膜タンパク質機能測定システムおよび膜タンパク質機能測定方法
【課題】微小孔上に展開した脂質二分子膜中に膜タンパク質を再構成することにより、該脂質二分子膜の伸展による膜タンパク質の活性化、および伸展による脂質二分子膜中の受容体の密度変化と活性の関係を測定できる膜タンパク質機能測定システム、ならびに膜タンパク質機能測定方法の提供を目的とする。
【解決手段】穴部１１を有する基板本体１２の、穴部１１の開口１１ａが膜タンパク質１３を含む脂質二分子膜１４に覆われており、脂質二分子膜１４上に緩衝液１５が配置された膜タンパク質機能測定用基板１０Ａと、脂質二分子膜１４を伸展する伸展手段２０と、を具備する膜タンパク質機能測定システム１。また、膜タンパク質機能測定システム１を用いた膜タンパク質機能測定方法。
【解決手段】穴部１１を有する基板本体１２の、穴部１１の開口１１ａが膜タンパク質１３を含む脂質二分子膜１４に覆われており、脂質二分子膜１４上に緩衝液１５が配置された膜タンパク質機能測定用基板１０Ａと、脂質二分子膜１４を伸展する伸展手段２０と、を具備する膜タンパク質機能測定システム１。また、膜タンパク質機能測定システム１を用いた膜タンパク質機能測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜タンパク質機能測定システムおよび膜タンパク質機能測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質をはじめとする生体分子の機能を理解する上で、その構造を知ることは不可欠である。生体分子が機能する際には、外界（細胞外）からの刺激に伴いその構造を変化させことでその機能を発揮する。
【０００３】
タンパク質、脂質、核酸などの生体分子の構造を生体内に近い条件で観察できる手法としては、水溶液中で観察が可能な走査プローブ顕微鏡、特に原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いる方法が広く用いられている。近年、ＡＦＭの技術は非常に進歩しており、生体分子の構造解析、および溶液中に添加した低分子化合物やペプチドの結合による生体分子の動的な構造変化の観察への更なる貢献が期待されている。
ＡＦＭを用いた測定装置及び測定方法としては、例えば、溶液中において分子レベルまたは原子レベルの分解能が達成された測定装置および測定方法（非特許文献１）や、ビデオレートでの観察を可能とする測定装置（非特許文献２）が挙げられる。
【０００４】
生体分子が外界から受ける刺激としては、一部の膜タンパク質では細胞膜の伸展が挙げられる。該膜タンパク質では、細胞膜の伸展によっても活性化され、リン酸化や、カルシウムイオンの透過などの生理活性を示すことが知られている（非特許文献３〜５）。これらの膜タンパク質以外にも、細胞膜の伸展によって活性化するタンパク質が存在する可能性がある。
また、一部の受容体に関しては、受容体密度と活性に相関があることが知られており（非特許文献６）。そのため、近傍の受容体同士の距離と、その機能との関係を詳細に分析し、その関係を明らかにすることも重要である。
しかし、細胞膜の伸展や、受容体同士の距離の変化によるタンパク質の活性化を詳細に評価する測定システムはなく、細胞膜の伸展により活性化する新たなタンパク質を探索することも、受容体同士の距離とその機能の関係を詳細に分析することも困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】T. Fukuma, M. J. Higgins, S. P. Jarvis, Direct imaging of lipid-ion network formation under physiological conditions by frequency modulation atomic force microscopy. Phys. Rev. Lett. 98 (2007) 10601-10603.
【非特許文献２】T. Ando, N. Kodera, E. Takai, D. Maruyama, K. Saito, A. Toda, A high-speed atomic force microscope for stdying biological macromolecules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (2001) 12468-12472.
【非特許文献３】A. Kloda, L. Kua, R. Hall, D. J. Adams, B. Martinac, Liposome reconstitution and modulation of recombinant N-methyl-D-aspartate receptor channels by membrane stretch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (2007) 1540-1545.
【非特許文献４】Y. Sawada, M. Tamada, B. J. Dubin-Thaler, O. Cherniavskaya, R. Sakai, S. Tanaka, M. P. Sheetz, Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas, Cell 127 (2006) 1015-1026.
【非特許文献５】K. Yamamoto, T. Sokabe, T. Matsumoto, K. Yoshimura, M. Shibata, N. Ohura, T. Fukuda, T. Sato, K. Sekine, S. Kato, M. Isshiki, T. Fujita, M. Kobayashi, K. Kawamura, H. Masuda, A. Kamiya, J. Ando, Impaired flow-dependent control of vascular tone and remodeling in P2X4-deficient mice, Nat Med. 12 (2006) 133-137.
【非特許文献６】Y. Fujiwara, Y. Kubo, Density dependent changes of the pore properties of P2X2 receptor channel, J. Physiol. 558 (2004) 31-43.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、微小孔上に展開した脂質二分子膜中に膜タンパク質を再構成した、該脂質二分子膜の伸展による膜タンパク質の活性化、および伸展による脂質二分子膜中の受容体の密度変化と活性の関係を測定できる膜タンパク質機能測定システム、ならびに膜タンパク質機能測定方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、前記課題を解決するために以下の構成を採用した。
［１］穴部を有する基板本体の、該穴部の開口が膜タンパク質を含む脂質二分子膜に覆われており、該脂質二分子膜上に緩衝液が配置された膜タンパク質機能測定用基板と、前記脂質二分子膜を伸展する伸展手段と、を具備する膜タンパク質機能測定システム。
［２］前記伸展手段が走査プローブ顕微鏡の深針である、前記［１］に記載の膜タンパク質機能測定システム。
［３］更に、前記脂質二分子膜の表面構造を観察する観察手段を具備する、前記［１］または［２］に記載の膜タンパク質機能測定システム。
［４］更に、前記基板における前記穴部の外部に設けられた第１の電極と、前記穴部の内部に設けられた第２の電極とを具備する、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システム。
［５］前記［１］〜［３］のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、前記穴部の内部に、膜タンパク質を透過するイオンに結合して蛍光を発するイオン感受性蛍光色素が配置され、かつ前記脂質二分子膜上に、膜タンパク質を透過するイオンを含む緩衝液が配置されており、前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、前記イオンチャネル型膜タンパク質のイオンの透過を蛍光強度の変化から測定し、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
［６］前記［１］〜［３］のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、前記穴部の内部に、核酸が配置され、かつ前記脂質二分子膜上に、核酸に結合して蛍光が増強する核酸結合性蛍光色素を含む緩衝液が配置されており、前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、前記イオンチャネル型膜タンパク質の前記核酸結合性蛍光色素の透過を蛍光強度の変化から測定し、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
［７］前記［１］〜［３］のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、前記穴部の内部に、蛍光標識した細胞外情報伝達物質が配置されており、前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、前記細胞外情報伝達物質の前記穴部の内部から外部への前記イオンチャネル型膜タンパク質を介した移動を蛍光強度の変化から測定し、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
［８］前記［１］〜［３］のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、前記膜タンパク質が代謝型膜タンパク質であり、前記穴部の内部に、細胞質抽出画分、および膜タンパク質を透過するカルシウムイオンに結合して蛍光を発するカルシウムイオン感受性蛍光色素が配置されており、前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、細胞内シグナル伝達系を介した小胞体からのカルシウムイオンの放出を蛍光強度の変化から測定し、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
［９］前記［４］に記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、前記脂質二分子膜上に、膜タンパク質を透過するイオンを含む緩衝液が配置されており、前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、前記第１の電極および第２の電極の間を流れる電流を測定して、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の膜タンパク質機能測定システムおよび膜タンパク質機能測定方法によれば、脂質二分子膜の伸展による膜タンパク質の活性化、および伸展による脂質二分子膜中の受容体の密度変化と活性の関係を測定できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の膜タンパク質機能測定システムの実施形態の一例を示した概略断面図である。
【図２】本発明の膜タンパク質機能測定システムの他の実施形態例を示した概略断面図である。
【図３】本発明の膜タンパク質機能測定方法の一工程を示した概略断面図である。
【図４】本発明の膜タンパク質機能測定方法の一工程を示した概略断面図である。
【図５】本発明の膜タンパク質機能測定方法の一工程を示した概略断面図である。
【図６】本発明の膜タンパク質機能測定方法の一工程を示した概略断面図である。
【図７】本発明の膜タンパク質機能測定方法の一工程を示した概略断面図である。
【図８】本発明の膜タンパク質機能測定方法の一工程を示した概略断面図である。
【図９】実験例１における基板の共焦点蛍光顕微鏡を用いた蛍光像である。
【図１０】実験例２における基板のＡＦＭ像である。
【図１１】実施例１における基板のＡＦＭ像（ａ）、ＡＦＭ像（ａ）中の破線部における脂質二分子膜の高さ情報を示したグラフ（ｂ）、およびＡＦＭ像（ａ）の拡大図（ｃ）である。
【図１２】実施例１における穴部を有する基板のＡＦＭ像（ａ）、ＡＦＭ像（ａ）中の破線部における脂質二分子膜の高さ情報を示したグラフ（ｂ）、およびＡＦＭ像（ａ）の拡大図（ｃ）である。
【図１３】実施例２における蛍光強度の変化を示したグラフ（ａ）および基板の共焦点蛍光顕微鏡を用いた蛍光像（ｂ）、ならびに実施例３における電流値の変化を示したグラフ（ｃ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜膜タンパク質機能測定システム＞
本発明の膜タンパク質機能測定システム１（以下、「システム１」という。）は、図１に示すように、膜タンパク質機能測定用基板１０Ａ（以下、「基板１０Ａ」という。）と、伸展手段２０と、を具備する。
基板１０Ａは、穴部１１を有する基板本体１２と、穴部１１の開口１１ａを覆う、膜タンパク質１３を含む脂質二分子膜１４と、脂質二分子膜１４上に配置された緩衝液１５とを有する。伸展手段２０は、脂質二分子膜１４を伸展する手段である。
【００１１】
基板１０Ａは、脂質二分子膜１４を伸展することによって活性化する膜タンパク質１３の構造変化、脂質二分子膜１４における局在の観測、蛍光強度の変化の測定による膜タンパク質１３の機能測定のための基板である。
基板１０Ａでは、穴部１１を覆う脂質二分子膜１４上に緩衝液１５が配置され、穴部１１の外部と穴部１１の内部が脂質二分子膜１４によって区切られている。
【００１２】
基板本体１２の表面は、平坦であることが好ましい。
基板本体１２の材質は、表面を平坦に加工できる材質が好ましく、例えば、マイカ、ガラス、シリコンなどが挙げられる。
基板本体１２の形状は特に限定されず、用途に応じた形状のものを使用することができ、例えば、平板状の基板が挙げられる。
基板本体１２の厚みは特に限定されず、０．１ｍｍ〜２ｍｍが好ましい。
【００１３】
基板本体１２は、穴部１１を有する。
基板本体１２における穴部１１の数は特に限定されず、１〜１０，０００個が好ましい。
穴部１１の形状は、開口１１ａに脂質二分子膜１４を安定に配置でき、必要に応じて蛍光顕微鏡による穴部１１の蛍光像の取得、ＡＦＭによる表面構造の観察等が可能な形状であればよい。穴部１１の形状としては、例えば、円筒状が挙げられる。
穴部１１は、凹状の穴であってもよく、貫通孔であってもよい。この例では、穴部１１は凹状の穴である。
【００１４】
開口１１ａの直径は、１０ｎｍ〜１０μｍが好ましい。開口１１ａの直径が１０ｎｍ以上であれば、ＡＦＭにより表面構造の観察等が容易になり、また膜タンパク質１３の機能測定が容易になる。開口１１ａの直径が１０μｍ以下であれば、脂質二分子膜１４をより安定に形成できる。
また、穴部１１の深さは、基板本体１２の厚みに応じて設定すればよく、５０ｎｍ〜２ｍｍが好ましい。
【００１５】
基板本体１２に穴部１１を形成する方法としては、例えば、フォトリソグラフィ法、ドライエッチング法等の微細加工技術が適用できる。また、プラスチックの基板本体１２であれば、加熱した注射針を刺すことにより形成してもよい。
【００１６】
膜タンパク質１３は、イオンチャネル型膜タンパク質もしくは代謝型膜タンパク質などが挙げられる。
イオンチャネル型膜タンパク質としては、例えばイオンチャネル型受容体が挙げられ、ＴＲＰ（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）チャネル（サブユニットはＴＲＰＶ１〜ＴＲＰＶ６、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＣ１〜ＴＲＰＣ７、ＴＲＰＭ１〜ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＭＬ１〜ＴＲＰＭＬ３、ＴＲＰＰ１〜ＴＲＰＰ５）、ＡＴＰ受容体（サブユニットはＰ２Ｘ１〜Ｐ２Ｘ７）、セトロニン受容体（サブユニットは５−ＨＴ３）、ＮＭＤＡ受容体（サブユニットはＮＲ１、ＮＲ２Ａ〜ＮＲ２Ｄ、ＮＲ３Ａ、ＮＲ３Ｂ）、ＡＭＰＡ受容体（サブユニットはＧｌｕＲ１〜ＧｌｕＲ４）、カイニン酸受容体（サブユニットはＧｌｕＲ５〜ＧｌｕＲ７、ＫＡ−１、ＫＡ−２）、ＧＡＢＡ受容体（サブユニットはα、β、γ）もしくはＧＡＢＡ受容体（サブタイプはＧＡＢＡＡ、ＧＡＢＡＣ）などが挙げられる。
代謝型膜タンパク質としては、例えばＧタンパク共役型受容体が挙げられ、アデノシン受容体（Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、Ａ３）、ＡＴＰ受容体（Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、Ｐ２Ｙ１１、Ｐ２Ｙ１２、Ｐ２Ｙ１３、Ｐ２Ｙ１４）、セロトニン受容体（サブユニットは５−ＨＴ１、５−ＨＴ２、５−ＨＴ４、５−ＨＴ６、５−ＨＴ７）、代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ１〜ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ５〜ｍＧｌｕＲ８）、アドレナリン受容体(α、β)、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ−１〜ＰＡＲ−４）、ブラジキニン受容体（Ｂ１、Ｂ２)、ＧＡＢＡＢ受容体、オピオイド受容体（ν受容体、δ受容体、κ受容体）などが挙げられる。
これら受容体は１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１７】
脂質二分子膜１４に膜タンパク質１３を再構成する方法は、公知の方法を用いることができ、例えば、ベシクルフュージョン法が挙げられる。
【００１８】
脂質二分子膜１４は、両親媒性分子であるリン脂質などの脂質分子が二層構造を形成した膜であり、生体膜の最も基本的な構造である。脂質分子は、疎水性部分と親水性部分を有し、疎水性部分同士が会合することにより安定な二分子膜構造を形成する。
脂質分子としては、常温で充分な流動性を持つものであればよく、各脂質の疎水部のアルキル鎖長、二重結合の部位と数は特に限定されない。
脂質分子としては、例えば、卵黄由来フォスファチジルコリン（ｅｇｇ−ｙｏｌｋ ＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（ＰＩＰ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴ脂質などが挙げられる。
これら脂質分子は、１種類のみを用いてもよく、２種類以上を用いてもよい。
【００１９】
脂質二分子膜１４の形成方法としては、例えば、ｎ−デカンなどの有機溶媒に溶解した脂質分子を用いる方法が挙げられる。まず、穴部１１に水溶液を配置し、その上部にｎ−デカンに溶解した脂質分子を配置する。これにより、ｎ−デカン中の脂質分子の親水部がｎ−デカンと穴部１１との界面に次第に集まり、均一な層を形成する。次いで、穴部１１のｎ−デカン上に緩衝液などの水溶液を配置する。これにより、ｎ−デカンと、該ｎ−デカンの上側（外部側）の水溶液との界面にも脂質分子の親水部が次第に集中してくる。ｎ−デカンは室温で揮発するため、最終的に穴部１１の開口１１ａを覆う均一な脂質二分子膜１４が形成される。
【００２０】
緩衝液１５は、充分な蛍光が検出でき、膜タンパク質１３の機能を阻害しないものであればよく、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどが挙げられる。
緩衝液１５の量は、脂質二分子膜１４を充分に覆う量であればよい。
【００２１】
伸展手段２０としては、脂質二分子膜１４に押し付けて部分的に機械的刺激を与え、脂質二分子膜１４を伸展できるものであればよく、ＡＦＭなどの走査プローブ顕微鏡の深針が好ましい。
【００２２】
また、システム１は、脂質二分子膜１４の表面構造を観察する観察手段を具備することが好ましい。
観察手段としては、例えば、ＡＦＭが挙げられる。また、膜タンパク質１３や脂質二分子膜１４を蛍光標識している場合であれば、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いることもできる。
【００２３】
また、穴部１１の開口１１ａが大きすぎることで、伸展しなくても脂質二分子膜１４が撓んで脂質二分子膜上の構造観察が困難となる場合は、穴部１１の開口１１ａを覆うように網目構造体を形成し、該網目構造体上に脂質二分子膜１４を形成するようにしてもよい。
網目構造体はナノ線状体からなる構造体であり、具体的には、ナノ線状体が多数の分岐を有して、網目を形成したものである。
ナノ線状体としては、例えば、ナノチューブ、ナノワイヤー、ナノファイバなどが挙げられ、その材質は特に制限はないが、ナノ線状体を容易に形成できる点では、カーボンが好ましい。
ここで、ナノ線状体とは、長さ方向に垂直な断面の直径が１〜２０ｎｍの線状体のことである。ナノ線状体の長さ方向に垂直な断面の直径が前記下限以上であれば、脂質二分子膜を充分に支持することができる。また、前記上限以下であれば、穴部１１の上に網目構造体が配置されても、観察目的の生体試料のＡＦＭ観察に支障をきたさない。
ナノ線状体としてカーボンナノチューブを用いる場合、その直径を前記範囲にするためには、後述する網目構造体の形成方法において、使用する金属触媒の種類、粒子径および密度や、形成時の温度を適宜選択すればよい。例えば、触媒の粒子径を大きくする程、直径は大きくなる。
【００２４】
網目構造体の形成方法としては、例えば、化学気相成長法（ＣＶＤ法）により形成する方法などが挙げられる。化学気相成長法を適用した場合の炭素源としては、例えば、メタン、エタン、アセチレン、メタノール、エタノールなどが挙げられる。
また、化学気相成長法により網目構造体を形成する場合には、ナノ線状体を容易に形成できることから、鉄などの金属触媒を用いることが好ましい。また、基板本体１２の表面にナノ線状体を形成するためには、金属触媒を基板本体１２の表面にあらかじめ付着させておくことが好ましい。
【００２５】
また、本発明の膜タンパク質機能測定システムの他の実施形態を図２に示す。
膜タンパク質機能測定システム２（以下、「システム２」という。）は、図２に示すように、膜タンパク質機能測定用基板１０Ｂ（以下、「基板１０Ｂ」という。）と、伸展手段２０と、を具備する。システム２においてシステム１と同じ部分には同じ符号を付して説明を省略する。
基板１０Ｂは、穴部１１を有する基板本体１２と、穴部１１の開口１１ａを覆う、膜タンパク質１３を含む脂質二分子膜１４と、脂質二分子膜１４上に配置された緩衝液１５と、穴部１１の外部に設けられ、緩衝液１５と接触する第１の電極１６と、穴部１１の内部に設けられた第２の電極１７とを有する。伸展手段２０は、脂質二分子膜１４を伸展する手段である。
【００２６】
第１の電極１６および第２の電極１７は、穴部１１の外部および内部においてそれぞれ緩衝液に接触するように設けられる。第１の電極１６および第２の電極１７は、それぞれ図示しない電流計に接続され、それら電極間に流れる電流を測定できるようになっている。
第２の電極１７は、穴部１１の底部に設けられることが好ましい。
電極の材質としては、例えば、銅、アルミニウム、金、銀、塩化銀、白金、クロム、ニッケルなどの金属、および導電性樹脂などの導電性物質が挙げられる。
電極の厚みは５０〜５００ｎｍであることが好ましい。
【００２７】
システム２には、システム１と同様に、ＡＦＭ、共焦点レーザースキャン顕微鏡などの、脂質二分子膜１４の表面構造を観察する観察手段を具備することが好ましい。また、穴部１１の開口１１ａを覆うように網目構造体を形成し、該網目構造体上に脂質二分子膜１４を形成するようにしてもよい。
【００２８】
＜膜タンパク質機能測定方法＞
本発明の膜タンパク質機能測定方法は、脂質二分子膜を伸展したときの膜タンパク質の機能、該膜タンパク質（受容体）の脂質二分子膜中での局在を測定する方法であって、前述の本発明の膜タンパク質機能測定システムを用いる方法である。
本発明の膜タンパク質機能測定方法は、機能の測定手段によって、下記方法（Ｉ）、方法（ＩＩ）または方法（ＩＩＩ）が挙げられる。
（Ｉ）ＡＦＭなどの観察手段により脂質二分子膜の表面構造を測定する場合。
（ＩＩ）膜タンパク質の機能を蛍光強度の変化により光学的に測定する場合。
（ＩＩＩ）膜タンパク質の機能を電流値の変化により電気的に測定する場合。
【００２９】
また、方法（ＩＩ）は、測定に用いる膜タンパク質と蛍光物質の種類により下記方法（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−４）が挙げられる。
（ＩＩ−１）膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、蛍光物質としてイオン感受性蛍光色素を用いる場合。
（ＩＩ−２）膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、蛍光物質として核酸結合性蛍光色素を用いる場合。
（ＩＩ−３）膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、蛍光物質として蛍光標識した細胞外情報伝達物質を用いる場合。
（ＩＩ−４）膜タンパク質が代謝型膜タンパク質であり、蛍光物質としてイオン感受性蛍光色素を用いる場合。
【００３０】
方法（Ｉ）：
システム１における膜タンパク質１３としてイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａと代謝型膜タンパク質１３Ｂを用いたシステム１Ａを用い、図３に示すように、ＡＦＭ探針などの伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展し、同時に、図示しない観察手段によりイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａおよび代謝型膜タンパク質１３Ｂを有する脂質二分子膜１４の表面構造を観察する。脂質二分子膜１４はＡＦＭの探針などの伸展手段２０で伸展する。
これにより、脂質二分子膜１４の伸展によるイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａと代謝型膜タンパク質１３Ｂの構造変化を調べることができる。同様に、脂質二分子膜１４の伸展による、イオンチャネル型膜タンパク質１３Ａと代謝型膜タンパク質１３Ｂの脂質二分子膜１４内の局在の変化を観察することができる。
【００３１】
方法（ＩＩ−１）：
システム１において、膜タンパク質１３がイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａであり、穴部１１の内部に、膜タンパク質１３を透過するイオン３１に結合して蛍光を発するイオン感受性蛍光色素３２が配置され、かつ脂質二分子膜１４上に、膜タンパク質１３を透過するイオン３１を含む緩衝液１５が配置されたシステム１Ｂを用い、図４に示すように、伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展し、イオンチャネル型膜タンパク質１３Ａのイオン３１の透過を蛍光強度の変化から測定する。
【００３２】
伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展すると、その刺激に伴ってイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの構造が変化し、膜貫通部分のイオンチャネルが開いて穴部１１にイオン３１が流入する。そして、穴部１１に流入したイオン３１とイオン感受性蛍光色素３２が結合して蛍光を発することで、脂質二分子膜１４の伸展によるイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの活性の変化を測定できる。
イオン感受性蛍光色素３２は、緩衝液に含有させて穴部１１の内部に配置する。緩衝液は、充分な蛍光が検出でき、イオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの機能を阻害しないものであればよく、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどが挙げられる。
【００３３】
イオン３１としては、例えば、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、塩化物イオン、カリウムイオンが挙げられる。
緩衝液１５中のイオン３１の濃度は、測定に応じて適宜決定すればよく、１ｎＭ〜５００ｍＭが好ましく、１０μＭ〜１５０ｍＭがより好ましい。
【００３４】
イオン感受性蛍光色素３２は、イオン３１と結合することにより蛍光を発する物質であり、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）と結合して蛍光を発するできるｆｕｒａ−２、ｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）と結合して蛍光を発するＳＢＦＩ、ＣｏｒｏＮａ、カリウムイオン（Ｋ＋）と結合して蛍光を発するＰＢＦＩ、塩化物イオン（Ｃｌ−）と結合して蛍光を発するＭＱＡＥなどが挙げられる。
穴部１１の内部におけるイオン感受性蛍光色素３２の濃度は、蛍光強度の変化によりイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの活性を測定できるのに充分な量であればよく、１００ｎＭ〜５００μＭが好ましく、１μＭ〜１００μＭがより好ましい
【００３５】
方法（ＩＩ−２）：
システム１において、膜タンパク質１３がイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａであり、穴部１１の内部に核酸３３が配置され、かつ脂質二分子膜１４上に、核酸３３に結合して蛍光が増強する核酸結合性蛍光色素３４を含む緩衝液１５が配置されたシステム１Ｃを用い、図５に示すように、伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展して、イオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの核酸結合性蛍光色素３４の透過を蛍光強度の変化から測定する。
【００３６】
伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展すると、その刺激に伴ってイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの構造が変化し、チャネルポアサイズが変化して、核酸結合性蛍光色素３４がイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａを介して穴部１１の内部に流入する。そして、穴部１１に流入した核酸結合性蛍光色素３４と核酸３３が結合して蛍光を発することで、脂質二分子膜１４の伸展によるイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの活性の変化を測定できる。
核酸３３は、緩衝液に含有させて穴部１１の内部に配置する。緩衝液は、充分な蛍光が検出でき、イオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの機能を阻害しないものであればよく、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどが挙げられる。
【００３７】
核酸３３としては、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。核酸は、人工的に合成したものであっても、細胞から抽出したものであってもよい。また、核酸３３の塩基対数は、蛍光強度の変化を定量的に測定することができれば特に限定されない。
穴部１１の内部における核酸３３の濃度は、核酸の種類、長さによっても異なるが、１ｎｇ／μＬ〜５００μｇ／μＬが好ましく、１〜１００μｇ／μＬがより好ましい。
【００３８】
核酸結合性蛍光色素３４としては、例えば、臭化エチジウム、プロピディウムイオダイドなどが挙げられる。
穴部１１の内部における核酸結合性蛍光色素３４の濃度は、蛍光強度の変化によりイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの活性を測定できるのに充分な量であればよく、１００ｎＭ〜５００μＭが好ましく、１μＭ〜１００μＭがより好ましい
【００３９】
方法（ＩＩ−３）：
システム１において、膜タンパク質１３がイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａであり、穴部１１の内部に、蛍光標識した細胞外情報伝達物質３５（以下、「リガンド分子３５」という。）が配置されたシステム１Ｄを用い、図６に示すように、伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展して、リガンド分子３５の穴部１１の内部から外部へのイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａを介した移動を蛍光強度の変化から測定する。
【００４０】
伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展すると、その刺激に伴ってイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａが活性化して構造が変化し、リガンド分子３５がイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａを介して穴部１１の内部から外部に流出し、穴部１１の内部において蛍光強度が小さくなる。そのため、穴部１１の内部においてリガンド分子３５による蛍光強度の変化を測定することで、脂質二分子膜１４の伸展によるイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの活性の変化を測定できる。
リガンド分子３５は、緩衝液に含有させて穴部１１の内部に配置する。緩衝液は、充分な蛍光が検出でき、イオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの機能を阻害しないものであればよく、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどが挙げられる。
【００４１】
リガンド分子３５は、細胞外情報伝達物質に蛍光物質が結合した化合物である。
細胞外情報伝達物質は、細胞間での情報伝達に用いられる物質であり、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グルタミン酸が挙げられる。
前記細胞外情報伝達物質に結合する蛍光物質としては、ＮＢＤ（ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｆｕｒａｚａｎ）、ＴｅｘａｓＲｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｃｙ ｄｙｅが好ましい。
リガンド分子３５の具体例としては、例えば、ＡＴＰ−ＦＩＴＣ、ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ＦＩＴＣが挙げられる。細胞外情報伝達物質にＦＩＴＣを結合させる方法は、公知の方法を用いることができる。
リガンド分子３５の濃度は、測定の目的に応じて適宜決定すればよく、１ｎＭ〜１０ｍＭが好ましく、１０ｎＭ〜１００μＭがより好ましい。
【００４２】
方法（ＩＩ−４）：
システム１において、膜タンパク質１３が代謝型膜タンパク質１３Ｂであり、穴部１１の内部に、細胞質抽出画分３６、およびカルシウムイオンに結合して蛍光を発するカルシウムイオン感受性蛍光色素３７が配置されたシステム１Ｅを用い、図７に示すように、伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展して、細胞内シグナル伝達系を介した小胞体からのカルシウムイオンの放出を蛍光強度の変化から測定する。
【００４３】
伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展すると、代謝型膜タンパク質１３Ｂが活性化する。そして、穴部１１の内部に存在する、代謝型膜タンパク質１３Ｂと会合していたグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）結合型Ｇタンパク質がグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）結合型Ｇタンパク質と置き換わることで、そのシグナル伝達経路の下流にあるホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を活性化する。ＰＬＣは、脂質二分子膜のホスファチジルイノシトールの１種であるＰＩ（４，５）Ｐ２を代謝してイノシトール三リン酸（ＩＰ３）を産生する。ＩＰ３は、小胞体のＩＰ３受容体に結合することでその構造を変化させ、小胞体内に存在するカルシウムイオンを細胞質（本方法（ＩＩ−４）では穴部１１）へ放出させる。放出されたカルシウムイオンは、カルシウムイオン感受性蛍光色素３７と結合し、蛍光強度を増加させる。このように、これら一連の反応を介して、脂質二分子膜１４の伸展により活性化した代謝型膜タンパク質１３Ｂの活性を測定することができる。
【００４４】
細胞質抽出物３６は、Ｇタンパク質共役型受容体を発現する細胞や組織から公知の方法により調製できる。
例えば、細胞の場合は、下記の方法が挙げられる。培養ディッシュ（直径１０ｃｍ）に播種した細胞を細胞間の隙間がなくなるまで培養する。次いで、細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３度洗浄し、セルスクレーバーで細胞を掻き取り、１．５ｍｌセーフロックチューブに入れ、５０００ｒｐｍ（４℃）で遠心して細胞を回収する。次いで、得られた細胞のペレットに純水５０μＬを加え、１０分間氷上にて静置し、低浸透圧刺激により細胞膜を破壊する。その後、ペレットを吸い込まないように上清をとり、プロテアーゼ阻害剤を加えて細胞質抽出画分３６とする。
【００４５】
カルシウムイオン感受性蛍光色素３７としては、例えば、ｆｕｒａ−２、ｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４などが挙げられる。
穴部１１の内部におけるカルシウムイオン感受性蛍光色素３７の濃度は、蛍光強度の変化によりＧタンパク質共役型受容体の活性を測定できる量であればよく、１００ｎＭ〜５００μＭが好ましく、１μＭ〜１００μＭがより好ましい。
【００４６】
方法（ＩＩＩ）：
システム２において、膜タンパク質１３がイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａであり、脂質二分子膜１４上に、膜タンパク質を透過するイオン３８を含む緩衝液１５が配置されており、図８に示すように、伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展して、第１の電極１６および第２の電極１７間の電流を測定する。
伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展すると、その刺激に伴ってイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの構造が変化し、膜貫通部分のイオンチャネルが開いて穴部１１にイオン３８が流入する。このイオン３８の流入により、第１の電極１６および第２の電極１７間で電流が検出されるので、脂質二分子膜１４の伸展によるイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの活性の変化を測定できる。
【００４７】
イオン３８は、方法（ＩＩ−１）で挙げたイオン３１と同じものが使用できる。
緩衝液１５中のイオン３８の濃度は、電流が充分に検出できる量であればよく、１ｎＭ〜５００ｍＭが好ましく、１０μＭ〜１５０ｍＭがより好ましい。
穴部１１の内部には、緩衝液を配置しておく。穴部１１の内部に配置する緩衝液は、脂質二分子膜１４上に配置する緩衝液１５と同じ緩衝液であることが好ましい。
【００４８】
以上説明した本発明の膜タンパク質機能測定システムおよび膜タンパク質機能測定方法によれば、膜タンパク質機能測定基板の穴部上に設けた脂質二分子膜を伸展したときの膜タンパク質の活性の変化を測定することができる。また、方法（Ｉ）と、方法（ＩＩ）または方法（ＩＩＩ）との併用、すなわち、ＡＦＭなどの観察手段と、光学的もしくは電気的な活性の測定を併用することにより、脂質二分子膜を伸展したときの該脂質二分子膜中の受容体の密度変化と活性の関係を測定することができる。
【００４９】
尚、本発明の膜タンパク質機能測定方法は、前述の方法には限定されない。例えば、方法（Ｉ）においてイオンチャネル型膜タンパク質のみを用いてもよく、代謝型膜タンパク質のみを用いてもよい。また、方法（ＩＩ）、方法（ＩＩＩ）において、膜タンパク質としてイオンチャネル型膜タンパク質と代謝型膜タンパク質の両方を用いて測定してもよい。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例及び比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
本実施例における蛍光像の観察は、共焦点レーザースキャン顕微鏡（商品名：ＬＳＭ５１０、ツァイス製）を用いて行った。
【００５１】
［実験例１］
卵黄由来のフォスファチジルコリンをクロロホルムに溶解し、アルゴンガス雰囲気下で乾燥し、最終濃度１６０μｇ／ｍＬで緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解した。該緩衝液を超音波破砕機で処理し、脂質小胞を作製した。次いで、前記脂質小胞に、２０質量％のフルオレセインで蛍光標識した脂質（フルオレセイン結合ジヘキサデカノイルグリセロフォスフォエタノールアミン）を最終濃度４０μｇ／ｍＬとなるように加えて、さらに脂質小胞を作製することで、蛍光により観察可能な脂質二分子膜を作製した。該脂質小胞を含む緩衝液に蛍光色素（アレクサ６４７、最大励起波長６５０ｎｍ、最大蛍光波長６６８ｎｍ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ使用、最終濃度５００μＭ）を混合し、その状態で穴部（ナノウェル）を有する基板へのベシクルフュージョンを行った。その後、該基板の蛍光像を観察したところ、基板の穴部にてアレクサ６４７由来の蛍光が観察された（図９（ａ）、測定領域５００×５００μｍ）。基板上に配置した前記緩衝液を、脂質を含まない緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で１０回置換し、不要物を除去した。その後、該基板の蛍光像を観察したところ、脂質二分子膜が基板に接着している様子が観察され、脂質二分子膜で覆われた部分（図９（ｂ））の穴部にのみアレクサ６４７由来の蛍光が観察されたことから、該穴部は脂質二分子膜で充分に覆われて密閉されていることが分かった。
【００５２】
［実験例２］
ジパルミトイルフォスファチジルコリン、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフェート、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォチオエタノールを７５：２３：２の比率で混合し、２００μｇ／ｍＬの濃度で緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解して脂質小胞を作製した。該脂質小胞を含む緩衝液を、穴部（ナノウェル）を有する基板に滴下し、穴部を覆う脂質二分子膜を作製し、該脂質二分子膜をＡＦＭの深針により伸展し、ＡＦＭにより観察した（図１０）。図１０における秒数は、伸展の開始時を０秒とした観察経過時間を意味する。
穴部を覆う脂質二分子膜は、その高さ情報から、平らに形成されていることが分かった（図１０（ａ）、１５秒）。ＡＦＭの深針による機械刺激を次第に強くしていくと、穴部を覆った脂質二分子膜は該穴部の内部側へと押し伸ばされた（図１０（ａ）、１５秒〜２１５秒）。その後、機械刺激を弱くしていくと、押し伸ばされた脂質二分子膜は元のように平らになった（図１０（ａ）、２１５〜２５５秒）。このように、本条件では伸展刺激を与えている状態でも、脂質二分子膜が移動することなく基板に接着していることがわかった。
一方、平らに戻った脂質二分子膜に対し、さらに強く機械刺激を加えていくと、最後には穴部を覆っている脂質二分子膜が破れ（図１０（ｂ）、１１０秒）、穴部の左方向に向かって脂質二分子膜が引き剥がされた（図１０（ｂ）、１４０秒）。このとき、高さ情報から穴部では、脂質二分子膜が破れている状態であることがわかった。
【００５３】
［実施例１］
バクテリオロドプシン（ＢＲ）７５質量％および脂質二分子膜２５質量％の複合体膜（紫膜）を５μｇ／ｍＬの濃度で緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ＭＫＣｌ）に溶解し、マイカ基板上に滴下して、３０分間室温で静置した。その後、紫膜を含まない緩衝液で１０回置換し、マイカ基板に接着していない紫膜を洗い流した。マイカ基板に接着した紫膜は高さが均一な膜状の構造（図１１（ａ）、（ｂ））であり、拡大すると分子が規則的に並んでいる様子が観察された（図１１（ｃ））。この観察結果を、D. J. Muller等の研究結果（Journal of Molecular Biology (1999) 285, 1903-1909）と比較したところ、図１１（ｃ）における領域Ｘ内の分子は三量体のＢＲタンパク質であると考えられた。
一方、穴部を有する基板に、前記と同様に紫膜を接着させ、該穴部上にあるＢＲタンパク質の観察を行った（図１２、（ａ））。穴部を覆う紫膜は平らではなく撓んだ状態であった（図１２、（ｂ））。この状態でも、個々のＢＲタンパク質の三量体が観察できた（図１２（ｃ）、領域Ｙ）。この観察では、ＡＦＭの深針により脂質二分子膜を伸展する刺激によっては、ＢＲタンパク質の顕著な構造変化は観察されず、三量体構造が保たれていた。対照的に、三量体構造間の距離は大きく変化しており、脂質二分子膜内におけるＢＲタンパク質の局在は変化することが明らかとなった。
このように、本発明の測定方法により、脂質二分子膜を伸展した状態で、膜タンパク質の構造や、膜タンパク質同士の位置関係を観察することができた。
【００５４】
［実施例２］
卵黄由来フォスファチジルコリンを１６０μｇ／ｍＬの濃度で緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、穴部を有する基板上に滴下して、該穴部上に脂質二分子膜を作製し、該脂質二分子膜にＮＭＤＡ受容体を含むプロテオリポソームを融合して受容体を挿入した。穴部の内部には、カルシウム感受性蛍光色素であるｆｌｕｏ−４（１０μＭ）を加え、穴部の外部の緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）には２ｍＭＣａＣｌ２を加えた。脂質二分子膜を伸展（開始時を０秒）すると、観察領域の蛍光強度が増加した（図１３（ａ））。この時の基板の状態を蛍光観察すると、穴部において脂質二分子膜の伸展に伴った蛍光が観測された（図１３（ｂ））。この結果、ＮＭＤＡ受容体は脂質二分子膜の伸展により活性化し、穴部外部に存在するカルシウムイオンを穴部内部に透過したことが明らかとなった。
【００５５】
［実施例３］
穴部の内部および外部にそれぞれ電極を設けた以外は、実施例２と同様にして穴部にＮＭＤＡ受容体を含む脂質二分子膜を作製した。ＡＦＭの深針により該脂質二分子膜を伸展したところ、電極間の電流値が変化した（図１３（ｃ））。
脂質二分子膜には精製したＮＭＤＡ受容体を挿入していることから、この電流値の変化は脂質二分子膜の伸展によりＮＭＤＡ受容体が活性化したためであると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、脂質二分子膜の伸展に関係する膜タンパク質の機能を解析するための測定システムおよび測定方法として有用であり、例えば、心筋梗塞や高血圧など、体内における脂質二分子膜の伸展に関わる膜タンパク質のスクリーニングシステムとして好適に利用できる。
【符号の説明】
【００５７】
１、１Ａ〜１Ｅ、２ 膜タンパク質機能測定システム １０ 膜タンパク質機能測定用基板 １１ 穴部 １２ 基板本体 １３ 膜タンパク質 １３Ａ イオンチャネル型膜タンパク質 １３Ｂ 代謝型膜タンパク質 １４ 脂質二分子膜 １５ 緩衝液 １６ 第１の電極 １７ 第２の電極 ２０ 伸展手段 ３１ イオン ３２ イオン感受性蛍光色素 ３３ 核酸 ３４ 核酸結合性蛍光色素 ３５ リガンド分子 ３６ 細胞質抽出画分 ３７ カルシウムイオン感受性蛍光色素 ３８ イオン
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜タンパク質機能測定システムおよび膜タンパク質機能測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質をはじめとする生体分子の機能を理解する上で、その構造を知ることは不可欠である。生体分子が機能する際には、外界（細胞外）からの刺激に伴いその構造を変化させことでその機能を発揮する。
【０００３】
タンパク質、脂質、核酸などの生体分子の構造を生体内に近い条件で観察できる手法としては、水溶液中で観察が可能な走査プローブ顕微鏡、特に原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いる方法が広く用いられている。近年、ＡＦＭの技術は非常に進歩しており、生体分子の構造解析、および溶液中に添加した低分子化合物やペプチドの結合による生体分子の動的な構造変化の観察への更なる貢献が期待されている。
ＡＦＭを用いた測定装置及び測定方法としては、例えば、溶液中において分子レベルまたは原子レベルの分解能が達成された測定装置および測定方法（非特許文献１）や、ビデオレートでの観察を可能とする測定装置（非特許文献２）が挙げられる。
【０００４】
生体分子が外界から受ける刺激としては、一部の膜タンパク質では細胞膜の伸展が挙げられる。該膜タンパク質では、細胞膜の伸展によっても活性化され、リン酸化や、カルシウムイオンの透過などの生理活性を示すことが知られている（非特許文献３〜５）。これらの膜タンパク質以外にも、細胞膜の伸展によって活性化するタンパク質が存在する可能性がある。
また、一部の受容体に関しては、受容体密度と活性に相関があることが知られており（非特許文献６）。そのため、近傍の受容体同士の距離と、その機能との関係を詳細に分析し、その関係を明らかにすることも重要である。
しかし、細胞膜の伸展や、受容体同士の距離の変化によるタンパク質の活性化を詳細に評価する測定システムはなく、細胞膜の伸展により活性化する新たなタンパク質を探索することも、受容体同士の距離とその機能の関係を詳細に分析することも困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】T. Fukuma, M. J. Higgins, S. P. Jarvis, Direct imaging of lipid-ion network formation under physiological conditions by frequency modulation atomic force microscopy. Phys. Rev. Lett. 98 (2007) 10601-10603.
【非特許文献２】T. Ando, N. Kodera, E. Takai, D. Maruyama, K. Saito, A. Toda, A high-speed atomic force microscope for stdying biological macromolecules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (2001) 12468-12472.
【非特許文献３】A. Kloda, L. Kua, R. Hall, D. J. Adams, B. Martinac, Liposome reconstitution and modulation of recombinant N-methyl-D-aspartate receptor channels by membrane stretch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (2007) 1540-1545.
【非特許文献４】Y. Sawada, M. Tamada, B. J. Dubin-Thaler, O. Cherniavskaya, R. Sakai, S. Tanaka, M. P. Sheetz, Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas, Cell 127 (2006) 1015-1026.
【非特許文献５】K. Yamamoto, T. Sokabe, T. Matsumoto, K. Yoshimura, M. Shibata, N. Ohura, T. Fukuda, T. Sato, K. Sekine, S. Kato, M. Isshiki, T. Fujita, M. Kobayashi, K. Kawamura, H. Masuda, A. Kamiya, J. Ando, Impaired flow-dependent control of vascular tone and remodeling in P2X4-deficient mice, Nat Med. 12 (2006) 133-137.
【非特許文献６】Y. Fujiwara, Y. Kubo, Density dependent changes of the pore properties of P2X2 receptor channel, J. Physiol. 558 (2004) 31-43.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、微小孔上に展開した脂質二分子膜中に膜タンパク質を再構成した、該脂質二分子膜の伸展による膜タンパク質の活性化、および伸展による脂質二分子膜中の受容体の密度変化と活性の関係を測定できる膜タンパク質機能測定システム、ならびに膜タンパク質機能測定方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、前記課題を解決するために以下の構成を採用した。
［１］穴部を有する基板本体の、該穴部の開口が膜タンパク質を含む脂質二分子膜に覆われており、該脂質二分子膜上に緩衝液が配置された膜タンパク質機能測定用基板と、前記脂質二分子膜を伸展する伸展手段と、を具備する膜タンパク質機能測定システム。
［２］前記伸展手段が走査プローブ顕微鏡の深針である、前記［１］に記載の膜タンパク質機能測定システム。
［３］更に、前記脂質二分子膜の表面構造を観察する観察手段を具備する、前記［１］または［２］に記載の膜タンパク質機能測定システム。
［４］更に、前記基板における前記穴部の外部に設けられた第１の電極と、前記穴部の内部に設けられた第２の電極とを具備する、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システム。
［５］前記［１］〜［３］のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、前記穴部の内部に、膜タンパク質を透過するイオンに結合して蛍光を発するイオン感受性蛍光色素が配置され、かつ前記脂質二分子膜上に、膜タンパク質を透過するイオンを含む緩衝液が配置されており、前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、前記イオンチャネル型膜タンパク質のイオンの透過を蛍光強度の変化から測定し、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
［６］前記［１］〜［３］のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、前記穴部の内部に、核酸が配置され、かつ前記脂質二分子膜上に、核酸に結合して蛍光が増強する核酸結合性蛍光色素を含む緩衝液が配置されており、前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、前記イオンチャネル型膜タンパク質の前記核酸結合性蛍光色素の透過を蛍光強度の変化から測定し、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
［７］前記［１］〜［３］のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、前記穴部の内部に、蛍光標識した細胞外情報伝達物質が配置されており、前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、前記細胞外情報伝達物質の前記穴部の内部から外部への前記イオンチャネル型膜タンパク質を介した移動を蛍光強度の変化から測定し、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
［８］前記［１］〜［３］のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、前記膜タンパク質が代謝型膜タンパク質であり、前記穴部の内部に、細胞質抽出画分、および膜タンパク質を透過するカルシウムイオンに結合して蛍光を発するカルシウムイオン感受性蛍光色素が配置されており、前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、細胞内シグナル伝達系を介した小胞体からのカルシウムイオンの放出を蛍光強度の変化から測定し、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
［９］前記［４］に記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、前記脂質二分子膜上に、膜タンパク質を透過するイオンを含む緩衝液が配置されており、前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、前記第１の電極および第２の電極の間を流れる電流を測定して、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の膜タンパク質機能測定システムおよび膜タンパク質機能測定方法によれば、脂質二分子膜の伸展による膜タンパク質の活性化、および伸展による脂質二分子膜中の受容体の密度変化と活性の関係を測定できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の膜タンパク質機能測定システムの実施形態の一例を示した概略断面図である。
【図２】本発明の膜タンパク質機能測定システムの他の実施形態例を示した概略断面図である。
【図３】本発明の膜タンパク質機能測定方法の一工程を示した概略断面図である。
【図４】本発明の膜タンパク質機能測定方法の一工程を示した概略断面図である。
【図５】本発明の膜タンパク質機能測定方法の一工程を示した概略断面図である。
【図６】本発明の膜タンパク質機能測定方法の一工程を示した概略断面図である。
【図７】本発明の膜タンパク質機能測定方法の一工程を示した概略断面図である。
【図８】本発明の膜タンパク質機能測定方法の一工程を示した概略断面図である。
【図９】実験例１における基板の共焦点蛍光顕微鏡を用いた蛍光像である。
【図１０】実験例２における基板のＡＦＭ像である。
【図１１】実施例１における基板のＡＦＭ像（ａ）、ＡＦＭ像（ａ）中の破線部における脂質二分子膜の高さ情報を示したグラフ（ｂ）、およびＡＦＭ像（ａ）の拡大図（ｃ）である。
【図１２】実施例１における穴部を有する基板のＡＦＭ像（ａ）、ＡＦＭ像（ａ）中の破線部における脂質二分子膜の高さ情報を示したグラフ（ｂ）、およびＡＦＭ像（ａ）の拡大図（ｃ）である。
【図１３】実施例２における蛍光強度の変化を示したグラフ（ａ）および基板の共焦点蛍光顕微鏡を用いた蛍光像（ｂ）、ならびに実施例３における電流値の変化を示したグラフ（ｃ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜膜タンパク質機能測定システム＞
本発明の膜タンパク質機能測定システム１（以下、「システム１」という。）は、図１に示すように、膜タンパク質機能測定用基板１０Ａ（以下、「基板１０Ａ」という。）と、伸展手段２０と、を具備する。
基板１０Ａは、穴部１１を有する基板本体１２と、穴部１１の開口１１ａを覆う、膜タンパク質１３を含む脂質二分子膜１４と、脂質二分子膜１４上に配置された緩衝液１５とを有する。伸展手段２０は、脂質二分子膜１４を伸展する手段である。
【００１１】
基板１０Ａは、脂質二分子膜１４を伸展することによって活性化する膜タンパク質１３の構造変化、脂質二分子膜１４における局在の観測、蛍光強度の変化の測定による膜タンパク質１３の機能測定のための基板である。
基板１０Ａでは、穴部１１を覆う脂質二分子膜１４上に緩衝液１５が配置され、穴部１１の外部と穴部１１の内部が脂質二分子膜１４によって区切られている。
【００１２】
基板本体１２の表面は、平坦であることが好ましい。
基板本体１２の材質は、表面を平坦に加工できる材質が好ましく、例えば、マイカ、ガラス、シリコンなどが挙げられる。
基板本体１２の形状は特に限定されず、用途に応じた形状のものを使用することができ、例えば、平板状の基板が挙げられる。
基板本体１２の厚みは特に限定されず、０．１ｍｍ〜２ｍｍが好ましい。
【００１３】
基板本体１２は、穴部１１を有する。
基板本体１２における穴部１１の数は特に限定されず、１〜１０，０００個が好ましい。
穴部１１の形状は、開口１１ａに脂質二分子膜１４を安定に配置でき、必要に応じて蛍光顕微鏡による穴部１１の蛍光像の取得、ＡＦＭによる表面構造の観察等が可能な形状であればよい。穴部１１の形状としては、例えば、円筒状が挙げられる。
穴部１１は、凹状の穴であってもよく、貫通孔であってもよい。この例では、穴部１１は凹状の穴である。
【００１４】
開口１１ａの直径は、１０ｎｍ〜１０μｍが好ましい。開口１１ａの直径が１０ｎｍ以上であれば、ＡＦＭにより表面構造の観察等が容易になり、また膜タンパク質１３の機能測定が容易になる。開口１１ａの直径が１０μｍ以下であれば、脂質二分子膜１４をより安定に形成できる。
また、穴部１１の深さは、基板本体１２の厚みに応じて設定すればよく、５０ｎｍ〜２ｍｍが好ましい。
【００１５】
基板本体１２に穴部１１を形成する方法としては、例えば、フォトリソグラフィ法、ドライエッチング法等の微細加工技術が適用できる。また、プラスチックの基板本体１２であれば、加熱した注射針を刺すことにより形成してもよい。
【００１６】
膜タンパク質１３は、イオンチャネル型膜タンパク質もしくは代謝型膜タンパク質などが挙げられる。
イオンチャネル型膜タンパク質としては、例えばイオンチャネル型受容体が挙げられ、ＴＲＰ（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）チャネル（サブユニットはＴＲＰＶ１〜ＴＲＰＶ６、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＣ１〜ＴＲＰＣ７、ＴＲＰＭ１〜ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＭＬ１〜ＴＲＰＭＬ３、ＴＲＰＰ１〜ＴＲＰＰ５）、ＡＴＰ受容体（サブユニットはＰ２Ｘ１〜Ｐ２Ｘ７）、セトロニン受容体（サブユニットは５−ＨＴ３）、ＮＭＤＡ受容体（サブユニットはＮＲ１、ＮＲ２Ａ〜ＮＲ２Ｄ、ＮＲ３Ａ、ＮＲ３Ｂ）、ＡＭＰＡ受容体（サブユニットはＧｌｕＲ１〜ＧｌｕＲ４）、カイニン酸受容体（サブユニットはＧｌｕＲ５〜ＧｌｕＲ７、ＫＡ−１、ＫＡ−２）、ＧＡＢＡ受容体（サブユニットはα、β、γ）もしくはＧＡＢＡ受容体（サブタイプはＧＡＢＡＡ、ＧＡＢＡＣ）などが挙げられる。
代謝型膜タンパク質としては、例えばＧタンパク共役型受容体が挙げられ、アデノシン受容体（Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、Ａ３）、ＡＴＰ受容体（Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、Ｐ２Ｙ１１、Ｐ２Ｙ１２、Ｐ２Ｙ１３、Ｐ２Ｙ１４）、セロトニン受容体（サブユニットは５−ＨＴ１、５−ＨＴ２、５−ＨＴ４、５−ＨＴ６、５−ＨＴ７）、代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ１〜ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ５〜ｍＧｌｕＲ８）、アドレナリン受容体(α、β)、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ−１〜ＰＡＲ−４）、ブラジキニン受容体（Ｂ１、Ｂ２)、ＧＡＢＡＢ受容体、オピオイド受容体（ν受容体、δ受容体、κ受容体）などが挙げられる。
これら受容体は１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１７】
脂質二分子膜１４に膜タンパク質１３を再構成する方法は、公知の方法を用いることができ、例えば、ベシクルフュージョン法が挙げられる。
【００１８】
脂質二分子膜１４は、両親媒性分子であるリン脂質などの脂質分子が二層構造を形成した膜であり、生体膜の最も基本的な構造である。脂質分子は、疎水性部分と親水性部分を有し、疎水性部分同士が会合することにより安定な二分子膜構造を形成する。
脂質分子としては、常温で充分な流動性を持つものであればよく、各脂質の疎水部のアルキル鎖長、二重結合の部位と数は特に限定されない。
脂質分子としては、例えば、卵黄由来フォスファチジルコリン（ｅｇｇ−ｙｏｌｋ ＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（ＰＩＰ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴ脂質などが挙げられる。
これら脂質分子は、１種類のみを用いてもよく、２種類以上を用いてもよい。
【００１９】
脂質二分子膜１４の形成方法としては、例えば、ｎ−デカンなどの有機溶媒に溶解した脂質分子を用いる方法が挙げられる。まず、穴部１１に水溶液を配置し、その上部にｎ−デカンに溶解した脂質分子を配置する。これにより、ｎ−デカン中の脂質分子の親水部がｎ−デカンと穴部１１との界面に次第に集まり、均一な層を形成する。次いで、穴部１１のｎ−デカン上に緩衝液などの水溶液を配置する。これにより、ｎ−デカンと、該ｎ−デカンの上側（外部側）の水溶液との界面にも脂質分子の親水部が次第に集中してくる。ｎ−デカンは室温で揮発するため、最終的に穴部１１の開口１１ａを覆う均一な脂質二分子膜１４が形成される。
【００２０】
緩衝液１５は、充分な蛍光が検出でき、膜タンパク質１３の機能を阻害しないものであればよく、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどが挙げられる。
緩衝液１５の量は、脂質二分子膜１４を充分に覆う量であればよい。
【００２１】
伸展手段２０としては、脂質二分子膜１４に押し付けて部分的に機械的刺激を与え、脂質二分子膜１４を伸展できるものであればよく、ＡＦＭなどの走査プローブ顕微鏡の深針が好ましい。
【００２２】
また、システム１は、脂質二分子膜１４の表面構造を観察する観察手段を具備することが好ましい。
観察手段としては、例えば、ＡＦＭが挙げられる。また、膜タンパク質１３や脂質二分子膜１４を蛍光標識している場合であれば、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いることもできる。
【００２３】
また、穴部１１の開口１１ａが大きすぎることで、伸展しなくても脂質二分子膜１４が撓んで脂質二分子膜上の構造観察が困難となる場合は、穴部１１の開口１１ａを覆うように網目構造体を形成し、該網目構造体上に脂質二分子膜１４を形成するようにしてもよい。
網目構造体はナノ線状体からなる構造体であり、具体的には、ナノ線状体が多数の分岐を有して、網目を形成したものである。
ナノ線状体としては、例えば、ナノチューブ、ナノワイヤー、ナノファイバなどが挙げられ、その材質は特に制限はないが、ナノ線状体を容易に形成できる点では、カーボンが好ましい。
ここで、ナノ線状体とは、長さ方向に垂直な断面の直径が１〜２０ｎｍの線状体のことである。ナノ線状体の長さ方向に垂直な断面の直径が前記下限以上であれば、脂質二分子膜を充分に支持することができる。また、前記上限以下であれば、穴部１１の上に網目構造体が配置されても、観察目的の生体試料のＡＦＭ観察に支障をきたさない。
ナノ線状体としてカーボンナノチューブを用いる場合、その直径を前記範囲にするためには、後述する網目構造体の形成方法において、使用する金属触媒の種類、粒子径および密度や、形成時の温度を適宜選択すればよい。例えば、触媒の粒子径を大きくする程、直径は大きくなる。
【００２４】
網目構造体の形成方法としては、例えば、化学気相成長法（ＣＶＤ法）により形成する方法などが挙げられる。化学気相成長法を適用した場合の炭素源としては、例えば、メタン、エタン、アセチレン、メタノール、エタノールなどが挙げられる。
また、化学気相成長法により網目構造体を形成する場合には、ナノ線状体を容易に形成できることから、鉄などの金属触媒を用いることが好ましい。また、基板本体１２の表面にナノ線状体を形成するためには、金属触媒を基板本体１２の表面にあらかじめ付着させておくことが好ましい。
【００２５】
また、本発明の膜タンパク質機能測定システムの他の実施形態を図２に示す。
膜タンパク質機能測定システム２（以下、「システム２」という。）は、図２に示すように、膜タンパク質機能測定用基板１０Ｂ（以下、「基板１０Ｂ」という。）と、伸展手段２０と、を具備する。システム２においてシステム１と同じ部分には同じ符号を付して説明を省略する。
基板１０Ｂは、穴部１１を有する基板本体１２と、穴部１１の開口１１ａを覆う、膜タンパク質１３を含む脂質二分子膜１４と、脂質二分子膜１４上に配置された緩衝液１５と、穴部１１の外部に設けられ、緩衝液１５と接触する第１の電極１６と、穴部１１の内部に設けられた第２の電極１７とを有する。伸展手段２０は、脂質二分子膜１４を伸展する手段である。
【００２６】
第１の電極１６および第２の電極１７は、穴部１１の外部および内部においてそれぞれ緩衝液に接触するように設けられる。第１の電極１６および第２の電極１７は、それぞれ図示しない電流計に接続され、それら電極間に流れる電流を測定できるようになっている。
第２の電極１７は、穴部１１の底部に設けられることが好ましい。
電極の材質としては、例えば、銅、アルミニウム、金、銀、塩化銀、白金、クロム、ニッケルなどの金属、および導電性樹脂などの導電性物質が挙げられる。
電極の厚みは５０〜５００ｎｍであることが好ましい。
【００２７】
システム２には、システム１と同様に、ＡＦＭ、共焦点レーザースキャン顕微鏡などの、脂質二分子膜１４の表面構造を観察する観察手段を具備することが好ましい。また、穴部１１の開口１１ａを覆うように網目構造体を形成し、該網目構造体上に脂質二分子膜１４を形成するようにしてもよい。
【００２８】
＜膜タンパク質機能測定方法＞
本発明の膜タンパク質機能測定方法は、脂質二分子膜を伸展したときの膜タンパク質の機能、該膜タンパク質（受容体）の脂質二分子膜中での局在を測定する方法であって、前述の本発明の膜タンパク質機能測定システムを用いる方法である。
本発明の膜タンパク質機能測定方法は、機能の測定手段によって、下記方法（Ｉ）、方法（ＩＩ）または方法（ＩＩＩ）が挙げられる。
（Ｉ）ＡＦＭなどの観察手段により脂質二分子膜の表面構造を測定する場合。
（ＩＩ）膜タンパク質の機能を蛍光強度の変化により光学的に測定する場合。
（ＩＩＩ）膜タンパク質の機能を電流値の変化により電気的に測定する場合。
【００２９】
また、方法（ＩＩ）は、測定に用いる膜タンパク質と蛍光物質の種類により下記方法（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−４）が挙げられる。
（ＩＩ−１）膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、蛍光物質としてイオン感受性蛍光色素を用いる場合。
（ＩＩ−２）膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、蛍光物質として核酸結合性蛍光色素を用いる場合。
（ＩＩ−３）膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、蛍光物質として蛍光標識した細胞外情報伝達物質を用いる場合。
（ＩＩ−４）膜タンパク質が代謝型膜タンパク質であり、蛍光物質としてイオン感受性蛍光色素を用いる場合。
【００３０】
方法（Ｉ）：
システム１における膜タンパク質１３としてイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａと代謝型膜タンパク質１３Ｂを用いたシステム１Ａを用い、図３に示すように、ＡＦＭ探針などの伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展し、同時に、図示しない観察手段によりイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａおよび代謝型膜タンパク質１３Ｂを有する脂質二分子膜１４の表面構造を観察する。脂質二分子膜１４はＡＦＭの探針などの伸展手段２０で伸展する。
これにより、脂質二分子膜１４の伸展によるイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａと代謝型膜タンパク質１３Ｂの構造変化を調べることができる。同様に、脂質二分子膜１４の伸展による、イオンチャネル型膜タンパク質１３Ａと代謝型膜タンパク質１３Ｂの脂質二分子膜１４内の局在の変化を観察することができる。
【００３１】
方法（ＩＩ−１）：
システム１において、膜タンパク質１３がイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａであり、穴部１１の内部に、膜タンパク質１３を透過するイオン３１に結合して蛍光を発するイオン感受性蛍光色素３２が配置され、かつ脂質二分子膜１４上に、膜タンパク質１３を透過するイオン３１を含む緩衝液１５が配置されたシステム１Ｂを用い、図４に示すように、伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展し、イオンチャネル型膜タンパク質１３Ａのイオン３１の透過を蛍光強度の変化から測定する。
【００３２】
伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展すると、その刺激に伴ってイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの構造が変化し、膜貫通部分のイオンチャネルが開いて穴部１１にイオン３１が流入する。そして、穴部１１に流入したイオン３１とイオン感受性蛍光色素３２が結合して蛍光を発することで、脂質二分子膜１４の伸展によるイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの活性の変化を測定できる。
イオン感受性蛍光色素３２は、緩衝液に含有させて穴部１１の内部に配置する。緩衝液は、充分な蛍光が検出でき、イオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの機能を阻害しないものであればよく、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどが挙げられる。
【００３３】
イオン３１としては、例えば、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、塩化物イオン、カリウムイオンが挙げられる。
緩衝液１５中のイオン３１の濃度は、測定に応じて適宜決定すればよく、１ｎＭ〜５００ｍＭが好ましく、１０μＭ〜１５０ｍＭがより好ましい。
【００３４】
イオン感受性蛍光色素３２は、イオン３１と結合することにより蛍光を発する物質であり、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）と結合して蛍光を発するできるｆｕｒａ−２、ｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）と結合して蛍光を発するＳＢＦＩ、ＣｏｒｏＮａ、カリウムイオン（Ｋ＋）と結合して蛍光を発するＰＢＦＩ、塩化物イオン（Ｃｌ−）と結合して蛍光を発するＭＱＡＥなどが挙げられる。
穴部１１の内部におけるイオン感受性蛍光色素３２の濃度は、蛍光強度の変化によりイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの活性を測定できるのに充分な量であればよく、１００ｎＭ〜５００μＭが好ましく、１μＭ〜１００μＭがより好ましい
【００３５】
方法（ＩＩ−２）：
システム１において、膜タンパク質１３がイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａであり、穴部１１の内部に核酸３３が配置され、かつ脂質二分子膜１４上に、核酸３３に結合して蛍光が増強する核酸結合性蛍光色素３４を含む緩衝液１５が配置されたシステム１Ｃを用い、図５に示すように、伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展して、イオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの核酸結合性蛍光色素３４の透過を蛍光強度の変化から測定する。
【００３６】
伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展すると、その刺激に伴ってイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの構造が変化し、チャネルポアサイズが変化して、核酸結合性蛍光色素３４がイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａを介して穴部１１の内部に流入する。そして、穴部１１に流入した核酸結合性蛍光色素３４と核酸３３が結合して蛍光を発することで、脂質二分子膜１４の伸展によるイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの活性の変化を測定できる。
核酸３３は、緩衝液に含有させて穴部１１の内部に配置する。緩衝液は、充分な蛍光が検出でき、イオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの機能を阻害しないものであればよく、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどが挙げられる。
【００３７】
核酸３３としては、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。核酸は、人工的に合成したものであっても、細胞から抽出したものであってもよい。また、核酸３３の塩基対数は、蛍光強度の変化を定量的に測定することができれば特に限定されない。
穴部１１の内部における核酸３３の濃度は、核酸の種類、長さによっても異なるが、１ｎｇ／μＬ〜５００μｇ／μＬが好ましく、１〜１００μｇ／μＬがより好ましい。
【００３８】
核酸結合性蛍光色素３４としては、例えば、臭化エチジウム、プロピディウムイオダイドなどが挙げられる。
穴部１１の内部における核酸結合性蛍光色素３４の濃度は、蛍光強度の変化によりイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの活性を測定できるのに充分な量であればよく、１００ｎＭ〜５００μＭが好ましく、１μＭ〜１００μＭがより好ましい
【００３９】
方法（ＩＩ−３）：
システム１において、膜タンパク質１３がイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａであり、穴部１１の内部に、蛍光標識した細胞外情報伝達物質３５（以下、「リガンド分子３５」という。）が配置されたシステム１Ｄを用い、図６に示すように、伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展して、リガンド分子３５の穴部１１の内部から外部へのイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａを介した移動を蛍光強度の変化から測定する。
【００４０】
伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展すると、その刺激に伴ってイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａが活性化して構造が変化し、リガンド分子３５がイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａを介して穴部１１の内部から外部に流出し、穴部１１の内部において蛍光強度が小さくなる。そのため、穴部１１の内部においてリガンド分子３５による蛍光強度の変化を測定することで、脂質二分子膜１４の伸展によるイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの活性の変化を測定できる。
リガンド分子３５は、緩衝液に含有させて穴部１１の内部に配置する。緩衝液は、充分な蛍光が検出でき、イオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの機能を阻害しないものであればよく、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどが挙げられる。
【００４１】
リガンド分子３５は、細胞外情報伝達物質に蛍光物質が結合した化合物である。
細胞外情報伝達物質は、細胞間での情報伝達に用いられる物質であり、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グルタミン酸が挙げられる。
前記細胞外情報伝達物質に結合する蛍光物質としては、ＮＢＤ（ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｆｕｒａｚａｎ）、ＴｅｘａｓＲｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｃｙ ｄｙｅが好ましい。
リガンド分子３５の具体例としては、例えば、ＡＴＰ−ＦＩＴＣ、ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ＦＩＴＣが挙げられる。細胞外情報伝達物質にＦＩＴＣを結合させる方法は、公知の方法を用いることができる。
リガンド分子３５の濃度は、測定の目的に応じて適宜決定すればよく、１ｎＭ〜１０ｍＭが好ましく、１０ｎＭ〜１００μＭがより好ましい。
【００４２】
方法（ＩＩ−４）：
システム１において、膜タンパク質１３が代謝型膜タンパク質１３Ｂであり、穴部１１の内部に、細胞質抽出画分３６、およびカルシウムイオンに結合して蛍光を発するカルシウムイオン感受性蛍光色素３７が配置されたシステム１Ｅを用い、図７に示すように、伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展して、細胞内シグナル伝達系を介した小胞体からのカルシウムイオンの放出を蛍光強度の変化から測定する。
【００４３】
伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展すると、代謝型膜タンパク質１３Ｂが活性化する。そして、穴部１１の内部に存在する、代謝型膜タンパク質１３Ｂと会合していたグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）結合型Ｇタンパク質がグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）結合型Ｇタンパク質と置き換わることで、そのシグナル伝達経路の下流にあるホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を活性化する。ＰＬＣは、脂質二分子膜のホスファチジルイノシトールの１種であるＰＩ（４，５）Ｐ２を代謝してイノシトール三リン酸（ＩＰ３）を産生する。ＩＰ３は、小胞体のＩＰ３受容体に結合することでその構造を変化させ、小胞体内に存在するカルシウムイオンを細胞質（本方法（ＩＩ−４）では穴部１１）へ放出させる。放出されたカルシウムイオンは、カルシウムイオン感受性蛍光色素３７と結合し、蛍光強度を増加させる。このように、これら一連の反応を介して、脂質二分子膜１４の伸展により活性化した代謝型膜タンパク質１３Ｂの活性を測定することができる。
【００４４】
細胞質抽出物３６は、Ｇタンパク質共役型受容体を発現する細胞や組織から公知の方法により調製できる。
例えば、細胞の場合は、下記の方法が挙げられる。培養ディッシュ（直径１０ｃｍ）に播種した細胞を細胞間の隙間がなくなるまで培養する。次いで、細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３度洗浄し、セルスクレーバーで細胞を掻き取り、１．５ｍｌセーフロックチューブに入れ、５０００ｒｐｍ（４℃）で遠心して細胞を回収する。次いで、得られた細胞のペレットに純水５０μＬを加え、１０分間氷上にて静置し、低浸透圧刺激により細胞膜を破壊する。その後、ペレットを吸い込まないように上清をとり、プロテアーゼ阻害剤を加えて細胞質抽出画分３６とする。
【００４５】
カルシウムイオン感受性蛍光色素３７としては、例えば、ｆｕｒａ−２、ｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４などが挙げられる。
穴部１１の内部におけるカルシウムイオン感受性蛍光色素３７の濃度は、蛍光強度の変化によりＧタンパク質共役型受容体の活性を測定できる量であればよく、１００ｎＭ〜５００μＭが好ましく、１μＭ〜１００μＭがより好ましい。
【００４６】
方法（ＩＩＩ）：
システム２において、膜タンパク質１３がイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａであり、脂質二分子膜１４上に、膜タンパク質を透過するイオン３８を含む緩衝液１５が配置されており、図８に示すように、伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展して、第１の電極１６および第２の電極１７間の電流を測定する。
伸展手段２０により脂質二分子膜１４を伸展すると、その刺激に伴ってイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの構造が変化し、膜貫通部分のイオンチャネルが開いて穴部１１にイオン３８が流入する。このイオン３８の流入により、第１の電極１６および第２の電極１７間で電流が検出されるので、脂質二分子膜１４の伸展によるイオンチャネル型膜タンパク質１３Ａの活性の変化を測定できる。
【００４７】
イオン３８は、方法（ＩＩ−１）で挙げたイオン３１と同じものが使用できる。
緩衝液１５中のイオン３８の濃度は、電流が充分に検出できる量であればよく、１ｎＭ〜５００ｍＭが好ましく、１０μＭ〜１５０ｍＭがより好ましい。
穴部１１の内部には、緩衝液を配置しておく。穴部１１の内部に配置する緩衝液は、脂質二分子膜１４上に配置する緩衝液１５と同じ緩衝液であることが好ましい。
【００４８】
以上説明した本発明の膜タンパク質機能測定システムおよび膜タンパク質機能測定方法によれば、膜タンパク質機能測定基板の穴部上に設けた脂質二分子膜を伸展したときの膜タンパク質の活性の変化を測定することができる。また、方法（Ｉ）と、方法（ＩＩ）または方法（ＩＩＩ）との併用、すなわち、ＡＦＭなどの観察手段と、光学的もしくは電気的な活性の測定を併用することにより、脂質二分子膜を伸展したときの該脂質二分子膜中の受容体の密度変化と活性の関係を測定することができる。
【００４９】
尚、本発明の膜タンパク質機能測定方法は、前述の方法には限定されない。例えば、方法（Ｉ）においてイオンチャネル型膜タンパク質のみを用いてもよく、代謝型膜タンパク質のみを用いてもよい。また、方法（ＩＩ）、方法（ＩＩＩ）において、膜タンパク質としてイオンチャネル型膜タンパク質と代謝型膜タンパク質の両方を用いて測定してもよい。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例及び比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
本実施例における蛍光像の観察は、共焦点レーザースキャン顕微鏡（商品名：ＬＳＭ５１０、ツァイス製）を用いて行った。
【００５１】
［実験例１］
卵黄由来のフォスファチジルコリンをクロロホルムに溶解し、アルゴンガス雰囲気下で乾燥し、最終濃度１６０μｇ／ｍＬで緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解した。該緩衝液を超音波破砕機で処理し、脂質小胞を作製した。次いで、前記脂質小胞に、２０質量％のフルオレセインで蛍光標識した脂質（フルオレセイン結合ジヘキサデカノイルグリセロフォスフォエタノールアミン）を最終濃度４０μｇ／ｍＬとなるように加えて、さらに脂質小胞を作製することで、蛍光により観察可能な脂質二分子膜を作製した。該脂質小胞を含む緩衝液に蛍光色素（アレクサ６４７、最大励起波長６５０ｎｍ、最大蛍光波長６６８ｎｍ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ使用、最終濃度５００μＭ）を混合し、その状態で穴部（ナノウェル）を有する基板へのベシクルフュージョンを行った。その後、該基板の蛍光像を観察したところ、基板の穴部にてアレクサ６４７由来の蛍光が観察された（図９（ａ）、測定領域５００×５００μｍ）。基板上に配置した前記緩衝液を、脂質を含まない緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で１０回置換し、不要物を除去した。その後、該基板の蛍光像を観察したところ、脂質二分子膜が基板に接着している様子が観察され、脂質二分子膜で覆われた部分（図９（ｂ））の穴部にのみアレクサ６４７由来の蛍光が観察されたことから、該穴部は脂質二分子膜で充分に覆われて密閉されていることが分かった。
【００５２】
［実験例２］
ジパルミトイルフォスファチジルコリン、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフェート、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォチオエタノールを７５：２３：２の比率で混合し、２００μｇ／ｍＬの濃度で緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解して脂質小胞を作製した。該脂質小胞を含む緩衝液を、穴部（ナノウェル）を有する基板に滴下し、穴部を覆う脂質二分子膜を作製し、該脂質二分子膜をＡＦＭの深針により伸展し、ＡＦＭにより観察した（図１０）。図１０における秒数は、伸展の開始時を０秒とした観察経過時間を意味する。
穴部を覆う脂質二分子膜は、その高さ情報から、平らに形成されていることが分かった（図１０（ａ）、１５秒）。ＡＦＭの深針による機械刺激を次第に強くしていくと、穴部を覆った脂質二分子膜は該穴部の内部側へと押し伸ばされた（図１０（ａ）、１５秒〜２１５秒）。その後、機械刺激を弱くしていくと、押し伸ばされた脂質二分子膜は元のように平らになった（図１０（ａ）、２１５〜２５５秒）。このように、本条件では伸展刺激を与えている状態でも、脂質二分子膜が移動することなく基板に接着していることがわかった。
一方、平らに戻った脂質二分子膜に対し、さらに強く機械刺激を加えていくと、最後には穴部を覆っている脂質二分子膜が破れ（図１０（ｂ）、１１０秒）、穴部の左方向に向かって脂質二分子膜が引き剥がされた（図１０（ｂ）、１４０秒）。このとき、高さ情報から穴部では、脂質二分子膜が破れている状態であることがわかった。
【００５３】
［実施例１］
バクテリオロドプシン（ＢＲ）７５質量％および脂質二分子膜２５質量％の複合体膜（紫膜）を５μｇ／ｍＬの濃度で緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ＭＫＣｌ）に溶解し、マイカ基板上に滴下して、３０分間室温で静置した。その後、紫膜を含まない緩衝液で１０回置換し、マイカ基板に接着していない紫膜を洗い流した。マイカ基板に接着した紫膜は高さが均一な膜状の構造（図１１（ａ）、（ｂ））であり、拡大すると分子が規則的に並んでいる様子が観察された（図１１（ｃ））。この観察結果を、D. J. Muller等の研究結果（Journal of Molecular Biology (1999) 285, 1903-1909）と比較したところ、図１１（ｃ）における領域Ｘ内の分子は三量体のＢＲタンパク質であると考えられた。
一方、穴部を有する基板に、前記と同様に紫膜を接着させ、該穴部上にあるＢＲタンパク質の観察を行った（図１２、（ａ））。穴部を覆う紫膜は平らではなく撓んだ状態であった（図１２、（ｂ））。この状態でも、個々のＢＲタンパク質の三量体が観察できた（図１２（ｃ）、領域Ｙ）。この観察では、ＡＦＭの深針により脂質二分子膜を伸展する刺激によっては、ＢＲタンパク質の顕著な構造変化は観察されず、三量体構造が保たれていた。対照的に、三量体構造間の距離は大きく変化しており、脂質二分子膜内におけるＢＲタンパク質の局在は変化することが明らかとなった。
このように、本発明の測定方法により、脂質二分子膜を伸展した状態で、膜タンパク質の構造や、膜タンパク質同士の位置関係を観察することができた。
【００５４】
［実施例２］
卵黄由来フォスファチジルコリンを１６０μｇ／ｍＬの濃度で緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、穴部を有する基板上に滴下して、該穴部上に脂質二分子膜を作製し、該脂質二分子膜にＮＭＤＡ受容体を含むプロテオリポソームを融合して受容体を挿入した。穴部の内部には、カルシウム感受性蛍光色素であるｆｌｕｏ−４（１０μＭ）を加え、穴部の外部の緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）には２ｍＭＣａＣｌ２を加えた。脂質二分子膜を伸展（開始時を０秒）すると、観察領域の蛍光強度が増加した（図１３（ａ））。この時の基板の状態を蛍光観察すると、穴部において脂質二分子膜の伸展に伴った蛍光が観測された（図１３（ｂ））。この結果、ＮＭＤＡ受容体は脂質二分子膜の伸展により活性化し、穴部外部に存在するカルシウムイオンを穴部内部に透過したことが明らかとなった。
【００５５】
［実施例３］
穴部の内部および外部にそれぞれ電極を設けた以外は、実施例２と同様にして穴部にＮＭＤＡ受容体を含む脂質二分子膜を作製した。ＡＦＭの深針により該脂質二分子膜を伸展したところ、電極間の電流値が変化した（図１３（ｃ））。
脂質二分子膜には精製したＮＭＤＡ受容体を挿入していることから、この電流値の変化は脂質二分子膜の伸展によりＮＭＤＡ受容体が活性化したためであると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、脂質二分子膜の伸展に関係する膜タンパク質の機能を解析するための測定システムおよび測定方法として有用であり、例えば、心筋梗塞や高血圧など、体内における脂質二分子膜の伸展に関わる膜タンパク質のスクリーニングシステムとして好適に利用できる。
【符号の説明】
【００５７】
１、１Ａ〜１Ｅ、２ 膜タンパク質機能測定システム １０ 膜タンパク質機能測定用基板 １１ 穴部 １２ 基板本体 １３ 膜タンパク質 １３Ａ イオンチャネル型膜タンパク質 １３Ｂ 代謝型膜タンパク質 １４ 脂質二分子膜 １５ 緩衝液 １６ 第１の電極 １７ 第２の電極 ２０ 伸展手段 ３１ イオン ３２ イオン感受性蛍光色素 ３３ 核酸 ３４ 核酸結合性蛍光色素 ３５ リガンド分子 ３６ 細胞質抽出画分 ３７ カルシウムイオン感受性蛍光色素 ３８ イオン
【特許請求の範囲】
【請求項１】
穴部を有する基板本体の、該穴部の開口が膜タンパク質を含む脂質二分子膜に覆われており、該脂質二分子膜上に緩衝液が配置された膜タンパク質機能測定用基板と、
前記脂質二分子膜を伸展する伸展手段と、
を具備する膜タンパク質機能測定システム。
【請求項２】
前記伸展手段が走査プローブ顕微鏡の深針である、請求項１に記載の膜タンパク質機能測定システム。
【請求項３】
更に、前記脂質二分子膜の表面構造を観察する観察手段を具備する、請求項１または２に記載の膜タンパク質機能測定システム。
【請求項４】
更に、前記基板における前記穴部の外部に設けられた第１の電極と、前記穴部の内部に設けられた第２の電極とを具備する、請求項１〜３のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システム。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、
前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、
前記穴部の内部に、膜タンパク質を透過するイオンに結合して蛍光を発するイオン感受性蛍光色素が配置され、かつ前記脂質二分子膜上に、膜タンパク質を透過するイオンを含む緩衝液が配置されており、
前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、前記イオンチャネル型膜タンパク質のイオンの透過を蛍光強度の変化から測定し、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、
前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、
前記穴部の内部に、核酸が配置され、かつ前記脂質二分子膜上に、核酸に結合して蛍光が増強する核酸結合性蛍光色素を含む緩衝液が配置されており、
前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、前記イオンチャネル型膜タンパク質の前記核酸結合性蛍光色素の透過を蛍光強度の変化から測定し、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、
前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、
前記穴部の内部に、蛍光標識した細胞外情報伝達物質が配置されており、
前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、前記細胞外情報伝達物質の前記穴部の内部から外部への前記イオンチャネル型膜タンパク質を介した移動を蛍光強度の変化から測定し、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、
前記膜タンパク質が代謝型膜タンパク質であり、
前記穴部の内部に、細胞質抽出画分、およびカルシウムイオンに結合して蛍光を発するカルシウムイオン感受性蛍光色素が配置されており、
前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、細胞内シグナル伝達系を介した小胞体からのカルシウムイオンの放出を蛍光強度の変化から測定し、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
【請求項９】
請求項４に記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、
前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、
前記脂質二分子膜上に、膜タンパク質を透過するイオンを含む緩衝液が配置されており、
前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、前記第１の電極および第２の電極の間を流れる電流を測定して、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
【請求項１】
穴部を有する基板本体の、該穴部の開口が膜タンパク質を含む脂質二分子膜に覆われており、該脂質二分子膜上に緩衝液が配置された膜タンパク質機能測定用基板と、
前記脂質二分子膜を伸展する伸展手段と、
を具備する膜タンパク質機能測定システム。
【請求項２】
前記伸展手段が走査プローブ顕微鏡の深針である、請求項１に記載の膜タンパク質機能測定システム。
【請求項３】
更に、前記脂質二分子膜の表面構造を観察する観察手段を具備する、請求項１または２に記載の膜タンパク質機能測定システム。
【請求項４】
更に、前記基板における前記穴部の外部に設けられた第１の電極と、前記穴部の内部に設けられた第２の電極とを具備する、請求項１〜３のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システム。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、
前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、
前記穴部の内部に、膜タンパク質を透過するイオンに結合して蛍光を発するイオン感受性蛍光色素が配置され、かつ前記脂質二分子膜上に、膜タンパク質を透過するイオンを含む緩衝液が配置されており、
前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、前記イオンチャネル型膜タンパク質のイオンの透過を蛍光強度の変化から測定し、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、
前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、
前記穴部の内部に、核酸が配置され、かつ前記脂質二分子膜上に、核酸に結合して蛍光が増強する核酸結合性蛍光色素を含む緩衝液が配置されており、
前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、前記イオンチャネル型膜タンパク質の前記核酸結合性蛍光色素の透過を蛍光強度の変化から測定し、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、
前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、
前記穴部の内部に、蛍光標識した細胞外情報伝達物質が配置されており、
前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、前記細胞外情報伝達物質の前記穴部の内部から外部への前記イオンチャネル型膜タンパク質を介した移動を蛍光強度の変化から測定し、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、
前記膜タンパク質が代謝型膜タンパク質であり、
前記穴部の内部に、細胞質抽出画分、およびカルシウムイオンに結合して蛍光を発するカルシウムイオン感受性蛍光色素が配置されており、
前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、細胞内シグナル伝達系を介した小胞体からのカルシウムイオンの放出を蛍光強度の変化から測定し、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
【請求項９】
請求項４に記載の膜タンパク質機能測定システムを用いた膜タンパク質の機能の測定方法であって、
前記膜タンパク質がイオンチャネル型膜タンパク質であり、
前記脂質二分子膜上に、膜タンパク質を透過するイオンを含む緩衝液が配置されており、
前記伸展手段により前記脂質二分子膜を伸展して、前記第１の電極および第２の電極の間を流れる電流を測定して、膜タンパク質の機能を測定する膜タンパク質機能測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１１−２２０７６（Ｐ２０１１−２２０７６Ａ）
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１６９０７９（Ｐ２００９−１６９０７９）
【出願日】平成２１年７月１７日（２００９．７．１７）
【出願人】（０００００４２２６）日本電信電話株式会社 (13,992)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１７日（２００９．７．１７）
【出願人】（０００００４２２６）日本電信電話株式会社 (13,992)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]