腹膜内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法
【課題】腹膜内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出できる方法を提供する。
【解決手段】腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法であって、予めアミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入された対象の腹腔内において、前記アミロイド結合性物質には、ホジトロン放出核種、シングルフォトン核種、フッ素、X線吸収物質のいずれかを結合させ、PET、SPECT、MRI、X線CTによって前記アミロイド結合性物質を検出する検出方法。
【解決手段】腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法であって、予めアミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入された対象の腹腔内において、前記アミロイド結合性物質には、ホジトロン放出核種、シングルフォトン核種、フッ素、X線吸収物質のいずれかを結合させ、PET、SPECT、MRI、X線CTによって前記アミロイド結合性物質を検出する検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腹膜内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎不全の患者に対する治療法として、従来血液透析療法や腹膜透析療法等が行なわれてきた。腹膜透析療法（ＣＡＰＤ）とは、腎不全患者の腹腔内にカテーテルを留置し、これを通じて透析液バッグより腹膜透析液を腹腔内に注入し、一定時間貯留した後、同カテーテルを通じて腹膜透析液を体外へ排出する操作を１日数回繰り返す方法である。腹膜透析液には、一般に、電解質塩に加えてグルコースが含有されており、グルコースは腹膜透析液においては浸透圧剤の役割を果たす。すなわち、血液中の過剰な水分を、浸透圧の差を利用して除去するために、腹膜透析液にはグルコースが使用される。
【０００３】
腹膜透析療法を行なう上での問題点として、長期に亘り腹膜透析を行なうことによる腹膜機能の劣化や腹膜の硬化・肥厚化が挙げられる。腹膜機能の劣化や腹膜の硬化・肥厚化により、溶質の除去や除水の能力が衰える、被嚢性腹膜硬化症（ＥＰＳ）の発症等の問題を引き起こすおそれがある。この原因のひとつとして、浸透圧剤として腹膜透析液に含まれるグルコースが分解されて発生するグルコース分解産物（ＧＤＰｓ）や、糖とタンパクとの反応により発生する最終糖化産物（ＡＧＥｓ）による腹膜への悪影響が指摘されている。
【０００４】
ＧＤＰとしては、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）、グリオキサール（ＧＯ）、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、フルフラール、５−ヒドロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）、３−デオキシグルコソン（３−ＤＧ）、３，４−ジデオキシグルコソン−３−エン（３，４−ＤＧＥ）が挙げられる。これらの物質は、腹膜透析液を加熱滅菌する際の熱負荷によってグルコースが分解されることで発生する。これらの物質が細胞毒性を持つことは知られており、腹膜透析液に含まれるＧＤＰｓの細胞毒性によって腹膜機能の劣化や腹膜の硬化・肥厚化が引き起こされるものと考えられてきた。
【０００５】
グルコース溶液に熱を加えた場合、溶液の水素イオン濃度（ｐＨ）が３に近いほど、熱負荷によるＧＤＰｓの発生を低減することができる。しかし、腹膜透析液は体内に注入するものであるため、ｐＨは生体に近い中性であることが好ましい。この相反する問題を解決するため、特許文献１に記載のような腹膜透析液が開発されている。この技術によれば、グルコースが含まれた液とグルコースが含まれない液をバッグ内にて分割し、グルコースが含まれた液側の室をグルコースが安定しやすいｐＨとした構成により、加熱滅菌時のＧＤＰｓの生成を抑制することができる。また、各室の液を混合した後の透析液のｐＨが生体に近いｐＨとなるよう各室の液を調製することで、ｐＨによる生体へのダメージも防ぐことができる。
【０００６】
また、特許文献２に記載の発明もある。特許文献２においては、腹膜硬化症にＡＧＥｓが関与しているとの知見から、ＡＧＥｓの生成を抑制する物質やこれを用いた腹膜透析液の構成が開示されている。しかし、ＧＤＰｓやＡＧＥｓが腹膜に対してどのように作用し、どのような機序で腹膜が硬化・肥厚化するのかについては解明されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許４２８４７３７号
【特許文献２】ＷＯ２００５／０１８６４９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のとおり、腹膜透析においては腹膜がダメージを受けるおそれが示唆されている。そこで、本発明は、腹膜細胞におけるアミロイド構造を検出できる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は一態様において、腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法であって、予めアミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入された対象の腹腔内において前記アミロイド結合性物質を検出することを含む検出方法に関する。
【００１０】
本発明はその他の態様において、腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法であって、予めアミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入された対象の腹腔から排出された液体中の腹膜細胞に存在する前記アミロイド結合性物質を検出することを含む検出方法に関する。
【００１１】
また、本発明はその他の態様において、上述の腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法に使用する、アミロイド結合性物質を含有する溶液組成物、腹膜透析液製剤、及び、腹腔内洗浄液に関する。
【００１２】
また、本発明はその他の態様において、腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法であって、予めアミロイド結合性物質を含有しない液体が腹腔内に導入された対象の腹腔から排出された液体中の腹膜細胞に存在するタンパク質のアミロイド構造をアミロイド結合性物質を用いて検出することを含む検出方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出することができ、好ましくは、腹膜のダメージを評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、３，４−ＤＧＥ添加後の腹膜中皮細胞に対するＹＯ−ＰＲＯ−１染色の結果の一例を示す。
【図２】図２は、３，４−ＤＧＥ添加後の腹膜中皮細胞に対するＣｏｎｇｏ Ｒｅｄ染色の結果の一例を示す。
【図３】図３は、３，４−ＤＧＥの化学式を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明者は、上記のＧＤＰｓの中でも特に３，４−ＤＧＥに着目し、３，４−ＤＧＥがタンパク質の変性を引き起こし、変性したタンパク質がアミロイド構造をとることにより腹膜中皮細胞の細胞死を引き起こすことを見出した。また、変性したタンパク質のアミロイド形成を抑制することで、３，４−ＤＧＥによる細胞死を抑制できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
【００１６】
すなわち、本発明は一態様において、腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法（以下、「本発明の検出方法」ともいう。）であって、予めアミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入された対象の腹腔内において前記アミロイド結合性物質を検出することを含む検出方法に関する。本発明の検出方法によれば、腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出することができる。そして、腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出することにより、好ましくは、腹膜のダメージを評価することができる。
【００１７】
腹膜透析における腹膜のダメージのメカニズムは以下のように考えられる。すなわち、腹膜透析における腹膜のダメージは、腹膜透析液中に含まれるＧＤＰが引き起こす腹膜細胞の細胞死によってもたらされ、ＧＤＰによる細胞死の原因はＧＤＰによるタンパク質の最終糖化産物（ＡＧＥｓ）のアミロイド化が誘導するアポトーシスであると考えられる。実際、アミロイド形成抑制物質によってＧＤＰに起因するアポトーシス及び細胞死が抑制されうる。但し、本発明はこのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【００１８】
本明細書において「腹膜細胞」とは、腹膜を構成する細胞をいい、好ましくは腹腔内面の細胞をいい、より好ましくは腹膜中皮細胞をいう。腹膜中皮細胞は、微繊毛を有した分泌細胞である。腹膜は、一般に、生体防御機能、癒着防止機能などの役割を担う。
【００１９】
本明細書において「腹膜のダメージ」とは、腹膜機能が低下することをいい、腹膜中皮細胞におけるアミロイド構造の発生、腹膜中皮細胞の腹膜からの剥離、腹膜中皮細胞の細胞死、腹膜の硬化及び／又は肥厚化、並びに被嚢性腹膜硬化症（ＥＰＳ）発症を含む。
【００２０】
本明細書において「タンパク質のアミロイド構造」とは、タンパク質が何らかの理由で変性後に分子構造の不安定なベータシート構造をとり、その後、βシート構造を有する繊維状凝集体として得られうるアミロイド繊維の構造をいう。本明細書において「腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造」とは、腹腔内又は腹膜細胞の内部若しくは周辺にて形成された或いは存在するタンパク質のアミロイド構造をいう。
【００２１】
グルコース分解物（ＧＤＰ）を含む液体（例えば、腹膜透析液）が腹膜表面（腹腔内面又は腹膜細胞）のタンパク質をアミロイド化し、このアミロイド化を介して腹膜中皮細胞にアポトーシス（細胞死）をもたらすこと、そして、アミロイド形成を抑制する物質によりＧＤＰ（特に、３，４−ＤＧＥ）誘発性の細胞死を抑制できることは、従来知られていなかった新たな知見である。
【００２２】
本明細書において「ＧＤＰ」とは、グルコース分解産物をいう。透析液には高温高圧条件下の滅菌処理が必要とされる。したがって、グルコースを使用する腹膜透析液は、ＧＤＰを含有することとなる。上述したとおり、腹膜透析液中のＧＤＰとしては、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）、グリオキサール（ＧＯ）、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、フルフラール、５−ヒドロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）、３−デオキシグルコソン（３−ＤＧ）、３，４−ＤＧＥが報告されている。ＧＤＰは、いずれも、腹膜透析液中で腹膜中皮細胞にダメージを与えると考えられるが、そのなかでも３，４−ＤＧＥの細胞毒性は著しく高い傾向がある。本明細書において「３，４−ＤＧＥ」とは、図３に示す３，４−ジデオキシグルコソン−３−エンのことをいう。
【００２３】
［アミロイド結合性物質］
本明細書における「アミロイド結合性物質」とは、アミロイド構造に結合能を有する公知の化合物を含みうる。公知のアミロイド結合性物質を示す文献としては、Fusheng Yang et al., The journal of Biological chemistry Vol.280, p5892-5901, 2005、 Volker Heiser et al., PNAS Vol.97, P6739-6744, 2000、 Harry Levine,III, Protein science, 2, p404-410, 1993 などが挙げられる。
【００２４】
アミロイド結合性物質は、そのものが後述する方法で検出可能である場合もあるが、検出方法に応じた修飾がされたものであってもよい。例えば、ＰＥＴ（ポジトロン放射断層撮影法）であればポジトロン放出核種を標識することが好ましく、ＳＰＥＣＴ（シングルフォトン放射線コンピュータ断層撮影法）であればシングルフォトン放出核種を標識することが好ましい。また、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）であれば例えばフッ素を結合することが好ましく、Ｘ線ＣＴであればＸ線吸収性物質を結合することが好ましい。これらの修飾をされた物質もアミロイド構造に結合能を有するのであれば、本明細書におけるアミロイド結合性物質に含まれうる。また、光学顕微鏡で検出を行う場合には、「アミロイド結合性物質」自身が色素であることが好ましい。さらに、アミロイド結合性物質は、アミロイド構造に結合能を有する抗体若しくは抗体の断片、及び検出方法に応じた修飾がされた抗体若しくは抗体の断片を含みうる。
【００２５】
「アミロイド結合性物質」の具体例としては、クルクミン、コンゴーレッド、チオフラビン、及びこれらの誘導体、並びに、フラボン誘導体、及び、クルクミン、コンゴーレッド、及びチオフラビンの誘導体以外のアミロイドイメージングプローブ（ＦＤＤＮＰ、ＳＢ−１３など）が挙げられる。これらの物質は、塩の形態であってもよい。
【００２６】
本明細書において「アミロイド形成抑制物質」とは、タンパク質のアミロイド構造の形成を抑制できる物質をいい、公知のアミロイド形成抑制物質を含みうる。なお、腹膜透析液内のＧＤＰの細胞毒性にアミロイド化が関与すること、及び、アミロイド形成抑制物質によりＧＤＰの細胞毒性を軽減できることは、従来知られていなかった新たな知見である。
【００２７】
本明細書におけるアミロイド結合性物質は、アミロイド形成抑制物質を含みうる。アミロイド形成抑制物質であるアミロイド結合性物質は、ＧＤＰによる腹膜細胞への傷害性を低減することができる点で好ましい。アミロイド形成抑制物質であるアミロイド結合性物質としては、クルクミン、コンゴーレッド、チオフラビン及びこれらの誘導体が挙げられる。なお、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩ、又はＸ線ＣＴのために修飾されたクルクミン、コンゴーレッド、及びチオフラビンの誘導体も本明細書における「アミロイド結合性物質」として好ましい。これらのアミロイド形成抑制物質であるアミロイド結合性物質の中でも、ＧＤＰの細胞障害性の低減の観点から、クルクミン及びクルクミン誘導体が好ましい。クルクミン誘導体としては、クルクミンと類似した構造を有し、アミロイド形成抑制作用を有するものが好ましい。
【００２８】
予め対象の腹腔内に導入されるアミロイド結合性物質を含む液体におけるアミロイド結合性物質の含有量は、適宜調節でき、例えば、コンゴーレッド及びチオフラビンを用いた例では１０〜１０００μＭとすることができ、クルクミンを用いた例では１〜１００μＭとすることができる。
【００２９】
本明細書において「対象」とは、ヒト及び又はヒト以外の哺乳類とすることができる。本発明の検出方法は、一態様において、「アミロイド結合性物質を含む液体が予め腹腔内に導入された対象」に行われる。ＣＡＰＤ（腹膜透析）療法の患者が対象である場合には、腹膜透析液及び／又は腹腔内洗浄液の代わりに、アミロイド結合性物質を含有する腹膜透析液及び／又は腹腔内洗浄液を腹腔内に導入することができる。したがって、「アミロイド結合性物質を含む液体」の一実施形態は、アミロイド結合性物質を含む腹膜透析液及び／又は腹腔内洗浄液である。
【００３０】
［アミロイド構造の検出方法］
腹腔内に導入されたアミロイド結合性物質を含む液体は、保持される腹腔内で腹膜表面の腹膜細胞と接するから、該腹膜細胞にアミロイド構造が存在すれば、該アミロイド結合性物質が容易に結合することができる。よって、このアミロイド構造に結合したアミロイド結合性物質を検出すれば、腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出できる。予め導入されたアミロイド結合性物質を含む液体の腹腔内貯留時間は適宜調節可能であり、例えば、１〜１２時間が挙げられる。
【００３１】
本発明の検出方法におけるアミロイド結合性物質の検出の一実施形態は、腹膜細胞におけるアミロイド構造に結合したアミロイド結合性物質をＰＥＴ（ポジトロン放射断層撮影法）、ＳＰＥＣＴ（シングルフォトン放射線コンピュータ断層撮影法）、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）、及びＸ線ＣＴ等でイメージングすることを含む。本実施形態では、対象の腹部（腹腔）をそのままイメージングすることでアミロイド結合性物質を検出する。イメージングの結果からアミロイドの定量を行うことは、当業者であれば、例えば、検量線や適当なプログラムを用いて容易に行うことができる。そして、アミロイド構造の量で腹膜のダメージを評価することができる。したがって、本発明は、その他の態様において、腹膜におけるアミロイドの定量方法に関する。なお、イメージングを行う前に必要に応じ、予め対象に導入したアミロイド結合性物質を含む液体を腹腔内から排出してもよい。
【００３２】
本発明の検出方法におけるアミロイド結合性物質の検出のその他の実施形態は、対象の腹腔内からの排液中に腹膜から剥離して存在する腹膜細胞に結合するアミロイド結合性物質を検出することを含む。前記排液の腹膜細胞にアミロイド構造が存在すれば、予め導入されたアミロイド結合性物質が結合しているので、検出可能となる。本実施形態では、光学顕微鏡で細胞を観察できる点から、アミロイド結合性物質は色素又は抗体であることが好ましい。排液中の腹膜細胞数及び腹膜細胞中のアミロイド構造の量の結果から腹膜のダメージを評価できる。なお、検出する腹膜細胞を回収する排液は、予め導入したアミロイド結合性物質を含む液体の排液であってもよく、あるいは、前記アミロイド結合性物質を含む液体の排液後に前記対象に導入されたアミロイド結合性物質を含まない液体の排液であってもよい。
【００３３】
上述したとおり、腹膜細胞は、腹腔内に導入した液体中に剥離してくることがある。したがって、本発明の検出方法は、さらにその他の態様において、腹膜細胞におけるアミロイド構造を検出する方法であって、予めアミロイド結合性物質を含まない液体が腹腔内に導入された対象の腹腔から排出された液体中の腹膜細胞に存在するタンパク質のアミロイド構造をアミロイド結合性物質を用いて検出することを含む検出方法に関する。すなわち、対象の腹腔内にアミロイド結合性物質を導入する代わりに、排液中の腹膜細胞にアミロイド結合性物質を接触させることにより、対象のアミロイド構造を検出できる。本態様の検出方法は、通常の腹膜透析療法（ＣＡＰＤ）における排液中の腹膜細胞を使用して行うことができる。
【００３４】
本発明の検出方法は、アミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入される前に、アミロイド形成抑制物質を含有する腹膜透析液で腹膜透析を行っていた対象、及び、アミロイド形成抑制物質を含有しない腹膜透析液で腹膜透析を行っていた対象のいずれの対象にも適用できる。すなわち、アミロイド形成抑制物質を含有する腹膜透析液で腹膜透析を行っていた場合と、アミロイド形成抑制物質を含有しない腹膜透析液で腹膜透析を行っていた場合とでは、腹膜に対するダメージが異なることが予見され、両方の場合での本発明の検出方法の結果を比較することにより、アミロイド形成抑制物質を含有する腹膜透析液の効果の確認や、腹膜機能の評価ができる。
【００３５】
［腹膜検査方法］
本発明は、さらにその他の態様において、腹膜検査方法であって、本発明の検出方法を行い、腹膜のアミロイド化の有無又はその程度を調べることを含む方法に関する。具体的な検出方法は、上述のとおりとすることができる。本発明の腹膜検査方法は、さらに、本発明の検出方法で得られたデータに基づき腹膜細胞のアミロイド量を定量すること、及び、腹膜のダメージを評価することを含んでもよい。
【００３６】
［腹膜透析方法］
本発明は、さらにその他の態様において、腹膜透析方法であって、アミロイド結合性物質を含む腹膜透析液を使用して本発明の検出方法又は本発明の腹膜検査方法を行うことを含む腹膜透析方法に関する。本発明の検出方法又は本発明の腹膜検査方法を行うこと以外の具体的な手法は、公知のＣＡＰＤ療法と同様に行うことができる。この態様の発明によれば、腹膜のダメージをモニターしながら腹膜透析を行うことができ、重篤な腹膜のダメージを予防できる。
【００３７】
［溶液組成物］
本発明は、その他の態様として、本発明の検出方法に使用する溶液組成物であって、電解質塩、及び、アミロイド結合性物質を含有する溶液組成物に関する。本明細書において電解質塩は、腹腔内に導入される溶液に使用される観点から、従来の腹膜透析液に使用される組成及び濃度であることが好ましい。電解質塩としては、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及びこれらの水和物、並びに、これらの組み合わせなどが挙げられ、血清中の組成及び濃度に近いものが好ましい。本発明の溶液組成物の限定的に解釈されない一実施形態において、含有される電解質塩の組み合わせ及びその濃度としては、０．４〜０．６ｗ／ｖ％塩化ナトリウム、０．０１〜０．０２ｗ／ｖ％塩化カルシウム水和物、０．００５〜０．０２ｗ／ｖ％塩化マグネシウム、及び０．３〜０．５ｗ／ｖ％乳酸ナトリウムが挙げられる。
【００３８】
［腹膜透析液製剤］
本発明は、その他の態様として、腹膜透析液製剤であって（以下、「本発明の腹膜透析液製剤」ともいう）、グルコース又はグルコースポリマー、電解質塩及びアミロイド結合性物質を含有する腹膜透析液製剤に関する。すなわち、本発明の腹膜透析液製剤は、従来のグルコース又はグルコースポリマーを含有する腹膜透析液に上述したアミロイド結合性物質を加えたものである。本発明の腹膜透析液製剤は、本発明の検出方法、本発明の検査方法、及び本発明の腹膜透析方法に用いることが好ましい。本発明の腹膜透析液製剤であれば、グルコースを用いる腹膜透析液から排除が困難なＧＤＰによる腹膜中皮細胞への傷害性を低減するとともに、腹膜のダメージをモニターできる。なお、本発明の腹膜透析液製剤における電解質塩は、上述の本発明の溶液組成物と同様とすることができる。
【００３９】
本明細書においてグルコースポリマーとは、構成単位としてグルコースを含むポリマー又は構成単位がグルコースのみからなるポリマーをいう。グルコースポリマーとしては、腹膜透析液として使用した場合に浸透圧差を形成できるものであれば特に制限されないが、腹膜透析液として使用する観点から、構成単位がαグルコースであるグルコースポリマーが好ましい。本明細書におけるグルコースポリマーの具体例としては、デキストラン、デンプン、グリコーゲン、セルロース、プルラン、カードラン、シゾフィラン、レンチナン、ペスタロチアン等が挙げられる。グルコース及びグルコースポリマーは、浸透圧を高くする機能を果たす観点から、腹膜透析液の浸透圧比が、好ましくは１．１〜１．６、より好ましくは１．２〜１．５となるように含有され、含有量としては、１．４〜２．５ｗ／ｖ％が好ましく、１．５〜２．４ｗ／ｖ％がより好ましい。
【００４０】
本発明の腹膜透析液製剤は、一実施形態として、電解質塩が溶解し、かつ、グルコース及びグルコースポリマーを含有しない第１液とグルコース又はグルコースポリマーが溶解した第２液とを分離して収容する腹膜透析液製剤であって、第１液及び第２液の少なくとも一方がアミロイド結合性物質を含有する腹膜透析液製剤に関する。この実施形態によれば、製造時にアミロイド結合性物質を添加でき、使用時における手間が省けるメリットがある。第１液及び第２液のいずれかにアミロイド結合性物質を含ませるかについては、そのアミロイド形成抑制剤のｐＨ安定性等から適宜判断できる。この実施形態は、例えば、従来の２液タイプの透析液バッグを用いて実施できる。
【００４１】
本発明の腹膜透析液製剤は、その他の実施形態として、電解質塩が溶解し、かつ、グルコース及びグルコースポリマーを含有しない第１液とグルコース又はグルコースポリマーが溶解した第２液とを分離して収容する腹膜透析液製剤であって、アミロイド結合性物質を含有する第３液をさらに分離して収容した腹膜透析液製剤に関する。この実施形態によれば、使用時までアミロイド結合性物質と第１液又は第２液との接触を避けることができるというメリットがある。この実施形態は、例えば、従来の３液タイプの透析液バッグを用いて実施できる。
【００４２】
本発明の腹膜透析液製剤は、さらにその他の実施形態として、従来の１〜３液タイプの腹膜透析液と該腹膜透析液に混注するためのアミロイド結合性物質との組み合わせの腹膜透析製剤に関する。前記アミロイド結合性物質は、操作の簡便性の点から前記アミロイド結合性物質が収容されたプレフィルドシリンジとすることが好ましい。したがって、本発明は、その他の態様として、腹膜透析液に混注するためのアミロイド結合性物質が収容されたプレフィルドシリンジに関する。本発明のプレフィルドシリンジは、薬液をアミロイド結合性物質又はその溶液とするほかは、従来公知のプレフィルドシリンジを採用できる。また、本発明のプレフィルドシリンジは、腹膜透析液に使用する旨の取扱い説明書が添付されていてもよい。
【００４３】
［腹腔内洗浄液］
本発明は、さらにその他の態様において、アミロイド結合性物質を含有する腹腔内洗浄液に関する。本明細書において、腹腔内洗浄液とは、腹腔内を洗浄するために腹腔内に導入する液体であって、例えば、腹膜透析療法を中止する場合に、透析液の代わりに腹腔内に注入し洗浄する液をいう。腹腔内洗浄液を用いて本発明の検査方法を行うことにより、腹膜透析による腹膜のダメージを評価することができる。本発明の腹腔内洗浄液におけるアミロイド結合性物質の含有量は、上述と同様にすることができ、その他の成分は従来と同様であってよく、例えば、生理食塩水とすることができる。
【実施例】
【００４４】
〔３，４−ＤＧＥの細胞毒性：アポトーシス細胞の検出〕
ＳＤ系ラット（雄、８週齢）から腹膜中皮細胞を回収し、８Ｗｅｌｌカルチャースライドを用いてＭ１９９培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ HYPERLINK "http://lsd.pharm.kyoto-u.ac.jp/weblsd/c/begin/penicillin" ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ入り）５００μｌ中で培養した。次にこの培養細胞に、自社にて透析液より単離・精製した３，４−ＤＧＥを最終濃度１００μＭとなるよう添加し、さらに４時間培養した。その後、アポトーシスを起こした細胞に浸透する緑色蛍光性の核酸染色剤ＹＯ−ＰＲＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）を０．５μｌ添加し、蛍光顕微鏡にて観察した。また、コントロールとして３，４−ＤＧＥを添加しない他は同様に培養した腹膜中皮細胞の蛍光顕微鏡観察を行った。その結果を図１に示す。図１に示した通り、３，４−ＤＧＥを添加した細胞では、ほとんどの細胞でアポトーシスが誘発されていた。
【００４５】
〔３，４−ＤＧＥの細胞毒性：アミロイド構造の検出〕
ＳＤ系ラット（雄、８週齢）から腹膜中皮細胞を回収し、８ＷｅｌｌカルチャースライドにてＭ１９９培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ HYPERLINK "http://lsd.pharm.kyoto-u.ac.jp/weblsd/c/begin/penicillin" ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ入り）５００μｌ中で培養した。次にこの培養細胞に、自社にて透析液より単離・精製した３，４−ＤＧＥを最終濃度１００μＭとなるよう添加し、さらに４時間培養した。その後、アミロイド染色剤であるコンゴーレッド（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度１０μＭとなるよう添加し、染色後光学顕微鏡にて観察した。また、コントロールとして３，４−ＤＧＥを添加しない他は同様に培養した腹膜中皮細胞の光学顕微鏡観察を行った。その結果を図２に示す。図２に示した通り、３，４−ＤＧＥを添加した細胞では、タンパク質のアミロイド化が引き起こされていた。
【００４６】
以上の結果、３，４−ＤＧＥによる細胞死の原因は、３，４−ＤＧＥによる最終糖化産物（ＡＧＥｓ）のアミロイド化が誘導するアポトーシスであると考えられる。
【００４７】
〔３，４−ＤＧＥの細胞毒性：細胞毒性の抑制〕
ＳＤ系ラット（雄、８週齢）から腹膜中皮細胞を回収し、８ＷｅｌｌカルチャースライドにてＭ１９９培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ HYPERLINK "http://lsd.pharm.kyoto-u.ac.jp/weblsd/c/begin/penicillin" ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ入り）５００μｌ中で培養した。次にこの培養細胞に、自社にて透析液より単離・精製した３，４−ＤＧＥ及びコンゴーレッド（Ｓｉｇｍａ社）をそれぞれ最終濃度１００μＭとなるよう添加し、さらに４時間培養した。その後Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いた核染色及び抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体を用いた免疫染色を行った。Ｖｉｍｅｎｔｉｎ免疫染色により細胞骨格を染色することで細胞の形態を確認し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色によりアポトーシス細胞で特徴的に観察される核の収縮を共焦点レーザー顕微鏡にて確認した。その観察結果に基づき、全細胞数及び死細胞数をカウントし、死細胞の割合（％）を算出した。その結果を下記表１に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
上記表１に示すとおり、アミロイド形成抑制能を有するコンゴーレッドと３，４−ＤＧＥとが共存する場合、３，４−ＤＧＥに起因する細胞毒性が低減されていた。したがって、ＧＤＰが存在しうる腹膜透析液中のアミロイド結合性物質がアミロイド形成抑制能を有する場合、アミロイド構造の検出と同時に、ＧＤＰによる腹膜へのダメージ軽減も可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、例えば、腹膜透析の分野で有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腹膜内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎不全の患者に対する治療法として、従来血液透析療法や腹膜透析療法等が行なわれてきた。腹膜透析療法（ＣＡＰＤ）とは、腎不全患者の腹腔内にカテーテルを留置し、これを通じて透析液バッグより腹膜透析液を腹腔内に注入し、一定時間貯留した後、同カテーテルを通じて腹膜透析液を体外へ排出する操作を１日数回繰り返す方法である。腹膜透析液には、一般に、電解質塩に加えてグルコースが含有されており、グルコースは腹膜透析液においては浸透圧剤の役割を果たす。すなわち、血液中の過剰な水分を、浸透圧の差を利用して除去するために、腹膜透析液にはグルコースが使用される。
【０００３】
腹膜透析療法を行なう上での問題点として、長期に亘り腹膜透析を行なうことによる腹膜機能の劣化や腹膜の硬化・肥厚化が挙げられる。腹膜機能の劣化や腹膜の硬化・肥厚化により、溶質の除去や除水の能力が衰える、被嚢性腹膜硬化症（ＥＰＳ）の発症等の問題を引き起こすおそれがある。この原因のひとつとして、浸透圧剤として腹膜透析液に含まれるグルコースが分解されて発生するグルコース分解産物（ＧＤＰｓ）や、糖とタンパクとの反応により発生する最終糖化産物（ＡＧＥｓ）による腹膜への悪影響が指摘されている。
【０００４】
ＧＤＰとしては、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）、グリオキサール（ＧＯ）、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、フルフラール、５−ヒドロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）、３−デオキシグルコソン（３−ＤＧ）、３，４−ジデオキシグルコソン−３−エン（３，４−ＤＧＥ）が挙げられる。これらの物質は、腹膜透析液を加熱滅菌する際の熱負荷によってグルコースが分解されることで発生する。これらの物質が細胞毒性を持つことは知られており、腹膜透析液に含まれるＧＤＰｓの細胞毒性によって腹膜機能の劣化や腹膜の硬化・肥厚化が引き起こされるものと考えられてきた。
【０００５】
グルコース溶液に熱を加えた場合、溶液の水素イオン濃度（ｐＨ）が３に近いほど、熱負荷によるＧＤＰｓの発生を低減することができる。しかし、腹膜透析液は体内に注入するものであるため、ｐＨは生体に近い中性であることが好ましい。この相反する問題を解決するため、特許文献１に記載のような腹膜透析液が開発されている。この技術によれば、グルコースが含まれた液とグルコースが含まれない液をバッグ内にて分割し、グルコースが含まれた液側の室をグルコースが安定しやすいｐＨとした構成により、加熱滅菌時のＧＤＰｓの生成を抑制することができる。また、各室の液を混合した後の透析液のｐＨが生体に近いｐＨとなるよう各室の液を調製することで、ｐＨによる生体へのダメージも防ぐことができる。
【０００６】
また、特許文献２に記載の発明もある。特許文献２においては、腹膜硬化症にＡＧＥｓが関与しているとの知見から、ＡＧＥｓの生成を抑制する物質やこれを用いた腹膜透析液の構成が開示されている。しかし、ＧＤＰｓやＡＧＥｓが腹膜に対してどのように作用し、どのような機序で腹膜が硬化・肥厚化するのかについては解明されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許４２８４７３７号
【特許文献２】ＷＯ２００５／０１８６４９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のとおり、腹膜透析においては腹膜がダメージを受けるおそれが示唆されている。そこで、本発明は、腹膜細胞におけるアミロイド構造を検出できる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は一態様において、腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法であって、予めアミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入された対象の腹腔内において前記アミロイド結合性物質を検出することを含む検出方法に関する。
【００１０】
本発明はその他の態様において、腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法であって、予めアミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入された対象の腹腔から排出された液体中の腹膜細胞に存在する前記アミロイド結合性物質を検出することを含む検出方法に関する。
【００１１】
また、本発明はその他の態様において、上述の腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法に使用する、アミロイド結合性物質を含有する溶液組成物、腹膜透析液製剤、及び、腹腔内洗浄液に関する。
【００１２】
また、本発明はその他の態様において、腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法であって、予めアミロイド結合性物質を含有しない液体が腹腔内に導入された対象の腹腔から排出された液体中の腹膜細胞に存在するタンパク質のアミロイド構造をアミロイド結合性物質を用いて検出することを含む検出方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出することができ、好ましくは、腹膜のダメージを評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、３，４−ＤＧＥ添加後の腹膜中皮細胞に対するＹＯ−ＰＲＯ−１染色の結果の一例を示す。
【図２】図２は、３，４−ＤＧＥ添加後の腹膜中皮細胞に対するＣｏｎｇｏ Ｒｅｄ染色の結果の一例を示す。
【図３】図３は、３，４−ＤＧＥの化学式を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明者は、上記のＧＤＰｓの中でも特に３，４−ＤＧＥに着目し、３，４−ＤＧＥがタンパク質の変性を引き起こし、変性したタンパク質がアミロイド構造をとることにより腹膜中皮細胞の細胞死を引き起こすことを見出した。また、変性したタンパク質のアミロイド形成を抑制することで、３，４−ＤＧＥによる細胞死を抑制できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
【００１６】
すなわち、本発明は一態様において、腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法（以下、「本発明の検出方法」ともいう。）であって、予めアミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入された対象の腹腔内において前記アミロイド結合性物質を検出することを含む検出方法に関する。本発明の検出方法によれば、腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出することができる。そして、腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出することにより、好ましくは、腹膜のダメージを評価することができる。
【００１７】
腹膜透析における腹膜のダメージのメカニズムは以下のように考えられる。すなわち、腹膜透析における腹膜のダメージは、腹膜透析液中に含まれるＧＤＰが引き起こす腹膜細胞の細胞死によってもたらされ、ＧＤＰによる細胞死の原因はＧＤＰによるタンパク質の最終糖化産物（ＡＧＥｓ）のアミロイド化が誘導するアポトーシスであると考えられる。実際、アミロイド形成抑制物質によってＧＤＰに起因するアポトーシス及び細胞死が抑制されうる。但し、本発明はこのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
【００１８】
本明細書において「腹膜細胞」とは、腹膜を構成する細胞をいい、好ましくは腹腔内面の細胞をいい、より好ましくは腹膜中皮細胞をいう。腹膜中皮細胞は、微繊毛を有した分泌細胞である。腹膜は、一般に、生体防御機能、癒着防止機能などの役割を担う。
【００１９】
本明細書において「腹膜のダメージ」とは、腹膜機能が低下することをいい、腹膜中皮細胞におけるアミロイド構造の発生、腹膜中皮細胞の腹膜からの剥離、腹膜中皮細胞の細胞死、腹膜の硬化及び／又は肥厚化、並びに被嚢性腹膜硬化症（ＥＰＳ）発症を含む。
【００２０】
本明細書において「タンパク質のアミロイド構造」とは、タンパク質が何らかの理由で変性後に分子構造の不安定なベータシート構造をとり、その後、βシート構造を有する繊維状凝集体として得られうるアミロイド繊維の構造をいう。本明細書において「腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造」とは、腹腔内又は腹膜細胞の内部若しくは周辺にて形成された或いは存在するタンパク質のアミロイド構造をいう。
【００２１】
グルコース分解物（ＧＤＰ）を含む液体（例えば、腹膜透析液）が腹膜表面（腹腔内面又は腹膜細胞）のタンパク質をアミロイド化し、このアミロイド化を介して腹膜中皮細胞にアポトーシス（細胞死）をもたらすこと、そして、アミロイド形成を抑制する物質によりＧＤＰ（特に、３，４−ＤＧＥ）誘発性の細胞死を抑制できることは、従来知られていなかった新たな知見である。
【００２２】
本明細書において「ＧＤＰ」とは、グルコース分解産物をいう。透析液には高温高圧条件下の滅菌処理が必要とされる。したがって、グルコースを使用する腹膜透析液は、ＧＤＰを含有することとなる。上述したとおり、腹膜透析液中のＧＤＰとしては、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）、グリオキサール（ＧＯ）、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、フルフラール、５−ヒドロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）、３−デオキシグルコソン（３−ＤＧ）、３，４−ＤＧＥが報告されている。ＧＤＰは、いずれも、腹膜透析液中で腹膜中皮細胞にダメージを与えると考えられるが、そのなかでも３，４−ＤＧＥの細胞毒性は著しく高い傾向がある。本明細書において「３，４−ＤＧＥ」とは、図３に示す３，４−ジデオキシグルコソン−３−エンのことをいう。
【００２３】
［アミロイド結合性物質］
本明細書における「アミロイド結合性物質」とは、アミロイド構造に結合能を有する公知の化合物を含みうる。公知のアミロイド結合性物質を示す文献としては、Fusheng Yang et al., The journal of Biological chemistry Vol.280, p5892-5901, 2005、 Volker Heiser et al., PNAS Vol.97, P6739-6744, 2000、 Harry Levine,III, Protein science, 2, p404-410, 1993 などが挙げられる。
【００２４】
アミロイド結合性物質は、そのものが後述する方法で検出可能である場合もあるが、検出方法に応じた修飾がされたものであってもよい。例えば、ＰＥＴ（ポジトロン放射断層撮影法）であればポジトロン放出核種を標識することが好ましく、ＳＰＥＣＴ（シングルフォトン放射線コンピュータ断層撮影法）であればシングルフォトン放出核種を標識することが好ましい。また、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）であれば例えばフッ素を結合することが好ましく、Ｘ線ＣＴであればＸ線吸収性物質を結合することが好ましい。これらの修飾をされた物質もアミロイド構造に結合能を有するのであれば、本明細書におけるアミロイド結合性物質に含まれうる。また、光学顕微鏡で検出を行う場合には、「アミロイド結合性物質」自身が色素であることが好ましい。さらに、アミロイド結合性物質は、アミロイド構造に結合能を有する抗体若しくは抗体の断片、及び検出方法に応じた修飾がされた抗体若しくは抗体の断片を含みうる。
【００２５】
「アミロイド結合性物質」の具体例としては、クルクミン、コンゴーレッド、チオフラビン、及びこれらの誘導体、並びに、フラボン誘導体、及び、クルクミン、コンゴーレッド、及びチオフラビンの誘導体以外のアミロイドイメージングプローブ（ＦＤＤＮＰ、ＳＢ−１３など）が挙げられる。これらの物質は、塩の形態であってもよい。
【００２６】
本明細書において「アミロイド形成抑制物質」とは、タンパク質のアミロイド構造の形成を抑制できる物質をいい、公知のアミロイド形成抑制物質を含みうる。なお、腹膜透析液内のＧＤＰの細胞毒性にアミロイド化が関与すること、及び、アミロイド形成抑制物質によりＧＤＰの細胞毒性を軽減できることは、従来知られていなかった新たな知見である。
【００２７】
本明細書におけるアミロイド結合性物質は、アミロイド形成抑制物質を含みうる。アミロイド形成抑制物質であるアミロイド結合性物質は、ＧＤＰによる腹膜細胞への傷害性を低減することができる点で好ましい。アミロイド形成抑制物質であるアミロイド結合性物質としては、クルクミン、コンゴーレッド、チオフラビン及びこれらの誘導体が挙げられる。なお、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩ、又はＸ線ＣＴのために修飾されたクルクミン、コンゴーレッド、及びチオフラビンの誘導体も本明細書における「アミロイド結合性物質」として好ましい。これらのアミロイド形成抑制物質であるアミロイド結合性物質の中でも、ＧＤＰの細胞障害性の低減の観点から、クルクミン及びクルクミン誘導体が好ましい。クルクミン誘導体としては、クルクミンと類似した構造を有し、アミロイド形成抑制作用を有するものが好ましい。
【００２８】
予め対象の腹腔内に導入されるアミロイド結合性物質を含む液体におけるアミロイド結合性物質の含有量は、適宜調節でき、例えば、コンゴーレッド及びチオフラビンを用いた例では１０〜１０００μＭとすることができ、クルクミンを用いた例では１〜１００μＭとすることができる。
【００２９】
本明細書において「対象」とは、ヒト及び又はヒト以外の哺乳類とすることができる。本発明の検出方法は、一態様において、「アミロイド結合性物質を含む液体が予め腹腔内に導入された対象」に行われる。ＣＡＰＤ（腹膜透析）療法の患者が対象である場合には、腹膜透析液及び／又は腹腔内洗浄液の代わりに、アミロイド結合性物質を含有する腹膜透析液及び／又は腹腔内洗浄液を腹腔内に導入することができる。したがって、「アミロイド結合性物質を含む液体」の一実施形態は、アミロイド結合性物質を含む腹膜透析液及び／又は腹腔内洗浄液である。
【００３０】
［アミロイド構造の検出方法］
腹腔内に導入されたアミロイド結合性物質を含む液体は、保持される腹腔内で腹膜表面の腹膜細胞と接するから、該腹膜細胞にアミロイド構造が存在すれば、該アミロイド結合性物質が容易に結合することができる。よって、このアミロイド構造に結合したアミロイド結合性物質を検出すれば、腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出できる。予め導入されたアミロイド結合性物質を含む液体の腹腔内貯留時間は適宜調節可能であり、例えば、１〜１２時間が挙げられる。
【００３１】
本発明の検出方法におけるアミロイド結合性物質の検出の一実施形態は、腹膜細胞におけるアミロイド構造に結合したアミロイド結合性物質をＰＥＴ（ポジトロン放射断層撮影法）、ＳＰＥＣＴ（シングルフォトン放射線コンピュータ断層撮影法）、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）、及びＸ線ＣＴ等でイメージングすることを含む。本実施形態では、対象の腹部（腹腔）をそのままイメージングすることでアミロイド結合性物質を検出する。イメージングの結果からアミロイドの定量を行うことは、当業者であれば、例えば、検量線や適当なプログラムを用いて容易に行うことができる。そして、アミロイド構造の量で腹膜のダメージを評価することができる。したがって、本発明は、その他の態様において、腹膜におけるアミロイドの定量方法に関する。なお、イメージングを行う前に必要に応じ、予め対象に導入したアミロイド結合性物質を含む液体を腹腔内から排出してもよい。
【００３２】
本発明の検出方法におけるアミロイド結合性物質の検出のその他の実施形態は、対象の腹腔内からの排液中に腹膜から剥離して存在する腹膜細胞に結合するアミロイド結合性物質を検出することを含む。前記排液の腹膜細胞にアミロイド構造が存在すれば、予め導入されたアミロイド結合性物質が結合しているので、検出可能となる。本実施形態では、光学顕微鏡で細胞を観察できる点から、アミロイド結合性物質は色素又は抗体であることが好ましい。排液中の腹膜細胞数及び腹膜細胞中のアミロイド構造の量の結果から腹膜のダメージを評価できる。なお、検出する腹膜細胞を回収する排液は、予め導入したアミロイド結合性物質を含む液体の排液であってもよく、あるいは、前記アミロイド結合性物質を含む液体の排液後に前記対象に導入されたアミロイド結合性物質を含まない液体の排液であってもよい。
【００３３】
上述したとおり、腹膜細胞は、腹腔内に導入した液体中に剥離してくることがある。したがって、本発明の検出方法は、さらにその他の態様において、腹膜細胞におけるアミロイド構造を検出する方法であって、予めアミロイド結合性物質を含まない液体が腹腔内に導入された対象の腹腔から排出された液体中の腹膜細胞に存在するタンパク質のアミロイド構造をアミロイド結合性物質を用いて検出することを含む検出方法に関する。すなわち、対象の腹腔内にアミロイド結合性物質を導入する代わりに、排液中の腹膜細胞にアミロイド結合性物質を接触させることにより、対象のアミロイド構造を検出できる。本態様の検出方法は、通常の腹膜透析療法（ＣＡＰＤ）における排液中の腹膜細胞を使用して行うことができる。
【００３４】
本発明の検出方法は、アミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入される前に、アミロイド形成抑制物質を含有する腹膜透析液で腹膜透析を行っていた対象、及び、アミロイド形成抑制物質を含有しない腹膜透析液で腹膜透析を行っていた対象のいずれの対象にも適用できる。すなわち、アミロイド形成抑制物質を含有する腹膜透析液で腹膜透析を行っていた場合と、アミロイド形成抑制物質を含有しない腹膜透析液で腹膜透析を行っていた場合とでは、腹膜に対するダメージが異なることが予見され、両方の場合での本発明の検出方法の結果を比較することにより、アミロイド形成抑制物質を含有する腹膜透析液の効果の確認や、腹膜機能の評価ができる。
【００３５】
［腹膜検査方法］
本発明は、さらにその他の態様において、腹膜検査方法であって、本発明の検出方法を行い、腹膜のアミロイド化の有無又はその程度を調べることを含む方法に関する。具体的な検出方法は、上述のとおりとすることができる。本発明の腹膜検査方法は、さらに、本発明の検出方法で得られたデータに基づき腹膜細胞のアミロイド量を定量すること、及び、腹膜のダメージを評価することを含んでもよい。
【００３６】
［腹膜透析方法］
本発明は、さらにその他の態様において、腹膜透析方法であって、アミロイド結合性物質を含む腹膜透析液を使用して本発明の検出方法又は本発明の腹膜検査方法を行うことを含む腹膜透析方法に関する。本発明の検出方法又は本発明の腹膜検査方法を行うこと以外の具体的な手法は、公知のＣＡＰＤ療法と同様に行うことができる。この態様の発明によれば、腹膜のダメージをモニターしながら腹膜透析を行うことができ、重篤な腹膜のダメージを予防できる。
【００３７】
［溶液組成物］
本発明は、その他の態様として、本発明の検出方法に使用する溶液組成物であって、電解質塩、及び、アミロイド結合性物質を含有する溶液組成物に関する。本明細書において電解質塩は、腹腔内に導入される溶液に使用される観点から、従来の腹膜透析液に使用される組成及び濃度であることが好ましい。電解質塩としては、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、及びこれらの水和物、並びに、これらの組み合わせなどが挙げられ、血清中の組成及び濃度に近いものが好ましい。本発明の溶液組成物の限定的に解釈されない一実施形態において、含有される電解質塩の組み合わせ及びその濃度としては、０．４〜０．６ｗ／ｖ％塩化ナトリウム、０．０１〜０．０２ｗ／ｖ％塩化カルシウム水和物、０．００５〜０．０２ｗ／ｖ％塩化マグネシウム、及び０．３〜０．５ｗ／ｖ％乳酸ナトリウムが挙げられる。
【００３８】
［腹膜透析液製剤］
本発明は、その他の態様として、腹膜透析液製剤であって（以下、「本発明の腹膜透析液製剤」ともいう）、グルコース又はグルコースポリマー、電解質塩及びアミロイド結合性物質を含有する腹膜透析液製剤に関する。すなわち、本発明の腹膜透析液製剤は、従来のグルコース又はグルコースポリマーを含有する腹膜透析液に上述したアミロイド結合性物質を加えたものである。本発明の腹膜透析液製剤は、本発明の検出方法、本発明の検査方法、及び本発明の腹膜透析方法に用いることが好ましい。本発明の腹膜透析液製剤であれば、グルコースを用いる腹膜透析液から排除が困難なＧＤＰによる腹膜中皮細胞への傷害性を低減するとともに、腹膜のダメージをモニターできる。なお、本発明の腹膜透析液製剤における電解質塩は、上述の本発明の溶液組成物と同様とすることができる。
【００３９】
本明細書においてグルコースポリマーとは、構成単位としてグルコースを含むポリマー又は構成単位がグルコースのみからなるポリマーをいう。グルコースポリマーとしては、腹膜透析液として使用した場合に浸透圧差を形成できるものであれば特に制限されないが、腹膜透析液として使用する観点から、構成単位がαグルコースであるグルコースポリマーが好ましい。本明細書におけるグルコースポリマーの具体例としては、デキストラン、デンプン、グリコーゲン、セルロース、プルラン、カードラン、シゾフィラン、レンチナン、ペスタロチアン等が挙げられる。グルコース及びグルコースポリマーは、浸透圧を高くする機能を果たす観点から、腹膜透析液の浸透圧比が、好ましくは１．１〜１．６、より好ましくは１．２〜１．５となるように含有され、含有量としては、１．４〜２．５ｗ／ｖ％が好ましく、１．５〜２．４ｗ／ｖ％がより好ましい。
【００４０】
本発明の腹膜透析液製剤は、一実施形態として、電解質塩が溶解し、かつ、グルコース及びグルコースポリマーを含有しない第１液とグルコース又はグルコースポリマーが溶解した第２液とを分離して収容する腹膜透析液製剤であって、第１液及び第２液の少なくとも一方がアミロイド結合性物質を含有する腹膜透析液製剤に関する。この実施形態によれば、製造時にアミロイド結合性物質を添加でき、使用時における手間が省けるメリットがある。第１液及び第２液のいずれかにアミロイド結合性物質を含ませるかについては、そのアミロイド形成抑制剤のｐＨ安定性等から適宜判断できる。この実施形態は、例えば、従来の２液タイプの透析液バッグを用いて実施できる。
【００４１】
本発明の腹膜透析液製剤は、その他の実施形態として、電解質塩が溶解し、かつ、グルコース及びグルコースポリマーを含有しない第１液とグルコース又はグルコースポリマーが溶解した第２液とを分離して収容する腹膜透析液製剤であって、アミロイド結合性物質を含有する第３液をさらに分離して収容した腹膜透析液製剤に関する。この実施形態によれば、使用時までアミロイド結合性物質と第１液又は第２液との接触を避けることができるというメリットがある。この実施形態は、例えば、従来の３液タイプの透析液バッグを用いて実施できる。
【００４２】
本発明の腹膜透析液製剤は、さらにその他の実施形態として、従来の１〜３液タイプの腹膜透析液と該腹膜透析液に混注するためのアミロイド結合性物質との組み合わせの腹膜透析製剤に関する。前記アミロイド結合性物質は、操作の簡便性の点から前記アミロイド結合性物質が収容されたプレフィルドシリンジとすることが好ましい。したがって、本発明は、その他の態様として、腹膜透析液に混注するためのアミロイド結合性物質が収容されたプレフィルドシリンジに関する。本発明のプレフィルドシリンジは、薬液をアミロイド結合性物質又はその溶液とするほかは、従来公知のプレフィルドシリンジを採用できる。また、本発明のプレフィルドシリンジは、腹膜透析液に使用する旨の取扱い説明書が添付されていてもよい。
【００４３】
［腹腔内洗浄液］
本発明は、さらにその他の態様において、アミロイド結合性物質を含有する腹腔内洗浄液に関する。本明細書において、腹腔内洗浄液とは、腹腔内を洗浄するために腹腔内に導入する液体であって、例えば、腹膜透析療法を中止する場合に、透析液の代わりに腹腔内に注入し洗浄する液をいう。腹腔内洗浄液を用いて本発明の検査方法を行うことにより、腹膜透析による腹膜のダメージを評価することができる。本発明の腹腔内洗浄液におけるアミロイド結合性物質の含有量は、上述と同様にすることができ、その他の成分は従来と同様であってよく、例えば、生理食塩水とすることができる。
【実施例】
【００４４】
〔３，４−ＤＧＥの細胞毒性：アポトーシス細胞の検出〕
ＳＤ系ラット（雄、８週齢）から腹膜中皮細胞を回収し、８Ｗｅｌｌカルチャースライドを用いてＭ１９９培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ HYPERLINK "http://lsd.pharm.kyoto-u.ac.jp/weblsd/c/begin/penicillin" ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ入り）５００μｌ中で培養した。次にこの培養細胞に、自社にて透析液より単離・精製した３，４−ＤＧＥを最終濃度１００μＭとなるよう添加し、さらに４時間培養した。その後、アポトーシスを起こした細胞に浸透する緑色蛍光性の核酸染色剤ＹＯ−ＰＲＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）を０．５μｌ添加し、蛍光顕微鏡にて観察した。また、コントロールとして３，４−ＤＧＥを添加しない他は同様に培養した腹膜中皮細胞の蛍光顕微鏡観察を行った。その結果を図１に示す。図１に示した通り、３，４−ＤＧＥを添加した細胞では、ほとんどの細胞でアポトーシスが誘発されていた。
【００４５】
〔３，４−ＤＧＥの細胞毒性：アミロイド構造の検出〕
ＳＤ系ラット（雄、８週齢）から腹膜中皮細胞を回収し、８ＷｅｌｌカルチャースライドにてＭ１９９培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ HYPERLINK "http://lsd.pharm.kyoto-u.ac.jp/weblsd/c/begin/penicillin" ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ入り）５００μｌ中で培養した。次にこの培養細胞に、自社にて透析液より単離・精製した３，４−ＤＧＥを最終濃度１００μＭとなるよう添加し、さらに４時間培養した。その後、アミロイド染色剤であるコンゴーレッド（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度１０μＭとなるよう添加し、染色後光学顕微鏡にて観察した。また、コントロールとして３，４−ＤＧＥを添加しない他は同様に培養した腹膜中皮細胞の光学顕微鏡観察を行った。その結果を図２に示す。図２に示した通り、３，４−ＤＧＥを添加した細胞では、タンパク質のアミロイド化が引き起こされていた。
【００４６】
以上の結果、３，４−ＤＧＥによる細胞死の原因は、３，４−ＤＧＥによる最終糖化産物（ＡＧＥｓ）のアミロイド化が誘導するアポトーシスであると考えられる。
【００４７】
〔３，４−ＤＧＥの細胞毒性：細胞毒性の抑制〕
ＳＤ系ラット（雄、８週齢）から腹膜中皮細胞を回収し、８ＷｅｌｌカルチャースライドにてＭ１９９培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ HYPERLINK "http://lsd.pharm.kyoto-u.ac.jp/weblsd/c/begin/penicillin" ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ入り）５００μｌ中で培養した。次にこの培養細胞に、自社にて透析液より単離・精製した３，４−ＤＧＥ及びコンゴーレッド（Ｓｉｇｍａ社）をそれぞれ最終濃度１００μＭとなるよう添加し、さらに４時間培養した。その後Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いた核染色及び抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ抗体を用いた免疫染色を行った。Ｖｉｍｅｎｔｉｎ免疫染色により細胞骨格を染色することで細胞の形態を確認し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色によりアポトーシス細胞で特徴的に観察される核の収縮を共焦点レーザー顕微鏡にて確認した。その観察結果に基づき、全細胞数及び死細胞数をカウントし、死細胞の割合（％）を算出した。その結果を下記表１に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
上記表１に示すとおり、アミロイド形成抑制能を有するコンゴーレッドと３，４−ＤＧＥとが共存する場合、３，４−ＤＧＥに起因する細胞毒性が低減されていた。したがって、ＧＤＰが存在しうる腹膜透析液中のアミロイド結合性物質がアミロイド形成抑制能を有する場合、アミロイド構造の検出と同時に、ＧＤＰによる腹膜へのダメージ軽減も可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、例えば、腹膜透析の分野で有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法であって、予めアミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入された対象の腹腔内において前記アミロイド結合性物質を検出することを含む、検出方法。
【請求項２】
アミロイド結合性物質の検出が、ＰＥＴ（ポジトロン放射断層撮影法）、ＳＰＥＣＴ（シングルフォトン放射線コンピュータ断層撮影法）、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）、及びＸ線ＣＴからなる群から選択される方法で検出することを含む、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法であって、予めアミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入された対象の腹腔から排出された液体中の腹膜細胞に存在する前記アミロイド結合性物質を検出することを含む、検出方法。
【請求項４】
予め対象の腹腔内に導入されたアミロイド結合性物質を含む液体が、腹膜透析液又は腹腔内洗浄液である、請求項１から３のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５】
前記対象が、アミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入される前に、アミロイド形成抑制物質を含有する腹膜透析液で腹膜透析を行っていた対象である、請求項１から４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項６】
前記対象が、アミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入される前に、アミロイド形成抑制物質を含有しない腹膜透析液で腹膜透析を行っていた対象である、請求項１から４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項７】
腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法であって、予めアミロイド結合性物質を含有しない液体が腹腔内に導入された対象の腹腔から排出された液体中の腹膜細胞に存在するタンパク質のアミロイド構造をアミロイド結合性物質を用いて検出することを含む、検出方法。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載の検出方法に使用する溶液組成物であって、電解質塩、及び、アミロイド結合性物質を含有する溶液組成物。
【請求項９】
請求項１から６のいずれかに記載の検出方法に使用する腹膜透析液製剤であって、グルコース又はグルコースポリマー、電解質塩、及びアミロイド結合性物質を含有する腹膜透析液製剤。
【請求項１０】
電解質塩が溶解し、かつ、グルコース及びグルコースポリマーを含有しない第１液とグルコース又はグルコースポリマーが溶解した第２液とを分離して収容する腹膜透析液製剤であって、第１液及び第２液の少なくとも一方がアミロイド結合性物質を含有するか、或いは、アミロイド結合性物質を含有する第３液をさらに分離して収容した、請求項９記載の腹膜透析液製剤。
【請求項１１】
請求項１から６のいずれかに記載の検出方法に使用する腹腔内洗浄液であって、アミロイド結合性物質を含有する腹腔内洗浄液。
【請求項１】
腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法であって、予めアミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入された対象の腹腔内において前記アミロイド結合性物質を検出することを含む、検出方法。
【請求項２】
アミロイド結合性物質の検出が、ＰＥＴ（ポジトロン放射断層撮影法）、ＳＰＥＣＴ（シングルフォトン放射線コンピュータ断層撮影法）、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）、及びＸ線ＣＴからなる群から選択される方法で検出することを含む、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法であって、予めアミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入された対象の腹腔から排出された液体中の腹膜細胞に存在する前記アミロイド結合性物質を検出することを含む、検出方法。
【請求項４】
予め対象の腹腔内に導入されたアミロイド結合性物質を含む液体が、腹膜透析液又は腹腔内洗浄液である、請求項１から３のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５】
前記対象が、アミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入される前に、アミロイド形成抑制物質を含有する腹膜透析液で腹膜透析を行っていた対象である、請求項１から４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項６】
前記対象が、アミロイド結合性物質を含む液体が腹腔内に導入される前に、アミロイド形成抑制物質を含有しない腹膜透析液で腹膜透析を行っていた対象である、請求項１から４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項７】
腹腔内におけるタンパク質のアミロイド構造を検出する方法であって、予めアミロイド結合性物質を含有しない液体が腹腔内に導入された対象の腹腔から排出された液体中の腹膜細胞に存在するタンパク質のアミロイド構造をアミロイド結合性物質を用いて検出することを含む、検出方法。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載の検出方法に使用する溶液組成物であって、電解質塩、及び、アミロイド結合性物質を含有する溶液組成物。
【請求項９】
請求項１から６のいずれかに記載の検出方法に使用する腹膜透析液製剤であって、グルコース又はグルコースポリマー、電解質塩、及びアミロイド結合性物質を含有する腹膜透析液製剤。
【請求項１０】
電解質塩が溶解し、かつ、グルコース及びグルコースポリマーを含有しない第１液とグルコース又はグルコースポリマーが溶解した第２液とを分離して収容する腹膜透析液製剤であって、第１液及び第２液の少なくとも一方がアミロイド結合性物質を含有するか、或いは、アミロイド結合性物質を含有する第３液をさらに分離して収容した、請求項９記載の腹膜透析液製剤。
【請求項１１】
請求項１から６のいずれかに記載の検出方法に使用する腹腔内洗浄液であって、アミロイド結合性物質を含有する腹腔内洗浄液。
【図３】
【図１】
【図２】
【図１】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−２４２２５２（Ｐ２０１１−２４２２５２Ａ）
【公開日】平成２３年１２月１日（２０１１．１２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１４５７３（Ｐ２０１０−１１４５７３）
【出願日】平成２２年５月１８日（２０１０．５．１８）
【出願人】（０００１５３０３０）株式会社ジェイ・エム・エス (452)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月１日（２０１１．１２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１８日（２０１０．５．１８）
【出願人】（０００１５３０３０）株式会社ジェイ・エム・エス (452)
【Ｆターム（参考）】
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