薄型分析用具
本発明は、試薬部（３３）が配置され、かつ試料液を保持するための反応空間（６）を備えた分析用具（１）に関する。試薬部（３３）は、反応空間（６）に試料液が保持されたときに溶解するように構成されている。反応空間（６）の一部は、互いに対面する第１および第２面（３１ｃ，５ａ）によって規定されており、第１および第２面（３１ｃ，５ａ）の対面距離（Ｈ１）が４５μｍ以下に設定されている。対面距離（Ｈ１）は、たとえば第１または第２電極（３１，３２）の上面（３１ｃ，３２ｃ）から、第２板材（５）における当該電極（３１、３２）の上面（３１ｃ，３２ｃ）に対面する部分（５ａ）までの最小距離とされる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、血液などの試料液中の特定成分（たとえばグルコースやコレステロール）の濃度を分析する際に使用される分析用具に関する。
【背景技術】
糖尿病患者にとっては、血糖値を管理するために日頃から自己の血糖値を把握しておくことは重要である。その一方、頻繁に医療機関に足を運ぶのが煩わしいことから、患者自身が簡易に血糖値の測定を行え、しかも出先などでも血糖値の測定を手軽に行えるように、手のひらに納まるようなサイズの携帯型の簡易血糖値測定装置が用いられている。このような血糖値測定装置を用いての血糖値測定は、酵素反応場を提供するグルコースセンサを血糖値測定装置に装着し、グルコースセンサに対して血液（検体）を供給することにより行われている。
グルコースセンサとしては、アンペロメトリー法やクーロメトリー法に代表される電気化学的手法を利用して、簡易血糖値測定装置においてグルコース濃度を測定できるように構成されたものがある。この種のグルコースセンサは、たとえば１対の電極（作用極および対極）と、試薬層と、この試薬層を内部に収容したキャピラリと、を備えたものとして構成されている。
アンペロメトリー法を採用する場合には、たとえば作用極および対極は同一平面状に横並びして、あるいは互いに対向して配置され、クーロメトリー法を採用する場合には、一般に、作用極および対極は対向するようにして配置される。試薬層は、酸化還元酵素および電子伝達物質を含んだものとして構成されるが、酸化還元酵素としてはＧＯＤが、電子伝達物質としてはフェリシアン化カリウムが汎用されている。このようなグルコースセンサでは、キャピラリを利用して試薬層に検体が供給されたときに、酸化還元酵素によって、たとえばグルコースの酸化反応が触媒される一方で、電子伝達物質の還元反応が触媒される。
グルコースセンサに対する血液の供給は、一般に、測定者の皮膚を切開して血液を出液させ、この血液をグルコースセンサに導入することにより行われている。この方法では、血液採取に対する測定者への負担を小さくする観点からは、採取すべき血液量が少ないほうが好ましい。そのため、検体量の低減のために様々な改良が検討されている（たとえば日本国特表２０００−５０９５０７号公報および米国特許出願公開第２００２／００９２６１２号明細書参照）。
日本国特表２０００−５０９５０７号公報には、クーロメトリー法を利用して少ないサンプル量でグルコース濃度を測定できるように、作用極および対極を対向配置し、かつ電極間の離間距離を５０μｍ以下としたグルコースセンサが開示されている。このグルコースセンサでは、使用すべき血液量を少なくすることはできるが、クーロメトリー法は殆ど全てのグルコースを反応させる方法であるため、測定時間が著しく長くなってしまうといった問題がある。
これに対して、米国特許出願公開第２００２／００９２６１２号明細書には、サンプル量を１．５μＬ以下と少なくしつつも、測定時間を１０秒と短くしたグルコースセンサが開示されている。このグルコースセンサでは、基板とカバーとの間に、作用極、対極および試薬層を配置したキャビティが形成されており、基板とカバーとの間の距離が２００μｍ以下とされている。このグルコースセンサでは、試薬層は、たとえばグルコースオキシダーゼおよびフェリシアン化物を含んだ状態で作用極の表面に固定化され、非水溶性とされている。
しかしながら、米国特許出願公開第２００２／００９２６１２号明細書に開示されたグルコースセンサにおいても、測定時間の短縮が十分であるとは言い難く、また測定精度の面において未だ改善の余地がある。
【発明の開示】
本発明は、測定時間を短く維持しつつも、微量の試料液によって精度良く濃度測定を行えるようにすることを目的としている。
本発明者は、上記した目的を達成すべく鋭意検討した結果、従来のグルコースセンサにおいて測定時間を短くすることができない原因の１つが試薬層の構成にあることに着目し、本発明をするに至った。
すなわち、従来のグルコースセンサの試薬層では、試薬層を作用極の表面に固定化しているために、グルコースとグルコースオキシダーゼとの反応が作用極の表面においてのみ生じ、グルコースとグルコースオキシダーゼの反応に時間を要して測定時間が長くなる。このような不具合を解消するためには、試薬層を試料液（血液）によって溶解しやすい構成とすることが考えられる。この場合、電子伝達物質が試料液（血液）中を拡散することとなるため、電子伝達物質の拡散に影響を与える因子、たとえば試料液の固体成分（血液における血球成分など）の割合の影響、あるいは試料液の温度の影響を排除する必要が生じる。また、フェリシアン化物のように血液に対する溶解性が比較的に小さいものを用いると、溶解時間が長くなって測定時間が長くなる。
本発明者はさらに、測定精度をさらに向上させるためには、次に説明する点を改善することが望ましいとの知見も得ている。すなわち、第１に、フェリシアン化物のように血液に対する溶解性が比較的に小さいものを用いると、溶解性のバラツキに起因して測定精度が悪化する虞がある。また、フェリシアン化物は保存安定性が悪く、保存時において容易に還元体へと移行するため、この点においても測定精度が低下することが懸念される。第２に、グルコースオキシダーゼは、グルコースとの反応速度が比較的に小さい（Ｋｍ（ミカエリス定数）が大きい）ため、グルコースオキシダーゼを使用することは測定時間を短縮する上では好ましくない。
以上の事情に鑑み、本発明においては、試料液を保持するための反応空間を備えた分析用具であって、上記反応空間には、試料液が保持されたときに溶解する試薬部が配置されており、上記反応空間の一部は、互いに対面する第１および第２面によって規定されており、かつ上記第１および第２面の対面距離が４５μｍ以下に設定されている、薄型分析用具が提供される。対面距離は、好ましくは２５〜４５μｍの範囲とされる。
本発明の薄型分析用具は、たとえば互いに対向した状態で間隔を隔てて配置され、かつ反応空間を規定する第１および第２板材を備えたものとして構成される。この場合、第１および第２面は、たとえば第１および第２板材の厚み方向に直交する方向に広がりをもつ面とされる。
本発明の薄型分析用具は、たとえば第１板材の一面に設けられ、かつ少なくとも一部が反応空間に臨むとともに、試料液に電圧を印加するために利用される第１および第２電極を備えたものとして構成される。この場合、対面距離は、第１または第２電極の上面（たとえば第１面に相当）から、第２板材における当該電極の上面に対面する部分（たとえば第２面に相当）までの最小距離として定義される。
本発明の薄型分析用具は、第１板材に設けられた第１電極と、第１電極に対面するように第２板材に設けられ、かつ第１電極とともに試料液に電圧を印加するために利用される第２電極と、を備えたものとして構成してもよい。この場合、対面距離は、第１電極の上面（たとえば第１面に相当）と第２電極の上面（たとえば第２面に相当）との間における最小距離として定義される。
反応空間は、たとえば毛細管力により試料を移動させることができるように構成される。
試薬部は、たとえば電子伝達物質および酸化還元酵素を含んだものとして構成される。
電子伝達物質としては、Ｒｕ化合物を用いるのが好ましい。Ｒｕ化合物としては、下記化学式（１）で示されるものを使用することができる。
［Ｒｕ（ＮＨ３）５Ｘ］ｎ＋ ・・・（１）
化学式（１）においては、Ｘとしては、ＮＨ３、ハロゲンイオン、ＣＮ、ピリジン、ニコチンアミド、あるいはＨ２Ｏが挙げられるが、ＸはＮＨ３またはハロゲンイオンであるのが好ましい。化学式（１）におけるｎ＋は、Ｘの種類により決定される酸化型Ｒｕ（ＩＩＩ）錯体の価数を表している。
酸化還元酵素としては、分析対象成分がグルコースである場合には、グルコース脱水素活性を有するＧＤＨを使用するのが好ましい。ＧＤＨとしては、ＦＡＤを補欠因子とするグルコース脱水素酵素（αＧＤＨ）を使用するのが好ましい。ＧＤＨとしてはさらに、αＧＤＨにチトクロムＣが結合したＧＤＨ（ＣｙＧＤＨ）を使用するのが好ましい。ＣｙＧＤＨおよびαＧＤＨとしては、国際公開第ＷＯ０２／３６７７９号パンフレットに開示されているものが挙げられる。ＧＤＨとしては、ブルクホルデリア属に属する微生物に由来のものを使用するのが好ましいが、ＣｙＧＤＨやαＧＤＨと同じＦＡＤおよびチトクロムＣをもつ他属の微生物に由来のＧＤＨを使用することもできる。他属の例としてＲａｌｓｔｏｎｉａ属あるいはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の中で病原性を持つグラム陰性菌が挙げられる。
たとえばαＧＤＨは、グルコース脱水素活性を有するサブユニットとして、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約６０ｋＤａであるＧＤＨ活性タンパク質（αサブユニット）を含んだものである。一方、ＣｙＧＤＨは、αサブユニットと、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約４３ｋＤａである電子伝達タンパク質（チトクロムＣ）と、をサブユニットとして含むものである。αＧＤＨやＣｙＧＤＨとしては、αサブユニットやチトクロムＣ以外のサブユニットをさらに有するものを使用することもできる。
ＣｙＧＤＨは、たとえばブルクホルデリア・セパシアに属する微生物が菌体外に分泌した酵素を精製し、あるいは当該菌体の菌体内酵素を精製することにより得ることができる。一方、αＧＤＨは、たとえばブルクホルデリア・セパシアに属する微生物から採取したαＧＤＨをコードする遺伝子が移入された形質転換体を形成し、この形質転換体から外部に分泌された酵素を精製し、あるいは当該形質転換体の菌体内酵素を精製することにより得ることができる。
ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物としては、たとえばブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株を使用することができる。このＫＳ１株は、平成１２年９月２５日に独立特許法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に微生物受託番号第ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０６として寄託されている。
試料液としては、たとえば血液、尿、唾液およびこれらの調整液などの生化学的試料が挙げられ、分析対象成分としては、たとえばグルコース、コレステロール、乳酸およびアスコルビン酸が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明に係るバイオセンサの全体斜視図である。
図２は、図１のＩＩ−ＩＩ線に沿う断面図である。
図３は、図１に示したバイオセンサの分解斜視図である。
図４は、図１ないし図３に示したバイオセンサを濃度測定装置に装着した状態を示すものであり、バイオセンサについては平面図で、濃度測定装置についてはブロック図で示したものである。
図５Ａおよび図５Ｂは、バイオセンサの作用を説明するためのものであり、バイオセンサの要部断面図である。
図６Ａおよび図６Ｂは、バイオセンサの他の例を示す断面図である。
図７は、本案バイオセンサ１に対する血液のヘマトクリット値の影響を示すグラフである。
図８は、本案バイオセンサ２に対する血液のヘマトクリット値の影響を示すグラフである。
図９は、比較バイオセンサ１に対する血液のヘマトクリット値の影響を示すグラフである。
図１０は、本案バイオセンサ１に対する血液の温度の影響を示すグラフである。
図１１は、本案バイオセンサ２に対する血液の温度の影響を示すグラフである。
図１２は、比較バイオセンサ１に対する血液の温度の影響を示すグラフである。
図１３は、本案バイオセンサ１に対する測定レンジの評価結果を示すグラフである。
図１４は、本案バイオセンサ３に対する再現性を、応答電流値のタイムコースとして評価した結果を示すグラフである。
図１５は、本案バイオセンサ４に対する再現性を、応答電流値のタイムコースとして評価した結果を示すグラフである。
図１６は、比較バイオセンサ２に対する再現性を、応答電流値のタイムコースとして評価した結果を示すグラフである。
図１７は、本案バイオセンサ３，４および比較バイオセンサ２に対する再現性を、Ｃ．Ｖ．のタイムコースとして評価した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面を参照しつつ具体的に説明する。本実施の形態においては、血糖値を測定するように構成されたグルコースセンサを例にとって説明するが、本発明は、血糖値を測定する場合に限定されず、血液中の他の成分あるいは血液以外の試料液を分析する分析用具に対しても適用することができる。
図１ないし図３に示したグルコースセンサ１は、濃度測定装置２に装着して使用するものであり（図４参照）、長矩形状の基板３に対して、スペーサ４を介してカバー５を積層した形態を有している。このグルコースセンサ１においては、各要素３〜５により反応空間６が規定されている。この反応空間６は、矩形断面を有する柱状の空間として規定されており、開口部（導入口）６１から導入された試料液を毛細管力を利用して移動させ、かつ導入された試料液を保持することができる。
スペーサ４は、基板３の上面３０からカバー５の下面５ａまでの距離、すなわち反応空間６の高さ寸法を規定するためのものである。このスペーサ４には、先端部が開放したスリット４１が形成されている。スリット４１は、反応空間６の幅寸法を規定するためのものであり、スリット４１における先端の開放部は、反応空間６の内部に試料液を導入するための導入口６１を構成するためのものである。
カバー５は、排気口５１を有している。排気口５１は、反応空間６の内部の気体を外部に排出するためのものであり、反応空間６の内部と連通している。したがって、導入口６１を介して反応空間６内に試料液が導入された場合には、反応空間６において生じる毛細管力により、試料液がカバー５に形成された排気口５１に向けて反応空間６の内部を移動する。
図３によく表れているように、基板３の上面３０には、作用極３１、対極３２および試薬部３３が形成されている。作用極３１および対極３２は、全体として基板３の長手方向に延びている。作用極３１および対極３２の端部３１ａ，３２ａは、基板３の短手方向に延び、かつ長手方向に並んでいる。一方、作用極３１および対極３２の端部３１ｂ，３２ｂは、後述する濃度測定装置２の第１および第２端子２０ａ，２０ｂ（図４参照）と接触させるための端子部を構成している。
作用極３１および対極３２は、たとえばスクリーン印刷、メッキ、あるいはスパッタリングにより、厚み寸法Ｄ（図２参照）が２０μｍ以下にされている。好ましくは、作用極３１および対極３２の厚み寸法Ｄは、１〜１０μｍに設定される。作用極３１の上面３１ｃからカバー５の下面５ａまでの対面距離Ｈ１（図２参照）は、４５μｍ以下、好ましくは２５〜４５μｍに設定されている。これは、対面距離Ｈ１が不当に大きいと、後述するように血液の温度やヘマトクリット値の影響を受け易い反面、対面距離Ｈ１が不当に小さいと、反応空間６の内部において血液を適切に移動させることができなくなるからである。
試薬部３３は、たとえばメディエータ（電子伝達物質）および相対的に少量の酸化還元酵素を含む固体状に形成されており、図２および図３によく表れているように、作用極３１および対極３２の端部３１ａ，３２ａどうしを橋渡すようにして設けられている。この試薬部３３は、血液に対して容易に溶解するものとされている。したがって、反応空間６に血液を導入した場合には、メディエータ、酸化還元酵素およびグルコースを含む液相反応系が構築される。この液相反応系においては、作用極３１の上面３１ｃのみならず、反応空間６における広範囲にわたってグルコースの酸化反応と、メディエータの還元反応が生じる。したがって、作用極の表面にメディエータや酸化還元酵素を固定化する場合に比べて、より短時間でより多くのグルコースを酸化させることができる。これにより、測定時間の短縮を図ることができるようになる。
メディエータとしては、Ｒｕ化合物を使用するのが好ましい。Ｒｕ化合物としては、たとえばＲｕ錯体が挙げられる。Ｒｕ錯体としては、電子伝達体として機能すればその配位子の種類は特に限定されないが、試薬部３３に酸化型の状態で含ませるのが好ましく、たとえば酸化型が下記化学式（２）で示されるものが使用される。
［Ｒｕ（ＮＨ３）５Ｘ］ｎ＋ ・・・（２）
化学式（２）におけるＸとしては、ＮＨ３、ハロゲンイオン、ＣＮ、ピリジン、ニコチンアミド、あるいはＨ２Ｏが挙げられるが、ＮＨ３またはハロゲンイオンが好ましい。一方、化学式におけるｎ＋はＸの種類により決定される酸化型（ＩＩＩ）錯体の価数を表している。
Ｒｕ錯体は、還元型（ＩＩ）が不安定なために通常は酸化型（ＩＩＩ）として存在する。そのため、グルコースセンサ１の試薬部３３にＲｕ錯体を混在させた状態で光や水に曝露されたとしても、メディエータが容易に還元してしまうことはない。そのため、メディエータの曝露に起因して測定誤差が生じることを抑制することができるようになる。また、Ｒｕ錯体は結晶化しにくく、微粉末状態を適切に維持することができるといった特性を有している。そのため、Ｒｕ錯体を用いれば、保存時に試薬部３３の溶解性が悪化することもない。さらには、Ｒｕ錯体とαＧＤＨやＣｙＧＤＨとの組み合わせについていえば、Ｒｕ錯体の電子伝達速度が大きいために測定時間を短くすることができるといった利点がある。
一方、酸化還元酵素としては、上述したαＧＤＨまたはＣｙＧＤＨを使用するのが好ましい。これらの酵素は、グルコースオキシダーゼに比べてグルコースに対する反応速度が大きいといった利点がある。この点からも、測定時間の短縮を図ることができるようになる。
図４に示したように、濃度測定装置２は、第１および第２端子２０ａ，２０ｂ、電圧印加部２１、電流値測定部２２、検知部２３、制御部２４、演算部２５および表示部２６を備えている。
第１および第２端子２０ａ，２０ｂは、濃度測定装置２に対してグルコースセンサ１を装着した場合に、グルコースセンサ１における作用極３１および対極３２の端部３１ｂ，３２ｂに接触させるためのものである。
電圧印加部２１は、第１および第２端子２０ａ，２０ｂを介して、グルコースセンサ１の作用極３１と対極３２との間に電圧を印加する際に利用される。電圧印加部２１としては、たとえば乾電池または充電池などの直流電源が使用される。
電流値測定部２２は、作用極３１および対極３２間への電圧印加時における作用極３１とメディエータとの間の電子の授受量を、応答電流値として測定するためのものである。
検知部２３は、濃度測定装置２にグルコースセンサ１を装着した後において、電流値測定部２２によって測定された電流値に基づいて、試薬部３３（図１ないし図３参照）に試料液が供給されたか否かを確認するためのものである。
制御部２４は、電圧印加部２１を制御し、作用極３１および対極３２の間に電圧が印加される状態（閉回路）と印加されない状態（開回路）とを選択するものである。
演算部２５は、電流値測定部２２により測定された応答電流値に応じて、グルコース濃度の演算を行うものである。演算部２５は、たとえばグルコース濃度をアンペロメトリックな手法により演算できるように構成されている。アンペロメトリックな手法を用いれば、クーロメトリックな手法を採用するよりも、短時間で濃度測定を行うことができる。
検知部２３、制御部２４、および演算部２５のそれぞれは、たとえばＣＰＵおよびＲＯＭやＲＡＭなどのメモリにより構成されるが、検知部２３、制御部２４、および演算部２５の全てを、１つのＣＰＵに対して複数のメモリを接続することにより構成することも可能である。
表示部２６は、演算部２５による演算結果の他、たとえばエラーである旨や操作手順などを表示するためのものであり、たとえば液晶表示装置により構成される。
次に、グルコースセンサ１および濃度測定装置２を用いたグルコース濃度の測定の手順について説明する。
図４に良く表れているように、まずグルコースセンサ１を濃度測定装置２に装着する。そうすると、グルコースセンサ１の作用極３１および対極３２の端部３１ｂ，３２ｂが濃度測定装置２の第１および第２端子２０ａ，２０ｂに接触する。この状態では、第１および第２端子２０ａ，２０ｂを介して、作用極３１および対極３２の間への電圧の印加が可能とされている。実際の測定においては、濃度測定装置２にグルコースセンサ１を装着した時点から、作用極３１と対極３２との間に定電圧が印加される。Ｒｕ錯体は、低電圧でメディエーションを起こすため、Ｒｕ錯体を用いる場合には、作用極３１および対極３２の間に印加する定電圧は、たとえば１００〜５００ｍＶの範囲に設定される。本実施の形態では、作用極３１および対極３２の間への定電圧の印加は、グルコース濃度を演算するための応答電流値が測定されるまでは継続して行われているものとする。
次いで、グルコースセンサ１の導入口６１を介して反応空間６に血液を導入する。血液は、毛細管力により導入口６１からカバー５に形成された排気口５１に向けて反応空間６内を進行する。その過程においては、血液が試薬部３３を溶解させる。
一方、試薬部３３に血液が供給されれば、酸化還元酵素によりグルコースがグルコノラクトンに酸化されるとともにメディエータが還元型とされる。なお、グルコノラクトンは非酵素的にグルコン酸となる。
還元型のメディエータは、作用極３１および対極３２の端部３１ｂ，３２ｂを介して作用極３１および対極３２に定電圧を印加した状態では、作用極の端部３１ａ側に移動し、この端部３１ａに電子を放出して酸化型のメディエータとなる。したがって、電圧印加部２１により作用極３１および対極３２間に定電圧を印加した状態では、還元型メディエータから付与された電子量が作用極３１および第１端子２０ａを介して電流値測定部２２において応答電流として測定される。この応答電流値は、電圧印加によって試薬部３３を移動した還元型のメディエータに由来する電子量に相関するものであり、いわゆる拡散電流と呼ばれるものである。
一方、電流値測定部２２において測定された応答電流値は、検知部２３においてモニタリングされており、応答電流値が閾値を越えた時点で、検知部２３は試薬部３３に血液が供給され、試薬部３３が溶解したことを検知する。検知部２３において血液が供給されたことが検知された場合には、この検知から一定時間経過したか否かが検知部２３により判断される。
検知部２３において一定時間が経過したと判断された場合には、電流値測定部２２において応答電流値を測定し、この応答電流値に基づいて、演算部２５においてグルコース濃度が演算される。グルコース濃度の演算は、応答電流値を電圧値に換算した後に、この電圧値を、予め作成しておいた電圧値とグルコース濃度との関係を示す検量線に当てはめることにより演算される。演算部２５における演算結果は、たとえば表示部２６において表示される。
作用極３１に接触している還元型のメディエータは、即座に作用極３１に対して電子を放出して酸化型となるが、作用極３１から一定距離離れた還元型のメディエータであっても、作用極３１に対して電子を放出して酸化型となる。以下、作用極３１に対して還元型のメディエータが電子を放出可能な領域を電子放出領域、作用極３１に対して還元型のメディエータが電子を放出することができない領域を非電子放出領域ということとする。
後述する実施例から推測できるように、電子放出領域における作用極の表面からの距離は、４５μｍよりも小さくなることはない。したがって、図５Ａに示したように、作用極３１の上面３１ｃからカバー５の下面５ａまでの対面距離Ｈ１が比較的に大きい場合、たとえば対面距離Ｈ１が５０μｍ以上の場合には、作用極３１の直上においては、電子放出領域７０の上方に非電子放出領域７１が存在することとなる。
これに対して、本願のグルコースセンサ１のように、作用極３１の上面３１ｃからカバー５の下面５ａまでの対面距離Ｈ１が４５μｍ以下に設定されている場合には、図５Ｂに示したように、電子放出領域７０における作用極３１の直上に位置する部分の厚み寸法（以下、単に「電子放出領域７０の厚み寸法」という）が対面距離Ｈ１に一致し、この電子放出領域７０の厚み寸法は、図５Ａに示した場合と同等かもしくはそれよりも小さくなる。
このように、対面距離Ｈ１が大きい場合（図５Ａ参照）と小さい場合（図５Ｂ参照）とでは、作用極３１の直上における様子が異なったものとなる。その結果、後述する本発明の実施例からも推測できるように、対面距離Ｈ１の大小により、還元型メディエータが消費される様子が異なったものとなる。
ここで、電圧非印加状態において、電子放出領域に存在する還元型のメディエータ（以下、「非拡散メディエータ」という）の濃度と、非電子放出領域に存在する還元型のメディエータ（以下、「拡散メディエータ」という）の濃度とが同一である系を考える。
図５Ａに示した対面距離Ｈ１が大きいケースでは、電子放出領域７０（点線で囲まれた部分）の厚み寸法が大きいために、電圧印加時に非拡散メディエータの全てが酸化されるわけではない。したがって、非拡散メディエータが一定量ずつ消費され、これに起因して電子放出領域７０と非電子放出領域７１との間に還元型メディエータの濃度差が生じる。これにより、電子放出領域７０に対しては、その上方および側方から、拡散メディエータが拡散してくる。その後は、電子放出領域７０に存在する還元型メディエータの酸化、および電子放出領域７０に対する拡散メディエータの拡散が重畳的に生じる。このため、対面距離Ｈ１が大きいケースでは、大きく分けて、初期は非拡散メディエータの消費、中期は非拡散メディエータおよび拡散メディエータの消費、後期は拡散メディエータの消費というプロセスを経ることとなる。
ここで、拡散メディエータの拡散速度は、電子放出領域７０と非電子放出領域７１との間における還元型メディエータの濃度差に加えて、拡散媒体（血液）の温度や移動抵抗（血液のヘマトクリット値）の影響を受ける。したがって、対面距離Ｈ１が大きいケースでは、血液の温度やヘマトクリット値の影響が経時的に徐々に大きくなる。
これに対して、対面距離Ｈ１が小さいケース（図５Ｂ参照）では、電子放出領域７０の厚み寸法が小さいために、初期において非拡散メディエータが殆ど全て消費され、次いで電子放出領域への拡散メディエータの拡散および消費が生じる。このため、対面距離Ｈ１が小さいケースでは、大きく分けて、初期は非拡散メディエータの消費、後期は拡散メディエータの消費というプロセスを経ることとなる。したがって、対面距離Ｈ１が小さいケースでは、血液の温度やヘマトクリット値の影響を受けにくい段階と、それらの影響を大きく受ける段階とに分かれることになる。
対面距離Ｈ１が電子放出領域の厚み寸法と一致するケースでは、電子放出領域に対する拡散メディエータの拡散は、電子放出領域の側方のみから行われる。そのため、対面距離Ｈ１が電子放出領域の厚み寸法よりも大きく、電子放出領域の側方および上方から拡散メディエータが拡散してくる場合に比べれば、対面距離Ｈ１が小さい場合には、拡散メディエータの拡散速度などが、測定電流値に与える影響は小さいといえる。とくに、血液の温度やヘマトクリット値の影響を受けにくい段階においては、拡散メディエータの挙動が測定電流値に与える影響は小さい。したがって、対面距離Ｈ１を電子放出領域の厚み寸法と同程度、もしくはそれよりも小さくすれば、血液の温度やヘマトクリット値の影響を受けにくく、電圧印加開始からの短い時間範囲（測定時間が短い範囲）における再現性が良好なものとなる。
本発明に係るグルコースセンサは、上述した実施の形態には限定されず、種々に設計変更可能である。たとえば作用極３１および対極３２は、少なくとも一部が反応空間６の内部に臨んでいればよく、たとえば図６Ａおよび図６Ｂに示した構成を採用することもできる。
図６Ａに示したグルコースセンサ１′は、基板３′に凹部３５′，３６′を形成し、この凹部３５′，３６′に作用極３１′および対極３２′を埋設形成したものである。
作用極３１′および対極３２′の上面３１ｃ′，３２ｃ′は、図示したように基板３′の上面３０′と面一となるようにしてもよく、また面一でなくてもよい。
このグルコースセンサ１′では、対面距離Ｈ１′は、作用極３１′の上面３１ｃ′からカバー５′の下面５ａ′までの距離として定義され、作用極３１′および対極３２′の上面３１ｃ′，３２ｃ′が基板３′の上面３０′と面一の場合には、対面距離Ｈ１′は、基板３′とカバー５′との間の距離Ｈ２′に一致する。
一方、図６Ｂに示したグルコースセンサ１″は、基板３″に作用極３１″を形成し、カバー５″に対極３２″を形成したものである。もちろん、基板に対極を形成し、カバーに作用極を形成してもよい。
このグルコースセンサ１″では、対面距離Ｈ１″は、作用極３１″の上面３１ｃ″と対極３２″の上面３２ｃ″との間の距離として定義される。
本発明は、スペーサによって反応空間の高さ寸法が規定された分析用具に限らず、反応空間となるべき凹部が形成された基板に対して、カバーを接合した構成の分析用具に対しても適用することができる。
【実施例】
以下においては、本発明に係るグルコースセンサが、応答電流値の測定において、血液中の血球や温度による影響が小さく、短時間で精度良くグルコース濃度を測定することができることについて、実施例１〜４を通して実証する。
［グルコースセンサの作成］
実施例１〜４においては、図１ないし図３に示したのと同様な構成のグルコースセンサを用いて評価した。各実施例において用いたグルコースセンサは、反応空間６の長さ寸法Ｌ（図２参照）、幅寸法Ｗ（図１参照）、作用極３１および対極３２の厚さ寸法Ｄ（図２参照）を、それぞれ３．４ｍｍ、１．５ｍｍ、１０μｍとした。グルコースセンサにおける対面距離Ｈ１、基板３とカバー５との間の距離Ｈ２（図２参照）、および試薬部３３の構成については、下記表１に示した通りとした。
本案グルコースセンサ１，２および比較グルコースセンサ１については、試薬部３３を、電子伝達層および酵素含有層からなる２層構造とした。電子伝達層は、基板３上に電子伝達物質を含む第１材料液を０．４μＬ塗布した後に第１材料液を送風乾燥（３０℃、１０％Ｒｈ）することにより形成した。酵素含有層は、電子伝達層上に、酸化還元酵素を含む第２材料液を０．３μＬ塗布した後に第２材料液を送風乾燥（３０℃、１０％Ｒｈ）することにより形成した。
第１材料液は、下記表２に▲１▼〜▲４▼で示した材料をその番号通りの順序で混合した混合液を、１〜３日放置した後、この混合液に電子伝達物質を添加することにより調製した。電子伝達物質としては、［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ３（同仁化学研究所「ＬＭ７２２」）を使用した。
表２などにおいて、ＳＷＮはルーセンタイトＳＷＮの略号であり、ＣＨＡＰＳは３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄの略号であり、ＡＣＥＳはＮ−（２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄの略号である。ＳＷＮとしては、コープケミカル（株）製「３１５０」を使用し、ＣＨＡＰＳとしては同仁化学研究所製「ＫＣ０６２」を使用し、ＡＣＥＳとしては同仁化学研究所製「ＥＤ０６７」を使用した。なお、ＡＣＥＳ溶液はｐＨが７．５となるように調製した。
一方、第２材料液は、酸化還元酵素を０．１％ＣＨＡＰＳに溶解させることにより調製した。酸化還元酵素としては、ＣｙＧＤＨ（グルコース脱水素活性が８００Ｕ／ｍｇ）を使用した。ＣｙＧＤＨについては、上述した通りである。
これに対して、本案グルコースセンサ３，４および比較グルコースセンサ２については、試薬部３３を、フェリシアン化カリウムとフェロシアン化カリウムが共存する構成とした。これは、酸化還元酵素の触媒能、その他の要因の影響を除外し、純粋に、対面距離Ｈ１の高さが再現性に与える影響を判断するためである。より具体的には、試薬部３３は、基板３上に材料液を保持させることにより液相として形成した。材料液としては、フェリシアン化カリウムが２０ｍＭ、フェロシアン化カリウムが２４ｍＭ、塩化カリウムが１．５Ｍとなるように調製されたものを用いた。
実施例１（ヘマトクリット値の影響の検討）
本実施例においては、本案グルコースセンサ１，２および比較グルコースセンサ１を用いて、ヘマトクリット（Ｈｃｔ）値が応答電流値に与える影響を評価した。
この評価においては、血液としては、グルコース濃度が４１２ｍｇ／ｄＬ、Ｈｃｔ値が１９％、４２％、あるいは６９％のいずれかのものを用いた。
作用極３１と対極３２との間への電圧印加は、印加電圧値を２００ｍＶとして血液の供給と同時に開始し、応答電流値は、電圧印加の開始から５ｓｅｃ、７ｓｅｃ、および１０ｓｅｃ後に測定した。各Ｈｃｔ値の血液については、５回ずつ応答電流値を測定した。
応答電流値の測定結果は、本案グルコースセンサ１については図７に、本案グルコースセンサ２については図８に、比較グルコースセンサ１については図９にそれぞれ示した。また、図７〜図９においては、横軸を時間（ｓｅｃ）、縦軸をＢｉａｓ（％）として示してある。Ｂｉａｓ（％）は、Ｈｃｔ値が４２％のときの応答電流値を基準とし、この基準値に対するずれ量を示すものであり、各図においては、Ｂｉａｓ（％）は５回の測定の平均値として示してある。
図７〜図９を比較すれば分かるように、電圧印加時間の如何に拘わらず、対面距離Ｈ１が小さいほどＢｉａｓが小さくなる傾向にある。したがって、対面距離Ｈ１が小さいほど、血液のＨｃｔ値の影響が小さくなる傾向が伺える。
実施例２（温度の影響）
本実施例においては、本案グルコースセンサ１，２および比較グルコースセンサ１を用いて、血液の温度が応答電流値に与える影響を評価した。
この評価においては、血液としては、Ｈｃｔ値が４２％、グルコース濃度が１００．０ｍｇ／ｄＬ、４２２．０ｍｇ／ｄＬ、あるいは６３６．０ｍｇ／ｄＬのいずれかで、温度が５℃、２５℃あるいは４５℃に調製されたものを用いた。
作用極３１と対極３２との間への電圧印加は、印加電圧値を２００ｍＶとして血液の供給開始から行い、応答電流値は、電圧印加開始から５ｓｅｃ後に測定した。各グルコース濃度の血液については、５回ずつ応答電流値を測定した。
応答電流値の測定結果は、本案グルコースセンサ１については図１０に、本案グルコースセンサ２については図１１に、比較グルコースセンサ１については図１２にそれぞれ示した。また、図１０〜図１２においては、横軸を温度（℃）、縦軸をＢｉａｓ（％）として各グルコース濃度について個別に示した。ここで、Ｂｉａｓ（％）は、温度が２５℃のときの応答電流値を基準とし、この基準に対するずれ量を示すものであり、各図においては、Ｂｉａｓ（％）は５回の測定の平均値として示してある。
図１０〜図１２を比較すれば分かるように、グルコース濃度および電圧印加時間の如何に拘わらず、対面距離Ｈ１が小さいほどＢｉａｓが小さくなる傾向にある。したがって、対面距離Ｈ１が小さいほど、血液の温度の影響が小さくなる傾向が伺える。
実施例３（測定レンジの評価）
本実施例では、本案グルコースセンサ１を用いて、測定レンジを評価した。測定レンジは、グルコース濃度と応答電流値との関係（直線性）により評価した。
この評価においては、血液としては、Ｈｃｔ値が４２％、グルコース濃度が０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、６１０ｍｇ／ｄＬ、８０５ｍｇ／ｄＬあるいは９８０ｍｇ／ｄＬのものを用いた。作用極３１と対極３２との間への電圧印加は、印加電圧値を２００ｍＶとして血液の供給開始から行い、応答電流値は、電圧印加の開始から３ｓｅｃ後に測定した。各グルコース濃度の血液については、１０回ずつ応答電流値を測定した。
応答電流値の測定結果は、図１３に示した。ただし、図１３においては、応答電流値（μＡ）は、１０回の測定の平均値として示してある。
図１３から分かるように、本案グルコースセンサ１では、グルコース濃度が０〜１０００ｍｇ／ｄＬの範囲で高い直線性を示しており、グルコース濃度が比較的に大きい場合（６００ｍｇ／ｄＬ以上）であっても、適切にグルコース濃度を測定できるといえる。したがって、本案グルコースセンサ１のように、酸化還元酵素としてＣｙＧＤＨを、メディエータとしてＲｕ錯体を使用すれば、対面距離Ｈ１を小さくして設定しても、３秒程度の短い測定時間で、０〜１０００ｍｇ／ｄＬの範囲にあるグルコースの濃度を適切に測定できるといえる。
実施例４（再現性の評価）
本実施例では、本案グルコースセンサ３，４および比較グルコースセンサ２を用いて、複数回の応答電流値の測定のタイムコースおよび相対標準偏差Ｃ．Ｖ．（％）のタイムコースに基づいて、応答電流値の再現性を評価した。
この評価においては、血液としてＨｃｔ値が４２％、グルコース濃度が４１２ｍｇ／ｄＬのものを用いた。作用極３１と対極３２との間への電圧印加は、印加電圧値を２００ｍＶとして血液の供給開始から５秒後に開始し、応答電流値は、電圧印加の開始から、５０ｍｓｅｃ毎に経時的に測定した。
タイムコースの測定結果については、図１４〜図１６に示した。これらの図においては、５回分の測定の応答電流値のタイムコースを同時に示してあり、図１４は本案グルコースセンサ３、図１５は本案グルコースセンサ４、図１６は比較グルコースセンサ２を用いたときの結果をそれぞれ示している。一方、図１７には、Ｃ．Ｖ．（％）のタイムコースを示した。このタイムコースは、応答電流値のタイムコースを得るための５回の応答電流値の測定に基づいて作成した。
図１４〜図１６から分かるように、本案グルコースセンサ３，４では、比較グルコースセンサ２と同様に応答電流値のタイムコースに殆どバラツキが見られず、複数回の測定において良好な再現性が得られた。一方、図１７から分かるように、本案グルコースセンサ３では、電圧印加開始初期、すなわち電圧印加開始から０．５〜３．０（ｓｅｃ）の時間範囲において、本案グルコースセンサ４や比較グルコースセンサ２に比べてＣ．Ｖ．が小さく、Ｃ．Ｖ．値が概ね２．５％以下と小さくなっている。本案グルコースセンサ４では、電圧印加開始から３．０〜７．０（ｓｅｃ）の時間範囲において、比較グルコースセンサ２に比べてＣ．Ｖ．が小さく、Ｃ．Ｖ．値が概ね２．５％以下と小さくなっている。これらの結果から分かるように、対面距離Ｈ１が小さく設定すれば、電圧印加開始から短い時間範囲において、再現性が良好なものとなっている。したがって、再現性の観点からは、対面距離Ｈ１を小さく設定したグルコースセンサは、短い測定時間に適したものであるといえる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【技術分野】
本発明は、血液などの試料液中の特定成分（たとえばグルコースやコレステロール）の濃度を分析する際に使用される分析用具に関する。
【背景技術】
糖尿病患者にとっては、血糖値を管理するために日頃から自己の血糖値を把握しておくことは重要である。その一方、頻繁に医療機関に足を運ぶのが煩わしいことから、患者自身が簡易に血糖値の測定を行え、しかも出先などでも血糖値の測定を手軽に行えるように、手のひらに納まるようなサイズの携帯型の簡易血糖値測定装置が用いられている。このような血糖値測定装置を用いての血糖値測定は、酵素反応場を提供するグルコースセンサを血糖値測定装置に装着し、グルコースセンサに対して血液（検体）を供給することにより行われている。
グルコースセンサとしては、アンペロメトリー法やクーロメトリー法に代表される電気化学的手法を利用して、簡易血糖値測定装置においてグルコース濃度を測定できるように構成されたものがある。この種のグルコースセンサは、たとえば１対の電極（作用極および対極）と、試薬層と、この試薬層を内部に収容したキャピラリと、を備えたものとして構成されている。
アンペロメトリー法を採用する場合には、たとえば作用極および対極は同一平面状に横並びして、あるいは互いに対向して配置され、クーロメトリー法を採用する場合には、一般に、作用極および対極は対向するようにして配置される。試薬層は、酸化還元酵素および電子伝達物質を含んだものとして構成されるが、酸化還元酵素としてはＧＯＤが、電子伝達物質としてはフェリシアン化カリウムが汎用されている。このようなグルコースセンサでは、キャピラリを利用して試薬層に検体が供給されたときに、酸化還元酵素によって、たとえばグルコースの酸化反応が触媒される一方で、電子伝達物質の還元反応が触媒される。
グルコースセンサに対する血液の供給は、一般に、測定者の皮膚を切開して血液を出液させ、この血液をグルコースセンサに導入することにより行われている。この方法では、血液採取に対する測定者への負担を小さくする観点からは、採取すべき血液量が少ないほうが好ましい。そのため、検体量の低減のために様々な改良が検討されている（たとえば日本国特表２０００−５０９５０７号公報および米国特許出願公開第２００２／００９２６１２号明細書参照）。
日本国特表２０００−５０９５０７号公報には、クーロメトリー法を利用して少ないサンプル量でグルコース濃度を測定できるように、作用極および対極を対向配置し、かつ電極間の離間距離を５０μｍ以下としたグルコースセンサが開示されている。このグルコースセンサでは、使用すべき血液量を少なくすることはできるが、クーロメトリー法は殆ど全てのグルコースを反応させる方法であるため、測定時間が著しく長くなってしまうといった問題がある。
これに対して、米国特許出願公開第２００２／００９２６１２号明細書には、サンプル量を１．５μＬ以下と少なくしつつも、測定時間を１０秒と短くしたグルコースセンサが開示されている。このグルコースセンサでは、基板とカバーとの間に、作用極、対極および試薬層を配置したキャビティが形成されており、基板とカバーとの間の距離が２００μｍ以下とされている。このグルコースセンサでは、試薬層は、たとえばグルコースオキシダーゼおよびフェリシアン化物を含んだ状態で作用極の表面に固定化され、非水溶性とされている。
しかしながら、米国特許出願公開第２００２／００９２６１２号明細書に開示されたグルコースセンサにおいても、測定時間の短縮が十分であるとは言い難く、また測定精度の面において未だ改善の余地がある。
【発明の開示】
本発明は、測定時間を短く維持しつつも、微量の試料液によって精度良く濃度測定を行えるようにすることを目的としている。
本発明者は、上記した目的を達成すべく鋭意検討した結果、従来のグルコースセンサにおいて測定時間を短くすることができない原因の１つが試薬層の構成にあることに着目し、本発明をするに至った。
すなわち、従来のグルコースセンサの試薬層では、試薬層を作用極の表面に固定化しているために、グルコースとグルコースオキシダーゼとの反応が作用極の表面においてのみ生じ、グルコースとグルコースオキシダーゼの反応に時間を要して測定時間が長くなる。このような不具合を解消するためには、試薬層を試料液（血液）によって溶解しやすい構成とすることが考えられる。この場合、電子伝達物質が試料液（血液）中を拡散することとなるため、電子伝達物質の拡散に影響を与える因子、たとえば試料液の固体成分（血液における血球成分など）の割合の影響、あるいは試料液の温度の影響を排除する必要が生じる。また、フェリシアン化物のように血液に対する溶解性が比較的に小さいものを用いると、溶解時間が長くなって測定時間が長くなる。
本発明者はさらに、測定精度をさらに向上させるためには、次に説明する点を改善することが望ましいとの知見も得ている。すなわち、第１に、フェリシアン化物のように血液に対する溶解性が比較的に小さいものを用いると、溶解性のバラツキに起因して測定精度が悪化する虞がある。また、フェリシアン化物は保存安定性が悪く、保存時において容易に還元体へと移行するため、この点においても測定精度が低下することが懸念される。第２に、グルコースオキシダーゼは、グルコースとの反応速度が比較的に小さい（Ｋｍ（ミカエリス定数）が大きい）ため、グルコースオキシダーゼを使用することは測定時間を短縮する上では好ましくない。
以上の事情に鑑み、本発明においては、試料液を保持するための反応空間を備えた分析用具であって、上記反応空間には、試料液が保持されたときに溶解する試薬部が配置されており、上記反応空間の一部は、互いに対面する第１および第２面によって規定されており、かつ上記第１および第２面の対面距離が４５μｍ以下に設定されている、薄型分析用具が提供される。対面距離は、好ましくは２５〜４５μｍの範囲とされる。
本発明の薄型分析用具は、たとえば互いに対向した状態で間隔を隔てて配置され、かつ反応空間を規定する第１および第２板材を備えたものとして構成される。この場合、第１および第２面は、たとえば第１および第２板材の厚み方向に直交する方向に広がりをもつ面とされる。
本発明の薄型分析用具は、たとえば第１板材の一面に設けられ、かつ少なくとも一部が反応空間に臨むとともに、試料液に電圧を印加するために利用される第１および第２電極を備えたものとして構成される。この場合、対面距離は、第１または第２電極の上面（たとえば第１面に相当）から、第２板材における当該電極の上面に対面する部分（たとえば第２面に相当）までの最小距離として定義される。
本発明の薄型分析用具は、第１板材に設けられた第１電極と、第１電極に対面するように第２板材に設けられ、かつ第１電極とともに試料液に電圧を印加するために利用される第２電極と、を備えたものとして構成してもよい。この場合、対面距離は、第１電極の上面（たとえば第１面に相当）と第２電極の上面（たとえば第２面に相当）との間における最小距離として定義される。
反応空間は、たとえば毛細管力により試料を移動させることができるように構成される。
試薬部は、たとえば電子伝達物質および酸化還元酵素を含んだものとして構成される。
電子伝達物質としては、Ｒｕ化合物を用いるのが好ましい。Ｒｕ化合物としては、下記化学式（１）で示されるものを使用することができる。
［Ｒｕ（ＮＨ３）５Ｘ］ｎ＋ ・・・（１）
化学式（１）においては、Ｘとしては、ＮＨ３、ハロゲンイオン、ＣＮ、ピリジン、ニコチンアミド、あるいはＨ２Ｏが挙げられるが、ＸはＮＨ３またはハロゲンイオンであるのが好ましい。化学式（１）におけるｎ＋は、Ｘの種類により決定される酸化型Ｒｕ（ＩＩＩ）錯体の価数を表している。
酸化還元酵素としては、分析対象成分がグルコースである場合には、グルコース脱水素活性を有するＧＤＨを使用するのが好ましい。ＧＤＨとしては、ＦＡＤを補欠因子とするグルコース脱水素酵素（αＧＤＨ）を使用するのが好ましい。ＧＤＨとしてはさらに、αＧＤＨにチトクロムＣが結合したＧＤＨ（ＣｙＧＤＨ）を使用するのが好ましい。ＣｙＧＤＨおよびαＧＤＨとしては、国際公開第ＷＯ０２／３６７７９号パンフレットに開示されているものが挙げられる。ＧＤＨとしては、ブルクホルデリア属に属する微生物に由来のものを使用するのが好ましいが、ＣｙＧＤＨやαＧＤＨと同じＦＡＤおよびチトクロムＣをもつ他属の微生物に由来のＧＤＨを使用することもできる。他属の例としてＲａｌｓｔｏｎｉａ属あるいはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の中で病原性を持つグラム陰性菌が挙げられる。
たとえばαＧＤＨは、グルコース脱水素活性を有するサブユニットとして、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約６０ｋＤａであるＧＤＨ活性タンパク質（αサブユニット）を含んだものである。一方、ＣｙＧＤＨは、αサブユニットと、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約４３ｋＤａである電子伝達タンパク質（チトクロムＣ）と、をサブユニットとして含むものである。αＧＤＨやＣｙＧＤＨとしては、αサブユニットやチトクロムＣ以外のサブユニットをさらに有するものを使用することもできる。
ＣｙＧＤＨは、たとえばブルクホルデリア・セパシアに属する微生物が菌体外に分泌した酵素を精製し、あるいは当該菌体の菌体内酵素を精製することにより得ることができる。一方、αＧＤＨは、たとえばブルクホルデリア・セパシアに属する微生物から採取したαＧＤＨをコードする遺伝子が移入された形質転換体を形成し、この形質転換体から外部に分泌された酵素を精製し、あるいは当該形質転換体の菌体内酵素を精製することにより得ることができる。
ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物としては、たとえばブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株を使用することができる。このＫＳ１株は、平成１２年９月２５日に独立特許法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に微生物受託番号第ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０６として寄託されている。
試料液としては、たとえば血液、尿、唾液およびこれらの調整液などの生化学的試料が挙げられ、分析対象成分としては、たとえばグルコース、コレステロール、乳酸およびアスコルビン酸が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明に係るバイオセンサの全体斜視図である。
図２は、図１のＩＩ−ＩＩ線に沿う断面図である。
図３は、図１に示したバイオセンサの分解斜視図である。
図４は、図１ないし図３に示したバイオセンサを濃度測定装置に装着した状態を示すものであり、バイオセンサについては平面図で、濃度測定装置についてはブロック図で示したものである。
図５Ａおよび図５Ｂは、バイオセンサの作用を説明するためのものであり、バイオセンサの要部断面図である。
図６Ａおよび図６Ｂは、バイオセンサの他の例を示す断面図である。
図７は、本案バイオセンサ１に対する血液のヘマトクリット値の影響を示すグラフである。
図８は、本案バイオセンサ２に対する血液のヘマトクリット値の影響を示すグラフである。
図９は、比較バイオセンサ１に対する血液のヘマトクリット値の影響を示すグラフである。
図１０は、本案バイオセンサ１に対する血液の温度の影響を示すグラフである。
図１１は、本案バイオセンサ２に対する血液の温度の影響を示すグラフである。
図１２は、比較バイオセンサ１に対する血液の温度の影響を示すグラフである。
図１３は、本案バイオセンサ１に対する測定レンジの評価結果を示すグラフである。
図１４は、本案バイオセンサ３に対する再現性を、応答電流値のタイムコースとして評価した結果を示すグラフである。
図１５は、本案バイオセンサ４に対する再現性を、応答電流値のタイムコースとして評価した結果を示すグラフである。
図１６は、比較バイオセンサ２に対する再現性を、応答電流値のタイムコースとして評価した結果を示すグラフである。
図１７は、本案バイオセンサ３，４および比較バイオセンサ２に対する再現性を、Ｃ．Ｖ．のタイムコースとして評価した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面を参照しつつ具体的に説明する。本実施の形態においては、血糖値を測定するように構成されたグルコースセンサを例にとって説明するが、本発明は、血糖値を測定する場合に限定されず、血液中の他の成分あるいは血液以外の試料液を分析する分析用具に対しても適用することができる。
図１ないし図３に示したグルコースセンサ１は、濃度測定装置２に装着して使用するものであり（図４参照）、長矩形状の基板３に対して、スペーサ４を介してカバー５を積層した形態を有している。このグルコースセンサ１においては、各要素３〜５により反応空間６が規定されている。この反応空間６は、矩形断面を有する柱状の空間として規定されており、開口部（導入口）６１から導入された試料液を毛細管力を利用して移動させ、かつ導入された試料液を保持することができる。
スペーサ４は、基板３の上面３０からカバー５の下面５ａまでの距離、すなわち反応空間６の高さ寸法を規定するためのものである。このスペーサ４には、先端部が開放したスリット４１が形成されている。スリット４１は、反応空間６の幅寸法を規定するためのものであり、スリット４１における先端の開放部は、反応空間６の内部に試料液を導入するための導入口６１を構成するためのものである。
カバー５は、排気口５１を有している。排気口５１は、反応空間６の内部の気体を外部に排出するためのものであり、反応空間６の内部と連通している。したがって、導入口６１を介して反応空間６内に試料液が導入された場合には、反応空間６において生じる毛細管力により、試料液がカバー５に形成された排気口５１に向けて反応空間６の内部を移動する。
図３によく表れているように、基板３の上面３０には、作用極３１、対極３２および試薬部３３が形成されている。作用極３１および対極３２は、全体として基板３の長手方向に延びている。作用極３１および対極３２の端部３１ａ，３２ａは、基板３の短手方向に延び、かつ長手方向に並んでいる。一方、作用極３１および対極３２の端部３１ｂ，３２ｂは、後述する濃度測定装置２の第１および第２端子２０ａ，２０ｂ（図４参照）と接触させるための端子部を構成している。
作用極３１および対極３２は、たとえばスクリーン印刷、メッキ、あるいはスパッタリングにより、厚み寸法Ｄ（図２参照）が２０μｍ以下にされている。好ましくは、作用極３１および対極３２の厚み寸法Ｄは、１〜１０μｍに設定される。作用極３１の上面３１ｃからカバー５の下面５ａまでの対面距離Ｈ１（図２参照）は、４５μｍ以下、好ましくは２５〜４５μｍに設定されている。これは、対面距離Ｈ１が不当に大きいと、後述するように血液の温度やヘマトクリット値の影響を受け易い反面、対面距離Ｈ１が不当に小さいと、反応空間６の内部において血液を適切に移動させることができなくなるからである。
試薬部３３は、たとえばメディエータ（電子伝達物質）および相対的に少量の酸化還元酵素を含む固体状に形成されており、図２および図３によく表れているように、作用極３１および対極３２の端部３１ａ，３２ａどうしを橋渡すようにして設けられている。この試薬部３３は、血液に対して容易に溶解するものとされている。したがって、反応空間６に血液を導入した場合には、メディエータ、酸化還元酵素およびグルコースを含む液相反応系が構築される。この液相反応系においては、作用極３１の上面３１ｃのみならず、反応空間６における広範囲にわたってグルコースの酸化反応と、メディエータの還元反応が生じる。したがって、作用極の表面にメディエータや酸化還元酵素を固定化する場合に比べて、より短時間でより多くのグルコースを酸化させることができる。これにより、測定時間の短縮を図ることができるようになる。
メディエータとしては、Ｒｕ化合物を使用するのが好ましい。Ｒｕ化合物としては、たとえばＲｕ錯体が挙げられる。Ｒｕ錯体としては、電子伝達体として機能すればその配位子の種類は特に限定されないが、試薬部３３に酸化型の状態で含ませるのが好ましく、たとえば酸化型が下記化学式（２）で示されるものが使用される。
［Ｒｕ（ＮＨ３）５Ｘ］ｎ＋ ・・・（２）
化学式（２）におけるＸとしては、ＮＨ３、ハロゲンイオン、ＣＮ、ピリジン、ニコチンアミド、あるいはＨ２Ｏが挙げられるが、ＮＨ３またはハロゲンイオンが好ましい。一方、化学式におけるｎ＋はＸの種類により決定される酸化型（ＩＩＩ）錯体の価数を表している。
Ｒｕ錯体は、還元型（ＩＩ）が不安定なために通常は酸化型（ＩＩＩ）として存在する。そのため、グルコースセンサ１の試薬部３３にＲｕ錯体を混在させた状態で光や水に曝露されたとしても、メディエータが容易に還元してしまうことはない。そのため、メディエータの曝露に起因して測定誤差が生じることを抑制することができるようになる。また、Ｒｕ錯体は結晶化しにくく、微粉末状態を適切に維持することができるといった特性を有している。そのため、Ｒｕ錯体を用いれば、保存時に試薬部３３の溶解性が悪化することもない。さらには、Ｒｕ錯体とαＧＤＨやＣｙＧＤＨとの組み合わせについていえば、Ｒｕ錯体の電子伝達速度が大きいために測定時間を短くすることができるといった利点がある。
一方、酸化還元酵素としては、上述したαＧＤＨまたはＣｙＧＤＨを使用するのが好ましい。これらの酵素は、グルコースオキシダーゼに比べてグルコースに対する反応速度が大きいといった利点がある。この点からも、測定時間の短縮を図ることができるようになる。
図４に示したように、濃度測定装置２は、第１および第２端子２０ａ，２０ｂ、電圧印加部２１、電流値測定部２２、検知部２３、制御部２４、演算部２５および表示部２６を備えている。
第１および第２端子２０ａ，２０ｂは、濃度測定装置２に対してグルコースセンサ１を装着した場合に、グルコースセンサ１における作用極３１および対極３２の端部３１ｂ，３２ｂに接触させるためのものである。
電圧印加部２１は、第１および第２端子２０ａ，２０ｂを介して、グルコースセンサ１の作用極３１と対極３２との間に電圧を印加する際に利用される。電圧印加部２１としては、たとえば乾電池または充電池などの直流電源が使用される。
電流値測定部２２は、作用極３１および対極３２間への電圧印加時における作用極３１とメディエータとの間の電子の授受量を、応答電流値として測定するためのものである。
検知部２３は、濃度測定装置２にグルコースセンサ１を装着した後において、電流値測定部２２によって測定された電流値に基づいて、試薬部３３（図１ないし図３参照）に試料液が供給されたか否かを確認するためのものである。
制御部２４は、電圧印加部２１を制御し、作用極３１および対極３２の間に電圧が印加される状態（閉回路）と印加されない状態（開回路）とを選択するものである。
演算部２５は、電流値測定部２２により測定された応答電流値に応じて、グルコース濃度の演算を行うものである。演算部２５は、たとえばグルコース濃度をアンペロメトリックな手法により演算できるように構成されている。アンペロメトリックな手法を用いれば、クーロメトリックな手法を採用するよりも、短時間で濃度測定を行うことができる。
検知部２３、制御部２４、および演算部２５のそれぞれは、たとえばＣＰＵおよびＲＯＭやＲＡＭなどのメモリにより構成されるが、検知部２３、制御部２４、および演算部２５の全てを、１つのＣＰＵに対して複数のメモリを接続することにより構成することも可能である。
表示部２６は、演算部２５による演算結果の他、たとえばエラーである旨や操作手順などを表示するためのものであり、たとえば液晶表示装置により構成される。
次に、グルコースセンサ１および濃度測定装置２を用いたグルコース濃度の測定の手順について説明する。
図４に良く表れているように、まずグルコースセンサ１を濃度測定装置２に装着する。そうすると、グルコースセンサ１の作用極３１および対極３２の端部３１ｂ，３２ｂが濃度測定装置２の第１および第２端子２０ａ，２０ｂに接触する。この状態では、第１および第２端子２０ａ，２０ｂを介して、作用極３１および対極３２の間への電圧の印加が可能とされている。実際の測定においては、濃度測定装置２にグルコースセンサ１を装着した時点から、作用極３１と対極３２との間に定電圧が印加される。Ｒｕ錯体は、低電圧でメディエーションを起こすため、Ｒｕ錯体を用いる場合には、作用極３１および対極３２の間に印加する定電圧は、たとえば１００〜５００ｍＶの範囲に設定される。本実施の形態では、作用極３１および対極３２の間への定電圧の印加は、グルコース濃度を演算するための応答電流値が測定されるまでは継続して行われているものとする。
次いで、グルコースセンサ１の導入口６１を介して反応空間６に血液を導入する。血液は、毛細管力により導入口６１からカバー５に形成された排気口５１に向けて反応空間６内を進行する。その過程においては、血液が試薬部３３を溶解させる。
一方、試薬部３３に血液が供給されれば、酸化還元酵素によりグルコースがグルコノラクトンに酸化されるとともにメディエータが還元型とされる。なお、グルコノラクトンは非酵素的にグルコン酸となる。
還元型のメディエータは、作用極３１および対極３２の端部３１ｂ，３２ｂを介して作用極３１および対極３２に定電圧を印加した状態では、作用極の端部３１ａ側に移動し、この端部３１ａに電子を放出して酸化型のメディエータとなる。したがって、電圧印加部２１により作用極３１および対極３２間に定電圧を印加した状態では、還元型メディエータから付与された電子量が作用極３１および第１端子２０ａを介して電流値測定部２２において応答電流として測定される。この応答電流値は、電圧印加によって試薬部３３を移動した還元型のメディエータに由来する電子量に相関するものであり、いわゆる拡散電流と呼ばれるものである。
一方、電流値測定部２２において測定された応答電流値は、検知部２３においてモニタリングされており、応答電流値が閾値を越えた時点で、検知部２３は試薬部３３に血液が供給され、試薬部３３が溶解したことを検知する。検知部２３において血液が供給されたことが検知された場合には、この検知から一定時間経過したか否かが検知部２３により判断される。
検知部２３において一定時間が経過したと判断された場合には、電流値測定部２２において応答電流値を測定し、この応答電流値に基づいて、演算部２５においてグルコース濃度が演算される。グルコース濃度の演算は、応答電流値を電圧値に換算した後に、この電圧値を、予め作成しておいた電圧値とグルコース濃度との関係を示す検量線に当てはめることにより演算される。演算部２５における演算結果は、たとえば表示部２６において表示される。
作用極３１に接触している還元型のメディエータは、即座に作用極３１に対して電子を放出して酸化型となるが、作用極３１から一定距離離れた還元型のメディエータであっても、作用極３１に対して電子を放出して酸化型となる。以下、作用極３１に対して還元型のメディエータが電子を放出可能な領域を電子放出領域、作用極３１に対して還元型のメディエータが電子を放出することができない領域を非電子放出領域ということとする。
後述する実施例から推測できるように、電子放出領域における作用極の表面からの距離は、４５μｍよりも小さくなることはない。したがって、図５Ａに示したように、作用極３１の上面３１ｃからカバー５の下面５ａまでの対面距離Ｈ１が比較的に大きい場合、たとえば対面距離Ｈ１が５０μｍ以上の場合には、作用極３１の直上においては、電子放出領域７０の上方に非電子放出領域７１が存在することとなる。
これに対して、本願のグルコースセンサ１のように、作用極３１の上面３１ｃからカバー５の下面５ａまでの対面距離Ｈ１が４５μｍ以下に設定されている場合には、図５Ｂに示したように、電子放出領域７０における作用極３１の直上に位置する部分の厚み寸法（以下、単に「電子放出領域７０の厚み寸法」という）が対面距離Ｈ１に一致し、この電子放出領域７０の厚み寸法は、図５Ａに示した場合と同等かもしくはそれよりも小さくなる。
このように、対面距離Ｈ１が大きい場合（図５Ａ参照）と小さい場合（図５Ｂ参照）とでは、作用極３１の直上における様子が異なったものとなる。その結果、後述する本発明の実施例からも推測できるように、対面距離Ｈ１の大小により、還元型メディエータが消費される様子が異なったものとなる。
ここで、電圧非印加状態において、電子放出領域に存在する還元型のメディエータ（以下、「非拡散メディエータ」という）の濃度と、非電子放出領域に存在する還元型のメディエータ（以下、「拡散メディエータ」という）の濃度とが同一である系を考える。
図５Ａに示した対面距離Ｈ１が大きいケースでは、電子放出領域７０（点線で囲まれた部分）の厚み寸法が大きいために、電圧印加時に非拡散メディエータの全てが酸化されるわけではない。したがって、非拡散メディエータが一定量ずつ消費され、これに起因して電子放出領域７０と非電子放出領域７１との間に還元型メディエータの濃度差が生じる。これにより、電子放出領域７０に対しては、その上方および側方から、拡散メディエータが拡散してくる。その後は、電子放出領域７０に存在する還元型メディエータの酸化、および電子放出領域７０に対する拡散メディエータの拡散が重畳的に生じる。このため、対面距離Ｈ１が大きいケースでは、大きく分けて、初期は非拡散メディエータの消費、中期は非拡散メディエータおよび拡散メディエータの消費、後期は拡散メディエータの消費というプロセスを経ることとなる。
ここで、拡散メディエータの拡散速度は、電子放出領域７０と非電子放出領域７１との間における還元型メディエータの濃度差に加えて、拡散媒体（血液）の温度や移動抵抗（血液のヘマトクリット値）の影響を受ける。したがって、対面距離Ｈ１が大きいケースでは、血液の温度やヘマトクリット値の影響が経時的に徐々に大きくなる。
これに対して、対面距離Ｈ１が小さいケース（図５Ｂ参照）では、電子放出領域７０の厚み寸法が小さいために、初期において非拡散メディエータが殆ど全て消費され、次いで電子放出領域への拡散メディエータの拡散および消費が生じる。このため、対面距離Ｈ１が小さいケースでは、大きく分けて、初期は非拡散メディエータの消費、後期は拡散メディエータの消費というプロセスを経ることとなる。したがって、対面距離Ｈ１が小さいケースでは、血液の温度やヘマトクリット値の影響を受けにくい段階と、それらの影響を大きく受ける段階とに分かれることになる。
対面距離Ｈ１が電子放出領域の厚み寸法と一致するケースでは、電子放出領域に対する拡散メディエータの拡散は、電子放出領域の側方のみから行われる。そのため、対面距離Ｈ１が電子放出領域の厚み寸法よりも大きく、電子放出領域の側方および上方から拡散メディエータが拡散してくる場合に比べれば、対面距離Ｈ１が小さい場合には、拡散メディエータの拡散速度などが、測定電流値に与える影響は小さいといえる。とくに、血液の温度やヘマトクリット値の影響を受けにくい段階においては、拡散メディエータの挙動が測定電流値に与える影響は小さい。したがって、対面距離Ｈ１を電子放出領域の厚み寸法と同程度、もしくはそれよりも小さくすれば、血液の温度やヘマトクリット値の影響を受けにくく、電圧印加開始からの短い時間範囲（測定時間が短い範囲）における再現性が良好なものとなる。
本発明に係るグルコースセンサは、上述した実施の形態には限定されず、種々に設計変更可能である。たとえば作用極３１および対極３２は、少なくとも一部が反応空間６の内部に臨んでいればよく、たとえば図６Ａおよび図６Ｂに示した構成を採用することもできる。
図６Ａに示したグルコースセンサ１′は、基板３′に凹部３５′，３６′を形成し、この凹部３５′，３６′に作用極３１′および対極３２′を埋設形成したものである。
作用極３１′および対極３２′の上面３１ｃ′，３２ｃ′は、図示したように基板３′の上面３０′と面一となるようにしてもよく、また面一でなくてもよい。
このグルコースセンサ１′では、対面距離Ｈ１′は、作用極３１′の上面３１ｃ′からカバー５′の下面５ａ′までの距離として定義され、作用極３１′および対極３２′の上面３１ｃ′，３２ｃ′が基板３′の上面３０′と面一の場合には、対面距離Ｈ１′は、基板３′とカバー５′との間の距離Ｈ２′に一致する。
一方、図６Ｂに示したグルコースセンサ１″は、基板３″に作用極３１″を形成し、カバー５″に対極３２″を形成したものである。もちろん、基板に対極を形成し、カバーに作用極を形成してもよい。
このグルコースセンサ１″では、対面距離Ｈ１″は、作用極３１″の上面３１ｃ″と対極３２″の上面３２ｃ″との間の距離として定義される。
本発明は、スペーサによって反応空間の高さ寸法が規定された分析用具に限らず、反応空間となるべき凹部が形成された基板に対して、カバーを接合した構成の分析用具に対しても適用することができる。
【実施例】
以下においては、本発明に係るグルコースセンサが、応答電流値の測定において、血液中の血球や温度による影響が小さく、短時間で精度良くグルコース濃度を測定することができることについて、実施例１〜４を通して実証する。
［グルコースセンサの作成］
実施例１〜４においては、図１ないし図３に示したのと同様な構成のグルコースセンサを用いて評価した。各実施例において用いたグルコースセンサは、反応空間６の長さ寸法Ｌ（図２参照）、幅寸法Ｗ（図１参照）、作用極３１および対極３２の厚さ寸法Ｄ（図２参照）を、それぞれ３．４ｍｍ、１．５ｍｍ、１０μｍとした。グルコースセンサにおける対面距離Ｈ１、基板３とカバー５との間の距離Ｈ２（図２参照）、および試薬部３３の構成については、下記表１に示した通りとした。
本案グルコースセンサ１，２および比較グルコースセンサ１については、試薬部３３を、電子伝達層および酵素含有層からなる２層構造とした。電子伝達層は、基板３上に電子伝達物質を含む第１材料液を０．４μＬ塗布した後に第１材料液を送風乾燥（３０℃、１０％Ｒｈ）することにより形成した。酵素含有層は、電子伝達層上に、酸化還元酵素を含む第２材料液を０．３μＬ塗布した後に第２材料液を送風乾燥（３０℃、１０％Ｒｈ）することにより形成した。
第１材料液は、下記表２に▲１▼〜▲４▼で示した材料をその番号通りの順序で混合した混合液を、１〜３日放置した後、この混合液に電子伝達物質を添加することにより調製した。電子伝達物質としては、［Ｒｕ（ＮＨ３）６］Ｃｌ３（同仁化学研究所「ＬＭ７２２」）を使用した。
表２などにおいて、ＳＷＮはルーセンタイトＳＷＮの略号であり、ＣＨＡＰＳは３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄの略号であり、ＡＣＥＳはＮ−（２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄの略号である。ＳＷＮとしては、コープケミカル（株）製「３１５０」を使用し、ＣＨＡＰＳとしては同仁化学研究所製「ＫＣ０６２」を使用し、ＡＣＥＳとしては同仁化学研究所製「ＥＤ０６７」を使用した。なお、ＡＣＥＳ溶液はｐＨが７．５となるように調製した。
一方、第２材料液は、酸化還元酵素を０．１％ＣＨＡＰＳに溶解させることにより調製した。酸化還元酵素としては、ＣｙＧＤＨ（グルコース脱水素活性が８００Ｕ／ｍｇ）を使用した。ＣｙＧＤＨについては、上述した通りである。
これに対して、本案グルコースセンサ３，４および比較グルコースセンサ２については、試薬部３３を、フェリシアン化カリウムとフェロシアン化カリウムが共存する構成とした。これは、酸化還元酵素の触媒能、その他の要因の影響を除外し、純粋に、対面距離Ｈ１の高さが再現性に与える影響を判断するためである。より具体的には、試薬部３３は、基板３上に材料液を保持させることにより液相として形成した。材料液としては、フェリシアン化カリウムが２０ｍＭ、フェロシアン化カリウムが２４ｍＭ、塩化カリウムが１．５Ｍとなるように調製されたものを用いた。
実施例１（ヘマトクリット値の影響の検討）
本実施例においては、本案グルコースセンサ１，２および比較グルコースセンサ１を用いて、ヘマトクリット（Ｈｃｔ）値が応答電流値に与える影響を評価した。
この評価においては、血液としては、グルコース濃度が４１２ｍｇ／ｄＬ、Ｈｃｔ値が１９％、４２％、あるいは６９％のいずれかのものを用いた。
作用極３１と対極３２との間への電圧印加は、印加電圧値を２００ｍＶとして血液の供給と同時に開始し、応答電流値は、電圧印加の開始から５ｓｅｃ、７ｓｅｃ、および１０ｓｅｃ後に測定した。各Ｈｃｔ値の血液については、５回ずつ応答電流値を測定した。
応答電流値の測定結果は、本案グルコースセンサ１については図７に、本案グルコースセンサ２については図８に、比較グルコースセンサ１については図９にそれぞれ示した。また、図７〜図９においては、横軸を時間（ｓｅｃ）、縦軸をＢｉａｓ（％）として示してある。Ｂｉａｓ（％）は、Ｈｃｔ値が４２％のときの応答電流値を基準とし、この基準値に対するずれ量を示すものであり、各図においては、Ｂｉａｓ（％）は５回の測定の平均値として示してある。
図７〜図９を比較すれば分かるように、電圧印加時間の如何に拘わらず、対面距離Ｈ１が小さいほどＢｉａｓが小さくなる傾向にある。したがって、対面距離Ｈ１が小さいほど、血液のＨｃｔ値の影響が小さくなる傾向が伺える。
実施例２（温度の影響）
本実施例においては、本案グルコースセンサ１，２および比較グルコースセンサ１を用いて、血液の温度が応答電流値に与える影響を評価した。
この評価においては、血液としては、Ｈｃｔ値が４２％、グルコース濃度が１００．０ｍｇ／ｄＬ、４２２．０ｍｇ／ｄＬ、あるいは６３６．０ｍｇ／ｄＬのいずれかで、温度が５℃、２５℃あるいは４５℃に調製されたものを用いた。
作用極３１と対極３２との間への電圧印加は、印加電圧値を２００ｍＶとして血液の供給開始から行い、応答電流値は、電圧印加開始から５ｓｅｃ後に測定した。各グルコース濃度の血液については、５回ずつ応答電流値を測定した。
応答電流値の測定結果は、本案グルコースセンサ１については図１０に、本案グルコースセンサ２については図１１に、比較グルコースセンサ１については図１２にそれぞれ示した。また、図１０〜図１２においては、横軸を温度（℃）、縦軸をＢｉａｓ（％）として各グルコース濃度について個別に示した。ここで、Ｂｉａｓ（％）は、温度が２５℃のときの応答電流値を基準とし、この基準に対するずれ量を示すものであり、各図においては、Ｂｉａｓ（％）は５回の測定の平均値として示してある。
図１０〜図１２を比較すれば分かるように、グルコース濃度および電圧印加時間の如何に拘わらず、対面距離Ｈ１が小さいほどＢｉａｓが小さくなる傾向にある。したがって、対面距離Ｈ１が小さいほど、血液の温度の影響が小さくなる傾向が伺える。
実施例３（測定レンジの評価）
本実施例では、本案グルコースセンサ１を用いて、測定レンジを評価した。測定レンジは、グルコース濃度と応答電流値との関係（直線性）により評価した。
この評価においては、血液としては、Ｈｃｔ値が４２％、グルコース濃度が０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、６１０ｍｇ／ｄＬ、８０５ｍｇ／ｄＬあるいは９８０ｍｇ／ｄＬのものを用いた。作用極３１と対極３２との間への電圧印加は、印加電圧値を２００ｍＶとして血液の供給開始から行い、応答電流値は、電圧印加の開始から３ｓｅｃ後に測定した。各グルコース濃度の血液については、１０回ずつ応答電流値を測定した。
応答電流値の測定結果は、図１３に示した。ただし、図１３においては、応答電流値（μＡ）は、１０回の測定の平均値として示してある。
図１３から分かるように、本案グルコースセンサ１では、グルコース濃度が０〜１０００ｍｇ／ｄＬの範囲で高い直線性を示しており、グルコース濃度が比較的に大きい場合（６００ｍｇ／ｄＬ以上）であっても、適切にグルコース濃度を測定できるといえる。したがって、本案グルコースセンサ１のように、酸化還元酵素としてＣｙＧＤＨを、メディエータとしてＲｕ錯体を使用すれば、対面距離Ｈ１を小さくして設定しても、３秒程度の短い測定時間で、０〜１０００ｍｇ／ｄＬの範囲にあるグルコースの濃度を適切に測定できるといえる。
実施例４（再現性の評価）
本実施例では、本案グルコースセンサ３，４および比較グルコースセンサ２を用いて、複数回の応答電流値の測定のタイムコースおよび相対標準偏差Ｃ．Ｖ．（％）のタイムコースに基づいて、応答電流値の再現性を評価した。
この評価においては、血液としてＨｃｔ値が４２％、グルコース濃度が４１２ｍｇ／ｄＬのものを用いた。作用極３１と対極３２との間への電圧印加は、印加電圧値を２００ｍＶとして血液の供給開始から５秒後に開始し、応答電流値は、電圧印加の開始から、５０ｍｓｅｃ毎に経時的に測定した。
タイムコースの測定結果については、図１４〜図１６に示した。これらの図においては、５回分の測定の応答電流値のタイムコースを同時に示してあり、図１４は本案グルコースセンサ３、図１５は本案グルコースセンサ４、図１６は比較グルコースセンサ２を用いたときの結果をそれぞれ示している。一方、図１７には、Ｃ．Ｖ．（％）のタイムコースを示した。このタイムコースは、応答電流値のタイムコースを得るための５回の応答電流値の測定に基づいて作成した。
図１４〜図１６から分かるように、本案グルコースセンサ３，４では、比較グルコースセンサ２と同様に応答電流値のタイムコースに殆どバラツキが見られず、複数回の測定において良好な再現性が得られた。一方、図１７から分かるように、本案グルコースセンサ３では、電圧印加開始初期、すなわち電圧印加開始から０．５〜３．０（ｓｅｃ）の時間範囲において、本案グルコースセンサ４や比較グルコースセンサ２に比べてＣ．Ｖ．が小さく、Ｃ．Ｖ．値が概ね２．５％以下と小さくなっている。本案グルコースセンサ４では、電圧印加開始から３．０〜７．０（ｓｅｃ）の時間範囲において、比較グルコースセンサ２に比べてＣ．Ｖ．が小さく、Ｃ．Ｖ．値が概ね２．５％以下と小さくなっている。これらの結果から分かるように、対面距離Ｈ１が小さく設定すれば、電圧印加開始から短い時間範囲において、再現性が良好なものとなっている。したがって、再現性の観点からは、対面距離Ｈ１を小さく設定したグルコースセンサは、短い測定時間に適したものであるといえる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料液を保持するための反応空間を備えた分析用具であって、
上記反応空間には、試料液が保持されたときに溶解する試薬部が配置されており、
上記反応空間の一部は、互いに対面する第１および第２面によって規定されており、かつ上記第１および第２面の対面距離が４５μｍ以下に設定されている、薄型分析用具。
【請求項２】
互いに対向した状態で間隔を隔てて配置され、かつ上記反応空間を規定する第１および第２板材を備えており、
上記第１および第２面は、上記第１および第２板材の厚み方向に直交する方向に広がりをもつ面である、請求項１に記載の薄型分析用具。
【請求項３】
上記第１板材の一面に設けられ、かつ少なくとも一部が上記反応空間に臨むとともに、試料液に電圧を印加するために利用される第１および第２電極をさらに備えており、
上記対面距離は、上記第１または第２電極の上面から、上記第２板材における当該電極の上面に対面する部分までの最小距離である、請求項２に記載の薄型分析用具。
【請求項４】
上記対面距離は、２５〜４５μｍの範囲である、請求項３に記載の薄型分析用具。
【請求項５】
上記第１板材に設けられた第１電極と、上記第１電極に対面するように上記第２板材に設けられ、かつ上記第１電極とともに試料液に電圧を印加するために利用される第２電極と、をさらに備えており、
上記対面距離は、上記第１電極と上記第２電極との間における最小距離である、請求項２に記載の薄型分析用具。
【請求項６】
上記対面距離は、２５〜４５μｍの範囲である、請求項５に記載の薄型分析用具。
【請求項７】
上記反応空間は、毛細管力により試料を移動させるように構成されている、請求項１に記載の薄型分析用具。
【請求項８】
上記試薬部は、電子伝達物質および酸化還元酵素を含んでいる、請求項１に記載の薄型分析用具。
【請求項９】
上記電子伝達物質は、Ｒｕ化合物である、請求項８に記載の薄型分析用具。
【請求項１０】
上記Ｒｕ化合物は、下記化学式（１）で示されるものである、請求項９に記載の薄型分析用具。
［Ｒｕ（ＮＨ３）５Ｘ］ｎ＋ ・・・（１）
上記化学式（１）においては、Ｘは、ＮＨ３、ハロゲンイオン、ＣＮ、ピリジン、ニコチンアミド、あるいはＨ２Ｏであり、ｎ＋はＸの種類により決定される酸化型Ｒｕ（ＩＩＩ）錯体の価数を表している。
【請求項１１】
上記化学式（１）におけるＸは、ＮＨ３またはハロゲンイオンである、請求項１０に記載の薄型分析用具。
【請求項１２】
上記酸化還元酵素は、グルコース脱水素活性を有するものである、請求項８に記載の薄型分析用具。
【請求項１３】
上記酸化還元酵素は、ブルクホルデリア属に属する微生物に由来のグルコース脱水素酵素である、請求項１２に記載の薄型分析用具。
【請求項１４】
上記酸化還元酵素は、グルコース脱水素活性を有し、かつ還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約６０ｋＤａであるαサブユニットを有している、請求項１３に記載の薄型分析用具。
【請求項１５】
上記酸化還元酵素は、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約４３ｋＤａであるチトクロムＣを有している、請求項１４に記載の薄型分析用具。
【請求項１６】
上記電子伝達物質は、Ｒｕ化合物であり、
上記酸化還元酵素は、ブルクホルデリア属に属する微生物に由来のグルコース脱水素酵素である、請求項８に記載の薄型分析用具。
【請求項１７】
上記Ｒｕ化合物は、下記化学式（２）で示されるものであり、
上記酸化還元酵素は、グルコース脱水素活性を有し、かつ還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約６０ｋＤａであるαサブユニットと、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約４３ｋＤａであるチトクロムＣと、を有している、請求項１６に記載の薄型分析用具。
［Ｒｕ（ＮＨ３）５Ｘ］ｎ＋ ・・・（２）
上記化学式（２）においては、Ｘは、ＮＨ３、ハロゲンイオン、ＣＮ、ピリジン、ニコチンアミド、あるいはＨ２Ｏであり、ｎ＋はＸの種類により決定される酸化型Ｒｕ（ＩＩＩ）錯体の価数を表している。
【請求項１８】
試料液として、血液、尿、唾液、あるいはこれらの調整液などの生化学的試料を使用し、グルコース、コレステロール、乳酸、あるいはアスコルビン酸を分析できるように構成されている、請求項１に記載の薄型分析用具。
【請求項１】
試料液を保持するための反応空間を備えた分析用具であって、
上記反応空間には、試料液が保持されたときに溶解する試薬部が配置されており、
上記反応空間の一部は、互いに対面する第１および第２面によって規定されており、かつ上記第１および第２面の対面距離が４５μｍ以下に設定されている、薄型分析用具。
【請求項２】
互いに対向した状態で間隔を隔てて配置され、かつ上記反応空間を規定する第１および第２板材を備えており、
上記第１および第２面は、上記第１および第２板材の厚み方向に直交する方向に広がりをもつ面である、請求項１に記載の薄型分析用具。
【請求項３】
上記第１板材の一面に設けられ、かつ少なくとも一部が上記反応空間に臨むとともに、試料液に電圧を印加するために利用される第１および第２電極をさらに備えており、
上記対面距離は、上記第１または第２電極の上面から、上記第２板材における当該電極の上面に対面する部分までの最小距離である、請求項２に記載の薄型分析用具。
【請求項４】
上記対面距離は、２５〜４５μｍの範囲である、請求項３に記載の薄型分析用具。
【請求項５】
上記第１板材に設けられた第１電極と、上記第１電極に対面するように上記第２板材に設けられ、かつ上記第１電極とともに試料液に電圧を印加するために利用される第２電極と、をさらに備えており、
上記対面距離は、上記第１電極と上記第２電極との間における最小距離である、請求項２に記載の薄型分析用具。
【請求項６】
上記対面距離は、２５〜４５μｍの範囲である、請求項５に記載の薄型分析用具。
【請求項７】
上記反応空間は、毛細管力により試料を移動させるように構成されている、請求項１に記載の薄型分析用具。
【請求項８】
上記試薬部は、電子伝達物質および酸化還元酵素を含んでいる、請求項１に記載の薄型分析用具。
【請求項９】
上記電子伝達物質は、Ｒｕ化合物である、請求項８に記載の薄型分析用具。
【請求項１０】
上記Ｒｕ化合物は、下記化学式（１）で示されるものである、請求項９に記載の薄型分析用具。
［Ｒｕ（ＮＨ３）５Ｘ］ｎ＋ ・・・（１）
上記化学式（１）においては、Ｘは、ＮＨ３、ハロゲンイオン、ＣＮ、ピリジン、ニコチンアミド、あるいはＨ２Ｏであり、ｎ＋はＸの種類により決定される酸化型Ｒｕ（ＩＩＩ）錯体の価数を表している。
【請求項１１】
上記化学式（１）におけるＸは、ＮＨ３またはハロゲンイオンである、請求項１０に記載の薄型分析用具。
【請求項１２】
上記酸化還元酵素は、グルコース脱水素活性を有するものである、請求項８に記載の薄型分析用具。
【請求項１３】
上記酸化還元酵素は、ブルクホルデリア属に属する微生物に由来のグルコース脱水素酵素である、請求項１２に記載の薄型分析用具。
【請求項１４】
上記酸化還元酵素は、グルコース脱水素活性を有し、かつ還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約６０ｋＤａであるαサブユニットを有している、請求項１３に記載の薄型分析用具。
【請求項１５】
上記酸化還元酵素は、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約４３ｋＤａであるチトクロムＣを有している、請求項１４に記載の薄型分析用具。
【請求項１６】
上記電子伝達物質は、Ｒｕ化合物であり、
上記酸化還元酵素は、ブルクホルデリア属に属する微生物に由来のグルコース脱水素酵素である、請求項８に記載の薄型分析用具。
【請求項１７】
上記Ｒｕ化合物は、下記化学式（２）で示されるものであり、
上記酸化還元酵素は、グルコース脱水素活性を有し、かつ還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約６０ｋＤａであるαサブユニットと、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約４３ｋＤａであるチトクロムＣと、を有している、請求項１６に記載の薄型分析用具。
［Ｒｕ（ＮＨ３）５Ｘ］ｎ＋ ・・・（２）
上記化学式（２）においては、Ｘは、ＮＨ３、ハロゲンイオン、ＣＮ、ピリジン、ニコチンアミド、あるいはＨ２Ｏであり、ｎ＋はＸの種類により決定される酸化型Ｒｕ（ＩＩＩ）錯体の価数を表している。
【請求項１８】
試料液として、血液、尿、唾液、あるいはこれらの調整液などの生化学的試料を使用し、グルコース、コレステロール、乳酸、あるいはアスコルビン酸を分析できるように構成されている、請求項１に記載の薄型分析用具。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６１４４４
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【発行日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６４４９５（Ｐ２００４−５６４４９５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１６１３２
【国際出願日】平成１５年１２月１６日（２００３．１２．１６）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【発行日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１６１３２
【国際出願日】平成１５年１２月１６日（２００３．１２．１６）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
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