臓器の保存方法および細胞の分離方法
【課題】膵臓等の所定の臓器から生きた状態の膵島等の細胞をより高い確率で分離して取り出すことが可能となる臓器の保存方法を提供すること。
【解決手段】膵臓１内の細胞を酸素化するための保存液を膵臓１の膵管１ａに注入する工程を備える臓器の保存方法によって膵臓１を保存する。この保存方法では、摘出してから所定時間経過した後であっても、膵臓１内の細胞の酸素分圧の低下を抑制することが可能になり、膵臓１から生きた状態の膵島をより高い確率で分離して取り出すことが可能になる。
【解決手段】膵臓１内の細胞を酸素化するための保存液を膵臓１の膵管１ａに注入する工程を備える臓器の保存方法によって膵臓１を保存する。この保存方法では、摘出してから所定時間経過した後であっても、膵臓１内の細胞の酸素分圧の低下を抑制することが可能になり、膵臓１から生きた状態の膵島をより高い確率で分離して取り出すことが可能になる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人体内から取り出された所定の臓器を保存するための臓器の保存方法およびこの臓器の保存方法で保存された臓器から所定の細胞を分離して取り出すための細胞の分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓からのインシュリン分泌がなくなってしまうインシュリン依存糖尿病（１型糖尿病）に対する治療法として、糖尿病患者に対して膵臓を移植する膵臓移植が行われている。この膵臓移植は大規模な手術であり、患者の体の負担が大きい。そこで、患者の体の負担を軽減するための治療法として、膵臓に含まれる膵島を取り出してこの膵島を糖尿病患者に移植する膵島移植が行われている（たとえば、非特許文献１参照）。
【０００３】
膵臓から膵島を分離して取り出すためには、まず、心臓死あるいは脳死の患者から膵臓を摘出し、膵島の分離が行われる所定の場所まで摘出された膵臓を運搬する必要がある。摘出後、運搬等の際に膵臓を保存するための方法として、従来から、フッ素系樹脂であるパーフロロカーボン（ＰＦＣ）を分散させたフッ素樹脂分散液であるＰＦＣ溶液と、ＵＷ液（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）との２層の液体からなる保存液に膵臓を浸す方法が提案されている。
【０００４】
【非特許文献１】後藤昌史、外４名、「ヨーロッパにおける膵島移植」、今日の移植、株式会社日本医学館、２００５年６月、Ｖｏｌ．１８、Ｎｏ．４、Ｐ４０１−４０８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＰＦＣ溶液とＵＷ液とからなる保存液に浸した状態で膵臓を保存した後に、膵臓から膵島を分離した場合、多くの膵島細胞が死んでしまい、膵島移植を行っても、移植の効果が少ないことが本願発明者あるいは他の研究者の研究により明らかになってきている。
【０００６】
そこで、本発明の課題は、膵臓等の所定の臓器から生きた状態の膵島等の細胞をより高い確率で分離して取り出すことが可能となる臓器の保存方法およびこの臓器の保存方法で保存された臓器から所定の細胞を分離して取り出すための細胞の分離方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するため、本願発明者は種々の検討を行った。その結果、所定の臓器内の細胞を酸素化するための保存液を所定の管内に注入して臓器を保存することで、臓器から細胞を分離する際に、生きた状態の細胞をより高い確率で分離して取り出すことが可能であることを知見するに至った。
【０００８】
本発明はかかる新たな知見に基づくものであり、本発明は、体内から取り出された臓器を保存する臓器の保存方法において、臓器は膵臓であり、膵臓内の細胞を酸素化するための保存液を膵臓の膵管に注入する工程を備えることを特徴とする。
【０００９】
また、上述の新たな知見に基づいて、本発明は、体内から取り出された臓器を保存する臓器の保存方法において、臓器は肝臓であり、肝臓内の細胞を酸素化するための保存液を肝臓の肝管に注入する工程を備えることを特徴とする。
【００１０】
本発明の臓器の保存方法では、膵臓の膵管あるいは肝臓の肝管に、内部の細胞を酸素化するための保存液を注入している。そのため、摘出してから所定時間経過した後であっても、膵臓あるいは肝臓内の表面細胞だけでなく全細胞の酸素分圧の低下を抑制することが可能になる。その結果、膵臓等の所定の臓器から細胞を分離する際に、生きた状態の細胞をより高い確率で分離して取り出すことが可能となる。
【００１１】
本発明において、保存液には、人工酸素運搬体が含まれていることが好ましい。このように構成すると、保存液内の酸素濃度を比較的短時間でかつ容易に上げることが可能になる。
【００１２】
本発明の臓器の保存方法は、この臓器の保存方法で臓器を保存する臓器保存工程と、臓器保存工程後に、臓器内の所定の細胞を臓器から分離して取り出す細胞分離工程とを備える細胞の分離方法に用いることができる。この細胞の分離方法では、細胞分離工程において、臓器を収納する臓器収納容器が配置される循環路内で、臓器を分解するための消化酵素入りの輸液を循環させるとともに、臓器収納容器を通過した輸液の溶存酸素量を増加させながら臓器を分解することが好ましい。このように構成すると、所定の臓器から細胞を分離する際に、生きた状態の細胞をさらに高い確率で分離して取り出すことが可能となる。また、保存液に人工酸素運搬体が含まれている場合には、消化酵素入りの輸液を循環させて臓器を分解する際に、人工酸素運搬体が輸液の中に混ざる。そのため、分離される細胞に対してより効果的に酸素を提供することが可能になる。
【発明の効果】
【００１３】
以上のように、本発明にかかる臓器の保存方法および細胞の分離方法では、所定の臓器から生きた状態の細胞をより高い確率で分離して取り出すことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
【００１５】
（膵島の分離方法）
図１は、本発明の実施の形態にかかる膵島の分離方法を説明するための図である。
【００１６】
本形態では、臓器としての膵臓１（図２参照）から所定の細胞としての膵島が分離されて取り出される。すなわち、本形態の細胞の分離方法は、膵島の分離方法である。
【００１７】
膵臓１からの膵島の分離は、図１に示す手順で行われる。すなわち、まず、心臓死または脳死の患者の体内から膵臓１を摘出し、膵島の分離が行われる所定の場所まで摘出された膵臓１を運搬する。その後、膵管に逆行性に、たとえばコラゲナーゼ等の消化酵素（具体的には、消化酵素入りの消化溶液）を注入する。膵管に消化酵素を注入することで、膵臓１全体に消化酵素を行き渡らせることができる。
【００１８】
その後、輸液を用いて膵臓１の分解（消化）を行う。また、膵臓１を分解した後の輸液に対して、遠心分離処理等の処理を行うことで、膵島と他の細胞とを分離する（すなわち、膵島を純化する。）。
【００１９】
以下、患者の体内から摘出された分解前の膵臓１を保存する臓器保存工程としての膵臓の保存工程と、この膵臓の保存工程で保存された膵臓１から膵島を分離して取り出す細胞分離工程としての膵島の分離工程を順次、説明する。
【００２０】
（膵臓の保存工程）
図２は、本発明の実施の形態にかかる膵臓１の保存状態を説明するための図である。
【００２１】
本形態の膵臓の保存工程は、心臓死または脳死の患者から摘出された膵臓１を膵島の分離が行われる所定の場所まで運搬等する際の膵臓の保存工程であり、この工程では、以下の保存方法で膵臓１が保存されている。すなわち、本形態の膵臓１の保存方法では、図２に示すように、断熱材付の保存容器２の中に収納された状態で、冷蔵されて膵臓１が保存されている。また、保存容器２の上端側は、上蓋３で覆われている。
【００２２】
膵臓１の膵管１ａには、膵臓１内の細胞を酸素化するための保存液としての第１の保存液（以下、「第１保存液」とする。）が注入されている。具体的には、シリンジ（注射器）を用いて、膵管１ａの端部から第１保存液が膵管１ａに注入されている。
【００２３】
第１保存液は、酸素濃度が比較的高い液体である。たとえば、第１保存液は、酸素の運搬機能を有する人工酸素運搬体を含む（すなわち、人工酸素運搬体入りの）ＵＷ液あるいは人工酸素運搬体入りのハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋ´ｓ溶液）である。または、第１保存液は、溶存酸素量を増加させた状態のＵＷ液あるいはＨａｎｋ´ｓ溶液である。なお、もともと溶存酸素量の多いＰＦＣ溶液を第１保存液とすることも可能である。
【００２４】
ここで、ＵＷ液等に含まれる人工酸素運搬体は、たとえば、人間の赤血球から得られるヘモグロビンを所定の膜等の内部に封入した人工赤血球である。また、人工酸素運搬体は、活性炭、ゼオライト等の多孔性物質であっても良い。
【００２５】
保存容器２には、膵臓１内の細胞を構成する細胞膜のナトリウムポンプ機能の低下を抑制するための第２の保存液４（以下、「第２保存液４」とする）が注入されている。本形態の第２保存液４は、ＵＷ液５とＰＦＣ溶液６とからなる２層の液体である。なお、ＰＦＣ溶液６の比重はＵＷ液５の比重よりも大きいため、図２に示すように、ＰＦＣ溶液６は、保存容器２の下側に溜っている。また、第２保存液４は、必ずしも膵臓１内の細胞膜のナトリウムポンプ機能の低下を抑制する機能を備えていなくて良く、たとえば、生理食塩水であっても良い。
【００２６】
本形態では、保存容器２内の膵臓１が第２保存液４に完全に浸るように、保存容器２に第２保存液４が注入されている。具体的には、膵管１ａの端部がＵＷ液５の中に配置されるように、保存容器２に第２保存液４が注入されている。
【００２７】
膵臓１を保存容器２内に保存する際には、まず、膵管１ａに第１保存液を注入し、第１保存液を注入した後の膵臓１を第２保存液４に浸す。なお、第２保存液４に膵臓１を浸した後に、膵管１ａに第１保存液を注入しても良い。
【００２８】
（膵島の分離工程）
図３は、本発明の実施の形態にかかる膵島の分離工程で使用される膵島分離装置１０の概略構成を示す概念図である。
【００２９】
本形態の膵島の分離工程では、図３に示す膵島分離装置１０が使用される。この膵島分離装置１０は、膵臓１を分解するための消化酵素入りの輸液が循環する循環路１２と、消化酵素が注入された後の膵臓１を収納する臓器収納容器としてのチャンバー１３と、循環路１２に輸液を注入し、また、循環路１２から輸液を取り出すための輸液交換用口１４と、輸液交換用口１４から注入された輸液がたまる輸液バッグ１５と、循環路１２で輸液を循環させるために輸液を吐出するポンプ１６と、輸液に酸素を溶解させて輸液の溶存酸素量を増加させる中空糸膜モジュール１７と、チャンバー１３内の温度を検出する温度センサ１８と、温度センサ１８での検出結果に基づいてチャンバー１３内の輸液の温度を所定の温度に維持するための熱交換器１９とを備えている。
【００３０】
なお、本形態の膵島分離装置１０で使用される輸液はたとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよび塩素等を含有するアセテートリンゲル液である。
【００３１】
循環路１２は、複数の可撓性の管状部材（たとえば、シリコンゴム製のチューブ）によって構成されている。また、チャンバー１３を基準とすると、循環路１２内には、チャンバー１３、輸液交換用口１４、輸液バッグ１５、ポンプ１６、中空糸膜モジュール１７および熱交換器１９がこの順番で配置されており、これらの各構成間には、循環路１２を構成する管状部材が配置されている。
【００３２】
チャンバー１３には消化酵素が注入された後の膵臓が収納され、また、輸液交換用口１４から循環路１２に輸液が注入される。そのため、消化酵素入りの輸液が循環路１２を循環する。
【００３３】
チャンバー１３は、たとえば、容器本体と蓋とからなる金属製の密閉容器である。輸液交換用口１４は、Ｔ型の継手である。この輸液交換用口１４には、循環路１２に輸液を注入する際、輸液が収納された輸液容器（図示省略）が接続され、循環路１２から輸液を取り出す際、輸液を回収するための回収容器が接続される。
【００３４】
輸液バッグ１５は、たとえば、プラスチック製の容器である。輸液交換用口１４と輸液バッグ１５とを接続する管状部材の端部、および、輸液バッグ１５とポンプ１６とを接続する管状部材の端部は、輸液バッグ１５内にたまった輸液の中に配置されている。ポンプ１６は、たとえば、ローラーポンプである。本形態では、輸液バッグ１５からポンプ１６に向かって輸液が流入し、ポンプ１６は、中空糸膜モジュール１７に向かって輸液を吐出する。
【００３５】
中空糸膜モジュール１７には、ポンプ１６からの輸液が流入し、また、中空糸膜モジュール１７から熱交換器１９に向かって輸液が流出する。また、中空糸膜モジュール１７には、酸素ボンベ等からなる酸素供給源２１が接続されており、酸素供給源２１から中空糸膜モジュール１７に気体状の酸素が供給される。この中空糸膜モジュール１７は、略円筒状に形成されたハウジング（図示省略）と、このハウジングの内部に配置された複数の中空糸膜（図示省略）とを備えている。本形態では、中空糸膜の内部を輸液が通過し、ハウジングの内部かつ中空糸膜の外部に酸素供給源２１から気体状の酸素が供給される。
【００３６】
なお、中空糸膜モジュール１７に代えて、平膜モジュールが配置されても良いし、中空糸膜や平膜以外の精密ろ過膜を酸素透過膜として有する膜モジュール、あるいは、シリコンゴム等で形成された酸素透過膜を有する膜モジュールが配置されても良い。
【００３７】
熱交換器１９は、所定の液体で満たされた容器２２と、容器２２に入っている液体内に配置される管部２３と、容器２２内の液体を加熱するためのヒータ（図示省略）とを備えている。この熱交換器１９では、温度センサ１８での検出結果に基づいて、ヒータがオンまたはオフし、容器２２内の液体の温度を制御することで、管部２３を通過する輸液の温度を調整する。また、管部１３を通過する輸液の温度を調整することで、チャンバー３内の輸液の温度を所定の温度に維持する。
【００３８】
以上の膵島分離装置１０を用いて、本形態の膵島の分離工程では、膵臓１を収納するチャンバー１３が配置される循環路１２内で、膵臓１を分解するための消化酵素入りの輸液を循環させる。また、中空糸膜モジュール１７によって、チャンバー１３を通過した輸液の溶存酸素量を増加させながら膵臓１を分解する。
【００３９】
（本形態の主な効果）
以上のように、本形態では、膵臓１内の細胞を酸素化するための第１保存液を膵管１ａに注入している。そのため、摘出してから所定時間経過した後であっても、膵臓１内の表面細胞だけでなく全細胞の酸素分圧の低下を抑制することが可能になる。その結果、膵臓１から膵島を分離する際に、生きた状態の膵島をより高い確率で分離して取り出すことが可能となる。
【００４０】
この効果を豚の膵臓を用いて測定した酸素分圧の実験データに基づいて詳細に説明する。図４は、豚の膵臓を用いて測定した酸素分圧の実験データを説明するための図であり、（Ａ）は実験データを示すグラフであり、（Ｂ）は実験条件を示す表である。
【００４１】
なお、以下の各条件Ａ１〜Ｄ１における膵管への第１保存液等の注入および膵臓の保存は４℃の条件下で行った。また、以下の各条件Ａ１〜Ｄ１で５個の膵臓を用いて酸素分圧を測定した。また、膵臓の酸素分圧を測定する際には、膵臓の長手方向の中心位置において、膵臓の長手方向に直交する厚さ方向（横断面方向）の最表層の小葉、中心部および中心部と最表層との中間位置の３箇所で酸素分圧を測定した。
【００４２】
図４（Ｂ）に示すように、酸素で飽和したＰＦＣ溶液を膵重量に対して等量、膵管に注入し、ＵＷ液とＰＦＣ溶液とからなる保存液に膵臓を浸して保存した場合（条件Ａ１）、酸素で飽和したＰＦＣ溶液を膵重量に対して半量、膵管に注入し、ＵＷ液とＰＦＣ溶液とからなる保存液に膵臓を浸して保存した場合（条件Ｂ１）、溶液内の酸素濃度を上げていない通常のＨａｎｋ´ｓ溶液を膵重量に対して半量、膵管に注入し、ＵＷ液とＰＦＣ溶液とからなる保存液に膵臓を浸して保存した場合（条件Ｃ１）、溶液内の酸素濃度を上げていない通常のＨａｎｋ´ｓ溶液を膵重量に対して半量、膵管に注入し、ＵＷ液からなる保存液に膵臓を浸して保存した場合（条件Ｄ１）のそれぞれの７時間経過後の膵臓の酸素分圧を測定した。
【００４３】
その結果、図４（Ａ）に示すように、酸素で飽和して、膵臓内の細胞を酸素化する機能を有するＰＦＣ溶液を膵管に注入した条件Ａ１、Ｂ１では、酸素分圧の平均値および標準偏差はそれぞれ、１０．９±４．３ｋＰａ、７．８±２．２ｋＰａであった。一方、膵臓内の細胞を酸素化する機能を有しないＨａｎｋ´ｓ溶液を膵管に注入した条件Ｃ１、Ｄ１では、酸素分圧の平均値および標準偏差はそれぞれ、３．２±０．３ｋＰａ、２．７±０．９ｋＰａであった。
【００４４】
すなわち、膵臓内の細胞を酸素化する機能を有するＰＦＣ溶液を膵管に注入した条件Ａ１、Ｂ１での酸素分圧は、膵臓内の細胞を酸素化する機能を有しないＨａｎｋ´ｓ溶液を膵管に注入した条件Ｃ１、Ｄ１での酸素分圧よりも高い値を示した。また、条件Ａ１での酸素分圧は、条件Ｂ１での酸素分圧よりも高い値を示した。この結果から、膵臓内の細胞を酸素化する機能を有する第１保存液をより多く膵管に注入した方が所定時間経過後の酸素分圧が高くなることがわかる。
【００４５】
このように、膵臓１内の細胞を酸素化する機能を有する第１保存液を膵管に注入することで、摘出してから所定時間経過した後であっても、膵臓内の細胞の酸素分圧の低下を抑制することが可能となる。その結果、膵臓から膵島を分離する際に、生きた状態の膵島をより高い確率で分離して取り出すことが可能となる。
【００４６】
また、第１保存液に、人工酸素運搬体が含まれている場合には、第１保存液内の酸素濃度を比較的短時間でかつ容易に上げることが可能になる。
【００４７】
本形態では、膵島の分離工程において、膵臓１を収納するチャンバー１３が配置される循環路１２内で、膵臓１を分解するための消化酵素入りの輸液を循環させ、中空糸膜モジュール１７によって、チャンバー１３を通過した輸液の溶存酸素量を増加させながら膵臓を分解している。そのため、膵臓１から膵島を分離する際に、生きた状態の膵島をさらに高い確率で分離して取り出すことが可能となる。
【００４８】
この効果を、豚の膵臓から膵島を分離する膵島の分離実験の結果に基づいて詳細に説明する。この分離実験では、まず、消化酵素が注入、充填された後の豚の膵臓をチャンバー１３内に収納した。その後、輸液交換用口１４から１０００ｍｌの輸液を注入し、ポンプ１６を起動して、循環路１２で輸液を循環させた。膵島分離装置１０から所定の間隔で輸液のサンプリングを行い、チャンバー１３内の膵臓の消化状態が十分だと思われた時点で、輸液交換用口１４から膵臓消化液（輸液）を回収した。より多くの膵島細胞を回収するために、輸液交換用口１４から１０００ｍｌの新たな輸液を注入しながら引き続き回収を継続した。１０００ｍｌの新たな輸液が循環路１２を循環するのに要する時間は５分である。チャンバー１３内が十分に希釈され、膵臓消化産物が回収できなくなるまでこの作業を継続した。通常、この作業に要する時間は、４０〜７０分位である。このように輸液を交換しながら、膵臓を分解し、回収された膵臓消化液に対して、遠心分離処理を行って、膵島と他の細胞とを分離する。
【００４９】
なお、この実験で、豚の膵臓に注入された消化酵素は、リベラーゼ（具体的には、Ｌｉｂｅｒａｓｅ Ｈｉ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製））であり、循環路１２で循環する輸液は、アセテートリンゲル液である。また、この実験では、温度センサ１８と熱交換器１９とによって、チャンバー１３内の輸液の温度を３７℃に保っている。
【００５０】
この分離実験では、ポンプ１６を起動して、循環路１２で輸液を循環させる際に、酸素供給源２１から気体状の酸素を中空糸膜モジュール１７に供給した。具体的には、酸素供給源２１から濃度９９．５％の酸素を供給した。酸素が供給されると、循環路１２内の輸液の溶存酸素量が増加した。具体的には、循環路１２に注入された直後は８ｍｇ／ｌであった輸液の溶存酸素量は、循環時間とともに次第に増加し、５分後には、３０ｍｇ／ｌを超え、１０分を経過すると、３３〜３４ｍｇ／ｌに収束した。
【００５１】
なお、この分離実験で使用された中空糸膜の細孔径の径は０．１〜０．２μｍであり、中空糸膜の内径Ｄ１は、１．８ｍｍであり、中空糸膜の外径は２．７ｍｍである。また、中空糸膜モジュール全体の有効膜面積は２５００ｃｍ２である。
【００５２】
このような条件で膵島細胞の分離を行い、分離された膵島細胞を２４時間培養した後に、膵島細胞の、アドシン二燐酸（ＡＤＰ）とアドシン三燐酸（ＡＴＰ）との比であるＡＤＰ／ＡＴＰの値を測定した。その結果、膵島細胞のＡＤＰ／ＡＴＰの値は０．０１９であった。一方、比較のため、中空糸膜モジュール１７を使用せずに（すなわち、輸液の中に酸素を溶解させずに）、かつ、その他の条件を同じにして膵島細胞を分離し、分離された膵島細胞を２４時間培養した後に、その膵島細胞のＡＤＰ／ＡＴＰの値を測定すると、その値は０．０７８であった。なお、これらの測定では、測定装置として、Ｐｒｏｍｅｇａ社製の「ＧｌｏＭａｘ２０／２０ｎＬｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ」を使用するとともに、ＡＤＰおよびＡＴＰ測定キット「ＡｐｏＧｌｏｗＡｓｓａｙｋｉｔ」を使用した。
【００５３】
ここで、ＡＤＰ／ＡＴＰは、本願発明者である後藤昌史らによって提案されている指標であり、このＡＤＰ／ＡＴＰの値と膵島の機能との関係については、後藤昌史ら他３名著の「Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｐｌａｎａｔａｔｉｏｎ ２００６；６：Ｐ２４８３−２４８７」に詳しく記載されている。このＡＤＰ／ＡＴＰの値が小さいと、分離後の膵島の機能が維持されていることを意味しており、本形態の膵島分離装置１を用いると、分離後の膵島の機能が大幅に維持されていることがわかる。なお、通常、ＡＤＰ／ＡＴＰの値が０．１より大きいとその膵島は膵島移植に不適とされている。
【００５４】
以上のように、本形態の膵島の分離工程によれば、膵臓から生きた状態の膵島をより高い確率で分離して取り出すことが可能になる。また、インシュリン発生能力の高い膵島を分離して取り出すことが可能になる。なお、第１保存液に人工酸素運搬体が含まれている場合には、消化酵素入りの輸液を循環させて臓器を分解する際に、人工酸素運搬体が輸液の中に混ざる。そのため、分離される膵島に対してより効果的に酸素を提供することが可能になる。
【００５５】
（他の実施の形態）
上述した形態では、膵臓１を例に本発明の実施の形態にかかる臓器の保存方法を説明しているが、本発明の臓器の保存方法は、肝臓にも適用可能である。たとえば、本発明の臓器の保存方法を肝臓に適用する場合には、肝臓内の細胞を酸素化するための第１保存液を肝臓の肝管に注入して肝臓を保存すれば良い。この際には、細胞を構成する細胞膜のナトリウムポンプ機能の低下を抑制するための第２保存液に肝臓を浸して保存することが好ましい。この場合には、たとえば、第１保存液として人工酸素運搬体入りのＵＷ液が用いられる。また、第２保存液としてＵＷ液が用いられるが、第２保存液は生理食塩水であっても良い。
【００５６】
この場合には、摘出してから所定時間経過した後であっても、肝臓の細胞の酸素分圧の低下を抑制することが可能となり、その結果、肝臓から細胞を分離する際に、生きた状態の細胞をより高い確率で分離して取り出すことが可能となる。なお、この保存方法で保存した肝臓から肝細胞を分離して取り出す際には、膵島分離装置１０と同様の構成を備える細胞分離装置を用いることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の実施の形態にかかる膵島の分離方法を説明するための図である。
【図２】本発明の実施の形態にかかる膵島の保存状態を説明するための図である。
【図３】本発明の実施の形態にかかる膵島の分離工程で使用される膵島分離装置の概略構成を示す概念図である。
【図４】豚の膵臓を用いて測定した酸素分圧の実験データを説明するための図であり、（Ａ）は実験データを示すグラフであり、（Ｂ）は実験条件を示す表である。
【符号の説明】
【００５８】
１ 膵臓（臓器）
１ａ 膵管
１２ 循環路
１３ チャンバー（臓器収納容器）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人体内から取り出された所定の臓器を保存するための臓器の保存方法およびこの臓器の保存方法で保存された臓器から所定の細胞を分離して取り出すための細胞の分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓からのインシュリン分泌がなくなってしまうインシュリン依存糖尿病（１型糖尿病）に対する治療法として、糖尿病患者に対して膵臓を移植する膵臓移植が行われている。この膵臓移植は大規模な手術であり、患者の体の負担が大きい。そこで、患者の体の負担を軽減するための治療法として、膵臓に含まれる膵島を取り出してこの膵島を糖尿病患者に移植する膵島移植が行われている（たとえば、非特許文献１参照）。
【０００３】
膵臓から膵島を分離して取り出すためには、まず、心臓死あるいは脳死の患者から膵臓を摘出し、膵島の分離が行われる所定の場所まで摘出された膵臓を運搬する必要がある。摘出後、運搬等の際に膵臓を保存するための方法として、従来から、フッ素系樹脂であるパーフロロカーボン（ＰＦＣ）を分散させたフッ素樹脂分散液であるＰＦＣ溶液と、ＵＷ液（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）との２層の液体からなる保存液に膵臓を浸す方法が提案されている。
【０００４】
【非特許文献１】後藤昌史、外４名、「ヨーロッパにおける膵島移植」、今日の移植、株式会社日本医学館、２００５年６月、Ｖｏｌ．１８、Ｎｏ．４、Ｐ４０１−４０８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＰＦＣ溶液とＵＷ液とからなる保存液に浸した状態で膵臓を保存した後に、膵臓から膵島を分離した場合、多くの膵島細胞が死んでしまい、膵島移植を行っても、移植の効果が少ないことが本願発明者あるいは他の研究者の研究により明らかになってきている。
【０００６】
そこで、本発明の課題は、膵臓等の所定の臓器から生きた状態の膵島等の細胞をより高い確率で分離して取り出すことが可能となる臓器の保存方法およびこの臓器の保存方法で保存された臓器から所定の細胞を分離して取り出すための細胞の分離方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するため、本願発明者は種々の検討を行った。その結果、所定の臓器内の細胞を酸素化するための保存液を所定の管内に注入して臓器を保存することで、臓器から細胞を分離する際に、生きた状態の細胞をより高い確率で分離して取り出すことが可能であることを知見するに至った。
【０００８】
本発明はかかる新たな知見に基づくものであり、本発明は、体内から取り出された臓器を保存する臓器の保存方法において、臓器は膵臓であり、膵臓内の細胞を酸素化するための保存液を膵臓の膵管に注入する工程を備えることを特徴とする。
【０００９】
また、上述の新たな知見に基づいて、本発明は、体内から取り出された臓器を保存する臓器の保存方法において、臓器は肝臓であり、肝臓内の細胞を酸素化するための保存液を肝臓の肝管に注入する工程を備えることを特徴とする。
【００１０】
本発明の臓器の保存方法では、膵臓の膵管あるいは肝臓の肝管に、内部の細胞を酸素化するための保存液を注入している。そのため、摘出してから所定時間経過した後であっても、膵臓あるいは肝臓内の表面細胞だけでなく全細胞の酸素分圧の低下を抑制することが可能になる。その結果、膵臓等の所定の臓器から細胞を分離する際に、生きた状態の細胞をより高い確率で分離して取り出すことが可能となる。
【００１１】
本発明において、保存液には、人工酸素運搬体が含まれていることが好ましい。このように構成すると、保存液内の酸素濃度を比較的短時間でかつ容易に上げることが可能になる。
【００１２】
本発明の臓器の保存方法は、この臓器の保存方法で臓器を保存する臓器保存工程と、臓器保存工程後に、臓器内の所定の細胞を臓器から分離して取り出す細胞分離工程とを備える細胞の分離方法に用いることができる。この細胞の分離方法では、細胞分離工程において、臓器を収納する臓器収納容器が配置される循環路内で、臓器を分解するための消化酵素入りの輸液を循環させるとともに、臓器収納容器を通過した輸液の溶存酸素量を増加させながら臓器を分解することが好ましい。このように構成すると、所定の臓器から細胞を分離する際に、生きた状態の細胞をさらに高い確率で分離して取り出すことが可能となる。また、保存液に人工酸素運搬体が含まれている場合には、消化酵素入りの輸液を循環させて臓器を分解する際に、人工酸素運搬体が輸液の中に混ざる。そのため、分離される細胞に対してより効果的に酸素を提供することが可能になる。
【発明の効果】
【００１３】
以上のように、本発明にかかる臓器の保存方法および細胞の分離方法では、所定の臓器から生きた状態の細胞をより高い確率で分離して取り出すことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
【００１５】
（膵島の分離方法）
図１は、本発明の実施の形態にかかる膵島の分離方法を説明するための図である。
【００１６】
本形態では、臓器としての膵臓１（図２参照）から所定の細胞としての膵島が分離されて取り出される。すなわち、本形態の細胞の分離方法は、膵島の分離方法である。
【００１７】
膵臓１からの膵島の分離は、図１に示す手順で行われる。すなわち、まず、心臓死または脳死の患者の体内から膵臓１を摘出し、膵島の分離が行われる所定の場所まで摘出された膵臓１を運搬する。その後、膵管に逆行性に、たとえばコラゲナーゼ等の消化酵素（具体的には、消化酵素入りの消化溶液）を注入する。膵管に消化酵素を注入することで、膵臓１全体に消化酵素を行き渡らせることができる。
【００１８】
その後、輸液を用いて膵臓１の分解（消化）を行う。また、膵臓１を分解した後の輸液に対して、遠心分離処理等の処理を行うことで、膵島と他の細胞とを分離する（すなわち、膵島を純化する。）。
【００１９】
以下、患者の体内から摘出された分解前の膵臓１を保存する臓器保存工程としての膵臓の保存工程と、この膵臓の保存工程で保存された膵臓１から膵島を分離して取り出す細胞分離工程としての膵島の分離工程を順次、説明する。
【００２０】
（膵臓の保存工程）
図２は、本発明の実施の形態にかかる膵臓１の保存状態を説明するための図である。
【００２１】
本形態の膵臓の保存工程は、心臓死または脳死の患者から摘出された膵臓１を膵島の分離が行われる所定の場所まで運搬等する際の膵臓の保存工程であり、この工程では、以下の保存方法で膵臓１が保存されている。すなわち、本形態の膵臓１の保存方法では、図２に示すように、断熱材付の保存容器２の中に収納された状態で、冷蔵されて膵臓１が保存されている。また、保存容器２の上端側は、上蓋３で覆われている。
【００２２】
膵臓１の膵管１ａには、膵臓１内の細胞を酸素化するための保存液としての第１の保存液（以下、「第１保存液」とする。）が注入されている。具体的には、シリンジ（注射器）を用いて、膵管１ａの端部から第１保存液が膵管１ａに注入されている。
【００２３】
第１保存液は、酸素濃度が比較的高い液体である。たとえば、第１保存液は、酸素の運搬機能を有する人工酸素運搬体を含む（すなわち、人工酸素運搬体入りの）ＵＷ液あるいは人工酸素運搬体入りのハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋ´ｓ溶液）である。または、第１保存液は、溶存酸素量を増加させた状態のＵＷ液あるいはＨａｎｋ´ｓ溶液である。なお、もともと溶存酸素量の多いＰＦＣ溶液を第１保存液とすることも可能である。
【００２４】
ここで、ＵＷ液等に含まれる人工酸素運搬体は、たとえば、人間の赤血球から得られるヘモグロビンを所定の膜等の内部に封入した人工赤血球である。また、人工酸素運搬体は、活性炭、ゼオライト等の多孔性物質であっても良い。
【００２５】
保存容器２には、膵臓１内の細胞を構成する細胞膜のナトリウムポンプ機能の低下を抑制するための第２の保存液４（以下、「第２保存液４」とする）が注入されている。本形態の第２保存液４は、ＵＷ液５とＰＦＣ溶液６とからなる２層の液体である。なお、ＰＦＣ溶液６の比重はＵＷ液５の比重よりも大きいため、図２に示すように、ＰＦＣ溶液６は、保存容器２の下側に溜っている。また、第２保存液４は、必ずしも膵臓１内の細胞膜のナトリウムポンプ機能の低下を抑制する機能を備えていなくて良く、たとえば、生理食塩水であっても良い。
【００２６】
本形態では、保存容器２内の膵臓１が第２保存液４に完全に浸るように、保存容器２に第２保存液４が注入されている。具体的には、膵管１ａの端部がＵＷ液５の中に配置されるように、保存容器２に第２保存液４が注入されている。
【００２７】
膵臓１を保存容器２内に保存する際には、まず、膵管１ａに第１保存液を注入し、第１保存液を注入した後の膵臓１を第２保存液４に浸す。なお、第２保存液４に膵臓１を浸した後に、膵管１ａに第１保存液を注入しても良い。
【００２８】
（膵島の分離工程）
図３は、本発明の実施の形態にかかる膵島の分離工程で使用される膵島分離装置１０の概略構成を示す概念図である。
【００２９】
本形態の膵島の分離工程では、図３に示す膵島分離装置１０が使用される。この膵島分離装置１０は、膵臓１を分解するための消化酵素入りの輸液が循環する循環路１２と、消化酵素が注入された後の膵臓１を収納する臓器収納容器としてのチャンバー１３と、循環路１２に輸液を注入し、また、循環路１２から輸液を取り出すための輸液交換用口１４と、輸液交換用口１４から注入された輸液がたまる輸液バッグ１５と、循環路１２で輸液を循環させるために輸液を吐出するポンプ１６と、輸液に酸素を溶解させて輸液の溶存酸素量を増加させる中空糸膜モジュール１７と、チャンバー１３内の温度を検出する温度センサ１８と、温度センサ１８での検出結果に基づいてチャンバー１３内の輸液の温度を所定の温度に維持するための熱交換器１９とを備えている。
【００３０】
なお、本形態の膵島分離装置１０で使用される輸液はたとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよび塩素等を含有するアセテートリンゲル液である。
【００３１】
循環路１２は、複数の可撓性の管状部材（たとえば、シリコンゴム製のチューブ）によって構成されている。また、チャンバー１３を基準とすると、循環路１２内には、チャンバー１３、輸液交換用口１４、輸液バッグ１５、ポンプ１６、中空糸膜モジュール１７および熱交換器１９がこの順番で配置されており、これらの各構成間には、循環路１２を構成する管状部材が配置されている。
【００３２】
チャンバー１３には消化酵素が注入された後の膵臓が収納され、また、輸液交換用口１４から循環路１２に輸液が注入される。そのため、消化酵素入りの輸液が循環路１２を循環する。
【００３３】
チャンバー１３は、たとえば、容器本体と蓋とからなる金属製の密閉容器である。輸液交換用口１４は、Ｔ型の継手である。この輸液交換用口１４には、循環路１２に輸液を注入する際、輸液が収納された輸液容器（図示省略）が接続され、循環路１２から輸液を取り出す際、輸液を回収するための回収容器が接続される。
【００３４】
輸液バッグ１５は、たとえば、プラスチック製の容器である。輸液交換用口１４と輸液バッグ１５とを接続する管状部材の端部、および、輸液バッグ１５とポンプ１６とを接続する管状部材の端部は、輸液バッグ１５内にたまった輸液の中に配置されている。ポンプ１６は、たとえば、ローラーポンプである。本形態では、輸液バッグ１５からポンプ１６に向かって輸液が流入し、ポンプ１６は、中空糸膜モジュール１７に向かって輸液を吐出する。
【００３５】
中空糸膜モジュール１７には、ポンプ１６からの輸液が流入し、また、中空糸膜モジュール１７から熱交換器１９に向かって輸液が流出する。また、中空糸膜モジュール１７には、酸素ボンベ等からなる酸素供給源２１が接続されており、酸素供給源２１から中空糸膜モジュール１７に気体状の酸素が供給される。この中空糸膜モジュール１７は、略円筒状に形成されたハウジング（図示省略）と、このハウジングの内部に配置された複数の中空糸膜（図示省略）とを備えている。本形態では、中空糸膜の内部を輸液が通過し、ハウジングの内部かつ中空糸膜の外部に酸素供給源２１から気体状の酸素が供給される。
【００３６】
なお、中空糸膜モジュール１７に代えて、平膜モジュールが配置されても良いし、中空糸膜や平膜以外の精密ろ過膜を酸素透過膜として有する膜モジュール、あるいは、シリコンゴム等で形成された酸素透過膜を有する膜モジュールが配置されても良い。
【００３７】
熱交換器１９は、所定の液体で満たされた容器２２と、容器２２に入っている液体内に配置される管部２３と、容器２２内の液体を加熱するためのヒータ（図示省略）とを備えている。この熱交換器１９では、温度センサ１８での検出結果に基づいて、ヒータがオンまたはオフし、容器２２内の液体の温度を制御することで、管部２３を通過する輸液の温度を調整する。また、管部１３を通過する輸液の温度を調整することで、チャンバー３内の輸液の温度を所定の温度に維持する。
【００３８】
以上の膵島分離装置１０を用いて、本形態の膵島の分離工程では、膵臓１を収納するチャンバー１３が配置される循環路１２内で、膵臓１を分解するための消化酵素入りの輸液を循環させる。また、中空糸膜モジュール１７によって、チャンバー１３を通過した輸液の溶存酸素量を増加させながら膵臓１を分解する。
【００３９】
（本形態の主な効果）
以上のように、本形態では、膵臓１内の細胞を酸素化するための第１保存液を膵管１ａに注入している。そのため、摘出してから所定時間経過した後であっても、膵臓１内の表面細胞だけでなく全細胞の酸素分圧の低下を抑制することが可能になる。その結果、膵臓１から膵島を分離する際に、生きた状態の膵島をより高い確率で分離して取り出すことが可能となる。
【００４０】
この効果を豚の膵臓を用いて測定した酸素分圧の実験データに基づいて詳細に説明する。図４は、豚の膵臓を用いて測定した酸素分圧の実験データを説明するための図であり、（Ａ）は実験データを示すグラフであり、（Ｂ）は実験条件を示す表である。
【００４１】
なお、以下の各条件Ａ１〜Ｄ１における膵管への第１保存液等の注入および膵臓の保存は４℃の条件下で行った。また、以下の各条件Ａ１〜Ｄ１で５個の膵臓を用いて酸素分圧を測定した。また、膵臓の酸素分圧を測定する際には、膵臓の長手方向の中心位置において、膵臓の長手方向に直交する厚さ方向（横断面方向）の最表層の小葉、中心部および中心部と最表層との中間位置の３箇所で酸素分圧を測定した。
【００４２】
図４（Ｂ）に示すように、酸素で飽和したＰＦＣ溶液を膵重量に対して等量、膵管に注入し、ＵＷ液とＰＦＣ溶液とからなる保存液に膵臓を浸して保存した場合（条件Ａ１）、酸素で飽和したＰＦＣ溶液を膵重量に対して半量、膵管に注入し、ＵＷ液とＰＦＣ溶液とからなる保存液に膵臓を浸して保存した場合（条件Ｂ１）、溶液内の酸素濃度を上げていない通常のＨａｎｋ´ｓ溶液を膵重量に対して半量、膵管に注入し、ＵＷ液とＰＦＣ溶液とからなる保存液に膵臓を浸して保存した場合（条件Ｃ１）、溶液内の酸素濃度を上げていない通常のＨａｎｋ´ｓ溶液を膵重量に対して半量、膵管に注入し、ＵＷ液からなる保存液に膵臓を浸して保存した場合（条件Ｄ１）のそれぞれの７時間経過後の膵臓の酸素分圧を測定した。
【００４３】
その結果、図４（Ａ）に示すように、酸素で飽和して、膵臓内の細胞を酸素化する機能を有するＰＦＣ溶液を膵管に注入した条件Ａ１、Ｂ１では、酸素分圧の平均値および標準偏差はそれぞれ、１０．９±４．３ｋＰａ、７．８±２．２ｋＰａであった。一方、膵臓内の細胞を酸素化する機能を有しないＨａｎｋ´ｓ溶液を膵管に注入した条件Ｃ１、Ｄ１では、酸素分圧の平均値および標準偏差はそれぞれ、３．２±０．３ｋＰａ、２．７±０．９ｋＰａであった。
【００４４】
すなわち、膵臓内の細胞を酸素化する機能を有するＰＦＣ溶液を膵管に注入した条件Ａ１、Ｂ１での酸素分圧は、膵臓内の細胞を酸素化する機能を有しないＨａｎｋ´ｓ溶液を膵管に注入した条件Ｃ１、Ｄ１での酸素分圧よりも高い値を示した。また、条件Ａ１での酸素分圧は、条件Ｂ１での酸素分圧よりも高い値を示した。この結果から、膵臓内の細胞を酸素化する機能を有する第１保存液をより多く膵管に注入した方が所定時間経過後の酸素分圧が高くなることがわかる。
【００４５】
このように、膵臓１内の細胞を酸素化する機能を有する第１保存液を膵管に注入することで、摘出してから所定時間経過した後であっても、膵臓内の細胞の酸素分圧の低下を抑制することが可能となる。その結果、膵臓から膵島を分離する際に、生きた状態の膵島をより高い確率で分離して取り出すことが可能となる。
【００４６】
また、第１保存液に、人工酸素運搬体が含まれている場合には、第１保存液内の酸素濃度を比較的短時間でかつ容易に上げることが可能になる。
【００４７】
本形態では、膵島の分離工程において、膵臓１を収納するチャンバー１３が配置される循環路１２内で、膵臓１を分解するための消化酵素入りの輸液を循環させ、中空糸膜モジュール１７によって、チャンバー１３を通過した輸液の溶存酸素量を増加させながら膵臓を分解している。そのため、膵臓１から膵島を分離する際に、生きた状態の膵島をさらに高い確率で分離して取り出すことが可能となる。
【００４８】
この効果を、豚の膵臓から膵島を分離する膵島の分離実験の結果に基づいて詳細に説明する。この分離実験では、まず、消化酵素が注入、充填された後の豚の膵臓をチャンバー１３内に収納した。その後、輸液交換用口１４から１０００ｍｌの輸液を注入し、ポンプ１６を起動して、循環路１２で輸液を循環させた。膵島分離装置１０から所定の間隔で輸液のサンプリングを行い、チャンバー１３内の膵臓の消化状態が十分だと思われた時点で、輸液交換用口１４から膵臓消化液（輸液）を回収した。より多くの膵島細胞を回収するために、輸液交換用口１４から１０００ｍｌの新たな輸液を注入しながら引き続き回収を継続した。１０００ｍｌの新たな輸液が循環路１２を循環するのに要する時間は５分である。チャンバー１３内が十分に希釈され、膵臓消化産物が回収できなくなるまでこの作業を継続した。通常、この作業に要する時間は、４０〜７０分位である。このように輸液を交換しながら、膵臓を分解し、回収された膵臓消化液に対して、遠心分離処理を行って、膵島と他の細胞とを分離する。
【００４９】
なお、この実験で、豚の膵臓に注入された消化酵素は、リベラーゼ（具体的には、Ｌｉｂｅｒａｓｅ Ｈｉ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製））であり、循環路１２で循環する輸液は、アセテートリンゲル液である。また、この実験では、温度センサ１８と熱交換器１９とによって、チャンバー１３内の輸液の温度を３７℃に保っている。
【００５０】
この分離実験では、ポンプ１６を起動して、循環路１２で輸液を循環させる際に、酸素供給源２１から気体状の酸素を中空糸膜モジュール１７に供給した。具体的には、酸素供給源２１から濃度９９．５％の酸素を供給した。酸素が供給されると、循環路１２内の輸液の溶存酸素量が増加した。具体的には、循環路１２に注入された直後は８ｍｇ／ｌであった輸液の溶存酸素量は、循環時間とともに次第に増加し、５分後には、３０ｍｇ／ｌを超え、１０分を経過すると、３３〜３４ｍｇ／ｌに収束した。
【００５１】
なお、この分離実験で使用された中空糸膜の細孔径の径は０．１〜０．２μｍであり、中空糸膜の内径Ｄ１は、１．８ｍｍであり、中空糸膜の外径は２．７ｍｍである。また、中空糸膜モジュール全体の有効膜面積は２５００ｃｍ２である。
【００５２】
このような条件で膵島細胞の分離を行い、分離された膵島細胞を２４時間培養した後に、膵島細胞の、アドシン二燐酸（ＡＤＰ）とアドシン三燐酸（ＡＴＰ）との比であるＡＤＰ／ＡＴＰの値を測定した。その結果、膵島細胞のＡＤＰ／ＡＴＰの値は０．０１９であった。一方、比較のため、中空糸膜モジュール１７を使用せずに（すなわち、輸液の中に酸素を溶解させずに）、かつ、その他の条件を同じにして膵島細胞を分離し、分離された膵島細胞を２４時間培養した後に、その膵島細胞のＡＤＰ／ＡＴＰの値を測定すると、その値は０．０７８であった。なお、これらの測定では、測定装置として、Ｐｒｏｍｅｇａ社製の「ＧｌｏＭａｘ２０／２０ｎＬｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ」を使用するとともに、ＡＤＰおよびＡＴＰ測定キット「ＡｐｏＧｌｏｗＡｓｓａｙｋｉｔ」を使用した。
【００５３】
ここで、ＡＤＰ／ＡＴＰは、本願発明者である後藤昌史らによって提案されている指標であり、このＡＤＰ／ＡＴＰの値と膵島の機能との関係については、後藤昌史ら他３名著の「Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｐｌａｎａｔａｔｉｏｎ ２００６；６：Ｐ２４８３−２４８７」に詳しく記載されている。このＡＤＰ／ＡＴＰの値が小さいと、分離後の膵島の機能が維持されていることを意味しており、本形態の膵島分離装置１を用いると、分離後の膵島の機能が大幅に維持されていることがわかる。なお、通常、ＡＤＰ／ＡＴＰの値が０．１より大きいとその膵島は膵島移植に不適とされている。
【００５４】
以上のように、本形態の膵島の分離工程によれば、膵臓から生きた状態の膵島をより高い確率で分離して取り出すことが可能になる。また、インシュリン発生能力の高い膵島を分離して取り出すことが可能になる。なお、第１保存液に人工酸素運搬体が含まれている場合には、消化酵素入りの輸液を循環させて臓器を分解する際に、人工酸素運搬体が輸液の中に混ざる。そのため、分離される膵島に対してより効果的に酸素を提供することが可能になる。
【００５５】
（他の実施の形態）
上述した形態では、膵臓１を例に本発明の実施の形態にかかる臓器の保存方法を説明しているが、本発明の臓器の保存方法は、肝臓にも適用可能である。たとえば、本発明の臓器の保存方法を肝臓に適用する場合には、肝臓内の細胞を酸素化するための第１保存液を肝臓の肝管に注入して肝臓を保存すれば良い。この際には、細胞を構成する細胞膜のナトリウムポンプ機能の低下を抑制するための第２保存液に肝臓を浸して保存することが好ましい。この場合には、たとえば、第１保存液として人工酸素運搬体入りのＵＷ液が用いられる。また、第２保存液としてＵＷ液が用いられるが、第２保存液は生理食塩水であっても良い。
【００５６】
この場合には、摘出してから所定時間経過した後であっても、肝臓の細胞の酸素分圧の低下を抑制することが可能となり、その結果、肝臓から細胞を分離する際に、生きた状態の細胞をより高い確率で分離して取り出すことが可能となる。なお、この保存方法で保存した肝臓から肝細胞を分離して取り出す際には、膵島分離装置１０と同様の構成を備える細胞分離装置を用いることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の実施の形態にかかる膵島の分離方法を説明するための図である。
【図２】本発明の実施の形態にかかる膵島の保存状態を説明するための図である。
【図３】本発明の実施の形態にかかる膵島の分離工程で使用される膵島分離装置の概略構成を示す概念図である。
【図４】豚の膵臓を用いて測定した酸素分圧の実験データを説明するための図であり、（Ａ）は実験データを示すグラフであり、（Ｂ）は実験条件を示す表である。
【符号の説明】
【００５８】
１ 膵臓（臓器）
１ａ 膵管
１２ 循環路
１３ チャンバー（臓器収納容器）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体内から取り出された臓器を保存する臓器の保存方法において、
上記臓器は膵臓であり、
上記膵臓内の細胞を酸素化するための保存液を上記膵臓の膵管に注入する工程を備えることを特徴とする臓器の保存方法。
【請求項２】
体内から取り出された臓器を保存する臓器の保存方法において、
上記臓器は肝臓であり、
上記肝臓内の細胞を酸素化するための保存液を上記肝臓の肝管に注入する工程を備えることを特徴とする臓器の保存方法。
【請求項３】
前記保存液には、人工酸素運搬体が含まれていることを特徴とする請求項１または２記載の臓器の保存方法。
【請求項４】
請求項１から３いずれかに記載の臓器の保存方法で前記臓器を保存する臓器保存工程と、上記臓器保存工程後に、前記臓器内の所定の細胞を前記臓器から分離して取り出す細胞分離工程とを備え、
上記細胞分離工程では、前記臓器を収納する臓器収納容器が配置される循環路内で、前記臓器を分解するための消化酵素入りの輸液を循環させるとともに、上記臓器収納容器を通過した上記輸液の溶存酸素量を増加させながら前記臓器を分解することを特徴とする細胞の分離方法。
【請求項１】
体内から取り出された臓器を保存する臓器の保存方法において、
上記臓器は膵臓であり、
上記膵臓内の細胞を酸素化するための保存液を上記膵臓の膵管に注入する工程を備えることを特徴とする臓器の保存方法。
【請求項２】
体内から取り出された臓器を保存する臓器の保存方法において、
上記臓器は肝臓であり、
上記肝臓内の細胞を酸素化するための保存液を上記肝臓の肝管に注入する工程を備えることを特徴とする臓器の保存方法。
【請求項３】
前記保存液には、人工酸素運搬体が含まれていることを特徴とする請求項１または２記載の臓器の保存方法。
【請求項４】
請求項１から３いずれかに記載の臓器の保存方法で前記臓器を保存する臓器保存工程と、上記臓器保存工程後に、前記臓器内の所定の細胞を前記臓器から分離して取り出す細胞分離工程とを備え、
上記細胞分離工程では、前記臓器を収納する臓器収納容器が配置される循環路内で、前記臓器を分解するための消化酵素入りの輸液を循環させるとともに、上記臓器収納容器を通過した上記輸液の溶存酸素量を増加させながら前記臓器を分解することを特徴とする細胞の分離方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−５１７８６（Ｐ２００９−５１７８６Ａ）
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２２１５３０（Ｐ２００７−２２１５３０）
【出願日】平成１９年８月２８日（２００７．８．２８）
【出願人】（５０５２２７０４３）野村ユニソン株式会社 (25)
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２８日（２００７．８．２８）
【出願人】（５０５２２７０４３）野村ユニソン株式会社 (25)
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
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