腫瘍由来樹状細胞阻害因子アンタゴニストおよびＴｏｌｌ様レセプターアゴニストの併用を使用する、癌を処置するための方法
【課題】異常な免疫応答から生じると考えられる疾患（特に癌）を処置すること。
【解決手段】樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的免疫反応において重要な役割を果たす。疾患状態（癌を含む）を処置するための材料および方法が提供され、この方法は、宿主から樹状細胞を刺激することによって、疾患による活性化刺激に対する応答性を低下させる。特に、哺乳動物において癌を処置するための方法を提供し、この方法は、この哺乳動物に、有効量の腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストを、有効量のＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）アゴニストと組み合わせて投与する工程を包含する。
【解決手段】樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的免疫反応において重要な役割を果たす。疾患状態（癌を含む）を処置するための材料および方法が提供され、この方法は、宿主から樹状細胞を刺激することによって、疾患による活性化刺激に対する応答性を低下させる。特に、哺乳動物において癌を処置するための方法を提供し、この方法は、この哺乳動物に、有効量の腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストを、有効量のＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）アゴニストと組み合わせて投与する工程を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、疾患状態（特に癌）の処置における、樹状細胞（ＤＣ）の操作および活性化のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
樹状細胞（ＤＣ）は、生得的免疫応答および適応的免疫応答を開始および調節することにおいて、重要な役割を果たす（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５２）。癌に関して、樹状細胞は、腫瘍抗原をサンプリングおよび提示し得、そして腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞をプライムし得る（Ｃｈｉｏｄｏｎｉら、１９９９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１２５−１３３）。さらに、樹状細胞は、抗腫瘍免疫応答において役割を果たすサイトカインであるインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）およびインターフェロンα（ＩＦＮα）の重要な供給源であり得る（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５２）。従って、近年、研究者らは、癌の処置におけるＤＣの活性を調査しようと試みてきた（例えば、Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら、１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：９９６−１００３；Ｈｓｕら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：５２；Ｍｕｒｐｈｙら、１９９６，Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２９：３７１；Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら、１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：９９６−１００３；Ｄａｌｌａｌら、２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：５８３−５８８；Ｚｅｉｄら、１９９３，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２５：３３８；Ｆｕｒｉｈａｔｏｎ ら、１９９２，６１：４０９；Ｔｓｕｊｉｔａｎｉら、１９９０，Ｃａｎｃｅｒ ６６：２０１２；Ｇｉａｎｎｉら、１９９１，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１８７：４９６；Ｍｕｒｐｈｙら、１９９３，Ｊ．Ｉｎｖ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１００：３３５８を参照のこと）。
【０００３】
適切な免疫応答を誘導するために、樹状細胞は、病原体、死細胞および／またはＴ細胞によって送達される活性化シグナルを受容しつつ、抗原発現の部位にてリクルートされ、抗原を取り込み、そして二次リンパ器官に移動しなければならない。いくつかの研究が、ヒト腫瘍におけるＤＣの状態に取り組んでおり、そして腫瘍内または癌患者における、損傷したＤＣ機能を報告している（Ｂｅｌｌら、１９９９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１４１７−１４２６；Ｓｃａｒｐｉｎｏら、２０００，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５６：８３１−８３７；Ｌｅｓｐａｇｎａｒｄら、１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８４：３０９−３１４；Ｅｎｋら、１９９７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７３：３０９−３１６）。さらに、いくつかの研究において、活性化ＤＣの観察は、陽性の予後因子であった（Ｅｎｋら、１９９７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７３：３０９−３１６）。従って、腫瘍において樹状細胞の活性化を増強することは、癌を処置するための有用な方法であり得る。
【０００４】
腫瘍は、ＤＣのナビゲーションを妨害するか、または必要な活性化シグナルを提供できないことによって、免疫系を逃れ得る（Ｖｉｃａｒｉら、２００１，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，印刷中）。特に、腫瘍は、病原体関連分子パターン（Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｔｅｒｎ （ＰＡＭＰ））の多くを発現しないようであり（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖら、２０００，Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１８５−１８８）、この病原体関連分子パターンは、ＤＣ活性化を誘発する（Ｒｅｉｓら、２００１，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４：４９５−４９８）。
【０００５】
近年、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）分子が、ＰＡＭＰに対するレセプターの重要なクラスとして同定されている。Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）は、微生物病原体に特異的な分子パターンを認識する（Ａｄｅｒｅｍら、２０００，Ｎａｔｕｒｅ ４０６：７８２−７８７）。１０種の別個のＴＬＲ分子が、ヒトにおいて記載されている。ＷＯ ９８／５０５４７（１９９９年１１月１２日公開）は、ＴＬＲ２〜１０を開示している。現在公開された命名は、ヒトにおいて１０種の別個のＴＬＲを含むことに、注目すべきである。これらのうち９種は、ＷＯ ９８／５０５４７のＴＬＲ−２〜ＴＬＲ−１０であるが、数字は一致していない（Ｋａｄｏｗａｋｉら、２００１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：８６３−８６９）。
【０００６】
微生物分子によって誘発されるＴＬＲを介したシグナル伝達は、ＤＣを強力に活性化して、同時刺激分子（ＣＤ８０およびＣＤ８６）をアップレギュレートし（Ｈｅｒｔｚら、２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：２４４４−２４５０）、そして、炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１２）を産生する（Ｔｈｏｍａ−Ｕｓｚｙｎｓｋｉら、２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３８０４−３８１０）。現在、多数の研究が、ＴＬＲタンパク質（細菌リポポリサッカリド（ＴＬＲ−４）、フラジェリン（ＴＬＲ−５）、リポタイコ酸（ＴＬＲ−２）およびポリＩ：Ｃ（ＴＬＲ−３）を含む）に対するリガンドとして作用する、広範な種々の化学的に多様な細菌産物を同定している。より具体的には、ＴＬＲ−９は、免疫刺激性細菌性ＣｐＧ ＤＮＡについてのリガンドであることが示されている（Ｈｅｍｍｉら、２０００，Ｎａｔｕｒｅ ４０８：７４０７４５；Ｗａｇｎｅｒ，２００１，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４：４９９−５０２）。
【０００７】
さらに、腫瘍は、ＤＣの分化または機能を阻害する因子の分泌を促進する。癌においてＤＣ機能を阻害し得る腫瘍関連因子のうちの１つは、ＩＬ−１０である。多数のヒトの原発性腫瘍または転移が、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を分泌することが、報告されている（Ｃｈｏｕａｉｂら、１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８：４９９３−４９７）。この因子は、ＤＣ機能の強力な調節因子として記載されている。実際、ＩＬ−１０は、ＩＬ−１２産生を負に調節し得、そしてＤＣのＴ細胞同時刺激能を阻害し得る（ＤｅＳｍｅｄｔら、１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．２７：１２２９−１２３５；Ｃａｕｘら、１９９４，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１１７７−１１８５）。しかし、ＤＣ阻害シグナル（例えば、ＩＬ−１０）をアンタゴナイズして、ＤＣの活性化を改善する能力、従って、癌に対する宿主免疫応答を改善する能力は、いまだ未知である。
【０００８】
癌治療の現在利用可能な方法（例えば、外科的治療、放射線療法、化学療法および免疫生物学的方法）は、限られた成功を得ているか、または深刻かつ所望されない副作用を生じるかのいずれかである。多数の臨床的に診断された固形腫瘍（ここで、この腫瘍は、局在化した増殖である）において、外科的除去は、主な処置手段とみなされている。しかし、手術後およびいくらかの遅延期間後に、しばしば、元の腫瘍が転移しているのが見られ、その結果、癌浸潤の二次的部位が全身に広がっており、そして患者は二次的癌増殖の後に死亡する。化学療法は、癌の処置において広く使用されているが、これは、通常、細胞増殖の防止に基づく全身的処置である。従って、化学療法は、全ての増殖している細胞（正常な細胞を含む）に影響を与え、所望でなく、かつしばしば深刻な副作用を導く、非特異的な処置様式である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、異常な免疫応答から生じると考えられる疾患（特に癌）を処置するための新規方法についての必要性が存在する。特に、腫瘍浸潤樹状細胞の活性化を促進する因子の解明は、腫瘍特異的免疫応答を増強するための、樹状細胞の操作を可能にする。樹状細胞の操作を介した、免疫応答の調節のための方法および治療は、これらの疾患の処置において有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、腫瘍浸潤樹状細胞の活性化を促進することによる、癌のような疾患に対する免疫治療のための材料および方法を提供することによって、上記の必要性を満たす。ＩＬ−１０アンタゴニストとＴＬＲ−９アゴニストとの併用投与は、有効な癌治療であることが現在発見されている。従って、本発明は、癌を処置する方法を提供し、この方法は、有効量のＴＬＲアゴニストと組み合わせて、有効量の腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストを、このような処置を必要とする個体に投与する工程を包含する。
【００１１】
好ましい実施形態において、腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストは、樹状細胞機能を阻害することが公知である、以下の腫瘍関連因子のいずれかのアンタゴニストであり得る：ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、ＴＧＦ−β、プロスタグランジン、ガングリオシド、Ｍ−ＣＳＦおよびＩＬ−１０。より好ましくは、この腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストは、ＩＬ−１０アンタゴニストである。より好ましくは、このＩＬ−１０アンタゴニストは、ＩＬ−１０サイトカインの直接的アンタゴニストまたはＩＬ−１０レセプターのアンタゴニストのいずれかである。特定の実施形態において、この腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストは、抗体もしくは抗体フラグメント、低分子またはアンチセンスヌクレオチド配列である。より好ましくは、この腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストは、抗ＩＬ−１０レセプター抗体である。
【００１２】
特定の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、低分子、組換えタンパク質、抗体もしくは抗体フラグメント、ヌクレオチド配列またはタンパク質−核酸配列である。好ましい実施形態において、このＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ−９のアゴニストである。より好ましくは、ＴＲＬアゴニストは、免疫刺激ヌクレオチド配列である。なおより好ましくは、この免疫刺激ヌクレオチド配列は、ＣｐＧモチーフを含む。最も好ましくは、この免疫刺激ヌクレオチド配列は、以下からなる群より選択される：ＣｐＧ ２００６（表２および配列番号１）；ＣｐＧ ２２１６（表２および配列番号２）；ＡＡＣ−３０（表２および配列番号３）；ならびにＧＡＣ−３０（表２および配列番号４）。この免疫刺激ヌクレオチド配列は、ホスホロチオエート改変のような構造的改変によって安定化され得るか、またはカチオン性リポソーム中にカプセル化されて、インビボの薬物動態および腫瘍標的化を改善し得る。
【００１３】
特定の実施形態において、この腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストは、静脈内、腫瘍内、皮内、筋内、皮下または局所的に投与される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、この腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよびＴＬＲアゴニストは、融合タンパク質の形態で投与されるか、または他の方法で互いに連結される。
【００１５】
本発明の方法は、少なくとも１つの腫瘍関連抗原の投与をさらに含み得る。腫瘍抗原は、融合タンパク質の形態で送達され得るか、またはＴＬＲアゴニストおよび／または腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストに連結され得る。
【００１６】
本発明のなお別の局面において、活性化因子（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＲＡＮＫ−ＬまたはＲＡＮＫのアゴニスト、ＣＤ４０−ＬまたはＣＤ４０のアゴニスト、４１ＢＢＬまたは４１ＢＢのアゴニスト、あるいはＴＮＦ／ＣＤ４０レセプターファミリーのメンバーの他の推定リガンド／アゴニスト）もまた、投与される。
【００１７】
本発明のなお別の局面において、サイトカインは、腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストと組み合わせて、これらの前またはこれらと同時にのいずれかで、投与される。１つの好ましい局面において、これらのサイトカインは、組換えタンパク質または組換え融合タンパク質または送達ベクターのいずれかとして使用される、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦまたはＦＬＴ−３Ｌである。これらの因子の投与は、前駆体からの特定のサブセットのＤＣの生成を刺激し、それによって、腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよびＴＬＲアゴニストの組み合わせを用いた活性化を受けやすい腫瘍浸潤樹状細胞の数を増加させる。
【００１８】
本発明のなお別の局面において、選択されたケモカインが、腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストの前にかまたはこれらと同時に投与される。１つの好ましい局面において、これらのケモカインは、組換えタンパク質または組換え融合タンパク質または送達ベクターのいずれかとして使用される、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２からなる群より選択される。最も好ましい局面において、このケモカインは、腫瘍内注射後に直接か、組換え抗体のような標的化構築物を介してか、または腫瘍への優先的送達を可能にする特定の小胞中のカプセル化を介してかのいずれかで、腫瘍に送達される。ケモカインの投与は、ＤＣの特定のサブセットの腫瘍への補充を促進し、それによって、腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストとＴＬＲアゴニストとの組み合わせを用いた活性化を受けやすい腫瘍浸潤樹状細胞の数を増加させ得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
癌を処置する方法であって、該方法は、そのような必要のある個体に、有効量の腫瘍由来樹状細胞（ＤＣ）阻害因子アンタゴニストを、有効量のＴＬＲアゴニストと組み合わせて投与する工程を包含する、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、前記腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストが、ＩＬ−６アンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＯＸ−４０アンタゴニスト、ＴＧＦ−Ｂアンタゴニスト、プロスタグランジンアンタゴニスト、ガングリオシドアンタゴニスト、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニスト、およびＩＬ−１０アンタゴニストからなる群より選択される、方法。
（項目３）
前記腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストが、ＩＬ−１０アンタゴニストである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ＩＬ−１０アンタゴニストが、ＩＬ−１０のアンタゴニストおよびＩＬ−１０レセプターのアンタゴニストからなる群より選択される、項目３に記載の方法。
（項目５）
項目４に記載の方法であって、前記ＩＬ−１０アンタゴニストが、以下：
ａ）組換え体；
ｂ）天然のリガンド；
ｃ）低分子；
ｄ）抗体または抗体フラグメント；
ｅ）アンチセンスヌクレオチド配列；あるいは
ｆ）可溶性ＩＬ−１０レセプター分子、
である、方法。
（項目６）
前記抗体が、モノクローナル抗体である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記抗体が、抗ＩＬ−１０Ｒモノクローナル抗体である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記ＴＬＲアゴニストが、以下：
ａ）組換え体；
ｂ）天然のリガンド；
ａ）免疫刺激性ヌクレオチド配列；
ｂ）低分子；
ｃ）精製された細菌抽出物；
ｄ）不活性化された細菌調製物、
である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ＴＬＲアゴニストが、ＴＬＲ−９のアゴニストである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ＴＬＲアゴニストが、免疫刺激性ヌクレオチド配列である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記免疫刺激性ヌクレオチド配列が、ＣｐＧモチーフを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記免疫刺激性ヌクレオチドが、ＣｐＧ ２００６（配列番号１）、ＣｐＧ ２２１６（配列番号２）、ＡＡＣ−３０（配列番号３）、およびＧＡＣ−３０（配列番号４）からなる群より選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記免疫刺激性ヌクレオチド配列が、ホスホロチオネート−改変のような構造改変によって安定化される、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記免疫刺激性ヌクレオチド配列が、カチオン性リポソームにカプセル化される、項目１０に記載の方法。
（項目１５）
前記腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストが、抗ＩＬ−１０Ｒモノクローナル抗体であり、そして前記ＴＬＲアゴニストがＣｐＧ ２００６（配列番号１）である、項目１に記載の方法。
（項目１６）
項目１に記載の方法であって、該方法が、前記腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストを送達部位に持続放出させる物質を投与する工程をさらに包含する、方法。
（項目１７）
前記腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストが、静脈内投与、腫瘍内投与、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与または局所投与される、項目１に記載の方法。
（項目１８）
少なくとも１つの腫瘍関連抗原を投与する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記腫瘍関連抗原が、ＴＬＲアゴニストに連結する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
項目１８に記載の方法であって、前記腫瘍関連抗原が、以下：Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、ＨＫｅｒ ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３ならびにテロメラーゼからなる群より選択される、方法。
（項目２１）
項目１に記載の方法であって、前記処置される癌が、以下：黒色腫、乳癌、膵臓癌、結腸癌、肺癌、神経膠腫、肝細胞癌、子宮内皮癌、胃癌、腸癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、卵巣癌、精巣癌、肝臓癌、頭部および頸部の癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、眼の癌、膀胱癌、神経膠芽腫、ならびに転移性の癌腫からなる群より選択される、方法。
（項目２２）
活性剤を投与する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記活性剤が、ＩＦＮα、ＴＮＦα、ＲＡＮＫリガンド／アゴニスト、ＣＤ４０リガンド／アゴニストまたはＴＮＦ／ＣＤ４０レセプターファミリーの別のメンバーのリガンド／アゴニストからなる群より選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
血液樹状細胞の数を増加させるサイトカインを投与する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記樹状細胞増殖因子が、ＦＬＴ３−Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦからなる群より選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
樹状細胞上で活性なサイトカインを腫瘍に送達する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目２７）
項目２６に記載の方法であって、前記ケモカインが、以下：ＣＣＬ２１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２５、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１３、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１からなる群より選択される、方法。
（項目２８）
前記ケモカインが、ケモカインまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくはその改変体および標的化部分を含む標的化構築物を用いて前記腫瘍に送達される、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
項目２８に記載の方法であって、前記標的化部分が、以下：
ａ）少なくとも１０個のアミノ酸のペプチド；
ｂ）タンパク質；
ｃ）低分子；
ｄ）ベクター；および
ｅ）抗体またはそのフラグメント、
からなる群より選択される、方法。
（項目３０）
前記腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストが、互いに連結する、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストが、腫瘍関連抗原にさらに連結される、項目３０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤樹状細胞が、骨髄由来樹状細胞と比較して、ＬＰＳ＋抗ＣＤ４０＋ＩＦＮγの組み合わせに対して非応答性であることを示す。図１Ａは、ＦＡＣＳ（ＤＣ１１ｃポジティブ細胞でゲート）による、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０およびＣＤ８６の表面発現の分析の結果を示す。図１Ｂは、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａとの２．５時間のインキュベーションを含む、２０時間後のＣＤ１１ｃ＋細胞による、ＩＬ−１２ｐ４０の細胞内発現を示す。図１Ｃは、混合白血球反応を示す。図１Ｄにおいて、ＩＬ−１２ｐ７０を、特異的ＥＬＩＳＡによって、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗ＣＤ４０を用いた活性化後の培養物上清において測定した。
【図２】ＣｐＧ １６６８＋抗ＩＬ−１０Ｒの組み合わせが、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤樹状細胞において、ＩＬ−１２およびＴＮＦαを回復した。Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍由来のＴＩＤＣを、抗ＣＤ１１ｃ磁気ビーズを使用して富化し、そしてＧＭ−ＣＳＦおよび種々の組み合わせのＬＰＳ、ＩＦＮγ抗ＣＤ４０、抗ＩＬ１０ＲおよびＣｐＧ １６６８の存在下で、一晩培養した。ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦαのレベルを、特異的ＥＬＩＳＡによって、培養物上清において測定した。
【図３】ＣｐＧ １６６８＋抗ＩＬ−１０Ｒの組み合わせは、ＤＣ浸潤Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍のＭＬＲ刺激能力を回復した。Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍由来のＴＩＤＣを、抗ＣＤ１１ｃ磁気ビーズを使用して富化し、ＧＭ−ＣＳＦおよび種々の組み合わせのＬＰＳ、ＩＦＮγ抗ＣＤ４０、抗ＩＬ１０ＲおよびＣｐＧ １６６８の存在下で、一晩培養した。次いで、細胞を照射し、そして一定数の富化した同種異系Ｔ細胞（３×１０５のＴ細胞）の存在下で、種々の数で５日間培養した。増殖を、放射性チミジン取り込みによって、培養の最後の１８時間の間に測定した。
【図４】親Ｃ２６腫瘍由来の腫瘍浸潤樹状細胞ならびに異なる組織学的起源の腫瘍由来の腫瘍浸潤樹状細胞は、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗ＣＤ４０の組み合わせに対して非応答性であるが、ＣｐＧ １６６８＋抗ＩＬ−１０Ｒに応答して、ＩＬ−１２を産生する。示された腫瘍由来のＴＩＤＣを、抗ＣＤ１１ｃ磁気ビーズを使用して富化し、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗ＣＤ４０、または抗ＩＬ１０Ｒ＋ＣｐＧ １６６８の存在下で、一晩培養した。図４は、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａとの２．５時間のインキュベーションを含む、２０時間後の培養細胞における、ＩＬ−１２ｐ４０の細胞内発現およびＣＤ１１ｃの表面発現を示す。
【図５】図５は、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍モデルにおける、ＣｐＧ１６６８＋抗ＩＬ１０Ｒ抗体の治療効果を示す。７週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス群に、５×１０４のＣ２６−６ＣＫ細胞を皮下注射し、そして腫瘍接種の７日後に始まる３週間にわたって、１週間に２回の２５０μｇの精製抗ＩＬ１０Ｒ抗体の腹腔内注射および毎週の１０μｇのＣｐＧ １６６８の腫瘍内注射の併用で、処置した。
【図６】図６は、Ｃ２６腫瘍モデルにおける、ＣｐＧ １６６８＋抗ＩＬ１０Ｒ抗体の治療効果を示す。７週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス群に、５×１０４のＣ２６細胞を皮下注射し、そして腫瘍接種の７日後に始まる３週間にわたって、２５０μｇの精製抗ＩＬ１０Ｒ抗体の腹腔内注射および５μｇのＣｐＧ １６６８の腫瘍内注射の併用で毎週処置した。
【図７】図７は、Ｂ１Ｆ０黒色腫腫瘍モデルにおける、ＣｐＧ１６６８＋抗ＩＬ１０Ｒ抗体の治療効果を示す。７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウス群に、５×１０４のＢ１６Ｆ０細胞を皮下注射し、そして腫瘍接種の７日後に始まる３週間にわたって、２５０μｇの精製抗ＩＬ１０Ｒ抗体の腹腔内注射および５μｇのＣｐＧ １６６８の腫瘍内注射の併用で毎週処置した。
【図８】図８は、別のＩＬ−１０アンタゴニストであるモノクローナル抗ＩＬ１０抗体が、ＴＬＲ−９アゴニストであるＣｐＧ １６６８と組み合わせて、ＤＣ浸潤Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍によるＩＬ−１２の産生を誘導し得ることを示す。Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍由来のＴＩＤＣを、抗ＣＤ１１ｃ磁気ビーズを使用して富化し、ＧＭ−ＣＳＦまたは抗ＩＬ１０Ｒ＋ＣｐＧ １６６８または抗ＩＬ１０＋ＣｐＧ １６６８の存在下で、一晩培養した。図８は、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａとの２．５時間のインキュベーションを含む、２０時間後の培養細胞における、ＩＬ−１２ｐ４０の細胞内発現およびＣＤ１１ｃの表面発現を示す。
【図９】図９は、別の腫瘍由来ＤＣ阻害因子であるＰＧＥ２が、ＤＣ活性化を可能にするためにアンタゴナイズされ得ることを示す。骨髄由来ＤＣを、（インドメタシン処理した）ＰＧＥ２を含む腫瘍上清の存在下または非存在下で培養した。次いで、異なるＤＣを、抗ＩＬ１０Ｒ抗体の存在下または非存在下で、ＬＰＳ、ＩＦＮγおよび抗ＣＤ４０抗体の組み合わせを用いた活性化の後に、成熟マーカーの発現およびＩＬ−１２産生について試験した。
【図１０】図１０は、Ｃ２６−６ＣＫ結腸癌腫腫瘍モデルにおける、ＣｐＧ １６６８＋インドメタシンの治療効果を示す。８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス群に、５×１０４のＣ２６−６ＣＫ細胞を皮下注射し、そして腫瘍接種の７日後に始まる３週間にわたる、５μｇのＣｐＧ １６６８の腫瘍内注射、および／または５日目〜２８日目の、飲用水中５μｇ／ｍｌのインドメタシンの併用で、毎週処置した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に引用される全ての参考文献は、その全体が参考として援用される。
本発明は、腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストとＴＬＲアゴニストとの併用投与が、腫瘍発達のいくつかのインビボモデル（Ｃ２６−６ＣＫ、Ｃ２６およびＢ１６Ｆ０を含む）において、強力な治療活性を有するという驚くべき発見に一部基づく。ＩＬ−１０アンタゴニストおよびＴＬＲ−９アゴニストの併用投与は、そうでなければ活性化に対して無反応性である腫瘍浸潤樹状細胞が、ＩＬ−１２およびＴＮＦαを産生し、そして改善された腫瘍抗原特異的免疫応答を誘導することを可能にすることが、現在発見されている。さらに、腫瘍保有動物へのＩＬ−１０アンタゴニストおよびＴＬＲ−９アゴニストの投与は、腫瘍の拒絶を誘導し得ることが、現在発見されている。
【００２１】
多数の報告が、腫瘍内のＤＣの活性化状態に取り組んでいる。１つのこのような報告では、ＧＭ−ＣＳＦおよびＣＤ４０Ｌを発現するように形質導入されたマウスＣ２６結腸癌腫瘍が、成熟した表現型を有するＤＣによってひどく浸潤され、そして、腫瘍の割合は、初期増殖後に退縮された（Ｃｈｉｏｄｏｎｉら、１９９９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １９０：１２５−１３３）。６Ｃカインを発現するように操作された同じＣ２６細胞は、未熟ＤＣによって浸潤された（Ｖｉｃａｒｉら、２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５ ：１９９２−２０００）。ＤＣの活性化および続く成熟は、免疫応答の開始に決定的な事象であるので、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤樹状細胞の活性化が腫瘍拒絶を生じ得ると考えられた。予期せぬことに、それらの腫瘍浸潤ＤＣは、共刺激分子の上方調節、混合白血球反応においてＴ細胞を刺激する能力、ならびにＩＬ−１２およびＴＮＦαを生成する能力を読み出しとして使用して、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体を介してＣＤ４０による刺激に応答しないことが見い出された。それらは、細菌刺激ＬＰＳ（ＴＬＲ−４のリガンド）にも、サイトカインＩＦＮγにも、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、および抗ＣＤ４０抗体の組み合わせにも応答しなかった。
【００２２】
従って、本発明者らが使用した特定の刺激因子を考慮する場合、腫瘍由来因子が、腫瘍浸潤ＤＣの不応状態を誘導することが、本発明者らによって仮定された。従って、この不応状態を阻害し得る因子の根絶が、有用な癌療法を生じ得た。ＩＬ−１０（ＤＣ阻害シグナル）が多くのヒト腫瘍によって分泌されるという報告を考慮して（Ｃｈｏｕａｉｂら、１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８：４９３−４９７；Ｄｅ Ｓｍｅｄｔら、１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１２２９−１２３５；Ｃａｕｘら、１９９４，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１１７７−１１８５）、本発明者らは、ＩＬ−１０の拮抗が、ＤＣ活性化、および従って、癌に対する宿主免疫応答を改善し得るか否かを試験した。しかし、ＩＬ−１０レセプターをブロッキングする抗体（抗ＩＬ１０Ｒ）でのマウスの処置は、Ｃ２６結腸癌腫瘍またはそのＣ２６−６ＣＫ改変体の発達に対してほとんど影響しないことが見い出された（後者は、ケモカインＣＣＬ２１／ＳＬＣ／６Ｃカインを発現させるためにＶｉｃａｒｉら、２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：１９９２−２０００において記載されるように操作された：（実施例ＩＶおよび図５を参照のこと））。実際、実施例ＩＩおよびＩＩＩに示されるように、抗ＩＬ１０Ｒ抗体は、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗ＣＤ４０での腫瘍浸潤ＤＣの活性化に対して全く影響を有さないか、または最小限の影響を有する。
【００２３】
続いて、本発明者らは、他の活性化シグナル（特にｔｏｌｌ様ファミリーの病原関連分子パターンレセプターであるが、ＴＬＲ−４とは異なるレセプターを介して媒介されたシグナル）が、腫瘍浸潤樹状細胞において有効であり得ると仮定した。特に、本発明者らは、マウスにおけるＣｐＧ １６６８（ＴＬＲ−９のリガンド）の効果を研究した（Ｈｅｍｍｉら、２０００，Ｎａｔｕｒｅ ４０８：７４０−７４５）。しかし、本発明者らは、ＣｐＧ １６６８が、腫瘍浸潤樹状細胞の活性化（実施例ＩＩおよびＩＩＩ）またはマウスにおける樹立皮下腫瘍の処置（実施例Ｖ〜ＶＩＩ）のいずれにおいても最低限の効果でしかないことを観察した。
【００２４】
しかし、著しく違って、本発明者らは、ＣｐＧ １６６８と抗ＩＬ１０Ｒとの組み合わせが、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤ＤＣによるＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦαの産生を誘導し、そしてＭＬＲにおけるそれらＤＣの刺激能を大いに増強するとの驚くべき発見をした（実施例ＩＩおよびＩＩＩを参照のこと）。続いて、ＣｐＧ １６６８＋抗ＩＬ１０Ｒ抗体の組み合わせは、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍を有するマウスにおいて有意な抗腫瘍効果を示した（実施例Ｖ）。さらに、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗ＣＤ４０抗体の組み合わせではなく、ＣｐＧ １６６８および抗ＩＬ１０Ｒ抗体の組み合わせが、同様に、親Ｃ２６腫瘍および他の組織学的起源の腫瘍（Ｂ１６メラノーマおよびＬＬ２肺癌）由来の腫瘍浸潤ＤＣにおいてＩＬ−１２産生を誘導し得た（実施例ＩＶを参照のこと）。ＣｐＧ １６６８＋抗ＩＬ１０Ｒの組み合わせはまた、Ｃ２６およびＢ１６Ｆ０腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を示した（実施例ＶＩおよびＶＩＩ）。
【００２５】
従って、本発明は、腫瘍浸潤樹状細胞の活性化を通じて、哺乳動物において癌を処置する方法であって、当該哺乳動物に、有効量のＴＬＲアゴニストと組み合わせて、有効量の腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法を提供する。
【００２６】
本明細書中で定義される場合、「腫瘍由来樹状細胞（ＤＣ）阻害因子アンタゴニスト」とは、結合アッセイまたは機能アッセイにおいて、腫瘍細胞によって分泌され、かつ樹状細胞機能を阻害することが公知である因子の作用をブロックすることが示される因子である。
【００２７】
本明細書中で定義される場合、「ＴＬＲアゴニスト」は、Ｂａｕｅｒら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９２３７−９２４２に記載されるようなｔｏｌｌ様レセプター（「ＴＬＲ」）を活性化する任意の分子である。特に好ましい実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、Ｈｅｍｍｉら、２０００，Ｎａｔｕｒｅ ４０８：７４０−７４５およびＢａｕｅｒら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９２３７−９２４２に記載されるような、ＴＬＲ９のアゴニストである。
【００２８】
（１．腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニスト）
用語「腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニスト」は、腫瘍浸潤ＤＣにおいて不応状態を誘導する腫瘍由来因子の作用をブロックする任意の因子を包含する。このような腫瘍由来因子の例としては、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、ＴＧＦ−β、プロスタグランジン、ガングリオシド、Ｍ−ＣＳＦ、およびＩＬ−１０（Ｃｈｏｕａｉｂら、１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １８ ：４９３−４９７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストは、活性化刺激因子の存在下の腫瘍樹状細胞に対するそれらの効果を分析することにより同定され得る。有効量の腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストの存在下で、腫瘍樹状細胞は成熟プロセスを受け、この後、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＦＮα）の産生、または成熟樹状細胞によって代表的に発現される分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３およびＤＣ−Ｌａｍｐ）の発現の測定が行われ得る。あるいは、腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストの効果は、樹状細胞成熟を阻害することが報告された腫瘍起源の精製または非精製因子の存在下で活性化される、腫瘍から単離されたものではない、ヒト樹状細胞の活性化を分析する際に、観察され得る。
【００３０】
腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストは、例えば、抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体が、ＩＬ−１０の作用をブロックするように、ＤＣ阻害因子それ自体に対して、または、例えば、抗ＩＬ−１０Ｒモノクローナル抗体がＤＣ上のそのレセプターを通じたＩＬ−１０のシグナル伝達を妨害するように、ＤＣ阻害因子が腫瘍浸潤ＤＣに対するそれらの正常な効果を有することを妨害する任意の他の手段によって、作用し得る。
【００３１】
腫瘍由来ＤＣ阻害因子のアンタゴニストは、抗体に由来し得るか、または抗体フラグメントを含み得る。さらに、結合アッセイまたは機能アッセイにおいてレセプターの活性化を阻害することが示される任意の小分子、アンタゴニスト、アンチセンスヌクレオチド配列、遺伝子送達ベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター）に含まれるヌクレオチド配列は、この定義内に入る。所定の標的（例えば、腫瘍関連分子（例えば、レセプター））に特異的に結合する小分子についていかにしてスクリーニングするかは、当該分野において周知である。例えば、Ｍｅｅｔｉｎｇｓ ｏｎ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ ０１７７２−１７４９を参照のこと。同様に、膜貫通ドメインを欠くレセプターの可溶性形態が使用され得る。最後に、対応するレセプターに強く結合するが、生物学的活性を本質的に欠く、腫瘍由来ＤＣ阻害因子の変異体アンタゴニスト形態が、使用され得る。
【００３２】
本発明の特に好ましい実施形態においては、腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストは、ＩＬ−１０アンタゴニストである。用語「ＩＬ−１０アンタゴニスト」は、ＩＬ−１０の活性を阻害する、ＩＬ−１０それ自体のアンタゴニスト、およびＩＬ−１０レセプターのアンタゴニストの両方を包含する。本発明において有用であるＩＬ−１０アンタゴニストの例としては、米国特許第５，２３１，０１２号（１９９３年７月２７日発行）（ＩＬ−１０およびＩＬ−１０アンタゴニストに関する）および米国特許第５，８６３，７９６号（１９９９年１月２６日発行）（ＩＬ−１０レセプターおよびＩＬ−１０レセプターアンタゴニストに関する）（これらは共に、本明細書中に参考として明確に援用される）に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
（２．ＴＬＲアゴニスト）
微生物由来のＴＬＲのいくつかのアゴニスト（例えば、リポ多糖、ペプチドグリカン、フラジェリンおよびリポテイコ酸）が記載されている（Ａｄｅｒｅｍら、２０００，Ｎａｔｕｒｅ ４０６：７８２−７８７；Ａｋｉｒａら、２００１，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：６７５−６８０）。これらのリガンドのいくつかは、ＴＬＲの異なるパターンを発現する異なる樹状細胞サブセットを活性化し得る（Ｋａｄｏｗａｋｉら、２００１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：８６３−８６９）。従って、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲアゴニスト特性を有する微生物剤の任意の調製物であり得る。例えば、ペニシリン殺傷連鎖球菌因子ＯＫ−４３２は、リポテイコ酸（ＴＬＲ結合を通じてＴｈ１サイトカインの産生を誘導し得る）を含む（Ｏｋａｍｏｔｏら、２０００，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４９：３６３−３７６）。以下の表１は、いくつかの公知のＴＬＲリガンドを列挙する：
（表１）
（公知のＴＬＲリガンド）
【００３４】
【表１】
ＬＴＡ：リポテイコ酸
ＬＰＳ：リポ多糖
ＰＧ：ペプチドグリカン。
【００３５】
非翻訳ＤＮＡの特定のタイプは、ＴＬＲを活性化することにより免疫応答を刺激することが示されている。特に、ＣｐＧモチーフを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、広範に開示されており、リンパ球を活性化することが報告されている（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、「ＣｐＧモチーフ」とは、非メチル化シトシン−グアニン（ＣｐＧ）ジヌクレオチドとして定義される。ＣｐＧモチーフを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、本発明の方法に従ってＴＬＲアゴニストとして使用され得る。
【００３６】
多くの免疫刺激性ヌクレオチド配列は、当該分野において記載されており、標準アッセイ（これは、免疫応答の種々の局面（例えば、サイトカイン分泌、抗体産生、ＮＫ細胞活性化およびＴ細胞増殖）を示す）を用いて容易に同定され得る。例えば、米国特許第６，１９４，３８８号および同第６，２０７，６４６号；ＷＯ９８／５２９６２；ＷＯ９８／５５４９５；ＷＯ９７／２８２５９；ＷＯ９９／１１２７５；Ｋｒｉｅｇら、１９９５，Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６−５４９；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９２Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４０７２−４０７６；Ｂａｌｌａｓら、１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７（５）１８４０−１８４５；Ｋｌｉｎｍａｎら、１９９７，ＰＮＡＳ ９３（７）：２８７９−８３；Ｓｈｉｍａｄａら、１９８６，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７７：８０８−８１６；Ｃｏｗｄｅｒｙら、１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４５７０−７５；Ｈａｒｔｍａｎｎら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（３）：１６１７−２４を参照のこと。
【００３７】
免疫刺激性ヌクレオチド配列は、６塩基または塩基対より大きな任意の長さであり得る。免疫刺激性ヌクレオチド配列は、改変（例えば、３’ＯＨ基または５’ＯＨ基の改変、ヌクレオチド塩基の改変、糖成分の改変、およびホスフェート環の改変）を含み得る。免疫刺激性ヌクレオチド配列は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ならびに一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、あるいは他の改変ポリヌクレオチドであり得る。免疫刺激性ヌクレオチド配列は、１つ以上のパリンドローム領域を含んでも含まなくてもよい。
【００３８】
免疫刺激性ヌクレオチド配列は、従来のポリヌクレオチド単離手順を用いて単離され得るか、または当該分野で周知である技術および核酸合成装置（酵素的方法、化学的方法、および大きなオリゴヌクレオチド配列の分解を包含するが、これらに限定されない）を用いて合成され得る。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと）。
本発明の方法において有用である免疫刺激性ヌクレオチド配列の例としては、米国特許第６，２１８，３７１号；米国特許第６，１９４，３８８号；米国特許第６，２０７，６４６号；米国特許第６，２３９，１１６号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ００／０６５８８（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６２９０９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６２９１０；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／１２２２３；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／５５４９５；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／６２９２３（Ｄｙｎａｖａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）に開示されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
特に、米国特許第６，１９４，３８８号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）は、少なくとも以下の式を含むオリゴヌクレオチドを含む免疫刺激性核酸を開示する：
５’ Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４ ３’
ここで、ＣおよびＧは、非メチル化であり、ここでＸ１Ｘ２は、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＴ、ＣｐＡ、ＣｐＧ、ＴｐＡ、ＴｐＴ、およびＴｐＧからなる群から選択されるジヌクレオチドであり、そしてＸ３Ｘ４は、ＴｐＴ、ＣｐＴ、ＡｐＴ、ＴｐＧ、ＡｐＧ、ＣｐＧ、ＴｐＣ、ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＴｐＡ、ＡｐＡおよびＣｐＡからなる群から選択されるジヌクレオチドであり、そしてここで少なくとも１つのヌクレオチドは、リン酸骨格改変を有する。細胞への取り込みを容易にするために、好ましいＣｐＧ含有免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、サイズが８〜４０塩基対の範囲にあるとして記載される。この式に入る免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、本願発明の方法において有用である。
【００４０】
ＷＯ９９／６２９２３は、本発明と併用して使用され得る免疫刺激性ヌクレオチド配列のさらなる例を開示する。特に、中央ＣＧ配列を含むヘキサマー配列またはヘキサヌクレオチドを含む改変免疫刺激性ヌクレオチド配列（ここで、Ｃ残基は、求電子（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ）部分を有するＣ−５および／またはＣ−６への付加により改変される）が開示される。
【００４１】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、インビボ分解に対して比較的耐性にする構造改変により安定化され得る。安定化改変の例としては、ホスホロチオエート改変（すなわち、少なくとも１つのホスフェート酸素が硫黄に置換される）、非イオン性ＤＮＡアナログ（例えば、アルキルホスホネートおよびアリールホスホネート（ここで、荷電されたホスホネート酸素が、アルキル基またはアリール基に置換される））、ホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステル（ここで、荷電された酸素部分が、アルキル化される）が挙げられる。片方の末端または両末端にジオール（例えば、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール）を含むオリゴヌクレオチドもまた、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性であることが示されている（米国特許第６，１９４，３８８号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）を参照のこと）。
【００４２】
免疫刺激性ヌクレオチド配列はまた、標的細胞表面へのより高いアフィニティー結合を生じる、かつ／または標的細胞による細胞取り込みの増大を生じる送達複合体中にカプセル化され得るか、またはこの送達複合体に結合され得る。免疫刺激性ヌクレオチド配列送達複合体の例としては、ステロール（例えば、コレステロール）、脂質（例えば、カチオン性脂質、ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）またはリポソーム）、または標的細胞特異的結合因子（例えば、標的細胞特異的レセプターにより認識されるリガンド）との会合が挙げられる。好ましい複合体は、標的細胞による内在化の前に重大な脱共役を防ぐように、インビボで十分に安定でなければならない。しかし、この複合体は、オリゴヌクレオチドが機能的形態で放出されるように、細胞内で適切な条件下で切断可能であるべきである（米国特許第６，１９４，３８８号；ＷＯ９９／６２９２３）。
【００４３】
特に好ましい実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ９のアゴニストであり、例えば、Ｈｅｍｍｉら、２０００，Ｎａｔｕｒｅ ４０８：７４０−７４５およびＢａｕｅｒら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９２３７−９２４２に記載される。これまで、ＴＬＲ−９について公知のリガンドは、マウスにおいてＣｐＧ１６６８（ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ）（配列番号５）およびヒトにおいてＣｐＧ ２００６（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ）（配列番号１）のような、ＣｐＧモチーフを含む非メチル化オリゴヌクレオチド配列である（Ｂａｕｅｒら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９２３７−９２４２）。以下の表２は、ＴＬＲ９の好ましいアゴニストを列挙する：
（表２）
【００４４】
【表２】
上記に加えて、ＴＬＲまたはそのフラグメントを使用するリガンドスクリーニングは、他の分子（レセプターに対する結合親和性を有する低分子を含む）を同定するために行われ得る。例えば、Ｍｅｅｔｉｎｇｓ ｏｎ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ ０１７７２−１７４９を参照のこと。次いで、引き続く生物学的アッセイは、推定アゴニストが活性を提供し得るか否かを決定するために利用され得る。化合物が、本質的な刺激活性を有する場合、これは、レセプターを活性化し得、従って、リガンドの活性を刺激する（例えば、シグナル伝達を誘導する）という点でアゴニストである。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、ＴＬＲアゴニストの「有効量」は、所望の生物学的効果を誘発する量である。特に、有効量は、腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストの有効量と組み合わせた場合、腫瘍浸潤ＤＣの活性化を誘発するに十分である量である。
【００４６】
腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストの「有効量」は、所望の生物学的効果を誘発する量である。特に、有効量は、有効量のＴＬＲアゴニストと組み合わされた場合、腫瘍浸潤ＤＣの活性化を誘発するに十分な量である。
【００４７】
「組み合わせた」投与は、同時投与または連続投与の両方をいう。腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストは、同じ部位または異なる部位に送達または投与され得、同時または４８時間を超えない遅延の後に投与され得る。同時または組み合わせの投与は、本明細書中で使用される場合、腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストおよび／または抗原が、（ａ）同時、または（ｂ）一般的処置スケジュールの経過の間の異なる時間のいずれかに被験体に投与されることを意味する。後者の場合、その２つの化合物は、意図される効果を達成するために適した十分に近いときに投与される。
【００４８】
本発明を実施するに当たって使用される腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストは、天然産物と同一のアミノ酸配列を有する組換えタンパク質、あるいは天然産物由来ではあるが、その薬物動態特性を変化させ、そして／または本来のＤＣ活性化または抗腫瘍特性を保持しつつ、新たな生物学的特性を付加する改変を含む組換えタンパク質であり得る。
【００４９】
腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストの送達様式は、注射（静脈内、腫瘍内、皮内、筋肉内、皮下、または局所的注射を含む）によってであり得る。
【００５０】
本発明の特に好ましい実施形態において、この腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよびＴＬＲアゴニストは、腫瘍関連抗原と組み合わせて投与される。本発明において使用するための腫瘍関連抗原としては、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、ＨＫｅｒ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼおよびｐ５３が挙げられるが、これらに限定されない。この列挙は、網羅的であることが意図されるのではないが、単に、本発明の実施において使用され得る抗原の型の例示であることが意図される。
【００５１】
腫瘍関連抗原とは異なる他の抗原は、これらの抗原に対する特定の免疫応答を増大させるために、腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよびＴＬＲアゴニストとともに投与され得る。これらの抗原としては、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物により発現される、ネイティブ分子または改変分子が挙げられるが、これらに限定されない。この抗原はまた、アレルゲンおよび自己抗原を含み得、この場合、腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストとＴＬＲアゴニストとの組み合わせは、例えば、Ｔｈ２型免疫応答をＴｈ１型免疫応答に変換する、より都合の良い結果に向う免疫応答を再指向するために、抗原とともに投与される。
【００５２】
抗原の異なる組み合わせが使用され得、これらの組み合わせは、異なる人種グループ、性別、地理的分布、および疾患段階を有する最適な機能を示す。本発明の１つの実施形態において、少なくとも２以上の異なる抗原が、腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストとＴＬＲアゴニストとの組み合わせの投与とともに投与される。
【００５３】
腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストは、互いと組み合わせて投与され得るか、そして／または抗原と共に投与され得るか、あるいは種々の様式で互いにまたは抗原に連結され得る（例えば、ＷＯ９８／１６２４７；ＷＯ９８／５５４９５；ＷＯ９９／６２８２３を参照のこと）。例えば、ＴＬＲアゴニストおよび／または腫瘍由来ＤＣ阻害性因子および／または抗原は、互いに対して空間的に近く投与されてもよいし、混合物として投与されてもよい（すなわち、溶液中）。連結は、多くの方法（結合体化、キャプシド化、プラットホームへの固定もしくは表面への吸着を通じる方法が挙げられる）において達成され得る。
【００５４】
ＴＬＲアゴニストを腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよび／または抗原に結合体化するために、種々の方法が使用され得る。会合は、共有結合的相互作用および／または非共有結合的相互作用（高親和性および／または低親和性相互作用を含む）を介し得る。ＴＬＲアゴニストおよび腫瘍由来ＤＣ阻害性因子を連結し得る非共有結合的相互作用の例としては、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合およびファンデルワールス相互作用が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストがタンパク質または抗体であり、ＴＬＲアゴニストが、免疫刺激性ポリヌクレオチドである場合、例えば、その結合体のペプチド部分は、当該分野で周知の方法を使用する固体支持体化学によって、免疫刺激性ポリヌクレオチドの３’末端に結合され得る（例えば、Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら，１９９０ａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４９３−４９９およびＨａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら，１９９０ｂ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１８：５０１−５０５を参照のこと）。あるいは、潜在的反応性官能基（例えば、アミンまたはカルボキシル基、シトシン塩基のＣ５）を有する「リンカーアーム」の組み込みは、ペプチド連結についての取っかかりを提供する（Ｒｕｔｈ，４ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｐ．１２３）。免疫刺激性ポリヌクレオチドのペプチドへの連結はまた、高親和性、非共有結合相互作用（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン複合体）によって形成され得る。
【００５５】
ビオチニル基は、例えば、オリゴヌクレオチドの改変塩基に結合され得る（Ｒｏｇｅｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７：７６４３−７６５１）。ストレプトアビジン部分のペプチド部分への組み込みは、ストレプトアビジン結合体化ペプチドと、ビオチン化ポリヌクレオチドとの非共有結合複合体の形成を可能にする。
【００５６】
ＤＣの成熟をさらに活性化または刺激する様に設計される部分が、有利には、投与され得る。このような薬剤の例は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＲＡＮＫ−ＬまたはＲＡＮＫのアゴニスト、ＣＤ４０−ＬまたはＣＤ４０のアゴニストである。このような活性化剤は、ＴＬＲアゴニストとともに、以下に関与し得るさらなる成熟シグナルを提供し得る：ｉ）組織からリンパ器官に向かって、排出リンパを通じてＤＣの移動を駆動すること、およびｉｉ）免疫応答、特に、抗腫瘍応答（例えば、ＩＬ−１２およびＩＦＮα（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５２））を増強する分子を分泌するようにＤＣを活性化すること。
【００５７】
ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＦＬＴ３−Ｌはまた、有利には、本発明の方法において投与され得る。ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＦＬＴ３−Ｌは、循環ＤＣのメンバーを増大させる（このＤＣは、次いで、腫瘍中に局所的に増員され得る）目的で投与され得る。このプロトコルは、少なくとも５〜７日間の間、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＦＬＴ３−Ｌでの全身的な予備処置を含む。別の方法は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＦＬＴ３−Ｌの局所的投与によりＤＣ−前駆体（単球、ＤＣの類プラスマ細胞前駆体（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｏｆ ＤＣ）（これは、次いで、同じ部位に送達された抗原を拾い上げ得る））のＤＣへの局所的分化を支持することである。
【００５８】
さらに、ケモカインまたは複数のケモカインの組み合わせは、有利には、本発明の腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストとＴＬＲアゴニストとの組み合わせにおいて投与される。有利な効果を有することが示されたケモカインとしては、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２５、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１３、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１が挙げられる（例えば、Ｓｏｚｚａｎｉら，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：３２９２−３２９５；Ｓｏｚｚａｎｉら，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１９９３−２０００；Ｘｕら，１９９６，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６０；３６５−３７１；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：１３１７−１３２２；Ｒｏａｋｅら，１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １８１：２２３７−２２４７および欧州特許出願ＥＰ ０ ９７４ ３５７ Ａ１（１９９８年７月１６日に出願され、２０００年１月２６日に公開）を参照のこと）。一般に、腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニスト、ＴＬＲアゴニストおよび／または活性化剤および／またはサイトカインは、薬学的キャリア中の腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよびＴＬＲアゴニストおよび／または抗原および／または活性化剤および／またはサイトカインの有効量を含む薬学的組成物として投与される。これらの試薬は、例えば、生理学的に無害な安定化剤および賦形剤とともに、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤（例えば、免疫原性アジュバント）中でさらなる活性成分または不活性成分と、治療用途のために組み合わされ得る。薬学的キャリアは、本発明の組成物を患者に送達するために適した、任意の適合性の非毒性物質であり得る。
【００５９】
サイトカインおよび／またはケモカインは、必要に応じて、ケモカインまたはサイトカインまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体および標的化部分を含む標的構築物を使用して、腫瘍に送達され得る。本明細書中で言及される場合「標的化部分」は、腫瘍関連抗原または腫瘍の非癌性成分によって具体的に表される構造（例えば、腫瘍血管系）を認識または標的化する部分である。標的化部分の例としては、腫瘍関連抗原または腫瘍の非癌性成分によって具体的に表される構造を認識または標的化するペプチド、タンパク質、低分子、ベクター、抗体または抗体フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、この標的化部分は、ペプチド、タンパク質、低分子、ベクター（例えば、ウイルスベクター）、抗体または抗体フラグメントである。より好ましい実施形態において、標的化部分は、抗体または抗体フラグメントである。最も好ましい実施形態において、標的化ベクターは、ＳｃＦｖフラグメントである。
【００６０】
標的化部分は、ヒトにおいて以下に記載されてきたように、腫瘍細胞によって発現される抗原に特異的であり得る：例えば、葉酸レセプターについて（Ｍｅｌａｎｉら，１９９８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：４１４６−４１５４）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプター、上皮増殖因子レセプターおよびＣＡ１２５腫瘍抗原（Ｇｌｅｎｎｉｅら，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：４０３−４１０）。いくつかの他の腫瘍抗原は、標的として使用され得、優先的に発現されるか、独特に発現されるか、過剰発現されるか、または腫瘍の悪性細胞によって成熟形態で発現されるかのいずれかである（Ｂｏｏｎら，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：６８１−６８３）。これらとしては、以下が挙げられ得る：Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、ＨＫｅｒ ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、インスリン様増殖因子レセプター（ＩＧＦ−Ｒ）、テロメラーゼおよびｐ５３。この列挙は、網羅的であることを意図するのではないが、単に本発明の実施において使用され得る抗原の型の例示であることを意図する。あるいは、標的部分は、悪性細胞とは異なる腫瘍の成分によって、および特定の腫瘍血管において優先的に発現される抗原に特異的であり得る。αｖインテグリンのファミリー、ＶＥＧＦレセプターおよびプロテオグリカンＮＧ２は、このような腫瘍血管関連抗原の例である（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５４２−５４６）。
【００６１】
原発性癌および転移性癌の両方は、本発明に従って処置され得る。処置され得る癌の型としては、黒色腫、乳癌、膵臓癌、結腸癌、肺癌、神経膠腫、肝細胞癌、子宮内膜癌、胃癌、腸の癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、卵巣癌、精巣癌、肝臓癌、頭部および頸部の癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、眼の癌、膀胱癌、神経膠芽腫、および転移性癌が挙げられるが、これらに限定されない。用語「癌腫」とは、上皮組織または内分泌組織の悪性疾患をいい、呼吸器系癌腫、胃腸系癌腫、尿生殖器系癌腫、前立腺癌種、内分泌系癌腫、および黒色腫が挙げられる。この用語のように、転移性は、本明細書中で使用される場合、局所的リンパ節から離れた部位への腫瘍の拡がりとして規定される。
【００６２】
有効な治療に必要な試薬の量は、多くの異なる要因に依存し、これらの要因としては、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、および投与される他の医薬品が挙げられる。従って、処置の投薬量は、安全性および有効性を最適化するように力価測定されるべきである。特定の癌の処置のための有効用量を試験する動物は、ヒトの投薬量のさらなる推定指標を提供する。種々の考案が、例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９０）ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版（１９９０），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載されている。投与方法は、これらの文献中および以下で議論される（例えば、静脈内、腹腔内、または筋肉内投与、経皮的拡散など）。薬学的に受容可能なキャリアとしては、以下が挙げら得る：水、生理食塩水、緩衝液、および例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙに記載される他の化合物。徐放性処方物または徐放装置は、連続投与のために使用され得る。
【００６３】
腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニスト剤についての投薬量範囲は、アゴニスト／アンタゴニストの形態に依存して変化する。例えば、ＩＬ−１０レセプター抗体の有効用量は、代表的には、約０．０５〜約２５μｇ／ｋｇ／日、好ましくは、約０．１〜約２０μｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは、約１〜約１０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。ＴＬＲアゴニストのような免疫原性組成物について、その量は、ＴＬＲアゴニストの形態、個体、どのような状態が処置されるべきか、および当業者に明らかな他の要因に基づいて変化し得る。考慮されるべき要因としては、抗原性、ＴＬＲアゴニストが複合体化されるかどうか、またはアジュバントもしくは送達分子に共有結合されるかどうか、投与経路および投与される免疫用量の回数が挙げられる。このような要因は、当該分野で公知である。適切な投薬量範囲は、樹状細胞の所望の活性化を提供する範囲である。一般に、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの投薬量範囲は、例えば、以下のうちのほぼいずれかであり得る：０．１〜１００μｇ、０．１〜５０μｇ、０．１〜２５μｇ、０．１〜１０μｇ、１〜５００μｇ、１００〜４００μｇ、２００〜３００μｇ、１〜１００μｇ、１００〜２００μｇ、３００〜４００μｇ、４００〜５００μｇ。あるいは、この用量は、以下のうちのほぼいずれかであり得る：０．１μｇ、０．２５μｇ、０．５μｇ、１．０μｇ、２．０μｇ、５．０μｇ、１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇ。従って、用量範囲は、以下のうちのほぼいずれかの下限を有する：０．１μｇ、０．２５μｇ、０．５μｇおよび１．０μｇ；および以下のほぼいずれかの上限を有する：２５μｇ、５０μｇおよび１００μｇ。これらの組成物において、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチド対抗原のモル比は、変動し得る。各患者に与えられる絶対量は、例えば、バイオアベイラビリティー、クリアランス速度および投与経路のような薬理学的特性に依存する。
【００６４】
一般的に、処置は、化合物の最適用量未満のより小さな投薬量で開始される。その後、投薬量は、最適な効果がその状況下で達成されるまで、少量ずつ増大される。
【００６５】
特定の状況についての適切な投薬量および投与レジメンの決定は、当該分野の技術範囲内である。
【００６６】
ベクターによって投与される腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよびＴＬＲアゴニストの投薬量は、主に、使用される特定のベクターの有効性および患者の状態、ならびに処置される患者の体重または体表面積に依存する。用量の大きさはまた、特定のベクターまたは特定の患者の形質導入された細胞型の投与に付随する任意の有害な副作用の存在、性質および程度により決定される。処置において投与されるベクターの有効量の決定にあたって、医師は、ベクターの循環血漿レベル、ベクターの毒性、疾患の進行、および抗ベクター抗体の産生を評価する。核酸の代表的な用量は、投与経路および遺伝子送達系に大きく依存する。送達方法および投薬量に依存して、約１μｇ〜１００ｍｇまたはそれ以上に容易に範囲が決められ得る。一般に、ベクターに由来する裸の核酸の用量等価物は、代表的な７０ｋｇの患者について約１μｇ〜１００μｇであり、ウイルス粒子を含むベクターの用量は、治療的核酸の等価な量を得るために計算される。
【００６７】
本願発明の実施におけるＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＦＬＴ−Ｌの好ましい生物学的に活性な用量は、循環ＣＤ１４＋／ＣＤ１３＋前駆体細胞の数の最大限の増大；ＤＣ前駆体および成熟ＤＣの表面上の抗原提示分子の発現；Ｔ細胞に対する抗原提示活性；および／または成熟ＤＣ機能と一致する抗原依存性Ｔ細胞応答の刺激を誘導するその投薬の組み合わせである。皮下投与に使用されるＧＭ−ＣＳＦの量は、代表的には、約０．２５μｇ／ｋｇ／日〜約１０．０μｇ／ｋｇ／日、好ましくは、約１．０〜８．０μｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは、２．５〜５．０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。特定の患者についての有効量は、上記に示すパラメーターの１つ以上の大きな変化を測定することによって確立され得る。
【実施例】
【００６８】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって示され得る。
【００６９】
（実施例１）
（Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤樹状細胞は、骨髄由来樹状細胞に比較した場合、ＬＰＳ＋抗−ＣＤ４０＋ＩＦＮγの組み合わせに非応答性である）
この実施例において、本発明者らは、ＤＣ浸潤Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍が、混合された白血球反応（ＭＬＲ）におけるＩＬ−１２産生能力またはＩＬ−１２刺激能力を、骨髄由来ＤＣ（図１）と比べて考慮する場合、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗−ＣＤ４０抗体に対して応答しないことを示した。全ての腫瘍細胞培養を、１０％ ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１ｍＭ ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、Ｇｅｎｔａｌｌｉｎ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｕｎｉｏｎ，ＮＪ）、２×１０−５Ｍ β−２ メルカプトエタノール （Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ Ｐａｒｋ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）中で実施した。全ての細胞培養を、５％ ＣＯ２で、湿潤化されたインキュベーター中で、３７℃で実施した。Ｃ２６結腸癌およびＴＳＡ乳腺癌は、Ｍａｒｉｏ Ｃｏｌｏｍｂｏ（Ｉｓｔｉｔｕｔｏ Ｎａｚｉｏｎａｌｅ ｐｅｒ ｌｏ Ｓｔｕｄｉｏ ｅ ｌａ Ｃｕｒａ ｄｅｉ Ｔｕｍｏｒｉ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）によって提供された。Ｂ１６Ｆ０黒色種およびＬＬ２肺癌腫を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＬＧＣ，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た。マウスケモカイン６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ／ＣＣＬ２１を安定して分泌するように操作されたＣ２６−６ＣＫ細胞株は、本発明者らによって以前に記載された（Ｖｉｃａｒｉら、２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：１９９２−２０００）。Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍由来のＴＩＤＣを、抗−ＣＤ１１ｃ磁気ビーズ（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して富化した。骨髄由来ＤＣを、骨髄前駆体をＧＭ−ＣＳＦ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｕｎｉｏｎ，ＮＪ）およびＴＮＦα（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）と共に５日間培養することによって得た。活性化を、１０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮγ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および２０μｇ／ｍｌ精製ＦＫＧ４５．５アゴニスト抗−ＣＤ４０抗体（ＡＧ Ｒｏｌｉｎｋ，Ｂａｓｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからのある種の贈与物）を培養培地に添加することによって、一晩実施した。図１Ａは、ＦＡＣＳ（ＣＤ１１ｃ陽性細胞に対してゲートされた）によるＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０およびＣＤ８６の表面発現の分析を示す。図１Ｂは、２０時間（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａと共に２．５時間インキュベーションすることを含む）後のＣＤ１１ｃ＋細胞によるＩＬ−１２ｐ４０の細胞内発現を示す。図１Ｃにおいて、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗−ＣＤ４０で刺激された混合白血球反応ＴＩＤＣまたは骨髄由来ＤＣを照射し、そして一定数の富化された同種異系Ｔ細胞（３×１０５
Ｔ細胞）の存在下で変動数で５日間培養した。増殖を、培養の最後の１８時間の間の放射性チミン取り込みによって測定した。図１Ｄは、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗−ＣＤ４０で活性化後の、特異的ＥＬＩＳＡによる培養上清のＩＬ−１２ ｐ７０の測定を示す。
【００７０】
これらの合わせた結果は、樹状細胞浸潤Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍が、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗−ＣＤ４０の組合せでの刺激の際に、樹状細胞の代表的な機能（すなわち、同種異系Ｔ細胞を刺激する能力およびＩＬ−１２を分泌する能力）を獲得し得ないことを示唆する。これらの弱った機能は、腫瘍と樹状細胞の相互作用の結果でありそうである。
【００７１】
（実施例ＩＩ）
（ＣｐＧ １６６８＋抗−ＩＬ１０Ｒ組み合わせは、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤樹状細胞におけるＩＬ−１２およびＴＮＦαを回復する）
この実施例において、本発明者らは、ＣｐＧ １６６８および抗−ＩＬ１０Ｒ抗体の組み合わせ投与が、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤樹状細胞においてＩＬ−１２およびＴＮＦαを回復することを示した（図２）。
【００７２】
Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍からのＴＩＤＣを、抗−ＣＤ１１ｃ磁気ビーズを使用して富化した。活性化を、ＧＭ−ＣＳＦ １０ｎｇ／ｍｌの存在下で一晩実施した。アクチベーターを、１０ｎｇ／ｍｇ ＬＰＳ、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮγ、２０μｇ／ｍｌ ＦＫＧ４５．５アゴニスト抗−ＣＤ４０抗体、５μｇ／ｍｌ ＣｐＧ １６６８（配列：ＴＣＣ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−ＴＴＣ−ＣＴＧ−ＡＴＧ−ＣＴ（ホスホロチオエート改変）ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０μｇ／ｍｌの抗−ＩＬ１０Ｒ（クローン１Ｂ１３Ａ、Ｃａｓｔｒｏら、２０００，Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１５２９−１５３４）で使用した。ＩＬ−１２、ｐ７０およびＴＮＦαを、２４時間刺激後、特異的ＥＬＩＳＡを使用して、培養上清において測定した。
【００７３】
全部で、これらの結果は、ＣｐＧ １６６８は、それ自体、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤ＤＣによるＩＬ−１２産生を誘導しないことを示す。抗−ＩＬ１０Ｒは、それ自体効果を有さない（示さず）か、またはＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗−ＣＤ４０と合わせた場合、最小の効果を有する。抗−ＩＬ１０ＲとＣｐＧ １６６８との組み合わせのみが、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤ＤＣから生体活性なＩｌ−１２およびＴＮＦαの有意な産生を誘導し得た。
【００７４】
（実施例ＩＩＩ）
（ＣｐＧ １６６８＋抗−ＩＬ１０Ｒの組み合わせは、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤樹状細胞においてＭＬＲ刺激能力を回復する）
この実施例において、本発明者らは、ＣｐＧ １６６８と抗−ＩＬ−１０レセプター抗体との組み合わせた投与が、ＭＬＲ刺激能力を回復することを示した。
【００７５】
Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍由来のＴＩＤＣを、抗−ＣＤ１１ｃ磁気ビーズを使用して富化し、ＧＭ−ＣＳＦおよびＬＰＳ、ＩＦＮγ抗−ＣＤ４０、抗−ＩＬ１０ＲとＣｐＧ １６６８との種々の組み合わせを使用して一晩培養した。次いで、細胞を、照射し、一定数の富化された同種異系Ｔ細胞（３×１０５ Ｔ細胞）の存在下で、５日間、変動数で培養した。増殖を、培養の最後の１８時間の間、放射性チミジン取り込みによって測定した。結果は、腫瘍浸潤ＤＣが、ＭＬＲアッセイにおいて弱い刺激物質細胞であるが、これらの刺激能力が、ＣｐＧ１６６８で最小に増強され得、抗−ＩＬ１０Ｒ＋ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗−ＣＤ４０の組み合わせでさらに増強され、そして抗−ＩＬ１０ＲとＣｐＧ １６６８との組み合わせで最高に増強されることを示す。従って、この実施例は、抗−ＩＬ１０Ｒ＋ＣｐＧ １６６８が、ＭＬＲにおけるＤＣ刺激能力を回復する最も適切な組み合わせであることを示す。これは、インビボでのナイーブなＴ細胞のより良いプライミングに解釈され得、従って、癌を処置するためのＩＬ−１０アンタゴニストとＴＬＲ９アゴニストとの組み合わせを使用する場合、腫瘍に対してより良いＴ細胞媒介免疫応答に解釈され得る。
【００７６】
（実施例ＩＶ）
（Ｃ２６野生型由来の腫瘍浸潤樹状細胞および他の組織学的（ｈｉｓｔｉｏｌｏｇｉｃａｌ）性質由来の腫瘍は、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗−ＣＤ４０に非応答性であるが、ＣｐＧ
１６６８＋抗−ＩＬ１０Ｒに応答してＩＬ−１２を産生する）
この実施例は、Ｃ２６野生型由来腫瘍浸潤樹状細胞および他の組織学的性質由来の腫瘍が、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗−ＣＤ４０に非応答性であるが、ＣｐＧ １６６８＋抗−ＩＬ１０Ｒに応答してＩＬ−１２を産生することを示す。
【００７７】
Ｃ２６結腸癌細胞、Ｂ１６黒色腫およびＬＬ２肺癌腫瘍由来のＴＩＤＣは、全て皮下で増殖し、抗−ＣＤ１１ｃ磁気ビーズを使用して富化し、ＧＭ−ＣＳＦおよびＬＰＳ、ＩＦＮγ、抗−ＣＤ４０、抗−ＩＬ１０ＲとＣｐＧ １６６８の種々との組み合わせの存在下で、一晩培養した。２０時間（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａと共に２．５時間インキュベーションすることを含む）後の、ＩＬ−１２ｐ４０の細胞内発現 対 ＣＤ１１ｃの表面発現のＦＡＣＳ分析。図４は、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍について見出されるように、親Ｃ２６腫瘍および異なる組織学的起源の腫瘍から単離されたＤＣが、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、抗−ＣＤ４０での活性化に対して応答せず、ＩＬ−１２を産生することによってＴＬＲ−９アゴニストＣｐＧ １６６８と抗−ＩＬ１０Ｒとの組み合わせに対して応答することを示す。従って、これらの観察は、ＩＬ１０アンタゴニストとＴＬＲ−９アゴニストとの組合せが、種々の腫瘍において有効な療法であることを示唆する。
【００７８】
（実施例Ｖ）
（Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍モデルにおけるＣｐＧ１６６８＋抗−ＩＬ１０Ｒ抗体の治療効果）
１×１０５ Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍細胞を、７匹の８週齢雌マウスＢＡＬＢ／ｃの群において、０日目にｓ．ｃ．で移植し、以下のように処置した：
１０μｇのＣｐＧ １６６８細胞を、７日目、１４日目、および２１日目で、腫瘍周辺（腫瘍が小さすぎる場合）または腫瘍内に注射した。
【００７９】
２５０μｇの抗−ＩＬ１０Ｒ精製抗体を、７日目に開始して、１週間に２回腹腔内に注射した（２４日目に中止した）。コントロール抗体は、精製ＧＬ１１３抗体であった。
【００８０】
腫瘍発達を、触診およびカリパスを使用した腫瘍測定によって、１週間に３回評価した。腫瘍容積＝Ｉ２×Ｌ×０．４であり、Ｉは、小直径であり、Ｌは、大直径である。マウスを、腫瘍が、１５００ｍｍ３を超えた場合または人道的基準のために屠殺した。
【００８１】
図５は、コントロール抗体または抗−ＩＬ１０Ｒ抗体を単独で注射された全てのマウスが、７〜１０日以内に腫瘍を発達させたことを示し、結局、約４週間で動物の屠殺を導いた。ＴＬＲ−９アゴニストＣｐＧ １６６８の注射は、１／７のマウスが、腫瘍を発達しなかったので、わずかな効果を有した。さらに、生存は、このＣｐＧ １６６８群において僅かにより良好であり、腫瘍の平均容積は、３週間後のコントロール群より小さかった。対照的に、ＣｐＧ １６６８と抗−ＩＬ１０Ｒとの組合せで処置されたマウスは、触知可能な腫瘍を発達するが、７匹のうち６匹のマウスについてこれらの腫瘍を拒絶した。続いて、これらのマウスは、残りの実験について腫瘍を有さないままであった。これらの結果は、ＴＬＲ−９アゴニストとＩＬ−１０アンタゴニストとの組み合わせが、Ｃ２６−６ＣＫモデルにおいて治療価値を有することを示し、このことは、この組合せが、ヒトを含む他の腫瘍を処置するために使用され得ることを示唆する。
【００８２】
（実施例ＶＩ）
（ＣｐＧ １６６８＋抗−ＩＬ１０Ｒ抗体のＣ２６腫瘍モデルにおける治療効果）
５×１０４ Ｃ２６腫瘍細胞を、７匹の８週齢雌マウスＢＡＬＢ／ｃの群において０日目で、ｓ．ｃ．移植し、以下のように処置した：
５μｇのＣｐＧ １６６８を、７日目、１４日目、および２１日目に腫瘍内に注射した。
【００８３】
２５０μｇの抗−ＩＬ１０Ｒ精製抗体を、７日目、１４日目、および２１日目に腹腔内注射した。コントロール抗体は、精製ＧＬ１１３抗体であった。
【００８４】
腫瘍発達を、触診およびカリパスを使用した腫瘍測定によって、１週間に３回評価した。腫瘍容積＝Ｉ２×Ｌ×０．４であり、Ｉは、小直径であり、Ｌは、大直径である。マウスを、腫瘍が、１５００ｍｍ３を超えた場合または人道的基準のために屠殺した。
【００８５】
図６は、コントロール抗体、ＣｐＧ１６６８または抗−ＩＬ１０Ｒ抗体を単独で注射された全てのマウスが、７日以内に腫瘍を発達させたことを示し、結局、約３〜４週間で動物の屠殺を導いた。対照的に、ＣｐＧ １６６８と抗−ＩＬ１０Ｒとの組合せで処置されたマウスは、触知可能な腫瘍を発達するが、７匹のうち６匹のマウスについてこれらの腫瘍を拒絶した。続いて、これらのマウスは、残りの実験について腫瘍を有さないままであった。これらの結果は、ＴＬＲ−９アゴニストとＩＬ−１０アンタゴニストとの組み合わせが、Ｃ２６モデルにおいて治療価値を有することを示し、このことは、この組合せが、ヒトを含む他の腫瘍を処置するために使用され得ることを示唆する。
【００８６】
（実施例ＶＩＩ）
（Ｂ１６Ｆ０黒色腫モデルにおけるＣｐＧ１６６８＋抗−ＩＬ１０Ｒ抗体の治療効果）
５×１０４ Ｂ１６Ｆ０腫瘍細胞を、７匹の８週齢雌マウスＣ５７ＢＬ／６の群において、０日目にｓ．ｃ．で移植し、以下のように処置した：
５μｇのＣｐＧ １６６８細胞を、７日目、１４日目、および２１日目で、腫瘍内に注射した。
【００８７】
２５０μｇの抗−ＩＬ１０Ｒ精製抗体を、７日目、１４日目、および２１日目に腹腔内に注射した。コントロール抗体は、精製ＧＬ１１３抗体であった。
【００８８】
腫瘍発達を、触診およびカリパスを使用した腫瘍測定によって、１週間に３回評価した。腫瘍容積＝Ｉ２×Ｌ×０．４であり、Ｉは、小直径であり、Ｌは、大直径である。マウスを、腫瘍が、１５００ｍｍ３を超えた場合または人道的基準のために屠殺した。
【００８９】
図７は、コントロール抗体、ＣｐＧ１６６８または抗−ＩＬ１０Ｒ抗体を単独で注射された全てのマウスが、７日以内に腫瘍を発達させたことを示し、結局、約３〜４週間で動物の屠殺を導いた。ＣｐＧ １６６８単独は、生存に対して、わずかな効果を有した。対照的に、ＣｐＧ １６６８と抗−ＩＬ１０Ｒとの組合せで処置されたマウスは、触知可能な腫瘍を発達するが、７匹のうち６匹のマウスについてこれらの腫瘍を拒絶した。続いて、これらのマウスは、残りの実験について腫瘍を有さないままであった。これらの結果は、ＴＬＲ−９アゴニストとＩＬ−１０アンタゴニストとの組み合わせが、Ｂ１６Ｆ０モデルにおいて治療価値を有することを示し、このことは、この組合せが、ヒトを含む他の腫瘍を処置するために使用され得ることを示唆する。
【００９０】
（実施例ＶＩＩＩ）
Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍由来の腫瘍浸潤ＤＣは、抗−ＩＬ１０抗体とＣｐＧ １６６８との組み合わせに応答してＩＬ−１２を産生し得る。
【００９１】
Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍由来のＴＩＤＣを、抗−ＣＤ１１ｃ磁気ビーズを使用して富化し、ＧＭ−ＣＳＦおよび抗−ＩＬ１０精製抗体とＣｐＧ １６６８との種々の組み合わせの存在下で一晩培養した。２０時間（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａと共に２．５時間インキュベーションすることを含む）後の、ＩＬ−１２ｐ４０の細胞内発現 対 ＣＤ１１ｃの表面発現のＦＡＣＳ分析。
【００９２】
図８は、ＣｐＧ １６６８と抗−ＩＬ１０Ｒとの組み合わせが、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得ることを示し、このことは、ＩＬ１０それ自体のアンタゴニストが、有効量のＴＩＲ−９アゴニストと組み合わせる場合に、癌の処置において有効であることを示唆する。
【００９３】
（実施例ＩＸ）
（骨髄由来ＤＣ活性化のＣ２６腫瘍由来の上清による阻害を、抗−ＩＬ１０Ｒおよび／またはインドメタシン（シクロオキシゲナーゼのインヒビター）によって回復し得る）
骨髄由来ＤＣを、Ｃ２６腫瘍由来の１０％ｖ／ｖの上清の存在下または非存在下で、５日間、骨髄前駆体をＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαと共に培養することによって得た。腫瘍上清を調製するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて皮下増殖した０．５ｃｍのＣ２６腫瘍を、切除し、切り刻み、次いで、１０ｍｌ ＤＭＥＭ中で４８時間培養した。得られた上清を、０．２μｍで濾過し、使用の前に凍結した。この上清は、特異的ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって決定されるように、０．２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０および５０ｎｇ／ｍｌのＰＧＥ２を含んだ。上清中のＰＧＥ２合成を阻害するために、シクロオキシゲナーゼのインヒビター（インドメタシン（Ｓｉｇｍａ））を、４８ｈ培養の間、１μｇ／ｍｌで添加した。
【００９４】
５日後、骨髄ＤＣを、１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ１０Ｒ抗体の存在下または非存在下で、最適用量のＬＰＳ、ＩＦＮγおよび抗−ＣＤ４０抗体の異なる組み合わせを用いて活性化した。ＤＣの活性化を、ＦＡＣＳによる共刺激分子ＣＤ４０およびＣＤ８６の発現によって測定し、そして細胞内染色によって検出されるＩＬ−１２の産生によって測定した。
【００９５】
図９は、Ｃ２６腫瘍上清が、ＤＣ活性化を阻害し得ることを示す。インドメタシンまたは抗−ＩＬ１０Ｒの存在下で作られる上清のＤＣ培地への添加によって効果が部分的に軽減される一方、両方の組み合わせは、ＣＤ４０およびＣＤ８６のアップレギュレーションならびにＩＬ−１２発現を十分回復し得る。
【００９６】
これらの実験は、シクロオキシゲナーゼの産物（特に、プロスタグランジン）がまた、腫瘍由来ＤＣ阻害性因子であることを強く示唆する。
【００９７】
（実施例Ｘ）
（ＣｐＧ １６６８＋インドメタシンのＣ２６−６ＣＫ腫瘍モデルにおける治療効果）
５×１０４ Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍細胞を、７匹の６週齢雌マウスＢＡＬＢ／ｃの群において０日目で、ｓ．ｃ．移植し、以下のように処置した：
５μｇのＣｐＧ １６６８を、７日目、１４日目、および２１日目に腫瘍内に注射した。
【００９８】
飲料水中の５μｇ／ｍｌのインドメタシンを、５日目に開始し、２８日目まで自由摂取。
【００９９】
腫瘍発達を、触診によって、１週間に３回評価した。マウスを、腫瘍が、１５００ｍｍ３を超えた場合または人道的基準のために屠殺した。
【０１００】
図１０は、全てのコントロールマウスが、７日以内に腫瘍を発達させたことを示し、結局、約３〜４週間で動物の屠殺を導いた。ＣｐＧ群またはインドメタシン群における１／７のマウスのみが、腫瘍を発達させなかった。対照的に、ＣｐＧ １６６８とインドメタシンとの組合せで処置されたマウスの４／７は、腫瘍を発達しなかった。これらの結果は、ＴＬＲ−９アゴニストとシクロオキシゲナーゼのインヒビターとの組合せが、Ｃ２６−６ＣＫモデルにおいて治療価値を有することを示し、このことは、この組合せが、ヒトを含む他の腫瘍を処置するために使用され得ることを示唆する。
【０１０１】
本発明の多くの改変およびバリエーションは、本発明の意図および範囲を逸脱することなくなされ得、このことは、当業者に明らかである。本明細書中に記載される特定の実施形態は、例のみのために提供され、本発明は、添付の特許請求の範囲の用語に加えてこのような特許請求の範囲が権利を与える等価物の全範囲によってのみ限定される。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、疾患状態（特に癌）の処置における、樹状細胞（ＤＣ）の操作および活性化のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
樹状細胞（ＤＣ）は、生得的免疫応答および適応的免疫応答を開始および調節することにおいて、重要な役割を果たす（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５２）。癌に関して、樹状細胞は、腫瘍抗原をサンプリングおよび提示し得、そして腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞をプライムし得る（Ｃｈｉｏｄｏｎｉら、１９９９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１２５−１３３）。さらに、樹状細胞は、抗腫瘍免疫応答において役割を果たすサイトカインであるインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）およびインターフェロンα（ＩＦＮα）の重要な供給源であり得る（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５２）。従って、近年、研究者らは、癌の処置におけるＤＣの活性を調査しようと試みてきた（例えば、Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら、１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：９９６−１００３；Ｈｓｕら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：５２；Ｍｕｒｐｈｙら、１９９６，Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２９：３７１；Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら、１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：９９６−１００３；Ｄａｌｌａｌら、２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：５８３−５８８；Ｚｅｉｄら、１９９３，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２５：３３８；Ｆｕｒｉｈａｔｏｎ ら、１９９２，６１：４０９；Ｔｓｕｊｉｔａｎｉら、１９９０，Ｃａｎｃｅｒ ６６：２０１２；Ｇｉａｎｎｉら、１９９１，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１８７：４９６；Ｍｕｒｐｈｙら、１９９３，Ｊ．Ｉｎｖ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１００：３３５８を参照のこと）。
【０００３】
適切な免疫応答を誘導するために、樹状細胞は、病原体、死細胞および／またはＴ細胞によって送達される活性化シグナルを受容しつつ、抗原発現の部位にてリクルートされ、抗原を取り込み、そして二次リンパ器官に移動しなければならない。いくつかの研究が、ヒト腫瘍におけるＤＣの状態に取り組んでおり、そして腫瘍内または癌患者における、損傷したＤＣ機能を報告している（Ｂｅｌｌら、１９９９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１４１７−１４２６；Ｓｃａｒｐｉｎｏら、２０００，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５６：８３１−８３７；Ｌｅｓｐａｇｎａｒｄら、１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８４：３０９−３１４；Ｅｎｋら、１９９７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７３：３０９−３１６）。さらに、いくつかの研究において、活性化ＤＣの観察は、陽性の予後因子であった（Ｅｎｋら、１９９７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７３：３０９−３１６）。従って、腫瘍において樹状細胞の活性化を増強することは、癌を処置するための有用な方法であり得る。
【０００４】
腫瘍は、ＤＣのナビゲーションを妨害するか、または必要な活性化シグナルを提供できないことによって、免疫系を逃れ得る（Ｖｉｃａｒｉら、２００１，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，印刷中）。特に、腫瘍は、病原体関連分子パターン（Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｔｅｒｎ （ＰＡＭＰ））の多くを発現しないようであり（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖら、２０００，Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１８５−１８８）、この病原体関連分子パターンは、ＤＣ活性化を誘発する（Ｒｅｉｓら、２００１，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４：４９５−４９８）。
【０００５】
近年、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）分子が、ＰＡＭＰに対するレセプターの重要なクラスとして同定されている。Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）は、微生物病原体に特異的な分子パターンを認識する（Ａｄｅｒｅｍら、２０００，Ｎａｔｕｒｅ ４０６：７８２−７８７）。１０種の別個のＴＬＲ分子が、ヒトにおいて記載されている。ＷＯ ９８／５０５４７（１９９９年１１月１２日公開）は、ＴＬＲ２〜１０を開示している。現在公開された命名は、ヒトにおいて１０種の別個のＴＬＲを含むことに、注目すべきである。これらのうち９種は、ＷＯ ９８／５０５４７のＴＬＲ−２〜ＴＬＲ−１０であるが、数字は一致していない（Ｋａｄｏｗａｋｉら、２００１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：８６３−８６９）。
【０００６】
微生物分子によって誘発されるＴＬＲを介したシグナル伝達は、ＤＣを強力に活性化して、同時刺激分子（ＣＤ８０およびＣＤ８６）をアップレギュレートし（Ｈｅｒｔｚら、２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：２４４４−２４５０）、そして、炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１２）を産生する（Ｔｈｏｍａ−Ｕｓｚｙｎｓｋｉら、２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３８０４−３８１０）。現在、多数の研究が、ＴＬＲタンパク質（細菌リポポリサッカリド（ＴＬＲ−４）、フラジェリン（ＴＬＲ−５）、リポタイコ酸（ＴＬＲ−２）およびポリＩ：Ｃ（ＴＬＲ−３）を含む）に対するリガンドとして作用する、広範な種々の化学的に多様な細菌産物を同定している。より具体的には、ＴＬＲ−９は、免疫刺激性細菌性ＣｐＧ ＤＮＡについてのリガンドであることが示されている（Ｈｅｍｍｉら、２０００，Ｎａｔｕｒｅ ４０８：７４０７４５；Ｗａｇｎｅｒ，２００１，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４：４９９−５０２）。
【０００７】
さらに、腫瘍は、ＤＣの分化または機能を阻害する因子の分泌を促進する。癌においてＤＣ機能を阻害し得る腫瘍関連因子のうちの１つは、ＩＬ−１０である。多数のヒトの原発性腫瘍または転移が、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を分泌することが、報告されている（Ｃｈｏｕａｉｂら、１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８：４９９３−４９７）。この因子は、ＤＣ機能の強力な調節因子として記載されている。実際、ＩＬ−１０は、ＩＬ−１２産生を負に調節し得、そしてＤＣのＴ細胞同時刺激能を阻害し得る（ＤｅＳｍｅｄｔら、１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．２７：１２２９−１２３５；Ｃａｕｘら、１９９４，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１１７７−１１８５）。しかし、ＤＣ阻害シグナル（例えば、ＩＬ−１０）をアンタゴナイズして、ＤＣの活性化を改善する能力、従って、癌に対する宿主免疫応答を改善する能力は、いまだ未知である。
【０００８】
癌治療の現在利用可能な方法（例えば、外科的治療、放射線療法、化学療法および免疫生物学的方法）は、限られた成功を得ているか、または深刻かつ所望されない副作用を生じるかのいずれかである。多数の臨床的に診断された固形腫瘍（ここで、この腫瘍は、局在化した増殖である）において、外科的除去は、主な処置手段とみなされている。しかし、手術後およびいくらかの遅延期間後に、しばしば、元の腫瘍が転移しているのが見られ、その結果、癌浸潤の二次的部位が全身に広がっており、そして患者は二次的癌増殖の後に死亡する。化学療法は、癌の処置において広く使用されているが、これは、通常、細胞増殖の防止に基づく全身的処置である。従って、化学療法は、全ての増殖している細胞（正常な細胞を含む）に影響を与え、所望でなく、かつしばしば深刻な副作用を導く、非特異的な処置様式である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、異常な免疫応答から生じると考えられる疾患（特に癌）を処置するための新規方法についての必要性が存在する。特に、腫瘍浸潤樹状細胞の活性化を促進する因子の解明は、腫瘍特異的免疫応答を増強するための、樹状細胞の操作を可能にする。樹状細胞の操作を介した、免疫応答の調節のための方法および治療は、これらの疾患の処置において有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、腫瘍浸潤樹状細胞の活性化を促進することによる、癌のような疾患に対する免疫治療のための材料および方法を提供することによって、上記の必要性を満たす。ＩＬ−１０アンタゴニストとＴＬＲ−９アゴニストとの併用投与は、有効な癌治療であることが現在発見されている。従って、本発明は、癌を処置する方法を提供し、この方法は、有効量のＴＬＲアゴニストと組み合わせて、有効量の腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストを、このような処置を必要とする個体に投与する工程を包含する。
【００１１】
好ましい実施形態において、腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストは、樹状細胞機能を阻害することが公知である、以下の腫瘍関連因子のいずれかのアンタゴニストであり得る：ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、ＴＧＦ−β、プロスタグランジン、ガングリオシド、Ｍ−ＣＳＦおよびＩＬ−１０。より好ましくは、この腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストは、ＩＬ−１０アンタゴニストである。より好ましくは、このＩＬ−１０アンタゴニストは、ＩＬ−１０サイトカインの直接的アンタゴニストまたはＩＬ−１０レセプターのアンタゴニストのいずれかである。特定の実施形態において、この腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストは、抗体もしくは抗体フラグメント、低分子またはアンチセンスヌクレオチド配列である。より好ましくは、この腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストは、抗ＩＬ−１０レセプター抗体である。
【００１２】
特定の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、低分子、組換えタンパク質、抗体もしくは抗体フラグメント、ヌクレオチド配列またはタンパク質−核酸配列である。好ましい実施形態において、このＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ−９のアゴニストである。より好ましくは、ＴＲＬアゴニストは、免疫刺激ヌクレオチド配列である。なおより好ましくは、この免疫刺激ヌクレオチド配列は、ＣｐＧモチーフを含む。最も好ましくは、この免疫刺激ヌクレオチド配列は、以下からなる群より選択される：ＣｐＧ ２００６（表２および配列番号１）；ＣｐＧ ２２１６（表２および配列番号２）；ＡＡＣ−３０（表２および配列番号３）；ならびにＧＡＣ−３０（表２および配列番号４）。この免疫刺激ヌクレオチド配列は、ホスホロチオエート改変のような構造的改変によって安定化され得るか、またはカチオン性リポソーム中にカプセル化されて、インビボの薬物動態および腫瘍標的化を改善し得る。
【００１３】
特定の実施形態において、この腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストは、静脈内、腫瘍内、皮内、筋内、皮下または局所的に投与される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、この腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよびＴＬＲアゴニストは、融合タンパク質の形態で投与されるか、または他の方法で互いに連結される。
【００１５】
本発明の方法は、少なくとも１つの腫瘍関連抗原の投与をさらに含み得る。腫瘍抗原は、融合タンパク質の形態で送達され得るか、またはＴＬＲアゴニストおよび／または腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストに連結され得る。
【００１６】
本発明のなお別の局面において、活性化因子（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＲＡＮＫ−ＬまたはＲＡＮＫのアゴニスト、ＣＤ４０−ＬまたはＣＤ４０のアゴニスト、４１ＢＢＬまたは４１ＢＢのアゴニスト、あるいはＴＮＦ／ＣＤ４０レセプターファミリーのメンバーの他の推定リガンド／アゴニスト）もまた、投与される。
【００１７】
本発明のなお別の局面において、サイトカインは、腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストと組み合わせて、これらの前またはこれらと同時にのいずれかで、投与される。１つの好ましい局面において、これらのサイトカインは、組換えタンパク質または組換え融合タンパク質または送達ベクターのいずれかとして使用される、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦまたはＦＬＴ−３Ｌである。これらの因子の投与は、前駆体からの特定のサブセットのＤＣの生成を刺激し、それによって、腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよびＴＬＲアゴニストの組み合わせを用いた活性化を受けやすい腫瘍浸潤樹状細胞の数を増加させる。
【００１８】
本発明のなお別の局面において、選択されたケモカインが、腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストの前にかまたはこれらと同時に投与される。１つの好ましい局面において、これらのケモカインは、組換えタンパク質または組換え融合タンパク質または送達ベクターのいずれかとして使用される、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２からなる群より選択される。最も好ましい局面において、このケモカインは、腫瘍内注射後に直接か、組換え抗体のような標的化構築物を介してか、または腫瘍への優先的送達を可能にする特定の小胞中のカプセル化を介してかのいずれかで、腫瘍に送達される。ケモカインの投与は、ＤＣの特定のサブセットの腫瘍への補充を促進し、それによって、腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストとＴＬＲアゴニストとの組み合わせを用いた活性化を受けやすい腫瘍浸潤樹状細胞の数を増加させ得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
癌を処置する方法であって、該方法は、そのような必要のある個体に、有効量の腫瘍由来樹状細胞（ＤＣ）阻害因子アンタゴニストを、有効量のＴＬＲアゴニストと組み合わせて投与する工程を包含する、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、前記腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストが、ＩＬ−６アンタゴニスト、ＶＥＧＦアンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＯＸ−４０アンタゴニスト、ＴＧＦ−Ｂアンタゴニスト、プロスタグランジンアンタゴニスト、ガングリオシドアンタゴニスト、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニスト、およびＩＬ−１０アンタゴニストからなる群より選択される、方法。
（項目３）
前記腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストが、ＩＬ−１０アンタゴニストである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ＩＬ−１０アンタゴニストが、ＩＬ−１０のアンタゴニストおよびＩＬ−１０レセプターのアンタゴニストからなる群より選択される、項目３に記載の方法。
（項目５）
項目４に記載の方法であって、前記ＩＬ−１０アンタゴニストが、以下：
ａ）組換え体；
ｂ）天然のリガンド；
ｃ）低分子；
ｄ）抗体または抗体フラグメント；
ｅ）アンチセンスヌクレオチド配列；あるいは
ｆ）可溶性ＩＬ−１０レセプター分子、
である、方法。
（項目６）
前記抗体が、モノクローナル抗体である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記抗体が、抗ＩＬ−１０Ｒモノクローナル抗体である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記ＴＬＲアゴニストが、以下：
ａ）組換え体；
ｂ）天然のリガンド；
ａ）免疫刺激性ヌクレオチド配列；
ｂ）低分子；
ｃ）精製された細菌抽出物；
ｄ）不活性化された細菌調製物、
である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ＴＬＲアゴニストが、ＴＬＲ−９のアゴニストである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ＴＬＲアゴニストが、免疫刺激性ヌクレオチド配列である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記免疫刺激性ヌクレオチド配列が、ＣｐＧモチーフを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記免疫刺激性ヌクレオチドが、ＣｐＧ ２００６（配列番号１）、ＣｐＧ ２２１６（配列番号２）、ＡＡＣ−３０（配列番号３）、およびＧＡＣ−３０（配列番号４）からなる群より選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記免疫刺激性ヌクレオチド配列が、ホスホロチオネート−改変のような構造改変によって安定化される、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記免疫刺激性ヌクレオチド配列が、カチオン性リポソームにカプセル化される、項目１０に記載の方法。
（項目１５）
前記腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストが、抗ＩＬ−１０Ｒモノクローナル抗体であり、そして前記ＴＬＲアゴニストがＣｐＧ ２００６（配列番号１）である、項目１に記載の方法。
（項目１６）
項目１に記載の方法であって、該方法が、前記腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストを送達部位に持続放出させる物質を投与する工程をさらに包含する、方法。
（項目１７）
前記腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストが、静脈内投与、腫瘍内投与、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与または局所投与される、項目１に記載の方法。
（項目１８）
少なくとも１つの腫瘍関連抗原を投与する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記腫瘍関連抗原が、ＴＬＲアゴニストに連結する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
項目１８に記載の方法であって、前記腫瘍関連抗原が、以下：Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、ＨＫｅｒ ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３ならびにテロメラーゼからなる群より選択される、方法。
（項目２１）
項目１に記載の方法であって、前記処置される癌が、以下：黒色腫、乳癌、膵臓癌、結腸癌、肺癌、神経膠腫、肝細胞癌、子宮内皮癌、胃癌、腸癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、卵巣癌、精巣癌、肝臓癌、頭部および頸部の癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、眼の癌、膀胱癌、神経膠芽腫、ならびに転移性の癌腫からなる群より選択される、方法。
（項目２２）
活性剤を投与する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記活性剤が、ＩＦＮα、ＴＮＦα、ＲＡＮＫリガンド／アゴニスト、ＣＤ４０リガンド／アゴニストまたはＴＮＦ／ＣＤ４０レセプターファミリーの別のメンバーのリガンド／アゴニストからなる群より選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
血液樹状細胞の数を増加させるサイトカインを投与する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記樹状細胞増殖因子が、ＦＬＴ３−Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦからなる群より選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
樹状細胞上で活性なサイトカインを腫瘍に送達する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目２７）
項目２６に記載の方法であって、前記ケモカインが、以下：ＣＣＬ２１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２５、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１３、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１からなる群より選択される、方法。
（項目２８）
前記ケモカインが、ケモカインまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくはその改変体および標的化部分を含む標的化構築物を用いて前記腫瘍に送達される、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
項目２８に記載の方法であって、前記標的化部分が、以下：
ａ）少なくとも１０個のアミノ酸のペプチド；
ｂ）タンパク質；
ｃ）低分子；
ｄ）ベクター；および
ｅ）抗体またはそのフラグメント、
からなる群より選択される、方法。
（項目３０）
前記腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストが、互いに連結する、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストが、腫瘍関連抗原にさらに連結される、項目３０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤樹状細胞が、骨髄由来樹状細胞と比較して、ＬＰＳ＋抗ＣＤ４０＋ＩＦＮγの組み合わせに対して非応答性であることを示す。図１Ａは、ＦＡＣＳ（ＤＣ１１ｃポジティブ細胞でゲート）による、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０およびＣＤ８６の表面発現の分析の結果を示す。図１Ｂは、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａとの２．５時間のインキュベーションを含む、２０時間後のＣＤ１１ｃ＋細胞による、ＩＬ−１２ｐ４０の細胞内発現を示す。図１Ｃは、混合白血球反応を示す。図１Ｄにおいて、ＩＬ−１２ｐ７０を、特異的ＥＬＩＳＡによって、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗ＣＤ４０を用いた活性化後の培養物上清において測定した。
【図２】ＣｐＧ １６６８＋抗ＩＬ−１０Ｒの組み合わせが、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤樹状細胞において、ＩＬ−１２およびＴＮＦαを回復した。Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍由来のＴＩＤＣを、抗ＣＤ１１ｃ磁気ビーズを使用して富化し、そしてＧＭ−ＣＳＦおよび種々の組み合わせのＬＰＳ、ＩＦＮγ抗ＣＤ４０、抗ＩＬ１０ＲおよびＣｐＧ １６６８の存在下で、一晩培養した。ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦαのレベルを、特異的ＥＬＩＳＡによって、培養物上清において測定した。
【図３】ＣｐＧ １６６８＋抗ＩＬ−１０Ｒの組み合わせは、ＤＣ浸潤Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍のＭＬＲ刺激能力を回復した。Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍由来のＴＩＤＣを、抗ＣＤ１１ｃ磁気ビーズを使用して富化し、ＧＭ−ＣＳＦおよび種々の組み合わせのＬＰＳ、ＩＦＮγ抗ＣＤ４０、抗ＩＬ１０ＲおよびＣｐＧ １６６８の存在下で、一晩培養した。次いで、細胞を照射し、そして一定数の富化した同種異系Ｔ細胞（３×１０５のＴ細胞）の存在下で、種々の数で５日間培養した。増殖を、放射性チミジン取り込みによって、培養の最後の１８時間の間に測定した。
【図４】親Ｃ２６腫瘍由来の腫瘍浸潤樹状細胞ならびに異なる組織学的起源の腫瘍由来の腫瘍浸潤樹状細胞は、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗ＣＤ４０の組み合わせに対して非応答性であるが、ＣｐＧ １６６８＋抗ＩＬ−１０Ｒに応答して、ＩＬ−１２を産生する。示された腫瘍由来のＴＩＤＣを、抗ＣＤ１１ｃ磁気ビーズを使用して富化し、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗ＣＤ４０、または抗ＩＬ１０Ｒ＋ＣｐＧ １６６８の存在下で、一晩培養した。図４は、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａとの２．５時間のインキュベーションを含む、２０時間後の培養細胞における、ＩＬ−１２ｐ４０の細胞内発現およびＣＤ１１ｃの表面発現を示す。
【図５】図５は、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍モデルにおける、ＣｐＧ１６６８＋抗ＩＬ１０Ｒ抗体の治療効果を示す。７週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス群に、５×１０４のＣ２６−６ＣＫ細胞を皮下注射し、そして腫瘍接種の７日後に始まる３週間にわたって、１週間に２回の２５０μｇの精製抗ＩＬ１０Ｒ抗体の腹腔内注射および毎週の１０μｇのＣｐＧ １６６８の腫瘍内注射の併用で、処置した。
【図６】図６は、Ｃ２６腫瘍モデルにおける、ＣｐＧ １６６８＋抗ＩＬ１０Ｒ抗体の治療効果を示す。７週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス群に、５×１０４のＣ２６細胞を皮下注射し、そして腫瘍接種の７日後に始まる３週間にわたって、２５０μｇの精製抗ＩＬ１０Ｒ抗体の腹腔内注射および５μｇのＣｐＧ １６６８の腫瘍内注射の併用で毎週処置した。
【図７】図７は、Ｂ１Ｆ０黒色腫腫瘍モデルにおける、ＣｐＧ１６６８＋抗ＩＬ１０Ｒ抗体の治療効果を示す。７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウス群に、５×１０４のＢ１６Ｆ０細胞を皮下注射し、そして腫瘍接種の７日後に始まる３週間にわたって、２５０μｇの精製抗ＩＬ１０Ｒ抗体の腹腔内注射および５μｇのＣｐＧ １６６８の腫瘍内注射の併用で毎週処置した。
【図８】図８は、別のＩＬ−１０アンタゴニストであるモノクローナル抗ＩＬ１０抗体が、ＴＬＲ−９アゴニストであるＣｐＧ １６６８と組み合わせて、ＤＣ浸潤Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍によるＩＬ−１２の産生を誘導し得ることを示す。Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍由来のＴＩＤＣを、抗ＣＤ１１ｃ磁気ビーズを使用して富化し、ＧＭ−ＣＳＦまたは抗ＩＬ１０Ｒ＋ＣｐＧ １６６８または抗ＩＬ１０＋ＣｐＧ １６６８の存在下で、一晩培養した。図８は、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａとの２．５時間のインキュベーションを含む、２０時間後の培養細胞における、ＩＬ−１２ｐ４０の細胞内発現およびＣＤ１１ｃの表面発現を示す。
【図９】図９は、別の腫瘍由来ＤＣ阻害因子であるＰＧＥ２が、ＤＣ活性化を可能にするためにアンタゴナイズされ得ることを示す。骨髄由来ＤＣを、（インドメタシン処理した）ＰＧＥ２を含む腫瘍上清の存在下または非存在下で培養した。次いで、異なるＤＣを、抗ＩＬ１０Ｒ抗体の存在下または非存在下で、ＬＰＳ、ＩＦＮγおよび抗ＣＤ４０抗体の組み合わせを用いた活性化の後に、成熟マーカーの発現およびＩＬ−１２産生について試験した。
【図１０】図１０は、Ｃ２６−６ＣＫ結腸癌腫腫瘍モデルにおける、ＣｐＧ １６６８＋インドメタシンの治療効果を示す。８週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス群に、５×１０４のＣ２６−６ＣＫ細胞を皮下注射し、そして腫瘍接種の７日後に始まる３週間にわたる、５μｇのＣｐＧ １６６８の腫瘍内注射、および／または５日目〜２８日目の、飲用水中５μｇ／ｍｌのインドメタシンの併用で、毎週処置した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に引用される全ての参考文献は、その全体が参考として援用される。
本発明は、腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストとＴＬＲアゴニストとの併用投与が、腫瘍発達のいくつかのインビボモデル（Ｃ２６−６ＣＫ、Ｃ２６およびＢ１６Ｆ０を含む）において、強力な治療活性を有するという驚くべき発見に一部基づく。ＩＬ−１０アンタゴニストおよびＴＬＲ−９アゴニストの併用投与は、そうでなければ活性化に対して無反応性である腫瘍浸潤樹状細胞が、ＩＬ−１２およびＴＮＦαを産生し、そして改善された腫瘍抗原特異的免疫応答を誘導することを可能にすることが、現在発見されている。さらに、腫瘍保有動物へのＩＬ−１０アンタゴニストおよびＴＬＲ−９アゴニストの投与は、腫瘍の拒絶を誘導し得ることが、現在発見されている。
【００２１】
多数の報告が、腫瘍内のＤＣの活性化状態に取り組んでいる。１つのこのような報告では、ＧＭ−ＣＳＦおよびＣＤ４０Ｌを発現するように形質導入されたマウスＣ２６結腸癌腫瘍が、成熟した表現型を有するＤＣによってひどく浸潤され、そして、腫瘍の割合は、初期増殖後に退縮された（Ｃｈｉｏｄｏｎｉら、１９９９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １９０：１２５−１３３）。６Ｃカインを発現するように操作された同じＣ２６細胞は、未熟ＤＣによって浸潤された（Ｖｉｃａｒｉら、２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５ ：１９９２−２０００）。ＤＣの活性化および続く成熟は、免疫応答の開始に決定的な事象であるので、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤樹状細胞の活性化が腫瘍拒絶を生じ得ると考えられた。予期せぬことに、それらの腫瘍浸潤ＤＣは、共刺激分子の上方調節、混合白血球反応においてＴ細胞を刺激する能力、ならびにＩＬ−１２およびＴＮＦαを生成する能力を読み出しとして使用して、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体を介してＣＤ４０による刺激に応答しないことが見い出された。それらは、細菌刺激ＬＰＳ（ＴＬＲ−４のリガンド）にも、サイトカインＩＦＮγにも、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、および抗ＣＤ４０抗体の組み合わせにも応答しなかった。
【００２２】
従って、本発明者らが使用した特定の刺激因子を考慮する場合、腫瘍由来因子が、腫瘍浸潤ＤＣの不応状態を誘導することが、本発明者らによって仮定された。従って、この不応状態を阻害し得る因子の根絶が、有用な癌療法を生じ得た。ＩＬ−１０（ＤＣ阻害シグナル）が多くのヒト腫瘍によって分泌されるという報告を考慮して（Ｃｈｏｕａｉｂら、１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８：４９３−４９７；Ｄｅ Ｓｍｅｄｔら、１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１２２９−１２３５；Ｃａｕｘら、１９９４，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１１７７−１１８５）、本発明者らは、ＩＬ−１０の拮抗が、ＤＣ活性化、および従って、癌に対する宿主免疫応答を改善し得るか否かを試験した。しかし、ＩＬ−１０レセプターをブロッキングする抗体（抗ＩＬ１０Ｒ）でのマウスの処置は、Ｃ２６結腸癌腫瘍またはそのＣ２６−６ＣＫ改変体の発達に対してほとんど影響しないことが見い出された（後者は、ケモカインＣＣＬ２１／ＳＬＣ／６Ｃカインを発現させるためにＶｉｃａｒｉら、２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：１９９２−２０００において記載されるように操作された：（実施例ＩＶおよび図５を参照のこと））。実際、実施例ＩＩおよびＩＩＩに示されるように、抗ＩＬ１０Ｒ抗体は、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗ＣＤ４０での腫瘍浸潤ＤＣの活性化に対して全く影響を有さないか、または最小限の影響を有する。
【００２３】
続いて、本発明者らは、他の活性化シグナル（特にｔｏｌｌ様ファミリーの病原関連分子パターンレセプターであるが、ＴＬＲ−４とは異なるレセプターを介して媒介されたシグナル）が、腫瘍浸潤樹状細胞において有効であり得ると仮定した。特に、本発明者らは、マウスにおけるＣｐＧ １６６８（ＴＬＲ−９のリガンド）の効果を研究した（Ｈｅｍｍｉら、２０００，Ｎａｔｕｒｅ ４０８：７４０−７４５）。しかし、本発明者らは、ＣｐＧ １６６８が、腫瘍浸潤樹状細胞の活性化（実施例ＩＩおよびＩＩＩ）またはマウスにおける樹立皮下腫瘍の処置（実施例Ｖ〜ＶＩＩ）のいずれにおいても最低限の効果でしかないことを観察した。
【００２４】
しかし、著しく違って、本発明者らは、ＣｐＧ １６６８と抗ＩＬ１０Ｒとの組み合わせが、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤ＤＣによるＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦαの産生を誘導し、そしてＭＬＲにおけるそれらＤＣの刺激能を大いに増強するとの驚くべき発見をした（実施例ＩＩおよびＩＩＩを参照のこと）。続いて、ＣｐＧ １６６８＋抗ＩＬ１０Ｒ抗体の組み合わせは、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍を有するマウスにおいて有意な抗腫瘍効果を示した（実施例Ｖ）。さらに、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗ＣＤ４０抗体の組み合わせではなく、ＣｐＧ １６６８および抗ＩＬ１０Ｒ抗体の組み合わせが、同様に、親Ｃ２６腫瘍および他の組織学的起源の腫瘍（Ｂ１６メラノーマおよびＬＬ２肺癌）由来の腫瘍浸潤ＤＣにおいてＩＬ−１２産生を誘導し得た（実施例ＩＶを参照のこと）。ＣｐＧ １６６８＋抗ＩＬ１０Ｒの組み合わせはまた、Ｃ２６およびＢ１６Ｆ０腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を示した（実施例ＶＩおよびＶＩＩ）。
【００２５】
従って、本発明は、腫瘍浸潤樹状細胞の活性化を通じて、哺乳動物において癌を処置する方法であって、当該哺乳動物に、有効量のＴＬＲアゴニストと組み合わせて、有効量の腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法を提供する。
【００２６】
本明細書中で定義される場合、「腫瘍由来樹状細胞（ＤＣ）阻害因子アンタゴニスト」とは、結合アッセイまたは機能アッセイにおいて、腫瘍細胞によって分泌され、かつ樹状細胞機能を阻害することが公知である因子の作用をブロックすることが示される因子である。
【００２７】
本明細書中で定義される場合、「ＴＬＲアゴニスト」は、Ｂａｕｅｒら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９２３７−９２４２に記載されるようなｔｏｌｌ様レセプター（「ＴＬＲ」）を活性化する任意の分子である。特に好ましい実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、Ｈｅｍｍｉら、２０００，Ｎａｔｕｒｅ ４０８：７４０−７４５およびＢａｕｅｒら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９２３７−９２４２に記載されるような、ＴＬＲ９のアゴニストである。
【００２８】
（１．腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニスト）
用語「腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニスト」は、腫瘍浸潤ＤＣにおいて不応状態を誘導する腫瘍由来因子の作用をブロックする任意の因子を包含する。このような腫瘍由来因子の例としては、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、ＴＧＦ−β、プロスタグランジン、ガングリオシド、Ｍ−ＣＳＦ、およびＩＬ−１０（Ｃｈｏｕａｉｂら、１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １８ ：４９３−４９７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストは、活性化刺激因子の存在下の腫瘍樹状細胞に対するそれらの効果を分析することにより同定され得る。有効量の腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストの存在下で、腫瘍樹状細胞は成熟プロセスを受け、この後、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＦＮα）の産生、または成熟樹状細胞によって代表的に発現される分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３およびＤＣ−Ｌａｍｐ）の発現の測定が行われ得る。あるいは、腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストの効果は、樹状細胞成熟を阻害することが報告された腫瘍起源の精製または非精製因子の存在下で活性化される、腫瘍から単離されたものではない、ヒト樹状細胞の活性化を分析する際に、観察され得る。
【００３０】
腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストは、例えば、抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体が、ＩＬ−１０の作用をブロックするように、ＤＣ阻害因子それ自体に対して、または、例えば、抗ＩＬ−１０Ｒモノクローナル抗体がＤＣ上のそのレセプターを通じたＩＬ−１０のシグナル伝達を妨害するように、ＤＣ阻害因子が腫瘍浸潤ＤＣに対するそれらの正常な効果を有することを妨害する任意の他の手段によって、作用し得る。
【００３１】
腫瘍由来ＤＣ阻害因子のアンタゴニストは、抗体に由来し得るか、または抗体フラグメントを含み得る。さらに、結合アッセイまたは機能アッセイにおいてレセプターの活性化を阻害することが示される任意の小分子、アンタゴニスト、アンチセンスヌクレオチド配列、遺伝子送達ベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター）に含まれるヌクレオチド配列は、この定義内に入る。所定の標的（例えば、腫瘍関連分子（例えば、レセプター））に特異的に結合する小分子についていかにしてスクリーニングするかは、当該分野において周知である。例えば、Ｍｅｅｔｉｎｇｓ ｏｎ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ ０１７７２−１７４９を参照のこと。同様に、膜貫通ドメインを欠くレセプターの可溶性形態が使用され得る。最後に、対応するレセプターに強く結合するが、生物学的活性を本質的に欠く、腫瘍由来ＤＣ阻害因子の変異体アンタゴニスト形態が、使用され得る。
【００３２】
本発明の特に好ましい実施形態においては、腫瘍由来ＤＣ阻害因子アンタゴニストは、ＩＬ−１０アンタゴニストである。用語「ＩＬ−１０アンタゴニスト」は、ＩＬ−１０の活性を阻害する、ＩＬ−１０それ自体のアンタゴニスト、およびＩＬ−１０レセプターのアンタゴニストの両方を包含する。本発明において有用であるＩＬ−１０アンタゴニストの例としては、米国特許第５，２３１，０１２号（１９９３年７月２７日発行）（ＩＬ−１０およびＩＬ−１０アンタゴニストに関する）および米国特許第５，８６３，７９６号（１９９９年１月２６日発行）（ＩＬ−１０レセプターおよびＩＬ−１０レセプターアンタゴニストに関する）（これらは共に、本明細書中に参考として明確に援用される）に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
（２．ＴＬＲアゴニスト）
微生物由来のＴＬＲのいくつかのアゴニスト（例えば、リポ多糖、ペプチドグリカン、フラジェリンおよびリポテイコ酸）が記載されている（Ａｄｅｒｅｍら、２０００，Ｎａｔｕｒｅ ４０６：７８２−７８７；Ａｋｉｒａら、２００１，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：６７５−６８０）。これらのリガンドのいくつかは、ＴＬＲの異なるパターンを発現する異なる樹状細胞サブセットを活性化し得る（Ｋａｄｏｗａｋｉら、２００１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：８６３−８６９）。従って、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲアゴニスト特性を有する微生物剤の任意の調製物であり得る。例えば、ペニシリン殺傷連鎖球菌因子ＯＫ−４３２は、リポテイコ酸（ＴＬＲ結合を通じてＴｈ１サイトカインの産生を誘導し得る）を含む（Ｏｋａｍｏｔｏら、２０００，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４９：３６３−３７６）。以下の表１は、いくつかの公知のＴＬＲリガンドを列挙する：
（表１）
（公知のＴＬＲリガンド）
【００３４】
【表１】
ＬＴＡ：リポテイコ酸
ＬＰＳ：リポ多糖
ＰＧ：ペプチドグリカン。
【００３５】
非翻訳ＤＮＡの特定のタイプは、ＴＬＲを活性化することにより免疫応答を刺激することが示されている。特に、ＣｐＧモチーフを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、広範に開示されており、リンパ球を活性化することが報告されている（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、「ＣｐＧモチーフ」とは、非メチル化シトシン−グアニン（ＣｐＧ）ジヌクレオチドとして定義される。ＣｐＧモチーフを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、本発明の方法に従ってＴＬＲアゴニストとして使用され得る。
【００３６】
多くの免疫刺激性ヌクレオチド配列は、当該分野において記載されており、標準アッセイ（これは、免疫応答の種々の局面（例えば、サイトカイン分泌、抗体産生、ＮＫ細胞活性化およびＴ細胞増殖）を示す）を用いて容易に同定され得る。例えば、米国特許第６，１９４，３８８号および同第６，２０７，６４６号；ＷＯ９８／５２９６２；ＷＯ９８／５５４９５；ＷＯ９７／２８２５９；ＷＯ９９／１１２７５；Ｋｒｉｅｇら、１９９５，Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６−５４９；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９２Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４０７２−４０７６；Ｂａｌｌａｓら、１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７（５）１８４０−１８４５；Ｋｌｉｎｍａｎら、１９９７，ＰＮＡＳ ９３（７）：２８７９−８３；Ｓｈｉｍａｄａら、１９８６，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７７：８０８−８１６；Ｃｏｗｄｅｒｙら、１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４５７０−７５；Ｈａｒｔｍａｎｎら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（３）：１６１７−２４を参照のこと。
【００３７】
免疫刺激性ヌクレオチド配列は、６塩基または塩基対より大きな任意の長さであり得る。免疫刺激性ヌクレオチド配列は、改変（例えば、３’ＯＨ基または５’ＯＨ基の改変、ヌクレオチド塩基の改変、糖成分の改変、およびホスフェート環の改変）を含み得る。免疫刺激性ヌクレオチド配列は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ならびに一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、あるいは他の改変ポリヌクレオチドであり得る。免疫刺激性ヌクレオチド配列は、１つ以上のパリンドローム領域を含んでも含まなくてもよい。
【００３８】
免疫刺激性ヌクレオチド配列は、従来のポリヌクレオチド単離手順を用いて単離され得るか、または当該分野で周知である技術および核酸合成装置（酵素的方法、化学的方法、および大きなオリゴヌクレオチド配列の分解を包含するが、これらに限定されない）を用いて合成され得る。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと）。
本発明の方法において有用である免疫刺激性ヌクレオチド配列の例としては、米国特許第６，２１８，３７１号；米国特許第６，１９４，３８８号；米国特許第６，２０７，６４６号；米国特許第６，２３９，１１６号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ００／０６５８８（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６２９０９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／６２９１０；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／１２２２３；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／５５４９５；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／６２９２３（Ｄｙｎａｖａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）に開示されたものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
特に、米国特許第６，１９４，３８８号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）は、少なくとも以下の式を含むオリゴヌクレオチドを含む免疫刺激性核酸を開示する：
５’ Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４ ３’
ここで、ＣおよびＧは、非メチル化であり、ここでＸ１Ｘ２は、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＴ、ＣｐＡ、ＣｐＧ、ＴｐＡ、ＴｐＴ、およびＴｐＧからなる群から選択されるジヌクレオチドであり、そしてＸ３Ｘ４は、ＴｐＴ、ＣｐＴ、ＡｐＴ、ＴｐＧ、ＡｐＧ、ＣｐＧ、ＴｐＣ、ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＴｐＡ、ＡｐＡおよびＣｐＡからなる群から選択されるジヌクレオチドであり、そしてここで少なくとも１つのヌクレオチドは、リン酸骨格改変を有する。細胞への取り込みを容易にするために、好ましいＣｐＧ含有免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、サイズが８〜４０塩基対の範囲にあるとして記載される。この式に入る免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、本願発明の方法において有用である。
【００４０】
ＷＯ９９／６２９２３は、本発明と併用して使用され得る免疫刺激性ヌクレオチド配列のさらなる例を開示する。特に、中央ＣＧ配列を含むヘキサマー配列またはヘキサヌクレオチドを含む改変免疫刺激性ヌクレオチド配列（ここで、Ｃ残基は、求電子（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ）部分を有するＣ−５および／またはＣ−６への付加により改変される）が開示される。
【００４１】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、インビボ分解に対して比較的耐性にする構造改変により安定化され得る。安定化改変の例としては、ホスホロチオエート改変（すなわち、少なくとも１つのホスフェート酸素が硫黄に置換される）、非イオン性ＤＮＡアナログ（例えば、アルキルホスホネートおよびアリールホスホネート（ここで、荷電されたホスホネート酸素が、アルキル基またはアリール基に置換される））、ホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステル（ここで、荷電された酸素部分が、アルキル化される）が挙げられる。片方の末端または両末端にジオール（例えば、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール）を含むオリゴヌクレオチドもまた、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性であることが示されている（米国特許第６，１９４，３８８号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）を参照のこと）。
【００４２】
免疫刺激性ヌクレオチド配列はまた、標的細胞表面へのより高いアフィニティー結合を生じる、かつ／または標的細胞による細胞取り込みの増大を生じる送達複合体中にカプセル化され得るか、またはこの送達複合体に結合され得る。免疫刺激性ヌクレオチド配列送達複合体の例としては、ステロール（例えば、コレステロール）、脂質（例えば、カチオン性脂質、ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）またはリポソーム）、または標的細胞特異的結合因子（例えば、標的細胞特異的レセプターにより認識されるリガンド）との会合が挙げられる。好ましい複合体は、標的細胞による内在化の前に重大な脱共役を防ぐように、インビボで十分に安定でなければならない。しかし、この複合体は、オリゴヌクレオチドが機能的形態で放出されるように、細胞内で適切な条件下で切断可能であるべきである（米国特許第６，１９４，３８８号；ＷＯ９９／６２９２３）。
【００４３】
特に好ましい実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ９のアゴニストであり、例えば、Ｈｅｍｍｉら、２０００，Ｎａｔｕｒｅ ４０８：７４０−７４５およびＢａｕｅｒら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９２３７−９２４２に記載される。これまで、ＴＬＲ−９について公知のリガンドは、マウスにおいてＣｐＧ１６６８（ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ）（配列番号５）およびヒトにおいてＣｐＧ ２００６（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ）（配列番号１）のような、ＣｐＧモチーフを含む非メチル化オリゴヌクレオチド配列である（Ｂａｕｅｒら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９２３７−９２４２）。以下の表２は、ＴＬＲ９の好ましいアゴニストを列挙する：
（表２）
【００４４】
【表２】
上記に加えて、ＴＬＲまたはそのフラグメントを使用するリガンドスクリーニングは、他の分子（レセプターに対する結合親和性を有する低分子を含む）を同定するために行われ得る。例えば、Ｍｅｅｔｉｎｇｓ ｏｎ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ ０１７７２−１７４９を参照のこと。次いで、引き続く生物学的アッセイは、推定アゴニストが活性を提供し得るか否かを決定するために利用され得る。化合物が、本質的な刺激活性を有する場合、これは、レセプターを活性化し得、従って、リガンドの活性を刺激する（例えば、シグナル伝達を誘導する）という点でアゴニストである。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、ＴＬＲアゴニストの「有効量」は、所望の生物学的効果を誘発する量である。特に、有効量は、腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストの有効量と組み合わせた場合、腫瘍浸潤ＤＣの活性化を誘発するに十分である量である。
【００４６】
腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストの「有効量」は、所望の生物学的効果を誘発する量である。特に、有効量は、有効量のＴＬＲアゴニストと組み合わされた場合、腫瘍浸潤ＤＣの活性化を誘発するに十分な量である。
【００４７】
「組み合わせた」投与は、同時投与または連続投与の両方をいう。腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストは、同じ部位または異なる部位に送達または投与され得、同時または４８時間を超えない遅延の後に投与され得る。同時または組み合わせの投与は、本明細書中で使用される場合、腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストおよび／または抗原が、（ａ）同時、または（ｂ）一般的処置スケジュールの経過の間の異なる時間のいずれかに被験体に投与されることを意味する。後者の場合、その２つの化合物は、意図される効果を達成するために適した十分に近いときに投与される。
【００４８】
本発明を実施するに当たって使用される腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストは、天然産物と同一のアミノ酸配列を有する組換えタンパク質、あるいは天然産物由来ではあるが、その薬物動態特性を変化させ、そして／または本来のＤＣ活性化または抗腫瘍特性を保持しつつ、新たな生物学的特性を付加する改変を含む組換えタンパク質であり得る。
【００４９】
腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストの送達様式は、注射（静脈内、腫瘍内、皮内、筋肉内、皮下、または局所的注射を含む）によってであり得る。
【００５０】
本発明の特に好ましい実施形態において、この腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよびＴＬＲアゴニストは、腫瘍関連抗原と組み合わせて投与される。本発明において使用するための腫瘍関連抗原としては、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、ＨＫｅｒ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼおよびｐ５３が挙げられるが、これらに限定されない。この列挙は、網羅的であることが意図されるのではないが、単に、本発明の実施において使用され得る抗原の型の例示であることが意図される。
【００５１】
腫瘍関連抗原とは異なる他の抗原は、これらの抗原に対する特定の免疫応答を増大させるために、腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよびＴＬＲアゴニストとともに投与され得る。これらの抗原としては、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物により発現される、ネイティブ分子または改変分子が挙げられるが、これらに限定されない。この抗原はまた、アレルゲンおよび自己抗原を含み得、この場合、腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストとＴＬＲアゴニストとの組み合わせは、例えば、Ｔｈ２型免疫応答をＴｈ１型免疫応答に変換する、より都合の良い結果に向う免疫応答を再指向するために、抗原とともに投与される。
【００５２】
抗原の異なる組み合わせが使用され得、これらの組み合わせは、異なる人種グループ、性別、地理的分布、および疾患段階を有する最適な機能を示す。本発明の１つの実施形態において、少なくとも２以上の異なる抗原が、腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストとＴＬＲアゴニストとの組み合わせの投与とともに投与される。
【００５３】
腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニストは、互いと組み合わせて投与され得るか、そして／または抗原と共に投与され得るか、あるいは種々の様式で互いにまたは抗原に連結され得る（例えば、ＷＯ９８／１６２４７；ＷＯ９８／５５４９５；ＷＯ９９／６２８２３を参照のこと）。例えば、ＴＬＲアゴニストおよび／または腫瘍由来ＤＣ阻害性因子および／または抗原は、互いに対して空間的に近く投与されてもよいし、混合物として投与されてもよい（すなわち、溶液中）。連結は、多くの方法（結合体化、キャプシド化、プラットホームへの固定もしくは表面への吸着を通じる方法が挙げられる）において達成され得る。
【００５４】
ＴＬＲアゴニストを腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよび／または抗原に結合体化するために、種々の方法が使用され得る。会合は、共有結合的相互作用および／または非共有結合的相互作用（高親和性および／または低親和性相互作用を含む）を介し得る。ＴＬＲアゴニストおよび腫瘍由来ＤＣ阻害性因子を連結し得る非共有結合的相互作用の例としては、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合およびファンデルワールス相互作用が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストがタンパク質または抗体であり、ＴＬＲアゴニストが、免疫刺激性ポリヌクレオチドである場合、例えば、その結合体のペプチド部分は、当該分野で周知の方法を使用する固体支持体化学によって、免疫刺激性ポリヌクレオチドの３’末端に結合され得る（例えば、Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら，１９９０ａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４９３−４９９およびＨａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら，１９９０ｂ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１８：５０１−５０５を参照のこと）。あるいは、潜在的反応性官能基（例えば、アミンまたはカルボキシル基、シトシン塩基のＣ５）を有する「リンカーアーム」の組み込みは、ペプチド連結についての取っかかりを提供する（Ｒｕｔｈ，４ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｐ．１２３）。免疫刺激性ポリヌクレオチドのペプチドへの連結はまた、高親和性、非共有結合相互作用（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン複合体）によって形成され得る。
【００５５】
ビオチニル基は、例えば、オリゴヌクレオチドの改変塩基に結合され得る（Ｒｏｇｅｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７：７６４３−７６５１）。ストレプトアビジン部分のペプチド部分への組み込みは、ストレプトアビジン結合体化ペプチドと、ビオチン化ポリヌクレオチドとの非共有結合複合体の形成を可能にする。
【００５６】
ＤＣの成熟をさらに活性化または刺激する様に設計される部分が、有利には、投与され得る。このような薬剤の例は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＲＡＮＫ−ＬまたはＲＡＮＫのアゴニスト、ＣＤ４０−ＬまたはＣＤ４０のアゴニストである。このような活性化剤は、ＴＬＲアゴニストとともに、以下に関与し得るさらなる成熟シグナルを提供し得る：ｉ）組織からリンパ器官に向かって、排出リンパを通じてＤＣの移動を駆動すること、およびｉｉ）免疫応答、特に、抗腫瘍応答（例えば、ＩＬ−１２およびＩＦＮα（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５２））を増強する分子を分泌するようにＤＣを活性化すること。
【００５７】
ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＦＬＴ３−Ｌはまた、有利には、本発明の方法において投与され得る。ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＦＬＴ３−Ｌは、循環ＤＣのメンバーを増大させる（このＤＣは、次いで、腫瘍中に局所的に増員され得る）目的で投与され得る。このプロトコルは、少なくとも５〜７日間の間、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＦＬＴ３−Ｌでの全身的な予備処置を含む。別の方法は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＦＬＴ３−Ｌの局所的投与によりＤＣ−前駆体（単球、ＤＣの類プラスマ細胞前駆体（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｏｆ ＤＣ）（これは、次いで、同じ部位に送達された抗原を拾い上げ得る））のＤＣへの局所的分化を支持することである。
【００５８】
さらに、ケモカインまたは複数のケモカインの組み合わせは、有利には、本発明の腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストとＴＬＲアゴニストとの組み合わせにおいて投与される。有利な効果を有することが示されたケモカインとしては、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２５、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１３、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１が挙げられる（例えば、Ｓｏｚｚａｎｉら，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：３２９２−３２９５；Ｓｏｚｚａｎｉら，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１９９３−２０００；Ｘｕら，１９９６，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６０；３６５−３７１；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：１３１７−１３２２；Ｒｏａｋｅら，１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １８１：２２３７−２２４７および欧州特許出願ＥＰ ０ ９７４ ３５７ Ａ１（１９９８年７月１６日に出願され、２０００年１月２６日に公開）を参照のこと）。一般に、腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニスト、ＴＬＲアゴニストおよび／または活性化剤および／またはサイトカインは、薬学的キャリア中の腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよびＴＬＲアゴニストおよび／または抗原および／または活性化剤および／またはサイトカインの有効量を含む薬学的組成物として投与される。これらの試薬は、例えば、生理学的に無害な安定化剤および賦形剤とともに、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤（例えば、免疫原性アジュバント）中でさらなる活性成分または不活性成分と、治療用途のために組み合わされ得る。薬学的キャリアは、本発明の組成物を患者に送達するために適した、任意の適合性の非毒性物質であり得る。
【００５９】
サイトカインおよび／またはケモカインは、必要に応じて、ケモカインまたはサイトカインまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体および標的化部分を含む標的構築物を使用して、腫瘍に送達され得る。本明細書中で言及される場合「標的化部分」は、腫瘍関連抗原または腫瘍の非癌性成分によって具体的に表される構造（例えば、腫瘍血管系）を認識または標的化する部分である。標的化部分の例としては、腫瘍関連抗原または腫瘍の非癌性成分によって具体的に表される構造を認識または標的化するペプチド、タンパク質、低分子、ベクター、抗体または抗体フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、この標的化部分は、ペプチド、タンパク質、低分子、ベクター（例えば、ウイルスベクター）、抗体または抗体フラグメントである。より好ましい実施形態において、標的化部分は、抗体または抗体フラグメントである。最も好ましい実施形態において、標的化ベクターは、ＳｃＦｖフラグメントである。
【００６０】
標的化部分は、ヒトにおいて以下に記載されてきたように、腫瘍細胞によって発現される抗原に特異的であり得る：例えば、葉酸レセプターについて（Ｍｅｌａｎｉら，１９９８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：４１４６−４１５４）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプター、上皮増殖因子レセプターおよびＣＡ１２５腫瘍抗原（Ｇｌｅｎｎｉｅら，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：４０３−４１０）。いくつかの他の腫瘍抗原は、標的として使用され得、優先的に発現されるか、独特に発現されるか、過剰発現されるか、または腫瘍の悪性細胞によって成熟形態で発現されるかのいずれかである（Ｂｏｏｎら，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：６８１−６８３）。これらとしては、以下が挙げられ得る：Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、ＨＫｅｒ ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、インスリン様増殖因子レセプター（ＩＧＦ−Ｒ）、テロメラーゼおよびｐ５３。この列挙は、網羅的であることを意図するのではないが、単に本発明の実施において使用され得る抗原の型の例示であることを意図する。あるいは、標的部分は、悪性細胞とは異なる腫瘍の成分によって、および特定の腫瘍血管において優先的に発現される抗原に特異的であり得る。αｖインテグリンのファミリー、ＶＥＧＦレセプターおよびプロテオグリカンＮＧ２は、このような腫瘍血管関連抗原の例である（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５４２−５４６）。
【００６１】
原発性癌および転移性癌の両方は、本発明に従って処置され得る。処置され得る癌の型としては、黒色腫、乳癌、膵臓癌、結腸癌、肺癌、神経膠腫、肝細胞癌、子宮内膜癌、胃癌、腸の癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、卵巣癌、精巣癌、肝臓癌、頭部および頸部の癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、眼の癌、膀胱癌、神経膠芽腫、および転移性癌が挙げられるが、これらに限定されない。用語「癌腫」とは、上皮組織または内分泌組織の悪性疾患をいい、呼吸器系癌腫、胃腸系癌腫、尿生殖器系癌腫、前立腺癌種、内分泌系癌腫、および黒色腫が挙げられる。この用語のように、転移性は、本明細書中で使用される場合、局所的リンパ節から離れた部位への腫瘍の拡がりとして規定される。
【００６２】
有効な治療に必要な試薬の量は、多くの異なる要因に依存し、これらの要因としては、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、および投与される他の医薬品が挙げられる。従って、処置の投薬量は、安全性および有効性を最適化するように力価測定されるべきである。特定の癌の処置のための有効用量を試験する動物は、ヒトの投薬量のさらなる推定指標を提供する。種々の考案が、例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９０）ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版（１９９０），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載されている。投与方法は、これらの文献中および以下で議論される（例えば、静脈内、腹腔内、または筋肉内投与、経皮的拡散など）。薬学的に受容可能なキャリアとしては、以下が挙げら得る：水、生理食塩水、緩衝液、および例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙに記載される他の化合物。徐放性処方物または徐放装置は、連続投与のために使用され得る。
【００６３】
腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよび／またはＴＬＲアゴニスト剤についての投薬量範囲は、アゴニスト／アンタゴニストの形態に依存して変化する。例えば、ＩＬ−１０レセプター抗体の有効用量は、代表的には、約０．０５〜約２５μｇ／ｋｇ／日、好ましくは、約０．１〜約２０μｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは、約１〜約１０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。ＴＬＲアゴニストのような免疫原性組成物について、その量は、ＴＬＲアゴニストの形態、個体、どのような状態が処置されるべきか、および当業者に明らかな他の要因に基づいて変化し得る。考慮されるべき要因としては、抗原性、ＴＬＲアゴニストが複合体化されるかどうか、またはアジュバントもしくは送達分子に共有結合されるかどうか、投与経路および投与される免疫用量の回数が挙げられる。このような要因は、当該分野で公知である。適切な投薬量範囲は、樹状細胞の所望の活性化を提供する範囲である。一般に、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの投薬量範囲は、例えば、以下のうちのほぼいずれかであり得る：０．１〜１００μｇ、０．１〜５０μｇ、０．１〜２５μｇ、０．１〜１０μｇ、１〜５００μｇ、１００〜４００μｇ、２００〜３００μｇ、１〜１００μｇ、１００〜２００μｇ、３００〜４００μｇ、４００〜５００μｇ。あるいは、この用量は、以下のうちのほぼいずれかであり得る：０．１μｇ、０．２５μｇ、０．５μｇ、１．０μｇ、２．０μｇ、５．０μｇ、１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇ。従って、用量範囲は、以下のうちのほぼいずれかの下限を有する：０．１μｇ、０．２５μｇ、０．５μｇおよび１．０μｇ；および以下のほぼいずれかの上限を有する：２５μｇ、５０μｇおよび１００μｇ。これらの組成物において、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチド対抗原のモル比は、変動し得る。各患者に与えられる絶対量は、例えば、バイオアベイラビリティー、クリアランス速度および投与経路のような薬理学的特性に依存する。
【００６４】
一般的に、処置は、化合物の最適用量未満のより小さな投薬量で開始される。その後、投薬量は、最適な効果がその状況下で達成されるまで、少量ずつ増大される。
【００６５】
特定の状況についての適切な投薬量および投与レジメンの決定は、当該分野の技術範囲内である。
【００６６】
ベクターによって投与される腫瘍由来ＤＣ阻害性因子アンタゴニストおよびＴＬＲアゴニストの投薬量は、主に、使用される特定のベクターの有効性および患者の状態、ならびに処置される患者の体重または体表面積に依存する。用量の大きさはまた、特定のベクターまたは特定の患者の形質導入された細胞型の投与に付随する任意の有害な副作用の存在、性質および程度により決定される。処置において投与されるベクターの有効量の決定にあたって、医師は、ベクターの循環血漿レベル、ベクターの毒性、疾患の進行、および抗ベクター抗体の産生を評価する。核酸の代表的な用量は、投与経路および遺伝子送達系に大きく依存する。送達方法および投薬量に依存して、約１μｇ〜１００ｍｇまたはそれ以上に容易に範囲が決められ得る。一般に、ベクターに由来する裸の核酸の用量等価物は、代表的な７０ｋｇの患者について約１μｇ〜１００μｇであり、ウイルス粒子を含むベクターの用量は、治療的核酸の等価な量を得るために計算される。
【００６７】
本願発明の実施におけるＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＦＬＴ−Ｌの好ましい生物学的に活性な用量は、循環ＣＤ１４＋／ＣＤ１３＋前駆体細胞の数の最大限の増大；ＤＣ前駆体および成熟ＤＣの表面上の抗原提示分子の発現；Ｔ細胞に対する抗原提示活性；および／または成熟ＤＣ機能と一致する抗原依存性Ｔ細胞応答の刺激を誘導するその投薬の組み合わせである。皮下投与に使用されるＧＭ−ＣＳＦの量は、代表的には、約０．２５μｇ／ｋｇ／日〜約１０．０μｇ／ｋｇ／日、好ましくは、約１．０〜８．０μｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは、２．５〜５．０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。特定の患者についての有効量は、上記に示すパラメーターの１つ以上の大きな変化を測定することによって確立され得る。
【実施例】
【００６８】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって示され得る。
【００６９】
（実施例１）
（Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤樹状細胞は、骨髄由来樹状細胞に比較した場合、ＬＰＳ＋抗−ＣＤ４０＋ＩＦＮγの組み合わせに非応答性である）
この実施例において、本発明者らは、ＤＣ浸潤Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍が、混合された白血球反応（ＭＬＲ）におけるＩＬ−１２産生能力またはＩＬ−１２刺激能力を、骨髄由来ＤＣ（図１）と比べて考慮する場合、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗−ＣＤ４０抗体に対して応答しないことを示した。全ての腫瘍細胞培養を、１０％ ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１ｍＭ ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、Ｇｅｎｔａｌｌｉｎ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｕｎｉｏｎ，ＮＪ）、２×１０−５Ｍ β−２ メルカプトエタノール （Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ Ｐａｒｋ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）中で実施した。全ての細胞培養を、５％ ＣＯ２で、湿潤化されたインキュベーター中で、３７℃で実施した。Ｃ２６結腸癌およびＴＳＡ乳腺癌は、Ｍａｒｉｏ Ｃｏｌｏｍｂｏ（Ｉｓｔｉｔｕｔｏ Ｎａｚｉｏｎａｌｅ ｐｅｒ ｌｏ Ｓｔｕｄｉｏ ｅ ｌａ Ｃｕｒａ ｄｅｉ Ｔｕｍｏｒｉ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ）によって提供された。Ｂ１６Ｆ０黒色種およびＬＬ２肺癌腫を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＬＧＣ，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た。マウスケモカイン６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ／ＣＣＬ２１を安定して分泌するように操作されたＣ２６−６ＣＫ細胞株は、本発明者らによって以前に記載された（Ｖｉｃａｒｉら、２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：１９９２−２０００）。Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍由来のＴＩＤＣを、抗−ＣＤ１１ｃ磁気ビーズ（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して富化した。骨髄由来ＤＣを、骨髄前駆体をＧＭ−ＣＳＦ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｕｎｉｏｎ，ＮＪ）およびＴＮＦα（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）と共に５日間培養することによって得た。活性化を、１０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮγ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および２０μｇ／ｍｌ精製ＦＫＧ４５．５アゴニスト抗−ＣＤ４０抗体（ＡＧ Ｒｏｌｉｎｋ，Ｂａｓｅｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからのある種の贈与物）を培養培地に添加することによって、一晩実施した。図１Ａは、ＦＡＣＳ（ＣＤ１１ｃ陽性細胞に対してゲートされた）によるＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０およびＣＤ８６の表面発現の分析を示す。図１Ｂは、２０時間（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａと共に２．５時間インキュベーションすることを含む）後のＣＤ１１ｃ＋細胞によるＩＬ−１２ｐ４０の細胞内発現を示す。図１Ｃにおいて、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗−ＣＤ４０で刺激された混合白血球反応ＴＩＤＣまたは骨髄由来ＤＣを照射し、そして一定数の富化された同種異系Ｔ細胞（３×１０５
Ｔ細胞）の存在下で変動数で５日間培養した。増殖を、培養の最後の１８時間の間の放射性チミン取り込みによって測定した。図１Ｄは、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗−ＣＤ４０で活性化後の、特異的ＥＬＩＳＡによる培養上清のＩＬ−１２ ｐ７０の測定を示す。
【００７０】
これらの合わせた結果は、樹状細胞浸潤Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍が、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗−ＣＤ４０の組合せでの刺激の際に、樹状細胞の代表的な機能（すなわち、同種異系Ｔ細胞を刺激する能力およびＩＬ−１２を分泌する能力）を獲得し得ないことを示唆する。これらの弱った機能は、腫瘍と樹状細胞の相互作用の結果でありそうである。
【００７１】
（実施例ＩＩ）
（ＣｐＧ １６６８＋抗−ＩＬ１０Ｒ組み合わせは、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤樹状細胞におけるＩＬ−１２およびＴＮＦαを回復する）
この実施例において、本発明者らは、ＣｐＧ １６６８および抗−ＩＬ１０Ｒ抗体の組み合わせ投与が、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤樹状細胞においてＩＬ−１２およびＴＮＦαを回復することを示した（図２）。
【００７２】
Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍からのＴＩＤＣを、抗−ＣＤ１１ｃ磁気ビーズを使用して富化した。活性化を、ＧＭ−ＣＳＦ １０ｎｇ／ｍｌの存在下で一晩実施した。アクチベーターを、１０ｎｇ／ｍｇ ＬＰＳ、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮγ、２０μｇ／ｍｌ ＦＫＧ４５．５アゴニスト抗−ＣＤ４０抗体、５μｇ／ｍｌ ＣｐＧ １６６８（配列：ＴＣＣ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−ＴＴＣ−ＣＴＧ−ＡＴＧ−ＣＴ（ホスホロチオエート改変）ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０μｇ／ｍｌの抗−ＩＬ１０Ｒ（クローン１Ｂ１３Ａ、Ｃａｓｔｒｏら、２０００，Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１５２９−１５３４）で使用した。ＩＬ−１２、ｐ７０およびＴＮＦαを、２４時間刺激後、特異的ＥＬＩＳＡを使用して、培養上清において測定した。
【００７３】
全部で、これらの結果は、ＣｐＧ １６６８は、それ自体、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤ＤＣによるＩＬ−１２産生を誘導しないことを示す。抗−ＩＬ１０Ｒは、それ自体効果を有さない（示さず）か、またはＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗−ＣＤ４０と合わせた場合、最小の効果を有する。抗−ＩＬ１０ＲとＣｐＧ １６６８との組み合わせのみが、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤ＤＣから生体活性なＩｌ−１２およびＴＮＦαの有意な産生を誘導し得た。
【００７４】
（実施例ＩＩＩ）
（ＣｐＧ １６６８＋抗−ＩＬ１０Ｒの組み合わせは、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤樹状細胞においてＭＬＲ刺激能力を回復する）
この実施例において、本発明者らは、ＣｐＧ １６６８と抗−ＩＬ−１０レセプター抗体との組み合わせた投与が、ＭＬＲ刺激能力を回復することを示した。
【００７５】
Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍由来のＴＩＤＣを、抗−ＣＤ１１ｃ磁気ビーズを使用して富化し、ＧＭ−ＣＳＦおよびＬＰＳ、ＩＦＮγ抗−ＣＤ４０、抗−ＩＬ１０ＲとＣｐＧ １６６８との種々の組み合わせを使用して一晩培養した。次いで、細胞を、照射し、一定数の富化された同種異系Ｔ細胞（３×１０５ Ｔ細胞）の存在下で、５日間、変動数で培養した。増殖を、培養の最後の１８時間の間、放射性チミジン取り込みによって測定した。結果は、腫瘍浸潤ＤＣが、ＭＬＲアッセイにおいて弱い刺激物質細胞であるが、これらの刺激能力が、ＣｐＧ１６６８で最小に増強され得、抗−ＩＬ１０Ｒ＋ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗−ＣＤ４０の組み合わせでさらに増強され、そして抗−ＩＬ１０ＲとＣｐＧ １６６８との組み合わせで最高に増強されることを示す。従って、この実施例は、抗−ＩＬ１０Ｒ＋ＣｐＧ １６６８が、ＭＬＲにおけるＤＣ刺激能力を回復する最も適切な組み合わせであることを示す。これは、インビボでのナイーブなＴ細胞のより良いプライミングに解釈され得、従って、癌を処置するためのＩＬ−１０アンタゴニストとＴＬＲ９アゴニストとの組み合わせを使用する場合、腫瘍に対してより良いＴ細胞媒介免疫応答に解釈され得る。
【００７６】
（実施例ＩＶ）
（Ｃ２６野生型由来の腫瘍浸潤樹状細胞および他の組織学的（ｈｉｓｔｉｏｌｏｇｉｃａｌ）性質由来の腫瘍は、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗−ＣＤ４０に非応答性であるが、ＣｐＧ
１６６８＋抗−ＩＬ１０Ｒに応答してＩＬ−１２を産生する）
この実施例は、Ｃ２６野生型由来腫瘍浸潤樹状細胞および他の組織学的性質由来の腫瘍が、ＬＰＳ＋ＩＦＮγ＋抗−ＣＤ４０に非応答性であるが、ＣｐＧ １６６８＋抗−ＩＬ１０Ｒに応答してＩＬ−１２を産生することを示す。
【００７７】
Ｃ２６結腸癌細胞、Ｂ１６黒色腫およびＬＬ２肺癌腫瘍由来のＴＩＤＣは、全て皮下で増殖し、抗−ＣＤ１１ｃ磁気ビーズを使用して富化し、ＧＭ−ＣＳＦおよびＬＰＳ、ＩＦＮγ、抗−ＣＤ４０、抗−ＩＬ１０ＲとＣｐＧ １６６８の種々との組み合わせの存在下で、一晩培養した。２０時間（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａと共に２．５時間インキュベーションすることを含む）後の、ＩＬ−１２ｐ４０の細胞内発現 対 ＣＤ１１ｃの表面発現のＦＡＣＳ分析。図４は、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍について見出されるように、親Ｃ２６腫瘍および異なる組織学的起源の腫瘍から単離されたＤＣが、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、抗−ＣＤ４０での活性化に対して応答せず、ＩＬ−１２を産生することによってＴＬＲ−９アゴニストＣｐＧ １６６８と抗−ＩＬ１０Ｒとの組み合わせに対して応答することを示す。従って、これらの観察は、ＩＬ１０アンタゴニストとＴＬＲ−９アゴニストとの組合せが、種々の腫瘍において有効な療法であることを示唆する。
【００７８】
（実施例Ｖ）
（Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍モデルにおけるＣｐＧ１６６８＋抗−ＩＬ１０Ｒ抗体の治療効果）
１×１０５ Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍細胞を、７匹の８週齢雌マウスＢＡＬＢ／ｃの群において、０日目にｓ．ｃ．で移植し、以下のように処置した：
１０μｇのＣｐＧ １６６８細胞を、７日目、１４日目、および２１日目で、腫瘍周辺（腫瘍が小さすぎる場合）または腫瘍内に注射した。
【００７９】
２５０μｇの抗−ＩＬ１０Ｒ精製抗体を、７日目に開始して、１週間に２回腹腔内に注射した（２４日目に中止した）。コントロール抗体は、精製ＧＬ１１３抗体であった。
【００８０】
腫瘍発達を、触診およびカリパスを使用した腫瘍測定によって、１週間に３回評価した。腫瘍容積＝Ｉ２×Ｌ×０．４であり、Ｉは、小直径であり、Ｌは、大直径である。マウスを、腫瘍が、１５００ｍｍ３を超えた場合または人道的基準のために屠殺した。
【００８１】
図５は、コントロール抗体または抗−ＩＬ１０Ｒ抗体を単独で注射された全てのマウスが、７〜１０日以内に腫瘍を発達させたことを示し、結局、約４週間で動物の屠殺を導いた。ＴＬＲ−９アゴニストＣｐＧ １６６８の注射は、１／７のマウスが、腫瘍を発達しなかったので、わずかな効果を有した。さらに、生存は、このＣｐＧ １６６８群において僅かにより良好であり、腫瘍の平均容積は、３週間後のコントロール群より小さかった。対照的に、ＣｐＧ １６６８と抗−ＩＬ１０Ｒとの組合せで処置されたマウスは、触知可能な腫瘍を発達するが、７匹のうち６匹のマウスについてこれらの腫瘍を拒絶した。続いて、これらのマウスは、残りの実験について腫瘍を有さないままであった。これらの結果は、ＴＬＲ−９アゴニストとＩＬ−１０アンタゴニストとの組み合わせが、Ｃ２６−６ＣＫモデルにおいて治療価値を有することを示し、このことは、この組合せが、ヒトを含む他の腫瘍を処置するために使用され得ることを示唆する。
【００８２】
（実施例ＶＩ）
（ＣｐＧ １６６８＋抗−ＩＬ１０Ｒ抗体のＣ２６腫瘍モデルにおける治療効果）
５×１０４ Ｃ２６腫瘍細胞を、７匹の８週齢雌マウスＢＡＬＢ／ｃの群において０日目で、ｓ．ｃ．移植し、以下のように処置した：
５μｇのＣｐＧ １６６８を、７日目、１４日目、および２１日目に腫瘍内に注射した。
【００８３】
２５０μｇの抗−ＩＬ１０Ｒ精製抗体を、７日目、１４日目、および２１日目に腹腔内注射した。コントロール抗体は、精製ＧＬ１１３抗体であった。
【００８４】
腫瘍発達を、触診およびカリパスを使用した腫瘍測定によって、１週間に３回評価した。腫瘍容積＝Ｉ２×Ｌ×０．４であり、Ｉは、小直径であり、Ｌは、大直径である。マウスを、腫瘍が、１５００ｍｍ３を超えた場合または人道的基準のために屠殺した。
【００８５】
図６は、コントロール抗体、ＣｐＧ１６６８または抗−ＩＬ１０Ｒ抗体を単独で注射された全てのマウスが、７日以内に腫瘍を発達させたことを示し、結局、約３〜４週間で動物の屠殺を導いた。対照的に、ＣｐＧ １６６８と抗−ＩＬ１０Ｒとの組合せで処置されたマウスは、触知可能な腫瘍を発達するが、７匹のうち６匹のマウスについてこれらの腫瘍を拒絶した。続いて、これらのマウスは、残りの実験について腫瘍を有さないままであった。これらの結果は、ＴＬＲ−９アゴニストとＩＬ−１０アンタゴニストとの組み合わせが、Ｃ２６モデルにおいて治療価値を有することを示し、このことは、この組合せが、ヒトを含む他の腫瘍を処置するために使用され得ることを示唆する。
【００８６】
（実施例ＶＩＩ）
（Ｂ１６Ｆ０黒色腫モデルにおけるＣｐＧ１６６８＋抗−ＩＬ１０Ｒ抗体の治療効果）
５×１０４ Ｂ１６Ｆ０腫瘍細胞を、７匹の８週齢雌マウスＣ５７ＢＬ／６の群において、０日目にｓ．ｃ．で移植し、以下のように処置した：
５μｇのＣｐＧ １６６８細胞を、７日目、１４日目、および２１日目で、腫瘍内に注射した。
【００８７】
２５０μｇの抗−ＩＬ１０Ｒ精製抗体を、７日目、１４日目、および２１日目に腹腔内に注射した。コントロール抗体は、精製ＧＬ１１３抗体であった。
【００８８】
腫瘍発達を、触診およびカリパスを使用した腫瘍測定によって、１週間に３回評価した。腫瘍容積＝Ｉ２×Ｌ×０．４であり、Ｉは、小直径であり、Ｌは、大直径である。マウスを、腫瘍が、１５００ｍｍ３を超えた場合または人道的基準のために屠殺した。
【００８９】
図７は、コントロール抗体、ＣｐＧ１６６８または抗−ＩＬ１０Ｒ抗体を単独で注射された全てのマウスが、７日以内に腫瘍を発達させたことを示し、結局、約３〜４週間で動物の屠殺を導いた。ＣｐＧ １６６８単独は、生存に対して、わずかな効果を有した。対照的に、ＣｐＧ １６６８と抗−ＩＬ１０Ｒとの組合せで処置されたマウスは、触知可能な腫瘍を発達するが、７匹のうち６匹のマウスについてこれらの腫瘍を拒絶した。続いて、これらのマウスは、残りの実験について腫瘍を有さないままであった。これらの結果は、ＴＬＲ−９アゴニストとＩＬ−１０アンタゴニストとの組み合わせが、Ｂ１６Ｆ０モデルにおいて治療価値を有することを示し、このことは、この組合せが、ヒトを含む他の腫瘍を処置するために使用され得ることを示唆する。
【００９０】
（実施例ＶＩＩＩ）
Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍由来の腫瘍浸潤ＤＣは、抗−ＩＬ１０抗体とＣｐＧ １６６８との組み合わせに応答してＩＬ−１２を産生し得る。
【００９１】
Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍由来のＴＩＤＣを、抗−ＣＤ１１ｃ磁気ビーズを使用して富化し、ＧＭ−ＣＳＦおよび抗−ＩＬ１０精製抗体とＣｐＧ １６６８との種々の組み合わせの存在下で一晩培養した。２０時間（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａと共に２．５時間インキュベーションすることを含む）後の、ＩＬ−１２ｐ４０の細胞内発現 対 ＣＤ１１ｃの表面発現のＦＡＣＳ分析。
【００９２】
図８は、ＣｐＧ １６６８と抗−ＩＬ１０Ｒとの組み合わせが、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍浸潤樹状細胞におけるＩＬ−１２産生を誘導し得ることを示し、このことは、ＩＬ１０それ自体のアンタゴニストが、有効量のＴＩＲ−９アゴニストと組み合わせる場合に、癌の処置において有効であることを示唆する。
【００９３】
（実施例ＩＸ）
（骨髄由来ＤＣ活性化のＣ２６腫瘍由来の上清による阻害を、抗−ＩＬ１０Ｒおよび／またはインドメタシン（シクロオキシゲナーゼのインヒビター）によって回復し得る）
骨髄由来ＤＣを、Ｃ２６腫瘍由来の１０％ｖ／ｖの上清の存在下または非存在下で、５日間、骨髄前駆体をＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαと共に培養することによって得た。腫瘍上清を調製するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて皮下増殖した０．５ｃｍのＣ２６腫瘍を、切除し、切り刻み、次いで、１０ｍｌ ＤＭＥＭ中で４８時間培養した。得られた上清を、０．２μｍで濾過し、使用の前に凍結した。この上清は、特異的ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって決定されるように、０．２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０および５０ｎｇ／ｍｌのＰＧＥ２を含んだ。上清中のＰＧＥ２合成を阻害するために、シクロオキシゲナーゼのインヒビター（インドメタシン（Ｓｉｇｍａ））を、４８ｈ培養の間、１μｇ／ｍｌで添加した。
【００９４】
５日後、骨髄ＤＣを、１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ１０Ｒ抗体の存在下または非存在下で、最適用量のＬＰＳ、ＩＦＮγおよび抗−ＣＤ４０抗体の異なる組み合わせを用いて活性化した。ＤＣの活性化を、ＦＡＣＳによる共刺激分子ＣＤ４０およびＣＤ８６の発現によって測定し、そして細胞内染色によって検出されるＩＬ−１２の産生によって測定した。
【００９５】
図９は、Ｃ２６腫瘍上清が、ＤＣ活性化を阻害し得ることを示す。インドメタシンまたは抗−ＩＬ１０Ｒの存在下で作られる上清のＤＣ培地への添加によって効果が部分的に軽減される一方、両方の組み合わせは、ＣＤ４０およびＣＤ８６のアップレギュレーションならびにＩＬ−１２発現を十分回復し得る。
【００９６】
これらの実験は、シクロオキシゲナーゼの産物（特に、プロスタグランジン）がまた、腫瘍由来ＤＣ阻害性因子であることを強く示唆する。
【００９７】
（実施例Ｘ）
（ＣｐＧ １６６８＋インドメタシンのＣ２６−６ＣＫ腫瘍モデルにおける治療効果）
５×１０４ Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍細胞を、７匹の６週齢雌マウスＢＡＬＢ／ｃの群において０日目で、ｓ．ｃ．移植し、以下のように処置した：
５μｇのＣｐＧ １６６８を、７日目、１４日目、および２１日目に腫瘍内に注射した。
【００９８】
飲料水中の５μｇ／ｍｌのインドメタシンを、５日目に開始し、２８日目まで自由摂取。
【００９９】
腫瘍発達を、触診によって、１週間に３回評価した。マウスを、腫瘍が、１５００ｍｍ３を超えた場合または人道的基準のために屠殺した。
【０１００】
図１０は、全てのコントロールマウスが、７日以内に腫瘍を発達させたことを示し、結局、約３〜４週間で動物の屠殺を導いた。ＣｐＧ群またはインドメタシン群における１／７のマウスのみが、腫瘍を発達させなかった。対照的に、ＣｐＧ １６６８とインドメタシンとの組合せで処置されたマウスの４／７は、腫瘍を発達しなかった。これらの結果は、ＴＬＲ−９アゴニストとシクロオキシゲナーゼのインヒビターとの組合せが、Ｃ２６−６ＣＫモデルにおいて治療価値を有することを示し、このことは、この組合せが、ヒトを含む他の腫瘍を処置するために使用され得ることを示唆する。
【０１０１】
本発明の多くの改変およびバリエーションは、本発明の意図および範囲を逸脱することなくなされ得、このことは、当業者に明らかである。本明細書中に記載される特定の実施形態は、例のみのために提供され、本発明は、添付の特許請求の範囲の用語に加えてこのような特許請求の範囲が権利を与える等価物の全範囲によってのみ限定される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１０−５３１４０（Ｐ２０１０−５３１４０Ａ）
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７４００４（Ｐ２００９−２７４００４）
【出願日】平成２１年１２月１日（２００９．１２．１）
【分割の表示】特願２００３−５４６９３２（Ｐ２００３−５４６９３２）の分割
【原出願日】平成１４年１１月２６日（２００２．１１．２６）
【出願人】（５９６１２９２１５）シェーリング コーポレイション (785)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１日（２００９．１２．１）
【分割の表示】特願２００３−５４６９３２（Ｐ２００３−５４６９３２）の分割
【原出願日】平成１４年１１月２６日（２００２．１１．２６）
【出願人】（５９６１２９２１５）シェーリング コーポレイション (785)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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