薬物の効力を増強するための組成物および方法
【課題】細胞傷害性または抗新生物薬物に対する取得したまたは固有の細胞抵抗性を減弱または克服する方法の提供。
【解決手段】メトトレキセート、パクリタキセル（タキソール）、5-フルオロウラシルおよびシクロホスファミドまたはそれらの配合物である細胞傷害性または抗新生物剤とヒアルロン酸としても知られるヒアルロナンを共投与することで当該薬物の癌細胞殺滅能を増強させる方法。
【解決手段】メトトレキセート、パクリタキセル（タキソール）、5-フルオロウラシルおよびシクロホスファミドまたはそれらの配合物である細胞傷害性または抗新生物剤とヒアルロン酸としても知られるヒアルロナンを共投与することで当該薬物の癌細胞殺滅能を増強させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬物の効力の増強に関し、さらに詳しくは、細胞または生体の薬物に対する抵抗性を克服することに関する。
【０００２】
（発明の背景）
任意の化学療法剤または薬物の臨床的有用性はその薬物に対する細胞抵抗性の発生によって著しく影響を受けることがある。したがって、薬物に対する抵抗性に関与する細胞機構を解明し、同時にこのような抵抗性を克服することを試みて、これまでかなりの量の研究が行われてきた。現在までに薬物の抵抗性に関与する可能性が考えられる多くの細胞機構が提案されている。これらには、
（i）薬物の代謝の変化（これには活性化の低下および不活性化の上昇が包含される）、
（ii）活性化合物に対する標的細胞または生体の非透過性
（iii）阻害酵素の特異性の変化
（iv）標的分子の産生増加
（v）細胞傷害性損傷の修復の増強、および
（vi）交互生化学的経路による阻害反応の副経路の利用
が包含される。
【０００３】
薬物抵抗性に関与する細胞機構は複雑であり、したがって、薬物抵抗性の問題を克服するため一般的に適用可能な方法の開発はほとんど進歩していない。薬物抵抗性はほとんどすべての化学療法的応用に伴う問題であるが、さらに複雑化する因子は、多くの場合、併用される多くの薬物による継続的かつ長期間の処置が要求されることである。
【０００４】
癌の処置においては、たとえば、活性薬物に対する癌癌細胞の非透過性が観察されることが多い。しかも、１つの薬物に対する抵抗性は生化学的に異なる他の薬物に対する抵抗性を付与することがしばしば見出される。これは多重薬物抵抗性と呼ばれる。多重薬物抵抗性の問題により影響される典型的な薬物にはドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチンおよびアクチノマイシンDが包含される。少なくとも一部の場合には、多重薬物抵抗性は、MdrIタンパク質と呼ばれ、P-糖タンパク質としても知られる細胞膜薬物エフラックストランスポーターの高レベルの発現に連結している複雑な表現型である。この「膜」ポンプは広い特異性を有し、細胞から、化学的に無関係な広範囲の様々な毒素を除去するように働く（Endicottら, 1989 参照）。
【０００５】
最近、スペクトルの広い薬物抵抗性の類似の機構がある種の微生物で報告されている。これらの結果は、哺乳動物細胞の多重薬物抵抗性ポンプに類似のきわめて広範囲の基質特異性を有する細菌エフラックスシステムの存在を指示するものである（Nikaido, 1993 参照）。
【０００６】
多重薬物抵抗性を逆転させる物質は抵抗性修飾剤（RMA）として知られ、ヒト癌が抵抗性になった化学療法剤の細胞傷害性を増強するのに重要である。多くの薬物がインビトロにおいてRMAとして同定されているが、これらの大部分は、多重抵抗性を逆転するのに要求される用量ではインビボにおいて高い毒性を示すため治療的に使用される可能性はほとんどまたは全くない。たとえば、アジドのような代謝毒はインビトロにおいては多重薬物抵抗性を逆転することができるが、インビボでは全く役に立たない。他の高度に有効なRMAの大部分、たとえばPSC833はMdrIタンパク質上の薬物結合部位の競合的アンタゴニストとして働くように思われる。これらの薬物の多くはまた、それらのインビボにおける有用性を限定する毒性を有する。したがって、多重薬物抵抗性を逆転させるためには別の薬理学的戦略を開発する必要がある。
【０００７】
抗新生物薬物の貧弱な腫瘍への取り込みを克服し、全身毒性を低下させる試みにおいて（Singhら, 1991）、研究者らは抗新生物薬物たとえばメトトレキセート（MTX）を悪性組織の局在に標的化することを試みてきた。幾つかの研究は既にそれらの腫瘍への親和性によって選択されたポリマーに薬物を連結させることにより化学療法剤を腫瘍に標的化することを試みている（Hudeczら, 1993; Kleinら, 1994; Akimaら, 1996）。これらのポリマーは活性薬物のそれらの標的組織への送達を補助するものではあるが、しかしながら、それらは必ずしも薬物抵抗性の問題を克服するものではない。
【０００８】
腫瘍標的化剤として提案された１つのポリマーはヒアルロナン（HA）である。ヒアルロン酸としても知られるHAは、直鎖状のポリマーからなる天然に存在する多糖であり、動物界を通して普遍的に見出される。HAはきわめて水溶性が高く、それにより生物学的システムに理想的な薬物送達ビヒクルとなっている。
【０００９】
本出願人らは今回、HAが驚くべきことに薬物担体として薬物の有用性を増大させるのみでなく、薬物抵抗性の克服にも使用されるユニークな構造および物理化学的性質を表すことを見出したのである。約1 g/Lの高濃度において、HAは分子量に比べて例外的に大きな容量を占め（Laurent, 1970）、このレベルまたはそれ以下で、それは緩く連結して巨大分子ネットワークを形成する（図１）。何らかの特定の理論に拘泥することを望むものではないが、HAの物理的特性に基づいて、多糖と薬物たとえばメトトレキセート間の相互作用の機構は以下２形態のいずれかまたは両者をとるものと本発明者らは考えている。
【００１０】
（i）化学的相互作用（図2A）
MTXのアミン基とHAのカルボキシル基の間にはイオン性結合が存在できるが、このような相互作用では沈殿を生じる可能性がある。他の可能な相互作用は薬物上の利用可能なアミン基とHAのヒドロキシル基との間の水素結合を介するものであるが、メトトレキセートは水に比較的不溶性であり、したがってもしこれが存在したとしてもきわめて弱い相互作用であると思われ、これは考え難い。MTXとHAの間の最も考えやすい結合はMTXの多くの疎水性グループとHAの二次構造における疎水性パッチの間の疎水性相互作用を介するものである（Scottら, 1989）。
【００１１】
（ii）分子会合
MTXをHAゲル中に単に「混合」した場合（図2B）、特別な化学結合を形成することなく、MTXは高濃度のHAによって形成された三次元ネットワーク内に捕捉され（Mikelsaar & Scott, 1994）、薬物は投与後、単純にHAから拡散する。HAが急速に取り込まれ、特異的な細胞受容体によって結合された場合、薬物はこれらの点、たとえばHA受容体を有するリンパ節、肝臓、骨髄、腫瘍細胞において高濃度に放出される。
【００１２】
この場合も何らかの特定の理論に拘泥することを望むものではないが、HAが活性薬物の標的化を補助する１つの機構は、幾つかの腫瘍タイプにおけるHA受容体の特徴的な過剰発現を介する可能性がある（Stamenkovicら, 1991; Wangら, 1998）。HA受容体CD44, ヒアルロナン仲介運動性の受容体（RHAMM）およびICAM-1は腫瘍の発生（Bartolazziら, 1994）および進行
に関与している。RHAMMは腫瘍細胞の運動性および浸潤を仲介する主要因子である（Hardwickら, 1992）。RHAMMが線維芽細胞のH-rasトランスフォーメーションに必須であることが証明され（Hallら, 1995）、これがこの受容体を腫瘍形成および増殖に強力に関与させることになっている。HAの代謝への関与が考えられる（McCourtら, 1994）受容体であるICAM-1は、マウス肥満細胞腫のようなトランスフォームされた組織（Gustafsonら, 1995a）、ならびにヒト乳癌の腫瘍細胞の間質およびクラスター（Ogawaら, 1998）において高度に発現される。
【００１３】
腫瘍細胞におけるHA受容体の発現の増加は、化学療法処置の基準へのHAの導入を試みる理論的な背景を提供する。しかしながら、現在までに得られているきわめて限られたデータは本発明に請求された方法を実際に教示するものとは言えない。たとえば、マイトマイシンCおよびエピルビシンに対するHAの化学的複合体化によって限られた成功が達成され、研究者らは結腸癌の増殖を0.8〜25％阻害することができたという（Akimaら, 1996）。Kleinおよび共同研究者ら（1994）はHAを5-FUと単に混合することにより移植されたラット乳癌およびFischerの膀胱癌への薬物の取り込みの増加が達成されたことを報告している。マウス肥満細胞腫が静脈内に注射されたHAに親和性を有することも証明されている（Gustafsonら, 1995b）。
【００１４】
一部のHAの研究はHAが薬物担体として使用できることを示してはいるが、この研究のどれも、HAが薬物に対する細胞抵抗性を克服できることは何ら示していない。
【００１５】
（発明の要約）
本発明は細胞傷害性または抗新生物薬物の有効性を増強させる方法において、上記薬物とヒアルロナンを共投与する工程からなり、ヒアルロナンとの共投与が薬物の癌細胞殺滅能を増強する方法に関する。
【００１６】
通常、細胞傷害性または抗新生物薬物とヒアルロナンの共投与はその癌細胞殺滅能を増強させる。すなわち、通常はその薬物に対して抵抗性である癌細胞はそれに感受性になる。
【００１７】
好ましくは、薬物はメトトレキセート、パクリタキセル（タキソール）または5-フルオロウラシル（5-FU）である。
【００１８】
本発明の第二の態様によれば、ヒアルロナンおよび細胞傷害性または抗新生物薬物からなる細胞傷害性または抗新生物医薬組成物が提供される。任意に、慣用の医薬用アジュバントをこの医薬組成物に含有させることができる。
【００１９】
通常、上記薬物はヒアルロナンの内部に同伴されるかまたはヒアルロナンに結合する。
【００２０】
本発明の第三の態様によれば、細胞傷害性または抗新生物薬物の有効性を増強させる方法において、ヒアルロナンおよび上記薬物からなる医薬組成物を投与する工程からなる方法が提供される。
【００２１】
理論に拘泥するわけではないが、薬物抵抗性を克服するために可能な機構は、
１．ヒアルロナンが抵抗性細胞上の受容体に結合するか、または膜エンドサイトーシスを介して細胞内に進入し、同伴または結合された薬物の細胞内送達を生じ、それが治療的に活性にされることを可能にする。
２．ヒアルロナンが抵抗性細胞の表面に結合し、そこで同伴または結合された薬物がヒアルロナンのネットワークから細胞内に拡散し、薬物の抵抗性細胞への送達を生じる。
３．ヒアルロナンおよび他のムコ多糖が薬物を同伴し、また様々な薬物を結合できるコイル状のコンフィギュレーションを採用する。
【００２２】
本発明の第四の態様によれば、本発明は薬物抵抗性を減弱または克服する方法において、細胞傷害性または抗新生物薬物を、その薬物を同伴および／または結合することが可能で、抵抗性細胞上の受容体への結合またはバルク（bulk）エンドサイトーシスを介して細胞内に進入できるムコ多糖類と共投与する工程からなり、上記薬物は細胞内に送達され、そこで治療的に活性にされる方法を提供する。
【００２３】
理論に拘泥するものではないが、ヒアルロナンと薬物の組み合わせは、薬物のより長期間にわたる細胞内への維持を生じ、薬物の長期にわたる放出および薬物がその薬理学的作用を発揮する時間の延長が可能になる。
【００２４】
したがって、本発明の第五の態様においては、薬物の有効性を増強させる方法において、上記薬物を上記薬物が単独で投与された場合より長期間細胞内に維持されるような方法で上記薬物を会合するムコ多糖と共投与する工程からなる方法を提供する。たとえば、薬物が細胞傷害性薬物である場合、薬物は長期間細胞内に維持され、長期間の放出、およびさらに長時間その毒性作用を発揮することが可能になる。
【００２５】
本発明の第六の態様によれば、薬物抵抗性疾患を処置する方法において、このような処置を必要とする患者に、ヒアルロナンおよび薬物を共投与する工程から構成される方法が提供される。
【００２６】
一実施態様においては、本発明のこの態様は、薬物抵抗性疾患を処置する方法においてこのような処置を必要とする患者に、ヒアルロナンおよび薬物からなる組成物を投与する工程から構成される方法を提供する。
【００２７】
とくに、薬物抵抗性疾患を処置する方法は薬物抵抗性の癌を有する患者に適用することができる。好ましくは、癌は、メトトレキセートまたは5-FUに対して抵抗性である。
【００２８】
さらに好ましくは、上記薬物の抵抗性は多重薬物抵抗性である。
【００２９】
本発明の第七の態様によれば、癌を処置する方法において、薬物を、上記薬物が単独で投与された場合より長期間、癌細胞内に維持されるような方法で、上記薬物を同伴もしくは結合および／または会合することが可能なムコ多糖と共投与する工程からなる方法を提供する。
【００３０】
本発明の第八の態様によれば、薬物の胃腸毒性を低減させる方法において、薬物を、上記薬物の胃腸毒性が低下するような方法で上記薬物を同伴もしくは結合および／または会合することができるムコ多糖と共投与する工程からなる方法を提供する。
【００３１】
本明細書および特許請求の範囲の記載を通じて、「からなる」の語ならびにその変化型たとえば「からなり」および「から構成される」の語は「包含するがそれらに限定されるものではない」ことを意味し、他の添加物、成分、数または工程を排除する意図ではない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、高濃度においてHAが三次元ネットワークを形成し、これは小分子たとえばメトトレキセートを同伴できることを示す。HA／薬物の病原部位への標的化はHAの特異的受容体への急速な結合、ついでHAからの薬物の拡散および／またはHAおよび／または薬物受容体を介するHAおよび薬物両者の共インターナリゼーションによって達成される。
【図２】図2Aは、メトトレキセートとHAの間の可能な分子相互作用を示す。これらには（i）イオン性結合、（ii）水素結合、または（iii）疎水性結合が包含される。 図2Bは、HA中におけるメトトレキセートの絡み合いの模式的表示である。高濃度においてHAは大きなコイル状分子によって表される三次元ネットワークを形成する。星印はわずか454 Dの分子量を有するメトトレキセートを表し、400〜900 kDのHA分子中に容易に同伴される。
【図３】図３は、ヌードマウスにおいて増殖したヒト乳癌腫瘍の一般的な病理を示す。パネルAはグレードII〜IIIのヒト腫瘍の一般的形態を示す。パネルBは図3Aに示す腫瘍の他の切片の顕微鏡写真を示す。この切片は周囲のマウス筋肉（M）、腫瘍カプセル（C）、腫瘍の壊死領域（N）、浸潤腫瘍（T）を示し、癌細胞が浸潤癌と会合していることが多く（Carter, 1990）ファイル状に癌細胞が並んだ「インディアンファイル」として知られる共通の現象を指示する（→）。
【図４】図４は、悪性な乳癌の古典的な病理学的特徴を示す。パネルAは、大きな壊死領域（N）を伴う特徴的な浸潤管癌の切片を示し、腫瘍のさらに侵襲的な過程を指示する。パネルBは血液細胞の存在を示し（→）、腫瘍が血管を新生すること、したがって生存していることが確認される。血管にきわめて接近して数個の管（D）が観察される。パネルCは（A）と標識され、核の分断によって指示されるように、アポトーシスを受けている細胞を示す。
【図５】図５は、ヌードマウスで増殖したヒト乳癌腫瘍上におけるHA受容体の免疫組織化学同定を示す。パネルAは癌胎児性抗原（CEA）の腫瘍における局在を示す。パネルBはヒト乳癌上におけるRHAMMの発現を示す。パネルCはヒト乳癌におけるICAM-1の発現を示す。HA受容体の局在、ICAM-1は内皮組織の周囲に一次的である（→）。パネルDはヒト乳癌におけるCD44の発現を示す。CD44Hは腫瘍細胞の約95％に検出された。H: ヒト起源の細胞；M: マウス起源の細胞
【図６】図６は、腫瘍のメトトレキセート標的化のための担体として使用されるヒアルロナンの分子量分析の結果を示す。
【図７】図７は、HAを担体として用い、ヒト乳癌のメトトレキセート標的化を示す。
【図８】図８は、HAの存在下、肝臓におけるメトトレキセートの取り込みの増加を示す。
【図９】図９は、薬物をHAとともに投与した場合、胃腸管におけるメトトレキセートの取り込みの減少を示す。
【図１０】図１０は、MTX／HAの間の可能な生理学的相互作用およびその結果の薬物／HA併用療法の腫瘍標的化能の模式的表示である。
【図１１】図１１は、HAの5-FUとの併用の細胞傷害性相乗的インビトロ作用を示す。
【図１２】図１２は、HAを担体として用い、ヒト乳癌腫瘍の5-FU標的化を示す。
【図１３】図１３は、ヒトにおけるHAの消失経路を示す。
【図１４】図１４は、胃、脳および肺臓における5-FUの取り込みの増加を示す。
【図１５】図１５は、血漿5-FUの薬物動態的消失に対するHAの作用を示す。
【図１６】図１６は、実験的終点の定義についての基準を示す。基準２（パネルA）および基準３（パネルB）を示す。
【図１７】図１７は、5-FU／HAアジュバント療法（6週処置基準）の効果：一次腫瘍容量に対する有効性を示す。
【図１８】図１８は、5-FU／HAアジュバント療法（6週処置基準）の効果：体重に対する有効性を示す。
【図１９】図１９は、5-FU／HAアジュバント療法（6週処置基準）の効果：癌のリンパ節への伸展および新たな腫瘍の形成に対する有効性を示す。
【図２０】図２０は、6カ月の有効性試験における腫瘍の一般的外観を示す。
【図２１】図２１は、5-FU／HAアジュバント療法の患者の生存率に対する有効性を示す。
【図２２】図２２は6週にわたりCMF／HA療法で処置したマウスの体重変化％を示す。
【図２３】図２３は6週にわたりCMF／HA療法で処置したマウスにおける腫瘍容量の変化％を示す。
【図２４】図２４は水に溶解したMTXの1H NMRスペクトルを示す。このスペクトルはMTX中の各グループの水素を容易に同定することができる。
【図２５】図２５は、MTXのHAとの可能性がある相互作用を示す。
【図２６】図２６は、ヒアルロン酸の600 MHz および298 Kでの600 MHz スペクトルを示す。
【図２７】図２７はMTX単独および2 nmole, 10 nmole, 20 nmole および80 nmoleのHA（50 kDa）を増量して添加したMTXの298 Kにおける 600 MHz 1H NMRスペクトルを示す。
【図２８】図２８は、5-FUおよび5-FU（1.25 mg/kg, 1.6 mg/mlおよび6.4mg/ml）をHA（750 kDa, 3 mg/ml）と70.0と8.5 ppm の間298 Kにおける 600 MHz 1H NMRスペクトルを示す。
【００３３】
略号
BSA ウシ血清アルブミン
Ci キューリー
CMF シクロホスファミド、メトトレキセートおよび5-フルオロウラシル
Cyc シクロホスファミド
DNA デオキシリボ核酸
Dpm 減衰／分
DTTP デオキシチミジントリホスフェート
ECM 細胞外マトリックス
EDTA エチレンジアミン四酢酸
ELISA 固相酵素免疫測定法
FCS ウシ胎児血清
5-FU 5-フルオロウラシル
GAG グリコサミノグリカン
GlcNAc N-アセチルグルコサミン
GlcUA グルクロン酸
HA ヒアルロナン／ヒアルロン酸
HABP ヒアルロナン結合タンパク質
HAase ヒアルロニダーゼ
HBSS ハンクス平衡塩溶液
HRP 西洋ワサビペルオキシダーゼ
h 時間
Kav ゲル内の分布有効容量
L リットル
min 分
PBS リン酸緩衝食塩溶液
PM 形質膜
RHAAM HA-仲介運動性の受容体
RMCa ラット乳癌
RNA リボ核酸
RT 室温
S-phase 合成相
S.D. 標準偏差
SEM 平均の標準誤差
Ve 溶出容量
V0 空隙容量
Vt 総容量
TGD 腫瘍成長遅延
TDT 腫瘍倍加Ti
【００３４】
（本発明の詳細な説明）
本発明をついでさらに以下の非限定的実施例を参照しながら説明する。しかしながら、実施例は単に例示的なものであり、上述の本発明の一般性に対していかなる意味でも限定として理解すべきではない。とくに、本発明は癌との関連において詳細に説明されるが、この場合の所見は癌の処置に限定されるものではないことは明らかであろう。たとえば、細胞傷害性薬物は他の状態の処置にも使用されるものであり、メトトレキセートは重症慢性関節リウマチの処置に広く使用されている。
【００３５】
実施例１ ヌードマウスにおけるヒト乳癌腫瘍の確認およびインシトウにおける乳癌腫瘍上のヒアルロナン受容体の同定
ヒト乳癌の適切な動物モデルを確立するためには、病理学的試験を実施することが必要である。腫瘍が生理学的に生存可能であるためには、毛細管ネットワークが腫瘍に栄養を供給するための血管新生が必須である。血管新生、管の浸潤、壊死、アポトーシス、高い有糸分裂指数および核の異常の存在はすべて、乳癌の特徴である。
【００３６】
ヒト乳癌細胞系MDA-MB-468（American Tissue Culture Collection, Rock ville, U.S.A.）はHA受容体、CD44, RHAMMおよびICAM-1のその発現に基づいて選択された。細胞は定常的に増殖させ、175 cm2の培養フラスコ内で10％ウシ胎児血清（FCS）および10μg/mlのゲンタマイシンを補充したLeibovitz L-15メジウム中で単層としてサブクローニングした。マウス細胞への注射のためには、100％の集蜜性に達するまで増殖させ、0.05％トリプシン／0.01％EDTA溶液中でトリプシン処理し、2回Beckman TJ-6実験室遠心分離器（Beckman, Australia）により400 gavで10分間遠心分離して洗浄し、モデル-MZ Coulter Counter（Coulter Electronics, England）を用いて計数し、血清を含まないLeibovitz L-15メジウムに1×108細胞/mlに再懸濁した。
【００３７】
無胸腺のBalb/c/WEHI雌性ヌードマウス（Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Melbourne, Australia）6〜8週齢85匹を特異的な病原体を含まない条件下に維持し、滅菌した飼料および水を自由に与えた。上述のようにして1000万個のMDA-MB 468細胞を調製し、各マウスの乳首下の脂肪パッドに直接注射した。腫瘍の増殖は96％のマウスで観察された。腫瘍の増殖が可視的に検知可能な場合は、腫瘍の進行は腫瘍容量を毎週測定してモニタリングした。腫瘍容量は３方向の垂直な直径から次式を用いて計算した。
V=(1/6) p (d1d2d3)
式中、Vは腫瘍容量（mm3）
d1は腫瘍の第一の直径（mm）
d2は腫瘍の第二の直径（mm）
d3は腫瘍の第三の直径（mm）である（Lamszusら, 1997）。
【００３８】
腫瘍の移植後８週における平均腫瘍サイズは482.2 mm3（SEM, 39.8 mm3）であった。
【００３９】
腫瘍の誘導から約8週後に、2匹の担癌マウスに致死用量のネンブタールを投与した。マウスの屠殺から3分以内に、腫瘍を外科的に摘出し、直ちに10％緩衝ホルマリン中で12時間固定した。固定した腫瘍を一連の70〜100％エタノール洗浄で一夜脱水し、ついでパラフィンに包埋し、それから2〜4μmの切片を切り出した。切片をスライド上に載せ、脱蝋し、冠水する。スライドを3×5分間リン酸緩衝食塩溶液（PBS）中で洗浄した。異好性タンパク質を10％ウシ胎児血清とのインキュベーションついでPBS洗浄によってブロックした。検出抗体を6分間室温（RT）で適用した。抗血清もしくは抗体はRHAMM（Applied Bioligands Corporation, Manitoba, Canada）, ICAM-1, CD44V6, CD44V10, 総CD44H, およびCAEに対して作成した。すべての他の検出抗体はZymed (California, U.S.A)から購入した。スライドをPBS中で3×5分間洗浄し、内因性ペルオキシダーゼ活性を20分間0.3％H2O2／メタノール中に浸漬してブロックした。ついでさらにPBS洗浄し、ペルオキシダーゼ接合ブタ抗-ウサギ二次抗体（Dako, Denmark）を60分間RTで適用し、PBS中で3×5分間洗浄した。Sigma Fast DAB (3,3'-ジアミノベンチジン, Sigma, St. Louis, U.S.A) 錠を製造業者の説明書に従って調製し、DAB溶液を5〜10分間RTで適用した。スライドを流水で10分間洗浄し、ヘマトキシリンによって対比染色し、脱水して搭載した。
【００４０】
ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した乳癌切片の検査では、図３および４に示すように、生存腫瘍に関連するすべての通常の特徴が証明され、動物宿主によるグレードIIヒト乳癌の維持は成功したことが確認された。悪性の特徴であるいくつかの性質がある。(B)と標識されたスライドの切片はこれらの性質を示す。切片(B)に観察される悪性の病理学的特徴は、
i) 高い核／細胞質比
ii) 角のあるクロマチンおよび核
iii) 不規則な核膜
である。
【００４１】
グレードII〜IIIのレベルの腫瘍はヌードマウスモデルで維持されると結論された。グレードII〜IIIのレベルの腫瘍は、一般に約47％の予後生存率を与える(Bloom & Richardson, 1957)。グレードII〜IIIのレベルの腫瘍は、
i) 中等度の核多形性、過染色性、および有糸分裂活性、表示された腫瘍の切片を通して観察される特徴；および
ii) 管形成はほとんどまたは全くないこと
によって特徴づけられる。壊死（N）の大きな領域を転移した腫瘍に相関させることが可能で、これは強い侵襲的浸潤過程を示唆する（Carter, 1990）。腫瘍の浸潤縁は（）によって指示される。
【００４２】
この実験の主要な目的は、これらのマウスで確立された組織学的および細胞学的挙動がそれらの自然のヒト宿主におけるこのような腫瘍の場合に匹敵することの確認であった。この目的を達成するために、本発明者らはまた、マウスにおける腫瘍細胞がヒト起源であり、それらは高度に関連するHA受容体、たとえばRHAMM, CD44および推定ICAM-1を発現することも示した。腫瘍標的化が受容体仲介インターナリゼーションまたは結合を介して起こると仮定されるので、HA受容体、ICAM-1, CD44およびRHAMMの発現を確認することが必要であった。図５B〜Dはこれらのすべての受容体が存在したことを証明する。表１には試験した２つの腫瘍における受容体の発現程度を掲げる。
【表１】
【００４３】
腫瘍細胞のヒト起源は腫瘍および周辺組織をヒト特異的癌マーカーで染色して確認した。CEAの存在は腫瘍がヒト起源であったことを明瞭に証明したが、これはマウス宿主の心脈管系によって維持された（図5A）。ポリクローナルCEA抗血清が分泌され、それはヒトCEAと排他的に反応する。この顕微鏡写真は褐色の染色で明らかなように、完全にヒト起源（H）であることが証明された。周囲の腫瘍カプセルおよび脂肪組織は抗血清（M）による染色を欠くことにより示されるように明らかにマウス起源である。褐色染色は腫瘍細胞上におけるRHAMMの高発現を証明する。最も強い染色は壊死および腫瘍浸潤組織を取り巻く領域に認めることができる。
【００４４】
実施例２ メトトレキセート／ヒアルロナン薬物配合物の調製および注射
ヌードマウスモデルの有用性が確立されたので、今回HA／MTX製剤の有効性を試験するために使用することができた。
MTXの保存溶液は粉末MTXを0.5％w/v 食塩溶液（pH 9）に溶解し、0.9％w/v NaClで24.5 mg/ml 濃度として調製した。保存溶液は、[3H]メトトレキセートを添加し、注射用等級の食塩で注射用濃度に希釈する前に、滅菌を保証するために、0.22μm のフィルターを通してろ過した。MTXの薬物動態に関する比較データはヌードマウスおよびヒトについて既に報告されている（Inabaら, 1998）ので、可能な限りヒト治療用量に近くシュミレートするため、この試験の設計に使用した。個々の注射溶液は、50μl 中15 mg/kg MTX（平均体重60 kg について0.42 mg/kg のヒト治療用量に均等；Inabaら, 1988）を送達するように個々のマウスの体重に従って調製した。
【００４５】
乾燥したHA（モデルMr 8.9×105 kDa）を24.5 mg/ml MTX保存溶液の一部に加え、一夜ボルテックス攪拌して溶解し、最終濃度21 mg/ml とした。滅菌性を保証するため、ゲンタマイシンを濃度50μg/ml に加え、一夜４℃でインキュベートした。ついで[3H]メトトレキセートを添加したのち、HA／MTX保存混合物を注射用等級の食塩で注射用濃度に希釈した。注射はマウスの体重により、50μl 中MTX 15 mg/kg およびHA 12.5 mg/kg が送達されるように個々に注射した。生体内に注射したこの量のHAによれば、実験期間中飽和キネティックスが観察された（Fraserら, 1983）。
【００４６】
メトトレキセート／HA 注射用混合物の調製時にHA がその分子量を保持することを保証するために、注射用溶液を、カラム特性1.6 cm×70 cm, サンプルサイズ 2 ml, 流速18 ml/時および分画サイズ2 ml でSephacryl S-100サイズ排除ゲル（Pharmacia, Uppsala, Sweden）上で分析した。図６は混合操作時にHAがその分子量を維持したことを示している。
【００４７】
マウスは各群40匹の2群に無作為に分割した。群１にはMTXのみを投与した。群２にはMTX／HA併用療法を行った。動物は個別に注射ボックスに収容し、注射は尾静脈に行った。各注射液により、トリチル化メトトレキセート（注射された平均崩壊度／分（dpm）±平均の標準誤差（SEM）：19,159.146±1,336,819）を含む15 mg/kg MTX±12.5 mg/kg HAが送達された。マウスは尿を収集できるように、柔らかい非湿潤性のプラスチック製の檻に個別に収容した。注射後30分、1時間、2時間、4時間または8時間に、マウスをネンブタール（Glaxo, Australia Pty. Ltd., Melbourne, Australia）0.1 ml の腹腔内注射によって麻酔し、注射針およびシリンジを用いて心臓または大動脈から血液を採集した。血液収集後、動物は頚椎脱臼によって屠殺した。
【００４８】
血液をEDTA-被覆ガラス試験管に取り、14,000 gav で10分間遠心分離して血漿を調製した。100μl の30％v/v 過酸化水素で脱色し、3 ml のHiSafeII シンチラントを加えたのち、50μl のアリコート中で放射能をカウントした。ケミおよびフォトルミネセンスを克服するためサンプルはWallac 1410 β-カウンター中、サンプルのソースに依存して、3, 7または20 d期にわたってカウントした。カウンティングの間の期間にはサンプルは室温で暗所に保存した。すべての計算はすべてのケミおよびフォトルミネセンスを除いた安定化サンプルについて実施した。
【００４９】
血漿中の注射MTXの百分率を計算するためには、標準式：
マウス体重（g）×マウス血液容量（0.07）×血液の血漿部分（0.59）
を用いて各マウスの総血漿容量を計算することが必要であった。ついで血漿中の注射MTXの百分率は
血漿容量（ml）×血漿dpm/ml×100／総注射dpm=血漿中％注射MTX
によって計算した。
【００５０】
血流中に送達されたMTXの量の正確な割合を保証するため尾静脈の注射部位を切り取り、MTXを定量した。注射部位に残された注射MTXの平均百分率は3.78％（SEM: 0.57％）であった。血流に送達されたMTXの量（組織および腫瘍に分布可能なMTX）は次のように計算された。
血流に送達されたMTXの量（dpm）=
注射シリンジの重量差（mg）×注射物質のDpm/mg−注射部位に残ったDpm
血流に送達されたMTXは以下「注射用量」と呼ぶ。
【００５１】
サンプル集団間の正確な比較を可能にし、臓器および腫瘍塊中のわずかな変動を正規化するために、生体臓器および腫瘍ならびに体液中のMTX濃度は組織グラム数あたりの注射用量の％として表示した。
【００５２】
注射部位に残った注射MTXの平均百分率は3.78％（SEM: 0.57％）であった。このような変動を正規化するため、腫瘍および組織に見出されたdpmを注射dpm−注射部位に残ったdpmの百分率として計算した。この量は以下利用可能なdpmまたは利用可能メトトレキセートと呼ぶことにする。結果は表２にまとめる。
【表２】
【００５３】
薬物をHAと共投与した場合、MTXの血漿レベルには統計的な有意差は認められなかった。MTXの全般的な薬物動態は変化しないままで、最大MTX血漿レベルに静脈内注射後0.5〜2時間以内で到達した（MIMS, 1997）。
【００５４】
可能な尿は非湿潤性プラスチック製の檻からシリンジおよび注射針で収集した。尿は14,000 gavで10分間遠心分離して澄明にした。その放射性カウントは8〜30μlの範囲のサンプルに3 ml のHiSafeII シンチラントを加えたのち測定した。各マウスにより排泄された尿の容量の正確な測定における技術的困難性にもかかわらず、本発明者らは尿中の注射MTX用量の百分率を次式で計算した。
収集の時間（時間）×42μl×dpm/μl尿×100／注射総dpm
=尿中注射MTXの％
【００５５】
排尿頻度の変動により、各マウスから尿を収集することはできなかった。３回またはそれ以上の標品が各処置あたり各時点で利用可能であった場合は、その時点においてデータのノンパラメトリックな統計的検定を行った。MTX/HAを投与されたマウスの尿には50％（p=0.043）以上のMTXが投与1時間後に認められた（表２参照）。
【００５６】
マウスの屠殺後直ちに、腫瘍、肝臓、心臓、脾臓、膀胱、左および右腎臓、子宮、肺臓、胃、腸、脳およびリンパ節を摘出し、総放射能を分析した。各組織の総放射能は100〜400 mg の組織を3〜6 ml のOptiSolv（ACC, Melbourne, Australia）中に22℃で36時間可溶化して測定した。可溶化の完了時に、組織中の放射能は10 ml のHiSafeII シンチラントを加えたのちカウントした。この場合も、ケミおよびフォトルミネセンスを克服するためにサンプルはWallac 1410 β-カウンター中、サンプルのソースに依存して、3, 7または20 d期にわたって2分間カウントした。カウンティングの間の期間には、サンプルは室温で暗所に保存した。すべて計算はすべてのケミおよびフォトルミネセンスを除いた安定化サンプルについて実施した。数字はメジアン±SEM（n=8）を表す。
【００５７】
代謝的に活性な臓器たとえば肝臓、脾臓および腎臓が腫瘍標的化の増大に何らかのプラスの局面を妨害できる薬物標的化の高レベルは経験されなかったということを確立することは重要であった。表２には試験した様々な時点での各組織のメトトレキセートの取り込みを掲げる。
【００５８】
Mann-Whitneyの順位和検定およびStudentのτ-検定を用いて、MTXをHAと共投与した場合のMTX濃度／g 組織には統計的な有意差はなかった。各時点における動物が少数なため、１つのデータポイントが重複すればMann-Whitney試験は統計的に無効になるが、肝臓、子宮および腸では明確な傾向が認められた。
【００５９】
肝臓では、HAと組み合わせた場合に、図７に示すように、短期間のMTXの取り込み増加がみられた。30分および1時間の時点で、肝臓にはMTX濃度にそれぞれ平均（メジアン）65％および26％の上昇が認められた。2時間では、処置に無関係に肝臓におけるMTXの量には差は観察されなかった。4時間後には興味ある傾向が明瞭になり、図８に示すように、HAと共注射した場合、肝臓におけるMTXの低下が見出された（4時間：68％低いMTX, 8時間：75％低いMTX）。
【００６０】
腸には有意な傾向があり、HAとMTXを組み合わせた場合にはすべての時点で、図９に示すように薬物の取り込み低下を生じた。
腸は完全にホモジナイズし、ついで組織約400 mg を3〜6 ml のOptiSolv中に22℃で24時間可溶化し、ついで10 ml のHiSafeII シンチラントを加えた。ケミおよびフォトルミネセンスを克服するため、サンプルはWallac 1410 β-カウンター中、サンプルのソースに依存して、3, 7または20 d期にわたって2分間カウントした。カウンティングの間の期間には、サンプルは室温で暗所に保存した。すべて計算はすべてのケミおよびフォトルミネセンスを除いた安定化サンプルについて実施した。
【００６１】
数字は平均（メジアン）±SEM（n=8）を表す。マッチしたペアについてのノンパラメトリックなランダム化試験でのデータの分析では、HAの共投与は薬物の胃腸管への排泄を有意に低下させることが証明された（p=0.031, 片側検定）。
MTX濃度の低下は43〜67％の範囲であった。マッチしたペアについてのノンパラメトリックなランダム化試験でのデータの分析では、HAの共投与は薬物の胃腸管への排泄を有意に低下させることを示した（p=0.031, 片側検定）。
【００６２】
肺ではHAと共投与した場合、4時間の時点で有意なMTXの低下があり、52％の平均（メジアン）低下（p=0.014％）を生じた。他の時点では有意差は証明されなかったが、しかしながら、この観察の意味は不確定である。
脾臓、子宮、脳、心臓、リンパ節、胃および腎臓では認めるべき傾向は検出されなかった。
【００６３】
メトトレキセートの腫瘍細胞へのHA標的化には２つの機構の可能性がある（図10）。
HAをMTXと配合した場合には有意な標的化効果が認められた（図７）。薬物の腫瘍における保持の最も大きい相対的増加は、0.5時間（平均24％の増加）、１時間（平均30％の増加）および2時間（平均119％の増加）に認められたが、一方、4時間および8時間での増加は無視できるものであった。集団サイズが小さいことおよびデータのノンパラメトリックな分布により、Mann-Whitney順位和検定を使用し、HAを共注射した場合に薬物の腫瘍取り込みは有意に上昇することが明らかにされた。1時間における統計的有意差はp=0.021であり、2時間においてはp=0.050であった。他の時点では、有意差は証明されなかったが、腫瘍のMTX濃度／gはHAと共注射した場合よりもかなり高い傾向を示した。
【００６４】
図７に示したデータは、HAとの共投与は注射後30分以内に腫瘍によるMTXの取り込みを著しく上昇させることを明らかに証明するものである。その上、共投与は腫瘍内における薬物の濃度に以後の分解時においても明らかに高いレベルを維持する。ノンパラメトリックな検定で評価した場合、1時間の時点で有意差はp=0.021（n1=8, n2=8）であり、2時間の時点で有意差はp=0.05（n1=8, N2=8）であった。
【００６５】
HAを含む捕捉されたMTXは受容体（CD44および／またはI-CAM-1）に結合し、受容体仲介エンドサイトーシスを介してインターナライズされ、薬物が腫瘍細胞内に放出される。
【００６６】
HA分子のメッシュは外向きの拡散に対する障碍として作用し、したがってHAが受容体（CD44, RHAMMおよび／またはI-CAM-1）に結合したのちは、捕捉されたMTXは腫瘍細胞中に拡散することができる。HAマトリックスによって細胞の表面に保持される一方、MTXは基底にある細胞中へのMTXの能動輸送に通常用いられる利用性が上昇する。
【００６７】
副作用と、活性の望ましい部位以外の組織に対する薬物の分布はまた、HAとのその会合によって影響されることがある。たとえば、HAは通常、受容体仲介細胞性取り込みと肝臓（80〜90％）、腎臓（10％）、脾臓および骨髄における異化により血流から除去され、後二者の部位においてはわずかな種間の変動がある。期待されるように、HAは少なくとも短時間、薬物の肝臓への送達を上昇させるようにみえる。30分および1時間の時点で、肝臓はそれぞれ65％および26％のMTX濃度の平均（メジアン）上昇を示した。2時間の時点では、肝臓中のMTX量に処置に無関係に差は観察されなかった。興味ある傾向は4時間後に明らかになり、HAを共注射した場合、肝臓にはMTXの低下が見出された（4時間：68％低下、８時間：75％低下）。静脈内投与後、MTXは体液中に広く分布し、肝臓中に何ヶ月も残留できる（McEvoy, 1988）ので、HAと共投与された場合、4時間および8時間の時点におけるMTXの平均濃度の低下は、薬物動態的クリアランスの経路におけるバランスの変化が指示されるものと考えられる。HAが、肝臓の内皮細胞（LEC）で急速に代謝されることを考慮すると、HAと共インターナライズされたMTXは肝臓の洞様毛細管被覆細胞内で放出され、そこで肝細胞中に拡散されて胆汁中ついで胃腸管内に分泌されるか、もしくは循環に戻ってさらに体液中へ分布および尿中へ排泄されるか、または両者の経路をとる。
【００６８】
短時間の肝臓への標的化は治療的利点になり得る。肝臓への転移の場合、MTXへの急速な高濃度での暴露は有利であり、観察された標的化はわずか1時間ほどのものであるから、長期の毒性の問題はないと思われる。肝臓標的化は、生物活性化を要求する薬物、たとえば薬物／HAがLECに標的化されるマイトマイシンC、ドキソルビシン等で利用できる。LBCに濃縮された不活性薬物が活性化するために肝細胞内に拡散され、このようにして活性化の標的化機構として作用することができる。
【００６９】
MTX毒性の主要部位の１つは胃腸管である。HAとMTXの共投与はGI管へ送達される薬物の量を有意に低下させる。胃腸内でのMTX濃度の低下には幾つかの機構の関与が考えられる。
メトトレキセートはきわめて小さな分子であり、通常は大部分の毛細管壁を通過することが期待される一方、HAとの会合はこの経路の通過は著しく低下するものと考えられる。
肝臓内皮細胞におけるHAの急速な分解は、MTXの急速な放出および血流中への復帰を生じ、これにより1時間の時点で指示されたように、腎クリアランスの上昇を受け、MTX／HAプレパレーションを投与されたマウスの尿に50％以上のMTXが排泄される。
【００７０】
MTXの生体からの最終的除去の主要な経路は尿中への排泄である。HAにより薬物の腎臓含量はわずかに上昇するように見えるが、本発明者らは他の証拠から、HAは腎臓によって取り込まれ速やかに異化されるので、その保持時間はきわめて短く、会合した薬物は迅速に尿中に放出されると考えている。
【００７１】
結論
ここに報告された結果は、治療薬剤のヒアルロナンとの共投与が所望の標的である病理学的組織へのそれらの選択的送達、すなわち、その点でのさらに高く、さらに有効な濃度を達成する前提を調べる前臨床的試験の第一の段階を提示するものである。この場合、ヒト乳癌および他の悪性腫瘍ならびに慢性関節リウマチの現在の処置基準に広く用いられている細胞傷害性薬剤、メトトレキセートを、ヒアルロナンとともにまたはヒアルロナンを用いないで静脈内経路によって試験した。
【００７２】
本発明者らは、ヌードマウスモデルが生存宿主におけるヒト乳癌の試験にとくに適当なモデルであることを見出し、疾患組織の部位に対する直接治療剤にHAを使用し、それらの有用な効果を増強させる基本的な問題の一部を解決した。本発明者らの結果は、HAと特別な会合の形態を示さない小分子量の薬物で達成され、HAが血流中に注射された場合、病理学的組織に送達されるこのような薬物の量を依然として増加させることが証明された。この試験は、生体において支配的な条件で、MTXはHAとともに、ヒト乳癌への送達の有意な増強を達成するのに十分維持され、また胃腸管毒性の望ましくない副作用を強力に低下させることを証明するものである。
【００７３】
実施例３ パクリタキセル／ヒアルロナン薬物配合物の調製および注射
HA／パクリタキセルのためのヌードマウスモデルの有用性が確立されたので、今回他の化学療法剤の有効性を試験するために使用することができた。治療的重要性により、パクリタキセル（タキソールとしても知られる）を使用することに決定した。
パクリタキセルは西洋イチイTaxus brevifoliaから単離され（Waniら, 1971）、進行した卵巣癌および乳癌に対して臨床的に活性であり（Rowniskyら, 1990; McGuireら, 1989）、現在他の様々な癌の処置のための臨床試験が進行中である。しかしながら、パクリタキセルに伴う大きな問題はそのきわめて高い親油性と、その結果、貧弱な水溶性である。この問題を解決するための努力がパクリタキセルの同族体およびプロドラッグの合成を導き、また同時に安全かつ生物学的適合性のある処方を組み立てる努力が払われている。これまで、臨床的な開発が保証される十分な安定性、溶解性または活性を示したプロドラッグはない（Mathewら, 1992; Vyasら, 1991）。しかしながら、半合成タキサンはパクリタキセルより高い溶解性および効力を示していて（Basseryら, 1991）、Taxotereからの１種はヒト試験に入っている（Bissetら, 1993）。
【００７４】
静脈内送達に用いられるパクリタキセルの現時点での臨床用処方は、薬剤6 mg/ml とともにエタノールとCremophor EL の1:1 (v/v) 比を使用している。Cremophor ELは実際にポリエトキシ化ヒマシ油であり、澄明な、油状の粘稠な黄色の界面活性剤である。安定性試験では最初の処方は４℃において５年の貯蔵寿命を有することが示されている。プレパレーションは使用前に0.9％食塩水または５％デキストロースで0.3〜1.2 mg/ml に希釈し、これらの条件下でのこの物質の物理学的および化学的安定性は約27時間である。しかしながら、ビヒクルのこれらのレベルへの希釈は過飽和溶液を生じ（Adamsら, 1993）、確立された指針外で使用すると、沈殿を生じる傾向がある。したがって、粒子の注入に対する安全手段として投与時に並列フィルターが要求される。希釈したパクリタキセル溶液はまた、製造から24時間以内に使用することが薦められている。上記溶液の曇りも認められ、これには輸液バッグおよびチューブからCremophorによる可塑剤の抽出に原因が帰せられている（Waughら, 1991）。
前述の物理学的不安定性に加えて、Cremophorの最も重要な問題は、それが薬理学的作用をもつと報告されていることである。様々な薬物がシクロスポリン、タクロリムスおよびテニポシドを含めて、Cremophor ELを用いて投与されている。しかしながら、パクリタキセルとともに投与されるCremophor ELの用量は他の市販薬剤と用いられる量よりも多い。Cremophorは重篤なまたは致命的な過敏性相を引き起こすことが観察されている。ビヒクルの毒性もまた、動物またはヒトへのパクリタキセルの急速な輸液に際して観察される致命的なまたは生命に危険があるアナフィラキシー反応の大きな原因になる可能性がある（Dye & Watkins, 1980; Lorenzら, 1977; Weissら, 1990）。
【００７５】
パクリタキセルの保存溶液を調製し、個々の注射液は、個々のマウスの体重に従って調製される。
【００７６】
乾燥したHA（モデルMr 8.9×105 kDa）を少量ずつ24.5 mg/ml のパクリタキセル保存溶液に加え、一夜ボルテックス攪拌して溶解し、最終濃度21 mg/ml とする。滅菌製を保証するため、ゲンタマイシンを濃度50μg/ml に加え、一夜４℃でインキュベートする。ついで[3H]パクリタキセルを添加したのち、HA／パクリタキセル保存混合物を注射用等級の食塩で注射用濃度に希釈する。注射はマウスの体重により、50μl 中パクリタキセル 15 mg/kg およびHA 12.5 mg/kg が送達されるように個々に注射する。生体内に注射したこの量のHAによれば、実験期間中飽和キネティックスが観察された（Fraserら, 1983）。
【００７７】
パクリタキセル／HA 注射用混合物の調製時にHA がその分子量が保持されていることを保証するために、注射用溶液を、カラム特性1.6 cm×70 cm, サンプルサイズ 2 ml, 流速18 ml/時および分画サイズ2 ml でSephacryl S-100サイズ排除ゲル（Pharmacia, Uppsala, Sweden）上で分析する。図４は、混合操作時にHAがその分子量を維持したことを示している。
【００７８】
マウスは各群40匹の動物を2群に無作為に分割する。群１にはパクリタキセルのみを投与し、群２にはパクリタキセル／HAの併用治療を行う。動物は個別に注射ボックスに収容し、注射は尾静脈に行う。各注射液中に、トリチル化パクリタキセル（注射された平均崩壊度／分（dpm）±平均の標準誤差（SEM）：19,159.146±1,336,819）が送達される。マウスは尿を収集できるように、柔らかい非湿潤性のプラスチック製の檻に個別に収容する。注射後30分、1時間、2時間、4時間または8時間に、マウスをネンブタール（Glaxo, Australia Pty. Ltd., Melbourne, Australia）0.1 ml の腹腔内注射によって麻酔し、注射針およびシリンジを用いて心臓または大動脈から血液を採集する。血液収集後、動物は頚椎脱臼によって屠殺する。
【００７９】
血液をEDTA-被覆ガラス試験管に取り、14,000 gav で10分間遠心分離して血漿を調製する。100μl の30％v/v 過酸化水素で脱色し、3 ml のHiSafeII シンチラントを加えたのち、50μl のアリコート中で放射能をカウントする。ケミおよびフォトルミネセンスを克服するためサンプルはWallac 1410 β-カウンター中、サンプルのソースに依存して、3, 7または20 d期にわたってカウントする。カウンティングの間の期間にはサンプルは室温で暗所に保存する。すべての計算はすべてのケミおよびフォトルミネセンスを除いた安定化サンプルについて実施する。
【００８０】
血漿中の注射パクリタキセルの百分率を計算するためには、標準式：
マウス体重（g）×マウス血液容量（0.07）×血液の血漿部分（0.59）
を用いて各マウスの総血漿容量（ml）を計算することが必要である。ついで、血漿中の注射パクリタキセルの百分率は
血漿容量（ml）×血漿dpm/ml×100／総注射dpm
=血漿中％注射パクリタキセル
によって計算する。
【００８１】
血流中に送達されたパクリタキセルの量の正確な割合を保証するため尾静脈の注射部位を切り取り、パクリタキセルを定量する。注射部位に残った注射パクリタキセルの平均百分率も測定される。血流に送達されたパクリタキセルの量（組織および腫瘍に分布可能なパクリタキセル）は次のように計算される。
血流に送達されたパクリタキセルの量（dpm）=
注射シリンジの重量差（mg）×注射物質のDpm/mg−注射部位に残ったDpm
血流に送達されたパクリタキセルは以下「注射用量」と呼ぶ。
【００８２】
サンプル集団間の正確な比較を可能にし、臓器および腫瘍塊中のわずかな変動を正規化するために、生体臓器および腫瘍ならびに体液中のパクリタキセル濃度は組織グラム数あたりの注射用量の％として表示する。
【００８３】
注射部位に残った注射パクリタキセルの平均百分率を計算する。このような変動を正規化するため、腫瘍および組織に見出されたdpmを注射dpm−注射部位に残ったdpmの百分率として計算する。この量は以下利用可能なdpmまたは利用可能パクリタキセルと呼ぶことにする。
【００８４】
可能な尿は非湿潤性プラスチック製の檻からシリンジおよび注射針で収集する。尿は14,000 gavで10分間遠心分離して澄明化する。その放射能カウントは8〜30μlの範囲のサンプルに3 ml のHiSafeII シンチラントを加えたのち測定する。
【００８５】
マウスの屠殺後直ちに、腫瘍、肝臓、心臓、脾臓、膀胱、左および右腎臓、子宮、肺臓、胃、腸、脳およびリンパ節を摘出し、総放射能を分析する。各組織の総放射能は100〜400 mg の組織を3〜6 ml のOptiSolv（ACC, Melbourne, Australia）中に22℃で36時間可溶化して測定する。可溶化の完了時に、組織中の放射能は10 ml のHiSafeII シンチラントを加えたのちカウントする。この場合も、ケミおよびフォトルミネセンスを克服するため、サンプルはWallac 1410 β-カウンター中、サンプルのソースに依存して、3, 7または20 d期にわたって2分間カウントする。カウンティングの間の期間には、サンプルは室温で暗所に保存する。すべて計算はすべてのケミおよびフォトルミネセンスを除いた安定化サンプルについて実施する。
【００８６】
実施例４ 5-フルオロウラシルおよびHA導入の使用
5-フルオロウラシル（5-FU）は乳癌および胃腸管の癌の処置に一般に用いられている抗代謝剤である（Piper & Fox, 1982）。5-FUは、それがDNAおよびRNA両者の合成を妨害する細胞内においてその活性ヌクレオチド型に変換される。この薬物はインビボにおいて２つの機構を介して機能する。
（i）FdUMPはチミジル酸シンターゼに強固に結合し、DNAの合成に要求される４種のデオキシリボヌクレオチドの１つである、デオキシチミジントリホスフェート（dTTP）の必須な前駆体であるチミジル酸の形成を妨害する。この阻害によって創成されたチミジンのない状態は能動的に分割している細胞に毒性である（Pinedo & Peters, 1988）。
（ii）5-FUが機能する第二の方法は、FUTPのRNAへの導入がRNA機能を妨害することである。Fdurdおよび5-FUによって引き起こされるチミジル酸シンターゼの阻害は細胞に対して細胞傷害性作用を引き起こすことができる。5-FUの濃度および暴露の持続の両者が細胞傷害性の重要な決定因子である。RNAに向けられた作用が暴露の長期間持続で優先されるので、DNAに向けられた作用が多分、S相における細胞の短期間暴露時にさらに重要であろうと考えられる。
【００８７】
幾つかの試験が抗癌剤の薬物送達システムとしてのHAの使用を検討している。Coradiniら（1999）は、HA／酪酸ナトリウム配合物がインビトロにおいて乳癌細胞による取り込みを増大させるか否かを決定するために、酪酸ナトリウムをHAに共有結合により結合させた。この研究は薬物送達ビヒクルとしてのHAの作用機構がHA-酪酸エステル誘導体のCD44受容体への輸送に関与する可能性を指示した。HA／薬物複合体はインターナライズされ、ついでHA／薬物複合体は細胞質で加水分解を受け、ついで酪酸塩が放出され、これが抗増殖作用を発揮した。１つのインビボ試験が、マウスルイス肺異種移植の処置方法としてHAに共有結合で連結されたマイトマイシンCを用いて行われた（Akimaら, 1996）。HA-MMC複合体は、単独の薬物マイトマイシンCが抗腫瘍活性を示さなかった0.01 mg/kg の低用量で抗腫瘍活性を生じることが見出された。
【００８８】
例５ ヒト乳癌細胞中の５−ＦＵとＨＡの相乗作用の研究
ＨＡ結合親和性（クルティ（Culty）ら、１９９４）とＣＤ４４およびＲＨＡＭＭのＨＡ受容体の発現（ワング（Wang）ら、１９９６）に基づき、ヒト乳腺癌株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１を選択した。細胞株の特徴の要約を表３に示す。
【００８９】
【表３】
【００９０】
細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、例１に記載のようにルーチンに培養した。
【００９１】
０nM ５−ＦＵ＋１００nmのＨＡを含有する培地で増殖させた乳癌細胞は、未処理細胞と比較した時、統計的に有意な増殖作用または細胞障害作用を示さないことが、表４から明らかである。
【００９２】
【表４】
【００９３】
従って、すべての結果を、０nM ５−ＦＵ／０nM ＨＡ細胞数のパーセントとして表した。細胞株の間で増殖パターンの明確な差が認められ、例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は、塗布効率が悪く、試験培地を適用する前に多くの浮遊細胞が存在した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞株は、高塗布効率を示し、非常に速い増殖速度を示した。
【００９４】
ＨＡを５−ＦＵと一緒にすると、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞株で相乗的細胞障害作用が観察されたが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１やＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞株では観察されなかった。これを、図１１に示す。５−ＦＵ単独のＩＣ50は＞５０μｍであったが、ＨＡと一緒にすると、ＩＣ50は４０nMであり、薬物投与量は１２５０倍まで低下した。
【００９５】
インビトロ実験の結果は、ＨＡの存在下で乳癌細胞に５−ＦＵを適用すると、細胞死滅が増加することを示した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は、５−ＦＵ／ＨＡ治療法に対する最大の感受性を示し、ＩＣ50は＞５０μＭから４０nMに低下し、一方ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＭＤＡ−ＭＢ−４３５は、５−ＦＵ／ＨＡ組合せにより大きく影響を受けなかった。クルティ（Culty）ら、１９９４により測定すると、乳癌細胞株はすべて、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（６０〜８０％）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（４０〜６０％）およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５（４０〜６０％）で高レベルのＣＤ４４受容体を発現した。これらの実験で使用される３つの細胞株は、ＨＡを分解することができ、腫瘍細胞中のＣＤ４４の機能は、ＨＡの分解の仲介であることを示している（クルティ（Culty）ら、１９９４）。
【００９６】
考慮すべき他の要因は、化学療法剤への細胞の以前の暴露である。患者から癌細胞株を単離する前に、癌患者はしばしば化学療法または放射線照射を受け、これが治療耐性細胞を含有する腫瘍を生成することがある。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５とＭＤＡ−ＭＢ−２３１の場合は、細胞株が得られた患者は、すでに５−ＦＵに暴露されていた（カイロー（Cailleau）、１９７４）。癌細胞は、薬物の細胞障害性を克服するいくつかの適応機構を有するため、治療後に残存した腫瘍塊が５−ＦＵに耐性であり、従ってインビトロで薬物に対する細胞の感受性を変化させている可能性が高い。
【００９７】
マウスで得られたインビボのデータをヒトへの治療に外挿することを目的として、実験モデルと計画を注意深く開発した。ヒトの乳癌異種移植片に対するインビボターゲティングと５−ＦＵ／ＨＡ補助（アジュバント）療法の治療効果を決定的に証明するために、以下の要因を試験した：
【００９８】
異質遺伝子型の細胞に対する免疫反応を避ける研究で充分受容されているモデルであるヌードマウスの、充分証明されたウォルターアンドエリザホールインスティテュート（Walter And Eliza Hall Institute）株で、ヒト乳癌を樹立した。
【００９９】
ヌードマウスとヒトについてすでに公表されている（イナバ（Inaba）ら、１９８８）５−ＦＵの薬物動力学についての比較データを、この研究の計画で使用して、ヒトの治療投与量をできるだけ厳密にシミュレートした。
【０１００】
大きな目的は、これらのマウスで樹立した腫瘍の組織学的および細胞学的挙動が、それらの天然のヒト宿主においてかかる腫瘍のそのような挙動に匹敵するかどうかの実証であった。この目的の達成の過程で我々は、マウス中の腫瘍細胞がヒト起源であり、これらはＲＨＡＭＭやＣＤ４４のような高度に関連するＨＡ受容体を発現することも証明した。
【０１０１】
例６ ＨＡと５−ＦＵ溶液の調製
乾燥したＨＡ（モードＭr ７×１０5ｋＤａ）を０．９％w/v発熱性物質不含注射用等級のＮａＣｌに溶解して、ＨＡストック溶液（１０μＭ、７mg/ml）を調製した。均一な溶解を確実にするために、ＨＡを４℃で一晩溶解し、次に完全にボルテックス混合した。ストック溶液の調製中にＨＡがその分子量を維持したことを確認するために、溶液をセファクリルＳ−１０００サイズ排除ゲル（カラムの規格、１．６×７０cm、試料サイズ２ml、流速１８ml/時間および２mlの画分サイズ）で分析した。ＨＡは最終濃度１００nMで使用し、すべての希釈は適当な増殖培地中で行った。
【０１０２】
５−ＦＵのストック溶液は、５−ＦＵを０．１Ｍ 水酸化ナトリウムに溶解し、０．９％w/vの発熱性物質不含注射用等級のＮａＣｌで濃度を２０mg/mlとして調製した。このストック溶液を０．２２μｍフィルターでろ過して無菌にしてから、［3Ｈ］−ＦＵを加え、注射用等級のＮａＣｌで注射濃度に希釈した。５０μｌ中３０mg/kgの５−ＦＵを投与（平均体重６０kgのヒトへの治療投与量１０．５mg/kgに等しい；イナバ（Inaba）ら、１９８８）する目的で、各マウスの体重に応じて各注射物を調製した。発熱性物質不含ＨＡストック溶液（１０mg/ml；モードＭr ７×１０5ｋＤａ）を２０mg/ml ５−ＦＵストック溶液の一部に加え、ボルテックス混合しながら一晩攪拌し、ＨＡの最終濃度を１２．５mg/kgマウス体重と等しくさせた。５０μｌ中３０mg/kgの５−ＦＵと１２．５mg/kgのＨＡを投与するために、マウスの体重に従って注射物を個々に調製した。この量のＨＡを体内に注射すると、実験期間について飽和動力学が観察されるであろう（フレーザー（fraser）ら、１９８３）。ＨＡが、注射混合物の調製の間その分子量を維持したことを確認するために、注射溶液をカラムの規格が１．６cm×７０cmのセファクリルＳ−１０００サイズ排除ゲルで、流速１８ml／時間と２mlの画分サイズで分析した。ウロン酸測定により、カラム画分中のヒアルロナンを検出した。
【０１０３】
ウロン酸測定を使用して、ゲルろ過クロマトグラフィー法で採取した画分からヒアルロナンの存在を定量的に検出した。次に２５μｌのアリコートの各画分を９６ウェルプレートに移した。次に２５０μｌのカルバゾール試薬（硫酸中３Ｍカルバゾール／０．０２５Ｍホウ酸）を、これらの溶液に加えた。９６ウェルプレートを８０℃で４５〜６０分インキュベートした。５５０nmのフィルターのついたダイナテク（Dynatech）ＭＲ７０００プレートリーダーを使用して、９６ウェルプレートを読んだ。吸光度がバックグランド吸光度より＞３標準偏差の時、有意であると見なした。バックグランドは、ＶoとＶtの前後の試料点と等しい数（平均数は１６であった）を取って計算した（フレーザー（fraser）ら、１９８８）。
【０１０４】
ＨＡと５−ＦＵに調製物（０．５％ ＮａＣｌ（ｐＨ８．９）中１０mg/mlのＨＡと２０mg/mlの５−ＦＵ）は、ＨＡの分子量に対して分解作用を示さなかった。サイズ排除ゲル中のクロマトグラフィー分析は、モード分子量７００，０００Daを示した。
【０１０５】
例７ 薬物細胞障害性測定法：実験計画
インビトロでの薬物力価測定実験を計画するには、静脈内投与後に血漿中で到達する濃度に似た薬物濃度を適用することが好ましい。５−ＦＵを静脈内経路（ｉｖ）で１０．５mg/kg（４００mg/m2）で治療的に投与すると、３０分以内のピーク血漿レベルは８μg/mlである（６μＭ、クボ（Kubo）、１９９０）。これらのインビボの血漿濃度に基づき、以下の薬物濃度を選択した：０、１、５、１０、２０、５０、１００μＭ ５−ＦＵ＋１００nM ＨＡ。細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５を、例４〜５で上記したように増殖させた。培養物がコンフルエンスに達した時、フラスコから細胞を０．２５％トリプシン／０．０５％ ＥＤＴＡ中に取った。単一細胞懸濁物を、コールター（Coulter）カウンター（ＺＭ１モデル）で計測し、細胞を細胞特異的培地に１００，０００細胞／mlで再懸濁した。ウェル当たり０．５mlの細胞懸濁液を加えて細胞を２４ウェルプレート（表面積２cm2）に広げて、５０，０００細胞／ウェルを得た。培養物を２４時間付着させ、次に培地を除去し、単層をＨＢＳＳで洗浄し、試験培地（５−ＦＵ＋ＨＡ）を適用した。試験培地中で４日間増殖後、培養物をＨＢＳＳで洗浄し、細胞を０．２５％トリプシン／０．０５％ ＥＤＴＡでトリプシン処理して、ウェルから除き、細胞をコールター（Coulter）カウンターで計測した。
【０１０６】
例８ 薬物送達および腫瘍ターゲティング（標的化）ビヒクルとしてのＨＡの評価
例５〜７に記載のインビトロの薬物感受性実験、およびＣＤ４４とＲＨＡＭＭのＨＡ受容体の発現の結果に基づいて、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８を、ヌードマウスヒト腫瘍異種移植片の作成のための癌細胞接種物として選択した。細胞をルーチン法で増殖させ、例５で上記したように継代した。マウスへの注射のために、細胞を１００％コンフルエンスになるまで増殖させ、０．２５％トリプシン／０．０１％ ＥＤＴＡ溶液でトリプシン処理して、ベックマン（Beckman）ＴＪ−６ベンチ遠心分離で４００ｇavで１０分間２回遠心分離して洗浄し、モデル−ＺＭコールター（Coulter）カウンターを使用して計測し、無血清レイボビッツ（Leibovitz）Ｌ−１５培地に１×１０8細胞／mlで再懸濁した。
【０１０７】
メスの無胸腺ＣＢＡ／ＷＥＨＩヌードマウス（６〜８週令）を、特定病原体未感染の条件下で維持し、無菌の食料と水は自由に与えた。各マウスに、５×１０6細胞／５０μｌを含有する注射を１回行った。第１乳首のすぐ下の乳房脂肪体中に、２６ゲージ針を使用して細胞を注入した（ラムスズス（Lamszus）ら、１９９７）。腫瘍の測定は、直角の３つの直径（ｄ1ｄ2ｄ3）を毎週測定して行った。腫瘍容量は、以下の式を使用して推定した：
（１／６）π（ｄ1ｄ2ｄ3）
【０１０８】
癌細胞接種の約４〜８週後に、５−ＦＵ±ＨＡによる処理を開始した。各試験で使用したマウスの平均腫瘍サイズを表５に要約する。
【０１０９】
【表５】
【０１１０】
乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８の腫瘍原性と、適当な動物宿主に注入した時腫瘍を生成させる能力を確立するために、病理試験をする必要があった。腫瘍が生理学的に活性があるためには、新血管新生（毛細管ネットワークが腫瘍に栄養物質を供給する）が必須である。血管新生、導管性浸潤、壊死、アポトーシス、高い分裂指数、および核異常の存在は、すべて乳癌に特徴的である。ヘマトキシリンとエオシン染色した乳癌切片を観察すると、これらのすべての特徴が証明され、この動物宿主が悪性度IIのヒト乳癌をうまく維持したことを確証している。
【０１１１】
腫瘍誘導の約８週間後、２匹の担癌マウスに致死量のネンブタールを与えた。マウスの死亡の３分以内に、腫瘍を外科的に取り出し、直ちに１０％緩衝化ホルマリン中で１２時間固定した。固定した腫瘍を、一連の７０〜１００％のエタノールで一晩脱水し、次にパラフィンに包埋し、そこから２〜４μｍ切片を切った。切片をスライド上に置き、パラフィンを除き、水にした。スライドをＰＢＳ中で３×５分洗浄した。異種親和性のタンパク質を、１０％胎児牛血清で１０分間インキュベートしてブロックし、次にＰＢＳで洗浄した。室温で６０分検出抗体を適用した。検出抗血清または抗体は、ＲＨＡＭＭ、ＣＤ４４ＨおよびＣＡＥに対するものであった。スライドをＰＢＳで３×５分洗浄し、メタノール中の０．３％の過酸化水素に２０分浸漬して内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。さらにＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ結合ブタ抗ウサギ２次抗血清を室温で６０分適用し、ＰＢＳで３×５分洗浄した。シグマファスト（Sigma Fast）３，３’−ジアミノベンジジン錠剤（ダブ（ＤＡＢ））を、製造業者の説明書に従って調製し、ＤＡＢ溶液を室温で５〜１０分適用した。スライドを水道水で１０分洗浄し、ヘマトキシリンで対染色し、脱水し、マウントした。
【０１１２】
腫瘍と周りの組織をヒト特異的癌マーカーで染色することにより、腫瘍がヒト起源であることを確認した。ＣＥＡの存在は、腫瘍がヒト由来であることを明確に証明し、一方マウス宿主の心血管系により維持された。腫瘍ターゲティングは受容体介在内在化または結合を介して起きると仮定したため、ＨＡ受容体、ＣＤ４４およびＲＨＡＭＭの発現を確立する必要があった。表６は、ヒト乳癌異種移植片上の受容体の発現程度のリストを示す。
【０１１３】
【表６】
【０１１４】
例９ ヌードマウスモデル中の５−ＦＵとＨＡの使用
マウスをランダムに、２５匹の２群に分けた。第１群には、［3Ｈ］５−ＦＵのみを、第２群には［3Ｈ］５−ＦＵ／ＨＡの組合せを投与した。注射の前後に注射シリンジの重さを測定して、尾静脈への処理は定量的に行った。３０mg/kgの５−ＦＵ±１２．５mg/kgのＨＡ内に含有されるトリチウム化５−ＦＵ（平均注入ｄｐｍ±ＳＥＭ；３１，３３３，００２±１３１，３４８）を、各注射で投与した。
【０１１５】
血流中に送達される［3Ｈ］５−ＦＵの量を正確に定量するために、尾静脈上の注射部位を切開し、その［3Ｈ］５−ＦＵ含量を測定した。血流中に送達された５−ＦＵの量（組織や腫瘍に分配されることができる５−ＦＵ）は、以下のように計算した：
（血流に送達された５−ＦＵの量）（dpm）＝（注射シリンジの重さの差）（mg）×（注射物質のdpm/mg）−（注射部位に残存するdpm）
【０１１６】
血流に送達された５−ＦＵの量を、「注射投与量」と呼ぶ。
【０１１７】
試料集団間を正確に評価し、臓器や腫瘍の重さの小さな変動を標準化するために、体内の臓器や腫瘍および体液中の５−ＦＵの濃度を、注射投与量／グラム組織の％として表した。
【０１１８】
尿が集められるように、柔らかい湿ったプラスチックの囲いにマウスを１匹ずつ入れた。注射の１０分、２０分、３０分、１時間または２時間後に、０．１mlネンブタールを腹腔内投与してマウスを麻酔した。
【０１１９】
マウスを麻酔して、針とシリンジを使用して心臓または大血管から血液を採取した。血液をＥＤＴＡガラス管に取り、１４，０００gavで１０分遠心分離して血漿を調製した。過酸化水素（３０％v/v）１００μｌで脱色し、３mlのハイセーフII（HiSaveII）シンチレーション液を加えて、放射活性を測定した。化学ルミネセンスと光ルミネセンスを抑えるために、試料の起源に従って３、７または２０ｄ期間にわたって、試料をワラック（Wallac）１４１０β−カウンターで２分間計測した。計測の間、試料は暗所で周囲温度で保存した。すべての計算は、すべての化学ルミネセンスと光ルミネセンスが消失した安定化した試料について行った。血漿中の注入された５−ＦＵの割合を決定するために、各マウスの総血漿量（ml）を計算する必要があった。標準的式は以下の通りである：
（マウスの重さ（ｇ））×マウス血液量（０．０７）×血液の血漿の比（０．５９）1
【０１２０】
血漿中の注入した５−ＦＵの割合は、以下から計算した：
（血漿容量（ml）×dpm/ml血漿×１００）／（注入した総dpm）
【０１２１】
可能な場合は、シリンジと針を有する非湿潤プラスチックの囲いから尿を採取した。１４，０００gavで１０分間遠心分離して、尿を清澄化した。８〜３０μｌの試料に３mlのハイセーフII（HiSaveII）シンチレーション液を加えて、放射活性を測定した。各マウスの出す尿量を正確に定量することの技術的困難さがあり、尿中の注入した５−ＦＵ投与量の％を、以下の式により計算した：
（採取時間（ｈ）×４２μｌ1×dpm／μｌ尿×１００）／（注入した総dpm）
【０１２２】
いったん血液を採取後、マウスを頚部脱臼により殺した。マウスの死亡直後に、腫瘍、肝臓、心臓、脾臓、膀胱、左腎臓、右腎臓、子宮、肺、胃、小腸、脳およびリンパ節を切りだし、総放射活性を分析した。組織当たりの総放射活性を測定した。１００〜４００mgの組織を３〜６ml中に２２℃で３６時間可溶化して、組織当たりの総放射活性を測定した。可溶化の終了後、１０mlのハイセーフII（HiSaveII)シンチレーション液を加えて組織を測定した。化学ルミネセンスを避けるために、上記したように試料を計測した。
【０１２３】
図１２に示すように、ＨＡを５−ＦＵと組合せると大きなターゲティング作用があった。薬物の腫瘍保持の最も大きな相対的上昇は１０分で観察され、ここでＨＡは薬物取り込みを２．４２倍増加させた（ｐ＝０．００１、スチューデントｔ検定）。ＨＡ／５−ＦＵ投与の２０分と３０分後、５−ＦＵの腫瘍取り込みの統計的に有意な上昇も認められ、薬物取り込みの上昇はそれぞれ１．５倍と２倍であった（ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）。他の時点は、単独投与の５−ＦＵとＨＡとの同時注入とで統計的に有意な差は示さなかった。
【０１２４】
肝臓、脾臓、および腎臓のような代謝臓器が高レベルの薬物ターゲティング（これは、腫瘍ターゲティングの上昇の陽性面に逆作用する）を受けないことを確立することは重要であった。表７は、試験した種々の時点での各組織の［3Ｈ］５−ＦＵ取り込みのリストを示す。
【０１２５】
【表７】
【０１２６】
図１３は、ＨＡの主要な代謝臓器が肝臓、リンパ節、および脾臓であり、５−ＦＵが肝臓中で広範に代謝されることを示す。
【０１２７】
５−ＦＵがＨＡとともに注入されると、これらの臓器は５−ＦＵ取り込みの有意な増加を示す。しかし腎臓は、ＨＡとの投与後に１０分で５−ＦＵターゲティングの有意な上昇（１．８倍、ｐ＝０．００４）を示した。この時点後、統計的に有意ではないが、サンプリング期間の最後まで、薬物取り込みの上昇の傾向は続いた。
【０１２８】
膀胱、小腸および骨髄は、５−ＦＵの取り込みの上昇を示さなかった。子宮のような組織では、１０分で薬物取り込みの短時間の上昇があった（１．８倍、ｐ＝０．０３２）が、他の時点では差は示されず、従ってこの観察の有意性は不明である。
【０１２９】
胃、脳および肺は、１つまたは２つのサンプリング時点で５−ＦＵ取り込みの上昇を示した。しかし各時点の動物の数が少ない（ｎ＝５）ため、統計的有意性を支持することができなかったが、図１４Ａ〜Ｃに示すように明確な傾向が観察された。
【０１３０】
後の１時間と２時間のサンプリング時点で、心臓５−ＦＵの有意な低下が認められ、ＨＡとの同時投与により、それぞれ５９％（ｐ＝０．００３）と５３％（ｐ＝０．０２１）低下した。
【０１３１】
排尿速度の変動のために、各マウスから尿を採取することができなかった。従って統計的な解析をするには不充分な尿が採取された。
【０１３２】
５−ＦＵをＨＡと同時注入すると、５−ＦＵの循環レベルが早期に低下した（表７）。ヒアルロナンは血漿５−ＦＵを５５％（ｐ＝０．００１）低下させた。図１５に示すように５−ＦＵ／ＨＡを投与されたマウスでは、薬物動態血漿半減期は２８分から５６分に変化した。
【０１３３】
例１０ マウスへの治療投与処方
ヒト乳癌の最も一般的な治療処方は、２８日間のサイクルの１日目と８日目に投与されるシクロホスファミド、メソトレキセート、および５−フルオロウラシルである。ヒト乳癌では、初期の治療処方は６サイクルであり、この時点で患者の状態が再評価され、従って我々は、マウスを長期薬効試験で６サイクル（６ヶ月）と短期薬効試験で６サイクル（６週）に伏して、ヒトの治療処方をできるだけシミュレートするようにした。マウスの生活史が２年であることを考慮して、我々は表８に示すように短期と長期の治療プロトコールを開始した。
【０１３４】
【表８】
【０１３５】
マウスを、短期試験では各群８匹の７群と、長期試験では８匹の５群に分けた（投与量と治療投与スケジュールについては表８を参照されたい）。
【０１３６】
化学療法を６ヶ月以上続けても一般的には利点はないため（ハリス（Harris）ら、１９９２）、治療は６ヶ月を超えることはしなかった。
【０１３７】
例８に記載のように長期試験の治療適用日に、マウスの体重と腫瘍容量を測定した。６週間の試験中毎日、マウスの体重と腫瘍容量を測定した。マウスを１匹ずつ注射ボックスに入れ、尾静脈から注射をした。化学療法に対する患者の応答で、ストレスは大きな因子であることが実験的に証明されており（シャックネイ（Shackney）ら、１９７８）、従って我々は、等しい数のマウスを各ケージに入れ、ケージ当たりのマウスの数は、実験の段階に依存して５〜８匹で変動させた。
【０１３８】
疾患の進行のために安楽死が必要となった時、または６ヶ月（長期）もしくは６週間（短期）の治療処方が完了した時を、実験の終点とした。動物倫理指針により、疾患の進行の程度を評価する独立の係員がマウスを２週間ごとに観察した。図１６に示すように、以下の基準を使用して、マウスが、死亡させるべき実験の終点に達したかどうかを決定した：
【０１３９】
１）マウスが飲食をせず、体重が大きく低下した；
２）腫瘍のサイズが体重の１０％より大きかった（パネルＡ）；
３）腫瘍の塊が大きいため、マウスが動けなかった（パネルＢ）；
【０１４０】
実験の終点で、０．１mlのネンブタール（６０mg/ml）を腹腔内投与注入してマウスを麻酔し、頚部脱臼によりマウスを死亡させた後、血液を採取した。
【０１４１】
６週間の試験後に、腫瘍の大きさを測定すると、図１７に示すように５−ＦＵと５−ＦＵ／ＨＡ治療の両方とも、食塩水群より有意に小さい腫瘍を示した（ｐ＝０．００５）。５−ＦＵ処理群と５−ＦＵ／ＨＡ処理群との間に、腫瘍容量に有意な差はなく、両方の治療法が一次（原発性）腫瘍に対して同等の効力を示すことを示している。食塩水とＨＡの一次腫瘍容量の間には統計的差はなかった。
【０１４２】
マウスを死亡させた直後に、腫瘍、肝臓、心臓、脾臓、膀胱、左の腎臓、右の腎臓、子宮、肺、胃、小腸、脳およびリンパ節を切りだし、０．０６Ｍリン酸（ｐＨ７．５）と塩化セチルピリジニウム（１．０％v/v）で緩衝化した４％ホルマリンに入れた。組織を１６〜２４時間固定してから、組織学的処理を行った。固定した組織を段階的に１００％エタノールまで脱水し、パラフィンブロックに包埋し、そこからの２〜４μｍの切片をガラス顕微鏡スライド上に置いた。ヘマトキシリン核染色とエオシン細胞質染色により組織切片を染色すると、処理の毒性を示す病理的特徴が強調された。
【０１４３】
マウス１匹につき９〜１１個のリンパ節を採取し、腫瘍領域を排水したすべての節が採取できるようにした。リンパ節の転移の検出には現在２つの方法が使用されている。
【０１４４】
ｉ）大きい臓器構造のルーチンのヘマトキシリンとエオシン染色
ii）癌胎児性抗原のような癌マーカーを使用する免疫組織化学
【０１４５】
転移検出の両方の方法が本試験では使用される。すべての市販のＣＥＡ抗体がヒト乳癌細胞と反応するわけではなく、従って我々は、５つの異なる抗体（ダコ（DAKO）、アマシャム（Amersham）、およびケーピーエル（ＫＰＬ））の反応性を試験した。
【０１４６】
ヘマトキシリンとエオシン染色リンパ節は、ピー・アレン（P. Allen）博士（認定病理学者）が観察し、各節を、腫瘍細胞の存在について顕微鏡で観察した。ＣＥＡ免疫染色リンパ節を顕微鏡で観察し、陽性に染色された節を数え、リンパ節転移が陽性であると見なした。
【０１４７】
腫瘍容量は、毛管測定により毎日または毎週モニターし、腫瘍容量は上記例８に記載のように計算した。
【０１４８】
５−ＦＵの最も一般的な毒性作用は、胃腸管に対してであり、出血性腸炎や小腸穿孔が起きる（マーチンデール（Martindale）、１９９３）。消化管異常（例えば、下痢）についてマウスを毎日モニターし、より重症の毒性症状（例えば、体重減少）について毎週モニターした。体重減少は、腫瘍の重さを引いて求めた真の体重を計算してモニターし、これはシバモト（Shibamoto）ら、１９９６で引用された１ｇ×腫瘍容量（cm3）として計算した。体重変化の証明のために、
［（体重（腫瘍以外）−治療の開始時の体重（腫瘍以外）］×１００／（治療の開始時の体重（腫瘍以外））
により、マウスの体重を、治療の開始時に体重に対して標準化した。
【０１４９】
治療処方にかかわらず、下痢のような毎日の消化管異常は認められなかった。体重減少（腫瘍の重さを除く）を指標として使用して、各治療処方について純粋の消化管毒性を予測した。各マウスの死亡時に、体重の変化パーセントを既に記載されているように計算した。５−ＦＵ／ＨＡ群治療群と比較すると食塩水群、ＨＡ群、５−ＦＵ治療群では、標準化した体重に統計的に有意な差があった（図１８）。５−ＦＵ／ＨＡ補助（アジュバント）療法を受けたマウスは、未治療群（これは、体重の真の増加は２％であった）と比較して治療の間に、１６％の体重増加を示した（スチューデントｔ検定、ｐ＝０．０２５）。
【０１５０】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の免疫組織化学検出を古典的な診断的病理学と組合せると、リンパ節転移の優れた定量値を与えた。平均的なマウスは１５〜１９個のリンパ節を含有（ラムスズス（Lamszus）ら、１９９７）し、従ってこの試験では、約６０〜７０％のマウスのリンパ節を調べた。注意深く操作して、乳房の脂肪体と胸部領域を排水させたすべての節を取り出し調べた。表９Ａに示すように、すべてのマウスはリンパ節の転移を示した。
【０１５１】
【表９】
【０１５２】
図１９Ａは、リンパ節関与（マウス当たりの転移節の数）の割合が、５−ＦＵ、５−ＦＵ／ＨＡおよびＨＡ治療により大きく影響を受けることを示し、食塩水群は、リンパ節関与の量が６倍増加した。再度ＨＡは、治療的価値を有することを示した。
【０１５３】
試験の最後にマウスを解剖しながら、すべての組織を腫瘍結節について顕微鏡的かつ巨視的に観察した。ＨＡ／５−ＦＵまたはＨＡ治療を受けたマウスを除いて、新しい腫瘍が首の回りまたは原発性腫瘍に隣接する領域の脇の下部分に観察された。治療処方へのＨＡの取り込みは、図１９Ｂに示すように新しい腫瘍形成を阻害した。
【０１５４】
治療法にかかわらず、全体的な生存率には有意差は無く（表９Ａ）、すべての群が治療処方を完了した。
【０１５５】
５−ＦＵ治療に伴う大きな毒性は、骨髄の減少と以後の白血球の低下であるため、治療に関連する血液毒性を評価する必要があった。マウスを麻酔して、針とシリンジを使用して心臓または大きい血管から血液を採取した。マウス粘着性食塩水（Ｍ）中で血液の１／１０希釈を作成し、これを血球計算計で計測して、白血球数を推定した。好中球、リンパ球、および赤血球を数えて、血球分画を行った。血球細胞亜集団の合計は、マウス血液について公表されているデータと比較して推定した。
【０１５６】
治療により臓器萎縮や肥大が誘導されなかったことを確認するために、死後に臓器を取り出し重量を測定した。各臓器の重さは、真の全体重の％として計算し、食塩水のみの群の臓器の重さと比較した（第１群）。
【０１５７】
例１１ 長期治療：６ヶ月処方
この試験はまだ継続しているが、有意なデータが作成されている。
【０１５８】
ＴＤＴは、腫瘍の大きさまたは細胞数が２倍になるのに要した時間（日数）であり、測定が簡単であり、概念的に臨床的な腫瘍挙動に容易に関連付けられる腫瘍増殖のパラメータである（シャックネイ（Shackney）ら、１９７８）。腫瘍の倍加時間をモニターすることにより、腫瘍の化学療法応答を評価することがしばしば可能である（ゆっくり増殖する腫瘍は、化学療法に対する応答が悪いため）（シャベル（Schabel）ら、１９７５）。
【０１５９】
各治療の腫瘍倍加時間を表９Ｂに示す。
【０１６０】
【表１０】
【０１６１】
５−ＦＵ／ＨＡ治療と５−ＦＵ治療との間のＴＤＴには有意差はなかった。６週間試験と同様に、ＨＡの投与はまた、一次腫瘍に対して治療作用を示し、ＴＤＴは食塩水群の１３±４日に対して２６±１．７５日であった。５−ＦＵの２４時間のＨＡの投与は、腫瘍増殖の遅延に関して５−ＦＵの治療的価値に抵抗するようであった。
【０１６２】
腫瘍の大きさと容量は、腫瘍治療の応答と進行をモニターするのに有用なパラメータであるが、最終的には治療による細胞障害性作用を示さない。我々は、ＨＡ／５−ＦＵ治療がより多くの細胞を死滅させ細胞の位置を破壊したかどうかを確立しようとした。死滅している細胞は、病理的に以下の症状が現れる：
ｉ）核の分解（アポトーシス）
ii）細胞の溶解（壊死）
【０１６３】
全腫瘍画像をＭＣＩＤコンピューターにスキャンして、全腫瘍領域を計算すると、死滅する細胞の数が定量された。断片化した核を有する細胞または溶解細胞の輪郭を描き、スキャンし、次にこれらの領域をデジタル化し、死滅する細胞の正確な領域を計算した。死滅細胞に帰因する腫瘍のパーセントは、以下により計算される：
（アポトーシスと壊死細胞の面積×１００）／（全乳癌の面積）
【０１６４】
生きた細胞は、死滅中のまたは死滅した細胞より多くの水を有し、従って乾燥した腫瘍の大きさ対湿潤した腫瘍の大きさの比を計算することにより、生きた細胞対生きていない細胞の全面積を推定することができる。５０℃で４８時間乾燥の前後に腫瘍を二分し、半分を腫瘍の病理のために処理し、残りの半分の重さを測定した。湿潤した腫瘍塊のパーセントとして乾燥重量を以下により計算した：
（乾燥した腫瘍の重量×１００）／（湿性乳癌の重量）
【０１６５】
全体的患者生存時間は、治療の開始後にマウスが生きた時間（日数または週数）として計算した。
【０１６６】
各治療の腫瘍の倍加時間を表９Ａに示す。５−ＦＵ／ＨＡ治療と５−ＦＵ治療との間のＴＤＴには有意差はなかった。しかしＨＡの投与は、一次腫瘍に対して治療作用を示し、ＴＤＴは食塩水群より有意に大きかった（ｐ、０．０５、多重比較Tukey検定）。５−ＦＵ前のＨＡ２４の投与は、腫瘍増殖の遅延に関して５−ＦＵの治療的価値に抵抗するようであった。
【０１６７】
５−ＦＵの引用された治療率は２６％である（イナバ（Inaba）ら、１９８９）が、５−ＦＵを投与されたマウスは「治療」されなかった。ＨＡ／５−ＦＵを補助療法を受けた２匹のマウスは「治療」され、腫瘍は完全に壊死し、約１２週間の治療後に脱落した。図２０Ｂは、ＨＡとＨＡ／５−ＦＵで治療を受けたマウスの小さい痂皮の特徴的な出現を示し、図２０Ｃは、小さい面積の壊死の出現と以後の大きい面積の痂皮の形成を示す。このマウスのうちの１匹では、小さな結節が再増殖したが、第２のマウスは２２週でもまだ腫瘍がなかった。図２０Ａから明らかなように、５−ＦＵと食塩水を投与されたマウスは大きな腫瘍があり、このため最終的に腫瘍が大きいためマウスは死亡した（表９Ｂ）が、ＨＡ±５−ＦＵを投与されたマウスは、特徴的な腫瘍の出現を示し、小さな壊死の後に痂皮が生成した。
【０１６８】
第２２週に、５−ＦＵ／ＨＡマウスの３７．５％はまだ生きており、５−ＦＵ／ＨＡ補助療法のマウスの大きな死因は、体重減少と代謝性ストレスであった（表９Ｂ）。
【０１６９】
ヒト乳癌異種移植片を有するマウスにＨＡ±５−ＦＵを投与すると、全体の患者生存率には有意な差があるようである。２４週間の試験の第２２週に、生き残っている群は、図２１に示すように５−ＦＵ／ＨＡ群とＨＡ群のみであった。
【０１７０】
結論
５−ＦＵターゲティングからのデータは、５−ＦＵをＨＡとともに１０、２０および３０分にＨＡとともに注入すると、腫瘍による５−ＦＵ取り込みはそれぞれ２．４倍、１．５倍および２倍増加し、５−ＦＵ取り込みの統計的に有意な上昇があった（表７）。これは、５−ＦＵがＨＡにより腫瘍にターゲティングされていたことを示す。５−ＦＵの腫瘍細胞へのＨＡターゲティングには２つの可能な機序がある：
【０１７１】
関連５−ＦＵを含有するＨＡは受容体（ＣＤ４４）に結合し、受容体介在エンドサイトーシスを介して内在化され、こうして腫瘍細胞中に薬物を放出する。
【０１７２】
ＨＡ分子メッシュは外部への拡散の障害として作用し、その結果ＨＡが受容体（ＣＤ４４とＲＨＡＭＭ）に結合した後、同伴された５−ＦＵは、腫瘍細胞中に拡散することができる。ＨＡマトリックスにより細胞の表面に維持されるが、５−ＦＵは、通常は５−ＦＵが下の細胞に移行するのに使用される能動輸送機序の利用性が向上している。
【０１７３】
ＨＡの異化作用は、主にリンパ節（フレーザー（Fraser）ら、１９８８）と肝臓（ロウレン（Laurent）ら、１９８６）で起きる。ＨＡは通常、肝臓（８０〜９０％）、腎臓（１０％）、脾臓（０．１％）および骨髄（０．１％）で、受容体介在細胞取り込みと異化により血流から排除される（フレーザー（Fraser）ら、１９８３）。循環ＨＡは、肝内皮細胞（ＬＥＣ）受容体（エリクソン（Eriksson）ら、１９８３）とも呼ばれる代謝性受容体により取り込まれ、ＣＤ４４受容体は、代謝ではなく細胞プロセスに関連したＨＡ内在化に関与し、一方ＲＨＡＭＭ受容体は、細胞の運動性にのみ関与しているようである。ＨＡを５−ＦＵと組合せると、高レベルの５−ＦＵが、ＨＡまたは５−ＦＵ代謝の部位にターゲティングされる。ターゲティング実験のデータ（表６）は、ＨＡとともに投与すると肝臓への５−ＦＵターゲティングに有意な上昇は無かったことを示す。肝臓へのターゲティングの上昇は観察されなかったため、肝臓上のＬＥＣ受容体は、ＣＤ４４受容体と比較してＨＡに対する結合親和性が低いかも知れないことを示唆する。他の可能性は、肝臓細胞上に発現されるＣＤ４４アイソフォーム（スタメンコビック（stamenkovic）ら、１９９１）が、高い親和性でＨＡには結合しないことである。肝臓と同様に、他の代謝臓器である脾臓、骨髄およびリンパ節では、５−ＦＵのターゲティングの上昇は観察されなかった。
【０１７４】
肝臓にターゲティングされた５−ＦＵでは、１０分以内に有意な１．８倍の上昇があった。他の４つの時点は、ＨＡ／５−ＦＵを同時投与した時、腎臓による５−ＦＵ取り込みの有意な上昇は示さなかったが、一般的な傾向が起きており、ＨＡとの投与により腎臓により多くの５−ＦＵが送達された。体内から５−ＦＵを除去する最終的排除の主要な経路は、尿排泄である。ＨＡとの薬物の腎含量はほとんど増加しないようであるが、我々は、他の証拠から、ＨＡは腎臓により取り込まれ迅速に異化され、その結果その滞留時間が短く、結合した薬物は尿中に迅速に放出されると考えている。
【０１７５】
胃、脳、肺および子宮のような組織では、１つ以上の時点で短期のターゲティングが認められる。母集団の試料数を増やすことを必要とし、これらの観察結果が真実かどうかを明確に示す、一貫した薬物動力学的パターンは得られていない。１０〜３０分で脳へのターゲティングが上昇する場合は、これは、ＨＡが、薬物が血液脳関門を通過する能力を増強することに関連しているという（ネルソン（Nelson）とフォーク（Falk）、１９９４））以前の観察結果により説明される。
【０１７６】
ＨＡとの投与で３０分と１時間の時点で、５−ＦＵレベルの有意な上昇があった。肺のマクロファージは高レベルのＨＡ結合性ＣＤ４４アイソフォーム（アンダーヒル（Underhill）ら、１９９３）を含有し、これがターゲティングの上昇の原因かも知れない。これは、肺癌の治療における治療的利点に関連している可能性があり、小および大細胞肺癌はＣＤ４４とＲＨＡＭＭの過剰発現を有すると報告されている（ホースト（Horst）ら、１９９０）。
【０１７７】
ＨＡを５−ＦＵと同時注入した時、１時間と２時間の時点で心臓への５−ＦＵのターゲティングが有意に低下した。５−ＦＵ投与は心臓毒性を引き起こすことがある（ＭＩＭＳ、１９９７）ため、５−ＦＵのＨＡとの投与は、５−ＦＵを単独で投与した時と比較して心臓への毒性の程度を減少させるかも知れない。
【０１７８】
ＨＡ／５−ＦＵ補助療法の治療効果を評価する時、長期と短期の治療プロトコールでいくつかの観察結果が一貫している。
【０１７９】
ＨＡ／５−ＦＵまたはＨＡ単独を投与されたマウスは、より多くのエネルギーを有し、体重を維持または増加するようであり、この観察結果は、６ヶ月試験でのＨＡ／５−ＦＵマウスの生存時間の増加により支持される。
【０１８０】
５−ＦＵ／ＨＡまたはＨＡを投与されたマウスの腫瘍は、外部の壊死が出現し、２つの腫瘍が脱落した。
【０１８１】
５−ＦＵへのＨＡの添加は、治療を６週間行った時、１次治療の容量への大きな作用はないようであったが、これは、腫瘍の血管が原因かも知れない。腫瘍は３つの領域からなる。５−ＦＵ有りおよび無しでＨＡを投与すると、これは腫瘍に達し、傷害された血管の大きなギャップ結合を介して、充分血管形成しかつ半壊死領域に入るであろう。ＨＡの水を吸収する能力のために、これは細胞外液の腫瘍の壊死領域への流入を引き起こし、従って腫瘍の容量の増加を招き、腫瘍血管をさらに傷害する可能性がある。この仮説は、ＨＡ±５−ＦＵで治療した腫瘍は、壊死と腫瘍細胞内液の洩れとをルーチンに示すという観察結果に一致する。壊死細胞対生存細胞の面積の計算と乾燥容量：湿潤容量の比の計算が完了すれば、この仮説を証明できるであろう。
【０１８２】
長期薬効試験は、図２１に示すように、ＨＡ／５−ＦＵ治療を受けたマウスの生存率の上昇を示した。これらのマウスの平均腫瘍容量はまた、他の治療群と比較して低下しているようであった。また長期試験でも、ＨＡ／５−ＦＵ群の死因は主に代謝性ストレスであり、５−ＦＵ群の死因は、大きすぎる腫瘍のサイズによる非運動性であることが、認められた。ＨＡのみのすべてのマウスは、毒性ではなく大きすぎる腫瘍のサイズによる非運動性によって死亡した。すなわちＨＡは、毒性作用は無いようであった。ターゲティング結果から、ＨＡと５−ＦＵを組合せて腫瘍に投与した時、５−ＦＵのターゲティングの上昇が起きることがわかった（図１２）。ＨＡ特異的受容体ＣＤ４４とＲＨＡＭＭ（これは、腫瘍部位で多量に存在することが証明されている（クルティ（Culty）ら、１９９４；ワング（Wang）ら、１９９６））へのＨＡの結合を介して５−ＦＵを腫瘍にターゲティングするＨＡの能力は、５−ＦＵおよび他の細胞障害性薬剤とのＨＡの使用が、治療作用を有するのに充分な薬物が腫瘍に到達しないことの問題を克服するのを助ける可能性があることを反映しているかも知れない。また、短期試験において、５−ＦＵ／ＨＡマウスは、すべての他の群と比較して体重の有意な上昇を示すことがわかった（図２１）。従って腫瘍部位へのＨＡのターゲティング能力は、５−ＦＵが他の臓器（例えば小腸）に行く量を減少させ、こうして５−ＦＵ療法に伴う副作用（特に、消化管毒性）を低下させるかも知れない。
【０１８３】
例１〜３に開示されたＭＴＸ／ＨＡ補助療法の以前の評価と比較して、我々は、表１０に要約するように、明確な共通の結果と差を認めた。
【０１８４】
【表１１】
【０１８５】
２つの試験の主要な差は、腫瘍の出発時の大きさであり、ＭＴＸ／ＨＡ試験では平均腫瘍容量１７５．１３mm3であったのに対して５−ＦＵ／ＨＡ試験では６１．６３mm3であった。腫瘍への粒子移動と腫瘍の大きさに対する患者の応答の動力学により、これは、ＴＤＴ予測に関連して得られた異なる結果の原因かも知れない。
【０１８６】
例１２ ヒアルロナンとの併用療法の治療効果
ヒトの一次（原発性）および転移性乳癌の最も一般的に使用される治療処方は、シクロホスファミド（Ｃｙｃ）、ＭＴＸおよび５５−ＦＵ（これは、２８日サイクルの１日目と８日目に投与される）の併用化学療法である。併用療法（しばしばＣＭＦと呼ばれる）は、通常６サイクル行われ、この時点で患者の状態が再評価される。ＣＭＦ療法による抗腫瘍応答率は、約５０％であると報告（ボナドンナ（Bonadonna）、１９８１；ボナドンナ（Bonadonna）、１９８８）されているが、この治療法は多くの副作用（例えば、疲労、吐き気、白血球減少、および嘔吐）を有する（ボナドンナ（Bonadonna）、１９７６；メイアロウィッツ（Meyerowitz）、１９７９）。ＭＴＸと５−ＦＵの両方についての薬物送達ビヒクルとしてＨＡの使用がうまくいっているため、我々は、６週間と６ヶ月の治療処方でＨＡ／ＣＭＦ補助（アジュンバント）療法の治療効果と毒性を調べた。
【０１８７】
ＭＴＸと５−ＦＵは、それぞれ上記例２と６に記載のように調製した。Ｃｙｓのストック濃度は、１ｇの凍結乾燥薬物を１mlの注射用等級の発熱性物質不含蒸留水に溶解し、注射用等級の０．９％塩化ナトリウムで５０mlとして調製した。ストック溶液を少量ずつアリコートし、使用するまで−２０℃に保存した。
【０１８８】
ＣＭＦ注射液は、薬物のストック溶液の適量を取って、以下の最終薬物濃度を得た：
３０mg/kg ５−ＦＵ（ストック溶液：２０mg/ml）
１５mg/kg ＭＴＸ（ストック溶液：２４．５mg/ml）
２６mg/kg Ｃｙｃ（ストック溶液：２０mg/ml）
１２．５mg/kg ＨＡ（ストック溶液：１０mg/ml）
【０１８９】
ＣＭＦ／ＨＡ補助療法の治療効果と可能な毒性を確立するために、ヌードマウス中のヒト乳癌異種移植片を使用した。できるだけヒトの治療処方をシミュレートするために、マウスを長期薬効試験の６サイクル（６ヶ月）の治療、短期薬効試験の６サイクル（６週間）の治療を行った。マウスを、短期試験ではランダムに１群８匹の７群に分け、長期試験ではランダムに８匹の５群に分けた。
【０１９０】
マウスを、７日間処方の１日目と２日目に３０mg/kg ５−ＦＵ；１５mg/kg ＭＴＸ；２６mg/kg Ｃｙｃ±１２．５mg/kgで６週間治療するか、または２８日処方の１日目と８日目に上記で６ヶ月治療した。対照群は食塩水、１２．５mg/kg ＨＡを投与したものか、または１日目に１２．５mg/kg ＨＡを投与され２日目にＣＭＦを投与されたマウスである。治療の毒性についてマウスを毎日モニターし、腫瘍の大きさを毎日または毎週測定した（表１１を参照）。
【０１９１】
【表１２】
【０１９２】
表１２ａと１２ｂに示すように、６週間試験では以下が観察された：
【０１９３】
１）ＨＡ（ＣＭＦ／ＨＡ、ＨＡ次にＣＭＦまたはＨＡのみ）を含有する治療処方を受けたマウスは、ＣＭＦのみの群より５０％多い生存を示した。ＣＭＦ治療群の平均生存期間は、４０．４日であり、他のすべての群は４２日であった。
【０１９４】
２）ＨＡとＣＭＦの組合せで治療したマウスはすべて、ＣＭＦのみまたはＨＡのみの組合せで治療したマウスに対して、有意な体重増加（ｔ検定、ｐ＜０．００１）を示し、健康の増強を示した（図２２を参照）。
【０１９５】
３）食塩水で治療したマウスの腫瘍の倍加時間（治療対照群は無し）は他の治療群より有意に短い（ｔ検定、ｐ＜０．００１）が、他の治療群の間には統計的に有意な差はなかった（図２３を参照）。
【０１９６】
４）原発性腫瘍の終点の容量について、ＣＭＦ治療群とＣＭＦ／ＨＡ治療群の間で有意差（ｔ検定、ｐ＝＜０．００１）があり、ＣＭＦは７／８匹のマウスで腫瘍の大きさが低下し、ＣＭＦ／ＨＡは一次腫瘍の大きさを３／８匹のマウスでのみ低下させた。
【０１９７】
５）マウスをＨＡ±ＣＭＦで治療した時、治療毒性は認められなかったが、ＣＭＦのみで治療したマウスは、疲労、結膜炎、全身性の健康不良を示した。
【０１９８】
ＣＭＦ／ＨＡまたはＨＡ治療を２８日サイクルの１日目と８日目に行うと、以下が観察された：治療群の間で生存期間に有意差はなかった。
【０１９９】
１）治療群の間で体重増加に有意差はなかった。
２）ＨＡ±ＣＭＦを投与されたマウスの一次腫瘍は、小さい壊死と痂皮形成を示した。
３）一次腫瘍の治療において、単独物質としてのＣＭＦは、食塩水やＨＡ治療に対して治療効果を示さなかった。ＣＭＦにＨＡを加えると、有意に大きな（ｔ検定、ｐ＝０．００１）一次腫瘍が得られた。
【０２００】
この試験から以下の結論が導かれる：
【０２０１】
１）ＨＡ／ＣＭＦ補助療法の長期投与（６ヶ月）は、治療効果の上昇または治療副作用の低下を示さない。
２）ＨＡ／ＣＭＦ補助療法の短期投与（６週間）は、単独治療としてのＣＭＦの投与に対して多くの利点を示す。
３）有意な体重増加。
４）治療を完了するマウス数の５０％の増加。
５）疲労、結膜炎、食欲減退のような副作用がなくなる。
６）ＨＡを投与されたマウスは毒性症状を示さなかった。
【０２０２】
【表１３】
【０２０３】
【表１４】
【０２０４】
例１３ 化学療法薬とＨＡとの相互作用の性質のＮＭＲ研究
ＨＡと化学療法薬との相互作用の性質を詳細に調べるために、1Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル法を使用した。酸化重水素（2Ｈ2Ｏ（９９．９６％））を、ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ(Cambridge Isotope Laboratories））から得た。ＭＴＸは、ファールディングファーマシューチカルズ（Faulding Pharmaceuticals））から得て、５−ＦＵとＨＡストック溶液は、既に記載されているように調製した。
【０２０５】
スペクトルは、
ＤＲＸスペクトル計を６００MHzで運転してシールドした勾配ユニットで２９８Ｋで記録した。２Ｄ実験は、ｔ1ディメンジョンで直交検出の時間比例相増加を使用して相感受性モードで記録した（マリオン（Marion）と
、１９８３）。２Ｄ実験は、混合時間１２０msのＭＬＥＶ−１７スピンロックシーケンス（バックス（Bax）とデービス（Davis）、１９８５）を使用するＴＯＣＳＹシーケンス；混合時間２５０と４００msのＮＯＥＳＹ（クマール（Kumar）ら、１９８０）、および混合時間２５０msのＲＯＥＳＹスペクトルを含んだ。プローブの温度較正は、エチレングリコールの化学シフトと比較して行った。すべての化学シフト（ppm）は、４，４−ジメチル−４−シラペンタン−１−スルホネート（ＤＳＳ、０ppm）のメチル共鳴を参照とした。
【０２０６】
ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹおよびＴＯＣＳＹ実験の水シグナルの溶媒抑制は、修飾ウォーターゲート（WATERGATE）シーケンス（ピオット（Piotto）ら、１９９２）を使用して行った（ここで、１msの２つの勾配パルスを二項３−９−１９パルスの両側に適用した）。スペクトルは、Ｆ2で４０９６の複合データ点で６０２４Hzより上で、Ｆ1ディメンジョンの５１２の増分で、ＴＯＣＳＹ実験では３２スキャン／増分、ＮＯＥＳＹでは８０スキャンで、ルーチンに取った。静かに交換するＮＨプロトンは、１６Ｋデータ点以上と３２スキャンで取った一連の１次元（１Ｄ）スペクトルを取ることにより検出した。
【０２０７】
ＮＭＲ拡散実験は、５００MHzで運転する勾配制御ユニットのついた
ＡＭＸスペクトル計で取った。すべて実験は、２９８Ｋで１６Ｋ以上の２９８Ｋデータ点と７５７５Hzで１６または６４スキャンで取った。拡散実験には、１５．４４G/cmの勾配強度を使用した。各拡散実験は、一連の１２ＰＦＧＬＥＤスペクトルから得られた（ここで、遅延（τ＝２０ms、Δ＝５０ms、Ｔ＝３０msおよびＴe＝１４ms）、Ｇの大きさは一定に維持したが、フィールド勾配パルス（δ）の長さは、１msのステップで０．２msから最終スペクトルの１２．２msまで増加させた）。
【０２０８】
すべてのスペクトルは、シリコングラフィックス（Silicon Graphics）インディゴ（Indigo）ワークステーションでXwinnmar（ブルーカー（Bruker））ソフトウェアを使用して処理した。２Ｄ実験のために、ｔ1ディメンジョンは、ゼロ充填から２０４８の実際のデータ点までであり、９０°相シフトサイン−ベルウィンドウ関数は、フーリエ変換の前に適用した。
【０２０９】
ＮＭＲ実験は、ＨＡを加えた時ＭＴＸの1Ｈ ＮＭＲスペクトル中の変化をモニターするように設計した。薬物ＭＴＸのスペクトルの特異的変化（ピークの広がりまたは移動）をモニターすることにより、どの薬物分子の領域がＨＡと相互作用（もしあれば）するかがわかる。図２４は、Ｈ2Ｏに溶解したＭＴＸの1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。このスペクトルは、メソトレキセート中の水素の各基を容易に同定する。
【０２１０】
メソトレキセート
メソトレキセートは、ヒアルロナン分子と反応できる多くの官能基を有する。ＭＴＸの２，４−アミノ−プテリジン芳香環上の一級アミンは、ヒアルロナン分子上のカルボキシル基とイオン性結合を形成することができる。メソトレキセート上のアミン基とヒアルロナンの炭水化物環上のヒドロキシル基との水素結合が、もう１つの可能性である。ＭＴＸの疎水性芳香環と、折り畳まれたヒアルロナンポリマー上の疎水性パッチとの疎水性相互作用も可能である。これらの相互作用を図２５に示す。
【０２１１】
メソトレキセートとＨＡとの間に特異的な相互作用があるかどうかという問題を解決するために、ＮＭＲ実験を計画して、ＨＡを添加した時のＭＴＸの1Ｈ ＮＭＲスペクトルの変化をモニターした。図２６は、６００MHzと２９８Ｋでのヒアルロン酸の６００MHzスペクトルを示す。
【０２１２】
図２７は、ＭＴＸ単独と、２nmole、１０nmole、２０nmoleおよび８０nmoleと増加するＨＡ（５０kDa）を添加したＭＴＸの２９８Ｋでの６００MHz 1Ｈ ＮＭＲスペクトルである。これらのスペクトルは、ＭＴＸ中のいずれのピークにも化学シフト位置の変化がないことを示す。ＨＡを連続的に添加するとスペクトルに現れる追加のピークは、ヒアルロン酸による共鳴と完全に一致する。これらのスペクトルでＭＴＸの共鳴のいずれにも化学シフト位置の変化が無いため、ＨＡ分子と相互作用しているＭＴＸ分子の特定の領域は無いようである。
【０２１３】
ＭＴＸ上のＮＨ基とＨＡ上の酸性基との間で強い相互作用があるかどうかを決定する１つの方法は、ＮＨプロトンの交換速度を測定することである。これらの水素は不安定であり、バルク溶媒と急速に交換することができる。しかし、もしこれらがＨＡ分子との強い相互作用に関与しているなら、これらはバルク溶媒から防御され、その交換速度は低下するであろう。この実験では、ＭＴＸのアミン水素は、Ｄ2Ｏからの重水素と交換し、交換速度は、ＭＴＸとＨＡとの相互作用の強度の定量的推定値を与える。０．５％w/v Ｎａ2ＣＯ3（ｐＨ９）に溶解したＭＴＸとＨＡの溶液に酸化重水素を添加して調製した溶液の1Ｈ ＮＭＲ分析は、４分以内にＭＴＸのすべてのアミン水素が、試料中の重水素と交換したことを示した。この結果は、ＭＴＸ中のアミン水素が、バルク溶媒との交換から防御されていないことを示唆する。
【０２１４】
1Ｈ ＮＭＲスペクトルからアミン水素のピークが消失する理由は、重水素が水素とは大きく異なる共鳴周波数を有し、従って1Ｈ ＮＭＲスペクトルには現れないためである。類似の実験をルーチンに使用して、ポリペプチドやタンパク質中の骨格アミド水素が溶媒から防御されるかどうかを試験する。タンパク質のアミド水素が、αらせんおよびβシート２次構造を安定化する水素結合に関与する時、これらの水素の交換速度はしばしば劇的に低下する。ある場合にはこれらの相互作用に関与する水素シグナルは、その相互作用とバルク溶媒（例えば、タンパク質の疎水性コア中）からの防御の強さに依存して数時間、数日またはさらには数ヶ月続く場合もある。
【０２１５】
ＭＴＸ単独およびＨＡの存在下で、拡散実験を行った。これらの実験は、捕捉されたＭＴＸの拡散がＨＡフレームワークの存在により遅延するかどうかを示すであろう。二重測定の1Ｈ ＮＭＲ拡散実験の結果は、ＭＴＸとＨＡ存在下のＭＴＸとの拡散係数の間の差は無視できるものであったため、大多数のＭＴＸ分子について、ＭＴＸ拡散速度の遅延が無いことを示した。この知見は、ＨＡフレームワークにおいて、ＨＡ分子中に大きな溶媒空洞があり、これが薬物が媒体中を自由に拡散することを可能にすることを示唆する。
【０２１６】
拡散実験は、ＭＴＸ分子のバルクは、ＨＡフレームワークを通して自由に拡散することを示唆した。このシナリオは、わずかな割合（例えばＭＴＸ分子の５％）が非特異的にＨＡ分子と弱く相互作用しているかどうかを考慮していない。
【０２１７】
上記実験から、ＭＴＸはＨＡとは強く相互作用せず、その相互作用はもしあったとしても特異的ではないことが明らかである。非特異結合について弱く結合するリガンド（１０-3〜１０-7Ｍ）を試験する１つの方法は、移動ＮＯＥＳＹ実験を行うことである。これらの２Ｄ実験では、リガンドが巨大分子ＨＡに弱く結合するなら、交差ピークが現れる。ＭＴＸ／ＨＡの移動ＮＯＥＳＹスペクトルは、ＭＴＸのＨＡへの結合による交差ピークは示さず、ＭＴＸとＨＡとの相互作用は無視できるものであることを示唆する。
【０２１８】
わずかな割合（例えばＭＴＸ分子の５％）がＨＡ分子に非特異的に弱く相互作用するかどうかのさらなるチェックとして。ＲＯＥＳＹスペクトルのピークは、遊離状態およびＨＡへの結合状態の間の化学的交換において、ＭＴＸ分子のわずかな割合があるかどうかを示す。２５０msのＲＯＥＳＹスペクトルは、化学交換ピークを示さず、わずかな割合のＭＴＸさえもＨＡと相互作用しないことを示唆する。
【０２１９】
５−フルオロウラシル
図２８は、２９８Ｋでの７０．０と８．５ppmの間の、５−ＦＵと、ＨＡ（７５０kDa、３mg/ml）と一緒の５−ＦＵ（１．２５mg/ml、１．６mg/mlおよび６．４mg/ml）の６００MHz 1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。相互作用があるかどうかを調べる最初の実験は、５０Kdaヒアルロン酸を用いて行った。５−ＦＵとＨＡとの間に相互作用は観察されなかった（データは示していない）。相互作用が、使用したＨＡの分子量に依存するかどうかを調べるために、７５０kDaヒアルロナンを用いてさらに力価測定実験を行った。使用した５−ＦＵの濃度は、スエーデン臨床的治験の準備のために行われたＨＡ／５−ＦＵ補助療法キングズカレッジロンドン製剤研究と同様であった。これらの濃度は、ＨＡ／５−ＦＵの混合、注入バッグ中、および血漿中で予測されるＨＡ／５−ＦＵ濃度で使用される濃度をシニュレートするように計画した。残念ながら、５−フルオロウラシルのアミン共鳴は、これらの製剤のｐＨ（８．８〜９．１）でバルク溶媒の水と急速に交換し、従ってこれらの共鳴は５−ＦＵのスペクトル中には見えない。ＣＨの１つの共鳴のみが、５−ＦＵのスペクトルに見える。これらの溶液のｐＨを低下させることは、低いｐＨ値では溶液から５−ＦＵが沈殿するため、現実的ではない。これらのスペクトルは、５−ＦＵのＣＨピークの化学シフト位置に変化が無いことを示す。これらのスペクトルは、５−ＦＵがＨＡ分子とは相互作用しないらしいことを示す。
【０２２０】
拡散実験は、５−ＦＵ単独およびＨＡの存在下で行った。表１３の二重測定の1Ｈ ＮＭＲ拡散実験の結果は、５−ＦＵ単独とＨＡの存在下での５−ＦＵの拡散係数の差は無視できるものであるため、５−ＦＵ拡散がヒアルロナンの存在により遅延されないことを示す。
【０２２１】
【表１５】
２Ｄ実験、ＮＯＥＳＹとＲＯＥＳＹ：その1Ｈ ＮＭＲスペクトル中に１つの共鳴のみしか存在しないため、５−ＦＵ上の２Ｄ実験は不可能である。
【０２２２】
ＭＴＸについて力価測定実験、重水素交換実験、拡散実験および移動ＮＯＥＳＹ実験と、５−ＦＵについて力価測定実験と拡散実験を使用して、ヒアルロナンの存在下でのＭＴＸと５−ＦＵのＮＭＲ分析を行うと、化学療法薬物とヒアルロナンとの間で相互作用は検出されなかった。これらの結果は、ヒアルロナンネットワークによる化学療法薬物の捕捉は、病原性の部位に送達される薬物の量を上昇させるのに充分であることを示唆する。これらの結果は、ゲルろ過クロマトグラフィー、平衡透析、およびヒアルロナンとＭＴＸおよび５−ＦＵとの分子相互作用のＣＤスペクトル法（これらも相互作用を検出しなかった）を使用した従来の研究と完全に一致する。
【０２２３】
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【技術分野】
【０００１】
本発明は薬物の効力の増強に関し、さらに詳しくは、細胞または生体の薬物に対する抵抗性を克服することに関する。
【０００２】
（発明の背景）
任意の化学療法剤または薬物の臨床的有用性はその薬物に対する細胞抵抗性の発生によって著しく影響を受けることがある。したがって、薬物に対する抵抗性に関与する細胞機構を解明し、同時にこのような抵抗性を克服することを試みて、これまでかなりの量の研究が行われてきた。現在までに薬物の抵抗性に関与する可能性が考えられる多くの細胞機構が提案されている。これらには、
（i）薬物の代謝の変化（これには活性化の低下および不活性化の上昇が包含される）、
（ii）活性化合物に対する標的細胞または生体の非透過性
（iii）阻害酵素の特異性の変化
（iv）標的分子の産生増加
（v）細胞傷害性損傷の修復の増強、および
（vi）交互生化学的経路による阻害反応の副経路の利用
が包含される。
【０００３】
薬物抵抗性に関与する細胞機構は複雑であり、したがって、薬物抵抗性の問題を克服するため一般的に適用可能な方法の開発はほとんど進歩していない。薬物抵抗性はほとんどすべての化学療法的応用に伴う問題であるが、さらに複雑化する因子は、多くの場合、併用される多くの薬物による継続的かつ長期間の処置が要求されることである。
【０００４】
癌の処置においては、たとえば、活性薬物に対する癌癌細胞の非透過性が観察されることが多い。しかも、１つの薬物に対する抵抗性は生化学的に異なる他の薬物に対する抵抗性を付与することがしばしば見出される。これは多重薬物抵抗性と呼ばれる。多重薬物抵抗性の問題により影響される典型的な薬物にはドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチンおよびアクチノマイシンDが包含される。少なくとも一部の場合には、多重薬物抵抗性は、MdrIタンパク質と呼ばれ、P-糖タンパク質としても知られる細胞膜薬物エフラックストランスポーターの高レベルの発現に連結している複雑な表現型である。この「膜」ポンプは広い特異性を有し、細胞から、化学的に無関係な広範囲の様々な毒素を除去するように働く（Endicottら, 1989 参照）。
【０００５】
最近、スペクトルの広い薬物抵抗性の類似の機構がある種の微生物で報告されている。これらの結果は、哺乳動物細胞の多重薬物抵抗性ポンプに類似のきわめて広範囲の基質特異性を有する細菌エフラックスシステムの存在を指示するものである（Nikaido, 1993 参照）。
【０００６】
多重薬物抵抗性を逆転させる物質は抵抗性修飾剤（RMA）として知られ、ヒト癌が抵抗性になった化学療法剤の細胞傷害性を増強するのに重要である。多くの薬物がインビトロにおいてRMAとして同定されているが、これらの大部分は、多重抵抗性を逆転するのに要求される用量ではインビボにおいて高い毒性を示すため治療的に使用される可能性はほとんどまたは全くない。たとえば、アジドのような代謝毒はインビトロにおいては多重薬物抵抗性を逆転することができるが、インビボでは全く役に立たない。他の高度に有効なRMAの大部分、たとえばPSC833はMdrIタンパク質上の薬物結合部位の競合的アンタゴニストとして働くように思われる。これらの薬物の多くはまた、それらのインビボにおける有用性を限定する毒性を有する。したがって、多重薬物抵抗性を逆転させるためには別の薬理学的戦略を開発する必要がある。
【０００７】
抗新生物薬物の貧弱な腫瘍への取り込みを克服し、全身毒性を低下させる試みにおいて（Singhら, 1991）、研究者らは抗新生物薬物たとえばメトトレキセート（MTX）を悪性組織の局在に標的化することを試みてきた。幾つかの研究は既にそれらの腫瘍への親和性によって選択されたポリマーに薬物を連結させることにより化学療法剤を腫瘍に標的化することを試みている（Hudeczら, 1993; Kleinら, 1994; Akimaら, 1996）。これらのポリマーは活性薬物のそれらの標的組織への送達を補助するものではあるが、しかしながら、それらは必ずしも薬物抵抗性の問題を克服するものではない。
【０００８】
腫瘍標的化剤として提案された１つのポリマーはヒアルロナン（HA）である。ヒアルロン酸としても知られるHAは、直鎖状のポリマーからなる天然に存在する多糖であり、動物界を通して普遍的に見出される。HAはきわめて水溶性が高く、それにより生物学的システムに理想的な薬物送達ビヒクルとなっている。
【０００９】
本出願人らは今回、HAが驚くべきことに薬物担体として薬物の有用性を増大させるのみでなく、薬物抵抗性の克服にも使用されるユニークな構造および物理化学的性質を表すことを見出したのである。約1 g/Lの高濃度において、HAは分子量に比べて例外的に大きな容量を占め（Laurent, 1970）、このレベルまたはそれ以下で、それは緩く連結して巨大分子ネットワークを形成する（図１）。何らかの特定の理論に拘泥することを望むものではないが、HAの物理的特性に基づいて、多糖と薬物たとえばメトトレキセート間の相互作用の機構は以下２形態のいずれかまたは両者をとるものと本発明者らは考えている。
【００１０】
（i）化学的相互作用（図2A）
MTXのアミン基とHAのカルボキシル基の間にはイオン性結合が存在できるが、このような相互作用では沈殿を生じる可能性がある。他の可能な相互作用は薬物上の利用可能なアミン基とHAのヒドロキシル基との間の水素結合を介するものであるが、メトトレキセートは水に比較的不溶性であり、したがってもしこれが存在したとしてもきわめて弱い相互作用であると思われ、これは考え難い。MTXとHAの間の最も考えやすい結合はMTXの多くの疎水性グループとHAの二次構造における疎水性パッチの間の疎水性相互作用を介するものである（Scottら, 1989）。
【００１１】
（ii）分子会合
MTXをHAゲル中に単に「混合」した場合（図2B）、特別な化学結合を形成することなく、MTXは高濃度のHAによって形成された三次元ネットワーク内に捕捉され（Mikelsaar & Scott, 1994）、薬物は投与後、単純にHAから拡散する。HAが急速に取り込まれ、特異的な細胞受容体によって結合された場合、薬物はこれらの点、たとえばHA受容体を有するリンパ節、肝臓、骨髄、腫瘍細胞において高濃度に放出される。
【００１２】
この場合も何らかの特定の理論に拘泥することを望むものではないが、HAが活性薬物の標的化を補助する１つの機構は、幾つかの腫瘍タイプにおけるHA受容体の特徴的な過剰発現を介する可能性がある（Stamenkovicら, 1991; Wangら, 1998）。HA受容体CD44, ヒアルロナン仲介運動性の受容体（RHAMM）およびICAM-1は腫瘍の発生（Bartolazziら, 1994）および進行
に関与している。RHAMMは腫瘍細胞の運動性および浸潤を仲介する主要因子である（Hardwickら, 1992）。RHAMMが線維芽細胞のH-rasトランスフォーメーションに必須であることが証明され（Hallら, 1995）、これがこの受容体を腫瘍形成および増殖に強力に関与させることになっている。HAの代謝への関与が考えられる（McCourtら, 1994）受容体であるICAM-1は、マウス肥満細胞腫のようなトランスフォームされた組織（Gustafsonら, 1995a）、ならびにヒト乳癌の腫瘍細胞の間質およびクラスター（Ogawaら, 1998）において高度に発現される。
【００１３】
腫瘍細胞におけるHA受容体の発現の増加は、化学療法処置の基準へのHAの導入を試みる理論的な背景を提供する。しかしながら、現在までに得られているきわめて限られたデータは本発明に請求された方法を実際に教示するものとは言えない。たとえば、マイトマイシンCおよびエピルビシンに対するHAの化学的複合体化によって限られた成功が達成され、研究者らは結腸癌の増殖を0.8〜25％阻害することができたという（Akimaら, 1996）。Kleinおよび共同研究者ら（1994）はHAを5-FUと単に混合することにより移植されたラット乳癌およびFischerの膀胱癌への薬物の取り込みの増加が達成されたことを報告している。マウス肥満細胞腫が静脈内に注射されたHAに親和性を有することも証明されている（Gustafsonら, 1995b）。
【００１４】
一部のHAの研究はHAが薬物担体として使用できることを示してはいるが、この研究のどれも、HAが薬物に対する細胞抵抗性を克服できることは何ら示していない。
【００１５】
（発明の要約）
本発明は細胞傷害性または抗新生物薬物の有効性を増強させる方法において、上記薬物とヒアルロナンを共投与する工程からなり、ヒアルロナンとの共投与が薬物の癌細胞殺滅能を増強する方法に関する。
【００１６】
通常、細胞傷害性または抗新生物薬物とヒアルロナンの共投与はその癌細胞殺滅能を増強させる。すなわち、通常はその薬物に対して抵抗性である癌細胞はそれに感受性になる。
【００１７】
好ましくは、薬物はメトトレキセート、パクリタキセル（タキソール）または5-フルオロウラシル（5-FU）である。
【００１８】
本発明の第二の態様によれば、ヒアルロナンおよび細胞傷害性または抗新生物薬物からなる細胞傷害性または抗新生物医薬組成物が提供される。任意に、慣用の医薬用アジュバントをこの医薬組成物に含有させることができる。
【００１９】
通常、上記薬物はヒアルロナンの内部に同伴されるかまたはヒアルロナンに結合する。
【００２０】
本発明の第三の態様によれば、細胞傷害性または抗新生物薬物の有効性を増強させる方法において、ヒアルロナンおよび上記薬物からなる医薬組成物を投与する工程からなる方法が提供される。
【００２１】
理論に拘泥するわけではないが、薬物抵抗性を克服するために可能な機構は、
１．ヒアルロナンが抵抗性細胞上の受容体に結合するか、または膜エンドサイトーシスを介して細胞内に進入し、同伴または結合された薬物の細胞内送達を生じ、それが治療的に活性にされることを可能にする。
２．ヒアルロナンが抵抗性細胞の表面に結合し、そこで同伴または結合された薬物がヒアルロナンのネットワークから細胞内に拡散し、薬物の抵抗性細胞への送達を生じる。
３．ヒアルロナンおよび他のムコ多糖が薬物を同伴し、また様々な薬物を結合できるコイル状のコンフィギュレーションを採用する。
【００２２】
本発明の第四の態様によれば、本発明は薬物抵抗性を減弱または克服する方法において、細胞傷害性または抗新生物薬物を、その薬物を同伴および／または結合することが可能で、抵抗性細胞上の受容体への結合またはバルク（bulk）エンドサイトーシスを介して細胞内に進入できるムコ多糖類と共投与する工程からなり、上記薬物は細胞内に送達され、そこで治療的に活性にされる方法を提供する。
【００２３】
理論に拘泥するものではないが、ヒアルロナンと薬物の組み合わせは、薬物のより長期間にわたる細胞内への維持を生じ、薬物の長期にわたる放出および薬物がその薬理学的作用を発揮する時間の延長が可能になる。
【００２４】
したがって、本発明の第五の態様においては、薬物の有効性を増強させる方法において、上記薬物を上記薬物が単独で投与された場合より長期間細胞内に維持されるような方法で上記薬物を会合するムコ多糖と共投与する工程からなる方法を提供する。たとえば、薬物が細胞傷害性薬物である場合、薬物は長期間細胞内に維持され、長期間の放出、およびさらに長時間その毒性作用を発揮することが可能になる。
【００２５】
本発明の第六の態様によれば、薬物抵抗性疾患を処置する方法において、このような処置を必要とする患者に、ヒアルロナンおよび薬物を共投与する工程から構成される方法が提供される。
【００２６】
一実施態様においては、本発明のこの態様は、薬物抵抗性疾患を処置する方法においてこのような処置を必要とする患者に、ヒアルロナンおよび薬物からなる組成物を投与する工程から構成される方法を提供する。
【００２７】
とくに、薬物抵抗性疾患を処置する方法は薬物抵抗性の癌を有する患者に適用することができる。好ましくは、癌は、メトトレキセートまたは5-FUに対して抵抗性である。
【００２８】
さらに好ましくは、上記薬物の抵抗性は多重薬物抵抗性である。
【００２９】
本発明の第七の態様によれば、癌を処置する方法において、薬物を、上記薬物が単独で投与された場合より長期間、癌細胞内に維持されるような方法で、上記薬物を同伴もしくは結合および／または会合することが可能なムコ多糖と共投与する工程からなる方法を提供する。
【００３０】
本発明の第八の態様によれば、薬物の胃腸毒性を低減させる方法において、薬物を、上記薬物の胃腸毒性が低下するような方法で上記薬物を同伴もしくは結合および／または会合することができるムコ多糖と共投与する工程からなる方法を提供する。
【００３１】
本明細書および特許請求の範囲の記載を通じて、「からなる」の語ならびにその変化型たとえば「からなり」および「から構成される」の語は「包含するがそれらに限定されるものではない」ことを意味し、他の添加物、成分、数または工程を排除する意図ではない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、高濃度においてHAが三次元ネットワークを形成し、これは小分子たとえばメトトレキセートを同伴できることを示す。HA／薬物の病原部位への標的化はHAの特異的受容体への急速な結合、ついでHAからの薬物の拡散および／またはHAおよび／または薬物受容体を介するHAおよび薬物両者の共インターナリゼーションによって達成される。
【図２】図2Aは、メトトレキセートとHAの間の可能な分子相互作用を示す。これらには（i）イオン性結合、（ii）水素結合、または（iii）疎水性結合が包含される。 図2Bは、HA中におけるメトトレキセートの絡み合いの模式的表示である。高濃度においてHAは大きなコイル状分子によって表される三次元ネットワークを形成する。星印はわずか454 Dの分子量を有するメトトレキセートを表し、400〜900 kDのHA分子中に容易に同伴される。
【図３】図３は、ヌードマウスにおいて増殖したヒト乳癌腫瘍の一般的な病理を示す。パネルAはグレードII〜IIIのヒト腫瘍の一般的形態を示す。パネルBは図3Aに示す腫瘍の他の切片の顕微鏡写真を示す。この切片は周囲のマウス筋肉（M）、腫瘍カプセル（C）、腫瘍の壊死領域（N）、浸潤腫瘍（T）を示し、癌細胞が浸潤癌と会合していることが多く（Carter, 1990）ファイル状に癌細胞が並んだ「インディアンファイル」として知られる共通の現象を指示する（→）。
【図４】図４は、悪性な乳癌の古典的な病理学的特徴を示す。パネルAは、大きな壊死領域（N）を伴う特徴的な浸潤管癌の切片を示し、腫瘍のさらに侵襲的な過程を指示する。パネルBは血液細胞の存在を示し（→）、腫瘍が血管を新生すること、したがって生存していることが確認される。血管にきわめて接近して数個の管（D）が観察される。パネルCは（A）と標識され、核の分断によって指示されるように、アポトーシスを受けている細胞を示す。
【図５】図５は、ヌードマウスで増殖したヒト乳癌腫瘍上におけるHA受容体の免疫組織化学同定を示す。パネルAは癌胎児性抗原（CEA）の腫瘍における局在を示す。パネルBはヒト乳癌上におけるRHAMMの発現を示す。パネルCはヒト乳癌におけるICAM-1の発現を示す。HA受容体の局在、ICAM-1は内皮組織の周囲に一次的である（→）。パネルDはヒト乳癌におけるCD44の発現を示す。CD44Hは腫瘍細胞の約95％に検出された。H: ヒト起源の細胞；M: マウス起源の細胞
【図６】図６は、腫瘍のメトトレキセート標的化のための担体として使用されるヒアルロナンの分子量分析の結果を示す。
【図７】図７は、HAを担体として用い、ヒト乳癌のメトトレキセート標的化を示す。
【図８】図８は、HAの存在下、肝臓におけるメトトレキセートの取り込みの増加を示す。
【図９】図９は、薬物をHAとともに投与した場合、胃腸管におけるメトトレキセートの取り込みの減少を示す。
【図１０】図１０は、MTX／HAの間の可能な生理学的相互作用およびその結果の薬物／HA併用療法の腫瘍標的化能の模式的表示である。
【図１１】図１１は、HAの5-FUとの併用の細胞傷害性相乗的インビトロ作用を示す。
【図１２】図１２は、HAを担体として用い、ヒト乳癌腫瘍の5-FU標的化を示す。
【図１３】図１３は、ヒトにおけるHAの消失経路を示す。
【図１４】図１４は、胃、脳および肺臓における5-FUの取り込みの増加を示す。
【図１５】図１５は、血漿5-FUの薬物動態的消失に対するHAの作用を示す。
【図１６】図１６は、実験的終点の定義についての基準を示す。基準２（パネルA）および基準３（パネルB）を示す。
【図１７】図１７は、5-FU／HAアジュバント療法（6週処置基準）の効果：一次腫瘍容量に対する有効性を示す。
【図１８】図１８は、5-FU／HAアジュバント療法（6週処置基準）の効果：体重に対する有効性を示す。
【図１９】図１９は、5-FU／HAアジュバント療法（6週処置基準）の効果：癌のリンパ節への伸展および新たな腫瘍の形成に対する有効性を示す。
【図２０】図２０は、6カ月の有効性試験における腫瘍の一般的外観を示す。
【図２１】図２１は、5-FU／HAアジュバント療法の患者の生存率に対する有効性を示す。
【図２２】図２２は6週にわたりCMF／HA療法で処置したマウスの体重変化％を示す。
【図２３】図２３は6週にわたりCMF／HA療法で処置したマウスにおける腫瘍容量の変化％を示す。
【図２４】図２４は水に溶解したMTXの1H NMRスペクトルを示す。このスペクトルはMTX中の各グループの水素を容易に同定することができる。
【図２５】図２５は、MTXのHAとの可能性がある相互作用を示す。
【図２６】図２６は、ヒアルロン酸の600 MHz および298 Kでの600 MHz スペクトルを示す。
【図２７】図２７はMTX単独および2 nmole, 10 nmole, 20 nmole および80 nmoleのHA（50 kDa）を増量して添加したMTXの298 Kにおける 600 MHz 1H NMRスペクトルを示す。
【図２８】図２８は、5-FUおよび5-FU（1.25 mg/kg, 1.6 mg/mlおよび6.4mg/ml）をHA（750 kDa, 3 mg/ml）と70.0と8.5 ppm の間298 Kにおける 600 MHz 1H NMRスペクトルを示す。
【００３３】
略号
BSA ウシ血清アルブミン
Ci キューリー
CMF シクロホスファミド、メトトレキセートおよび5-フルオロウラシル
Cyc シクロホスファミド
DNA デオキシリボ核酸
Dpm 減衰／分
DTTP デオキシチミジントリホスフェート
ECM 細胞外マトリックス
EDTA エチレンジアミン四酢酸
ELISA 固相酵素免疫測定法
FCS ウシ胎児血清
5-FU 5-フルオロウラシル
GAG グリコサミノグリカン
GlcNAc N-アセチルグルコサミン
GlcUA グルクロン酸
HA ヒアルロナン／ヒアルロン酸
HABP ヒアルロナン結合タンパク質
HAase ヒアルロニダーゼ
HBSS ハンクス平衡塩溶液
HRP 西洋ワサビペルオキシダーゼ
h 時間
Kav ゲル内の分布有効容量
L リットル
min 分
PBS リン酸緩衝食塩溶液
PM 形質膜
RHAAM HA-仲介運動性の受容体
RMCa ラット乳癌
RNA リボ核酸
RT 室温
S-phase 合成相
S.D. 標準偏差
SEM 平均の標準誤差
Ve 溶出容量
V0 空隙容量
Vt 総容量
TGD 腫瘍成長遅延
TDT 腫瘍倍加Ti
【００３４】
（本発明の詳細な説明）
本発明をついでさらに以下の非限定的実施例を参照しながら説明する。しかしながら、実施例は単に例示的なものであり、上述の本発明の一般性に対していかなる意味でも限定として理解すべきではない。とくに、本発明は癌との関連において詳細に説明されるが、この場合の所見は癌の処置に限定されるものではないことは明らかであろう。たとえば、細胞傷害性薬物は他の状態の処置にも使用されるものであり、メトトレキセートは重症慢性関節リウマチの処置に広く使用されている。
【００３５】
実施例１ ヌードマウスにおけるヒト乳癌腫瘍の確認およびインシトウにおける乳癌腫瘍上のヒアルロナン受容体の同定
ヒト乳癌の適切な動物モデルを確立するためには、病理学的試験を実施することが必要である。腫瘍が生理学的に生存可能であるためには、毛細管ネットワークが腫瘍に栄養を供給するための血管新生が必須である。血管新生、管の浸潤、壊死、アポトーシス、高い有糸分裂指数および核の異常の存在はすべて、乳癌の特徴である。
【００３６】
ヒト乳癌細胞系MDA-MB-468（American Tissue Culture Collection, Rock ville, U.S.A.）はHA受容体、CD44, RHAMMおよびICAM-1のその発現に基づいて選択された。細胞は定常的に増殖させ、175 cm2の培養フラスコ内で10％ウシ胎児血清（FCS）および10μg/mlのゲンタマイシンを補充したLeibovitz L-15メジウム中で単層としてサブクローニングした。マウス細胞への注射のためには、100％の集蜜性に達するまで増殖させ、0.05％トリプシン／0.01％EDTA溶液中でトリプシン処理し、2回Beckman TJ-6実験室遠心分離器（Beckman, Australia）により400 gavで10分間遠心分離して洗浄し、モデル-MZ Coulter Counter（Coulter Electronics, England）を用いて計数し、血清を含まないLeibovitz L-15メジウムに1×108細胞/mlに再懸濁した。
【００３７】
無胸腺のBalb/c/WEHI雌性ヌードマウス（Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Melbourne, Australia）6〜8週齢85匹を特異的な病原体を含まない条件下に維持し、滅菌した飼料および水を自由に与えた。上述のようにして1000万個のMDA-MB 468細胞を調製し、各マウスの乳首下の脂肪パッドに直接注射した。腫瘍の増殖は96％のマウスで観察された。腫瘍の増殖が可視的に検知可能な場合は、腫瘍の進行は腫瘍容量を毎週測定してモニタリングした。腫瘍容量は３方向の垂直な直径から次式を用いて計算した。
V=(1/6) p (d1d2d3)
式中、Vは腫瘍容量（mm3）
d1は腫瘍の第一の直径（mm）
d2は腫瘍の第二の直径（mm）
d3は腫瘍の第三の直径（mm）である（Lamszusら, 1997）。
【００３８】
腫瘍の移植後８週における平均腫瘍サイズは482.2 mm3（SEM, 39.8 mm3）であった。
【００３９】
腫瘍の誘導から約8週後に、2匹の担癌マウスに致死用量のネンブタールを投与した。マウスの屠殺から3分以内に、腫瘍を外科的に摘出し、直ちに10％緩衝ホルマリン中で12時間固定した。固定した腫瘍を一連の70〜100％エタノール洗浄で一夜脱水し、ついでパラフィンに包埋し、それから2〜4μmの切片を切り出した。切片をスライド上に載せ、脱蝋し、冠水する。スライドを3×5分間リン酸緩衝食塩溶液（PBS）中で洗浄した。異好性タンパク質を10％ウシ胎児血清とのインキュベーションついでPBS洗浄によってブロックした。検出抗体を6分間室温（RT）で適用した。抗血清もしくは抗体はRHAMM（Applied Bioligands Corporation, Manitoba, Canada）, ICAM-1, CD44V6, CD44V10, 総CD44H, およびCAEに対して作成した。すべての他の検出抗体はZymed (California, U.S.A)から購入した。スライドをPBS中で3×5分間洗浄し、内因性ペルオキシダーゼ活性を20分間0.3％H2O2／メタノール中に浸漬してブロックした。ついでさらにPBS洗浄し、ペルオキシダーゼ接合ブタ抗-ウサギ二次抗体（Dako, Denmark）を60分間RTで適用し、PBS中で3×5分間洗浄した。Sigma Fast DAB (3,3'-ジアミノベンチジン, Sigma, St. Louis, U.S.A) 錠を製造業者の説明書に従って調製し、DAB溶液を5〜10分間RTで適用した。スライドを流水で10分間洗浄し、ヘマトキシリンによって対比染色し、脱水して搭載した。
【００４０】
ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した乳癌切片の検査では、図３および４に示すように、生存腫瘍に関連するすべての通常の特徴が証明され、動物宿主によるグレードIIヒト乳癌の維持は成功したことが確認された。悪性の特徴であるいくつかの性質がある。(B)と標識されたスライドの切片はこれらの性質を示す。切片(B)に観察される悪性の病理学的特徴は、
i) 高い核／細胞質比
ii) 角のあるクロマチンおよび核
iii) 不規則な核膜
である。
【００４１】
グレードII〜IIIのレベルの腫瘍はヌードマウスモデルで維持されると結論された。グレードII〜IIIのレベルの腫瘍は、一般に約47％の予後生存率を与える(Bloom & Richardson, 1957)。グレードII〜IIIのレベルの腫瘍は、
i) 中等度の核多形性、過染色性、および有糸分裂活性、表示された腫瘍の切片を通して観察される特徴；および
ii) 管形成はほとんどまたは全くないこと
によって特徴づけられる。壊死（N）の大きな領域を転移した腫瘍に相関させることが可能で、これは強い侵襲的浸潤過程を示唆する（Carter, 1990）。腫瘍の浸潤縁は（）によって指示される。
【００４２】
この実験の主要な目的は、これらのマウスで確立された組織学的および細胞学的挙動がそれらの自然のヒト宿主におけるこのような腫瘍の場合に匹敵することの確認であった。この目的を達成するために、本発明者らはまた、マウスにおける腫瘍細胞がヒト起源であり、それらは高度に関連するHA受容体、たとえばRHAMM, CD44および推定ICAM-1を発現することも示した。腫瘍標的化が受容体仲介インターナリゼーションまたは結合を介して起こると仮定されるので、HA受容体、ICAM-1, CD44およびRHAMMの発現を確認することが必要であった。図５B〜Dはこれらのすべての受容体が存在したことを証明する。表１には試験した２つの腫瘍における受容体の発現程度を掲げる。
【表１】
【００４３】
腫瘍細胞のヒト起源は腫瘍および周辺組織をヒト特異的癌マーカーで染色して確認した。CEAの存在は腫瘍がヒト起源であったことを明瞭に証明したが、これはマウス宿主の心脈管系によって維持された（図5A）。ポリクローナルCEA抗血清が分泌され、それはヒトCEAと排他的に反応する。この顕微鏡写真は褐色の染色で明らかなように、完全にヒト起源（H）であることが証明された。周囲の腫瘍カプセルおよび脂肪組織は抗血清（M）による染色を欠くことにより示されるように明らかにマウス起源である。褐色染色は腫瘍細胞上におけるRHAMMの高発現を証明する。最も強い染色は壊死および腫瘍浸潤組織を取り巻く領域に認めることができる。
【００４４】
実施例２ メトトレキセート／ヒアルロナン薬物配合物の調製および注射
ヌードマウスモデルの有用性が確立されたので、今回HA／MTX製剤の有効性を試験するために使用することができた。
MTXの保存溶液は粉末MTXを0.5％w/v 食塩溶液（pH 9）に溶解し、0.9％w/v NaClで24.5 mg/ml 濃度として調製した。保存溶液は、[3H]メトトレキセートを添加し、注射用等級の食塩で注射用濃度に希釈する前に、滅菌を保証するために、0.22μm のフィルターを通してろ過した。MTXの薬物動態に関する比較データはヌードマウスおよびヒトについて既に報告されている（Inabaら, 1998）ので、可能な限りヒト治療用量に近くシュミレートするため、この試験の設計に使用した。個々の注射溶液は、50μl 中15 mg/kg MTX（平均体重60 kg について0.42 mg/kg のヒト治療用量に均等；Inabaら, 1988）を送達するように個々のマウスの体重に従って調製した。
【００４５】
乾燥したHA（モデルMr 8.9×105 kDa）を24.5 mg/ml MTX保存溶液の一部に加え、一夜ボルテックス攪拌して溶解し、最終濃度21 mg/ml とした。滅菌性を保証するため、ゲンタマイシンを濃度50μg/ml に加え、一夜４℃でインキュベートした。ついで[3H]メトトレキセートを添加したのち、HA／MTX保存混合物を注射用等級の食塩で注射用濃度に希釈した。注射はマウスの体重により、50μl 中MTX 15 mg/kg およびHA 12.5 mg/kg が送達されるように個々に注射した。生体内に注射したこの量のHAによれば、実験期間中飽和キネティックスが観察された（Fraserら, 1983）。
【００４６】
メトトレキセート／HA 注射用混合物の調製時にHA がその分子量を保持することを保証するために、注射用溶液を、カラム特性1.6 cm×70 cm, サンプルサイズ 2 ml, 流速18 ml/時および分画サイズ2 ml でSephacryl S-100サイズ排除ゲル（Pharmacia, Uppsala, Sweden）上で分析した。図６は混合操作時にHAがその分子量を維持したことを示している。
【００４７】
マウスは各群40匹の2群に無作為に分割した。群１にはMTXのみを投与した。群２にはMTX／HA併用療法を行った。動物は個別に注射ボックスに収容し、注射は尾静脈に行った。各注射液により、トリチル化メトトレキセート（注射された平均崩壊度／分（dpm）±平均の標準誤差（SEM）：19,159.146±1,336,819）を含む15 mg/kg MTX±12.5 mg/kg HAが送達された。マウスは尿を収集できるように、柔らかい非湿潤性のプラスチック製の檻に個別に収容した。注射後30分、1時間、2時間、4時間または8時間に、マウスをネンブタール（Glaxo, Australia Pty. Ltd., Melbourne, Australia）0.1 ml の腹腔内注射によって麻酔し、注射針およびシリンジを用いて心臓または大動脈から血液を採集した。血液収集後、動物は頚椎脱臼によって屠殺した。
【００４８】
血液をEDTA-被覆ガラス試験管に取り、14,000 gav で10分間遠心分離して血漿を調製した。100μl の30％v/v 過酸化水素で脱色し、3 ml のHiSafeII シンチラントを加えたのち、50μl のアリコート中で放射能をカウントした。ケミおよびフォトルミネセンスを克服するためサンプルはWallac 1410 β-カウンター中、サンプルのソースに依存して、3, 7または20 d期にわたってカウントした。カウンティングの間の期間にはサンプルは室温で暗所に保存した。すべての計算はすべてのケミおよびフォトルミネセンスを除いた安定化サンプルについて実施した。
【００４９】
血漿中の注射MTXの百分率を計算するためには、標準式：
マウス体重（g）×マウス血液容量（0.07）×血液の血漿部分（0.59）
を用いて各マウスの総血漿容量を計算することが必要であった。ついで血漿中の注射MTXの百分率は
血漿容量（ml）×血漿dpm/ml×100／総注射dpm=血漿中％注射MTX
によって計算した。
【００５０】
血流中に送達されたMTXの量の正確な割合を保証するため尾静脈の注射部位を切り取り、MTXを定量した。注射部位に残された注射MTXの平均百分率は3.78％（SEM: 0.57％）であった。血流に送達されたMTXの量（組織および腫瘍に分布可能なMTX）は次のように計算された。
血流に送達されたMTXの量（dpm）=
注射シリンジの重量差（mg）×注射物質のDpm/mg−注射部位に残ったDpm
血流に送達されたMTXは以下「注射用量」と呼ぶ。
【００５１】
サンプル集団間の正確な比較を可能にし、臓器および腫瘍塊中のわずかな変動を正規化するために、生体臓器および腫瘍ならびに体液中のMTX濃度は組織グラム数あたりの注射用量の％として表示した。
【００５２】
注射部位に残った注射MTXの平均百分率は3.78％（SEM: 0.57％）であった。このような変動を正規化するため、腫瘍および組織に見出されたdpmを注射dpm−注射部位に残ったdpmの百分率として計算した。この量は以下利用可能なdpmまたは利用可能メトトレキセートと呼ぶことにする。結果は表２にまとめる。
【表２】
【００５３】
薬物をHAと共投与した場合、MTXの血漿レベルには統計的な有意差は認められなかった。MTXの全般的な薬物動態は変化しないままで、最大MTX血漿レベルに静脈内注射後0.5〜2時間以内で到達した（MIMS, 1997）。
【００５４】
可能な尿は非湿潤性プラスチック製の檻からシリンジおよび注射針で収集した。尿は14,000 gavで10分間遠心分離して澄明にした。その放射性カウントは8〜30μlの範囲のサンプルに3 ml のHiSafeII シンチラントを加えたのち測定した。各マウスにより排泄された尿の容量の正確な測定における技術的困難性にもかかわらず、本発明者らは尿中の注射MTX用量の百分率を次式で計算した。
収集の時間（時間）×42μl×dpm/μl尿×100／注射総dpm
=尿中注射MTXの％
【００５５】
排尿頻度の変動により、各マウスから尿を収集することはできなかった。３回またはそれ以上の標品が各処置あたり各時点で利用可能であった場合は、その時点においてデータのノンパラメトリックな統計的検定を行った。MTX/HAを投与されたマウスの尿には50％（p=0.043）以上のMTXが投与1時間後に認められた（表２参照）。
【００５６】
マウスの屠殺後直ちに、腫瘍、肝臓、心臓、脾臓、膀胱、左および右腎臓、子宮、肺臓、胃、腸、脳およびリンパ節を摘出し、総放射能を分析した。各組織の総放射能は100〜400 mg の組織を3〜6 ml のOptiSolv（ACC, Melbourne, Australia）中に22℃で36時間可溶化して測定した。可溶化の完了時に、組織中の放射能は10 ml のHiSafeII シンチラントを加えたのちカウントした。この場合も、ケミおよびフォトルミネセンスを克服するためにサンプルはWallac 1410 β-カウンター中、サンプルのソースに依存して、3, 7または20 d期にわたって2分間カウントした。カウンティングの間の期間には、サンプルは室温で暗所に保存した。すべて計算はすべてのケミおよびフォトルミネセンスを除いた安定化サンプルについて実施した。数字はメジアン±SEM（n=8）を表す。
【００５７】
代謝的に活性な臓器たとえば肝臓、脾臓および腎臓が腫瘍標的化の増大に何らかのプラスの局面を妨害できる薬物標的化の高レベルは経験されなかったということを確立することは重要であった。表２には試験した様々な時点での各組織のメトトレキセートの取り込みを掲げる。
【００５８】
Mann-Whitneyの順位和検定およびStudentのτ-検定を用いて、MTXをHAと共投与した場合のMTX濃度／g 組織には統計的な有意差はなかった。各時点における動物が少数なため、１つのデータポイントが重複すればMann-Whitney試験は統計的に無効になるが、肝臓、子宮および腸では明確な傾向が認められた。
【００５９】
肝臓では、HAと組み合わせた場合に、図７に示すように、短期間のMTXの取り込み増加がみられた。30分および1時間の時点で、肝臓にはMTX濃度にそれぞれ平均（メジアン）65％および26％の上昇が認められた。2時間では、処置に無関係に肝臓におけるMTXの量には差は観察されなかった。4時間後には興味ある傾向が明瞭になり、図８に示すように、HAと共注射した場合、肝臓におけるMTXの低下が見出された（4時間：68％低いMTX, 8時間：75％低いMTX）。
【００６０】
腸には有意な傾向があり、HAとMTXを組み合わせた場合にはすべての時点で、図９に示すように薬物の取り込み低下を生じた。
腸は完全にホモジナイズし、ついで組織約400 mg を3〜6 ml のOptiSolv中に22℃で24時間可溶化し、ついで10 ml のHiSafeII シンチラントを加えた。ケミおよびフォトルミネセンスを克服するため、サンプルはWallac 1410 β-カウンター中、サンプルのソースに依存して、3, 7または20 d期にわたって2分間カウントした。カウンティングの間の期間には、サンプルは室温で暗所に保存した。すべて計算はすべてのケミおよびフォトルミネセンスを除いた安定化サンプルについて実施した。
【００６１】
数字は平均（メジアン）±SEM（n=8）を表す。マッチしたペアについてのノンパラメトリックなランダム化試験でのデータの分析では、HAの共投与は薬物の胃腸管への排泄を有意に低下させることが証明された（p=0.031, 片側検定）。
MTX濃度の低下は43〜67％の範囲であった。マッチしたペアについてのノンパラメトリックなランダム化試験でのデータの分析では、HAの共投与は薬物の胃腸管への排泄を有意に低下させることを示した（p=0.031, 片側検定）。
【００６２】
肺ではHAと共投与した場合、4時間の時点で有意なMTXの低下があり、52％の平均（メジアン）低下（p=0.014％）を生じた。他の時点では有意差は証明されなかったが、しかしながら、この観察の意味は不確定である。
脾臓、子宮、脳、心臓、リンパ節、胃および腎臓では認めるべき傾向は検出されなかった。
【００６３】
メトトレキセートの腫瘍細胞へのHA標的化には２つの機構の可能性がある（図10）。
HAをMTXと配合した場合には有意な標的化効果が認められた（図７）。薬物の腫瘍における保持の最も大きい相対的増加は、0.5時間（平均24％の増加）、１時間（平均30％の増加）および2時間（平均119％の増加）に認められたが、一方、4時間および8時間での増加は無視できるものであった。集団サイズが小さいことおよびデータのノンパラメトリックな分布により、Mann-Whitney順位和検定を使用し、HAを共注射した場合に薬物の腫瘍取り込みは有意に上昇することが明らかにされた。1時間における統計的有意差はp=0.021であり、2時間においてはp=0.050であった。他の時点では、有意差は証明されなかったが、腫瘍のMTX濃度／gはHAと共注射した場合よりもかなり高い傾向を示した。
【００６４】
図７に示したデータは、HAとの共投与は注射後30分以内に腫瘍によるMTXの取り込みを著しく上昇させることを明らかに証明するものである。その上、共投与は腫瘍内における薬物の濃度に以後の分解時においても明らかに高いレベルを維持する。ノンパラメトリックな検定で評価した場合、1時間の時点で有意差はp=0.021（n1=8, n2=8）であり、2時間の時点で有意差はp=0.05（n1=8, N2=8）であった。
【００６５】
HAを含む捕捉されたMTXは受容体（CD44および／またはI-CAM-1）に結合し、受容体仲介エンドサイトーシスを介してインターナライズされ、薬物が腫瘍細胞内に放出される。
【００６６】
HA分子のメッシュは外向きの拡散に対する障碍として作用し、したがってHAが受容体（CD44, RHAMMおよび／またはI-CAM-1）に結合したのちは、捕捉されたMTXは腫瘍細胞中に拡散することができる。HAマトリックスによって細胞の表面に保持される一方、MTXは基底にある細胞中へのMTXの能動輸送に通常用いられる利用性が上昇する。
【００６７】
副作用と、活性の望ましい部位以外の組織に対する薬物の分布はまた、HAとのその会合によって影響されることがある。たとえば、HAは通常、受容体仲介細胞性取り込みと肝臓（80〜90％）、腎臓（10％）、脾臓および骨髄における異化により血流から除去され、後二者の部位においてはわずかな種間の変動がある。期待されるように、HAは少なくとも短時間、薬物の肝臓への送達を上昇させるようにみえる。30分および1時間の時点で、肝臓はそれぞれ65％および26％のMTX濃度の平均（メジアン）上昇を示した。2時間の時点では、肝臓中のMTX量に処置に無関係に差は観察されなかった。興味ある傾向は4時間後に明らかになり、HAを共注射した場合、肝臓にはMTXの低下が見出された（4時間：68％低下、８時間：75％低下）。静脈内投与後、MTXは体液中に広く分布し、肝臓中に何ヶ月も残留できる（McEvoy, 1988）ので、HAと共投与された場合、4時間および8時間の時点におけるMTXの平均濃度の低下は、薬物動態的クリアランスの経路におけるバランスの変化が指示されるものと考えられる。HAが、肝臓の内皮細胞（LEC）で急速に代謝されることを考慮すると、HAと共インターナライズされたMTXは肝臓の洞様毛細管被覆細胞内で放出され、そこで肝細胞中に拡散されて胆汁中ついで胃腸管内に分泌されるか、もしくは循環に戻ってさらに体液中へ分布および尿中へ排泄されるか、または両者の経路をとる。
【００６８】
短時間の肝臓への標的化は治療的利点になり得る。肝臓への転移の場合、MTXへの急速な高濃度での暴露は有利であり、観察された標的化はわずか1時間ほどのものであるから、長期の毒性の問題はないと思われる。肝臓標的化は、生物活性化を要求する薬物、たとえば薬物／HAがLECに標的化されるマイトマイシンC、ドキソルビシン等で利用できる。LBCに濃縮された不活性薬物が活性化するために肝細胞内に拡散され、このようにして活性化の標的化機構として作用することができる。
【００６９】
MTX毒性の主要部位の１つは胃腸管である。HAとMTXの共投与はGI管へ送達される薬物の量を有意に低下させる。胃腸内でのMTX濃度の低下には幾つかの機構の関与が考えられる。
メトトレキセートはきわめて小さな分子であり、通常は大部分の毛細管壁を通過することが期待される一方、HAとの会合はこの経路の通過は著しく低下するものと考えられる。
肝臓内皮細胞におけるHAの急速な分解は、MTXの急速な放出および血流中への復帰を生じ、これにより1時間の時点で指示されたように、腎クリアランスの上昇を受け、MTX／HAプレパレーションを投与されたマウスの尿に50％以上のMTXが排泄される。
【００７０】
MTXの生体からの最終的除去の主要な経路は尿中への排泄である。HAにより薬物の腎臓含量はわずかに上昇するように見えるが、本発明者らは他の証拠から、HAは腎臓によって取り込まれ速やかに異化されるので、その保持時間はきわめて短く、会合した薬物は迅速に尿中に放出されると考えている。
【００７１】
結論
ここに報告された結果は、治療薬剤のヒアルロナンとの共投与が所望の標的である病理学的組織へのそれらの選択的送達、すなわち、その点でのさらに高く、さらに有効な濃度を達成する前提を調べる前臨床的試験の第一の段階を提示するものである。この場合、ヒト乳癌および他の悪性腫瘍ならびに慢性関節リウマチの現在の処置基準に広く用いられている細胞傷害性薬剤、メトトレキセートを、ヒアルロナンとともにまたはヒアルロナンを用いないで静脈内経路によって試験した。
【００７２】
本発明者らは、ヌードマウスモデルが生存宿主におけるヒト乳癌の試験にとくに適当なモデルであることを見出し、疾患組織の部位に対する直接治療剤にHAを使用し、それらの有用な効果を増強させる基本的な問題の一部を解決した。本発明者らの結果は、HAと特別な会合の形態を示さない小分子量の薬物で達成され、HAが血流中に注射された場合、病理学的組織に送達されるこのような薬物の量を依然として増加させることが証明された。この試験は、生体において支配的な条件で、MTXはHAとともに、ヒト乳癌への送達の有意な増強を達成するのに十分維持され、また胃腸管毒性の望ましくない副作用を強力に低下させることを証明するものである。
【００７３】
実施例３ パクリタキセル／ヒアルロナン薬物配合物の調製および注射
HA／パクリタキセルのためのヌードマウスモデルの有用性が確立されたので、今回他の化学療法剤の有効性を試験するために使用することができた。治療的重要性により、パクリタキセル（タキソールとしても知られる）を使用することに決定した。
パクリタキセルは西洋イチイTaxus brevifoliaから単離され（Waniら, 1971）、進行した卵巣癌および乳癌に対して臨床的に活性であり（Rowniskyら, 1990; McGuireら, 1989）、現在他の様々な癌の処置のための臨床試験が進行中である。しかしながら、パクリタキセルに伴う大きな問題はそのきわめて高い親油性と、その結果、貧弱な水溶性である。この問題を解決するための努力がパクリタキセルの同族体およびプロドラッグの合成を導き、また同時に安全かつ生物学的適合性のある処方を組み立てる努力が払われている。これまで、臨床的な開発が保証される十分な安定性、溶解性または活性を示したプロドラッグはない（Mathewら, 1992; Vyasら, 1991）。しかしながら、半合成タキサンはパクリタキセルより高い溶解性および効力を示していて（Basseryら, 1991）、Taxotereからの１種はヒト試験に入っている（Bissetら, 1993）。
【００７４】
静脈内送達に用いられるパクリタキセルの現時点での臨床用処方は、薬剤6 mg/ml とともにエタノールとCremophor EL の1:1 (v/v) 比を使用している。Cremophor ELは実際にポリエトキシ化ヒマシ油であり、澄明な、油状の粘稠な黄色の界面活性剤である。安定性試験では最初の処方は４℃において５年の貯蔵寿命を有することが示されている。プレパレーションは使用前に0.9％食塩水または５％デキストロースで0.3〜1.2 mg/ml に希釈し、これらの条件下でのこの物質の物理学的および化学的安定性は約27時間である。しかしながら、ビヒクルのこれらのレベルへの希釈は過飽和溶液を生じ（Adamsら, 1993）、確立された指針外で使用すると、沈殿を生じる傾向がある。したがって、粒子の注入に対する安全手段として投与時に並列フィルターが要求される。希釈したパクリタキセル溶液はまた、製造から24時間以内に使用することが薦められている。上記溶液の曇りも認められ、これには輸液バッグおよびチューブからCremophorによる可塑剤の抽出に原因が帰せられている（Waughら, 1991）。
前述の物理学的不安定性に加えて、Cremophorの最も重要な問題は、それが薬理学的作用をもつと報告されていることである。様々な薬物がシクロスポリン、タクロリムスおよびテニポシドを含めて、Cremophor ELを用いて投与されている。しかしながら、パクリタキセルとともに投与されるCremophor ELの用量は他の市販薬剤と用いられる量よりも多い。Cremophorは重篤なまたは致命的な過敏性相を引き起こすことが観察されている。ビヒクルの毒性もまた、動物またはヒトへのパクリタキセルの急速な輸液に際して観察される致命的なまたは生命に危険があるアナフィラキシー反応の大きな原因になる可能性がある（Dye & Watkins, 1980; Lorenzら, 1977; Weissら, 1990）。
【００７５】
パクリタキセルの保存溶液を調製し、個々の注射液は、個々のマウスの体重に従って調製される。
【００７６】
乾燥したHA（モデルMr 8.9×105 kDa）を少量ずつ24.5 mg/ml のパクリタキセル保存溶液に加え、一夜ボルテックス攪拌して溶解し、最終濃度21 mg/ml とする。滅菌製を保証するため、ゲンタマイシンを濃度50μg/ml に加え、一夜４℃でインキュベートする。ついで[3H]パクリタキセルを添加したのち、HA／パクリタキセル保存混合物を注射用等級の食塩で注射用濃度に希釈する。注射はマウスの体重により、50μl 中パクリタキセル 15 mg/kg およびHA 12.5 mg/kg が送達されるように個々に注射する。生体内に注射したこの量のHAによれば、実験期間中飽和キネティックスが観察された（Fraserら, 1983）。
【００７７】
パクリタキセル／HA 注射用混合物の調製時にHA がその分子量が保持されていることを保証するために、注射用溶液を、カラム特性1.6 cm×70 cm, サンプルサイズ 2 ml, 流速18 ml/時および分画サイズ2 ml でSephacryl S-100サイズ排除ゲル（Pharmacia, Uppsala, Sweden）上で分析する。図４は、混合操作時にHAがその分子量を維持したことを示している。
【００７８】
マウスは各群40匹の動物を2群に無作為に分割する。群１にはパクリタキセルのみを投与し、群２にはパクリタキセル／HAの併用治療を行う。動物は個別に注射ボックスに収容し、注射は尾静脈に行う。各注射液中に、トリチル化パクリタキセル（注射された平均崩壊度／分（dpm）±平均の標準誤差（SEM）：19,159.146±1,336,819）が送達される。マウスは尿を収集できるように、柔らかい非湿潤性のプラスチック製の檻に個別に収容する。注射後30分、1時間、2時間、4時間または8時間に、マウスをネンブタール（Glaxo, Australia Pty. Ltd., Melbourne, Australia）0.1 ml の腹腔内注射によって麻酔し、注射針およびシリンジを用いて心臓または大動脈から血液を採集する。血液収集後、動物は頚椎脱臼によって屠殺する。
【００７９】
血液をEDTA-被覆ガラス試験管に取り、14,000 gav で10分間遠心分離して血漿を調製する。100μl の30％v/v 過酸化水素で脱色し、3 ml のHiSafeII シンチラントを加えたのち、50μl のアリコート中で放射能をカウントする。ケミおよびフォトルミネセンスを克服するためサンプルはWallac 1410 β-カウンター中、サンプルのソースに依存して、3, 7または20 d期にわたってカウントする。カウンティングの間の期間にはサンプルは室温で暗所に保存する。すべての計算はすべてのケミおよびフォトルミネセンスを除いた安定化サンプルについて実施する。
【００８０】
血漿中の注射パクリタキセルの百分率を計算するためには、標準式：
マウス体重（g）×マウス血液容量（0.07）×血液の血漿部分（0.59）
を用いて各マウスの総血漿容量（ml）を計算することが必要である。ついで、血漿中の注射パクリタキセルの百分率は
血漿容量（ml）×血漿dpm/ml×100／総注射dpm
=血漿中％注射パクリタキセル
によって計算する。
【００８１】
血流中に送達されたパクリタキセルの量の正確な割合を保証するため尾静脈の注射部位を切り取り、パクリタキセルを定量する。注射部位に残った注射パクリタキセルの平均百分率も測定される。血流に送達されたパクリタキセルの量（組織および腫瘍に分布可能なパクリタキセル）は次のように計算される。
血流に送達されたパクリタキセルの量（dpm）=
注射シリンジの重量差（mg）×注射物質のDpm/mg−注射部位に残ったDpm
血流に送達されたパクリタキセルは以下「注射用量」と呼ぶ。
【００８２】
サンプル集団間の正確な比較を可能にし、臓器および腫瘍塊中のわずかな変動を正規化するために、生体臓器および腫瘍ならびに体液中のパクリタキセル濃度は組織グラム数あたりの注射用量の％として表示する。
【００８３】
注射部位に残った注射パクリタキセルの平均百分率を計算する。このような変動を正規化するため、腫瘍および組織に見出されたdpmを注射dpm−注射部位に残ったdpmの百分率として計算する。この量は以下利用可能なdpmまたは利用可能パクリタキセルと呼ぶことにする。
【００８４】
可能な尿は非湿潤性プラスチック製の檻からシリンジおよび注射針で収集する。尿は14,000 gavで10分間遠心分離して澄明化する。その放射能カウントは8〜30μlの範囲のサンプルに3 ml のHiSafeII シンチラントを加えたのち測定する。
【００８５】
マウスの屠殺後直ちに、腫瘍、肝臓、心臓、脾臓、膀胱、左および右腎臓、子宮、肺臓、胃、腸、脳およびリンパ節を摘出し、総放射能を分析する。各組織の総放射能は100〜400 mg の組織を3〜6 ml のOptiSolv（ACC, Melbourne, Australia）中に22℃で36時間可溶化して測定する。可溶化の完了時に、組織中の放射能は10 ml のHiSafeII シンチラントを加えたのちカウントする。この場合も、ケミおよびフォトルミネセンスを克服するため、サンプルはWallac 1410 β-カウンター中、サンプルのソースに依存して、3, 7または20 d期にわたって2分間カウントする。カウンティングの間の期間には、サンプルは室温で暗所に保存する。すべて計算はすべてのケミおよびフォトルミネセンスを除いた安定化サンプルについて実施する。
【００８６】
実施例４ 5-フルオロウラシルおよびHA導入の使用
5-フルオロウラシル（5-FU）は乳癌および胃腸管の癌の処置に一般に用いられている抗代謝剤である（Piper & Fox, 1982）。5-FUは、それがDNAおよびRNA両者の合成を妨害する細胞内においてその活性ヌクレオチド型に変換される。この薬物はインビボにおいて２つの機構を介して機能する。
（i）FdUMPはチミジル酸シンターゼに強固に結合し、DNAの合成に要求される４種のデオキシリボヌクレオチドの１つである、デオキシチミジントリホスフェート（dTTP）の必須な前駆体であるチミジル酸の形成を妨害する。この阻害によって創成されたチミジンのない状態は能動的に分割している細胞に毒性である（Pinedo & Peters, 1988）。
（ii）5-FUが機能する第二の方法は、FUTPのRNAへの導入がRNA機能を妨害することである。Fdurdおよび5-FUによって引き起こされるチミジル酸シンターゼの阻害は細胞に対して細胞傷害性作用を引き起こすことができる。5-FUの濃度および暴露の持続の両者が細胞傷害性の重要な決定因子である。RNAに向けられた作用が暴露の長期間持続で優先されるので、DNAに向けられた作用が多分、S相における細胞の短期間暴露時にさらに重要であろうと考えられる。
【００８７】
幾つかの試験が抗癌剤の薬物送達システムとしてのHAの使用を検討している。Coradiniら（1999）は、HA／酪酸ナトリウム配合物がインビトロにおいて乳癌細胞による取り込みを増大させるか否かを決定するために、酪酸ナトリウムをHAに共有結合により結合させた。この研究は薬物送達ビヒクルとしてのHAの作用機構がHA-酪酸エステル誘導体のCD44受容体への輸送に関与する可能性を指示した。HA／薬物複合体はインターナライズされ、ついでHA／薬物複合体は細胞質で加水分解を受け、ついで酪酸塩が放出され、これが抗増殖作用を発揮した。１つのインビボ試験が、マウスルイス肺異種移植の処置方法としてHAに共有結合で連結されたマイトマイシンCを用いて行われた（Akimaら, 1996）。HA-MMC複合体は、単独の薬物マイトマイシンCが抗腫瘍活性を示さなかった0.01 mg/kg の低用量で抗腫瘍活性を生じることが見出された。
【００８８】
例５ ヒト乳癌細胞中の５−ＦＵとＨＡの相乗作用の研究
ＨＡ結合親和性（クルティ（Culty）ら、１９９４）とＣＤ４４およびＲＨＡＭＭのＨＡ受容体の発現（ワング（Wang）ら、１９９６）に基づき、ヒト乳腺癌株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１を選択した。細胞株の特徴の要約を表３に示す。
【００８９】
【表３】
【００９０】
細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、例１に記載のようにルーチンに培養した。
【００９１】
０nM ５−ＦＵ＋１００nmのＨＡを含有する培地で増殖させた乳癌細胞は、未処理細胞と比較した時、統計的に有意な増殖作用または細胞障害作用を示さないことが、表４から明らかである。
【００９２】
【表４】
【００９３】
従って、すべての結果を、０nM ５−ＦＵ／０nM ＨＡ細胞数のパーセントとして表した。細胞株の間で増殖パターンの明確な差が認められ、例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は、塗布効率が悪く、試験培地を適用する前に多くの浮遊細胞が存在した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞株は、高塗布効率を示し、非常に速い増殖速度を示した。
【００９４】
ＨＡを５−ＦＵと一緒にすると、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞株で相乗的細胞障害作用が観察されたが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１やＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞株では観察されなかった。これを、図１１に示す。５−ＦＵ単独のＩＣ50は＞５０μｍであったが、ＨＡと一緒にすると、ＩＣ50は４０nMであり、薬物投与量は１２５０倍まで低下した。
【００９５】
インビトロ実験の結果は、ＨＡの存在下で乳癌細胞に５−ＦＵを適用すると、細胞死滅が増加することを示した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は、５−ＦＵ／ＨＡ治療法に対する最大の感受性を示し、ＩＣ50は＞５０μＭから４０nMに低下し、一方ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とＭＤＡ−ＭＢ−４３５は、５−ＦＵ／ＨＡ組合せにより大きく影響を受けなかった。クルティ（Culty）ら、１９９４により測定すると、乳癌細胞株はすべて、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（６０〜８０％）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（４０〜６０％）およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５（４０〜６０％）で高レベルのＣＤ４４受容体を発現した。これらの実験で使用される３つの細胞株は、ＨＡを分解することができ、腫瘍細胞中のＣＤ４４の機能は、ＨＡの分解の仲介であることを示している（クルティ（Culty）ら、１９９４）。
【００９６】
考慮すべき他の要因は、化学療法剤への細胞の以前の暴露である。患者から癌細胞株を単離する前に、癌患者はしばしば化学療法または放射線照射を受け、これが治療耐性細胞を含有する腫瘍を生成することがある。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５とＭＤＡ−ＭＢ−２３１の場合は、細胞株が得られた患者は、すでに５−ＦＵに暴露されていた（カイロー（Cailleau）、１９７４）。癌細胞は、薬物の細胞障害性を克服するいくつかの適応機構を有するため、治療後に残存した腫瘍塊が５−ＦＵに耐性であり、従ってインビトロで薬物に対する細胞の感受性を変化させている可能性が高い。
【００９７】
マウスで得られたインビボのデータをヒトへの治療に外挿することを目的として、実験モデルと計画を注意深く開発した。ヒトの乳癌異種移植片に対するインビボターゲティングと５−ＦＵ／ＨＡ補助（アジュバント）療法の治療効果を決定的に証明するために、以下の要因を試験した：
【００９８】
異質遺伝子型の細胞に対する免疫反応を避ける研究で充分受容されているモデルであるヌードマウスの、充分証明されたウォルターアンドエリザホールインスティテュート（Walter And Eliza Hall Institute）株で、ヒト乳癌を樹立した。
【００９９】
ヌードマウスとヒトについてすでに公表されている（イナバ（Inaba）ら、１９８８）５−ＦＵの薬物動力学についての比較データを、この研究の計画で使用して、ヒトの治療投与量をできるだけ厳密にシミュレートした。
【０１００】
大きな目的は、これらのマウスで樹立した腫瘍の組織学的および細胞学的挙動が、それらの天然のヒト宿主においてかかる腫瘍のそのような挙動に匹敵するかどうかの実証であった。この目的の達成の過程で我々は、マウス中の腫瘍細胞がヒト起源であり、これらはＲＨＡＭＭやＣＤ４４のような高度に関連するＨＡ受容体を発現することも証明した。
【０１０１】
例６ ＨＡと５−ＦＵ溶液の調製
乾燥したＨＡ（モードＭr ７×１０5ｋＤａ）を０．９％w/v発熱性物質不含注射用等級のＮａＣｌに溶解して、ＨＡストック溶液（１０μＭ、７mg/ml）を調製した。均一な溶解を確実にするために、ＨＡを４℃で一晩溶解し、次に完全にボルテックス混合した。ストック溶液の調製中にＨＡがその分子量を維持したことを確認するために、溶液をセファクリルＳ−１０００サイズ排除ゲル（カラムの規格、１．６×７０cm、試料サイズ２ml、流速１８ml/時間および２mlの画分サイズ）で分析した。ＨＡは最終濃度１００nMで使用し、すべての希釈は適当な増殖培地中で行った。
【０１０２】
５−ＦＵのストック溶液は、５−ＦＵを０．１Ｍ 水酸化ナトリウムに溶解し、０．９％w/vの発熱性物質不含注射用等級のＮａＣｌで濃度を２０mg/mlとして調製した。このストック溶液を０．２２μｍフィルターでろ過して無菌にしてから、［3Ｈ］−ＦＵを加え、注射用等級のＮａＣｌで注射濃度に希釈した。５０μｌ中３０mg/kgの５−ＦＵを投与（平均体重６０kgのヒトへの治療投与量１０．５mg/kgに等しい；イナバ（Inaba）ら、１９８８）する目的で、各マウスの体重に応じて各注射物を調製した。発熱性物質不含ＨＡストック溶液（１０mg/ml；モードＭr ７×１０5ｋＤａ）を２０mg/ml ５−ＦＵストック溶液の一部に加え、ボルテックス混合しながら一晩攪拌し、ＨＡの最終濃度を１２．５mg/kgマウス体重と等しくさせた。５０μｌ中３０mg/kgの５−ＦＵと１２．５mg/kgのＨＡを投与するために、マウスの体重に従って注射物を個々に調製した。この量のＨＡを体内に注射すると、実験期間について飽和動力学が観察されるであろう（フレーザー（fraser）ら、１９８３）。ＨＡが、注射混合物の調製の間その分子量を維持したことを確認するために、注射溶液をカラムの規格が１．６cm×７０cmのセファクリルＳ−１０００サイズ排除ゲルで、流速１８ml／時間と２mlの画分サイズで分析した。ウロン酸測定により、カラム画分中のヒアルロナンを検出した。
【０１０３】
ウロン酸測定を使用して、ゲルろ過クロマトグラフィー法で採取した画分からヒアルロナンの存在を定量的に検出した。次に２５μｌのアリコートの各画分を９６ウェルプレートに移した。次に２５０μｌのカルバゾール試薬（硫酸中３Ｍカルバゾール／０．０２５Ｍホウ酸）を、これらの溶液に加えた。９６ウェルプレートを８０℃で４５〜６０分インキュベートした。５５０nmのフィルターのついたダイナテク（Dynatech）ＭＲ７０００プレートリーダーを使用して、９６ウェルプレートを読んだ。吸光度がバックグランド吸光度より＞３標準偏差の時、有意であると見なした。バックグランドは、ＶoとＶtの前後の試料点と等しい数（平均数は１６であった）を取って計算した（フレーザー（fraser）ら、１９８８）。
【０１０４】
ＨＡと５−ＦＵに調製物（０．５％ ＮａＣｌ（ｐＨ８．９）中１０mg/mlのＨＡと２０mg/mlの５−ＦＵ）は、ＨＡの分子量に対して分解作用を示さなかった。サイズ排除ゲル中のクロマトグラフィー分析は、モード分子量７００，０００Daを示した。
【０１０５】
例７ 薬物細胞障害性測定法：実験計画
インビトロでの薬物力価測定実験を計画するには、静脈内投与後に血漿中で到達する濃度に似た薬物濃度を適用することが好ましい。５−ＦＵを静脈内経路（ｉｖ）で１０．５mg/kg（４００mg/m2）で治療的に投与すると、３０分以内のピーク血漿レベルは８μg/mlである（６μＭ、クボ（Kubo）、１９９０）。これらのインビボの血漿濃度に基づき、以下の薬物濃度を選択した：０、１、５、１０、２０、５０、１００μＭ ５−ＦＵ＋１００nM ＨＡ。細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５を、例４〜５で上記したように増殖させた。培養物がコンフルエンスに達した時、フラスコから細胞を０．２５％トリプシン／０．０５％ ＥＤＴＡ中に取った。単一細胞懸濁物を、コールター（Coulter）カウンター（ＺＭ１モデル）で計測し、細胞を細胞特異的培地に１００，０００細胞／mlで再懸濁した。ウェル当たり０．５mlの細胞懸濁液を加えて細胞を２４ウェルプレート（表面積２cm2）に広げて、５０，０００細胞／ウェルを得た。培養物を２４時間付着させ、次に培地を除去し、単層をＨＢＳＳで洗浄し、試験培地（５−ＦＵ＋ＨＡ）を適用した。試験培地中で４日間増殖後、培養物をＨＢＳＳで洗浄し、細胞を０．２５％トリプシン／０．０５％ ＥＤＴＡでトリプシン処理して、ウェルから除き、細胞をコールター（Coulter）カウンターで計測した。
【０１０６】
例８ 薬物送達および腫瘍ターゲティング（標的化）ビヒクルとしてのＨＡの評価
例５〜７に記載のインビトロの薬物感受性実験、およびＣＤ４４とＲＨＡＭＭのＨＡ受容体の発現の結果に基づいて、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８を、ヌードマウスヒト腫瘍異種移植片の作成のための癌細胞接種物として選択した。細胞をルーチン法で増殖させ、例５で上記したように継代した。マウスへの注射のために、細胞を１００％コンフルエンスになるまで増殖させ、０．２５％トリプシン／０．０１％ ＥＤＴＡ溶液でトリプシン処理して、ベックマン（Beckman）ＴＪ−６ベンチ遠心分離で４００ｇavで１０分間２回遠心分離して洗浄し、モデル−ＺＭコールター（Coulter）カウンターを使用して計測し、無血清レイボビッツ（Leibovitz）Ｌ−１５培地に１×１０8細胞／mlで再懸濁した。
【０１０７】
メスの無胸腺ＣＢＡ／ＷＥＨＩヌードマウス（６〜８週令）を、特定病原体未感染の条件下で維持し、無菌の食料と水は自由に与えた。各マウスに、５×１０6細胞／５０μｌを含有する注射を１回行った。第１乳首のすぐ下の乳房脂肪体中に、２６ゲージ針を使用して細胞を注入した（ラムスズス（Lamszus）ら、１９９７）。腫瘍の測定は、直角の３つの直径（ｄ1ｄ2ｄ3）を毎週測定して行った。腫瘍容量は、以下の式を使用して推定した：
（１／６）π（ｄ1ｄ2ｄ3）
【０１０８】
癌細胞接種の約４〜８週後に、５−ＦＵ±ＨＡによる処理を開始した。各試験で使用したマウスの平均腫瘍サイズを表５に要約する。
【０１０９】
【表５】
【０１１０】
乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８の腫瘍原性と、適当な動物宿主に注入した時腫瘍を生成させる能力を確立するために、病理試験をする必要があった。腫瘍が生理学的に活性があるためには、新血管新生（毛細管ネットワークが腫瘍に栄養物質を供給する）が必須である。血管新生、導管性浸潤、壊死、アポトーシス、高い分裂指数、および核異常の存在は、すべて乳癌に特徴的である。ヘマトキシリンとエオシン染色した乳癌切片を観察すると、これらのすべての特徴が証明され、この動物宿主が悪性度IIのヒト乳癌をうまく維持したことを確証している。
【０１１１】
腫瘍誘導の約８週間後、２匹の担癌マウスに致死量のネンブタールを与えた。マウスの死亡の３分以内に、腫瘍を外科的に取り出し、直ちに１０％緩衝化ホルマリン中で１２時間固定した。固定した腫瘍を、一連の７０〜１００％のエタノールで一晩脱水し、次にパラフィンに包埋し、そこから２〜４μｍ切片を切った。切片をスライド上に置き、パラフィンを除き、水にした。スライドをＰＢＳ中で３×５分洗浄した。異種親和性のタンパク質を、１０％胎児牛血清で１０分間インキュベートしてブロックし、次にＰＢＳで洗浄した。室温で６０分検出抗体を適用した。検出抗血清または抗体は、ＲＨＡＭＭ、ＣＤ４４ＨおよびＣＡＥに対するものであった。スライドをＰＢＳで３×５分洗浄し、メタノール中の０．３％の過酸化水素に２０分浸漬して内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。さらにＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ結合ブタ抗ウサギ２次抗血清を室温で６０分適用し、ＰＢＳで３×５分洗浄した。シグマファスト（Sigma Fast）３，３’−ジアミノベンジジン錠剤（ダブ（ＤＡＢ））を、製造業者の説明書に従って調製し、ＤＡＢ溶液を室温で５〜１０分適用した。スライドを水道水で１０分洗浄し、ヘマトキシリンで対染色し、脱水し、マウントした。
【０１１２】
腫瘍と周りの組織をヒト特異的癌マーカーで染色することにより、腫瘍がヒト起源であることを確認した。ＣＥＡの存在は、腫瘍がヒト由来であることを明確に証明し、一方マウス宿主の心血管系により維持された。腫瘍ターゲティングは受容体介在内在化または結合を介して起きると仮定したため、ＨＡ受容体、ＣＤ４４およびＲＨＡＭＭの発現を確立する必要があった。表６は、ヒト乳癌異種移植片上の受容体の発現程度のリストを示す。
【０１１３】
【表６】
【０１１４】
例９ ヌードマウスモデル中の５−ＦＵとＨＡの使用
マウスをランダムに、２５匹の２群に分けた。第１群には、［3Ｈ］５−ＦＵのみを、第２群には［3Ｈ］５−ＦＵ／ＨＡの組合せを投与した。注射の前後に注射シリンジの重さを測定して、尾静脈への処理は定量的に行った。３０mg/kgの５−ＦＵ±１２．５mg/kgのＨＡ内に含有されるトリチウム化５−ＦＵ（平均注入ｄｐｍ±ＳＥＭ；３１，３３３，００２±１３１，３４８）を、各注射で投与した。
【０１１５】
血流中に送達される［3Ｈ］５−ＦＵの量を正確に定量するために、尾静脈上の注射部位を切開し、その［3Ｈ］５−ＦＵ含量を測定した。血流中に送達された５−ＦＵの量（組織や腫瘍に分配されることができる５−ＦＵ）は、以下のように計算した：
（血流に送達された５−ＦＵの量）（dpm）＝（注射シリンジの重さの差）（mg）×（注射物質のdpm/mg）−（注射部位に残存するdpm）
【０１１６】
血流に送達された５−ＦＵの量を、「注射投与量」と呼ぶ。
【０１１７】
試料集団間を正確に評価し、臓器や腫瘍の重さの小さな変動を標準化するために、体内の臓器や腫瘍および体液中の５−ＦＵの濃度を、注射投与量／グラム組織の％として表した。
【０１１８】
尿が集められるように、柔らかい湿ったプラスチックの囲いにマウスを１匹ずつ入れた。注射の１０分、２０分、３０分、１時間または２時間後に、０．１mlネンブタールを腹腔内投与してマウスを麻酔した。
【０１１９】
マウスを麻酔して、針とシリンジを使用して心臓または大血管から血液を採取した。血液をＥＤＴＡガラス管に取り、１４，０００gavで１０分遠心分離して血漿を調製した。過酸化水素（３０％v/v）１００μｌで脱色し、３mlのハイセーフII（HiSaveII）シンチレーション液を加えて、放射活性を測定した。化学ルミネセンスと光ルミネセンスを抑えるために、試料の起源に従って３、７または２０ｄ期間にわたって、試料をワラック（Wallac）１４１０β−カウンターで２分間計測した。計測の間、試料は暗所で周囲温度で保存した。すべての計算は、すべての化学ルミネセンスと光ルミネセンスが消失した安定化した試料について行った。血漿中の注入された５−ＦＵの割合を決定するために、各マウスの総血漿量（ml）を計算する必要があった。標準的式は以下の通りである：
（マウスの重さ（ｇ））×マウス血液量（０．０７）×血液の血漿の比（０．５９）1
【０１２０】
血漿中の注入した５−ＦＵの割合は、以下から計算した：
（血漿容量（ml）×dpm/ml血漿×１００）／（注入した総dpm）
【０１２１】
可能な場合は、シリンジと針を有する非湿潤プラスチックの囲いから尿を採取した。１４，０００gavで１０分間遠心分離して、尿を清澄化した。８〜３０μｌの試料に３mlのハイセーフII（HiSaveII）シンチレーション液を加えて、放射活性を測定した。各マウスの出す尿量を正確に定量することの技術的困難さがあり、尿中の注入した５−ＦＵ投与量の％を、以下の式により計算した：
（採取時間（ｈ）×４２μｌ1×dpm／μｌ尿×１００）／（注入した総dpm）
【０１２２】
いったん血液を採取後、マウスを頚部脱臼により殺した。マウスの死亡直後に、腫瘍、肝臓、心臓、脾臓、膀胱、左腎臓、右腎臓、子宮、肺、胃、小腸、脳およびリンパ節を切りだし、総放射活性を分析した。組織当たりの総放射活性を測定した。１００〜４００mgの組織を３〜６ml中に２２℃で３６時間可溶化して、組織当たりの総放射活性を測定した。可溶化の終了後、１０mlのハイセーフII（HiSaveII)シンチレーション液を加えて組織を測定した。化学ルミネセンスを避けるために、上記したように試料を計測した。
【０１２３】
図１２に示すように、ＨＡを５−ＦＵと組合せると大きなターゲティング作用があった。薬物の腫瘍保持の最も大きな相対的上昇は１０分で観察され、ここでＨＡは薬物取り込みを２．４２倍増加させた（ｐ＝０．００１、スチューデントｔ検定）。ＨＡ／５−ＦＵ投与の２０分と３０分後、５−ＦＵの腫瘍取り込みの統計的に有意な上昇も認められ、薬物取り込みの上昇はそれぞれ１．５倍と２倍であった（ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）。他の時点は、単独投与の５−ＦＵとＨＡとの同時注入とで統計的に有意な差は示さなかった。
【０１２４】
肝臓、脾臓、および腎臓のような代謝臓器が高レベルの薬物ターゲティング（これは、腫瘍ターゲティングの上昇の陽性面に逆作用する）を受けないことを確立することは重要であった。表７は、試験した種々の時点での各組織の［3Ｈ］５−ＦＵ取り込みのリストを示す。
【０１２５】
【表７】
【０１２６】
図１３は、ＨＡの主要な代謝臓器が肝臓、リンパ節、および脾臓であり、５−ＦＵが肝臓中で広範に代謝されることを示す。
【０１２７】
５−ＦＵがＨＡとともに注入されると、これらの臓器は５−ＦＵ取り込みの有意な増加を示す。しかし腎臓は、ＨＡとの投与後に１０分で５−ＦＵターゲティングの有意な上昇（１．８倍、ｐ＝０．００４）を示した。この時点後、統計的に有意ではないが、サンプリング期間の最後まで、薬物取り込みの上昇の傾向は続いた。
【０１２８】
膀胱、小腸および骨髄は、５−ＦＵの取り込みの上昇を示さなかった。子宮のような組織では、１０分で薬物取り込みの短時間の上昇があった（１．８倍、ｐ＝０．０３２）が、他の時点では差は示されず、従ってこの観察の有意性は不明である。
【０１２９】
胃、脳および肺は、１つまたは２つのサンプリング時点で５−ＦＵ取り込みの上昇を示した。しかし各時点の動物の数が少ない（ｎ＝５）ため、統計的有意性を支持することができなかったが、図１４Ａ〜Ｃに示すように明確な傾向が観察された。
【０１３０】
後の１時間と２時間のサンプリング時点で、心臓５−ＦＵの有意な低下が認められ、ＨＡとの同時投与により、それぞれ５９％（ｐ＝０．００３）と５３％（ｐ＝０．０２１）低下した。
【０１３１】
排尿速度の変動のために、各マウスから尿を採取することができなかった。従って統計的な解析をするには不充分な尿が採取された。
【０１３２】
５−ＦＵをＨＡと同時注入すると、５−ＦＵの循環レベルが早期に低下した（表７）。ヒアルロナンは血漿５−ＦＵを５５％（ｐ＝０．００１）低下させた。図１５に示すように５−ＦＵ／ＨＡを投与されたマウスでは、薬物動態血漿半減期は２８分から５６分に変化した。
【０１３３】
例１０ マウスへの治療投与処方
ヒト乳癌の最も一般的な治療処方は、２８日間のサイクルの１日目と８日目に投与されるシクロホスファミド、メソトレキセート、および５−フルオロウラシルである。ヒト乳癌では、初期の治療処方は６サイクルであり、この時点で患者の状態が再評価され、従って我々は、マウスを長期薬効試験で６サイクル（６ヶ月）と短期薬効試験で６サイクル（６週）に伏して、ヒトの治療処方をできるだけシミュレートするようにした。マウスの生活史が２年であることを考慮して、我々は表８に示すように短期と長期の治療プロトコールを開始した。
【０１３４】
【表８】
【０１３５】
マウスを、短期試験では各群８匹の７群と、長期試験では８匹の５群に分けた（投与量と治療投与スケジュールについては表８を参照されたい）。
【０１３６】
化学療法を６ヶ月以上続けても一般的には利点はないため（ハリス（Harris）ら、１９９２）、治療は６ヶ月を超えることはしなかった。
【０１３７】
例８に記載のように長期試験の治療適用日に、マウスの体重と腫瘍容量を測定した。６週間の試験中毎日、マウスの体重と腫瘍容量を測定した。マウスを１匹ずつ注射ボックスに入れ、尾静脈から注射をした。化学療法に対する患者の応答で、ストレスは大きな因子であることが実験的に証明されており（シャックネイ（Shackney）ら、１９７８）、従って我々は、等しい数のマウスを各ケージに入れ、ケージ当たりのマウスの数は、実験の段階に依存して５〜８匹で変動させた。
【０１３８】
疾患の進行のために安楽死が必要となった時、または６ヶ月（長期）もしくは６週間（短期）の治療処方が完了した時を、実験の終点とした。動物倫理指針により、疾患の進行の程度を評価する独立の係員がマウスを２週間ごとに観察した。図１６に示すように、以下の基準を使用して、マウスが、死亡させるべき実験の終点に達したかどうかを決定した：
【０１３９】
１）マウスが飲食をせず、体重が大きく低下した；
２）腫瘍のサイズが体重の１０％より大きかった（パネルＡ）；
３）腫瘍の塊が大きいため、マウスが動けなかった（パネルＢ）；
【０１４０】
実験の終点で、０．１mlのネンブタール（６０mg/ml）を腹腔内投与注入してマウスを麻酔し、頚部脱臼によりマウスを死亡させた後、血液を採取した。
【０１４１】
６週間の試験後に、腫瘍の大きさを測定すると、図１７に示すように５−ＦＵと５−ＦＵ／ＨＡ治療の両方とも、食塩水群より有意に小さい腫瘍を示した（ｐ＝０．００５）。５−ＦＵ処理群と５−ＦＵ／ＨＡ処理群との間に、腫瘍容量に有意な差はなく、両方の治療法が一次（原発性）腫瘍に対して同等の効力を示すことを示している。食塩水とＨＡの一次腫瘍容量の間には統計的差はなかった。
【０１４２】
マウスを死亡させた直後に、腫瘍、肝臓、心臓、脾臓、膀胱、左の腎臓、右の腎臓、子宮、肺、胃、小腸、脳およびリンパ節を切りだし、０．０６Ｍリン酸（ｐＨ７．５）と塩化セチルピリジニウム（１．０％v/v）で緩衝化した４％ホルマリンに入れた。組織を１６〜２４時間固定してから、組織学的処理を行った。固定した組織を段階的に１００％エタノールまで脱水し、パラフィンブロックに包埋し、そこからの２〜４μｍの切片をガラス顕微鏡スライド上に置いた。ヘマトキシリン核染色とエオシン細胞質染色により組織切片を染色すると、処理の毒性を示す病理的特徴が強調された。
【０１４３】
マウス１匹につき９〜１１個のリンパ節を採取し、腫瘍領域を排水したすべての節が採取できるようにした。リンパ節の転移の検出には現在２つの方法が使用されている。
【０１４４】
ｉ）大きい臓器構造のルーチンのヘマトキシリンとエオシン染色
ii）癌胎児性抗原のような癌マーカーを使用する免疫組織化学
【０１４５】
転移検出の両方の方法が本試験では使用される。すべての市販のＣＥＡ抗体がヒト乳癌細胞と反応するわけではなく、従って我々は、５つの異なる抗体（ダコ（DAKO）、アマシャム（Amersham）、およびケーピーエル（ＫＰＬ））の反応性を試験した。
【０１４６】
ヘマトキシリンとエオシン染色リンパ節は、ピー・アレン（P. Allen）博士（認定病理学者）が観察し、各節を、腫瘍細胞の存在について顕微鏡で観察した。ＣＥＡ免疫染色リンパ節を顕微鏡で観察し、陽性に染色された節を数え、リンパ節転移が陽性であると見なした。
【０１４７】
腫瘍容量は、毛管測定により毎日または毎週モニターし、腫瘍容量は上記例８に記載のように計算した。
【０１４８】
５−ＦＵの最も一般的な毒性作用は、胃腸管に対してであり、出血性腸炎や小腸穿孔が起きる（マーチンデール（Martindale）、１９９３）。消化管異常（例えば、下痢）についてマウスを毎日モニターし、より重症の毒性症状（例えば、体重減少）について毎週モニターした。体重減少は、腫瘍の重さを引いて求めた真の体重を計算してモニターし、これはシバモト（Shibamoto）ら、１９９６で引用された１ｇ×腫瘍容量（cm3）として計算した。体重変化の証明のために、
［（体重（腫瘍以外）−治療の開始時の体重（腫瘍以外）］×１００／（治療の開始時の体重（腫瘍以外））
により、マウスの体重を、治療の開始時に体重に対して標準化した。
【０１４９】
治療処方にかかわらず、下痢のような毎日の消化管異常は認められなかった。体重減少（腫瘍の重さを除く）を指標として使用して、各治療処方について純粋の消化管毒性を予測した。各マウスの死亡時に、体重の変化パーセントを既に記載されているように計算した。５−ＦＵ／ＨＡ群治療群と比較すると食塩水群、ＨＡ群、５−ＦＵ治療群では、標準化した体重に統計的に有意な差があった（図１８）。５−ＦＵ／ＨＡ補助（アジュバント）療法を受けたマウスは、未治療群（これは、体重の真の増加は２％であった）と比較して治療の間に、１６％の体重増加を示した（スチューデントｔ検定、ｐ＝０．０２５）。
【０１５０】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の免疫組織化学検出を古典的な診断的病理学と組合せると、リンパ節転移の優れた定量値を与えた。平均的なマウスは１５〜１９個のリンパ節を含有（ラムスズス（Lamszus）ら、１９９７）し、従ってこの試験では、約６０〜７０％のマウスのリンパ節を調べた。注意深く操作して、乳房の脂肪体と胸部領域を排水させたすべての節を取り出し調べた。表９Ａに示すように、すべてのマウスはリンパ節の転移を示した。
【０１５１】
【表９】
【０１５２】
図１９Ａは、リンパ節関与（マウス当たりの転移節の数）の割合が、５−ＦＵ、５−ＦＵ／ＨＡおよびＨＡ治療により大きく影響を受けることを示し、食塩水群は、リンパ節関与の量が６倍増加した。再度ＨＡは、治療的価値を有することを示した。
【０１５３】
試験の最後にマウスを解剖しながら、すべての組織を腫瘍結節について顕微鏡的かつ巨視的に観察した。ＨＡ／５−ＦＵまたはＨＡ治療を受けたマウスを除いて、新しい腫瘍が首の回りまたは原発性腫瘍に隣接する領域の脇の下部分に観察された。治療処方へのＨＡの取り込みは、図１９Ｂに示すように新しい腫瘍形成を阻害した。
【０１５４】
治療法にかかわらず、全体的な生存率には有意差は無く（表９Ａ）、すべての群が治療処方を完了した。
【０１５５】
５−ＦＵ治療に伴う大きな毒性は、骨髄の減少と以後の白血球の低下であるため、治療に関連する血液毒性を評価する必要があった。マウスを麻酔して、針とシリンジを使用して心臓または大きい血管から血液を採取した。マウス粘着性食塩水（Ｍ）中で血液の１／１０希釈を作成し、これを血球計算計で計測して、白血球数を推定した。好中球、リンパ球、および赤血球を数えて、血球分画を行った。血球細胞亜集団の合計は、マウス血液について公表されているデータと比較して推定した。
【０１５６】
治療により臓器萎縮や肥大が誘導されなかったことを確認するために、死後に臓器を取り出し重量を測定した。各臓器の重さは、真の全体重の％として計算し、食塩水のみの群の臓器の重さと比較した（第１群）。
【０１５７】
例１１ 長期治療：６ヶ月処方
この試験はまだ継続しているが、有意なデータが作成されている。
【０１５８】
ＴＤＴは、腫瘍の大きさまたは細胞数が２倍になるのに要した時間（日数）であり、測定が簡単であり、概念的に臨床的な腫瘍挙動に容易に関連付けられる腫瘍増殖のパラメータである（シャックネイ（Shackney）ら、１９７８）。腫瘍の倍加時間をモニターすることにより、腫瘍の化学療法応答を評価することがしばしば可能である（ゆっくり増殖する腫瘍は、化学療法に対する応答が悪いため）（シャベル（Schabel）ら、１９７５）。
【０１５９】
各治療の腫瘍倍加時間を表９Ｂに示す。
【０１６０】
【表１０】
【０１６１】
５−ＦＵ／ＨＡ治療と５−ＦＵ治療との間のＴＤＴには有意差はなかった。６週間試験と同様に、ＨＡの投与はまた、一次腫瘍に対して治療作用を示し、ＴＤＴは食塩水群の１３±４日に対して２６±１．７５日であった。５−ＦＵの２４時間のＨＡの投与は、腫瘍増殖の遅延に関して５−ＦＵの治療的価値に抵抗するようであった。
【０１６２】
腫瘍の大きさと容量は、腫瘍治療の応答と進行をモニターするのに有用なパラメータであるが、最終的には治療による細胞障害性作用を示さない。我々は、ＨＡ／５−ＦＵ治療がより多くの細胞を死滅させ細胞の位置を破壊したかどうかを確立しようとした。死滅している細胞は、病理的に以下の症状が現れる：
ｉ）核の分解（アポトーシス）
ii）細胞の溶解（壊死）
【０１６３】
全腫瘍画像をＭＣＩＤコンピューターにスキャンして、全腫瘍領域を計算すると、死滅する細胞の数が定量された。断片化した核を有する細胞または溶解細胞の輪郭を描き、スキャンし、次にこれらの領域をデジタル化し、死滅する細胞の正確な領域を計算した。死滅細胞に帰因する腫瘍のパーセントは、以下により計算される：
（アポトーシスと壊死細胞の面積×１００）／（全乳癌の面積）
【０１６４】
生きた細胞は、死滅中のまたは死滅した細胞より多くの水を有し、従って乾燥した腫瘍の大きさ対湿潤した腫瘍の大きさの比を計算することにより、生きた細胞対生きていない細胞の全面積を推定することができる。５０℃で４８時間乾燥の前後に腫瘍を二分し、半分を腫瘍の病理のために処理し、残りの半分の重さを測定した。湿潤した腫瘍塊のパーセントとして乾燥重量を以下により計算した：
（乾燥した腫瘍の重量×１００）／（湿性乳癌の重量）
【０１６５】
全体的患者生存時間は、治療の開始後にマウスが生きた時間（日数または週数）として計算した。
【０１６６】
各治療の腫瘍の倍加時間を表９Ａに示す。５−ＦＵ／ＨＡ治療と５−ＦＵ治療との間のＴＤＴには有意差はなかった。しかしＨＡの投与は、一次腫瘍に対して治療作用を示し、ＴＤＴは食塩水群より有意に大きかった（ｐ、０．０５、多重比較Tukey検定）。５−ＦＵ前のＨＡ２４の投与は、腫瘍増殖の遅延に関して５−ＦＵの治療的価値に抵抗するようであった。
【０１６７】
５−ＦＵの引用された治療率は２６％である（イナバ（Inaba）ら、１９８９）が、５−ＦＵを投与されたマウスは「治療」されなかった。ＨＡ／５−ＦＵを補助療法を受けた２匹のマウスは「治療」され、腫瘍は完全に壊死し、約１２週間の治療後に脱落した。図２０Ｂは、ＨＡとＨＡ／５−ＦＵで治療を受けたマウスの小さい痂皮の特徴的な出現を示し、図２０Ｃは、小さい面積の壊死の出現と以後の大きい面積の痂皮の形成を示す。このマウスのうちの１匹では、小さな結節が再増殖したが、第２のマウスは２２週でもまだ腫瘍がなかった。図２０Ａから明らかなように、５−ＦＵと食塩水を投与されたマウスは大きな腫瘍があり、このため最終的に腫瘍が大きいためマウスは死亡した（表９Ｂ）が、ＨＡ±５−ＦＵを投与されたマウスは、特徴的な腫瘍の出現を示し、小さな壊死の後に痂皮が生成した。
【０１６８】
第２２週に、５−ＦＵ／ＨＡマウスの３７．５％はまだ生きており、５−ＦＵ／ＨＡ補助療法のマウスの大きな死因は、体重減少と代謝性ストレスであった（表９Ｂ）。
【０１６９】
ヒト乳癌異種移植片を有するマウスにＨＡ±５−ＦＵを投与すると、全体の患者生存率には有意な差があるようである。２４週間の試験の第２２週に、生き残っている群は、図２１に示すように５−ＦＵ／ＨＡ群とＨＡ群のみであった。
【０１７０】
結論
５−ＦＵターゲティングからのデータは、５−ＦＵをＨＡとともに１０、２０および３０分にＨＡとともに注入すると、腫瘍による５−ＦＵ取り込みはそれぞれ２．４倍、１．５倍および２倍増加し、５−ＦＵ取り込みの統計的に有意な上昇があった（表７）。これは、５−ＦＵがＨＡにより腫瘍にターゲティングされていたことを示す。５−ＦＵの腫瘍細胞へのＨＡターゲティングには２つの可能な機序がある：
【０１７１】
関連５−ＦＵを含有するＨＡは受容体（ＣＤ４４）に結合し、受容体介在エンドサイトーシスを介して内在化され、こうして腫瘍細胞中に薬物を放出する。
【０１７２】
ＨＡ分子メッシュは外部への拡散の障害として作用し、その結果ＨＡが受容体（ＣＤ４４とＲＨＡＭＭ）に結合した後、同伴された５−ＦＵは、腫瘍細胞中に拡散することができる。ＨＡマトリックスにより細胞の表面に維持されるが、５−ＦＵは、通常は５−ＦＵが下の細胞に移行するのに使用される能動輸送機序の利用性が向上している。
【０１７３】
ＨＡの異化作用は、主にリンパ節（フレーザー（Fraser）ら、１９８８）と肝臓（ロウレン（Laurent）ら、１９８６）で起きる。ＨＡは通常、肝臓（８０〜９０％）、腎臓（１０％）、脾臓（０．１％）および骨髄（０．１％）で、受容体介在細胞取り込みと異化により血流から排除される（フレーザー（Fraser）ら、１９８３）。循環ＨＡは、肝内皮細胞（ＬＥＣ）受容体（エリクソン（Eriksson）ら、１９８３）とも呼ばれる代謝性受容体により取り込まれ、ＣＤ４４受容体は、代謝ではなく細胞プロセスに関連したＨＡ内在化に関与し、一方ＲＨＡＭＭ受容体は、細胞の運動性にのみ関与しているようである。ＨＡを５−ＦＵと組合せると、高レベルの５−ＦＵが、ＨＡまたは５−ＦＵ代謝の部位にターゲティングされる。ターゲティング実験のデータ（表６）は、ＨＡとともに投与すると肝臓への５−ＦＵターゲティングに有意な上昇は無かったことを示す。肝臓へのターゲティングの上昇は観察されなかったため、肝臓上のＬＥＣ受容体は、ＣＤ４４受容体と比較してＨＡに対する結合親和性が低いかも知れないことを示唆する。他の可能性は、肝臓細胞上に発現されるＣＤ４４アイソフォーム（スタメンコビック（stamenkovic）ら、１９９１）が、高い親和性でＨＡには結合しないことである。肝臓と同様に、他の代謝臓器である脾臓、骨髄およびリンパ節では、５−ＦＵのターゲティングの上昇は観察されなかった。
【０１７４】
肝臓にターゲティングされた５−ＦＵでは、１０分以内に有意な１．８倍の上昇があった。他の４つの時点は、ＨＡ／５−ＦＵを同時投与した時、腎臓による５−ＦＵ取り込みの有意な上昇は示さなかったが、一般的な傾向が起きており、ＨＡとの投与により腎臓により多くの５−ＦＵが送達された。体内から５−ＦＵを除去する最終的排除の主要な経路は、尿排泄である。ＨＡとの薬物の腎含量はほとんど増加しないようであるが、我々は、他の証拠から、ＨＡは腎臓により取り込まれ迅速に異化され、その結果その滞留時間が短く、結合した薬物は尿中に迅速に放出されると考えている。
【０１７５】
胃、脳、肺および子宮のような組織では、１つ以上の時点で短期のターゲティングが認められる。母集団の試料数を増やすことを必要とし、これらの観察結果が真実かどうかを明確に示す、一貫した薬物動力学的パターンは得られていない。１０〜３０分で脳へのターゲティングが上昇する場合は、これは、ＨＡが、薬物が血液脳関門を通過する能力を増強することに関連しているという（ネルソン（Nelson）とフォーク（Falk）、１９９４））以前の観察結果により説明される。
【０１７６】
ＨＡとの投与で３０分と１時間の時点で、５−ＦＵレベルの有意な上昇があった。肺のマクロファージは高レベルのＨＡ結合性ＣＤ４４アイソフォーム（アンダーヒル（Underhill）ら、１９９３）を含有し、これがターゲティングの上昇の原因かも知れない。これは、肺癌の治療における治療的利点に関連している可能性があり、小および大細胞肺癌はＣＤ４４とＲＨＡＭＭの過剰発現を有すると報告されている（ホースト（Horst）ら、１９９０）。
【０１７７】
ＨＡを５−ＦＵと同時注入した時、１時間と２時間の時点で心臓への５−ＦＵのターゲティングが有意に低下した。５−ＦＵ投与は心臓毒性を引き起こすことがある（ＭＩＭＳ、１９９７）ため、５−ＦＵのＨＡとの投与は、５−ＦＵを単独で投与した時と比較して心臓への毒性の程度を減少させるかも知れない。
【０１７８】
ＨＡ／５−ＦＵ補助療法の治療効果を評価する時、長期と短期の治療プロトコールでいくつかの観察結果が一貫している。
【０１７９】
ＨＡ／５−ＦＵまたはＨＡ単独を投与されたマウスは、より多くのエネルギーを有し、体重を維持または増加するようであり、この観察結果は、６ヶ月試験でのＨＡ／５−ＦＵマウスの生存時間の増加により支持される。
【０１８０】
５−ＦＵ／ＨＡまたはＨＡを投与されたマウスの腫瘍は、外部の壊死が出現し、２つの腫瘍が脱落した。
【０１８１】
５−ＦＵへのＨＡの添加は、治療を６週間行った時、１次治療の容量への大きな作用はないようであったが、これは、腫瘍の血管が原因かも知れない。腫瘍は３つの領域からなる。５−ＦＵ有りおよび無しでＨＡを投与すると、これは腫瘍に達し、傷害された血管の大きなギャップ結合を介して、充分血管形成しかつ半壊死領域に入るであろう。ＨＡの水を吸収する能力のために、これは細胞外液の腫瘍の壊死領域への流入を引き起こし、従って腫瘍の容量の増加を招き、腫瘍血管をさらに傷害する可能性がある。この仮説は、ＨＡ±５−ＦＵで治療した腫瘍は、壊死と腫瘍細胞内液の洩れとをルーチンに示すという観察結果に一致する。壊死細胞対生存細胞の面積の計算と乾燥容量：湿潤容量の比の計算が完了すれば、この仮説を証明できるであろう。
【０１８２】
長期薬効試験は、図２１に示すように、ＨＡ／５−ＦＵ治療を受けたマウスの生存率の上昇を示した。これらのマウスの平均腫瘍容量はまた、他の治療群と比較して低下しているようであった。また長期試験でも、ＨＡ／５−ＦＵ群の死因は主に代謝性ストレスであり、５−ＦＵ群の死因は、大きすぎる腫瘍のサイズによる非運動性であることが、認められた。ＨＡのみのすべてのマウスは、毒性ではなく大きすぎる腫瘍のサイズによる非運動性によって死亡した。すなわちＨＡは、毒性作用は無いようであった。ターゲティング結果から、ＨＡと５−ＦＵを組合せて腫瘍に投与した時、５−ＦＵのターゲティングの上昇が起きることがわかった（図１２）。ＨＡ特異的受容体ＣＤ４４とＲＨＡＭＭ（これは、腫瘍部位で多量に存在することが証明されている（クルティ（Culty）ら、１９９４；ワング（Wang）ら、１９９６））へのＨＡの結合を介して５−ＦＵを腫瘍にターゲティングするＨＡの能力は、５−ＦＵおよび他の細胞障害性薬剤とのＨＡの使用が、治療作用を有するのに充分な薬物が腫瘍に到達しないことの問題を克服するのを助ける可能性があることを反映しているかも知れない。また、短期試験において、５−ＦＵ／ＨＡマウスは、すべての他の群と比較して体重の有意な上昇を示すことがわかった（図２１）。従って腫瘍部位へのＨＡのターゲティング能力は、５−ＦＵが他の臓器（例えば小腸）に行く量を減少させ、こうして５−ＦＵ療法に伴う副作用（特に、消化管毒性）を低下させるかも知れない。
【０１８３】
例１〜３に開示されたＭＴＸ／ＨＡ補助療法の以前の評価と比較して、我々は、表１０に要約するように、明確な共通の結果と差を認めた。
【０１８４】
【表１１】
【０１８５】
２つの試験の主要な差は、腫瘍の出発時の大きさであり、ＭＴＸ／ＨＡ試験では平均腫瘍容量１７５．１３mm3であったのに対して５−ＦＵ／ＨＡ試験では６１．６３mm3であった。腫瘍への粒子移動と腫瘍の大きさに対する患者の応答の動力学により、これは、ＴＤＴ予測に関連して得られた異なる結果の原因かも知れない。
【０１８６】
例１２ ヒアルロナンとの併用療法の治療効果
ヒトの一次（原発性）および転移性乳癌の最も一般的に使用される治療処方は、シクロホスファミド（Ｃｙｃ）、ＭＴＸおよび５５−ＦＵ（これは、２８日サイクルの１日目と８日目に投与される）の併用化学療法である。併用療法（しばしばＣＭＦと呼ばれる）は、通常６サイクル行われ、この時点で患者の状態が再評価される。ＣＭＦ療法による抗腫瘍応答率は、約５０％であると報告（ボナドンナ（Bonadonna）、１９８１；ボナドンナ（Bonadonna）、１９８８）されているが、この治療法は多くの副作用（例えば、疲労、吐き気、白血球減少、および嘔吐）を有する（ボナドンナ（Bonadonna）、１９７６；メイアロウィッツ（Meyerowitz）、１９７９）。ＭＴＸと５−ＦＵの両方についての薬物送達ビヒクルとしてＨＡの使用がうまくいっているため、我々は、６週間と６ヶ月の治療処方でＨＡ／ＣＭＦ補助（アジュンバント）療法の治療効果と毒性を調べた。
【０１８７】
ＭＴＸと５−ＦＵは、それぞれ上記例２と６に記載のように調製した。Ｃｙｓのストック濃度は、１ｇの凍結乾燥薬物を１mlの注射用等級の発熱性物質不含蒸留水に溶解し、注射用等級の０．９％塩化ナトリウムで５０mlとして調製した。ストック溶液を少量ずつアリコートし、使用するまで−２０℃に保存した。
【０１８８】
ＣＭＦ注射液は、薬物のストック溶液の適量を取って、以下の最終薬物濃度を得た：
３０mg/kg ５−ＦＵ（ストック溶液：２０mg/ml）
１５mg/kg ＭＴＸ（ストック溶液：２４．５mg/ml）
２６mg/kg Ｃｙｃ（ストック溶液：２０mg/ml）
１２．５mg/kg ＨＡ（ストック溶液：１０mg/ml）
【０１８９】
ＣＭＦ／ＨＡ補助療法の治療効果と可能な毒性を確立するために、ヌードマウス中のヒト乳癌異種移植片を使用した。できるだけヒトの治療処方をシミュレートするために、マウスを長期薬効試験の６サイクル（６ヶ月）の治療、短期薬効試験の６サイクル（６週間）の治療を行った。マウスを、短期試験ではランダムに１群８匹の７群に分け、長期試験ではランダムに８匹の５群に分けた。
【０１９０】
マウスを、７日間処方の１日目と２日目に３０mg/kg ５−ＦＵ；１５mg/kg ＭＴＸ；２６mg/kg Ｃｙｃ±１２．５mg/kgで６週間治療するか、または２８日処方の１日目と８日目に上記で６ヶ月治療した。対照群は食塩水、１２．５mg/kg ＨＡを投与したものか、または１日目に１２．５mg/kg ＨＡを投与され２日目にＣＭＦを投与されたマウスである。治療の毒性についてマウスを毎日モニターし、腫瘍の大きさを毎日または毎週測定した（表１１を参照）。
【０１９１】
【表１２】
【０１９２】
表１２ａと１２ｂに示すように、６週間試験では以下が観察された：
【０１９３】
１）ＨＡ（ＣＭＦ／ＨＡ、ＨＡ次にＣＭＦまたはＨＡのみ）を含有する治療処方を受けたマウスは、ＣＭＦのみの群より５０％多い生存を示した。ＣＭＦ治療群の平均生存期間は、４０．４日であり、他のすべての群は４２日であった。
【０１９４】
２）ＨＡとＣＭＦの組合せで治療したマウスはすべて、ＣＭＦのみまたはＨＡのみの組合せで治療したマウスに対して、有意な体重増加（ｔ検定、ｐ＜０．００１）を示し、健康の増強を示した（図２２を参照）。
【０１９５】
３）食塩水で治療したマウスの腫瘍の倍加時間（治療対照群は無し）は他の治療群より有意に短い（ｔ検定、ｐ＜０．００１）が、他の治療群の間には統計的に有意な差はなかった（図２３を参照）。
【０１９６】
４）原発性腫瘍の終点の容量について、ＣＭＦ治療群とＣＭＦ／ＨＡ治療群の間で有意差（ｔ検定、ｐ＝＜０．００１）があり、ＣＭＦは７／８匹のマウスで腫瘍の大きさが低下し、ＣＭＦ／ＨＡは一次腫瘍の大きさを３／８匹のマウスでのみ低下させた。
【０１９７】
５）マウスをＨＡ±ＣＭＦで治療した時、治療毒性は認められなかったが、ＣＭＦのみで治療したマウスは、疲労、結膜炎、全身性の健康不良を示した。
【０１９８】
ＣＭＦ／ＨＡまたはＨＡ治療を２８日サイクルの１日目と８日目に行うと、以下が観察された：治療群の間で生存期間に有意差はなかった。
【０１９９】
１）治療群の間で体重増加に有意差はなかった。
２）ＨＡ±ＣＭＦを投与されたマウスの一次腫瘍は、小さい壊死と痂皮形成を示した。
３）一次腫瘍の治療において、単独物質としてのＣＭＦは、食塩水やＨＡ治療に対して治療効果を示さなかった。ＣＭＦにＨＡを加えると、有意に大きな（ｔ検定、ｐ＝０．００１）一次腫瘍が得られた。
【０２００】
この試験から以下の結論が導かれる：
【０２０１】
１）ＨＡ／ＣＭＦ補助療法の長期投与（６ヶ月）は、治療効果の上昇または治療副作用の低下を示さない。
２）ＨＡ／ＣＭＦ補助療法の短期投与（６週間）は、単独治療としてのＣＭＦの投与に対して多くの利点を示す。
３）有意な体重増加。
４）治療を完了するマウス数の５０％の増加。
５）疲労、結膜炎、食欲減退のような副作用がなくなる。
６）ＨＡを投与されたマウスは毒性症状を示さなかった。
【０２０２】
【表１３】
【０２０３】
【表１４】
【０２０４】
例１３ 化学療法薬とＨＡとの相互作用の性質のＮＭＲ研究
ＨＡと化学療法薬との相互作用の性質を詳細に調べるために、1Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル法を使用した。酸化重水素（2Ｈ2Ｏ（９９．９６％））を、ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ(Cambridge Isotope Laboratories））から得た。ＭＴＸは、ファールディングファーマシューチカルズ（Faulding Pharmaceuticals））から得て、５−ＦＵとＨＡストック溶液は、既に記載されているように調製した。
【０２０５】
スペクトルは、
ＤＲＸスペクトル計を６００MHzで運転してシールドした勾配ユニットで２９８Ｋで記録した。２Ｄ実験は、ｔ1ディメンジョンで直交検出の時間比例相増加を使用して相感受性モードで記録した（マリオン（Marion）と
、１９８３）。２Ｄ実験は、混合時間１２０msのＭＬＥＶ−１７スピンロックシーケンス（バックス（Bax）とデービス（Davis）、１９８５）を使用するＴＯＣＳＹシーケンス；混合時間２５０と４００msのＮＯＥＳＹ（クマール（Kumar）ら、１９８０）、および混合時間２５０msのＲＯＥＳＹスペクトルを含んだ。プローブの温度較正は、エチレングリコールの化学シフトと比較して行った。すべての化学シフト（ppm）は、４，４−ジメチル−４−シラペンタン−１−スルホネート（ＤＳＳ、０ppm）のメチル共鳴を参照とした。
【０２０６】
ＮＯＥＳＹ、ＲＯＥＳＹおよびＴＯＣＳＹ実験の水シグナルの溶媒抑制は、修飾ウォーターゲート（WATERGATE）シーケンス（ピオット（Piotto）ら、１９９２）を使用して行った（ここで、１msの２つの勾配パルスを二項３−９−１９パルスの両側に適用した）。スペクトルは、Ｆ2で４０９６の複合データ点で６０２４Hzより上で、Ｆ1ディメンジョンの５１２の増分で、ＴＯＣＳＹ実験では３２スキャン／増分、ＮＯＥＳＹでは８０スキャンで、ルーチンに取った。静かに交換するＮＨプロトンは、１６Ｋデータ点以上と３２スキャンで取った一連の１次元（１Ｄ）スペクトルを取ることにより検出した。
【０２０７】
ＮＭＲ拡散実験は、５００MHzで運転する勾配制御ユニットのついた
ＡＭＸスペクトル計で取った。すべて実験は、２９８Ｋで１６Ｋ以上の２９８Ｋデータ点と７５７５Hzで１６または６４スキャンで取った。拡散実験には、１５．４４G/cmの勾配強度を使用した。各拡散実験は、一連の１２ＰＦＧＬＥＤスペクトルから得られた（ここで、遅延（τ＝２０ms、Δ＝５０ms、Ｔ＝３０msおよびＴe＝１４ms）、Ｇの大きさは一定に維持したが、フィールド勾配パルス（δ）の長さは、１msのステップで０．２msから最終スペクトルの１２．２msまで増加させた）。
【０２０８】
すべてのスペクトルは、シリコングラフィックス（Silicon Graphics）インディゴ（Indigo）ワークステーションでXwinnmar（ブルーカー（Bruker））ソフトウェアを使用して処理した。２Ｄ実験のために、ｔ1ディメンジョンは、ゼロ充填から２０４８の実際のデータ点までであり、９０°相シフトサイン−ベルウィンドウ関数は、フーリエ変換の前に適用した。
【０２０９】
ＮＭＲ実験は、ＨＡを加えた時ＭＴＸの1Ｈ ＮＭＲスペクトル中の変化をモニターするように設計した。薬物ＭＴＸのスペクトルの特異的変化（ピークの広がりまたは移動）をモニターすることにより、どの薬物分子の領域がＨＡと相互作用（もしあれば）するかがわかる。図２４は、Ｈ2Ｏに溶解したＭＴＸの1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。このスペクトルは、メソトレキセート中の水素の各基を容易に同定する。
【０２１０】
メソトレキセート
メソトレキセートは、ヒアルロナン分子と反応できる多くの官能基を有する。ＭＴＸの２，４−アミノ−プテリジン芳香環上の一級アミンは、ヒアルロナン分子上のカルボキシル基とイオン性結合を形成することができる。メソトレキセート上のアミン基とヒアルロナンの炭水化物環上のヒドロキシル基との水素結合が、もう１つの可能性である。ＭＴＸの疎水性芳香環と、折り畳まれたヒアルロナンポリマー上の疎水性パッチとの疎水性相互作用も可能である。これらの相互作用を図２５に示す。
【０２１１】
メソトレキセートとＨＡとの間に特異的な相互作用があるかどうかという問題を解決するために、ＮＭＲ実験を計画して、ＨＡを添加した時のＭＴＸの1Ｈ ＮＭＲスペクトルの変化をモニターした。図２６は、６００MHzと２９８Ｋでのヒアルロン酸の６００MHzスペクトルを示す。
【０２１２】
図２７は、ＭＴＸ単独と、２nmole、１０nmole、２０nmoleおよび８０nmoleと増加するＨＡ（５０kDa）を添加したＭＴＸの２９８Ｋでの６００MHz 1Ｈ ＮＭＲスペクトルである。これらのスペクトルは、ＭＴＸ中のいずれのピークにも化学シフト位置の変化がないことを示す。ＨＡを連続的に添加するとスペクトルに現れる追加のピークは、ヒアルロン酸による共鳴と完全に一致する。これらのスペクトルでＭＴＸの共鳴のいずれにも化学シフト位置の変化が無いため、ＨＡ分子と相互作用しているＭＴＸ分子の特定の領域は無いようである。
【０２１３】
ＭＴＸ上のＮＨ基とＨＡ上の酸性基との間で強い相互作用があるかどうかを決定する１つの方法は、ＮＨプロトンの交換速度を測定することである。これらの水素は不安定であり、バルク溶媒と急速に交換することができる。しかし、もしこれらがＨＡ分子との強い相互作用に関与しているなら、これらはバルク溶媒から防御され、その交換速度は低下するであろう。この実験では、ＭＴＸのアミン水素は、Ｄ2Ｏからの重水素と交換し、交換速度は、ＭＴＸとＨＡとの相互作用の強度の定量的推定値を与える。０．５％w/v Ｎａ2ＣＯ3（ｐＨ９）に溶解したＭＴＸとＨＡの溶液に酸化重水素を添加して調製した溶液の1Ｈ ＮＭＲ分析は、４分以内にＭＴＸのすべてのアミン水素が、試料中の重水素と交換したことを示した。この結果は、ＭＴＸ中のアミン水素が、バルク溶媒との交換から防御されていないことを示唆する。
【０２１４】
1Ｈ ＮＭＲスペクトルからアミン水素のピークが消失する理由は、重水素が水素とは大きく異なる共鳴周波数を有し、従って1Ｈ ＮＭＲスペクトルには現れないためである。類似の実験をルーチンに使用して、ポリペプチドやタンパク質中の骨格アミド水素が溶媒から防御されるかどうかを試験する。タンパク質のアミド水素が、αらせんおよびβシート２次構造を安定化する水素結合に関与する時、これらの水素の交換速度はしばしば劇的に低下する。ある場合にはこれらの相互作用に関与する水素シグナルは、その相互作用とバルク溶媒（例えば、タンパク質の疎水性コア中）からの防御の強さに依存して数時間、数日またはさらには数ヶ月続く場合もある。
【０２１５】
ＭＴＸ単独およびＨＡの存在下で、拡散実験を行った。これらの実験は、捕捉されたＭＴＸの拡散がＨＡフレームワークの存在により遅延するかどうかを示すであろう。二重測定の1Ｈ ＮＭＲ拡散実験の結果は、ＭＴＸとＨＡ存在下のＭＴＸとの拡散係数の間の差は無視できるものであったため、大多数のＭＴＸ分子について、ＭＴＸ拡散速度の遅延が無いことを示した。この知見は、ＨＡフレームワークにおいて、ＨＡ分子中に大きな溶媒空洞があり、これが薬物が媒体中を自由に拡散することを可能にすることを示唆する。
【０２１６】
拡散実験は、ＭＴＸ分子のバルクは、ＨＡフレームワークを通して自由に拡散することを示唆した。このシナリオは、わずかな割合（例えばＭＴＸ分子の５％）が非特異的にＨＡ分子と弱く相互作用しているかどうかを考慮していない。
【０２１７】
上記実験から、ＭＴＸはＨＡとは強く相互作用せず、その相互作用はもしあったとしても特異的ではないことが明らかである。非特異結合について弱く結合するリガンド（１０-3〜１０-7Ｍ）を試験する１つの方法は、移動ＮＯＥＳＹ実験を行うことである。これらの２Ｄ実験では、リガンドが巨大分子ＨＡに弱く結合するなら、交差ピークが現れる。ＭＴＸ／ＨＡの移動ＮＯＥＳＹスペクトルは、ＭＴＸのＨＡへの結合による交差ピークは示さず、ＭＴＸとＨＡとの相互作用は無視できるものであることを示唆する。
【０２１８】
わずかな割合（例えばＭＴＸ分子の５％）がＨＡ分子に非特異的に弱く相互作用するかどうかのさらなるチェックとして。ＲＯＥＳＹスペクトルのピークは、遊離状態およびＨＡへの結合状態の間の化学的交換において、ＭＴＸ分子のわずかな割合があるかどうかを示す。２５０msのＲＯＥＳＹスペクトルは、化学交換ピークを示さず、わずかな割合のＭＴＸさえもＨＡと相互作用しないことを示唆する。
【０２１９】
５−フルオロウラシル
図２８は、２９８Ｋでの７０．０と８．５ppmの間の、５−ＦＵと、ＨＡ（７５０kDa、３mg/ml）と一緒の５−ＦＵ（１．２５mg/ml、１．６mg/mlおよび６．４mg/ml）の６００MHz 1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。相互作用があるかどうかを調べる最初の実験は、５０Kdaヒアルロン酸を用いて行った。５−ＦＵとＨＡとの間に相互作用は観察されなかった（データは示していない）。相互作用が、使用したＨＡの分子量に依存するかどうかを調べるために、７５０kDaヒアルロナンを用いてさらに力価測定実験を行った。使用した５−ＦＵの濃度は、スエーデン臨床的治験の準備のために行われたＨＡ／５−ＦＵ補助療法キングズカレッジロンドン製剤研究と同様であった。これらの濃度は、ＨＡ／５−ＦＵの混合、注入バッグ中、および血漿中で予測されるＨＡ／５−ＦＵ濃度で使用される濃度をシニュレートするように計画した。残念ながら、５−フルオロウラシルのアミン共鳴は、これらの製剤のｐＨ（８．８〜９．１）でバルク溶媒の水と急速に交換し、従ってこれらの共鳴は５−ＦＵのスペクトル中には見えない。ＣＨの１つの共鳴のみが、５−ＦＵのスペクトルに見える。これらの溶液のｐＨを低下させることは、低いｐＨ値では溶液から５−ＦＵが沈殿するため、現実的ではない。これらのスペクトルは、５−ＦＵのＣＨピークの化学シフト位置に変化が無いことを示す。これらのスペクトルは、５−ＦＵがＨＡ分子とは相互作用しないらしいことを示す。
【０２２０】
拡散実験は、５−ＦＵ単独およびＨＡの存在下で行った。表１３の二重測定の1Ｈ ＮＭＲ拡散実験の結果は、５−ＦＵ単独とＨＡの存在下での５−ＦＵの拡散係数の差は無視できるものであるため、５−ＦＵ拡散がヒアルロナンの存在により遅延されないことを示す。
【０２２１】
【表１５】
２Ｄ実験、ＮＯＥＳＹとＲＯＥＳＹ：その1Ｈ ＮＭＲスペクトル中に１つの共鳴のみしか存在しないため、５−ＦＵ上の２Ｄ実験は不可能である。
【０２２２】
ＭＴＸについて力価測定実験、重水素交換実験、拡散実験および移動ＮＯＥＳＹ実験と、５−ＦＵについて力価測定実験と拡散実験を使用して、ヒアルロナンの存在下でのＭＴＸと５−ＦＵのＮＭＲ分析を行うと、化学療法薬物とヒアルロナンとの間で相互作用は検出されなかった。これらの結果は、ヒアルロナンネットワークによる化学療法薬物の捕捉は、病原性の部位に送達される薬物の量を上昇させるのに充分であることを示唆する。これらの結果は、ゲルろ過クロマトグラフィー、平衡透析、およびヒアルロナンとＭＴＸおよび５−ＦＵとの分子相互作用のＣＤスペクトル法（これらも相互作用を検出しなかった）を使用した従来の研究と完全に一致する。
【０２２３】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞傷害性または抗新生物薬物に対する取得したまたは固有の細胞抵抗性を減弱または克服する方法において、それを必要とする患者に、上記薬物の有効量をヒアルロナンとともに全身的に共投与する工程からなり、上記薬物はその薬物単独の同量に比べて細胞傷害的にまたは抗新生物的により有効である方法。
【請求項２】
上記薬物はメトトレキセート、パクリタキセル（タキソール）、5-フルオロウラシルおよびシクロホスファミドまたはそれらの配合物からなる群より選択される「請求項１」記載の方法。
【請求項３】
上記薬物はヒアルロナンと、薬物が上記ヒアルロナンにより同伴および／または結合されるように配合される「請求項２」記載の方法。
【請求項４】
上記の配合された薬物およびヒアルロナンは抵抗性細胞上の受容体に結合できる「請求項３」記載の方法。
【請求項５】
上記の配合された薬物およびヒアルロナンは、バルクエンドサイトーシスを介して抵抗性細胞内に進入することが可能であり、同薬物は細胞内に送達され、それによりそれが治療的に活性になる「請求項３」記載の方法。
【請求項６】
取得したまたは固有の細胞抵抗性は薬物抵抗性疾患と関連する「請求項１」記載の方法。
【請求項７】
薬物抵抗性疾患は薬物抵抗性癌である「請求項６」記載の方法。
【請求項８】
薬物の胃腸管毒性を低下させる方法において、それを必要とする患者に有効量の上記薬物をヒアルロナンとともに全身的に共投与する工程からなり、上記薬物単独の同量に比較して上記薬物は低下した胃腸管毒性を有する方法。
【請求項９】
細胞傷害性または抗新生物薬物に対する取得したまたは固有の細胞抵抗性を減弱または克服するための医薬組成物において、
分子量700,000ダルトンより大きいヒアルロナン、および細胞傷害性または抗新生物薬物からなり、
上記組成物はそれを必要とする患者に全身的に投与され、上記薬物単独に比較して細胞傷害的にまたは抗新生物的により有効であり、
ただし薬物がパクリタキセルである場合にはヒアルロナンの分子量は750,000ダルトンより大きい医薬組成物。
【請求項１】
細胞傷害性または抗新生物薬物に対する取得したまたは固有の細胞抵抗性を減弱または克服する方法において、それを必要とする患者に、上記薬物の有効量をヒアルロナンとともに全身的に共投与する工程からなり、上記薬物はその薬物単独の同量に比べて細胞傷害的にまたは抗新生物的により有効である方法。
【請求項２】
上記薬物はメトトレキセート、パクリタキセル（タキソール）、5-フルオロウラシルおよびシクロホスファミドまたはそれらの配合物からなる群より選択される「請求項１」記載の方法。
【請求項３】
上記薬物はヒアルロナンと、薬物が上記ヒアルロナンにより同伴および／または結合されるように配合される「請求項２」記載の方法。
【請求項４】
上記の配合された薬物およびヒアルロナンは抵抗性細胞上の受容体に結合できる「請求項３」記載の方法。
【請求項５】
上記の配合された薬物およびヒアルロナンは、バルクエンドサイトーシスを介して抵抗性細胞内に進入することが可能であり、同薬物は細胞内に送達され、それによりそれが治療的に活性になる「請求項３」記載の方法。
【請求項６】
取得したまたは固有の細胞抵抗性は薬物抵抗性疾患と関連する「請求項１」記載の方法。
【請求項７】
薬物抵抗性疾患は薬物抵抗性癌である「請求項６」記載の方法。
【請求項８】
薬物の胃腸管毒性を低下させる方法において、それを必要とする患者に有効量の上記薬物をヒアルロナンとともに全身的に共投与する工程からなり、上記薬物単独の同量に比較して上記薬物は低下した胃腸管毒性を有する方法。
【請求項９】
細胞傷害性または抗新生物薬物に対する取得したまたは固有の細胞抵抗性を減弱または克服するための医薬組成物において、
分子量700,000ダルトンより大きいヒアルロナン、および細胞傷害性または抗新生物薬物からなり、
上記組成物はそれを必要とする患者に全身的に投与され、上記薬物単独に比較して細胞傷害的にまたは抗新生物的により有効であり、
ただし薬物がパクリタキセルである場合にはヒアルロナンの分子量は750,000ダルトンより大きい医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【公開番号】特開２０１１−１７８８０２（Ｐ２０１１−１７８８０２Ａ）
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０４３３４（Ｐ２０１１−１０４３３４）
【出願日】平成２３年５月９日（２０１１．５．９）
【分割の表示】特願２０００−５９３３３９（Ｐ２０００−５９３３３９）の分割
【原出願日】平成１２年１月６日（２０００．１．６）
【出願人】（５０１２７４６５４）アルケミア オンコロジー ピーティワイ リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月９日（２０１１．５．９）
【分割の表示】特願２０００−５９３３３９（Ｐ２０００−５９３３３９）の分割
【原出願日】平成１２年１月６日（２０００．１．６）
【出願人】（５０１２７４６５４）アルケミア オンコロジー ピーティワイ リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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