脂肪排泄促進剤
【課題】脂肪吸収阻害剤の開発。
【解決手段】難水溶性糖修飾タンパク質を有効成分とする脂肪増加抑制剤及び／又は脂肪排泄促進剤。
【解決手段】難水溶性糖修飾タンパク質を有効成分とする脂肪増加抑制剤及び／又は脂肪排泄促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪排泄促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
過剰なエネルギー摂取が脂肪として体内に蓄積され、近年、内臓型肥満が生活習慣病危険因子として特に注目されている。内臓脂肪蓄積の予防は、メタボリックシンドロームに象徴される重大な生活習慣病の発症リスクを低減させるために重要であると考えられている。
急激に体内に吸収された脂質は、その殆どがエネルギーに変換されることなく、脂肪組織に蓄積されると考えられており、実際に、内臓脂肪量と食後血中中性脂肪量の間には正の相関があるという報告もある。食後高脂血症は、内臓脂肪の蓄積ばかりでなく、それ自身が心臓病や脳卒中等の動脈硬化性疾患の危険因子ともなることから、食事性脂質の吸収調節は生活習慣病全般の予防における重要課題であると考えられている。食事により得られた脂質は、小腸壁より吸収される。
摂取されたエネルギーは運動などによって消費することも対策の１つであるが、食後の急激な脂質吸収の制御も重要な対策と考えられている。脂肪吸収阻害（脂質排泄促進）を示す成分としては、多糖である食物繊維やポリフェノールなどが挙げられるが、タンパク質でこのような効果を示すものは見受けられない。
【０００３】
特許文献１（特開２００７−９９６５１号公報）には、脂質の胃内滞留時間を延長させる作用を有する剤として雲南紅茶の抽出物を有効成分とする抗脂肪性薬剤が提案されている。
特許文献２（特開２００７−２４６４７１号公報）には、血中中性脂肪の上昇を抑制する剤として、シソ（Perilla frutescens）乾燥物の濃度９０〜９９．９容量％エタノール水溶液の抽出物を有効成分とする血中中性脂肪上昇抑制剤が提案されている。
【０００４】
本発明者は、糖修飾タンパクの利用に関する研究開発を続けてきた。先に本発明者は、水溶性に優れた筋肉タンパク質を開発し提案（特許文献３（特許３８６００２５号公報）参照）した。更に、この新規な水溶性に優れた筋肉タンパク質の応用研究開発を継続している。この水溶性に優れた筋肉タンパク質が、血中中性脂肪上昇抑制作用を示すことを見出し、糖修飾タンパク質を有効成分とする血中中性脂肪上昇抑制剤として特願２００７−３０６９１８号に提案した。
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−９９６５１号公報
【特許文献２】特開２００７−２４６４７１号公報
【特許文献３】特許３８６００２５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
糖修飾タンパク質の新たな機能の探求を続けた結果、難水溶性の糖修飾タンパク質に注目し、新たな機能を提供することを目的とする。特に、本発明は、脂肪吸収阻害について着目したものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の主な構成は次のとおりである。
（１）難水溶性糖修飾タンパク質を有効成分とする脂肪排泄促進剤。
（２）難水溶性糖修飾タンパク質が、糖修飾魚肉タンパク質であることを特徴とする（１）記載の脂肪排泄促進剤。
（３）難水溶性糖修飾タンパク質が、サケの筋肉タンパク質とアルギン酸オリゴ糖を混合し、８０℃以上で加熱処理して得られた魚肉タンパク質であることを特徴とする（１）記載の脂肪排泄促進剤。
【発明の効果】
【０００８】
難水溶性魚肉タンパク質などの難水溶性糖修飾タンパク質を摂取することにより、脂肪の増加を抑制し、脂肪排泄を促進することができる。
高脂肪食時に難水溶性魚肉タンパク質を同時に摂取することにより、体重増加を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
糖修飾タンパク質は、サケやコイなどの魚類やホタテ貝などの貝類など魚介類、トリ、ブタ、ウシなど家畜類の筋肉タンパク質を糖修飾して、水に難溶化したタンパク質とする。本件発明に用いる難水溶性タンパク質は、筋肉タンパク質と還元糖類の間で起きるメイラード反応を進行させることによって難水溶性を付与した鮭肉タンパク（難水溶性魚肉タンパク質）である。
【００１０】
魚介類、家畜類の肉を細切りして、筋肉タンパク質を抽出し、或いはそのまま、還元糖類と混合し、脱水し、相対湿度３５％以下で８０℃以上に保持することにより、溶解度を２０％以下とする糖修飾タンパク質とすることができる。
還元糖類としては、単糖(グルコース、リボースなど)、平均重合度２０以下のオリゴ糖類で還元末端を有しているもの、例えば、アルギン酸オリゴ糖、キトサンオリゴ糖などの還元性オリゴ糖が挙げられる。
タンパク質変性防止剤としては、グルコースやソルビトール等が挙げられる。
【００１１】
本件発明におけるタンパク質と糖の混合比は、筋肉タンパク質：糖類＝１：０．１〜１：１０の範囲が望ましい。
筋肉タンパク質は、糖と混合後、脱水処理に付される。脱水処理は、例えば、相対湿度10％の低湿度下での加熱処理や、凍結乾燥、噴霧乾燥、減圧乾燥等の処理あるいはこれらの組み合わせ処理により行うことができる。又、脱水処理により、メイラード反応に好適な0.25〜6.0％の水分含量とすることもできるが、脱水処理終了時点での水分含量が6.0％を上回るものであったとしても、相対湿度35％以下で、30〜70℃に保持することにより、水分含量を0.25〜6.0％の範囲にすることもできる。
【００１２】
[難水溶性魚肉タンパク質の製法例]
＜サケ筋肉タンパク質のアルギン酸オリゴ糖修飾例＞
サケ筋肉を径２mm以下にミートチョッパーで細切した。このサケ魚肉100ｇに対してそれに含まれる筋原線維タンパク質量（15％湿重量）と等量のアルギン酸オリゴ糖（15ｇ）とソルビトール（14.1ｇ）を混合した後、凍結乾燥によって脱水して水分含量を0.9％とした。続いて80℃で24時間保持した。本操作によって，アルギン酸オリゴ糖分子はサケ筋肉中のリジン残基と反応してタンパク質−アルギン酸オリゴ糖複合体（Meat-AO conjugate）を得ることができた。なお、加熱温度を違えて実験した結果を図１に示す。８０℃加熱においては、３時間程度で２４時間加熱と同水準のアルギン酸オリゴ糖を含むMeat-AO conjugateが得られることが明らかとなった。
【００１３】
[アルギン酸オリゴ糖修飾の例]
＜試験条件＞
採卵・採精後のシロサケから落とし身を採肉後、0.2％NaHCO3溶液に懸濁し、回転篩にて予備脱水肉を回収した。これを再び冷水に懸濁し、予備脱水処理を２回実施した。得られた洗浄サケ肉をスクリュープレスで脱水し（水分含量90％程度）、裏ごし機に供して小骨や結締組織などの夾雑物を除去した。続いて、この脱水肉の固形分（タンパク質含有量）に対して等重量のソルビトールと１／２重量のアルギン酸オリゴ糖（AO）を加え，ニーダーで混合・撹拌し，さらに-25℃で貯蔵・凍結乾燥処理によって粉末化した。
この魚肉ー糖混合物を，恒温恒湿乾燥機（タバイ社製 ＰＲ−１Ｇ）を用いて、所定の温度と湿度環境下に保持し、サケ肉タンパク質のリジン残基とアルギン酸オリゴ糖の還元末端の間で起きるメイラード反応を利用して、Meat-AO conjugateを調製した。所定の温度として、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃で５０時間の加熱処理をおこない、アルギン酸オリゴ糖（AO）の結合量を測定した。その結果を図１に示す。また、図２に６０℃と８０℃の３時間処理後のアルギン酸オリゴ糖（AO）の結合量測定結果を示す。加熱処理中の湿度は乾湿式温度計を用いて確認した。
【００１４】
＜アルギン酸オリゴ糖の結合量測定（分析）法＞
0.5M NaCl、40mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)に分散したMeat-AO conjugateをホモジナイズ（13,500 rpm, 30秒×２回）し、60％飽和硫酸アンモニウムによって沈殿させた（氷冷下で30分間撹拌）。これを4℃で遠心分離（20,000×ｇ, 30分）することによって、沈殿にMeat-AO conugateを得た。上清を除去した後、沈殿を60％飽和硫酸アンモニウムに再分散した。この操作を４回繰り返すことによって，未反応のアルギン酸オリゴ糖を完全に除去した。続いてMeat-AO conjugateを0.5 M NaCl (pH 7.5)に溶解し、硫酸アンモニウムを除去するために同溶媒に透析した。
このようにして得たMeat-AO conjugate（未反応のアルギン酸オリゴ糖を除去した溶液）について，アルギン酸オリゴ糖濃度をフェノール硫酸法で，またタンパク質濃度を Biuret法で測定した。そして同一試料中のアルギン酸オリゴ糖濃度（μg/mL）をタンパク質濃度 (mg/mL)で除すことにより，Meat-AO conjugateに結合したアルギン酸オリゴ糖結合量（μg/mg）を算出した。
【００１５】
＜溶解試験＞
６０℃加熱処理のアルギン酸オリゴ糖修飾タンパク質と８０℃・２４時間加熱処理のアルギン酸オリゴ糖修飾タンパク質の0.1 M NaC1に対する溶解度を試験した。６０℃で加熱した場合の各反応時間に対する溶解度を図３（ａ）に、６０℃・３時間加熱及び８０℃・２４時間加熱のアルギン酸オリゴ糖修飾タンパク質の溶解度を図３（ｂ）に示す。
＜結果＞
（１）サケタンパクに対するアルギン酸オリゴ糖の結合反応は、温度によって差があることが明らかであり、アルギン酸オリゴ糖の結合量は、８０℃・３時間未満で１７０μｇ／ｍｇ ｍｅａｔに達して安定することがわかり、低温になるほど結合反応は遅くなり、６０℃・３時間では１３０μｇ／ｍｇ ｍｅａｔ、４０℃では５０時間経過後も１５０μｇ／ｍｇ ｍｅａｔ程度にとどまる。
（２）０．１ＭＮａＣｌ水溶液に対する溶解度は、６０℃・３時間処理してアルギン酸オリゴ糖結合量を１３０μｇ／ｍｇ ｍｅａｔとしたものは７５％溶解し、８０℃・２４時間処理してではアルギン酸オリゴ糖結合量を１７０μｇ／ｍｇ ｍｅａｔとしたものは２０％溶解となり、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾したサケタンパクが得られる。
【実施例】
【００１６】
[ 脂肪排出促進試験 ]
高脂肪飼料とアルギン酸オリゴ糖結合量１７０μｇ／ｍｇ ｍｅａｔとした難水溶性サケタンパク質を混合した飼料をラットに摂取させ、体内脂肪量及び糞便中の脂肪含量を測定し、その影響を試験した。試験条件は下記のとおり。試験結果は図４〜１０に示す。
【００１７】
＜試験条件＞
動物：SDラット、8週齢、雄、７群、ｎ＝７
投与方法：７種類の普通飼料に混餌した飼料を自由摂取させた
測定項目： 体重測定、摂餌量
採 便： 飼料摂取開始2、4、6、8週目の連続3日間
摘出臓器： 白色脂肪（腹腔内脂肪、副睾丸脂肪、腎周囲脂肪）、褐色脂肪組織、肝臓、脾臓、腎臓、盲腸、心臓、精巣
採 血： 総コレステロール、HDLコレステロール、LDLコレステロール、遊離コレステロール、トリグリセリド、リン脂質、遊離脂肪酸、AST、ALT、LD、ALP、総タンパク質、血糖、アルブミン
【００１８】
＜試験群＞
8週齢、雄、SDラットを下記Ａ群〜Ｇ群の７群に分けて、次の物質を摂取させた。
（Ａ）群：コントロール群（n=７）：
コントロール食（AIN93G）
この群は、ラット用の普通の飼料を供与した
（Ｂ）群：脂質投与群（n=７）：
高脂肪食混餌飼料：ラードを30%混入した飼料を供与した。
この群は、高脂肪食摂取した場合の基本データを得ることを意図して設けた。
（Ｃ）群：水溶性魚肉投与群（n=７）：
高脂肪食 ＋ 水溶性魚肉タンパク質（60℃・3時間）
水溶性魚肉タンパク質として、温度60℃・3時間の条件でアルギン酸オリゴ糖を 反応させたものを使用した。
この群は、水溶性魚肉タンパク質の影響を得ることを意図して設けた。
（Ｄ）群：高脂肪食 ＋ 難水溶性魚肉タンパク質（80℃・24時間）投与群（n=７）：
難水溶性魚肉タンパク質として、温度80℃、24時間の条件でアルギン酸オリゴ糖 を反応させたものを使用した。
この群は、難水溶性魚肉タンパク質の影響を得ることを意図して設けた。
（Ｅ）群：高脂肪食 ＋ 未反応魚肉タンパク質 投与群（n=７）：
未反応魚肉タンパク質は、魚肉とアルギン酸オリゴ糖とソルビトールを混合させ ただけのものである。この群は、未反応魚肉タンパク質の影響を確認することを 意図して設けた。
（Ｆ）群：糖類投与群（n=７）：
高脂肪食 ＋ 糖類（アルギン酸オリゴ糖、ソルビトールのみ）
この群は、アルギン酸オリゴ糖、ソルビトールの影響を確認することを意図して 設けた。
（Ｇ）群：糖類投与群（n=７）：
高脂肪食 ＋ 大豆タンパク質（20％）
【００１９】
図４に８週目の体重及び初日と比較した増加体重を示す。高脂肪食を含まないコントロールＡと高脂肪食に難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質を添加したＤ群は、同程度の最終体重及び増加体重量であった。これに対して、高脂肪食を添加した他のＢ群、Ｃ群、Ｅ群、Ｆ群、Ｇ群はＣ群がやや低いものの、増加量は多かった。
この結果、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質は、高脂肪食を摂取しても、体重増加を抑制できることが分かる。抑制の程度は、本実験では高脂肪食を含まない餌と同程度のパフォーマンスであるので、高脂肪食の影響を無視し得る程度である。
【００２０】
図５には（ａ）腹腔内脂肪量、（ｂ）副睾丸脂肪量、（ｃ）腸間膜脂肪量について示している。（ａ）腹腔内脂肪量及び（ｃ）腸間膜脂肪量は、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質を給餌したＤ群のラットが一番少ない脂肪重量であった。（ｂ）副睾丸脂肪量は、コントロールのＡ群の次に少なく、高脂肪食を混入したＢ〜Ｇ群の中では、Ｄ群が一番少ない結果である。水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質は脂肪量を促進する傾向が見られるが、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質は、脂肪の増加を抑制あるいはコントロールの比較において、積極的に排出あるいは吸収阻害機能があるものと想定される。
（ａ）腹腔内脂肪量、（ｂ）副睾丸脂肪量、（ｃ）腸間膜脂肪量を合計した脂肪量を（ｄ）に示す。難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパクが、脂肪量が一番少ない。水溶性アルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質及び未反応の魚肉タンパク質は高脂肪食飼料よりもやや高いので脂肪吸収促進傾向が認められるのに対して、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパクは脂肪増進阻害機能があることが明確である。
【００２１】
図６に８週目の糞便中の脂肪含量を示す。難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質を給餌したＤ群のラットの糞便中に優位に多くの脂質が測定された。図５の脂肪量とあわせて考えると、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質は脂肪の排出を促進しているものと考えられる。
【００２２】
図７〜図９に血液成分についての測定結果を示す。
トリグリセライドは、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質が少ない値を示すが、高脂肪食のＢ群と差はなく、高脂肪食と併用した場合に中立であるが、抑制効果は確認できない。他の成分についても、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質が優位に作用効果を発揮することは確認できなかった。
この結果、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパクは、脂肪排出促進に作用するものと推定できる。
【００２３】
図１０は盲腸壁の重量を示す。難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質を摂取したＤ群や、飼料にアルギン酸オリゴ糖が含まれるその他の群（Ｃ群、Ｅ群、Ｆ群）では、盲腸壁重量がコントロール群よりも増加していた。D群の盲腸壁重量は、水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質（Ｃ群）や未反応魚肉タンパク質摂取群（Ｅ群）のものと大差はなかった。肝臓、脾臓、腎臓、心臓、精巣重量は各群間に差はなく、ラットの健康に問題はなかった。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】アルギン酸オリゴ糖結合量を示すグラフである。
【図２】６０℃・３ｈ、８０℃・３ｈアルギン酸オリゴ糖結合量を示すグラフである。
【図３】(a)６０℃加熱生成アルギン酸オリゴ糖修飾タンパク質の溶解度曲線、(b)６０℃・３時間加熱と８０℃・２４時間加熱によって生成したアルギン酸オリゴ糖修飾タンパク質の溶解度を示すグラフである。
【図４】ラットの体重を示すグラフである。
【図５】脂肪重量を示す。（ａ）腹腔内脂肪量、（ｂ）副睾丸脂肪量、（ｃ）腸間膜脂肪量、（ｄ）合計脂肪量を示す。
【図６】糞便中の脂肪含量（投与後８週目）を示すグラフである。
【図７】血液生化学的検査（脂質関連物質（１））（ａ）トリグリセライド、（ｂ）リン脂質、（ｃ）遊離脂肪酸を示すグラフである。
【図８】血液生化学的検査（脂質関連物質（２））（ａ）総コレステロール、（ｂ）遊離型コレステロールを示すグラフである。
【図９】血液生化学的検査（脂質関連物質（３））（ａ）ＨＤＬコレステロール、（ｂ）ＬＤＬコレステロールを示す。
【図１０】盲腸壁重量を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪排泄促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
過剰なエネルギー摂取が脂肪として体内に蓄積され、近年、内臓型肥満が生活習慣病危険因子として特に注目されている。内臓脂肪蓄積の予防は、メタボリックシンドロームに象徴される重大な生活習慣病の発症リスクを低減させるために重要であると考えられている。
急激に体内に吸収された脂質は、その殆どがエネルギーに変換されることなく、脂肪組織に蓄積されると考えられており、実際に、内臓脂肪量と食後血中中性脂肪量の間には正の相関があるという報告もある。食後高脂血症は、内臓脂肪の蓄積ばかりでなく、それ自身が心臓病や脳卒中等の動脈硬化性疾患の危険因子ともなることから、食事性脂質の吸収調節は生活習慣病全般の予防における重要課題であると考えられている。食事により得られた脂質は、小腸壁より吸収される。
摂取されたエネルギーは運動などによって消費することも対策の１つであるが、食後の急激な脂質吸収の制御も重要な対策と考えられている。脂肪吸収阻害（脂質排泄促進）を示す成分としては、多糖である食物繊維やポリフェノールなどが挙げられるが、タンパク質でこのような効果を示すものは見受けられない。
【０００３】
特許文献１（特開２００７−９９６５１号公報）には、脂質の胃内滞留時間を延長させる作用を有する剤として雲南紅茶の抽出物を有効成分とする抗脂肪性薬剤が提案されている。
特許文献２（特開２００７−２４６４７１号公報）には、血中中性脂肪の上昇を抑制する剤として、シソ（Perilla frutescens）乾燥物の濃度９０〜９９．９容量％エタノール水溶液の抽出物を有効成分とする血中中性脂肪上昇抑制剤が提案されている。
【０００４】
本発明者は、糖修飾タンパクの利用に関する研究開発を続けてきた。先に本発明者は、水溶性に優れた筋肉タンパク質を開発し提案（特許文献３（特許３８６００２５号公報）参照）した。更に、この新規な水溶性に優れた筋肉タンパク質の応用研究開発を継続している。この水溶性に優れた筋肉タンパク質が、血中中性脂肪上昇抑制作用を示すことを見出し、糖修飾タンパク質を有効成分とする血中中性脂肪上昇抑制剤として特願２００７−３０６９１８号に提案した。
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−９９６５１号公報
【特許文献２】特開２００７−２４６４７１号公報
【特許文献３】特許３８６００２５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
糖修飾タンパク質の新たな機能の探求を続けた結果、難水溶性の糖修飾タンパク質に注目し、新たな機能を提供することを目的とする。特に、本発明は、脂肪吸収阻害について着目したものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の主な構成は次のとおりである。
（１）難水溶性糖修飾タンパク質を有効成分とする脂肪排泄促進剤。
（２）難水溶性糖修飾タンパク質が、糖修飾魚肉タンパク質であることを特徴とする（１）記載の脂肪排泄促進剤。
（３）難水溶性糖修飾タンパク質が、サケの筋肉タンパク質とアルギン酸オリゴ糖を混合し、８０℃以上で加熱処理して得られた魚肉タンパク質であることを特徴とする（１）記載の脂肪排泄促進剤。
【発明の効果】
【０００８】
難水溶性魚肉タンパク質などの難水溶性糖修飾タンパク質を摂取することにより、脂肪の増加を抑制し、脂肪排泄を促進することができる。
高脂肪食時に難水溶性魚肉タンパク質を同時に摂取することにより、体重増加を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
糖修飾タンパク質は、サケやコイなどの魚類やホタテ貝などの貝類など魚介類、トリ、ブタ、ウシなど家畜類の筋肉タンパク質を糖修飾して、水に難溶化したタンパク質とする。本件発明に用いる難水溶性タンパク質は、筋肉タンパク質と還元糖類の間で起きるメイラード反応を進行させることによって難水溶性を付与した鮭肉タンパク（難水溶性魚肉タンパク質）である。
【００１０】
魚介類、家畜類の肉を細切りして、筋肉タンパク質を抽出し、或いはそのまま、還元糖類と混合し、脱水し、相対湿度３５％以下で８０℃以上に保持することにより、溶解度を２０％以下とする糖修飾タンパク質とすることができる。
還元糖類としては、単糖(グルコース、リボースなど)、平均重合度２０以下のオリゴ糖類で還元末端を有しているもの、例えば、アルギン酸オリゴ糖、キトサンオリゴ糖などの還元性オリゴ糖が挙げられる。
タンパク質変性防止剤としては、グルコースやソルビトール等が挙げられる。
【００１１】
本件発明におけるタンパク質と糖の混合比は、筋肉タンパク質：糖類＝１：０．１〜１：１０の範囲が望ましい。
筋肉タンパク質は、糖と混合後、脱水処理に付される。脱水処理は、例えば、相対湿度10％の低湿度下での加熱処理や、凍結乾燥、噴霧乾燥、減圧乾燥等の処理あるいはこれらの組み合わせ処理により行うことができる。又、脱水処理により、メイラード反応に好適な0.25〜6.0％の水分含量とすることもできるが、脱水処理終了時点での水分含量が6.0％を上回るものであったとしても、相対湿度35％以下で、30〜70℃に保持することにより、水分含量を0.25〜6.0％の範囲にすることもできる。
【００１２】
[難水溶性魚肉タンパク質の製法例]
＜サケ筋肉タンパク質のアルギン酸オリゴ糖修飾例＞
サケ筋肉を径２mm以下にミートチョッパーで細切した。このサケ魚肉100ｇに対してそれに含まれる筋原線維タンパク質量（15％湿重量）と等量のアルギン酸オリゴ糖（15ｇ）とソルビトール（14.1ｇ）を混合した後、凍結乾燥によって脱水して水分含量を0.9％とした。続いて80℃で24時間保持した。本操作によって，アルギン酸オリゴ糖分子はサケ筋肉中のリジン残基と反応してタンパク質−アルギン酸オリゴ糖複合体（Meat-AO conjugate）を得ることができた。なお、加熱温度を違えて実験した結果を図１に示す。８０℃加熱においては、３時間程度で２４時間加熱と同水準のアルギン酸オリゴ糖を含むMeat-AO conjugateが得られることが明らかとなった。
【００１３】
[アルギン酸オリゴ糖修飾の例]
＜試験条件＞
採卵・採精後のシロサケから落とし身を採肉後、0.2％NaHCO3溶液に懸濁し、回転篩にて予備脱水肉を回収した。これを再び冷水に懸濁し、予備脱水処理を２回実施した。得られた洗浄サケ肉をスクリュープレスで脱水し（水分含量90％程度）、裏ごし機に供して小骨や結締組織などの夾雑物を除去した。続いて、この脱水肉の固形分（タンパク質含有量）に対して等重量のソルビトールと１／２重量のアルギン酸オリゴ糖（AO）を加え，ニーダーで混合・撹拌し，さらに-25℃で貯蔵・凍結乾燥処理によって粉末化した。
この魚肉ー糖混合物を，恒温恒湿乾燥機（タバイ社製 ＰＲ−１Ｇ）を用いて、所定の温度と湿度環境下に保持し、サケ肉タンパク質のリジン残基とアルギン酸オリゴ糖の還元末端の間で起きるメイラード反応を利用して、Meat-AO conjugateを調製した。所定の温度として、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃で５０時間の加熱処理をおこない、アルギン酸オリゴ糖（AO）の結合量を測定した。その結果を図１に示す。また、図２に６０℃と８０℃の３時間処理後のアルギン酸オリゴ糖（AO）の結合量測定結果を示す。加熱処理中の湿度は乾湿式温度計を用いて確認した。
【００１４】
＜アルギン酸オリゴ糖の結合量測定（分析）法＞
0.5M NaCl、40mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)に分散したMeat-AO conjugateをホモジナイズ（13,500 rpm, 30秒×２回）し、60％飽和硫酸アンモニウムによって沈殿させた（氷冷下で30分間撹拌）。これを4℃で遠心分離（20,000×ｇ, 30分）することによって、沈殿にMeat-AO conugateを得た。上清を除去した後、沈殿を60％飽和硫酸アンモニウムに再分散した。この操作を４回繰り返すことによって，未反応のアルギン酸オリゴ糖を完全に除去した。続いてMeat-AO conjugateを0.5 M NaCl (pH 7.5)に溶解し、硫酸アンモニウムを除去するために同溶媒に透析した。
このようにして得たMeat-AO conjugate（未反応のアルギン酸オリゴ糖を除去した溶液）について，アルギン酸オリゴ糖濃度をフェノール硫酸法で，またタンパク質濃度を Biuret法で測定した。そして同一試料中のアルギン酸オリゴ糖濃度（μg/mL）をタンパク質濃度 (mg/mL)で除すことにより，Meat-AO conjugateに結合したアルギン酸オリゴ糖結合量（μg/mg）を算出した。
【００１５】
＜溶解試験＞
６０℃加熱処理のアルギン酸オリゴ糖修飾タンパク質と８０℃・２４時間加熱処理のアルギン酸オリゴ糖修飾タンパク質の0.1 M NaC1に対する溶解度を試験した。６０℃で加熱した場合の各反応時間に対する溶解度を図３（ａ）に、６０℃・３時間加熱及び８０℃・２４時間加熱のアルギン酸オリゴ糖修飾タンパク質の溶解度を図３（ｂ）に示す。
＜結果＞
（１）サケタンパクに対するアルギン酸オリゴ糖の結合反応は、温度によって差があることが明らかであり、アルギン酸オリゴ糖の結合量は、８０℃・３時間未満で１７０μｇ／ｍｇ ｍｅａｔに達して安定することがわかり、低温になるほど結合反応は遅くなり、６０℃・３時間では１３０μｇ／ｍｇ ｍｅａｔ、４０℃では５０時間経過後も１５０μｇ／ｍｇ ｍｅａｔ程度にとどまる。
（２）０．１ＭＮａＣｌ水溶液に対する溶解度は、６０℃・３時間処理してアルギン酸オリゴ糖結合量を１３０μｇ／ｍｇ ｍｅａｔとしたものは７５％溶解し、８０℃・２４時間処理してではアルギン酸オリゴ糖結合量を１７０μｇ／ｍｇ ｍｅａｔとしたものは２０％溶解となり、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾したサケタンパクが得られる。
【実施例】
【００１６】
[ 脂肪排出促進試験 ]
高脂肪飼料とアルギン酸オリゴ糖結合量１７０μｇ／ｍｇ ｍｅａｔとした難水溶性サケタンパク質を混合した飼料をラットに摂取させ、体内脂肪量及び糞便中の脂肪含量を測定し、その影響を試験した。試験条件は下記のとおり。試験結果は図４〜１０に示す。
【００１７】
＜試験条件＞
動物：SDラット、8週齢、雄、７群、ｎ＝７
投与方法：７種類の普通飼料に混餌した飼料を自由摂取させた
測定項目： 体重測定、摂餌量
採 便： 飼料摂取開始2、4、6、8週目の連続3日間
摘出臓器： 白色脂肪（腹腔内脂肪、副睾丸脂肪、腎周囲脂肪）、褐色脂肪組織、肝臓、脾臓、腎臓、盲腸、心臓、精巣
採 血： 総コレステロール、HDLコレステロール、LDLコレステロール、遊離コレステロール、トリグリセリド、リン脂質、遊離脂肪酸、AST、ALT、LD、ALP、総タンパク質、血糖、アルブミン
【００１８】
＜試験群＞
8週齢、雄、SDラットを下記Ａ群〜Ｇ群の７群に分けて、次の物質を摂取させた。
（Ａ）群：コントロール群（n=７）：
コントロール食（AIN93G）
この群は、ラット用の普通の飼料を供与した
（Ｂ）群：脂質投与群（n=７）：
高脂肪食混餌飼料：ラードを30%混入した飼料を供与した。
この群は、高脂肪食摂取した場合の基本データを得ることを意図して設けた。
（Ｃ）群：水溶性魚肉投与群（n=７）：
高脂肪食 ＋ 水溶性魚肉タンパク質（60℃・3時間）
水溶性魚肉タンパク質として、温度60℃・3時間の条件でアルギン酸オリゴ糖を 反応させたものを使用した。
この群は、水溶性魚肉タンパク質の影響を得ることを意図して設けた。
（Ｄ）群：高脂肪食 ＋ 難水溶性魚肉タンパク質（80℃・24時間）投与群（n=７）：
難水溶性魚肉タンパク質として、温度80℃、24時間の条件でアルギン酸オリゴ糖 を反応させたものを使用した。
この群は、難水溶性魚肉タンパク質の影響を得ることを意図して設けた。
（Ｅ）群：高脂肪食 ＋ 未反応魚肉タンパク質 投与群（n=７）：
未反応魚肉タンパク質は、魚肉とアルギン酸オリゴ糖とソルビトールを混合させ ただけのものである。この群は、未反応魚肉タンパク質の影響を確認することを 意図して設けた。
（Ｆ）群：糖類投与群（n=７）：
高脂肪食 ＋ 糖類（アルギン酸オリゴ糖、ソルビトールのみ）
この群は、アルギン酸オリゴ糖、ソルビトールの影響を確認することを意図して 設けた。
（Ｇ）群：糖類投与群（n=７）：
高脂肪食 ＋ 大豆タンパク質（20％）
【００１９】
図４に８週目の体重及び初日と比較した増加体重を示す。高脂肪食を含まないコントロールＡと高脂肪食に難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質を添加したＤ群は、同程度の最終体重及び増加体重量であった。これに対して、高脂肪食を添加した他のＢ群、Ｃ群、Ｅ群、Ｆ群、Ｇ群はＣ群がやや低いものの、増加量は多かった。
この結果、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質は、高脂肪食を摂取しても、体重増加を抑制できることが分かる。抑制の程度は、本実験では高脂肪食を含まない餌と同程度のパフォーマンスであるので、高脂肪食の影響を無視し得る程度である。
【００２０】
図５には（ａ）腹腔内脂肪量、（ｂ）副睾丸脂肪量、（ｃ）腸間膜脂肪量について示している。（ａ）腹腔内脂肪量及び（ｃ）腸間膜脂肪量は、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質を給餌したＤ群のラットが一番少ない脂肪重量であった。（ｂ）副睾丸脂肪量は、コントロールのＡ群の次に少なく、高脂肪食を混入したＢ〜Ｇ群の中では、Ｄ群が一番少ない結果である。水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質は脂肪量を促進する傾向が見られるが、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質は、脂肪の増加を抑制あるいはコントロールの比較において、積極的に排出あるいは吸収阻害機能があるものと想定される。
（ａ）腹腔内脂肪量、（ｂ）副睾丸脂肪量、（ｃ）腸間膜脂肪量を合計した脂肪量を（ｄ）に示す。難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパクが、脂肪量が一番少ない。水溶性アルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質及び未反応の魚肉タンパク質は高脂肪食飼料よりもやや高いので脂肪吸収促進傾向が認められるのに対して、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパクは脂肪増進阻害機能があることが明確である。
【００２１】
図６に８週目の糞便中の脂肪含量を示す。難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質を給餌したＤ群のラットの糞便中に優位に多くの脂質が測定された。図５の脂肪量とあわせて考えると、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質は脂肪の排出を促進しているものと考えられる。
【００２２】
図７〜図９に血液成分についての測定結果を示す。
トリグリセライドは、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質が少ない値を示すが、高脂肪食のＢ群と差はなく、高脂肪食と併用した場合に中立であるが、抑制効果は確認できない。他の成分についても、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質が優位に作用効果を発揮することは確認できなかった。
この結果、難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパクは、脂肪排出促進に作用するものと推定できる。
【００２３】
図１０は盲腸壁の重量を示す。難水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質を摂取したＤ群や、飼料にアルギン酸オリゴ糖が含まれるその他の群（Ｃ群、Ｅ群、Ｆ群）では、盲腸壁重量がコントロール群よりも増加していた。D群の盲腸壁重量は、水溶性のアルギン酸オリゴ糖修飾魚肉タンパク質（Ｃ群）や未反応魚肉タンパク質摂取群（Ｅ群）のものと大差はなかった。肝臓、脾臓、腎臓、心臓、精巣重量は各群間に差はなく、ラットの健康に問題はなかった。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】アルギン酸オリゴ糖結合量を示すグラフである。
【図２】６０℃・３ｈ、８０℃・３ｈアルギン酸オリゴ糖結合量を示すグラフである。
【図３】(a)６０℃加熱生成アルギン酸オリゴ糖修飾タンパク質の溶解度曲線、(b)６０℃・３時間加熱と８０℃・２４時間加熱によって生成したアルギン酸オリゴ糖修飾タンパク質の溶解度を示すグラフである。
【図４】ラットの体重を示すグラフである。
【図５】脂肪重量を示す。（ａ）腹腔内脂肪量、（ｂ）副睾丸脂肪量、（ｃ）腸間膜脂肪量、（ｄ）合計脂肪量を示す。
【図６】糞便中の脂肪含量（投与後８週目）を示すグラフである。
【図７】血液生化学的検査（脂質関連物質（１））（ａ）トリグリセライド、（ｂ）リン脂質、（ｃ）遊離脂肪酸を示すグラフである。
【図８】血液生化学的検査（脂質関連物質（２））（ａ）総コレステロール、（ｂ）遊離型コレステロールを示すグラフである。
【図９】血液生化学的検査（脂質関連物質（３））（ａ）ＨＤＬコレステロール、（ｂ）ＬＤＬコレステロールを示す。
【図１０】盲腸壁重量を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
難水溶性糖修飾タンパク質を有効成分とする脂肪増加抑制剤及び／又は脂肪排泄促進剤。
【請求項２】
難水溶性糖修飾タンパク質が、糖修飾魚肉タンパク質であることを特徴とする請求項１記載の脂肪増加抑制剤及び／又は脂肪排泄促進剤。
【請求項３】
難水溶性糖修飾タンパク質が、サケの筋肉タンパク質とアルギン酸オリゴ糖を混合し、８０℃以上で加熱処理して得られた魚肉タンパク質であることを特徴とする請求項１記載の脂肪増加抑制剤及び／又は脂肪排泄促進剤。
【請求項１】
難水溶性糖修飾タンパク質を有効成分とする脂肪増加抑制剤及び／又は脂肪排泄促進剤。
【請求項２】
難水溶性糖修飾タンパク質が、糖修飾魚肉タンパク質であることを特徴とする請求項１記載の脂肪増加抑制剤及び／又は脂肪排泄促進剤。
【請求項３】
難水溶性糖修飾タンパク質が、サケの筋肉タンパク質とアルギン酸オリゴ糖を混合し、８０℃以上で加熱処理して得られた魚肉タンパク質であることを特徴とする請求項１記載の脂肪増加抑制剤及び／又は脂肪排泄促進剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１０−４７５０９（Ｐ２０１０−４７５０９Ａ）
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２１２５７４（Ｐ２００８−２１２５７４）
【出願日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【出願人】（５９３１０６９１８）株式会社ファンケル (310)
【Ｆターム（参考）】
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