腫瘍細胞致死性をトリガーするのに有用な核酸
本発明は、化学的に修飾された主鎖及び少なくとも４〜１０００bp、好ましくは８〜５００bp、最も好ましくは１６〜２００bpを含む二本鎖核酸断片に関する。開示された分子（ＤＲＩＬ分子）は、ＤＮＡ損傷シグナリング及び修復経路、特に二本鎖切断修復の非相同性ＮＨＥＪ経路を妨害することができる。本発明は、腫瘍細胞／組織のＤＮＡ修復で誘発される致死性（短縮するとＤＲＩＬＬ）をトリガーするために、腫瘍細胞核に導入されるのに有効な量において、薬学的に許容されうる担体と組み合わせて、ＤＮＡ切断処置、特に放射線治療又は化学療法と共同して使用されるべき佐剤組成物としてＤＲＩＬ分子を適用することを開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、生物学的及び治療用途のためのオリゴヌクレオチド／ＤＮＡ断片の使用の分野にあり、更に詳しくは、ＤＮＡ損傷シグナリング（DNA damage signaling）及び修復経路、特に二本鎖切断（ＤＳＢ）修復の非相同性末端結合（non-homologous end joining）（ＮＨＥＪ）経路を妨害する核酸の分野にある。
【０００２】
本発明は、抗がん性治療を受けた腫瘍の細胞致死性（cell lethality）をトリガー（triger）するためのツールとして有用な核酸に関する。
【０００３】
単独の又は外科手術と組み合わせた放射線治療、化学療法は、ヒトがんに対する必須の治療宝庫である。
【０００４】
電離放射線は、直接又は間接に二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢｓ）を引き起こしそして細胞／組織死（ネクローシス又はアポトーシス）をトリガーする。電離放射線の細胞障害性効果は、ヒトがんの処置において広く使用されている放射線治療の基礎を形成する。放射線治療の有効性は、現在、ある種の腫瘍（例えば、グリオブラストーマ）の放射線耐性及びすぐ近くの正常な組織の照射により引き起こされる副作用（例えば、乳がん及び頚部がんの処置における）により制限される。
【０００５】
過去数年にわたり、腫瘍細胞の放射線感受性又は放射線耐性の基礎にある現象の複雑性を洞察するために、電離放射線応答に関する生物学的機構に多くの研究が集中した。電離放射線に対する応答を精密に調節する種々の経路の理解は、放射線治療と共同して、放射線に対して高度に耐性の腫瘍、例えば、脳腫瘍又は頭部腫瘍及び頚部腫瘍からの回復の可能性を改良することができる新規な薬物及び治療のための分子標的の同定に向けての重要な一歩である。
【０００６】
化学療法剤の使用は、直接又は間接のＤＳＢｓを含むＤＮＡ損傷を引き起こすことがある。主に使用される化学療法剤（化学的細胞障害剤）のファミリーの例は、トポイソメラーゼＩ又はＩＩの阻害剤（カンプトテシン／トポテカン（topotecan）、エピルビシン／エトポシド）、ＤＮＡ架橋剤（シスプラチン／カルボプラチン／オキサリプラチン）、ＤＮＡアルキル化剤（カルムスチン／ダカルバジン）又は抗代謝剤（５−フルオロウラシル／ゲムシタビン（gemcitabine）／カペシタビン（（capecitabine））並びに有糸分裂紡錘体の阻害剤（パクリタキセル／ドセタキセル（docetaxel）／ビノレルビン（vinorelbine）である。生物学的細胞傷害剤（モノクローナル抗体、サイトカイン／キナーゼ阻害剤、免疫治療／ワクチン）の開発における最近の進歩は、腫瘍のサブセットに対するそれらの有効性及び特異性を証明した。しかし、それらは、しばしば化学的細胞傷害剤と組み合わせて使用される。新規な細胞障害性薬物の開発における多くの進歩にもかかわらず、化学療法に対する薬物耐性は、依然としてがんの処置における主要な臨床的関心事である。薬物摂取／流出、代謝分解、標的の突然変異誘発、高められた修復、細胞死（アポトーシス及びネクロシス）のシグナリングに関する薬物耐性の機構の理解は、化学療法の有効性を保証するために必須でありそして特にある処置耐性の腫瘍における治療指数を改良するのに必須である。
【０００７】
化学療法と放射線治療の共同は、ガンの処置において広く使用される。まだ完全には解明されていないけれども、細胞傷害剤の作用の生物学的基礎は、細胞機構、例えば、細胞サイクル又はＤＮＡ損傷に頼っており、これらは、また、がん治療における種々の処置を組み合わせることにより付加的又はより良好な相乗的利益すらもたらす放射線誘発細胞死のための重要なファクターでもある。
【０００８】
最近の１０年間に、この分野で多くの研究が行なわれた。放射線に対する応答におけるシグナル伝達の複雑性は、正確に叙述され始めている。
【０００９】
中でも、電離放射線で標的化されるべき特に興味深い遺伝子は、放射線で誘発された致死性機構、例えば、アポトーシス又はＤＮＡ修復、の調節に関与した遺伝子である。電離放射線により誘発される細胞死は主にＤＳＢｓの修復に依存する。
【００１０】
２つの機構、即ち、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ、配列非依存性経路）及び相同性組換え（ＨＲ、配列依存性経路）（Jackson, 2002により概説された）がこれらの損傷の修復に関与している。これらの２つの主要なＤＳＢ修復経路に関与する標的化遺伝子は、使用されるアプローチ又はがん細胞系統に依存して少ない又は並の放射線感受性をもたらす（Belenkov et al., 2002; Marangoni et al. 2000; Ohnishi et al, 1998）。
【００１１】
Ｋｕ７０及びＫｕ８０、ＤＮＡ−ＰＫｓｃタンパク質は、放射線で誘発された又は化学的に誘発されたＤＮＡ損傷の修復において重要である。損傷が適切な時間に修復されなければ、細胞は死ぬ。ゆえに、それらは、標的細胞及び組織を放射線治療及び化学療法に感受性とするための興味深い分子標的である。哺乳動物細胞において優性であると考えられるＮＨＥＪ経路に関与したこれらのカギとなるタンパク質（Ｋｕ７０／Ｋｕ８０、ＤＮＡ−ＰＫｓｃ、等）を阻害するために多くのアプローチが考えられそして行なわれた：
１）ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ）（即ち、ＤＮＡ−ＰＫｓｃ、ＰＡＲＰ−１、ＡＴＭ、ＡＴＲ）の阻害剤（Boulton et al., 2000; Durant & Karran, 2003; Willmore et al., 2004; Vauger et al., 2004）
２）ネガティブドミナント&ペプチド（ＫＵ８０のＣ末端）（Marangoni et al., 2000; Kim et al., 2002）
３）一本鎖抗体可変性断片（ｓｃＦｖ）（ＤＮＡ−ＰＫｓｃ）（Li et al. 2003）
４）ＲＮＡアプタマー（ＳＥＬＥＸ：ＲＮＡ結合Ｋｕ）（Yoo & Dynan, 1998）
５）アンチセンス（Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＤＮＡ−ＰＫｓｃ）（Li et al., 2003b; Marangoni et al., 2000; Sak et al., 2002）
６）ｓｉＲＮＡ（ＤＮＡ−ＰＫｓｃ）（Peng et al, 2000）。
【００１２】
これらの莫大な努力にもかかわらず、ＤＮＡ修復遺伝子標的化とがん治療の組み合わせは、依然として初期の実験段階にあり、これまでいかなる証明された利益も示していない。上記したアプローチは共通の特徴を共有していることに留意する価値がある：、それらは可能なバイパスを有する複雑なカスケード経路（例えば、ＮＨＥＪ）に関与した単一のエフェクター（タンパク質）を標的化する。
【００１３】
本発明者は、直接又は間接ＤＮＡ損傷抗がん性治療に対する腫瘍感受性は、切断されたＤＮＡ断片の模倣物として作用しそしてＤＮＡ損傷処理により誘発されたＤＳＢ部位として認識される、化学的に修飾された若しくは修飾されていない二本鎖核酸分子を使用することにより高められうることを見出した。この分子は、該修飾による非複製性構造を有することができる。
【００１４】
そこで、本発明の目的は、放射線治療及び化学療法に対する処置耐性腫瘍の応答を高めることができる、下記において「ＤＮＡ修復で誘発された致死性」（DNA repair induced lethality）（短縮して表すとＤＲＩＬ）分子とも名づけられたこのような二本鎖核酸断片を提供することである。
【００１５】
更に詳しくは、本発明は、ＤＮＡのＤＳＢｓを直接又は間接に引き起こすことができる物理的及び化学的作用物質と組み合わせて使用されるべき新規なＤＲＩＬ分子を提供すること、及び該ＤＲＩＬ分子の使用を直接又は間接ＤＮＡ損傷を引き起こす抗がん性治療と組み合わせてがんを処置する方法を提供することを目的とする。
【００１６】
本発明の他の目的は、特に放射線治療及び／又は化学療法に対して高度に耐性の腫瘍に対するがん処置の有効性を高めるための抗腫瘍治療佐剤（anti-tumoral therapeutic adjuvants）を製造するためのＤＲＩＬ分子の使用に関する。
【００１７】
本発明のＤＲＩＬ分子は、ＮＨＥＪ経路（配列非依存性経路）に関与するタンパク質、特に、Ｋｕタンパク質のための基質（substrates）でありそして、少なくとも４〜１００００塩基対（bp）、特に４〜１０００bpの配列非依存性主鎖を含む。
【００１８】
それらは、
−該二本鎖ＤＲＩＬ分子が、薬学的に許容されうる担体と共に使用されるとき、細胞核中に細胞／組織体（cell/tissue body）により摂取されることができるようなもの、
−ＤＲＩＬ分子の自由端（free ends）が二本鎖切断修復及び損傷シグナリングに関与するＤＮＡ結合タンパク質により認識されうるようなもの、
−ＤＲＩＬ分子の自由端が前記酵素により腫瘍細胞ゲノムＤＮＡに組み込まれやすいようなものである。
【００１９】
ＮＨＥＪ経路を介するＤＲＩＬ分子の作用の機構に従えば、それらの長さは、実際的考慮を除いては限定それ自体ではないが、少なくとも４bp、更に好ましくは少なくとも８bpを含まなければならない。
【００２０】
好ましくは、本発明のＤＲＩＬ分子は、８〜５００bp、最も好ましくは、１６〜２００bpを含む。
【００２１】
特に好ましいＤＲＩＬ分子は、１６〜１００bp、更に有利には、２４〜１００bpを含む。
【００２２】
本発明に従うＤＲＩＬ分子は、ネイティブなホスホジエステル主鎖を有するか又は化学的に修飾されたホスホジエステル主鎖又は化学的基若しくは化学的基の混合体を有する他の主鎖を有し、但し、修飾されたオリゴマーは、ＮＨＥＬ経路、特にＫｕタンパク質、及びＤＳＢ損傷シグナリング経路に関与するタンパク質のための基質のままであるものとする。有利には、化学的修飾は、ＤＲＩＬ分子に化学的安定性を与えること及び／又は、もしそれらのゲノム組込みが起こるならば、それらのゲノム組込み時に更なる複製（突然変異誘発効果の潜在的原因）についてそれらを阻止することを意図する。
【００２３】
それらは、ペントフラノシル基の代わりに、２’−Ｏ−アルキルリボース、２’−Ｏ−アルキル−Ｃ４’分岐したリボース（2’-O-alkyl-C4’branched ribose）、シクロブチル又は他の炭素環又はヘキシトールのような糖模倣物を有することもできる。
【００２４】
それらは、線状にされることができ、あるいはヘアピン二本鎖核酸であって、そのループは核酸であることができる、あるいは当業者により知られている他の化学的基、好ましくはリンカー、例えばヘキサエチレングリコール又はテトラデオキシチミジレート（Ｔ４）であることができるヘアピン二本鎖核酸から作られることができる。
【００２５】
本発明のＤＲＩＬ分子は、少なくとも１つの自由ｄｓＤＮＡ端（free dsDNA ends）から構成されることができ、該自由端は平滑である（blunt）ことができ又は５’−／３’−突き出し端部であることができ、そして修飾された核酸主鎖あるいは他の化学的基又は当業者により知られている化学的基の混合体を含むことができる。
【００２６】
好ましい断片は、各ストランドの端部に１つ以上の化学的基を含む。好ましい化学的基は、ホスホロチオエートを含む。あるいは、好ましい断片は、３’−３’ヌクレオチド結合（3'-3'nucleotide linkage）を有する。
【００２７】
本発明の他の修飾された主鎖は、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、モルホリノ核酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ メチレン／エチレンで橋かけされたロックされた核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及び短鎖アルキル、あるいは可変長さのシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子若しくは複素環糖内結合、あるいは当業者により知られているいかなる修飾されたヌクレオチドも含む。
【００２８】
US Patent No.5,677,437は、ヘテロ芳香族オリゴヌクレオシド結合を記載している。窒素リンカー又は窒素を含有する基を使用して、オリゴヌクレオチド模倣物を製造することもできる（U.S.Patent No.5,792,844及びNO.5,783,682）。U.S.Patent No.5,637,684は、ホスホルアミデート及びホスホロチオアミデートオリゴマー化合物を記載している。モルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドも予想される（U.S.Patent No.5,034,506）。他の態様、例えば、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）主鎖においては、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖はポリアミド主鎖で置き換えることができ、その際、塩基は、ポリアミド主鎖のアザ窒素原子に直接又は間接に結合している。他の合成オリゴヌクレオチドは、２’位置に下記のもの：ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ3、ＳＣＨ3、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＮＨ2もしくはＯ（ＣＨ2）nＣＨ3（式中、ｎは１〜約１０である）；Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリール若しくはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ3；ＯＣＦ3；Ｏ−；Ｓ−；又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、若しくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ3；ＳＯ2ＣＨ3；ＯＮＯ2；ＮＯ2；Ｎ3；ＮＨ2；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；又はオリゴヌクレオチドの薬物動態学的及び／又は薬力学的性質を改良するための基及び同様な性質を有する他の置換基、の１つを含む置換された糖部分を有することができる。
【００２９】
ＤＲＩＬ分子は、天然のヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド又は２’−リボヌクレオチドに本質的に基づいており、そして場合により、アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシル以外の１種以上の修飾されたヌクレオチド及び／又はヌクレオ塩基を含む。
【００３０】
通常の塩基以外の適切なヌクレオ塩基は、例えば、Ｃ５−メチルシトシン、ウラシル、プソイドイソシトシン、Ｃ５−プロピニルウラシル、Ｎ７−デアザグアニン、Ｎ７−グリコシル化グアニン、又はα−アノマー、又は他の修飾されたヌクレオ塩基又は塩基性残基である。
【００３１】
照射されるか又は化学療法により処置されるとき組織又は身体中の細胞内にあるであろう化学的に修飾されたＤＲＩＬ分子は、ＤＳＢ部位でゲノムＤＮＡに組み込まれるか、又はＮＨＥＪのような細胞ＤＮＡ修復機構によって、電離放射線により誘発されたＤＳＢ部位として認識されるであろう。次いで、それらは、ＤＳＢ修復タンパク質により結合され、切断された染色体に組み込まれるか又は修復システムを飽和する。
【００３２】
本発明の態様に従えば、該ＤＲＩＬ分子は、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復又は損傷シグナリングプロセスを妨害する少なくとも１つの埋め込まれたエレメント（embedded element）を更に含む。
【００３３】
該非複製性エレメント（１つ又は複数）は、二本鎖断片の内部位置又は端部で組み込まれることができる。それ（それら）は、
ａ）ＤＮＡ複製のためのテンプレートとして使用することができないユニット、例えばポリエチレングリコール鎖、好ましくはヘキサエチレングリコール鎖、又は場合により１個以上のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、窒素により中断されている及び／又は置換されたいかなる炭化水素鎖、又は１個以上のヘテロ原子を含むヘテロ原子基若しくは複素環基；
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ又はエキソヌクレアーゼによって作用されにくい（not amenable）ブロッキングエレメントであるユニット、例えば、いかなる３’−修飾されたヌクレオチド又は当業者により知られている他のヌクレオチド；
ｃ）ヘアピン断片のループにおいて使用されるときの、ネイティブオリゴヌクレオチド、例えば、Ｔｎ、好ましくは、テトラデオキシチミジレート（Ｔ４）、
を含むことができる。
【００３４】
上記ストランドは、化学合成、半生合成又は生合成、いかなる増幅方法、それに続くいかなる抽出及び製造方法並びにいかなる化学的修飾によっても製造される。
【００３５】
培養された細胞及びヌードマウスにおける異種移植された腫瘍及び遺伝子的に修飾されたマウスにおいて行なわれた実験は、該ＤＲＩＬ分子が放射線治療及び／又は化学療法を受けた腫瘍の細胞／組織致死性をトリガーすることを示した。
【００３６】
かくして、本発明は、ＤＮＡ切断処理と共同して使用されるべき佐剤組成物（adjuvant compositions）であって、腫瘍細胞の核において導入されるのに有効な量において薬学的に許容されうる担体と組み合わせて上記した如きＤＲＩＬ分子を含む佐剤組成物にも関する。
【００３７】
本発明は、
上記した如きＤＲＩＬ分子をがん細胞／組織に導入すること、及び
細胞においてＤＮＡ損傷方法によりＤＮＡ切断を誘発すること、
を共に含む抗がん性治療に対する腫瘍感受性を促進する方法にも関する。
【００３８】
インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）研究において使用されるプロトコールに基づいて、本発明は、放射線治療又は化学療法と組み合わせてＤＲＩＬ分子を使用する臨床プロトコールを確立する原理を提供する。いかなるプロトコールの基礎もなす原理は、ＤＮＡ損傷事象が起こるとき、ＤＲＩＬ分子が細胞の核に送達されるべきであるということである。ゆえに、ＤＲＩＬ分子は、放射線治療の数時間前に投与されなければならないが、これに対して、それらは、投与方式及び各成分の薬物動態学に依存して、化学療法剤（１つ又は複数）と共に与えられることができる。
【００３９】
マウスに関するプロトコールは、照射の数時間前、例えば５時間前に、そして１週間に３回、ＤＲＩＬ分子を投与すること含み、その際総照射線量は６週間の処置にわたり３０Ｇｙに相当する。部分に分けた照射の使用は、特に有効である。
【００４０】
有利には、該方法は、ＤＲＩＬ分子による処置を二重化学療法とカップリングさせることを含む。例えば、５−ＦＵ及びＣＰＴ１１を、完全に１週間の休止により間隔をおいて、３日間連続して３回一緒に注入する。あるいは、ＤＲＩＬ分子による処理は放射線治療とカップリングさせる。
【００４１】
それは、特に患者の重量に依存して、当業者によりヒトに容易に適合させられるであろう。
【００４２】
好ましい態様では、ＤＲＩＬ分子は、上記した如き化学的に修飾されたＤＲＩＬ分子及びヒト治療における他の実施である。
【００４３】
他の態様では、ＤＲＩＬ分子は、化学的に修飾されておらずそしてネイティブな核酸断片に対応するが、化学的に修飾された断片の特徴を示し、特に、前記化学的に修飾されたＤＲＩＬ分子に関して規定された塩基対の数及び性質を有する。
【００４４】
更に詳しくは、ＤＮＡストランド切断は、電離放射線（放射線治療）又は化学反応（化学療法）により達成される。
【００４５】
このような方法は、腫瘍に対するＤＮＡ損傷治療と共同の新規な治療佐剤である。
【００４６】
本発明は、腫瘍、特に放射線治療及び／又は化学療法に高度に耐性の腫瘍を処置するための抗腫瘍薬物を製造するための該化学的に修飾されていないＤＲＩＬ分子の使用であって、該薬物は、ＤＮＡ切断処置、特に放射線治療又は化学療法と共同して使用される、使用にも関する。
【００４７】
ｉｎ ｖｉｖｏで、化学的に修飾された又は修飾されていないＤＲＩＬ分子は、適切な許容されうる担体と共に、いかなる適切な経路によっても、例えば、経口又は静脈内、又は腫瘍内投与又は皮下注射又はその他により投与される。
【００４８】
本発明の他の特徴及び利点は、図１〜５及び表１及び２に関して下記の実施例に示される。
【００４９】
ヌードマウスの異種移植されたヒト放射線耐性腫瘍（頭部及び頚部、グリオブラストーマ）並びにトランスジェニックマウスの消化管にＲａｓV12G×Ａｐｃ1638N二重突然変異で誘発された腫瘍における分子及び細胞の研究並びにアッセイを、
ｉ）ＤＲＩＬ分子の生物学的活性を評価するため、ii）抗がん性治療を増感させることにおいて、ＤＲＩＬ分子を使用することによるＤＮＡ Ｂａｉｔアプローチを確証するため、iii） 観察されたＤＲＩＬ効果の基礎をなす分子及び細胞機構を解明するために、行なった。これらの研究の結果を下記の節（実施例）において慨述しそして要約する。
【００５０】
実施例１：ＤＲＩＬ分子のデザイン、合成及び調製
２つのタイプのＤＲＩＬ分子：線状又はヘアピンｄｓＤＮＡ断片をデザインした。ヘアピンＤＲＩＬ分子では、ヘキサエチレングリコールリンカー（ＰＥＧと略記する）又はテトラデオキシチミジレート（Ｔ４と略記する）をループとして使用した。ｄｓＤＮＡステムの端部（１つ又は複数）を、ホスホロチオエート又は３’−３’ヌクレオチド結合の組込みにより３’−エキソヌクレアーゼによる化学的分解に対して保護することができる。一般に、他の化学的修飾を使用することができるが、但し、それらはＫｕ７０／Ｋｕ８０−ＤＮＡ ＰＫｓｃ結合と適合性であるものとする（Ｍartensson & Hammarten,2002）。種々のステム長さ８bp、（ＤＲＩＬ８−ＰＥＧ）、１６bp（ＤＲＩＬ１６−ＰＥＧ）、２４bp（ＤＲＩＬ２４−ＰＥＧ）及び３２bp（ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ）、並びに種々のステム配列を有する種々のＤＲＩＬ分子が使用された。両端が２つのＰＥＧループによりシールされているダンベルｄｓＤＮＡ断片（ＤＲＩＬ３２−２ｘＰＥＧ）もコントロールとしてデザインされた。いくらかのＤＲＩＬ分子は、フルオレセイン（ＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ）、シアニン３（ＤＲＩＬ３２−Ｃｙ３）又はビオチン（ＤＲＩＬ３２−Ｂｔ）でタグ付けされたＴを介して標識された。表１．１及び１．２はこの研究で使用したＤＲＩＬ分子の配列及び化学構造を要約した。
【００５１】
【表１】
【００５２】
表１．１：ＤＲＩＬ分子の配列及び化学的構造。太字はホスホロチオエート主鎖を有するヌクレオチドである。実線はヘキサエチレングリコールリンカー（ＰＥＧ）を記号で表している。ＤＲＩＬ３２−Ｔ４はＰＥＧリンカーの代わりにリンカーとしてＴ４を含有する。ＤＲＩＬ３２−２ｘＰＥＧは、ダンベル（閉じた）分子である。ＤＲＩＬ３２ｓ３３−ＰＥＧはシャッフルド配列（同じ塩基組成であるが異なる順序）及び３’−３’結合を有する。
【００５３】
【表２】
【００５４】
表１．２：６４bpＤＲＩＬ分子の配列及び化学的構造。太字はホスホロチオエート主鎖を有するヌクレオチドである。実線はヘキサエチレングリコールリンカー（ＰＥＧ）を記号で表している。
【００５５】
すべてのＤＲＩＬ分子は、自動化された固相オリゴヌクレオチド合成により製造される（Eurogenetic, Belgium）。それらは、変性逆相ＨＰＬＣにより精製された。変性毛細管ゲル電気泳動及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＬＣ−ＭＳを品質コントロールのために使用した。９０%より多くのオリゴヌクレオチドは完全長である。すべてのサンプルは出荷の前に凍結乾燥された。
【００５６】
受け取ると、すべてのサンプルを二回蒸留水（bi-distilled water）に溶解した。標識されていないＤＲＩＬ分子の濃度は、変性条件下（ＤＲＩＬ分子の熱安定性に依存して６０℃〜９０℃）に分光測法により測定された（Cantor ＆ Warshaw,，1970）。ダンベルｄｓＤＮＡ断片（ＤＲＩＬ３２−２ｘＰＥＧ）は、ＰＥＧループを有しそして３’突き出し及び相補性端部を有する２つの半ヘアピンのアニーリング及びＤＮＡ Ｔ４リガーゼ（Biolabs）によるライゲーションにより調製された。
【００５７】
熱力学的及び速度論的考察に基づいて、ＤＲＩＬ分子の分子度（molecularity）に従って、ＤＲＩＬ分子のサンプルを調製するために下記のプロトコールを使用した：
二分子ＤＲＩＬ分子（ＤＲＩＬ３２、ＤＲＩＬ６４及びＤＲＩＬ６４−ＰＥＧ）について：
二回蒸留水中の各ストランドの１：１ストック溶液（可能な最も高い濃度）の混合物は、各ストランドの完全な変性のために９０℃で５分間加熱されなければならない。室温に円滑に戻す（サンプルを典型的には水浴中に放置した）ことによりアニーリングを行いそして得られる二本鎖分子を−２０℃でアリコートにおいて保存した。
【００５８】
一分子ＤＲＩＬ分子（ヘアピン）について：
二回蒸留水中のヘアピンＤＲＩＬ分子２００μMを含有する溶液は、完全な変性のために９０℃で５分間加熱されなければならない。サンプルを氷水（０℃）中に冷却することによりアニーリングを行なわなければならない。アリコートの保存は−２０℃であった。
【００５９】
実施例２：ＤＲＩＬ分子の生化学的分析
ＤＲＩＬ分子の作用の機構を細かく調べるための第一の工程として、一連のバンドシフトアッセイを、標準プロトコールに従ってＨｅｐ２細胞からの核内タンパク質抽出物（nuclear protein extracts）の存在下に種々の32Ｐ放射線標識されたＤＲＩＬ分子で行なった。典型的には、32Ｐ放射線標識されたＤＲＩＬ分子１０nMを、ＴＢＥ緩衝剤中で３０℃で１０分間種々の濃度の核内タンパク質（0、１０、２０、４０、８０、１６０及び３２０ng/μl）の存在下にインキュベーションした。次いでサンプルを５%アクリルアミドネイティブゲル上にロードした。４℃で２時間９５Vで電気泳動を行なった。ゲルを乾燥しそしてホスホルイメージャー（phosphor imager）（Molecular Dynamics）により走査した。
【００６０】
図１．１は、８bpＤＲＩＬ８−ＰＥＧ（最も短いＤＲＩＬ分子）を除いて、共通のバンド（バンド１）を有するより長いＤＲＩＬ分子では３までの遅延したバンド（retarded bands）が観察された。他のバンドは長いＤＲＩＬ分子の存在において生じた。３２bpの長いＤＲＩＬ分子（ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ、ＤＲＩＬ３２ｐｏ−ＰＥＧ及びＤＲＩＬ３２）を有するＨｅｐ２核内タンパク質抽出物の滴定の遅延したバンドバターンはより複雑である。遅延したバンド１の強度は、タンパク質の濃度が増加するにつれて、増加し次いで減少する。遅延したバンド２及び３の強度は、それがプラトーに達するまでタンパク質濃度の関数として増加する。
【００６１】
マウスモノクローナル抗Ｋｕ７０抗体（Santa Cruz Biotechnology）による結合相互作用及びバンドシフトアッセイを行なうと、遅延したバンド１及び２は、Ｋｕ複合体を含有することが示された（図１．２：線α−Ｋｕに関して、それは、ゲル上にサンプルをロードする前に、結合反応に抗Ｋｕ抗体を加えた（＋）及び加えなかった（−）場合に、示される）。バンドは１、２及び３の番号を付けられておりそして、抗Ｋｕ結合後にシフトした移行を示すバンドの番号に星印を加えた。）
【００６２】
バンド１及び２は、抗Ｋｕ７０抗体添加によりバンド１＊及び２＊にスーパーシフトされた（super-shifted）。バンド１はＤＲＩＬに結合した１つのＫｕ７０／８０複合体を有し、そしてバンド２は、ＤＲＩＬに結合した２つのＫｕ７０／８０複合体を有するようである。精製されたＫｕタンパク質で行なわれたコントロール実験は、この解釈を確証した。バンド３は、抗Ｋｕ７０抗体の添加により消失したが（明らかに、ＤＲＩＬ２４−ＰＥＧ及びＤＲＩＬ３２ｐｏ−ＰＥＧで見られた）、これは、バンド３もＫｕ複合体を含有することを示すことが留意される。
【００６３】
Ｋｕタンパク質の同定は、ＤＲＩＬ分子がＮＨＥＪ装置と相互作用することを明らかに示す。
【００６４】
実施例３：ＤＲＩＬ分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
電離放射線と共同して、婦人の頚部がん（Ｈｅｌａ）及び喉頭がん（Ｈｅｐ２）に由来する２つの放射線耐性のヒトがん細胞系におけるクローン原性生存アッセイ（clonogenic survival assay）により、培養された細胞におけるＤＲＩＬ分子の活性を研究した。
【００６５】
３．１）誘発された細胞致死性
Ｈｅｌａ細胞におけるＤＲＩＬ分子の８時間のトランスフェクション及び137セシウムからの 線（ rays）行なわれた、２時間の間隔をおいた０．５Ｇｙ分割線量による４回の照射（４×０．５Ｇｙ）をすると、トランスフェクションされていない細胞に比べて、クローン原性生存の有意な減少が観察された。結果は、図２．１に示され、この図２．１においては、パネルＡは、ＤＲＩＬ３２及びＤＲＩＬ３２−ＰＥＧの存在下に正規化された生存クローン数の用量依存性を与え、そしてパネルＢは、８３nM（培養培地中の濃度）における種々のＤＲＩＬ分子の存在下に正規化された生存クローン数を与える。
【００６６】
この効果は、用量依存性方式においてＤＲＩＬ分子の化学的性質に依存する。このアッセイでは、ヘアピンＤＲＩＬ分子（ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ、ＤＲＩＬ３２−Ｔ４及びＤＲＩＬ２４−ＰＥＧ）並びに線状二本鎖ＤＲＩＬ分子（ＤＲＩＬ６４−ＰＥＧ及びＤＲＩＬ６４）は、クローン原性生存を有意に減少させた。遊離ｄｓＤＮＡ端部を欠く（両端でヘキサエチレングリコールリンカーでキャップされた）ダンベルＤＲＩＬ分子（ＤＲＩＬ３２−２ｘＰＥＧ）は、いかなる効果も示さないことは留意する価値がある。ループの化学的性質は問題にならない（例えば、ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ対ＤＲＩＬ３２−Ｔ４）。これらの観察は、ＤＲＩＬ分子のいくらかは、電離放射線に細胞を増感させることができることを示す。
【００６７】
細胞培養物は、１０%血清を補充されたＭＥＭ中にあった。スーパーフェクト（Superfect）（Qiagene）は、製造者の指示に従ってトランスフェクション剤として使用された。クローン原性生存は、未処理細胞の数に対するコロニーを形成する処理された細胞の数として評価された。
【００６８】
ＤＲＩＬ分子による外因性ＤＮＡの変則的組込みの抑制
電離放射線は、外因性ＤＮＡのトランスフェクション、放射線で高められた組込みと呼ばれる方法を改良することが知られている。Ｈｅｌａ細胞培養物をこのアッセイのために使用した。細胞を、線状プラスミド（ネオマイシン耐性をコードする遺伝子を有する）２μg及び３つの異なる割合のＤＮＡ／スーパーフェクト（１：２、１：５、１：１０）により８時間の期間トランスフェクションした。トランスフェクション時間の期間中、細胞を種々の照射プロトコール：照射なし、１Ｇｙ及び２Ｇｙの１回の単一照射、並びに２時間毎に０．５Ｇｙの分割線量により送達された２Ｇｙ照射（４×０．５Ｇｙ）、にさらした。プラスミドの組込みは、Ｇ４１８の０．６mg/mlを含有する培地中で増殖するＮｅｏＲ細胞の選択により監視された。プラスミド組込みは、分割照射プロトコールにより有意に高められた。ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ分子２μgがトランスフェクション混合物に加えられると、放射線で高められた組込みは無効にされた（図２．２）。
【００６９】
この実験は、Ｋｕ、ＤＮＡ−ＰＫ及びＡＴＭタンパク質（Nimura et al., 2002）を必要とする外因性ＤＮＡの放射線で高められた変則的組込みは、ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ分子の作用の機構がＮＨＥＪ経路に関与したタンパク質の捕捉により作用するので、予想されるとおりＤＲＩＬ分子により抑制されることを示した。
【００７０】
３．３）ＤＳＢｓ修復の誘発された阻害
核におけるＤＳＢ損傷は、ＤＮＡ切断を標識するγ−Ｈ２ＡＸ抗体を使用することにより免疫検出されうる。Ｈ２ＡＸフォーカス（H2AX foci）の大部分は、照射後に急速に現れ、そしてＤＳＢｓ修復プロセスが進行するにつれて消失した。少数のＨ２ＡＸフォーカスはトランスフェクションされていない細胞において照射の２時間後に検出された。
【００７１】
図２．３は、２Ｇｙ照射の２時間後における蛍光性ＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ分子によりトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞で得られた結果を与える。左のパネル：ＤＲＩＬ３２−ＦＴＩＣの蛍光（明るいドット及びパッチ）及び核におけるγ−Ｈ２ＡＸ抗体の免疫蛍光により検出されたＤＮＡ修復フォーカス；右パネル：γ−Ｈ２ＡＸ抗体の免疫蛍光及びＤＡＰＩ対比染色により検出されたＤＮＡ修復フォーカスを有する核の同じ像。下部左コーナーの矢印は、核におけるＤＲＩＬ３２−ＦＴＩＣ及びγ−Ｈ２ＡＸシグナルの不存在を示す。上部右コーナーにおける矢印は、共局在化したＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ及びγ−Ｈ２ＡＸシグナルを示す。
【００７２】
図２．３に示されたとおり、修復されていないＤＳＢ切断は、ＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣによる二重蛍光標識及びγ−Ｈ２ＡＸ抗体のそれにより示されたとおり、照射（２Ｇｙ）の２時間後にＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ分子によりトランスフェクションされたＨｅｌａ細胞において持続した。同じ培養において、ＤＳＢ修復フォーカスは、ＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣにより有効にトランスフェクションされていない細胞では殆ど検出できなかったが、これはＤＮＡ修復がこれらの細胞においては完全であったことを示唆することは留意する価値がある。
【００７３】
トランスフェクション及び照射プロトコールは上記したそれらと同様であった。免疫検出については、細胞を５cm直径のペトリ皿中で表面カバースリップ上で成育させ、製造者の指示に従ってSuperfect(Qiagene）によりＦＴＩＣで標識されたＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ分子２μgでトランスフェクションした。トランスフェクションの開始から４時間後に、細胞を照射し（２Ｇｙ）、次いで３７℃で培地中に２時間休止させた。３回の洗浄サイクル後に、細胞を２%ＰＦＡで１０分間固定化した。１回の追加の洗浄後に、 −Ｈ２ＡＸの存在は、１×ＰＢＳ、１%ＢＳＡ中に１／１００に希釈されたウサギ抗 −Ｈ２ＡＸ抗体（４４１１−ＰＣ、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）で検出された。細胞を１×ＰＢＳ、０．５%ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３回洗浄し、次いで１×ＰＢＳ、１%ＢＳＡ中に１／１００に希釈されたローダミン−コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体と室温で１時間インキュベーションした。細胞をエピフルオレッセンス顕微鏡法により可視化した。
【００７４】
実施例４：ＧＭＡ３２細胞系におけるＤＲＩＬ分子の効果及び照射又は有糸分裂阻害剤とのそれらの関連
ＤＮＡ切断を許容するＧＭＡ３２チャイニーズハムスター繊維芽細胞を、ピルビン酸ナトリウム１mM、グルタミン２mM、１ｘＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン及び１０%ウマ血清を補充したＭＥＭ培地（Gibco）中に維持した。典型的には、２×１０5〜４×１０5個の細胞を、製造者の指示に従ってトランスフェクション剤（１：３割合の）としてリポフェクタミン２０００（Life Technologies）を伴う種々のＤＲＩＬ分子（４．５μg）のトランスフェクションの２４時間前に５cm直径のペトリ皿中で抗体なしの培地中に播種した。トランスフェクションの終わりに、細胞を照射するか（４ＧＹ）又は有糸分裂阻害剤：ノコダゾール（２００nM）、ナベルビン（１００nM）又はタキソール（２００nM）により処理した。約１６時間後に、薬物を除去しそして細胞を回復させた。137セシウム源からのγ線により細胞照射を行った。２４時間の回復（recovery）の後に、細胞を集めそしてＦＡＣＳ、ウエスタンブロット分析のため使用し又はクローン原性（生存）及び各処理の効果を決定するために使用した。
【００７５】
図３．１は、未処理ＧＭＡ３２細胞、リポフェクタミン単独でトランスフェクションされた細胞又はリポフェクタミンと共に種々のＤＲＩＬ分子でトランスフェクションされた細胞であって、更に照射又は有糸分裂阻害剤処理はされていない細胞のＦＡＣＳ分析を示す。Ｍ１期（M1 phase）は、細胞死を示すｓｕｂ−Ｇ１段階（sub-G1 stage）における細胞の百分率を表す。有意な細胞死は、二本鎖ＤＲＩＬ３２及びヘアピンＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ分子の存在下にのみ観察され、これに対して、ヘアピンＤＲＩＬ１６−ＰＥＧ及び一本鎖ＤＲＩＬ３２ｓｓは、それぞれ、中間及び並の細胞死を誘発した。最も短いヘアピンＤＲＩＬ１６−ＰＥＧは、コントロール（リポフェクタミンのみによりトランスフェクションされた細胞）に比較して細胞死をトリガーしなかった。
【００７６】
実験は、ＦＡＣＳカリバーフローサイトメーター（FACScalibur flow cytometer）（Becton Dickerson）を使用して行なわれた。細胞を集め、低温ＧＭ緩衝剤（６．５mMグルコース、１３７mMＮａＣｌ、５．４mMＫＣｌ、２mMＮａ2ＨＰＯ4、１mMＫＨＰＯ4、０．５mMＥＤＴＡ）１ml中に懸濁させ、そして冷１００%エタノール３mlの添加後少なくとも２時間４℃で保存した。その段階で、細胞を１ｘＰＢＳで最後に洗浄し、次いでＰＩ溶液（１ｘＰＢＳ緩衝剤中の５０μg/mlヨウ化プロピジウム、２５μg/mlＲＮアーゼＡ）中で室温で３０分間染色した。（１００００の事象をＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウエアで分析し、そして細胞集合体をゲートアウトした（gated out））。ＤＮＡのｓｕｂ−Ｇ１含有率を有する細胞の百分率を得点化した。
【００７７】
同じ条件下に、γ−Ｈ２ＡＸ標識によるセリン１３９でリン酸化されたＨ２ＡＸのＤＮＡ修復フォーカスの免疫検出（核中の明るいドット又はパッチ）を、未処理ＧＭＡ３２細胞、リポフェクタミン単独でトランスフェクションされた細胞又はリポフェクタミンと共に種々のＤＲＩＬ分子でトランスフェクションされた細胞において行なった。細胞膜及び核の対比染色はＦＩＴＣ−ＤｉＯＣ６及びＤＡＰＩにより達成された。ＤＲＩＬ分子の同様な効果が観察された（図３．２）。この実験は、二本鎖ＤＲＩＬ３２及びヘアピンＤＲＩＬ３２−ＰＥＧの両方共、ＤＮＡ損傷があたかも核内で起こったかの如く、同様な細胞応答を有効にトリガーすることができることを示す。これは、ＮＨＥＪ経路を経由してＤＳＢ修復に関与したタンパク質を捕捉するためにこれらのＤＲＩＬ分子を使用することができるという視覚的証拠を与える。
【００７８】
免疫検出のために、細胞を種々のＤＲＩＬ分子によるトランスフェクションの２４時間前に５cm直径のペトリ皿中でカバースリップ上で成育させた。トランスフェクションの１日後に、ＦＩＴＣ−ＤｉＯＣ６（Molecular probe）を３７℃で５分間培地中に加えた（膜を対比染色するために）。３回の洗浄サイクル後に、細胞を4%ＰＦＡで２０分間固定化した。追加の洗浄後に、セリン１３９でリン酸化されたＨ２ＡＸ（γ−Ｈ２ＡＸ）を、1×ＰＢＳ、１%ＢＳＡ中で１／１００に希釈されたウサギ抗γ−Ｈ２ＡＸ抗体（4411-PC、Trevigen）で検出した。細胞を１×ＰＢＳ、０．５%ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３回洗浄し、次いで、1×ＰＢＳ、１%ＢＳＡ中で１／１００に希釈されたヤギ抗ウサギ抗体Ａｌｅｘａ５９４（Molecular Probe）と共に室温で１時間インキュベーションした。細胞をエピフルオレッセンス顕微鏡法により可視化した。
【００７９】
ＤＮＡ損傷シグナリングの証拠を探すために、更なる実験を行なった。タンパク質ｐ５３は、ＤＮＡ損傷シグナリングを媒介すること及びそのリン酸化状態を変えることにより適当な応答（ＤＮＡ修復、アポトーシス等）に協同することにおける周知の主要タンパク質である。特に、セリン１５残基のリン酸化は、フィードバックコントロールとして作用するＭＤＭ２タンパク質との相互作用に関与している。かくして、ｐ５３のセリン１５のリン酸化状態をウエスタンブロットにより評価した。図３．３は、細胞が二本鎖ＤＲＩＬ３２又はヘアピンＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ分子によりトランスフェクションされるとき、ｐ５３セリン１５が高度にリン酸化され、これに対して、より短いヘアピンＤＲＩＬ１６−ＰＥＧは中程度のリン酸化を誘発することを示す。最も短いＤＲＩＬ８−ＰＥＧも単一鎖ＤＲＩＬ３２ｓｓ分子も、ｐ５３タンパク質のセリン１５に対する有意なリン酸化を誘発することができなかった。この実験は、ＧＭＡ３２細胞における両二本鎖ＤＲＩＬ３２及びヘアピンＤＲＩＬ３２−ＰＥＧの存在はＤＮＡ損傷として検出され、そしてたぶんＡＴＭ活性化経路によって、ｐ５３タンパク質リン酸化の如き伝達応答（transducer responses）に対するシグナルを誘発するという追加の証拠を与える。
【００８０】
ウエスタンブロット分析では、細胞をLaemmli緩衝剤中に溶解した。等量の溶解物を１２%ポリアクリルアミドゲル中に溶解した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、これを、５%脱脂乳でブロックした（１時間）後に ５%脱脂乳を含有するＴＢＳＴ緩衝剤（１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０mMＮａＣｌ、０．１%Ｔｗｅｅｎ２０）中に５００倍希釈された抗ｐ５３Ｓｅｒ１５抗体（9284、Cell Signaling）と一夜インキュベーションさせた。次いで、ブロットをＴＢＳＴ中で１／５０００に希釈されたセイヨウワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ第２抗体（ＰＯ４４８、Ｄａｋｏ）とインキュベーションした。タンパク質−抗体複合体を、高められた化学発光（RPN2106、ECL、Amersham）により検出した。
【００８１】
ＧＭＡ３２細胞中のＤＲＩＬ分子の放射線増感及び化学増感の効果は、クローン原性（clonogenicity）（クローン生存）アッセイにより評価された。図３．４は、４Ｇｙ照射に対する放射線増感は、二本鎖ＤＲＩＬ３２又はヘアピンＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ分子でトランスフェクションされたＧＭＡ３２細胞で観察されることを示す。更に、二本鎖ＤＲＩＬ３２又はヘアピンＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ分子でトランスフェクションされたＧＭＡ３２細胞で、それらが有糸分裂阻害剤（２００nMノコダゾール、１００nMナベルビン（ビノレルビン）又は２００nMタキソール（パクリタキセル））により処理されるとき、化学増感も観察された。これらの薬物は、微小管の重合又は脱重合をブロックしそしてＤＮＡ切断を間接に誘発することができる。
【００８２】
クローン原性アッセイでは、細胞を計数した後、逐次希釈を行って種々の量の細胞を５cmペトリ皿に播種した。細胞の数は、１００〜２００（コントロール細胞）〜３０００（トランスフェクションされた及び／又は処理された細胞）の範囲にある。１０日後、細胞（クローンを形成する）を４%パラホルムアルデヒドで固定し（２０分）、次いでメチレンブルーで着色し（１５分）、そして各プレートにおけるクローンの数（三重で（in triplicate））を得点化した。
【００８３】
実施例５：ヌードマウスにおける異種移植されたヒト腫瘍の処理の放射線増感
放射線治療と共同のＤＲＩＬ分子のｉｎ ｖｉｖｏ活性は、放射線耐性細胞系（喉頭がんに由来するＨｅｐ２）の皮下注射によりを又は腫瘍断片（グリオブラストーマに由来するＵ８７細胞系の皮下注射により前もって得られた）によりヒト腫瘍を異種移植されたヌードマウスを使用することにより評価された。
【００８４】
インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）概念の証明を確立するために、研究は、主として放射線耐性ヒト喉頭腫瘍を異種移植されたマウスに関して行なわれた。腫瘍の局在化された照射を行なうために、マウスを適当に保護して137セシウム源からのγ線で照射を行なった。典型的なアッセイ条件は、照射の５時間前に、製造者の指示に従って、ＤＲＩＬ分子１ナノモルとトランスフェクション剤（カチオン性デンドリマー（Superfct,Qiagen）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS、Polyplus transfection）、ポリエチレンイミン（PEI、Polyplus Transfection）との適当な調製物の腫瘍内注入からなる。３０Ｇｙの総計線量が４〜５週間に送達された：ｉ）３×２Ｇｙ／週（２日毎に約１）；ii）５Ｇｙ／週；iii）１５Ｇｙ／２週。腫瘍のサイズを、１週間に２〜３回測定した。照射及びＭＥＭ培地（ＤＲＩＬ希釈緩衝剤）の腫瘍内注入による処理は、ＤＲＩＬなし（ＭＥＭ）の照射処理のコントロールとして使用された。腫瘍の容積を計算した（Ｖ＝（ａ＋ｂ2）／２、ここで、ａ＝長さ、ｂ＝幅）。初期容積に対する時間ｔで測定された容積の比（Ｖｔ／Ｖｉ）は腫瘍進行のインディケーターとして使用された。マウスを１００日まで追跡した。少なくとも４つの独立した系列の６匹の動物を試験した。
【００８５】
結果を図４により示す（パネルＡ：未処理アーム（ｎ＝３８）；パネルＢ：２０μl培養培地（ＭＥＭ）＋３×２Ｇｙ／週照射によるコントロールアーム（ｎ＝３０）；パネルＣ：１ナノモル（２０μg）ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ＋３×２Ｇｙ／週照射によるアーム（ｎ＝３５）。ＭＥＭ又はＤＲＩＬ３２−ＰＥＧは、照射の５時間前の腫瘍内注射により送達された。分割照射線量（２Ｇｙ）が２日毎に１回、１週間に３回与えられた。処理を５週続けて、総計３０Ｇｙの照射とした。ドットは、各マウスの腫瘍容積の時間経過を表す。実線は、最善の多項式フィッティングである。パネルＤは、その腫瘍容積の増加（Ｖｔ／Ｖｉ）が＜５のすべてのマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットを示す。
【００８６】
有意な量のデータは３×２Ｇｙ／週の照射を伴なうＤＲＩＬ３２−ＰＥＧのアームに蓄積された（パネルＣ、ｎ＝３５）が、これは明らかに、コントロールアーム：未処理（パネルＡ、ｎ＝３８）、ＭＥＭ＋３×２Ｇｙ（パネルＢ、ｎ＝３０）に比較して放射線増感を示した。Ｍａｎ及びＷｈｉｔｎｅｙの統計的検定は、ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ＋３×２Ｇｙのアーム対ＭＥＭ＋３×２Ｇｙのアームについてｐ値＝０．０００６７を与えた。初期容積の５倍より小さい腫瘍容積を有する（Ｖｔ／Ｖｉ＜５）マウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットにおいて同じ傾向が観察された（パネルＤ）。
【００８７】
次いで、ｉｎ ｖｉｖｏ活性についてＤＲＩＬ分子の分子特徴及び最適プロトコールを規定するために、異種移植されたヒト喉頭腫瘍を有するマウスで更なる研究を行なった。研究されたコホート（cohort）から得られたデータは生化学的及びインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）研究において観察されたＤＲＩＬ分子の分子特徴と合致している（例えば、実施例２、３及び４参照）。更に、
１）照射の分割、３×２Ｇｙ／週は、ヒト臨床プロトコールを回顧すると、最善の放射線増感を与え；
２）放射線増感は用量依存性である：１ナノモル（２０μg）ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ＞０．３ナノモル（６μg）ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧであり、０．１ナノモル（２μg）ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧにおいて効果なし；
３）放射線増感はＤＲＩＬ３２−ＰＥＧの腫瘍内注入と電離放射線との間の滞留時間（dwell time）に依存する：５時間＞＞１時間
４）ＤＲＩＬ分子は製造者の指示に従ってトランスフェクション剤（superfect、ＤＯＧＳ又はＰＥＩ）と共に使用されなければならない、
ということが示された。
【００８８】
腫瘍断面の組織学的染色及び磁気共鳴像画像化は、放射線治療と関連したＤＲＩＬ分子の組み合わせた処理後に、ネクロシスの存在を示した。
【００８９】
放射線増感は、ヒトグリオブラストーマ腫瘍を異種移植されたマウスでも観察された。グリオブラストーマは、脳腫瘍の最も高いグレードであり、そしてはやい致死的結果及び放射線治療及び化学療法に対する耐性を伴うその格段の攻撃的進行により特徴付けられる。ヒトグリオブラストーマに由来するＵ８７細胞２〜３百万個を、最初にヌードマウスに皮下注射した。次いで移植された腫瘍を取り出し、次いで約８mm3グリオブラストーマ腫瘍の皮下移植により他のヌードマウスに播種するのに使用した。表２は、ヌードマウスにおける異種移植されたヒトグリオブラストーマ腫瘍のパイロットシリーズのデータを示す。腫瘍内注射によりＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ（１ナノモル）及び照射（１×１５Ｇｙ／週又は３×５Ｇｙ／週、次いで１週間の休止、次いで第２処理サイクル、電離放射線の総線量を３０Ｇｙとした）を受け取ったアーム（arm）における５０%のマウスは、処理の開始の２５日後に＜４cm3の腫瘍容積を有していたが、これに対して、コントロールアーム（未処理又は照射されそして生理食塩水溶液（ＰＢＳ）を注射された）におけるマウスの１００%が、４cm3を十分に超えた腫瘍容積を有しており、そして処理の終わる前の動物倫理に関する最近の規制に従ってアッセイの終わる前に殺した。
【００９０】
【表３】
【００９１】
表２：ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ（１ナノモル／腫瘍内注射）によるヌードマウスに異種移植されたヒトグリオブラストーマの放射線増感のアッセイ。照射の２つのプロトコールを使用した：１×１５Ｇｙ／週又は３×５Ｇｙ／週、次いで１週間休止、次いで第２照射サイクル。全照射線量は３０Ｇｙであった。コントロールグループは、未処理又は生理的食塩水溶液（ＰＢＳ）注射を受け取ったグループであった。
【００９２】
要約すると、ヌードマウスに異種移植された２つのヒト放射線耐性腫瘍（喉頭及びグリオブラストーマ）の腫瘍進行の有意な減少は、ＤＲＩＬ分子がこれらの攻撃的放射線耐性腫瘍に対する放射線治療の効果を有効に放射線増感させることができるという証拠を与える。かくして、ＤＮＡ毒餌アプローチ（DNA Bait Approach）の原理の証明はｉｎ ｖｉｖｏで達成された。
【００９３】
実施例６：Ｋ−ＲａｓV12GｘＡｐｃ1638Nトランスジェニックマウスにおいて誘発された消化腫瘍の処理の化学増感
ＤＲＩＬ分子が抗がん剤化学療法を増感する能力を評価するために、内因性マウス腫瘍モデルが選ばれた。このために、Ｋ−ＲａｓV12G及びＡｐｃ1638N突然変異を有するトランスジェニックマウスを使用した。それらは、２つのトランスジェニックマウスを交配させる（breeding）ことにより得られた：１つはマウスビリンプロモーターの制御下のＫ−ＲａｓV12G突然変異体（ｐＶｉｌｌ／Ｋ−ｒａｓV12G）を有し（Janssen et al., 2002）、他方は、１つの対立遺伝子におけるＡｐｃ1638N突然変異を含有する（Fodde et al., 1994）
。ｐＶｉｌｌ／Ｋ−ＲａｓV12G×Ａｐｃ1638N突然変異を有するトランスジェニックマウスは、約５ヶ月齢で消化管に自然発生的腫瘍を発生しそして急に死亡した。
【００９４】
それらは、図５．１パネルＡに示されたプロトコールに従って、化学療法（５ＦＵ＋ＣＰＴ１１）とＤＲＩＬ３２−ＰＥＧの組み合わせ対化学療法のみにより１２週の平均齢で処理された。プロトコールは、３つの処理サイクルを含む。各サイクルは、１週間に３回、続いて１週間の休止での、経口投与によるＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ０．１mgと共に、５ＦＵ０．６mg及びＣＰＴ１１、０．６mgの腹腔内注射からなる。５ＦＵ（５フルオロウラシル、Ｔｅｖａ）を5０mg/mlの濃度で０．９%ＮａＣｌ溶液中に調製した。CPT11/Irinotecan (Campto,Aventis）は、２０mg/mlの濃度で０．９%ＮａＣｌ溶液中に調製した。マウスの健康状態及び生存を死ぬまで監視した。ＤＲＩＬ分子による追加の毒性効果の臨床的適応（clinical indication）は観察されなかった。
【００９５】
結果を図５．１に示す。パネルＡ：１２週の平均齢のＫ−ＲａｓV12G×Ａｐｃ1638N トランスジェニックマウスの３つのグループ／アームのための処理プロトコール：コントロールグループ（未処理）、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１により処理されたグループ、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１及びＤＲＩＬ３２−ＰＥＧにより処理されたグループ。それは３サイクルの処理により行なわれた。各サイクルは、１週間に３回、続いて１週間の休止での、経口投与によるＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ０．１mgと共に、５ＦＵ０．６mg及びＣＰＴ１１、０．６mgの腹腔内注射からなる。各グループに関与したマウスの数を括弧内に示す。終点は生存の時間である：パネルＢ：３つのグループの生存曲線のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロット；パネルＣ：パネルＢに示された如き３つのグループの平均生存時間（median survival time）。
【００９６】
減少したコホートにもかかわらず、化学療法のみ（１７３日）及びコントロールアーム（１７５日）（パネルＢ及びＣ）の生存時間と比較して、化学療法（５ＦＵ＋ＣＰＴ１１）及びＤＲＩＬ３２−ＰＥＧの組み合わせを受け取ったアームにおいて生存時間の有意な改良が観察された（平均生存＝２２６日、ｐ値＝０．２）。統計的有意性を高めるために、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１＋ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ及び５ＦＵ＋ＣＰＴ１１アームのコホートを増加させるための追加のアッセイが現在進行中である。
【００９７】
動物あたりの腫瘍の平均数を評価するために、処理の終わりから２週間後に（１８週の平均齢の）一連のマウスを殺した。肉眼及び組織学検査により腸を検査した（ヘマトキシリン−エオシン−サフランによる標準染色）。
【００９８】
結果を図５．２に示す。各グループにおける動物の数を括弧内に示した。図５．１パネルＡに示されたプロトコールの２週間後に（週１８）すべてのマウスを殺した。コントロールアーム（未処理グループ、ｎ＝１０１）の平均数は３０．８／動物である。
【００９９】
両検査は、化学療法のみを受け取ったアーム（ｎ＝７）に比較して、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１及びＤＲＩＬ３２−ＰＥＧの組み合わせを受け取ったアーム（ｎ＝８）における腫瘍数の有意な減少（＞３０%）を一貫して示した（図５．２）。コントロールアーム（未処理グループ、ｎ＝１０１）の平均数は３０．８／動物であることに留意する価値がある。
【０１００】
フルオレセインによりタグ付けされたＤＲＩＬ分子（ＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ）及び５ＦＵ＋ＣＰＴ１１で処理された動物から調製された腫瘍サンプルを、免疫蛍光染色法を使用して分析した。Ｈ２ＡＸ標識されたフォーカス（H2AX labelled foci）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ所見を回顧して（実施例３．３及び４参照）蛍光ＤＲＩＬ分子で共染色した。図６．３は、１８週齢のＫ−ＲａｓV12G×Ａｐｃ1638N トランスジェニックマウスが化学療法（５ＦＵ＋ＣＰＴ１１）及びＤＲＩＬ３２−ＦＴＩＣにより３日間連続的に処理されそしてパネルＡに示された最後の処理の２時間後に殺す、追加のアッセイを示す。腸を取り出しそしてＰＢＳにより洗浄した。次いで腫瘍組織をサンプリングしそして−８０℃で凍結させた。分析のために、５μmの組織学的サンプルを冷凍装置により凍結された腫瘍組織から作成した。ＰＢＳ中に１／５００に希釈されたポリクローナルウサギ抗γ−Ｈ２ＡＸ抗体（Trevigan）による免疫蛍光、次いでＰＢＳ中に１／２００に希釈されたシアニン３によりタグ付けされたヤギ抗ウサギ抗体（Jackson）による免疫蛍光により、ＤＮＡ修復フォーカスを検出した。サンプルをＤＡＰＩ（Sigma）により対比染色もした。サンプルをエピフルオレッセンス顕微鏡法により可視化した。ＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣの蛍光は腫瘍組織（腺構造間の上皮及び間質）中に不均一に散在しており、そして優先的な核局在化を有していたことが見出された（図６．３、パネルＢ、左）。γ−Ｈ２ＡＸ部位について同様なパターンが見いだされた（図６．３、パネルＢ、右）。殆ど共局在化されたＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ及びγ−Ｈ２ＡＸシグナルが観察された。
【０１０１】
要するに、生存の改良及び動物当りの腫瘍数の減少は、ＤＲＩＬ分子（ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ）によるＫ−ＲａｓV12G及びＡｐｃ1638N突然変異を有するトランスジェニックマウスにおける消化腫瘍（digestive tumors）の処理の化学的増感の証拠を一貫して示す。処理された動物における腫瘍組織の綿密な分析は、ＤＲＩＬ分子がＤＮＡ修復プロセスを妨害するという証拠を与える。
【０１０２】
ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ分子の経口投与は、この研究においていかなるトランスフェクション剤も含まないことが指摘されるべきである。
【０１０３】
結論として、生化学的データ及びｉｎ ｖｉｖｏデータは、ＮＨＥＪ経路によるＤＳＢ修復の妨害、及び直接又は間接ＤＮＡ損傷（電離放射線又は化学療法剤）により引き起こされた修復シグナル伝達経路の妨害によるＤＲＩＬ分子の作用の機構と明らかに合致している。ＮＨＥＪ経路（配列非依存性経路）の性質により、ＤＲＩＬ分子の配列及び長さに対する限定はない（Jackson, 2002; Barnes, 2001, Downs & Jackon, 2004）。ｉｎ ｖｉｖｏ研究は、ＤＲＩＬ分子によるマウスにおける腫瘍の有効な放射線増感及び化学的増感を確証した。すべてのデータは、一緒になって、ＤＲＩＬ分子の分子的特徴により特徴付けられたＤＮＡＢａｉｔアプローチの概念の証明を一貫して与えた。
【０１０４】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１．１】Ｈｅｐ２細胞から種々の量の核内抽出物の存在下に種々の32Ｐ放射線標識されたＤＲＩＬ分子に関して行なわれたバンドシフトアッセイを示す。
【図１．２】Ｈｅｐ２細胞核内抽出物中のタンパク質に関する種々の32Ｐ放射線標識されたＤＲＩＬ分子の遅延したバンド（retarded bands）におけるＫｕタンパク質の存在の同定を示す。
【図２．１】ＤＲＩＬ分子のγ線で行なわれた照射後のＨｅｌａ細胞のクローン原生生存アッセイを示す。
【図２．２】ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ分子によるネオマイシン耐性をコードする遺伝子を有する線状プラスミド断片（２μg）の放射線で高められた変則的組込みの阻害を示す。
【図２．３】照射後に蛍光ＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ分子によりトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞を示す。
【図３．１】更に照射することなく又は有糸分裂阻害剤処理なしの、未処理ＧＭＡ３２細胞、リポフェクタミンのみによりトランスフェクションされた細胞、リポフェクタミンと共に種々のＤＲＩＬ分子でトランスフェクションされた細胞のＦＡＣＳ分析を示す。
【図３．２】未処理ＧＭＡ３２細胞、リポフェクタミン単独でトランスフェクションされた細胞、リポフェクタミンと共に種々のＤＲＩＬ分子でトランスフェクションされた細胞におけるγ−Ｈ２ＡＸ標識によるＤＮＡ修復フォーカスの免疫検出を示す。
【図３．３】更に照射することなく又は有糸分裂阻害剤処理なしの、未処理ＧＭＡ３２細胞、リポフェクタミンのみによりトランスフェクションされた細胞、リポフェクタミンと共に種々のＤＲＩＬ分子でトランスフェクションされた細胞のｐ５３セリン１５残基のリン酸化状態のウエスタンブロット分析を示す。
【図３．４】未処理ＧＭＡ３２細胞及び照射又は種々の有糸分裂阻害剤により処理されたＧＭＡ３２細胞のクローン原性生存を示す。
【図４】処理を伴うか又は処理なしの初期容積に対する時間ｔにおける腫瘍容積の比（Ｖｔ／Ｖｉ）として監視されたマウスにおける異種移植されたヒト喉頭腫瘍の成長を示す。
【図５．１】Ｋ−ＲａｓV12G×Ａｐｃ1638Nトランスジェニックマウスにおいて誘発された消化腫瘍（digestive tumors）の処理の化学増感を示す。
【図５．２】肉眼又は組織学検査による動物当り消化腫瘍の平均数を示す。
【図５．３】パネルＡ：プロトコールスキーム（ｉ．ｐ．：腹腔内注入；ｏ．：経口投与）。パネルＢ：パネルＡに与えられたプロトコールに従って処理された動物の腫瘍組織からの５μm切片に関するＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣの蛍光（左）及び免疫蛍光標識されたγ−Ｈ２ＡＸの蛍光（右）。下部は上部（１０×レンズを使用する、白色ボックス）に示されたゾーンの詳細（６３×レンズを使用して）を示す。蛍光ＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ及び標識されたγ−Ｈ２ＡＸの共局在化は、ＤＡＰＩ対比染色された核上の明るいドットとして現れる。カラー写真は必要に応じて入手可能である。
【図１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、生物学的及び治療用途のためのオリゴヌクレオチド／ＤＮＡ断片の使用の分野にあり、更に詳しくは、ＤＮＡ損傷シグナリング（DNA damage signaling）及び修復経路、特に二本鎖切断（ＤＳＢ）修復の非相同性末端結合（non-homologous end joining）（ＮＨＥＪ）経路を妨害する核酸の分野にある。
【０００２】
本発明は、抗がん性治療を受けた腫瘍の細胞致死性（cell lethality）をトリガー（triger）するためのツールとして有用な核酸に関する。
【０００３】
単独の又は外科手術と組み合わせた放射線治療、化学療法は、ヒトがんに対する必須の治療宝庫である。
【０００４】
電離放射線は、直接又は間接に二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢｓ）を引き起こしそして細胞／組織死（ネクローシス又はアポトーシス）をトリガーする。電離放射線の細胞障害性効果は、ヒトがんの処置において広く使用されている放射線治療の基礎を形成する。放射線治療の有効性は、現在、ある種の腫瘍（例えば、グリオブラストーマ）の放射線耐性及びすぐ近くの正常な組織の照射により引き起こされる副作用（例えば、乳がん及び頚部がんの処置における）により制限される。
【０００５】
過去数年にわたり、腫瘍細胞の放射線感受性又は放射線耐性の基礎にある現象の複雑性を洞察するために、電離放射線応答に関する生物学的機構に多くの研究が集中した。電離放射線に対する応答を精密に調節する種々の経路の理解は、放射線治療と共同して、放射線に対して高度に耐性の腫瘍、例えば、脳腫瘍又は頭部腫瘍及び頚部腫瘍からの回復の可能性を改良することができる新規な薬物及び治療のための分子標的の同定に向けての重要な一歩である。
【０００６】
化学療法剤の使用は、直接又は間接のＤＳＢｓを含むＤＮＡ損傷を引き起こすことがある。主に使用される化学療法剤（化学的細胞障害剤）のファミリーの例は、トポイソメラーゼＩ又はＩＩの阻害剤（カンプトテシン／トポテカン（topotecan）、エピルビシン／エトポシド）、ＤＮＡ架橋剤（シスプラチン／カルボプラチン／オキサリプラチン）、ＤＮＡアルキル化剤（カルムスチン／ダカルバジン）又は抗代謝剤（５−フルオロウラシル／ゲムシタビン（gemcitabine）／カペシタビン（（capecitabine））並びに有糸分裂紡錘体の阻害剤（パクリタキセル／ドセタキセル（docetaxel）／ビノレルビン（vinorelbine）である。生物学的細胞傷害剤（モノクローナル抗体、サイトカイン／キナーゼ阻害剤、免疫治療／ワクチン）の開発における最近の進歩は、腫瘍のサブセットに対するそれらの有効性及び特異性を証明した。しかし、それらは、しばしば化学的細胞傷害剤と組み合わせて使用される。新規な細胞障害性薬物の開発における多くの進歩にもかかわらず、化学療法に対する薬物耐性は、依然としてがんの処置における主要な臨床的関心事である。薬物摂取／流出、代謝分解、標的の突然変異誘発、高められた修復、細胞死（アポトーシス及びネクロシス）のシグナリングに関する薬物耐性の機構の理解は、化学療法の有効性を保証するために必須でありそして特にある処置耐性の腫瘍における治療指数を改良するのに必須である。
【０００７】
化学療法と放射線治療の共同は、ガンの処置において広く使用される。まだ完全には解明されていないけれども、細胞傷害剤の作用の生物学的基礎は、細胞機構、例えば、細胞サイクル又はＤＮＡ損傷に頼っており、これらは、また、がん治療における種々の処置を組み合わせることにより付加的又はより良好な相乗的利益すらもたらす放射線誘発細胞死のための重要なファクターでもある。
【０００８】
最近の１０年間に、この分野で多くの研究が行なわれた。放射線に対する応答におけるシグナル伝達の複雑性は、正確に叙述され始めている。
【０００９】
中でも、電離放射線で標的化されるべき特に興味深い遺伝子は、放射線で誘発された致死性機構、例えば、アポトーシス又はＤＮＡ修復、の調節に関与した遺伝子である。電離放射線により誘発される細胞死は主にＤＳＢｓの修復に依存する。
【００１０】
２つの機構、即ち、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ、配列非依存性経路）及び相同性組換え（ＨＲ、配列依存性経路）（Jackson, 2002により概説された）がこれらの損傷の修復に関与している。これらの２つの主要なＤＳＢ修復経路に関与する標的化遺伝子は、使用されるアプローチ又はがん細胞系統に依存して少ない又は並の放射線感受性をもたらす（Belenkov et al., 2002; Marangoni et al. 2000; Ohnishi et al, 1998）。
【００１１】
Ｋｕ７０及びＫｕ８０、ＤＮＡ−ＰＫｓｃタンパク質は、放射線で誘発された又は化学的に誘発されたＤＮＡ損傷の修復において重要である。損傷が適切な時間に修復されなければ、細胞は死ぬ。ゆえに、それらは、標的細胞及び組織を放射線治療及び化学療法に感受性とするための興味深い分子標的である。哺乳動物細胞において優性であると考えられるＮＨＥＪ経路に関与したこれらのカギとなるタンパク質（Ｋｕ７０／Ｋｕ８０、ＤＮＡ−ＰＫｓｃ、等）を阻害するために多くのアプローチが考えられそして行なわれた：
１）ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ）（即ち、ＤＮＡ−ＰＫｓｃ、ＰＡＲＰ−１、ＡＴＭ、ＡＴＲ）の阻害剤（Boulton et al., 2000; Durant & Karran, 2003; Willmore et al., 2004; Vauger et al., 2004）
２）ネガティブドミナント&ペプチド（ＫＵ８０のＣ末端）（Marangoni et al., 2000; Kim et al., 2002）
３）一本鎖抗体可変性断片（ｓｃＦｖ）（ＤＮＡ−ＰＫｓｃ）（Li et al. 2003）
４）ＲＮＡアプタマー（ＳＥＬＥＸ：ＲＮＡ結合Ｋｕ）（Yoo & Dynan, 1998）
５）アンチセンス（Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＤＮＡ−ＰＫｓｃ）（Li et al., 2003b; Marangoni et al., 2000; Sak et al., 2002）
６）ｓｉＲＮＡ（ＤＮＡ−ＰＫｓｃ）（Peng et al, 2000）。
【００１２】
これらの莫大な努力にもかかわらず、ＤＮＡ修復遺伝子標的化とがん治療の組み合わせは、依然として初期の実験段階にあり、これまでいかなる証明された利益も示していない。上記したアプローチは共通の特徴を共有していることに留意する価値がある：、それらは可能なバイパスを有する複雑なカスケード経路（例えば、ＮＨＥＪ）に関与した単一のエフェクター（タンパク質）を標的化する。
【００１３】
本発明者は、直接又は間接ＤＮＡ損傷抗がん性治療に対する腫瘍感受性は、切断されたＤＮＡ断片の模倣物として作用しそしてＤＮＡ損傷処理により誘発されたＤＳＢ部位として認識される、化学的に修飾された若しくは修飾されていない二本鎖核酸分子を使用することにより高められうることを見出した。この分子は、該修飾による非複製性構造を有することができる。
【００１４】
そこで、本発明の目的は、放射線治療及び化学療法に対する処置耐性腫瘍の応答を高めることができる、下記において「ＤＮＡ修復で誘発された致死性」（DNA repair induced lethality）（短縮して表すとＤＲＩＬ）分子とも名づけられたこのような二本鎖核酸断片を提供することである。
【００１５】
更に詳しくは、本発明は、ＤＮＡのＤＳＢｓを直接又は間接に引き起こすことができる物理的及び化学的作用物質と組み合わせて使用されるべき新規なＤＲＩＬ分子を提供すること、及び該ＤＲＩＬ分子の使用を直接又は間接ＤＮＡ損傷を引き起こす抗がん性治療と組み合わせてがんを処置する方法を提供することを目的とする。
【００１６】
本発明の他の目的は、特に放射線治療及び／又は化学療法に対して高度に耐性の腫瘍に対するがん処置の有効性を高めるための抗腫瘍治療佐剤（anti-tumoral therapeutic adjuvants）を製造するためのＤＲＩＬ分子の使用に関する。
【００１７】
本発明のＤＲＩＬ分子は、ＮＨＥＪ経路（配列非依存性経路）に関与するタンパク質、特に、Ｋｕタンパク質のための基質（substrates）でありそして、少なくとも４〜１００００塩基対（bp）、特に４〜１０００bpの配列非依存性主鎖を含む。
【００１８】
それらは、
−該二本鎖ＤＲＩＬ分子が、薬学的に許容されうる担体と共に使用されるとき、細胞核中に細胞／組織体（cell/tissue body）により摂取されることができるようなもの、
−ＤＲＩＬ分子の自由端（free ends）が二本鎖切断修復及び損傷シグナリングに関与するＤＮＡ結合タンパク質により認識されうるようなもの、
−ＤＲＩＬ分子の自由端が前記酵素により腫瘍細胞ゲノムＤＮＡに組み込まれやすいようなものである。
【００１９】
ＮＨＥＪ経路を介するＤＲＩＬ分子の作用の機構に従えば、それらの長さは、実際的考慮を除いては限定それ自体ではないが、少なくとも４bp、更に好ましくは少なくとも８bpを含まなければならない。
【００２０】
好ましくは、本発明のＤＲＩＬ分子は、８〜５００bp、最も好ましくは、１６〜２００bpを含む。
【００２１】
特に好ましいＤＲＩＬ分子は、１６〜１００bp、更に有利には、２４〜１００bpを含む。
【００２２】
本発明に従うＤＲＩＬ分子は、ネイティブなホスホジエステル主鎖を有するか又は化学的に修飾されたホスホジエステル主鎖又は化学的基若しくは化学的基の混合体を有する他の主鎖を有し、但し、修飾されたオリゴマーは、ＮＨＥＬ経路、特にＫｕタンパク質、及びＤＳＢ損傷シグナリング経路に関与するタンパク質のための基質のままであるものとする。有利には、化学的修飾は、ＤＲＩＬ分子に化学的安定性を与えること及び／又は、もしそれらのゲノム組込みが起こるならば、それらのゲノム組込み時に更なる複製（突然変異誘発効果の潜在的原因）についてそれらを阻止することを意図する。
【００２３】
それらは、ペントフラノシル基の代わりに、２’−Ｏ−アルキルリボース、２’−Ｏ−アルキル−Ｃ４’分岐したリボース（2’-O-alkyl-C4’branched ribose）、シクロブチル又は他の炭素環又はヘキシトールのような糖模倣物を有することもできる。
【００２４】
それらは、線状にされることができ、あるいはヘアピン二本鎖核酸であって、そのループは核酸であることができる、あるいは当業者により知られている他の化学的基、好ましくはリンカー、例えばヘキサエチレングリコール又はテトラデオキシチミジレート（Ｔ４）であることができるヘアピン二本鎖核酸から作られることができる。
【００２５】
本発明のＤＲＩＬ分子は、少なくとも１つの自由ｄｓＤＮＡ端（free dsDNA ends）から構成されることができ、該自由端は平滑である（blunt）ことができ又は５’−／３’−突き出し端部であることができ、そして修飾された核酸主鎖あるいは他の化学的基又は当業者により知られている化学的基の混合体を含むことができる。
【００２６】
好ましい断片は、各ストランドの端部に１つ以上の化学的基を含む。好ましい化学的基は、ホスホロチオエートを含む。あるいは、好ましい断片は、３’−３’ヌクレオチド結合（3'-3'nucleotide linkage）を有する。
【００２７】
本発明の他の修飾された主鎖は、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、モルホリノ核酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ メチレン／エチレンで橋かけされたロックされた核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及び短鎖アルキル、あるいは可変長さのシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子若しくは複素環糖内結合、あるいは当業者により知られているいかなる修飾されたヌクレオチドも含む。
【００２８】
US Patent No.5,677,437は、ヘテロ芳香族オリゴヌクレオシド結合を記載している。窒素リンカー又は窒素を含有する基を使用して、オリゴヌクレオチド模倣物を製造することもできる（U.S.Patent No.5,792,844及びNO.5,783,682）。U.S.Patent No.5,637,684は、ホスホルアミデート及びホスホロチオアミデートオリゴマー化合物を記載している。モルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドも予想される（U.S.Patent No.5,034,506）。他の態様、例えば、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）主鎖においては、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖はポリアミド主鎖で置き換えることができ、その際、塩基は、ポリアミド主鎖のアザ窒素原子に直接又は間接に結合している。他の合成オリゴヌクレオチドは、２’位置に下記のもの：ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ3、ＳＣＨ3、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＮＨ2もしくはＯ（ＣＨ2）nＣＨ3（式中、ｎは１〜約１０である）；Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリール若しくはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ3；ＯＣＦ3；Ｏ−；Ｓ−；又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、若しくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ3；ＳＯ2ＣＨ3；ＯＮＯ2；ＮＯ2；Ｎ3；ＮＨ2；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；又はオリゴヌクレオチドの薬物動態学的及び／又は薬力学的性質を改良するための基及び同様な性質を有する他の置換基、の１つを含む置換された糖部分を有することができる。
【００２９】
ＤＲＩＬ分子は、天然のヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド又は２’−リボヌクレオチドに本質的に基づいており、そして場合により、アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシル以外の１種以上の修飾されたヌクレオチド及び／又はヌクレオ塩基を含む。
【００３０】
通常の塩基以外の適切なヌクレオ塩基は、例えば、Ｃ５−メチルシトシン、ウラシル、プソイドイソシトシン、Ｃ５−プロピニルウラシル、Ｎ７−デアザグアニン、Ｎ７−グリコシル化グアニン、又はα−アノマー、又は他の修飾されたヌクレオ塩基又は塩基性残基である。
【００３１】
照射されるか又は化学療法により処置されるとき組織又は身体中の細胞内にあるであろう化学的に修飾されたＤＲＩＬ分子は、ＤＳＢ部位でゲノムＤＮＡに組み込まれるか、又はＮＨＥＪのような細胞ＤＮＡ修復機構によって、電離放射線により誘発されたＤＳＢ部位として認識されるであろう。次いで、それらは、ＤＳＢ修復タンパク質により結合され、切断された染色体に組み込まれるか又は修復システムを飽和する。
【００３２】
本発明の態様に従えば、該ＤＲＩＬ分子は、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復又は損傷シグナリングプロセスを妨害する少なくとも１つの埋め込まれたエレメント（embedded element）を更に含む。
【００３３】
該非複製性エレメント（１つ又は複数）は、二本鎖断片の内部位置又は端部で組み込まれることができる。それ（それら）は、
ａ）ＤＮＡ複製のためのテンプレートとして使用することができないユニット、例えばポリエチレングリコール鎖、好ましくはヘキサエチレングリコール鎖、又は場合により１個以上のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、窒素により中断されている及び／又は置換されたいかなる炭化水素鎖、又は１個以上のヘテロ原子を含むヘテロ原子基若しくは複素環基；
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ又はエキソヌクレアーゼによって作用されにくい（not amenable）ブロッキングエレメントであるユニット、例えば、いかなる３’−修飾されたヌクレオチド又は当業者により知られている他のヌクレオチド；
ｃ）ヘアピン断片のループにおいて使用されるときの、ネイティブオリゴヌクレオチド、例えば、Ｔｎ、好ましくは、テトラデオキシチミジレート（Ｔ４）、
を含むことができる。
【００３４】
上記ストランドは、化学合成、半生合成又は生合成、いかなる増幅方法、それに続くいかなる抽出及び製造方法並びにいかなる化学的修飾によっても製造される。
【００３５】
培養された細胞及びヌードマウスにおける異種移植された腫瘍及び遺伝子的に修飾されたマウスにおいて行なわれた実験は、該ＤＲＩＬ分子が放射線治療及び／又は化学療法を受けた腫瘍の細胞／組織致死性をトリガーすることを示した。
【００３６】
かくして、本発明は、ＤＮＡ切断処理と共同して使用されるべき佐剤組成物（adjuvant compositions）であって、腫瘍細胞の核において導入されるのに有効な量において薬学的に許容されうる担体と組み合わせて上記した如きＤＲＩＬ分子を含む佐剤組成物にも関する。
【００３７】
本発明は、
上記した如きＤＲＩＬ分子をがん細胞／組織に導入すること、及び
細胞においてＤＮＡ損傷方法によりＤＮＡ切断を誘発すること、
を共に含む抗がん性治療に対する腫瘍感受性を促進する方法にも関する。
【００３８】
インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）研究において使用されるプロトコールに基づいて、本発明は、放射線治療又は化学療法と組み合わせてＤＲＩＬ分子を使用する臨床プロトコールを確立する原理を提供する。いかなるプロトコールの基礎もなす原理は、ＤＮＡ損傷事象が起こるとき、ＤＲＩＬ分子が細胞の核に送達されるべきであるということである。ゆえに、ＤＲＩＬ分子は、放射線治療の数時間前に投与されなければならないが、これに対して、それらは、投与方式及び各成分の薬物動態学に依存して、化学療法剤（１つ又は複数）と共に与えられることができる。
【００３９】
マウスに関するプロトコールは、照射の数時間前、例えば５時間前に、そして１週間に３回、ＤＲＩＬ分子を投与すること含み、その際総照射線量は６週間の処置にわたり３０Ｇｙに相当する。部分に分けた照射の使用は、特に有効である。
【００４０】
有利には、該方法は、ＤＲＩＬ分子による処置を二重化学療法とカップリングさせることを含む。例えば、５−ＦＵ及びＣＰＴ１１を、完全に１週間の休止により間隔をおいて、３日間連続して３回一緒に注入する。あるいは、ＤＲＩＬ分子による処理は放射線治療とカップリングさせる。
【００４１】
それは、特に患者の重量に依存して、当業者によりヒトに容易に適合させられるであろう。
【００４２】
好ましい態様では、ＤＲＩＬ分子は、上記した如き化学的に修飾されたＤＲＩＬ分子及びヒト治療における他の実施である。
【００４３】
他の態様では、ＤＲＩＬ分子は、化学的に修飾されておらずそしてネイティブな核酸断片に対応するが、化学的に修飾された断片の特徴を示し、特に、前記化学的に修飾されたＤＲＩＬ分子に関して規定された塩基対の数及び性質を有する。
【００４４】
更に詳しくは、ＤＮＡストランド切断は、電離放射線（放射線治療）又は化学反応（化学療法）により達成される。
【００４５】
このような方法は、腫瘍に対するＤＮＡ損傷治療と共同の新規な治療佐剤である。
【００４６】
本発明は、腫瘍、特に放射線治療及び／又は化学療法に高度に耐性の腫瘍を処置するための抗腫瘍薬物を製造するための該化学的に修飾されていないＤＲＩＬ分子の使用であって、該薬物は、ＤＮＡ切断処置、特に放射線治療又は化学療法と共同して使用される、使用にも関する。
【００４７】
ｉｎ ｖｉｖｏで、化学的に修飾された又は修飾されていないＤＲＩＬ分子は、適切な許容されうる担体と共に、いかなる適切な経路によっても、例えば、経口又は静脈内、又は腫瘍内投与又は皮下注射又はその他により投与される。
【００４８】
本発明の他の特徴及び利点は、図１〜５及び表１及び２に関して下記の実施例に示される。
【００４９】
ヌードマウスの異種移植されたヒト放射線耐性腫瘍（頭部及び頚部、グリオブラストーマ）並びにトランスジェニックマウスの消化管にＲａｓV12G×Ａｐｃ1638N二重突然変異で誘発された腫瘍における分子及び細胞の研究並びにアッセイを、
ｉ）ＤＲＩＬ分子の生物学的活性を評価するため、ii）抗がん性治療を増感させることにおいて、ＤＲＩＬ分子を使用することによるＤＮＡ Ｂａｉｔアプローチを確証するため、iii） 観察されたＤＲＩＬ効果の基礎をなす分子及び細胞機構を解明するために、行なった。これらの研究の結果を下記の節（実施例）において慨述しそして要約する。
【００５０】
実施例１：ＤＲＩＬ分子のデザイン、合成及び調製
２つのタイプのＤＲＩＬ分子：線状又はヘアピンｄｓＤＮＡ断片をデザインした。ヘアピンＤＲＩＬ分子では、ヘキサエチレングリコールリンカー（ＰＥＧと略記する）又はテトラデオキシチミジレート（Ｔ４と略記する）をループとして使用した。ｄｓＤＮＡステムの端部（１つ又は複数）を、ホスホロチオエート又は３’−３’ヌクレオチド結合の組込みにより３’−エキソヌクレアーゼによる化学的分解に対して保護することができる。一般に、他の化学的修飾を使用することができるが、但し、それらはＫｕ７０／Ｋｕ８０−ＤＮＡ ＰＫｓｃ結合と適合性であるものとする（Ｍartensson & Hammarten,2002）。種々のステム長さ８bp、（ＤＲＩＬ８−ＰＥＧ）、１６bp（ＤＲＩＬ１６−ＰＥＧ）、２４bp（ＤＲＩＬ２４−ＰＥＧ）及び３２bp（ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ）、並びに種々のステム配列を有する種々のＤＲＩＬ分子が使用された。両端が２つのＰＥＧループによりシールされているダンベルｄｓＤＮＡ断片（ＤＲＩＬ３２−２ｘＰＥＧ）もコントロールとしてデザインされた。いくらかのＤＲＩＬ分子は、フルオレセイン（ＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ）、シアニン３（ＤＲＩＬ３２−Ｃｙ３）又はビオチン（ＤＲＩＬ３２−Ｂｔ）でタグ付けされたＴを介して標識された。表１．１及び１．２はこの研究で使用したＤＲＩＬ分子の配列及び化学構造を要約した。
【００５１】
【表１】
【００５２】
表１．１：ＤＲＩＬ分子の配列及び化学的構造。太字はホスホロチオエート主鎖を有するヌクレオチドである。実線はヘキサエチレングリコールリンカー（ＰＥＧ）を記号で表している。ＤＲＩＬ３２−Ｔ４はＰＥＧリンカーの代わりにリンカーとしてＴ４を含有する。ＤＲＩＬ３２−２ｘＰＥＧは、ダンベル（閉じた）分子である。ＤＲＩＬ３２ｓ３３−ＰＥＧはシャッフルド配列（同じ塩基組成であるが異なる順序）及び３’−３’結合を有する。
【００５３】
【表２】
【００５４】
表１．２：６４bpＤＲＩＬ分子の配列及び化学的構造。太字はホスホロチオエート主鎖を有するヌクレオチドである。実線はヘキサエチレングリコールリンカー（ＰＥＧ）を記号で表している。
【００５５】
すべてのＤＲＩＬ分子は、自動化された固相オリゴヌクレオチド合成により製造される（Eurogenetic, Belgium）。それらは、変性逆相ＨＰＬＣにより精製された。変性毛細管ゲル電気泳動及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＬＣ−ＭＳを品質コントロールのために使用した。９０%より多くのオリゴヌクレオチドは完全長である。すべてのサンプルは出荷の前に凍結乾燥された。
【００５６】
受け取ると、すべてのサンプルを二回蒸留水（bi-distilled water）に溶解した。標識されていないＤＲＩＬ分子の濃度は、変性条件下（ＤＲＩＬ分子の熱安定性に依存して６０℃〜９０℃）に分光測法により測定された（Cantor ＆ Warshaw,，1970）。ダンベルｄｓＤＮＡ断片（ＤＲＩＬ３２−２ｘＰＥＧ）は、ＰＥＧループを有しそして３’突き出し及び相補性端部を有する２つの半ヘアピンのアニーリング及びＤＮＡ Ｔ４リガーゼ（Biolabs）によるライゲーションにより調製された。
【００５７】
熱力学的及び速度論的考察に基づいて、ＤＲＩＬ分子の分子度（molecularity）に従って、ＤＲＩＬ分子のサンプルを調製するために下記のプロトコールを使用した：
二分子ＤＲＩＬ分子（ＤＲＩＬ３２、ＤＲＩＬ６４及びＤＲＩＬ６４−ＰＥＧ）について：
二回蒸留水中の各ストランドの１：１ストック溶液（可能な最も高い濃度）の混合物は、各ストランドの完全な変性のために９０℃で５分間加熱されなければならない。室温に円滑に戻す（サンプルを典型的には水浴中に放置した）ことによりアニーリングを行いそして得られる二本鎖分子を−２０℃でアリコートにおいて保存した。
【００５８】
一分子ＤＲＩＬ分子（ヘアピン）について：
二回蒸留水中のヘアピンＤＲＩＬ分子２００μMを含有する溶液は、完全な変性のために９０℃で５分間加熱されなければならない。サンプルを氷水（０℃）中に冷却することによりアニーリングを行なわなければならない。アリコートの保存は−２０℃であった。
【００５９】
実施例２：ＤＲＩＬ分子の生化学的分析
ＤＲＩＬ分子の作用の機構を細かく調べるための第一の工程として、一連のバンドシフトアッセイを、標準プロトコールに従ってＨｅｐ２細胞からの核内タンパク質抽出物（nuclear protein extracts）の存在下に種々の32Ｐ放射線標識されたＤＲＩＬ分子で行なった。典型的には、32Ｐ放射線標識されたＤＲＩＬ分子１０nMを、ＴＢＥ緩衝剤中で３０℃で１０分間種々の濃度の核内タンパク質（0、１０、２０、４０、８０、１６０及び３２０ng/μl）の存在下にインキュベーションした。次いでサンプルを５%アクリルアミドネイティブゲル上にロードした。４℃で２時間９５Vで電気泳動を行なった。ゲルを乾燥しそしてホスホルイメージャー（phosphor imager）（Molecular Dynamics）により走査した。
【００６０】
図１．１は、８bpＤＲＩＬ８−ＰＥＧ（最も短いＤＲＩＬ分子）を除いて、共通のバンド（バンド１）を有するより長いＤＲＩＬ分子では３までの遅延したバンド（retarded bands）が観察された。他のバンドは長いＤＲＩＬ分子の存在において生じた。３２bpの長いＤＲＩＬ分子（ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ、ＤＲＩＬ３２ｐｏ−ＰＥＧ及びＤＲＩＬ３２）を有するＨｅｐ２核内タンパク質抽出物の滴定の遅延したバンドバターンはより複雑である。遅延したバンド１の強度は、タンパク質の濃度が増加するにつれて、増加し次いで減少する。遅延したバンド２及び３の強度は、それがプラトーに達するまでタンパク質濃度の関数として増加する。
【００６１】
マウスモノクローナル抗Ｋｕ７０抗体（Santa Cruz Biotechnology）による結合相互作用及びバンドシフトアッセイを行なうと、遅延したバンド１及び２は、Ｋｕ複合体を含有することが示された（図１．２：線α−Ｋｕに関して、それは、ゲル上にサンプルをロードする前に、結合反応に抗Ｋｕ抗体を加えた（＋）及び加えなかった（−）場合に、示される）。バンドは１、２及び３の番号を付けられておりそして、抗Ｋｕ結合後にシフトした移行を示すバンドの番号に星印を加えた。）
【００６２】
バンド１及び２は、抗Ｋｕ７０抗体添加によりバンド１＊及び２＊にスーパーシフトされた（super-shifted）。バンド１はＤＲＩＬに結合した１つのＫｕ７０／８０複合体を有し、そしてバンド２は、ＤＲＩＬに結合した２つのＫｕ７０／８０複合体を有するようである。精製されたＫｕタンパク質で行なわれたコントロール実験は、この解釈を確証した。バンド３は、抗Ｋｕ７０抗体の添加により消失したが（明らかに、ＤＲＩＬ２４−ＰＥＧ及びＤＲＩＬ３２ｐｏ−ＰＥＧで見られた）、これは、バンド３もＫｕ複合体を含有することを示すことが留意される。
【００６３】
Ｋｕタンパク質の同定は、ＤＲＩＬ分子がＮＨＥＪ装置と相互作用することを明らかに示す。
【００６４】
実施例３：ＤＲＩＬ分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
電離放射線と共同して、婦人の頚部がん（Ｈｅｌａ）及び喉頭がん（Ｈｅｐ２）に由来する２つの放射線耐性のヒトがん細胞系におけるクローン原性生存アッセイ（clonogenic survival assay）により、培養された細胞におけるＤＲＩＬ分子の活性を研究した。
【００６５】
３．１）誘発された細胞致死性
Ｈｅｌａ細胞におけるＤＲＩＬ分子の８時間のトランスフェクション及び137セシウムからの 線（ rays）行なわれた、２時間の間隔をおいた０．５Ｇｙ分割線量による４回の照射（４×０．５Ｇｙ）をすると、トランスフェクションされていない細胞に比べて、クローン原性生存の有意な減少が観察された。結果は、図２．１に示され、この図２．１においては、パネルＡは、ＤＲＩＬ３２及びＤＲＩＬ３２−ＰＥＧの存在下に正規化された生存クローン数の用量依存性を与え、そしてパネルＢは、８３nM（培養培地中の濃度）における種々のＤＲＩＬ分子の存在下に正規化された生存クローン数を与える。
【００６６】
この効果は、用量依存性方式においてＤＲＩＬ分子の化学的性質に依存する。このアッセイでは、ヘアピンＤＲＩＬ分子（ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ、ＤＲＩＬ３２−Ｔ４及びＤＲＩＬ２４−ＰＥＧ）並びに線状二本鎖ＤＲＩＬ分子（ＤＲＩＬ６４−ＰＥＧ及びＤＲＩＬ６４）は、クローン原性生存を有意に減少させた。遊離ｄｓＤＮＡ端部を欠く（両端でヘキサエチレングリコールリンカーでキャップされた）ダンベルＤＲＩＬ分子（ＤＲＩＬ３２−２ｘＰＥＧ）は、いかなる効果も示さないことは留意する価値がある。ループの化学的性質は問題にならない（例えば、ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ対ＤＲＩＬ３２−Ｔ４）。これらの観察は、ＤＲＩＬ分子のいくらかは、電離放射線に細胞を増感させることができることを示す。
【００６７】
細胞培養物は、１０%血清を補充されたＭＥＭ中にあった。スーパーフェクト（Superfect）（Qiagene）は、製造者の指示に従ってトランスフェクション剤として使用された。クローン原性生存は、未処理細胞の数に対するコロニーを形成する処理された細胞の数として評価された。
【００６８】
ＤＲＩＬ分子による外因性ＤＮＡの変則的組込みの抑制
電離放射線は、外因性ＤＮＡのトランスフェクション、放射線で高められた組込みと呼ばれる方法を改良することが知られている。Ｈｅｌａ細胞培養物をこのアッセイのために使用した。細胞を、線状プラスミド（ネオマイシン耐性をコードする遺伝子を有する）２μg及び３つの異なる割合のＤＮＡ／スーパーフェクト（１：２、１：５、１：１０）により８時間の期間トランスフェクションした。トランスフェクション時間の期間中、細胞を種々の照射プロトコール：照射なし、１Ｇｙ及び２Ｇｙの１回の単一照射、並びに２時間毎に０．５Ｇｙの分割線量により送達された２Ｇｙ照射（４×０．５Ｇｙ）、にさらした。プラスミドの組込みは、Ｇ４１８の０．６mg/mlを含有する培地中で増殖するＮｅｏＲ細胞の選択により監視された。プラスミド組込みは、分割照射プロトコールにより有意に高められた。ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ分子２μgがトランスフェクション混合物に加えられると、放射線で高められた組込みは無効にされた（図２．２）。
【００６９】
この実験は、Ｋｕ、ＤＮＡ−ＰＫ及びＡＴＭタンパク質（Nimura et al., 2002）を必要とする外因性ＤＮＡの放射線で高められた変則的組込みは、ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ分子の作用の機構がＮＨＥＪ経路に関与したタンパク質の捕捉により作用するので、予想されるとおりＤＲＩＬ分子により抑制されることを示した。
【００７０】
３．３）ＤＳＢｓ修復の誘発された阻害
核におけるＤＳＢ損傷は、ＤＮＡ切断を標識するγ−Ｈ２ＡＸ抗体を使用することにより免疫検出されうる。Ｈ２ＡＸフォーカス（H2AX foci）の大部分は、照射後に急速に現れ、そしてＤＳＢｓ修復プロセスが進行するにつれて消失した。少数のＨ２ＡＸフォーカスはトランスフェクションされていない細胞において照射の２時間後に検出された。
【００７１】
図２．３は、２Ｇｙ照射の２時間後における蛍光性ＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ分子によりトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞で得られた結果を与える。左のパネル：ＤＲＩＬ３２−ＦＴＩＣの蛍光（明るいドット及びパッチ）及び核におけるγ−Ｈ２ＡＸ抗体の免疫蛍光により検出されたＤＮＡ修復フォーカス；右パネル：γ−Ｈ２ＡＸ抗体の免疫蛍光及びＤＡＰＩ対比染色により検出されたＤＮＡ修復フォーカスを有する核の同じ像。下部左コーナーの矢印は、核におけるＤＲＩＬ３２−ＦＴＩＣ及びγ−Ｈ２ＡＸシグナルの不存在を示す。上部右コーナーにおける矢印は、共局在化したＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ及びγ−Ｈ２ＡＸシグナルを示す。
【００７２】
図２．３に示されたとおり、修復されていないＤＳＢ切断は、ＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣによる二重蛍光標識及びγ−Ｈ２ＡＸ抗体のそれにより示されたとおり、照射（２Ｇｙ）の２時間後にＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ分子によりトランスフェクションされたＨｅｌａ細胞において持続した。同じ培養において、ＤＳＢ修復フォーカスは、ＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣにより有効にトランスフェクションされていない細胞では殆ど検出できなかったが、これはＤＮＡ修復がこれらの細胞においては完全であったことを示唆することは留意する価値がある。
【００７３】
トランスフェクション及び照射プロトコールは上記したそれらと同様であった。免疫検出については、細胞を５cm直径のペトリ皿中で表面カバースリップ上で成育させ、製造者の指示に従ってSuperfect(Qiagene）によりＦＴＩＣで標識されたＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ分子２μgでトランスフェクションした。トランスフェクションの開始から４時間後に、細胞を照射し（２Ｇｙ）、次いで３７℃で培地中に２時間休止させた。３回の洗浄サイクル後に、細胞を２%ＰＦＡで１０分間固定化した。１回の追加の洗浄後に、 −Ｈ２ＡＸの存在は、１×ＰＢＳ、１%ＢＳＡ中に１／１００に希釈されたウサギ抗 −Ｈ２ＡＸ抗体（４４１１−ＰＣ、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）で検出された。細胞を１×ＰＢＳ、０．５%ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３回洗浄し、次いで１×ＰＢＳ、１%ＢＳＡ中に１／１００に希釈されたローダミン−コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体と室温で１時間インキュベーションした。細胞をエピフルオレッセンス顕微鏡法により可視化した。
【００７４】
実施例４：ＧＭＡ３２細胞系におけるＤＲＩＬ分子の効果及び照射又は有糸分裂阻害剤とのそれらの関連
ＤＮＡ切断を許容するＧＭＡ３２チャイニーズハムスター繊維芽細胞を、ピルビン酸ナトリウム１mM、グルタミン２mM、１ｘＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン及び１０%ウマ血清を補充したＭＥＭ培地（Gibco）中に維持した。典型的には、２×１０5〜４×１０5個の細胞を、製造者の指示に従ってトランスフェクション剤（１：３割合の）としてリポフェクタミン２０００（Life Technologies）を伴う種々のＤＲＩＬ分子（４．５μg）のトランスフェクションの２４時間前に５cm直径のペトリ皿中で抗体なしの培地中に播種した。トランスフェクションの終わりに、細胞を照射するか（４ＧＹ）又は有糸分裂阻害剤：ノコダゾール（２００nM）、ナベルビン（１００nM）又はタキソール（２００nM）により処理した。約１６時間後に、薬物を除去しそして細胞を回復させた。137セシウム源からのγ線により細胞照射を行った。２４時間の回復（recovery）の後に、細胞を集めそしてＦＡＣＳ、ウエスタンブロット分析のため使用し又はクローン原性（生存）及び各処理の効果を決定するために使用した。
【００７５】
図３．１は、未処理ＧＭＡ３２細胞、リポフェクタミン単独でトランスフェクションされた細胞又はリポフェクタミンと共に種々のＤＲＩＬ分子でトランスフェクションされた細胞であって、更に照射又は有糸分裂阻害剤処理はされていない細胞のＦＡＣＳ分析を示す。Ｍ１期（M1 phase）は、細胞死を示すｓｕｂ−Ｇ１段階（sub-G1 stage）における細胞の百分率を表す。有意な細胞死は、二本鎖ＤＲＩＬ３２及びヘアピンＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ分子の存在下にのみ観察され、これに対して、ヘアピンＤＲＩＬ１６−ＰＥＧ及び一本鎖ＤＲＩＬ３２ｓｓは、それぞれ、中間及び並の細胞死を誘発した。最も短いヘアピンＤＲＩＬ１６−ＰＥＧは、コントロール（リポフェクタミンのみによりトランスフェクションされた細胞）に比較して細胞死をトリガーしなかった。
【００７６】
実験は、ＦＡＣＳカリバーフローサイトメーター（FACScalibur flow cytometer）（Becton Dickerson）を使用して行なわれた。細胞を集め、低温ＧＭ緩衝剤（６．５mMグルコース、１３７mMＮａＣｌ、５．４mMＫＣｌ、２mMＮａ2ＨＰＯ4、１mMＫＨＰＯ4、０．５mMＥＤＴＡ）１ml中に懸濁させ、そして冷１００%エタノール３mlの添加後少なくとも２時間４℃で保存した。その段階で、細胞を１ｘＰＢＳで最後に洗浄し、次いでＰＩ溶液（１ｘＰＢＳ緩衝剤中の５０μg/mlヨウ化プロピジウム、２５μg/mlＲＮアーゼＡ）中で室温で３０分間染色した。（１００００の事象をＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウエアで分析し、そして細胞集合体をゲートアウトした（gated out））。ＤＮＡのｓｕｂ−Ｇ１含有率を有する細胞の百分率を得点化した。
【００７７】
同じ条件下に、γ−Ｈ２ＡＸ標識によるセリン１３９でリン酸化されたＨ２ＡＸのＤＮＡ修復フォーカスの免疫検出（核中の明るいドット又はパッチ）を、未処理ＧＭＡ３２細胞、リポフェクタミン単独でトランスフェクションされた細胞又はリポフェクタミンと共に種々のＤＲＩＬ分子でトランスフェクションされた細胞において行なった。細胞膜及び核の対比染色はＦＩＴＣ−ＤｉＯＣ６及びＤＡＰＩにより達成された。ＤＲＩＬ分子の同様な効果が観察された（図３．２）。この実験は、二本鎖ＤＲＩＬ３２及びヘアピンＤＲＩＬ３２−ＰＥＧの両方共、ＤＮＡ損傷があたかも核内で起こったかの如く、同様な細胞応答を有効にトリガーすることができることを示す。これは、ＮＨＥＪ経路を経由してＤＳＢ修復に関与したタンパク質を捕捉するためにこれらのＤＲＩＬ分子を使用することができるという視覚的証拠を与える。
【００７８】
免疫検出のために、細胞を種々のＤＲＩＬ分子によるトランスフェクションの２４時間前に５cm直径のペトリ皿中でカバースリップ上で成育させた。トランスフェクションの１日後に、ＦＩＴＣ−ＤｉＯＣ６（Molecular probe）を３７℃で５分間培地中に加えた（膜を対比染色するために）。３回の洗浄サイクル後に、細胞を4%ＰＦＡで２０分間固定化した。追加の洗浄後に、セリン１３９でリン酸化されたＨ２ＡＸ（γ−Ｈ２ＡＸ）を、1×ＰＢＳ、１%ＢＳＡ中で１／１００に希釈されたウサギ抗γ−Ｈ２ＡＸ抗体（4411-PC、Trevigen）で検出した。細胞を１×ＰＢＳ、０．５%ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３回洗浄し、次いで、1×ＰＢＳ、１%ＢＳＡ中で１／１００に希釈されたヤギ抗ウサギ抗体Ａｌｅｘａ５９４（Molecular Probe）と共に室温で１時間インキュベーションした。細胞をエピフルオレッセンス顕微鏡法により可視化した。
【００７９】
ＤＮＡ損傷シグナリングの証拠を探すために、更なる実験を行なった。タンパク質ｐ５３は、ＤＮＡ損傷シグナリングを媒介すること及びそのリン酸化状態を変えることにより適当な応答（ＤＮＡ修復、アポトーシス等）に協同することにおける周知の主要タンパク質である。特に、セリン１５残基のリン酸化は、フィードバックコントロールとして作用するＭＤＭ２タンパク質との相互作用に関与している。かくして、ｐ５３のセリン１５のリン酸化状態をウエスタンブロットにより評価した。図３．３は、細胞が二本鎖ＤＲＩＬ３２又はヘアピンＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ分子によりトランスフェクションされるとき、ｐ５３セリン１５が高度にリン酸化され、これに対して、より短いヘアピンＤＲＩＬ１６−ＰＥＧは中程度のリン酸化を誘発することを示す。最も短いＤＲＩＬ８−ＰＥＧも単一鎖ＤＲＩＬ３２ｓｓ分子も、ｐ５３タンパク質のセリン１５に対する有意なリン酸化を誘発することができなかった。この実験は、ＧＭＡ３２細胞における両二本鎖ＤＲＩＬ３２及びヘアピンＤＲＩＬ３２−ＰＥＧの存在はＤＮＡ損傷として検出され、そしてたぶんＡＴＭ活性化経路によって、ｐ５３タンパク質リン酸化の如き伝達応答（transducer responses）に対するシグナルを誘発するという追加の証拠を与える。
【００８０】
ウエスタンブロット分析では、細胞をLaemmli緩衝剤中に溶解した。等量の溶解物を１２%ポリアクリルアミドゲル中に溶解した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、これを、５%脱脂乳でブロックした（１時間）後に ５%脱脂乳を含有するＴＢＳＴ緩衝剤（１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０mMＮａＣｌ、０．１%Ｔｗｅｅｎ２０）中に５００倍希釈された抗ｐ５３Ｓｅｒ１５抗体（9284、Cell Signaling）と一夜インキュベーションさせた。次いで、ブロットをＴＢＳＴ中で１／５０００に希釈されたセイヨウワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ第２抗体（ＰＯ４４８、Ｄａｋｏ）とインキュベーションした。タンパク質−抗体複合体を、高められた化学発光（RPN2106、ECL、Amersham）により検出した。
【００８１】
ＧＭＡ３２細胞中のＤＲＩＬ分子の放射線増感及び化学増感の効果は、クローン原性（clonogenicity）（クローン生存）アッセイにより評価された。図３．４は、４Ｇｙ照射に対する放射線増感は、二本鎖ＤＲＩＬ３２又はヘアピンＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ分子でトランスフェクションされたＧＭＡ３２細胞で観察されることを示す。更に、二本鎖ＤＲＩＬ３２又はヘアピンＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ分子でトランスフェクションされたＧＭＡ３２細胞で、それらが有糸分裂阻害剤（２００nMノコダゾール、１００nMナベルビン（ビノレルビン）又は２００nMタキソール（パクリタキセル））により処理されるとき、化学増感も観察された。これらの薬物は、微小管の重合又は脱重合をブロックしそしてＤＮＡ切断を間接に誘発することができる。
【００８２】
クローン原性アッセイでは、細胞を計数した後、逐次希釈を行って種々の量の細胞を５cmペトリ皿に播種した。細胞の数は、１００〜２００（コントロール細胞）〜３０００（トランスフェクションされた及び／又は処理された細胞）の範囲にある。１０日後、細胞（クローンを形成する）を４%パラホルムアルデヒドで固定し（２０分）、次いでメチレンブルーで着色し（１５分）、そして各プレートにおけるクローンの数（三重で（in triplicate））を得点化した。
【００８３】
実施例５：ヌードマウスにおける異種移植されたヒト腫瘍の処理の放射線増感
放射線治療と共同のＤＲＩＬ分子のｉｎ ｖｉｖｏ活性は、放射線耐性細胞系（喉頭がんに由来するＨｅｐ２）の皮下注射によりを又は腫瘍断片（グリオブラストーマに由来するＵ８７細胞系の皮下注射により前もって得られた）によりヒト腫瘍を異種移植されたヌードマウスを使用することにより評価された。
【００８４】
インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）概念の証明を確立するために、研究は、主として放射線耐性ヒト喉頭腫瘍を異種移植されたマウスに関して行なわれた。腫瘍の局在化された照射を行なうために、マウスを適当に保護して137セシウム源からのγ線で照射を行なった。典型的なアッセイ条件は、照射の５時間前に、製造者の指示に従って、ＤＲＩＬ分子１ナノモルとトランスフェクション剤（カチオン性デンドリマー（Superfct,Qiagen）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS、Polyplus transfection）、ポリエチレンイミン（PEI、Polyplus Transfection）との適当な調製物の腫瘍内注入からなる。３０Ｇｙの総計線量が４〜５週間に送達された：ｉ）３×２Ｇｙ／週（２日毎に約１）；ii）５Ｇｙ／週；iii）１５Ｇｙ／２週。腫瘍のサイズを、１週間に２〜３回測定した。照射及びＭＥＭ培地（ＤＲＩＬ希釈緩衝剤）の腫瘍内注入による処理は、ＤＲＩＬなし（ＭＥＭ）の照射処理のコントロールとして使用された。腫瘍の容積を計算した（Ｖ＝（ａ＋ｂ2）／２、ここで、ａ＝長さ、ｂ＝幅）。初期容積に対する時間ｔで測定された容積の比（Ｖｔ／Ｖｉ）は腫瘍進行のインディケーターとして使用された。マウスを１００日まで追跡した。少なくとも４つの独立した系列の６匹の動物を試験した。
【００８５】
結果を図４により示す（パネルＡ：未処理アーム（ｎ＝３８）；パネルＢ：２０μl培養培地（ＭＥＭ）＋３×２Ｇｙ／週照射によるコントロールアーム（ｎ＝３０）；パネルＣ：１ナノモル（２０μg）ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ＋３×２Ｇｙ／週照射によるアーム（ｎ＝３５）。ＭＥＭ又はＤＲＩＬ３２−ＰＥＧは、照射の５時間前の腫瘍内注射により送達された。分割照射線量（２Ｇｙ）が２日毎に１回、１週間に３回与えられた。処理を５週続けて、総計３０Ｇｙの照射とした。ドットは、各マウスの腫瘍容積の時間経過を表す。実線は、最善の多項式フィッティングである。パネルＤは、その腫瘍容積の増加（Ｖｔ／Ｖｉ）が＜５のすべてのマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットを示す。
【００８６】
有意な量のデータは３×２Ｇｙ／週の照射を伴なうＤＲＩＬ３２−ＰＥＧのアームに蓄積された（パネルＣ、ｎ＝３５）が、これは明らかに、コントロールアーム：未処理（パネルＡ、ｎ＝３８）、ＭＥＭ＋３×２Ｇｙ（パネルＢ、ｎ＝３０）に比較して放射線増感を示した。Ｍａｎ及びＷｈｉｔｎｅｙの統計的検定は、ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ＋３×２Ｇｙのアーム対ＭＥＭ＋３×２Ｇｙのアームについてｐ値＝０．０００６７を与えた。初期容積の５倍より小さい腫瘍容積を有する（Ｖｔ／Ｖｉ＜５）マウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロットにおいて同じ傾向が観察された（パネルＤ）。
【００８７】
次いで、ｉｎ ｖｉｖｏ活性についてＤＲＩＬ分子の分子特徴及び最適プロトコールを規定するために、異種移植されたヒト喉頭腫瘍を有するマウスで更なる研究を行なった。研究されたコホート（cohort）から得られたデータは生化学的及びインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）研究において観察されたＤＲＩＬ分子の分子特徴と合致している（例えば、実施例２、３及び４参照）。更に、
１）照射の分割、３×２Ｇｙ／週は、ヒト臨床プロトコールを回顧すると、最善の放射線増感を与え；
２）放射線増感は用量依存性である：１ナノモル（２０μg）ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ＞０．３ナノモル（６μg）ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧであり、０．１ナノモル（２μg）ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧにおいて効果なし；
３）放射線増感はＤＲＩＬ３２−ＰＥＧの腫瘍内注入と電離放射線との間の滞留時間（dwell time）に依存する：５時間＞＞１時間
４）ＤＲＩＬ分子は製造者の指示に従ってトランスフェクション剤（superfect、ＤＯＧＳ又はＰＥＩ）と共に使用されなければならない、
ということが示された。
【００８８】
腫瘍断面の組織学的染色及び磁気共鳴像画像化は、放射線治療と関連したＤＲＩＬ分子の組み合わせた処理後に、ネクロシスの存在を示した。
【００８９】
放射線増感は、ヒトグリオブラストーマ腫瘍を異種移植されたマウスでも観察された。グリオブラストーマは、脳腫瘍の最も高いグレードであり、そしてはやい致死的結果及び放射線治療及び化学療法に対する耐性を伴うその格段の攻撃的進行により特徴付けられる。ヒトグリオブラストーマに由来するＵ８７細胞２〜３百万個を、最初にヌードマウスに皮下注射した。次いで移植された腫瘍を取り出し、次いで約８mm3グリオブラストーマ腫瘍の皮下移植により他のヌードマウスに播種するのに使用した。表２は、ヌードマウスにおける異種移植されたヒトグリオブラストーマ腫瘍のパイロットシリーズのデータを示す。腫瘍内注射によりＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ（１ナノモル）及び照射（１×１５Ｇｙ／週又は３×５Ｇｙ／週、次いで１週間の休止、次いで第２処理サイクル、電離放射線の総線量を３０Ｇｙとした）を受け取ったアーム（arm）における５０%のマウスは、処理の開始の２５日後に＜４cm3の腫瘍容積を有していたが、これに対して、コントロールアーム（未処理又は照射されそして生理食塩水溶液（ＰＢＳ）を注射された）におけるマウスの１００%が、４cm3を十分に超えた腫瘍容積を有しており、そして処理の終わる前の動物倫理に関する最近の規制に従ってアッセイの終わる前に殺した。
【００９０】
【表３】
【００９１】
表２：ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ（１ナノモル／腫瘍内注射）によるヌードマウスに異種移植されたヒトグリオブラストーマの放射線増感のアッセイ。照射の２つのプロトコールを使用した：１×１５Ｇｙ／週又は３×５Ｇｙ／週、次いで１週間休止、次いで第２照射サイクル。全照射線量は３０Ｇｙであった。コントロールグループは、未処理又は生理的食塩水溶液（ＰＢＳ）注射を受け取ったグループであった。
【００９２】
要約すると、ヌードマウスに異種移植された２つのヒト放射線耐性腫瘍（喉頭及びグリオブラストーマ）の腫瘍進行の有意な減少は、ＤＲＩＬ分子がこれらの攻撃的放射線耐性腫瘍に対する放射線治療の効果を有効に放射線増感させることができるという証拠を与える。かくして、ＤＮＡ毒餌アプローチ（DNA Bait Approach）の原理の証明はｉｎ ｖｉｖｏで達成された。
【００９３】
実施例６：Ｋ−ＲａｓV12GｘＡｐｃ1638Nトランスジェニックマウスにおいて誘発された消化腫瘍の処理の化学増感
ＤＲＩＬ分子が抗がん剤化学療法を増感する能力を評価するために、内因性マウス腫瘍モデルが選ばれた。このために、Ｋ−ＲａｓV12G及びＡｐｃ1638N突然変異を有するトランスジェニックマウスを使用した。それらは、２つのトランスジェニックマウスを交配させる（breeding）ことにより得られた：１つはマウスビリンプロモーターの制御下のＫ−ＲａｓV12G突然変異体（ｐＶｉｌｌ／Ｋ−ｒａｓV12G）を有し（Janssen et al., 2002）、他方は、１つの対立遺伝子におけるＡｐｃ1638N突然変異を含有する（Fodde et al., 1994）
。ｐＶｉｌｌ／Ｋ−ＲａｓV12G×Ａｐｃ1638N突然変異を有するトランスジェニックマウスは、約５ヶ月齢で消化管に自然発生的腫瘍を発生しそして急に死亡した。
【００９４】
それらは、図５．１パネルＡに示されたプロトコールに従って、化学療法（５ＦＵ＋ＣＰＴ１１）とＤＲＩＬ３２−ＰＥＧの組み合わせ対化学療法のみにより１２週の平均齢で処理された。プロトコールは、３つの処理サイクルを含む。各サイクルは、１週間に３回、続いて１週間の休止での、経口投与によるＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ０．１mgと共に、５ＦＵ０．６mg及びＣＰＴ１１、０．６mgの腹腔内注射からなる。５ＦＵ（５フルオロウラシル、Ｔｅｖａ）を5０mg/mlの濃度で０．９%ＮａＣｌ溶液中に調製した。CPT11/Irinotecan (Campto,Aventis）は、２０mg/mlの濃度で０．９%ＮａＣｌ溶液中に調製した。マウスの健康状態及び生存を死ぬまで監視した。ＤＲＩＬ分子による追加の毒性効果の臨床的適応（clinical indication）は観察されなかった。
【００９５】
結果を図５．１に示す。パネルＡ：１２週の平均齢のＫ−ＲａｓV12G×Ａｐｃ1638N トランスジェニックマウスの３つのグループ／アームのための処理プロトコール：コントロールグループ（未処理）、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１により処理されたグループ、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１及びＤＲＩＬ３２−ＰＥＧにより処理されたグループ。それは３サイクルの処理により行なわれた。各サイクルは、１週間に３回、続いて１週間の休止での、経口投与によるＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ０．１mgと共に、５ＦＵ０．６mg及びＣＰＴ１１、０．６mgの腹腔内注射からなる。各グループに関与したマウスの数を括弧内に示す。終点は生存の時間である：パネルＢ：３つのグループの生存曲線のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒプロット；パネルＣ：パネルＢに示された如き３つのグループの平均生存時間（median survival time）。
【００９６】
減少したコホートにもかかわらず、化学療法のみ（１７３日）及びコントロールアーム（１７５日）（パネルＢ及びＣ）の生存時間と比較して、化学療法（５ＦＵ＋ＣＰＴ１１）及びＤＲＩＬ３２−ＰＥＧの組み合わせを受け取ったアームにおいて生存時間の有意な改良が観察された（平均生存＝２２６日、ｐ値＝０．２）。統計的有意性を高めるために、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１＋ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ及び５ＦＵ＋ＣＰＴ１１アームのコホートを増加させるための追加のアッセイが現在進行中である。
【００９７】
動物あたりの腫瘍の平均数を評価するために、処理の終わりから２週間後に（１８週の平均齢の）一連のマウスを殺した。肉眼及び組織学検査により腸を検査した（ヘマトキシリン−エオシン−サフランによる標準染色）。
【００９８】
結果を図５．２に示す。各グループにおける動物の数を括弧内に示した。図５．１パネルＡに示されたプロトコールの２週間後に（週１８）すべてのマウスを殺した。コントロールアーム（未処理グループ、ｎ＝１０１）の平均数は３０．８／動物である。
【００９９】
両検査は、化学療法のみを受け取ったアーム（ｎ＝７）に比較して、５ＦＵ＋ＣＰＴ１１及びＤＲＩＬ３２−ＰＥＧの組み合わせを受け取ったアーム（ｎ＝８）における腫瘍数の有意な減少（＞３０%）を一貫して示した（図５．２）。コントロールアーム（未処理グループ、ｎ＝１０１）の平均数は３０．８／動物であることに留意する価値がある。
【０１００】
フルオレセインによりタグ付けされたＤＲＩＬ分子（ＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ）及び５ＦＵ＋ＣＰＴ１１で処理された動物から調製された腫瘍サンプルを、免疫蛍光染色法を使用して分析した。Ｈ２ＡＸ標識されたフォーカス（H2AX labelled foci）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ所見を回顧して（実施例３．３及び４参照）蛍光ＤＲＩＬ分子で共染色した。図６．３は、１８週齢のＫ−ＲａｓV12G×Ａｐｃ1638N トランスジェニックマウスが化学療法（５ＦＵ＋ＣＰＴ１１）及びＤＲＩＬ３２−ＦＴＩＣにより３日間連続的に処理されそしてパネルＡに示された最後の処理の２時間後に殺す、追加のアッセイを示す。腸を取り出しそしてＰＢＳにより洗浄した。次いで腫瘍組織をサンプリングしそして−８０℃で凍結させた。分析のために、５μmの組織学的サンプルを冷凍装置により凍結された腫瘍組織から作成した。ＰＢＳ中に１／５００に希釈されたポリクローナルウサギ抗γ−Ｈ２ＡＸ抗体（Trevigan）による免疫蛍光、次いでＰＢＳ中に１／２００に希釈されたシアニン３によりタグ付けされたヤギ抗ウサギ抗体（Jackson）による免疫蛍光により、ＤＮＡ修復フォーカスを検出した。サンプルをＤＡＰＩ（Sigma）により対比染色もした。サンプルをエピフルオレッセンス顕微鏡法により可視化した。ＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣの蛍光は腫瘍組織（腺構造間の上皮及び間質）中に不均一に散在しており、そして優先的な核局在化を有していたことが見出された（図６．３、パネルＢ、左）。γ−Ｈ２ＡＸ部位について同様なパターンが見いだされた（図６．３、パネルＢ、右）。殆ど共局在化されたＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ及びγ−Ｈ２ＡＸシグナルが観察された。
【０１０１】
要するに、生存の改良及び動物当りの腫瘍数の減少は、ＤＲＩＬ分子（ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ）によるＫ−ＲａｓV12G及びＡｐｃ1638N突然変異を有するトランスジェニックマウスにおける消化腫瘍（digestive tumors）の処理の化学的増感の証拠を一貫して示す。処理された動物における腫瘍組織の綿密な分析は、ＤＲＩＬ分子がＤＮＡ修復プロセスを妨害するという証拠を与える。
【０１０２】
ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ分子の経口投与は、この研究においていかなるトランスフェクション剤も含まないことが指摘されるべきである。
【０１０３】
結論として、生化学的データ及びｉｎ ｖｉｖｏデータは、ＮＨＥＪ経路によるＤＳＢ修復の妨害、及び直接又は間接ＤＮＡ損傷（電離放射線又は化学療法剤）により引き起こされた修復シグナル伝達経路の妨害によるＤＲＩＬ分子の作用の機構と明らかに合致している。ＮＨＥＪ経路（配列非依存性経路）の性質により、ＤＲＩＬ分子の配列及び長さに対する限定はない（Jackson, 2002; Barnes, 2001, Downs & Jackon, 2004）。ｉｎ ｖｉｖｏ研究は、ＤＲＩＬ分子によるマウスにおける腫瘍の有効な放射線増感及び化学的増感を確証した。すべてのデータは、一緒になって、ＤＲＩＬ分子の分子的特徴により特徴付けられたＤＮＡＢａｉｔアプローチの概念の証明を一貫して与えた。
【０１０４】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１．１】Ｈｅｐ２細胞から種々の量の核内抽出物の存在下に種々の32Ｐ放射線標識されたＤＲＩＬ分子に関して行なわれたバンドシフトアッセイを示す。
【図１．２】Ｈｅｐ２細胞核内抽出物中のタンパク質に関する種々の32Ｐ放射線標識されたＤＲＩＬ分子の遅延したバンド（retarded bands）におけるＫｕタンパク質の存在の同定を示す。
【図２．１】ＤＲＩＬ分子のγ線で行なわれた照射後のＨｅｌａ細胞のクローン原生生存アッセイを示す。
【図２．２】ＤＲＩＬ３２−ＰＥＧ分子によるネオマイシン耐性をコードする遺伝子を有する線状プラスミド断片（２μg）の放射線で高められた変則的組込みの阻害を示す。
【図２．３】照射後に蛍光ＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ分子によりトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞を示す。
【図３．１】更に照射することなく又は有糸分裂阻害剤処理なしの、未処理ＧＭＡ３２細胞、リポフェクタミンのみによりトランスフェクションされた細胞、リポフェクタミンと共に種々のＤＲＩＬ分子でトランスフェクションされた細胞のＦＡＣＳ分析を示す。
【図３．２】未処理ＧＭＡ３２細胞、リポフェクタミン単独でトランスフェクションされた細胞、リポフェクタミンと共に種々のＤＲＩＬ分子でトランスフェクションされた細胞におけるγ−Ｈ２ＡＸ標識によるＤＮＡ修復フォーカスの免疫検出を示す。
【図３．３】更に照射することなく又は有糸分裂阻害剤処理なしの、未処理ＧＭＡ３２細胞、リポフェクタミンのみによりトランスフェクションされた細胞、リポフェクタミンと共に種々のＤＲＩＬ分子でトランスフェクションされた細胞のｐ５３セリン１５残基のリン酸化状態のウエスタンブロット分析を示す。
【図３．４】未処理ＧＭＡ３２細胞及び照射又は種々の有糸分裂阻害剤により処理されたＧＭＡ３２細胞のクローン原性生存を示す。
【図４】処理を伴うか又は処理なしの初期容積に対する時間ｔにおける腫瘍容積の比（Ｖｔ／Ｖｉ）として監視されたマウスにおける異種移植されたヒト喉頭腫瘍の成長を示す。
【図５．１】Ｋ−ＲａｓV12G×Ａｐｃ1638Nトランスジェニックマウスにおいて誘発された消化腫瘍（digestive tumors）の処理の化学増感を示す。
【図５．２】肉眼又は組織学検査による動物当り消化腫瘍の平均数を示す。
【図５．３】パネルＡ：プロトコールスキーム（ｉ．ｐ．：腹腔内注入；ｏ．：経口投与）。パネルＢ：パネルＡに与えられたプロトコールに従って処理された動物の腫瘍組織からの５μm切片に関するＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣの蛍光（左）及び免疫蛍光標識されたγ−Ｈ２ＡＸの蛍光（右）。下部は上部（１０×レンズを使用する、白色ボックス）に示されたゾーンの詳細（６３×レンズを使用して）を示す。蛍光ＤＲＩＬ３２−ＦＩＴＣ及び標識されたγ−Ｈ２ＡＸの共局在化は、ＤＡＰＩ対比染色された核上の明るいドットとして現れる。カラー写真は必要に応じて入手可能である。
【図１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＨＥＪ経路（配列非依存性経路）特に、Ｋｕタンパク質及びＤＳＢ損傷シグナリング経路に関与するタンパク質のための基質である、少なくとも４〜１００００塩基対（bp）、特に４〜１０００bpの配列非依存性主鎖を含む、ＤＮＡ修復で誘発される致死性分子（ＤＲＩＬ分子）。
【請求項２】
ネイティブなホスホジエステル主鎖、又は化学的に修飾されたホスホジエステル主鎖、又は１個以上の化学的基を有する他の主鎖を有する請求項１に記載の分子であり、但し、修飾された分子は、配列非依存性ＮＨＥＬ経路に関与するタンパク質のための基質のままである、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
ペントフラノシル基の代わりに、糖模倣物、例えば、２’−Ｏ−アルキルリボース、２’−Ｏ−アルキル−Ｃ４’分岐したリボース、シクロブチル又は他の炭素環又はヘキシトールを更に含む、請求項１又は２に記載の分子。
【請求項４】
線状主鎖を有するか、あるいは、核酸又は化学的基、例えば、ヘキサエチレングリコール若しくはテトラデオキシチミジレート基を含むループを有するヘアピン二本鎖核酸から作られた、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分子。
【請求項５】
少なくとも１つの自由端を有する、請求項１〜４のずれか１項に記載の分子。
【請求項６】
各ストランドの端部又は少なくとも３’端部ストランドに１個以上の化学的基を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分子。
【請求項７】
各ストランドの端部又は少なくとも３’端部ストランドに１個以上のホスホロチオエートを含む、請求項６に記載の分子。
【請求項８】
該主鎖が、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、モルホリノ核酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ メチレン／エチレン橋かけされたロックされた核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及び短鎖アルキル、あるいは可変長さのシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子若しくは複素環糖内結合を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の分子。
【請求項９】
該断片が、天然のヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド又は２’−リボヌクレオチドに基づいており、そして場合により、アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシル以外の１種以上の修飾されたヌクレオチド及び／又はヌクレオ塩基を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１０】
該ヌクレオ塩基が、Ｃ５−メチルシトシン、ウラシル、プソイドイソシトシン、Ｃ５−プロピニルウラシル、Ｎ７−デアザグアニン、Ｎ７−グリコシル化グアニン、又はα−アノマー、又は他の修飾されたヌクレオ塩基又は塩基性残基を含む群において選ばれる、請求項９に記載の分子。
【請求項１１】
ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復又は損傷シグナリングプロセスを妨害する少なくとも１つの埋め込まれたエレメントを更に含み、該エレメントは、二本鎖分子の中心又は端部で組み込まれている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１２】
ａ）ポリエチレングリコール鎖、好ましくはヘキサエチレングリコール鎖、又は場合により１個以上のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、窒素により中断された及び／又は置換されたいかなる炭化水素鎖、又は１個以上のヘテロ原子を含むヘテロ原子基若しくは複素環基；
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ又はエキソヌクレアーゼによって作用されにくいブロッキングエレメントであるユニット、例えば、いかなる３’−修飾されたヌクレオチド；
ｃ）ヘアピン断片のループにおいて使用されるときの、ネイティブオリゴヌクレオチド、例えば、Ｔｎ、好ましくは、テトラデオキシチミジレート（Ｔ４）、
を含む、請求項１１に記載の分子。
【請求項１３】
ＤＮＡ切断処理、特に放射線治療又は化学療法と共同して使用されるべき佐剤組成物であって、腫瘍細胞の核に導入されるのに有効な量において、薬学的に許容されうる担体と組み合わせて、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の少なくとも１種のＤＮＡ修復で誘発される致死性分子を含む佐剤組成物。
【請求項１４】
該ＤＮＡ修復で誘発される致死性分子を、いかなる許容されうる担体と共に、いかなる適切な経路によっても、例えば、経口又は静脈内又は腫瘍内投与又はあるいは皮下注射により投与する、請求項１３に記載の佐剤組成物。
【請求項１５】
腫瘍、特に放射線治療及び／又は化学療法に高度に耐性の腫瘍を処置するための抗腫瘍薬物を製造するためのネイティブ二本鎖核酸断片の、ＤＮＡ切断処置、特に放射線治療又は化学療法と共同した使用。
【請求項１】
ＮＨＥＪ経路（配列非依存性経路）特に、Ｋｕタンパク質及びＤＳＢ損傷シグナリング経路に関与するタンパク質のための基質である、少なくとも４〜１００００塩基対（bp）、特に４〜１０００bpの配列非依存性主鎖を含む、ＤＮＡ修復で誘発される致死性分子（ＤＲＩＬ分子）。
【請求項２】
ネイティブなホスホジエステル主鎖、又は化学的に修飾されたホスホジエステル主鎖、又は１個以上の化学的基を有する他の主鎖を有する請求項１に記載の分子であり、但し、修飾された分子は、配列非依存性ＮＨＥＬ経路に関与するタンパク質のための基質のままである、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
ペントフラノシル基の代わりに、糖模倣物、例えば、２’−Ｏ−アルキルリボース、２’−Ｏ−アルキル−Ｃ４’分岐したリボース、シクロブチル又は他の炭素環又はヘキシトールを更に含む、請求項１又は２に記載の分子。
【請求項４】
線状主鎖を有するか、あるいは、核酸又は化学的基、例えば、ヘキサエチレングリコール若しくはテトラデオキシチミジレート基を含むループを有するヘアピン二本鎖核酸から作られた、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分子。
【請求項５】
少なくとも１つの自由端を有する、請求項１〜４のずれか１項に記載の分子。
【請求項６】
各ストランドの端部又は少なくとも３’端部ストランドに１個以上の化学的基を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分子。
【請求項７】
各ストランドの端部又は少なくとも３’端部ストランドに１個以上のホスホロチオエートを含む、請求項６に記載の分子。
【請求項８】
該主鎖が、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、モルホリノ核酸、２’−Ｏ，４’−Ｃ メチレン／エチレン橋かけされたロックされた核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及び短鎖アルキル、あるいは可変長さのシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子若しくは複素環糖内結合を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の分子。
【請求項９】
該断片が、天然のヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド又は２’−リボヌクレオチドに基づいており、そして場合により、アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシル以外の１種以上の修飾されたヌクレオチド及び／又はヌクレオ塩基を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１０】
該ヌクレオ塩基が、Ｃ５−メチルシトシン、ウラシル、プソイドイソシトシン、Ｃ５−プロピニルウラシル、Ｎ７−デアザグアニン、Ｎ７−グリコシル化グアニン、又はα−アノマー、又は他の修飾されたヌクレオ塩基又は塩基性残基を含む群において選ばれる、請求項９に記載の分子。
【請求項１１】
ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復又は損傷シグナリングプロセスを妨害する少なくとも１つの埋め込まれたエレメントを更に含み、該エレメントは、二本鎖分子の中心又は端部で組み込まれている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１２】
ａ）ポリエチレングリコール鎖、好ましくはヘキサエチレングリコール鎖、又は場合により１個以上のヘテロ原子、例えば、酸素、硫黄、窒素により中断された及び／又は置換されたいかなる炭化水素鎖、又は１個以上のヘテロ原子を含むヘテロ原子基若しくは複素環基；
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ又はエキソヌクレアーゼによって作用されにくいブロッキングエレメントであるユニット、例えば、いかなる３’−修飾されたヌクレオチド；
ｃ）ヘアピン断片のループにおいて使用されるときの、ネイティブオリゴヌクレオチド、例えば、Ｔｎ、好ましくは、テトラデオキシチミジレート（Ｔ４）、
を含む、請求項１１に記載の分子。
【請求項１３】
ＤＮＡ切断処理、特に放射線治療又は化学療法と共同して使用されるべき佐剤組成物であって、腫瘍細胞の核に導入されるのに有効な量において、薬学的に許容されうる担体と組み合わせて、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の少なくとも１種のＤＮＡ修復で誘発される致死性分子を含む佐剤組成物。
【請求項１４】
該ＤＮＡ修復で誘発される致死性分子を、いかなる許容されうる担体と共に、いかなる適切な経路によっても、例えば、経口又は静脈内又は腫瘍内投与又はあるいは皮下注射により投与する、請求項１３に記載の佐剤組成物。
【請求項１５】
腫瘍、特に放射線治療及び／又は化学療法に高度に耐性の腫瘍を処置するための抗腫瘍薬物を製造するためのネイティブ二本鎖核酸断片の、ＤＮＡ切断処置、特に放射線治療又は化学療法と共同した使用。
【図１】
【図２】
【図２】
【図２．３】
【図３】
【図３】
【図３】
【図３】
【図４】
【図５】
【図５】
【図５】
【図２】
【図２】
【図２．３】
【図３】
【図３】
【図３】
【図３】
【図４】
【図５】
【図５】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５１０４０５（Ｐ２００７−５１０４０５Ａ）
【公表日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３６０７３（Ｐ２００６−５３６０７３）
【出願日】平成１６年１０月２５日（２００４．１０．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１２８５７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４０３７８
【国際公開日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【出願人】（５０００２６５３３）アンスティテュ・キュリ (20)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＣＵＲＩＥ
【出願人】（５００４７０４８２）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック（セーエヌエールエス） (25)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ （ＣＮＲＳ）
【出願人】（５０６１４０５５０）ミュゼオム・ナショナル・ディストワール・ナチュレル (4)
【氏名又は名称原語表記】ＭＵＳＥＵＭ ＮＡＴＩＯＮＡＬ Ｄ’ＨＩＳＴＯＩＲＥ ＮＡＴＵＲＥＬＬＥ
【出願人】（５００４８８２２５）アンスティテュ ナシオナル ド ラ サント エ ド ラ ルシュルシェ メディカル（アンセルム） (26)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬＥ（ＩＮＳＥＲＭ）
【住所又は居所原語表記】１０１，ｒｕｅ ｄｅ Ｔｏｌｂｉａｃ，Ｆ−７５６５４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １３ Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月２５日（２００４．１０．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１２８５７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４０３７８
【国際公開日】平成１７年５月６日（２００５．５．６）
【出願人】（５０００２６５３３）アンスティテュ・キュリ (20)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＣＵＲＩＥ
【出願人】（５００４７０４８２）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック（セーエヌエールエス） (25)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ （ＣＮＲＳ）
【出願人】（５０６１４０５５０）ミュゼオム・ナショナル・ディストワール・ナチュレル (4)
【氏名又は名称原語表記】ＭＵＳＥＵＭ ＮＡＴＩＯＮＡＬ Ｄ’ＨＩＳＴＯＩＲＥ ＮＡＴＵＲＥＬＬＥ
【出願人】（５００４８８２２５）アンスティテュ ナシオナル ド ラ サント エ ド ラ ルシュルシェ メディカル（アンセルム） (26)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬＥ（ＩＮＳＥＲＭ）
【住所又は居所原語表記】１０１，ｒｕｅ ｄｅ Ｔｏｌｂｉａｃ，Ｆ−７５６５４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １３ Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
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