腫瘍の治療のための、抗ＭＥＴモノクローナル抗体、フラグメント及びそのベクター、並びに対応する製品
腫瘍及び／または転移の治療のための薬物を調製するための、及び腫瘍性細胞を検出するための診断用装置の準備のための、肝細胞増殖因子の細胞外ドメインに対して産生されたモノクローナル抗体並びに抗Ｍｅｔモノクローナル抗体をコードしているヌクレオチド配列の少なくとも部分を含むベクター、抗Ｍｅｔモノクローナル抗体及び／またはそのフラグメント及び少なくとも１つのキナーゼ阻害剤を含む製品の使用が開示されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍及び腫瘍転移に関する治療薬の調製並びにインビボ、またはインビトロにおける腫瘍細胞を検知する診断用装置のためのモノクローナル抗体、フラグメント及び／またはそれらの部分の使用、並びにモノクローナル抗体、フラグメント及び／またはそれらの部分をコードしているヌクレオチド配列の使用に関する。特に、本発明は肝細胞増殖因子受容体の細胞外領域に対して産生される抗Ｍｅｔモノクローナル抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌免疫療法の科学的な調査は１９５０年代に始まり、最初の適用はポリクローナル抗体に頼っていた。５０年以上経った今日、モノクローナル抗体を用いた免疫療法は癌治療（１、２）のための有望な代替として提供し続けている。癌においてチロシンキナーゼ受容体（ＲＴＫｓ）を標的とするいくつかの抗体が臨床診療（３）で現在使われている。これらの抗体の作用のメカニズムは症例が異なれば異なり、そして成功した出願の例にもかかわらず、しばしば十分に理解されていない（４）。ベバシズマブ及びセツキシマブは、それぞれ血管内皮増殖因子−血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ）及び上皮細胞増殖因子−上皮細胞増殖因子受容体を標的とし、そしてリガンド−受容体の相互作用（５、６）を防ぐことによって作用する。ハーセプチンはヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）に特有のモノクローナル抗体で、上皮細胞増殖因子受容体ファミリーの一員である。ハーセプチン効果の基礎をなしている作用のメカニズムは完全に明白となったわけではないがＨＥＲ２の分解を促進することが示された。このように、腫瘍細胞（７）の表面で受容体レベルを低下させる。
【０００３】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のためにチロシンキナーゼ受容体をコードしているＭＥＴ発癌遺伝子は、細胞増殖、浸潤及びアポトーシスからの保護を導く遺伝的プログラムを制御している。肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）の調節された活性化は腫瘍原性の性質の獲得のためにだけでなく浸潤性表現型（８）の達成のためにも重大な意味を持つ。人間の腫瘍におけるＭＥＴの役割はいくつかの実験的なアプローチから見出され、カルシノーマの遺伝的形成においてＭＥＴの活性化突然変異の発見によって明解に証明された。（９、１０）。さらに、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）の恒常的活性化は孤発性癌でもまた頻繁に起こり、この研究所及び他の研究所からの研究により特別なヒストタイプ（histotypes)の腫瘍においてＭＥＴ発癌遺伝子が過剰発現されるか、または自己分泌機構を経由して活性化されることが示された。その上、ＭＥＴ遺伝子は結腸直腸癌腫(11)の血行性転移で増幅される。Ｍｅｔ活性化を妨げることは腫瘍形成及び転移のプロセスを阻止する挑戦的なアプローチになる。過去数年において、シグナル伝達し、ＨＧＦＲそれ自体またはそのリガンドを標的としている異常なＨＧＦＲを阻止するためにいくつかの戦略が提案されている。これらのアプローチはＨＧＦ拮抗剤、ＨＧＦ中和抗体、ＨＧＦＲおとり、ＨＧＦＲの小分子ＡＴＰ結合部位阻害剤またはゲルダナマイシン、ＳＨ２ドメインポリペプチド及びリボザイム（１２でチェックされる）のような小分子の使用を含んでいる。
【０００４】
発明の要約
本発明は腫瘍により影響を受けた対象における腫瘍及び／または転移の治療において、並びにインビボ、またはインビトロのいずれかで腫瘍細胞を検知する診断用装置において肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）の細胞外領域に対して指向されるモノクローナル抗体の使用に関する。
【０００５】
このように、本発明の目的は、薬物の調製のため、腫瘍及び腫瘍により被る場所への転移の治療のため及びインビボまたはインビトロのいずれかにおいて腫瘍細胞を検知する診断用装置のために、i）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体、ii）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含むフラグメント及び／またはiii）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域または相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含む一般的に操作された抗体を使用するもので、そのうち抗Ｍｅｔモノクローナル抗体−抗ＭＥＴ−Ｒと称する−は先端バイオテクノロジーセンター（ＡＢＣ）、細胞系統コレクション研究所（ＩＣＬＣ）、受託番号ＩＣＬＣ ＰＤ ０５００６をもつイタリア、ジェノバ、ラルゴ ロザンナ ベンツィ １０、ＧＭＰにおけるＳ．Ｓ． Ｂａｎｃａ Ｃｅｌｌｕｌｅ ｅ Ｃｏｌｔｕｒｅ、により寄託された融合細胞系統によって産生される。
【０００６】
本発明の他の目的は、腫瘍に罹っている対象における腫瘍及び転移の治療のための薬剤の調製のための、融合細胞系統ＩＣＬＣ ＰＤ０５００６によって産生される抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域またはＣＤＲｓをコードしているヌクレオチド配列の少なくとも部分を含むベクターの使用である。
【０００７】
本発明の他の目的は、ｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体、ｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含むフラグメント及び／またはｉｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域またはＣＤＲｓを含む遺伝子操作により得られた抗体並びに少なくとも１つのキナーゼ阻害剤の、腫瘍及び／または転移の治療に同時に、別々に、連続的に使用するための混合調合物としての使用である。
【０００８】
本発明の他の目的は、腫瘍及び／または転移の予防及び／または治療における薬理学的に有効である化合物の同定のために、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）の細胞外ドメインの少なくとも一つの部分に結合することができる化合物をスクリーニングする方法である。
【０００９】
本発明の他の目的は、インビボ、またはインビトロのいずれかで腫瘍細胞を検知する診断用ツールとして用いるように抗Ｍｅｔ−Ｒ、それらのフラグメント及び／または抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体のエピトープ領域またはＣＤＲｓを含む遺伝子操作により得られた抗体の使用である。
【００１０】
本発明によれば、これらの目的は、本発明に関してここに提供された技術的な説明に不可欠な部分である下記の特許請求の範囲に記載した方法によって達成される。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１
抗Ｍｅｔ−ＲはＨＧＦＲ活性化及びシグナル伝達を減じる。（Ａ）ＨＧＦＲ活性化の評価。ＧＴＬ１６細胞を所定時間抗ＭＥＴ−Ｒに曝した。ＨＧＦＲは細胞溶解物から免疫沈降され、そしてウェスタンブロットによって指示された抗体で調べた抗Ｍｅｔ−Ｒ処置により、バンド密度の定量化により示されているように、受容体のダウンレギュレーションよりももっとはっきりと受容体活性化を減少させる結果となった。（Ｂ）ＨＧＦＲシグナルの分析。細胞をＶＳＶ−Ｇまたは抗ＭＥＴ−Ｒのいずれかで前処置し、そして所定の時間ＨＧＦで刺激した。Ａｋｔリン酸化を全細胞溶解物中で評価した。上部のパネルに示されるように抗Ｍｅｔ−Ｒは基底及びＨＧＦ誘導性のＡｋｔ活性化の両者を減少させた。
図２
抗Ｍｅｔ−Ｒはインビトロにおける癌細胞の形質転換された表現型を阻害する。（Ａ）ＧＬＴ１６細胞の足場非依存性増殖。前処理された細胞を０．５％アガーに播種した。細胞を抗ＭＥＴ−ＲまたはＶＳＶ−Ｇ抗体の所定の量の存在において維持し、そして１０日後増殖したコロニーを染色した。足場非依存性増殖は抗ＭＥＴ−Ｒの少しの服用量でも徹底して阻害された。（Ｂ）浸潤アッセイ。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ β４をマトリゲル被覆トランスウェル容器に播種する前に、所定の抗体を用いて２４時間前処理した。低いほうの容器を、ＤＭＥＭ２％ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍｌＨＧＦで満たした。２４時間後、遊走した細胞を染色し、カウントした。ＨＧＦの応答における浸潤性能力は刺激されていない細胞と比較して向上するように発現する。示されるように抗Ｍｅｔ−Ｒ治療により細胞の浸潤が著しく減少した。
図３
抗Ｍｅｔ−Ｒはインビボ（Ａ、Ｂ）の腫瘍形成アッセイにおける癌細胞の形質転換された表現型を阻害する。ヌードマウスの皮下に１．５×１０６ＧＴＬ１６細胞を注入した。腫瘍が出現した後、同じサイズの腫瘍が示されたマウスを選抜し、ＶＳＶ−Ｇまたは抗ＭＥＴ−Ｒのいずれかの２μｇ／ｇｒを週２回生体内原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）に注入した。腫瘍の体積を異なる時点で測定した（Ａ）。示されるように、人間の腫瘍細胞を移植されたヌードマウスにおいて抗ＭＥＴ−Ｒは腫瘍増殖を弱めた。マウスは治療の８週間後に屠殺され、腫瘍の重量を測定した（Ｂ）抗Ｍｅｔ−Ｒの治療により、対照マウスよりも著しく腫瘍が小さくなった（ｐ＜０．０５）。（Ｃ）ＨＧＦＲ活性化の評価。ＶＳＶ−Ｇ（パネルＡ）、または抗ＭＥＴ−Ｒ（パネルＢ）で処置されたマウスからの腫瘍切片を抗−ヒトのリン酸−ＨＧＦＲで染色した。
腫瘍の免疫化学的分析により抗ＭＥＴ−Ｒで処置されたマウスにおいて、活性化ＨＧＦＲのレベルが強く低下したことが明らかとなった。
図４
抗Ｍｅｔ−Ｒ治療はインビボでの腫瘍の進行を妨げる。ヌードマウスの皮下に２．５×１０６ＭＤＡ−ＭＢ−４３５β４細胞を接種した。腫瘍の増殖を無処置のマウス（Ａ）と以下で処置されたマウスを用いて評価した：１０μｇ／ｇｒ ＶＳＶ−Ｇを投与されたＩＰ（Ｂ）、１０μｇ／ｇｒ抗ＭＥＴ−Ｒ ＩＰ（Ｃ）、１０μｇ／ｇｒ抗ＭＥＴ−Ｒ ＩＰ（Ｄ）、及び２μｇ／ｇｒ抗ＭＥＴ−Ｒ ＩＳ（Ｅ）。図（Ｋ）で示すように、抗ＭＥＴ−Ｒはヒト腫瘍細胞を移植されたヌードマウスにおいて腫瘍の増殖を阻害した。左のパネルで示されるように、抗ヒトリン酸−ＨＧＦＲの免疫化学的染色を腫瘍の断片上で実施した。強いＨＧＦＲ活性化は無処置マウス（Ｆ）と支配抗体で処置されたマウス（Ｇ）の両者で起こっていた。抗ＭＥＴ−Ｒの投与により腫瘍増殖の阻害と平行してＨＧＦＲの阻害を引き起こす結果となった。（Ｌ）肺転移の分析。転移は、ヘマトキシリン／エオシン染色の後、肺部の微細な観察によって数えられた。転移数の服用に依存する減少は抗ＭＥＴ−Ｒ治療を受けているマウスに明らかであった。（Ｍ−Ｎ）腫瘍血管新生の評価。腫瘍組織学的切片上の免疫蛍光染色は抗−マウスＣＤ３１抗体で実施された。血管の数及び面積は蛍光顕微鏡検査によって評価された。図示のとおり、血管の数及びサイズの両者は抗ＭＥＴ−Ｒ処置に応じて減少された。
図５
抗ＭＥＴ−ＲはＨＧＦＲのダウンレギュレーションを誘導する。ＧＴＬ１６細胞（Ａ）及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５ β４（Ｂ）は示された時間、抗ＭＥＴ−Ｒで処置された。全細胞溶解物の等量をウェスタンブロット法のために処理し、抗ＨＧＦＲ（上のパネル）または付加対照として、抗−Ｈｓｐ７０（下のパネル）抗体で調査した。図示のとおり、抗ＭＥＴ−Ｒは、過剰発現細胞（ＧＴＬ１６）及びＨＧＦＲ（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ β４）の正常レベルを表している細胞の両者においてＨＧＦＲのダウンレギュレーションを誘導することができた。（Ｃ）細胞表面におけるＨＧＦＲの細胞蛍光測定法による定量化。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ β４細胞を培地だけ（黒いバー）またはＨＧＦ（灰色のバー）または抗ＭＥＴ−Ｒ（白いバー）で培養した。示された時点で、細胞を抗−エキストラＨＧＦＲ抗体（ａｎｔｉ−ｅｘｔｒａ ＨＧＦＲ Ａｂ）（Ｄ０２４）で染色した。図示のとおり、抗ＭＥＴ−Ｒは３０時間の処置の後、最大限の縮小で効率的に表面のＨＧＦＲの量を減らすことができた。
図６
抗体−誘導及びリガンド−依存ダウンレギュレーションは、異なる経路をたどる。（Ａ）ＨＧＦまたは抗ＭＥＴ−Ｒによる処置の前に、ＨｅＬａ（上部パネル）及びＧＴＬ１６（下部パネル）細胞をラクタシスチン（ｌａｃｔ）またはコンカナマイシン（ｃｏｎｃ）のいずれかまたは両者で２時間前処理した。ＨＧＦＲダウンレギュレーションを全細胞溶解物上で評価した。プロテアソームの存在において、リガンド−誘導ＨＧＦＲのダウンレギュレーション損なわれたが、一方抗体−誘導はそうではなかった。この状態において、細胞内部分（抗−内Ｍｅｔ）に対して指向される抗体によって唯一発見され得る６０Ｋｄ切片（矢印）は細胞内に蓄積された。さらに、抗−ユビキチン抗体（Ｂ、上部パネル）でプローブすることによって、プロテアソームの分解に関係付けられる分子が予想されるように、このフラグメントはユビキチン部分でタグが付けられたことが示された。
図７
抗ＭＥＴ−Ｒはタンパク質分解性のＨＧＦＲの切断及び細胞外ドメイン（外部ドメイン）の脱落を誘導する。（Ａ）ＧＴＬ１６細胞を代謝的に３５Ｓメチオニン及び３５Ｓシステインで標識し、それから４時間でＨＧＦまたは抗ＭＥＴ−Ｒを用いて処理した。上澄みを集め、細胞外ドメインに対して向けられる抗ＨＧＦＲ抗体で免疫沈降した。ゲルは非還元（上部パネル）または還元（下部パネル）の条件下で走った。還元剤がない場合、ＨＧＦＲのα及びβ鎖は複合体として遊走する一方、β−メルカプトエタノールの存在下において２つのバンドは別々に走った。図に示すように、ＨＧＦではなく、抗ＭＥＴ−ＲはＨＧＦＲ外部ドメインの脱落を誘導することができた。（Ｂ）抗ＭＥＴ−Ｒは内皮細胞でまた脱落している外部ドメインを誘導する。ＨＵＶＥＣ細胞を示された時間抗体に曝した。培地を集め、ＨＧＦＲβ鎖の細胞外部分を認識している抗体を用いて免疫沈降した。同じ抗−エキストラＨＧＦＲ（ａｎｔｉ−ｅｘｔｒａ ＨＧＦＲ）を用いてウェスタンブロットにより調べた。（Ｃ、Ｄ）ＨＧＦＲの脱落は用量と時間に依存する。細胞は抗ＭＥＴ−Ｒ（Ｃ）の増加量または異なる時間（Ｄ）に刺激された。培地は（Ｂ）で処理した。
図８
ＨＧＦＲの脱落のためにシグナル伝達の活性化は必要とされない。Ｃｏｓ−７細胞に異なるＨＧＦＲ変異体を形質移入し４８時間後、４時間抗ＭＥＴ−Ｒで処理した。全細胞溶解物と条件培地の等量をウェスタンブロッティングのために処理した。示したとおり抗Ｍｅｔ−Ｒはダウンレギュレーション及びすべてのＨＧＦＲ変異体の外部ドメイン脱落を誘導することができた。ＨＧＦＲ ＫＤ＝ＨＧＦＲキナーゼデッド、キナーゼ活性の欠如；ＨＧＦＲダブル＝２つのドッキングチロシン１３４９、１３５６が欠如し、そしてシグナルトランスデューサーを補充することができないＨＧＦＲ変異体；ＨＧＦＲ−ＧＦＰ＝全細胞内部分がＧＦＰ配列に置換されたＨＧＦＲ変異体。
図９
ＨＧＦＲ脱落外部ドメインは「おとり（ｄｅｃｏｙ）」として振舞う抗Ｍｅｔ−Ｒで前処理された細胞は培地においてＨＧＦＲ外部ドメイン（Ｍｅｔ ｅｃｔｏ）の存在または非存在のいずれにおいてもＨＧＦで刺激された。示すとおり、脱落ＨＧＦＲ外部ドメインはＡｋｔ活性化を損ない、そして「おとり」として振舞った。
図１０
遺伝子導入を媒介されたレンチウイルスベクターによって遺伝子上に修飾された細胞は抗ＭＥＴ−Ｒを発現する。
（Ａ）双方向性レンチウイルスベクター（統合化形）の概略図は抗ＭＥＴ−Ｒを表したものである；ＬＴＲ：ＨＩＶ−１末端反復配列；Ｕ３領域はＲ領域から位置−１８で削除される。ＳＤ：スプライス供与。ＳＡ：スプライス受容体。ＰｏｌｙＡ ＳＶ４０：サルウイルス４０のポリアデニル化。Ｃｔｅ：恒常性輸送要素はサルのマソン−ファイザーウイルスに由来した。ＰｍｉｎＣＭＶ：最小プロモーターはサイトメガロウイルスに由来した。ｈＰＧＫ：ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子のヒトプロモーター。ＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節因子。ＦＬＡＧ Ｔａｇ：３回繰り返されたＤＹＫＤＤＤＫエピトープをコードしている配列。Ｈｉｓ Ｔａｇ：７ヒスチジン残基をコードしている配列。
（Ｂ）抗ＭＥＴ−Ｒ ｃＤＮＡｓを保有しているレンチウイルスベクターで形質導入された２つの代表細胞系から集められた無血清培養上清（それぞれ７５μｌのサンプル）のウェスタンブロット解析。サンプルは還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、そして対応するフィルターは抗マウスＩｇでプローブされた。
（Ｃ）抗ＭＥＴ−Ｒ ｃＤＮＡｓを保有しているレンチウイルスベクターで形質導入された細胞系のパネルから由来した培養上清における抗ＭＥＴ−Ｒの定量化を報告している表。
図１１
組み換え抗ＭＥＴ−Ｒ結合はＭｅｔの細胞外ドメインと高い結合性をもって結合する。（Ａ）異なる源（融合細胞または遺伝子上で修飾されたカルシノーマ細胞系）に由来された抗ＭＥＴ−Ｒで免疫沈降されたＭｅｔ受容体を含む細胞溶解物のウェスタンブロット。免疫沈降は１から細胞培養上清で保温しているＳｅｐｈ．Ｐｒｏｔ．Ｇで実行された：無関係なＭＡｂを生じている融合細胞；２ 抗ＭＥＴ−Ｒ ＭＡｂを生じている２つの融合細胞；３ 抗Ｍｅｔ−Ｒ ＭＡｂのｃＤＮＡｓを保有しているレンチウイルスベクターで感染されたＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞 ４：感染していないＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞。サンプルを還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして対応するフィルターを受容体のＣ末端領域に対して向けられる抗Ｍｅｔ抗体でプローブした。（Ｂ）抗ＭＥＴ−Ｒ及び組み換え抗ＭＥＴ−ＲのＭｅｔ受容体の細胞外ドメインに対する結合アッセイ。ヒトＩｇ（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）に由来するＦｃドメインに融合した精製されたＭＥＴ細胞外ドメインで被覆された９６ウェルプレートを精製された抗ＭＥＴ−Ｒまたは組み換え抗ＭＥＴ−Ｒ（０から５，５ｎＭまで）の増加する濃度で培養した。抗体を結合した抗マウスＩｇ−ＨＲＰを使うことによって結合曲線が明らかとなった。結合の特異性を制御するためにＦｃ−Ｒｏｎ（ヒトＩｇのＦｃドメインをＲｏｎ受容体の細胞外ドメインに融合して得られたキメラタンパク質、Ｍｅｔ受容体系統に属するタンパク質）で被覆されたウェルを使って同じアッセイを試みた。
図１２
組み換え抗ＭＥＴ−ＲはＨＧＦＲのタンパク質分解性の切断及び細胞外ドメイン（外部ドメイン）の脱落を誘導する。結腸直腸癌由来の細胞系であるＨＣＴ−１６を精製された抗ＭＥＴ−Ｒ（Ａ）または組み換え抗ＭＥＴ−Ｒ（Ｂ）の示された量で、２４時間の無血清条件で培養した。全細胞溶解物（上部パネル）及び細胞培養上清（下部パネル）をウェスタンブロットに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。細胞の成熟Ｍｅｔ（ｐ１４５）型の減少及び培養上清のＭｅｔ外部ドメイン（ｐ８０）の同時増加を、Ｍｅｔβ鎖の細胞外部分に位置したドメインであることを認識するＤＬ−２１抗Ｍｅｔ ｍＡｂを用いてフィルターをプローブしてモニターした。
図１３
抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターを用いた形質導入はインビトロ及びインビボにおける癌細胞の形質転換された表現型を制御する。（Ａ）足場非依存性増殖アッセイ抗Ｍｅｔ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターで形質導入された（抗ＭＥＴ−Ｒ）またはされていない（対照、ＷＴ）ＨＣＴ−１１６細胞を０．５％の寒天に播種した。細胞を２％ＦＣＳ＋８０ｎｇ／ｍｌＨＧＦで補充された培養で維持した。１４日後コロニーを数えた；代表的なウェルを上欄に示す；グラフの下にコロニーの数（３通りから算出される）を表している。（Ｂ）浸潤アッセイ抗Ｍｅｔ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターを用いて形質導入された（抗ＭＥＴ−Ｒ）またはされていない（対照、ＷＴ）のＨＣＴ−１１６細胞をマトリゲルで被覆したトランスウェルの容器上にのせた。下方容器を２％ＦＢＳ＋８０ｎｇ／ｍｌＨＧＦ培地で満たした。２４時間後フィルターの下方部分に付着した細胞の数を数えた。写真は代表的なフィルターのフィールドである。（Ｃ）インビボにおける腫瘍潜時。抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターで形質導入された（抗ＭＥＴ−Ｒ）またはされていない（対照、ＷＴ）ＨＣＴ−１１６細胞を胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に注入した（３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ、ｎ＝６それぞれのグループ）。腫瘍体積をノギスを用いて２日おきに評価した。腫瘍体積が１５ｍｍを超えたとき、マウスを腫瘍存在が陽性であると考えた。（Ｄ）インビボにおける腫瘍増殖。抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターで形質導入された（抗ＭＥＴ−Ｒ）またはされていない（対照、ＷＴ）ＨＣＴ−１１６細胞を胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に注入した（３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ、ｎ＝６それぞれのグループ）。腫瘍増殖の動態について腫瘍体積をノギスで３日おきに測定することで評価した。６５日目でマウスをすべて屠殺した。
図１４
抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターの直接的な内部腫瘍送達は腫瘍増殖を阻害した。ＨＣＴ−１１６細胞（４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）を胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に注入した。腫瘍体積が１０ｍｍの大きさになったときレンチウイルスベクター粒子（１μｇのｐ２４／マウス）を０日目と３日目に内部腫瘤に投与した。１つのグループ（ＣＴＲＬ）ＧＦＰをコードしているベクター粒子を受容する一方、他のグループは抗ＭＥＴ−Ｒ（抗ＭＥｔ−Ｒ）をコードしているベクター粒子を受容した。腫瘍増殖の動態について腫瘍体積をノギスを用いて３日おきに測定することで評価した。
図１５
抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているプラスミドのマップ。
図１６
抗Ｍｅｔ−Ｒ ＦＬＡＧ−Ｈｉｓをコードしているプラスミドのマップ。
図１７
ＨＧＦＲ（Ｍｅｔ外部ドメイン）の外部細胞部分に由来するドメインの模式図。
図１８
抗Ｍｅｔ−ＲはＩＰＴｓ領域に位置するエピトープを特異的に認識する。ｍｙｃ−タグを付けたおとりＭｅｔ、ｍｙｃ−タグを付けたＳＥＭＡ ＰＳＩ及びｍｙｃ−タグを付けたＰＳＩ ＩＰＴ１−４をコードしているレンチウイルスベクター粒子で形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５の条件培地を抗ＭＥＴ−Ｒ抗体で免疫沈降し、そしてビオチン化抗−ｍｙｃ抗体を使ってウェスタンブロットにより検出した（右側パネル）。条件培地の等量をタンパク質発現の対照としてロードした（左側パネル）。ＣＴＲＬ：空のレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地。おとりＭｅｔ：全細胞外ドメインを発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地。ＰＳＩ−ＩＰＴ：ＨＧＦＲのＰＳＩ、ＩＰＴ−１、ＩＰＴ−２、ＩＰＴ−３、ＩＰＴ−４ドメインを発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地。ＳＥＭＡ−ＰＳＩ：ＨＧＦＲのＳｅｍａ及びＰＳＩドメインを発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地。右側に分子量がＫＤで示されている。
図１９
抗Ｍｅｔ−ＲはＩＰＴ−４領域に位置するエピトープを認識する。標識されたＩＰＴ−１、ＩＰＴ−２、ＩＰＴ−３、ＩＰＴ−４ドメインのすべてを発現しているレンチウイルスベクター粒子で形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の細胞溶解物を抗ＭＥＴ−Ｒ抗体で免疫沈降し、そして抗−フラッグ抗体を使ってウェスタンブロットにより検出した（左側パネル）；タンパク質発現の対照として、細胞溶解物の同量を抗−フラッグ抗体で免疫沈降し、同じ抗−フラッグ抗体を用いてウェスタンブロットにより検出した（右側パネル）。ＣＴＲＬ：空のレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。ＩＰＴ１：ＨＧＦＲのＩＰＴ−１領域を発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。ＩＰＴ２：ＨＧＦＲのＩＰＴ−２領域を発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。ＩＰＴ３：ＨＧＦＲのＩＰＴ−３領域を発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。ＩＰＴ４：ＨＧＦＲのＩＰＴ−４領域を発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。右側ＫＤにおける分子量が示されている。
図２０
抗Ｍｅｔ−Ｒはインタクト細胞においてＨＧＦ受容体を特異的に染色する。パネルＡ：抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体を用いた流動細胞計測法により分析されたＧＴＬ−１６の特性。細線：イソタイプのＣＴＲＬ抗体で培養されたＧＴＬ−１６；太線：抗Ｍｅｔ−Ｒで培養されたＧＴＬ−１６。ＭＦＩ：平均蛍光強度。パネルＣ：蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８を用いて接合されたヤギ抗−マウスＩｇによって明らかにされた抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体を用いて標識されたＧＴＬ−１６細胞の免疫蛍光分析。パネルＢ：抗−マウスＩｇ／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８のみで標識されたＧＴＬ−１６細胞。（最初の拡大率、×６３）
図２１
抗Ｍｅｔ−Ｒ重鎖の核酸（ａ）とアミノ酸（ｂ）配列。ＣＤＲ領域はヌクレオチドとアミノ酸配列の両者に下線が引かれている。
図２２
抗ＭＥＴ−Ｒ軽鎖の核酸（ａ）とアミノ酸（ｂ）配列。ＣＤＲ領域はヌクレオチドとアミノ酸配列の両者に下線が引かれている。
【００１２】
発明の詳細な説明
ＭＥＴ原癌遺伝子によってコードされている肝細胞増殖因子受容体は、活性化と同時に、「浸潤性の腫瘍」として知られる生物学的反応の複雑な範囲を誘導するチロシンキナーゼ受容体である（８）。これは細胞増殖の誘導と配位、転移、分化及び残存を意味する。生理的条件下で、胚発生の間、浸潤性増殖プログラムは臓器発生で中心的な役割を担うが、癌で制御が解かれたとき腫瘍の進行と転移に寄与する（１３）。
【００１３】
いくつかの癌遺伝型は生殖細胞系のＭＥＴ遺伝子のミスセンス変異が原因であり（９、１０）、また予後が悪いことにしばしば相関する固形腫瘍の大部分で不適当なＨＧＦＲの活性化が見られる（１４）などのように、ヒト腫瘍におけるＨＧＦＲの関与が現在確固として樹立されている。ヒトの癌で最も頻繁な変異は、受容体の過剰発現（１５）により構造性の二量化が起こり、またリガンド不在でさえも受容体が活性化することである（１６）。さらなるＨＧＦＲ発現は、（ｉ）ＭＥＴが腫瘍性細胞に肝転移を選択的優位に与える大腸腫瘍において遺伝子の増幅、（ｉｉ）Ｒａｓ、Ｒｅｔ及びＥｔｓ（１７、１８）のように他の癌遺伝子によって誘導される増強された転写、（ｉｉｉ）低酸素−活性化型転写が原因の可能性があり、この場合、受容体の高い量が細胞をＨＧＦに過敏化し腫瘍の浸潤を促進する（１９）。
【００１４】
チロシンキナーゼ受容体（ＲＴＫｓ）を干渉するため、２つの戦略が臨床診療において現在つかわれている：（ｉ）チロシンキナーゼ活性を阻害している小分子を用いた処置；（ｉｉ）受容体の活性化を干渉している抗体を用いた処置。
【００１５】
本発明は腫瘍治療での抗ＨＧＦＲ抗体の使用に関するものであり、特に抗ＭＥＴ−Ｒと呼ばれる抗Ｍｅｔモノクローナル抗体の使用に関するものであり、驚くべきことに、受容体のダウンレギュレーションを誘導することができるということがわかった、受託番号ＰＤ０５００６としてＩＣＬＣに寄託された融合細胞によって産生される。
【００１６】
一つの実施態様において、本発明は、腫瘍を患っている患者の腫瘍及び転移の治療のための薬剤の調製のために、モノクローナル抗体抗ＭＥＴ−Ｒを使用することを含む。
【００１７】
さらなる実施態様において、本発明は、インビボまたはインビトロのいずれかで腫瘍性細胞を検知する診断装置の製造のために抗ＭＥＴ−Ｒ抗体を使用することに関する。
【００１８】
抗Ｍｅｔ−Ｒは、ＨＧＦＲの細胞外ドメインに特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である（２０）。このモノクローナル抗体は肝細胞増殖因子（運動性、増殖、細胞生存、浸潤、管形成及び血管新生）によって誘導されたすべての生物学的影響を引き起こすというわけではないが、しかし、運動性のみを誘導する。さらに、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の恒常的発現を上方制御するが、しかし、長期間ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体を誘導及び維持することはできない。このｍＡｂは二価のｍＡｂに完全に依存し、受容体の二量化を必要とする受容体リン酸化を活性化する。
【００１９】
この抗体の作用薬能力は、その治療能力を正当化するには、本質的には、十分ではない。実際、発明者が調べた異なる抗ＭＥＴ−Ｒモノクローナル抗体（ＤＯ−２４）は、効果的な受容体のダウンレギュレーションを誘導することはできず、また受容体の細胞外部分の脱落を促進しない。
【００２０】
抗Ｍｅｔ−ＲはＨＧＦＲとＨＧＦの相互作用を妨げないが、実施例４に示し、図５で議論されているように、ＨＧＦＲのダウンレギュレーションを効果的に促進する。この相互作用はＨＧＦＲに仲介されたシグナル伝達の阻害、そして特に、抗アポトーシス応答に含まれることで知られるＡｋｔ経路の阻害に繋がる。
【００２１】
以下に記す結果から明らかなように、抗ＭＥＴ−Ｒによるインビトロでの処置は、足場非依存性様式（実施例２及び図２を参照）、足場の欠如によるアポトーシスからの回避を必要とする性質で増殖するための細胞能力の機能障害を引き起こす結果となることを発明者は証明した。さらに、インビボにおいて、実施例３に詳述するように、抗ＭＥＴ−Ｒで処置された動物において、腫瘍が、増殖率の重要な変化なしでアポトーシスの増殖率を示すことを本発明者らは観察した。一方、抗体に対する応答における細胞増殖特性の修正についてはインビトロやインビボのいずれにおいても発明者は観察せず、ＭＡＰＫ経路の活性化において抗ＭＥＴ−Ｒの阻害効果の欠如と一致している。異なる経路を活性化するためのＨＧＦＲの能力の解離は新規ではなく、異なるＨＧＦＲ変異体（２１）とＨＧＦＲ部分的作用薬（２２）の応答ですでに示されている。
【００２２】
抗体−誘導ＨＧＦＲダウンレギュレーションは受容体の細胞外部分の脱落を含む。外部ドメイン脱落は、膜タンパク質の細胞外ドメインが細胞表面からタンパク分解により遊離する過程であり、したがって細胞は、環境刺激に応答して表面を急激に変化させ、可溶性制御因子を生じる。本発明者は、実施例６及び７において抗ＭＥＴ−Ｒの活性化の証拠を示している。
【００２３】
本出願において発明者は、抗ＭＥＴ−Ｒが、ヌードマウスに移植された癌細胞から腫瘍の増殖と突発性転移の形成を阻害するというようなインビボで活性があるという証拠を、特に実施例３で、提供している。この実験は、癌細胞及び微小環境の両者で抗体の活性によりこれらの効果が引き起こされることを示唆している。実際、内皮細胞はＨＧＦＲ（２４）を発現しており抗Ｍｅｔ−Ｒがこの種の細胞でもまたＨＧＦＲの脱落を誘導することを証明した（データは示されない）。一次性腫瘍の新血管新生は腫瘍増殖及び転移両者にとって絶対の必要条件であり、ＨＧＦが強力な血管新生因子（２４）であることが確固として樹立されている。さらに、ＨＧＦＲ活性化において、ＶＥＧＦの遊離と他の血管新生因子の増加が引き起こる（４８−４９−４０）。このように、血管新生における効果は、腫瘍細胞でＭｅｔ機能が阻害されることが腫瘍からそのような因子の遊離を阻害するというように、間接的であり得る。本発明の発明者は、抗ＭＥＴ−Ｒで処置した後、微小環境の血管の数の減少による、腫瘍内血管新生の重要な縮小を観察した。
【００２４】
抗体に長時間曝した後、明らかな病理学的変化を示さなかったというように、宿主細胞の抗ＭＥＴ−Ｒの活性が、脾臓、骨髄、肝臓、心臓、骨及び腎臓のような異なる器官の機能性に影響を及ぼさなかったことは価値に値しない。したがって、正常及び腫瘍性細胞の両者においてＨＧＦ−Ｒを認識することにもかかわらず、抗ＭＥＴ−ＲはＨＧＦ−Ｒの過剰発現を検知し、細胞の生存能力への変化を誘導する能力を示す。
【００２５】
結論として、この結果は、ＨＧＦＲの抗ＭＥＴ−Ｒによって誘導されたダウンレギュレーションが免疫療法及び腫瘍を患った患者の腫瘍の治療及び転移の予防における更なる方法を提供することができる医薬組成物である抗ＭＥＴ−Ｒまたはそのフラグメントの使用のための候補メカニズムであることを示唆している。
【００２６】
その上、抗Ｍｅｔ−Ｒは、インビボまたはインビトロの両者において腫瘍細胞を検知するために、たとえば適した標的を用いて抗ＭＥＴ−Ｒをラベルすることによって、診断用ツールとして使用されることができる。
【００２７】
本発明に従って動物における従来の方法により、または好ましくは遺伝子工学技術によって、抗ＭＥＴ−Ｒを産生することができる。
【００２８】
本発明によるモノクローナル抗体抗ＭＥＴ−Ｒの使用は、遺伝子工学的ヒト化抗体及び適した診断用マーカーで標識された抗体の使用を含むことを目的としている。遺伝子工学的ヒト化抗体及びそれらの作成のための方法は当該分野で知られている。参考文献２５を参照。
【００２９】
抗Ｍｅｔ−Ｒの使用もまた、エピトープ結合領域または相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを含むタンパク質のような、そのエピトープ結合領域を有するフラグメントの使用を含む。従来のフラグメントは、特にタンパク質分解による切断によって産生されるが、組み換えＤＮＡ技術によってだけでなく、液体または固相合成のような化学合成によって産生されることもできる。
【００３０】
抗Ｍｅｔ−Ｒとそのフラグメントは、送達が薬輸送の従来の方法を使って達成される可溶性タンパク質の形で、好ましくは医薬組成物で使用される。抗体抗ＭＥＴ−Ｒ及び／またはそのフラグメントを含む医薬組成物の投与は、当業者に知られた方法によって達成される。例えば、化合物は患者に注射されるか注入される水溶液として投与される。適当な投薬量の決定は患者の年齢及び体重を含む多くの症例に特異的な要因に依存し、当業者の専門知識の範囲内の通例の実験を含む。
【００３１】
本発明の他の態様は、腫瘍に苦しむ患者の腫瘍細胞のインビボまたはインビトロでの検知のための適した診断用マーカーを用いて標識されたモノクローナル抗体抗ＭＥＴ−Ｒを含む医薬組成物の製造を含む。
【００３２】
本発明は、最小のコアプロモーター（ｍｉｎＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）をヒトのホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子の効率的なプロモーターの上流に逆方向に連結することによって得られる合成プロモーター及びモノクローナル抗体抗ＭＥＴ−Ｒの少なくとも部分をコードしているＤＮＡを含むＤＮＡベクターの製造を包含する。ベクターに含まれるＤＮＡ配列は抗ＭＥＴ−Ｒの軽鎖及び／または重鎖をコードしている；ＤＮＡ配列において保守的な置換基並びに５’または３’末端の両者でタグ配列の付加によって修飾された配列もまた本発明によって包含される。抗ＭＥＴ−Ｒの軽鎖及び重鎖をコードしているヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１及び配列番号２に示される。
【００３３】
さらに、本発明者はタグ配列を抗ＭＥＴ−Ｒ重鎖に付加している重鎖を修飾した（配列番号３）。この配列はＮｉｃｈｅｌカラムを用いてＭＡｂを精製することができ、抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ）によって特異的に認められる。
【００３４】
本発明のＤＮＡベクターの産生は当該分野で知られたさまざまな方法によって達成され得るが、産生を実施例１０で例証する。
【００３５】
その他の実施態様において、本発明は、当該分野における腫瘍及び転移の治療のための医薬の調製のために、モノクローナル抗体抗ＭＥＴ−Ｒのエピトープ結合領域をコードしているＤＮＡを含むＤＮＡベクターを使用することを含む。本発明におけるＤＮＡベクターの送達は遺伝子治療の既知の方法を使用することによって達成され得る。例えば参考文献（１０）に示される。
【００３６】
本発明の更なる実施態様において、腫瘍治療において同時、別々、または連続した使用に対する混合された調製として、抗体抗ＭＥＴ−Ｒ及び／またはそのフラグメント及びキナーゼ阻害剤を含む製品を含む。本発明において有利に使用され得るキナーゼ阻害剤の例は、Ｋ２５２Ａスタウロスポリン類似体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ．；３６）；ＰＨＡ−６６５７５２（３Ｚ）−５−［（２，６−ジクロロベンジル）スルホニル］−３−［（３，５−ジメチル−４−{［（２Ｒ）−２−ピロリジン−１−イル］カルボニル}−１Ｈ−ピロール−２−イル）メチレン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（３４）；ＳＵ１１２７４［（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−（{３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］１Ｈ−ピロール−２−イル}メチレン）−Ｎ−メチル−２−オキソインドールイン−５−スルホンアミド］（３７，３８，３５）；ＳＵ１１２７１［（３Ｚ）−５−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イルスルホニル）−３−（{３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル}メチレン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン］（３８）；ＳＵ１１６０６［（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−{［３，５−ジメチル−４−（３−モルフォリン−４−イルプロピル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン}−Ｎ−メチル−２−オキソインドールイン−５−スルホンアミド］（３８）である。
【００３７】
発明者は、実際、抗ＭＥＴ−Ｒによって活性化した阻害メカニズムがＨＧＦＲチロシンキナーゼ活性を必要としないことを認めた。この特徴は治療的なアプローチにおいて関連性のある優位性を意味する。臨床診療において、実際、標的分子に対する影響を向上させるために異なる薬を併用することは頻繁にある。ＨＧＦＲの場合、抗体とともにキナーゼ阻害剤を併用することが可能であり、ＨＧＦＲ活性化とレベルの両者の働きが発揮される。これは、腫瘍の増殖及び浸潤性転移性表現型の取得の両者を防ぐ目的で、Ｍｅｔを過剰発現している腫瘍における標的治療の治療有効性を強化すると思われる。
【００３８】
抗体である抗ＭＥＴ−Ｒ及び本発明による生産物のそのフラグメントは上述したように産生される。本発明による併用に使われるキナーゼ阻害剤は従来の化学合成または遺伝子工学技術によって産生され得る。
【００３９】
更なる実施態様において、本発明は、肝細胞増殖因子受容体の細胞外ドメインの少なくとも一部分に結合可能な化合物のスクリーニング方法を含むもので、そのうちこれらの化合物は肝細胞増殖因子受容体に対する拮抗作用の活性を有し、かつ腫瘍及び／または転移の予防及び／または処置において薬理活性である。特に、これらの化合物は肝細胞増殖因子のダウンレギュレーションを誘導するか、または肝細胞増殖因子の細胞外ドメインの少なくとも一部分を脱落させることができる。
【００４０】
本発明は実施例に制限されないものとして、望ましい実施態様に関して記載されたものである。
【００４１】
抗体、阻害剤及び他の試薬
モノクローナル抗ＨＧＦＲ抗ＭＥＴ−Ｒは（２０）にはじめて記載された。免疫沈降及びウェスタンブロット解析のために使用された他の抗体は：抗ＨＧＦＲ抗体ＤＯ２４及びＤＬ２１（２０に記載したＨＧＦＲ細胞外ドメインであると認識されている）；ホスホチロシンＰＹ２０（形質導入研究室）、抗ユビキチン（Ｂａｂｃｏ）、抗ＨＳＰ７０（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）、抗ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３、細胞シグナルテクノロジー）、抗Ａｋｔ（サンタクルーズバイオテクノロジー）、抗ＨＧＦＲ細胞間ドメイン（Ｃ１２、サンタクルーズバイオテクノロジー）である。免疫組織化学的染色は以下のものとともに実施された：抗ヒトホスホ−ＨＧＦＲ（細胞シグナル）及び抗マウスＣＤ３１抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。インビトロ及びインビボでの実験のために抗小泡性口内炎ウイルス抗体（ＶＳＶ−Ｇ、シグマ）がコントロールとして使用された。ラクタシスチン及びコンカナマイシンはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。
【００４２】
抗ＭＥＴ−Ｒヌクレオチド及びアミノ酸配列
配列番号１及び図２１ａに対応する抗ＭＥＴ−Ｒ重鎖ヌクレオチド配列の翻訳は図２１ｂ及び配列番号６に示されている。
【００４３】
図２１ａ及び図２１ｂ中、ＣＤＲ領域に対応するヌクレオチド及びアミノ酸配列に下線を引いている；それらのアミノ酸配列は：ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＹＴＦＴＳＹＷ（配列番号８）；ＣＤＲ−Ｈ２：ＩＮＰＳＳＧＲＴ（配列番号９）；ＣＤＲ−Ｈ３：ＡＳＲＧＹ（配列番号１０）。
【００４４】
配列番号２及び図２２ａに対応する抗ＭＥＴ−Ｒ軽鎖ヌクレオチド配列の翻訳は図２２ｂ及び配列番号７に示されている。
【００４５】
図２２ａ及び図２２ｂ中、ＣＤＲ領域に対応するヌクレオチド及びアミノ酸配列に下線を引いている；それらのアミノ酸配列は：ＣＤＲ−Ｌ１：ＱＳＶＤＹＤＧＧＳＹ（配列番号１１）；ＣＤＲ−Ｌ２：ＡＡＳ（配列番号１２）；ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＱＳＹＥＤＰＬＴ（配列番号１３）。
【００４６】
レンチウイルスベクターの製品のための２９３Ｔ細胞の一過性の形質導入
形質移入のおよそ２４時間前に２９３Ｔ細胞６．０×１０６個を１５ｃｍシャーレに播種した。形質移入の２時間前に培地にＩＭＤＭ２２ｍｌを加えて、熱不活性化ＦＢＳ（１０％）、ペニシリン（２５Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（２５Ｕ／ｍｌ）及びグルタミン（１％）を補充した。形質移入のためのプラスミドＤＮＡｍｉｘは以下を加えることによって準備された：ＥＮＶプラスミド（ＶＳＶ−Ｇ）、９μｇ；ＰＡＣＫＡＧＩＮＧプラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ１６．２μｇ；ＲＥＶプラスミド、６．２５μｇ；ＴＲＡＮＳＦＥＲベクタープラスミド＃３３０または＃３３１、３７．５μｇ。プラスミド溶液を０．１×ＴＥ／ｄＨ２Ｏ（２：１）で最終的に１１２５μｌとした。２．５ＭのＣａＣｌ１２５μｌを加え、５分間ＲＴで放置した。次いで、フルスピードで攪拌し、２×ＨＢＳ溶液１２５０μｌを加え、その後即座に細胞培養に滴下して加えた。Ｃａｐｉで誘導されたプラスミドＤＮＡを１４−１６時間培養し、その後培地を１ｍＭのナトリウム酪酸塩（１８ｍｌ／シャーレ）を加えた新しい培地と交換した。ベクター粒子を含んでいる細胞培養上清を培地交換後に３０−３６時間かけて収集した。収集した後、上清を２５００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、０．２μｍのろ紙に通して、−８０℃で保存した。
【００４７】
レンチウイルスベクターを含む細胞上清による標的細胞の感染
１０％ＦＢＳ、グルタミンを補充したフレッシュ培地に１０５個の細胞を播種した。感染のため、上述のようにＨＩＶ−１ Ｇａｐ ｐ２４当価物のベクター粒子の最終濃度が１０ないし１５０ｎｇ／ｍｌ（ＥＬＩＳＡアッセイによる測定）で準備されたレンチウイルスベクター粒子を含む上清とともにポリブレン８μｇ／ｍｌの存在下で細胞系を培養した。１８時間後、培地を換えて細胞を増殖させた。培養が８０％までコンフルエントな状態になったとき、細胞を血清なしの培地で培養し、７２時間後抗ＭＥＴ−Ｒを含む上清を収集した。
【００４８】
ＨＧＦＲダウンレギュレーションアッセイ
細胞を１０％致死性ウシ血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。抗体及びＨＧＦによる処置はそれぞれ８０μｇ／ｍｌ及び８０ｎｇ／ｍｌの無血清培地で行われた。示したように、刺激の前に、細胞を１０μＭラクタシスチンまたは１００ｎＭコンカナマイシンで２時間予め培養した。ＨＧＦＲ分解の解析のため細胞をＬＢバッファ（２％ＳＤＳ、０．５Ｍトリス−塩酸ｐＨ＝６．８）に溶解し、そして細胞溶解物のタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて評価した。その後、等量分の全タンパク質と等量分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングによって分析した。免疫沈降実験のため、プロテアーゼ阻害剤及び１ｍＭ Ｎａ−パナジン酸の存在下で、ＥＢバッファ（２０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．４、ＭＥＤＴＡ ５ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、１０％グリセロール、１％トリトン×−１００）に細胞を溶解させた。適当な抗体による免疫沈降の後、よく洗浄した。その後、免疫沈降されたタンパク質を標準的な方法によるウェスタンブロッティングで処理した。ＥＣＬ検知システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて最終的な検知を試みた。
【００４９】
ＨＧＦＲ脱落の代謝標識化と分析
細胞を１６時間血清欠乏させ、［３５Ｓ］メチオニン［３５Ｓ］システイン（１００μＣｉ／ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．）で３０分間パルスラベルした。メチオニン及びシステインのないＤＭＥＭ培地で抗ＭＥＴ−ＲまたはＶＳＶ−ＧまたはＨＧＦのいずれかを４時間処理した。条件培地を集め抗ＨＧＦＲ細胞外抗体とともに免疫沈降に供した。免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、（２６）にすでに記載したようにオートラジオグラフィを撮った。
【００５０】
インビトロ生物学的アッセイ
足場非依存性増殖の評価のために抗Ｍｅｔ−ＲまたはＶＳＶ−Ｇのいずれかの培地で４８時間前処理した。その後、１５００個の細胞をＤＭＥＭ２％ＦＢＳ及び０．５％柔らかい寒天（ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロース、ＢＭＡ）に播種し、そして指示された量の抗体及びＨＧＦの存在下で１０日間維持した。増殖したコロニーをテトラゾリウム染色（４７）で最終的に視覚化した。浸潤アッセイをＴｒａｎｓｗｅｌｌ容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）で行った。ポリカーボネイトフィルター（８μｍポアサイズ）をマトリゲル基底膜（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の１５μｇ／ｃｍ２で被覆した。２０ｎＭの抗ＭＥＴ−ＲまたはＶＳＶ−Ｇとともに播種する前に、２４時間細胞を予め培養して抗体を処理した。５×１０４この細胞をフィルターの上方に播種し、容器の底にＨＧＦ１００ｎｇ／ｍｌを加えてＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳで培養した。４８時間後、フィルターの上方を機械的に除去した。下方に遊走した細胞を固定し、染色して数えた。ＨＧＦの刺激上に遊走した細胞の数と、遊走しなかった細胞とに振り分けることにより遊走指数を得た。
【００５１】
インビトロにおける抗Ｍｅｔ−ＲによるＨＧＦＲの標識化
流動細胞数測定のために、１０５個のＧＴＬ−１６細胞をＰＢＳ−ＥＤＴＡ０．０２５％で分離し、ＰＢＳで洗浄して、抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体の５０μｇ／ｍｌまたはアイソタイプ対照マウスＩｇの同量で１５分ＲＴの間培養した。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＦＩＴＣ接合ヤギ抗マウスＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１５μｇ／ｍｌで細胞を培養した。その後、細胞を洗浄し、ＰＢＳ−５％ＢＳＡ中に再懸濁し、流動細胞数測定（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって分析した。ＧＴＬ−１６細胞をメタノール：アセトン（３：１）中で５分間氷上で固定し、その後ＰＢＳで２％ヤギ血清で３０分間ブロックした。精製された抗Ｍｅｔ−ＲをＰＢＳ２％ヤギ血清中に２．５μｇ／ｍｌの濃度で加えて、１時間培養し、その後ＰＢＳで３回洗浄した後、結合抗ＨＧＦＲ抗体をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（分子プローブ）と抱合する抗−マウスＩｇ４μｇ／ｍｌで分離した。サンプルの分析を蛍光顕微鏡（ＤＭ−ＩＲＢ，Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｓ）にて行った。
【００５２】
インビボ実験
Ｓｗｉｓｓ ＣＤ１ バックグラウンドの６週目の免疫不全ｎｕ／ｎｕのメスのマウスの後部即腹部の皮下に、１×１０６個のＧＴＬ１６または２．５×１０６ＭＤＡ−ＭＢ−４３５β４のいずれかを播種することによってインビボ実験を行った。腫瘍の外見上、同程度の大きさの腫瘤を患ったマウスを選択し、Ｉ．Ｐ．またはＩ．Ｓ．（ＧＴＬ１６を注射したマウスの場合、Ｉ．Ｓ．のみ）のいずれかにて、抗ＭＥＴ−Ｒ及び抗ＶＳＶ−Ｇの示した量とともに週に２回播種した。処置を始めてから８週間経過後、マウスを屠殺し、腫瘍の重量を測定した。ＭＤＡ−ＭＢ４３５β４を注入したマウスにおいて、自然転移の存在を調べるために肺を分析した。リン酸化ＨＧＦＲの評価のために、抗−ホスホ−ＨＧＦＲ抗体（細胞シグナル、１：１００）を用いてパラフィンで包埋した腫瘍切片５μｍを原発腫瘍の免疫組織化学的染色した。一般的な病理学的調査のために、マソン−トリクロムプロトコル（シグマ）によるヘマトキシリン／エオシン染色の後、転移の数が肺の顕微鏡観察によって樹立された。組織−Ｔｅｋ ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ）で包埋されたサンプルについて、免疫組織化学によって腫瘍血管新生の評価をし、−８０℃で即座に凍結させた。免疫組織化学的染色のために、ラットモノクローナル抗マウスＣＤ３１抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）が使用された。
【００５３】
アポトーシスの評価
アポトーシスの形態的な評価はＫｅｒｒの基準に従って評価された。壊死病巣の近くの多数の単独壊死細胞及び虚血誘導アポトーシスの原因で、壊死の領域から遠い、少なくとも１ＨＰＦ（Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｆｉｅｌｄ＝０．６３ ｍｍ）の組織のみを信頼できるアポトーシス性の数と考えた。広範囲に及ぶ腫瘍状壊死によるケースは評価しなかった。すべてのケースを２つのカテゴリのうち１つにまとめた：１０ＨＰＦにつきアポトーシス数が１０以上またはそれ以下。
【００５４】
プロテアーゼの阻害
抗体刺激の前に、細胞を２時間下記の阻害剤で処置した：ウロキナーゼを阻害するためのアミロライド（Ｓｉｇｍａ）４ｍｌ；ＡＤＡＭ及びＺｎ−依存プロテアーゼを阻害するための１，１０−フェナントロリン（Ｓｉｇｍａ）５ｍＭ；セリン及びシステインプロテアーゼを阻害するためのアプロチニン２０μｇ／ｍｌ及びロイペプチン１００μｇ／ｍｌ、酸性プロテアーゼを阻害するためのペプスタチンＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ） １０μｇ／ｍｌ。細胞を１μＭ ＴＰＡで２４時間処置することによりＰＫＣを阻害した。
【００５５】
スクリーニング方法
本発明は、ＨＧＦまたは他の受容体作用薬の存在または不存在において、ＨＧＦＲの発現／機能／生物学的活性を調節するか、またはＨＧＦＲの細胞外ドメインの脱落を誘導するテスト化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【００５６】
テスト化合物は、好ましくは受容体細胞外部分と相互に作用してＨＧＦＲと結合する。さらに好ましくは、テスト化合物は、テスト化合物の欠如と比較して少なくともおよそ１０、好ましくはおよそ５０、さらに好ましくはおよそ７５、９０、または１００％の割合で、ＨＧＦＲで媒介される生物学的活性を減少させる。
【００５７】
テスト化合物はＨＧＦＲの発現をさらに抑制する。さらに好ましくは、テスト化合物が不存在の場合に比べて少なくともおよそ１０、好ましくはおよそ５０、さらに好ましくは７５、９０、または１００％の割合でＨＧＦＲ転写物またはタンパク質をダウンレギュレーションする。
【００５８】
テスト化合物
テスト化合物は、当該分野で既知の薬理学的な作用薬、ペプチドまたはタンパク質でもよく、または薬理学的活性を有することが知られている化合物でもよい。テスト化合物は自然に生じたもの、または研究所で設計されたものでよい。それらは微生物、動物、または植物から単離されてもよく、組み換え技術によって産生されるか、または当該分野で知られた化学的方法によって合成されてもよい。所望により、テスト化合物は当該分野で知られた生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な平行な固相または液層ライブラリー、逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー方法、「１−ビーズ、１−化合物」ライブラリー方法、及び親和性クロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー方法を含むがこれに限定されるものではない、コンビナトリアルライブラリーの方法のいくつかを使って得ることもできる。生物学的ライブラリーのアプローチはポリペプチドライブラリーに限定される、一方他の４つのアプローチはポリペプチド、非ポリペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる。
【００５９】
結合アッセイ
結合アッセイのためテスト化合物は、ＨＧＦＲ細胞外部分に結合する分子であって、該分子はＨＧＦＲの通常の生物学的活性化を妨げるような抗Ｍｅｔ−Ｒ活性化を模倣する。このような分子の例として、以下に限定されるものではないが、小分子、ペプチドまたはペプチドのような分子を含む。
【００６０】
結合アッセイにおいて、テスト化合物またはＨＧＦＲ細胞外部分のいずれかは、放射性同位元素、蛍光性、化学発光、または酵素ラベル（例えば、放射性同位元素で識別されたヨウ素、放射性同位元素で識別されたリン、フルオロフォアまたは蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能なラベルを含むことができる。ＨＧＦＲの細胞外ドメインに結合するテスト化合物の検出は、例えば、放射性物質を直接数えることによって、シンチレーション測定によって、または検出可能な化合物に適した基質の変換を決定することによって達成され得るものであって、ＨＧＦＲまたはその細胞外ドメインの部分は担体に結合しているか、または細胞によって発現されるか、当該分野でよく知られた方法に従って検知され得る。
【００６１】
機能的アッセイ
テスト化合物はＨＧＦＲの生物学的効果を減少する能力に対して試験される。このような生物学的効果は本出願で記載された機能的なアッセイを用いて決定され得る。それらは足場非依存増殖アッセイ及び浸潤アッセイ（両者は実施例２及び１１に詳述している）及びインビボでの形質転換された表現型の評価（実施例３、１１、１に詳述している）により適用される。このように、機能的アッセイは、ＨＧＦＲを発現している細胞系を用いてインビトロで行うか、またはＨＧＦＲを発現している実験的または自然に生じる腫瘍の発達を調査することが可能である動物モデルを用いてインビボで行うことができる。少なくともおよそ１０、好ましくはおよそ５０、さらに好ましくは７５、９０または１００％の割合でＨＧＦＲの生物学的活性を減少させるテスト化合物は、ＨＧＦＲ生物学的活性を減少させるための有望な薬理学的薬剤として認識される。
【００６２】
実施例
実施例１。抗Ｍｅｔ抗体抗ＭＥＴ−ＲがＨＧＦＲシグナル伝達を阻害する。
抗Ｍｅｔ−Ｒは、リガンドによる結合とは異なるエピトープであると認めるＨＧＦ受容体の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体である。このｍＡｂは部分的な作用薬として振る舞う。なぜならば、これは肝細胞増殖因子（運動性、増殖、細胞生存、浸潤、管形成及び血管新生）によって誘導されるすべての生物学的影響を引き起こすわけではなく、運動性のみを引き起こすからである。さらに、それはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性因子の構成的発現を上方制御するが、長期間ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性因子受容体の発現を誘導及び維持することはできない。このｍＡｂは、ｍＡｂの二価性に強く依存し、受容体の二量化を必要とする受容体のリン酸化を活性化する。
【００６３】
抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体が、腫瘍の過剰発現において構造的ＨＧＦ受容体の活性化を阻害するためのツールとして適当かどうかという疑問に答えるために、発明者らはまず始めに、抗体に慢性的に曝された腫瘍細胞において、その生化学的及び生物学的活性を分析した。モデルとして、発明者は、ＨＧＦＲが過剰発現され、それにしたがってオリゴマー形成され、恒常的に活性化されるという、人の胃のカルシノーマに由来するＧＴＬ１６細胞を用いた。図１Ａは、ＨＧＦＲ発現とチロシンのリン酸化における重要な縮小を示す。
【００６４】
その後、ＨＧＦＲシグナル伝達における抗体の影響を評価した。ＨＧＦＲは刺激的なＡｋｔ活性化による強力な抗アポトーシスプログラムを促進することで知られているため、発明者は抗ＭＥＴ−Ｒ治療上のＡｋｔのリン酸化のレベルを評価した。図１Ｂで示すとおり、Ａｋｔのリン酸化は、基底状態及びＨＧＦで刺激された細胞の両者で抑制された。
【００６５】
ＨＧＦＲによって活性化された他の重要な経路は、細胞増殖の刺激を含むことで知られているＭＡＰＫ経路である。発明者らは抗体で処理された細胞中のＭＡＰＫｓの活性化のレベルを調査したが、この経路の重要な抑制は観察されなかった（データは示していない）。
【００６６】
実施例２。抗Ｍｅｔ−Ｒはインビトロで癌の形質転換された表現型を抑制する。
細胞増殖及び形質転換された表現型における抗体の影響を足場依存性及び非依存性方法で増殖し、細胞外マトリックスを浸潤する細胞活性を測定することにより評価した。図２Ａに示すように、抗体治療において足場依存性条件で増殖する細胞の活性における相違は観察されなかった。
【００６７】
足場非依存性増殖は、足場の欠如によるアポトーシス、いわゆる「アノイキス」を克服する細胞の能力に強く依存する；この特徴は、通常柔らかい寒天（２８）上で増殖する細胞の能力を評価することによって分析されている。ＨＧＦＲ活性化が細胞にこの特徴を与えることができることを多くの論文が示しているので、発明者らは０．５％の寒天にＧＴＬ１６を播種し、抗ＭＥＴ−Ｒまたは対照としての無関係なアイソタイプに対応する抗体の異なる量の存在または非存在での培養を維持した。図２Ｂに示すように、ＶＳＶ−Ｇで処置された、並びに処置されていない細胞は多数のコロニーを形成することができた。逆に言えば、抗ＭＥＴ−Ｒは用量依存的様式において癌細胞の足場非依存的増殖を徹底的に阻害した。ＧＴＬ１６細胞が、構成的ＨＧＦＲ活性化によって、基礎条件でさえも柔らかい寒天でコロニーを形成することが可能であること、及び抗体がＨＧＦの存在下及び非存在下の両者においてこれらの細胞の形質転換された表現型を減らすことは興味深い。
【００６８】
細胞侵襲性を阻害する抗体の能力を評価するために、発明者らは、再構成された基底膜（２９）を浸潤することができる乳癌細胞系のＮＤＡ−ＭＢ−４３５β４について研究した。図２Ｃに示すように、インビトロにおいて抗ＭＥＴ−Ｒを用いたこれらの細胞の処置はＨＧＦに対する応答において浸潤特性の用量依存的縮小を引き起こす結果となった。
【００６９】
実施例３。抗Ｍｅｔ−Ｒはインビボにおいて形質転換された表現型を阻害する
インビボにおける腫瘍増殖に対する抗ＭＥＴ−Ｒの活性を評価するために、発明者は免疫不全のメスのマウスｎｕ／ｎｕの後側腹部の皮下にＧＴＬ１６細胞を接種した。このマウスに週に２回、抗ＭＥＴ−ＲまたはＶＳＶ−Ｇのいずれかを、生体内原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）で投与して処置した（２μｇ／ｇｒ）。注射の部位に腫瘍が出現する移植後１週間、治療を開始した：比較し得る大きさの腫瘍を患っているマウスのみに４週間治療した。すべての処置と増殖の減少が抗ＭＥＴ−Ｒで処置したマウスに観察されている間、腫瘍体積をモニターし（図３Ａ）、処置の後、マウスを死体解剖して腫瘍を切除し、秤量した。図３Ｂに示すように抗Ｍｅｔ−Ｒで処置されたマウスにおいて、腫瘍は対照よりも顕著に縮小した（ｐ＜０．０５）。アポトーシス細胞のパーセンテージがかなり上昇した間（図３Ｄ）、受容体がリン酸化された形に対して特異的抗体で染色することによって示されるように、これらの腫瘍におけるＨＧＦＲ活性化のレベルは減少した（図３Ｃ）。さらに、本発明者らは腫瘍切片をヘマトキシリン／エオシンで染色した後、アポトーシス及び有糸分裂の指数を評価した。抗ＭＥＴ−Ｒで扱われたマウスから得られた腫瘍組織でアポトーシスが増加した間、有糸分裂の数がほとんど変化しなかった（データは示さない）。
【００７０】
発明者はインビボにおける自発性転移のモデルシステムであるＭＤＡ−ＭＢ−４３５β４細胞で同じ種類の実験を行った（２９）。マウスに週に２回、抗ＭＥＴ−Ｒまたは対照抗体の異なる投与量で処置し、いずれか一方を全身的に（腹膜内に１μｇ／ｇｒまたは１０μｇ／ｇｒ）投与するかまたは腫瘍に（生体内原位置に２μｇ／ｇｒ）投与した。治療は移植した日から始まり、８週間（転移の可能性が現れる時間）行った。治療の後、マウスを死体解剖して原発腫瘍及び肺（これらの細胞が転移する確立の高い部位）の解析を行った。異なる器官（脾臓、骨髄、肝臓、心臓、骨及び肝臓）を可能性のある毒性作用を除外するために調べた。肉眼分析により抗Ｍｅｔ−Ｒ治療が主要な腫瘍集団の増殖を阻害することが示された（図４Ａ−Ｅ及びＫ）。ＨＧＦＲのチロシン−リン酸化形態であることを認識している抗体による免疫組織化学的な染色により、この場合も受容体活性化の顕著な減少が示された（図４Ｆ−Ｊ）。さらに、肺切片の顕微鏡分析によって抗Ｍｅｔ−Ｒの腫瘍内注入及び全身投与の両者が肺及び検査された器官で遠隔転移の出現を阻害したことが明らかとなった（図４Ｌ）。
【００７１】
ＨＧＦが強力な血管新生因子であり、ＨＧＦＲシグナルが腫瘍血管新生の一因となることが多くの論文で示されていたので、発明者らは抗ＭＥＴ−Ｒ処置と同時に腫瘍血管新生を分析した。これらの腫瘍について発明者らは血管（数はより少なく、大きさはより大きかった）及びそれらの分岐（図４Ｍ、Ｎ）の数の顕著な減少を見出した。発明者は、このように、処置の抗腫瘍及び抗転移効果は、腫瘍及び微環境の出芽血管における抗体の合同作用に由るものであると結論付けた。
【００７２】
実施例４。抗Ｍｅｔ−ＲはＨＧＦＲダウンレギュレーションを誘導する
抗ＭＥＴ−ＲがＨＧＦＲ活性化を阻害することができるメカニズムを研究するために、発明者は抗ＭＥＴ−ＲまたはＶＳＶ−Ｇのいずれかを用いて、ＨＧＦＲ過剰発現細胞を処置した；この実施例は多くの自然に生じる腫瘍でしばしば観察されるものと似ている。図５Ａで示されるように、発明者は、ＶＳＶ−Ｇ処置ではなく抗ＭＥＴ−Ｒ処置において、時間依存方法でＨＧＦＲの全体量が減少したことを観察した。これは抗Ｍｅｔ抗体が受容体のダウンレギュレーションを特異的に誘導することを示唆している。これらの細胞において過剰発現ＨＧＦＲ、ＨＧＦ、リガンドが受容体のダウンレギュレーションを誘導することができないということは興味深い（図６、下方パネル）。
【００７３】
発明者らは抗ＭＥＴ−Ｒ抗体がＨＧＦＲの標準レベルに発現している細胞でもまた受容体のダウンレギュレーションを引き起こすかどうかを検証した。図５Ｂの左パネルに示すように、これらの細胞もまた抗ＭＥＴ−ＲがＨＧＦＲを効果的にダウンレギュレーションした。
【００７４】
細胞膜で曝されたＨＧＦＲの抗体に誘導された縮小をＦＡＣＳ分析によって評価した。細胞の蛍光定量分析により、抗体処置が細胞表面で発現されたＨＧＦＲ量をＨＧＦそれ自体よりも高い効率で減少させたことが示された（図５Ｂ、右側パネル）。同じアッセイにおいて同様の減少がＧＴＬ１６細胞でもまた観察された（図示せず）。
【００７５】
実施例５。抗Ｍｅｔ−Ｒに誘導されたＨＧＦＲのダウンレギュレーションの分子メカニズム
リガンド依存性及び抗体誘導性のダウンレギュレーションは異なる経路を辿る。ＲＴＫｓのリガンド依存性ダウンレギュレーションは内面化、ユビキチン化、選別エンドソーム及び最終的にリソソームまたはプロテアソーム分解（３０）を含む多段階過程である。
【００７６】
抗体誘導性ＨＧＦＲダウンレギュレーションにどの分解経路が関与しているかを評価するために、発明者らは抗体刺激の前に、それぞれ特定の阻害剤コンカナマイシン及びラクタシスチンを用いて、ライソームまたはプロテアソームの活性を遮断した。驚くべきことに、プロテアソーム経路の阻害がリガンド誘導性ＨＧＦＲ分解を顕著に損なう間、抗ＭＥＴ−Ｒ処置による受容体ダウンレギュレーションに影響を及ぼさない（図６Ａ、上方パネル）。このように、抗体及びリガンドは異なる分子メカニズムを経由してＨＧＦＲダウンレギュレーションを促進することを示唆している。さらに、プロテアソームの活性が損なわれたとき、基底状態でかろうじて検出可能である６０Ｋｄのフラグメントは、抗体処置（図６Ａ、下方パネル）と同時に細胞内にかなり蓄積された。このフラグメントは、唯一抗−細胞内ＨＧＦＲ抗体とともにウェスタンブロットで検出され、そして受容体の細胞質ドメインに存在していた。さらに分子がプロテアソーム分解に関係していると予想されるように、６０Ｋｄフラグメントはユビキチン部分で標識された（図６Ｂ）。
【００７７】
受容体の細胞外ドメイン（Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）が、抗ＭＥＴ−Ｒ処置と同時に細胞溶解物で検出されなかったので、発明者らはそれが「脱落」として知られる現象である、開裂の際に細胞外部に遊離することかどうかを検証した。この減少を確認するために、発明者らは細胞培養中にＨＧＦＲ細胞外ドメインの存在を調べた。細胞に放射性３５Ｓ−システイン及び３５Ｓ−メチオニンで代謝的に標識化し、ＨＧＦまたは抗ＭＥＴ−Ｒで４時間処置した。培養液を集め、細胞外ドメインを認識している抗ＨＧＦＲ抗体で免疫沈降に供した。図７Ａに示すように、代謝的に標識化した細胞の培地から、発明者らは、１３０Ｋｄの見かけ上の分子量（細胞外αβ鎖の複合体に対応）を有する非還元条件下で走ったバンドを免疫沈降した；ゲルが還元条件下で走ったとき、複合体は８０Ｋｄ（β鎖）及び４５Ｋｄ（α鎖）の２つのバンドに分離した。ＨＧＦ刺激がこの過程を増強しない一方、受容体の脱落は抗体結合と同時に劇的に増加した。以前のデータ（１５）によると、ＨＧＦＲ細胞外ドメインの少量は細胞外環境に恒常的に遊離することが知られている。抗体−誘導性細胞外ドメイン脱落が、内皮細胞（図７Ｂ）のように、ＨＧＦＲの標準レベルを発現している細胞で観察されることを強調することは興味深い。
【００７８】
抗体の量を４時間かけて増やして細胞を処置することによって、発明者らは抗体媒介ＨＧＦＲ脱落が用量依存性であったことが観察された（図７Ｃ）。抗体誘導性ＨＧＦＲ脱落の動態解析をするために、発明者らは、細胞を同量の抗ＭＥＴ−ＲまたはＶＳＶ−Ｇのいずれかを異なる時間で刺激した。細胞外ドメインの増加レベルは抗ＭＥＴ−Ｒの培地で検出されたがＶＳＶ−Ｇで処置された細胞では検出されなかった。このことから抗体誘導性脱落は特異的でかつ時間依存性であることを示す（図７Ｄ）。
【００７９】
実施例６。抗体誘導性ＨＧＦＲ脱落は細胞表面で起こる
エンドサイトーシスがＨＧＦＲ脱落に必要かどうかを調べるために、発明者らは、クラスリン依存性エンドサイトーシスを減じて、その発現がテトラサイクリン制御システムの制御下にある、ダイナミン（Ｄｙｎ Ｋ４４Ａ）の変異体を安定に形質移入した細胞を利用した。細胞を、ダイナミン変異体の発現の結果としてエンドサイトーシスを減じるために、テトラサイクリンの存在下（Ｃｔｒ）または非存在下（Ｋ４４Ａ Ｄｙｎ）のいずれかで４８時間維持した。図７Ｄに示すように、抗体により誘導される脱落はクラスリン依存性エンドサイトーシスが抑制された細胞で減じなかった。
【００８０】
膜タンパク質の脱落により一般的に含まれるプロテアーゼはＡＤＡＭファミリーのα−セクレターゼに属する。ＨＧＦＲ脱落に関する酵素の同定を試みるために、キレート剤１，１０−フェナントロリン、ＡＤＡＭｓ及びＺｎ−依存性プロテアーゼの阻害剤を抗体処置の前に細胞に加えた。この条件において、受容体脱落は影響を受けなかった（データは示さない）。これにより、ＨＧＦＲ細胞外ドメインのタンパク質分解がα−セクレターゼによってではなくＺｎ−非依存性プロテアーゼによって媒介されることが示された。
【００８１】
ＨＧＦＲがブロット凝固に含まれる遺伝子に転写的に関係していることは知られているので、発明者らもまた血液凝固システムのプロテアーゼが細胞外ドメイン脱落の原因で起こるかどうかを調べた。しかしながら、アプロチニンとともにそれらの阻害剤は抗体誘導性ＨＧＦＲ細胞外ドメイン脱落を変化させなかったことから、この工程におけるプロ凝血原（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）の役割は除外された（データは示さない）。他の阻害剤（アミロライド、ペプスタチンＡ、ロイペプチン）のパネルを用いて、発明者らもまたウロキナーゼ、酸性プロテアーゼ、セリン及びシステインプロテアーゼ（データは示さない）のような他で知られるヒドロラーゼの関与を除外した。さらに、この酵素の高用量（１μＭ）及び長期間にわたる処置（２４時間）でホルボールエステルＴＰＡを用いた阻害が細胞外ドメイン脱落を減少しなかった（データは示さない）ので、発明者らは細胞外ドメインの脱落はＰＫＣａの活性化に非依存性であることを証明した。
【００８２】
すべてが適切なポジティブコントロールとともに行われた実験のこのセットは、ＨＧＦＲ細胞外ドメイン脱落に起因する酵素が受容体脱落を明らかに含むプロテアーゼのリスト外のものであったことを示している。
【００８３】
実施例７。ＨＧＦＲ活性化は抗体誘導性脱落を必要としない。
発明者が以前に報告しているように、エンドフィリン、ＣＩＮ８５及びＣｂ１を含む三量体複合体はＨＧＦＲ（３２）のリガンド依存性ダウンレギュレーションを媒介する。この複合体は、ＨＧＦＲ活性化と同時に受容体に補充され、エンドサイトーシス、ユビキチン化及び受容体分解を促進する。受容体活性化及びシグナル伝達が抗体依存性下方調節及び脱落を必要とするかどうかを調べるために、発明者らは抗ＭＥＴ−Ｒの能力を促進させてさまざまなＨＧＦＲ変異体をダウンレギュレーションさせた。発明者らはＨＧＦＲ対照または以下の変異体のいずれかのＣＯＳ−７細胞で強制発現させた：ｉ）ＡＴＰ結合ポケットでＬｙｓ−Ａｌａ置換に起因して、チロシンキナーゼ活性の「死」受容体欠如をコードしているＭＥＴ ＫＤ、ｉｉ）シグナル伝達を結合チロシンＹ１３４９、Ｙ１３５６が欠如しているＨＧＦＲをコードしているＭＥＴ「二重」、（ｉｉｉ）受容体の細胞内ドメイン全体をコードしている配列がＧＦＰ配列によって置換された優性陰性変異体。形質移入の４８時間後、細胞を３時間抗ＭＥＴ−Ｒで処置した。細胞抽出物及び細胞外培養をウェスタンブロットによって分析した。予想外に、抗ＭＥＴ−Ｒはすべての変異体でダウンレギュレーションを引き起こし、そしてＨＧＦＲ脱落を誘導することが可能であった（図８）。この実験は抗体依存性ＨＧＦ受容体ダウンレギュレーションが受容体キナーゼ活性化または細胞質のトランスデューサーの補充を必要としないこと、及びすべての細胞内ドメインがこの工程に不要であることを示唆している。これは、抗体及びリガンドが異なるダウンレギュレーションメカニズムを活性化することをさらに確証している。
【００８４】
実施例８。細胞外ドメインを脱落するＨＧＦＲは「おとり」として機能する
遺伝子操作により得られたＨＧＦＲの細胞外ドメインが優性陰性の「おとり」分子（３３）として機能するということが示されているので、発明者らはＨＧＦＲシグナルを阻害している脱落外部ドメインの能力を試験した。抗ＭＥＴ−ＲまたはＶＳＶ−Ｇで７２時間前処理した細胞を培地でＨＧＦＲ細胞外ドメインの存在下（図９、４−６レーン）または非存在下（７−９レーン）のいずれかでＨＧＦを用いて、異なる時間で刺激した。示したとおり、ＨＧＦＲ細胞外ドメインの存在下において、ＨＧＦに引き起こされるＡｋｔリン酸化はかなり損なわれた。したがって、おとり（３３）のような脱落フラグメントはＨＧＦ結合の競争相手としてかつＨＧＦＲ活性化を妨げる優性陰性分子として働くという考えが支持された。
【００８５】
実施例９。作用薬抗ＭＥＴ−Ｒ抗体ＤＯ−２４は細胞外ドメイン脱落を誘導しない。
この抗体の作用薬としての能力はその治療的な活性を正当化するには、本質的には、十分でない。実際、我々が調べた異なる抗ＭＥＴ−Ｒ分子抗体（ＤＯ−２４）は受容体の細胞外部分の脱落を促進しないが受容体を完全に活性化することができる。
【００８６】
実施例１０。レンチウイルスを介する遺伝子導入手段による抗ＭＥＴ−Ｒの産生
発明者らは抗ＭＥＴ−Ｒ重または軽鎖配列を双方向性レンチウイルスベクター（５１）に挿入した（図１０Ａ、１５及び１６）。このレンチウイルスベクターは、最小の中心的なプロモーター（ｍｉｎＣＭＶプロモーター）をｈＰＧＫプロモーター（５１）の上流及び逆配位に連結して得られる合成プロモーター（ＡＣＣＴＧＧＧＴＴ、配列番号４）の存在により２つの分離ｃＤＮＡの協調的な発現を引き起こす。この合成プロモーターは転写性の活性を両方向に駆動することができる抗Ｍｅｔ−Ｒをコードしている２つのｃＤＮＡを一方はアンチセンス配位（軽鎖）の上流にかつセンス配位（重鎖）の下流に置くことによって、２つの独立したｍＲＮＡを協調的に産生することが可能である。発明者らは、開示したように、２９３Ｔ細胞の一過性の遺伝子移入を用いてベクター粒子を産生した。そして、標的細胞のゲノムを永久的に修飾するために、発明者らはベクター粒子を含む上清の細胞系に由来したカルシノーマのパネルを遺伝子導入した。遺伝子導入の後、細胞を結成欠乏状態にし、細胞培養上清を集めるために７２時間培養した。抗ＭＥＴ−Ｒ抗体の存在をウェスタンブロット解析によって評価し（図１０Ｂ）そして抗ＭＥＴ−Ｒ定量をＥＬＩＳＡによって行った（図１０Ｃ）。すべてのトランデュースされた細胞系は培養上清で分泌された抗ＭＥＴ−Ｒ抗体を産生した。抗体の産生は、細胞系の分析に依存して０．２−６μｇ／ｍｌの範囲で変化した。組み換え体抗ＭＥＴ−Ｒ特異性を免疫沈降アッセイによって制御した（図１１Ａ）し、一方結合性をＥＬＩＳＡアッセイによって評価した（図１１Ｂ）。組み換え体抗ＭＥＴ−ＲはＭｅｔ受容体を融合細胞によって従来法により産生された抗ＭＥＴ−Ｒによって得られたものと同じ範囲の結合性をもって特異的に認識することができる。さらに、抗ＭＥＴ−Ｒが融合細胞によって産生されるように、組み換え体抗ＭＥＴ−ＲはＭｅｔタンパク質分解及び細胞外ドメインの脱落を誘導することができた（図１２）。
【００８７】
実施例１１。抗Ｍｅｔ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターを用いた形質導入はインビトロ及びインビボにおける癌細胞の形質転換された表現型を阻害する。
発明者らは抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターを用いてＨＣＴ−１１６細胞を形質導入した（２５ｎｇ ｐ２４／ｍｌ）。遺伝子導入された細胞を、対照細胞と比較して形質転換された表現型についてインビトロ及びインビボにおける腫瘍形成の足場非依存性増殖及び浸潤特性を分析することによって試験した。足場非依存性増殖について、発明者らは０．５％の寒天上に抗ＭＥＴ−Ｒを産生する細胞及び対照としての対照細胞を播種し、培地上で１５日維持されたコロニーを数えた。形質導入された細胞は、足場非依存性増殖の能力において阻害され、コロニーの数が減少し、大きさも対照で産生されたコロニーと比較して小さかった（図１３Ａ）。細胞浸潤を試験するために、発明者らは細胞が再構成された基底膜を浸潤する能力を分析した。図１３Ｂに示すように、形質導入された細胞はそれらの浸潤特性の減少を示した。発明者らは、胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に注入している抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターで形質導入された細胞のインビボにおける腫瘍形成を調べた。図１３Ｃ及びＤで示されるデータは形質導入された細胞が腫瘍潜伏のようにインビボでの腫瘍形成の特性が損なわれ、腫瘍増殖が対照に比べて阻害されたことを示した。
【００８８】
実施例１２。抗Ｍｅｔ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターの腫瘍内への直接投与は腫瘍増殖を阻害する。
抗ＭＥＴ−Ｒ遺伝子導入の有効性を正式な証拠を得るために、発明者らは、抗体をコードしているｃＤＮＡｓを有するレンチウイルスベクター粒子をヌードマウスの側腹部にＨＣＴ−１１６細胞の皮下注射によって予め処置した腫瘍に直接投与した。抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているベクターで処置した腫瘍は、対照ベクターで処置した腫瘍と比較してより遅い成長率を示した（図１４）。
【００８９】
実施例１３。Ｍｅｔ細胞外ドメイン上の抗ＭＥＴ−Ｒ結合部位。
抗ＭＥＴ−Ｒによって認識されるエピトープをマップするために、免疫沈降実験は肝細胞増殖因子受容体（Ｍｅｔ細胞外ドメインとしても知られる）の異なる細胞外ドメインを使って行われた（図１７）：
−おとりＭｅｔ（アミノ酸１−９３２）：膜貫通型ドメインの前に切断されたヒトＭｅｔの全細胞外領域に対応する可溶性組み換え型タンパク質（Ｍｉｃｈｉｅｌｉら、０００４）；
−ＳＥＭＡ ＰＳＩ（アミノ酸１−５６２）：ＳＥＭＡドメイン（アミノ酸１−５１５）（Ｓｔａｍｏｓら、２００４；Ｇｈｅｒａｒｄｉら、２００４）及びＰＳＩ領域（アミノ酸５１６−５６２）（Ｋｏｚｌｏｖら、２００４）を含むおとりＭｅｔの切断された形。
−ＰＳＩ ＩＰＴ（アミノ酸１−２４；５１６−９３２）：ＰＳＩ領域（アミノ酸５１６−５６２）及び４ＩＰＴドメイン（アミノ酸５６３−９３２）（Ｂｏｒｋら、１９９９；Ｇｈｅｒａｒｄｉら、２００４）に融合された内因性リーダー配列（アミノ酸１−２４）を含んでいるおとりＭｅｔの切断された形。
【００９０】
ポリヒスチジン標識及びＭｙｃ−エピトープ標識はそれぞれの分子のＣ−末端に加えられた。
【００９１】
おとりＭｅｔ配列はジーンバンク受託番号Ｘ５４５５９（Ｇｉｏｒｄａｎｏら、１９９１）にコードされた配列に由来した；この配列は正確にプロセスされて、膜に位置するチロシンキナーゼタンパク質をコードするヒトＭｅｔ遺伝子の主な転写物に対応する。
【００９２】
他の論文はジーンバンク受託番号Ｊ０２９５８（Ｐａｒｋら、１９８７）をコードしている配列について言及している；この番号はヌクレオチド２２６４からヌクレオチド２３１８の場所に５４ｂｐの挿入を含む選択的にスプライシングされたマイナー転写物に対応している。この転写物は正確にプロセスされず、膜に位置しないチロシンキナーゼタンパク質をコードしている（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、１９９１）。この配列によるとＭｅｔの細胞外領域はアミノ酸１−９５０に対応し、そして第３のＩＰＴドメイン（ＩＰＴ３）は１８のアミノ酸の挿入を含んでいる。
【００９３】
表１は配列Ｘ５４５５９及びＪ０２９５８によるＭｅｔの異なる領域の位置を要約している。
【００９４】
【表１】
【００９５】
設計された分子のｃＤＮＡをｐＲＲＬ．ｓｉｎ．ＰＰＴ．ＣＭＶ．Ｗｐｒｅレンチウイルスベクター（Ｆｏｌｌｅｎｚｉら、２０００）にサブクローンした；組み換え体レンチウイルス粒子をラージスケールで産生し、ヒト腫瘍細胞系（Ｍｉｃｈｉｅｌｉら、２００４）を形質導入するのに使用した。
【００９６】
ｍｙｃで標識されたおとりＭｅｔ、ＳＥＭＡ ＰＳＩ及びＰＳＩ ＩＰＴで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５の条件培地を抗ＭＥＴ−Ｒ抗体で免疫沈降し、そしてビオチン化された抗ｍｙｃ抗体を使ってウェスタンブロットにより検出した（図１８、右側パネル）。同量の条件培地をタンパク質発現のための対照として加え（図１８、左側パネル）、この対照は空のレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地である。図１８の右側パネルに示すように抗Ｍｅｔ−ＲはおとりＭｅｔ及びＰＳＩ−ＩＰＴを免疫沈降することができるが、ＳＥＭＡ−ＰＳＩを免疫沈降することはできない。したがって、それはＩＰＴ領域（Ｂｏｒｋら、１９９９）にエピトープを認めた。
【００９７】
抗体抗ＭＥＴ−Ｒによって認められるエピトープをさらに詳細にマップするため、免疫沈降実験を単一ＩＰＴ領域（Ｂｏｒｋら、１９９９）を用いて行った。それぞれのＩＰＴはＩＰＴ１（アミノ酸５６３−６５６）またはＩＰＴ２（アミノ酸６５７−７４１）またはＩＰＴ３（アミノ酸７４２−８３８）またはＩＰＴ４（アミノ酸８３９−９３２）に融合した内因性のリーダー配列（アミノ酸１−２４）を含むＰＳＩ−ＩＰＴの切断された形である。
【００９８】
ポリヒスチジン標識及びフラッグーエピトープ標識はそれぞれの分子のＣ−末端に加えられた。以前に報告され、組み換え体レンチウイルス粒子がヒト腫瘍細胞系を遺伝子導入するために使用されたように、設計された分子のｃＤＮＡは同じレンチウイルスベクターにサブクローンされた。
【００９９】
これらすべての組み換え体タンパク質は可溶性因子であるが、ＩＰＴ２は形質導入細胞の条件培地に分泌されない。この理由のために、免疫沈降実験は細胞溶解物上で実行された。
【０１００】
フラッグで標識された単一ＩＰＴで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５の細胞溶解物を抗ＭＥＴ−Ｒ抗体で免疫沈降し、抗フラッグ抗体を用いてウェスタンブロットによって検出した（図１９、左側パネル）；タンパク質発現の対照として、同量の細胞溶解物を抗フラッグ抗体で免疫沈降し、そして同じ抗フラッグ抗体を使ってウェスタンブロットにより検出した（図１９、右側パネル）。
【０１０１】
左側のパネルに示すように、抗ＭＥＴ−ＲはＩＰＴ４を免疫沈降させることは可能であるが、他の３つのＩＰＴドメインを免疫沈降させることはできない。抗Ｍｅｔ−ＲはＭＥＴ細胞外領域のＩＰＴ４ドメインを含むエピトープを認識する。
【０１０２】
実施例１４。抗ＭＥＴ−ＲはＦＡＣＳ分析または免疫蛍光分析によって両者とも無処置の細胞でＨＧＦＲを認識した
ヒトの胃癌細胞系であるＧＴＬ−１６を抗ＭＥＴ−Ｒ抗体で培養した。流動細胞計測法によって分析されたＧＴＬ−１６の特性は、抗ＭＥＴ−ＲがＨＧＦＲを発現している細胞を特異的に染色することができることを明らかにした。抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体で標識された細胞における蛍光強度は対照細胞に関して増加した（図２０、パネルＡ）。固定した後、免疫蛍光分析をするためにＧＴＬ−１６細胞を抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体で培養した。染色によりＭｅｔ受容体に対応する細胞表面に特異的に標識化することを明らかにした（図２０、パネルＢ、Ｃ）。
【０１０３】
当然、発明の原則が同じことを維持する間、実施例によって開示され、例示されることに関して、添付された特許請求の範囲に定義されたように本発明の範囲からの逸脱することなく、構成及び実施例の詳細は広く変動するかもしれない。
【０１０４】
文献目録
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【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】抗Ｍｅｔ−ＲはＨＧＦＲ活性化及びシグナル伝達を減じる。（Ａ）ＨＧＦＲ活性化の評価。ＧＴＬ１６細胞を所定時間抗ＭＥＴ−Ｒに曝した。ＨＧＦＲは細胞溶解物から免疫沈降され、そしてウェスタンブロットによって指示された抗体で調べた抗Ｍｅｔ−Ｒ処置により、バンド密度の定量化により示されているように、受容体のダウンレギュレーションよりももっとはっきりと受容体活性化を減少させる結果となった。（Ｂ）ＨＧＦＲシグナルの分析。細胞をＶＳＶ−Ｇまたは抗ＭＥＴ−Ｒのいずれかで前処置し、そして所定の時間ＨＧＦで刺激した。Ａｋｔリン酸化を全細胞溶解物中で評価した。上部のパネルに示されるように抗Ｍｅｔ−Ｒは基底及びＨＧＦ誘導性のＡｋｔ活性化の両者を減少させた。
【図２】抗Ｍｅｔ−Ｒはインビトロにおける癌細胞の形質転換された表現型を阻害する。（Ａ）ＧＬＴ１６細胞の足場非依存性増殖。前処理された細胞を０．５％アガーに播種した。細胞を抗ＭＥＴ−ＲまたはＶＳＶ−Ｇ抗体の所定の量の存在において維持し、そして１０日後増殖したコロニーを染色した。足場非依存性増殖は抗ＭＥＴ−Ｒの少しの服用量でも徹底して阻害された。（Ｂ）浸潤アッセイ。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ β４をマトリゲル被覆トランスウェル容器に播種する前に、所定の抗体を用いて２４時間前処理した。低いほうの容器を、ＤＭＥＭ２％ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍｌＨＧＦで満たした。２４時間後、遊走した細胞を染色し、カウントした。ＨＧＦの応答における浸潤性能力は刺激されていない細胞と比較して向上するように発現する。示されるように抗Ｍｅｔ−Ｒ治療により細胞の浸潤が著しく減少した。
【図３】抗Ｍｅｔ−Ｒはインビボ（Ａ、Ｂ）の腫瘍形成アッセイにおける癌細胞の形質転換された表現型を阻害する。ヌードマウスの皮下に１．５×１０６ＧＴＬ１６細胞を注入した。腫瘍が出現した後、同じサイズの腫瘍が示されたマウスを選抜し、ＶＳＶ−Ｇまたは抗ＭＥＴ−Ｒのいずれかの２μｇ／ｇｒを週２回生体内原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）に注入した。腫瘍の体積を異なる時点で測定した（Ａ）。示されるように、人間の腫瘍細胞を移植されたヌードマウスにおいて抗ＭＥＴ−Ｒは腫瘍増殖を弱めた。マウスは治療の８週間後に屠殺され、腫瘍の重量を測定した（Ｂ）抗Ｍｅｔ−Ｒの治療により、対照マウスよりも著しく腫瘍が小さくなった（ｐ＜０．０５）。（Ｃ）ＨＧＦＲ活性化の評価。ＶＳＶ−Ｇ（パネルＡ）、または抗ＭＥＴ−Ｒ（パネルＢ）で処置されたマウスからの腫瘍切片を抗−ヒトのリン酸−ＨＧＦＲで染色した。 腫瘍の免疫化学的分析により抗ＭＥＴ−Ｒで処置されたマウスにおいて、活性化ＨＧＦＲのレベルが強く低下したことが明らかとなった。
【図４】抗Ｍｅｔ−Ｒ治療はインビボでの腫瘍の進行を妨げる。ヌードマウスの皮下に２．５×１０６ＭＤＡ−ＭＢ−４３５β４細胞を接種した。腫瘍の増殖を無処置のマウス（Ａ）と以下で処置されたマウスを用いて評価した：１０μｇ／ｇｒ ＶＳＶ−Ｇを投与されたＩＰ（Ｂ）、１０μｇ／ｇｒ抗ＭＥＴ−Ｒ ＩＰ（Ｃ）、１０μｇ／ｇｒ抗ＭＥＴ−Ｒ ＩＰ（Ｄ）、及び２μｇ／ｇｒ抗ＭＥＴ−Ｒ ＩＳ（Ｅ）。図（Ｋ）で示すように、抗ＭＥＴ−Ｒはヒト腫瘍細胞を移植されたヌードマウスにおいて腫瘍の増殖を阻害した。左のパネルで示されるように、抗ヒトリン酸−ＨＧＦＲの免疫化学的染色を腫瘍の断片上で実施した。強いＨＧＦＲ活性化は無処置マウス（Ｆ）と支配抗体で処置されたマウス（Ｇ）の両者で起こっていた。抗ＭＥＴ−Ｒの投与により腫瘍増殖の阻害と平行してＨＧＦＲの阻害を引き起こす結果となった。（Ｌ）肺転移の分析。転移は、ヘマトキシリン／エオシン染色の後、肺部の微細な観察によって数えられた。転移数の服用に依存する減少は抗ＭＥＴ−Ｒ治療を受けているマウスに明らかであった。（Ｍ−Ｎ）腫瘍血管新生の評価。腫瘍組織学的切片上の免疫蛍光染色は抗−マウスＣＤ３１抗体で実施された。血管の数及び面積は蛍光顕微鏡検査によって評価された。図示のとおり、血管の数及びサイズの両者は抗ＭＥＴ−Ｒ処置に応じて減少された。
【図５】抗ＭＥＴ−ＲはＨＧＦＲのダウンレギュレーションを誘導する。ＧＴＬ１６細胞（Ａ）及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５ β４（Ｂ）は示された時間、抗ＭＥＴ−Ｒで処置された。全細胞溶解物の等量をウェスタンブロット法のために処理し、抗ＨＧＦＲ（上のパネル）または付加対照として、抗−Ｈｓｐ７０（下のパネル）抗体で調査した。図示のとおり、抗ＭＥＴ−Ｒは、過剰発現細胞（ＧＴＬ１６）及びＨＧＦＲ（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ β４）の正常レベルを表している細胞の両者においてＨＧＦＲのダウンレギュレーションを誘導することができた。（Ｃ）細胞表面におけるＨＧＦＲの細胞蛍光測定法による定量化。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ β４細胞を培地だけ（黒いバー）またはＨＧＦ（灰色のバー）または抗ＭＥＴ−Ｒ（白いバー）で培養した。示された時点で、細胞を抗−エキストラＨＧＦＲ抗体（ａｎｔｉ−ｅｘｔｒａ ＨＧＦＲ Ａｂ）（Ｄ０２４）で染色した。図示のとおり、抗ＭＥＴ−Ｒは３０時間の処置の後、最大限の縮小で効率的に表面のＨＧＦＲの量を減らすことができた。
【図６】抗体−誘導及びリガンド−依存ダウンレギュレーションは、異なる経路をたどる。（Ａ）ＨＧＦまたは抗ＭＥＴ−Ｒによる処置の前に、ＨｅＬａ（上部パネル）及びＧＴＬ１６（下部パネル）細胞をラクタシスチン（ｌａｃｔ）またはコンカナマイシン（ｃｏｎｃ）のいずれかまたは両者で２時間前処理した。ＨＧＦＲダウンレギュレーションを全細胞溶解物上で評価した。プロテアソームの存在において、リガンド−誘導ＨＧＦＲのダウンレギュレーション損なわれたが、一方抗体−誘導はそうではなかった。この状態において、細胞内部分（抗−内Ｍｅｔ）に対して指向される抗体によって唯一発見され得る６０Ｋｄ切片（矢印）は細胞内に蓄積された。さらに、抗−ユビキチン抗体（Ｂ、上部パネル）でプローブすることによって、プロテアソームの分解に関係付けられる分子が予想されるように、このフラグメントはユビキチン部分でタグが付けられたことが示された。
【図７】抗ＭＥＴ−Ｒはタンパク質分解性のＨＧＦＲの切断及び細胞外ドメイン（外部ドメイン）の脱落を誘導する。（Ａ）ＧＴＬ１６細胞を代謝的に３５Ｓメチオニン及び３５Ｓシステインで標識し、それから４時間でＨＧＦまたは抗ＭＥＴ−Ｒを用いて処理した。上澄みを集め、細胞外ドメインに対して向けられる抗ＨＧＦＲ抗体で免疫沈降した。ゲルは非還元（上部パネル）または還元（下部パネル）の条件下で走った。還元剤がない場合、ＨＧＦＲのα及びβ鎖は複合体として遊走する一方、β−メルカプトエタノールの存在下において２つのバンドは別々に走った。図に示すように、ＨＧＦではなく、抗ＭＥＴ−ＲはＨＧＦＲ外部ドメインの脱落を誘導することができた。（Ｂ）抗ＭＥＴ−Ｒは内皮細胞でまた脱落している外部ドメインを誘導する。ＨＵＶＥＣ細胞を示された時間抗体に曝した。培地を集め、ＨＧＦＲβ鎖の細胞外部分を認識している抗体を用いて免疫沈降した。同じ抗−エキストラＨＧＦＲ（ａｎｔｉ−ｅｘｔｒａ ＨＧＦＲ）を用いてウェスタンブロットにより調べた。（Ｃ、Ｄ）ＨＧＦＲの脱落は用量と時間に依存する。細胞は抗ＭＥＴ−Ｒ（Ｃ）の増加量または異なる時間（Ｄ）に刺激された。培地は（Ｂ）で処理した。
【図８】ＨＧＦＲの脱落のためにシグナル伝達の活性化は必要とされない。Ｃｏｓ−７細胞に異なるＨＧＦＲ変異体を形質移入し４８時間後、４時間抗ＭＥＴ−Ｒで処理した。全細胞溶解物と条件培地の等量をウェスタンブロッティングのために処理した。示したとおり抗Ｍｅｔ−Ｒはダウンレギュレーション及びすべてのＨＧＦＲ変異体の外部ドメイン脱落を誘導することができた。ＨＧＦＲ ＫＤ＝ＨＧＦＲキナーゼデッド、キナーゼ活性の欠如；ＨＧＦＲダブル＝２つのドッキングチロシン１３４９、１３５６が欠如し、そしてシグナルトランスデューサーを補充することができないＨＧＦＲ変異体；ＨＧＦＲ−ＧＦＰ＝全細胞内部分がＧＦＰ配列に置換されたＨＧＦＲ変異体。
【図９】ＨＧＦＲ脱落外部ドメインは「おとり（ｄｅｃｏｙ）」として振舞う抗Ｍｅｔ−Ｒで前処理された細胞は培地においてＨＧＦＲ外部ドメイン（Ｍｅｔ ｅｃｔｏ）の存在または非存在のいずれにおいてもＨＧＦで刺激された。示すとおり、脱落ＨＧＦＲ外部ドメインはＡｋｔ活性化を損ない、そして「おとり」として振舞った。
【図１０】遺伝子導入を媒介されたレンチウイルスベクターによって遺伝子上に修飾された細胞は抗ＭＥＴ−Ｒを発現する。（Ａ）双方向性レンチウイルスベクター（統合化形）の概略図は抗ＭＥＴ−Ｒを表したものである；ＬＴＲ：ＨＩＶ−１末端反復配列；Ｕ３領域はＲ領域から位置−１８で削除される。ＳＤ：スプライス供与。ＳＡ：スプライス受容体。ＰｏｌｙＡ ＳＶ４０：サルウイルス４０のポリアデニル化。Ｃｔｅ：恒常性輸送要素はサルのマソン−ファイザーウイルスに由来した。ＰｍｉｎＣＭＶ：最小プロモーターはサイトメガロウイルスに由来した。ｈＰＧＫ：ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子のヒトプロモーター。ＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節因子。ＦＬＡＧ Ｔａｇ：３回繰り返されたＤＹＫＤＤＤＫエピトープをコードしている配列。Ｈｉｓ Ｔａｇ：７ヒスチジン残基をコードしている配列。（Ｂ）抗ＭＥＴ−Ｒ ｃＤＮＡｓを保有しているレンチウイルスベクターで形質導入された２つの代表細胞系から集められた無血清培養上清（それぞれ７５μｌのサンプル）のウェスタンブロット解析。サンプルは還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、そして対応するフィルターは抗マウスＩｇでプローブされた。（Ｃ）抗ＭＥＴ−Ｒ ｃＤＮＡｓを保有しているレンチウイルスベクターで形質導入された細胞系のパネルから由来した培養上清における抗ＭＥＴ−Ｒの定量化を報告している表。
【図１１】組み換え抗ＭＥＴ−Ｒ結合はＭｅｔの細胞外ドメインと高い結合性をもって結合する。（Ａ）異なる源（融合細胞または遺伝子上で修飾されたカルシノーマ細胞系）に由来された抗ＭＥＴ−Ｒで免疫沈降されたＭｅｔ受容体を含む細胞溶解物のウェスタンブロット。免疫沈降は１から細胞培養上清で保温しているＳｅｐｈ．Ｐｒｏｔ．Ｇで実行された：無関係なＭＡｂを生じている融合細胞；２ 抗ＭＥＴ−Ｒ ＭＡｂを生じている２つの融合細胞；３ 抗Ｍｅｔ−Ｒ ＭＡｂのｃＤＮＡｓを保有しているレンチウイルスベクターで感染されたＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞 ４：感染していないＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞。サンプルを還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして対応するフィルターを受容体のＣ末端領域に対して向けられる抗Ｍｅｔ抗体でプローブした。（Ｂ）抗ＭＥＴ−Ｒ及び組み換え抗ＭＥＴ−ＲのＭｅｔ受容体の細胞外ドメインに対する結合アッセイ。ヒトＩｇ（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）に由来するＦｃドメインに融合した精製されたＭＥＴ細胞外ドメインで被覆された９６ウェルプレートを精製された抗ＭＥＴ−Ｒまたは組み換え抗ＭＥＴ−Ｒ（０から５，５ｎＭまで）の増加する濃度で培養した。抗体を結合した抗マウスＩｇ−ＨＲＰを使うことによって結合曲線が明らかとなった。結合の特異性を制御するためにＦｃ−Ｒｏｎ（ヒトＩｇのＦｃドメインをＲｏｎ受容体の細胞外ドメインに融合して得られたキメラタンパク質、Ｍｅｔ受容体系統に属するタンパク質）で被覆されたウェルを使って同じアッセイを試みた。
【図１２】組み換え抗ＭＥＴ−ＲはＨＧＦＲのタンパク質分解性の切断及び細胞外ドメイン（外部ドメイン）の脱落を誘導する。結腸直腸癌由来の細胞系であるＨＣＴ−１６を精製された抗ＭＥＴ−Ｒ（Ａ）または組み換え抗ＭＥＴ−Ｒ（Ｂ）の示された量で、２４時間の無血清条件で培養した。全細胞溶解物（上部パネル）及び細胞培養上清（下部パネル）をウェスタンブロットに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。細胞の成熟Ｍｅｔ（ｐ１４５）型の減少及び培養上清のＭｅｔ外部ドメイン（ｐ８０）の同時増加を、Ｍｅｔβ鎖の細胞外部分に位置したドメインであることを認識するＤＬ−２１抗Ｍｅｔ ｍＡｂを用いてフィルターをプローブしてモニターした。
【図１３】抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターを用いた形質導入はインビトロ及びインビボにおける癌細胞の形質転換された表現型を制御する。（Ａ）足場非依存性増殖アッセイ抗Ｍｅｔ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターで形質導入された（抗ＭＥＴ−Ｒ）またはされていない（対照、ＷＴ）ＨＣＴ−１１６細胞を０．５％の寒天に播種した。細胞を２％ＦＣＳ＋８０ｎｇ／ｍｌＨＧＦで補充された培養で維持した。１４日後コロニーを数えた；代表的なウェルを上欄に示す；グラフの下にコロニーの数（３通りから算出される）を表している。（Ｂ）浸潤アッセイ抗Ｍｅｔ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターを用いて形質導入された（抗ＭＥＴ−Ｒ）またはされていない（対照、ＷＴ）のＨＣＴ−１１６細胞をマトリゲルで被覆したトランスウェルの容器上にのせた。下方容器を２％ＦＢＳ＋８０ｎｇ／ｍｌＨＧＦ培地で満たした。２４時間後フィルターの下方部分に付着した細胞の数を数えた。写真は代表的なフィルターのフィールドである。（Ｃ）インビボにおける腫瘍潜時。抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターで形質導入された（抗ＭＥＴ−Ｒ）またはされていない（対照、ＷＴ）ＨＣＴ−１１６細胞を胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に注入した（３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ、ｎ＝６それぞれのグループ）。腫瘍体積をノギスを用いて２日おきに評価した。腫瘍体積が１５ｍｍを超えたとき、マウスを腫瘍存在が陽性であると考えた。（Ｄ）インビボにおける腫瘍増殖。抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターで形質導入された（抗ＭＥＴ−Ｒ）またはされていない（対照、ＷＴ）ＨＣＴ−１１６細胞を胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に注入した（３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ、ｎ＝６それぞれのグループ）。腫瘍増殖の動態について腫瘍体積をノギスで３日おきに測定することで評価した。６５日目でマウスをすべて屠殺した。
【図１４】抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターの直接的な内部腫瘍送達は腫瘍増殖を阻害した。ＨＣＴ−１１６細胞（４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）を胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に注入した。腫瘍体積が１０ｍｍの大きさになったときレンチウイルスベクター粒子（１μｇのｐ２４／マウス）を０日目と３日目に内部腫瘤に投与した。１つのグループ（ＣＴＲＬ）ＧＦＰをコードしているベクター粒子を受容する一方、他のグループは抗ＭＥＴ−Ｒ（抗ＭＥｔ−Ｒ）をコードしているベクター粒子を受容した。腫瘍増殖の動態について腫瘍体積をノギスを用いて３日おきに測定することで評価した。
【図１５】抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているプラスミドのマップ。
【図１６】抗Ｍｅｔ−Ｒ ＦＬＡＧ−Ｈｉｓをコードしているプラスミドのマップ。
【図１７】ＨＧＦＲ（Ｍｅｔ外部ドメイン）の外部細胞部分に由来するドメインの模式図。
【図１８】抗Ｍｅｔ−ＲはＩＰＴｓ領域に位置するエピトープを特異的に認識する。ｍｙｃ−タグを付けたおとりＭｅｔ、ｍｙｃ−タグを付けたＳＥＭＡ ＰＳＩ及びｍｙｃ−タグを付けたＰＳＩ ＩＰＴ１−４をコードしているレンチウイルスベクター粒子で形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５の条件培地を抗ＭＥＴ−Ｒ抗体で免疫沈降し、そしてビオチン化抗−ｍｙｃ抗体を使ってウェスタンブロットにより検出した（右側パネル）。条件培地の等量をタンパク質発現の対照としてロードした（左側パネル）。ＣＴＲＬ：空のレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地。おとりＭｅｔ：全細胞外ドメインを発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地。ＰＳＩ−ＩＰＴ：ＨＧＦＲのＰＳＩ、ＩＰＴ−１、ＩＰＴ−２、ＩＰＴ−３、ＩＰＴ−４ドメインを発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地。ＳＥＭＡ−ＰＳＩ：ＨＧＦＲのＳｅｍａ及びＰＳＩドメインを発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地。右側に分子量がＫＤで示されている。
【図１９】抗Ｍｅｔ−ＲはＩＰＴ−４領域に位置するエピトープを認識する。標識されたＩＰＴ−１、ＩＰＴ−２、ＩＰＴ−３、ＩＰＴ−４ドメインのすべてを発現しているレンチウイルスベクター粒子で形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の細胞溶解物を抗ＭＥＴ−Ｒ抗体で免疫沈降し、そして抗−フラッグ抗体を使ってウェスタンブロットにより検出した（左側パネル）；タンパク質発現の対照として、細胞溶解物の同量を抗−フラッグ抗体で免疫沈降し、同じ抗−フラッグ抗体を用いてウェスタンブロットにより検出した（右側パネル）。ＣＴＲＬ：空のレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。ＩＰＴ１：ＨＧＦＲのＩＰＴ−１領域を発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。ＩＰＴ２：ＨＧＦＲのＩＰＴ−２領域を発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。ＩＰＴ３：ＨＧＦＲのＩＰＴ−３領域を発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。ＩＰＴ４：ＨＧＦＲのＩＰＴ−４領域を発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。右側ＫＤにおける分子量が示されている。
【図２０】抗Ｍｅｔ−Ｒはインタクト細胞においてＨＧＦ受容体を特異的に染色する。パネルＡ：抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体を用いた流動細胞計測法により分析されたＧＴＬ−１６の特性。細線：イソタイプのＣＴＲＬ抗体で培養されたＧＴＬ−１６；太線：抗Ｍｅｔ−Ｒで培養されたＧＴＬ−１６。ＭＦＩ：平均蛍光強度。パネルＣ：蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８を用いて接合されたヤギ抗−マウスＩｇによって明らかにされた抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体を用いて標識されたＧＴＬ−１６細胞の免疫蛍光分析。パネルＢ：抗−マウスＩｇ／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８のみで標識されたＧＴＬ−１６細胞。（最初の拡大率、×６３）
【図２１】抗Ｍｅｔ−Ｒ重鎖の核酸（ａ）とアミノ酸（ｂ）配列。ＣＤＲ領域はヌクレオチドとアミノ酸配列の両者に下線が引かれている。
【図２２】抗ＭＥＴ−Ｒ軽鎖の核酸（ａ）とアミノ酸（ｂ）配列。ＣＤＲ領域はヌクレオチドとアミノ酸配列の両者に下線が引かれている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍及び腫瘍転移に関する治療薬の調製並びにインビボ、またはインビトロにおける腫瘍細胞を検知する診断用装置のためのモノクローナル抗体、フラグメント及び／またはそれらの部分の使用、並びにモノクローナル抗体、フラグメント及び／またはそれらの部分をコードしているヌクレオチド配列の使用に関する。特に、本発明は肝細胞増殖因子受容体の細胞外領域に対して産生される抗Ｍｅｔモノクローナル抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌免疫療法の科学的な調査は１９５０年代に始まり、最初の適用はポリクローナル抗体に頼っていた。５０年以上経った今日、モノクローナル抗体を用いた免疫療法は癌治療（１、２）のための有望な代替として提供し続けている。癌においてチロシンキナーゼ受容体（ＲＴＫｓ）を標的とするいくつかの抗体が臨床診療（３）で現在使われている。これらの抗体の作用のメカニズムは症例が異なれば異なり、そして成功した出願の例にもかかわらず、しばしば十分に理解されていない（４）。ベバシズマブ及びセツキシマブは、それぞれ血管内皮増殖因子−血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ）及び上皮細胞増殖因子−上皮細胞増殖因子受容体を標的とし、そしてリガンド−受容体の相互作用（５、６）を防ぐことによって作用する。ハーセプチンはヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）に特有のモノクローナル抗体で、上皮細胞増殖因子受容体ファミリーの一員である。ハーセプチン効果の基礎をなしている作用のメカニズムは完全に明白となったわけではないがＨＥＲ２の分解を促進することが示された。このように、腫瘍細胞（７）の表面で受容体レベルを低下させる。
【０００３】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のためにチロシンキナーゼ受容体をコードしているＭＥＴ発癌遺伝子は、細胞増殖、浸潤及びアポトーシスからの保護を導く遺伝的プログラムを制御している。肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）の調節された活性化は腫瘍原性の性質の獲得のためにだけでなく浸潤性表現型（８）の達成のためにも重大な意味を持つ。人間の腫瘍におけるＭＥＴの役割はいくつかの実験的なアプローチから見出され、カルシノーマの遺伝的形成においてＭＥＴの活性化突然変異の発見によって明解に証明された。（９、１０）。さらに、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）の恒常的活性化は孤発性癌でもまた頻繁に起こり、この研究所及び他の研究所からの研究により特別なヒストタイプ（histotypes)の腫瘍においてＭＥＴ発癌遺伝子が過剰発現されるか、または自己分泌機構を経由して活性化されることが示された。その上、ＭＥＴ遺伝子は結腸直腸癌腫(11)の血行性転移で増幅される。Ｍｅｔ活性化を妨げることは腫瘍形成及び転移のプロセスを阻止する挑戦的なアプローチになる。過去数年において、シグナル伝達し、ＨＧＦＲそれ自体またはそのリガンドを標的としている異常なＨＧＦＲを阻止するためにいくつかの戦略が提案されている。これらのアプローチはＨＧＦ拮抗剤、ＨＧＦ中和抗体、ＨＧＦＲおとり、ＨＧＦＲの小分子ＡＴＰ結合部位阻害剤またはゲルダナマイシン、ＳＨ２ドメインポリペプチド及びリボザイム（１２でチェックされる）のような小分子の使用を含んでいる。
【０００４】
発明の要約
本発明は腫瘍により影響を受けた対象における腫瘍及び／または転移の治療において、並びにインビボ、またはインビトロのいずれかで腫瘍細胞を検知する診断用装置において肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）の細胞外領域に対して指向されるモノクローナル抗体の使用に関する。
【０００５】
このように、本発明の目的は、薬物の調製のため、腫瘍及び腫瘍により被る場所への転移の治療のため及びインビボまたはインビトロのいずれかにおいて腫瘍細胞を検知する診断用装置のために、i）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体、ii）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含むフラグメント及び／またはiii）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域または相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含む一般的に操作された抗体を使用するもので、そのうち抗Ｍｅｔモノクローナル抗体−抗ＭＥＴ−Ｒと称する−は先端バイオテクノロジーセンター（ＡＢＣ）、細胞系統コレクション研究所（ＩＣＬＣ）、受託番号ＩＣＬＣ ＰＤ ０５００６をもつイタリア、ジェノバ、ラルゴ ロザンナ ベンツィ １０、ＧＭＰにおけるＳ．Ｓ． Ｂａｎｃａ Ｃｅｌｌｕｌｅ ｅ Ｃｏｌｔｕｒｅ、により寄託された融合細胞系統によって産生される。
【０００６】
本発明の他の目的は、腫瘍に罹っている対象における腫瘍及び転移の治療のための薬剤の調製のための、融合細胞系統ＩＣＬＣ ＰＤ０５００６によって産生される抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域またはＣＤＲｓをコードしているヌクレオチド配列の少なくとも部分を含むベクターの使用である。
【０００７】
本発明の他の目的は、ｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体、ｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含むフラグメント及び／またはｉｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域またはＣＤＲｓを含む遺伝子操作により得られた抗体並びに少なくとも１つのキナーゼ阻害剤の、腫瘍及び／または転移の治療に同時に、別々に、連続的に使用するための混合調合物としての使用である。
【０００８】
本発明の他の目的は、腫瘍及び／または転移の予防及び／または治療における薬理学的に有効である化合物の同定のために、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）の細胞外ドメインの少なくとも一つの部分に結合することができる化合物をスクリーニングする方法である。
【０００９】
本発明の他の目的は、インビボ、またはインビトロのいずれかで腫瘍細胞を検知する診断用ツールとして用いるように抗Ｍｅｔ−Ｒ、それらのフラグメント及び／または抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体のエピトープ領域またはＣＤＲｓを含む遺伝子操作により得られた抗体の使用である。
【００１０】
本発明によれば、これらの目的は、本発明に関してここに提供された技術的な説明に不可欠な部分である下記の特許請求の範囲に記載した方法によって達成される。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１
抗Ｍｅｔ−ＲはＨＧＦＲ活性化及びシグナル伝達を減じる。（Ａ）ＨＧＦＲ活性化の評価。ＧＴＬ１６細胞を所定時間抗ＭＥＴ−Ｒに曝した。ＨＧＦＲは細胞溶解物から免疫沈降され、そしてウェスタンブロットによって指示された抗体で調べた抗Ｍｅｔ−Ｒ処置により、バンド密度の定量化により示されているように、受容体のダウンレギュレーションよりももっとはっきりと受容体活性化を減少させる結果となった。（Ｂ）ＨＧＦＲシグナルの分析。細胞をＶＳＶ−Ｇまたは抗ＭＥＴ−Ｒのいずれかで前処置し、そして所定の時間ＨＧＦで刺激した。Ａｋｔリン酸化を全細胞溶解物中で評価した。上部のパネルに示されるように抗Ｍｅｔ−Ｒは基底及びＨＧＦ誘導性のＡｋｔ活性化の両者を減少させた。
図２
抗Ｍｅｔ−Ｒはインビトロにおける癌細胞の形質転換された表現型を阻害する。（Ａ）ＧＬＴ１６細胞の足場非依存性増殖。前処理された細胞を０．５％アガーに播種した。細胞を抗ＭＥＴ−ＲまたはＶＳＶ−Ｇ抗体の所定の量の存在において維持し、そして１０日後増殖したコロニーを染色した。足場非依存性増殖は抗ＭＥＴ−Ｒの少しの服用量でも徹底して阻害された。（Ｂ）浸潤アッセイ。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ β４をマトリゲル被覆トランスウェル容器に播種する前に、所定の抗体を用いて２４時間前処理した。低いほうの容器を、ＤＭＥＭ２％ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍｌＨＧＦで満たした。２４時間後、遊走した細胞を染色し、カウントした。ＨＧＦの応答における浸潤性能力は刺激されていない細胞と比較して向上するように発現する。示されるように抗Ｍｅｔ−Ｒ治療により細胞の浸潤が著しく減少した。
図３
抗Ｍｅｔ−Ｒはインビボ（Ａ、Ｂ）の腫瘍形成アッセイにおける癌細胞の形質転換された表現型を阻害する。ヌードマウスの皮下に１．５×１０６ＧＴＬ１６細胞を注入した。腫瘍が出現した後、同じサイズの腫瘍が示されたマウスを選抜し、ＶＳＶ−Ｇまたは抗ＭＥＴ−Ｒのいずれかの２μｇ／ｇｒを週２回生体内原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）に注入した。腫瘍の体積を異なる時点で測定した（Ａ）。示されるように、人間の腫瘍細胞を移植されたヌードマウスにおいて抗ＭＥＴ−Ｒは腫瘍増殖を弱めた。マウスは治療の８週間後に屠殺され、腫瘍の重量を測定した（Ｂ）抗Ｍｅｔ−Ｒの治療により、対照マウスよりも著しく腫瘍が小さくなった（ｐ＜０．０５）。（Ｃ）ＨＧＦＲ活性化の評価。ＶＳＶ−Ｇ（パネルＡ）、または抗ＭＥＴ−Ｒ（パネルＢ）で処置されたマウスからの腫瘍切片を抗−ヒトのリン酸−ＨＧＦＲで染色した。
腫瘍の免疫化学的分析により抗ＭＥＴ−Ｒで処置されたマウスにおいて、活性化ＨＧＦＲのレベルが強く低下したことが明らかとなった。
図４
抗Ｍｅｔ−Ｒ治療はインビボでの腫瘍の進行を妨げる。ヌードマウスの皮下に２．５×１０６ＭＤＡ−ＭＢ−４３５β４細胞を接種した。腫瘍の増殖を無処置のマウス（Ａ）と以下で処置されたマウスを用いて評価した：１０μｇ／ｇｒ ＶＳＶ−Ｇを投与されたＩＰ（Ｂ）、１０μｇ／ｇｒ抗ＭＥＴ−Ｒ ＩＰ（Ｃ）、１０μｇ／ｇｒ抗ＭＥＴ−Ｒ ＩＰ（Ｄ）、及び２μｇ／ｇｒ抗ＭＥＴ−Ｒ ＩＳ（Ｅ）。図（Ｋ）で示すように、抗ＭＥＴ−Ｒはヒト腫瘍細胞を移植されたヌードマウスにおいて腫瘍の増殖を阻害した。左のパネルで示されるように、抗ヒトリン酸−ＨＧＦＲの免疫化学的染色を腫瘍の断片上で実施した。強いＨＧＦＲ活性化は無処置マウス（Ｆ）と支配抗体で処置されたマウス（Ｇ）の両者で起こっていた。抗ＭＥＴ−Ｒの投与により腫瘍増殖の阻害と平行してＨＧＦＲの阻害を引き起こす結果となった。（Ｌ）肺転移の分析。転移は、ヘマトキシリン／エオシン染色の後、肺部の微細な観察によって数えられた。転移数の服用に依存する減少は抗ＭＥＴ−Ｒ治療を受けているマウスに明らかであった。（Ｍ−Ｎ）腫瘍血管新生の評価。腫瘍組織学的切片上の免疫蛍光染色は抗−マウスＣＤ３１抗体で実施された。血管の数及び面積は蛍光顕微鏡検査によって評価された。図示のとおり、血管の数及びサイズの両者は抗ＭＥＴ−Ｒ処置に応じて減少された。
図５
抗ＭＥＴ−ＲはＨＧＦＲのダウンレギュレーションを誘導する。ＧＴＬ１６細胞（Ａ）及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５ β４（Ｂ）は示された時間、抗ＭＥＴ−Ｒで処置された。全細胞溶解物の等量をウェスタンブロット法のために処理し、抗ＨＧＦＲ（上のパネル）または付加対照として、抗−Ｈｓｐ７０（下のパネル）抗体で調査した。図示のとおり、抗ＭＥＴ−Ｒは、過剰発現細胞（ＧＴＬ１６）及びＨＧＦＲ（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ β４）の正常レベルを表している細胞の両者においてＨＧＦＲのダウンレギュレーションを誘導することができた。（Ｃ）細胞表面におけるＨＧＦＲの細胞蛍光測定法による定量化。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ β４細胞を培地だけ（黒いバー）またはＨＧＦ（灰色のバー）または抗ＭＥＴ−Ｒ（白いバー）で培養した。示された時点で、細胞を抗−エキストラＨＧＦＲ抗体（ａｎｔｉ−ｅｘｔｒａ ＨＧＦＲ Ａｂ）（Ｄ０２４）で染色した。図示のとおり、抗ＭＥＴ−Ｒは３０時間の処置の後、最大限の縮小で効率的に表面のＨＧＦＲの量を減らすことができた。
図６
抗体−誘導及びリガンド−依存ダウンレギュレーションは、異なる経路をたどる。（Ａ）ＨＧＦまたは抗ＭＥＴ−Ｒによる処置の前に、ＨｅＬａ（上部パネル）及びＧＴＬ１６（下部パネル）細胞をラクタシスチン（ｌａｃｔ）またはコンカナマイシン（ｃｏｎｃ）のいずれかまたは両者で２時間前処理した。ＨＧＦＲダウンレギュレーションを全細胞溶解物上で評価した。プロテアソームの存在において、リガンド−誘導ＨＧＦＲのダウンレギュレーション損なわれたが、一方抗体−誘導はそうではなかった。この状態において、細胞内部分（抗−内Ｍｅｔ）に対して指向される抗体によって唯一発見され得る６０Ｋｄ切片（矢印）は細胞内に蓄積された。さらに、抗−ユビキチン抗体（Ｂ、上部パネル）でプローブすることによって、プロテアソームの分解に関係付けられる分子が予想されるように、このフラグメントはユビキチン部分でタグが付けられたことが示された。
図７
抗ＭＥＴ−Ｒはタンパク質分解性のＨＧＦＲの切断及び細胞外ドメイン（外部ドメイン）の脱落を誘導する。（Ａ）ＧＴＬ１６細胞を代謝的に３５Ｓメチオニン及び３５Ｓシステインで標識し、それから４時間でＨＧＦまたは抗ＭＥＴ−Ｒを用いて処理した。上澄みを集め、細胞外ドメインに対して向けられる抗ＨＧＦＲ抗体で免疫沈降した。ゲルは非還元（上部パネル）または還元（下部パネル）の条件下で走った。還元剤がない場合、ＨＧＦＲのα及びβ鎖は複合体として遊走する一方、β−メルカプトエタノールの存在下において２つのバンドは別々に走った。図に示すように、ＨＧＦではなく、抗ＭＥＴ−ＲはＨＧＦＲ外部ドメインの脱落を誘導することができた。（Ｂ）抗ＭＥＴ−Ｒは内皮細胞でまた脱落している外部ドメインを誘導する。ＨＵＶＥＣ細胞を示された時間抗体に曝した。培地を集め、ＨＧＦＲβ鎖の細胞外部分を認識している抗体を用いて免疫沈降した。同じ抗−エキストラＨＧＦＲ（ａｎｔｉ−ｅｘｔｒａ ＨＧＦＲ）を用いてウェスタンブロットにより調べた。（Ｃ、Ｄ）ＨＧＦＲの脱落は用量と時間に依存する。細胞は抗ＭＥＴ−Ｒ（Ｃ）の増加量または異なる時間（Ｄ）に刺激された。培地は（Ｂ）で処理した。
図８
ＨＧＦＲの脱落のためにシグナル伝達の活性化は必要とされない。Ｃｏｓ−７細胞に異なるＨＧＦＲ変異体を形質移入し４８時間後、４時間抗ＭＥＴ−Ｒで処理した。全細胞溶解物と条件培地の等量をウェスタンブロッティングのために処理した。示したとおり抗Ｍｅｔ−Ｒはダウンレギュレーション及びすべてのＨＧＦＲ変異体の外部ドメイン脱落を誘導することができた。ＨＧＦＲ ＫＤ＝ＨＧＦＲキナーゼデッド、キナーゼ活性の欠如；ＨＧＦＲダブル＝２つのドッキングチロシン１３４９、１３５６が欠如し、そしてシグナルトランスデューサーを補充することができないＨＧＦＲ変異体；ＨＧＦＲ−ＧＦＰ＝全細胞内部分がＧＦＰ配列に置換されたＨＧＦＲ変異体。
図９
ＨＧＦＲ脱落外部ドメインは「おとり（ｄｅｃｏｙ）」として振舞う抗Ｍｅｔ−Ｒで前処理された細胞は培地においてＨＧＦＲ外部ドメイン（Ｍｅｔ ｅｃｔｏ）の存在または非存在のいずれにおいてもＨＧＦで刺激された。示すとおり、脱落ＨＧＦＲ外部ドメインはＡｋｔ活性化を損ない、そして「おとり」として振舞った。
図１０
遺伝子導入を媒介されたレンチウイルスベクターによって遺伝子上に修飾された細胞は抗ＭＥＴ−Ｒを発現する。
（Ａ）双方向性レンチウイルスベクター（統合化形）の概略図は抗ＭＥＴ−Ｒを表したものである；ＬＴＲ：ＨＩＶ−１末端反復配列；Ｕ３領域はＲ領域から位置−１８で削除される。ＳＤ：スプライス供与。ＳＡ：スプライス受容体。ＰｏｌｙＡ ＳＶ４０：サルウイルス４０のポリアデニル化。Ｃｔｅ：恒常性輸送要素はサルのマソン−ファイザーウイルスに由来した。ＰｍｉｎＣＭＶ：最小プロモーターはサイトメガロウイルスに由来した。ｈＰＧＫ：ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子のヒトプロモーター。ＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節因子。ＦＬＡＧ Ｔａｇ：３回繰り返されたＤＹＫＤＤＤＫエピトープをコードしている配列。Ｈｉｓ Ｔａｇ：７ヒスチジン残基をコードしている配列。
（Ｂ）抗ＭＥＴ−Ｒ ｃＤＮＡｓを保有しているレンチウイルスベクターで形質導入された２つの代表細胞系から集められた無血清培養上清（それぞれ７５μｌのサンプル）のウェスタンブロット解析。サンプルは還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、そして対応するフィルターは抗マウスＩｇでプローブされた。
（Ｃ）抗ＭＥＴ−Ｒ ｃＤＮＡｓを保有しているレンチウイルスベクターで形質導入された細胞系のパネルから由来した培養上清における抗ＭＥＴ−Ｒの定量化を報告している表。
図１１
組み換え抗ＭＥＴ−Ｒ結合はＭｅｔの細胞外ドメインと高い結合性をもって結合する。（Ａ）異なる源（融合細胞または遺伝子上で修飾されたカルシノーマ細胞系）に由来された抗ＭＥＴ−Ｒで免疫沈降されたＭｅｔ受容体を含む細胞溶解物のウェスタンブロット。免疫沈降は１から細胞培養上清で保温しているＳｅｐｈ．Ｐｒｏｔ．Ｇで実行された：無関係なＭＡｂを生じている融合細胞；２ 抗ＭＥＴ−Ｒ ＭＡｂを生じている２つの融合細胞；３ 抗Ｍｅｔ−Ｒ ＭＡｂのｃＤＮＡｓを保有しているレンチウイルスベクターで感染されたＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞 ４：感染していないＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞。サンプルを還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして対応するフィルターを受容体のＣ末端領域に対して向けられる抗Ｍｅｔ抗体でプローブした。（Ｂ）抗ＭＥＴ−Ｒ及び組み換え抗ＭＥＴ−ＲのＭｅｔ受容体の細胞外ドメインに対する結合アッセイ。ヒトＩｇ（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）に由来するＦｃドメインに融合した精製されたＭＥＴ細胞外ドメインで被覆された９６ウェルプレートを精製された抗ＭＥＴ−Ｒまたは組み換え抗ＭＥＴ−Ｒ（０から５，５ｎＭまで）の増加する濃度で培養した。抗体を結合した抗マウスＩｇ−ＨＲＰを使うことによって結合曲線が明らかとなった。結合の特異性を制御するためにＦｃ−Ｒｏｎ（ヒトＩｇのＦｃドメインをＲｏｎ受容体の細胞外ドメインに融合して得られたキメラタンパク質、Ｍｅｔ受容体系統に属するタンパク質）で被覆されたウェルを使って同じアッセイを試みた。
図１２
組み換え抗ＭＥＴ−ＲはＨＧＦＲのタンパク質分解性の切断及び細胞外ドメイン（外部ドメイン）の脱落を誘導する。結腸直腸癌由来の細胞系であるＨＣＴ−１６を精製された抗ＭＥＴ−Ｒ（Ａ）または組み換え抗ＭＥＴ−Ｒ（Ｂ）の示された量で、２４時間の無血清条件で培養した。全細胞溶解物（上部パネル）及び細胞培養上清（下部パネル）をウェスタンブロットに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。細胞の成熟Ｍｅｔ（ｐ１４５）型の減少及び培養上清のＭｅｔ外部ドメイン（ｐ８０）の同時増加を、Ｍｅｔβ鎖の細胞外部分に位置したドメインであることを認識するＤＬ−２１抗Ｍｅｔ ｍＡｂを用いてフィルターをプローブしてモニターした。
図１３
抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターを用いた形質導入はインビトロ及びインビボにおける癌細胞の形質転換された表現型を制御する。（Ａ）足場非依存性増殖アッセイ抗Ｍｅｔ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターで形質導入された（抗ＭＥＴ−Ｒ）またはされていない（対照、ＷＴ）ＨＣＴ−１１６細胞を０．５％の寒天に播種した。細胞を２％ＦＣＳ＋８０ｎｇ／ｍｌＨＧＦで補充された培養で維持した。１４日後コロニーを数えた；代表的なウェルを上欄に示す；グラフの下にコロニーの数（３通りから算出される）を表している。（Ｂ）浸潤アッセイ抗Ｍｅｔ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターを用いて形質導入された（抗ＭＥＴ−Ｒ）またはされていない（対照、ＷＴ）のＨＣＴ−１１６細胞をマトリゲルで被覆したトランスウェルの容器上にのせた。下方容器を２％ＦＢＳ＋８０ｎｇ／ｍｌＨＧＦ培地で満たした。２４時間後フィルターの下方部分に付着した細胞の数を数えた。写真は代表的なフィルターのフィールドである。（Ｃ）インビボにおける腫瘍潜時。抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターで形質導入された（抗ＭＥＴ−Ｒ）またはされていない（対照、ＷＴ）ＨＣＴ−１１６細胞を胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に注入した（３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ、ｎ＝６それぞれのグループ）。腫瘍体積をノギスを用いて２日おきに評価した。腫瘍体積が１５ｍｍを超えたとき、マウスを腫瘍存在が陽性であると考えた。（Ｄ）インビボにおける腫瘍増殖。抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターで形質導入された（抗ＭＥＴ−Ｒ）またはされていない（対照、ＷＴ）ＨＣＴ−１１６細胞を胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に注入した（３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ、ｎ＝６それぞれのグループ）。腫瘍増殖の動態について腫瘍体積をノギスで３日おきに測定することで評価した。６５日目でマウスをすべて屠殺した。
図１４
抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターの直接的な内部腫瘍送達は腫瘍増殖を阻害した。ＨＣＴ−１１６細胞（４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）を胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に注入した。腫瘍体積が１０ｍｍの大きさになったときレンチウイルスベクター粒子（１μｇのｐ２４／マウス）を０日目と３日目に内部腫瘤に投与した。１つのグループ（ＣＴＲＬ）ＧＦＰをコードしているベクター粒子を受容する一方、他のグループは抗ＭＥＴ−Ｒ（抗ＭＥｔ−Ｒ）をコードしているベクター粒子を受容した。腫瘍増殖の動態について腫瘍体積をノギスを用いて３日おきに測定することで評価した。
図１５
抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているプラスミドのマップ。
図１６
抗Ｍｅｔ−Ｒ ＦＬＡＧ−Ｈｉｓをコードしているプラスミドのマップ。
図１７
ＨＧＦＲ（Ｍｅｔ外部ドメイン）の外部細胞部分に由来するドメインの模式図。
図１８
抗Ｍｅｔ−ＲはＩＰＴｓ領域に位置するエピトープを特異的に認識する。ｍｙｃ−タグを付けたおとりＭｅｔ、ｍｙｃ−タグを付けたＳＥＭＡ ＰＳＩ及びｍｙｃ−タグを付けたＰＳＩ ＩＰＴ１−４をコードしているレンチウイルスベクター粒子で形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５の条件培地を抗ＭＥＴ−Ｒ抗体で免疫沈降し、そしてビオチン化抗−ｍｙｃ抗体を使ってウェスタンブロットにより検出した（右側パネル）。条件培地の等量をタンパク質発現の対照としてロードした（左側パネル）。ＣＴＲＬ：空のレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地。おとりＭｅｔ：全細胞外ドメインを発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地。ＰＳＩ−ＩＰＴ：ＨＧＦＲのＰＳＩ、ＩＰＴ−１、ＩＰＴ−２、ＩＰＴ−３、ＩＰＴ−４ドメインを発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地。ＳＥＭＡ−ＰＳＩ：ＨＧＦＲのＳｅｍａ及びＰＳＩドメインを発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地。右側に分子量がＫＤで示されている。
図１９
抗Ｍｅｔ−ＲはＩＰＴ−４領域に位置するエピトープを認識する。標識されたＩＰＴ−１、ＩＰＴ−２、ＩＰＴ−３、ＩＰＴ−４ドメインのすべてを発現しているレンチウイルスベクター粒子で形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の細胞溶解物を抗ＭＥＴ−Ｒ抗体で免疫沈降し、そして抗−フラッグ抗体を使ってウェスタンブロットにより検出した（左側パネル）；タンパク質発現の対照として、細胞溶解物の同量を抗−フラッグ抗体で免疫沈降し、同じ抗−フラッグ抗体を用いてウェスタンブロットにより検出した（右側パネル）。ＣＴＲＬ：空のレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。ＩＰＴ１：ＨＧＦＲのＩＰＴ−１領域を発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。ＩＰＴ２：ＨＧＦＲのＩＰＴ−２領域を発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。ＩＰＴ３：ＨＧＦＲのＩＰＴ−３領域を発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。ＩＰＴ４：ＨＧＦＲのＩＰＴ−４領域を発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。右側ＫＤにおける分子量が示されている。
図２０
抗Ｍｅｔ−Ｒはインタクト細胞においてＨＧＦ受容体を特異的に染色する。パネルＡ：抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体を用いた流動細胞計測法により分析されたＧＴＬ−１６の特性。細線：イソタイプのＣＴＲＬ抗体で培養されたＧＴＬ−１６；太線：抗Ｍｅｔ−Ｒで培養されたＧＴＬ−１６。ＭＦＩ：平均蛍光強度。パネルＣ：蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８を用いて接合されたヤギ抗−マウスＩｇによって明らかにされた抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体を用いて標識されたＧＴＬ−１６細胞の免疫蛍光分析。パネルＢ：抗−マウスＩｇ／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８のみで標識されたＧＴＬ−１６細胞。（最初の拡大率、×６３）
図２１
抗Ｍｅｔ−Ｒ重鎖の核酸（ａ）とアミノ酸（ｂ）配列。ＣＤＲ領域はヌクレオチドとアミノ酸配列の両者に下線が引かれている。
図２２
抗ＭＥＴ−Ｒ軽鎖の核酸（ａ）とアミノ酸（ｂ）配列。ＣＤＲ領域はヌクレオチドとアミノ酸配列の両者に下線が引かれている。
【００１２】
発明の詳細な説明
ＭＥＴ原癌遺伝子によってコードされている肝細胞増殖因子受容体は、活性化と同時に、「浸潤性の腫瘍」として知られる生物学的反応の複雑な範囲を誘導するチロシンキナーゼ受容体である（８）。これは細胞増殖の誘導と配位、転移、分化及び残存を意味する。生理的条件下で、胚発生の間、浸潤性増殖プログラムは臓器発生で中心的な役割を担うが、癌で制御が解かれたとき腫瘍の進行と転移に寄与する（１３）。
【００１３】
いくつかの癌遺伝型は生殖細胞系のＭＥＴ遺伝子のミスセンス変異が原因であり（９、１０）、また予後が悪いことにしばしば相関する固形腫瘍の大部分で不適当なＨＧＦＲの活性化が見られる（１４）などのように、ヒト腫瘍におけるＨＧＦＲの関与が現在確固として樹立されている。ヒトの癌で最も頻繁な変異は、受容体の過剰発現（１５）により構造性の二量化が起こり、またリガンド不在でさえも受容体が活性化することである（１６）。さらなるＨＧＦＲ発現は、（ｉ）ＭＥＴが腫瘍性細胞に肝転移を選択的優位に与える大腸腫瘍において遺伝子の増幅、（ｉｉ）Ｒａｓ、Ｒｅｔ及びＥｔｓ（１７、１８）のように他の癌遺伝子によって誘導される増強された転写、（ｉｉｉ）低酸素−活性化型転写が原因の可能性があり、この場合、受容体の高い量が細胞をＨＧＦに過敏化し腫瘍の浸潤を促進する（１９）。
【００１４】
チロシンキナーゼ受容体（ＲＴＫｓ）を干渉するため、２つの戦略が臨床診療において現在つかわれている：（ｉ）チロシンキナーゼ活性を阻害している小分子を用いた処置；（ｉｉ）受容体の活性化を干渉している抗体を用いた処置。
【００１５】
本発明は腫瘍治療での抗ＨＧＦＲ抗体の使用に関するものであり、特に抗ＭＥＴ−Ｒと呼ばれる抗Ｍｅｔモノクローナル抗体の使用に関するものであり、驚くべきことに、受容体のダウンレギュレーションを誘導することができるということがわかった、受託番号ＰＤ０５００６としてＩＣＬＣに寄託された融合細胞によって産生される。
【００１６】
一つの実施態様において、本発明は、腫瘍を患っている患者の腫瘍及び転移の治療のための薬剤の調製のために、モノクローナル抗体抗ＭＥＴ−Ｒを使用することを含む。
【００１７】
さらなる実施態様において、本発明は、インビボまたはインビトロのいずれかで腫瘍性細胞を検知する診断装置の製造のために抗ＭＥＴ−Ｒ抗体を使用することに関する。
【００１８】
抗Ｍｅｔ−Ｒは、ＨＧＦＲの細胞外ドメインに特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である（２０）。このモノクローナル抗体は肝細胞増殖因子（運動性、増殖、細胞生存、浸潤、管形成及び血管新生）によって誘導されたすべての生物学的影響を引き起こすというわけではないが、しかし、運動性のみを誘導する。さらに、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の恒常的発現を上方制御するが、しかし、長期間ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体を誘導及び維持することはできない。このｍＡｂは二価のｍＡｂに完全に依存し、受容体の二量化を必要とする受容体リン酸化を活性化する。
【００１９】
この抗体の作用薬能力は、その治療能力を正当化するには、本質的には、十分ではない。実際、発明者が調べた異なる抗ＭＥＴ−Ｒモノクローナル抗体（ＤＯ−２４）は、効果的な受容体のダウンレギュレーションを誘導することはできず、また受容体の細胞外部分の脱落を促進しない。
【００２０】
抗Ｍｅｔ−ＲはＨＧＦＲとＨＧＦの相互作用を妨げないが、実施例４に示し、図５で議論されているように、ＨＧＦＲのダウンレギュレーションを効果的に促進する。この相互作用はＨＧＦＲに仲介されたシグナル伝達の阻害、そして特に、抗アポトーシス応答に含まれることで知られるＡｋｔ経路の阻害に繋がる。
【００２１】
以下に記す結果から明らかなように、抗ＭＥＴ−Ｒによるインビトロでの処置は、足場非依存性様式（実施例２及び図２を参照）、足場の欠如によるアポトーシスからの回避を必要とする性質で増殖するための細胞能力の機能障害を引き起こす結果となることを発明者は証明した。さらに、インビボにおいて、実施例３に詳述するように、抗ＭＥＴ−Ｒで処置された動物において、腫瘍が、増殖率の重要な変化なしでアポトーシスの増殖率を示すことを本発明者らは観察した。一方、抗体に対する応答における細胞増殖特性の修正についてはインビトロやインビボのいずれにおいても発明者は観察せず、ＭＡＰＫ経路の活性化において抗ＭＥＴ−Ｒの阻害効果の欠如と一致している。異なる経路を活性化するためのＨＧＦＲの能力の解離は新規ではなく、異なるＨＧＦＲ変異体（２１）とＨＧＦＲ部分的作用薬（２２）の応答ですでに示されている。
【００２２】
抗体−誘導ＨＧＦＲダウンレギュレーションは受容体の細胞外部分の脱落を含む。外部ドメイン脱落は、膜タンパク質の細胞外ドメインが細胞表面からタンパク分解により遊離する過程であり、したがって細胞は、環境刺激に応答して表面を急激に変化させ、可溶性制御因子を生じる。本発明者は、実施例６及び７において抗ＭＥＴ−Ｒの活性化の証拠を示している。
【００２３】
本出願において発明者は、抗ＭＥＴ−Ｒが、ヌードマウスに移植された癌細胞から腫瘍の増殖と突発性転移の形成を阻害するというようなインビボで活性があるという証拠を、特に実施例３で、提供している。この実験は、癌細胞及び微小環境の両者で抗体の活性によりこれらの効果が引き起こされることを示唆している。実際、内皮細胞はＨＧＦＲ（２４）を発現しており抗Ｍｅｔ−Ｒがこの種の細胞でもまたＨＧＦＲの脱落を誘導することを証明した（データは示されない）。一次性腫瘍の新血管新生は腫瘍増殖及び転移両者にとって絶対の必要条件であり、ＨＧＦが強力な血管新生因子（２４）であることが確固として樹立されている。さらに、ＨＧＦＲ活性化において、ＶＥＧＦの遊離と他の血管新生因子の増加が引き起こる（４８−４９−４０）。このように、血管新生における効果は、腫瘍細胞でＭｅｔ機能が阻害されることが腫瘍からそのような因子の遊離を阻害するというように、間接的であり得る。本発明の発明者は、抗ＭＥＴ−Ｒで処置した後、微小環境の血管の数の減少による、腫瘍内血管新生の重要な縮小を観察した。
【００２４】
抗体に長時間曝した後、明らかな病理学的変化を示さなかったというように、宿主細胞の抗ＭＥＴ−Ｒの活性が、脾臓、骨髄、肝臓、心臓、骨及び腎臓のような異なる器官の機能性に影響を及ぼさなかったことは価値に値しない。したがって、正常及び腫瘍性細胞の両者においてＨＧＦ−Ｒを認識することにもかかわらず、抗ＭＥＴ−ＲはＨＧＦ−Ｒの過剰発現を検知し、細胞の生存能力への変化を誘導する能力を示す。
【００２５】
結論として、この結果は、ＨＧＦＲの抗ＭＥＴ−Ｒによって誘導されたダウンレギュレーションが免疫療法及び腫瘍を患った患者の腫瘍の治療及び転移の予防における更なる方法を提供することができる医薬組成物である抗ＭＥＴ−Ｒまたはそのフラグメントの使用のための候補メカニズムであることを示唆している。
【００２６】
その上、抗Ｍｅｔ−Ｒは、インビボまたはインビトロの両者において腫瘍細胞を検知するために、たとえば適した標的を用いて抗ＭＥＴ−Ｒをラベルすることによって、診断用ツールとして使用されることができる。
【００２７】
本発明に従って動物における従来の方法により、または好ましくは遺伝子工学技術によって、抗ＭＥＴ−Ｒを産生することができる。
【００２８】
本発明によるモノクローナル抗体抗ＭＥＴ−Ｒの使用は、遺伝子工学的ヒト化抗体及び適した診断用マーカーで標識された抗体の使用を含むことを目的としている。遺伝子工学的ヒト化抗体及びそれらの作成のための方法は当該分野で知られている。参考文献２５を参照。
【００２９】
抗Ｍｅｔ−Ｒの使用もまた、エピトープ結合領域または相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを含むタンパク質のような、そのエピトープ結合領域を有するフラグメントの使用を含む。従来のフラグメントは、特にタンパク質分解による切断によって産生されるが、組み換えＤＮＡ技術によってだけでなく、液体または固相合成のような化学合成によって産生されることもできる。
【００３０】
抗Ｍｅｔ−Ｒとそのフラグメントは、送達が薬輸送の従来の方法を使って達成される可溶性タンパク質の形で、好ましくは医薬組成物で使用される。抗体抗ＭＥＴ−Ｒ及び／またはそのフラグメントを含む医薬組成物の投与は、当業者に知られた方法によって達成される。例えば、化合物は患者に注射されるか注入される水溶液として投与される。適当な投薬量の決定は患者の年齢及び体重を含む多くの症例に特異的な要因に依存し、当業者の専門知識の範囲内の通例の実験を含む。
【００３１】
本発明の他の態様は、腫瘍に苦しむ患者の腫瘍細胞のインビボまたはインビトロでの検知のための適した診断用マーカーを用いて標識されたモノクローナル抗体抗ＭＥＴ−Ｒを含む医薬組成物の製造を含む。
【００３２】
本発明は、最小のコアプロモーター（ｍｉｎＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）をヒトのホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子の効率的なプロモーターの上流に逆方向に連結することによって得られる合成プロモーター及びモノクローナル抗体抗ＭＥＴ−Ｒの少なくとも部分をコードしているＤＮＡを含むＤＮＡベクターの製造を包含する。ベクターに含まれるＤＮＡ配列は抗ＭＥＴ−Ｒの軽鎖及び／または重鎖をコードしている；ＤＮＡ配列において保守的な置換基並びに５’または３’末端の両者でタグ配列の付加によって修飾された配列もまた本発明によって包含される。抗ＭＥＴ−Ｒの軽鎖及び重鎖をコードしているヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１及び配列番号２に示される。
【００３３】
さらに、本発明者はタグ配列を抗ＭＥＴ−Ｒ重鎖に付加している重鎖を修飾した（配列番号３）。この配列はＮｉｃｈｅｌカラムを用いてＭＡｂを精製することができ、抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ）によって特異的に認められる。
【００３４】
本発明のＤＮＡベクターの産生は当該分野で知られたさまざまな方法によって達成され得るが、産生を実施例１０で例証する。
【００３５】
その他の実施態様において、本発明は、当該分野における腫瘍及び転移の治療のための医薬の調製のために、モノクローナル抗体抗ＭＥＴ−Ｒのエピトープ結合領域をコードしているＤＮＡを含むＤＮＡベクターを使用することを含む。本発明におけるＤＮＡベクターの送達は遺伝子治療の既知の方法を使用することによって達成され得る。例えば参考文献（１０）に示される。
【００３６】
本発明の更なる実施態様において、腫瘍治療において同時、別々、または連続した使用に対する混合された調製として、抗体抗ＭＥＴ−Ｒ及び／またはそのフラグメント及びキナーゼ阻害剤を含む製品を含む。本発明において有利に使用され得るキナーゼ阻害剤の例は、Ｋ２５２Ａスタウロスポリン類似体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ．；３６）；ＰＨＡ−６６５７５２（３Ｚ）−５−［（２，６−ジクロロベンジル）スルホニル］−３−［（３，５−ジメチル−４−{［（２Ｒ）−２−ピロリジン−１−イル］カルボニル}−１Ｈ−ピロール−２−イル）メチレン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（３４）；ＳＵ１１２７４［（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−（{３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］１Ｈ−ピロール−２−イル}メチレン）−Ｎ−メチル−２−オキソインドールイン−５−スルホンアミド］（３７，３８，３５）；ＳＵ１１２７１［（３Ｚ）−５−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イルスルホニル）−３−（{３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル}メチレン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン］（３８）；ＳＵ１１６０６［（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−{［３，５−ジメチル−４−（３−モルフォリン−４−イルプロピル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン}−Ｎ−メチル−２−オキソインドールイン−５−スルホンアミド］（３８）である。
【００３７】
発明者は、実際、抗ＭＥＴ−Ｒによって活性化した阻害メカニズムがＨＧＦＲチロシンキナーゼ活性を必要としないことを認めた。この特徴は治療的なアプローチにおいて関連性のある優位性を意味する。臨床診療において、実際、標的分子に対する影響を向上させるために異なる薬を併用することは頻繁にある。ＨＧＦＲの場合、抗体とともにキナーゼ阻害剤を併用することが可能であり、ＨＧＦＲ活性化とレベルの両者の働きが発揮される。これは、腫瘍の増殖及び浸潤性転移性表現型の取得の両者を防ぐ目的で、Ｍｅｔを過剰発現している腫瘍における標的治療の治療有効性を強化すると思われる。
【００３８】
抗体である抗ＭＥＴ−Ｒ及び本発明による生産物のそのフラグメントは上述したように産生される。本発明による併用に使われるキナーゼ阻害剤は従来の化学合成または遺伝子工学技術によって産生され得る。
【００３９】
更なる実施態様において、本発明は、肝細胞増殖因子受容体の細胞外ドメインの少なくとも一部分に結合可能な化合物のスクリーニング方法を含むもので、そのうちこれらの化合物は肝細胞増殖因子受容体に対する拮抗作用の活性を有し、かつ腫瘍及び／または転移の予防及び／または処置において薬理活性である。特に、これらの化合物は肝細胞増殖因子のダウンレギュレーションを誘導するか、または肝細胞増殖因子の細胞外ドメインの少なくとも一部分を脱落させることができる。
【００４０】
本発明は実施例に制限されないものとして、望ましい実施態様に関して記載されたものである。
【００４１】
抗体、阻害剤及び他の試薬
モノクローナル抗ＨＧＦＲ抗ＭＥＴ−Ｒは（２０）にはじめて記載された。免疫沈降及びウェスタンブロット解析のために使用された他の抗体は：抗ＨＧＦＲ抗体ＤＯ２４及びＤＬ２１（２０に記載したＨＧＦＲ細胞外ドメインであると認識されている）；ホスホチロシンＰＹ２０（形質導入研究室）、抗ユビキチン（Ｂａｂｃｏ）、抗ＨＳＰ７０（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）、抗ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３、細胞シグナルテクノロジー）、抗Ａｋｔ（サンタクルーズバイオテクノロジー）、抗ＨＧＦＲ細胞間ドメイン（Ｃ１２、サンタクルーズバイオテクノロジー）である。免疫組織化学的染色は以下のものとともに実施された：抗ヒトホスホ−ＨＧＦＲ（細胞シグナル）及び抗マウスＣＤ３１抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。インビトロ及びインビボでの実験のために抗小泡性口内炎ウイルス抗体（ＶＳＶ−Ｇ、シグマ）がコントロールとして使用された。ラクタシスチン及びコンカナマイシンはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。
【００４２】
抗ＭＥＴ−Ｒヌクレオチド及びアミノ酸配列
配列番号１及び図２１ａに対応する抗ＭＥＴ−Ｒ重鎖ヌクレオチド配列の翻訳は図２１ｂ及び配列番号６に示されている。
【００４３】
図２１ａ及び図２１ｂ中、ＣＤＲ領域に対応するヌクレオチド及びアミノ酸配列に下線を引いている；それらのアミノ酸配列は：ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＹＴＦＴＳＹＷ（配列番号８）；ＣＤＲ−Ｈ２：ＩＮＰＳＳＧＲＴ（配列番号９）；ＣＤＲ−Ｈ３：ＡＳＲＧＹ（配列番号１０）。
【００４４】
配列番号２及び図２２ａに対応する抗ＭＥＴ−Ｒ軽鎖ヌクレオチド配列の翻訳は図２２ｂ及び配列番号７に示されている。
【００４５】
図２２ａ及び図２２ｂ中、ＣＤＲ領域に対応するヌクレオチド及びアミノ酸配列に下線を引いている；それらのアミノ酸配列は：ＣＤＲ−Ｌ１：ＱＳＶＤＹＤＧＧＳＹ（配列番号１１）；ＣＤＲ−Ｌ２：ＡＡＳ（配列番号１２）；ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＱＳＹＥＤＰＬＴ（配列番号１３）。
【００４６】
レンチウイルスベクターの製品のための２９３Ｔ細胞の一過性の形質導入
形質移入のおよそ２４時間前に２９３Ｔ細胞６．０×１０６個を１５ｃｍシャーレに播種した。形質移入の２時間前に培地にＩＭＤＭ２２ｍｌを加えて、熱不活性化ＦＢＳ（１０％）、ペニシリン（２５Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（２５Ｕ／ｍｌ）及びグルタミン（１％）を補充した。形質移入のためのプラスミドＤＮＡｍｉｘは以下を加えることによって準備された：ＥＮＶプラスミド（ＶＳＶ−Ｇ）、９μｇ；ＰＡＣＫＡＧＩＮＧプラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ１６．２μｇ；ＲＥＶプラスミド、６．２５μｇ；ＴＲＡＮＳＦＥＲベクタープラスミド＃３３０または＃３３１、３７．５μｇ。プラスミド溶液を０．１×ＴＥ／ｄＨ２Ｏ（２：１）で最終的に１１２５μｌとした。２．５ＭのＣａＣｌ１２５μｌを加え、５分間ＲＴで放置した。次いで、フルスピードで攪拌し、２×ＨＢＳ溶液１２５０μｌを加え、その後即座に細胞培養に滴下して加えた。Ｃａｐｉで誘導されたプラスミドＤＮＡを１４−１６時間培養し、その後培地を１ｍＭのナトリウム酪酸塩（１８ｍｌ／シャーレ）を加えた新しい培地と交換した。ベクター粒子を含んでいる細胞培養上清を培地交換後に３０−３６時間かけて収集した。収集した後、上清を２５００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、０．２μｍのろ紙に通して、−８０℃で保存した。
【００４７】
レンチウイルスベクターを含む細胞上清による標的細胞の感染
１０％ＦＢＳ、グルタミンを補充したフレッシュ培地に１０５個の細胞を播種した。感染のため、上述のようにＨＩＶ−１ Ｇａｐ ｐ２４当価物のベクター粒子の最終濃度が１０ないし１５０ｎｇ／ｍｌ（ＥＬＩＳＡアッセイによる測定）で準備されたレンチウイルスベクター粒子を含む上清とともにポリブレン８μｇ／ｍｌの存在下で細胞系を培養した。１８時間後、培地を換えて細胞を増殖させた。培養が８０％までコンフルエントな状態になったとき、細胞を血清なしの培地で培養し、７２時間後抗ＭＥＴ−Ｒを含む上清を収集した。
【００４８】
ＨＧＦＲダウンレギュレーションアッセイ
細胞を１０％致死性ウシ血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。抗体及びＨＧＦによる処置はそれぞれ８０μｇ／ｍｌ及び８０ｎｇ／ｍｌの無血清培地で行われた。示したように、刺激の前に、細胞を１０μＭラクタシスチンまたは１００ｎＭコンカナマイシンで２時間予め培養した。ＨＧＦＲ分解の解析のため細胞をＬＢバッファ（２％ＳＤＳ、０．５Ｍトリス−塩酸ｐＨ＝６．８）に溶解し、そして細胞溶解物のタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて評価した。その後、等量分の全タンパク質と等量分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングによって分析した。免疫沈降実験のため、プロテアーゼ阻害剤及び１ｍＭ Ｎａ−パナジン酸の存在下で、ＥＢバッファ（２０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．４、ＭＥＤＴＡ ５ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、１０％グリセロール、１％トリトン×−１００）に細胞を溶解させた。適当な抗体による免疫沈降の後、よく洗浄した。その後、免疫沈降されたタンパク質を標準的な方法によるウェスタンブロッティングで処理した。ＥＣＬ検知システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて最終的な検知を試みた。
【００４９】
ＨＧＦＲ脱落の代謝標識化と分析
細胞を１６時間血清欠乏させ、［３５Ｓ］メチオニン［３５Ｓ］システイン（１００μＣｉ／ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．）で３０分間パルスラベルした。メチオニン及びシステインのないＤＭＥＭ培地で抗ＭＥＴ−ＲまたはＶＳＶ−ＧまたはＨＧＦのいずれかを４時間処理した。条件培地を集め抗ＨＧＦＲ細胞外抗体とともに免疫沈降に供した。免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、（２６）にすでに記載したようにオートラジオグラフィを撮った。
【００５０】
インビトロ生物学的アッセイ
足場非依存性増殖の評価のために抗Ｍｅｔ−ＲまたはＶＳＶ−Ｇのいずれかの培地で４８時間前処理した。その後、１５００個の細胞をＤＭＥＭ２％ＦＢＳ及び０．５％柔らかい寒天（ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロース、ＢＭＡ）に播種し、そして指示された量の抗体及びＨＧＦの存在下で１０日間維持した。増殖したコロニーをテトラゾリウム染色（４７）で最終的に視覚化した。浸潤アッセイをＴｒａｎｓｗｅｌｌ容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）で行った。ポリカーボネイトフィルター（８μｍポアサイズ）をマトリゲル基底膜（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の１５μｇ／ｃｍ２で被覆した。２０ｎＭの抗ＭＥＴ−ＲまたはＶＳＶ−Ｇとともに播種する前に、２４時間細胞を予め培養して抗体を処理した。５×１０４この細胞をフィルターの上方に播種し、容器の底にＨＧＦ１００ｎｇ／ｍｌを加えてＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳで培養した。４８時間後、フィルターの上方を機械的に除去した。下方に遊走した細胞を固定し、染色して数えた。ＨＧＦの刺激上に遊走した細胞の数と、遊走しなかった細胞とに振り分けることにより遊走指数を得た。
【００５１】
インビトロにおける抗Ｍｅｔ−ＲによるＨＧＦＲの標識化
流動細胞数測定のために、１０５個のＧＴＬ−１６細胞をＰＢＳ−ＥＤＴＡ０．０２５％で分離し、ＰＢＳで洗浄して、抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体の５０μｇ／ｍｌまたはアイソタイプ対照マウスＩｇの同量で１５分ＲＴの間培養した。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＦＩＴＣ接合ヤギ抗マウスＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１５μｇ／ｍｌで細胞を培養した。その後、細胞を洗浄し、ＰＢＳ−５％ＢＳＡ中に再懸濁し、流動細胞数測定（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって分析した。ＧＴＬ−１６細胞をメタノール：アセトン（３：１）中で５分間氷上で固定し、その後ＰＢＳで２％ヤギ血清で３０分間ブロックした。精製された抗Ｍｅｔ−ＲをＰＢＳ２％ヤギ血清中に２．５μｇ／ｍｌの濃度で加えて、１時間培養し、その後ＰＢＳで３回洗浄した後、結合抗ＨＧＦＲ抗体をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（分子プローブ）と抱合する抗−マウスＩｇ４μｇ／ｍｌで分離した。サンプルの分析を蛍光顕微鏡（ＤＭ−ＩＲＢ，Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｓ）にて行った。
【００５２】
インビボ実験
Ｓｗｉｓｓ ＣＤ１ バックグラウンドの６週目の免疫不全ｎｕ／ｎｕのメスのマウスの後部即腹部の皮下に、１×１０６個のＧＴＬ１６または２．５×１０６ＭＤＡ−ＭＢ−４３５β４のいずれかを播種することによってインビボ実験を行った。腫瘍の外見上、同程度の大きさの腫瘤を患ったマウスを選択し、Ｉ．Ｐ．またはＩ．Ｓ．（ＧＴＬ１６を注射したマウスの場合、Ｉ．Ｓ．のみ）のいずれかにて、抗ＭＥＴ−Ｒ及び抗ＶＳＶ−Ｇの示した量とともに週に２回播種した。処置を始めてから８週間経過後、マウスを屠殺し、腫瘍の重量を測定した。ＭＤＡ−ＭＢ４３５β４を注入したマウスにおいて、自然転移の存在を調べるために肺を分析した。リン酸化ＨＧＦＲの評価のために、抗−ホスホ−ＨＧＦＲ抗体（細胞シグナル、１：１００）を用いてパラフィンで包埋した腫瘍切片５μｍを原発腫瘍の免疫組織化学的染色した。一般的な病理学的調査のために、マソン−トリクロムプロトコル（シグマ）によるヘマトキシリン／エオシン染色の後、転移の数が肺の顕微鏡観察によって樹立された。組織−Ｔｅｋ ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ）で包埋されたサンプルについて、免疫組織化学によって腫瘍血管新生の評価をし、−８０℃で即座に凍結させた。免疫組織化学的染色のために、ラットモノクローナル抗マウスＣＤ３１抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）が使用された。
【００５３】
アポトーシスの評価
アポトーシスの形態的な評価はＫｅｒｒの基準に従って評価された。壊死病巣の近くの多数の単独壊死細胞及び虚血誘導アポトーシスの原因で、壊死の領域から遠い、少なくとも１ＨＰＦ（Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｆｉｅｌｄ＝０．６３ ｍｍ）の組織のみを信頼できるアポトーシス性の数と考えた。広範囲に及ぶ腫瘍状壊死によるケースは評価しなかった。すべてのケースを２つのカテゴリのうち１つにまとめた：１０ＨＰＦにつきアポトーシス数が１０以上またはそれ以下。
【００５４】
プロテアーゼの阻害
抗体刺激の前に、細胞を２時間下記の阻害剤で処置した：ウロキナーゼを阻害するためのアミロライド（Ｓｉｇｍａ）４ｍｌ；ＡＤＡＭ及びＺｎ−依存プロテアーゼを阻害するための１，１０−フェナントロリン（Ｓｉｇｍａ）５ｍＭ；セリン及びシステインプロテアーゼを阻害するためのアプロチニン２０μｇ／ｍｌ及びロイペプチン１００μｇ／ｍｌ、酸性プロテアーゼを阻害するためのペプスタチンＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ） １０μｇ／ｍｌ。細胞を１μＭ ＴＰＡで２４時間処置することによりＰＫＣを阻害した。
【００５５】
スクリーニング方法
本発明は、ＨＧＦまたは他の受容体作用薬の存在または不存在において、ＨＧＦＲの発現／機能／生物学的活性を調節するか、またはＨＧＦＲの細胞外ドメインの脱落を誘導するテスト化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【００５６】
テスト化合物は、好ましくは受容体細胞外部分と相互に作用してＨＧＦＲと結合する。さらに好ましくは、テスト化合物は、テスト化合物の欠如と比較して少なくともおよそ１０、好ましくはおよそ５０、さらに好ましくはおよそ７５、９０、または１００％の割合で、ＨＧＦＲで媒介される生物学的活性を減少させる。
【００５７】
テスト化合物はＨＧＦＲの発現をさらに抑制する。さらに好ましくは、テスト化合物が不存在の場合に比べて少なくともおよそ１０、好ましくはおよそ５０、さらに好ましくは７５、９０、または１００％の割合でＨＧＦＲ転写物またはタンパク質をダウンレギュレーションする。
【００５８】
テスト化合物
テスト化合物は、当該分野で既知の薬理学的な作用薬、ペプチドまたはタンパク質でもよく、または薬理学的活性を有することが知られている化合物でもよい。テスト化合物は自然に生じたもの、または研究所で設計されたものでよい。それらは微生物、動物、または植物から単離されてもよく、組み換え技術によって産生されるか、または当該分野で知られた化学的方法によって合成されてもよい。所望により、テスト化合物は当該分野で知られた生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な平行な固相または液層ライブラリー、逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー方法、「１−ビーズ、１−化合物」ライブラリー方法、及び親和性クロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー方法を含むがこれに限定されるものではない、コンビナトリアルライブラリーの方法のいくつかを使って得ることもできる。生物学的ライブラリーのアプローチはポリペプチドライブラリーに限定される、一方他の４つのアプローチはポリペプチド、非ポリペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる。
【００５９】
結合アッセイ
結合アッセイのためテスト化合物は、ＨＧＦＲ細胞外部分に結合する分子であって、該分子はＨＧＦＲの通常の生物学的活性化を妨げるような抗Ｍｅｔ−Ｒ活性化を模倣する。このような分子の例として、以下に限定されるものではないが、小分子、ペプチドまたはペプチドのような分子を含む。
【００６０】
結合アッセイにおいて、テスト化合物またはＨＧＦＲ細胞外部分のいずれかは、放射性同位元素、蛍光性、化学発光、または酵素ラベル（例えば、放射性同位元素で識別されたヨウ素、放射性同位元素で識別されたリン、フルオロフォアまたは蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能なラベルを含むことができる。ＨＧＦＲの細胞外ドメインに結合するテスト化合物の検出は、例えば、放射性物質を直接数えることによって、シンチレーション測定によって、または検出可能な化合物に適した基質の変換を決定することによって達成され得るものであって、ＨＧＦＲまたはその細胞外ドメインの部分は担体に結合しているか、または細胞によって発現されるか、当該分野でよく知られた方法に従って検知され得る。
【００６１】
機能的アッセイ
テスト化合物はＨＧＦＲの生物学的効果を減少する能力に対して試験される。このような生物学的効果は本出願で記載された機能的なアッセイを用いて決定され得る。それらは足場非依存増殖アッセイ及び浸潤アッセイ（両者は実施例２及び１１に詳述している）及びインビボでの形質転換された表現型の評価（実施例３、１１、１に詳述している）により適用される。このように、機能的アッセイは、ＨＧＦＲを発現している細胞系を用いてインビトロで行うか、またはＨＧＦＲを発現している実験的または自然に生じる腫瘍の発達を調査することが可能である動物モデルを用いてインビボで行うことができる。少なくともおよそ１０、好ましくはおよそ５０、さらに好ましくは７５、９０または１００％の割合でＨＧＦＲの生物学的活性を減少させるテスト化合物は、ＨＧＦＲ生物学的活性を減少させるための有望な薬理学的薬剤として認識される。
【００６２】
実施例
実施例１。抗Ｍｅｔ抗体抗ＭＥＴ−ＲがＨＧＦＲシグナル伝達を阻害する。
抗Ｍｅｔ−Ｒは、リガンドによる結合とは異なるエピトープであると認めるＨＧＦ受容体の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体である。このｍＡｂは部分的な作用薬として振る舞う。なぜならば、これは肝細胞増殖因子（運動性、増殖、細胞生存、浸潤、管形成及び血管新生）によって誘導されるすべての生物学的影響を引き起こすわけではなく、運動性のみを引き起こすからである。さらに、それはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性因子の構成的発現を上方制御するが、長期間ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性因子受容体の発現を誘導及び維持することはできない。このｍＡｂは、ｍＡｂの二価性に強く依存し、受容体の二量化を必要とする受容体のリン酸化を活性化する。
【００６３】
抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体が、腫瘍の過剰発現において構造的ＨＧＦ受容体の活性化を阻害するためのツールとして適当かどうかという疑問に答えるために、発明者らはまず始めに、抗体に慢性的に曝された腫瘍細胞において、その生化学的及び生物学的活性を分析した。モデルとして、発明者は、ＨＧＦＲが過剰発現され、それにしたがってオリゴマー形成され、恒常的に活性化されるという、人の胃のカルシノーマに由来するＧＴＬ１６細胞を用いた。図１Ａは、ＨＧＦＲ発現とチロシンのリン酸化における重要な縮小を示す。
【００６４】
その後、ＨＧＦＲシグナル伝達における抗体の影響を評価した。ＨＧＦＲは刺激的なＡｋｔ活性化による強力な抗アポトーシスプログラムを促進することで知られているため、発明者は抗ＭＥＴ−Ｒ治療上のＡｋｔのリン酸化のレベルを評価した。図１Ｂで示すとおり、Ａｋｔのリン酸化は、基底状態及びＨＧＦで刺激された細胞の両者で抑制された。
【００６５】
ＨＧＦＲによって活性化された他の重要な経路は、細胞増殖の刺激を含むことで知られているＭＡＰＫ経路である。発明者らは抗体で処理された細胞中のＭＡＰＫｓの活性化のレベルを調査したが、この経路の重要な抑制は観察されなかった（データは示していない）。
【００６６】
実施例２。抗Ｍｅｔ−Ｒはインビトロで癌の形質転換された表現型を抑制する。
細胞増殖及び形質転換された表現型における抗体の影響を足場依存性及び非依存性方法で増殖し、細胞外マトリックスを浸潤する細胞活性を測定することにより評価した。図２Ａに示すように、抗体治療において足場依存性条件で増殖する細胞の活性における相違は観察されなかった。
【００６７】
足場非依存性増殖は、足場の欠如によるアポトーシス、いわゆる「アノイキス」を克服する細胞の能力に強く依存する；この特徴は、通常柔らかい寒天（２８）上で増殖する細胞の能力を評価することによって分析されている。ＨＧＦＲ活性化が細胞にこの特徴を与えることができることを多くの論文が示しているので、発明者らは０．５％の寒天にＧＴＬ１６を播種し、抗ＭＥＴ−Ｒまたは対照としての無関係なアイソタイプに対応する抗体の異なる量の存在または非存在での培養を維持した。図２Ｂに示すように、ＶＳＶ−Ｇで処置された、並びに処置されていない細胞は多数のコロニーを形成することができた。逆に言えば、抗ＭＥＴ−Ｒは用量依存的様式において癌細胞の足場非依存的増殖を徹底的に阻害した。ＧＴＬ１６細胞が、構成的ＨＧＦＲ活性化によって、基礎条件でさえも柔らかい寒天でコロニーを形成することが可能であること、及び抗体がＨＧＦの存在下及び非存在下の両者においてこれらの細胞の形質転換された表現型を減らすことは興味深い。
【００６８】
細胞侵襲性を阻害する抗体の能力を評価するために、発明者らは、再構成された基底膜（２９）を浸潤することができる乳癌細胞系のＮＤＡ−ＭＢ−４３５β４について研究した。図２Ｃに示すように、インビトロにおいて抗ＭＥＴ−Ｒを用いたこれらの細胞の処置はＨＧＦに対する応答において浸潤特性の用量依存的縮小を引き起こす結果となった。
【００６９】
実施例３。抗Ｍｅｔ−Ｒはインビボにおいて形質転換された表現型を阻害する
インビボにおける腫瘍増殖に対する抗ＭＥＴ−Ｒの活性を評価するために、発明者は免疫不全のメスのマウスｎｕ／ｎｕの後側腹部の皮下にＧＴＬ１６細胞を接種した。このマウスに週に２回、抗ＭＥＴ−ＲまたはＶＳＶ−Ｇのいずれかを、生体内原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）で投与して処置した（２μｇ／ｇｒ）。注射の部位に腫瘍が出現する移植後１週間、治療を開始した：比較し得る大きさの腫瘍を患っているマウスのみに４週間治療した。すべての処置と増殖の減少が抗ＭＥＴ−Ｒで処置したマウスに観察されている間、腫瘍体積をモニターし（図３Ａ）、処置の後、マウスを死体解剖して腫瘍を切除し、秤量した。図３Ｂに示すように抗Ｍｅｔ−Ｒで処置されたマウスにおいて、腫瘍は対照よりも顕著に縮小した（ｐ＜０．０５）。アポトーシス細胞のパーセンテージがかなり上昇した間（図３Ｄ）、受容体がリン酸化された形に対して特異的抗体で染色することによって示されるように、これらの腫瘍におけるＨＧＦＲ活性化のレベルは減少した（図３Ｃ）。さらに、本発明者らは腫瘍切片をヘマトキシリン／エオシンで染色した後、アポトーシス及び有糸分裂の指数を評価した。抗ＭＥＴ−Ｒで扱われたマウスから得られた腫瘍組織でアポトーシスが増加した間、有糸分裂の数がほとんど変化しなかった（データは示さない）。
【００７０】
発明者はインビボにおける自発性転移のモデルシステムであるＭＤＡ−ＭＢ−４３５β４細胞で同じ種類の実験を行った（２９）。マウスに週に２回、抗ＭＥＴ−Ｒまたは対照抗体の異なる投与量で処置し、いずれか一方を全身的に（腹膜内に１μｇ／ｇｒまたは１０μｇ／ｇｒ）投与するかまたは腫瘍に（生体内原位置に２μｇ／ｇｒ）投与した。治療は移植した日から始まり、８週間（転移の可能性が現れる時間）行った。治療の後、マウスを死体解剖して原発腫瘍及び肺（これらの細胞が転移する確立の高い部位）の解析を行った。異なる器官（脾臓、骨髄、肝臓、心臓、骨及び肝臓）を可能性のある毒性作用を除外するために調べた。肉眼分析により抗Ｍｅｔ−Ｒ治療が主要な腫瘍集団の増殖を阻害することが示された（図４Ａ−Ｅ及びＫ）。ＨＧＦＲのチロシン−リン酸化形態であることを認識している抗体による免疫組織化学的な染色により、この場合も受容体活性化の顕著な減少が示された（図４Ｆ−Ｊ）。さらに、肺切片の顕微鏡分析によって抗Ｍｅｔ−Ｒの腫瘍内注入及び全身投与の両者が肺及び検査された器官で遠隔転移の出現を阻害したことが明らかとなった（図４Ｌ）。
【００７１】
ＨＧＦが強力な血管新生因子であり、ＨＧＦＲシグナルが腫瘍血管新生の一因となることが多くの論文で示されていたので、発明者らは抗ＭＥＴ−Ｒ処置と同時に腫瘍血管新生を分析した。これらの腫瘍について発明者らは血管（数はより少なく、大きさはより大きかった）及びそれらの分岐（図４Ｍ、Ｎ）の数の顕著な減少を見出した。発明者は、このように、処置の抗腫瘍及び抗転移効果は、腫瘍及び微環境の出芽血管における抗体の合同作用に由るものであると結論付けた。
【００７２】
実施例４。抗Ｍｅｔ−ＲはＨＧＦＲダウンレギュレーションを誘導する
抗ＭＥＴ−ＲがＨＧＦＲ活性化を阻害することができるメカニズムを研究するために、発明者は抗ＭＥＴ−ＲまたはＶＳＶ−Ｇのいずれかを用いて、ＨＧＦＲ過剰発現細胞を処置した；この実施例は多くの自然に生じる腫瘍でしばしば観察されるものと似ている。図５Ａで示されるように、発明者は、ＶＳＶ−Ｇ処置ではなく抗ＭＥＴ−Ｒ処置において、時間依存方法でＨＧＦＲの全体量が減少したことを観察した。これは抗Ｍｅｔ抗体が受容体のダウンレギュレーションを特異的に誘導することを示唆している。これらの細胞において過剰発現ＨＧＦＲ、ＨＧＦ、リガンドが受容体のダウンレギュレーションを誘導することができないということは興味深い（図６、下方パネル）。
【００７３】
発明者らは抗ＭＥＴ−Ｒ抗体がＨＧＦＲの標準レベルに発現している細胞でもまた受容体のダウンレギュレーションを引き起こすかどうかを検証した。図５Ｂの左パネルに示すように、これらの細胞もまた抗ＭＥＴ−ＲがＨＧＦＲを効果的にダウンレギュレーションした。
【００７４】
細胞膜で曝されたＨＧＦＲの抗体に誘導された縮小をＦＡＣＳ分析によって評価した。細胞の蛍光定量分析により、抗体処置が細胞表面で発現されたＨＧＦＲ量をＨＧＦそれ自体よりも高い効率で減少させたことが示された（図５Ｂ、右側パネル）。同じアッセイにおいて同様の減少がＧＴＬ１６細胞でもまた観察された（図示せず）。
【００７５】
実施例５。抗Ｍｅｔ−Ｒに誘導されたＨＧＦＲのダウンレギュレーションの分子メカニズム
リガンド依存性及び抗体誘導性のダウンレギュレーションは異なる経路を辿る。ＲＴＫｓのリガンド依存性ダウンレギュレーションは内面化、ユビキチン化、選別エンドソーム及び最終的にリソソームまたはプロテアソーム分解（３０）を含む多段階過程である。
【００７６】
抗体誘導性ＨＧＦＲダウンレギュレーションにどの分解経路が関与しているかを評価するために、発明者らは抗体刺激の前に、それぞれ特定の阻害剤コンカナマイシン及びラクタシスチンを用いて、ライソームまたはプロテアソームの活性を遮断した。驚くべきことに、プロテアソーム経路の阻害がリガンド誘導性ＨＧＦＲ分解を顕著に損なう間、抗ＭＥＴ−Ｒ処置による受容体ダウンレギュレーションに影響を及ぼさない（図６Ａ、上方パネル）。このように、抗体及びリガンドは異なる分子メカニズムを経由してＨＧＦＲダウンレギュレーションを促進することを示唆している。さらに、プロテアソームの活性が損なわれたとき、基底状態でかろうじて検出可能である６０Ｋｄのフラグメントは、抗体処置（図６Ａ、下方パネル）と同時に細胞内にかなり蓄積された。このフラグメントは、唯一抗−細胞内ＨＧＦＲ抗体とともにウェスタンブロットで検出され、そして受容体の細胞質ドメインに存在していた。さらに分子がプロテアソーム分解に関係していると予想されるように、６０Ｋｄフラグメントはユビキチン部分で標識された（図６Ｂ）。
【００７７】
受容体の細胞外ドメイン（Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）が、抗ＭＥＴ−Ｒ処置と同時に細胞溶解物で検出されなかったので、発明者らはそれが「脱落」として知られる現象である、開裂の際に細胞外部に遊離することかどうかを検証した。この減少を確認するために、発明者らは細胞培養中にＨＧＦＲ細胞外ドメインの存在を調べた。細胞に放射性３５Ｓ−システイン及び３５Ｓ−メチオニンで代謝的に標識化し、ＨＧＦまたは抗ＭＥＴ−Ｒで４時間処置した。培養液を集め、細胞外ドメインを認識している抗ＨＧＦＲ抗体で免疫沈降に供した。図７Ａに示すように、代謝的に標識化した細胞の培地から、発明者らは、１３０Ｋｄの見かけ上の分子量（細胞外αβ鎖の複合体に対応）を有する非還元条件下で走ったバンドを免疫沈降した；ゲルが還元条件下で走ったとき、複合体は８０Ｋｄ（β鎖）及び４５Ｋｄ（α鎖）の２つのバンドに分離した。ＨＧＦ刺激がこの過程を増強しない一方、受容体の脱落は抗体結合と同時に劇的に増加した。以前のデータ（１５）によると、ＨＧＦＲ細胞外ドメインの少量は細胞外環境に恒常的に遊離することが知られている。抗体−誘導性細胞外ドメイン脱落が、内皮細胞（図７Ｂ）のように、ＨＧＦＲの標準レベルを発現している細胞で観察されることを強調することは興味深い。
【００７８】
抗体の量を４時間かけて増やして細胞を処置することによって、発明者らは抗体媒介ＨＧＦＲ脱落が用量依存性であったことが観察された（図７Ｃ）。抗体誘導性ＨＧＦＲ脱落の動態解析をするために、発明者らは、細胞を同量の抗ＭＥＴ−ＲまたはＶＳＶ−Ｇのいずれかを異なる時間で刺激した。細胞外ドメインの増加レベルは抗ＭＥＴ−Ｒの培地で検出されたがＶＳＶ−Ｇで処置された細胞では検出されなかった。このことから抗体誘導性脱落は特異的でかつ時間依存性であることを示す（図７Ｄ）。
【００７９】
実施例６。抗体誘導性ＨＧＦＲ脱落は細胞表面で起こる
エンドサイトーシスがＨＧＦＲ脱落に必要かどうかを調べるために、発明者らは、クラスリン依存性エンドサイトーシスを減じて、その発現がテトラサイクリン制御システムの制御下にある、ダイナミン（Ｄｙｎ Ｋ４４Ａ）の変異体を安定に形質移入した細胞を利用した。細胞を、ダイナミン変異体の発現の結果としてエンドサイトーシスを減じるために、テトラサイクリンの存在下（Ｃｔｒ）または非存在下（Ｋ４４Ａ Ｄｙｎ）のいずれかで４８時間維持した。図７Ｄに示すように、抗体により誘導される脱落はクラスリン依存性エンドサイトーシスが抑制された細胞で減じなかった。
【００８０】
膜タンパク質の脱落により一般的に含まれるプロテアーゼはＡＤＡＭファミリーのα−セクレターゼに属する。ＨＧＦＲ脱落に関する酵素の同定を試みるために、キレート剤１，１０−フェナントロリン、ＡＤＡＭｓ及びＺｎ−依存性プロテアーゼの阻害剤を抗体処置の前に細胞に加えた。この条件において、受容体脱落は影響を受けなかった（データは示さない）。これにより、ＨＧＦＲ細胞外ドメインのタンパク質分解がα−セクレターゼによってではなくＺｎ−非依存性プロテアーゼによって媒介されることが示された。
【００８１】
ＨＧＦＲがブロット凝固に含まれる遺伝子に転写的に関係していることは知られているので、発明者らもまた血液凝固システムのプロテアーゼが細胞外ドメイン脱落の原因で起こるかどうかを調べた。しかしながら、アプロチニンとともにそれらの阻害剤は抗体誘導性ＨＧＦＲ細胞外ドメイン脱落を変化させなかったことから、この工程におけるプロ凝血原（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）の役割は除外された（データは示さない）。他の阻害剤（アミロライド、ペプスタチンＡ、ロイペプチン）のパネルを用いて、発明者らもまたウロキナーゼ、酸性プロテアーゼ、セリン及びシステインプロテアーゼ（データは示さない）のような他で知られるヒドロラーゼの関与を除外した。さらに、この酵素の高用量（１μＭ）及び長期間にわたる処置（２４時間）でホルボールエステルＴＰＡを用いた阻害が細胞外ドメイン脱落を減少しなかった（データは示さない）ので、発明者らは細胞外ドメインの脱落はＰＫＣａの活性化に非依存性であることを証明した。
【００８２】
すべてが適切なポジティブコントロールとともに行われた実験のこのセットは、ＨＧＦＲ細胞外ドメイン脱落に起因する酵素が受容体脱落を明らかに含むプロテアーゼのリスト外のものであったことを示している。
【００８３】
実施例７。ＨＧＦＲ活性化は抗体誘導性脱落を必要としない。
発明者が以前に報告しているように、エンドフィリン、ＣＩＮ８５及びＣｂ１を含む三量体複合体はＨＧＦＲ（３２）のリガンド依存性ダウンレギュレーションを媒介する。この複合体は、ＨＧＦＲ活性化と同時に受容体に補充され、エンドサイトーシス、ユビキチン化及び受容体分解を促進する。受容体活性化及びシグナル伝達が抗体依存性下方調節及び脱落を必要とするかどうかを調べるために、発明者らは抗ＭＥＴ−Ｒの能力を促進させてさまざまなＨＧＦＲ変異体をダウンレギュレーションさせた。発明者らはＨＧＦＲ対照または以下の変異体のいずれかのＣＯＳ−７細胞で強制発現させた：ｉ）ＡＴＰ結合ポケットでＬｙｓ−Ａｌａ置換に起因して、チロシンキナーゼ活性の「死」受容体欠如をコードしているＭＥＴ ＫＤ、ｉｉ）シグナル伝達を結合チロシンＹ１３４９、Ｙ１３５６が欠如しているＨＧＦＲをコードしているＭＥＴ「二重」、（ｉｉｉ）受容体の細胞内ドメイン全体をコードしている配列がＧＦＰ配列によって置換された優性陰性変異体。形質移入の４８時間後、細胞を３時間抗ＭＥＴ−Ｒで処置した。細胞抽出物及び細胞外培養をウェスタンブロットによって分析した。予想外に、抗ＭＥＴ−Ｒはすべての変異体でダウンレギュレーションを引き起こし、そしてＨＧＦＲ脱落を誘導することが可能であった（図８）。この実験は抗体依存性ＨＧＦ受容体ダウンレギュレーションが受容体キナーゼ活性化または細胞質のトランスデューサーの補充を必要としないこと、及びすべての細胞内ドメインがこの工程に不要であることを示唆している。これは、抗体及びリガンドが異なるダウンレギュレーションメカニズムを活性化することをさらに確証している。
【００８４】
実施例８。細胞外ドメインを脱落するＨＧＦＲは「おとり」として機能する
遺伝子操作により得られたＨＧＦＲの細胞外ドメインが優性陰性の「おとり」分子（３３）として機能するということが示されているので、発明者らはＨＧＦＲシグナルを阻害している脱落外部ドメインの能力を試験した。抗ＭＥＴ−ＲまたはＶＳＶ−Ｇで７２時間前処理した細胞を培地でＨＧＦＲ細胞外ドメインの存在下（図９、４−６レーン）または非存在下（７−９レーン）のいずれかでＨＧＦを用いて、異なる時間で刺激した。示したとおり、ＨＧＦＲ細胞外ドメインの存在下において、ＨＧＦに引き起こされるＡｋｔリン酸化はかなり損なわれた。したがって、おとり（３３）のような脱落フラグメントはＨＧＦ結合の競争相手としてかつＨＧＦＲ活性化を妨げる優性陰性分子として働くという考えが支持された。
【００８５】
実施例９。作用薬抗ＭＥＴ−Ｒ抗体ＤＯ−２４は細胞外ドメイン脱落を誘導しない。
この抗体の作用薬としての能力はその治療的な活性を正当化するには、本質的には、十分でない。実際、我々が調べた異なる抗ＭＥＴ−Ｒ分子抗体（ＤＯ−２４）は受容体の細胞外部分の脱落を促進しないが受容体を完全に活性化することができる。
【００８６】
実施例１０。レンチウイルスを介する遺伝子導入手段による抗ＭＥＴ−Ｒの産生
発明者らは抗ＭＥＴ−Ｒ重または軽鎖配列を双方向性レンチウイルスベクター（５１）に挿入した（図１０Ａ、１５及び１６）。このレンチウイルスベクターは、最小の中心的なプロモーター（ｍｉｎＣＭＶプロモーター）をｈＰＧＫプロモーター（５１）の上流及び逆配位に連結して得られる合成プロモーター（ＡＣＣＴＧＧＧＴＴ、配列番号４）の存在により２つの分離ｃＤＮＡの協調的な発現を引き起こす。この合成プロモーターは転写性の活性を両方向に駆動することができる抗Ｍｅｔ−Ｒをコードしている２つのｃＤＮＡを一方はアンチセンス配位（軽鎖）の上流にかつセンス配位（重鎖）の下流に置くことによって、２つの独立したｍＲＮＡを協調的に産生することが可能である。発明者らは、開示したように、２９３Ｔ細胞の一過性の遺伝子移入を用いてベクター粒子を産生した。そして、標的細胞のゲノムを永久的に修飾するために、発明者らはベクター粒子を含む上清の細胞系に由来したカルシノーマのパネルを遺伝子導入した。遺伝子導入の後、細胞を結成欠乏状態にし、細胞培養上清を集めるために７２時間培養した。抗ＭＥＴ−Ｒ抗体の存在をウェスタンブロット解析によって評価し（図１０Ｂ）そして抗ＭＥＴ−Ｒ定量をＥＬＩＳＡによって行った（図１０Ｃ）。すべてのトランデュースされた細胞系は培養上清で分泌された抗ＭＥＴ−Ｒ抗体を産生した。抗体の産生は、細胞系の分析に依存して０．２−６μｇ／ｍｌの範囲で変化した。組み換え体抗ＭＥＴ−Ｒ特異性を免疫沈降アッセイによって制御した（図１１Ａ）し、一方結合性をＥＬＩＳＡアッセイによって評価した（図１１Ｂ）。組み換え体抗ＭＥＴ−ＲはＭｅｔ受容体を融合細胞によって従来法により産生された抗ＭＥＴ−Ｒによって得られたものと同じ範囲の結合性をもって特異的に認識することができる。さらに、抗ＭＥＴ−Ｒが融合細胞によって産生されるように、組み換え体抗ＭＥＴ−ＲはＭｅｔタンパク質分解及び細胞外ドメインの脱落を誘導することができた（図１２）。
【００８７】
実施例１１。抗Ｍｅｔ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターを用いた形質導入はインビトロ及びインビボにおける癌細胞の形質転換された表現型を阻害する。
発明者らは抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターを用いてＨＣＴ−１１６細胞を形質導入した（２５ｎｇ ｐ２４／ｍｌ）。遺伝子導入された細胞を、対照細胞と比較して形質転換された表現型についてインビトロ及びインビボにおける腫瘍形成の足場非依存性増殖及び浸潤特性を分析することによって試験した。足場非依存性増殖について、発明者らは０．５％の寒天上に抗ＭＥＴ−Ｒを産生する細胞及び対照としての対照細胞を播種し、培地上で１５日維持されたコロニーを数えた。形質導入された細胞は、足場非依存性増殖の能力において阻害され、コロニーの数が減少し、大きさも対照で産生されたコロニーと比較して小さかった（図１３Ａ）。細胞浸潤を試験するために、発明者らは細胞が再構成された基底膜を浸潤する能力を分析した。図１３Ｂに示すように、形質導入された細胞はそれらの浸潤特性の減少を示した。発明者らは、胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に注入している抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターで形質導入された細胞のインビボにおける腫瘍形成を調べた。図１３Ｃ及びＤで示されるデータは形質導入された細胞が腫瘍潜伏のようにインビボでの腫瘍形成の特性が損なわれ、腫瘍増殖が対照に比べて阻害されたことを示した。
【００８８】
実施例１２。抗Ｍｅｔ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターの腫瘍内への直接投与は腫瘍増殖を阻害する。
抗ＭＥＴ−Ｒ遺伝子導入の有効性を正式な証拠を得るために、発明者らは、抗体をコードしているｃＤＮＡｓを有するレンチウイルスベクター粒子をヌードマウスの側腹部にＨＣＴ−１１６細胞の皮下注射によって予め処置した腫瘍に直接投与した。抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているベクターで処置した腫瘍は、対照ベクターで処置した腫瘍と比較してより遅い成長率を示した（図１４）。
【００８９】
実施例１３。Ｍｅｔ細胞外ドメイン上の抗ＭＥＴ−Ｒ結合部位。
抗ＭＥＴ−Ｒによって認識されるエピトープをマップするために、免疫沈降実験は肝細胞増殖因子受容体（Ｍｅｔ細胞外ドメインとしても知られる）の異なる細胞外ドメインを使って行われた（図１７）：
−おとりＭｅｔ（アミノ酸１−９３２）：膜貫通型ドメインの前に切断されたヒトＭｅｔの全細胞外領域に対応する可溶性組み換え型タンパク質（Ｍｉｃｈｉｅｌｉら、０００４）；
−ＳＥＭＡ ＰＳＩ（アミノ酸１−５６２）：ＳＥＭＡドメイン（アミノ酸１−５１５）（Ｓｔａｍｏｓら、２００４；Ｇｈｅｒａｒｄｉら、２００４）及びＰＳＩ領域（アミノ酸５１６−５６２）（Ｋｏｚｌｏｖら、２００４）を含むおとりＭｅｔの切断された形。
−ＰＳＩ ＩＰＴ（アミノ酸１−２４；５１６−９３２）：ＰＳＩ領域（アミノ酸５１６−５６２）及び４ＩＰＴドメイン（アミノ酸５６３−９３２）（Ｂｏｒｋら、１９９９；Ｇｈｅｒａｒｄｉら、２００４）に融合された内因性リーダー配列（アミノ酸１−２４）を含んでいるおとりＭｅｔの切断された形。
【００９０】
ポリヒスチジン標識及びＭｙｃ−エピトープ標識はそれぞれの分子のＣ−末端に加えられた。
【００９１】
おとりＭｅｔ配列はジーンバンク受託番号Ｘ５４５５９（Ｇｉｏｒｄａｎｏら、１９９１）にコードされた配列に由来した；この配列は正確にプロセスされて、膜に位置するチロシンキナーゼタンパク質をコードするヒトＭｅｔ遺伝子の主な転写物に対応する。
【００９２】
他の論文はジーンバンク受託番号Ｊ０２９５８（Ｐａｒｋら、１９８７）をコードしている配列について言及している；この番号はヌクレオチド２２６４からヌクレオチド２３１８の場所に５４ｂｐの挿入を含む選択的にスプライシングされたマイナー転写物に対応している。この転写物は正確にプロセスされず、膜に位置しないチロシンキナーゼタンパク質をコードしている（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、１９９１）。この配列によるとＭｅｔの細胞外領域はアミノ酸１−９５０に対応し、そして第３のＩＰＴドメイン（ＩＰＴ３）は１８のアミノ酸の挿入を含んでいる。
【００９３】
表１は配列Ｘ５４５５９及びＪ０２９５８によるＭｅｔの異なる領域の位置を要約している。
【００９４】
【表１】
【００９５】
設計された分子のｃＤＮＡをｐＲＲＬ．ｓｉｎ．ＰＰＴ．ＣＭＶ．Ｗｐｒｅレンチウイルスベクター（Ｆｏｌｌｅｎｚｉら、２０００）にサブクローンした；組み換え体レンチウイルス粒子をラージスケールで産生し、ヒト腫瘍細胞系（Ｍｉｃｈｉｅｌｉら、２００４）を形質導入するのに使用した。
【００９６】
ｍｙｃで標識されたおとりＭｅｔ、ＳＥＭＡ ＰＳＩ及びＰＳＩ ＩＰＴで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５の条件培地を抗ＭＥＴ−Ｒ抗体で免疫沈降し、そしてビオチン化された抗ｍｙｃ抗体を使ってウェスタンブロットにより検出した（図１８、右側パネル）。同量の条件培地をタンパク質発現のための対照として加え（図１８、左側パネル）、この対照は空のレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地である。図１８の右側パネルに示すように抗Ｍｅｔ−ＲはおとりＭｅｔ及びＰＳＩ−ＩＰＴを免疫沈降することができるが、ＳＥＭＡ−ＰＳＩを免疫沈降することはできない。したがって、それはＩＰＴ領域（Ｂｏｒｋら、１９９９）にエピトープを認めた。
【００９７】
抗体抗ＭＥＴ−Ｒによって認められるエピトープをさらに詳細にマップするため、免疫沈降実験を単一ＩＰＴ領域（Ｂｏｒｋら、１９９９）を用いて行った。それぞれのＩＰＴはＩＰＴ１（アミノ酸５６３−６５６）またはＩＰＴ２（アミノ酸６５７−７４１）またはＩＰＴ３（アミノ酸７４２−８３８）またはＩＰＴ４（アミノ酸８３９−９３２）に融合した内因性のリーダー配列（アミノ酸１−２４）を含むＰＳＩ−ＩＰＴの切断された形である。
【００９８】
ポリヒスチジン標識及びフラッグーエピトープ標識はそれぞれの分子のＣ−末端に加えられた。以前に報告され、組み換え体レンチウイルス粒子がヒト腫瘍細胞系を遺伝子導入するために使用されたように、設計された分子のｃＤＮＡは同じレンチウイルスベクターにサブクローンされた。
【００９９】
これらすべての組み換え体タンパク質は可溶性因子であるが、ＩＰＴ２は形質導入細胞の条件培地に分泌されない。この理由のために、免疫沈降実験は細胞溶解物上で実行された。
【０１００】
フラッグで標識された単一ＩＰＴで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５の細胞溶解物を抗ＭＥＴ−Ｒ抗体で免疫沈降し、抗フラッグ抗体を用いてウェスタンブロットによって検出した（図１９、左側パネル）；タンパク質発現の対照として、同量の細胞溶解物を抗フラッグ抗体で免疫沈降し、そして同じ抗フラッグ抗体を使ってウェスタンブロットにより検出した（図１９、右側パネル）。
【０１０１】
左側のパネルに示すように、抗ＭＥＴ−ＲはＩＰＴ４を免疫沈降させることは可能であるが、他の３つのＩＰＴドメインを免疫沈降させることはできない。抗Ｍｅｔ−ＲはＭＥＴ細胞外領域のＩＰＴ４ドメインを含むエピトープを認識する。
【０１０２】
実施例１４。抗ＭＥＴ−ＲはＦＡＣＳ分析または免疫蛍光分析によって両者とも無処置の細胞でＨＧＦＲを認識した
ヒトの胃癌細胞系であるＧＴＬ−１６を抗ＭＥＴ−Ｒ抗体で培養した。流動細胞計測法によって分析されたＧＴＬ−１６の特性は、抗ＭＥＴ−ＲがＨＧＦＲを発現している細胞を特異的に染色することができることを明らかにした。抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体で標識された細胞における蛍光強度は対照細胞に関して増加した（図２０、パネルＡ）。固定した後、免疫蛍光分析をするためにＧＴＬ−１６細胞を抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体で培養した。染色によりＭｅｔ受容体に対応する細胞表面に特異的に標識化することを明らかにした（図２０、パネルＢ、Ｃ）。
【０１０３】
当然、発明の原則が同じことを維持する間、実施例によって開示され、例示されることに関して、添付された特許請求の範囲に定義されたように本発明の範囲からの逸脱することなく、構成及び実施例の詳細は広く変動するかもしれない。
【０１０４】
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【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】抗Ｍｅｔ−ＲはＨＧＦＲ活性化及びシグナル伝達を減じる。（Ａ）ＨＧＦＲ活性化の評価。ＧＴＬ１６細胞を所定時間抗ＭＥＴ−Ｒに曝した。ＨＧＦＲは細胞溶解物から免疫沈降され、そしてウェスタンブロットによって指示された抗体で調べた抗Ｍｅｔ−Ｒ処置により、バンド密度の定量化により示されているように、受容体のダウンレギュレーションよりももっとはっきりと受容体活性化を減少させる結果となった。（Ｂ）ＨＧＦＲシグナルの分析。細胞をＶＳＶ−Ｇまたは抗ＭＥＴ−Ｒのいずれかで前処置し、そして所定の時間ＨＧＦで刺激した。Ａｋｔリン酸化を全細胞溶解物中で評価した。上部のパネルに示されるように抗Ｍｅｔ−Ｒは基底及びＨＧＦ誘導性のＡｋｔ活性化の両者を減少させた。
【図２】抗Ｍｅｔ−Ｒはインビトロにおける癌細胞の形質転換された表現型を阻害する。（Ａ）ＧＬＴ１６細胞の足場非依存性増殖。前処理された細胞を０．５％アガーに播種した。細胞を抗ＭＥＴ−ＲまたはＶＳＶ−Ｇ抗体の所定の量の存在において維持し、そして１０日後増殖したコロニーを染色した。足場非依存性増殖は抗ＭＥＴ−Ｒの少しの服用量でも徹底して阻害された。（Ｂ）浸潤アッセイ。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ β４をマトリゲル被覆トランスウェル容器に播種する前に、所定の抗体を用いて２４時間前処理した。低いほうの容器を、ＤＭＥＭ２％ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍｌＨＧＦで満たした。２４時間後、遊走した細胞を染色し、カウントした。ＨＧＦの応答における浸潤性能力は刺激されていない細胞と比較して向上するように発現する。示されるように抗Ｍｅｔ−Ｒ治療により細胞の浸潤が著しく減少した。
【図３】抗Ｍｅｔ−Ｒはインビボ（Ａ、Ｂ）の腫瘍形成アッセイにおける癌細胞の形質転換された表現型を阻害する。ヌードマウスの皮下に１．５×１０６ＧＴＬ１６細胞を注入した。腫瘍が出現した後、同じサイズの腫瘍が示されたマウスを選抜し、ＶＳＶ−Ｇまたは抗ＭＥＴ−Ｒのいずれかの２μｇ／ｇｒを週２回生体内原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）に注入した。腫瘍の体積を異なる時点で測定した（Ａ）。示されるように、人間の腫瘍細胞を移植されたヌードマウスにおいて抗ＭＥＴ−Ｒは腫瘍増殖を弱めた。マウスは治療の８週間後に屠殺され、腫瘍の重量を測定した（Ｂ）抗Ｍｅｔ−Ｒの治療により、対照マウスよりも著しく腫瘍が小さくなった（ｐ＜０．０５）。（Ｃ）ＨＧＦＲ活性化の評価。ＶＳＶ−Ｇ（パネルＡ）、または抗ＭＥＴ−Ｒ（パネルＢ）で処置されたマウスからの腫瘍切片を抗−ヒトのリン酸−ＨＧＦＲで染色した。 腫瘍の免疫化学的分析により抗ＭＥＴ−Ｒで処置されたマウスにおいて、活性化ＨＧＦＲのレベルが強く低下したことが明らかとなった。
【図４】抗Ｍｅｔ−Ｒ治療はインビボでの腫瘍の進行を妨げる。ヌードマウスの皮下に２．５×１０６ＭＤＡ−ＭＢ−４３５β４細胞を接種した。腫瘍の増殖を無処置のマウス（Ａ）と以下で処置されたマウスを用いて評価した：１０μｇ／ｇｒ ＶＳＶ−Ｇを投与されたＩＰ（Ｂ）、１０μｇ／ｇｒ抗ＭＥＴ−Ｒ ＩＰ（Ｃ）、１０μｇ／ｇｒ抗ＭＥＴ−Ｒ ＩＰ（Ｄ）、及び２μｇ／ｇｒ抗ＭＥＴ−Ｒ ＩＳ（Ｅ）。図（Ｋ）で示すように、抗ＭＥＴ−Ｒはヒト腫瘍細胞を移植されたヌードマウスにおいて腫瘍の増殖を阻害した。左のパネルで示されるように、抗ヒトリン酸−ＨＧＦＲの免疫化学的染色を腫瘍の断片上で実施した。強いＨＧＦＲ活性化は無処置マウス（Ｆ）と支配抗体で処置されたマウス（Ｇ）の両者で起こっていた。抗ＭＥＴ−Ｒの投与により腫瘍増殖の阻害と平行してＨＧＦＲの阻害を引き起こす結果となった。（Ｌ）肺転移の分析。転移は、ヘマトキシリン／エオシン染色の後、肺部の微細な観察によって数えられた。転移数の服用に依存する減少は抗ＭＥＴ−Ｒ治療を受けているマウスに明らかであった。（Ｍ−Ｎ）腫瘍血管新生の評価。腫瘍組織学的切片上の免疫蛍光染色は抗−マウスＣＤ３１抗体で実施された。血管の数及び面積は蛍光顕微鏡検査によって評価された。図示のとおり、血管の数及びサイズの両者は抗ＭＥＴ−Ｒ処置に応じて減少された。
【図５】抗ＭＥＴ−ＲはＨＧＦＲのダウンレギュレーションを誘導する。ＧＴＬ１６細胞（Ａ）及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５ β４（Ｂ）は示された時間、抗ＭＥＴ−Ｒで処置された。全細胞溶解物の等量をウェスタンブロット法のために処理し、抗ＨＧＦＲ（上のパネル）または付加対照として、抗−Ｈｓｐ７０（下のパネル）抗体で調査した。図示のとおり、抗ＭＥＴ−Ｒは、過剰発現細胞（ＧＴＬ１６）及びＨＧＦＲ（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ β４）の正常レベルを表している細胞の両者においてＨＧＦＲのダウンレギュレーションを誘導することができた。（Ｃ）細胞表面におけるＨＧＦＲの細胞蛍光測定法による定量化。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ β４細胞を培地だけ（黒いバー）またはＨＧＦ（灰色のバー）または抗ＭＥＴ−Ｒ（白いバー）で培養した。示された時点で、細胞を抗−エキストラＨＧＦＲ抗体（ａｎｔｉ−ｅｘｔｒａ ＨＧＦＲ Ａｂ）（Ｄ０２４）で染色した。図示のとおり、抗ＭＥＴ−Ｒは３０時間の処置の後、最大限の縮小で効率的に表面のＨＧＦＲの量を減らすことができた。
【図６】抗体−誘導及びリガンド−依存ダウンレギュレーションは、異なる経路をたどる。（Ａ）ＨＧＦまたは抗ＭＥＴ−Ｒによる処置の前に、ＨｅＬａ（上部パネル）及びＧＴＬ１６（下部パネル）細胞をラクタシスチン（ｌａｃｔ）またはコンカナマイシン（ｃｏｎｃ）のいずれかまたは両者で２時間前処理した。ＨＧＦＲダウンレギュレーションを全細胞溶解物上で評価した。プロテアソームの存在において、リガンド−誘導ＨＧＦＲのダウンレギュレーション損なわれたが、一方抗体−誘導はそうではなかった。この状態において、細胞内部分（抗−内Ｍｅｔ）に対して指向される抗体によって唯一発見され得る６０Ｋｄ切片（矢印）は細胞内に蓄積された。さらに、抗−ユビキチン抗体（Ｂ、上部パネル）でプローブすることによって、プロテアソームの分解に関係付けられる分子が予想されるように、このフラグメントはユビキチン部分でタグが付けられたことが示された。
【図７】抗ＭＥＴ−Ｒはタンパク質分解性のＨＧＦＲの切断及び細胞外ドメイン（外部ドメイン）の脱落を誘導する。（Ａ）ＧＴＬ１６細胞を代謝的に３５Ｓメチオニン及び３５Ｓシステインで標識し、それから４時間でＨＧＦまたは抗ＭＥＴ−Ｒを用いて処理した。上澄みを集め、細胞外ドメインに対して向けられる抗ＨＧＦＲ抗体で免疫沈降した。ゲルは非還元（上部パネル）または還元（下部パネル）の条件下で走った。還元剤がない場合、ＨＧＦＲのα及びβ鎖は複合体として遊走する一方、β−メルカプトエタノールの存在下において２つのバンドは別々に走った。図に示すように、ＨＧＦではなく、抗ＭＥＴ−ＲはＨＧＦＲ外部ドメインの脱落を誘導することができた。（Ｂ）抗ＭＥＴ−Ｒは内皮細胞でまた脱落している外部ドメインを誘導する。ＨＵＶＥＣ細胞を示された時間抗体に曝した。培地を集め、ＨＧＦＲβ鎖の細胞外部分を認識している抗体を用いて免疫沈降した。同じ抗−エキストラＨＧＦＲ（ａｎｔｉ−ｅｘｔｒａ ＨＧＦＲ）を用いてウェスタンブロットにより調べた。（Ｃ、Ｄ）ＨＧＦＲの脱落は用量と時間に依存する。細胞は抗ＭＥＴ−Ｒ（Ｃ）の増加量または異なる時間（Ｄ）に刺激された。培地は（Ｂ）で処理した。
【図８】ＨＧＦＲの脱落のためにシグナル伝達の活性化は必要とされない。Ｃｏｓ−７細胞に異なるＨＧＦＲ変異体を形質移入し４８時間後、４時間抗ＭＥＴ−Ｒで処理した。全細胞溶解物と条件培地の等量をウェスタンブロッティングのために処理した。示したとおり抗Ｍｅｔ−Ｒはダウンレギュレーション及びすべてのＨＧＦＲ変異体の外部ドメイン脱落を誘導することができた。ＨＧＦＲ ＫＤ＝ＨＧＦＲキナーゼデッド、キナーゼ活性の欠如；ＨＧＦＲダブル＝２つのドッキングチロシン１３４９、１３５６が欠如し、そしてシグナルトランスデューサーを補充することができないＨＧＦＲ変異体；ＨＧＦＲ−ＧＦＰ＝全細胞内部分がＧＦＰ配列に置換されたＨＧＦＲ変異体。
【図９】ＨＧＦＲ脱落外部ドメインは「おとり（ｄｅｃｏｙ）」として振舞う抗Ｍｅｔ−Ｒで前処理された細胞は培地においてＨＧＦＲ外部ドメイン（Ｍｅｔ ｅｃｔｏ）の存在または非存在のいずれにおいてもＨＧＦで刺激された。示すとおり、脱落ＨＧＦＲ外部ドメインはＡｋｔ活性化を損ない、そして「おとり」として振舞った。
【図１０】遺伝子導入を媒介されたレンチウイルスベクターによって遺伝子上に修飾された細胞は抗ＭＥＴ−Ｒを発現する。（Ａ）双方向性レンチウイルスベクター（統合化形）の概略図は抗ＭＥＴ−Ｒを表したものである；ＬＴＲ：ＨＩＶ−１末端反復配列；Ｕ３領域はＲ領域から位置−１８で削除される。ＳＤ：スプライス供与。ＳＡ：スプライス受容体。ＰｏｌｙＡ ＳＶ４０：サルウイルス４０のポリアデニル化。Ｃｔｅ：恒常性輸送要素はサルのマソン−ファイザーウイルスに由来した。ＰｍｉｎＣＭＶ：最小プロモーターはサイトメガロウイルスに由来した。ｈＰＧＫ：ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子のヒトプロモーター。ＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節因子。ＦＬＡＧ Ｔａｇ：３回繰り返されたＤＹＫＤＤＤＫエピトープをコードしている配列。Ｈｉｓ Ｔａｇ：７ヒスチジン残基をコードしている配列。（Ｂ）抗ＭＥＴ−Ｒ ｃＤＮＡｓを保有しているレンチウイルスベクターで形質導入された２つの代表細胞系から集められた無血清培養上清（それぞれ７５μｌのサンプル）のウェスタンブロット解析。サンプルは還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、そして対応するフィルターは抗マウスＩｇでプローブされた。（Ｃ）抗ＭＥＴ−Ｒ ｃＤＮＡｓを保有しているレンチウイルスベクターで形質導入された細胞系のパネルから由来した培養上清における抗ＭＥＴ−Ｒの定量化を報告している表。
【図１１】組み換え抗ＭＥＴ−Ｒ結合はＭｅｔの細胞外ドメインと高い結合性をもって結合する。（Ａ）異なる源（融合細胞または遺伝子上で修飾されたカルシノーマ細胞系）に由来された抗ＭＥＴ−Ｒで免疫沈降されたＭｅｔ受容体を含む細胞溶解物のウェスタンブロット。免疫沈降は１から細胞培養上清で保温しているＳｅｐｈ．Ｐｒｏｔ．Ｇで実行された：無関係なＭＡｂを生じている融合細胞；２ 抗ＭＥＴ−Ｒ ＭＡｂを生じている２つの融合細胞；３ 抗Ｍｅｔ−Ｒ ＭＡｂのｃＤＮＡｓを保有しているレンチウイルスベクターで感染されたＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞 ４：感染していないＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞。サンプルを還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして対応するフィルターを受容体のＣ末端領域に対して向けられる抗Ｍｅｔ抗体でプローブした。（Ｂ）抗ＭＥＴ−Ｒ及び組み換え抗ＭＥＴ−ＲのＭｅｔ受容体の細胞外ドメインに対する結合アッセイ。ヒトＩｇ（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）に由来するＦｃドメインに融合した精製されたＭＥＴ細胞外ドメインで被覆された９６ウェルプレートを精製された抗ＭＥＴ−Ｒまたは組み換え抗ＭＥＴ−Ｒ（０から５，５ｎＭまで）の増加する濃度で培養した。抗体を結合した抗マウスＩｇ−ＨＲＰを使うことによって結合曲線が明らかとなった。結合の特異性を制御するためにＦｃ−Ｒｏｎ（ヒトＩｇのＦｃドメインをＲｏｎ受容体の細胞外ドメインに融合して得られたキメラタンパク質、Ｍｅｔ受容体系統に属するタンパク質）で被覆されたウェルを使って同じアッセイを試みた。
【図１２】組み換え抗ＭＥＴ−ＲはＨＧＦＲのタンパク質分解性の切断及び細胞外ドメイン（外部ドメイン）の脱落を誘導する。結腸直腸癌由来の細胞系であるＨＣＴ−１６を精製された抗ＭＥＴ−Ｒ（Ａ）または組み換え抗ＭＥＴ−Ｒ（Ｂ）の示された量で、２４時間の無血清条件で培養した。全細胞溶解物（上部パネル）及び細胞培養上清（下部パネル）をウェスタンブロットに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。細胞の成熟Ｍｅｔ（ｐ１４５）型の減少及び培養上清のＭｅｔ外部ドメイン（ｐ８０）の同時増加を、Ｍｅｔβ鎖の細胞外部分に位置したドメインであることを認識するＤＬ−２１抗Ｍｅｔ ｍＡｂを用いてフィルターをプローブしてモニターした。
【図１３】抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターを用いた形質導入はインビトロ及びインビボにおける癌細胞の形質転換された表現型を制御する。（Ａ）足場非依存性増殖アッセイ抗Ｍｅｔ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターで形質導入された（抗ＭＥＴ−Ｒ）またはされていない（対照、ＷＴ）ＨＣＴ−１１６細胞を０．５％の寒天に播種した。細胞を２％ＦＣＳ＋８０ｎｇ／ｍｌＨＧＦで補充された培養で維持した。１４日後コロニーを数えた；代表的なウェルを上欄に示す；グラフの下にコロニーの数（３通りから算出される）を表している。（Ｂ）浸潤アッセイ抗Ｍｅｔ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターを用いて形質導入された（抗ＭＥＴ−Ｒ）またはされていない（対照、ＷＴ）のＨＣＴ−１１６細胞をマトリゲルで被覆したトランスウェルの容器上にのせた。下方容器を２％ＦＢＳ＋８０ｎｇ／ｍｌＨＧＦ培地で満たした。２４時間後フィルターの下方部分に付着した細胞の数を数えた。写真は代表的なフィルターのフィールドである。（Ｃ）インビボにおける腫瘍潜時。抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターで形質導入された（抗ＭＥＴ−Ｒ）またはされていない（対照、ＷＴ）ＨＣＴ−１１６細胞を胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に注入した（３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ、ｎ＝６それぞれのグループ）。腫瘍体積をノギスを用いて２日おきに評価した。腫瘍体積が１５ｍｍを超えたとき、マウスを腫瘍存在が陽性であると考えた。（Ｄ）インビボにおける腫瘍増殖。抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターで形質導入された（抗ＭＥＴ−Ｒ）またはされていない（対照、ＷＴ）ＨＣＴ−１１６細胞を胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に注入した（３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ、ｎ＝６それぞれのグループ）。腫瘍増殖の動態について腫瘍体積をノギスで３日おきに測定することで評価した。６５日目でマウスをすべて屠殺した。
【図１４】抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているレンチウイルスベクターの直接的な内部腫瘍送達は腫瘍増殖を阻害した。ＨＣＴ−１１６細胞（４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）を胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に注入した。腫瘍体積が１０ｍｍの大きさになったときレンチウイルスベクター粒子（１μｇのｐ２４／マウス）を０日目と３日目に内部腫瘤に投与した。１つのグループ（ＣＴＲＬ）ＧＦＰをコードしているベクター粒子を受容する一方、他のグループは抗ＭＥＴ−Ｒ（抗ＭＥｔ−Ｒ）をコードしているベクター粒子を受容した。腫瘍増殖の動態について腫瘍体積をノギスを用いて３日おきに測定することで評価した。
【図１５】抗ＭＥＴ−Ｒをコードしているプラスミドのマップ。
【図１６】抗Ｍｅｔ−Ｒ ＦＬＡＧ−Ｈｉｓをコードしているプラスミドのマップ。
【図１７】ＨＧＦＲ（Ｍｅｔ外部ドメイン）の外部細胞部分に由来するドメインの模式図。
【図１８】抗Ｍｅｔ−ＲはＩＰＴｓ領域に位置するエピトープを特異的に認識する。ｍｙｃ−タグを付けたおとりＭｅｔ、ｍｙｃ−タグを付けたＳＥＭＡ ＰＳＩ及びｍｙｃ−タグを付けたＰＳＩ ＩＰＴ１−４をコードしているレンチウイルスベクター粒子で形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５の条件培地を抗ＭＥＴ−Ｒ抗体で免疫沈降し、そしてビオチン化抗−ｍｙｃ抗体を使ってウェスタンブロットにより検出した（右側パネル）。条件培地の等量をタンパク質発現の対照としてロードした（左側パネル）。ＣＴＲＬ：空のレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地。おとりＭｅｔ：全細胞外ドメインを発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地。ＰＳＩ−ＩＰＴ：ＨＧＦＲのＰＳＩ、ＩＰＴ−１、ＩＰＴ−２、ＩＰＴ−３、ＩＰＴ−４ドメインを発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地。ＳＥＭＡ−ＰＳＩ：ＨＧＦＲのＳｅｍａ及びＰＳＩドメインを発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の条件培地。右側に分子量がＫＤで示されている。
【図１９】抗Ｍｅｔ−ＲはＩＰＴ−４領域に位置するエピトープを認識する。標識されたＩＰＴ−１、ＩＰＴ−２、ＩＰＴ−３、ＩＰＴ−４ドメインのすべてを発現しているレンチウイルスベクター粒子で形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の細胞溶解物を抗ＭＥＴ−Ｒ抗体で免疫沈降し、そして抗−フラッグ抗体を使ってウェスタンブロットにより検出した（左側パネル）；タンパク質発現の対照として、細胞溶解物の同量を抗−フラッグ抗体で免疫沈降し、同じ抗−フラッグ抗体を用いてウェスタンブロットにより検出した（右側パネル）。ＣＴＲＬ：空のレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。ＩＰＴ１：ＨＧＦＲのＩＰＴ−１領域を発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。ＩＰＴ２：ＨＧＦＲのＩＰＴ−２領域を発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。ＩＰＴ３：ＨＧＦＲのＩＰＴ−３領域を発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。ＩＰＴ４：ＨＧＦＲのＩＰＴ−４領域を発現しているレンチウイルスベクターで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞からの細胞溶解物。右側ＫＤにおける分子量が示されている。
【図２０】抗Ｍｅｔ−Ｒはインタクト細胞においてＨＧＦ受容体を特異的に染色する。パネルＡ：抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体を用いた流動細胞計測法により分析されたＧＴＬ−１６の特性。細線：イソタイプのＣＴＲＬ抗体で培養されたＧＴＬ−１６；太線：抗Ｍｅｔ−Ｒで培養されたＧＴＬ−１６。ＭＦＩ：平均蛍光強度。パネルＣ：蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８を用いて接合されたヤギ抗−マウスＩｇによって明らかにされた抗Ｍｅｔ−Ｒ抗体を用いて標識されたＧＴＬ−１６細胞の免疫蛍光分析。パネルＢ：抗−マウスＩｇ／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８のみで標識されたＧＴＬ−１６細胞。（最初の拡大率、×６３）
【図２１】抗Ｍｅｔ−Ｒ重鎖の核酸（ａ）とアミノ酸（ｂ）配列。ＣＤＲ領域はヌクレオチドとアミノ酸配列の両者に下線が引かれている。
【図２２】抗ＭＥＴ−Ｒ軽鎖の核酸（ａ）とアミノ酸（ｂ）配列。ＣＤＲ領域はヌクレオチドとアミノ酸配列の両者に下線が引かれている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を被った患者における腫瘍及び／または転移の治療のための、薬剤製造のための、ｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体、ｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含むフラグメント及び／またはｉｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含む遺伝子操作により得られたまたはヒト化抗体の、使用であって、前記抗体が融合細胞系ＩＣＬＣ ＰＤ０５００６により産生された、前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の使用。
【請求項２】
抗体、フラグメント及び／または遺伝子操作により得られた抗体が可溶性タンパク質の形態であることを特徴とする請求項１の使用。
【請求項３】
抗体及び／または遺伝子操作により得られた抗体がＤＮＡ組み換え技術、固相合成、液相合成からなるグループより選択された方法によって産生されることを特徴とする請求項１の使用。
【請求項４】
フラグメントがＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及びエピトープ結合領域を含むタンパク質からなるグループより選択されることを特徴とする請求項１の使用。
【請求項５】
フラグメントが抗体のタンパク質切断、ＤＮＡ組み換え技術、固相合成、液相合成からなるグループより選択された方法によって産生されることを特徴とする請求項１の使用。
【請求項６】
薬剤が注射によりまたは点滴により投与されることを特徴とする請求項１の使用。
【請求項７】
腫瘍が結腸直腸腫瘍及び肝臓腫瘍から選択されることを特徴とする請求項１の使用。
【請求項８】
腫瘍を被った患者における腫瘍及び／または転移の治療のための、薬剤製造のための、（ｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体、（ｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含むフラグメント、または（ｉｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含む遺伝子操作により得られたまたはヒト化抗体をコードしているヌクレオチド配列の、使用であって、抗Ｍｅｔモノクローナル抗体が融合細胞系ＩＣＬＣ ＰＤ０５００６により産生されたものである、ヌクレオチド配列の使用。
【請求項９】
ヌクレオチド配列が、少なくとも（ｉ）配列番号１及び配列番号２、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の保存的な置換が存在する配列番号１及び配列番号２に対応するヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号９（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号１０（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１２（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ３）を含むことを特徴とする請求項８の使用。
【請求項１０】
少なくとも（ｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体、（ｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体の少なくとも１つのエピトープ結合領域を含むフラグメント、または（ｉｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含む遺伝子操作により得られたまたはヒト化抗体をコードしているヌクレオチド配列を含むベクターの、腫瘍を被った対象において腫瘍及び／または転移の治療のための、薬剤の調製のための、使用であって、抗Ｍｅｔ−モノクローナル抗体が融合細胞系ＩＣＬＣ ＰＤ０５００６によって産生されたものである、ベクターの使用。
【請求項１１】
ベクターが（ｉ）配列番号１及び配列番号２、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の保存的な置換が存在する配列番号１及び配列番号２に対応するヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号９（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号１０（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１２（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ３）から選択されたヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１０の使用。
【請求項１２】
ベクターが粒子の形態であることを特徴とする請求項１０の使用。
【請求項１３】
（ｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体、（ｉｉ）エピトープ結合領域を含むフラグメント及び／または（ｉｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含む遺伝子操作により得られたまたはヒト化抗体並びに少なくとも１つのキナーゼ阻害剤を含む製品であって、腫瘍及び／または転移の治療において同時に、別々に、または連続した使用のための混合調合物であり、抗Ｍｅｔモノクローナル抗体が融合細胞系ＩＣＬＣ ＰＤ０５００６により産生されたものである製品。
【請求項１４】
抗体及び／または少なくとも１つのそのフラグメントが可溶化タンパク質であることを特徴とする請求項１３の製品。
【請求項１５】
抗体及び／または遺伝子操作により得られた抗体がＤＮＡ組み換え技術、固相合成または液相合成からなるグループより選択された方法によって産生されたことを特徴とする請求項１３の製品。
【請求項１６】
フラグメントがＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、少なくともエピトープ結合領域を含むタンパク質からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１３の製品。
【請求項１７】
フラグメントが抗体のタンパク質切断、固相合成または液相合成からなるグループから選択された方法によって産生されたことを特徴とする請求項１３の製品。
【請求項１８】
少なくとも１つのキナーゼ阻害剤がＫ２５２Ａスタウロスポリン類似体；（３Ｚ）−５−［（２，６−ジクロロベンジル）スルホニル］−３−［（３，５−ジメチル−４−｛［（２Ｒ）−２−（ピロリジン−１−イルメチル）ピロリジン−１−イル］カルボニル｝１Ｈ−ピロール−２−イル）メチレン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン；［（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−（｛３，５ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホナミド］；［（３Ｚ）−５−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イルスルホニル）−３−（｛３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン］；［（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−｛［３，５−ジメチル−４−（３−モルフォリン−４−イルプロピル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン｝−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド］からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１３の製品。
【請求項１９】
注射によりまたは点滴により投与されることを特徴とする請求項１３の製品。
【請求項２０】
肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）の細胞外ドメインの少なくとも一部分に結合可能な化合物であって、ＨＧＦＲに対して拮抗剤活性を有し、かつ腫瘍及び／または転移の予防及び／または治療において薬理学的に活性である化合物を選別するための方法であって、前記化合物の標的としてＨＧＦＲの細胞外ドメインの少なくとも一部分の使用を含む方法。
【請求項２１】
化合物がＨＧＦＲダウンレギュレーションを誘導することができることを特徴とする請求項２０の方法。
【請求項２２】
化合物がＨＧＦＲの細胞外ドメインの少なくとも一部分の脱落を誘導することができることを特徴とする請求項２０の方法。
【請求項２３】
化合物がＨＧＦＲシグナルを変換することによる腫瘍性細胞のアポトーシスの増殖及び／または増強を制限することができることを特徴とする請求項２０の方法。
【請求項２４】
ＨＧＦＲの細胞外ドメインの少なくとも一部分がおとりのＭｅｔ、ＳＥＭＡ ＰＳＩ、ＰＳＩ ＩＰＴ、ＩＰＴ、ＩＰＴ１、ＩＰＴ２、ＩＰＴ３、ＵＰＴ４またはその組み合わせから選択されることを特徴とする請求項２０〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ＨＧＦＲの細胞外ドメインの少なくとも一部分がＩＰＴ１、ＩＰＴ２、ＩＰＴ３、ＩＰＴ４またはその組み合わせから選択されることを特徴とする請求項２４の方法。
【請求項２６】
ＨＧＦＲの細胞外ドメインの少なくとも一部分がＩＰＴ４であることを特徴とする請求項２４の方法。
【請求項２７】
ａ）ＨＧＦＲの細胞外ドメインの少なくとも一部分を発現する遺伝子を含む宿主細胞を提供し；ｂ）前記細胞に化合物を投与し；ｃ）前記化合物が以下：−ＨＧＦＲのダウンレギュレーション、−ＨＧＦＲの細胞外ドメインの少なくとも一部分の脱落、または−ＨＧＦＲシグナルの変化及び腫瘍細胞増殖の制限を誘導するかどうかを決定することを特徴とする請求項２０〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
（ｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体、（ｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含むフラグメント及び／または（ｉｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含む遺伝子操作により得られたまたはヒト化抗体の、腫瘍細胞を検知する目的の診断用の装置の製造のための、使用であって、前記抗Ｍｅｔモノクローナル抗体が融合細胞系ＩＣＬＣ ＰＤ０５００６により産生されたものである、使用。
【請求項２９】
抗Ｍｅｔモノクローナル抗体、フラグメントまたは遺伝子操作により得られたまたはヒト化抗体がマーカーに結合された、請求項２８の使用。
【請求項３０】
マーカーが放射性同位体、蛍光分子、化学発光トレーサーまたは分子フラッグから選択される、請求項２９の使用。
【請求項１】
腫瘍を被った患者における腫瘍及び／または転移の治療のための、薬剤製造のための、ｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体、ｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含むフラグメント及び／またはｉｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含む遺伝子操作により得られたまたはヒト化抗体の、使用であって、前記抗体が融合細胞系ＩＣＬＣ ＰＤ０５００６により産生された、前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の使用。
【請求項２】
抗体、フラグメント及び／または遺伝子操作により得られた抗体が可溶性タンパク質の形態であることを特徴とする請求項１の使用。
【請求項３】
抗体及び／または遺伝子操作により得られた抗体がＤＮＡ組み換え技術、固相合成、液相合成からなるグループより選択された方法によって産生されることを特徴とする請求項１の使用。
【請求項４】
フラグメントがＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及びエピトープ結合領域を含むタンパク質からなるグループより選択されることを特徴とする請求項１の使用。
【請求項５】
フラグメントが抗体のタンパク質切断、ＤＮＡ組み換え技術、固相合成、液相合成からなるグループより選択された方法によって産生されることを特徴とする請求項１の使用。
【請求項６】
薬剤が注射によりまたは点滴により投与されることを特徴とする請求項１の使用。
【請求項７】
腫瘍が結腸直腸腫瘍及び肝臓腫瘍から選択されることを特徴とする請求項１の使用。
【請求項８】
腫瘍を被った患者における腫瘍及び／または転移の治療のための、薬剤製造のための、（ｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体、（ｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含むフラグメント、または（ｉｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含む遺伝子操作により得られたまたはヒト化抗体をコードしているヌクレオチド配列の、使用であって、抗Ｍｅｔモノクローナル抗体が融合細胞系ＩＣＬＣ ＰＤ０５００６により産生されたものである、ヌクレオチド配列の使用。
【請求項９】
ヌクレオチド配列が、少なくとも（ｉ）配列番号１及び配列番号２、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の保存的な置換が存在する配列番号１及び配列番号２に対応するヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号９（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号１０（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１２（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ３）を含むことを特徴とする請求項８の使用。
【請求項１０】
少なくとも（ｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体、（ｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体の少なくとも１つのエピトープ結合領域を含むフラグメント、または（ｉｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含む遺伝子操作により得られたまたはヒト化抗体をコードしているヌクレオチド配列を含むベクターの、腫瘍を被った対象において腫瘍及び／または転移の治療のための、薬剤の調製のための、使用であって、抗Ｍｅｔ−モノクローナル抗体が融合細胞系ＩＣＬＣ ＰＤ０５００６によって産生されたものである、ベクターの使用。
【請求項１１】
ベクターが（ｉ）配列番号１及び配列番号２、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の保存的な置換が存在する配列番号１及び配列番号２に対応するヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号９（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号１０（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号１２（ＣＤＲ−Ｌ２）及び配列番号１３（ＣＤＲ−Ｌ３）から選択されたヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１０の使用。
【請求項１２】
ベクターが粒子の形態であることを特徴とする請求項１０の使用。
【請求項１３】
（ｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体、（ｉｉ）エピトープ結合領域を含むフラグメント及び／または（ｉｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含む遺伝子操作により得られたまたはヒト化抗体並びに少なくとも１つのキナーゼ阻害剤を含む製品であって、腫瘍及び／または転移の治療において同時に、別々に、または連続した使用のための混合調合物であり、抗Ｍｅｔモノクローナル抗体が融合細胞系ＩＣＬＣ ＰＤ０５００６により産生されたものである製品。
【請求項１４】
抗体及び／または少なくとも１つのそのフラグメントが可溶化タンパク質であることを特徴とする請求項１３の製品。
【請求項１５】
抗体及び／または遺伝子操作により得られた抗体がＤＮＡ組み換え技術、固相合成または液相合成からなるグループより選択された方法によって産生されたことを特徴とする請求項１３の製品。
【請求項１６】
フラグメントがＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、少なくともエピトープ結合領域を含むタンパク質からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１３の製品。
【請求項１７】
フラグメントが抗体のタンパク質切断、固相合成または液相合成からなるグループから選択された方法によって産生されたことを特徴とする請求項１３の製品。
【請求項１８】
少なくとも１つのキナーゼ阻害剤がＫ２５２Ａスタウロスポリン類似体；（３Ｚ）−５−［（２，６−ジクロロベンジル）スルホニル］−３−［（３，５−ジメチル−４−｛［（２Ｒ）−２−（ピロリジン−１−イルメチル）ピロリジン−１−イル］カルボニル｝１Ｈ−ピロール−２−イル）メチレン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン；［（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−（｛３，５ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホナミド］；［（３Ｚ）−５−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イルスルホニル）−３−（｛３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン］；［（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−｛［３，５−ジメチル−４−（３−モルフォリン−４−イルプロピル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン｝−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド］からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１３の製品。
【請求項１９】
注射によりまたは点滴により投与されることを特徴とする請求項１３の製品。
【請求項２０】
肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）の細胞外ドメインの少なくとも一部分に結合可能な化合物であって、ＨＧＦＲに対して拮抗剤活性を有し、かつ腫瘍及び／または転移の予防及び／または治療において薬理学的に活性である化合物を選別するための方法であって、前記化合物の標的としてＨＧＦＲの細胞外ドメインの少なくとも一部分の使用を含む方法。
【請求項２１】
化合物がＨＧＦＲダウンレギュレーションを誘導することができることを特徴とする請求項２０の方法。
【請求項２２】
化合物がＨＧＦＲの細胞外ドメインの少なくとも一部分の脱落を誘導することができることを特徴とする請求項２０の方法。
【請求項２３】
化合物がＨＧＦＲシグナルを変換することによる腫瘍性細胞のアポトーシスの増殖及び／または増強を制限することができることを特徴とする請求項２０の方法。
【請求項２４】
ＨＧＦＲの細胞外ドメインの少なくとも一部分がおとりのＭｅｔ、ＳＥＭＡ ＰＳＩ、ＰＳＩ ＩＰＴ、ＩＰＴ、ＩＰＴ１、ＩＰＴ２、ＩＰＴ３、ＵＰＴ４またはその組み合わせから選択されることを特徴とする請求項２０〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ＨＧＦＲの細胞外ドメインの少なくとも一部分がＩＰＴ１、ＩＰＴ２、ＩＰＴ３、ＩＰＴ４またはその組み合わせから選択されることを特徴とする請求項２４の方法。
【請求項２６】
ＨＧＦＲの細胞外ドメインの少なくとも一部分がＩＰＴ４であることを特徴とする請求項２４の方法。
【請求項２７】
ａ）ＨＧＦＲの細胞外ドメインの少なくとも一部分を発現する遺伝子を含む宿主細胞を提供し；ｂ）前記細胞に化合物を投与し；ｃ）前記化合物が以下：−ＨＧＦＲのダウンレギュレーション、−ＨＧＦＲの細胞外ドメインの少なくとも一部分の脱落、または−ＨＧＦＲシグナルの変化及び腫瘍細胞増殖の制限を誘導するかどうかを決定することを特徴とする請求項２０〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
（ｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体、（ｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含むフラグメント及び／または（ｉｉｉ）抗Ｍｅｔモノクローナル抗体のエピトープ結合領域を含む遺伝子操作により得られたまたはヒト化抗体の、腫瘍細胞を検知する目的の診断用の装置の製造のための、使用であって、前記抗Ｍｅｔモノクローナル抗体が融合細胞系ＩＣＬＣ ＰＤ０５００６により産生されたものである、使用。
【請求項２９】
抗Ｍｅｔモノクローナル抗体、フラグメントまたは遺伝子操作により得られたまたはヒト化抗体がマーカーに結合された、請求項２８の使用。
【請求項３０】
マーカーが放射性同位体、蛍光分子、化学発光トレーサーまたは分子フラッグから選択される、請求項２９の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１ａ】
【図２１ｂ】
【図２２ａ】
【図２２ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１ａ】
【図２１ｂ】
【図２２ａ】
【図２２ｂ】
【公表番号】特表２００９−５２６０１０（Ｐ２００９−５２６０１０Ａ）
【公表日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５３７３９（Ｐ２００８−５５３７３９）
【出願日】平成１９年２月５日（２００７．２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５１０６６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９０８０７
【国際公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【出願人】（５０８２３８３３６）メセレシス・トランスレイショナル・リサーチ・ソシエタ・アノニマ (4)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＴＨＥＲＥＳＩＳ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月５日（２００７．２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５１０６６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９０８０７
【国際公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【出願人】（５０８２３８３３６）メセレシス・トランスレイショナル・リサーチ・ソシエタ・アノニマ (4)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＴＨＥＲＥＳＩＳ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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