脈管の疾患を処置するための方法
本明細書において含まれる組成物および方法は、アテローム性動脈硬化症ならびに他の脈管疾患（例えば、血栓症、血管形成術および／またはステントの後の再狭窄、ならびにバイパス手術後の静脈移植片疾患）の、ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）および／または骨髄性分化因子８８（ＭｙＤ８８）の発現または生物学的活性の阻害による処置を記載する。ＴＬＲ４細胞シグナル伝達は、少なくとも部分的に、アテローム性動脈硬化症および他の形態の脈管疾患の発現、継続、および／または悪化の原因である。本発明は、ＴＬＲ４レセプターおよび／またはＭｙＤ８８の生物学的活性に影響を及ぼすことによってこのシグナル伝達経路を阻害するために用いる、いくつかの手段を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府の権利）
本明細書において記載される発明は、国立保健研究所とＤｒ．Ｍｏｓｈｅ Ａｒｄｉｔｉ（Ｄｅｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）との間の助成金第ＨＬ−５１０８７号および同第ＡＩ−５０６９９号の経過において生じたか、またはそれらの下で生じた。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、シグナル伝達経路に関する。より詳細には、本発明は、ｔｏｌｌ様レセプター（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）４（ＴＬＲ４）のアンタゴニストおよび骨髄性分化因子（ｍｙｅｌｉｏｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）８８（ＭｙＤ８８）の機能のアンタゴニストに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
心臓疾患は、依然として世界的に主要な死亡の原因であり、年間総死亡数の３０％近く（すなわち、およそ１，５００万人）の原因である。心臓および脈管の疾患は、毎年さらに多くの個体を衰弱させる。多数にとって、アテローム性動脈硬化症は、終生続く過程である；アテローム性動脈硬化症は、幼年期に初期段階を有し得、中年または中年以降まで臨床的な発現がないことがあり得る。アテローム性動脈硬化症の発症は、不健康な生活習慣（例えば、タバコの使用、バランスの悪い食事、および身体的不活動）に繰り返し関連付けられてきた。心臓および脈管の疾患の種々の形態の検出および処置には、大きな進歩がもたらされてきたが、予防的手段および組み合わされた処置レジメンは、通常、内在する疾患状態を休止させることもまたは治癒させることも出来ない。
【０００４】
アテローム性動脈硬化症は、現在、アテローム発生性リポタンパク質（ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、細胞外マトリックス、新脈管（ｎｅｏｖｅｓｓｅｌ）、カルシウム、および炎症細胞の内皮下での蓄積によって特徴付けられる慢性炎症性疾患であると見なされる。脈管壁における炎症遺伝子の活性化、ならびにその後の炎症細胞および免疫細胞（例えば、単球およびＴ細胞）の接着、化学誘引、内皮下遊走、残留、および活性化は、アテローム性動脈硬化症の開始、進行、および不安定化において重要な役割を果たすと考えられる（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。先天免疫系の感染性因子および感染性成分がアテローム性動脈硬化症の原因としての潜在的な役割に焦点を当てた関心が高まっている（非特許文献７）。しかし、抗生物質による心臓血管疾患の処置を調査する臨床試験は、矛盾する結果をもたらしている（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。これは、おそらくは、差異を検出する能力が不十分であることに起因するか、または他の短所に起因する（非特許文献１１）。
【０００５】
臨床学的な失望にも関わらず、理解が深まると共に、抗生物質および／または免疫による心臓血管疾患の処置が将来的に実現することを示唆する、実験的な証拠が蓄積している（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。特に、動物研究からの興味深いデータは、アテローム性動脈硬化症に基づく病理学における、ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）および先天性免疫系の他の重要な成分の潜在的な重要性を示唆する（非特許文献１５；非特許文献１６）。ＴＬＲは、細菌性病原体または病原体関連分子パターンに応答して炎症促進性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）シグナル伝達経路を活性化するレセプターのファミリーである。ＴＬＲへのリガンド結合は、このレセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプタードメインへの、アダプター分子である骨髄性分化因子８８（ＭｙＤ８８）の漸増をもたらす。シグナルの細胞内伝播は、転写因子であるＮＦ−κＢの活性化をもたらし、それによって、炎症応答に影響を及ぼす（非特許文献１７）。さらに、研究は、ＭｙＤ８８を介してシグナル伝達するＴＬＲが、多くの細菌性病原体に対する炎症促進性サイトカイン応答において必須であることを示した（非特許文献１８）。ＭｙＤ８８は、種々の細胞レセプターによる生化学的シグナル伝達のために必要なアダプタータンパク質であり、そのような細胞レセプターとして、例えば、ＴＬＲ４のようなＴＬＲ、ならびにインターロイキン−１（ＩＬ−１）およびインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）が挙げられる。
【０００６】
研究は、ヒトおよびマウスの脂質が豊富なアテローム性動脈硬化症のプラークがＴＬＲ４を発現すること、ならびに、マクロファージにおけるＴＬＲ４の発現が、酸化された低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）によってアップレギュレートされるが、ネイティブのＬＤＬによってはアップレギュレートされないことを示した（非特許文献１９；非特許文献２０）。インビトロの研究は、炎症促進性かつアテローム発生促進性（ｐｒｏａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ）のリポタンパク質である最小限に改変されたＬＤＬ（ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＬＤＬ：ＭＭ−ＬＤＬ）が、マクロファージ上のＴＬＲ４およびそのコレセプター（ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるＣＤ１４によって認識されること、ならびに、このリポタンパク質の結合がアクチン重合およびマクロファージの拡散をもたらすことを実証した（非特許文献２１）。ヒトの内皮細胞（ＥＣ）において、ＴＬＲ４によるＭＭ−ＬＤＬの認識は、単球の遊出および脈管壁での残留において重要なケモカインであるＩＬ−８の分泌をもたらす（非特許文献２２）。しかし、ＭＭ−ＬＤＬのこの作用は、ＣＤ１４非依存的である。ＴＬＲ４遺伝子の多型を発現する患者は、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）低応答性を発現し、頚動脈のアテローム性動脈硬化症および急性の冠状動脈のイベントから保護され（非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６）、そしてスタチンを用いての危険性低減からより高い利益を引き出す（非特許文献２７）。まとめると、これらの知見は、ＴＬＲシグナル伝達が、アテローム性動脈硬化症のプラークの発達において役割を果たし得ることを示唆する。
【非特許文献１】Ｒｏｓｓ，Ｒ．「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」、１９９９年、第３４０巻、ｐ．１１５−１２６
【非特許文献２】Ｇｌａｓｓ，Ｃ．Ｋ．およびＷｉｔｚｔｕｍ，Ｊ．Ｌ．「Ｃｅｌｌ」、２００１年、第１０４巻、ｐ．５０３−５１６
【非特許文献３】Ｓｈａｈ，Ｐ．Ｋ．「Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．」、２００３年、第４１巻、ｐ．１５Ｓ−２２Ｓ
【非特許文献４】Ｌｉｂｂｙ，Ｐ．「Ｎａｔｕｒｅ」、２００２年、第４２０巻、ｐ．８６８−８７４
【非特許文献５】Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｇ．Ｋ．ら、「Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．」、２００２年、第９１巻、ｐ．２８１−２９１
【非特許文献６】Ｂｉｎｄｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、「Ｎａｔ．Ｍｅｄ．」、２００２年、第８巻、ｐ．１２１８−１２２６
【非特許文献７】Ｋｏｌ，Ａ．およびＬｉｂｂｙ，Ｐ．「Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．」、１９９８年、第８巻、ｐ．１９１−１９９
【非特許文献８】Ｓａｎｄｅｒ，Ｄ．ら、「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００４年、第１０９巻、ｐ．１０１０−１０１５
【非特許文献９】Ｚａｈｎ，Ｒ．ら、「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００３年、第１０７巻、ｐ．１２５３−１２５９
【非特許文献１０】Ｓａｎｄｅｒ，Ｄ．ら、「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００２年、第１０６巻、ｐ．２４２８−２４３３
【非特許文献１１】Ｇｒａｙｓｔｏｎ，Ｊ．Ｔ．「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００３年、第１０７巻、ｐ．１２２８−１２３０
【非特許文献１２】Ｆｒｅｄｒｉｋｓｏｎ，Ｇ．Ｎ．ら、「Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．」、２００３年、第２３巻、ｐ．８７９−８８４
【非特許文献１３】Ｂｉｎｄｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、「Ｎａｔ．Ｍｅｄ．」、２００３年、第９巻、ｐ．７３６−７４３
【非特許文献１４】Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｇ．Ｋ．「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００２年、第１０６巻、ｐ．１５９９−１６０１
【非特許文献１５】Ｍｉｃｈｅｌｓｅｎ，Ｋ．Ｓ．ら「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２００４年、第１７３巻、ｐ．５９０１−５９０７
【非特許文献１６】ｄｅ Ｋｌｅｉｊｎ，Ｄ．およびＰａｓｔｅｒｋａｍｐ，Ｇ．「Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．」、２００３年、第６０巻、ｐ．５８−６７
【非特許文献１７】Ｚｈａｎｇ，Ｇ．およびＧｈｏｓｈ，Ｓ．「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．」、２００１年、第１０７巻、ｐ．１３−１９
【非特許文献１８】Ｄｅｌ Ｒｉｏ，Ｌ．ら「Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２００４年、第１７２巻、ｐ．６９５４−６０
【非特許文献１９】Ｘｕ，Ｘ．Ｈ．ら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００１年、第１０４巻、ｐ．３１０３−３１０８
【非特許文献２０】Ｅｄｆｅｌｄｔ，Ｋ．ら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００２年、第１０５巻、ｐ．１１５８−１１６１
【非特許文献２１】Ｍｉｌｌｅｒ，Ｙ．Ｉ．ら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、２００３年、第２７８巻、ｐ．１５６１−１５６８
【非特許文献２２】Ｗａｌｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、２００３年、第２７８巻、ｐ．２９６６１−２９６６６
【非特許文献２３】Ａｒｂｏｕｒ，Ｎ．Ｃ．ら「Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．」、２０００年、第２５巻、ｐ．１８７−１９１
【非特許文献２４】Ｋｉｅｃｈｌ，Ｓ．ら「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」、２００２年、第３４７巻、ｐ．１８５−１９２
【非特許文献２５】Ｋｉｅｃｈｌ，Ｓ．ら「Ａｎｎ．Ｍｅｄ．」、２００３年、第３５巻、ｐ．１６４−１７１
【非特許文献２６】Ａｍｅｚｉａｎｅ，Ｎ．ら「Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．」、２００３年、第２３巻、ｐ．６１−６４
【非特許文献２７】Ｂｏｅｋｈｏｌｄｔ，Ｓ．Ｍ．ら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００３年、第１０７巻、ｐ．２４１６−２４２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
脈管の疾患のための従来の処置は、実質的な欠点を有する：多くは部分的にしか有効でなく、関連する状態の本当の治癒を提供するものはほとんどない。この分野において、アテローム性動脈硬化症を含む脈管の疾患を、予防、処置、および治癒するための方法の明確な必要性が存在したままである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願を通して参照される全ての文献の開示は、本明細書において参考として援用される。
【０００９】
上記の関連技術の例、およびそれらの例に関連する限定は、例示的であることを意図されており、排他的であることを意図されない。関連技術の他の限定は、本明細書を読み図面をよく見れば当業者に明らかとなる。
【００１０】
（発明の要旨）
以下の実施形態およびそれらの局面は、組成物および方法と組み合わせて記載され例証される。それらの組成物および方法は、例示的かつ例証的であることを意味され、範囲の限定となることを意味されない。種々の実施形態において、一つ以上の上記の問題が、低減されるかまたは取り除かれており、一方、他の実施形態は、他の改善を目的とする。
【００１１】
ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）および骨髄性分化因子８８（ＭｙＤ８８）は、種々の疾患状態に関するシグナル伝達経路に関与することが公知である。そのような疾患状態としては、例えば、アテローム性動脈硬化症が挙げられる。種々の実施形態において、ＴＬＲ４の機能およびＭｙＤ８８シグナル伝達経路をＴＬＲ４インヒビターおよび／またはＭｙＤ８８インヒビターを投与することによって阻害するための組成物および方法が、開示される。
【００１２】
非限定的な例による実施形態として、ｔｏｌｌ様レセプター４（「ＴＬＲ４」）および／または骨髄性分化因子８８（ＭｙＤ８８）の生物学的活性を阻害するための方法（例えば、それらの発現またはシグナル伝達を阻害することによる方法）が挙げられる。さらに、非限定的な例による実施形態は、疾患を処置する方法を提供し、その方法において、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の阻害が有益な効果を有する。そのような疾患としては、例えば、アテローム性動脈硬化症および血栓症のような脈管疾患、血管形成および／またはステント（ｓｔｅｎｔｉｎｇ）後の再狭窄、および、バイパス手術後の静脈−移植片疾患（ｖｅｉｎ−ｇｒａｆｔ ｄｉｓｅａｓｅ）が挙げられる。
【００１３】
非限定的な例による別の実施形態としては、種々のペプチド模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）を使用してＭｙＤ８８細胞シグナル伝達経路を阻害する方法が挙げられる。この方法は、ＴＬＲ４レセプターに結合する低分子のペプチド（すなわち、およそ１０〜２０アミノ酸のペプチド）の導入を伴い、それによってＴＬＲ４レセプターがＭｙＤ８８に結合することもＭｙＤ８８シグナルカスケードを誘発することも妨げる。この様式において、ＴＬＲ４レセプターがＭｙＤ８８に正しく結合し得ないので、ＭｙＤ８８シグナル伝達が遮断される。
【００１４】
同様に、非限定的な例による別の実施形態としては、種々のペプチド模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）を使用してＴＬＲ４細胞シグナル伝達経路を阻害する方法が挙げられる。この方法は、内因性ＭｙＤ８８に結合する低分子のペプチド（すなわち、およそ１０〜２０アミノ酸のペプチド）の導入を伴い、それによって内因性ＭｙＤ８８がＴＬＲ４に結合することもＴＬＲ４シグナルカスケードを誘発することも妨げる。この様式において、利用可能なＴＬＲ４模倣物が利用可能な内因性ＭｙＤ８８について競合するので、ＴＬＲ４シグナル伝達が遮断される。
【００１５】
非限定的な例による別の実施形態としては、抗ＴＬＲ４抗体および／または抗ＭｙＤ８８抗体の導入を介してＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の発現を阻害する方法が挙げられる。そのような抗体は、任意の従来の機構を介して、哺乳動物においてＴＬＲ４シグナル伝達および／またはＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害するための有効量で、哺乳動物に送達され得る。
【００１６】
上記の例示的な局面および実施形態に加えて、図面の参照および以下の詳細な説明をよく読むことによって、さらなる局面および実施形態が明らかになる。
【００１７】
例示的実施形態は、参照される図面において示される。本明細書において開示されるこれらの実施形態および図は、制限的であるよりむしろ例証的であるとみなされることが意図される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（詳細な説明）
本明細書において考察される実施形態は、ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）および骨髄性分化因子８８（ＭｙＤ８８）の活性および発現を阻害するための組成物および方法に基づく。種々の実施形態において、これらの方法は、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の活性の阻害が患者に対して有益な効果（例えば、疾患の改善、その疾患の合併症の重篤度の緩和、その疾患の顕在化の予防、その疾患の再発の予防、単にその疾患の悪化の予防、または上述のいずれかに影響するための治療努力（たとえそのような治療努力が最終的に不首尾であるとしても））を有する任意の疾患を処置するために、使用され得る。ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の活性が、その疾患を含む病理学的状態の開始、悪化、または維持において役割を果たすことが公知であるかまたは推測されている疾患が、当該分野において公知である。アテローム性動脈硬化症、再狭窄、炎症、および他の脈管疾患が、例である。本発明の方法は、これらの疾患のいずれかを処置するために使用され得る。
【００１９】
蓄積している証拠が、免疫系とアテローム性動脈硬化症との間の根本的な関連を示すが、これまでのところ、この証拠は主として間接的であった。本明細書において実証されるように、ＭｙＤ８８またはＴＬＲ４のいずれかの遺伝子欠損は、ＡｐｏＥ欠損マウスにおいて、大動脈アテローム性動脈硬化症を軽減した。さらに、ＭｙＤ８８またはＴＬＲ４の欠損は、より強い構造的安定性を示唆するプラーク組成の変化と関連していた。このことは、脂質およびマクロファージ内容物の減少、および炎症促進性酵素であるＣＯＸ−２の発現の著しい減少によって証拠付けられる。遺伝的ＭｙＤ８８欠損を有するマウスまたはこの欠損を有さないマウスに由来する内皮細胞（ＥＣ）を用いた細胞培養研究は、遺伝的なＭｙＤ８８の欠損によって、白血球−ＥＣ接着が著しく妨げられることを示した。最後に、ＭｙＤ８８欠損またはＴＬＲ４欠損のアテローム保護的（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）効果は、血清のコレステロールまたはリポタンパク質の変化に起因する二次的なものではないことが示された。なおさらに、循環する炎症促進性サイトカインＩＬ−１２および単球化学誘導タンパク質１（ＭＣＰ−１）の減少の知見は、ＭｙＤ８８欠損およびＴＬＲ４欠損のアテローム保護的効果が、部分的には、全身性炎症の低減からもたらされ得ることを示唆する。集合的に、これらの結果は、直接的に、先天免疫シグナル伝達が、全身性効果および局所性効果の両方を有することを示す。これらの効果は、共に、アテローム性動脈硬化症の発症を著しく阻害し、より安定なプラーク表現型を促進する。
【００２０】
ＭｙＤ８８は、全てのＴＬＲ（ＴＬＲ３を除く）、ならびにＩＬ−１レセプターおよびＩＬ−１８レセプターのシグナルを伝達すると考えられている。ＡｐｏＥ−／−の背景のＩＬ−１β欠損マウスを使用した先行の研究（Ｋｉｒｉｉ，Ｈ．ら（２００３）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２３，６５６−６６０）は、アテローム性動脈硬化症の程度の、穏かな３０％の軽減を見出した。これは、ＭｙＤ８８およびＡｐｏＥの両方を欠損したマウスに関して本明細書において考察される結果（図１）において観察された６０％近くの軽減より、かなり小さい。この知見は、ＭｙＤ８８シグナルが、インタクトなＩＬ−１βシグナル伝達に依存する効果に加えて、下流のアテローム発生促進性効果を媒介することを示唆する。インタクトなＩＬ−１βシグナル伝達を備えるＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスを用いた結果は、この解釈と一致した。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスと比較して、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスは、より穏かだが有意なアテローム性動脈硬化症の病変の縮小（それぞれ、５７％対２４％）を示し、そして、マクロファージ浸潤およびＭＣＰ−１血清濃度の持続性の減少を示した。しかし、この穏かな縮小は、予測されていなかったわけではない。アテローム性動脈硬化症は、多要因性（ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ）であり、動的であり、脈管構造内において時間的および位置的に可変性が高い。多くの重要な寄与物が存在するので、この疾患の罹患率または範囲のいずれかにおける絶大な可変性の原因である、単独の原因は存在しない。本明細書において考察されるこれらの結果は、これらの見解と一致し、ＴＬＲ４シグナル伝達およびＭｙｄ８８シグナル伝達は、一つの原因であることを示すが、また、インタクトな免疫機構が、この疾患に二次的に関連しているというよりもむしろ、この疾患の病因の重要な寄与物であることを、直接的に示す。加えて、ＭｙＤ８８を使用する他のＴＬＲもまた、アテローム発生に関与し得る。近年、数種の細菌性またはウイルス性の微生物が、アテローム発生に関与しているとみなされており、これらの微生物は、例えば、ＴＬＲ２に対するリガンドを含有する（Ｂｉｎｄｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，１２１８−１２２６；Ｌｉｂｂｙ，Ｐ．，Ｒｉｄｋｅｒ，Ｐ．Ｍ．およびＭａｓｅｒｉ，Ａ．（２００２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０５，１１３５−１１４３；Ｍｕｈｌｅｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．（２００３）Ｃａｒｄｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．２１，３３３−３６２）。
【００２１】
ＭｙＤ８８欠損は、２型Ｔヘルパー応答への転換と関連している（Ｓｃｈｎａｒｅ，Ｍ．ら（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，９４７−９５０；Ｍｕｒａｉｌｌｅ，Ｅ．ら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０，４２３７−４２４１；Ｋａｉｓｈｏ，Ｔ．ら（２００２）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４，６９５−７００）。この概念に従って、ＭｙＤ８８欠損が、ＩＬ−１２ｐ４０の血清濃度の低下に関連するという観察がなされた。ＣＯＸ−２、ＩＬ−１２、およびＭＣＰ−１もまた、試験された。なぜならば、これらの全てがアテローム発生に関与しており、ＴＬＲ４シグナル伝達およびＭｙＤ８８シグナル伝達の下流の標的であるからである（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ，Ｌ．ら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１３，７３２−７３８；Ｒｈｅｅ，Ｓ．Ｈ．およびＨｗａｎｇ，Ｄ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，３４０３５−３４０４０；Ｋａｗａｉ、Ｔ．ら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，５８８７−５８９４）。ＩＬ−１２は、マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の進行に直接的に関連するので、ＭｙＤ８８欠損マウスにおいて観察されるがＴＬＲ４欠損マウスにおいては観察されないＩＬ−１２ｐ４０のレベルの低下は、部分的に、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおいて観察されるアテローム性動脈硬化症のさらなる減少の原因であり得る（Ｌｅｅ，Ｔ．Ｓ．ら（１９９９）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９，７３４−７４２；Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｐ．およびＴｉｐｐｉｎｇ，Ｐ．Ｇ．（２００３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６３，１１１７−１１２５）。ＴＬＲ４欠損もしくはＭｙＤ８８欠損はまた、重要なアテローム発生促進性ケモカインであるＭＣＰ−１の循環するレベルの著しい低下と関連していた（Ｂｏｒｉｎｇ，Ｌ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９４，８９４−８９７；Ｇｕ，Ｌ．ら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２，２７５−２８１）。ＭＣＰ−１欠損はまた、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスおよびＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の軽減に寄与した可能性がある。なぜならば、近年の研究によって、ＭＣＰ−１（またはそのレセプターＣＣＲ２）の遺伝子欠損が、ＡｐｏＥレセプター欠損マウスまたはＬＤＬレセプター欠損マウスにおける、マクロファージの浸潤の減少、およびアテローム性動脈硬化症の軽減に関連していることが示されたからである（Ｂｏｒｉｎｇ，Ｌ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９４，８９４−８９７；Ｇｕ，Ｌ．ら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２，２７５−２８１）。さらに、近年の研究によって、不安定狭心症および急性心筋梗塞が、循環する単球におけるｈＴＬＲ４の下流での発現の増強とシグナル伝達事象の増強に関連していることが示され、このことは、ｈＴＬＲ４の活性化が、免疫によって媒介されるアテローム性動脈硬化症の進行における、シグナル伝達機構であることを示唆する（Ｍｅｔｈｅ，Ｈ．ら（２００５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）。
【００２２】
アテローム性動脈硬化症病変におけるＣＯＸ−２の発現の増加は、薬理学的および直接的な遺伝子的証拠と合わせて、ＣＯＸ−２がアテローム性動脈硬化症病変形性を促進することを示唆する（Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ，Ｕ．ら（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５，１２８１−１２９１；Ｂｕｒｌｅｉｇｈ，Ｍ．Ｅ．ら（２００２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０５，１８１６−１８２３；Ｒｏｔｔ，Ｄ．ら（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４１，１８１２−１８１９；Ｂｅｌｔｏｎ，Ｏ．Ａ．ら（２００３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０８，３０１７−３０２３；Ｏｌｅｓｅｎ，Ｍ．ら（２００２）Ｓｃａｎｄ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｊ．３６，３６２−３６７；Ｖｅｒｍａ，Ｓ．ら（２００１）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０４，２８７９−２８８２）。これらのデータと一致して、ＭｙＤ８８欠損が、アテローム性動脈硬化症のプラークにおけるＣＯＸ−２免疫反応性の著しい減少をもたらすことが見出された。この結果は、少なくとも部分的に、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおいて観察されるアテローム性動脈硬化症の阻害の原因であり得る。
【００２３】
アテローム発生の経過の重要な初期事象の一つは、白血球−ＥＣ接着の増強である。ＭｙＤ８８欠損ＥＣは、ＭＭ−ＬＤＬ刺激に応答して白血球接着を支持する能力の損傷を示すが、ＴＮＦ−α刺激に応答して白血球接着を支持する能力には損傷を示さないことが見出された。先行のデータ（Ｓｈｉ，Ｗ．ら（２０００）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８６，１０７８−１０８４）は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＥＣが、ＭＭ−ＬＤＬに応答して炎症促進性分子の実質的な誘導を示し、一方、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来のＥＣは、このような誘導を示さないことを示唆した。共に、これらのデータは、ＭｙＤ８８が、ＥＣ上、単核性の食細胞上、またはこれらの両方の、細胞接着分子の発現および／または機能を調節し得ることを示唆する。しかし、ＭｙＤ８８および／またはＴＬＲ４が、単球からマクロファージへの転換、または動脈壁内での単球性食細胞の生存もしくは残留のような過程にも影響を及ぼし得る可能性は、除外することが出来ない。
【００２４】
アテローム性動脈硬化症の発症におけるＮＦ−κＢの関与についての証拠は、実質的である（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｔ．およびＣｙｂｕｌｓｋｙ，Ｍ．Ｉ．（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７，２５５−２６４）。近年の研究は、ＮＦ−κＢ経路のマクロファージ特異的な阻害が、おそらくはマクロファージによるＩＬ−１０の産生の減少に起因して、マウスにおいてより重篤なアテローム性動脈硬化症をもたらすことを報告した（Ｋａｎｔｅｒｓ，Ｅ．ら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２，１１７６−１１８５）。しかし、本明細書において考察されるように、同腹子コントロールと比較して、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおいてＩＬ−１０の発現に差異は存在しなかった。より近年に、アテローム発生促進性ＬＤＬレセプターがヌルであるレシピエントマウスへのｐ５０欠損ドナーマウスの骨髄移植は、アテローム性動脈硬化症の軽減をもたらすことが、報告された（Ｋａｎｔｅｒｓ，Ｅ．ら（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０３，９３４−９４０）。立証されるように、アテローム性動脈硬化症におけるＮＦ−κＢの関与は、完全には明らかにされていない。
【００２５】
本明細書において考察される結果は、ＡｐｏＥ−／−マウスおよびＡｐｏＥ−／−／ｌｐｓｄマウスの間で、アテローム性動脈硬化症の程度に差異が存在しないことを示唆した先の報告（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｄ．ら（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１，１４３７−１４４２）と対照的である（ＡｐｏＥ−／−／ｌｐｓｄマウスは、ＡｐｏＥ−／−とＬＰＳ低応答性株であるＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＮとの戻し交配によってもたらされた株である）。しかし、本明細書において考察される結果は、アテローム性動脈硬化症を直接的に測定しているが、一方、記述される研究（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｄ．ら（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１，１４３７−１４４２）は、全大動脈中のコレステリルエステル含有量から、アテローム性動脈硬化症の負荷を概算した。加えて、ＡｐｏＥ−／−／ｌｐｓｄマウスは、部分的にのみ、ＴＬＲ４−／−遺伝子型を反映する。なぜならば、ＡｐｏＥ−／−／ｌｐｓｄマウスはまた、機能が未知である２個のさらなる遺伝子も欠失しているからである（Ｑｕｒｅｓｈｉ，Ｓ．Ｔ．ら（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９，６１５−６２５）。さらに、偶発突然変異に起因する非機能的ＴＬＲ４を有する異なるＬＰＳ低応答性株であるＣ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｐｏｌｔｏｒａｋ，Ａ．ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２，２０８５−２０８８）は、アテローム性動脈硬化症の発症に対して耐性である（Ｓｈｉ，Ｗ．ら（２０００）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８６，１０７８−１０８４）。この知見は、本明細書において考察される結果と一致している。
【００２６】
要約すると、本明細書において考察されるこれらの種々の実施形態は、アテローム性動脈硬化症易発性の高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ）マウスであるＡｐｏＥ−／−（このマウスはまた、アダプター分子であるＭｙＤ８８またはその上流のレセプターであるＴＬＲ４のいずれかにヌル変異を保有する）が、循環コレステロールレベルまたはリポタンパク質プロフィールを有意に変化させることなく、大動脈アテローム性動脈硬化症の軽減、プラークの脂質内容物の減少、プラークのマクロファージファージ浸潤の減少、およびシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２免疫応答性の低下を示すことを実証することによって、先行技術の所見を発展させる。証拠は、ＭｙＤ８８欠損が、循環する炎症促進性分子であるＩＬ−１２ｐ４０および／またはＭＣＰ−１のレベルの低下、ならびにＭＭ−ＬＤＬに応答しての白血球−ＥＣ接着（これは、ＭｙＤ８８欠損のアテローム保護的効果に寄与し得る）の低下をもたらすことを示唆する。これらの結果は、ＴＬＲ４およびＭｙＤ８８によって媒介されるシグナル伝達を、高コレステロール血症と、炎症と、アテローム性動脈硬化症との間の中心的繋がりとして関連付け、そして、アテローム性動脈硬化症の予防及び治療のための革新的な治療標的の開発のための基礎を提供する（Ｍｉｃｈｅｌｓｅｎ，Ｋ．Ｓ．ら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１，１０６７９−１０６８４）。そのようなものとして、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８を阻害することが公知である利用可能な化合物は、ヒトの疾患および傷害の処置において使用され得る。
【００２７】
従って、本明細書において考察される実施形態は、ＴＬＲ４−／−の動物およびＭｙＤ８８−／−の動物が、それらの冠循環において、野性型ＴＬＲ４の動物および野性型ＭｙＤ８８の動物より、実質的により少ないアテローム性動脈硬化症のプラークを生じるという、驚くべき知見に基づく。本明細書において考察される例示的局面は、種々の疾患状態の処置のためにＴＬＲ４およびＭｙＤ８８の機能を阻害する治療的組成物および治療方法に関する。種々の実施形態はまた、ヒトまたは動物の医薬における使用のために意図される薬学的組成物中でのこれらの使用に関する。
【００２８】
種々の実施形態において、多様なＴＬＲ４インヒビターおよび／またはＭｙＤ８８インヒビターが、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の生物学的活性を阻害するために使用される。本発明に従うこれらのＴＬＲ４インヒビターおよび／またはＭｙＤ８８インヒビターは、任意の疾患状態を処置するために使用され得る。「疾患状態」は、動物（これは、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む）の任意の不健康状態を含み、そのような疾患状態としては、炎症性の病気（ｉｌｌｎｅｓｓ）または疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）の種々の形態（例えば、アテローム性動脈硬化症、移植性アテローム性動脈硬化症（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、静脈移植片アテローム性動脈硬化症（ｖｅｉｎ−ｇｒａｆｔ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ステント後再狭窄（ｓｔｅｎｔ ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、および血管形成術後再狭窄（ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、ならびにアテローム性動脈硬化症が引き起こす他の心臓血管疾患（本明細書の以下において「脈管疾患」））が挙げられる。「脈管疾患」は、動物（これは、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む）の任意の不健康状態をさらに含み、このような脈管疾患としては、以下が挙げられる：狭心症およびそのサブタイプ（例えば、不安定狭心症、および異型狭心症）；脳、心臓、骨、および腸管のような器官を冒す虚血、および虚血と関連する状態（例えば、脳卒中、一過性脳虚血発作、心臓発作、骨壊死、結腸炎、腎機能不全（ｐｏｏｒ ｋｉｄｎｅｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、および鬱血性心不全）；体肢への血液循環の減少、および血液循環の減少の合併症（例えば、遅い創傷治癒、感染、および間欠性跛行）；アテローム性動脈硬化症自体（アテローム性動脈硬化症病変の血管形成術後またはステント植え込み術後の再狭窄を含む）；バイパス手術後の静脈移植片アテローム性動脈硬化症；移植性アテローム性動脈硬化症；ならびに、アテローム性動脈硬化症によって引き起こされるか、アテローム性動脈硬化症と関連する他の疾患。他の適用は、当業者によって認識され、従って、本明細書において包含される。哺乳動物において疾患状態を「処置する」または哺乳動物における疾患状態の「処置」としては、以下が挙げられる：（１）その疾患にかかりやすくなっているがその疾患をまだ経験しないかもしくはその疾患の症状を示さない哺乳動物において、その疾患が起こることを予防すること；（２）その疾患を阻害すること、すなわち、その疾患の発症を止めること；（３）その疾患を軽減すること、すなわち、その疾患の退行を引き起こすこと、または（４）被験体にとって有益な任意の効果を提供すること。
【００２９】
種々の実施形態において、これらのインヒビターは、哺乳動物に、種々の次の実施形態において示される手段のような任意の適切な手段によって投与され得る。そのようなインヒビターとしては、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の生物学的活性の阻害をもたらす任意の化合物、薬学的組成物または他の組成物が挙げられ得る。
【００３０】
種々の実施形態において、本発明に従うこれらのＴＬＲ４インヒビターおよび／またはＭｙＤ８８インヒビターは、治療有効量において投与され得る。「治療有効量」とは、疾患を処置するために哺乳動物に投与された場合に、その疾患のためのそのような処置をもたらすために十分な量を意味する。「有益な効果」とは、本明細書において使用される場合、患者における任意の効果を指し、そのような効果としては、例えば、以下が挙げられる：疾患の緩和、その疾患の合併症の重篤度の低減、その疾患の発現の予防、その疾患の再発の予防、単なるその疾患の悪化の予防、または、上述のいずれかに影響するための治療努力（たとえそのような治療努力が最終的に不首尾であるとしても）。
【００３１】
種々の実施形態において、本明細書において考察される組成物および方法は、既に存在するアテローム性動脈硬化症の軽減、まだ形成されていないアテローム性動脈硬化症の阻害、または存在するアテローム性動脈硬化症の軽減および新しいアテローム性動脈硬化症の阻害の両方から利益を受け得る、任意の患者において使用され得る。上で考察される治療指標において、これらの組成物は、等業者にとって公知の他の治療的介入と組み合わせて、有益に使用され得る。併用治療によって脈管疾患を処置するための、本発明の種々の実施形態において記載されるインヒビターの使用はまた、一般的な抗炎症薬、サイトカイン、または免疫モジュレーターと組み合わせての、哺乳動物への本発明の化合物の投与を包含する。
【００３２】
種々の実施形態において、種々のペプチド模倣物を使用してＴＬＲ４シグナル伝達および／またはＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害するための方法が、提供される。一実施形態において、この方法は、ＴＬＲ４レセプターに結合しそれによってこれらのレセプターがＭｙＤ８８に結合することを妨げる低分子ペプチド（すなわち、およそ１０〜２０アミノ酸のペプチド）の導入を包含する。別の実施形態において、この方法は、内因性ＭｙＤ８８に結合する低分子ペプチドの導入を包含する。短い、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の重複するセグメント（ｓｅｇｍｅｎｔ）（例えば、長さがおよそ１０〜２０アミノ酸）が、分離され得、どの個々のセグメントがＭｙＤ８８分子への結合によって（ＴＬＲ４模倣物の場合）、またはＴＬＲ４レセプターへの結合（ＭｙＤ８８模倣物の場合）によって、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の細胞シグナル伝達をもたらすかが試験され得る。分離に続いて、これらのセグメントは、複製されて、そのセグメントが、少なくとも、ＴＬＲ４レセプターに結合するＭｙＤ８８の一部、またはＭｙＤ８８に結合するＴＬＲ４レセプターの一部を含むか否かを決定するために試験される。本明細書において考察される方法に従う使用に適したセグメントは、ＴＬＲ４レセプターに結合するＭｙＤ８８の少なくとも一部、またはＭｙＤ８８に結合するＴＬＲ４レセプターの少なくとも一部を含み、それによって、このセグメントの個々の複製物の十分量の投与は、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８のシグナル伝達を妨げる。投与されると、セグメントは、好ましくは、ＴＬＲ４レセプターのＭｙＤ８８結合部位に結合するか、または内因性ＭｙＤ８８に結合し、それによってＴＬＲ４レセプターがＭｙＤ８８の対応部位に結合することを妨げるか、または内因性ＭｙＤ８８がＴＬＲ４レセプターの対応部位に結合することを妨げる。このことは、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の細胞シグナル伝達を、有意に妨げる。
【００３３】
本発明の方法に従うと、ＴＬＲ４レセプターに結合するＭｙＤ８８の少なくとも一部を実際に含むセグメントが、疾患状態の処置のために患者に投与され得る。種々の実施形態において、このＭｙＤ８８の一部は、このＴＬＲ４レセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター結合ドメインに結合し得る。同様に、本明細書において考察される別の方法に従うと、内因性ＭｙＤ８８に結合するＴＬＲ４レセプターの少なくとも一部を実際に含むセグメントが、疾患状態の処置のために患者に投与され得る。種々の実施形態において、このＴＬＲ４レセプターの一部は、このＴＬＲ４レセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター結合ドメインに対応し得る。さらに、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８のペプチド模倣物は、多様な薬学的組成物中に処方され得、それらのいずれか一つが、本発明の方法に従う使用に適し得ることが、当業者によって容易に理解される。
【００３４】
投与は、任意の適切な手段によって行われ得、そのような手段として、以下を介する手段が挙げられる：経口形態（例えば、カプセル剤、錠剤、液剤、もしくは懸濁剤）；静脈内形態；注射可能形態；移植可能形態（例えば、ステント被覆、徐放機構、もしくは生分解性ポリマーユニット）；または、それによって活性因子もしくは治療因子が患者に送達され得る、任意の他の適切な機構。その投薬量は、投与の選択される形態に従って同様に決定され、その投薬量のレベルは、最も適切な投与手段が過度の実験なしに容易に確認され得るように、過度の実験なしに容易に確認され得る。
【００３５】
種々の実施形態において考察されるようなペプチド模倣物とは、ＴＬＲ４レセプターおよび／またはＭｙＤ８８分子の、任意の構造アナログを指す。適切なペプチド模倣物の例としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＣＲＸ−６７５（Ｃｏｒｉｘａ；Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡより入手可能）、ＲＰ１０５（Ｄｉｖａｎｏｖｉｃ，Ｓ．ら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ＳＴ２エフェクター分子（Ｂｒｉｎｔ，Ｅ．Ｋ．ら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５，３７３−３７９）、種々のワクシニアウイルスＯＲＦ類（例えば、Ａ４６ＲおよびＡ５２Ｒ：Ｂｏｗｉｅ，Ａ．ら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，１０１６２−１０１６７）、ヒドロシンナモイル−Ｌ−バリルピロリジン（Ｂａｒｔｆａｉ，Ｔ．ら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００，７９７１−７９７６）。他のペプチド模倣物は、当業者によって容易に認識される。
【００３６】
種々の実施形態において、抗ＭｙＤ８８抗体の導入を介してＭｙＤ８８の発現を阻害する方法が提供される。他の実施形態において、抗ＴＬＲ４抗体の導入を介してＴＬＲ４の発現を阻害する方法が提供される。任意の適切な抗ＴＬＲ４抗体および／または抗ＭｙＤ８８抗体は、本発明のこの局面と組み合わせて使用され得、以下を含むが、決してそれらに限定されない：抗ＴＬＲ４抗体および／もしくは抗ＭｙＤ８８抗体、ならびにそれらの任意の適切な誘導体、それらの等価物、または抗ＴＬＲ４抗体および／もしくは抗ＭｙＤ８８抗体と同様の様式で機能する活性部位を有する化合物（これらの化合物は、天然に存在する化合物であるか、または合成化合物である）；（これらの全ては、本明細書の以下において句「抗ＴＬＲ４抗体および／または抗ＭｙＤ８８抗体」内に含まれる）。種々の実施形態において、これらの抗ＴＬＲ４抗体および／または抗ＭｙＤ８８抗体は、ＴＬＲ４レセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター結合ドメイン、またはＴＬＲ４レセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター結合ドメインに結合するＭｙＤ８８の一部を標的化し得る。
【００３７】
抗ＴＬＲ４抗体および／または抗ＭｙＤ８８抗体の、本発明の方法を達成するために必要な適当量、ならびに、その抗体を哺乳動物に送達する最も便利な経路は、当業者によって、過度の実験なしに決定され得る。さらに、抗ＴＬＲ４抗体および／または抗ＭｙＤ８８抗体が、種々の薬学的組成物中に処方され得、それらのいずれか一つが本発明の方法に従う使用に適切であり得ることが、当業者によって容易に理解される。
【００３８】
そのような抗体は、任意の従来の機構を介して、哺乳動物におけるＴＬＲ４シグナル伝達および／またはＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害するための治療有効量において、哺乳動物に送達され得る；この送達の機構およびＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の発現を阻害するために必要な抗体の量の両方は、過度の実験なしに容易に確認される。
【００３９】
適切な抗ＴＬＲ４抗体および／または抗ＭｙＤ８８抗体の例としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：抗ＴＬＲ４抗体製品番号ａｂ８３７６、ａｂ２８９１、ａｂ６５６３、ａｂ６７２６、ａｂ６７２８、ａｂ６７２９、ａｂ６７８５、ａｂ６７８８、ａｂ７００２、ａｂ７０１８、およびＨＴＡ１２５（Ａｂｃａｍ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫより入手可能）；ＭＴＳ５１０（Ｍｏｎｏｓａｎ；Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓより入手可能）；抗ＭｙＤ８８抗体製品番号ａｂ２０６４およびａｂ２０６８（Ａｂｃａｍより入手可能）；抗ＭｙＤ８８抗体カタログ番号２１２５（ＰｒｏＳｃｉ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；Ｐｏｗａｙ，ＣＡより入手可能）；抗ＭｙＤ８８抗体製品番号Ｍ９９３４（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより入手可能）。他の抗ＴＬＲ４抗体および／または抗ＭｙＤ８８抗体は、当業者によって容易に認識される。
【００４０】
種々の実施形態において、本発明の抗体は、スクリーニングされ得、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の標的領域への結合におけるそれらの抗体の有効性を決定され得る。適切である抗血清をスクリーニングするための技術は、当該分野において公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆ Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２巻、第３版、Ａ１４．５０−１４．５１（２００１））。例えば、一般的な技術としては、抗血清と目的のタンパク質との反応性について、ウェスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ、または放射免疫アッセイを行うことが挙げられる。
【００４１】
低分子アンタゴニストの出現によって、アテローム性動脈硬化症に基づく病因の処置におけるＴＬＲシグナル伝達の治療的阻害の効力を評価することが可能となり得る。低分子アンタゴニストは、当該分野において公知である（Ｂａｒｔｆａｉ，Ｔ．ら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００，７９７１−７９７６）。特に、ＮＦ−κＢを活性化しないｔｏｌｌ−インターロイキン１レセプター（ＴＩＲ）スーパーファミリーの分子は、ＴＬＲ４シグナル伝達を負に調節することが示されている（Ｂｒｉｎｔ，Ｅ．Ｋ．ら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５，３７３−３７９）。さらに、種々の組成物が、ＮＦ−κＢを遮断し、ＴＬＲシグナル伝達を負に調節することが、当該分野において公知である（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３，３９６−４０３；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２５，６８７−６９３；Ｌｉｅｗ，Ｆ．Ｙ．ら（２００５）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．９６，２７−３１）。他の組成物およびインヒビターは、当業者によって認識され、従って、本明細書において包含される。なおさらに、シグナル伝達経路に拮抗させるために使用されるレセプターリガンドおよび抗体のアナログの例は、当該分野において公知である。例えば、特異的なケモカインに対する中和抗体、および、レセプターを活性化して機能的応答を惹起することなく特異的なケモカインと結合ドメインについて競合する、レセプターリガンドのアンタゴニストが、当該分野において議論される（Ｈｏｗａｒｄら（１９９６）Ｔｒｅｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４，４６−５１）。具体的には、抗ケモカイン抗体の使用は、多数の動物モデルにおいて炎症を抑えることが示されている（例えば、ブレオマイシン誘導性肺線維症における抗ＭＩＰ−１α（Ｓｍｉｔｈら（１９９４）Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ ５７，７８２−７８７）；再灌流傷害における抗ＩＬ−８（Ｓｅｋｉｄｏら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３６５，６５４−６５７）、および、糸球体腎炎のラットモデルにおける抗ＭＣＰ−１（Ｗａｄａら（１９９６）ＦＡＳＥＢ Ｊ １０，１４１８−１４２５））。さらに、ケモカインレセプターの機能の数種の低分子アンタゴニストが、科学文献および特許文献において報告されている（Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．（１９９８）Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３，１００９５−１００９８；Ｈｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒ，Ｊ．（１９９８）Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３，１５６８７−１５６９２；Ｂｒｉｇｈｔら（１９９８）ＢｉｏｏｒｇＭｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ８，７７１−７７４；Ｌａｐｉｅｒｒｅ，２６ｔｈ Ｎａｔｌ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、６月１４日〜１８日、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ（Ｖａ．）、ＵＳＡ（１９９８）；Ｆｏｒｂｅｓら（２０００）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ １０，１８０３−１８０６４；Ｋａｔｏら、ＷＯ ９７／２４３２５；Ｓｈｉｏｔａら、ＷＯ ９７／４４３２９；Ｎａｙａら、ＷＯ ９８／０４５５４；Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒら、ＷＯ ９８／０２１５１；Ｈａｇｍａｎｎら、ＷＯ ９８／２７８１５；Ｃｏｎｎｏｒら、ＷＯ ９８／０６７０３；Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎら、米国特許第６，２８８，１０３号）。
【００４２】
本発明によって企図される一つのそのような代替的実施形態としては、種々のスタチンを使用してＴＬＲ４シグナル伝達および／またはＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害するための方法（Ｍｅｔｈｅ，Ｈ．ら（２００５）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２５，１−７）が挙げられる。アトロバスタチン（Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ：Ｐｆｉｚｅｒ；Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩから入手可能）およびシンバスタチン（Ｍｅｒｃｋ；Ｗｅｓｔ Ｐｏｉｎｔ，ＰＡから入手可能）が、例である。任意の適切なスタチンが、本発明のこの局面と組み合わせて使用され得、そのようなスタチンとしては、以下が挙げられるが、それらに決して限定されない：ＴＬＲ４シグナル伝達経路および／もしくはＭｙＤ８８シグナル伝達経路に作用することが現在公知であるかまたは将来において発見されるスタチン、およびそれらの任意の適切な誘導体、それらの等価物、またはスタチンと同様の様式で機能する活性部位を有する化合物（これらの化合物は、天然に存在する化合物であるか、もしくは合成化合物である）；（これらの全てが、本明細書の以下において句「スタチン」の内に含まれる）。ＴＬＲ４シグナル伝達経路および／もしくはＭｙＤ８８シグナル伝達経路のなお他のインヒビターが、本発明に含まれ、例えば、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＳＴ２エフェクター分子（Ｂｒｉｎｔ，Ｅ．Ｋ．ら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５，３７３−３７９）、抗アポトーシス性（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質Ａ２０（Ａｒｖｅｌｏ，Ｍ．Ｂ．ら（２００２）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３５，５３５−５４３）、可溶性ＴＬＲ４、作用性の脂質Ａ（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｌｉｐｉｄ Ａ）およびそのアナログ（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３，３９６−４０３）、Ｉ−κＢ−２のインヒビター（Ｅｐｉｎａｔ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８，６８９６−６９０９；Ｈａｅｆｎｅｒ，Ｂ．（２００２）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ ７，６５３−６６３）、サリチル酸塩およびパルテノライド（ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄｅ）（Ｋｏｏｐ，Ｅ．ら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５，９５６−９５９；Ａｌｍａｗｉ，Ｗ．Ｙ．ら（２００２）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２８，６９−７８）、ＰＳ−１１４５（Ｅｐｉｎａｔ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８，６８９６−６９０９）、ｐ３８およびＪＮＫのインヒビター（Ｂｏｅｈｍ，Ｃ．Ｊ．ら（２０００）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｐａｔ １０，２５−３７；Ｅｎｇｌｉｓｈ，Ｊ．Ｍ．ら（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ２３，４０−４５）、ＩＬ−１レセプター関連キナーゼ４のインヒビターおよびＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ（ＴＧＦ−β ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ）１のインヒビター。他の組成物およびインヒビターは、当業者によって認識され、従って、本明細書において包含される。
【００４３】
スタチンおよび上述のインヒビターの、本発明の方法をもたらすために必要な適当量、およびこれらのスタチンおよびインヒビターを哺乳動物に送達する最も便利な経路は、当業者によって、過度の実験なしに決定され得る（Ｍｅｔｈｅ，Ｈ．ら（２００５）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２５，１−７；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３，３９６−４０３；Ｂｒｉｎｔ，Ｅ．Ｋ．ら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５，３７３−３７９）。さらに、スタチンが、種々の薬学的組成物中に処方され得、それらのいずれか一つが、本発明の方法に従う使用に適切であり得ることは、当業者によって容易に理解される。
【００４４】
そのようなスタチンおよび上述のインヒビターは、任意の従来の機構を介して、哺乳動物においてＴＬＲ４シグナル伝達および／またはＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害するための治療有効量において、哺乳動物に送達され得る；この送達の機構、ならびにＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の発現を阻害するために必要なスタチンの量の両方は、余分の実験なしに、容易に確認され得る（Ｍｅｔｈｅ，Ｈ．ら（２００５）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２５，１−７；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３，３９６−４０３；Ｂｒｉｎｔ，Ｅ．Ｋ．ら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５，３７３−３７９）。
【００４５】
種々の実施形態において、本発明は、薬学的に受容可能な賦形剤と、本明細書において考察される例示的局面と関連して使用される少なくとも一種のインヒビターの治療有効量とを含有する、薬学的組成物を提供する。「薬学的に受容可能な賦形剤」とは、薬学的組成物の調製において有用な賦形剤を意味し、一般に安全であり、非毒性であり、そして望ましく、さらに、動物への使用のために、ならびにヒトの薬学的使用のために受容可能である賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体であり得るか、またはエアロゾル組成物の場合においては、気体であり得る。
【００４６】
種々の実施形態において、本発明に従う薬学的組成物は、任意の投与経路を介する送達のために処方され得る。「投与経路」とは、当該分野において公知の任意の投与経路を指し得、そのような投与経路としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：エアロゾル投与経路、鼻投与経路、経口投与経路、経粘膜投与経路、経皮投与経路、または非経口投与経路。「非経口」とは、一般に注射に関連する投与経路を指し、そのような投与経路としては、以下が挙げられる：眼窩内投与経路、注入投与経路、動脈内投与経路、関節内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）投与経路、心臓内投与経路、皮内投与経路、筋肉内投与経路、腹腔内投与経路、肺内投与経路、脊髄内投与経路、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）投与経路、くも膜内投与経路、子宮内投与経路、静脈内投与経路、くも膜下投与経路、被膜下（ｓｕｂｃａｐｓｕｌａｒ）投与経路、皮下投与経路、経粘膜投与経路、または経気管投与経路。非経口経路を介する場合、この組成物は、注入もしくは注射のためには、液剤もしくは懸濁剤の形態であり得るか、または、凍結乾燥された散剤の形態としてあり得る。
【００４７】
本発明に従う薬学的組成物はまた、任意の薬学的に受容可能なキャリアを含有し得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、本明細書において使用される場合、一つの組織、器官、または身体の部分から、別の組織、別の器官、または身体の別の部分への、目的の化合物の運搬または輸送に関与する、薬学的に受容可能な物質、組成物、またはビヒクルを指す。例えば、このキャリアは、液体または固体の、充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、もしくはカプセル化物質、またはそれらの組み合わせであり得る。このキャリアの各々の成分は、この処方物の他の成分と適合性でなければならないという点において、「薬学的に受容可能」でなければならない。また、このキャリアの各々の成分は、接触し得る任意の組織または器官に接触する使用に適していなければならない。このことは、このキャリアの各々の成分が、毒性、刺激、アレルギー性応答、免疫原性、またはその治療上の利点を過剰に上回る任意の他の合併症の危険性を有してはならないことを意味する。
【００４８】
本発明に従う薬学的組成物はまた、カプセル化され得るか、錠剤化され得るか、または経口投与のために乳濁剤またはシロップ剤に調製され得る。薬学的に受容可能な固体もしくは液体のキャリアが、この組成物を強化もしくは安定化するために、またはこの組成物の調製を容易にするために、添加され得る。液体のキャリアとしては、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、グリセリン、食塩水、アルコール、および水が挙げられる。固体のキャリアとしては、デンプン、乳糖、硫酸カルシウム、脱水剤（ｄｉｙｄｒａｔｅ）、石膏、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、滑石、ペクチン、アラビアゴム、寒天、またはゼラチンが挙げられる。また、キャリアとしては、徐放物質（例えば、単独または蝋と共に、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレート）が挙げられ得る。
【００４９】
薬学的調製物は、調剤の従来の技術に従って作製され、そのような技術は、以下の工程を包含する：錠剤形態のためには、粉砕（ｍｉｌｌｉｎｇ）、混合、造粒、および必要な場合は、圧縮の工程；または、硬質ゼラチンカプセル形態のためには、粉砕、混合、および充填の工程。液体のキャリアが使用される場合、この調製物は、シロップ剤、エリキシル剤、乳濁剤、または水性もしくは非水性の懸濁剤の形態であり得る。このような液体処方物は、直接的に経口で、または柔らかいゼラチンカプセル中に充填されて、投与され得る。
【００５０】
本発明に従う薬学的組成物は、治療有効量で送達され得る。正確な治療有効量とは、所与の被験体において、処置の効力に関して、最も有効な結果を生じるその組成物の量である。この量は、種々の要因に依存して変化し、そのような要因として、以下が挙げられるが、それらに限定されない：その治療化合物の特徴（活性、薬学動態学、薬力学、バイオアベイラビリティを含む）、その被験体の生理学的状態（年齢、性別、疾患の型および段階、一般的な身体状態、所与の投薬量に対する応答性、および医薬の型を含む）、その処方物中の一種または拭く数種の薬学的に受容可能なキャリアの性質、および投与経路。臨床学および薬学の分野の当業者は、慣用的な実験を介して（例えば、化合物の投与に対する被験体の応答をモニタリングし、それに従って投薬量を調整することによって）治療有効量を決定し得る。さらなる手引きについては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ編、第２０版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ＰＡ，ＵＳＡ）（２０００）を参照されたい。
【実施例】
【００５１】
（実施例１：ＡｐｏＥ／ＭｙＤ８８のダブルノックアウトマウスおよびＡｐｏＥ／ＴＬＲ４のダブルノックアウトマウスの作製）
ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。ＭｙＤ８８−／−マウスおよびＴＬＲ４−／−マウスを、Ｓ．Ａｋｉｒａ（Ｏｓａｋａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｓａｋａ）の好意によって入手した。両方の株を、４世代にわたってＣ５７ＢＬ／６株中に戻し交配した。ＭｙＤ８８−／−マウスおよびＴＬＲ４−／−マウスを、ＡｐｏＥ−／−のＣ５７ＢＬ／６マウスと交配した。ヘテロ接合体のマウスを、交雑（ｉｎｔｅｒｃｒｏｓｓ）し、ＭｙＤ８８＋／＋、＋／−、−／−のマウス、ならびにＴＬＲ４＋／＋および−／−のマウスの組み合わせを有する、ホモ接合体のＡｐｏＥ−／−マウスを作製した。このプロセスは、合計５世代のＣ５７ＢＬ／６背景への戻し交配を生じる。雄および雌のマウスに、高（０．１５％）コレステロール食（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、６ヶ月間にわたり与えた。
【００５２】
（実施例２：大動脈および大動脈洞におけるアテローム性動脈硬化症の評価）
大動脈を切除し、付着した（外膜性の）脂肪を取り除いて、次いでＨｉｓｔｏＣＨＯＩＣＥ（Ａｍｒｅｃｓｏ；Ｓｏｌｏｎ，ＯＨより入手した）中で固定した。全大動脈を、大動脈弓から大動脈分岐まで縦方向に切開し、正面向きで標本にし、脂質をＯｉｌ ｒｅｄ Ｏで染色した。心臓を、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ，Ｓａｋｕｒａ；Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡより入手した）に包埋し、大動脈洞の横断切片をＯｉｌ ｒｅｄ Ｏで染色した。病変領域を、ＩＭＡＧＥＰＲＯ ＰＬＵＳ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ；Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤより入手した）で定量した。画像解析を、これらのマウスの遺伝子型に対してマスクされた（ｂｌｉｎｄｅｄ）訓練された観察者によって行った。アテローム性動脈硬化症のプラーク内へのマクロファージの浸潤を評価するために、大動脈洞の凍結切片を固定し、３％の過酸化水素と共にインキュベートし、透過処理（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）した。これらの切片を、マクロファージ特異的抗体であるＭＯＭＡ−２、またはコントロールＩｇＧ抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ；Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣより入手した）と共にインキュベートした。可視化のために、３−アミノ−９−エチルーカルバゾル色原体（ＤＡＫＯ；Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡより入手した）を、基質として使用した（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｏｎ，Ｇ．Ｎ．ら（２００３）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２３，８７９−８８４）。ＭＯＭＡ−２マクロファージ免疫陽性領域を、ＩＭＡＧＥＰＲＯ ＰＬＵＳで定量した。
【００５３】
（実施例３：ＣＯＸ−２染色）
切片を、０．１ＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ／０．１５ＭのＮａＣｌ／０．５％のブロッキング試薬（ＴＮＢブロッキング緩衝剤）中でブロッキングし、ＴＮＢブロッキング緩衝剤中で希釈したＣＯＸ−２一次抗体またはコントロールのＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡより入手した）と共に、４℃で一晩インキュベートし（１：５，０００希釈）、その後、ストレプトアビジン−西洋ワサビペロキシダーゼ複合体と共にインキュベートした。シグナルを、チラミド（ｔｙｒａｍｉｄｅ）シグナル増幅キット（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡより入手した）を、製造者の推奨に従って使用することによって増幅し、切片を、１００ｎＭのＳＹＴＯＸグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲより入手した）で、核について対比染色した。
【００５４】
（実施例４：脂質プロフィール）
マウスから、一晩の絶食の後で、屠殺時に血清を得た。総コレステロール濃度を、比色分析アッセイ（ｉｎｆｉｎｉｔｙ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより入手した）を使用して、二連で決定した。トリグリセリド濃度を、Ｌ型トリグリセリドＨアッセイを製造者の指示書（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡより入手した）に従って使用することによって決定した。リポタンパク質プロフィールを、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することによって決定した。
【００５５】
（実施例５：単離されたマウス大動脈内皮細胞（Ｅｃ）における機能研究）
ＭｙＤ８８−／−マウスおよびＭｙＤ８８＋／＋マウス由来の胸大動脈を、洗浄し、長さ３ｍｍの環に切断した。これらのセグメントを、裏返しにし、Ｉ型コラーゲン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡより入手した）でコーティングした組織培養皿中に置き、２０％のＦＢＳ（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｔａｒｚａｎａ，ＣＡより入手した）、１％の抗生物質／抗真菌性物質の溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡより入手した）、１単位／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａより入手した）、および６０μｇ／ｍｌのＥＣ増殖補給剤（Ｕｐｓｔａｔｅ；Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡより入手した）で補充されたＭＣＤＢ１３１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手した）中でインキュベートした。脈管の環を、細胞の発生物が観察されたらすぐに取り除いた。細胞の同一性を、フォン・ヴィレブランド因子（ＤＡＫＯより入手した）での染色によって、および１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）−アセチル化ＬＤＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓより入手した）取り込み実験によって、確認した（ＥＣの純度＞９５％）。接着アッセイのために、ＥＣをコンフルエンシーまで増殖させた。これらの細胞を、１％のリポタンパク質除去血清を含有する培養培地中で６時間にわたって、ＭＭ−ＬＤＬ、ネイティブなＬＤＬ、ＬＰＳ、または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αで刺激した。インキュベーション後に、細胞を血清を含まない培地で洗浄し、５μＭの２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、アセトキシメチルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓより入手した）で標識したヒト末梢血液単核細胞と共に１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、０．５ＮのＮａＯＨで溶解した。蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）において測定した（励起、４８５ｎｍ；発光（ｅｍｍｉｓｓｉｏｎ）、５２８ｎｍ）。
【００５６】
（実施例６：サイトカインおよびケモカインの血清レベル）
ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、およびケモカインであるＫＣの、マウスの血清中の濃度を、ＥＬＩＳＡによって、製造者の指示書（ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、およびＭＣＰ−１についてはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより入手し、ＫＣについてはＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓより入手した）に従って、測定した。
【００５７】
（実施例７：統計学的解析）
データを、平均値±ＳＤとして表した。統計学的有意を、ボンフェローニ補正を用いた一要素（ｏｎｅ−ｆａｃｔｏｒ）ＡＮＯＶＡ、およびスチューデントｔ検定によって決定した。Ｐ＜０．０５を、統計学的に有意と見なした。
【００５８】
（実施例８：ＭｙＤ８８欠損は、ＡｐｏＥ−／−マウスにおける循環コレステロールプロフィールまたは循環リポタンパク質プロフィールを変化させない）
アテローム性動脈硬化症の発症についてのＭｙＤ８８の役割を研究するために、ＡｐｏＥ−／−マウスとＭｙＤ８８−／−マウスとを交雑し、類遺伝子性（ｃｏｎｇｅｎｉｃｉｔｙ）を増強し、分散の二次的な原因を減少させるために、Ｃ５７ＢＬ／６株に少なくとも５世代にわたって戻し交配することによって、ダブルノックアウトマウスを作製した。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−ならびに同腹仔コントロール（ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋）に、高コレステロール食を与え、６ヶ月で屠殺した。血漿脂質濃度に対するＭｙＤ８８の効果を評価するために、全血清コレステロール濃度を測定した。これらの遺伝子型の間で、２４週齢で、全コレステロール濃度または血漿トリグリセリド濃度に有意差は見出されなかった（データは示さず）。リポタンパク質プロフィールに対するＭｙＤ８８欠損の有意な効果は存在しなかった（データは示さず）。
【００５９】
（実施例９：ＭｙＤ８８欠損は、ＡｐｏＥ−／−マウスにおける大動脈アテローム性動脈硬化症の程度を軽減する）
アテローム発生性の食餌を与えられたＡｐｏＥ−／−マウスは、ヒトにおいて見られる形態学的特徴と類似の形態学的特徴を有する、アテローム性動脈硬化症の病変を発症する（Ｂｒｅｓｌｏｗ，Ｊ．Ｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２，６８５−６８８）。大動脈アテローム性動脈硬化症の程度に対するＭｙＤ８８欠損の効果を評価するために、総病変領域を、大動脈の正面向きの標本、および脂質についてのＯｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色を使用することによって測定した（図１Ａ）。コンピューターによって補助される定量的組織形態計測分析は、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の程度の５７％の減少を明らかにした。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の程度は、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＝＋／＋マウスにおいて観察されるアテローム性動脈硬化症の程度と、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の程度において観察されるアテローム性動脈硬化症の程度の間の中間であった。このことは、遺伝子の用量−応答効果と一致している（図１Ｂ、左）。ＭｙＤ８８欠損のアテローム保護的効果は、オスのマウスにおいてもメスのマウスにおいても観察された。
【００６０】
（実施例１０：ＭｙＤ８８欠損は、プラークの脂質含有量の低下、マクロファージの浸潤の減少、およびＣＯＸ−２免疫応答性の低下に関連する）
アテローム性動脈硬化症のプラークの組成に対するＭｙＤ８８欠損の効果を試験するために、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスの大動脈洞のプラークにおいて、脂質含有量をＯｉｌ ｒｅｄ Ｏ組織化学染色で試験し、マクロファージの浸潤の程度をＭＯＭＡ−２免疫染色で試験した。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスの大動脈洞のプラークは、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスのプラークより、有意により少ない脂質およびマクロファージ蓄積（各々、６９％および７５％の減少）を示した。中間のレベルが、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウスにおいて観察された（図２Ａ、左、およびＢ、およびＣ）。このことは、繰り返し、遺伝子の用量−応答の関係と一致した。大動脈洞のプラークの病変の大きさの定量は、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおいて、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスと比較して、病変の大きさの有意な減少を明らかにした（Ｐ＜０．０５、データは示さず）。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスの大動脈洞のプラークにおいて、ＣＯＸ−２の免疫染色を評価し、ＭｙＤ８８欠損によってもたらされるアテローム性動脈硬化症の程度の軽減が、炎症促進性酵素であるＣＯＸ−２の発現の減少を伴っているか否かを決定した。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウス由来の病変は、広範囲のＣＯＸ−２免疫染色を示した。ＣＯＸ−２免疫染色は、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおいて著しく少なかった（図２Ｄ）。中間のレベルのＣＯＸ−２免疫反応性が、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウスにおいて観察された（図２Ｄ）。
【００６１】
（実施例１１：ＭｙＤ８８欠損は、炎症性サイトカインであるＩＬ−１２およびＭＣＰ−１の循環レベルの低下と関連する）
一般的な抗炎症性機構によるアテローム発生の阻害におけるＭｙＤ８８欠損の効果を試験した。ＭｙＤ８８欠損は、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて、重要な炎症促進性のサイトカインおよびケモカイン（Ｔヘルパー１サイトカインであるＩＬ−１２およびＭＣＰ−１）の循環濃度を変化させた。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスは、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスと比較して、著しく低下したＩＬ−１２ｐ４０およびＭＣＰ−１の血清レベルを有した（図３Ａおよび図３Ｂ）。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウスのＩＬ−１２ｐ４０血清濃度は、野生型ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスの血清濃度に匹敵した。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウスにおけるＭＣＰ−１の血清濃度は、野生型ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスのＭＣＰ−１の血清濃度に匹敵した。ＭｙＤ８８欠損は、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０またはケモカインＫＣの循環濃度の有意変化とは、全く関連しなかった（データは示さず）。これらの結果は、ＡｐｏＥ欠損およびＭｙＤ８８欠損の両方を有するマウスにおいて観察されるアテローム発生の抑制の少なくとも一部は、アテローム発生促進性の炎症性分子の循環レベルの一般的な低下によって媒介され得るという解釈と、最もよく一致するようであった。
【００６２】
（実施例１２：ＭｙＤ８８欠損は、ＭＭ−ＬＤＬによる刺激の際の白血球のＥＣへの接着の低下と関連する）
増強された白血球−ＥＣ接着は、アテローム性動脈硬化症のプラークの発達における中心的な初期事象の一つを構成する。白血球−ＥＣ接着に対するＭｙＤ８８欠損の効果を決定するために、ＭｙＤ８８−／−マウスおよびＭｙＤ８８＋／＋マウスから、大動脈のＥＣを単離し、それらと白血球（ヒト末梢血液の単核細胞）との相互作用を、ＭＭ−ＬＤＬによる刺激の際に評価した。ＭｙＤ８８＋／＋マウスの大動脈由来のＥＣは、ＭＭ−ＬＤＬによって刺激された場合、用量依存性の白血球接着の増大を示したが、未改変のネイティブＬＤＬによって刺激された場合は、白血球接着の増大は示さなかった（図４）。対照的に、ＭｙＤ８８欠損マウス由来のＥＣへの白血球接着は、ＭＭ−ＬＤＬまたはＬＤＬのいずれかによる刺激に応答して増大しなかった。しかし、ＴＮＦ−α誘導性の白血球のＥＣへの接着は、ＭｙＤ８８−／−のＥＣにおいては低下しておらず、ＭｙＤ８８＋／＋のＥＣへの白血球接着と異ならなかった。これらの結果は、ＭＭ−ＬＤＬによって刺激されたＭｙＤ８８−／−のＥＣへの白血球の接着の低下は、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスの発達中のプラークへの単核食細胞の浸潤の減少をもたらし得ることを示唆する。
【００６３】
（実施例１３：ＴＬＲ４欠損は、ＡｐｏＥ−／−マウスにおける大動脈アテローム性動脈硬化症の程度を低減する）
さらに、アテローム性動脈硬化症の発症に対するＭｙＤ８８および上流のレセプターの役割を明らかにするために、ＡｐｏＥ−／−マウスとＴＬＲ４−／−マウスとを交雑して、ダブルノックアウトマウスを作製した。ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−および同腹仔のコントロール（ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋）に、高コレステロール食を与え、６ヶ月で屠殺した。総血清コレステロール濃度および総血清トリグリセリド濃度を計測し、そして、ＡｐｏＥおよびＭｙＤ８８の両方を欠損しているマウスを用いる場合、これらの遺伝子型の間で、総コレステロール濃度または総血漿トリグリセリド濃度に有意差は見出されなかった（データは示さず）。全大動脈の総病変領域を、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色の後で計測した。定量分析は、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスにおいて、アテローム性動脈硬化症の程度の２４％の減少を明らかにした（ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−についてはｎ＝１２、およびＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋についてはｎ＝８、Ｐ＜０．０１；図１Ｂ、右）。
【００６４】
（実施例１４：ＴＬＲ４欠損は、プラークの脂質含有量の減少、マクロファージの浸潤の低下、およびＭＣＰ−１の血清濃度の低下に関連する）
さらに、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の特徴を研究するために、脂質含有量およびマクロファージ浸潤を、大動脈洞のプラークにおいて定量した（図２Ａの右のパネル、および図５Ａ）。大動脈洞のプラークの脂質含有量は、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスにおいて有意に減少した（５５％減少）。ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスにおけるマクロファージ浸潤もまた、コントロールマウスと比較して、有意に６５％減少した。さらに、ＭＣＰ−１血清濃度は、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスにおいて優位に低下した（図５Ｂ）。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスと対照的に、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスとＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋マウスとの間で、ＩＬ−１２ｐ４０の血清濃度に有意差は存在しなかった（データは示さず）。
【００６５】
上の記載は、本発明の特定の実施形態に言及するが、一方、本発明の精神から逸脱することなく多くの改変がなされ得ることが理解される。添付の特許請求の範囲は、本発明の真の範囲および精神の中へ含まれるような改変を含むように意図される。ここで開示される実施形態は、従って、あらゆる点で、例示的であるものとしてみなされるべきであり、制限的であるものとしてみなされるべきではなく、本発明の範囲は、上記の明細書よりもむしろ、付属の特許請求の範囲によって示され、そして、これらの特許請求の範囲の意味または特許請求の範囲の等価の範囲に起こる全ての変更は、従って、その明細書において含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１Ａ】図１は、本発明の実施形態に従うと、ＭｙＤ８８欠損およびＴＬＲ４欠損が、大動脈アテローム性動脈硬化症の程度を軽減することを示す。図１Ａは、高コレステロール食を６ヶ月間与えられたＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスの大動脈の一連の顕微鏡写真を表す。大動脈は単離され、脂質蓄積物についてＯｉｌ ｒｅｄ Ｏで染色された。３群からの代表的な標本が示される。
【図１Ｂ】図１は、本発明の実施形態に従うと、ＭｙＤ８８欠損およびＴＬＲ４欠損が、大動脈アテローム性動脈硬化症の程度を軽減することを示す。図１Ｂは、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス（左）、およびＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウス（右）における全大動脈中のプラーク面積の定量を示す。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋マウスの大動脈は、脂質蓄積物についてＯｉｌ ｒｅｄ Ｏで染色された。プラーク面積の平均値およびＳＤ（ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋についてはｎ＝１３；ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋についてはｎ＝８；そして、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−についてはｎ＝１２）が示される。ＭｙＤ８８−／−またはＴＬＲ４−／−における総プラーク面積は、対応する野生型マウスと比較して有意に減少した（＊，Ｐ＜０．０１）。
【図２Ａ】図２は、本発明の実施形態に従うと、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおける大動脈洞のプラーク中の、脂質含有物、マクロファージ浸潤、およびＣＯＸ−２発現が減少することを示す。図２Ａは、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウス（左）、ならびに、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋マウス（右）に由来する大動脈プラークの脂質含有量の定量を示す。示されるのは、総プラーク面積に相対的な脂質含有量のパーセンテージの平均値およびＳＤである（ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋についてはｎ＝１０；ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋についてはｎ＝７；そして、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−についてはｎ＝８）。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−またはＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−における相対的脂質含有量は、対応する野生型マウスと比較して、有意に減少する（＊＊，Ｐ＜０．０１；＊，Ｐ＜０．０５）。
【図２Ｂ】図２は、本発明の実施形態に従うと、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおける大動脈洞のプラーク中の、脂質含有物、マクロファージ浸潤、およびＣＯＸ−２発現が減少することを示す。図２Ｂは、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスに由来する大動脈洞のプラークの代表的なＭＯＭＡ−２染色の一連の顕微鏡写真を表す。
【図２Ｃ】図２は、本発明の実施形態に従うと、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおける大動脈洞のプラーク中の、脂質含有物、マクロファージ浸潤、およびＣＯＸ−２発現が減少することを示す。図２Ｃは、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスの大動脈洞のプラークにおけるマクロファージ免疫反応性の定量分析を示し、総プラーク面積の比率として表される（各群において、ｎ＝１０）。平均値およびＳＤが示される（＊，Ｐ＜０．０１）。
【図２Ｄ】図２は、本発明の実施形態に従うと、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおける大動脈洞のプラーク中の、脂質含有物、マクロファージ浸潤、およびＣＯＸ−２発現が減少することを示す。図２Ｄは、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスの強膜のプラークにおけるＣＯＸ−２免疫蛍光染色の定量分析を示す（各群において、ｎ＝７）。平均値およびＳＤが示される（＊，Ｐ＜０．０１）。
【図３Ａ】図３は、本発明の実施形態に従うと、ＩＬ−１２ｐ４０および単球の化学誘引タンパク質１（ＭＣＰ−１）の血清濃度が、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおいて減少することを示す。図３Ａは、高コレステロール食を６ヶ月与えられたＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウス（各群において、ｎ＝１９）のＩＬ−１２ｐ４０血清濃度を示す。
【図３Ｂ】図３は、本発明の実施形態に従うと、ＩＬ−１２ｐ４０および単球の化学誘引物質１（ＭＣＰ−１）の血清濃度が、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおいて減少することを示す。図３Ｂは、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウス（各群において、ｎ＝２４）のＭＣＰ−１血清濃度を示す。平均値およびＳＤが示される（＊，Ｐ＜０．０１）。
【図４】図４は、本発明の実施形態に従うと、ＭｙＤ８８欠損マウス由来の内皮細胞（Ｅｃ）が、ＭＭ−ＬＤＬ誘導性の白血球の接着の低下を示すことを示す。ＭＭ−ＬＤＬ、ＬＤＬ、またはＴＮＦ−αで刺激されたＭｙＤ８８−／−マウスまたはＭｙＤ８８＋／＋マウスの大動脈に由来するマウス大動脈ＥＣへの、ヒト末梢血液の単核細胞の接着。同様の結果を有する３回の代表的な実験の一つからのデータが、バックグラウンドに対する白血球接着の増大の倍数として表される（＊，Ｐ＜０．０５）。
【図５Ａ】図５は、本発明の実施形態に従うと、ＴＬＲ４欠損が、マクロファージの浸潤およびＭＣＰ−１分泌の程度を低下させることを示す。図５Ａは、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスおよびＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋マウスの大動脈洞のプラークにおける、マクロファージ免疫反応性の定量分析を示し、総プラーク面積の比率として表される（各群ごとに、ｎ＝７）。平均値およびＳＤが示される（＊，Ｐ＜０．０１）
【図５Ｂ】図５は、本発明の実施形態に従うと、ＴＬＲ４欠損が、マクロファージの浸潤およびＭＣＰ−１分泌の程度を低下させることを示す。図５Ｂは、、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスおよびＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋マウスのＭＣＰ−１血清濃度を示す（ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋についてはｎ＝８、そしてＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−についてはｎ＝１４）。平均値およびＳＤが示される（＊，Ｐ＜０．０１）。
【技術分野】
【０００１】
（政府の権利）
本明細書において記載される発明は、国立保健研究所とＤｒ．Ｍｏｓｈｅ Ａｒｄｉｔｉ（Ｄｅｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）との間の助成金第ＨＬ−５１０８７号および同第ＡＩ−５０６９９号の経過において生じたか、またはそれらの下で生じた。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、シグナル伝達経路に関する。より詳細には、本発明は、ｔｏｌｌ様レセプター（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）４（ＴＬＲ４）のアンタゴニストおよび骨髄性分化因子（ｍｙｅｌｉｏｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）８８（ＭｙＤ８８）の機能のアンタゴニストに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
心臓疾患は、依然として世界的に主要な死亡の原因であり、年間総死亡数の３０％近く（すなわち、およそ１，５００万人）の原因である。心臓および脈管の疾患は、毎年さらに多くの個体を衰弱させる。多数にとって、アテローム性動脈硬化症は、終生続く過程である；アテローム性動脈硬化症は、幼年期に初期段階を有し得、中年または中年以降まで臨床的な発現がないことがあり得る。アテローム性動脈硬化症の発症は、不健康な生活習慣（例えば、タバコの使用、バランスの悪い食事、および身体的不活動）に繰り返し関連付けられてきた。心臓および脈管の疾患の種々の形態の検出および処置には、大きな進歩がもたらされてきたが、予防的手段および組み合わされた処置レジメンは、通常、内在する疾患状態を休止させることもまたは治癒させることも出来ない。
【０００４】
アテローム性動脈硬化症は、現在、アテローム発生性リポタンパク質（ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、細胞外マトリックス、新脈管（ｎｅｏｖｅｓｓｅｌ）、カルシウム、および炎症細胞の内皮下での蓄積によって特徴付けられる慢性炎症性疾患であると見なされる。脈管壁における炎症遺伝子の活性化、ならびにその後の炎症細胞および免疫細胞（例えば、単球およびＴ細胞）の接着、化学誘引、内皮下遊走、残留、および活性化は、アテローム性動脈硬化症の開始、進行、および不安定化において重要な役割を果たすと考えられる（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。先天免疫系の感染性因子および感染性成分がアテローム性動脈硬化症の原因としての潜在的な役割に焦点を当てた関心が高まっている（非特許文献７）。しかし、抗生物質による心臓血管疾患の処置を調査する臨床試験は、矛盾する結果をもたらしている（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。これは、おそらくは、差異を検出する能力が不十分であることに起因するか、または他の短所に起因する（非特許文献１１）。
【０００５】
臨床学的な失望にも関わらず、理解が深まると共に、抗生物質および／または免疫による心臓血管疾患の処置が将来的に実現することを示唆する、実験的な証拠が蓄積している（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。特に、動物研究からの興味深いデータは、アテローム性動脈硬化症に基づく病理学における、ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）および先天性免疫系の他の重要な成分の潜在的な重要性を示唆する（非特許文献１５；非特許文献１６）。ＴＬＲは、細菌性病原体または病原体関連分子パターンに応答して炎症促進性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）シグナル伝達経路を活性化するレセプターのファミリーである。ＴＬＲへのリガンド結合は、このレセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプタードメインへの、アダプター分子である骨髄性分化因子８８（ＭｙＤ８８）の漸増をもたらす。シグナルの細胞内伝播は、転写因子であるＮＦ−κＢの活性化をもたらし、それによって、炎症応答に影響を及ぼす（非特許文献１７）。さらに、研究は、ＭｙＤ８８を介してシグナル伝達するＴＬＲが、多くの細菌性病原体に対する炎症促進性サイトカイン応答において必須であることを示した（非特許文献１８）。ＭｙＤ８８は、種々の細胞レセプターによる生化学的シグナル伝達のために必要なアダプタータンパク質であり、そのような細胞レセプターとして、例えば、ＴＬＲ４のようなＴＬＲ、ならびにインターロイキン−１（ＩＬ−１）およびインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）が挙げられる。
【０００６】
研究は、ヒトおよびマウスの脂質が豊富なアテローム性動脈硬化症のプラークがＴＬＲ４を発現すること、ならびに、マクロファージにおけるＴＬＲ４の発現が、酸化された低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）によってアップレギュレートされるが、ネイティブのＬＤＬによってはアップレギュレートされないことを示した（非特許文献１９；非特許文献２０）。インビトロの研究は、炎症促進性かつアテローム発生促進性（ｐｒｏａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ）のリポタンパク質である最小限に改変されたＬＤＬ（ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＬＤＬ：ＭＭ−ＬＤＬ）が、マクロファージ上のＴＬＲ４およびそのコレセプター（ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるＣＤ１４によって認識されること、ならびに、このリポタンパク質の結合がアクチン重合およびマクロファージの拡散をもたらすことを実証した（非特許文献２１）。ヒトの内皮細胞（ＥＣ）において、ＴＬＲ４によるＭＭ−ＬＤＬの認識は、単球の遊出および脈管壁での残留において重要なケモカインであるＩＬ−８の分泌をもたらす（非特許文献２２）。しかし、ＭＭ−ＬＤＬのこの作用は、ＣＤ１４非依存的である。ＴＬＲ４遺伝子の多型を発現する患者は、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）低応答性を発現し、頚動脈のアテローム性動脈硬化症および急性の冠状動脈のイベントから保護され（非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６）、そしてスタチンを用いての危険性低減からより高い利益を引き出す（非特許文献２７）。まとめると、これらの知見は、ＴＬＲシグナル伝達が、アテローム性動脈硬化症のプラークの発達において役割を果たし得ることを示唆する。
【非特許文献１】Ｒｏｓｓ，Ｒ．「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」、１９９９年、第３４０巻、ｐ．１１５−１２６
【非特許文献２】Ｇｌａｓｓ，Ｃ．Ｋ．およびＷｉｔｚｔｕｍ，Ｊ．Ｌ．「Ｃｅｌｌ」、２００１年、第１０４巻、ｐ．５０３−５１６
【非特許文献３】Ｓｈａｈ，Ｐ．Ｋ．「Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．」、２００３年、第４１巻、ｐ．１５Ｓ−２２Ｓ
【非特許文献４】Ｌｉｂｂｙ，Ｐ．「Ｎａｔｕｒｅ」、２００２年、第４２０巻、ｐ．８６８−８７４
【非特許文献５】Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｇ．Ｋ．ら、「Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．」、２００２年、第９１巻、ｐ．２８１−２９１
【非特許文献６】Ｂｉｎｄｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、「Ｎａｔ．Ｍｅｄ．」、２００２年、第８巻、ｐ．１２１８−１２２６
【非特許文献７】Ｋｏｌ，Ａ．およびＬｉｂｂｙ，Ｐ．「Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．」、１９９８年、第８巻、ｐ．１９１−１９９
【非特許文献８】Ｓａｎｄｅｒ，Ｄ．ら、「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００４年、第１０９巻、ｐ．１０１０−１０１５
【非特許文献９】Ｚａｈｎ，Ｒ．ら、「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００３年、第１０７巻、ｐ．１２５３−１２５９
【非特許文献１０】Ｓａｎｄｅｒ，Ｄ．ら、「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００２年、第１０６巻、ｐ．２４２８−２４３３
【非特許文献１１】Ｇｒａｙｓｔｏｎ，Ｊ．Ｔ．「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００３年、第１０７巻、ｐ．１２２８−１２３０
【非特許文献１２】Ｆｒｅｄｒｉｋｓｏｎ，Ｇ．Ｎ．ら、「Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．」、２００３年、第２３巻、ｐ．８７９−８８４
【非特許文献１３】Ｂｉｎｄｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、「Ｎａｔ．Ｍｅｄ．」、２００３年、第９巻、ｐ．７３６−７４３
【非特許文献１４】Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｇ．Ｋ．「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００２年、第１０６巻、ｐ．１５９９−１６０１
【非特許文献１５】Ｍｉｃｈｅｌｓｅｎ，Ｋ．Ｓ．ら「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２００４年、第１７３巻、ｐ．５９０１−５９０７
【非特許文献１６】ｄｅ Ｋｌｅｉｊｎ，Ｄ．およびＰａｓｔｅｒｋａｍｐ，Ｇ．「Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．」、２００３年、第６０巻、ｐ．５８−６７
【非特許文献１７】Ｚｈａｎｇ，Ｇ．およびＧｈｏｓｈ，Ｓ．「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．」、２００１年、第１０７巻、ｐ．１３−１９
【非特許文献１８】Ｄｅｌ Ｒｉｏ，Ｌ．ら「Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２００４年、第１７２巻、ｐ．６９５４−６０
【非特許文献１９】Ｘｕ，Ｘ．Ｈ．ら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００１年、第１０４巻、ｐ．３１０３−３１０８
【非特許文献２０】Ｅｄｆｅｌｄｔ，Ｋ．ら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００２年、第１０５巻、ｐ．１１５８−１１６１
【非特許文献２１】Ｍｉｌｌｅｒ，Ｙ．Ｉ．ら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、２００３年、第２７８巻、ｐ．１５６１−１５６８
【非特許文献２２】Ｗａｌｔｏｎ，Ｋ．Ａ．ら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、２００３年、第２７８巻、ｐ．２９６６１−２９６６６
【非特許文献２３】Ａｒｂｏｕｒ，Ｎ．Ｃ．ら「Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．」、２０００年、第２５巻、ｐ．１８７−１９１
【非特許文献２４】Ｋｉｅｃｈｌ，Ｓ．ら「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」、２００２年、第３４７巻、ｐ．１８５−１９２
【非特許文献２５】Ｋｉｅｃｈｌ，Ｓ．ら「Ａｎｎ．Ｍｅｄ．」、２００３年、第３５巻、ｐ．１６４−１７１
【非特許文献２６】Ａｍｅｚｉａｎｅ，Ｎ．ら「Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．」、２００３年、第２３巻、ｐ．６１−６４
【非特許文献２７】Ｂｏｅｋｈｏｌｄｔ，Ｓ．Ｍ．ら「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」、２００３年、第１０７巻、ｐ．２４１６−２４２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
脈管の疾患のための従来の処置は、実質的な欠点を有する：多くは部分的にしか有効でなく、関連する状態の本当の治癒を提供するものはほとんどない。この分野において、アテローム性動脈硬化症を含む脈管の疾患を、予防、処置、および治癒するための方法の明確な必要性が存在したままである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願を通して参照される全ての文献の開示は、本明細書において参考として援用される。
【０００９】
上記の関連技術の例、およびそれらの例に関連する限定は、例示的であることを意図されており、排他的であることを意図されない。関連技術の他の限定は、本明細書を読み図面をよく見れば当業者に明らかとなる。
【００１０】
（発明の要旨）
以下の実施形態およびそれらの局面は、組成物および方法と組み合わせて記載され例証される。それらの組成物および方法は、例示的かつ例証的であることを意味され、範囲の限定となることを意味されない。種々の実施形態において、一つ以上の上記の問題が、低減されるかまたは取り除かれており、一方、他の実施形態は、他の改善を目的とする。
【００１１】
ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）および骨髄性分化因子８８（ＭｙＤ８８）は、種々の疾患状態に関するシグナル伝達経路に関与することが公知である。そのような疾患状態としては、例えば、アテローム性動脈硬化症が挙げられる。種々の実施形態において、ＴＬＲ４の機能およびＭｙＤ８８シグナル伝達経路をＴＬＲ４インヒビターおよび／またはＭｙＤ８８インヒビターを投与することによって阻害するための組成物および方法が、開示される。
【００１２】
非限定的な例による実施形態として、ｔｏｌｌ様レセプター４（「ＴＬＲ４」）および／または骨髄性分化因子８８（ＭｙＤ８８）の生物学的活性を阻害するための方法（例えば、それらの発現またはシグナル伝達を阻害することによる方法）が挙げられる。さらに、非限定的な例による実施形態は、疾患を処置する方法を提供し、その方法において、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の阻害が有益な効果を有する。そのような疾患としては、例えば、アテローム性動脈硬化症および血栓症のような脈管疾患、血管形成および／またはステント（ｓｔｅｎｔｉｎｇ）後の再狭窄、および、バイパス手術後の静脈−移植片疾患（ｖｅｉｎ−ｇｒａｆｔ ｄｉｓｅａｓｅ）が挙げられる。
【００１３】
非限定的な例による別の実施形態としては、種々のペプチド模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）を使用してＭｙＤ８８細胞シグナル伝達経路を阻害する方法が挙げられる。この方法は、ＴＬＲ４レセプターに結合する低分子のペプチド（すなわち、およそ１０〜２０アミノ酸のペプチド）の導入を伴い、それによってＴＬＲ４レセプターがＭｙＤ８８に結合することもＭｙＤ８８シグナルカスケードを誘発することも妨げる。この様式において、ＴＬＲ４レセプターがＭｙＤ８８に正しく結合し得ないので、ＭｙＤ８８シグナル伝達が遮断される。
【００１４】
同様に、非限定的な例による別の実施形態としては、種々のペプチド模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）を使用してＴＬＲ４細胞シグナル伝達経路を阻害する方法が挙げられる。この方法は、内因性ＭｙＤ８８に結合する低分子のペプチド（すなわち、およそ１０〜２０アミノ酸のペプチド）の導入を伴い、それによって内因性ＭｙＤ８８がＴＬＲ４に結合することもＴＬＲ４シグナルカスケードを誘発することも妨げる。この様式において、利用可能なＴＬＲ４模倣物が利用可能な内因性ＭｙＤ８８について競合するので、ＴＬＲ４シグナル伝達が遮断される。
【００１５】
非限定的な例による別の実施形態としては、抗ＴＬＲ４抗体および／または抗ＭｙＤ８８抗体の導入を介してＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の発現を阻害する方法が挙げられる。そのような抗体は、任意の従来の機構を介して、哺乳動物においてＴＬＲ４シグナル伝達および／またはＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害するための有効量で、哺乳動物に送達され得る。
【００１６】
上記の例示的な局面および実施形態に加えて、図面の参照および以下の詳細な説明をよく読むことによって、さらなる局面および実施形態が明らかになる。
【００１７】
例示的実施形態は、参照される図面において示される。本明細書において開示されるこれらの実施形態および図は、制限的であるよりむしろ例証的であるとみなされることが意図される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（詳細な説明）
本明細書において考察される実施形態は、ｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）および骨髄性分化因子８８（ＭｙＤ８８）の活性および発現を阻害するための組成物および方法に基づく。種々の実施形態において、これらの方法は、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の活性の阻害が患者に対して有益な効果（例えば、疾患の改善、その疾患の合併症の重篤度の緩和、その疾患の顕在化の予防、その疾患の再発の予防、単にその疾患の悪化の予防、または上述のいずれかに影響するための治療努力（たとえそのような治療努力が最終的に不首尾であるとしても））を有する任意の疾患を処置するために、使用され得る。ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の活性が、その疾患を含む病理学的状態の開始、悪化、または維持において役割を果たすことが公知であるかまたは推測されている疾患が、当該分野において公知である。アテローム性動脈硬化症、再狭窄、炎症、および他の脈管疾患が、例である。本発明の方法は、これらの疾患のいずれかを処置するために使用され得る。
【００１９】
蓄積している証拠が、免疫系とアテローム性動脈硬化症との間の根本的な関連を示すが、これまでのところ、この証拠は主として間接的であった。本明細書において実証されるように、ＭｙＤ８８またはＴＬＲ４のいずれかの遺伝子欠損は、ＡｐｏＥ欠損マウスにおいて、大動脈アテローム性動脈硬化症を軽減した。さらに、ＭｙＤ８８またはＴＬＲ４の欠損は、より強い構造的安定性を示唆するプラーク組成の変化と関連していた。このことは、脂質およびマクロファージ内容物の減少、および炎症促進性酵素であるＣＯＸ−２の発現の著しい減少によって証拠付けられる。遺伝的ＭｙＤ８８欠損を有するマウスまたはこの欠損を有さないマウスに由来する内皮細胞（ＥＣ）を用いた細胞培養研究は、遺伝的なＭｙＤ８８の欠損によって、白血球−ＥＣ接着が著しく妨げられることを示した。最後に、ＭｙＤ８８欠損またはＴＬＲ４欠損のアテローム保護的（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）効果は、血清のコレステロールまたはリポタンパク質の変化に起因する二次的なものではないことが示された。なおさらに、循環する炎症促進性サイトカインＩＬ−１２および単球化学誘導タンパク質１（ＭＣＰ−１）の減少の知見は、ＭｙＤ８８欠損およびＴＬＲ４欠損のアテローム保護的効果が、部分的には、全身性炎症の低減からもたらされ得ることを示唆する。集合的に、これらの結果は、直接的に、先天免疫シグナル伝達が、全身性効果および局所性効果の両方を有することを示す。これらの効果は、共に、アテローム性動脈硬化症の発症を著しく阻害し、より安定なプラーク表現型を促進する。
【００２０】
ＭｙＤ８８は、全てのＴＬＲ（ＴＬＲ３を除く）、ならびにＩＬ−１レセプターおよびＩＬ−１８レセプターのシグナルを伝達すると考えられている。ＡｐｏＥ−／−の背景のＩＬ−１β欠損マウスを使用した先行の研究（Ｋｉｒｉｉ，Ｈ．ら（２００３）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２３，６５６−６６０）は、アテローム性動脈硬化症の程度の、穏かな３０％の軽減を見出した。これは、ＭｙＤ８８およびＡｐｏＥの両方を欠損したマウスに関して本明細書において考察される結果（図１）において観察された６０％近くの軽減より、かなり小さい。この知見は、ＭｙＤ８８シグナルが、インタクトなＩＬ−１βシグナル伝達に依存する効果に加えて、下流のアテローム発生促進性効果を媒介することを示唆する。インタクトなＩＬ−１βシグナル伝達を備えるＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスを用いた結果は、この解釈と一致した。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスと比較して、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスは、より穏かだが有意なアテローム性動脈硬化症の病変の縮小（それぞれ、５７％対２４％）を示し、そして、マクロファージ浸潤およびＭＣＰ−１血清濃度の持続性の減少を示した。しかし、この穏かな縮小は、予測されていなかったわけではない。アテローム性動脈硬化症は、多要因性（ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ）であり、動的であり、脈管構造内において時間的および位置的に可変性が高い。多くの重要な寄与物が存在するので、この疾患の罹患率または範囲のいずれかにおける絶大な可変性の原因である、単独の原因は存在しない。本明細書において考察されるこれらの結果は、これらの見解と一致し、ＴＬＲ４シグナル伝達およびＭｙｄ８８シグナル伝達は、一つの原因であることを示すが、また、インタクトな免疫機構が、この疾患に二次的に関連しているというよりもむしろ、この疾患の病因の重要な寄与物であることを、直接的に示す。加えて、ＭｙＤ８８を使用する他のＴＬＲもまた、アテローム発生に関与し得る。近年、数種の細菌性またはウイルス性の微生物が、アテローム発生に関与しているとみなされており、これらの微生物は、例えば、ＴＬＲ２に対するリガンドを含有する（Ｂｉｎｄｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，１２１８−１２２６；Ｌｉｂｂｙ，Ｐ．，Ｒｉｄｋｅｒ，Ｐ．Ｍ．およびＭａｓｅｒｉ，Ａ．（２００２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０５，１１３５−１１４３；Ｍｕｈｌｅｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．（２００３）Ｃａｒｄｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．２１，３３３−３６２）。
【００２１】
ＭｙＤ８８欠損は、２型Ｔヘルパー応答への転換と関連している（Ｓｃｈｎａｒｅ，Ｍ．ら（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，９４７−９５０；Ｍｕｒａｉｌｌｅ，Ｅ．ら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０，４２３７−４２４１；Ｋａｉｓｈｏ，Ｔ．ら（２００２）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４，６９５−７００）。この概念に従って、ＭｙＤ８８欠損が、ＩＬ−１２ｐ４０の血清濃度の低下に関連するという観察がなされた。ＣＯＸ−２、ＩＬ−１２、およびＭＣＰ−１もまた、試験された。なぜならば、これらの全てがアテローム発生に関与しており、ＴＬＲ４シグナル伝達およびＭｙＤ８８シグナル伝達の下流の標的であるからである（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ，Ｌ．ら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１３，７３２−７３８；Ｒｈｅｅ，Ｓ．Ｈ．およびＨｗａｎｇ，Ｄ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，３４０３５−３４０４０；Ｋａｗａｉ、Ｔ．ら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，５８８７−５８９４）。ＩＬ−１２は、マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の進行に直接的に関連するので、ＭｙＤ８８欠損マウスにおいて観察されるがＴＬＲ４欠損マウスにおいては観察されないＩＬ−１２ｐ４０のレベルの低下は、部分的に、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおいて観察されるアテローム性動脈硬化症のさらなる減少の原因であり得る（Ｌｅｅ，Ｔ．Ｓ．ら（１９９９）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９，７３４−７４２；Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｐ．およびＴｉｐｐｉｎｇ，Ｐ．Ｇ．（２００３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６３，１１１７−１１２５）。ＴＬＲ４欠損もしくはＭｙＤ８８欠損はまた、重要なアテローム発生促進性ケモカインであるＭＣＰ−１の循環するレベルの著しい低下と関連していた（Ｂｏｒｉｎｇ，Ｌ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９４，８９４−８９７；Ｇｕ，Ｌ．ら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２，２７５−２８１）。ＭＣＰ−１欠損はまた、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスおよびＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の軽減に寄与した可能性がある。なぜならば、近年の研究によって、ＭＣＰ−１（またはそのレセプターＣＣＲ２）の遺伝子欠損が、ＡｐｏＥレセプター欠損マウスまたはＬＤＬレセプター欠損マウスにおける、マクロファージの浸潤の減少、およびアテローム性動脈硬化症の軽減に関連していることが示されたからである（Ｂｏｒｉｎｇ，Ｌ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９４，８９４−８９７；Ｇｕ，Ｌ．ら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２，２７５−２８１）。さらに、近年の研究によって、不安定狭心症および急性心筋梗塞が、循環する単球におけるｈＴＬＲ４の下流での発現の増強とシグナル伝達事象の増強に関連していることが示され、このことは、ｈＴＬＲ４の活性化が、免疫によって媒介されるアテローム性動脈硬化症の進行における、シグナル伝達機構であることを示唆する（Ｍｅｔｈｅ，Ｈ．ら（２００５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）。
【００２２】
アテローム性動脈硬化症病変におけるＣＯＸ−２の発現の増加は、薬理学的および直接的な遺伝子的証拠と合わせて、ＣＯＸ−２がアテローム性動脈硬化症病変形性を促進することを示唆する（Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ，Ｕ．ら（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５，１２８１−１２９１；Ｂｕｒｌｅｉｇｈ，Ｍ．Ｅ．ら（２００２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０５，１８１６−１８２３；Ｒｏｔｔ，Ｄ．ら（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４１，１８１２−１８１９；Ｂｅｌｔｏｎ，Ｏ．Ａ．ら（２００３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０８，３０１７−３０２３；Ｏｌｅｓｅｎ，Ｍ．ら（２００２）Ｓｃａｎｄ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｊ．３６，３６２−３６７；Ｖｅｒｍａ，Ｓ．ら（２００１）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０４，２８７９−２８８２）。これらのデータと一致して、ＭｙＤ８８欠損が、アテローム性動脈硬化症のプラークにおけるＣＯＸ−２免疫反応性の著しい減少をもたらすことが見出された。この結果は、少なくとも部分的に、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおいて観察されるアテローム性動脈硬化症の阻害の原因であり得る。
【００２３】
アテローム発生の経過の重要な初期事象の一つは、白血球−ＥＣ接着の増強である。ＭｙＤ８８欠損ＥＣは、ＭＭ−ＬＤＬ刺激に応答して白血球接着を支持する能力の損傷を示すが、ＴＮＦ−α刺激に応答して白血球接着を支持する能力には損傷を示さないことが見出された。先行のデータ（Ｓｈｉ，Ｗ．ら（２０００）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８６，１０７８−１０８４）は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＥＣが、ＭＭ−ＬＤＬに応答して炎症促進性分子の実質的な誘導を示し、一方、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来のＥＣは、このような誘導を示さないことを示唆した。共に、これらのデータは、ＭｙＤ８８が、ＥＣ上、単核性の食細胞上、またはこれらの両方の、細胞接着分子の発現および／または機能を調節し得ることを示唆する。しかし、ＭｙＤ８８および／またはＴＬＲ４が、単球からマクロファージへの転換、または動脈壁内での単球性食細胞の生存もしくは残留のような過程にも影響を及ぼし得る可能性は、除外することが出来ない。
【００２４】
アテローム性動脈硬化症の発症におけるＮＦ−κＢの関与についての証拠は、実質的である（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｔ．およびＣｙｂｕｌｓｋｙ，Ｍ．Ｉ．（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７，２５５−２６４）。近年の研究は、ＮＦ−κＢ経路のマクロファージ特異的な阻害が、おそらくはマクロファージによるＩＬ−１０の産生の減少に起因して、マウスにおいてより重篤なアテローム性動脈硬化症をもたらすことを報告した（Ｋａｎｔｅｒｓ，Ｅ．ら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２，１１７６−１１８５）。しかし、本明細書において考察されるように、同腹子コントロールと比較して、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおいてＩＬ−１０の発現に差異は存在しなかった。より近年に、アテローム発生促進性ＬＤＬレセプターがヌルであるレシピエントマウスへのｐ５０欠損ドナーマウスの骨髄移植は、アテローム性動脈硬化症の軽減をもたらすことが、報告された（Ｋａｎｔｅｒｓ，Ｅ．ら（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０３，９３４−９４０）。立証されるように、アテローム性動脈硬化症におけるＮＦ−κＢの関与は、完全には明らかにされていない。
【００２５】
本明細書において考察される結果は、ＡｐｏＥ−／−マウスおよびＡｐｏＥ−／−／ｌｐｓｄマウスの間で、アテローム性動脈硬化症の程度に差異が存在しないことを示唆した先の報告（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｄ．ら（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１，１４３７−１４４２）と対照的である（ＡｐｏＥ−／−／ｌｐｓｄマウスは、ＡｐｏＥ−／−とＬＰＳ低応答性株であるＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＮとの戻し交配によってもたらされた株である）。しかし、本明細書において考察される結果は、アテローム性動脈硬化症を直接的に測定しているが、一方、記述される研究（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｄ．ら（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１，１４３７−１４４２）は、全大動脈中のコレステリルエステル含有量から、アテローム性動脈硬化症の負荷を概算した。加えて、ＡｐｏＥ−／−／ｌｐｓｄマウスは、部分的にのみ、ＴＬＲ４−／−遺伝子型を反映する。なぜならば、ＡｐｏＥ−／−／ｌｐｓｄマウスはまた、機能が未知である２個のさらなる遺伝子も欠失しているからである（Ｑｕｒｅｓｈｉ，Ｓ．Ｔ．ら（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９，６１５−６２５）。さらに、偶発突然変異に起因する非機能的ＴＬＲ４を有する異なるＬＰＳ低応答性株であるＣ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｐｏｌｔｏｒａｋ，Ａ．ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２，２０８５−２０８８）は、アテローム性動脈硬化症の発症に対して耐性である（Ｓｈｉ，Ｗ．ら（２０００）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８６，１０７８−１０８４）。この知見は、本明細書において考察される結果と一致している。
【００２６】
要約すると、本明細書において考察されるこれらの種々の実施形態は、アテローム性動脈硬化症易発性の高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ）マウスであるＡｐｏＥ−／−（このマウスはまた、アダプター分子であるＭｙＤ８８またはその上流のレセプターであるＴＬＲ４のいずれかにヌル変異を保有する）が、循環コレステロールレベルまたはリポタンパク質プロフィールを有意に変化させることなく、大動脈アテローム性動脈硬化症の軽減、プラークの脂質内容物の減少、プラークのマクロファージファージ浸潤の減少、およびシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２免疫応答性の低下を示すことを実証することによって、先行技術の所見を発展させる。証拠は、ＭｙＤ８８欠損が、循環する炎症促進性分子であるＩＬ−１２ｐ４０および／またはＭＣＰ−１のレベルの低下、ならびにＭＭ−ＬＤＬに応答しての白血球−ＥＣ接着（これは、ＭｙＤ８８欠損のアテローム保護的効果に寄与し得る）の低下をもたらすことを示唆する。これらの結果は、ＴＬＲ４およびＭｙＤ８８によって媒介されるシグナル伝達を、高コレステロール血症と、炎症と、アテローム性動脈硬化症との間の中心的繋がりとして関連付け、そして、アテローム性動脈硬化症の予防及び治療のための革新的な治療標的の開発のための基礎を提供する（Ｍｉｃｈｅｌｓｅｎ，Ｋ．Ｓ．ら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１，１０６７９−１０６８４）。そのようなものとして、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８を阻害することが公知である利用可能な化合物は、ヒトの疾患および傷害の処置において使用され得る。
【００２７】
従って、本明細書において考察される実施形態は、ＴＬＲ４−／−の動物およびＭｙＤ８８−／−の動物が、それらの冠循環において、野性型ＴＬＲ４の動物および野性型ＭｙＤ８８の動物より、実質的により少ないアテローム性動脈硬化症のプラークを生じるという、驚くべき知見に基づく。本明細書において考察される例示的局面は、種々の疾患状態の処置のためにＴＬＲ４およびＭｙＤ８８の機能を阻害する治療的組成物および治療方法に関する。種々の実施形態はまた、ヒトまたは動物の医薬における使用のために意図される薬学的組成物中でのこれらの使用に関する。
【００２８】
種々の実施形態において、多様なＴＬＲ４インヒビターおよび／またはＭｙＤ８８インヒビターが、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の生物学的活性を阻害するために使用される。本発明に従うこれらのＴＬＲ４インヒビターおよび／またはＭｙＤ８８インヒビターは、任意の疾患状態を処置するために使用され得る。「疾患状態」は、動物（これは、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む）の任意の不健康状態を含み、そのような疾患状態としては、炎症性の病気（ｉｌｌｎｅｓｓ）または疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）の種々の形態（例えば、アテローム性動脈硬化症、移植性アテローム性動脈硬化症（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、静脈移植片アテローム性動脈硬化症（ｖｅｉｎ−ｇｒａｆｔ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ステント後再狭窄（ｓｔｅｎｔ ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、および血管形成術後再狭窄（ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、ならびにアテローム性動脈硬化症が引き起こす他の心臓血管疾患（本明細書の以下において「脈管疾患」））が挙げられる。「脈管疾患」は、動物（これは、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む）の任意の不健康状態をさらに含み、このような脈管疾患としては、以下が挙げられる：狭心症およびそのサブタイプ（例えば、不安定狭心症、および異型狭心症）；脳、心臓、骨、および腸管のような器官を冒す虚血、および虚血と関連する状態（例えば、脳卒中、一過性脳虚血発作、心臓発作、骨壊死、結腸炎、腎機能不全（ｐｏｏｒ ｋｉｄｎｅｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、および鬱血性心不全）；体肢への血液循環の減少、および血液循環の減少の合併症（例えば、遅い創傷治癒、感染、および間欠性跛行）；アテローム性動脈硬化症自体（アテローム性動脈硬化症病変の血管形成術後またはステント植え込み術後の再狭窄を含む）；バイパス手術後の静脈移植片アテローム性動脈硬化症；移植性アテローム性動脈硬化症；ならびに、アテローム性動脈硬化症によって引き起こされるか、アテローム性動脈硬化症と関連する他の疾患。他の適用は、当業者によって認識され、従って、本明細書において包含される。哺乳動物において疾患状態を「処置する」または哺乳動物における疾患状態の「処置」としては、以下が挙げられる：（１）その疾患にかかりやすくなっているがその疾患をまだ経験しないかもしくはその疾患の症状を示さない哺乳動物において、その疾患が起こることを予防すること；（２）その疾患を阻害すること、すなわち、その疾患の発症を止めること；（３）その疾患を軽減すること、すなわち、その疾患の退行を引き起こすこと、または（４）被験体にとって有益な任意の効果を提供すること。
【００２９】
種々の実施形態において、これらのインヒビターは、哺乳動物に、種々の次の実施形態において示される手段のような任意の適切な手段によって投与され得る。そのようなインヒビターとしては、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の生物学的活性の阻害をもたらす任意の化合物、薬学的組成物または他の組成物が挙げられ得る。
【００３０】
種々の実施形態において、本発明に従うこれらのＴＬＲ４インヒビターおよび／またはＭｙＤ８８インヒビターは、治療有効量において投与され得る。「治療有効量」とは、疾患を処置するために哺乳動物に投与された場合に、その疾患のためのそのような処置をもたらすために十分な量を意味する。「有益な効果」とは、本明細書において使用される場合、患者における任意の効果を指し、そのような効果としては、例えば、以下が挙げられる：疾患の緩和、その疾患の合併症の重篤度の低減、その疾患の発現の予防、その疾患の再発の予防、単なるその疾患の悪化の予防、または、上述のいずれかに影響するための治療努力（たとえそのような治療努力が最終的に不首尾であるとしても）。
【００３１】
種々の実施形態において、本明細書において考察される組成物および方法は、既に存在するアテローム性動脈硬化症の軽減、まだ形成されていないアテローム性動脈硬化症の阻害、または存在するアテローム性動脈硬化症の軽減および新しいアテローム性動脈硬化症の阻害の両方から利益を受け得る、任意の患者において使用され得る。上で考察される治療指標において、これらの組成物は、等業者にとって公知の他の治療的介入と組み合わせて、有益に使用され得る。併用治療によって脈管疾患を処置するための、本発明の種々の実施形態において記載されるインヒビターの使用はまた、一般的な抗炎症薬、サイトカイン、または免疫モジュレーターと組み合わせての、哺乳動物への本発明の化合物の投与を包含する。
【００３２】
種々の実施形態において、種々のペプチド模倣物を使用してＴＬＲ４シグナル伝達および／またはＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害するための方法が、提供される。一実施形態において、この方法は、ＴＬＲ４レセプターに結合しそれによってこれらのレセプターがＭｙＤ８８に結合することを妨げる低分子ペプチド（すなわち、およそ１０〜２０アミノ酸のペプチド）の導入を包含する。別の実施形態において、この方法は、内因性ＭｙＤ８８に結合する低分子ペプチドの導入を包含する。短い、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の重複するセグメント（ｓｅｇｍｅｎｔ）（例えば、長さがおよそ１０〜２０アミノ酸）が、分離され得、どの個々のセグメントがＭｙＤ８８分子への結合によって（ＴＬＲ４模倣物の場合）、またはＴＬＲ４レセプターへの結合（ＭｙＤ８８模倣物の場合）によって、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の細胞シグナル伝達をもたらすかが試験され得る。分離に続いて、これらのセグメントは、複製されて、そのセグメントが、少なくとも、ＴＬＲ４レセプターに結合するＭｙＤ８８の一部、またはＭｙＤ８８に結合するＴＬＲ４レセプターの一部を含むか否かを決定するために試験される。本明細書において考察される方法に従う使用に適したセグメントは、ＴＬＲ４レセプターに結合するＭｙＤ８８の少なくとも一部、またはＭｙＤ８８に結合するＴＬＲ４レセプターの少なくとも一部を含み、それによって、このセグメントの個々の複製物の十分量の投与は、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８のシグナル伝達を妨げる。投与されると、セグメントは、好ましくは、ＴＬＲ４レセプターのＭｙＤ８８結合部位に結合するか、または内因性ＭｙＤ８８に結合し、それによってＴＬＲ４レセプターがＭｙＤ８８の対応部位に結合することを妨げるか、または内因性ＭｙＤ８８がＴＬＲ４レセプターの対応部位に結合することを妨げる。このことは、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の細胞シグナル伝達を、有意に妨げる。
【００３３】
本発明の方法に従うと、ＴＬＲ４レセプターに結合するＭｙＤ８８の少なくとも一部を実際に含むセグメントが、疾患状態の処置のために患者に投与され得る。種々の実施形態において、このＭｙＤ８８の一部は、このＴＬＲ４レセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター結合ドメインに結合し得る。同様に、本明細書において考察される別の方法に従うと、内因性ＭｙＤ８８に結合するＴＬＲ４レセプターの少なくとも一部を実際に含むセグメントが、疾患状態の処置のために患者に投与され得る。種々の実施形態において、このＴＬＲ４レセプターの一部は、このＴＬＲ４レセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター結合ドメインに対応し得る。さらに、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８のペプチド模倣物は、多様な薬学的組成物中に処方され得、それらのいずれか一つが、本発明の方法に従う使用に適し得ることが、当業者によって容易に理解される。
【００３４】
投与は、任意の適切な手段によって行われ得、そのような手段として、以下を介する手段が挙げられる：経口形態（例えば、カプセル剤、錠剤、液剤、もしくは懸濁剤）；静脈内形態；注射可能形態；移植可能形態（例えば、ステント被覆、徐放機構、もしくは生分解性ポリマーユニット）；または、それによって活性因子もしくは治療因子が患者に送達され得る、任意の他の適切な機構。その投薬量は、投与の選択される形態に従って同様に決定され、その投薬量のレベルは、最も適切な投与手段が過度の実験なしに容易に確認され得るように、過度の実験なしに容易に確認され得る。
【００３５】
種々の実施形態において考察されるようなペプチド模倣物とは、ＴＬＲ４レセプターおよび／またはＭｙＤ８８分子の、任意の構造アナログを指す。適切なペプチド模倣物の例としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＣＲＸ−６７５（Ｃｏｒｉｘａ；Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡより入手可能）、ＲＰ１０５（Ｄｉｖａｎｏｖｉｃ，Ｓ．ら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ＳＴ２エフェクター分子（Ｂｒｉｎｔ，Ｅ．Ｋ．ら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５，３７３−３７９）、種々のワクシニアウイルスＯＲＦ類（例えば、Ａ４６ＲおよびＡ５２Ｒ：Ｂｏｗｉｅ，Ａ．ら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，１０１６２−１０１６７）、ヒドロシンナモイル−Ｌ−バリルピロリジン（Ｂａｒｔｆａｉ，Ｔ．ら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００，７９７１−７９７６）。他のペプチド模倣物は、当業者によって容易に認識される。
【００３６】
種々の実施形態において、抗ＭｙＤ８８抗体の導入を介してＭｙＤ８８の発現を阻害する方法が提供される。他の実施形態において、抗ＴＬＲ４抗体の導入を介してＴＬＲ４の発現を阻害する方法が提供される。任意の適切な抗ＴＬＲ４抗体および／または抗ＭｙＤ８８抗体は、本発明のこの局面と組み合わせて使用され得、以下を含むが、決してそれらに限定されない：抗ＴＬＲ４抗体および／もしくは抗ＭｙＤ８８抗体、ならびにそれらの任意の適切な誘導体、それらの等価物、または抗ＴＬＲ４抗体および／もしくは抗ＭｙＤ８８抗体と同様の様式で機能する活性部位を有する化合物（これらの化合物は、天然に存在する化合物であるか、または合成化合物である）；（これらの全ては、本明細書の以下において句「抗ＴＬＲ４抗体および／または抗ＭｙＤ８８抗体」内に含まれる）。種々の実施形態において、これらの抗ＴＬＲ４抗体および／または抗ＭｙＤ８８抗体は、ＴＬＲ４レセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター結合ドメイン、またはＴＬＲ４レセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター結合ドメインに結合するＭｙＤ８８の一部を標的化し得る。
【００３７】
抗ＴＬＲ４抗体および／または抗ＭｙＤ８８抗体の、本発明の方法を達成するために必要な適当量、ならびに、その抗体を哺乳動物に送達する最も便利な経路は、当業者によって、過度の実験なしに決定され得る。さらに、抗ＴＬＲ４抗体および／または抗ＭｙＤ８８抗体が、種々の薬学的組成物中に処方され得、それらのいずれか一つが本発明の方法に従う使用に適切であり得ることが、当業者によって容易に理解される。
【００３８】
そのような抗体は、任意の従来の機構を介して、哺乳動物におけるＴＬＲ４シグナル伝達および／またはＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害するための治療有効量において、哺乳動物に送達され得る；この送達の機構およびＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の発現を阻害するために必要な抗体の量の両方は、過度の実験なしに容易に確認される。
【００３９】
適切な抗ＴＬＲ４抗体および／または抗ＭｙＤ８８抗体の例としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：抗ＴＬＲ４抗体製品番号ａｂ８３７６、ａｂ２８９１、ａｂ６５６３、ａｂ６７２６、ａｂ６７２８、ａｂ６７２９、ａｂ６７８５、ａｂ６７８８、ａｂ７００２、ａｂ７０１８、およびＨＴＡ１２５（Ａｂｃａｍ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫより入手可能）；ＭＴＳ５１０（Ｍｏｎｏｓａｎ；Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓより入手可能）；抗ＭｙＤ８８抗体製品番号ａｂ２０６４およびａｂ２０６８（Ａｂｃａｍより入手可能）；抗ＭｙＤ８８抗体カタログ番号２１２５（ＰｒｏＳｃｉ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；Ｐｏｗａｙ，ＣＡより入手可能）；抗ＭｙＤ８８抗体製品番号Ｍ９９３４（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより入手可能）。他の抗ＴＬＲ４抗体および／または抗ＭｙＤ８８抗体は、当業者によって容易に認識される。
【００４０】
種々の実施形態において、本発明の抗体は、スクリーニングされ得、ＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の標的領域への結合におけるそれらの抗体の有効性を決定され得る。適切である抗血清をスクリーニングするための技術は、当該分野において公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆ Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２巻、第３版、Ａ１４．５０−１４．５１（２００１））。例えば、一般的な技術としては、抗血清と目的のタンパク質との反応性について、ウェスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ、または放射免疫アッセイを行うことが挙げられる。
【００４１】
低分子アンタゴニストの出現によって、アテローム性動脈硬化症に基づく病因の処置におけるＴＬＲシグナル伝達の治療的阻害の効力を評価することが可能となり得る。低分子アンタゴニストは、当該分野において公知である（Ｂａｒｔｆａｉ，Ｔ．ら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００，７９７１−７９７６）。特に、ＮＦ−κＢを活性化しないｔｏｌｌ−インターロイキン１レセプター（ＴＩＲ）スーパーファミリーの分子は、ＴＬＲ４シグナル伝達を負に調節することが示されている（Ｂｒｉｎｔ，Ｅ．Ｋ．ら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５，３７３−３７９）。さらに、種々の組成物が、ＮＦ−κＢを遮断し、ＴＬＲシグナル伝達を負に調節することが、当該分野において公知である（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３，３９６−４０３；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２５，６８７−６９３；Ｌｉｅｗ，Ｆ．Ｙ．ら（２００５）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．９６，２７−３１）。他の組成物およびインヒビターは、当業者によって認識され、従って、本明細書において包含される。なおさらに、シグナル伝達経路に拮抗させるために使用されるレセプターリガンドおよび抗体のアナログの例は、当該分野において公知である。例えば、特異的なケモカインに対する中和抗体、および、レセプターを活性化して機能的応答を惹起することなく特異的なケモカインと結合ドメインについて競合する、レセプターリガンドのアンタゴニストが、当該分野において議論される（Ｈｏｗａｒｄら（１９９６）Ｔｒｅｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４，４６−５１）。具体的には、抗ケモカイン抗体の使用は、多数の動物モデルにおいて炎症を抑えることが示されている（例えば、ブレオマイシン誘導性肺線維症における抗ＭＩＰ−１α（Ｓｍｉｔｈら（１９９４）Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ ５７，７８２−７８７）；再灌流傷害における抗ＩＬ−８（Ｓｅｋｉｄｏら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３６５，６５４−６５７）、および、糸球体腎炎のラットモデルにおける抗ＭＣＰ−１（Ｗａｄａら（１９９６）ＦＡＳＥＢ Ｊ １０，１４１８−１４２５））。さらに、ケモカインレセプターの機能の数種の低分子アンタゴニストが、科学文献および特許文献において報告されている（Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．（１９９８）Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３，１００９５−１００９８；Ｈｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｒ，Ｊ．（１９９８）Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３，１５６８７−１５６９２；Ｂｒｉｇｈｔら（１９９８）ＢｉｏｏｒｇＭｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ８，７７１−７７４；Ｌａｐｉｅｒｒｅ，２６ｔｈ Ｎａｔｌ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、６月１４日〜１８日、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ（Ｖａ．）、ＵＳＡ（１９９８）；Ｆｏｒｂｅｓら（２０００）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ １０，１８０３−１８０６４；Ｋａｔｏら、ＷＯ ９７／２４３２５；Ｓｈｉｏｔａら、ＷＯ ９７／４４３２９；Ｎａｙａら、ＷＯ ９８／０４５５４；Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒら、ＷＯ ９８／０２１５１；Ｈａｇｍａｎｎら、ＷＯ ９８／２７８１５；Ｃｏｎｎｏｒら、ＷＯ ９８／０６７０３；Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎら、米国特許第６，２８８，１０３号）。
【００４２】
本発明によって企図される一つのそのような代替的実施形態としては、種々のスタチンを使用してＴＬＲ４シグナル伝達および／またはＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害するための方法（Ｍｅｔｈｅ，Ｈ．ら（２００５）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２５，１−７）が挙げられる。アトロバスタチン（Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ：Ｐｆｉｚｅｒ；Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩから入手可能）およびシンバスタチン（Ｍｅｒｃｋ；Ｗｅｓｔ Ｐｏｉｎｔ，ＰＡから入手可能）が、例である。任意の適切なスタチンが、本発明のこの局面と組み合わせて使用され得、そのようなスタチンとしては、以下が挙げられるが、それらに決して限定されない：ＴＬＲ４シグナル伝達経路および／もしくはＭｙＤ８８シグナル伝達経路に作用することが現在公知であるかまたは将来において発見されるスタチン、およびそれらの任意の適切な誘導体、それらの等価物、またはスタチンと同様の様式で機能する活性部位を有する化合物（これらの化合物は、天然に存在する化合物であるか、もしくは合成化合物である）；（これらの全てが、本明細書の以下において句「スタチン」の内に含まれる）。ＴＬＲ４シグナル伝達経路および／もしくはＭｙＤ８８シグナル伝達経路のなお他のインヒビターが、本発明に含まれ、例えば、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＳＴ２エフェクター分子（Ｂｒｉｎｔ，Ｅ．Ｋ．ら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５，３７３−３７９）、抗アポトーシス性（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）タンパク質Ａ２０（Ａｒｖｅｌｏ，Ｍ．Ｂ．ら（２００２）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３５，５３５−５４３）、可溶性ＴＬＲ４、作用性の脂質Ａ（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｌｉｐｉｄ Ａ）およびそのアナログ（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３，３９６−４０３）、Ｉ−κＢ−２のインヒビター（Ｅｐｉｎａｔ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８，６８９６−６９０９；Ｈａｅｆｎｅｒ，Ｂ．（２００２）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ ７，６５３−６６３）、サリチル酸塩およびパルテノライド（ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄｅ）（Ｋｏｏｐ，Ｅ．ら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５，９５６−９５９；Ａｌｍａｗｉ，Ｗ．Ｙ．ら（２００２）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２８，６９−７８）、ＰＳ−１１４５（Ｅｐｉｎａｔ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８，６８９６−６９０９）、ｐ３８およびＪＮＫのインヒビター（Ｂｏｅｈｍ，Ｃ．Ｊ．ら（２０００）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｐａｔ １０，２５−３７；Ｅｎｇｌｉｓｈ，Ｊ．Ｍ．ら（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ２３，４０−４５）、ＩＬ−１レセプター関連キナーゼ４のインヒビターおよびＴＧＦ−βによって活性化されるキナーゼ（ＴＧＦ−β ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ）１のインヒビター。他の組成物およびインヒビターは、当業者によって認識され、従って、本明細書において包含される。
【００４３】
スタチンおよび上述のインヒビターの、本発明の方法をもたらすために必要な適当量、およびこれらのスタチンおよびインヒビターを哺乳動物に送達する最も便利な経路は、当業者によって、過度の実験なしに決定され得る（Ｍｅｔｈｅ，Ｈ．ら（２００５）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２５，１−７；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３，３９６−４０３；Ｂｒｉｎｔ，Ｅ．Ｋ．ら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５，３７３−３７９）。さらに、スタチンが、種々の薬学的組成物中に処方され得、それらのいずれか一つが、本発明の方法に従う使用に適切であり得ることは、当業者によって容易に理解される。
【００４４】
そのようなスタチンおよび上述のインヒビターは、任意の従来の機構を介して、哺乳動物においてＴＬＲ４シグナル伝達および／またはＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害するための治療有効量において、哺乳動物に送達され得る；この送達の機構、ならびにＴＬＲ４および／またはＭｙＤ８８の発現を阻害するために必要なスタチンの量の両方は、余分の実験なしに、容易に確認され得る（Ｍｅｔｈｅ，Ｈ．ら（２００５）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２５，１−７；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３，３９６−４０３；Ｂｒｉｎｔ，Ｅ．Ｋ．ら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５，３７３−３７９）。
【００４５】
種々の実施形態において、本発明は、薬学的に受容可能な賦形剤と、本明細書において考察される例示的局面と関連して使用される少なくとも一種のインヒビターの治療有効量とを含有する、薬学的組成物を提供する。「薬学的に受容可能な賦形剤」とは、薬学的組成物の調製において有用な賦形剤を意味し、一般に安全であり、非毒性であり、そして望ましく、さらに、動物への使用のために、ならびにヒトの薬学的使用のために受容可能である賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体であり得るか、またはエアロゾル組成物の場合においては、気体であり得る。
【００４６】
種々の実施形態において、本発明に従う薬学的組成物は、任意の投与経路を介する送達のために処方され得る。「投与経路」とは、当該分野において公知の任意の投与経路を指し得、そのような投与経路としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：エアロゾル投与経路、鼻投与経路、経口投与経路、経粘膜投与経路、経皮投与経路、または非経口投与経路。「非経口」とは、一般に注射に関連する投与経路を指し、そのような投与経路としては、以下が挙げられる：眼窩内投与経路、注入投与経路、動脈内投与経路、関節内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）投与経路、心臓内投与経路、皮内投与経路、筋肉内投与経路、腹腔内投与経路、肺内投与経路、脊髄内投与経路、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）投与経路、くも膜内投与経路、子宮内投与経路、静脈内投与経路、くも膜下投与経路、被膜下（ｓｕｂｃａｐｓｕｌａｒ）投与経路、皮下投与経路、経粘膜投与経路、または経気管投与経路。非経口経路を介する場合、この組成物は、注入もしくは注射のためには、液剤もしくは懸濁剤の形態であり得るか、または、凍結乾燥された散剤の形態としてあり得る。
【００４７】
本発明に従う薬学的組成物はまた、任意の薬学的に受容可能なキャリアを含有し得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、本明細書において使用される場合、一つの組織、器官、または身体の部分から、別の組織、別の器官、または身体の別の部分への、目的の化合物の運搬または輸送に関与する、薬学的に受容可能な物質、組成物、またはビヒクルを指す。例えば、このキャリアは、液体または固体の、充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、もしくはカプセル化物質、またはそれらの組み合わせであり得る。このキャリアの各々の成分は、この処方物の他の成分と適合性でなければならないという点において、「薬学的に受容可能」でなければならない。また、このキャリアの各々の成分は、接触し得る任意の組織または器官に接触する使用に適していなければならない。このことは、このキャリアの各々の成分が、毒性、刺激、アレルギー性応答、免疫原性、またはその治療上の利点を過剰に上回る任意の他の合併症の危険性を有してはならないことを意味する。
【００４８】
本発明に従う薬学的組成物はまた、カプセル化され得るか、錠剤化され得るか、または経口投与のために乳濁剤またはシロップ剤に調製され得る。薬学的に受容可能な固体もしくは液体のキャリアが、この組成物を強化もしくは安定化するために、またはこの組成物の調製を容易にするために、添加され得る。液体のキャリアとしては、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、グリセリン、食塩水、アルコール、および水が挙げられる。固体のキャリアとしては、デンプン、乳糖、硫酸カルシウム、脱水剤（ｄｉｙｄｒａｔｅ）、石膏、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、滑石、ペクチン、アラビアゴム、寒天、またはゼラチンが挙げられる。また、キャリアとしては、徐放物質（例えば、単独または蝋と共に、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレート）が挙げられ得る。
【００４９】
薬学的調製物は、調剤の従来の技術に従って作製され、そのような技術は、以下の工程を包含する：錠剤形態のためには、粉砕（ｍｉｌｌｉｎｇ）、混合、造粒、および必要な場合は、圧縮の工程；または、硬質ゼラチンカプセル形態のためには、粉砕、混合、および充填の工程。液体のキャリアが使用される場合、この調製物は、シロップ剤、エリキシル剤、乳濁剤、または水性もしくは非水性の懸濁剤の形態であり得る。このような液体処方物は、直接的に経口で、または柔らかいゼラチンカプセル中に充填されて、投与され得る。
【００５０】
本発明に従う薬学的組成物は、治療有効量で送達され得る。正確な治療有効量とは、所与の被験体において、処置の効力に関して、最も有効な結果を生じるその組成物の量である。この量は、種々の要因に依存して変化し、そのような要因として、以下が挙げられるが、それらに限定されない：その治療化合物の特徴（活性、薬学動態学、薬力学、バイオアベイラビリティを含む）、その被験体の生理学的状態（年齢、性別、疾患の型および段階、一般的な身体状態、所与の投薬量に対する応答性、および医薬の型を含む）、その処方物中の一種または拭く数種の薬学的に受容可能なキャリアの性質、および投与経路。臨床学および薬学の分野の当業者は、慣用的な実験を介して（例えば、化合物の投与に対する被験体の応答をモニタリングし、それに従って投薬量を調整することによって）治療有効量を決定し得る。さらなる手引きについては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ編、第２０版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ＰＡ，ＵＳＡ）（２０００）を参照されたい。
【実施例】
【００５１】
（実施例１：ＡｐｏＥ／ＭｙＤ８８のダブルノックアウトマウスおよびＡｐｏＥ／ＴＬＲ４のダブルノックアウトマウスの作製）
ＡｐｏＥ欠損Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。ＭｙＤ８８−／−マウスおよびＴＬＲ４−／−マウスを、Ｓ．Ａｋｉｒａ（Ｏｓａｋａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｓａｋａ）の好意によって入手した。両方の株を、４世代にわたってＣ５７ＢＬ／６株中に戻し交配した。ＭｙＤ８８−／−マウスおよびＴＬＲ４−／−マウスを、ＡｐｏＥ−／−のＣ５７ＢＬ／６マウスと交配した。ヘテロ接合体のマウスを、交雑（ｉｎｔｅｒｃｒｏｓｓ）し、ＭｙＤ８８＋／＋、＋／−、−／−のマウス、ならびにＴＬＲ４＋／＋および−／−のマウスの組み合わせを有する、ホモ接合体のＡｐｏＥ−／−マウスを作製した。このプロセスは、合計５世代のＣ５７ＢＬ／６背景への戻し交配を生じる。雄および雌のマウスに、高（０．１５％）コレステロール食（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、６ヶ月間にわたり与えた。
【００５２】
（実施例２：大動脈および大動脈洞におけるアテローム性動脈硬化症の評価）
大動脈を切除し、付着した（外膜性の）脂肪を取り除いて、次いでＨｉｓｔｏＣＨＯＩＣＥ（Ａｍｒｅｃｓｏ；Ｓｏｌｏｎ，ＯＨより入手した）中で固定した。全大動脈を、大動脈弓から大動脈分岐まで縦方向に切開し、正面向きで標本にし、脂質をＯｉｌ ｒｅｄ Ｏで染色した。心臓を、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ，Ｓａｋｕｒａ；Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡより入手した）に包埋し、大動脈洞の横断切片をＯｉｌ ｒｅｄ Ｏで染色した。病変領域を、ＩＭＡＧＥＰＲＯ ＰＬＵＳ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ；Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤより入手した）で定量した。画像解析を、これらのマウスの遺伝子型に対してマスクされた（ｂｌｉｎｄｅｄ）訓練された観察者によって行った。アテローム性動脈硬化症のプラーク内へのマクロファージの浸潤を評価するために、大動脈洞の凍結切片を固定し、３％の過酸化水素と共にインキュベートし、透過処理（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）した。これらの切片を、マクロファージ特異的抗体であるＭＯＭＡ−２、またはコントロールＩｇＧ抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ；Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣより入手した）と共にインキュベートした。可視化のために、３−アミノ−９−エチルーカルバゾル色原体（ＤＡＫＯ；Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡより入手した）を、基質として使用した（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｏｎ，Ｇ．Ｎ．ら（２００３）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２３，８７９−８８４）。ＭＯＭＡ−２マクロファージ免疫陽性領域を、ＩＭＡＧＥＰＲＯ ＰＬＵＳで定量した。
【００５３】
（実施例３：ＣＯＸ−２染色）
切片を、０．１ＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ／０．１５ＭのＮａＣｌ／０．５％のブロッキング試薬（ＴＮＢブロッキング緩衝剤）中でブロッキングし、ＴＮＢブロッキング緩衝剤中で希釈したＣＯＸ−２一次抗体またはコントロールのＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡより入手した）と共に、４℃で一晩インキュベートし（１：５，０００希釈）、その後、ストレプトアビジン−西洋ワサビペロキシダーゼ複合体と共にインキュベートした。シグナルを、チラミド（ｔｙｒａｍｉｄｅ）シグナル増幅キット（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡより入手した）を、製造者の推奨に従って使用することによって増幅し、切片を、１００ｎＭのＳＹＴＯＸグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲより入手した）で、核について対比染色した。
【００５４】
（実施例４：脂質プロフィール）
マウスから、一晩の絶食の後で、屠殺時に血清を得た。総コレステロール濃度を、比色分析アッセイ（ｉｎｆｉｎｉｔｙ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより入手した）を使用して、二連で決定した。トリグリセリド濃度を、Ｌ型トリグリセリドＨアッセイを製造者の指示書（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡより入手した）に従って使用することによって決定した。リポタンパク質プロフィールを、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することによって決定した。
【００５５】
（実施例５：単離されたマウス大動脈内皮細胞（Ｅｃ）における機能研究）
ＭｙＤ８８−／−マウスおよびＭｙＤ８８＋／＋マウス由来の胸大動脈を、洗浄し、長さ３ｍｍの環に切断した。これらのセグメントを、裏返しにし、Ｉ型コラーゲン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡより入手した）でコーティングした組織培養皿中に置き、２０％のＦＢＳ（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｔａｒｚａｎａ，ＣＡより入手した）、１％の抗生物質／抗真菌性物質の溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡより入手した）、１単位／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａより入手した）、および６０μｇ／ｍｌのＥＣ増殖補給剤（Ｕｐｓｔａｔｅ；Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡより入手した）で補充されたＭＣＤＢ１３１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手した）中でインキュベートした。脈管の環を、細胞の発生物が観察されたらすぐに取り除いた。細胞の同一性を、フォン・ヴィレブランド因子（ＤＡＫＯより入手した）での染色によって、および１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）−アセチル化ＬＤＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓより入手した）取り込み実験によって、確認した（ＥＣの純度＞９５％）。接着アッセイのために、ＥＣをコンフルエンシーまで増殖させた。これらの細胞を、１％のリポタンパク質除去血清を含有する培養培地中で６時間にわたって、ＭＭ−ＬＤＬ、ネイティブなＬＤＬ、ＬＰＳ、または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αで刺激した。インキュベーション後に、細胞を血清を含まない培地で洗浄し、５μＭの２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、アセトキシメチルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓより入手した）で標識したヒト末梢血液単核細胞と共に１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、０．５ＮのＮａＯＨで溶解した。蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）において測定した（励起、４８５ｎｍ；発光（ｅｍｍｉｓｓｉｏｎ）、５２８ｎｍ）。
【００５６】
（実施例６：サイトカインおよびケモカインの血清レベル）
ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＭＣＰ−１、およびケモカインであるＫＣの、マウスの血清中の濃度を、ＥＬＩＳＡによって、製造者の指示書（ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、およびＭＣＰ−１についてはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより入手し、ＫＣについてはＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓより入手した）に従って、測定した。
【００５７】
（実施例７：統計学的解析）
データを、平均値±ＳＤとして表した。統計学的有意を、ボンフェローニ補正を用いた一要素（ｏｎｅ−ｆａｃｔｏｒ）ＡＮＯＶＡ、およびスチューデントｔ検定によって決定した。Ｐ＜０．０５を、統計学的に有意と見なした。
【００５８】
（実施例８：ＭｙＤ８８欠損は、ＡｐｏＥ−／−マウスにおける循環コレステロールプロフィールまたは循環リポタンパク質プロフィールを変化させない）
アテローム性動脈硬化症の発症についてのＭｙＤ８８の役割を研究するために、ＡｐｏＥ−／−マウスとＭｙＤ８８−／−マウスとを交雑し、類遺伝子性（ｃｏｎｇｅｎｉｃｉｔｙ）を増強し、分散の二次的な原因を減少させるために、Ｃ５７ＢＬ／６株に少なくとも５世代にわたって戻し交配することによって、ダブルノックアウトマウスを作製した。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−ならびに同腹仔コントロール（ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋）に、高コレステロール食を与え、６ヶ月で屠殺した。血漿脂質濃度に対するＭｙＤ８８の効果を評価するために、全血清コレステロール濃度を測定した。これらの遺伝子型の間で、２４週齢で、全コレステロール濃度または血漿トリグリセリド濃度に有意差は見出されなかった（データは示さず）。リポタンパク質プロフィールに対するＭｙＤ８８欠損の有意な効果は存在しなかった（データは示さず）。
【００５９】
（実施例９：ＭｙＤ８８欠損は、ＡｐｏＥ−／−マウスにおける大動脈アテローム性動脈硬化症の程度を軽減する）
アテローム発生性の食餌を与えられたＡｐｏＥ−／−マウスは、ヒトにおいて見られる形態学的特徴と類似の形態学的特徴を有する、アテローム性動脈硬化症の病変を発症する（Ｂｒｅｓｌｏｗ，Ｊ．Ｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２，６８５−６８８）。大動脈アテローム性動脈硬化症の程度に対するＭｙＤ８８欠損の効果を評価するために、総病変領域を、大動脈の正面向きの標本、および脂質についてのＯｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色を使用することによって測定した（図１Ａ）。コンピューターによって補助される定量的組織形態計測分析は、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の程度の５７％の減少を明らかにした。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の程度は、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＝＋／＋マウスにおいて観察されるアテローム性動脈硬化症の程度と、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の程度において観察されるアテローム性動脈硬化症の程度の間の中間であった。このことは、遺伝子の用量−応答効果と一致している（図１Ｂ、左）。ＭｙＤ８８欠損のアテローム保護的効果は、オスのマウスにおいてもメスのマウスにおいても観察された。
【００６０】
（実施例１０：ＭｙＤ８８欠損は、プラークの脂質含有量の低下、マクロファージの浸潤の減少、およびＣＯＸ−２免疫応答性の低下に関連する）
アテローム性動脈硬化症のプラークの組成に対するＭｙＤ８８欠損の効果を試験するために、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスの大動脈洞のプラークにおいて、脂質含有量をＯｉｌ ｒｅｄ Ｏ組織化学染色で試験し、マクロファージの浸潤の程度をＭＯＭＡ−２免疫染色で試験した。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスの大動脈洞のプラークは、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスのプラークより、有意により少ない脂質およびマクロファージ蓄積（各々、６９％および７５％の減少）を示した。中間のレベルが、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウスにおいて観察された（図２Ａ、左、およびＢ、およびＣ）。このことは、繰り返し、遺伝子の用量−応答の関係と一致した。大動脈洞のプラークの病変の大きさの定量は、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおいて、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスと比較して、病変の大きさの有意な減少を明らかにした（Ｐ＜０．０５、データは示さず）。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスの大動脈洞のプラークにおいて、ＣＯＸ−２の免疫染色を評価し、ＭｙＤ８８欠損によってもたらされるアテローム性動脈硬化症の程度の軽減が、炎症促進性酵素であるＣＯＸ−２の発現の減少を伴っているか否かを決定した。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウス由来の病変は、広範囲のＣＯＸ−２免疫染色を示した。ＣＯＸ−２免疫染色は、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおいて著しく少なかった（図２Ｄ）。中間のレベルのＣＯＸ−２免疫反応性が、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウスにおいて観察された（図２Ｄ）。
【００６１】
（実施例１１：ＭｙＤ８８欠損は、炎症性サイトカインであるＩＬ−１２およびＭＣＰ−１の循環レベルの低下と関連する）
一般的な抗炎症性機構によるアテローム発生の阻害におけるＭｙＤ８８欠損の効果を試験した。ＭｙＤ８８欠損は、ＡｐｏＥ−／−マウスにおいて、重要な炎症促進性のサイトカインおよびケモカイン（Ｔヘルパー１サイトカインであるＩＬ−１２およびＭＣＰ−１）の循環濃度を変化させた。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスは、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスと比較して、著しく低下したＩＬ−１２ｐ４０およびＭＣＰ−１の血清レベルを有した（図３Ａおよび図３Ｂ）。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウスのＩＬ−１２ｐ４０血清濃度は、野生型ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスの血清濃度に匹敵した。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウスにおけるＭＣＰ−１の血清濃度は、野生型ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスのＭＣＰ−１の血清濃度に匹敵した。ＭｙＤ８８欠損は、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０またはケモカインＫＣの循環濃度の有意変化とは、全く関連しなかった（データは示さず）。これらの結果は、ＡｐｏＥ欠損およびＭｙＤ８８欠損の両方を有するマウスにおいて観察されるアテローム発生の抑制の少なくとも一部は、アテローム発生促進性の炎症性分子の循環レベルの一般的な低下によって媒介され得るという解釈と、最もよく一致するようであった。
【００６２】
（実施例１２：ＭｙＤ８８欠損は、ＭＭ−ＬＤＬによる刺激の際の白血球のＥＣへの接着の低下と関連する）
増強された白血球−ＥＣ接着は、アテローム性動脈硬化症のプラークの発達における中心的な初期事象の一つを構成する。白血球−ＥＣ接着に対するＭｙＤ８８欠損の効果を決定するために、ＭｙＤ８８−／−マウスおよびＭｙＤ８８＋／＋マウスから、大動脈のＥＣを単離し、それらと白血球（ヒト末梢血液の単核細胞）との相互作用を、ＭＭ−ＬＤＬによる刺激の際に評価した。ＭｙＤ８８＋／＋マウスの大動脈由来のＥＣは、ＭＭ−ＬＤＬによって刺激された場合、用量依存性の白血球接着の増大を示したが、未改変のネイティブＬＤＬによって刺激された場合は、白血球接着の増大は示さなかった（図４）。対照的に、ＭｙＤ８８欠損マウス由来のＥＣへの白血球接着は、ＭＭ−ＬＤＬまたはＬＤＬのいずれかによる刺激に応答して増大しなかった。しかし、ＴＮＦ−α誘導性の白血球のＥＣへの接着は、ＭｙＤ８８−／−のＥＣにおいては低下しておらず、ＭｙＤ８８＋／＋のＥＣへの白血球接着と異ならなかった。これらの結果は、ＭＭ−ＬＤＬによって刺激されたＭｙＤ８８−／−のＥＣへの白血球の接着の低下は、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスの発達中のプラークへの単核食細胞の浸潤の減少をもたらし得ることを示唆する。
【００６３】
（実施例１３：ＴＬＲ４欠損は、ＡｐｏＥ−／−マウスにおける大動脈アテローム性動脈硬化症の程度を低減する）
さらに、アテローム性動脈硬化症の発症に対するＭｙＤ８８および上流のレセプターの役割を明らかにするために、ＡｐｏＥ−／−マウスとＴＬＲ４−／−マウスとを交雑して、ダブルノックアウトマウスを作製した。ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−および同腹仔のコントロール（ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋）に、高コレステロール食を与え、６ヶ月で屠殺した。総血清コレステロール濃度および総血清トリグリセリド濃度を計測し、そして、ＡｐｏＥおよびＭｙＤ８８の両方を欠損しているマウスを用いる場合、これらの遺伝子型の間で、総コレステロール濃度または総血漿トリグリセリド濃度に有意差は見出されなかった（データは示さず）。全大動脈の総病変領域を、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色の後で計測した。定量分析は、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスにおいて、アテローム性動脈硬化症の程度の２４％の減少を明らかにした（ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−についてはｎ＝１２、およびＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋についてはｎ＝８、Ｐ＜０．０１；図１Ｂ、右）。
【００６４】
（実施例１４：ＴＬＲ４欠損は、プラークの脂質含有量の減少、マクロファージの浸潤の低下、およびＭＣＰ−１の血清濃度の低下に関連する）
さらに、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の特徴を研究するために、脂質含有量およびマクロファージ浸潤を、大動脈洞のプラークにおいて定量した（図２Ａの右のパネル、および図５Ａ）。大動脈洞のプラークの脂質含有量は、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスにおいて有意に減少した（５５％減少）。ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスにおけるマクロファージ浸潤もまた、コントロールマウスと比較して、有意に６５％減少した。さらに、ＭＣＰ−１血清濃度は、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスにおいて優位に低下した（図５Ｂ）。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスと対照的に、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスとＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋マウスとの間で、ＩＬ−１２ｐ４０の血清濃度に有意差は存在しなかった（データは示さず）。
【００６５】
上の記載は、本発明の特定の実施形態に言及するが、一方、本発明の精神から逸脱することなく多くの改変がなされ得ることが理解される。添付の特許請求の範囲は、本発明の真の範囲および精神の中へ含まれるような改変を含むように意図される。ここで開示される実施形態は、従って、あらゆる点で、例示的であるものとしてみなされるべきであり、制限的であるものとしてみなされるべきではなく、本発明の範囲は、上記の明細書よりもむしろ、付属の特許請求の範囲によって示され、そして、これらの特許請求の範囲の意味または特許請求の範囲の等価の範囲に起こる全ての変更は、従って、その明細書において含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１Ａ】図１は、本発明の実施形態に従うと、ＭｙＤ８８欠損およびＴＬＲ４欠損が、大動脈アテローム性動脈硬化症の程度を軽減することを示す。図１Ａは、高コレステロール食を６ヶ月間与えられたＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスの大動脈の一連の顕微鏡写真を表す。大動脈は単離され、脂質蓄積物についてＯｉｌ ｒｅｄ Ｏで染色された。３群からの代表的な標本が示される。
【図１Ｂ】図１は、本発明の実施形態に従うと、ＭｙＤ８８欠損およびＴＬＲ４欠損が、大動脈アテローム性動脈硬化症の程度を軽減することを示す。図１Ｂは、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス（左）、およびＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウス（右）における全大動脈中のプラーク面積の定量を示す。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋マウスの大動脈は、脂質蓄積物についてＯｉｌ ｒｅｄ Ｏで染色された。プラーク面積の平均値およびＳＤ（ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋についてはｎ＝１３；ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋についてはｎ＝８；そして、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−についてはｎ＝１２）が示される。ＭｙＤ８８−／−またはＴＬＲ４−／−における総プラーク面積は、対応する野生型マウスと比較して有意に減少した（＊，Ｐ＜０．０１）。
【図２Ａ】図２は、本発明の実施形態に従うと、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおける大動脈洞のプラーク中の、脂質含有物、マクロファージ浸潤、およびＣＯＸ−２発現が減少することを示す。図２Ａは、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウス（左）、ならびに、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋マウス（右）に由来する大動脈プラークの脂質含有量の定量を示す。示されるのは、総プラーク面積に相対的な脂質含有量のパーセンテージの平均値およびＳＤである（ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋についてはｎ＝１０；ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋についてはｎ＝７；そして、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−についてはｎ＝８）。ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−またはＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−における相対的脂質含有量は、対応する野生型マウスと比較して、有意に減少する（＊＊，Ｐ＜０．０１；＊，Ｐ＜０．０５）。
【図２Ｂ】図２は、本発明の実施形態に従うと、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおける大動脈洞のプラーク中の、脂質含有物、マクロファージ浸潤、およびＣＯＸ−２発現が減少することを示す。図２Ｂは、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスに由来する大動脈洞のプラークの代表的なＭＯＭＡ−２染色の一連の顕微鏡写真を表す。
【図２Ｃ】図２は、本発明の実施形態に従うと、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおける大動脈洞のプラーク中の、脂質含有物、マクロファージ浸潤、およびＣＯＸ−２発現が減少することを示す。図２Ｃは、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスの大動脈洞のプラークにおけるマクロファージ免疫反応性の定量分析を示し、総プラーク面積の比率として表される（各群において、ｎ＝１０）。平均値およびＳＤが示される（＊，Ｐ＜０．０１）。
【図２Ｄ】図２は、本発明の実施形態に従うと、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおける大動脈洞のプラーク中の、脂質含有物、マクロファージ浸潤、およびＣＯＸ−２発現が減少することを示す。図２Ｄは、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウスの強膜のプラークにおけるＣＯＸ−２免疫蛍光染色の定量分析を示す（各群において、ｎ＝７）。平均値およびＳＤが示される（＊，Ｐ＜０．０１）。
【図３Ａ】図３は、本発明の実施形態に従うと、ＩＬ−１２ｐ４０および単球の化学誘引タンパク質１（ＭＣＰ−１）の血清濃度が、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおいて減少することを示す。図３Ａは、高コレステロール食を６ヶ月与えられたＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウス（各群において、ｎ＝１９）のＩＬ−１２ｐ４０血清濃度を示す。
【図３Ｂ】図３は、本発明の実施形態に従うと、ＩＬ−１２ｐ４０および単球の化学誘引物質１（ＭＣＰ−１）の血清濃度が、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウスにおいて減少することを示す。図３Ｂは、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８−／−マウス、ＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／−マウス、およびＡｐｏＥ−／−／ＭｙＤ８８＋／＋マウス（各群において、ｎ＝２４）のＭＣＰ−１血清濃度を示す。平均値およびＳＤが示される（＊，Ｐ＜０．０１）。
【図４】図４は、本発明の実施形態に従うと、ＭｙＤ８８欠損マウス由来の内皮細胞（Ｅｃ）が、ＭＭ−ＬＤＬ誘導性の白血球の接着の低下を示すことを示す。ＭＭ−ＬＤＬ、ＬＤＬ、またはＴＮＦ−αで刺激されたＭｙＤ８８−／−マウスまたはＭｙＤ８８＋／＋マウスの大動脈に由来するマウス大動脈ＥＣへの、ヒト末梢血液の単核細胞の接着。同様の結果を有する３回の代表的な実験の一つからのデータが、バックグラウンドに対する白血球接着の増大の倍数として表される（＊，Ｐ＜０．０５）。
【図５Ａ】図５は、本発明の実施形態に従うと、ＴＬＲ４欠損が、マクロファージの浸潤およびＭＣＰ−１分泌の程度を低下させることを示す。図５Ａは、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスおよびＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋マウスの大動脈洞のプラークにおける、マクロファージ免疫反応性の定量分析を示し、総プラーク面積の比率として表される（各群ごとに、ｎ＝７）。平均値およびＳＤが示される（＊，Ｐ＜０．０１）
【図５Ｂ】図５は、本発明の実施形態に従うと、ＴＬＲ４欠損が、マクロファージの浸潤およびＭＣＰ−１分泌の程度を低下させることを示す。図５Ｂは、、ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−マウスおよびＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋マウスのＭＣＰ−１血清濃度を示す（ＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４＋／＋についてはｎ＝８、そしてＡｐｏＥ−／−／ＴＬＲ４−／−についてはｎ＝１４）。平均値およびＳＤが示される（＊，Ｐ＜０．０１）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における脈管疾患を処置する方法であって、以下：
少なくとも１種のｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）インヒビター、少なくとも１種の骨髄性分化因子８８（ＭｙＤ８８）インヒビター、または少なくとも１種のＴＬＲ４インヒビターと少なくとも１種のＭｙＤ８８インヒビターとの組合せを含有する組成物を提供する工程；および
該脈管疾患を処置するための有効量で、該組成物を該被験体に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記脈管疾患は、アテローム性動脈硬化症、移植性アテローム性動脈硬化症、静脈移植片アテローム性動脈硬化症、血栓症、再狭窄、ステント後再狭窄、および血管形成術後再狭窄からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＴＬＲ４インヒビターは、ＴＬＲ４ペプチド模倣物および抗ＴＬＲ４抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭｙＤ８８インヒビターは、ＭｙＤ８８ペプチド模倣物および抗ＭｙＤ８８抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＬＲ４インヒビターは、ＣＲＸ−６７５、ＲＰ１０５、ＳＴ２エフェクター分子、ワクシニアウイルスＯＲＦ Ａ４６ＲおよびワクシニアウイルスＯＲＦ Ａ５２Ｒ、ヒドロシンナモイル−Ｌ−バリルピロリジン、ａｂ８３７６、ａｂ２８９１、ａｂ６５６３、ａｂ６７２６、ａｂ６７２８、ａｂ６７２９、ａｂ６７８５、ａｂ６７８８、ａｂ７００２、ａｂ７０１８、ＨＴＡ１２５、ＭＴＳ５１０、ならびにこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭｙＤ８８インヒビターは、ＳＴ２エフェクター分子、ワクシニアウイルスＯＲＦ Ａ４６ＲおよびワクシニアウイルスＯＲＦ Ａ５２Ｒ、ヒドロシンナモイル−Ｌ−バリルピロリジン、抗ＭｙＤ８８抗体ａｂ２０６４および抗ＭｙＤ８８抗体ａｂ２０６８、抗ＭｙＤ８８抗体２１２５、抗ＭｙＤ８８抗体Ｍ９９３４、ならびにこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記被験体は、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記投与の経路は、経口投与経路、非経口投与経路、または移植可能投与経路である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物を投与する工程が、脈管内デバイスによって該組成物を送達する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記脈管内デバイスは、カテーテルまたはステントである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記脈管内デバイスは、前記組成物で被覆されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＬＲ４インヒビターは、ＴＬＲ４シグナル伝達事象の間に内因性ＭｙＤ８８に結合するＴＬＲ４レセプターの少なくとも一部に対応するタンパク質の配列、抗ＴＬＲ４抗体、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭｙＤ８８インヒビターは、ＴＬＲ４シグナル伝達事象の間にＴＬＲ４レセプターに結合するＭｙＤ８８分子の少なくとも一部に対応するタンパク質の配列、抗ＭｙＤ８８抗体、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＭｙＤ８８インヒビターは、ＴＬＲ４シグナル伝達事象の間にＴＬＲ４レセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプタードメインに結合するＭｙＤ８８の少なくとも一部に対応するタンパク質の配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＬＲ４インヒビターは、ＴＬＲ４レセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプタードメインに対応するタンパク質の配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患は、アテローム性動脈硬化症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が薬学的に受容可能なキャリアを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
薬学的組成物であって、以下：
（ａ）治療有効量の、少なくとも１種のｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）インヒビター、少なくとも１種の骨髄性分化因子８８（ＭｙＤ８８）インヒビター、または少なくとも１種のＴＬＲ４インヒビターと少なくとも１種のＭｙＤ８８インヒビターとの組合せ；および
（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤
を含有する、薬学的組成物。
【請求項１９】
抗炎症薬、サイトカイン、または免疫モジュレーターをさらに含有する、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記ＴＬＲ４インヒビターは、ＴＬＲ４ペプチド模倣物および抗ＴＬＲ４抗体からなる群より選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記ＭｙＤ８８インヒビターは、ＭｙＤ８８ペプチド模倣物および抗ＭｙＤ８８抗体からなる群より選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記ＴＬＲ４インヒビターは、ＣＲＸ−６７５、ＲＰ１０５、ＳＴ２エフェクター分子、ワクシニアウイルスＯＲＦ Ａ４６ＲおよびワクシニアウイルスＯＲＦ Ａ５２Ｒ、ヒドロシンナモイル−Ｌ−バリルピロリジン、ａｂ８３７６、ａｂ２８９１、ａｂ６５６３、ａｂ６７２６、ａｂ６７２８、ａｂ６７２９、ａｂ６７８５、ａｂ６７８８、ａｂ７００２、ａｂ７０１８、ＨＴＡ１２５、ＭＴＳ５１０、ならびにこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記ＭｙＤ８８インヒビターは、ＳＴ２エフェクター分子、ワクシニアウイルスＯＲＦ Ａ４６ＲおよびワクシニアウイルスＯＲＦ Ａ５２Ｒ、ヒドロシンナモイル−Ｌ−バリルピロリジン、抗ＭｙＤ８８抗体ａｂ２０６４および抗ＭｙＤ８８抗体ａｂ２０６８、抗ＭｙＤ８８抗体２１２５、抗ＭｙＤ８８抗体Ｍ９９３４、ならびにこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記ＴＬＲ４インヒビターは、ＴＬＲ４シグナル伝達事象の間に内因性ＭｙＤ８８に結合するＴＬＲ４レセプターの少なくとも一部に対応するタンパク質の配列、抗ＴＬＲ４抗体、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記ＭｙＤ８８インヒビターは、ＴＬＲ４シグナル伝達事象の間にＴＬＲ４レセプターに結合するＭｙＤ８８分子の少なくとも一部に対応するタンパク質の配列、抗ＭｙＤ８８抗体、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記ＭｙＤ８８インヒビターは、ＴＬＲ４シグナル伝達事象の間にＴＬＲ４レセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプタードメインに結合するＭｙＤ８８の少なくとも一部に対応するタンパク質の配列である、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記ＴＬＲ４インヒビターは、ＴＬＲ４レセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプタードメインに対応するタンパク質の配列である、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項１】
被験体における脈管疾患を処置する方法であって、以下：
少なくとも１種のｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）インヒビター、少なくとも１種の骨髄性分化因子８８（ＭｙＤ８８）インヒビター、または少なくとも１種のＴＬＲ４インヒビターと少なくとも１種のＭｙＤ８８インヒビターとの組合せを含有する組成物を提供する工程；および
該脈管疾患を処置するための有効量で、該組成物を該被験体に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記脈管疾患は、アテローム性動脈硬化症、移植性アテローム性動脈硬化症、静脈移植片アテローム性動脈硬化症、血栓症、再狭窄、ステント後再狭窄、および血管形成術後再狭窄からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＴＬＲ４インヒビターは、ＴＬＲ４ペプチド模倣物および抗ＴＬＲ４抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭｙＤ８８インヒビターは、ＭｙＤ８８ペプチド模倣物および抗ＭｙＤ８８抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＬＲ４インヒビターは、ＣＲＸ−６７５、ＲＰ１０５、ＳＴ２エフェクター分子、ワクシニアウイルスＯＲＦ Ａ４６ＲおよびワクシニアウイルスＯＲＦ Ａ５２Ｒ、ヒドロシンナモイル−Ｌ−バリルピロリジン、ａｂ８３７６、ａｂ２８９１、ａｂ６５６３、ａｂ６７２６、ａｂ６７２８、ａｂ６７２９、ａｂ６７８５、ａｂ６７８８、ａｂ７００２、ａｂ７０１８、ＨＴＡ１２５、ＭＴＳ５１０、ならびにこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭｙＤ８８インヒビターは、ＳＴ２エフェクター分子、ワクシニアウイルスＯＲＦ Ａ４６ＲおよびワクシニアウイルスＯＲＦ Ａ５２Ｒ、ヒドロシンナモイル−Ｌ−バリルピロリジン、抗ＭｙＤ８８抗体ａｂ２０６４および抗ＭｙＤ８８抗体ａｂ２０６８、抗ＭｙＤ８８抗体２１２５、抗ＭｙＤ８８抗体Ｍ９９３４、ならびにこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記被験体は、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記投与の経路は、経口投与経路、非経口投与経路、または移植可能投与経路である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物を投与する工程が、脈管内デバイスによって該組成物を送達する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記脈管内デバイスは、カテーテルまたはステントである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記脈管内デバイスは、前記組成物で被覆されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＬＲ４インヒビターは、ＴＬＲ４シグナル伝達事象の間に内因性ＭｙＤ８８に結合するＴＬＲ４レセプターの少なくとも一部に対応するタンパク質の配列、抗ＴＬＲ４抗体、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭｙＤ８８インヒビターは、ＴＬＲ４シグナル伝達事象の間にＴＬＲ４レセプターに結合するＭｙＤ８８分子の少なくとも一部に対応するタンパク質の配列、抗ＭｙＤ８８抗体、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＭｙＤ８８インヒビターは、ＴＬＲ４シグナル伝達事象の間にＴＬＲ４レセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプタードメインに結合するＭｙＤ８８の少なくとも一部に対応するタンパク質の配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＬＲ４インヒビターは、ＴＬＲ４レセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプタードメインに対応するタンパク質の配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患は、アテローム性動脈硬化症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が薬学的に受容可能なキャリアを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
薬学的組成物であって、以下：
（ａ）治療有効量の、少なくとも１種のｔｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）インヒビター、少なくとも１種の骨髄性分化因子８８（ＭｙＤ８８）インヒビター、または少なくとも１種のＴＬＲ４インヒビターと少なくとも１種のＭｙＤ８８インヒビターとの組合せ；および
（ｂ）薬学的に受容可能な賦形剤
を含有する、薬学的組成物。
【請求項１９】
抗炎症薬、サイトカイン、または免疫モジュレーターをさらに含有する、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記ＴＬＲ４インヒビターは、ＴＬＲ４ペプチド模倣物および抗ＴＬＲ４抗体からなる群より選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記ＭｙＤ８８インヒビターは、ＭｙＤ８８ペプチド模倣物および抗ＭｙＤ８８抗体からなる群より選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記ＴＬＲ４インヒビターは、ＣＲＸ−６７５、ＲＰ１０５、ＳＴ２エフェクター分子、ワクシニアウイルスＯＲＦ Ａ４６ＲおよびワクシニアウイルスＯＲＦ Ａ５２Ｒ、ヒドロシンナモイル−Ｌ−バリルピロリジン、ａｂ８３７６、ａｂ２８９１、ａｂ６５６３、ａｂ６７２６、ａｂ６７２８、ａｂ６７２９、ａｂ６７８５、ａｂ６７８８、ａｂ７００２、ａｂ７０１８、ＨＴＡ１２５、ＭＴＳ５１０、ならびにこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記ＭｙＤ８８インヒビターは、ＳＴ２エフェクター分子、ワクシニアウイルスＯＲＦ Ａ４６ＲおよびワクシニアウイルスＯＲＦ Ａ５２Ｒ、ヒドロシンナモイル−Ｌ−バリルピロリジン、抗ＭｙＤ８８抗体ａｂ２０６４および抗ＭｙＤ８８抗体ａｂ２０６８、抗ＭｙＤ８８抗体２１２５、抗ＭｙＤ８８抗体Ｍ９９３４、ならびにこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記ＴＬＲ４インヒビターは、ＴＬＲ４シグナル伝達事象の間に内因性ＭｙＤ８８に結合するＴＬＲ４レセプターの少なくとも一部に対応するタンパク質の配列、抗ＴＬＲ４抗体、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記ＭｙＤ８８インヒビターは、ＴＬＲ４シグナル伝達事象の間にＴＬＲ４レセプターに結合するＭｙＤ８８分子の少なくとも一部に対応するタンパク質の配列、抗ＭｙＤ８８抗体、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記ＭｙＤ８８インヒビターは、ＴＬＲ４シグナル伝達事象の間にＴＬＲ４レセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプタードメインに結合するＭｙＤ８８の少なくとも一部に対応するタンパク質の配列である、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記ＴＬＲ４インヒビターは、ＴＬＲ４レセプターのｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプタードメインに対応するタンパク質の配列である、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【公表番号】特表２００７−５３４７７５（Ｐ２００７−５３４７７５Ａ）
【公表日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１１１０６（Ｐ２００７−５１１１０６）
【出願日】平成１７年５月２５日（２００５．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１８６０４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１７９７５
【国際公開日】平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【出願人】（３９８０６２１４９）セダーズ−シナイ メディカル センター (34)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２５日（２００５．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１８６０４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１７９７５
【国際公開日】平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【出願人】（３９８０６２１４９）セダーズ−シナイ メディカル センター (34)
【Ｆターム（参考）】
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