腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物
【課題】腎臓の糸球体病変の予防、緩和または治療できる医薬組成物を提供すること。
【解決手段】ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して調節作用を有する化合物と、インターフェロンとを組み合わせてなる腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物。
【解決手段】ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して調節作用を有する化合物と、インターフェロンとを組み合わせてなる腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎糸球体障害治療剤のスクリーニング方法に関し、さらに詳しくは、ヒト末梢血単核球上にまたはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株上に発現する４Ｆ２ｈｃを検定することにより腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する化合物をスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物に関し、さらに詳しくは、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して調節作用を有する化合物と、インターフェロンとを組み合わせてなる腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器や組織障害後の修復・再生について、神経組織、皮膚創傷、腎尿細管障害などに関わる宿主固有の自己免疫性細胞の応答が存在することが示唆されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。そして、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２＋マクロファージと調節型ＣＤ２−ＣＤ４＋Ｔリンパ球を誘導促進する化合物が、選択的に腎糸球体障害を修復することが知られており（特許文献１）、またエフェクターマクロファージの誘導を抑制する化合物が腎臓の糸球体病変の改善効果があることも知られている（特許文献２）。
【０００３】
臓器障害後の組織修復には、ＤＮＡレベルの修復、細胞レベルの修復、そして器官構造レベルの修復が必要であり、細胞レベルにおいては、臓器に存在する前駆細胞の増殖分化を含む、細胞増殖、蛋白合成が要求され、構造の再構築修復には、損傷した組織が選択的に修復されることが示唆されている（非特許文献３）。
【０００４】
損傷した組織細胞に選択的に蛋白合成を促し修復や再生へと導くためには、修復再生の作用を有する細胞が選択的に病変の組織細胞に接着・融合する分子を持つと同時に、蛋白合成を促す分子も発現していることが合目的的である。
【０００５】
Fusion-regulatory protein（ＦＲＰ）−１、ＣＤ９８、４Ｆ２ｈｃ（４Ｆ２ heavy chain）は同じ分子のことであり、ＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子とも表示される。この分子は免疫刺激やウイルス感染時にＴ細胞やマクロファージに発現し、ウイルス感染時には融合を促し多核細胞を形成することが知られており（非特許文献４）、β１インテグリンと関連をもった機能、造血作用、アポトーシス、リンパ球増殖、ＢおよびＴリンパ球の機能、細胞融合から破骨細胞新生（osteoclastogenesis）、変異原性、ウイルス感染後の細胞癒合など多彩な細胞機能に関わっている。そして、前記分子（ＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子）は、アミノ酸トランスポーターのヘテロメリックアミノ酸トランスポーター（heteromeric amino acid transporter、ＨＡＴと略す）の重鎖（Ｈ鎖）を構成する（非特許文献５、非特許文献６）。ヒトマクロファージ上にもこのヘテロメリックアミノ酸トランスポーターが発現することは知られている（非特許文献７）。このヘテロメリックアミノ酸トランスポーターは、アミノ酸輸送について選択性は少なく、非特異的に蛋白合成を促すものである。
また、ある種の化合物（例えば、Ｃｙｎａｒｏｐｉｃｒｉｎ）がＣＤ９８分子を抑制して細胞凝集を抑えることが知られている（非特許文献４、非特許文献８）。
【０００６】
しかしながら、ＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子の発現を調節することにより、ヘテロメリックアミノ酸トランスポーターを発現した修復再生に関わる細胞を惹起する化合物の存在は知られていないし、試験管内にて上記の機能をもつ化合物を同定するためのスクリーニング方法も存在しない。
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００４／０２４１８５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／７２７３０号パンフレット
【非特許文献１】Renal Failure (1996); 18:355-375
【非特許文献２】Immunology Today (2000); 21:265-269
【非特許文献３】J Nephrology (2003); 16:186-195
【非特許文献４】Critical Review in Immunology (2000); 20: 167-196
【非特許文献５】Current Drug Metabolism (2001); 2: 339-354
【非特許文献６】Physiology (2005); 20: 112-124
【非特許文献７】Am J Physiol Cell Physiol (2001); C1964-C1970
【非特許文献８】Biochemical and Biophysical Research Communications (2004); 313: 954-961
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、腎糸球体障害治療剤のスクリーニング方法を提供するものである。さらに、本発明は、前記スクリーニング方法で得られた化合物とインターフェロンを含んでなる医薬組成物を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、選択的に糸球体病変を軽減し修復する作用を有する公知化合物（特許文献１，２）で治療された動物は対照動物と比べて、ヘテロメリックアミノ酸トランスポーターのひとつであるＡｓｃ−１分子を発現する単核球細胞が糸球体病変部位に優位に局在し、それら動物の糸球体病変は有意に軽減されている知見を得た。
【００１０】
さらに本発明者は、ヒト末梢血単核球をリポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激培養する際、あるいはヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株（以下、単にヒト培養細胞株ということもある。）をインターフェロンで刺激培養する際、同時に糸球体病変を選択的に抑え修復する公知化合物（前記特許文献１，２）を添加して培養したところ、ヘテロメリックアミノ酸トランスポーターのＨ鎖であるＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子の発現を選択的に調整する作用をもつ知見を得た。
【００１１】
すなわち、単核球細胞あるいは前記ヒト培養細胞樹立株がヘテロメリックアミノ酸トランスポーターのひとつである神経細胞由来のＡｓｃ−１（asc-type amino acid transporter 1）を発現することは、Ｈ鎖分子であるＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子が活性化されたことにより糸球体が神経細胞の分子をあわせもつ特性と関連して糸球体病変時の障害細胞に親和性をもって接着融合し、Ａｓｃ−１が障害を受けた器官組織細胞が必要とするアミノ酸を広く供給でき細胞障害修復のために蛋白合成を促すことを意味する。
【００１２】
そして、糸球体病変を選択的に抑え修復する公知化合物が、Ａｓｃ−１を発現する単核球細胞を糸球体病変部位に選択的に誘導すること、さらに、この公知化合物が、ヒト末梢血単核球あるいは前記ヒト培養細胞樹立株をリポ多糖類（ＬＰＳ）またはインターフェロンなどのマクロファージ活性化物質で刺激培養開始と同時に添加して培養すると、ヘテロメリックアミノ酸トランスポーターのＨ鎖であるＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子の発現を選択的に調整する作用をもつことから、該当する化合物を容易に探索、同定するスクリーニング方法を提供することができる知見を得た。また、本発明者は、前記スクリーニング方法により得られた化合物とインターフェロンを併用することにより、腎臓の糸球体病変を飛躍的に予防、緩和または治療する医薬組成物を提供することができる知見も得た。
【００１３】
本発明者は、上記の知見に基づいてさらに検討を重ねて、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、
（１）ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株と、マクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して被検化合物が示す調節作用を検定することを特徴とする腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する化合物のスクリーニング方法、
（２）被検化合物が示す調節作用の検定を、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株をマクロファージ活性化物質および被検化合物の存在下に培養し、該単核球または該ヒト単球もしくは該ヒト培養細胞樹立株上に発現する４Ｆ２ｈｃの量を、被検化合物の非存在下に培養したときに発現する４Ｆ２ｈｃの量と比較することにより行なう前記（１）記載のスクリーニング方法、
（３）ヒト末梢血単核球の培養をヒトＡＢ型血清の存在下に、またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株の培養をウシ胎児血清の存在下に行なう前記（２）記載のスクリーニング方法、
（４）単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株上に発現する４Ｆ２ｈｃの量を、ＦＡＣＳｃａｎ解析により算出することを特徴とする前記（２）記載のスクリーニング方法、
（５）マクロファージ活性化物質がインターフェロンまたはリポ多糖類である前記（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（６）ヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株がヒト白血病培養細胞株ＴＨＰ−１である前記（１）〜（５）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（７）（ａ）ヒトＡＢ型血清中、ヒト末梢血単核球をリポ多糖類および被検化合物の存在下に培養し、（ｂ）得られる培養液からヒト末梢血単核球を回収し、（ｃ）回収したヒト末梢血単核球に４Ｆ２ｈｃの抗体を反応させ、（ｄ）ＦＡＣＳｃａｎ解析により４Ｆ２ｈｃ量を算出し、（ｅ）該４Ｆ２ｈｃ量を被検化合物の非存在下のときの４Ｆ２ｈｃ量と比較して４Ｆ２ｈｃ量の増大または減少を検出することを特徴とする腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療できる化合物のスクリーニング方法、
（８）（ａ）ウシ胎児血清中、ヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株をリポ多糖類もしくはインターフェロンおよび被検化合物の存在下に培養し、（ｂ）得られる培養液からヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株を回収し、（ｃ）回収した該ヒト培養細胞樹立株に４Ｆ２ｈｃの抗体を反応させ、（ｄ）ＦＡＣＳｃａｎ解析により４Ｆ２ｈｃ量を算出し、（ｅ）該４Ｆ２ｈｃ量を被検化合物の非存在下のときの４Ｆ２ｈｃ量と比較して４Ｆ２ｈｃ量の増大または減少を検出することを特徴とする腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療できる化合物のスクリーニング方法、
（９）ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して調節作用を有する化合物と、インターフェロンとを組み合わせてなる腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物、
（１０）化合物が前記（１）〜（８）のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択される化合物である前記（９）記載の医薬組成物、
（１１）化合物が、２−フルオロ−５−オキソテトラヒドロフラン−２−カルボン酸ベンジルエステルまたは１−（４−フルオロフェノキシ）−３−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソベンゾフラン−１−カルボン酸である前記（９）または（１０）に記載の医薬組成物、
（１２）腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物が、配合剤であることを特徴とする前記（９）〜（１１）項のいずれかに記載の医薬組成物、
（１３）腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物が、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して調節作用を有する化合物を含有してなる薬剤と、インターフェロンとを含有してなる薬剤とからなるキットであることを特徴とする前記（８）に記載の医薬組成物、および
（１４）前記（１）〜（８）のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択された腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する化合物と、インターフェロンとを腎臓の糸球体病変の予防、緩和または治療を必要とする患者に投与することを特徴とする腎臓の糸球体病変の予防、緩和または治療方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のスクリーニング方法によれば、腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療できる化合物を容易に探索、同定することができる。また、本発明によれば、腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬化合物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の腎臓の糸球体病変の予防、緩和または治療できる化合物のスクリーニング方法は、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して被検化合物が示す調節作用を検定することを特徴とする。
【００１７】
被検化合物が示す調節作用の検定は、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とを被検化合物の存在下に培養し、該単核球または該ヒト培養細胞樹立株上に発現する４Ｆ２ｈｃの量を、被検化合物の非存在下に培養したときに発現する４Ｆ２ｈｃの量と比較することにより行なう。
【００１８】
本スクリーニング法に用いるヒト末梢単核球（peripheral blood mononuclear cell;ＰＢＭＣと略称される。）は、ヒトの末梢血から自体公知の方法により得ることができる。例えば、ヒトの末梢血から単核球細胞を分離する方法としては、５．７％ｗ／ｖのフィコール４００と、９．０％ｗ／ｖのジアトリゾネイト ナトリウム（Sodium diatrizoate）の水溶液であって比重が１．０７７ｇ／ｍＬに調整されたフィコール・パック（Ficoll-Paque、登録商標、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals）社製）とを用いた遠心分離方法を挙げることができる。より具体的には、上記の方法は、（ａ）予め決められた量のフィコール・パックを試験管の底に設置する工程、（ｂ）そのまま或いは希釈した血液試料を注意深くフィコール・パック上にピペットで移す工程、（ｃ）フィコール・パックの比重よりも大きい比重を有する血液成分が、フィコール・パック中に進むか、あるいはフィコール・パックを通過するように、（ｂ）で作製したフィコール・パック血液調整物を約４００〜５００×ｇで約３０〜４０分間遠心分離する工程、および（ｄ）ピペットでフィコール・パックの上方に分離された単核球細胞層を採取する工程からなる。
【００１９】
本発明で用いるヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とは、ヒトの正常な単球もしくはマクロファージと同様のマクロファージ活性化物質による刺激応答を示すものをいう。このようなヒト培養細胞樹立株としては、例えば、ヒト白血病培養細胞株などが挙げられ、具体的にはヒト白血病培養細胞株ＴＨＰ-１が挙げられる。ヒト白血病培養細胞株ＴＨＰ-１は、（財）ヒューマンサイエンス振興財団、研究資源バンク（Health Science Research Resources Bank）、（泉南市、大阪）から購入し使用することができる。該ＴＨＰ-１は、ヒト急性単球性白血病患者の末梢血由来から樹立されたマクロファージ様の細胞活性を合わせもつ培養細胞株である。
【００２０】
一方、本発明のスクリーング方法で用いるマクロファージ活性化物質は、ヒト末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cell；ＰＢＭＣ）または前記ヒト培養細胞株にヘテロメリックアミノ酸トランスポーターであるＡｓｃ−１分子、ＬＡＴ１（L-type amino acid transporter 1）、ＬＡＴ２（L-type amino acid transporter 2）（これらはＨ鎖にＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子をもつ）などを発現させる物質であれば特に限定されないが、好ましくはリポ多糖類（ＬＰＳ）またはインターフェロンである。インターフェロンとしては、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγなどが挙げられ、好ましくはインターフェロンγである。
【００２１】
前記リポ多糖類は、自体公知の方法を用いて調製できる。例えば、微生物から抽出し、所望により毒性を除去する処理を行うという方法が挙げられる。微生物からの抽出は、例えば、熱フェノール抽出法（Westphal & Jann., Methods Carbohydr. Chem. 5, 83−89 (1965) ）、または微生物をラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下でプロテナーゼＫ処理をする方法などを挙げることができる。また、化学的に合成したものを用いてもよいし、市販のものを適宜用いることもできる。本発明においては、適当な溶媒、好ましくはＲＰＭＩ１６４０液を用いて溶液としたときに、濃度が約６０〜１００μｇ／ｍＬ程度、好ましくは約７０〜９０μｇ／ｍＬ程度、より好ましくは約８０μｇ／ｍＬ程度の高濃度のものを用いることが好ましい。なお、リポ多糖類は市販品（例えば、Sigma社製の大腸菌由来のＬＰＳ、カタログ番号Ｌ２６５４）を好適に使用することもできる。一方、インターフェロンは、遺伝子工学技術により製造されるヒトリコンビナントインターフェロンを好適に使用することができる。
【００２２】
ヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株の培養に用いられる培地としては、ＲＰＭＩ培地が好ましい。このＲＰＭＩ培地は、Goding，J．W．(1980)J．Immunol．Methods 39，285，JAMA 199(1957)519に記載されている。また、市販品（Sigma社製）を用いてもよい。
【００２３】
ヒト末梢血単核球の培養はヒトＡＢ血清の存在下に、またはヒト培養細胞樹立株の培養はウシ胎児血清の存在下に、約３７℃で好適に実施できる。“被検化合物”、“リポ多糖類またはインターフェロン”、“ヒトＡＢ血清またはウシ胎児血清”および“ヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株”は、任意の組み合わせの２種または全部を予め混合してから前記培地に加えてもよく、それぞれを単独で前記培地に加えてもよい。ヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株の培養時間は、通常２〜１４日、好ましくは６〜１０日である。また、培養温度は約３７℃が好ましい。本培養は約５％ＣＯ２の条件下で実施するのが好ましい。
【００２４】
培養後、ヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株を回収し、該単核球または該ヒト培養細胞樹立株上に発現したＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子を該分子に対する抗体と反応させ、抗体が結合したヒト末梢血単核球細胞またはヒト培養細胞樹立株を例えばＦＡＣＳｃａｎにて解析することにより、該単核球または該ヒト培養細胞樹立株上に発現したＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子の量を算出することができる。
【００２５】
ＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子に対する抗体は、モノクローナル抗体でもよく、ポリクローナル抗体でもよい。モノクローナル抗体は、例えばJ Virology (1992); 66: 5999-6007に記載の方法に従って、次のようにして調製することができる。すなわち、ヒト上皮培養細胞株ＦＬでBALB/cマウスを免疫し、マウスの脾臓を採取しＳＰ２／０−ＡＧ−１４ミエローマ細胞と細胞融合を行う。ハイブリドーマ細胞を検出するためのスクリーニングには、ニューカッスル病ウイルスに感染したＦＬまたはＨｅｌａ細胞を用いる融合促進アッセイ（fusion-enhancing assay）が用いられる。これにより、マウス抗ヒトモノクローナル抗体４−５−１、６−１−３を産生するハイブリドーマ細胞を検出できる。ハイブリドーマ細胞は、５％ウシ胎児血清を加えたＭＥＭ培養液にて静置培養する。培養上清を原液濃度にてＦＡＣＳｃａｎに使用することができる。また、ヒト膀胱癌培養株Ｔ２４を免疫原として得られたＨＢＪ―１２７ハイブリドーマ細胞（Jpn J Cancer Res.(Gann) (1985); 76: 336参照）を、同様に、５％ウシ胎児血清を加えたＭＥＭ培養液にて静置培養する。培養上清を原液濃度にてＦＡＣＳｃａｎに使用できる。なお、上記モノクローナル抗体４−５−１、６−１−３およびＨＢＪ―１２７の性質は、Critical Reviews in Immunology, volume20/issue 3,2000,167-196に記載されている。ＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子に対するポリクローナル抗体は、ヒト４Ｆ２ｈｃの１６４−１７５のアミノ酸残基（ＨＫＮＱＫＤＤＶＡＱＴＤ（配列番号１））に相当するペプチドを合成し、そのＣ末端にシステイン残基を導入し、ＫＬＨ（keyhole−limpet hemocyanin）をカップリングさせて、ウサギに免疫し、同じペプチド（ヒト４Ｆ２ｈｃの１６４−１７５）を結合したアフィニテイーカラムにて精製して得ることができる。
【００２６】
ＦＡＣＳｃａｎは、回収したヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株に上記モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を作用させ、ついで二次抗体である蛍光抗体（例えば、ＦＩＴＣ−ヤギＩｇＧ）を作用させ、蛍光抗体で染色されたヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株を液流に乗せて流し、レーザー光の焦点を通過させ、個々の細胞が発する蛍光を測定することによって、ヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株に発現したＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子の量を測定することによって実施される。また、ＦＡＣＳｃａｎは、細胞膜に穴を開けて細胞質内のタンパク質も合わせて測定することができる。細胞質内のタンパク質も合わせて測定する場合を以下に説明する。まず、細胞を固定化する。すなわち、前記の如く回収したヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株に約４％ホルムアルデヒド溶液を添加し、約３７℃において約１０分静置して固定化する（Cytometry Part A(2003)；55A:61-70）。細胞固定には、例えば市販の細胞固定／細胞膜浸透化キット（商品名：BD Cytofix/CytopermTM Kit、カタログNo.554714、BD Bioscience社)のBD Cytofix/CytopermTM液を用いることができる。次に、抗体が細胞膜を通過できるよう膜透過処理を行う。すなわち、固定化処理後のヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株に約０．１％サポニン溶液を添加し、約４℃において約３０分静置する。膜透過処理には、例えば市販の前記、０．１％サポニンを含有する細胞固定／細胞膜浸透化キットのBD Perm/WashTM染色バッファーを用いることができる。ついで、免疫染色を行う。すなわち、膜透過処理後のヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株の細胞に、一次抗体であるウサギ抗ヒト４Ｆ２ｈｃポリクローナル抗体を反応させる。ついで、二次抗体として蛍光標識抗体（例えば、ヤギＦＩＴＣ−抗ウサギ免疫グロブリン）を反応させる。前記蛍光標識抗体で染色されたヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株を液流に乗せて流し、レーザー光の焦点を通過させ、個々の細胞が発する蛍光を測定することによって、ヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株に発現した４Ｆ２ｈｃ分子の量を測定する。
【００２７】
上記で測定されたＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子量を、被検化合物の非存在下のときの４Ｆ２ｈｃ量と比較することにより、ＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子量の増大または減少を検出することにより、ＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子の発現に対する被検化合物の調節作用を検定することができる。ここで、腎糸球体病変により低下している４Ｆ２ｈｃ量を増大させ、また腎糸球体病変により高まっているＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子量を減少させる化合物を同定・選択することにより、腎臓の糸球体病変の予防、緩和または治療できる化合物をスクリーニングすることができる。
【００２８】
また本発明の別の態様は、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して調節作用を有する化合物（以下、有効成分化合物ともいう。）と、インターフェロンとを組み合わせてなる腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物である。前記有効成分化合物と、インターフェロンとを併用することにより、腎臓の糸球体病変を予防、緩和、または治療する効果を前記化合物単独使用に比べて増強させることができる。
前記有効成分化合物としては、前記スクリーニング方法により選択された腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する化合物が挙げられる。このような化合物としては、国際公開第０１／７２７３０号パンフレットに記載されるような化合物、例えば、下記式［Ｉ］または［ＩＩ］：
【化１】
（式中、記号は国際公開第０１／７２７３０号パンフレットに記載されたものと同一意味を有する。）
で示される化合物が挙げられる。具体的には、２−フルオロ−５−オキソテトラヒドロフラン−２−カルボン酸ベンジルエステル、１−（４−フルオロフェノキシ）−３−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソベンゾフラン−１−カルボン酸などが挙げられる。また、前記有効成分化合物として下記式（３−２）で示される化合物も挙げられる。
【化２】
【００２９】
本発明の医薬組成物は、前記有効成分化合物とインターフェロンとを合剤としてもよく、各成分をそれぞれ含む薬剤からなるキットであってもよい。キットである場合、有効成分化合物を含む薬剤とインターフェロンを含む薬剤とを別々に投与してもよく、あるいは同時に投与してもよい。前記有効成分化合物とインターフェロンのモル比率は、通常１：０．００１〜１：０．５、好ましくは１：０．０２〜１：０．１である。
【実施例】
【００３０】
以下、実験例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明は、これら実験例により制限されるものではない。なお、本実験例に使用した被検化合物は、腎糸球体病変を選択的に抑制することが知られている化合物（６−２）および化合物（３−２）と、尿細管間質病変を選択的に抑制することが知られている化合物（４−２）および化合物（７−３）であり、これらの構造式は次の通りである（前記特許文献１、２参照）。
【化３】
【００３１】
上記既知化合物のうち、化合物（６−２）および化合物（３−２）は腎糸球体病変を選択的に抑制することが、一方、化合物（４−２）および化合物（７−３）は尿細管間質病変を選択的に抑制することが既知である（前記特許文献１，２）。
【００３２】
［実験例１］
（実験方法）
１）ヒト末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cell, ＰＢＭＣと略す）の分離：
正常ヒト末梢血よりヘパリンを少量シリンジに満たし約３０ｍｌを採血し、直ちに等量の０．９％生理食塩水（１ｍＭＥＤＴＡ添加）と混和した。５０ｍｌチューブに１２ｍｌヒストパック（Sigam-Aldrich社、HISTOPAQUE-1119, Cat No.1119-1）と１０ｍｌフィコールパック(Amersham Bioscience社、Ficoll-Paque Plus)を重層した上に静かに血液を重層した。４００ｇ２０分室温にて遠心し、血漿成分を約８ｍｌ集め、０．２μｍのミリポアフィルターを通した。リンパ球を含む単核球分画を集め、冷却したＰＢＳ（Ｃａ＋＋）を十分量加えて混和し、２５０ｇ１０分、４℃にて遠心洗浄した。上清を捨て、２回同様の操作を行なった。ペレットに先の採取した血漿を約８ｍｌ加えて混和し３７℃１０分静置した。２５０ｇ１０分、４℃にて遠心洗浄し、ペレットに血清未添加ＲＰＭＩ１６４０（２ｍＭＬグルタミン、５μｇ／ｍｌゲンタマイシン、以下、培養液ＲＰＭＩと略す）を加えて同様に遠心洗浄を行なった。ＰＢＭＣの最終細胞数を２×１０６／ｍｌに調整した。
【００３３】
２）リポ多糖類（ＬＰＳ）の調整：
大腸菌由来のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｌ２６５４）１ｍｇを５ｍｌの培養液ＲＰＭＩで希釈し、０．２μｌのミリポアフィルターを通したものを、ＬＰＳとして使用した。
【００３４】
３）被検化合物の希釈：
滅菌されたＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide））原液に被検化合物を溶解した後、培養液ＲＰＭＩで希釈を進め、最終１０−５（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ濃度になるように被検化合物を希釈調整し、１００ｎＭ以下の被検化合物濃度で活性を検討した。
【００３５】
４）培養：
マイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ３０４６）の各ウェルに、１０００μｌのＰＢＭＣ溶液、同量のＬＰＳ、２５０μｌの被検化合物溶液、２５０μｌのヒトＡＢ血清を加えて、６日間３７℃にて５％ＣＯ２−９５％ａｉｒに培養した。
【００３６】
５）培養ＰＢＭＣの回収：
培養終了後に、ラバーにて付着細胞を含めてＰＢＭＣを回収した。培養液は血清未添加ハンクス溶液（５μｌ／ｍｌゲンタマイシン加）にて１回洗浄し、同液で細胞数の濃度を４×１０６/mlに調整した。
【００３７】
６）ＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃに対するモノクローナル抗体（マウス抗ヒトモノクローナル抗体４−５−１、６−１−３およびＨＢＪ−１２７）の作成：
マウス抗ヒトモノクローナル抗体４−５−１および６−１−３の作成は、J Virology (1992); 66: 5999-6007に記載されている方法に準拠して行なった。すなわち、ヒト上皮培養細胞株ＦＬでＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、マウスの脾臓を採取しＳＰ２／０−ＡＧ−１４骨髄腫細胞と細胞融合を行なった。ハイブリドーマ細胞を検出するためのスクリーニングには、ニューキャッスル病ウイルス（Newcasle disease virus）に感染したＦＬ細胞またはＨｅｌａ細胞を用いた融合促進アッセイ（fusion-enhancing assay）を用いた。これにより、マウス抗ヒトモノクローナル抗体４−５−１，６−１−３を産生するハイブリドーマ細胞を検出した。
ハイブリドーマ細胞は、５％ウシ胎児血清を加えたＭＥＭ培養液にて静置培養した。培養上清を原液濃度にてＦＡＣＳｃａｎに使用した。
ヒト膀胱癌培養株Ｔ２４を免疫原として得られたＨＢＪ−１２７ハイブリドーマ細胞（Jpn J Cancer Res.(Gann) (1985); 76: 336参照）を、同様に、５％ウシ胎児血清を加えたＭＥＭ培養液にて静置培養した。培養上清を原液濃度にてＦＡＣＳｃａｎに使用した。
なお、上記で得られたマウス抗ヒトモノクローナル抗体４−５−１、６−１−３およびＨＢＪ−１２７の性質は、Critical Reviews in Immunology (2000); 20: 167-196に記載されている。
【００３８】
７）ＦＡＣＳｃａｎによる解析：
ＦＡＣＳｃａｎ用のチューブに３種類の抗体（すなわち、マウス抗ヒトモノクローナル抗体４−５−１、６−１−３およびＨＢＪ−１２７）を１００μｌ入れ、被検細胞を同量加えた。対照としてＰＢＳ（Ｃａ＋＋）をおいた。３７℃にて１０分、そして４℃にて２０分静置し、１５００ｒｐｍ５分遠心し、上清を捨て、ＰＢＳ（Ｃａ＋＋）を４ｍｌ加えて１５００ｒｐｍ５分遠心し上清を捨てた。チューブに二次抗体、ＦＩＴＣ−ヤギＩｇＧ（anti-mouse whole IgG， Cappel社 Cat#. 55493）を５０μｌ加え、４℃３０分静置した。再度、ＰＢＳ（Ｃａ＋＋）を４ｍｌ加えて１５００ｒｐｍ５分遠心し上清を除き、撹拌し、１％ホルマリン−ＰＢＳ溶液を３００μｌ〜５００μｌ加えて浮遊した。約１万個の細胞を測定し、単球マクロファージ分画の移動率を対照と比較し、１０％以上の差があれば有意と判定した。
【００３９】
（結果）
結果は、下記表１の通りである。
【表１】
【００４０】
（考察）
上記表１から、化合物（６−２）は、ＬＰＳにて刺激され培養されたヒトＰＢＭＣのマクロファージ分画に発現されるアミノ酸トランスポーターのＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃに対する分子を活性化し、発現を増加させた。一方、化合物（７−３）は発現を増加させなかった。
なお、表には示していないが、異なる正常ヒトＰＢＭＣを使った場合には、逆に、９０％以上に分子の発現増強した例においては、化合物（６−２）は選択的に５％以下に発現を低下させる作用を示した。
【００４１】
［実験例２］
（実験方法）
上記実験例１の１）〜５）と同様にして、ヒト末梢血単核球に、被検化合物（６−２）（終濃度１０ｎＭ）、または被検化合物（７−３）（終濃度１００ｎＭ）をＬＰＳ（終濃度８０μｇ／ｍｌ）添加と同時に添加して６日間培養した。さらに、一次抗体として、ウサギ抗ヒト４Ｆ２ｈｃポリクローナル抗体（Biol Pharm Bull 30：415-422，2007参照）を用いて、同様にしてヒトＰＢＭＣ中の、単球マクロファージより大きな分画（large-macropharge）に発現されるＨＡＴのピーク値を市販の細胞固定／細胞膜浸透化キット（商品名：BD Cytofix/CytopermTM Kit、カタログNo.554714、BD Bioscience社)を用いるＦＡＣＳｃａｎにより測定した。
なお、被検化合物の無添加のものを対照とし、ウサギ抗ヒトｒＢＡＴ（related to b０，＋−type amino acid transporter）ポリクローナル抗体は、ヒトｒＢＡＴのアミノ基末端（ＭＡＥＤＫＳＫＲＤＳＩＥＭＳＭＫＧＣ（配列番号２））とマウスｂ０，＋ＡＴ（ＢＡＴ１）のカルボキシル基末端（ＣＨＬＱＭＬＥＶＶＰＥＫＤＰＥ（配列番号３））からなる合成ペプチドを担体であるＫＬＨ（keyhole−limpet hemocyanin）にカップリングさせてウサギに免疫して得たものを使用した。
【００４２】
（結果）
結果は、下記表２の通りである。
【表２】
【００４３】
（考察）
上記表２から、被検化合物（６−２）はＨＡＴのheavy chainのうち４Ｆ２ｈｃ量をｒＢＡＴ量に影響することなく選択的に減少させたが、被検化合物（７−３）に効果はみられなかった。従って、被検化合物（６−２）が腎糸球体病変を軽減する効果があることから、同様に４Ｆ２ｈｃ量の発現を調節する効果を有する化合物を選択することにより腎糸球体病変を軽減させる化合物をスクリーニングできることが確認された。
【００４４】
［実験例３］
（実験方法）
上記実験例２において、ヒト末梢血単核球の代わりにヒト白血病培養細胞株ＴＨＰ−１を用い、被検化合物（６−２）の添加濃度を終濃度１００ｎＭ、被検化合物（７−３）の添加濃度を終濃度１０００ｎＭとし、ヒトＡＢ血清の代わりにウシ胎児血清を用いる以外は同様とし、ヒト白血病培養細胞株ＴＨＰ−１中の、ＬＰＳの刺激を受けていないものと比べて、より大きな分画(Large-cell)に発現されるＨＡＴのピーク値を求めた。なお、被検化合物の無添加のものを対照（コントロール）とし、ＨＡＴのピーク値の測定は市販の細胞固定／細胞膜浸透化キット（商品名：BD Cytofix/CytopermTM Kit、カタログNo.554714、BD Bioscience社)を用いるＦＡＣＳｃａｎにより行なった。
【００４５】
（結果）
結果は、下記表３の通りである。
【表３】
【００４６】
（考察）
上記表３から、被検化合物（６−２）はＨＡＴのheavy chainである４Ｆ２ｈｃ量を著しく変化させたが、被検化合物（７−３）では変化がみられなかった。従って、被検化合物（６−２）が腎糸球体病変を軽減する効果があることから、ヒト白血病培養細胞株ＴＨＰ-１を用いて、同様に４Ｆ２ｈｃ量の発現を調節する効果を有する化合物を選択することにより腎糸球体病変を軽減させる化合物を容易にスクリーニングできることが確認された。
【００４７】
［実験例４］
（実験方法）
上記実験例２において、ヒト末梢血単核球の代わりにヒト白血病培養細胞株ＴＨＰ−１を用い、被検化合物（６−２）の添加濃度を終濃度１００ｎＭ、ヒトＡＢ血清の代わりにウシ胎児血清を用い、ＬＰＳの代わりにヒトリコンビナント インターフェロンγ(human recombinant Interferon-gamma,（PHP050，Serotec社)（終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）とする以外は同様にした。また、一次抗体として、ウサギ抗ヒト４Ｆ２ｈｃポリクローナル抗体（Biol Pharm Bull 30：415-422，2007参照）を用いて、同様にしてヒト白血病培養細胞株ＴＨＰ−１中の、ＬＰＳの刺激を受けていないものと比べて、より大きな分画(Large-cell)に発現されるＨＡＴのピーク値を求めた。なお、被検化合物の無添加のもの（ＤＭＳＯのみ）を対照（コントロール）とし、ウサギ抗ヒトｒＢＡＴポリクローナル抗体は、実験例２と同様にして得た。
【００４８】
（結果）
結果は、下記表４の通りである。
【表４】
【００４９】
（考察）
上記表４から、被検化合物（６−２）はＨＡＴのheavy chainのうち４Ｆ２ｈｃ量をｒＢＡＴ量に影響することなく選択的に減少させた。従って、被検化合物（６−２）が腎糸球体病変を軽減する効果があることから、同様に４Ｆ２ｈｃ量の発現を調節する効果を有する化合物を選択することにより腎糸球体病変を軽減させる化合物を容易にスクリーニングできることが確認された。
【００５０】
［実験例５］
（実験方法）
１）ラット一側尿管閉塞解除モデルの作成：
８−９週齢、約２８０ｇのＳＤラット雄を用いて、石橋が考案確立した方法（石橋道男ほか：日本腎臓学会誌４２：２４８，２０００）により実験モデルを作成した。すなわち、ラットをエーテル麻酔下にて開腹し左腎下極の高さで尿管を７−０ナイロンで結紮閉腹した。閉塞１４日目に閉塞を解除しカフを用い尿路を再建した。すなわち、１４日後に結紮された閉塞尿管を部分切除し、２５ゲージポリエチレンチューブ（日本シャーウッド製）をカフとして、下方正常尿管断端より内腔に挿入留置し、次に上方の拡張した尿管内にもカフを留置し、それぞれ７−０ナイロンにて結紮固定し尿路を再建した。同時に、対側の右腎を摘出した。閉塞解除後に体重を測定し、解除後２日目、５日目および７日目に採血して血清クレアチニンを測定し、７日目には麻酔のもと犠死させ、左閉塞解除腎を摘出した。摘出した腎について腎重量の測定、腎病理形態学的検査を実施した。このモデルにおいて、被検化合物を投与しない場合は、閉塞期間中と閉塞解除後の経時的な病理形態学的検討において、腎構造の破壊をきたし、糸球体ボーマン嚢壁肥厚、メサンギウム細胞増生、糸球体硬化、尿細管の萎縮、拡張、間質への細胞浸潤、繊維化を呈する。
【００５１】
２）被検化合物の投与：
上記１）で得たモデルを用いて、被検化合物のインビボの生物学的な効果を検討した。被検化合物は、アラビアゴムとともに被検化合物の原末を滅菌生理食塩水に溶解し、アラビアゴムは５％、被検化合物は３０ｍｇ／ｍｌに調整した。連日３０ｍｇ／ｋｇを皮下注射した。１４日間の閉塞期間と７日間の閉塞解除の２１日間連日投与した。なお、コントロールは溶媒である５％アラビアゴムのみを投与した。
【００５２】
３）糸球体病変の観察：
被検化合物の投与開始から２２日目に、麻酔下に犠死させ、左閉塞解除腎を摘出し、中性ホルマリンにて固定した。固定されたパラフィン包埋腎組織を４ミクロンの厚みにて薄切し検討した。
組織切片を顕微鏡で観察し、視野内に入る糸球体の数と、病変（尿細管極におけるボーマン嚢上皮細胞の腫大を伴う拡張またはボーマン嚢基底膜の肥厚）の認められる糸球体の数を計数し、５０個の糸球体当たりの病変の認められる糸球体（病変糸球体と呼び）の数を算出した。
また、糸球体病変が改善したか否かは、５０個の糸球体当たりの病変糸球体数がコントロール群の平均値よりも１／２以下に抑えられた場合を改善ありと判定した。
【００５３】
４）Ａｓｃ−１陽性細胞数の検討：
アフィニテイー精製抗ラットＡｓｃ−１ポリクローナル抗体（ウサギ）を次のようにして作成した。すなわち、抗Ａｓｃ−１ペプタイドポリクローナル抗体（ウサギ）の作成のために、Ａｓｃ−１の５１７−５３０のアミノ酸残基に対応するオリゴペプチド（ＰＳＰＬＰＩＴＤＫＰＬＫＴＱＣ（配列番号４））を合成し（J Biol Chem (2000); 275:9690-9698参照）、Ｃ末端のシステイン基にアジュバンドとしてキーホールリンペッドヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanine）を結合させ、ウサギに免疫した。血清を免疫後７日目と１４日目に採取した。Ａｓｃ−１の５１７−５３０のアミノ酸残基に相当するオリゴペプチドを結合したアフィニテイーカラムにて血清を吸着解離操作により濃縮し、タンパク量０．５ｍｇ／ｍｌのアフィニテイー精製抗体を得た。免疫病理学的検討に際しては、パラフィンラット腎臓組織を用いてＰＢＳにて希釈し至適濃度にて使用した。
免疫組織染色は、ベンタナ社製自動免疫染色装置を含めベンタナＨＸシステムベンチマーク（ベンタナジャパン、東京）のプロトコールを基本にして行った。組織切片は、脱パラフィン後に、１００℃１時間熱処理を行った。ブロッキングとして１０％ヤギ血清（ヒストファイン ＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット、株式会社ニチレイバイオサイエンス社）を用い、一次抗体にアフィニテイー精製抗ラットＡｓｃ−１ポリクローナル抗体（ウサギ）を至適濃度、５０倍希釈にて室温１時間反応した。二次抗体として、ビオチン標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ヤギ）（ヒストファイン ＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット、株式会社ニチレイバイオサイエンス社）を室温３０分反応し、発色にはシンプルステインＤＡＢ溶液（ヒストファイン ＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット、株式会社ニチレイバイオサイエンス社）を用いた。
染色された細胞を顕微鏡にて観察し、視野内に入る細胞数とＡｓｃ−１＋細胞数とを計数し、５０個の糸球体当たりのＡｓｃ−１＋細胞の数を算出した。
【００５４】
５）尿細管間質病変の観察：
前記３）と同様にして得た組織切片を顕微鏡で観察し、尿細管の拡張に伴う尿細管の萎縮、尿細管基底膜の肥厚および尿細管間質の繊維化を観察し、±（ごく軽度の変化が認められた）を０．５点、＋（軽度の変化が認められた）を１点、＋＋（中程度の変化が認められた）を２点、＋＋＋（高度の変化が認められた）を３点とし、その合計を算出した。
また、糸球体病変が改善したか否かは、コントロール群の病変程度の平均値より１／２以下に抑えられた場合をもって改善ありと判定した。
【００５５】
（結果）
結果は下記表５〜８に示す通りである。
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【００５６】
（考察）
ラット一側尿管閉塞解除モデルにおける糸球体病変として、糸球体尿細管極のボーマン嚢上皮細胞の腫大を伴う拡張と、ボーマン嚢基底膜の肥厚が観察される。一方、尿細管間質病変は尿細管の拡張に伴う尿細管の萎縮、間質の線維化と基底膜の肥厚がある。表５から、化合物（６−２）を投与した群では、尿細管病変を軽減しないが、糸球体病変を選択的に軽減したことがわかる。
【００５７】
また、Ａｓｃ−１はＨＡＴ群のアミノ酸トランスポーターのひとつで、そのＨ鎖はＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃで共通している。化合物（６−２）を投与した群では、Ａｓｃ−１陽性細胞が糸球体係蹄やボーマン嚢壁の障害部位に集積し、コントロール群に較べて優位に増加した。すなわち、化合物（６−２）は、ＨＡＴのＨ鎖に作用することにより、ＨＡＴを活性化し、糸球体病変に親和性を有するＡｓｃ−１を発現する細胞を惹起した。Ａｓｃ−１のＨ鎖の４Ｆ２ｈｃ／ＦＲＰ−１／ＣＤ９８は、インテグリンの接着性の亢進と関連し、細胞融合を有することから、Ａｓｃ−１陽性細胞が、糸球体病変部位に誘導されて接着融合し、ＨＡＴの作用である蛋白合成を促進させる作用によって糸球体病変を軽減したものと考えられた。
【００５８】
一方、表６は、同様のモデルに化合物（７−３）を投与した実験結果である。対照群が４匹のうち１匹に尿細管間質病変が軽減されているが、化合物（７−３）群では、４匹すべてに病変が軽減されていたことから、同化合物は選択的に尿細管間質病変を抑える作用を有していることがわかる。このモデルでは、主たる障害が尿細管間質病変で糸球体病変は二次的であることから、尿細管間質病変の軽減により二次的に糸球体病変が軽度となっている可能性が考えられる。また、化合物（７−３）の投与群では、ＨＡＴのＨ鎖であるＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃへの作用を示さず、糸球体内へのＡｓｃ−１陽性細胞も少なかった。
【００５９】
表７は、化合物（６−２）と同じ作用をもつ公知化合物（３−２）を上記のモデルに投与したときの解析結果である。表４から、化合物（３−２）は、化合物（６−２）と同様の結果が得られていることがわかる。
【００６０】
表８は、化合物（７−３）と同じ作用をもつ公知化合物（４−２）を比較した解析結果である。表８から、化合物（４−２）は化合物（７−３）と同様の結果であったことが分かる。
【００６１】
以上の結果から、試験管内のスクリーニングによりＨＡＴのＨ鎖であるＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃを制御する化合物が同定されたとき、その化合物は、腎障害時にＨＡＴのＡｓｃ−１陽性細胞を惹起し腎糸球体病変に集積し接着融合することで蛋白合成を助長させることにより、選択的に腎糸球体病変を軽減する薬理作用を発揮することが確認できた。
【００６２】
［実験例６］
（実験方法）
５週齢の雄性ＳＤ（Sprague-Dawley）ラットにピューロマイシン（puromycin）５０ｍｇ／ｋｇを１回静脈内投与した場合、糸球体上皮障害を受けて投与後６日目から１４日目をピークに高度な蛋白尿を呈し、以後暫時軽減していくが、再び尿細管質病変による蛋白尿を再度呈することが知られている（Diamonod JR, Karnovsky MJ:Focal and segmental glomerulosclerosis following a single intravenous dose of puromycin aminonucleoside, Am. J. Pathol; 1986;122;481-487参照）（以下、このモデルをピューロマイシン誘導急性ネフローゼモデルという）。
糸球体病変のモデルとして上記のようなピューロマイシン誘導急性ネフローゼモデルを用いて、以下の方法で腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する化合物とインターフェロンγの併用による腎臓の糸球体病変の予防、緩和または治療についての効果を調べた。
５週齢の雄性ＳＤ（Sprague-Dawley）ラットにピューロマイシンを投与する日の５日前から前記化合物（６−２）を３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを連日皮下投与し、同時にピューロマイシンを投与する日の５日前からラットリコンビナント インターフェロンγ(rat recombinant Interferon-gamma,（PeproTech社)（終濃度９．０９μｇ／ｍｌ））０．２５ｍｌ（２．３×１０４Ｕ）を腹腔内に隔日に投与し、ピューロマイシン５０ｍｇ／ｋｇを１回静脈内投与した。ピューロマイシン投与後も、前記化合物（６−２）とラットリコンビナント インターフェロンγを同じ投与量にて、前記化合物（６−２）は連日、ラットリコンビナント インターフェロンγは隔日に投与を継続した。
ピューロマイシン投与後６日目、１２日目、１９日目に２４時間尿を蓄尿し、尿中のラットアルブミン排泄量をＥＬＩＺＡ法にて測定した。また同時に、尿中クレアニチン濃度を酵素法にて測定した。糸球体上皮障害の指標として、アルブミン排泄量および尿中アルブミン排泄量／尿中クレアニチンの比を評価した。
（結果）
結果は、表９、１０に示す。
【表９】
【表１０】
【００６３】
（考察）
化合物（６−２）とラットリコンビナント インターフェロンγの併用群は、化合物（６−２）単独投与群に比べて、有意に尿中アルブミン排泄量が減少すると共に、尿中アルブミン排泄量／尿中クレアニチンが優位に改善された。このことから、インターフェロンγを併用することで、腎臓の糸球体病変に対してより有効な治療効果が得られることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明方法によれば、簡便な方法で腎糸球体病変治療薬をスクリーニングできるため、医薬品産業において有用である。また、本発明によれば、有用な腎糸球体病変治療薬を提供できるため、医薬品産業において有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎糸球体障害治療剤のスクリーニング方法に関し、さらに詳しくは、ヒト末梢血単核球上にまたはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株上に発現する４Ｆ２ｈｃを検定することにより腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する化合物をスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物に関し、さらに詳しくは、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して調節作用を有する化合物と、インターフェロンとを組み合わせてなる腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器や組織障害後の修復・再生について、神経組織、皮膚創傷、腎尿細管障害などに関わる宿主固有の自己免疫性細胞の応答が存在することが示唆されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。そして、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２＋マクロファージと調節型ＣＤ２−ＣＤ４＋Ｔリンパ球を誘導促進する化合物が、選択的に腎糸球体障害を修復することが知られており（特許文献１）、またエフェクターマクロファージの誘導を抑制する化合物が腎臓の糸球体病変の改善効果があることも知られている（特許文献２）。
【０００３】
臓器障害後の組織修復には、ＤＮＡレベルの修復、細胞レベルの修復、そして器官構造レベルの修復が必要であり、細胞レベルにおいては、臓器に存在する前駆細胞の増殖分化を含む、細胞増殖、蛋白合成が要求され、構造の再構築修復には、損傷した組織が選択的に修復されることが示唆されている（非特許文献３）。
【０００４】
損傷した組織細胞に選択的に蛋白合成を促し修復や再生へと導くためには、修復再生の作用を有する細胞が選択的に病変の組織細胞に接着・融合する分子を持つと同時に、蛋白合成を促す分子も発現していることが合目的的である。
【０００５】
Fusion-regulatory protein（ＦＲＰ）−１、ＣＤ９８、４Ｆ２ｈｃ（４Ｆ２ heavy chain）は同じ分子のことであり、ＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子とも表示される。この分子は免疫刺激やウイルス感染時にＴ細胞やマクロファージに発現し、ウイルス感染時には融合を促し多核細胞を形成することが知られており（非特許文献４）、β１インテグリンと関連をもった機能、造血作用、アポトーシス、リンパ球増殖、ＢおよびＴリンパ球の機能、細胞融合から破骨細胞新生（osteoclastogenesis）、変異原性、ウイルス感染後の細胞癒合など多彩な細胞機能に関わっている。そして、前記分子（ＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子）は、アミノ酸トランスポーターのヘテロメリックアミノ酸トランスポーター（heteromeric amino acid transporter、ＨＡＴと略す）の重鎖（Ｈ鎖）を構成する（非特許文献５、非特許文献６）。ヒトマクロファージ上にもこのヘテロメリックアミノ酸トランスポーターが発現することは知られている（非特許文献７）。このヘテロメリックアミノ酸トランスポーターは、アミノ酸輸送について選択性は少なく、非特異的に蛋白合成を促すものである。
また、ある種の化合物（例えば、Ｃｙｎａｒｏｐｉｃｒｉｎ）がＣＤ９８分子を抑制して細胞凝集を抑えることが知られている（非特許文献４、非特許文献８）。
【０００６】
しかしながら、ＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子の発現を調節することにより、ヘテロメリックアミノ酸トランスポーターを発現した修復再生に関わる細胞を惹起する化合物の存在は知られていないし、試験管内にて上記の機能をもつ化合物を同定するためのスクリーニング方法も存在しない。
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００４／０２４１８５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／７２７３０号パンフレット
【非特許文献１】Renal Failure (1996); 18:355-375
【非特許文献２】Immunology Today (2000); 21:265-269
【非特許文献３】J Nephrology (2003); 16:186-195
【非特許文献４】Critical Review in Immunology (2000); 20: 167-196
【非特許文献５】Current Drug Metabolism (2001); 2: 339-354
【非特許文献６】Physiology (2005); 20: 112-124
【非特許文献７】Am J Physiol Cell Physiol (2001); C1964-C1970
【非特許文献８】Biochemical and Biophysical Research Communications (2004); 313: 954-961
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、腎糸球体障害治療剤のスクリーニング方法を提供するものである。さらに、本発明は、前記スクリーニング方法で得られた化合物とインターフェロンを含んでなる医薬組成物を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、選択的に糸球体病変を軽減し修復する作用を有する公知化合物（特許文献１，２）で治療された動物は対照動物と比べて、ヘテロメリックアミノ酸トランスポーターのひとつであるＡｓｃ−１分子を発現する単核球細胞が糸球体病変部位に優位に局在し、それら動物の糸球体病変は有意に軽減されている知見を得た。
【００１０】
さらに本発明者は、ヒト末梢血単核球をリポ多糖類（ＬＰＳ）で刺激培養する際、あるいはヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株（以下、単にヒト培養細胞株ということもある。）をインターフェロンで刺激培養する際、同時に糸球体病変を選択的に抑え修復する公知化合物（前記特許文献１，２）を添加して培養したところ、ヘテロメリックアミノ酸トランスポーターのＨ鎖であるＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子の発現を選択的に調整する作用をもつ知見を得た。
【００１１】
すなわち、単核球細胞あるいは前記ヒト培養細胞樹立株がヘテロメリックアミノ酸トランスポーターのひとつである神経細胞由来のＡｓｃ−１（asc-type amino acid transporter 1）を発現することは、Ｈ鎖分子であるＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子が活性化されたことにより糸球体が神経細胞の分子をあわせもつ特性と関連して糸球体病変時の障害細胞に親和性をもって接着融合し、Ａｓｃ−１が障害を受けた器官組織細胞が必要とするアミノ酸を広く供給でき細胞障害修復のために蛋白合成を促すことを意味する。
【００１２】
そして、糸球体病変を選択的に抑え修復する公知化合物が、Ａｓｃ−１を発現する単核球細胞を糸球体病変部位に選択的に誘導すること、さらに、この公知化合物が、ヒト末梢血単核球あるいは前記ヒト培養細胞樹立株をリポ多糖類（ＬＰＳ）またはインターフェロンなどのマクロファージ活性化物質で刺激培養開始と同時に添加して培養すると、ヘテロメリックアミノ酸トランスポーターのＨ鎖であるＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子の発現を選択的に調整する作用をもつことから、該当する化合物を容易に探索、同定するスクリーニング方法を提供することができる知見を得た。また、本発明者は、前記スクリーニング方法により得られた化合物とインターフェロンを併用することにより、腎臓の糸球体病変を飛躍的に予防、緩和または治療する医薬組成物を提供することができる知見も得た。
【００１３】
本発明者は、上記の知見に基づいてさらに検討を重ねて、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、
（１）ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株と、マクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して被検化合物が示す調節作用を検定することを特徴とする腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する化合物のスクリーニング方法、
（２）被検化合物が示す調節作用の検定を、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株をマクロファージ活性化物質および被検化合物の存在下に培養し、該単核球または該ヒト単球もしくは該ヒト培養細胞樹立株上に発現する４Ｆ２ｈｃの量を、被検化合物の非存在下に培養したときに発現する４Ｆ２ｈｃの量と比較することにより行なう前記（１）記載のスクリーニング方法、
（３）ヒト末梢血単核球の培養をヒトＡＢ型血清の存在下に、またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株の培養をウシ胎児血清の存在下に行なう前記（２）記載のスクリーニング方法、
（４）単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株上に発現する４Ｆ２ｈｃの量を、ＦＡＣＳｃａｎ解析により算出することを特徴とする前記（２）記載のスクリーニング方法、
（５）マクロファージ活性化物質がインターフェロンまたはリポ多糖類である前記（１）〜（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（６）ヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株がヒト白血病培養細胞株ＴＨＰ−１である前記（１）〜（５）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（７）（ａ）ヒトＡＢ型血清中、ヒト末梢血単核球をリポ多糖類および被検化合物の存在下に培養し、（ｂ）得られる培養液からヒト末梢血単核球を回収し、（ｃ）回収したヒト末梢血単核球に４Ｆ２ｈｃの抗体を反応させ、（ｄ）ＦＡＣＳｃａｎ解析により４Ｆ２ｈｃ量を算出し、（ｅ）該４Ｆ２ｈｃ量を被検化合物の非存在下のときの４Ｆ２ｈｃ量と比較して４Ｆ２ｈｃ量の増大または減少を検出することを特徴とする腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療できる化合物のスクリーニング方法、
（８）（ａ）ウシ胎児血清中、ヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株をリポ多糖類もしくはインターフェロンおよび被検化合物の存在下に培養し、（ｂ）得られる培養液からヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株を回収し、（ｃ）回収した該ヒト培養細胞樹立株に４Ｆ２ｈｃの抗体を反応させ、（ｄ）ＦＡＣＳｃａｎ解析により４Ｆ２ｈｃ量を算出し、（ｅ）該４Ｆ２ｈｃ量を被検化合物の非存在下のときの４Ｆ２ｈｃ量と比較して４Ｆ２ｈｃ量の増大または減少を検出することを特徴とする腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療できる化合物のスクリーニング方法、
（９）ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して調節作用を有する化合物と、インターフェロンとを組み合わせてなる腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物、
（１０）化合物が前記（１）〜（８）のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択される化合物である前記（９）記載の医薬組成物、
（１１）化合物が、２−フルオロ−５−オキソテトラヒドロフラン−２−カルボン酸ベンジルエステルまたは１−（４−フルオロフェノキシ）−３−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソベンゾフラン−１−カルボン酸である前記（９）または（１０）に記載の医薬組成物、
（１２）腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物が、配合剤であることを特徴とする前記（９）〜（１１）項のいずれかに記載の医薬組成物、
（１３）腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物が、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して調節作用を有する化合物を含有してなる薬剤と、インターフェロンとを含有してなる薬剤とからなるキットであることを特徴とする前記（８）に記載の医薬組成物、および
（１４）前記（１）〜（８）のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択された腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する化合物と、インターフェロンとを腎臓の糸球体病変の予防、緩和または治療を必要とする患者に投与することを特徴とする腎臓の糸球体病変の予防、緩和または治療方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のスクリーニング方法によれば、腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療できる化合物を容易に探索、同定することができる。また、本発明によれば、腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬化合物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の腎臓の糸球体病変の予防、緩和または治療できる化合物のスクリーニング方法は、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して被検化合物が示す調節作用を検定することを特徴とする。
【００１７】
被検化合物が示す調節作用の検定は、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とを被検化合物の存在下に培養し、該単核球または該ヒト培養細胞樹立株上に発現する４Ｆ２ｈｃの量を、被検化合物の非存在下に培養したときに発現する４Ｆ２ｈｃの量と比較することにより行なう。
【００１８】
本スクリーニング法に用いるヒト末梢単核球（peripheral blood mononuclear cell;ＰＢＭＣと略称される。）は、ヒトの末梢血から自体公知の方法により得ることができる。例えば、ヒトの末梢血から単核球細胞を分離する方法としては、５．７％ｗ／ｖのフィコール４００と、９．０％ｗ／ｖのジアトリゾネイト ナトリウム（Sodium diatrizoate）の水溶液であって比重が１．０７７ｇ／ｍＬに調整されたフィコール・パック（Ficoll-Paque、登録商標、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals）社製）とを用いた遠心分離方法を挙げることができる。より具体的には、上記の方法は、（ａ）予め決められた量のフィコール・パックを試験管の底に設置する工程、（ｂ）そのまま或いは希釈した血液試料を注意深くフィコール・パック上にピペットで移す工程、（ｃ）フィコール・パックの比重よりも大きい比重を有する血液成分が、フィコール・パック中に進むか、あるいはフィコール・パックを通過するように、（ｂ）で作製したフィコール・パック血液調整物を約４００〜５００×ｇで約３０〜４０分間遠心分離する工程、および（ｄ）ピペットでフィコール・パックの上方に分離された単核球細胞層を採取する工程からなる。
【００１９】
本発明で用いるヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とは、ヒトの正常な単球もしくはマクロファージと同様のマクロファージ活性化物質による刺激応答を示すものをいう。このようなヒト培養細胞樹立株としては、例えば、ヒト白血病培養細胞株などが挙げられ、具体的にはヒト白血病培養細胞株ＴＨＰ-１が挙げられる。ヒト白血病培養細胞株ＴＨＰ-１は、（財）ヒューマンサイエンス振興財団、研究資源バンク（Health Science Research Resources Bank）、（泉南市、大阪）から購入し使用することができる。該ＴＨＰ-１は、ヒト急性単球性白血病患者の末梢血由来から樹立されたマクロファージ様の細胞活性を合わせもつ培養細胞株である。
【００２０】
一方、本発明のスクリーング方法で用いるマクロファージ活性化物質は、ヒト末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cell；ＰＢＭＣ）または前記ヒト培養細胞株にヘテロメリックアミノ酸トランスポーターであるＡｓｃ−１分子、ＬＡＴ１（L-type amino acid transporter 1）、ＬＡＴ２（L-type amino acid transporter 2）（これらはＨ鎖にＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子をもつ）などを発現させる物質であれば特に限定されないが、好ましくはリポ多糖類（ＬＰＳ）またはインターフェロンである。インターフェロンとしては、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγなどが挙げられ、好ましくはインターフェロンγである。
【００２１】
前記リポ多糖類は、自体公知の方法を用いて調製できる。例えば、微生物から抽出し、所望により毒性を除去する処理を行うという方法が挙げられる。微生物からの抽出は、例えば、熱フェノール抽出法（Westphal & Jann., Methods Carbohydr. Chem. 5, 83−89 (1965) ）、または微生物をラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下でプロテナーゼＫ処理をする方法などを挙げることができる。また、化学的に合成したものを用いてもよいし、市販のものを適宜用いることもできる。本発明においては、適当な溶媒、好ましくはＲＰＭＩ１６４０液を用いて溶液としたときに、濃度が約６０〜１００μｇ／ｍＬ程度、好ましくは約７０〜９０μｇ／ｍＬ程度、より好ましくは約８０μｇ／ｍＬ程度の高濃度のものを用いることが好ましい。なお、リポ多糖類は市販品（例えば、Sigma社製の大腸菌由来のＬＰＳ、カタログ番号Ｌ２６５４）を好適に使用することもできる。一方、インターフェロンは、遺伝子工学技術により製造されるヒトリコンビナントインターフェロンを好適に使用することができる。
【００２２】
ヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株の培養に用いられる培地としては、ＲＰＭＩ培地が好ましい。このＲＰＭＩ培地は、Goding，J．W．(1980)J．Immunol．Methods 39，285，JAMA 199(1957)519に記載されている。また、市販品（Sigma社製）を用いてもよい。
【００２３】
ヒト末梢血単核球の培養はヒトＡＢ血清の存在下に、またはヒト培養細胞樹立株の培養はウシ胎児血清の存在下に、約３７℃で好適に実施できる。“被検化合物”、“リポ多糖類またはインターフェロン”、“ヒトＡＢ血清またはウシ胎児血清”および“ヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株”は、任意の組み合わせの２種または全部を予め混合してから前記培地に加えてもよく、それぞれを単独で前記培地に加えてもよい。ヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株の培養時間は、通常２〜１４日、好ましくは６〜１０日である。また、培養温度は約３７℃が好ましい。本培養は約５％ＣＯ２の条件下で実施するのが好ましい。
【００２４】
培養後、ヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株を回収し、該単核球または該ヒト培養細胞樹立株上に発現したＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子を該分子に対する抗体と反応させ、抗体が結合したヒト末梢血単核球細胞またはヒト培養細胞樹立株を例えばＦＡＣＳｃａｎにて解析することにより、該単核球または該ヒト培養細胞樹立株上に発現したＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子の量を算出することができる。
【００２５】
ＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子に対する抗体は、モノクローナル抗体でもよく、ポリクローナル抗体でもよい。モノクローナル抗体は、例えばJ Virology (1992); 66: 5999-6007に記載の方法に従って、次のようにして調製することができる。すなわち、ヒト上皮培養細胞株ＦＬでBALB/cマウスを免疫し、マウスの脾臓を採取しＳＰ２／０−ＡＧ−１４ミエローマ細胞と細胞融合を行う。ハイブリドーマ細胞を検出するためのスクリーニングには、ニューカッスル病ウイルスに感染したＦＬまたはＨｅｌａ細胞を用いる融合促進アッセイ（fusion-enhancing assay）が用いられる。これにより、マウス抗ヒトモノクローナル抗体４−５−１、６−１−３を産生するハイブリドーマ細胞を検出できる。ハイブリドーマ細胞は、５％ウシ胎児血清を加えたＭＥＭ培養液にて静置培養する。培養上清を原液濃度にてＦＡＣＳｃａｎに使用することができる。また、ヒト膀胱癌培養株Ｔ２４を免疫原として得られたＨＢＪ―１２７ハイブリドーマ細胞（Jpn J Cancer Res.(Gann) (1985); 76: 336参照）を、同様に、５％ウシ胎児血清を加えたＭＥＭ培養液にて静置培養する。培養上清を原液濃度にてＦＡＣＳｃａｎに使用できる。なお、上記モノクローナル抗体４−５−１、６−１−３およびＨＢＪ―１２７の性質は、Critical Reviews in Immunology, volume20/issue 3,2000,167-196に記載されている。ＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子に対するポリクローナル抗体は、ヒト４Ｆ２ｈｃの１６４−１７５のアミノ酸残基（ＨＫＮＱＫＤＤＶＡＱＴＤ（配列番号１））に相当するペプチドを合成し、そのＣ末端にシステイン残基を導入し、ＫＬＨ（keyhole−limpet hemocyanin）をカップリングさせて、ウサギに免疫し、同じペプチド（ヒト４Ｆ２ｈｃの１６４−１７５）を結合したアフィニテイーカラムにて精製して得ることができる。
【００２６】
ＦＡＣＳｃａｎは、回収したヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株に上記モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を作用させ、ついで二次抗体である蛍光抗体（例えば、ＦＩＴＣ−ヤギＩｇＧ）を作用させ、蛍光抗体で染色されたヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株を液流に乗せて流し、レーザー光の焦点を通過させ、個々の細胞が発する蛍光を測定することによって、ヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株に発現したＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子の量を測定することによって実施される。また、ＦＡＣＳｃａｎは、細胞膜に穴を開けて細胞質内のタンパク質も合わせて測定することができる。細胞質内のタンパク質も合わせて測定する場合を以下に説明する。まず、細胞を固定化する。すなわち、前記の如く回収したヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株に約４％ホルムアルデヒド溶液を添加し、約３７℃において約１０分静置して固定化する（Cytometry Part A(2003)；55A:61-70）。細胞固定には、例えば市販の細胞固定／細胞膜浸透化キット（商品名：BD Cytofix/CytopermTM Kit、カタログNo.554714、BD Bioscience社)のBD Cytofix/CytopermTM液を用いることができる。次に、抗体が細胞膜を通過できるよう膜透過処理を行う。すなわち、固定化処理後のヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株に約０．１％サポニン溶液を添加し、約４℃において約３０分静置する。膜透過処理には、例えば市販の前記、０．１％サポニンを含有する細胞固定／細胞膜浸透化キットのBD Perm/WashTM染色バッファーを用いることができる。ついで、免疫染色を行う。すなわち、膜透過処理後のヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株の細胞に、一次抗体であるウサギ抗ヒト４Ｆ２ｈｃポリクローナル抗体を反応させる。ついで、二次抗体として蛍光標識抗体（例えば、ヤギＦＩＴＣ−抗ウサギ免疫グロブリン）を反応させる。前記蛍光標識抗体で染色されたヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株を液流に乗せて流し、レーザー光の焦点を通過させ、個々の細胞が発する蛍光を測定することによって、ヒト末梢血単核球またはヒト培養細胞樹立株に発現した４Ｆ２ｈｃ分子の量を測定する。
【００２７】
上記で測定されたＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子量を、被検化合物の非存在下のときの４Ｆ２ｈｃ量と比較することにより、ＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子量の増大または減少を検出することにより、ＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子の発現に対する被検化合物の調節作用を検定することができる。ここで、腎糸球体病変により低下している４Ｆ２ｈｃ量を増大させ、また腎糸球体病変により高まっているＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃ分子量を減少させる化合物を同定・選択することにより、腎臓の糸球体病変の予防、緩和または治療できる化合物をスクリーニングすることができる。
【００２８】
また本発明の別の態様は、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して調節作用を有する化合物（以下、有効成分化合物ともいう。）と、インターフェロンとを組み合わせてなる腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物である。前記有効成分化合物と、インターフェロンとを併用することにより、腎臓の糸球体病変を予防、緩和、または治療する効果を前記化合物単独使用に比べて増強させることができる。
前記有効成分化合物としては、前記スクリーニング方法により選択された腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する化合物が挙げられる。このような化合物としては、国際公開第０１／７２７３０号パンフレットに記載されるような化合物、例えば、下記式［Ｉ］または［ＩＩ］：
【化１】
（式中、記号は国際公開第０１／７２７３０号パンフレットに記載されたものと同一意味を有する。）
で示される化合物が挙げられる。具体的には、２−フルオロ−５−オキソテトラヒドロフラン−２−カルボン酸ベンジルエステル、１−（４−フルオロフェノキシ）−３−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソベンゾフラン−１−カルボン酸などが挙げられる。また、前記有効成分化合物として下記式（３−２）で示される化合物も挙げられる。
【化２】
【００２９】
本発明の医薬組成物は、前記有効成分化合物とインターフェロンとを合剤としてもよく、各成分をそれぞれ含む薬剤からなるキットであってもよい。キットである場合、有効成分化合物を含む薬剤とインターフェロンを含む薬剤とを別々に投与してもよく、あるいは同時に投与してもよい。前記有効成分化合物とインターフェロンのモル比率は、通常１：０．００１〜１：０．５、好ましくは１：０．０２〜１：０．１である。
【実施例】
【００３０】
以下、実験例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明は、これら実験例により制限されるものではない。なお、本実験例に使用した被検化合物は、腎糸球体病変を選択的に抑制することが知られている化合物（６−２）および化合物（３−２）と、尿細管間質病変を選択的に抑制することが知られている化合物（４−２）および化合物（７−３）であり、これらの構造式は次の通りである（前記特許文献１、２参照）。
【化３】
【００３１】
上記既知化合物のうち、化合物（６−２）および化合物（３−２）は腎糸球体病変を選択的に抑制することが、一方、化合物（４−２）および化合物（７−３）は尿細管間質病変を選択的に抑制することが既知である（前記特許文献１，２）。
【００３２】
［実験例１］
（実験方法）
１）ヒト末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cell, ＰＢＭＣと略す）の分離：
正常ヒト末梢血よりヘパリンを少量シリンジに満たし約３０ｍｌを採血し、直ちに等量の０．９％生理食塩水（１ｍＭＥＤＴＡ添加）と混和した。５０ｍｌチューブに１２ｍｌヒストパック（Sigam-Aldrich社、HISTOPAQUE-1119, Cat No.1119-1）と１０ｍｌフィコールパック(Amersham Bioscience社、Ficoll-Paque Plus)を重層した上に静かに血液を重層した。４００ｇ２０分室温にて遠心し、血漿成分を約８ｍｌ集め、０．２μｍのミリポアフィルターを通した。リンパ球を含む単核球分画を集め、冷却したＰＢＳ（Ｃａ＋＋）を十分量加えて混和し、２５０ｇ１０分、４℃にて遠心洗浄した。上清を捨て、２回同様の操作を行なった。ペレットに先の採取した血漿を約８ｍｌ加えて混和し３７℃１０分静置した。２５０ｇ１０分、４℃にて遠心洗浄し、ペレットに血清未添加ＲＰＭＩ１６４０（２ｍＭＬグルタミン、５μｇ／ｍｌゲンタマイシン、以下、培養液ＲＰＭＩと略す）を加えて同様に遠心洗浄を行なった。ＰＢＭＣの最終細胞数を２×１０６／ｍｌに調整した。
【００３３】
２）リポ多糖類（ＬＰＳ）の調整：
大腸菌由来のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｌ２６５４）１ｍｇを５ｍｌの培養液ＲＰＭＩで希釈し、０．２μｌのミリポアフィルターを通したものを、ＬＰＳとして使用した。
【００３４】
３）被検化合物の希釈：
滅菌されたＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide））原液に被検化合物を溶解した後、培養液ＲＰＭＩで希釈を進め、最終１０−５（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ濃度になるように被検化合物を希釈調整し、１００ｎＭ以下の被検化合物濃度で活性を検討した。
【００３５】
４）培養：
マイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ３０４６）の各ウェルに、１０００μｌのＰＢＭＣ溶液、同量のＬＰＳ、２５０μｌの被検化合物溶液、２５０μｌのヒトＡＢ血清を加えて、６日間３７℃にて５％ＣＯ２−９５％ａｉｒに培養した。
【００３６】
５）培養ＰＢＭＣの回収：
培養終了後に、ラバーにて付着細胞を含めてＰＢＭＣを回収した。培養液は血清未添加ハンクス溶液（５μｌ／ｍｌゲンタマイシン加）にて１回洗浄し、同液で細胞数の濃度を４×１０６/mlに調整した。
【００３７】
６）ＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃに対するモノクローナル抗体（マウス抗ヒトモノクローナル抗体４−５−１、６−１−３およびＨＢＪ−１２７）の作成：
マウス抗ヒトモノクローナル抗体４−５−１および６−１−３の作成は、J Virology (1992); 66: 5999-6007に記載されている方法に準拠して行なった。すなわち、ヒト上皮培養細胞株ＦＬでＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、マウスの脾臓を採取しＳＰ２／０−ＡＧ−１４骨髄腫細胞と細胞融合を行なった。ハイブリドーマ細胞を検出するためのスクリーニングには、ニューキャッスル病ウイルス（Newcasle disease virus）に感染したＦＬ細胞またはＨｅｌａ細胞を用いた融合促進アッセイ（fusion-enhancing assay）を用いた。これにより、マウス抗ヒトモノクローナル抗体４−５−１，６−１−３を産生するハイブリドーマ細胞を検出した。
ハイブリドーマ細胞は、５％ウシ胎児血清を加えたＭＥＭ培養液にて静置培養した。培養上清を原液濃度にてＦＡＣＳｃａｎに使用した。
ヒト膀胱癌培養株Ｔ２４を免疫原として得られたＨＢＪ−１２７ハイブリドーマ細胞（Jpn J Cancer Res.(Gann) (1985); 76: 336参照）を、同様に、５％ウシ胎児血清を加えたＭＥＭ培養液にて静置培養した。培養上清を原液濃度にてＦＡＣＳｃａｎに使用した。
なお、上記で得られたマウス抗ヒトモノクローナル抗体４−５−１、６−１−３およびＨＢＪ−１２７の性質は、Critical Reviews in Immunology (2000); 20: 167-196に記載されている。
【００３８】
７）ＦＡＣＳｃａｎによる解析：
ＦＡＣＳｃａｎ用のチューブに３種類の抗体（すなわち、マウス抗ヒトモノクローナル抗体４−５−１、６−１−３およびＨＢＪ−１２７）を１００μｌ入れ、被検細胞を同量加えた。対照としてＰＢＳ（Ｃａ＋＋）をおいた。３７℃にて１０分、そして４℃にて２０分静置し、１５００ｒｐｍ５分遠心し、上清を捨て、ＰＢＳ（Ｃａ＋＋）を４ｍｌ加えて１５００ｒｐｍ５分遠心し上清を捨てた。チューブに二次抗体、ＦＩＴＣ−ヤギＩｇＧ（anti-mouse whole IgG， Cappel社 Cat#. 55493）を５０μｌ加え、４℃３０分静置した。再度、ＰＢＳ（Ｃａ＋＋）を４ｍｌ加えて１５００ｒｐｍ５分遠心し上清を除き、撹拌し、１％ホルマリン−ＰＢＳ溶液を３００μｌ〜５００μｌ加えて浮遊した。約１万個の細胞を測定し、単球マクロファージ分画の移動率を対照と比較し、１０％以上の差があれば有意と判定した。
【００３９】
（結果）
結果は、下記表１の通りである。
【表１】
【００４０】
（考察）
上記表１から、化合物（６−２）は、ＬＰＳにて刺激され培養されたヒトＰＢＭＣのマクロファージ分画に発現されるアミノ酸トランスポーターのＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃに対する分子を活性化し、発現を増加させた。一方、化合物（７−３）は発現を増加させなかった。
なお、表には示していないが、異なる正常ヒトＰＢＭＣを使った場合には、逆に、９０％以上に分子の発現増強した例においては、化合物（６−２）は選択的に５％以下に発現を低下させる作用を示した。
【００４１】
［実験例２］
（実験方法）
上記実験例１の１）〜５）と同様にして、ヒト末梢血単核球に、被検化合物（６−２）（終濃度１０ｎＭ）、または被検化合物（７−３）（終濃度１００ｎＭ）をＬＰＳ（終濃度８０μｇ／ｍｌ）添加と同時に添加して６日間培養した。さらに、一次抗体として、ウサギ抗ヒト４Ｆ２ｈｃポリクローナル抗体（Biol Pharm Bull 30：415-422，2007参照）を用いて、同様にしてヒトＰＢＭＣ中の、単球マクロファージより大きな分画（large-macropharge）に発現されるＨＡＴのピーク値を市販の細胞固定／細胞膜浸透化キット（商品名：BD Cytofix/CytopermTM Kit、カタログNo.554714、BD Bioscience社)を用いるＦＡＣＳｃａｎにより測定した。
なお、被検化合物の無添加のものを対照とし、ウサギ抗ヒトｒＢＡＴ（related to b０，＋−type amino acid transporter）ポリクローナル抗体は、ヒトｒＢＡＴのアミノ基末端（ＭＡＥＤＫＳＫＲＤＳＩＥＭＳＭＫＧＣ（配列番号２））とマウスｂ０，＋ＡＴ（ＢＡＴ１）のカルボキシル基末端（ＣＨＬＱＭＬＥＶＶＰＥＫＤＰＥ（配列番号３））からなる合成ペプチドを担体であるＫＬＨ（keyhole−limpet hemocyanin）にカップリングさせてウサギに免疫して得たものを使用した。
【００４２】
（結果）
結果は、下記表２の通りである。
【表２】
【００４３】
（考察）
上記表２から、被検化合物（６−２）はＨＡＴのheavy chainのうち４Ｆ２ｈｃ量をｒＢＡＴ量に影響することなく選択的に減少させたが、被検化合物（７−３）に効果はみられなかった。従って、被検化合物（６−２）が腎糸球体病変を軽減する効果があることから、同様に４Ｆ２ｈｃ量の発現を調節する効果を有する化合物を選択することにより腎糸球体病変を軽減させる化合物をスクリーニングできることが確認された。
【００４４】
［実験例３］
（実験方法）
上記実験例２において、ヒト末梢血単核球の代わりにヒト白血病培養細胞株ＴＨＰ−１を用い、被検化合物（６−２）の添加濃度を終濃度１００ｎＭ、被検化合物（７−３）の添加濃度を終濃度１０００ｎＭとし、ヒトＡＢ血清の代わりにウシ胎児血清を用いる以外は同様とし、ヒト白血病培養細胞株ＴＨＰ−１中の、ＬＰＳの刺激を受けていないものと比べて、より大きな分画(Large-cell)に発現されるＨＡＴのピーク値を求めた。なお、被検化合物の無添加のものを対照（コントロール）とし、ＨＡＴのピーク値の測定は市販の細胞固定／細胞膜浸透化キット（商品名：BD Cytofix/CytopermTM Kit、カタログNo.554714、BD Bioscience社)を用いるＦＡＣＳｃａｎにより行なった。
【００４５】
（結果）
結果は、下記表３の通りである。
【表３】
【００４６】
（考察）
上記表３から、被検化合物（６−２）はＨＡＴのheavy chainである４Ｆ２ｈｃ量を著しく変化させたが、被検化合物（７−３）では変化がみられなかった。従って、被検化合物（６−２）が腎糸球体病変を軽減する効果があることから、ヒト白血病培養細胞株ＴＨＰ-１を用いて、同様に４Ｆ２ｈｃ量の発現を調節する効果を有する化合物を選択することにより腎糸球体病変を軽減させる化合物を容易にスクリーニングできることが確認された。
【００４７】
［実験例４］
（実験方法）
上記実験例２において、ヒト末梢血単核球の代わりにヒト白血病培養細胞株ＴＨＰ−１を用い、被検化合物（６−２）の添加濃度を終濃度１００ｎＭ、ヒトＡＢ血清の代わりにウシ胎児血清を用い、ＬＰＳの代わりにヒトリコンビナント インターフェロンγ(human recombinant Interferon-gamma,（PHP050，Serotec社)（終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）とする以外は同様にした。また、一次抗体として、ウサギ抗ヒト４Ｆ２ｈｃポリクローナル抗体（Biol Pharm Bull 30：415-422，2007参照）を用いて、同様にしてヒト白血病培養細胞株ＴＨＰ−１中の、ＬＰＳの刺激を受けていないものと比べて、より大きな分画(Large-cell)に発現されるＨＡＴのピーク値を求めた。なお、被検化合物の無添加のもの（ＤＭＳＯのみ）を対照（コントロール）とし、ウサギ抗ヒトｒＢＡＴポリクローナル抗体は、実験例２と同様にして得た。
【００４８】
（結果）
結果は、下記表４の通りである。
【表４】
【００４９】
（考察）
上記表４から、被検化合物（６−２）はＨＡＴのheavy chainのうち４Ｆ２ｈｃ量をｒＢＡＴ量に影響することなく選択的に減少させた。従って、被検化合物（６−２）が腎糸球体病変を軽減する効果があることから、同様に４Ｆ２ｈｃ量の発現を調節する効果を有する化合物を選択することにより腎糸球体病変を軽減させる化合物を容易にスクリーニングできることが確認された。
【００５０】
［実験例５］
（実験方法）
１）ラット一側尿管閉塞解除モデルの作成：
８−９週齢、約２８０ｇのＳＤラット雄を用いて、石橋が考案確立した方法（石橋道男ほか：日本腎臓学会誌４２：２４８，２０００）により実験モデルを作成した。すなわち、ラットをエーテル麻酔下にて開腹し左腎下極の高さで尿管を７−０ナイロンで結紮閉腹した。閉塞１４日目に閉塞を解除しカフを用い尿路を再建した。すなわち、１４日後に結紮された閉塞尿管を部分切除し、２５ゲージポリエチレンチューブ（日本シャーウッド製）をカフとして、下方正常尿管断端より内腔に挿入留置し、次に上方の拡張した尿管内にもカフを留置し、それぞれ７−０ナイロンにて結紮固定し尿路を再建した。同時に、対側の右腎を摘出した。閉塞解除後に体重を測定し、解除後２日目、５日目および７日目に採血して血清クレアチニンを測定し、７日目には麻酔のもと犠死させ、左閉塞解除腎を摘出した。摘出した腎について腎重量の測定、腎病理形態学的検査を実施した。このモデルにおいて、被検化合物を投与しない場合は、閉塞期間中と閉塞解除後の経時的な病理形態学的検討において、腎構造の破壊をきたし、糸球体ボーマン嚢壁肥厚、メサンギウム細胞増生、糸球体硬化、尿細管の萎縮、拡張、間質への細胞浸潤、繊維化を呈する。
【００５１】
２）被検化合物の投与：
上記１）で得たモデルを用いて、被検化合物のインビボの生物学的な効果を検討した。被検化合物は、アラビアゴムとともに被検化合物の原末を滅菌生理食塩水に溶解し、アラビアゴムは５％、被検化合物は３０ｍｇ／ｍｌに調整した。連日３０ｍｇ／ｋｇを皮下注射した。１４日間の閉塞期間と７日間の閉塞解除の２１日間連日投与した。なお、コントロールは溶媒である５％アラビアゴムのみを投与した。
【００５２】
３）糸球体病変の観察：
被検化合物の投与開始から２２日目に、麻酔下に犠死させ、左閉塞解除腎を摘出し、中性ホルマリンにて固定した。固定されたパラフィン包埋腎組織を４ミクロンの厚みにて薄切し検討した。
組織切片を顕微鏡で観察し、視野内に入る糸球体の数と、病変（尿細管極におけるボーマン嚢上皮細胞の腫大を伴う拡張またはボーマン嚢基底膜の肥厚）の認められる糸球体の数を計数し、５０個の糸球体当たりの病変の認められる糸球体（病変糸球体と呼び）の数を算出した。
また、糸球体病変が改善したか否かは、５０個の糸球体当たりの病変糸球体数がコントロール群の平均値よりも１／２以下に抑えられた場合を改善ありと判定した。
【００５３】
４）Ａｓｃ−１陽性細胞数の検討：
アフィニテイー精製抗ラットＡｓｃ−１ポリクローナル抗体（ウサギ）を次のようにして作成した。すなわち、抗Ａｓｃ−１ペプタイドポリクローナル抗体（ウサギ）の作成のために、Ａｓｃ−１の５１７−５３０のアミノ酸残基に対応するオリゴペプチド（ＰＳＰＬＰＩＴＤＫＰＬＫＴＱＣ（配列番号４））を合成し（J Biol Chem (2000); 275:9690-9698参照）、Ｃ末端のシステイン基にアジュバンドとしてキーホールリンペッドヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanine）を結合させ、ウサギに免疫した。血清を免疫後７日目と１４日目に採取した。Ａｓｃ−１の５１７−５３０のアミノ酸残基に相当するオリゴペプチドを結合したアフィニテイーカラムにて血清を吸着解離操作により濃縮し、タンパク量０．５ｍｇ／ｍｌのアフィニテイー精製抗体を得た。免疫病理学的検討に際しては、パラフィンラット腎臓組織を用いてＰＢＳにて希釈し至適濃度にて使用した。
免疫組織染色は、ベンタナ社製自動免疫染色装置を含めベンタナＨＸシステムベンチマーク（ベンタナジャパン、東京）のプロトコールを基本にして行った。組織切片は、脱パラフィン後に、１００℃１時間熱処理を行った。ブロッキングとして１０％ヤギ血清（ヒストファイン ＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット、株式会社ニチレイバイオサイエンス社）を用い、一次抗体にアフィニテイー精製抗ラットＡｓｃ−１ポリクローナル抗体（ウサギ）を至適濃度、５０倍希釈にて室温１時間反応した。二次抗体として、ビオチン標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ヤギ）（ヒストファイン ＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット、株式会社ニチレイバイオサイエンス社）を室温３０分反応し、発色にはシンプルステインＤＡＢ溶液（ヒストファイン ＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット、株式会社ニチレイバイオサイエンス社）を用いた。
染色された細胞を顕微鏡にて観察し、視野内に入る細胞数とＡｓｃ−１＋細胞数とを計数し、５０個の糸球体当たりのＡｓｃ−１＋細胞の数を算出した。
【００５４】
５）尿細管間質病変の観察：
前記３）と同様にして得た組織切片を顕微鏡で観察し、尿細管の拡張に伴う尿細管の萎縮、尿細管基底膜の肥厚および尿細管間質の繊維化を観察し、±（ごく軽度の変化が認められた）を０．５点、＋（軽度の変化が認められた）を１点、＋＋（中程度の変化が認められた）を２点、＋＋＋（高度の変化が認められた）を３点とし、その合計を算出した。
また、糸球体病変が改善したか否かは、コントロール群の病変程度の平均値より１／２以下に抑えられた場合をもって改善ありと判定した。
【００５５】
（結果）
結果は下記表５〜８に示す通りである。
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【００５６】
（考察）
ラット一側尿管閉塞解除モデルにおける糸球体病変として、糸球体尿細管極のボーマン嚢上皮細胞の腫大を伴う拡張と、ボーマン嚢基底膜の肥厚が観察される。一方、尿細管間質病変は尿細管の拡張に伴う尿細管の萎縮、間質の線維化と基底膜の肥厚がある。表５から、化合物（６−２）を投与した群では、尿細管病変を軽減しないが、糸球体病変を選択的に軽減したことがわかる。
【００５７】
また、Ａｓｃ−１はＨＡＴ群のアミノ酸トランスポーターのひとつで、そのＨ鎖はＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃで共通している。化合物（６−２）を投与した群では、Ａｓｃ−１陽性細胞が糸球体係蹄やボーマン嚢壁の障害部位に集積し、コントロール群に較べて優位に増加した。すなわち、化合物（６−２）は、ＨＡＴのＨ鎖に作用することにより、ＨＡＴを活性化し、糸球体病変に親和性を有するＡｓｃ−１を発現する細胞を惹起した。Ａｓｃ−１のＨ鎖の４Ｆ２ｈｃ／ＦＲＰ−１／ＣＤ９８は、インテグリンの接着性の亢進と関連し、細胞融合を有することから、Ａｓｃ−１陽性細胞が、糸球体病変部位に誘導されて接着融合し、ＨＡＴの作用である蛋白合成を促進させる作用によって糸球体病変を軽減したものと考えられた。
【００５８】
一方、表６は、同様のモデルに化合物（７−３）を投与した実験結果である。対照群が４匹のうち１匹に尿細管間質病変が軽減されているが、化合物（７−３）群では、４匹すべてに病変が軽減されていたことから、同化合物は選択的に尿細管間質病変を抑える作用を有していることがわかる。このモデルでは、主たる障害が尿細管間質病変で糸球体病変は二次的であることから、尿細管間質病変の軽減により二次的に糸球体病変が軽度となっている可能性が考えられる。また、化合物（７−３）の投与群では、ＨＡＴのＨ鎖であるＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃへの作用を示さず、糸球体内へのＡｓｃ−１陽性細胞も少なかった。
【００５９】
表７は、化合物（６−２）と同じ作用をもつ公知化合物（３−２）を上記のモデルに投与したときの解析結果である。表４から、化合物（３−２）は、化合物（６−２）と同様の結果が得られていることがわかる。
【００６０】
表８は、化合物（７−３）と同じ作用をもつ公知化合物（４−２）を比較した解析結果である。表８から、化合物（４−２）は化合物（７−３）と同様の結果であったことが分かる。
【００６１】
以上の結果から、試験管内のスクリーニングによりＨＡＴのＨ鎖であるＦＲＰ−１／ＣＤ９８／４Ｆ２ｈｃを制御する化合物が同定されたとき、その化合物は、腎障害時にＨＡＴのＡｓｃ−１陽性細胞を惹起し腎糸球体病変に集積し接着融合することで蛋白合成を助長させることにより、選択的に腎糸球体病変を軽減する薬理作用を発揮することが確認できた。
【００６２】
［実験例６］
（実験方法）
５週齢の雄性ＳＤ（Sprague-Dawley）ラットにピューロマイシン（puromycin）５０ｍｇ／ｋｇを１回静脈内投与した場合、糸球体上皮障害を受けて投与後６日目から１４日目をピークに高度な蛋白尿を呈し、以後暫時軽減していくが、再び尿細管質病変による蛋白尿を再度呈することが知られている（Diamonod JR, Karnovsky MJ:Focal and segmental glomerulosclerosis following a single intravenous dose of puromycin aminonucleoside, Am. J. Pathol; 1986;122;481-487参照）（以下、このモデルをピューロマイシン誘導急性ネフローゼモデルという）。
糸球体病変のモデルとして上記のようなピューロマイシン誘導急性ネフローゼモデルを用いて、以下の方法で腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する化合物とインターフェロンγの併用による腎臓の糸球体病変の予防、緩和または治療についての効果を調べた。
５週齢の雄性ＳＤ（Sprague-Dawley）ラットにピューロマイシンを投与する日の５日前から前記化合物（６−２）を３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを連日皮下投与し、同時にピューロマイシンを投与する日の５日前からラットリコンビナント インターフェロンγ(rat recombinant Interferon-gamma,（PeproTech社)（終濃度９．０９μｇ／ｍｌ））０．２５ｍｌ（２．３×１０４Ｕ）を腹腔内に隔日に投与し、ピューロマイシン５０ｍｇ／ｋｇを１回静脈内投与した。ピューロマイシン投与後も、前記化合物（６−２）とラットリコンビナント インターフェロンγを同じ投与量にて、前記化合物（６−２）は連日、ラットリコンビナント インターフェロンγは隔日に投与を継続した。
ピューロマイシン投与後６日目、１２日目、１９日目に２４時間尿を蓄尿し、尿中のラットアルブミン排泄量をＥＬＩＺＡ法にて測定した。また同時に、尿中クレアニチン濃度を酵素法にて測定した。糸球体上皮障害の指標として、アルブミン排泄量および尿中アルブミン排泄量／尿中クレアニチンの比を評価した。
（結果）
結果は、表９、１０に示す。
【表９】
【表１０】
【００６３】
（考察）
化合物（６−２）とラットリコンビナント インターフェロンγの併用群は、化合物（６−２）単独投与群に比べて、有意に尿中アルブミン排泄量が減少すると共に、尿中アルブミン排泄量／尿中クレアニチンが優位に改善された。このことから、インターフェロンγを併用することで、腎臓の糸球体病変に対してより有効な治療効果が得られることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明方法によれば、簡便な方法で腎糸球体病変治療薬をスクリーニングできるため、医薬品産業において有用である。また、本発明によれば、有用な腎糸球体病変治療薬を提供できるため、医薬品産業において有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して調節作用を有する化合物と、インターフェロンとを組み合わせてなる腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物。
【請求項２】
化合物が、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株と、マクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して被検化合物が示す調節作用を検定することを特徴とする腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する化合物のスクリーニング方法により選択される化合物である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
化合物が、（１）ヒトＡＢ型血清中、ヒト末梢血単核球をリポ多糖類および被検化合物の存在下に培養し、（２）得られる培養液からヒト末梢血単核球を回収し、（３）回収したヒト末梢血単核球に４Ｆ２ｈｃの抗体を反応させ、（４）ＦＡＣＳｃａｎ解析により４Ｆ２ｈｃ量を算出し、（５）該４Ｆ２ｈｃ量を被検化合物の非存在下のときの４Ｆ２ｈｃ量と比較して４Ｆ２ｈｃ量の増大または減少を検出することを特徴とする腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療できる化合物のスクリーニング方法により選択される化合物である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
化合物が、（１）ウシ胎児血清中、ヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株をリポ多糖類もしくはインターフェロンおよび被検化合物の存在下に培養し、（２）得られる培養液からヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株を回収し、（３）回収した該ヒト培養細胞樹立株に４Ｆ２ｈｃの抗体を反応させ、（４）ＦＡＣＳｃａｎ解析により４Ｆ２ｈｃ量を算出し、（５）該４Ｆ２ｈｃ量を被検化合物の非存在下のときの４Ｆ２ｈｃ量と比較して４Ｆ２ｈｃ量の増大または減少を検出することを特徴とする腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する化合物のスクリーニング方法により選択される化合物である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
化合物が、２−フルオロ−５−オキソテトラヒドロフラン−２−カルボン酸ベンジルエステルまたは１−（４−フルオロフェノキシ）−３−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソベンゾフラン−１−カルボン酸である請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物が、配合剤であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物が、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して調節作用を有する化合物を含有してなる薬剤と、インターフェロンとを含有してなる薬剤とからなるキットであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１】
ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して調節作用を有する化合物と、インターフェロンとを組み合わせてなる腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物。
【請求項２】
化合物が、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株と、マクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して被検化合物が示す調節作用を検定することを特徴とする腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する化合物のスクリーニング方法により選択される化合物である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
化合物が、（１）ヒトＡＢ型血清中、ヒト末梢血単核球をリポ多糖類および被検化合物の存在下に培養し、（２）得られる培養液からヒト末梢血単核球を回収し、（３）回収したヒト末梢血単核球に４Ｆ２ｈｃの抗体を反応させ、（４）ＦＡＣＳｃａｎ解析により４Ｆ２ｈｃ量を算出し、（５）該４Ｆ２ｈｃ量を被検化合物の非存在下のときの４Ｆ２ｈｃ量と比較して４Ｆ２ｈｃ量の増大または減少を検出することを特徴とする腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療できる化合物のスクリーニング方法により選択される化合物である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
化合物が、（１）ウシ胎児血清中、ヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株をリポ多糖類もしくはインターフェロンおよび被検化合物の存在下に培養し、（２）得られる培養液からヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株を回収し、（３）回収した該ヒト培養細胞樹立株に４Ｆ２ｈｃの抗体を反応させ、（４）ＦＡＣＳｃａｎ解析により４Ｆ２ｈｃ量を算出し、（５）該４Ｆ２ｈｃ量を被検化合物の非存在下のときの４Ｆ２ｈｃ量と比較して４Ｆ２ｈｃ量の増大または減少を検出することを特徴とする腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する化合物のスクリーニング方法により選択される化合物である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
化合物が、２−フルオロ−５−オキソテトラヒドロフラン−２−カルボン酸ベンジルエステルまたは１−（４−フルオロフェノキシ）−３−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソベンゾフラン−１−カルボン酸である請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物が、配合剤であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
腎臓の糸球体病変を予防、緩和または治療する医薬組成物が、ヒト末梢血単核球またはヒト単球もしくはヒトマクロファージの性質を有するヒト培養細胞樹立株とマクロファージ活性化物質とが接触して惹起される４Ｆ２ｈｃの発現に対して調節作用を有する化合物を含有してなる薬剤と、インターフェロンとを含有してなる薬剤とからなるキットであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【公開番号】特開２００９−１２６８２２（Ｐ２００９−１２６８２２Ａ）
【公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３０３４０６（Ｐ２００７−３０３４０６）
【出願日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【出願人】（５００１３８０５４）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【出願人】（５００１３８０５４）
【Ｆターム（参考）】
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