオン化する。次にイオン化したペプチドを質量分析器でそれらの質量対電荷比に従って分離し、分離したイオンを検出する。質量分析は、特にマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）およびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法の発明以来、タンパク質解析において広く用いられている。質量分析器にはいくつかの種類があり、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよび三連四重極型ＴＯＦ、またはＥＳＩと連結したイオントラップ質量分析器が挙げられる。従って、例えばＱ−Ｔｏｆ−２質量分析計は全質量スペクトル範囲にわたってイオンの同時検出を可能にする直交飛行時間分析器を利用する。さらなる詳細に関しては、例えばＣｈｅｍｕｓｅｖｉｃｈら、Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．３６：８４９−８６５（２００１）を参照のこと。
【００７９】
必要に応じて、ペプチド断片のアミノ酸配列および最終的にはそれらの由来するタンパク質のアミノ酸配列は、技術分野で公知の技術、例えば質量分析特定の変形形態、またはエドマン分解により決定することができる。
【００８０】
質量分析データから分枝の配列を決定する方法は、２００４年２月２７日出願の同時係属中の特許出願第１０／７８９，４２４号に開示されており、その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。この方法は、デノボシーケンシングおよびデータベース検索を含み、完全に配列決定されていないが配列データベースに存在する配列に近い配列相同性を有する配列変化および未知タンパク質を同定するために用いることもできる。
【００８１】
（２．染色体異数性）
染色体異常は周産期の罹患率および死亡率の原因となることが多い。染色体異常は生児出産２００対１の罹患率で発生する。これらの異常の主な原因は染色体異数性、つまり両親から受け継いだ染色体の数の異常である。最も頻度の高い染色体異数性の１つがトリソミー２１（ダウン症候群）であり、これは生児出産８００対１で発生する（Ｈｏｏｋ ＥＢ， Ｈａｍｅｒｔｏｎ Ｊ Ｌ：Ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｎｅｗｂｏｒｎ ｓｔｕｄｉｅｓ： Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔｕｄｉｅｓ： Ｒｅｓｕｌｔｓ ｂｙ ｓｅｘ ａｎｄ ｂｙ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ．Ｉｎ Ｈｏｏｋ ＥＢ， Ｐｏｒｔｅｒ ＩＨ（ｅｄｓ）： Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，６３−７９頁．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９７８）。トリソミー２１の主要なリスク因子は、３５以上の母体年齢であるが、トリソミー２１の子の８０％が３５歳よりも若い女性に生まれている。他の多く見られる異数性の状態としてはトリソミー１３および１８、ターナー症候群ならびにクラインフェルター症候群が挙げられる。
【００８２】
（３．生体液のプロテオームプロフィールまたは生体液で同定されたバイオマーカーを用いる胎児染色体異数性の診断）
本発明は、生体液、例えば、妊娠女性の羊水、血清、血漿、尿、脳脊髄液、母乳、粘液、または唾液のプロテオーム解析に基づく、早期かつ信頼性のある、非侵襲性の胎児染色体異数性の診断のための方法を提供する。
【００８３】
前に述べたように、本発明において用語「プロテオームプロフィール」は、所定の時点での生体試料、例えば生体液中の複数のタンパク質の発現パターンの表現をさすために用いられる。プロテオームプロフィールは、例えば質量スペクトルとして表すことができるが、タンパク質の任意の物理化学的または生化学的特性に基づく他の表現も含まれる。生体液のプロテオーム中に存在する全てまたは一部のタンパク質を同定および配列決定することが可能であるが、それは本発明に従って生成されたプロテオームプロフィールの診断使用に必要ではない。診断は、診断される染色体異数性、例えば胎児のダウン症候群が存在する場合に、標準プロテオームプロフィールと同じ環境下で得た同じ生体液のプロテオームプロフィールとの間の特徴的な差異（固有の発現サイン）に基づくものであってよい。固有の発現サインは、統計学的に有意な形で、同種類の供給源から得られた対応する標準生体試料のプロテオームプロフィールとは異なる、試験試料または参照生体試料のプロテオームプロフィールの中の何らかの固有の特徴またはモチーフであり得る。例えば、もしプロテオームプロフィールが質量スペクトルの形で示されるならば、固有の発現サインは、一般に、対応する正常な試料の質量スペクトルとは質的にも量的にも異なるピークまたはピークの組合せである。従って、質量スペクトルにおける新規なピークまたは新規なピークの組合せの出現、あるいは質量スペクトルにおける既存のピークまたは既存のピークの組合せの振幅または形状における何らかの統計上有意な変化は、固有の発現サインとみなすことができる。妊娠女性被験体から得られた試験試料のプロテオームプロフィールを、染色体異数性の特徴を示す固有の発現サインを含む参照試料のプロテオームプロフィールと比較した時に、もし試験試料が固有の発現サインを参照試料と共有しているならば、その胎児はこのような染色体異数性と診断される。
【００８４】
特定の染色体異数性、例えば胎児ダウン症候群は、試験される母体被験体から得られた生体液のプロテオームプロフィールと、同じように得られて処理された同種類の標準生体液のプロテオームプロフィールとを比較することにより診断され得る。もし試験試料のプロテオームプロフィールが標準試料のプロテオームプロフィールと本質的に同じであれば、胎児は試験された染色体異数性がないと見なされる。もし試験試料のプロテオームプロフィールが標準試料のプロテオームプロフィールに対して固有の発現サインを示すならば、胎児は染色体異数性と診断される。
【００８５】
あるいは、またはさらに、試験試料のプロテオームプロフィールを、独立に当該の状態と診断された妊娠女性の生体液から得られた参照試料のプロテオームプロフィールと比較してもよい。この場合、もし試験試料のプロテオームプロフィールが参照試料のプロテオームプロフィールと固有の発現サインを表す少なくとも１種類の特徴、または特徴の組合せを共有するならば、胎児は病的状態と診断される。
【００８６】
本発明の方法において、標準的な生体試料のプロテオームプロフィールは診断上重要な役割を果たす。上記に論じたように、もし試験試料のプロテオームプロフィールが標準生体試料のプロテオームプロフィールと本質的に同じであれば、胎児は同定される染色体異数性ではないと診断される。差異が統計上有意であるならばデータを解析して決定される。
【００８７】
本発明の診断法の感受性は、本質的に同じ発現レベルで正常なプロテオームおよび病変プロテオームの両方で見出されるタンパク質（共通タンパク質、例えばアルブミンおよび免疫グロブリン）を解析の前に従来型のタンパク質分離法を用いて取り除くことにより高めることができる。固有の発現サインの一部でないこのような共通タンパク質を取り除くことによって、感受性および診断精度が改善される。あるいは、またはさらに、一般に機械によるスペクトル選択アルゴリズムを用いて結果をコンピュータ分析する間に、共通タンパク質の発現サインを排除して（またはシグナルを取り除いて）診断要求を行うことができる。下記実施例で詳述される結果は、統計学的に有意な形で母体の血清または羊水の標準プロテオームプロフィールとは異なる異数性の特徴を示すプロテオームプロフィールを提示する。さらに、実施例および同封の図は、個別のバイオマーカー、バイオマーカーの群、および異数性の特徴を示す固有の発現サインを同定する。
【００８８】
プロテオームプロフィールを比較するための統計的手法は当技術分野で周知である。例えば、質量スペクトルの場合、スペクトルの横軸に沿った主要な質量／電荷（Ｍ／Ｚ）ポジションでのピーク振幅値によってプロテオームプロフィールを定義する。従って、特徴的なプロテオームプロフィールは、例えば、所定のＭ／Ｚ値でのスペクトル振幅の組合せによって形成されたパターンによって特徴付けることができる。特徴的な発現サインの存在または不在、あるいは２つのプロフィールの実質的な同一性は、試験試料のプロテオームプロフィール（パターン）と参照試料または標準試料のプロテオームプロフィール（パターン）とを、適当なアルゴリズムを用いて照合することによって決定できる。プロテオームパターンを解析するための統計的手法は、例えば、Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＩＩＩ，ら、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３５９：５７２−７７（２００２）．； Ｉｓｓａｑら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２９２：５８７−９２（２００２）； Ｂａｌｌら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １８：３９５−４０４（２００２）；およびＬｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ， ４８：１２９６−１３０４（２００２）に開示されている。
【００８９】
特定の実施形態では、母親から得られた試料をタンパク質チップに適用し、質量分析によりプロテオームパターンを生成する。スペクトル内のピークのパターンは、上に記載されるように、適したバイオインフォマティクス・ソフトウェアによって解析することができる。
【００９０】
下記の実施例に示したデータは、胎児異数性の特徴を示すいくつかの固有の発現サインを提供する。例えば、図に示されるように、正常な母体血清の質量スペクトルと、約１２５〜１５０ｋＤ（領域１）、約６０〜６８ｋＤａ（領域２）、約５０〜５５ｋＤａ（領域３）、約４０〜４５ｋＤａ（領域４）、約３８〜４２ｋＤａ（領域５）、約１６〜２０ｋＤａ（領域６）、および約３５〜３５ｋＤａ（領域７）の分子量範囲で胎児が異数性を有している場合の母体血清の質量スペクトルとの間には特徴的な差異がある。羊水では、約６〜７ｋＤａおよび／または８〜１０ｋＤａの分子量範囲で特徴的な発現サインがある。従って、各々固有の発現サインを表す、質量スペクトル全体、または記載した領域のうちの１以上を、母体の血清を用いて胎児の異数性を診断するために用いることができる。さらに、これらの発現サインを含む質量スペクトル、または領域１〜７の１以上の任意の組合せを胎児異数性の診断法の陽性対照として用いることができる。さらに、またはあるいは、異数性を診断するための方法には、異数性を有する胎児を妊娠している女性の生体液（手短に言うと「異数性生体液」）中に差次的に発現した１種類以上のタンパク質、またはこのような差次的に発現したタンパク質の断片の検出が含まれ得る。差次的発現には、もし同種類の標準生体液中のその発現レベルに関して異数性生体液中のタンパク質の発現レベルの間に特徴的な差異があるならば、過剰発現および過少発現の両方が含まれる。
【００９１】
母体血清を用いる胎児異数性の検出に適したバイオマーカーは、表１、２、および５〜６に記載されている。母体羊水を用いる胎児異数性の検出に適したバイオマーカーは、表３に記載されている。母体血清および羊水中にそれぞれ存在する好ましいバイオマーカーは、表４に記載されている。診断アッセイは、表１〜６に記載される１種類以上のポリペプチドに基づくものであるか、または表１〜６に記載される１種類以上のポリペプチドのアッセイの一部として用いることができる。特定の実施形態では、表１〜６に記載される１〜２０、または１〜１５、または１〜２０、または１〜１５または１〜１０、または１〜９、または１〜８、または１〜７、または１〜６、または１〜５、または１〜４、または１〜３、または１または２個のバイオマーカーを、単独または他の異数性のバイオマーカーと組み合わせて、あるいは異数性の１以上の固有の発現サインと共に用いる。バイオマーカーの可能性のある組合せの例としては、以下が挙げられる：補体Ｈ因子と妊娠ゾーンタンパク質；補体Ｈ因子とアファミン；妊娠ゾーンタンパク質とα−２−ｈｓ−糖タンパク質；補体Ｈ因子、アンジオテンシノーゲンとクラステリン；アポリポタンパク質、ＡＭＢＰタンパク質と血漿レチノール結合タンパク質；補体Ｈ因子、アファミン、アンジオテンシノーゲンとクラステリン；補体Ｈ因子、アファミン、色素上皮由来因子、血清アミロイドＡタンパク質、アンジオテンシノーゲンとクラステリン；アポリポタンパク質Ｅ、ＡＭＢＰタンパク質、血漿レチノール結合タンパク質、血清トランスフェリン前駆体、α−２−マクログロブリン前駆体とヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体；インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１前駆体、補体成分Ｃ９前駆体、フィブリノゲンα／α−Ｅ鎖前駆体、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ前駆体、ロイシンリッチα−２−糖タンパク質前駆体、アポリポタンパク質Ｅ前駆体、フェチュイン−Ｂ前駆体と補体Ｃ４前駆体。しかし、注意すべきは、本発明がこれらの例に限定されず、むしろ可能性のある組合せの全ての順列が本発明において使用を見出すことができることである。
【００９２】
上記のように、異なるバイオマーカーおよび／または特徴的な発現サインの組合せは、診断精度を有意に改善するであろう。例えば、個別のバイオマーカーは一般に胎児異数性、例えばダウン症候群を、約３０％〜８０％の発生頻度で検出することができる。バイオマーカーおよび／または特徴的な発現サインの組合せでは、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％の精度を達成することができる。別個の生物学的経路を通じて独立に作用するバイオマーカーの組合せは、このような組合せが診断感受性を有意に増加させることが期待されることから、特に有利である。
【００９３】
本発明の診断法は、本質的に同じ検出率で、妊娠第一期および第二期に等しく適用可能できる。
【００９４】
本発明のスクリーニング法は、単独で用いた場合、突出した検出率および精度を提供するが、胎児異数性の検出のための既存のスクリーニング法と組み合わせることもできる。従って、本明細書における診断方法を、１以上の既知のバイオマーカー、例えばダウン症候群またはトリソミー１８の場合は、血清バイオマーカー、ＰＡＰＰ−Ａ、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（βｈＣＧ）、非結合型エストリオール（ｕＥ３）、およびインヒビンＡの１種類以上と組み合わせることができる。特に、本スクリーニング法は、ＰＡＰＰ−ＡおよびβｈＣＧを独立したバイオマーカーとして用いる検査、または、特にスクリーニングが妊娠第二期に行われる場合、ＡＦＰ、βｈＣＧ、およびｕＥ３に基づく３種類のマーカー血清検査と組み合わせることができる。検査は、追加として、または代わりに、インヒビン−Ａを含んでよい。本明細書に記載される診断方法と組み合わせてよい、他の染色体異数性を同定することのできるマーカーは、当技術分野で周知である。
【００９５】
本明細書におけるスクリーニングアッセイは、さらに、臨床または実験的使用で胎児異数性を検出するための他の手法と組み合わせるかあるいはそれらの手法で補うことができ、このような手法としては、経腹的および透過型超音波検査をはじめとする超音波検査；染色体異常を検査するための種々の技法；ならびに後頚部透過像（ＮＴ）測定が挙げられる。
【００９６】
（４．タンパク質および抗体アレイ）
上記に考察された診断アッセイは、タンパク質アレイを用いて行うことができる。近年、タンパク質アレイは、タンパク質を検出し、それらの発現レベルをモニターし、タンパク質相互作用および機能を調べるための強力な手段として広く認められるようになってきた。それらはハイスループットタンパク質解析を可能にし、自動化された手段を用いて多数の定量を同時に行うことができる。このような定量は、本来はＤＮＡアレイのために開発されたマイクロアレイまたはチップの形式で行われ、材料の使用は最小限であるが多量のデータを生成する。
【００９７】
２Ｄゲル電気泳動、２Ｄ液体クロマトグラフィー、および質量分析によるプロテオーム解析は上記のように非常に効果的であるが、必要とされる高い感受性を常に提供するものではなく、低量で発現する多くのタンパク質を逃しかねない。タンパク質マイクロアレイは、その高い効率に加えて、向上した感受性を提供する。
【００９８】
タンパク質アレイは、当技術分野で周知の種々の共有結合および非共有結合化学を用いて、固体表面、例えばガラス、シリコン、マイクロウェル、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ膜、およびマイクロビーズ上にタンパク質を固定化することにより形成される。固相支持体は、カップリング手順の前後に化学的に安定である必要があり、良好なスポット形状を可能にし、最小限の非特異結合を表示し、検出系のバックグラウンドとなってはならず、異なる検出系と両立すべきである。
【００９９】
概して、タンパク質マイクロアレイは、ＤＮＡアレイの読みに一般的に用いられるものと同じ検出方法を用いる。同様に、ＤＮＡマイクロアレイの読みに用いられるものと同じ器具をタンパク質アレイに適用できる。
【０１００】
従って、キャプチャーアレイ（例えば抗体アレイ）は、２種類の異なる供給源、例えば正常な生体液および病変生体液から蛍光標識されたタンパク質でプローブすることができる。この場合、読み出しは、標的タンパク質の発現レベルの変化を反映するものとして、蛍光シグナルの変化に基づく。それに代わる読み出しとしては、限定されないが、蛍光共鳴エネルギー移動、表面プラズモン共鳴、ローリングサークルＤＮＡ増幅、質量分析、共鳴光散乱、および原子間力顕微鏡が挙げられる。
【０１０１】
さらなる詳細には、例えば、Ｚｈｏｕ Ｈ，ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：Ｓ３４−９（２００１）；Ｚｈｕら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：４０−４５−（２００１）；ＷｉｌｓｏｎおよびＮｏｃｋ，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ４２：４９４−５００（２００３）；ならびにＳｃｈｗｅｉｔｚｅｒおよびＫｉｎｇｓｍｏｒｅ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３：１４−９（２００２）を参照のこと。生体分子アレイは、２００２年６月１８日公開の米国特許第６，４０６，９２１号にも開示されており、その全開示内容は参照により明白に本明細書に組み入れられる。
【０１０２】
本発明のさらなる詳細は以下の限定されない例から明らかとなる。
【実施例】
【０１０３】
（実施例Ｉ）
（母体血清および羊水試料で発現したタンパク質およびポリペプチドの同定）
（材料および方法）
母体血清および羊水試料の評価を行った（妊娠期間に一致）。
【０１０４】
【化１】
（ヒト血清において豊富なタンパク質の免疫除去）
Ａｇｉｌｅｎｔマルチプルアフィニティシステムを用いて、ヒト血清から６つの主なタンパク質（アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、抗トリプシン、トランスフェリン、およびハプトグロビン）を取り除いた。マルチプルアフィニティカラムは抗体−抗原相互作用、ならびに試料充填、洗浄、溶出、および再生のために最適化されたバッファーに基づいている。カラムによって６つの存在量の高いタンパク質（全タンパク質質量の８０〜９０％）、例えばアルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、抗トリプシン、トランスフェリン、およびハプトグロビンをヒト血清から取り除き、プロテオーム解析のための存在量の低いタンパク質を濃縮させる。
【０１０５】
ヒト血清（４０μｌ）を、ＡｇｉｌｅｎｔバッファーＡ（３５μｌの血清および１８０μｌのバッファーＡ）で５倍希釈した。微粒子を、１６，０００ｘｇにて１分間、０．２２μｍスピンフィルターで濾過することによって取り除いた。１６０μｌの希釈血清を、オートサンプラー、ＵＶ検出器、およびフラクションコレクターを備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムに付属するＡｇｉｌｅｎｔ免疫親和性カラム（４．６×１００ｍｍ）に注入した。流速は、最初の１０分間は０．５ｍｌ／分、Ｂは０％、１０〜１７分は１ｍｌ／分でＢは１００％、そして１７〜２８は１ｍｌ／分でＢは０％であった。５０００ＭＷＣＯフィルターを用いて、存在量の低い流入画分２〜５を回収し、濃縮し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．４でバッファー交換した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＤＣタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質濃度を決定した。
【０１０６】
（蛍光２−ＤＧＥ）
血清（１〜３ｍｇ）から存在量の高いタンパク質を、上記のように、Ａｇｉｌｅｎｔ免疫親和性カラムを用いて取り除いた。次に、血清タンパク質（２０〜５０μｇ）を、色素１００〜４００ｐｍ／タンパク質２０〜５０μｇの濃度のＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ Ｆｌｕｏｒ ｍｉｎｉｍａｌ ｄｙｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識した。異なる色素（Ｃｙ５、Ｃｙ３、およびＣｙ２）を用いて対照試料または試験試料または参照血清試料を標識した。標識タンパク質をアセトン沈殿により精製し、ＩＥＦバッファーに溶かし、２４または１３ｃｍのＩＰＧストリップ（ｐＨ４〜７）へ室温にて１２時間再水和した。再水和の後、ＩＰＧストリップを、６５〜７０ｋＶｈｒｓにて一次元電気泳動に付した。次に、二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の前にＩＰＧストリップをＤＴＴ平衡バッファーＩおよびＩＡＡ平衡バッファーＩＩで１５分間順次平衡化した。次に、ＩＰＧストリップを８〜１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せ、電気泳動を８０〜９０Ｖで１８時間実施して二次元でタンパク質を分離した。
【０１０７】
二次元の後、５５０〜６００の範囲のＰＭＴ電圧で適当なレーザーおよびフィルターを用いてＴｙｐｈｏｏｎ ９４００スキャナー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でゲルをスキャンした。選択された色を使って異なるチャネル（対照および検査）の画像を重ね合わせ、ＩｍａｇｅＱａｕｎｔソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて差異をモニターした。Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いてゲル画像の定量化を行った。
【０１０８】
タンパク質同定のため、血清タンパク質（５００ｇ〜１５００μｇ）を、標識せずに２−ＤＧＥに付した。ゲルをクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、画像化した。個々のスポットをゲルから切り出し、脱染し、ゲル内で３７℃にて２４時間トリプシン消化した。ペプチドを０．１％ ＴＦＡで抽出し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＺｉｐ Ｔｉｐｃ１８ピペットチップを用いて精製した。
【０１０９】
（ウエスタン免疫ブロット法および免疫沈降）
５０〜１００μｇの血清タンパク質を、２００Ｖにて６０分間４〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、９０ｍＡにて７５分間ＰＶＤＦ膜に移した。膜を５％ミルク−ＰＢＳＴで４５分間室温にてブロッキングし、１μｇ／ｍｌの一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ａｎｄ Ｄａｋｏ）で４℃にて一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、膜をＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体（Ｓｉｇｍａ）で室温にて９０分間インキュベートし、ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）で可視化した。免疫沈降のため、２０μｇの一次抗体を６００μｇの血清タンパク質と混合し、４℃にて一晩インキュベートした。次に、１５μｌのプロテインＧ−セファロースビーズを添加し、シェーカーで室温にて６０分間インキュベートした。溶出およびＰＡＧＥの前にビーズをＩＰバッファーで６回洗浄した。
【０１１０】
（母体血清のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ解析）
羊水および血清試料の合計０．５〜３．０μｇのタンパク質を順相ＮＰ２０（ＳｉＯ２表面）、逆相Ｈ４（疎水性表面：Ｃ−１６（長鎖脂肪族化合物）、または固定化したニッケル（ＩＭＡＣ）ＳＥＬＤＩタンパク質チップ（登録商標）アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）にスポットした。室温にて１時間のインキュベーションの後、ＮＰ１およびＨ４チップを５−μｌの水洗浄に付して結合しなかったタンパク質および妨害物質（すなわちバッファー、塩、洗剤）を除去した。２〜３分間風乾した後、シナピン酸の５０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）と０．５％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）との飽和溶液のうち０．５μｌを２適用分添加し、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ （ＰＢＳ ＩＩ）で飛行時間質量分析による質量分析を行った。
【０１１１】
（同位体コードアフィニティタグ（ＩＣＡＴ））
ＩＣＡＴは、対照試料および病変試料において、タンパク質の同定および差次的発現タンパク質の定量化データを提供することにより２ＤＧＥのいくつかの制限を克服するために用いられる最近開発された補完的技法である。ＩＣＡＴペプチド標識技術は、同位体組成の異なる反応プローブを用いることによりタンパク質の２つの集団を区別する。タンパク質上の遊離システインをアルキル化するタンパク質−反応性基（ヨードアセトアミド）、１２Ｃまたは１３Ｃ同位体標識されたリンカー領域、およびシステイン含有ペプチドを選択的に単離するための親和性（ビオチン）タグで構成される、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から市販されている、切断可能なＩＣＡＴ試薬を用いた。２つの試料、対照および病変試料を、同位体的に軽い（１２Ｃ）または重い（１３Ｃ）ＩＣＡＴ試薬でそれぞれ処理する。次に、標識されたタンパク質混合物を組み合わせ、タンパク質分解によって消化する。次に、ビオチン化ペプチドの固定化した単量体アビジンアフィニティーキャプチャーを用いて標識したペプチドを単離する。次に、標識されたペプチド上のビオチン標識を切断し、エレクトロスプレーイオン化法タンデム質量分析（ＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳ）と組み合わせたナノスケールの液体クロマトグラフィーによりペプチドを分析する。得られるＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＭＣＡＴソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて分析して対照および病変試料におけるタグペプチド対の相対存在量を判定し、大型タンパク質配列データベースを検索してこのタンパク質を同定する。対照は、比較分析のためタンパク質存在量のレベルを標準化するための内部標準として働く。存在比の増加または低下により上方制御または下方制御についての情報を提供する。
【０１１２】
（タンパク質の同定）
（データ獲得および解析）
トリプシンでのゲル内消化の後、Ｗａｔｅｒｓ ＣａｐＬＣに接続されているＷａｔｅｒｓハイブリッド四重極飛行時間質量分析計（Ｑ−Ｔｏｆ−２）で試料を解析した。Ｑ−Ｔｏｆ−２は標準のＺ−スプレーまたはナノスプレー源が備え付けられ、ＩｎｔｅｇｒａｆｒｉｔまたはＮａｎｏｅａｓｅ Ｃ１８ ７５μｍ ＩＤ×１５ｃｍ×３．５１μｍ熔融石英キャピラリーカラムに接続されている。Ｗｉｎｄｏｗｓ ＮＴ（登録商標）およびＭａｓｓＬｙｎｘ４．０ソフトウェアを備えたＣｏｍｐａｑワークステーションで機器を制御し、データを獲得した。Ｑ−Ｔｏｆ−２を、Ｇｌｕ１フィブリノペプチドＢを付属のＣａｐＬＣから直接注入または注射によって用いて較正した。データに従う（Ｄａｔａ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）解析を用いた。ＭＳ／ＭＳＭＳサーベイ法を用いてＭＳ／ＭＳＭＳスペクトルを得た。質量４００〜１５００ＤａをＭＳサーベイのためにスキャンし、質量５０〜１９００ＤａをＭＳ／ＭＳのためにスキャンした。一次データ解析を、Ｗｉｎｄｏｗｓ ２０００（登録商標）およびＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ２．１ （ＰＬＧＳ）ならびにＰＥＡＫＳデノボシーケンシングアルゴリズムおよび本発明者らの所有するＯｐｅｎＳｅａソフトウェアｖ１．１（Ｓｅａｒｌｅら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７６：２２２０−２２３０（２００４））を備えたＰＣで行った。
【０１１３】
（ＰＬＧＳ ｖ２．１）
タンデム質量スペクトル（ＭＳ／ＭＳ）の自動分析をＰＬＧＳ ｖ２．１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて行った。処理パラメータは、バックグラウンド除去を行わずに中程度または低度の同位体除去を用いた。処理の後、同位体を除去したＭＳ／ＭＳスペクトルを、データベース検索を含むワークフローおよびａｕｔｏｍｏｄを用いて、非重複性のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｅｘ （ＩＰＩ）ヒトデータベース（２０）で検索した。ワークフローにおいて、固定された修飾はカルバミドメチルＣであり、可変性の修飾は酸化 Ｍおよびリン酸化 ＳＴＹであった。データベース検索後に非特異的一次消化試薬を用いてａｕｔｏｍｏｄクエリーを実行して可能性のあるあらゆる修飾および置換を検索した。
【０１１４】
（ＯｐｅｎＳｅａ ｖ１．１）
質量に基づくアラインメントアルゴリズムであるＯｐｅｎＳｅａ ｖ１．１は、ＰＥＡＫＳによりデータから得たデノボ配列をデータベース中のタンパク質配列にアラインすることによりペプチドのＭＳ／ＭＳデータからタンパク質を同定する。ＯｐｅｎＳｅａは全てのアミノ酸文字を一連の質量に変換し、ダイナミックプログラミングアプローチを用いてこれらの質量を比較する。
【０１１５】
全てのＱ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳスペクトルを、Ｐｅａｋｓ Ｂａｔｃｈ Ｖｅｒｓｉｏｎ２．２（Ｍａら、Ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｒｏｍ ＭＳ／ＭＳ ｓｐｅｃｔｒｕｍ，ｉｎ １４ｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｍａｔｃｈｉｎｇ，２００３；Ｎｅｌｓｏｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６７：１１５３−８（１９９５））（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．，Ｗａｔｅｒｌｏｏ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、０．１ＡＭＵの質量精度を用いてデノボ配列決定した。Ｐｅａｋｓは、未知の質量領域なしに全アミノ酸配列を報告するが、その配列中の各アミノ酸に信頼度スコアを割り当てる。アミノ酸の信頼度スコアが５０％より低い配列領域をそれらのアミノ酸の組み合わせた質量で置き換えた。もし全配列の平均信頼度スコアが５０％よりも低ければ、平均信頼度よりも低い信頼度のアミノ酸だけを組み合わせた。全ての配列を、仮定上の親質量および断片質量の計算のためにモノアイソトピック質量を用いてＯｐｅｎＳｅａで解析し、全ての配列が０．２５ＡＭＵの質量精度で一致した。全ての試料を非重複性のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｅｘ（ＩＰＩ）ヒトデータベースで検索した。
【０１１６】
タンパク質を同定するために用いたパラメータは次の通りであった：１）タンパク質の説明の中に「ケラチン」という文字列を含むデータベース一致データはいずれも排除した；２）各タンパク質はＰＬＧＳ ｖ２．１およびＯｐｅｎＳｅａ ｖ１．１の両方で存在の可能性が９５％を上回らねばならない；ならびに３）各タンパク質は２種類以上のペプチドを有していなければならない。
【０１１７】
（質量分析に基づくバイオマーカーの検出のための免疫親和性アッセイ）
２−ＤＧＥ ＤＩＧＥ実験を用いて同定された、母体対照とダウン症候群血清との間で差次的に発現したタンパク質バイオマーカーは、タンパク質プロフィールに基づく胎児ダウン症候群の検出のためのハイスループットスクリーニング系の開発に適している。個々のタンパク質バイオマーカーを、免疫アフィニティー精製により母体の血清から捕捉し、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）により解析した。
【０１１８】
（試料調製およびバイオマーカー免疫沈降）
血清試料を、７００×ｇにて１５分間遠心分離して血液細胞を小球状にした。上清を−８０℃にて保存した。各血清試料（個々のバイオマーカー標的に対し各５０μＬ以下）を結合バッファーで希釈し、５０μｇの結合抗体で誘導体化した免疫親和性ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）とともにインキュベートした。ダウン症候群標的タンパク質を低いｐＨのカオトロピックバッファーを用いてビーズから溶出した。溶出液を脱塩し、ＺｉｐＴｉｐ（商標）Ｃ４ピペットチップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて濃縮し、疎水性／親水性対照ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ標的（ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ（商標）ＭＴＰ標的プレート、ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上に（シナピン酸マトリックスに沿って）直接スポットした。ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ標的は、試料分布および結晶化でさえも促進し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルの感受性を高くし、手動の「スイート・スポット」検索への依存を減らして、ハイスループット自動化に対して解析をさらに従順にする。
【０１１９】
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析）
溶出した完全なタンパク質バイオマーカーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析をＡｕｔｏｆｌｅｘ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて行った。Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの解像度仕様（シトクロムｃの解像度＝１０００、１２３６１ Ｄａ、 Ｒｓ＝ｍ／Δｍ（ＦＷＨＭ））は、タンパク質イソ型および修飾型の検出を可能にする。例えば、Ｎｅｌｓｏｎと共同研究者らは、たった５３Ｄａ（アポＥ２およびアポＥ３イソ型：それぞれ３４，２３６．６および３４，１８３．６Ｄａ）で質量の異なるアポリポタンパク質Ｅのイソ型を分離できた（２２８ Ａ．Ｔ．Ｂ．ｎ，母体の血清スクリーニング．Ｉｎ ＡＣＯＧ．１９９６ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｏｂｓｔｒｅｔｉｃｉａｎｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｓｔｓ）。ＭＡＬＤＩ−ＭＳを、大型ポリペプチドおよびタンパク質（＞５０００ｍ／ｚ）の検出のために陽極性を用いて遅延引き出し法、リニアモードで操作した。減衰した調節可能な５０Ｈｚ窒素レーザー（３３７ｎｍ）を１スペクトルあたり１００〜２００ショットで用いて質量スペクトルを得た。
【０１２０】
適切なシグナル対ノイズを考慮して、目的の特異的バイオマーカー標的の強度レベルに応じていくつかのスペクトルを組み合わせた。使用したＢｒｕｋｅｒ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計の質量精度は、リニア検出モード（＞５０００ｍ／ｚの質量の大きいポリペプチド／タンパク質の検出に用いられる）で内部キャリブレーション（ｍ／ｚ１２，３６１においてシトクロムｃに関して）を用いて＜１００ｐｐｍである。Ｂｒｕｋｅｒ ＭＴＰ ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ（商標）標的プレート上の４つのサンプルウェルの各セット間のキャリブレーションアンカーを利用して外部キャリブレーションを行う。対照試料およびダウン症候群試料から得られたＭＡＬＤＩ−ＭＳバイオマーカーイオンシグナルの処理後解析をＣｌｉｎＰｒｏ Ｔｏｏｌｓソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて行った。
【０１２１】
（結果）
（（Ａ）ダウン症候群を検出するためのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いるプロテオームプロフィール。）
対照およびダウン症候群を代表するタンパク質パターンをそれぞれ同定するため、方法に記載されるようにＡｇｉｌｅｎｔ免疫親和性カラムを用いて主に豊富なタンパク質を取り除くことにより最初に低分子量タンパク質を血清中で濃縮した。１〜２μｇの濃縮されたタンパク質試料のプロフィールを、４種類の異なる表面化学増強捕捉プロトコール（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｉｐ Ａｒｒａｙｓ）を用いてＳＥＬＤＩ−ＴＯＦにて生成した。Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｗｉｚａｒｄ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ， Ｉｎｃ．）を用いるデータ解析は、対照とダウン症候群血清とで別個のピークを明らかにした（図１）。試料のサブセットをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＴＯＦ−ＴＯＦ，Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）でさらに評価し（Ｋｅｒｓｅｙら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ４：１９８５−１９８８（２００４））、Ｃｌｉｎｐｒｏｔソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いてデータを解析した。このアプローチも、ダウン症候群試料において少数の別個のピークを明らかにした。これらの結果は、低分子量範囲でのダウン症候群の母体血清における潜在的差異が、ＳＥＬＤＩ／ＭＡＬＤＩプロファイリングにより検出され得ることを証明した。ダウン症候群に特有のこれらのプロフィールを利用する敏感かつ特異的アッセイは独自のハイスループットスクリーニング検査へと発展させることができる。
【０１２２】
（（Ｂ）蛍光２−ＤＧＥ。）
方法の項に記載されるように調製された母体血清試料の一致した対（対照およびダウン症候群）を蛍光色素（Ｃｙ５、Ｃｙ３およびＣｙ２）で標識し、２−Ｄゲルで分離した。ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘは、２−Ｄゲル、ならびに、対照およびダウン症候群試料とともにゲルの全てから分離した、固定した内部標準（プールした母体血清）を用いる半定量手順（２−Ｄプロフィール）を使って大量の試料をスクリーニングするための独自のハイスループットフォーマットを開発した。図１に示されるように、妊娠第二期母体血清試料は、対照およびダウン症候群の場合での明白な差異、ならびに妊娠第一期および第二期からのプロフィールの有意な類似性を明らかにした。強度比の定量化（Ｐｈｏｒｅｔｉｃｓソフトウェア、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア、ＳＡＳ解析）は、目的の重要な領域１〜７（図２に示されるように、高〜低分子量）が約４０〜８０％の範囲にある感受性を示したことを実証した。２以上の領域の組合せは、この一致対モデルにおいて全てのダウン症候群の場合を対照と区別することができた。
【０１２３】
目的のこれらの領域における可能性のあるタンパク質の同定のため、分取２−Ｄゲル（精製されたタンパク質１〜２ｍｇ）を妊娠第一期および第二期からの血清試料の３組の一致対から用いた。目的の領域からのスポット（図２、円で囲んだ領域）をパンチし、トリプシンで消化し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（Ｑ−ＴＯＦ２）で解析した。独自のプロテオームソフトウェア（ＯｐｅｎＳｅａ）を用いてタンパク質同定およびデータ解析を行った。目的の各領域は２〜３種類のタンパク質を示した（表１）。目的の領域に示されたタンパク質は、妊娠第一期および第二期血清試料の両方について同一であった。領域１〜７に示されない、母体の血清において差次的に発現したタンパク質を表２に列挙する。
【０１２４】
羊水試料の一致対（対照およびダウン症候群）を、上記のように蛍光色素（Ｃｙ５、Ｃｙ３およびＣｙ２）で分析し、２−Ｄゲルで分離した。デノボシーケンシングを用いて差次的に発現したタンパク質を同定し、および表３に列挙した。
【０１２５】
２Ｄ蛍光ゲルにおいて注目される相対的な定量的差異は、ウエスタンブロット法を用いて測定することができる。例として領域１に発現した主要タンパク質に対する抗体（補体Ｈ因子）を用いて、同様に２Ｄ蛍光ゲルに分離した母体血清２Ｄウエスタンブロットをプローブした。図４に示されるように、補体Ｈ因子は対照母体血清と比較してダウン症候群において、より高いレベルで発現した。このことは、同定されたタンパク質バイオマーカーが、母体の血清において胎児ダウン症候群を検出するための標準定量化免疫測定に用いることができることを実証する。
【０１２６】
図５はダウン症候群の候補バイオマーカーのデノボタンパク質配列同定の略図である。特に、この図は補体Ｈ因子に属するペプチド配列を表すスペクトルを示す。
【０１２７】
図６はダウン症候群の候補バイオマーカーのデノボタンパク質配列同定の異なる略図である。この図は補体Ｈ因子に属すると同定されたペプチド配列の配列適用範囲マップを示す。薄い陰影はポリペプチド配列内で同定されたペプチドを表し、濃い陰影を付けられたアミノ酸残基は示した位置での可能性のあるタンパク質修飾である。
【０１２８】
（バイオマーカーを測定するための免疫ＭＡＬＤＩアッセイの開発）
上に示されたように、蛍光２−Ｄゲル解析およびタンパク質同定は、妊娠第一期および第二期試料の両方の母体血清においてかなりの数の可能性のあるバイオマーカーを明らかにした。免疫ＭＡＬＤＩアッセイプラットフォームは、前例のない多成分解析の機会を提供する。このアッセイプラットフォームのもう１つの主な利点は、疾患に特異的なイソ型を捕捉できる能力である。このようなタンパク質分解断片またはタンパク質修飾を測るための正確なＥＬＩＳＡを開発することは非常に困難であろう。この例は、ダウン症候群を検出するために免疫ＭＡＬＤＩ技術を用いるハイスループットアッセイを開発する実現可能性を実証する。
【０１２９】
免疫ＭＡＬＤＩアッセイは、領域６および７で差次的に発現したタンパク質を同定するために開発された。この領域の２−Ｄゲルスポットからのタンパク質同定は、アポリポタンパク質ＡＩ、ＡＩＩ、およびＥの存在を証明する。対照およびダウン症候群試料の一致した対の母体血清試料６００μｇを用いてアポリポタンパク質の免疫沈降を行った。方法に記載されるようにＡｕｔｏｆｌｅｘ ＴＯＦ−ＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて溶出剤のプロフィール生成を行った。図３に示されるように、３種類全ての形態のアポリポタンパク質を検出し、アポリポタンパク質ＡＩＩは２つの試料間で有意な定量的差異を示した。さらに、アポリポタンパク質ＡＩＩ複合体もダウン症候群母体の血清において別個のイソ型を明らかにした。
【０１３０】
上記試料対のＭＡＬＤＩ解析は、対照血清と比較してダウン症候群血清においてアポＡ１の下方制御を示した。アポリポタンパク質Ａ２（アポＡ２）抗体を用いて同じセットの対照およびダウン症候群血清のＩＰ解析を行った場合、図３に示すＭＡＬＤＩプロフィールは、アポＡ２の相対強度がダウン症候群血清に対して対照血清において再び高かったことを示した（アポＡ２ ＭＷ＝８７０７．９Ｄａ）。さらに、ダウン症候群ＩＰに対して対照には異なる種類が存在した。従って、本発明者らのデータから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって、相対強度の変化ならびにバイオマーカーパターン変化の両方の評価が可能となることが証明される。
【０１３１】
この実験は、２−ＤＧＥ解析で同定された他のバイオマーカーおよび相対定量のためのコンピュータツール（ＣｌｉｎＰｒｏｔソフトウェア）の使用の最適化、ならびに診断プロフィールを作成するための統計アルゴリズムの最適化が、頑強なハイスループットアッセイ系を提供することを証明する。この系は他の可能性のある標的の添加によって、同じ設定において他の異数性を区別するために広げることができる。
【０１３２】
前記説明の全体にわたって、本発明は特定の一実施形態を参照して考察されているが、そのように限定されるものではない。実際、本明細書において示し説明したものに加えて、本発明の種々の修飾は前記の説明から当業者には明らかであり、付属の請求項の範囲内にある。
【０１３３】
（実施例ＩＩ）
（ダウン症候群において差次的に発現したタンパク質の分離および同定のための二次元液体クロマトグラフィー）
母体対照血清およびダウン症候群血清由来タンパク質の２Ｄ−ＤＩＧＥ解析を補う戦略として、完全なタンパク質を分離するための二次元液体クロマトグラフィー（２Ｄ−ＬＣ）法を用いることができる。２Ｄ−ＬＣ法は、対照血清試料とダウン症候群血清試料との間の差次的タンパク質発現の比較を可能にする仮想２Ｄマップを提供する。
【０１３４】
（試料調製および２Ｄ−ＬＣの方法論）
母体対照血清およびダウン症候群血清におけるタンパク質発現の比較分析のため、プールした母体の血清の一式を、妊娠第一期および妊娠第二期の患者から準備した。全ての血清を免疫精製し（Ａｇｉｌｅｎｔ）、ＣＦ適合性のためにバッファー交換した。５〜７ｍｇの全血清タンパク質を各試料にプールした。同量の全タンパク質を各対照／ダウン症候群試料対の２Ｄ−ＬＣ分析に用いた；妊娠第一期および第二期試料対を独立に分析した。
【０１３５】
２Ｄ−ＬＣ分析を、ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＦ２Ｄ系（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ；Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で行った。手短に言えば、血清タンパク質を一次元目のＣＦ陰イオン交換カラムに充填し、下降する直線ｐＨ勾配を用いてタンパク質等電点（ｐＩ／ｐＨ）に従って０．３ｐＨ単位の画分へ溶出する。次に、各ｐＨ画分を、無孔性Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを用いてタンパク質疎水性により二次元で分離する（各ｐＨ画分から４８画分）。質量分析によるタンパク質同定のためトリプシンで酵素消化される合計８００画分をＲＰ−ＨＰＬＣの次元から（各試料から）回収した。
【０１３６】
（回収した差次的画分のＭＳ解析）
図７は、妊娠第二期の母体ダウン症候群血清に対する母体対照血清の２Ｄ−ＬＣ分析により生成されたタンパク質発現マップを示す。図７Ａは、Ｘ軸にＣＦから溶出したタンパク質のｐＩを、Ｙ軸にＲＰ−ＨＰＬＣから溶出したタンパク質の保持時間、または疎水性を表示するＰｒｏｔｅｏＶｕｅソフトウェアを用いて生成された２Ｄ−ＬＣマップを表す。図７Ｂは、左側に赤色で表される対照試料の２Ｄマップ、および右側に緑色で表されるダウン症候群試料の２Ｄマップを表す。図の中央は２種類の試料の差分マップ（図７Ｂでは別々に表示）を表し、緑色に見えるバンドはダウン症候群試料において上方制御されたタンパク質であり、赤色に見えるバンドは対照試料において上方制御されたタンパク質である。
【０１３７】
ダウン症候群かまたは対照血清における上方制御を示す差分マップ中のバンドをトリプシンで消化させ、ＥＳＩ−ＱＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ（ＱＴＯＦ２，Ｗａｔｅｒｓ；Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いるタンパク質同定解析の準備をした。対照かまたはダウン症候群試料の高強度ピークの少なくとも１０〜２０％の差次的強度カットオフを用いると、これは妊娠第一期試料セットでは約９５バンド、妊娠第二期試料セットでは８０バンドに相当する。対照画分とダウン症候群画分と間の差次的発現強度は、０．００４ＡＵ〜０．６３８ＡＵであった（画分消化のＭＳ解析の検出の限界は、保存的に約０．０５ＡＵ；二次元目の分離のためのＡＵスケールは最大約１．３ＡＵに達する）。
【０１３８】
（母体のダウン症候群血清において差次的に発現したタンパク質の２Ｄ−ＬＣ同定）
表５は、ダウン症候群母体の血清においてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（Ｑ−ＴＯＦ２，Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ）解析で差次的ペプチド数を示す同定されたタンパク質の一覧を示す。（略語は、Ｔ１、妊娠第一期；Ｔ２、妊娠第二期母体の血清。）
（実施例ＩＩＩ）
（ダウン症候群の母体血清予測糖タンパク質プロフィール）
グリコシル化は、真核生物においてタンパク質の複合翻訳後修飾の１つである。単一のグリコシル化事象などの小さな変化が生理学的に重要なタンパク質の運命および機能を変え、それは次には生物の特定の疾患または状態に関連しうるので、グリコシル化プロセスの体系的評価は、タンパク質バイオマーカーの発掘に有益な手段である。細胞シグナルまたは発達段階に応じて発生するグリコシル化パターンまたはグリカン構造における変化を用いて癌などの疾患を同定することもあり得る。レクチンに基づくアフィニティー精製は、異なるクラスのグリコシル化タンパク質を単離するための選択法である。レクチンは植物タンパク質で、特異的かつ可逆的に糖タンパク質のグリカン部分と結合することができる。糖タンパク質の主要クラスおよび種類は試験試料から個別に単離することができ、それらを用いて疾患に対して対照を比較するための差次的グリコシル化プロフィールを生成することができる。
【０１３９】
（方法）
妊娠期間の一致した対照およびＤＳ母体の血清由来の全糖タンパク質、シアル酸、マンノースおよびＯ−グリコシル化タンパク質を、適当なレクチン親和性カラム（Ｑ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ、Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
【０１４０】
レクチン、マンノース結合レクチン（ＣｏｎＡ、ＬＣＨ、ＧＮＡ）＋シアル酸／Ｎ−アセチル−グルコサミン結合レクチン（ＷＧＡ、ＳＮＡ）の組合せを用いて全糖タンパク質抽出を行った。マンノース結合レクチン（ＣｏｎＡ、ＬＣＨ、ＧＮＡ）を利用してＭ結合糖タンパク質を抽出した。シアル酸／Ｎ−アセチル−グルコサミン結合レクチン（ＷＧＡ、ＳＮＡ、ＭＡＬ）を利用してＳ結合糖タンパク質を抽出した。ガラクトース／Ｎ−アセチル−ガラクトサミン結合レクチン（ＡＩＬ、ＰＮＡ）を利用してＯ結合糖タンパク質を抽出した。
【０１４１】
対照およびダウン症候群母体の血清から抽出した糖タンパク質を、二次元蛍光ゲル電気泳動およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳアプローチを用いて解析してダウン症候群の可能性のあるマーカーを同定した。単離された対照およびダウン症候群糖タンパク質各５０ｕｇを４００ｐｍのＣｙ３およびＣｙ５蛍光色素でそれぞれ標識した。Ｅｔｔａｎ Ｄａｌｔ ２ ＩＰＧｐｈｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ−Ａｍｒｅｓｈａｍ）のｐＨ４〜７ ＩＰＧストリップで各ＩＰＧストリップ長に適当な電圧を用いて等電点電気泳動を行った。１０〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲルを二次元目ＰＡＧＥに用いた。Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＣｙ３およびＣｙ５の励起波長を使って各ゲルの差次的蛍光画像を得た。質量分析計（Ｑ−ＴＯＦ ２、 Ｗａｔｅｒｓ Ｉｎｃ）でのタンパク質同定のために、差次的に発現したタンパク質スポットをＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）ソフトウェアを用いて可視化し、ゲルから切り出し、トリプシンで消化させた。
【０１４２】
図８〜１１は、ダウン症候群の母体血清中の糖タンパク質の固有の差次的発現プロフィールを表す。
【０１４３】
差異を示す領域の赤色または緑色を、ゲルから抜き出し、トリプシンで消化させ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いてタンパク質同定を確認した。
【０１４４】
妊娠第一期および第二期対照およびダウン症候群母体血清試料から抽出した全糖タンパク質混合物をトリプシンで消化させ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて解析した。差異を表す糖タンパク質（各タンパク質に対し多数の全ペプチド）を蓄積して、二次元ゲルから差次的に発現したスポットから同定された糖タンパク質と比較し、ダウン症候群母体血清において同定された糖タンパク質の一覧を表６に示す。
【０１４５】
本明細書の全体にわたって引用したあらゆる参照文献、およびその中で引用される参照文献は、その全文が参照により明白に本明細書に組み入れられる。
【０１４６】
【表１】
【０１４７】
【表２】
【０１４８】
【表３】
【０１４９】
【表４】
【０１５０】
【表５】
【０１５１】
【表６−１】
【０１５２】
【表６−２】
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】妊娠第二期対照およびダウン症候群試料の母体血清のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析。一番上のパネルは４つ全てが一致した例からプールされた対照を表す。２つの群間で差次的に発現する潜在的ピークを示す目的の領域を枠で囲んだ。
【図２】１００ｐｍのＣｕｓ５（ダウン症候群）またはＣｙ３（対照）で標識したＡｇｉｌｅｎｔ免疫親和性カラムを用いて精製された母体血清試料（タンパク質２０μｇ）の２−Ｄゲル。ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ ９４１００スキャナー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で６００ＰＭＴ電圧にてスキャンした。Ｐｈｏｒｅｔｉｃ ２Ｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて画像を重ね合わせた。
【図３】免疫−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳアッセイ。免疫沈降したアポリポタンパク質Ａ）．アポリポタンパク質Ａ１．Ｂ）．アポリポタンパク質Ａ２．Ｃ）．アポリポタンパク質Ｅの、母体対照由来のスペクトル（青色の痕跡）およびダウン症候群血清由来のスペクトル（赤色の痕跡）。パネルＤは、図２の２Ｄ ＤＩＧＥゲルから採取された挿入物で、これからいくつかのアポリポタンパク質種がタンデム質量分析により同定された。
【図４】母体血清における差次的タンパク質発現の検出。ヒト補体Ｈ因子抗体でプローブした２−Ｄウエスタン免疫ブロット法。Ａ）妊娠第二期対照血清；Ｂ）妊娠第二期ダウン症候群母体血清。
【図５】ダウン症候群の候補バイオマーカーのデノボタンパク質配列同定の略図。スペクトルは補体Ｈ因子に属するペプチド配列を表す。
【図６】ダウン症候群の候補バイオマーカーのデノボタンパク質配列同定の略図。補体Ｈ因子に属すると同定されたペプチド配列の配列範囲対象マップ。薄い陰影は同定されたペプチド、濃い陰影はこれらのアミノ酸の可能性のあるタンパク質修飾を表す。
【図７】回収した差次的２−Ｄ液体クロマトグラフィー画分のＭＳ分析。Ａ）ＰｒｏｔｅｏＶｕｅソフトウェアを用いて生成された２Ｄ−ＬＣマップは、Ｘ軸にＣＦから溶出したタンパク質のｐＩを表示し、Ｙ軸にＲＰ−ＨＰＬＣから溶出したタンパク質の保持時間、または疎水性を表示する。Ｂ）対照試料の２Ｄマップは左側に赤色で表され、ＤＳ試料の２Ｄマップは右側に緑色で表される。図の中央には２種類の試料の差分マップ（Ｂでは別々に表示）が表示され、マップ中、緑色に見えるバンドはＤＳ試料において上方制御されたタンパク質であり、赤色に見えるバンドは対照試料において上方制御されたタンパク質である。
【図８】妊娠第二期の対照（赤色）およびＤＳ（緑色）母体血清における全糖タンパク質の差次的発現を表す蛍光二次元ゲル画像。
【図９】妊娠第二期の対照（赤色）およびＤＳ（緑色）母体血清におけるシアル酸（Ｓｉａｌｉｃ）−糖タンパク質の差次的発現を表す蛍光二次元ゲル画像。
【図１０】妊娠第二期の対照（赤色）およびＤＳ（緑色）母体血清におけるマンノース結合糖タンパク質の差次的発現を表す蛍光二次元ゲル画像。
【図１１】妊娠第二期の対照（赤色）およびＤＳ（緑色）母体血清におけるＯ−結合糖タンパク質の差次的発現を表す蛍光二次元ゲル画像。
【図１２】全糖タンパク質のトリプシン消化のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ。対照の母体血清（上部）およびダウン症候群の母体血清（下部）。ダウン症候群で発現したペプチドの有意差が枠で囲まれている。
【図１３】シアル酸糖タンパク質のトリプシン消化のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ。対照の母体血清（上部）およびダウン症候群の母体血清（下部）。ダウン症候群で発現したペプチドの有意差が枠で囲まれている。
【図１４】マンノース結合糖タンパク質のトリプシン消化のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ。対照の母体血清（上部）およびダウン症候群の母体血清（下部）。ダウン症候群で発現したペプチドの有意差が枠で囲まれている。
【図１５】Ｏ−結合糖タンパク質のトリプシン消化のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ。対照の母体血清（上部）およびダウン症候群の母体血清（下部）。ダウン症候群で発現したペプチドの有意差が枠で囲まれている。
【図１６】１００ｐｍのＣｕｓ５（トリソミー１８）またはＣｙ３（対照）で標識したＡｇｉｌｅｎｔ免疫親和性カラムを用いて精製された母体血清試料（タンパク質２０μｇ）の２−Ｄゲル。ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ ９４１００スキャナー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で６００ＰＭＴ電圧にてスキャンした。Ｐｈｏｒｅｔｉｃ ２Ｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて画像を重ね合わせた。
【図１７】１００ｐｍのＣｕｓ５（トリソミー１３）またはＣｙ３（対照）で標識したＡｇｉｌｅｎｔ免疫親和性カラムを用いて精製された母体血清試料（タンパク質２０μｇ）の２−Ｄゲル。ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ ９４１００スキャナー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で６００ＰＭＴ電圧にてスキャンした。Ｐｈｏｒｅｔｉｃ ２Ｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて画像を重ね合わせた。
【図１８】１００ｐｍのＣｕｓ５（神経管欠損症）またはＣｙ３（対照）で標識したＡｇｉｌｅｎｔ免疫親和性カラムを用いて精製された母体血清試料（タンパク質２０μｇ）の２−Ｄゲル。ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ ９４１００スキャナー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で６００ＰＭＴ電圧にてスキャンした。Ｐｈｏｒｅｔｉｃ ２Ｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて画像を重ね合わせた。
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、胎児異数性の非侵襲性の早期診断のための方法に関する。特に、本発明は、母体の生体液、例えば母体血清また羊水において異数性の特徴を示すタンパク質発現パターンを同定することによる、胎児異数性の診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
（プロテオミクス）
タンパク質発現パターンの大規模解析は、現在のＤＮＡクローニングおよび遺伝子プロファイリングアプローチの重要かつ必要な補完技法として浮上している（非特許文献１）。ＤＮＡ配列情報は、ホモロジー法に基づいて何らかの構造上および可能性のあるタンパク質修飾を推論する際に有用であるが、翻訳後修飾、タンパク質分解または区分化によるタンパク質機能の調節に関する情報は得られない。
【０００３】
従来のゲルに基づく方法、例えば一次元および二次元ゲル電気泳動は小型タンパク質（タンパク質＜１，０００）の検出に有用であるが、それには大量の試料を必要とする（非特許文献２）。この制限を克服するためのアプローチとしては、試料中のタンパク質の質量を示すプロフィールを正確に生成するマトリックス支援レーザー脱離イオン化法または表面増強レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩまたはＳＥＬＤＩ）飛行時間型質量分析計が挙げられる。これらのパターンまたはプロフィールを用いると種々の疾患の同定およびモニターができる。同定の２番目の工程は、ペプチドマッピングとタンデム質量分析とを連結させて、ペプチド断片からアミノ酸配列情報を生成することによりもたらされる。これは、例えば、ＭＡＬＤＩ／ＳＥＬＤＩまたはＥＳＩを四重極の飛行時間型ＭＳ（Ｑｑ−ＴＯＦ ＭＳ）と連結させることにより実現することができる。この最後の方法は、特定のペプチドの定量化に用いることもできる（ＩＣＡＴ法）。
【０００４】
（胎児異数性）
胎児異数性は染色体数の異常であり、卵形成または精子形成中の減数分裂の不分離の結果として生ずることが多いが、トリソミー８などの特定の異数性は接合後の減数分裂分離に起因する場合がより多い（非特許文献３）。このような異常には正常な染色体数の減少および増加の両方が含まれ、常染色体ならびに性染色体に関係し得る。異数性の減少の例はターナー症候群で、Ｘ性染色体が１本しか存在しないことが特徴である。染色体数の増加の例としては、ダウン症候群（染色体２１のトリソミー）、パトー症候群（染色体１３のトリソミー）、エドワード症候群（染色体１８のトリソミー）、およびクラインフェルター症候群（性染色体のＸＸＹトリソミー）が挙げられる。異数性は一般に著しい身体的かつ神経学的障害を引き起こし、その結果多くの患者が成人期に達することができない。実際、１３、１８、または２１以外の染色体に関する常染色体異数性を有する胎児は一般に子宮の中で死亡する。しかし、特定の異数性、例えばクラインフェルター症候群は、あまり明白でない表現型を示し、他のトリソミー、例えばＸＸＹおよびＸＸＸの患者は、成熟して生殖能力のある成人となる場合も多い。
【０００５】
ダウン症候群は人間において最も一般的な単一パターンの形成異常であり、出生時に最も多く見られる重大な先天異常の１つであって、生児出生６６０人に１人の割合で起こる（非特許文献４）。妊娠第二期に生存しているダウン症候群の胎児全てのうち約３人に１人はその期間を生き抜くことができない；従って、妊娠第二期のダウン症候群の真の発生率は妊娠５００例中１例に近い（非特許文献５）。ダウン症候群の乳児の多数は、著しい罹患率および死亡率を引き起こす重大な心臓、胃腸、またはその他の異常を有する。さらに、大多数のダウン症候群の乳児のＩＱは５０未満であり、この症候群を米国における精神遅滞の主な原因の１つにしている。米国では毎年約２５００万人の妊娠女性がダウン症候群の血清スクリーニング検査を受けており、スクリーニングがなければ、これらの妊娠のうち約４、０００例がダウン症候群の子を出産する可能性がある（非特許文献６）。
【０００６】
ダウン症候群は生児出産において最も一般的な異数性であるものの、染色体１３、１８、および性染色体の異数性はかなりの数の個体に及んでいる。例えばトリソミー１８の発生率は、出生約７０００対１であり、トリソミー１３の発生率は出生約２９，０００対１である（非特許文献３）。その他の異数性は妊娠中に高い割合で発生するが、胎児が出産予定日になる前、通常妊娠１５週以内に自然流産となる（Ｎｉｃｏｌａｉｄｉｅｓ ＆ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、前掲）。例えば、トリソミー１６は最も一般的な単一のヒトトリソミーであり、認識される全ての妊娠の１．５％に起こると考えられているが、致死性の染色体異常である（非特許文献３）。トリソミー１５および８はより低い割合で発生するが（全ての自然流産のうちそれぞれ約１．４％および０．７％）これも致死性の異常である（非特許文献３）。
【０００７】
（胎児異数性の診断）
最終的な胎児異数性の出生前診断には、羊水穿刺または絨毛膜標本採取（ＣＶＳ）による侵襲的な検査を必要とし、これらの検査は０．５％〜１％の妊娠の喪失という処置に伴うリスクに関連している（非特許文献７）。胎児異数性、例えばダウン症候群に関するスクリーニングは異常のある胎児を妊娠することのリスクについての評価を患者に提供するため、一般に妊娠中に行われている。これらの侵襲的な検査法に関連するリスクのため、非侵襲的な異数性のスクリーニング法に多くの関心が集まっている。
【０００８】
特定の異数性との関連において様々なアプローチ法が用いられているものの、ダウン症候群の場合、スクリーニングは、最初は完全に母体の年齢を基準とし、３５歳という任意の境界で侵襲的な胎児検査の実施に値するハイリスクな女性の母集団を限定していた。このアプローチの結果、ダウン症候群の胎児の検出率は２０％〜３０％、侵襲的な胎児検査の割合は５％〜７％となる。従って、各例のダウン症候群を検出するために約１４０例の羊水穿刺が必要とされ、異常胎児が２人検出されるたびに正常な胎児１人が死亡する（非特許文献８）。
【０００９】
これらの制限のため、検出率を向上させ、侵襲的検査率を低下させるために妊娠第二期の血清スクリーニング法が導入された。現在のダウン症候群のスクリーニングの注意基準は、妊娠１５〜１８週の全ての患者に３種類のマーカー血清検査を行うことを求めており、これを母体の年齢（ＭＡ）とともにリスク判定に用いる。この検査はα−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（βｈＣＧ）、および非結合型エストリオール（ｕＥ３）を検定する。もしこの「３種類スクリーニング」から導かれるリスクが所定の境界より大きければ、患者は胎児核型分析のための侵襲的検査を提案される。最も一般的に用いられるリスク境界は、３８０対１（３５歳女性の出産予定日リスク）であり、この結果ダウン症候群の検出率は６５％〜７０％、侵襲的胎児検査を提案される妊娠母集団は５％〜７％である（非特許文献９）。ＭＡとこの妊娠第二期血清の「３種類スクリーニング」とを組み合わせて用いて１例のダウン症候群を検出するために６０例の羊水穿刺が行われると推測されている（非特許文献８）。
【００１０】
ダウン症候群の血清の「３種類スクリーニング」の現在の注意基準は今「４種類検査」へと発展中であり、この検査では血清マーカーインヒビン−Ａが他の３種類の分析物に加えられる。４種類検査は１９９６年８月からロンドンのＷｏｌｆｓｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ＭｅｄｉｃｉｎｅでＷａｌｄ教授の指揮下で臨床的に提案されてきた。毎日の診療でのインヒビン−Ａの成績は予想通りである。スクリーニングマーカーとしてのインヒビン−Ａの成績の評価は非常に一貫している。公表された６つの研究において、ダウン症候群妊娠の場合の母体の血清インヒビン−Ａレベルは、非罹患妊娠において見出されたレベルよりも平均して１．９倍高かった（非特許文献９）。インヒビン−Ａは、ダウン症候群妊娠の単変量予測因子として、最も強力な単一マーカーであるβｈＣＧとほぼ同程度と評価されている（固定されたスクリーニング陽性率５％で、βｈＣＧの検出率４９％と比較してインヒビン−Ａの検出率は４４％である。）（非特許文献９）。インヒビン−Ａを３種類検査に加えることにより、「３種類スクリーニング」のダウン症候群検出率が７７％から８０％へ、侵襲的な検査の比率は５％〜７％に改善されるであろう（非特許文献９；非特許文献１０）。あるいは、４種類の検査を用いてダウン症候群の検出率７０％を維持する一方で、侵襲的検査率を５％に減らし、実施される羊水穿刺の件数を有意に低下させることもできるであろう。
【００１１】
羊水穿刺の頻度をさらに減らす努力において、妊娠第二期スクリーニング超音波検査がダウン症候群スクリーニングに適用されている。特定の主な胎児の構造上の異常の同定は、ダウン症候群および他の異数性のリスクを著しく増加させ、その結果侵襲的な胎児検査の指標と考えられる。しかし、このアプローチはダウン症候群の集団スクリーニングを改善しない、というのも一般集団における９８％の胎児が構造上の異常を有していないためである。
【００１２】
それ自体は構造上の異常ではなく、標準的な核型の存在下で胎児に何らリスクを与えない異数性の超音波マーカーの役割を評価するさらなる研究が行われている。ダウン症候群スクリーニングに用いられるこのような超音波マーカーとしては、脈絡叢嚢胞、エコー源性腸管、短い大腿骨、短い上腕骨、微小な水腎症、および肥厚した後頚部襞が挙げられる。超音波検査によるアプローチはスクリーニング陽性率５％でダウン症候群の胎児の７３％まで同定する可能性があると何人かの研究者が示唆しているが、これらの研究は全て、既に異数性のリスクの高い母集団から導かれている（非特許文献１１）。これらの検査の成績をハイリスク母集団から一般集団または非選択集団まで正確に推定することは、問題とされる疾患の有病率は著しく減少するものであるため不可能である。従って、この「遺伝子の超音波検査」の価値は、一般集団のスクリーニングに適用された場合大幅に限定される。さらに、この知見の希薄さのため、超音波検査によるスクリーニング法の成績はオペレーターの技術と経験に非常に左右され、３次センターの外部で超音波検査によるスクリーニングを適用する場合は再現できない可能性がある（非特許文献１２）。「遺伝子の超音波検査」は一次スクリーニングツールとしては有用でないように思われるが、最初の陽性スクリーニング検査の後の異数性のリスクの減少に役割を有しうる（非特許文献８）。
【００１３】
ダウン症候群の妊娠第二期スクリーニングに関する主な問題は、それが妊娠１５〜１８週で行われること、続いて、必要であれば妊娠１６〜２０週で羊水穿刺診断が行われることである。このことは、一般的な妊娠期間の上限である妊娠２４週に達する前に妊娠中絶を望む場合、患者および医療提供者に著しい時間的制約をもたらす。さらに、このような後期の妊娠中絶は母体の罹患率の増加に関係する（非特許文献１３）。妊娠第一期を基にする超音波検査による異数性スクリーニングプログラムの価値には、異常が確認された場合の安全な妊娠中絶の方法、ならびに異常が妊娠の初期に検出された場合の患者のプライバシーおよび機密保持の向上が含まれるであろう。
【００１４】
ロンドンのＦｅｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎの研究者らは、ＭＡと妊娠第一期の胎児の超音波評価を組み合わせて用いるスクリーニングからダウン症候群の検出率８０％を示した（非特許文献１４；非特許文献１５）。これは、胎児の首の後部とその上を覆う皮膚との間の半透明の空間の測定に頼るもので、その空間がダウン症候群および他の異数性の胎児では大きくなっていることが報告されている。この後頚部透過像（ＮＴ）測定は、妊娠１０〜１４週の間の経腹的または経膣的超音波検査により達成が容易であると報告されている（非特許文献１６）。ダウン症候群の妊娠第一期スクリーニングを裏付ける大部分のデータはロンドンのＦｅｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎからのものである（非特許文献１４；非特許文献１６）。しかし、ダウン症候群の検出率は異なるセンター間で一致しておらず、現在まで、Ｆｅｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎネットワーク以外でかれらの結果を反復したセンターはない。
【００１５】
種々の妊娠関連タンパク質およびホルモンの妊娠第一期の濃度が、染色体的に正常な妊娠と異常な妊娠とで異なることを示すデータもある。ダウン症候群およびエドワード症候群に関する最も有望な２種類の妊娠第一期血清マーカーはＰＡＰＰ−Ａおよび遊離βｈＣＧであると思われる（非特許文献１７）。ＰＡＰＰ−Ａの妊娠第一期血清レベルがダウン症候群において有意に低いこと、およびこの低下が後頚部透過像（ＮＴ）の肥厚とは関係のないことが報告されている（非特許文献１８）。さらに、両方の合計および遊離β−ｈＣＧの妊娠第一期血清レベルがダウン症候群胎児において高いこと、およびこの増加も後頚部透過像（ＮＴ）の肥厚とは関係のないことが示されている（非特許文献１９）。ＰＡＰＰ−Ａおよび遊離βｈＣＧもまた、ダウン症候群スクリーニングに適用した場合、互いに関係がない（非特許文献２０）。多施設プロスペクティブ研究において、ＰＡＰＰ−Ａと遊離βｈＣＧとを組み合せると、ダウン症候群の検出率は６０％、侵襲的検査率は５％となった（非特許文献２１）。数理モデルは、ＭＡ、ＮＴ肥厚、遊離βｈＣＧ血清、およびＰＡＰＰ−Ａ血清を利用する複合妊娠第一期スクリーニングプログラムが、侵襲的検査率５％に対して８０％を超えるダウン症候群胎児を検出できると示唆している（非特許文献２０）。これらの治験およびモデルは最近Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓにより総説されている（非特許文献２２）。
【００１６】
これらのデータは、胎児異数性、例えばダウン症候群の複合妊娠第一期スクリーニングプログラムまたは妊娠第一期および第二期統合スクリーニングプログラムが、標準的な妊娠第二期スクリーニングよりも優れているであろうことを示唆しているが、この仮説は臨床現場ではまだ確認されていない。
【００１７】
ダウン症候群の妊娠第一期スクリーニングの有効性を明確にし、妊娠第一期および第二期スクリーニングの診断能力を比較するため、ＮＩＨは最近多施設の妊娠第一期および第二期リスク評価（Ｆｉｒｓｔ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄ Ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｉｓｋ；ＦＡＳＴＥＲ）試験に資金援助した。このプロスペクティブ研究では、患者がＮＴの超音波検査を受け、妊娠１０週と３日から１３週と６日までにＰＡＰＰ−Ａおよび遊離βｈＣＧのための母体血清を採取され、結果は妊娠１５週〜１８週と６日までの４種類スクリーニング（ＡＦＰ、βｈＣＧ、ｕＥ３、およびインヒビン−Ａ）を含む２次リスクスクリーニング後まで患者に知らされなかった。３８、０００名を超える患者がこの調査を完了し、その中から１１７例の胎児トリソミー２１が同定され、そのうち８７例で妊娠第一期および第二期のデータが揃った。各検査の診断能力は、複合妊娠第一期スクリーニング（ＮＴ／ＰＡＰＰ−Ａ／遊離βｈＣＧ／ＭＡ）；妊娠第二期血清スクリーニング（母体ＡＦＰ／遊離βｈＣＧ／ｕＥ３／インヒビン−Ａ／ＭＡ）；または妊娠第一期および第二期統合スクリーニングを含むスクリーニング法によって分析された。
【００１８】
これらのデータは妊娠第一期、または複合妊娠第一期および第二期統合スクリーニングの有用性を確認するものであるが、重大な制限がある。第一に、これらの検査が妊娠期間に大いに依存していること、および妊娠が進むにつれて差別的でなくなること。第二に、ダウン症候群の検出を最適化するために、これらの検査は全てスクリーニング陽性率が低く（５％）、真の偽陽性率が非常に高く（９０％を上回る）、その結果患者の不安、および遺伝子検査のための不必要な侵襲的な羊水穿刺をもたらす。従って、信頼性があり広い範囲の妊娠期間にわたって強く且つ偽陽性率の低いそれに変わる検査に対して差し迫った必要がある。
【非特許文献１】ＰａｎｄｅｙおよびＭａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ,２０００年,第４０５巻，ｐ．８３７−４６
【非特許文献２】Ｌｉｌｌｅｙ ＫＳ， Ｒａｚｚａｑ Ａ， Ｄｕｐｒｅｅ Ｐ，「Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ．」，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．，２００２年，第６巻，第１号，ｐ．４６−５０
【非特許文献３】ＮｉｃｏｌａｉｄｉｓおよびＰｅｔｅｒｓｅｎ，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，１９９８年，第１３巻，第２号，ｐ．３１３−３１９
【非特許文献４】Ｊｏｎｅｓ，Ｋ．，「Ｄｏｗｎ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ｉｎ Ｓｍｉｔｈ’ｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚａｂｌｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ」，Ｊｏｎｅｓ，Ｋ．編，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１９９７年，ｐ．８−１３
【非特許文献５】Ｃｕｃｋｌｅ，Ｈ．，「Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｏｗｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ， ｉｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｄｏｗｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｔｒｏｍｅｓｔｅｒ」，Ｊ．ＧｒｕｄｚｉｎｋａｓおよびＲ．Ｗａｒｄ編，ＲＣＯＧ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，１９９７年，ｐ．３−１３
【非特許文献６】Ｐａｌｏｍａｋｉ，Ｇ．Ｅ．，ら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．，１９９７年，第１７６巻，第５号，ｐ．１０４６−１０５１
【非特許文献７】Ｄ’Ａｌｔｏｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｓｅｍｉｎ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ，１９９４年，第１８巻，第３号，ｐ．１４０−６２
【非特許文献８】ＶｉｎｔｚｉｅｌｏｓおよびＥｇａｎ，Ａｍ Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ，１９９５年，第１７２巻，第３号，ｐ．８３７−４４
【非特許文献９】Ｗａｌｄら、Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｒｅｅｎ，１９９７年，第４巻，第４号，ｐ．１８１−２４６
【非特許文献１０】Ｗａｌｄら、Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ，１９９６年，第１６巻，第２号，ｐ．１４３−５３
【非特許文献１１】Ｂｅｎａｃｅｒｒａｆら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，１９９４年，第１９３巻，第１号，ｐ．１３５−４０
【非特許文献１２】Ｅｗｉｇｍａｎ、Ｂ．Ｇ．，ら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，１９９３年，第３２９巻，第１２号，ｐ．８２１−７
【非特許文献１３】Ｌａｗｓｏｎ，Ｈ．Ｗ．，ら、Ａｍ Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ，１９９４年，第１７１巻，第５号，ｐ．１３６５−７２
【非特許文献１４】Ｐａｎｄｙａ，Ｐ．Ｐ．ら、Ｂｒ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅａｃｏｌ，１９９５年，第１０２巻，第１２号，ｐ．９５７−６２
【非特許文献１５】Ｓｎｉｊｄｅｒｓ，Ｒ．Ｊ．，ら，Ｌａｎｃｅｔ，１９９８年，第３５２巻，第９１２５号，ｐ．３４３−６
【非特許文献１６】Ｓｎｉｊｄｅｒｓ，Ｒ．Ｊ．，ら，Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ，１９９６年，第７巻，第３号，ｐ．２１６−２６
【非特許文献１７】Ｗａｐｎｅｒ，Ｒ．，ら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２００３年，第３４９巻，第１５号，ｐ．１４０５−１４１３
【非特許文献１８】Ｂｒｉｚｏｔ，Ｍ．Ｌ．，ら，Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ，１９９４年，第８４巻，第６号，ｐ．９１８−２２
【非特許文献１９】Ｂｒｉｚｏｔ，Ｍ．Ｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎａｅｃｏｌ，１９９５年，第１０２巻，第２号，ｐ．１２７−３２
【非特許文献２０】ＷａｌｄおよびＨａｃｋｓｈａｗ，Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ，１９９７年，第１７巻，第９号，ｐ．９２１−９
【非特許文献２１】Ｈａｄｄｏｗ，Ｊ．Ｅ．，ら，Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ，１９９８年，第３３８巻，第１４号，ｐ．９５５−６１
【非特許文献２２】Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｉｎ Ｏｂｓｔｒｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，２００３年，第２１巻，ｐ．３１３−２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
ダウン症候群ならびに他の胎児異数性の診断のための新規で効率的で信頼のおける非侵襲性の方法の開発が特に望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の概要）
一態様では、本発明は、母体の生体液の試験試料のプロテオームプロフィールと、同じ種類の生体液の標準または参照プロテオームプロフィールとを比較すること、ならびに前記試験試料のプロテオームプロフィールが前記標準プロテオームプロフィールに存在しないかまたは前記参照プロテオームプロフィールに存在する、表１〜２および５〜６に記載されるバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを表す少なくとも１つの固有の発現サインを示す場合、胎児異数性の存在を決定することを含む、胎児異数性の診断のための方法に関する。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、母体の生体液の試験試料のプロテオームプロフィールと、同じ種類の生体液の標準または参照プロテオームプロフィールとを比較すること、ならびに前記試験試料のプロテオームプロフィールが前記標準プロテオームプロフィールに存在しないかまたは前記参照プロテオームプロフィールに存在する、表３に記載されるバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを表す少なくとも１つの固有の発現サインを示す場合、胎児異数性の存在を決定することを含む、胎児異数性の診断のための方法に関する。
【００２２】
一実施形態では、本発明は、妊娠ヒト女性から得られた試験試料の使用に関する。
【００２３】
本発明の他の実施形態では、プロテオームプロフィールは質量スペクトルである。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態では、試験試料は母体の血清である。
【００２５】
もう１つの実施形態では、固有の発現サインは、１６〜２０ｋＤａ、３５〜３８ｋＤａ、３８〜４２ｋＤａ、４０〜４５ｋＤａ、５０〜５５ｋＤａ、６０〜６８ｋＤａ、および１２５〜１５０ｋＤａの分子量範囲のうちの１以上にある。
【００２６】
他の実施形態では、試験試料は母体の羊水である。
【００２７】
他の実施形態では、固有の発現サインは６〜７ｋＤａおよび８〜１０ｋＤａの分子量範囲の一方または両方にある。
【００２８】
他の実施形態では、本方法を妊娠の第一期に行う。
【００２９】
他の実施形態では、本方法を妊娠の第二期に行う。
【００３０】
さらなる実施形態では、本方法は、試験試料において胎児異数性の少なくとも１種類のバイオマーカーの転写されたｍＲＮＡのレベルまたは翻訳されたタンパク質のレベルを測定すること、および前記転写されたｍＲＮＡのレベルまたは翻訳されたタンパク質のレベルが、標準生体試料におけるそのレベルに対して異なる場合に、胎児異数性の存在を確認することをさらに含む。
【００３１】
他の実施形態では、診断される胎児異数性は、ダウン症候群、トリソミー１３、トリソミー１８、Ｘ染色体トリソミー、Ｘ染色体モノソミー、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ遺伝子型）、またはＸＹＹ症候群（ＸＹＹ遺伝子型）である。
【００３２】
他の実施形態では、その転写されたｍＲＮＡのレベルまたは翻訳されたタンパク質のレベルを検出されるバイオマーカーは、ＰＡＰＰ−Ａ、ａ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｂｈＣＧ）、非結合型エストリオール（ｕＥ３）、およびインヒビンＡからなる群から選択される。
【００３３】
さらなる実施形態では、本方法は、妊娠ヒト女性を１種類以上のさらなる診断法に付すことをさらに含む。
【００３４】
他の実施形態では、さらなる診断法は、超音波検査、染色体異常を検査するための技法、および後頚部透過像（ＮＴ）測定からなる群から選択される。
【００３５】
さらなる実施形態では、本発明は１種類以上のバイオマーカーの固有の発現サインの比較を伴う。さらに、発現サインの数は２、３、４、５、６、７、８種類、またはそれより多くのバイオマーカーの数であり得る。
【００３６】
さらなる実施形態では、バイオマーカーは、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；妊娠ゾーンタンパク質（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｚｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＰＺＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２０７４１）；アファミン（ＡＦＡＭ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４３６５２）；アンジオテンシノーゲン（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；α−２−ｈｓ−糖タンパク質（Ａ２ＨＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６５）；クラステリン（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）；アポリポタンパク質ＡＩ（ＡＰＡ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４７）；アポリポタンパク質ＡＩＶ（ＡＰＡ４＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０６７２７）；アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ３６９５５）；血清アミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７３５）；ＡＭＢＰタンパク質（ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６０）；血漿レチノール結合タンパク質（ＲＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５３）；血清トランスフェリン前駆体（ＴＲＦＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７８７）；α−１−抗トリプシン前駆体（Ａ１ＡＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１００９）；α−２−マクログロブリン前駆体（Ａ２ＭＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２３）；補体Ｃ３前駆体（ＣＯ３＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２４）；アンジオテンシノーゲン前駆体（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；セルロプラスミン前駆体（ＣＥＲＵ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００４５０）；ハプトグロビン前駆体（ＨＰＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７３８）；抗トロンビン−ＩＩＩ前駆体（ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１００８）；ヘモペキシン前駆体（ＨＥＭＯ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７９０）；α−１−酸性糖タンパク質１前駆体（Ａ１ＡＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６３）；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ前駆体（ＡＰＡ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４７）；α １ｂ−糖タンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４２１７）；キニノゲン前駆体（ＫＮＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０４２−２）；インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ２前駆体（ＩＴＨ２＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１９８２３）；α−２−ｈｓ−糖タンパク質前駆体（Ａ２ＨＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６５）；α−１−抗キモトリプシン前駆体（ＡＡＣＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１１）；インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ４前駆体（ＩＴＨ４＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ１４６２４−２）；補体Ｈ因子前駆体（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３−１）；血漿プロテアーゼＣ１インヒビター前駆体（ＩＣ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０５１５５）；ヘパリン補因子ＩＩ前駆体（ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０５５４６）；補体Ｂ因子前駆体（ＣＦＡＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７５１−１）；α−２−糖タンパク質１、亜鉛（ＺＡ２Ｇ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２５３１１）；ビトロネクチン前駆体（ＶＴＮＣ＿ＨＵＭＡＮ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４００４）；インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１前駆体（ＩＴＨ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１９８２７）；補体成分Ｃ９前駆体（ＣＯ９＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７４８）；フィブリノゲンα／α−Ｅ鎖前駆体（ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６７１−１）；フィブリノゲンβ鎖前駆体（ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６７５）；フィブリノゲンγ鎖前駆体（ＦＩＢＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６７９−１）；プロトロンビン前駆体（ＴＨＲＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７３４）；クラステリン前駆体（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）；α−１Ｂ−糖タンパク質前駆体（Ａ１ＢＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４２１７）；α−１−酸性糖タンパク質２前駆体（Ａ１ＡＨ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１９６５２）；アポリポタンパク質Ｄ前駆体（ＡＰＯＤ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０５０９０）；妊娠ゾーンタンパク質前駆体（ＰＺＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２０７４２）；ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体（ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４１９６）；性ホルモン結合グロブリン前駆体（ＳＨＢＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４２７８−１）；プラスミノゲン前駆体（ＰＬＭＮ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７４７）；アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ前駆体（ＡＰＣ３＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６５６）；ロイシンリッチα−２−糖タンパク質前駆体（Ａ２ＧＬ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５０）；アポリポタンパク質Ｅ前駆体（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；フェチュイン−Ｂ前駆体（ＦＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＵＧＭ５）；ミオシン反応性免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＵＬ８３）；補体Ｃ１Ｓ成分前駆体（Ｃ１Ｓ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０９８７１）；ＡＭＢＰタンパク質前駆体（ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６０）；および補体Ｃ４前駆体（ＣＯ４＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２８）からなる群から選択される。
【００３７】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；および妊娠ゾーンタンパク質（ＰＺＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２０７４１）である。
【００３８】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；およびアファミン（ＡＦＡＭ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４３６５２）である。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、妊娠ゾーンタンパク質（ＰＺＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２０７４１）；およびα−２−ｈｓ−糖タンパク質（Ａ２ＨＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６５）である。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；アンジオテンシノーゲン（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；およびクラステリン（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）である。
【００４１】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；ＡＭＢＰタンパク質（ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６０）；および血漿レチノール結合タンパク質（ＲＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５３）である。
【００４２】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；アファミン（ＡＦＡＭ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４３６５２）；アンジオテンシノーゲン（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；およびクラステリン（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）である。
【００４３】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；アファミン（ＡＦＡＭ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４３６５２）；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ３６９５５）；血清アミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７３５）；アンジオテンシノーゲン（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；およびクラステリン（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）である。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；ＡＭＢＰタンパク質（ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６０）；血漿レチノール結合タンパク質（ＲＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５３）；血清トランスフェリン前駆体（ＴＲＦＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７８７）；α−２−マクログロブリン前駆体（Ａ２ＭＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２３）；およびヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体（ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４１９６）である。
【００４５】
特定の実施形態では、本発明で用いられるバイオマーカーは、インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１前駆体（ＩＴＨ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１９８２７）；補体成分Ｃ９前駆体（ＣＯ９＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７４８）；フィブリノゲンα／α−Ｅ鎖前駆体（ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６７１−１）；アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ前駆体（ＡＰＣ３＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６５６）；ロイシンリッチα−２−糖タンパク質前駆体（Ａ２ＧＬ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５０）；アポリポタンパク質Ｅ前駆体（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；フェチュイン−Ｂ前駆体（ＦＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＵＧＭ５）；および補体Ｃ４前駆体（ＣＯ４＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２８）である。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１種類の糖タンパク質を含むプロテオームプロフィールの使用を含む。
【００４７】
特定の実施形態では、本発明は、シアル酸糖タンパク質、マンノース結合糖タンパク質、およびＯ−結合糖タンパク質からなる群から選択されるプロテオームプロフィールに用いられる糖タンパク質を含む。
【００４８】
特定の実施形態では、本発明は、常染色体異数性である、胎児異数性の検出を含む。
【００４９】
さらなる実施形態では、本発明は、染色体１３、１８、または２１のトリソミーの検出を含む。
【００５０】
特定の実施形態では、本発明は、性染色体異数性である、胎児異数性の検出を含む。
【００５１】
さらなる実施形態では、本発明は、Ｘ染色体トリソミー、Ｘ染色体モノソミー、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ遺伝子型）、およびＸＹＹ症候群（ＸＹＹ遺伝子型）からなる群から選択される異数性の検出を含む。
【００５２】
（図表の簡単な説明）
表１． 目的の最初の７領域から同定されたダウン症候群の候補母体血清バイオマーカー（図２）。２Ｄスポットのゲル内消化のタンデムＭＳ／ＭＳ分析に続くデノボシーケンシングおよびＯｐｅｎＳｅａを用いるデータベース検索により、これらの領域における各タンパク質の相対存在量が明らかとなった。
【００５３】
表２． 同定されたダウン症候群の候補母体血清バイオマーカー。２Ｄスポットのゲル内消化のタンデムＭＳ／ＭＳ分析に続いてデノボシーケンシングおよびＯｐｅｎＳｅａを用いるデータベース検索により、これらの領域における各タンパク質の相対存在量が明らかとなった。
【００５４】
表３． 同定されたダウン症候群の候補羊水バイオマーカー。２Ｄスポットのゲル内消化のタンデムＭＳ／ＭＳ分析に続いてデノボシーケンシングおよびＯｐｅｎＳｅａを用いるデータベース検索により、これらの領域における各タンパク質の相対存在量が明らかとなった。
【００５５】
表４． 胎児のダウン症候群の診断に好ましい母体血清および羊水バイオマーカー。
【００５６】
表５． 目的の最初の領域から同定されたダウン症候群の候補母体血清バイオマーカー（図７）。タンデムＭＳ／ＭＳを用いて特異的な候補バイオマーカーを同定した。
【００５７】
表６． 目的の最初の領域から同定されたダウン症候群の候補母体血清バイオマーカー（図８〜１１）。タンデムＭＳ／ＭＳを用いて特異的な候補バイオマーカーを同定した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ａ．定義）
別に定義される場合を除いて、本明細書において用いられる技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４）は、本願で用いられる用語の多くに一般的な指針を当業者に提供する。
【００５９】
本明細書において用いられる用語「プロテオーム」は、所定の時点での生体試料中のタンパク質の大部分を説明するために用いられる。プロテオームの概念は基本的にゲノムとは異なる。ゲノムが実質的に静的なものであるのに対して、プロテオームは内的および外的事象に応じて絶えず変化する。
【００６０】
用語「プロテオームプロフィール」は、所定の時点での生体試料、例えば生体液中の複数のタンパク質の発現パターンの表現をさすために用いられる。プロテオームプロフィールは、例えば質量スペクトルとして表すことができるが、タンパク質、またはその断片の任意の物理化学的または生化学的特性に基づく他の表現も含まれる。従ってプロテオームプロフィールは、例えば、二次元ゲル電気泳動、例えば２−Ｄ ＰＡＧＥにより測定されるタンパク質の電気泳動特性の差異に基づいてよく、例えば二次元電気泳動ゲルでの複数のスポットとして表すことができる。あるいは、プロテオームプロフィールは、二次元液体クロマトグラフィーで測定されるタンパク質の等電点および疎水性に基づいてよく、例えばコンピュータにより生成された仮想二次元マップとして表すことができる。さらに、レクチンに基づくアフィニティー精製を、本明細書に記載される技法と組み合わせて、生体試料中に見出される種々のタンパク質の特異的グリコシル化特性を強調するプロテオームプロフィールを生成することができる。
【００６１】
差次的発現プロフィールは、たとえ特異的に同定されたタンパク質が存在しない場合であっても重要な診断価値を有しうる。例えば免疫ブロット法により、単一のタンパク質スポットまたはクロマトグラフ溶出剤がそれから検出でき、タンパク質マイクロアレイを用いて複数のスポット、溶出剤、またはタンパク質を同定することができる。プロテオームプロフィールは一般に、数ピークから５０以上のピークを表す複合プロフィールまでの範囲であり得る情報を表すかまたは含む。従って、例えば、プロテオームプロフィールは、少なくとも２種類、または少なくとも３種類、または少なくとも４種類、または少なくとも５種類、または少なくとも６種類、または少なくとも７種類、または少なくとも８種類、または少なくとも９種類、または少なくとも１０種類、または少なくとも１５種類、または少なくとも２０種類、または少なくとも２５種類、または少なくとも３０種類、または少なくとも３５種類、または少なくとも４０種類、または少なくとも４５種類、または少なくとも５０種類のタンパク質、および同種類のものを含むかまたは表しうる。
【００６２】
用語「固有の発現サイン」は、統計学的に有意な形で、対応する標準的な（同種の供給源、例えば生体液から得られた）生体試料のプロテオームプロフィールとは異なる、生体試料（例えば参照試料または試験試料）のプロテオームプロフィールの中の固有の特徴またはモチーフを説明するために用いられる。
【００６３】
用語「標準プロテオームプロフィール」は、異数性、または他の染色体異常を有さない胎児を妊娠している妊娠女性から得られた試験試料と同じ種類の母体生体液の生体試料のプロテオームプロフィールをさすために用いられる。
【００６４】
用語「参照プロテオームプロフィール」は、異数性を有する胎児を妊娠している妊娠女性から得られた試験試料と同じ種類の母体生体液の生体試料のプロテオームプロフィールをさすために用いられる。
【００６５】
「患者の応答」は、患者への利益を示す任意のエンドポイントを用いて評価することができ、このエンドポイントとしては、限定されないが、（１）病的状態の進行の（少なくともある程度の）阻害、（２）病的状態の予防、（３）病的状態に関連する１以上の症状の（少なくともある程度の）軽減；（４）処置後の生存期間の増加；および／または（５）処置後の所定の時点での死亡率の低下が挙げられる。
【００６６】
用語「処置」とは、対象が標的病的状態または障害を予防されるかまたは減速される（緩和される）、治療的な処置と予防的手段の両方をさす。処置の必要な者としては、既に障害のある者ならびに障害を有する傾向のある者または障害が予防されている者が挙げられる。
【００６７】
「先天性奇形」は、遺伝性ではないが出生時には存在している異常である。
【００６８】
診断アッセイの「感受性」または「診断感受性」は、疾患を有する人の中から疾患を発見する検査の確率、または検査結果が陽性であって、疾患を有する人の割合として定義される。統計用語では：感受性＝真陽性／（真陽性＋偽陽性）。
【００６９】
用語「１以上の」とは、本明細書においてプロテオミクスプロフィール、タンパク質マーカー、および固有の発現サインとの関連において、任意の順列での、グループ内の任意の１、２、３、４、その他の記載されたメンバーを意味するために用いられる。従って、用語「１以上の」には、グループ内で具体的に記載された任意の２、任意の３、任意の４その他のメンバーが挙げられる。明細書および請求項を通じて具体的な下位群が記載されているが、これらに限定されない。用語「１以上の」は広い意味で用いられ、複数のメンバーを含むグループ内の任意の下位群を示すために用いられるということに重点が置かれる。同様に、用語「少なくとも２」、「少なくとも３」、「少なくとも４」、その他は、組合せの中のメンバーの合計数が少なくとも３、少なくとも３、少なくとも４、その他であるならば、特定のグループ内のメンバーの任意の組合せを網羅する。
【００７０】
Ｂ．詳細な説明
本発明は、母体生体液のプロテオームプロフィールに基づく、胎児ダウン症候群および他の染色体異数性の早期の信用性のある非侵襲性の検査のための方法および手段に関する。本発明は当技術分野で周知のプロテオミクス技術を利用し、例えば、その内容が参照により明示的に本明細書に組み入れられる以下のテキストに記載される：Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ： Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｔａｃｔｉｃｅ），Ｍ．Ｒ．Ｗｉｌｋｉｎｓら、ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１００７；２−Ｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｎｄｒｅｗ Ｌ Ｌｉｎｋ， ｅｄｉｔｏｒ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９；Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ： Ｔｗｏ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｔａｃｔｉｃｅ），Ｔ．Ｒａｂｉｌｌｏｕｄ ｅｄｉｔｏｒ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，２０００；Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｔａｃｔｉｃｅ），Ｐ．Ｊａｍｅｓ ｅｄｉｔｏｒ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，２００１；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，Ｄ．Ｃ．Ｌｉｅｂｌｅｒ ｅｄｉｔｏｒ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２；Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒ．Ｗｅｓｔｅｒｍｅｉｅｒら、ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２００２。
【００７１】
当業者であれば、本明細書に記載されるものと類似しているかまたは同等である多くの方法および材料を理解するであろうし、それらを本発明の実践に用いてもよい。実際に、本発明は記載される方法および材料に一切限定されない。
【００７２】
（１．生体液中に発現したタンパク質およびポリペプチドの同定）
本発明によれば、生体液のプロテオミクス解析は、当技術分野で公知の種々の方法を用いて行うことができる。
【００７３】
一般に、異なる供給源由来の試料、例えば標準的な生体液（標準試料）および試験生体液（試験試料）のタンパク質パターン（プロテオームマップ）を比較して、疾患において上方制御または下方制御されているタンパク質を検出する。次にこれらのタンパク質を、例えばペプチドマスフィンガープリント法および／または質量分析とシーケンシング法を用いて、同定および完全な特性決定のために摘出するか、あるいは標準および／または疾患特異的プロテオームマップを直接目的の疾患の診断に用いるか、または疾患の存在もしくは不在を確認するために用いることができる。
【００７４】
比較分析では、タンパク質の相対存在量を正確に表し、正確な結果を得るために、標準試料と試験試料を全く同じように扱うことが重要である。必要とされる全タンパク質量は、用いる分析法によって決まり、当業者が容易に決定することができる。生体試料に存在するタンパク質は、一般に、それらのｐＩおよび分子量に従って二次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）で分離される。タンパク質はまず、等電点電気泳動（一次元ゲル電気泳動）を用いてそれらの電荷により分離される。この工程は、例えば、市販されている固定化されたｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップを用いて行うことができる。二次元目は集まったＩＰＧストリップを試料として用いる通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。２−ＤＥ分離後、クーマシーブルーまたは銀染色のような従来型の染料を用いてタンパク質を可視化し、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ ＧＳ８００デンシトメーターおよびＰＤＱＵＥＳＴソフトウェア（両方市販されている）などの既知の技術および装置を用いて画像化することができる。次に個々のスポットをゲルから切り出し、脱染し、トリプシン消化に付す。ペプチド混合物は質量分析（ＭＳ）で解析できる。
【００７５】
比較分析の代替法、およびこれらの種々の方法の組合せも、本発明の範囲内で使用されうる。例えば、生体試料中に存在するタンパク質を、下記実施例ＩＩに記載されるようにそれらの等電点および疎水性に従って二次元液体クロマトグラフィーにより分離してよい。限定されるものではないが、分子量、ｐＨ、または特異的結合親和性、例えば抗体−抗原相互作用に基づいて分離できる材料を含む広範囲の分離材料が当技術分野で周知であるので、当然、クロマトグラフ分離は疎水性に基づく必要はない。さらに、最初の分離工程が完了すると、個々のスポットまたは溶出液試料に存在するペプチドを、キャピラリー高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離し、個別にまたはプールでＭＳにより解析することができる。
【００７６】
実施例ＩＩＩに詳述されるように、グリコシル化は真核生物において重要な翻訳後タンパク質修飾であり、従って生体試料のグリコシル化の状態を分離および同定する系は、タンパク質バイオマーカーを発掘する際の有益な手段であり得る。レクチンに基づくアフィニティー精製は、異なるクラスのグリコシル化タンパク質を、それらの特異的かつ可逆的に糖タンパク質のグリカン部分と結合する能力によって単離するための選択法である。糖タンパク質の主要クラスおよび種類は個別に試験試料から単離することができ、ひとたび分離すると、質量分析を用いて疾患に対して対照を比較するための差次的グリコシル化プロフィールを生成することができる。
【００７７】
下に詳細に考察されるように、幅広い種類のレクチンおよびそれらの特異性が当技術分野で公知である。１種類以上のこれらのレクチン、ならびに任意の順列のこれらのレクチンおよび他のレクチンの可能性のある組合せを本発明の実践に用いることができる。マンノース結合レクチンは、限定されるものではないが、以下を含むことが知られている：分枝α−マンノース構造、高マンノース型、およびハイブリッド型ならびに二分岐複合型Ｎ−グリカンと結合する、タチナタマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）由来のコンカナバリンＡ；二分岐および三分岐複合型Ｎ−グリカンのフコシル化したコア領域と結合するレンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）由来のレンチルレクチン；ならびにα１−３およびα１−６結合高マンノース構造と結合するスノードロップ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ）由来のスノードロップレクチン。ガラクトース／Ｎ−アセチルガラクトサミン結合レクチンとしては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒと結合するトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）由来のトウゴマ凝集素（ＲＣＡ１２０）；Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｔ抗原）と結合するピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）由来のピーナッツ凝集素；（Ｓｉａ）Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｔ抗原）と結合するジャックフルーツ（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）由来のジャカリン；およびＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｔｎ−抗原）と結合するヘアリーベッチ（Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａ）由来のヘアリーベッチレクチン。シアル酸／Ｎ−アセチルグルコサミン結合レクチンとしては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、およびＮｅｕ５Ａｃ（シアル酸）と結合する小麦胚芽（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来の小麦胚凝集素；Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ（ＮＡｃ）−Ｒと結合するセイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ）由来のエルダーベリーレクチン；Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｇｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒと結合するイヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）由来のイヌエンジュレクチン。フコース結合レクチンとしては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌ−Ｒと結合するハリエニシダ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）由来のハリエニシダ凝集素；Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３／４）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、およびＲ２−ＧｌｃＮＡｃβ１−４（Ｆｕｃα１−６）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ１と結合するヒイロチャワンタケ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ）由来のヒイロチャワンタケレクチン。
【００７８】
質量分析計は、イオン源、質量分析器、イオン検出器、およびデータ収集ユニットから成る。最初に、イオン源でペプチドをイオン化する。次にイオン化したペプチドを質量分析器でそれらの質量対電荷比に従って分離し、分離したイオンを検出する。質量分析は、特にマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）およびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法の発明以来、タンパク質解析において広く用いられている。質量分析器にはいくつかの種類があり、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよび三連四重極型ＴＯＦ、またはＥＳＩと連結したイオントラップ質量分析器が挙げられる。従って、例えばＱ−Ｔｏｆ−２質量分析計は全質量スペクトル範囲にわたってイオンの同時検出を可能にする直交飛行時間分析器を利用する。さらなる詳細に関しては、例えばＣｈｅｍｕｓｅｖｉｃｈら、Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．３６：８４９−８６５（２００１）を参照のこと。
【００７９】
必要に応じて、ペプチド断片のアミノ酸配列および最終的にはそれらの由来するタンパク質のアミノ酸配列は、技術分野で公知の技術、例えば質量分析特定の変形形態、またはエドマン分解により決定することができる。
【００８０】
質量分析データから分枝の配列を決定する方法は、２００４年２月２７日出願の同時係属中の特許出願第１０／７８９，４２４号に開示されており、その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。この方法は、デノボシーケンシングおよびデータベース検索を含み、完全に配列決定されていないが配列データベースに存在する配列に近い配列相同性を有する配列変化および未知タンパク質を同定するために用いることもできる。
【００８１】
（２．染色体異数性）
染色体異常は周産期の罹患率および死亡率の原因となることが多い。染色体異常は生児出産２００対１の罹患率で発生する。これらの異常の主な原因は染色体異数性、つまり両親から受け継いだ染色体の数の異常である。最も頻度の高い染色体異数性の１つがトリソミー２１（ダウン症候群）であり、これは生児出産８００対１で発生する（Ｈｏｏｋ ＥＢ， Ｈａｍｅｒｔｏｎ Ｊ Ｌ：Ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｎｅｗｂｏｒｎ ｓｔｕｄｉｅｓ： Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔｕｄｉｅｓ： Ｒｅｓｕｌｔｓ ｂｙ ｓｅｘ ａｎｄ ｂｙ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ．Ｉｎ Ｈｏｏｋ ＥＢ， Ｐｏｒｔｅｒ ＩＨ（ｅｄｓ）： Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，６３−７９頁．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９７８）。トリソミー２１の主要なリスク因子は、３５以上の母体年齢であるが、トリソミー２１の子の８０％が３５歳よりも若い女性に生まれている。他の多く見られる異数性の状態としてはトリソミー１３および１８、ターナー症候群ならびにクラインフェルター症候群が挙げられる。
【００８２】
（３．生体液のプロテオームプロフィールまたは生体液で同定されたバイオマーカーを用いる胎児染色体異数性の診断）
本発明は、生体液、例えば、妊娠女性の羊水、血清、血漿、尿、脳脊髄液、母乳、粘液、または唾液のプロテオーム解析に基づく、早期かつ信頼性のある、非侵襲性の胎児染色体異数性の診断のための方法を提供する。
【００８３】
前に述べたように、本発明において用語「プロテオームプロフィール」は、所定の時点での生体試料、例えば生体液中の複数のタンパク質の発現パターンの表現をさすために用いられる。プロテオームプロフィールは、例えば質量スペクトルとして表すことができるが、タンパク質の任意の物理化学的または生化学的特性に基づく他の表現も含まれる。生体液のプロテオーム中に存在する全てまたは一部のタンパク質を同定および配列決定することが可能であるが、それは本発明に従って生成されたプロテオームプロフィールの診断使用に必要ではない。診断は、診断される染色体異数性、例えば胎児のダウン症候群が存在する場合に、標準プロテオームプロフィールと同じ環境下で得た同じ生体液のプロテオームプロフィールとの間の特徴的な差異（固有の発現サイン）に基づくものであってよい。固有の発現サインは、統計学的に有意な形で、同種類の供給源から得られた対応する標準生体試料のプロテオームプロフィールとは異なる、試験試料または参照生体試料のプロテオームプロフィールの中の何らかの固有の特徴またはモチーフであり得る。例えば、もしプロテオームプロフィールが質量スペクトルの形で示されるならば、固有の発現サインは、一般に、対応する正常な試料の質量スペクトルとは質的にも量的にも異なるピークまたはピークの組合せである。従って、質量スペクトルにおける新規なピークまたは新規なピークの組合せの出現、あるいは質量スペクトルにおける既存のピークまたは既存のピークの組合せの振幅または形状における何らかの統計上有意な変化は、固有の発現サインとみなすことができる。妊娠女性被験体から得られた試験試料のプロテオームプロフィールを、染色体異数性の特徴を示す固有の発現サインを含む参照試料のプロテオームプロフィールと比較した時に、もし試験試料が固有の発現サインを参照試料と共有しているならば、その胎児はこのような染色体異数性と診断される。
【００８４】
特定の染色体異数性、例えば胎児ダウン症候群は、試験される母体被験体から得られた生体液のプロテオームプロフィールと、同じように得られて処理された同種類の標準生体液のプロテオームプロフィールとを比較することにより診断され得る。もし試験試料のプロテオームプロフィールが標準試料のプロテオームプロフィールと本質的に同じであれば、胎児は試験された染色体異数性がないと見なされる。もし試験試料のプロテオームプロフィールが標準試料のプロテオームプロフィールに対して固有の発現サインを示すならば、胎児は染色体異数性と診断される。
【００８５】
あるいは、またはさらに、試験試料のプロテオームプロフィールを、独立に当該の状態と診断された妊娠女性の生体液から得られた参照試料のプロテオームプロフィールと比較してもよい。この場合、もし試験試料のプロテオームプロフィールが参照試料のプロテオームプロフィールと固有の発現サインを表す少なくとも１種類の特徴、または特徴の組合せを共有するならば、胎児は病的状態と診断される。
【００８６】
本発明の方法において、標準的な生体試料のプロテオームプロフィールは診断上重要な役割を果たす。上記に論じたように、もし試験試料のプロテオームプロフィールが標準生体試料のプロテオームプロフィールと本質的に同じであれば、胎児は同定される染色体異数性ではないと診断される。差異が統計上有意であるならばデータを解析して決定される。
【００８７】
本発明の診断法の感受性は、本質的に同じ発現レベルで正常なプロテオームおよび病変プロテオームの両方で見出されるタンパク質（共通タンパク質、例えばアルブミンおよび免疫グロブリン）を解析の前に従来型のタンパク質分離法を用いて取り除くことにより高めることができる。固有の発現サインの一部でないこのような共通タンパク質を取り除くことによって、感受性および診断精度が改善される。あるいは、またはさらに、一般に機械によるスペクトル選択アルゴリズムを用いて結果をコンピュータ分析する間に、共通タンパク質の発現サインを排除して（またはシグナルを取り除いて）診断要求を行うことができる。下記実施例で詳述される結果は、統計学的に有意な形で母体の血清または羊水の標準プロテオームプロフィールとは異なる異数性の特徴を示すプロテオームプロフィールを提示する。さらに、実施例および同封の図は、個別のバイオマーカー、バイオマーカーの群、および異数性の特徴を示す固有の発現サインを同定する。
【００８８】
プロテオームプロフィールを比較するための統計的手法は当技術分野で周知である。例えば、質量スペクトルの場合、スペクトルの横軸に沿った主要な質量／電荷（Ｍ／Ｚ）ポジションでのピーク振幅値によってプロテオームプロフィールを定義する。従って、特徴的なプロテオームプロフィールは、例えば、所定のＭ／Ｚ値でのスペクトル振幅の組合せによって形成されたパターンによって特徴付けることができる。特徴的な発現サインの存在または不在、あるいは２つのプロフィールの実質的な同一性は、試験試料のプロテオームプロフィール（パターン）と参照試料または標準試料のプロテオームプロフィール（パターン）とを、適当なアルゴリズムを用いて照合することによって決定できる。プロテオームパターンを解析するための統計的手法は、例えば、Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ＩＩＩ，ら、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３５９：５７２−７７（２００２）．； Ｉｓｓａｑら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２９２：５８７−９２（２００２）； Ｂａｌｌら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １８：３９５−４０４（２００２）；およびＬｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ， ４８：１２９６−１３０４（２００２）に開示されている。
【００８９】
特定の実施形態では、母親から得られた試料をタンパク質チップに適用し、質量分析によりプロテオームパターンを生成する。スペクトル内のピークのパターンは、上に記載されるように、適したバイオインフォマティクス・ソフトウェアによって解析することができる。
【００９０】
下記の実施例に示したデータは、胎児異数性の特徴を示すいくつかの固有の発現サインを提供する。例えば、図に示されるように、正常な母体血清の質量スペクトルと、約１２５〜１５０ｋＤ（領域１）、約６０〜６８ｋＤａ（領域２）、約５０〜５５ｋＤａ（領域３）、約４０〜４５ｋＤａ（領域４）、約３８〜４２ｋＤａ（領域５）、約１６〜２０ｋＤａ（領域６）、および約３５〜３５ｋＤａ（領域７）の分子量範囲で胎児が異数性を有している場合の母体血清の質量スペクトルとの間には特徴的な差異がある。羊水では、約６〜７ｋＤａおよび／または８〜１０ｋＤａの分子量範囲で特徴的な発現サインがある。従って、各々固有の発現サインを表す、質量スペクトル全体、または記載した領域のうちの１以上を、母体の血清を用いて胎児の異数性を診断するために用いることができる。さらに、これらの発現サインを含む質量スペクトル、または領域１〜７の１以上の任意の組合せを胎児異数性の診断法の陽性対照として用いることができる。さらに、またはあるいは、異数性を診断するための方法には、異数性を有する胎児を妊娠している女性の生体液（手短に言うと「異数性生体液」）中に差次的に発現した１種類以上のタンパク質、またはこのような差次的に発現したタンパク質の断片の検出が含まれ得る。差次的発現には、もし同種類の標準生体液中のその発現レベルに関して異数性生体液中のタンパク質の発現レベルの間に特徴的な差異があるならば、過剰発現および過少発現の両方が含まれる。
【００９１】
母体血清を用いる胎児異数性の検出に適したバイオマーカーは、表１、２、および５〜６に記載されている。母体羊水を用いる胎児異数性の検出に適したバイオマーカーは、表３に記載されている。母体血清および羊水中にそれぞれ存在する好ましいバイオマーカーは、表４に記載されている。診断アッセイは、表１〜６に記載される１種類以上のポリペプチドに基づくものであるか、または表１〜６に記載される１種類以上のポリペプチドのアッセイの一部として用いることができる。特定の実施形態では、表１〜６に記載される１〜２０、または１〜１５、または１〜２０、または１〜１５または１〜１０、または１〜９、または１〜８、または１〜７、または１〜６、または１〜５、または１〜４、または１〜３、または１または２個のバイオマーカーを、単独または他の異数性のバイオマーカーと組み合わせて、あるいは異数性の１以上の固有の発現サインと共に用いる。バイオマーカーの可能性のある組合せの例としては、以下が挙げられる：補体Ｈ因子と妊娠ゾーンタンパク質；補体Ｈ因子とアファミン；妊娠ゾーンタンパク質とα−２−ｈｓ−糖タンパク質；補体Ｈ因子、アンジオテンシノーゲンとクラステリン；アポリポタンパク質、ＡＭＢＰタンパク質と血漿レチノール結合タンパク質；補体Ｈ因子、アファミン、アンジオテンシノーゲンとクラステリン；補体Ｈ因子、アファミン、色素上皮由来因子、血清アミロイドＡタンパク質、アンジオテンシノーゲンとクラステリン；アポリポタンパク質Ｅ、ＡＭＢＰタンパク質、血漿レチノール結合タンパク質、血清トランスフェリン前駆体、α−２−マクログロブリン前駆体とヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体；インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１前駆体、補体成分Ｃ９前駆体、フィブリノゲンα／α−Ｅ鎖前駆体、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ前駆体、ロイシンリッチα−２−糖タンパク質前駆体、アポリポタンパク質Ｅ前駆体、フェチュイン−Ｂ前駆体と補体Ｃ４前駆体。しかし、注意すべきは、本発明がこれらの例に限定されず、むしろ可能性のある組合せの全ての順列が本発明において使用を見出すことができることである。
【００９２】
上記のように、異なるバイオマーカーおよび／または特徴的な発現サインの組合せは、診断精度を有意に改善するであろう。例えば、個別のバイオマーカーは一般に胎児異数性、例えばダウン症候群を、約３０％〜８０％の発生頻度で検出することができる。バイオマーカーおよび／または特徴的な発現サインの組合せでは、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％の精度を達成することができる。別個の生物学的経路を通じて独立に作用するバイオマーカーの組合せは、このような組合せが診断感受性を有意に増加させることが期待されることから、特に有利である。
【００９３】
本発明の診断法は、本質的に同じ検出率で、妊娠第一期および第二期に等しく適用可能できる。
【００９４】
本発明のスクリーニング法は、単独で用いた場合、突出した検出率および精度を提供するが、胎児異数性の検出のための既存のスクリーニング法と組み合わせることもできる。従って、本明細書における診断方法を、１以上の既知のバイオマーカー、例えばダウン症候群またはトリソミー１８の場合は、血清バイオマーカー、ＰＡＰＰ−Ａ、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（βｈＣＧ）、非結合型エストリオール（ｕＥ３）、およびインヒビンＡの１種類以上と組み合わせることができる。特に、本スクリーニング法は、ＰＡＰＰ−ＡおよびβｈＣＧを独立したバイオマーカーとして用いる検査、または、特にスクリーニングが妊娠第二期に行われる場合、ＡＦＰ、βｈＣＧ、およびｕＥ３に基づく３種類のマーカー血清検査と組み合わせることができる。検査は、追加として、または代わりに、インヒビン−Ａを含んでよい。本明細書に記載される診断方法と組み合わせてよい、他の染色体異数性を同定することのできるマーカーは、当技術分野で周知である。
【００９５】
本明細書におけるスクリーニングアッセイは、さらに、臨床または実験的使用で胎児異数性を検出するための他の手法と組み合わせるかあるいはそれらの手法で補うことができ、このような手法としては、経腹的および透過型超音波検査をはじめとする超音波検査；染色体異常を検査するための種々の技法；ならびに後頚部透過像（ＮＴ）測定が挙げられる。
【００９６】
（４．タンパク質および抗体アレイ）
上記に考察された診断アッセイは、タンパク質アレイを用いて行うことができる。近年、タンパク質アレイは、タンパク質を検出し、それらの発現レベルをモニターし、タンパク質相互作用および機能を調べるための強力な手段として広く認められるようになってきた。それらはハイスループットタンパク質解析を可能にし、自動化された手段を用いて多数の定量を同時に行うことができる。このような定量は、本来はＤＮＡアレイのために開発されたマイクロアレイまたはチップの形式で行われ、材料の使用は最小限であるが多量のデータを生成する。
【００９７】
２Ｄゲル電気泳動、２Ｄ液体クロマトグラフィー、および質量分析によるプロテオーム解析は上記のように非常に効果的であるが、必要とされる高い感受性を常に提供するものではなく、低量で発現する多くのタンパク質を逃しかねない。タンパク質マイクロアレイは、その高い効率に加えて、向上した感受性を提供する。
【００９８】
タンパク質アレイは、当技術分野で周知の種々の共有結合および非共有結合化学を用いて、固体表面、例えばガラス、シリコン、マイクロウェル、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ膜、およびマイクロビーズ上にタンパク質を固定化することにより形成される。固相支持体は、カップリング手順の前後に化学的に安定である必要があり、良好なスポット形状を可能にし、最小限の非特異結合を表示し、検出系のバックグラウンドとなってはならず、異なる検出系と両立すべきである。
【００９９】
概して、タンパク質マイクロアレイは、ＤＮＡアレイの読みに一般的に用いられるものと同じ検出方法を用いる。同様に、ＤＮＡマイクロアレイの読みに用いられるものと同じ器具をタンパク質アレイに適用できる。
【０１００】
従って、キャプチャーアレイ（例えば抗体アレイ）は、２種類の異なる供給源、例えば正常な生体液および病変生体液から蛍光標識されたタンパク質でプローブすることができる。この場合、読み出しは、標的タンパク質の発現レベルの変化を反映するものとして、蛍光シグナルの変化に基づく。それに代わる読み出しとしては、限定されないが、蛍光共鳴エネルギー移動、表面プラズモン共鳴、ローリングサークルＤＮＡ増幅、質量分析、共鳴光散乱、および原子間力顕微鏡が挙げられる。
【０１０１】
さらなる詳細には、例えば、Ｚｈｏｕ Ｈ，ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：Ｓ３４−９（２００１）；Ｚｈｕら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：４０−４５−（２００１）；ＷｉｌｓｏｎおよびＮｏｃｋ，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ４２：４９４−５００（２００３）；ならびにＳｃｈｗｅｉｔｚｅｒおよびＫｉｎｇｓｍｏｒｅ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３：１４−９（２００２）を参照のこと。生体分子アレイは、２００２年６月１８日公開の米国特許第６，４０６，９２１号にも開示されており、その全開示内容は参照により明白に本明細書に組み入れられる。
【０１０２】
本発明のさらなる詳細は以下の限定されない例から明らかとなる。
【実施例】
【０１０３】
（実施例Ｉ）
（母体血清および羊水試料で発現したタンパク質およびポリペプチドの同定）
（材料および方法）
母体血清および羊水試料の評価を行った（妊娠期間に一致）。
【０１０４】
【化１】
（ヒト血清において豊富なタンパク質の免疫除去）
Ａｇｉｌｅｎｔマルチプルアフィニティシステムを用いて、ヒト血清から６つの主なタンパク質（アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、抗トリプシン、トランスフェリン、およびハプトグロビン）を取り除いた。マルチプルアフィニティカラムは抗体−抗原相互作用、ならびに試料充填、洗浄、溶出、および再生のために最適化されたバッファーに基づいている。カラムによって６つの存在量の高いタンパク質（全タンパク質質量の８０〜９０％）、例えばアルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、抗トリプシン、トランスフェリン、およびハプトグロビンをヒト血清から取り除き、プロテオーム解析のための存在量の低いタンパク質を濃縮させる。
【０１０５】
ヒト血清（４０μｌ）を、ＡｇｉｌｅｎｔバッファーＡ（３５μｌの血清および１８０μｌのバッファーＡ）で５倍希釈した。微粒子を、１６，０００ｘｇにて１分間、０．２２μｍスピンフィルターで濾過することによって取り除いた。１６０μｌの希釈血清を、オートサンプラー、ＵＶ検出器、およびフラクションコレクターを備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムに付属するＡｇｉｌｅｎｔ免疫親和性カラム（４．６×１００ｍｍ）に注入した。流速は、最初の１０分間は０．５ｍｌ／分、Ｂは０％、１０〜１７分は１ｍｌ／分でＢは１００％、そして１７〜２８は１ｍｌ／分でＢは０％であった。５０００ＭＷＣＯフィルターを用いて、存在量の低い流入画分２〜５を回収し、濃縮し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．４でバッファー交換した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＤＣタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質濃度を決定した。
【０１０６】
（蛍光２−ＤＧＥ）
血清（１〜３ｍｇ）から存在量の高いタンパク質を、上記のように、Ａｇｉｌｅｎｔ免疫親和性カラムを用いて取り除いた。次に、血清タンパク質（２０〜５０μｇ）を、色素１００〜４００ｐｍ／タンパク質２０〜５０μｇの濃度のＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ Ｆｌｕｏｒ ｍｉｎｉｍａｌ ｄｙｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識した。異なる色素（Ｃｙ５、Ｃｙ３、およびＣｙ２）を用いて対照試料または試験試料または参照血清試料を標識した。標識タンパク質をアセトン沈殿により精製し、ＩＥＦバッファーに溶かし、２４または１３ｃｍのＩＰＧストリップ（ｐＨ４〜７）へ室温にて１２時間再水和した。再水和の後、ＩＰＧストリップを、６５〜７０ｋＶｈｒｓにて一次元電気泳動に付した。次に、二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の前にＩＰＧストリップをＤＴＴ平衡バッファーＩおよびＩＡＡ平衡バッファーＩＩで１５分間順次平衡化した。次に、ＩＰＧストリップを８〜１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せ、電気泳動を８０〜９０Ｖで１８時間実施して二次元でタンパク質を分離した。
【０１０７】
二次元の後、５５０〜６００の範囲のＰＭＴ電圧で適当なレーザーおよびフィルターを用いてＴｙｐｈｏｏｎ ９４００スキャナー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でゲルをスキャンした。選択された色を使って異なるチャネル（対照および検査）の画像を重ね合わせ、ＩｍａｇｅＱａｕｎｔソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて差異をモニターした。Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いてゲル画像の定量化を行った。
【０１０８】
タンパク質同定のため、血清タンパク質（５００ｇ〜１５００μｇ）を、標識せずに２−ＤＧＥに付した。ゲルをクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、画像化した。個々のスポットをゲルから切り出し、脱染し、ゲル内で３７℃にて２４時間トリプシン消化した。ペプチドを０．１％ ＴＦＡで抽出し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＺｉｐ Ｔｉｐｃ１８ピペットチップを用いて精製した。
【０１０９】
（ウエスタン免疫ブロット法および免疫沈降）
５０〜１００μｇの血清タンパク質を、２００Ｖにて６０分間４〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、９０ｍＡにて７５分間ＰＶＤＦ膜に移した。膜を５％ミルク−ＰＢＳＴで４５分間室温にてブロッキングし、１μｇ／ｍｌの一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ａｎｄ Ｄａｋｏ）で４℃にて一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、膜をＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体（Ｓｉｇｍａ）で室温にて９０分間インキュベートし、ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）で可視化した。免疫沈降のため、２０μｇの一次抗体を６００μｇの血清タンパク質と混合し、４℃にて一晩インキュベートした。次に、１５μｌのプロテインＧ−セファロースビーズを添加し、シェーカーで室温にて６０分間インキュベートした。溶出およびＰＡＧＥの前にビーズをＩＰバッファーで６回洗浄した。
【０１１０】
（母体血清のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ解析）
羊水および血清試料の合計０．５〜３．０μｇのタンパク質を順相ＮＰ２０（ＳｉＯ２表面）、逆相Ｈ４（疎水性表面：Ｃ−１６（長鎖脂肪族化合物）、または固定化したニッケル（ＩＭＡＣ）ＳＥＬＤＩタンパク質チップ（登録商標）アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）にスポットした。室温にて１時間のインキュベーションの後、ＮＰ１およびＨ４チップを５−μｌの水洗浄に付して結合しなかったタンパク質および妨害物質（すなわちバッファー、塩、洗剤）を除去した。２〜３分間風乾した後、シナピン酸の５０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）と０．５％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）との飽和溶液のうち０．５μｌを２適用分添加し、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ （ＰＢＳ ＩＩ）で飛行時間質量分析による質量分析を行った。
【０１１１】
（同位体コードアフィニティタグ（ＩＣＡＴ））
ＩＣＡＴは、対照試料および病変試料において、タンパク質の同定および差次的発現タンパク質の定量化データを提供することにより２ＤＧＥのいくつかの制限を克服するために用いられる最近開発された補完的技法である。ＩＣＡＴペプチド標識技術は、同位体組成の異なる反応プローブを用いることによりタンパク質の２つの集団を区別する。タンパク質上の遊離システインをアルキル化するタンパク質−反応性基（ヨードアセトアミド）、１２Ｃまたは１３Ｃ同位体標識されたリンカー領域、およびシステイン含有ペプチドを選択的に単離するための親和性（ビオチン）タグで構成される、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から市販されている、切断可能なＩＣＡＴ試薬を用いた。２つの試料、対照および病変試料を、同位体的に軽い（１２Ｃ）または重い（１３Ｃ）ＩＣＡＴ試薬でそれぞれ処理する。次に、標識されたタンパク質混合物を組み合わせ、タンパク質分解によって消化する。次に、ビオチン化ペプチドの固定化した単量体アビジンアフィニティーキャプチャーを用いて標識したペプチドを単離する。次に、標識されたペプチド上のビオチン標識を切断し、エレクトロスプレーイオン化法タンデム質量分析（ＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳ）と組み合わせたナノスケールの液体クロマトグラフィーによりペプチドを分析する。得られるＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＭＣＡＴソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて分析して対照および病変試料におけるタグペプチド対の相対存在量を判定し、大型タンパク質配列データベースを検索してこのタンパク質を同定する。対照は、比較分析のためタンパク質存在量のレベルを標準化するための内部標準として働く。存在比の増加または低下により上方制御または下方制御についての情報を提供する。
【０１１２】
（タンパク質の同定）
（データ獲得および解析）
トリプシンでのゲル内消化の後、Ｗａｔｅｒｓ ＣａｐＬＣに接続されているＷａｔｅｒｓハイブリッド四重極飛行時間質量分析計（Ｑ−Ｔｏｆ−２）で試料を解析した。Ｑ−Ｔｏｆ−２は標準のＺ−スプレーまたはナノスプレー源が備え付けられ、ＩｎｔｅｇｒａｆｒｉｔまたはＮａｎｏｅａｓｅ Ｃ１８ ７５μｍ ＩＤ×１５ｃｍ×３．５１μｍ熔融石英キャピラリーカラムに接続されている。Ｗｉｎｄｏｗｓ ＮＴ（登録商標）およびＭａｓｓＬｙｎｘ４．０ソフトウェアを備えたＣｏｍｐａｑワークステーションで機器を制御し、データを獲得した。Ｑ−Ｔｏｆ−２を、Ｇｌｕ１フィブリノペプチドＢを付属のＣａｐＬＣから直接注入または注射によって用いて較正した。データに従う（Ｄａｔａ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）解析を用いた。ＭＳ／ＭＳＭＳサーベイ法を用いてＭＳ／ＭＳＭＳスペクトルを得た。質量４００〜１５００ＤａをＭＳサーベイのためにスキャンし、質量５０〜１９００ＤａをＭＳ／ＭＳのためにスキャンした。一次データ解析を、Ｗｉｎｄｏｗｓ ２０００（登録商標）およびＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ２．１ （ＰＬＧＳ）ならびにＰＥＡＫＳデノボシーケンシングアルゴリズムおよび本発明者らの所有するＯｐｅｎＳｅａソフトウェアｖ１．１（Ｓｅａｒｌｅら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７６：２２２０−２２３０（２００４））を備えたＰＣで行った。
【０１１３】
（ＰＬＧＳ ｖ２．１）
タンデム質量スペクトル（ＭＳ／ＭＳ）の自動分析をＰＬＧＳ ｖ２．１ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて行った。処理パラメータは、バックグラウンド除去を行わずに中程度または低度の同位体除去を用いた。処理の後、同位体を除去したＭＳ／ＭＳスペクトルを、データベース検索を含むワークフローおよびａｕｔｏｍｏｄを用いて、非重複性のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｅｘ （ＩＰＩ）ヒトデータベース（２０）で検索した。ワークフローにおいて、固定された修飾はカルバミドメチルＣであり、可変性の修飾は酸化 Ｍおよびリン酸化 ＳＴＹであった。データベース検索後に非特異的一次消化試薬を用いてａｕｔｏｍｏｄクエリーを実行して可能性のあるあらゆる修飾および置換を検索した。
【０１１４】
（ＯｐｅｎＳｅａ ｖ１．１）
質量に基づくアラインメントアルゴリズムであるＯｐｅｎＳｅａ ｖ１．１は、ＰＥＡＫＳによりデータから得たデノボ配列をデータベース中のタンパク質配列にアラインすることによりペプチドのＭＳ／ＭＳデータからタンパク質を同定する。ＯｐｅｎＳｅａは全てのアミノ酸文字を一連の質量に変換し、ダイナミックプログラミングアプローチを用いてこれらの質量を比較する。
【０１１５】
全てのＱ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳスペクトルを、Ｐｅａｋｓ Ｂａｔｃｈ Ｖｅｒｓｉｏｎ２．２（Ｍａら、Ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅ ｎｏｖｏ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｒｏｍ ＭＳ／ＭＳ ｓｐｅｃｔｒｕｍ，ｉｎ １４ｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｍａｔｃｈｉｎｇ，２００３；Ｎｅｌｓｏｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６７：１１５３−８（１９９５））（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．，Ｗａｔｅｒｌｏｏ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、０．１ＡＭＵの質量精度を用いてデノボ配列決定した。Ｐｅａｋｓは、未知の質量領域なしに全アミノ酸配列を報告するが、その配列中の各アミノ酸に信頼度スコアを割り当てる。アミノ酸の信頼度スコアが５０％より低い配列領域をそれらのアミノ酸の組み合わせた質量で置き換えた。もし全配列の平均信頼度スコアが５０％よりも低ければ、平均信頼度よりも低い信頼度のアミノ酸だけを組み合わせた。全ての配列を、仮定上の親質量および断片質量の計算のためにモノアイソトピック質量を用いてＯｐｅｎＳｅａで解析し、全ての配列が０．２５ＡＭＵの質量精度で一致した。全ての試料を非重複性のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｅｘ（ＩＰＩ）ヒトデータベースで検索した。
【０１１６】
タンパク質を同定するために用いたパラメータは次の通りであった：１）タンパク質の説明の中に「ケラチン」という文字列を含むデータベース一致データはいずれも排除した；２）各タンパク質はＰＬＧＳ ｖ２．１およびＯｐｅｎＳｅａ ｖ１．１の両方で存在の可能性が９５％を上回らねばならない；ならびに３）各タンパク質は２種類以上のペプチドを有していなければならない。
【０１１７】
（質量分析に基づくバイオマーカーの検出のための免疫親和性アッセイ）
２−ＤＧＥ ＤＩＧＥ実験を用いて同定された、母体対照とダウン症候群血清との間で差次的に発現したタンパク質バイオマーカーは、タンパク質プロフィールに基づく胎児ダウン症候群の検出のためのハイスループットスクリーニング系の開発に適している。個々のタンパク質バイオマーカーを、免疫アフィニティー精製により母体の血清から捕捉し、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）により解析した。
【０１１８】
（試料調製およびバイオマーカー免疫沈降）
血清試料を、７００×ｇにて１５分間遠心分離して血液細胞を小球状にした。上清を−８０℃にて保存した。各血清試料（個々のバイオマーカー標的に対し各５０μＬ以下）を結合バッファーで希釈し、５０μｇの結合抗体で誘導体化した免疫親和性ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）とともにインキュベートした。ダウン症候群標的タンパク質を低いｐＨのカオトロピックバッファーを用いてビーズから溶出した。溶出液を脱塩し、ＺｉｐＴｉｐ（商標）Ｃ４ピペットチップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて濃縮し、疎水性／親水性対照ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ標的（ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ（商標）ＭＴＰ標的プレート、ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上に（シナピン酸マトリックスに沿って）直接スポットした。ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ標的は、試料分布および結晶化でさえも促進し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルの感受性を高くし、手動の「スイート・スポット」検索への依存を減らして、ハイスループット自動化に対して解析をさらに従順にする。
【０１１９】
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析）
溶出した完全なタンパク質バイオマーカーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析をＡｕｔｏｆｌｅｘ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて行った。Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの解像度仕様（シトクロムｃの解像度＝１０００、１２３６１ Ｄａ、 Ｒｓ＝ｍ／Δｍ（ＦＷＨＭ））は、タンパク質イソ型および修飾型の検出を可能にする。例えば、Ｎｅｌｓｏｎと共同研究者らは、たった５３Ｄａ（アポＥ２およびアポＥ３イソ型：それぞれ３４，２３６．６および３４，１８３．６Ｄａ）で質量の異なるアポリポタンパク質Ｅのイソ型を分離できた（２２８ Ａ．Ｔ．Ｂ．ｎ，母体の血清スクリーニング．Ｉｎ ＡＣＯＧ．１９９６ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｏｂｓｔｒｅｔｉｃｉａｎｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｓｔｓ）。ＭＡＬＤＩ−ＭＳを、大型ポリペプチドおよびタンパク質（＞５０００ｍ／ｚ）の検出のために陽極性を用いて遅延引き出し法、リニアモードで操作した。減衰した調節可能な５０Ｈｚ窒素レーザー（３３７ｎｍ）を１スペクトルあたり１００〜２００ショットで用いて質量スペクトルを得た。
【０１２０】
適切なシグナル対ノイズを考慮して、目的の特異的バイオマーカー標的の強度レベルに応じていくつかのスペクトルを組み合わせた。使用したＢｒｕｋｅｒ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計の質量精度は、リニア検出モード（＞５０００ｍ／ｚの質量の大きいポリペプチド／タンパク質の検出に用いられる）で内部キャリブレーション（ｍ／ｚ１２，３６１においてシトクロムｃに関して）を用いて＜１００ｐｐｍである。Ｂｒｕｋｅｒ ＭＴＰ ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ（商標）標的プレート上の４つのサンプルウェルの各セット間のキャリブレーションアンカーを利用して外部キャリブレーションを行う。対照試料およびダウン症候群試料から得られたＭＡＬＤＩ−ＭＳバイオマーカーイオンシグナルの処理後解析をＣｌｉｎＰｒｏ Ｔｏｏｌｓソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて行った。
【０１２１】
（結果）
（（Ａ）ダウン症候群を検出するためのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いるプロテオームプロフィール。）
対照およびダウン症候群を代表するタンパク質パターンをそれぞれ同定するため、方法に記載されるようにＡｇｉｌｅｎｔ免疫親和性カラムを用いて主に豊富なタンパク質を取り除くことにより最初に低分子量タンパク質を血清中で濃縮した。１〜２μｇの濃縮されたタンパク質試料のプロフィールを、４種類の異なる表面化学増強捕捉プロトコール（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｉｐ Ａｒｒａｙｓ）を用いてＳＥＬＤＩ−ＴＯＦにて生成した。Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｗｉｚａｒｄ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ， Ｉｎｃ．）を用いるデータ解析は、対照とダウン症候群血清とで別個のピークを明らかにした（図１）。試料のサブセットをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＴＯＦ−ＴＯＦ，Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）でさらに評価し（Ｋｅｒｓｅｙら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ４：１９８５−１９８８（２００４））、Ｃｌｉｎｐｒｏｔソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いてデータを解析した。このアプローチも、ダウン症候群試料において少数の別個のピークを明らかにした。これらの結果は、低分子量範囲でのダウン症候群の母体血清における潜在的差異が、ＳＥＬＤＩ／ＭＡＬＤＩプロファイリングにより検出され得ることを証明した。ダウン症候群に特有のこれらのプロフィールを利用する敏感かつ特異的アッセイは独自のハイスループットスクリーニング検査へと発展させることができる。
【０１２２】
（（Ｂ）蛍光２−ＤＧＥ。）
方法の項に記載されるように調製された母体血清試料の一致した対（対照およびダウン症候群）を蛍光色素（Ｃｙ５、Ｃｙ３およびＣｙ２）で標識し、２−Ｄゲルで分離した。ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘは、２−Ｄゲル、ならびに、対照およびダウン症候群試料とともにゲルの全てから分離した、固定した内部標準（プールした母体血清）を用いる半定量手順（２−Ｄプロフィール）を使って大量の試料をスクリーニングするための独自のハイスループットフォーマットを開発した。図１に示されるように、妊娠第二期母体血清試料は、対照およびダウン症候群の場合での明白な差異、ならびに妊娠第一期および第二期からのプロフィールの有意な類似性を明らかにした。強度比の定量化（Ｐｈｏｒｅｔｉｃｓソフトウェア、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア、ＳＡＳ解析）は、目的の重要な領域１〜７（図２に示されるように、高〜低分子量）が約４０〜８０％の範囲にある感受性を示したことを実証した。２以上の領域の組合せは、この一致対モデルにおいて全てのダウン症候群の場合を対照と区別することができた。
【０１２３】
目的のこれらの領域における可能性のあるタンパク質の同定のため、分取２−Ｄゲル（精製されたタンパク質１〜２ｍｇ）を妊娠第一期および第二期からの血清試料の３組の一致対から用いた。目的の領域からのスポット（図２、円で囲んだ領域）をパンチし、トリプシンで消化し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（Ｑ−ＴＯＦ２）で解析した。独自のプロテオームソフトウェア（ＯｐｅｎＳｅａ）を用いてタンパク質同定およびデータ解析を行った。目的の各領域は２〜３種類のタンパク質を示した（表１）。目的の領域に示されたタンパク質は、妊娠第一期および第二期血清試料の両方について同一であった。領域１〜７に示されない、母体の血清において差次的に発現したタンパク質を表２に列挙する。
【０１２４】
羊水試料の一致対（対照およびダウン症候群）を、上記のように蛍光色素（Ｃｙ５、Ｃｙ３およびＣｙ２）で分析し、２−Ｄゲルで分離した。デノボシーケンシングを用いて差次的に発現したタンパク質を同定し、および表３に列挙した。
【０１２５】
２Ｄ蛍光ゲルにおいて注目される相対的な定量的差異は、ウエスタンブロット法を用いて測定することができる。例として領域１に発現した主要タンパク質に対する抗体（補体Ｈ因子）を用いて、同様に２Ｄ蛍光ゲルに分離した母体血清２Ｄウエスタンブロットをプローブした。図４に示されるように、補体Ｈ因子は対照母体血清と比較してダウン症候群において、より高いレベルで発現した。このことは、同定されたタンパク質バイオマーカーが、母体の血清において胎児ダウン症候群を検出するための標準定量化免疫測定に用いることができることを実証する。
【０１２６】
図５はダウン症候群の候補バイオマーカーのデノボタンパク質配列同定の略図である。特に、この図は補体Ｈ因子に属するペプチド配列を表すスペクトルを示す。
【０１２７】
図６はダウン症候群の候補バイオマーカーのデノボタンパク質配列同定の異なる略図である。この図は補体Ｈ因子に属すると同定されたペプチド配列の配列適用範囲マップを示す。薄い陰影はポリペプチド配列内で同定されたペプチドを表し、濃い陰影を付けられたアミノ酸残基は示した位置での可能性のあるタンパク質修飾である。
【０１２８】
（バイオマーカーを測定するための免疫ＭＡＬＤＩアッセイの開発）
上に示されたように、蛍光２−Ｄゲル解析およびタンパク質同定は、妊娠第一期および第二期試料の両方の母体血清においてかなりの数の可能性のあるバイオマーカーを明らかにした。免疫ＭＡＬＤＩアッセイプラットフォームは、前例のない多成分解析の機会を提供する。このアッセイプラットフォームのもう１つの主な利点は、疾患に特異的なイソ型を捕捉できる能力である。このようなタンパク質分解断片またはタンパク質修飾を測るための正確なＥＬＩＳＡを開発することは非常に困難であろう。この例は、ダウン症候群を検出するために免疫ＭＡＬＤＩ技術を用いるハイスループットアッセイを開発する実現可能性を実証する。
【０１２９】
免疫ＭＡＬＤＩアッセイは、領域６および７で差次的に発現したタンパク質を同定するために開発された。この領域の２−Ｄゲルスポットからのタンパク質同定は、アポリポタンパク質ＡＩ、ＡＩＩ、およびＥの存在を証明する。対照およびダウン症候群試料の一致した対の母体血清試料６００μｇを用いてアポリポタンパク質の免疫沈降を行った。方法に記載されるようにＡｕｔｏｆｌｅｘ ＴＯＦ−ＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて溶出剤のプロフィール生成を行った。図３に示されるように、３種類全ての形態のアポリポタンパク質を検出し、アポリポタンパク質ＡＩＩは２つの試料間で有意な定量的差異を示した。さらに、アポリポタンパク質ＡＩＩ複合体もダウン症候群母体の血清において別個のイソ型を明らかにした。
【０１３０】
上記試料対のＭＡＬＤＩ解析は、対照血清と比較してダウン症候群血清においてアポＡ１の下方制御を示した。アポリポタンパク質Ａ２（アポＡ２）抗体を用いて同じセットの対照およびダウン症候群血清のＩＰ解析を行った場合、図３に示すＭＡＬＤＩプロフィールは、アポＡ２の相対強度がダウン症候群血清に対して対照血清において再び高かったことを示した（アポＡ２ ＭＷ＝８７０７．９Ｄａ）。さらに、ダウン症候群ＩＰに対して対照には異なる種類が存在した。従って、本発明者らのデータから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって、相対強度の変化ならびにバイオマーカーパターン変化の両方の評価が可能となることが証明される。
【０１３１】
この実験は、２−ＤＧＥ解析で同定された他のバイオマーカーおよび相対定量のためのコンピュータツール（ＣｌｉｎＰｒｏｔソフトウェア）の使用の最適化、ならびに診断プロフィールを作成するための統計アルゴリズムの最適化が、頑強なハイスループットアッセイ系を提供することを証明する。この系は他の可能性のある標的の添加によって、同じ設定において他の異数性を区別するために広げることができる。
【０１３２】
前記説明の全体にわたって、本発明は特定の一実施形態を参照して考察されているが、そのように限定されるものではない。実際、本明細書において示し説明したものに加えて、本発明の種々の修飾は前記の説明から当業者には明らかであり、付属の請求項の範囲内にある。
【０１３３】
（実施例ＩＩ）
（ダウン症候群において差次的に発現したタンパク質の分離および同定のための二次元液体クロマトグラフィー）
母体対照血清およびダウン症候群血清由来タンパク質の２Ｄ−ＤＩＧＥ解析を補う戦略として、完全なタンパク質を分離するための二次元液体クロマトグラフィー（２Ｄ−ＬＣ）法を用いることができる。２Ｄ−ＬＣ法は、対照血清試料とダウン症候群血清試料との間の差次的タンパク質発現の比較を可能にする仮想２Ｄマップを提供する。
【０１３４】
（試料調製および２Ｄ−ＬＣの方法論）
母体対照血清およびダウン症候群血清におけるタンパク質発現の比較分析のため、プールした母体の血清の一式を、妊娠第一期および妊娠第二期の患者から準備した。全ての血清を免疫精製し（Ａｇｉｌｅｎｔ）、ＣＦ適合性のためにバッファー交換した。５〜７ｍｇの全血清タンパク質を各試料にプールした。同量の全タンパク質を各対照／ダウン症候群試料対の２Ｄ−ＬＣ分析に用いた；妊娠第一期および第二期試料対を独立に分析した。
【０１３５】
２Ｄ−ＬＣ分析を、ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＦ２Ｄ系（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ；Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で行った。手短に言えば、血清タンパク質を一次元目のＣＦ陰イオン交換カラムに充填し、下降する直線ｐＨ勾配を用いてタンパク質等電点（ｐＩ／ｐＨ）に従って０．３ｐＨ単位の画分へ溶出する。次に、各ｐＨ画分を、無孔性Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを用いてタンパク質疎水性により二次元で分離する（各ｐＨ画分から４８画分）。質量分析によるタンパク質同定のためトリプシンで酵素消化される合計８００画分をＲＰ−ＨＰＬＣの次元から（各試料から）回収した。
【０１３６】
（回収した差次的画分のＭＳ解析）
図７は、妊娠第二期の母体ダウン症候群血清に対する母体対照血清の２Ｄ−ＬＣ分析により生成されたタンパク質発現マップを示す。図７Ａは、Ｘ軸にＣＦから溶出したタンパク質のｐＩを、Ｙ軸にＲＰ−ＨＰＬＣから溶出したタンパク質の保持時間、または疎水性を表示するＰｒｏｔｅｏＶｕｅソフトウェアを用いて生成された２Ｄ−ＬＣマップを表す。図７Ｂは、左側に赤色で表される対照試料の２Ｄマップ、および右側に緑色で表されるダウン症候群試料の２Ｄマップを表す。図の中央は２種類の試料の差分マップ（図７Ｂでは別々に表示）を表し、緑色に見えるバンドはダウン症候群試料において上方制御されたタンパク質であり、赤色に見えるバンドは対照試料において上方制御されたタンパク質である。
【０１３７】
ダウン症候群かまたは対照血清における上方制御を示す差分マップ中のバンドをトリプシンで消化させ、ＥＳＩ−ＱＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ（ＱＴＯＦ２，Ｗａｔｅｒｓ；Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いるタンパク質同定解析の準備をした。対照かまたはダウン症候群試料の高強度ピークの少なくとも１０〜２０％の差次的強度カットオフを用いると、これは妊娠第一期試料セットでは約９５バンド、妊娠第二期試料セットでは８０バンドに相当する。対照画分とダウン症候群画分と間の差次的発現強度は、０．００４ＡＵ〜０．６３８ＡＵであった（画分消化のＭＳ解析の検出の限界は、保存的に約０．０５ＡＵ；二次元目の分離のためのＡＵスケールは最大約１．３ＡＵに達する）。
【０１３８】
（母体のダウン症候群血清において差次的に発現したタンパク質の２Ｄ−ＬＣ同定）
表５は、ダウン症候群母体の血清においてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（Ｑ−ＴＯＦ２，Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ）解析で差次的ペプチド数を示す同定されたタンパク質の一覧を示す。（略語は、Ｔ１、妊娠第一期；Ｔ２、妊娠第二期母体の血清。）
（実施例ＩＩＩ）
（ダウン症候群の母体血清予測糖タンパク質プロフィール）
グリコシル化は、真核生物においてタンパク質の複合翻訳後修飾の１つである。単一のグリコシル化事象などの小さな変化が生理学的に重要なタンパク質の運命および機能を変え、それは次には生物の特定の疾患または状態に関連しうるので、グリコシル化プロセスの体系的評価は、タンパク質バイオマーカーの発掘に有益な手段である。細胞シグナルまたは発達段階に応じて発生するグリコシル化パターンまたはグリカン構造における変化を用いて癌などの疾患を同定することもあり得る。レクチンに基づくアフィニティー精製は、異なるクラスのグリコシル化タンパク質を単離するための選択法である。レクチンは植物タンパク質で、特異的かつ可逆的に糖タンパク質のグリカン部分と結合することができる。糖タンパク質の主要クラスおよび種類は試験試料から個別に単離することができ、それらを用いて疾患に対して対照を比較するための差次的グリコシル化プロフィールを生成することができる。
【０１３９】
（方法）
妊娠期間の一致した対照およびＤＳ母体の血清由来の全糖タンパク質、シアル酸、マンノースおよびＯ−グリコシル化タンパク質を、適当なレクチン親和性カラム（Ｑ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ、Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
【０１４０】
レクチン、マンノース結合レクチン（ＣｏｎＡ、ＬＣＨ、ＧＮＡ）＋シアル酸／Ｎ−アセチル−グルコサミン結合レクチン（ＷＧＡ、ＳＮＡ）の組合せを用いて全糖タンパク質抽出を行った。マンノース結合レクチン（ＣｏｎＡ、ＬＣＨ、ＧＮＡ）を利用してＭ結合糖タンパク質を抽出した。シアル酸／Ｎ−アセチル−グルコサミン結合レクチン（ＷＧＡ、ＳＮＡ、ＭＡＬ）を利用してＳ結合糖タンパク質を抽出した。ガラクトース／Ｎ−アセチル−ガラクトサミン結合レクチン（ＡＩＬ、ＰＮＡ）を利用してＯ結合糖タンパク質を抽出した。
【０１４１】
対照およびダウン症候群母体の血清から抽出した糖タンパク質を、二次元蛍光ゲル電気泳動およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳアプローチを用いて解析してダウン症候群の可能性のあるマーカーを同定した。単離された対照およびダウン症候群糖タンパク質各５０ｕｇを４００ｐｍのＣｙ３およびＣｙ５蛍光色素でそれぞれ標識した。Ｅｔｔａｎ Ｄａｌｔ ２ ＩＰＧｐｈｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ−Ａｍｒｅｓｈａｍ）のｐＨ４〜７ ＩＰＧストリップで各ＩＰＧストリップ長に適当な電圧を用いて等電点電気泳動を行った。１０〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲルを二次元目ＰＡＧＥに用いた。Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ ｍｏｄｅ ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＣｙ３およびＣｙ５の励起波長を使って各ゲルの差次的蛍光画像を得た。質量分析計（Ｑ−ＴＯＦ ２、 Ｗａｔｅｒｓ Ｉｎｃ）でのタンパク質同定のために、差次的に発現したタンパク質スポットをＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）ソフトウェアを用いて可視化し、ゲルから切り出し、トリプシンで消化させた。
【０１４２】
図８〜１１は、ダウン症候群の母体血清中の糖タンパク質の固有の差次的発現プロフィールを表す。
【０１４３】
差異を示す領域の赤色または緑色を、ゲルから抜き出し、トリプシンで消化させ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いてタンパク質同定を確認した。
【０１４４】
妊娠第一期および第二期対照およびダウン症候群母体血清試料から抽出した全糖タンパク質混合物をトリプシンで消化させ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて解析した。差異を表す糖タンパク質（各タンパク質に対し多数の全ペプチド）を蓄積して、二次元ゲルから差次的に発現したスポットから同定された糖タンパク質と比較し、ダウン症候群母体血清において同定された糖タンパク質の一覧を表６に示す。
【０１４５】
本明細書の全体にわたって引用したあらゆる参照文献、およびその中で引用される参照文献は、その全文が参照により明白に本明細書に組み入れられる。
【０１４６】
【表１】
【０１４７】
【表２】
【０１４８】
【表３】
【０１４９】
【表４】
【０１５０】
【表５】
【０１５１】
【表６−１】
【０１５２】
【表６−２】
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】妊娠第二期対照およびダウン症候群試料の母体血清のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析。一番上のパネルは４つ全てが一致した例からプールされた対照を表す。２つの群間で差次的に発現する潜在的ピークを示す目的の領域を枠で囲んだ。
【図２】１００ｐｍのＣｕｓ５（ダウン症候群）またはＣｙ３（対照）で標識したＡｇｉｌｅｎｔ免疫親和性カラムを用いて精製された母体血清試料（タンパク質２０μｇ）の２−Ｄゲル。ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ ９４１００スキャナー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で６００ＰＭＴ電圧にてスキャンした。Ｐｈｏｒｅｔｉｃ ２Ｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて画像を重ね合わせた。
【図３】免疫−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳアッセイ。免疫沈降したアポリポタンパク質Ａ）．アポリポタンパク質Ａ１．Ｂ）．アポリポタンパク質Ａ２．Ｃ）．アポリポタンパク質Ｅの、母体対照由来のスペクトル（青色の痕跡）およびダウン症候群血清由来のスペクトル（赤色の痕跡）。パネルＤは、図２の２Ｄ ＤＩＧＥゲルから採取された挿入物で、これからいくつかのアポリポタンパク質種がタンデム質量分析により同定された。
【図４】母体血清における差次的タンパク質発現の検出。ヒト補体Ｈ因子抗体でプローブした２−Ｄウエスタン免疫ブロット法。Ａ）妊娠第二期対照血清；Ｂ）妊娠第二期ダウン症候群母体血清。
【図５】ダウン症候群の候補バイオマーカーのデノボタンパク質配列同定の略図。スペクトルは補体Ｈ因子に属するペプチド配列を表す。
【図６】ダウン症候群の候補バイオマーカーのデノボタンパク質配列同定の略図。補体Ｈ因子に属すると同定されたペプチド配列の配列範囲対象マップ。薄い陰影は同定されたペプチド、濃い陰影はこれらのアミノ酸の可能性のあるタンパク質修飾を表す。
【図７】回収した差次的２−Ｄ液体クロマトグラフィー画分のＭＳ分析。Ａ）ＰｒｏｔｅｏＶｕｅソフトウェアを用いて生成された２Ｄ−ＬＣマップは、Ｘ軸にＣＦから溶出したタンパク質のｐＩを表示し、Ｙ軸にＲＰ−ＨＰＬＣから溶出したタンパク質の保持時間、または疎水性を表示する。Ｂ）対照試料の２Ｄマップは左側に赤色で表され、ＤＳ試料の２Ｄマップは右側に緑色で表される。図の中央には２種類の試料の差分マップ（Ｂでは別々に表示）が表示され、マップ中、緑色に見えるバンドはＤＳ試料において上方制御されたタンパク質であり、赤色に見えるバンドは対照試料において上方制御されたタンパク質である。
【図８】妊娠第二期の対照（赤色）およびＤＳ（緑色）母体血清における全糖タンパク質の差次的発現を表す蛍光二次元ゲル画像。
【図９】妊娠第二期の対照（赤色）およびＤＳ（緑色）母体血清におけるシアル酸（Ｓｉａｌｉｃ）−糖タンパク質の差次的発現を表す蛍光二次元ゲル画像。
【図１０】妊娠第二期の対照（赤色）およびＤＳ（緑色）母体血清におけるマンノース結合糖タンパク質の差次的発現を表す蛍光二次元ゲル画像。
【図１１】妊娠第二期の対照（赤色）およびＤＳ（緑色）母体血清におけるＯ−結合糖タンパク質の差次的発現を表す蛍光二次元ゲル画像。
【図１２】全糖タンパク質のトリプシン消化のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ。対照の母体血清（上部）およびダウン症候群の母体血清（下部）。ダウン症候群で発現したペプチドの有意差が枠で囲まれている。
【図１３】シアル酸糖タンパク質のトリプシン消化のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ。対照の母体血清（上部）およびダウン症候群の母体血清（下部）。ダウン症候群で発現したペプチドの有意差が枠で囲まれている。
【図１４】マンノース結合糖タンパク質のトリプシン消化のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ。対照の母体血清（上部）およびダウン症候群の母体血清（下部）。ダウン症候群で発現したペプチドの有意差が枠で囲まれている。
【図１５】Ｏ−結合糖タンパク質のトリプシン消化のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ。対照の母体血清（上部）およびダウン症候群の母体血清（下部）。ダウン症候群で発現したペプチドの有意差が枠で囲まれている。
【図１６】１００ｐｍのＣｕｓ５（トリソミー１８）またはＣｙ３（対照）で標識したＡｇｉｌｅｎｔ免疫親和性カラムを用いて精製された母体血清試料（タンパク質２０μｇ）の２−Ｄゲル。ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ ９４１００スキャナー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で６００ＰＭＴ電圧にてスキャンした。Ｐｈｏｒｅｔｉｃ ２Ｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて画像を重ね合わせた。
【図１７】１００ｐｍのＣｕｓ５（トリソミー１３）またはＣｙ３（対照）で標識したＡｇｉｌｅｎｔ免疫親和性カラムを用いて精製された母体血清試料（タンパク質２０μｇ）の２−Ｄゲル。ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ ９４１００スキャナー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で６００ＰＭＴ電圧にてスキャンした。Ｐｈｏｒｅｔｉｃ ２Ｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて画像を重ね合わせた。
【図１８】１００ｐｍのＣｕｓ５（神経管欠損症）またはＣｙ３（対照）で標識したＡｇｉｌｅｎｔ免疫親和性カラムを用いて精製された母体血清試料（タンパク質２０μｇ）の２−Ｄゲル。ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ ９４１００スキャナー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で６００ＰＭＴ電圧にてスキャンした。Ｐｈｏｒｅｔｉｃ ２Ｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて画像を重ね合わせた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
母体の生体液の試験試料のプロテオームプロフィールと、同じ種類の生体液の標準または参照プロテオームプロフィールとを比較する工程と、該試験試料のプロテオームプロフィールが、該標準プロテオームプロフィールに存在しないかまたは該参照プロテオームプロフィールに存在する、表１〜２および５〜６に記載されるバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを表す少なくとも１つの固有の発現サインを示す場合、胎児異数性の存在を決定する工程とを含む、胎児異数性の診断のための方法。
【請求項２】
母体の生体液の試験試料のプロテオームプロフィールと、同じ種類の生体液の標準または参照プロテオームプロフィールとを比較する工程と、該試験試料のプロテオームプロフィールが、該標準プロテオームプロフィールに存在しないかまたは該参照プロテオームプロフィールに存在する、表３に記載されるバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを表す少なくとも１つの固有の発現サインを示す場合、胎児異数性の存在を決定する工程とを含む、胎児異数性の診断のための方法。
【請求項３】
前記試験試料が妊娠ヒト女性から得たものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記プロテオームプロフィールが質量スペクトルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記試験試料が母体の血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記固有の発現サインが、１６〜２０ｋＤａ、３５〜３８ｋＤａ、３８〜４２ｋＤａ、４０〜４５ｋＤａ、５０〜５５ｋＤａ、６０〜６８ｋＤａ、および１２５〜１５０ｋＤａの分子量範囲のうちの１以上にある、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試験試料が母体の羊水である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記固有の発現サインが、６〜７ｋＤａおよび８〜１０ｋＤａの分子量範囲の一方または両方にある、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
妊娠の第一期に行う、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
妊娠の第二期に行う、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験試料において、胎児異数性の少なくとも１種類のさらなるバイオマーカーの転写されたｍＲＮＡのレベルまたは翻訳されたタンパク質のレベルを測定する工程と、前記転写されたｍＲＮＡのレベルまたは翻訳されたタンパク質のレベルが、標準生体試料におけるそのレベルに対して異なる場合に、胎児異数性の存在を確認する工程とをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記胎児異数性が、ダウン症候群、トリソミー１３、トリソミー１８、Ｘ染色体トリソミー、Ｘ染色体モノソミー、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ遺伝子型）、またはＸＹＹ症候群（ＸＹＹ遺伝子型）である、請求項１、２および１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記のさらなるバイオマーカーが、ＰＡＰＰ−Ａ、ａ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｂｈＣＧ）、非結合型エストリオール（ｕＥ３）、およびインヒビンＡからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
転写されたｍＲＮＡのレベルまたは翻訳されたＰＡＰＰ−ＡおよびｂｈＣＧのレベルを決定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
転写されたｍＲＮＡのレベルまたは翻訳されたＡＦＰ、ｂｈＣＧ、およびｕＥ３のレベルをさらに決定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
転写されたｍＲＮＡのレベルまたは翻訳されたインヒビン−Ａのレベルをさらに決定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
妊娠ヒト女性に１種類以上のさらなる診断法を受けさせる工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
前記さらなる診断法が、超音波検査、染色体異常を検査するための技法、および後頚部透過像（ＮＴ）測定からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記バイオマーカーの１種類より多い固有の発現サインを比較する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
前記バイオマーカーが、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；妊娠ゾーンタンパク質（ＰＺＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２０７４１）；アファミン（ＡＦＡＭ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４３６５２）；アンジオテンシノーゲン（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；α−２−ｈｓ−糖タンパク質（Ａ２ＨＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６５）；クラステリン（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）；アポリポタンパク質ＡＩ（ＡＰＡ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４７）；アポリポタンパク質ＡＩＶ（ＡＰＡ４＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０６７２７）；アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ３６９５５）；血清アミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７３５）；ＡＭＢＰタンパク質（ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６０）；血漿レチノール結合タンパク質（ＲＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５３）；血清トランスフェリン前駆体（ＴＲＦＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７８７）；α−１−抗トリプシン前駆体（Ａ１ＡＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１００９）；α−２−マクログロブリン前駆体（Ａ２ＭＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２３）；補体Ｃ３前駆体（ＣＯ３＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２４）；アンジオテンシノーゲン前駆体（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；セルロプラスミン前駆体（ＣＥＲＵ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００４５０）；ハプトグロビン前駆体（ＨＰＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７３８）；抗トロンビン−ＩＩＩ前駆体（ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１００８）；ヘモペキシン前駆体（ＨＥＭＯ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７９０）；α−１−酸性糖タンパク質１前駆体（Ａ１ＡＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６３）；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ前駆体（ＡＰＡ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４７）；α １ｂ−糖タンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４２１７）；キニノゲン前駆体（ＫＮＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０４２−２）；インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ２前駆体（ＩＴＨ２＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１９８２３）；α−２−ｈｓ−糖タンパク質前駆体（Ａ２ＨＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６５）；α−１−抗キモトリプシン前駆体（ＡＡＣＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１１）；インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ４前駆体（ＩＴＨ４＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ１４６２４−２）；補体Ｈ因子前駆体（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３−１）；血漿プロテアーゼＣ１インヒビター前駆体（ＩＣ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０５１５５）；ヘパリン補因子ＩＩ前駆体（ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０５５４６）；補体Ｂ因子前駆体（ＣＦＡＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７５１−１）；α−２−糖タンパク質１、亜鉛（ＺＡ２Ｇ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２５３１１）；ビトロネクチン前駆体（ＶＴＮＣ＿ＨＵＭＡＮ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４００４）；インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１前駆体（ＩＴＨ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１９８２７）；補体成分Ｃ９前駆体（ＣＯ９＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７４８）；フィブリノゲンα／α−Ｅ鎖前駆体（ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６７１−１）；フィブリノゲンβ鎖前駆体（ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６７５）；フィブリノゲンγ鎖前駆体（ＦＩＢＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６７９−１）；プロトロンビン前駆体（ＴＨＲＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７３４）；クラステリン前駆体（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）；α−１Ｂ−糖タンパク質前駆体（Ａ１ＢＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４２１７）；α−１−酸性糖タンパク質２前駆体（Ａ１ＡＨ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１９６５２）；アポリポタンパク質Ｄ前駆体（ＡＰＯＤ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０５０９０）；妊娠ゾーンタンパク質前駆体（ＰＺＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２０７４２）；ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体（ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４１９６）；性ホルモン結合グロブリン前駆体（ＳＨＢＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４２７８−１）；プラスミノゲン前駆体（ＰＬＭＮ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７４７）；アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ前駆体（ＡＰＣ３＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６５６）；ロイシンリッチα−２−糖タンパク質前駆体（Ａ２ＧＬ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５０）；アポリポタンパク質Ｅ前駆体（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；フェチュインＢ前駆体（ＦＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＵＧＭ５）；ミオシン反応性免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＵＬ８３）；補体Ｃ１Ｓ成分前駆体（Ｃ１Ｓ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０９８７１）；ＡＭＢＰタンパク質前駆体（ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６０）；および、補体Ｃ４前駆体（ＣＯ４＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２８）からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
前記バイオマーカーの１種類より多い固有の発現サインの比較を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記バイオマーカーが、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；および妊娠ゾーンタンパク質（ＰＺＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２０７４１）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２３】
前記バイオマーカーが、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；およびアファミン（ＡＦＡＭ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４３６５２）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２４】
前記バイオマーカーが、妊娠ゾーンタンパク質（ＰＺＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２０７４１）；およびα−２−ｈｓ−糖タンパク質（Ａ２ＨＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６５）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２５】
前記バイオマーカーが、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；アンジオテンシノーゲン（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；およびクラステリン（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２６】
前記バイオマーカーが、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；ＡＭＢＰタンパク質（ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６０）；および血漿レチノール結合タンパク質（ＲＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５３）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２７】
前記バイオマーカーが、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；アファミン（ＡＦＡＭ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４３６５２）；アンジオテンシノーゲン（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；およびクラステリン（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２８】
前記バイオマーカーが、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；アファミン（ＡＦＡＭ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４３６５２）；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ３６９５５）；血清アミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７３５）；アンジオテンシノーゲン（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；およびクラステリン（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２９】
前記バイオマーカーが、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；ＡＭＢＰタンパク質（ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６０）；血漿レチノール結合タンパク質（ＲＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５３）；血清トランスフェリン前駆体（ＴＲＦＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７８７）；α−２−マクログロブリン前駆体（Ａ２ＭＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２３）；およびヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体（ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４１９６）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３０】
前記バイオマーカーが、インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１前駆体（ＩＴＨ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１９８２７）；補体成分Ｃ９前駆体（ＣＯ９＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７４８）；フィブリノゲンα／α−Ｅ鎖前駆体（ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６７１−１）；アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ前駆体（ＡＰＣ３＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６５６）；ロイシンリッチα−２−糖タンパク質前駆体（Ａ２ＧＬ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５０）；アポリポタンパク質Ｅ前駆体（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；フェチュイン−Ｂ前駆体（ＦＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＵＧＭ５）；および補体Ｃ４前駆体（ＣＯ４＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２８）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３１】
前記プロテオームプロフィールに、少なくとも１種類の糖タンパク質が含まれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１種類の糖タンパク質が、シアル酸糖タンパク質、マンノース結合糖タンパク質、およびＯ−結合糖タンパク質からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記胎児異数性が常染色体異数性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３４】
前記常染色体異数性が、染色体１３、１８、または２１のトリソミーである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記胎児異数性が、性染色体異数性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３６】
前記性染色体異数性が、Ｘ染色体トリソミー、Ｘ染色体モノソミー、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ遺伝子型）、およびＸＹＹ症候群（ＸＹＹ遺伝子型）からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項１】
母体の生体液の試験試料のプロテオームプロフィールと、同じ種類の生体液の標準または参照プロテオームプロフィールとを比較する工程と、該試験試料のプロテオームプロフィールが、該標準プロテオームプロフィールに存在しないかまたは該参照プロテオームプロフィールに存在する、表１〜２および５〜６に記載されるバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを表す少なくとも１つの固有の発現サインを示す場合、胎児異数性の存在を決定する工程とを含む、胎児異数性の診断のための方法。
【請求項２】
母体の生体液の試験試料のプロテオームプロフィールと、同じ種類の生体液の標準または参照プロテオームプロフィールとを比較する工程と、該試験試料のプロテオームプロフィールが、該標準プロテオームプロフィールに存在しないかまたは該参照プロテオームプロフィールに存在する、表３に記載されるバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを表す少なくとも１つの固有の発現サインを示す場合、胎児異数性の存在を決定する工程とを含む、胎児異数性の診断のための方法。
【請求項３】
前記試験試料が妊娠ヒト女性から得たものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記プロテオームプロフィールが質量スペクトルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記試験試料が母体の血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記固有の発現サインが、１６〜２０ｋＤａ、３５〜３８ｋＤａ、３８〜４２ｋＤａ、４０〜４５ｋＤａ、５０〜５５ｋＤａ、６０〜６８ｋＤａ、および１２５〜１５０ｋＤａの分子量範囲のうちの１以上にある、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試験試料が母体の羊水である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記固有の発現サインが、６〜７ｋＤａおよび８〜１０ｋＤａの分子量範囲の一方または両方にある、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
妊娠の第一期に行う、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
妊娠の第二期に行う、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験試料において、胎児異数性の少なくとも１種類のさらなるバイオマーカーの転写されたｍＲＮＡのレベルまたは翻訳されたタンパク質のレベルを測定する工程と、前記転写されたｍＲＮＡのレベルまたは翻訳されたタンパク質のレベルが、標準生体試料におけるそのレベルに対して異なる場合に、胎児異数性の存在を確認する工程とをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記胎児異数性が、ダウン症候群、トリソミー１３、トリソミー１８、Ｘ染色体トリソミー、Ｘ染色体モノソミー、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ遺伝子型）、またはＸＹＹ症候群（ＸＹＹ遺伝子型）である、請求項１、２および１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記のさらなるバイオマーカーが、ＰＡＰＰ−Ａ、ａ−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｂｈＣＧ）、非結合型エストリオール（ｕＥ３）、およびインヒビンＡからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
転写されたｍＲＮＡのレベルまたは翻訳されたＰＡＰＰ−ＡおよびｂｈＣＧのレベルを決定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
転写されたｍＲＮＡのレベルまたは翻訳されたＡＦＰ、ｂｈＣＧ、およびｕＥ３のレベルをさらに決定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
転写されたｍＲＮＡのレベルまたは翻訳されたインヒビン−Ａのレベルをさらに決定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
妊娠ヒト女性に１種類以上のさらなる診断法を受けさせる工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
前記さらなる診断法が、超音波検査、染色体異常を検査するための技法、および後頚部透過像（ＮＴ）測定からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記バイオマーカーの１種類より多い固有の発現サインを比較する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
前記バイオマーカーが、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；妊娠ゾーンタンパク質（ＰＺＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２０７４１）；アファミン（ＡＦＡＭ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４３６５２）；アンジオテンシノーゲン（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；α−２−ｈｓ−糖タンパク質（Ａ２ＨＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６５）；クラステリン（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）；アポリポタンパク質ＡＩ（ＡＰＡ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４７）；アポリポタンパク質ＡＩＶ（ＡＰＡ４＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０６７２７）；アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ３６９５５）；血清アミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７３５）；ＡＭＢＰタンパク質（ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６０）；血漿レチノール結合タンパク質（ＲＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５３）；血清トランスフェリン前駆体（ＴＲＦＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７８７）；α−１−抗トリプシン前駆体（Ａ１ＡＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１００９）；α−２−マクログロブリン前駆体（Ａ２ＭＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２３）；補体Ｃ３前駆体（ＣＯ３＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２４）；アンジオテンシノーゲン前駆体（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；セルロプラスミン前駆体（ＣＥＲＵ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００４５０）；ハプトグロビン前駆体（ＨＰＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７３８）；抗トロンビン−ＩＩＩ前駆体（ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１００８）；ヘモペキシン前駆体（ＨＥＭＯ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７９０）；α−１−酸性糖タンパク質１前駆体（Ａ１ＡＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６３）；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ前駆体（ＡＰＡ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４７）；α １ｂ−糖タンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４２１７）；キニノゲン前駆体（ＫＮＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０４２−２）；インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ２前駆体（ＩＴＨ２＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１９８２３）；α−２−ｈｓ−糖タンパク質前駆体（Ａ２ＨＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６５）；α−１−抗キモトリプシン前駆体（ＡＡＣＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１１）；インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ４前駆体（ＩＴＨ４＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ１４６２４−２）；補体Ｈ因子前駆体（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３−１）；血漿プロテアーゼＣ１インヒビター前駆体（ＩＣ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０５１５５）；ヘパリン補因子ＩＩ前駆体（ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０５５４６）；補体Ｂ因子前駆体（ＣＦＡＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７５１−１）；α−２−糖タンパク質１、亜鉛（ＺＡ２Ｇ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２５３１１）；ビトロネクチン前駆体（ＶＴＮＣ＿ＨＵＭＡＮ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４００４）；インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１前駆体（ＩＴＨ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１９８２７）；補体成分Ｃ９前駆体（ＣＯ９＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７４８）；フィブリノゲンα／α−Ｅ鎖前駆体（ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６７１−１）；フィブリノゲンβ鎖前駆体（ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６７５）；フィブリノゲンγ鎖前駆体（ＦＩＢＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６７９−１）；プロトロンビン前駆体（ＴＨＲＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７３４）；クラステリン前駆体（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）；α−１Ｂ−糖タンパク質前駆体（Ａ１ＢＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４２１７）；α−１−酸性糖タンパク質２前駆体（Ａ１ＡＨ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１９６５２）；アポリポタンパク質Ｄ前駆体（ＡＰＯＤ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０５０９０）；妊娠ゾーンタンパク質前駆体（ＰＺＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２０７４２）；ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体（ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４１９６）；性ホルモン結合グロブリン前駆体（ＳＨＢＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４２７８−１）；プラスミノゲン前駆体（ＰＬＭＮ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００７４７）；アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ前駆体（ＡＰＣ３＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６５６）；ロイシンリッチα−２−糖タンパク質前駆体（Ａ２ＧＬ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５０）；アポリポタンパク質Ｅ前駆体（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；フェチュインＢ前駆体（ＦＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＵＧＭ５）；ミオシン反応性免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＵＬ８３）；補体Ｃ１Ｓ成分前駆体（Ｃ１Ｓ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０９８７１）；ＡＭＢＰタンパク質前駆体（ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６０）；および、補体Ｃ４前駆体（ＣＯ４＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２８）からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
前記バイオマーカーの１種類より多い固有の発現サインの比較を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記バイオマーカーが、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；および妊娠ゾーンタンパク質（ＰＺＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２０７４１）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２３】
前記バイオマーカーが、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；およびアファミン（ＡＦＡＭ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４３６５２）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２４】
前記バイオマーカーが、妊娠ゾーンタンパク質（ＰＺＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２０７４１）；およびα−２−ｈｓ−糖タンパク質（Ａ２ＨＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６５）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２５】
前記バイオマーカーが、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；アンジオテンシノーゲン（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；およびクラステリン（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２６】
前記バイオマーカーが、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；ＡＭＢＰタンパク質（ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６０）；および血漿レチノール結合タンパク質（ＲＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５３）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２７】
前記バイオマーカーが、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；アファミン（ＡＦＡＭ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４３６５２）；アンジオテンシノーゲン（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；およびクラステリン（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２８】
前記バイオマーカーが、補体Ｈ因子（ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６０３）；アファミン（ＡＦＡＭ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ４３６５２）；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ３６９５５）；血清アミロイドＡタンパク質（ＳＡＡ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７３５）；アンジオテンシノーゲン（ＡＮＧＴ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０１９）；およびクラステリン（ＣＬＵＳ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１０９０９）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２９】
前記バイオマーカーが、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；ＡＭＢＰタンパク質（ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６０）；血漿レチノール結合タンパク質（ＲＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５３）；血清トランスフェリン前駆体（ＴＲＦＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７８７）；α−２−マクログロブリン前駆体（Ａ２ＭＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２３）；およびヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体（ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４１９６）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３０】
前記バイオマーカーが、インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１前駆体（ＩＴＨ１＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１９８２７）；補体成分Ｃ９前駆体（ＣＯ９＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７４８）；フィブリノゲンα／α−Ｅ鎖前駆体（ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６７１−１）；アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ前駆体（ＡＰＣ３＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６５６）；ロイシンリッチα−２−糖タンパク質前駆体（Ａ２ＧＬ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７５０）；アポリポタンパク質Ｅ前駆体（ＡＰＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２６４９）；フェチュイン−Ｂ前駆体（ＦＥＴＢ＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＵＧＭ５）；および補体Ｃ４前駆体（ＣＯ４＿ＨＵＭＡＮ；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１０２８）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３１】
前記プロテオームプロフィールに、少なくとも１種類の糖タンパク質が含まれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１種類の糖タンパク質が、シアル酸糖タンパク質、マンノース結合糖タンパク質、およびＯ−結合糖タンパク質からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記胎児異数性が常染色体異数性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３４】
前記常染色体異数性が、染色体１３、１８、または２１のトリソミーである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記胎児異数性が、性染色体異数性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３６】
前記性染色体異数性が、Ｘ染色体トリソミー、Ｘ染色体モノソミー、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ遺伝子型）、およびＸＹＹ症候群（ＸＹＹ遺伝子型）からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２００８−５１３０３１（Ｐ２００８−５１３０３１Ａ）
【公表日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３２６７８（Ｐ２００７−５３２６７８）
【出願日】平成１７年９月２０日（２００５．９．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３４０８３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３４４２７
【国際公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【出願人】（５０５３５９２２９）プロテオジェニックス， インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月２０日（２００５．９．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３４０８３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３４４２７
【国際公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【出願人】（５０５３５９２２９）プロテオジェニックス， インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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