草本類バイオマスの糖化処理方法
【課題】安価、かつ、効率的に草本類バイオマスを糖化することができる上、環境に与える負荷が小さく実用的な草本類バイオマスの糖化処理方法を提供する。
【解決手段】草本類バイオマスを濃度０．０１ｗｔ％以上１０ｗｔ％未満の希アルカリまたは希酸、有機溶媒で処理した後、その希アルカリ処理後の草本類バイオマスをクロストリジウム属細菌またはその培養液で処理する工程を有している、草本類バイオマスの糖化処理方法。クロストリジウム属菌としては、クロストリジウム・サーモセラムを好適に用いることができる。
【解決手段】草本類バイオマスを濃度０．０１ｗｔ％以上１０ｗｔ％未満の希アルカリまたは希酸、有機溶媒で処理した後、その希アルカリ処理後の草本類バイオマスをクロストリジウム属細菌またはその培養液で処理する工程を有している、草本類バイオマスの糖化処理方法。クロストリジウム属菌としては、クロストリジウム・サーモセラムを好適に用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、草本類バイオマスを糖化（分解）してアルコール等の有用物質を製造する技術に関するものであり、詳しくは、微生物を培養させることによって草本類バイオマスを糖化（分解）する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
石油に代わるエネルギー原料の製造方法として、各種のバイオマスからエタノールを製造する方法が注目されている。それらのバイオマスの中でも、稲わら・バガス等の草本類バイオマス（セルロース系バイオマス）は、存在量が膨大で再生可能という点から、注目すべき重要な材料の一つである。そして、そのような草本類バイオマスからエタノールを製造するために、バイオマスを糖化させる（分解する）方法としては、バイオマスを高濃度の酸やアルカリで加水分解する方法が知られている（特許文献１）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−４３３２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、バイオマスを高濃度の酸やアルカリで加水分解する方法は、高濃度の酸・アルカリ廃液が大量に発生するために、処理装置の腐食対策が必要となる。それゆえ、コストが高くなる上、環境に与える負荷が大きい、という不具合がある。
【０００５】
本発明の目的は、上記従来のバイオマスの糖化（分解）方法の問題点を解消し、安価、かつ、効率的に草本類バイオマスを分解することができる上、環境に与える負荷が小さく実用的な草本類バイオマスの糖化（分解）処理方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる本発明の内、請求項１に記載された発明は、草本類バイオマスを糖化するための糖化処理法であって、草本類バイオマスを濃度０．０１ｗｔ％以上１０ｗｔ％未満の希アルカリまたは希酸、有機溶媒で化学的に処理した後、その化学処理後の草本類バイオマスをクロストリジウム属細菌で処理する工程を有することを特徴とするものである。
【０００７】
請求項２に記載された発明は、請求項１に記載された発明において、前記草本類バイオマスが、ネピアグラスを主成分とするものであり、前記クロストリジウム属細菌が、クロストリジウム・サーモセラムであることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項３に記載された発明は、請求項１、または請求項２に記載された発明において、前記化学処理が、ネピアグラスを濃度０．０１ｗｔ％以上１０ｗｔ％未満の水酸化ナトリウム溶液中に浸漬させて２５℃以上１００℃以下に加熱するものであることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項４に記載された発明は、請求項１〜３のいずれかに記載された発明において、糖化処理にクロストリジウム属細菌の糖化酵素を含むクロストリジウム属細菌培養液、または糖化酵素を含む培養液の抽出液を用いることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のバイオマス糖化処理方法は、セルラーゼ等の高価な加水分解酵素を用いないため、草本類バイオマスを安価、かつ、効率的に糖化（分解）することが可能である。加えて、高濃度の酸・アルカリ等の化学廃液が発生しないので、装置が簡略化でき、省エネルギーで環境に与える負荷が小さい。また、同一の菌により酵素生産とエタノール発酵を行なう糖化発酵同時進行（ＣＢＰ：Consolidated Bio Processing）に用いる菌としてクロストリジウム属細菌を使用することができる。ＣＢＰは、次世代発酵法として注目されており、バイオエタノール生産コストを低減する上で、糖化酵素を自ら生産し、糖化と発酵を総て一段階で行う発酵法である。また、本糖化法はバイオエタノールだけでなく、バイオマスからの水素やブタノール等のバイオ燃料生産にも適用可能である。一方、培養液や抽出液は、クロストリジウム・サーモセラムなどが生産する高活性セルラーゼ複合体（セルロソーム）を含んでおり、これらは高活性セルラーゼとして、酵素によるセルロースの加水分解とエタノールの発酵を一つの反応装置内で同時に行なう同時糖化発酵システム（ＳＳＦ：Simultaneous Saccharification and Fermentation、または併行発酵法）にセルラーゼの代わりとして用いることができる。同様に、クロストリジウム培養液や抽出液は、バイオエタノールだけでなくバイオマスからの水素やブタノール等のバイオ燃料生産における糖化処理にも適用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明における草本類バイオマスとは、セルロース系バイオマスのことであり、かかる草本類バイオマスとしては、イネ、ムギ、サトウキビ、ヨシ、ススキ、トウモロコシ等の植物を主体とするバイオマスを好適に用いることができる。また、木質のセルロース、ヘミセルロースを含んだリグノセルロースからなるセルロース系バイオマスや、古紙等からなるセルロース系バイオマスも同様に用いることができる。なお、草本類バイオマスとして、ネピアグラスを主成分とするものを用いると、クロストリジウム菌を培養させた際の草本類バイオマスの糖化効率（分解効率）がより高いものとなるので好ましい。
【００１２】
また、クロストリジウム属菌としては、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・セルロボランス、クロストリジウム・アセトブチリカム等の各種のものを用いることが可能であるが、クロストリジウム・サーモセラムを用いると、クロストリジウム菌を培養させた際の草本類バイオマスの糖化効率がより向上するので好ましい。以下の実施例では、ＡＴＣＣ２７４０５株を用いたが、この株に限られるわけではない。
【００１３】
また、本発明における草本類バイオマスの化学処理とは、濃度０．０１ｗｔ％以上１０ｗｔ％未満の希アルカリまたは希酸、有機溶媒を用いて、草本類バイオマスからリグニンを除去する処理のことである。かかる化学処理に希アルカリ溶液を用いる場合には、希アルカリ溶液として、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム等からなるものを好適に用いることができる。なお、水酸化ナトリウムを用いて希アルカリ処理を行うと、クロストリジウム属菌を培養させた際の草本類バイオマスの糖化効率がより高いものとなるので好ましい。加えて、水酸化ナトリウムを用いて希アルカリ処理を行う際に、水酸化ナトリウム溶液（草本類バイオマスと水酸化ナトリウムとの混合液）の加熱温度を２５℃以上１００℃以下に調整すると、クロストリジウム菌を培養させた際の草本類バイオマスの糖化効率がきわめて高いものとなるので好ましい。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明に係る草本類バイオマスの糖化処理方法について、実施例および比較例により詳細に説明する。
【００１５】
［実施例1］
１．０ ｗｔ％水酸化ナトリウム溶液２ｌ（リットル）にネピアグラスの乾燥粉末４０ｇを加え撹拌しながら、６０℃で２４時間の処理を施した。その後、塩酸を用いてｐＨを７．０に中和し、溶液から残渣（バイオマス）を取り出して水洗後、８０℃で２４時間乾燥し、希アルカリ処理ネピアグラスとして冷暗所に保存した。次に、以下の表１に示すＧＳ培地に表２のビタミンを加え、炭素源としてセロビオースを濃度０．５％に調整した培地（ｐＨ７．４）を前培養培地とした。この前培養培地５ｍｌにクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株の凍結菌体を植菌し、２日間６０℃にて前培養を行った。本培養で用いた培地は、上記前培養用ＧＳ培地と同様であるが、炭素源としてセロビオースの代わりに希アルカリ処理を施したネピアグラスを０．５％の濃度で添加した。本培養は本培養用の培地（８０ｍｌ）に増殖したクロストリジウムを含む前培養液を５％植菌して行った。酵素の活性測定は４-methylumbelliferonを含む蛍光物質を基質に用いて、分解後の蛍光を測定し、 セルラーゼ活性（Endoglucanase：エンドグルカナーゼ、Cellobiohydrolase：セロビオヒドロラーゼ、β-glucosidase：グルコシダーゼ）を測定することで行った。
【００１６】
１．Endoglucanase活性とCellobiohydrolase活性
１．２５ｍＭ ４-methylumbelliferyl-cellobioside ３２μｌ
１００ｍＭ グルコノラクトン ２μｌ
ＤＷ ２μｌ
培養上清 ４μｌ
５０℃、３０分
【００１７】
２．Endoglucanase活性（Cellobioseを加えてセロビオヒドロラーゼの活性を阻害）
１．２５ｍＭ ４-methylumbelliferyl-cellobioside ３２μｌ
１００ｍＭ グルコノラクトン ２μｌ
２ｍＭ Cellobiose ２μｌ
培養上清 ４μｌ
５０℃、３０分
【００１８】
なお、４-methylumbelliferyl-cellobiosideの基質ではEndoglucanase活性およびセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨＩ）活性が同時に出るので、上記基質に０．２５ｍＭとなるようにセロビオースを添加してセロビオヒドロラーゼ活性を阻害し、ＣＢＨＩ活性だけを除いたものが Endoglucanase活性と定義し、残りをセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨＩ）活性と定義した。
【００１９】
３．β-glucosidase活性、β-xylosidase活性
１．２５ｍＭ ４-Methylumbelliferyl-glucoside(or xyloside) ３２μｌ
ＤＤＷ ４μｌ
培養上清 ４μｌ
５０℃、３０分
【００２０】
４．活性測定と単位
蛍光分光光度計により、３６５ｎｍの励起光で４５５ｎｍの蛍光を測定した。両活性も１ｍｉｎ当たり１μｍｏｌｅの４-methylumbelliferonを遊離する活性を１Ｕと定義した。
【００２１】
また、培養液を２０時間放置した後の様子（ネピアグラス残査の量等）を目視によって観察した。測定結果および観察結果を表３に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】
［実施例２］
ネピアグラス粉末を水酸化ナトリウムで処理する際の水酸化ナトリウム溶液の濃度を２．０ｗｔ％に変更した以外は実施例１と同様にして培養液を調製し、当該培養液を１０時間、１５時間、２０時間放置した後のセルロース分解酵素の活性を実施例１と同様に測定した。また、培養液を２０時間放置した後の様子を実施例１と同様に目視によって観察した。測定結果および観察結果を表３に示す。
【００２５】
［実施例３］
ネピアグラス粉末に水酸化ナトリウム溶液を加えた混合液の加熱温度を２５℃に変更した以外は、実施例１と同様にして培養液を調製し、当該培養液を１０時間、１５時間、２０時間放置した後のセルロース分解酵素の活性を実施例１と同様に測定した。また、培養液を２０時間放置した後の様子を実施例１と同様に目視によって観察した。測定結果および観察結果を表３に示す。
【００２６】
［実施例４］
ネピアグラス粉末に水酸化ナトリウム溶液を加えた混合液の加熱温度を２５℃に変更するとともに、ネピアグラス粉末を水酸化ナトリウムで処理する際の水酸化ナトリウム溶液の濃度を２．０ｗｔ％に変更した以外は実施例１と同様にして培養液を調製し、当該培養液を１０時間、１５時間、２０時間放置した後のセルロース分解酵素の活性を実施例１と同様に測定した。また、培養液を２０時間放置した後の様子を実施例１と同様に目視によって観察した。測定結果および観察結果を表３に示す。
【００２７】
［比較例１］
本培養で希アルカリ処理を施したネピアグラスの代わりに、ネピアグラスの乾燥粉末を０．５ｗｔ％の濃度で添加する以外は実施例1と同様に行い、１０時間、１５時間、２０時間後および４日後のセルロース分解酵素の活性を測定した。また、培養液を２０時間放置した後の様子を実施例１と同様に目視によって観察した。測定結果および観察結果を表３および図１に示す。
【００２８】
［実施例５］
糖化酵素（セルロソーム）を含有させたクロストリジウム・サーモセラムATCC27405株の培養液を用いてネピアグラスの糖化実験を行った。当該セルロソームは、クロストリジウムの細胞表層に結合して存在する場合には、細胞表層の突起物として観察されるが、培養液中にも分泌生産されるため、菌体を除いた培養液や、培養液からタンパク質を抽出した抽出液は、高いセルラーゼ活性を有している。なお、クロストリジウム培養液からのセルロソーム含有抽出液の調製は次のように行った。クロストリジウム・サーモセラムATCC27405株を０．５％（ｗ／ｖ）の微小結晶性セルロース（Avicel）を含むクロストリジウム・サーモセラム用培養液で３０時間、６０℃で培養した。基質（Avicel）がほとんど完全に消化された後、菌体と残りのセルロースを遠心分離によって取り除いた。無細胞となったセルロソームを含む上澄みの培養液を氷で冷却し、リン酸膨潤セルロース（０．１２ｇ／ｌ培養液）を加えた。４℃で２時間冷却後、リン酸膨潤セルロースを含んだ培養液（懸濁液）を１０，０００ｘｇで遠心分離し、セルロソームが結合した沈殿物（リン酸膨潤セルロース）には、セルロソーム遊離用の緩衝液（１２ｍＭ ＣａＣｌ２／２ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ 緩衝液，pＨ７．５）を加えた。 懸濁液を透明な液になるまで（３〜５時間）、５０℃、酢酸セルロース製の透析チューブで上記緩衝液に対して透析した。 サンプルを１０，０００ｘｇで遠心分離し、遊離したセルロソームを含む上清を限外濾過で濃縮し、セファロース４Ｂクロマトグラフィーで分子量により分画した。 カラム平衡用の緩衝液として５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ 緩衝液，ｐＨ７．５を用いた。最初のピークにセルロソームが回収され、これを精製セルロソームとした。しかる後、ＮａＮ３を最終濃縮０．０５％（ｗ／ｖ）になるように加え、セルロソーム濃度を０．９ｍｇ／ｍｌに合わせて保存した。このセルロソーム含有培養液の抽出液を用いた糖化実験は、クロストリジウム・サーモセラムATCC27405株を２日培養した培養液を用い、タンパク量０．１ｍｇ、反応溶液 ５ｍＬ、基質濃度（ネピアグラス濃度）０．６％の条件下で行った。また、ネピアグラスとしては、粉末試料を６０℃に加熱した１％ のＮａＯＨ中で加熱処理した希アルカリ処理試料を用いた。ネピアグラスの分解の程度は、糖化に伴い分解される糖を定量分析することで評価した。その評価結果を表３および図２ に示す。
【００２９】
［比較例２］
ネピアグラス試料として希アルカリ処理を施していないネピアグラスを用いた以外は実施例５と同様に行い、ネピアグラスの分解の程度を評価した。評価結果を表３および図２に示す。
【００３０】
【表３】
【００３１】
表３および図１から、ネピアグラス粉末を希アルカリ処理した後にクロストリジウム・サーモセラムを加えて培養液を調製した場合には、ネピアグラス粉末を希アルカリ処理することなく培養液を調製した場合に比べて、セルロース分解酵素の活性が上昇し、ネピアグラスの糖化（分解）が進んでいることが分かる。また、ネピアグラス粉末を希アルカリ処理する際の水酸化ナトリウム溶液の濃度が高い場合（２．０ｗｔ％の濃度の場合）、温度が高い場合（６０℃の場合）には、セルロース分解酵素の活性がより上昇し、ネピアグラスの糖化（分解）が一段と進み易い傾向にあることが分かる。
【００３２】
また、表３および図２から、ネピアグラスの場合には、６０℃の１％ＮａＯＨ中で処理した後に２４時間に亘りセルロソーム処理したときに、最も糖類が残留しており、特に、セロビオースが多く残留していたことが分かる。反対に、未処理では、ほとんど糖類が残留していないことが分かる。グルコースよりもセロビオースが多く残留しているのは、セルロソーム精製の過程でグルコシダーゼ活性が失われたためである。一方、生菌処理では、培地５０ｍＬに対して、１ｍＬの前培養液を使用した結果、ほとんど残留した糖類が見られなかったが、その理由は、分解された糖類が菌体の増殖に使われているためと考えられる。これらの実験結果から、クロストリジウム生菌は、糖化発酵同時進行（ＣＢＰ）の糖化処理に好適に用いることができ、また、セルロソームを含んだ培養液は、セルラーゼ代替物や並行発酵（ＳＳＦ）の糖化酵素として好適に用い得ることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明に係る草本類バイオマスの糖化処理方法は、上記の如く優れた効果を奏するものであるから、草本類バイオマスからのエタノール製造に好適に用いることができる。すなわち、上述の如く、クロストリジウム生菌の糖化機能は、バイオエタノール製造における糖化発酵同時進行（ＣＢＰ）の糖化処理に好適に用いることができ、セルロソームを含んだ培養液は、セルラーゼ代替物や並行発酵（ＳＳＦ）の糖化酵素として好適に用いることができる。また、セルロソームを含んだ培養液は、バイオエタノールに加えてバイオブタノール等のバイオ燃料や、有機酸やアミノ酸製造等のバイオリファイナリーの原料として用いるバイオマス（草本や木質などのリグノセルロース）の糖化処理に幅広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ネピアグラス（未処理）培養４日後の培養液中のＢＧＬ（βグルコシダーゼ）、ＢＸＬ（キシロシダーゼ）およびＥＧ（エンドグルカナーゼ）活性を示す図である。
【図２】セルロソームを含んだ培養抽出液によるネピアグラス分解中の残存糖を分析した結果であり、アルカリ処理および未処理のネピアグラスを比較した図である。ＮＰは未処理のネピアグラス、ＮＡはアルカリ処理（１％ ＮａＯＨ ６０℃）のネピアグラスである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、草本類バイオマスを糖化（分解）してアルコール等の有用物質を製造する技術に関するものであり、詳しくは、微生物を培養させることによって草本類バイオマスを糖化（分解）する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
石油に代わるエネルギー原料の製造方法として、各種のバイオマスからエタノールを製造する方法が注目されている。それらのバイオマスの中でも、稲わら・バガス等の草本類バイオマス（セルロース系バイオマス）は、存在量が膨大で再生可能という点から、注目すべき重要な材料の一つである。そして、そのような草本類バイオマスからエタノールを製造するために、バイオマスを糖化させる（分解する）方法としては、バイオマスを高濃度の酸やアルカリで加水分解する方法が知られている（特許文献１）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−４３３２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、バイオマスを高濃度の酸やアルカリで加水分解する方法は、高濃度の酸・アルカリ廃液が大量に発生するために、処理装置の腐食対策が必要となる。それゆえ、コストが高くなる上、環境に与える負荷が大きい、という不具合がある。
【０００５】
本発明の目的は、上記従来のバイオマスの糖化（分解）方法の問題点を解消し、安価、かつ、効率的に草本類バイオマスを分解することができる上、環境に与える負荷が小さく実用的な草本類バイオマスの糖化（分解）処理方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる本発明の内、請求項１に記載された発明は、草本類バイオマスを糖化するための糖化処理法であって、草本類バイオマスを濃度０．０１ｗｔ％以上１０ｗｔ％未満の希アルカリまたは希酸、有機溶媒で化学的に処理した後、その化学処理後の草本類バイオマスをクロストリジウム属細菌で処理する工程を有することを特徴とするものである。
【０００７】
請求項２に記載された発明は、請求項１に記載された発明において、前記草本類バイオマスが、ネピアグラスを主成分とするものであり、前記クロストリジウム属細菌が、クロストリジウム・サーモセラムであることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項３に記載された発明は、請求項１、または請求項２に記載された発明において、前記化学処理が、ネピアグラスを濃度０．０１ｗｔ％以上１０ｗｔ％未満の水酸化ナトリウム溶液中に浸漬させて２５℃以上１００℃以下に加熱するものであることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項４に記載された発明は、請求項１〜３のいずれかに記載された発明において、糖化処理にクロストリジウム属細菌の糖化酵素を含むクロストリジウム属細菌培養液、または糖化酵素を含む培養液の抽出液を用いることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のバイオマス糖化処理方法は、セルラーゼ等の高価な加水分解酵素を用いないため、草本類バイオマスを安価、かつ、効率的に糖化（分解）することが可能である。加えて、高濃度の酸・アルカリ等の化学廃液が発生しないので、装置が簡略化でき、省エネルギーで環境に与える負荷が小さい。また、同一の菌により酵素生産とエタノール発酵を行なう糖化発酵同時進行（ＣＢＰ：Consolidated Bio Processing）に用いる菌としてクロストリジウム属細菌を使用することができる。ＣＢＰは、次世代発酵法として注目されており、バイオエタノール生産コストを低減する上で、糖化酵素を自ら生産し、糖化と発酵を総て一段階で行う発酵法である。また、本糖化法はバイオエタノールだけでなく、バイオマスからの水素やブタノール等のバイオ燃料生産にも適用可能である。一方、培養液や抽出液は、クロストリジウム・サーモセラムなどが生産する高活性セルラーゼ複合体（セルロソーム）を含んでおり、これらは高活性セルラーゼとして、酵素によるセルロースの加水分解とエタノールの発酵を一つの反応装置内で同時に行なう同時糖化発酵システム（ＳＳＦ：Simultaneous Saccharification and Fermentation、または併行発酵法）にセルラーゼの代わりとして用いることができる。同様に、クロストリジウム培養液や抽出液は、バイオエタノールだけでなくバイオマスからの水素やブタノール等のバイオ燃料生産における糖化処理にも適用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明における草本類バイオマスとは、セルロース系バイオマスのことであり、かかる草本類バイオマスとしては、イネ、ムギ、サトウキビ、ヨシ、ススキ、トウモロコシ等の植物を主体とするバイオマスを好適に用いることができる。また、木質のセルロース、ヘミセルロースを含んだリグノセルロースからなるセルロース系バイオマスや、古紙等からなるセルロース系バイオマスも同様に用いることができる。なお、草本類バイオマスとして、ネピアグラスを主成分とするものを用いると、クロストリジウム菌を培養させた際の草本類バイオマスの糖化効率（分解効率）がより高いものとなるので好ましい。
【００１２】
また、クロストリジウム属菌としては、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・セルロボランス、クロストリジウム・アセトブチリカム等の各種のものを用いることが可能であるが、クロストリジウム・サーモセラムを用いると、クロストリジウム菌を培養させた際の草本類バイオマスの糖化効率がより向上するので好ましい。以下の実施例では、ＡＴＣＣ２７４０５株を用いたが、この株に限られるわけではない。
【００１３】
また、本発明における草本類バイオマスの化学処理とは、濃度０．０１ｗｔ％以上１０ｗｔ％未満の希アルカリまたは希酸、有機溶媒を用いて、草本類バイオマスからリグニンを除去する処理のことである。かかる化学処理に希アルカリ溶液を用いる場合には、希アルカリ溶液として、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム等からなるものを好適に用いることができる。なお、水酸化ナトリウムを用いて希アルカリ処理を行うと、クロストリジウム属菌を培養させた際の草本類バイオマスの糖化効率がより高いものとなるので好ましい。加えて、水酸化ナトリウムを用いて希アルカリ処理を行う際に、水酸化ナトリウム溶液（草本類バイオマスと水酸化ナトリウムとの混合液）の加熱温度を２５℃以上１００℃以下に調整すると、クロストリジウム菌を培養させた際の草本類バイオマスの糖化効率がきわめて高いものとなるので好ましい。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明に係る草本類バイオマスの糖化処理方法について、実施例および比較例により詳細に説明する。
【００１５】
［実施例1］
１．０ ｗｔ％水酸化ナトリウム溶液２ｌ（リットル）にネピアグラスの乾燥粉末４０ｇを加え撹拌しながら、６０℃で２４時間の処理を施した。その後、塩酸を用いてｐＨを７．０に中和し、溶液から残渣（バイオマス）を取り出して水洗後、８０℃で２４時間乾燥し、希アルカリ処理ネピアグラスとして冷暗所に保存した。次に、以下の表１に示すＧＳ培地に表２のビタミンを加え、炭素源としてセロビオースを濃度０．５％に調整した培地（ｐＨ７．４）を前培養培地とした。この前培養培地５ｍｌにクロストリジウム・サーモセラムＡＴＣＣ２７４０５株の凍結菌体を植菌し、２日間６０℃にて前培養を行った。本培養で用いた培地は、上記前培養用ＧＳ培地と同様であるが、炭素源としてセロビオースの代わりに希アルカリ処理を施したネピアグラスを０．５％の濃度で添加した。本培養は本培養用の培地（８０ｍｌ）に増殖したクロストリジウムを含む前培養液を５％植菌して行った。酵素の活性測定は４-methylumbelliferonを含む蛍光物質を基質に用いて、分解後の蛍光を測定し、 セルラーゼ活性（Endoglucanase：エンドグルカナーゼ、Cellobiohydrolase：セロビオヒドロラーゼ、β-glucosidase：グルコシダーゼ）を測定することで行った。
【００１６】
１．Endoglucanase活性とCellobiohydrolase活性
１．２５ｍＭ ４-methylumbelliferyl-cellobioside ３２μｌ
１００ｍＭ グルコノラクトン ２μｌ
ＤＷ ２μｌ
培養上清 ４μｌ
５０℃、３０分
【００１７】
２．Endoglucanase活性（Cellobioseを加えてセロビオヒドロラーゼの活性を阻害）
１．２５ｍＭ ４-methylumbelliferyl-cellobioside ３２μｌ
１００ｍＭ グルコノラクトン ２μｌ
２ｍＭ Cellobiose ２μｌ
培養上清 ４μｌ
５０℃、３０分
【００１８】
なお、４-methylumbelliferyl-cellobiosideの基質ではEndoglucanase活性およびセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨＩ）活性が同時に出るので、上記基質に０．２５ｍＭとなるようにセロビオースを添加してセロビオヒドロラーゼ活性を阻害し、ＣＢＨＩ活性だけを除いたものが Endoglucanase活性と定義し、残りをセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨＩ）活性と定義した。
【００１９】
３．β-glucosidase活性、β-xylosidase活性
１．２５ｍＭ ４-Methylumbelliferyl-glucoside(or xyloside) ３２μｌ
ＤＤＷ ４μｌ
培養上清 ４μｌ
５０℃、３０分
【００２０】
４．活性測定と単位
蛍光分光光度計により、３６５ｎｍの励起光で４５５ｎｍの蛍光を測定した。両活性も１ｍｉｎ当たり１μｍｏｌｅの４-methylumbelliferonを遊離する活性を１Ｕと定義した。
【００２１】
また、培養液を２０時間放置した後の様子（ネピアグラス残査の量等）を目視によって観察した。測定結果および観察結果を表３に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】
［実施例２］
ネピアグラス粉末を水酸化ナトリウムで処理する際の水酸化ナトリウム溶液の濃度を２．０ｗｔ％に変更した以外は実施例１と同様にして培養液を調製し、当該培養液を１０時間、１５時間、２０時間放置した後のセルロース分解酵素の活性を実施例１と同様に測定した。また、培養液を２０時間放置した後の様子を実施例１と同様に目視によって観察した。測定結果および観察結果を表３に示す。
【００２５】
［実施例３］
ネピアグラス粉末に水酸化ナトリウム溶液を加えた混合液の加熱温度を２５℃に変更した以外は、実施例１と同様にして培養液を調製し、当該培養液を１０時間、１５時間、２０時間放置した後のセルロース分解酵素の活性を実施例１と同様に測定した。また、培養液を２０時間放置した後の様子を実施例１と同様に目視によって観察した。測定結果および観察結果を表３に示す。
【００２６】
［実施例４］
ネピアグラス粉末に水酸化ナトリウム溶液を加えた混合液の加熱温度を２５℃に変更するとともに、ネピアグラス粉末を水酸化ナトリウムで処理する際の水酸化ナトリウム溶液の濃度を２．０ｗｔ％に変更した以外は実施例１と同様にして培養液を調製し、当該培養液を１０時間、１５時間、２０時間放置した後のセルロース分解酵素の活性を実施例１と同様に測定した。また、培養液を２０時間放置した後の様子を実施例１と同様に目視によって観察した。測定結果および観察結果を表３に示す。
【００２７】
［比較例１］
本培養で希アルカリ処理を施したネピアグラスの代わりに、ネピアグラスの乾燥粉末を０．５ｗｔ％の濃度で添加する以外は実施例1と同様に行い、１０時間、１５時間、２０時間後および４日後のセルロース分解酵素の活性を測定した。また、培養液を２０時間放置した後の様子を実施例１と同様に目視によって観察した。測定結果および観察結果を表３および図１に示す。
【００２８】
［実施例５］
糖化酵素（セルロソーム）を含有させたクロストリジウム・サーモセラムATCC27405株の培養液を用いてネピアグラスの糖化実験を行った。当該セルロソームは、クロストリジウムの細胞表層に結合して存在する場合には、細胞表層の突起物として観察されるが、培養液中にも分泌生産されるため、菌体を除いた培養液や、培養液からタンパク質を抽出した抽出液は、高いセルラーゼ活性を有している。なお、クロストリジウム培養液からのセルロソーム含有抽出液の調製は次のように行った。クロストリジウム・サーモセラムATCC27405株を０．５％（ｗ／ｖ）の微小結晶性セルロース（Avicel）を含むクロストリジウム・サーモセラム用培養液で３０時間、６０℃で培養した。基質（Avicel）がほとんど完全に消化された後、菌体と残りのセルロースを遠心分離によって取り除いた。無細胞となったセルロソームを含む上澄みの培養液を氷で冷却し、リン酸膨潤セルロース（０．１２ｇ／ｌ培養液）を加えた。４℃で２時間冷却後、リン酸膨潤セルロースを含んだ培養液（懸濁液）を１０，０００ｘｇで遠心分離し、セルロソームが結合した沈殿物（リン酸膨潤セルロース）には、セルロソーム遊離用の緩衝液（１２ｍＭ ＣａＣｌ２／２ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ 緩衝液，pＨ７．５）を加えた。 懸濁液を透明な液になるまで（３〜５時間）、５０℃、酢酸セルロース製の透析チューブで上記緩衝液に対して透析した。 サンプルを１０，０００ｘｇで遠心分離し、遊離したセルロソームを含む上清を限外濾過で濃縮し、セファロース４Ｂクロマトグラフィーで分子量により分画した。 カラム平衡用の緩衝液として５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ 緩衝液，ｐＨ７．５を用いた。最初のピークにセルロソームが回収され、これを精製セルロソームとした。しかる後、ＮａＮ３を最終濃縮０．０５％（ｗ／ｖ）になるように加え、セルロソーム濃度を０．９ｍｇ／ｍｌに合わせて保存した。このセルロソーム含有培養液の抽出液を用いた糖化実験は、クロストリジウム・サーモセラムATCC27405株を２日培養した培養液を用い、タンパク量０．１ｍｇ、反応溶液 ５ｍＬ、基質濃度（ネピアグラス濃度）０．６％の条件下で行った。また、ネピアグラスとしては、粉末試料を６０℃に加熱した１％ のＮａＯＨ中で加熱処理した希アルカリ処理試料を用いた。ネピアグラスの分解の程度は、糖化に伴い分解される糖を定量分析することで評価した。その評価結果を表３および図２ に示す。
【００２９】
［比較例２］
ネピアグラス試料として希アルカリ処理を施していないネピアグラスを用いた以外は実施例５と同様に行い、ネピアグラスの分解の程度を評価した。評価結果を表３および図２に示す。
【００３０】
【表３】
【００３１】
表３および図１から、ネピアグラス粉末を希アルカリ処理した後にクロストリジウム・サーモセラムを加えて培養液を調製した場合には、ネピアグラス粉末を希アルカリ処理することなく培養液を調製した場合に比べて、セルロース分解酵素の活性が上昇し、ネピアグラスの糖化（分解）が進んでいることが分かる。また、ネピアグラス粉末を希アルカリ処理する際の水酸化ナトリウム溶液の濃度が高い場合（２．０ｗｔ％の濃度の場合）、温度が高い場合（６０℃の場合）には、セルロース分解酵素の活性がより上昇し、ネピアグラスの糖化（分解）が一段と進み易い傾向にあることが分かる。
【００３２】
また、表３および図２から、ネピアグラスの場合には、６０℃の１％ＮａＯＨ中で処理した後に２４時間に亘りセルロソーム処理したときに、最も糖類が残留しており、特に、セロビオースが多く残留していたことが分かる。反対に、未処理では、ほとんど糖類が残留していないことが分かる。グルコースよりもセロビオースが多く残留しているのは、セルロソーム精製の過程でグルコシダーゼ活性が失われたためである。一方、生菌処理では、培地５０ｍＬに対して、１ｍＬの前培養液を使用した結果、ほとんど残留した糖類が見られなかったが、その理由は、分解された糖類が菌体の増殖に使われているためと考えられる。これらの実験結果から、クロストリジウム生菌は、糖化発酵同時進行（ＣＢＰ）の糖化処理に好適に用いることができ、また、セルロソームを含んだ培養液は、セルラーゼ代替物や並行発酵（ＳＳＦ）の糖化酵素として好適に用い得ることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明に係る草本類バイオマスの糖化処理方法は、上記の如く優れた効果を奏するものであるから、草本類バイオマスからのエタノール製造に好適に用いることができる。すなわち、上述の如く、クロストリジウム生菌の糖化機能は、バイオエタノール製造における糖化発酵同時進行（ＣＢＰ）の糖化処理に好適に用いることができ、セルロソームを含んだ培養液は、セルラーゼ代替物や並行発酵（ＳＳＦ）の糖化酵素として好適に用いることができる。また、セルロソームを含んだ培養液は、バイオエタノールに加えてバイオブタノール等のバイオ燃料や、有機酸やアミノ酸製造等のバイオリファイナリーの原料として用いるバイオマス（草本や木質などのリグノセルロース）の糖化処理に幅広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ネピアグラス（未処理）培養４日後の培養液中のＢＧＬ（βグルコシダーゼ）、ＢＸＬ（キシロシダーゼ）およびＥＧ（エンドグルカナーゼ）活性を示す図である。
【図２】セルロソームを含んだ培養抽出液によるネピアグラス分解中の残存糖を分析した結果であり、アルカリ処理および未処理のネピアグラスを比較した図である。ＮＰは未処理のネピアグラス、ＮＡはアルカリ処理（１％ ＮａＯＨ ６０℃）のネピアグラスである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
草本類バイオマスを糖化するための糖化処理法であって、
草本類バイオマスを濃度０．０１ｗｔ％以上１０ｗｔ％未満の希アルカリまたは希酸、有機溶媒で化学的に処理した後、その化学処理後の草本類バイオマスをクロストリジウム属細菌で処理する糖化工程を有することを特徴とする草本類バイオマスの糖化処理方法。
【請求項２】
前記草本類バイオマスが、ネピアグラスを主成分とするものであり、前記糖化工程を行うクロストリジウム属細菌が、クロストリジウム・サーモセラムであることを特徴とする請求項１に記載の草本類バイオマスの糖化処理方法。
【請求項３】
前記化学処理が、ネピアグラスを濃度０．０１ｗｔ％以上１０ｗｔ％未満の水酸化ナトリウム溶液中に浸漬させて２５℃以上１００℃以下に加熱するものであることを特徴とする請求項１、または請求項２に記載の草本類バイオマスの糖化処理方法。
【請求項４】
前記糖化処理に、クロストリジウム属細菌の糖化酵素を含むクロストリジウム属細菌培養液、または糖化酵素を含む培養液の抽出液を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の草本類バイオマスの糖化処理方法。
【請求項１】
草本類バイオマスを糖化するための糖化処理法であって、
草本類バイオマスを濃度０．０１ｗｔ％以上１０ｗｔ％未満の希アルカリまたは希酸、有機溶媒で化学的に処理した後、その化学処理後の草本類バイオマスをクロストリジウム属細菌で処理する糖化工程を有することを特徴とする草本類バイオマスの糖化処理方法。
【請求項２】
前記草本類バイオマスが、ネピアグラスを主成分とするものであり、前記糖化工程を行うクロストリジウム属細菌が、クロストリジウム・サーモセラムであることを特徴とする請求項１に記載の草本類バイオマスの糖化処理方法。
【請求項３】
前記化学処理が、ネピアグラスを濃度０．０１ｗｔ％以上１０ｗｔ％未満の水酸化ナトリウム溶液中に浸漬させて２５℃以上１００℃以下に加熱するものであることを特徴とする請求項１、または請求項２に記載の草本類バイオマスの糖化処理方法。
【請求項４】
前記糖化処理に、クロストリジウム属細菌の糖化酵素を含むクロストリジウム属細菌培養液、または糖化酵素を含む培養液の抽出液を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の草本類バイオマスの糖化処理方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−１１０２３０（Ｐ２０１０−１１０２３０Ａ）
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８３３４４（Ｐ２００８−２８３３４４）
【出願日】平成２０年１１月４日（２００８．１１．４）
【出願人】（０００２１３２９７）中部電力株式会社 (811)
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月４日（２００８．１１．４）
【出願人】（０００２１３２９７）中部電力株式会社 (811)
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【Ｆターム（参考）】
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