虫歯予防剤
【課題】臭いや味が問題にならないような材料に由来する虫歯予防剤を開発すること。
【解決手段】本発明は、ミル科藻類の藻体抽出物を含む虫歯予防剤を提供する。本発明の虫歯予防剤において、前記藻類はミル属に属する場合がある。前記藻類は、ミル、イセモミル、タマミル、コブシミル、クロミル、モツレミル及びナガミルからなるグループから選択される少なくとも１種類のミル属の生物種に属する場合がある。本発明の虫歯予防剤において、前記藻体抽出物は、粉砕された藻体を水溶液で抽出して得られる場合がある。本発明の虫歯予防剤において、前藻体抽出物はＧａｌＮＡｃと競合する糖鎖に結合するレクチンの場合がある。本発明の虫歯予防剤を含む医薬品組成物、食品組成物、歯磨き剤及び口内洗浄剤を提供する。
【解決手段】本発明は、ミル科藻類の藻体抽出物を含む虫歯予防剤を提供する。本発明の虫歯予防剤において、前記藻類はミル属に属する場合がある。前記藻類は、ミル、イセモミル、タマミル、コブシミル、クロミル、モツレミル及びナガミルからなるグループから選択される少なくとも１種類のミル属の生物種に属する場合がある。本発明の虫歯予防剤において、前記藻体抽出物は、粉砕された藻体を水溶液で抽出して得られる場合がある。本発明の虫歯予防剤において、前藻体抽出物はＧａｌＮＡｃと競合する糖鎖に結合するレクチンの場合がある。本発明の虫歯予防剤を含む医薬品組成物、食品組成物、歯磨き剤及び口内洗浄剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミル科藻類の藻体抽出物を含む虫歯予防剤、特に、ミル科藻類の藻体抽出物を含み、口腔内のプラーク又はバイオフィルムへの付着及び増殖を抑制する効果を有する虫歯予防剤と、該虫歯予防剤を含む、医薬品組成物、食品組成物、歯磨き剤及び口内洗浄剤とに関する。
【背景技術】
【０００２】
口腔細菌は、口腔内のプラーク又はバイオフィルムに付着して増殖し、齲蝕すなわち虫歯や歯槽膿漏その他の歯周病を引き起こす。前記プラーク又はバイオフィルムは、唾液の生体高分子が歯の表面に付着してペリクルという皮膜を形成し、該ペリクルに口腔細菌が付着することにより成長する。したがって虫歯や歯周病の予防のためにはペリクルへの口腔細菌の付着を抑制又は阻止する必要がある。エリスリトール、キシリトール等の糖アルコール類には虫歯抑制効果があることが知られているが、糖アルコールは口腔細菌の代謝により齲蝕の原因となる乳酸を産生しないために虫歯が出来にくくなるものであり、口腔細菌の付着の抑制や阻止には関与しない。
【０００３】
口腔細菌がペリクルや他の口腔細菌の菌体に付着する際には、口腔細菌の産生する糖鎖結合タンパク質のレクチンが関与していると考えられる。つまり、ペリクルに滞積した唾液の生体高分子、すなわち、多糖類又は糖タンパク質と口腔細菌レクチンとが糖鎖特異的な結合を行うことにより、ペリクルに口腔細菌が付着すると考えられる。すると、外部から口腔細菌のレクチンと競合するレクチンを口腔内に投与することによって、ペリクルの糖鎖への口腔細菌のレクチンの結合を阻害すれば、口腔細菌のバイオフィルムへの付着及び増殖を抑制又は阻害して、虫歯や歯周病のような口腔細菌による感染症を予防することができる。
【０００４】
実際にこのような発想に基づいて、口腔細菌とペリクルとの結合を阻害するレクチンが非特許文献１ないし３に報告されている。これらの文献で報告されたレクチンには、植物のグルコース・マンノース認識レクチンや、藻類のムチン認識レクチンがある。また、特許文献１には、マッシュルーム由来のレクチンＡＢＡ等には、口腔内のプラーク又はバイオフィルムへの付着及び増殖を抑制する効果があることが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｅｉｘｅｉｒａ， Ｅ．Ｈ．ら、Ｊ Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１０１： １１１−６ （２００６）．
【非特許文献２】Ｔｅｉｘｅｉｒａ， Ｅ．Ｈ．ら、Ｊ Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１０３： １００１−６ （２００７）．
【非特許文献３】Ｉｓｌａｍ，Ｂ．ら、Ｊ Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１０６： １６８２−９ （２００９）．
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６７９０３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、マッシュルームの抽出成分を用いて虫歯予防剤を開発する場合には、抽出成分中のタンパク質は１ミリリットルあたり数ミリグラムを必要とし、大量に安定して調製することが困難である。またマッシュルームの抽出成分は、強い臭い及びえぐみがあるので、食品に添加するのには適さない。そこで、臭いや味が問題にならないような材料に由来する虫歯予防剤を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ミル科藻類の藻体抽出物を含む虫歯予防剤を提供する。
【０００９】
本発明の虫歯予防剤において、前記藻類はミル属に属する場合がある。
【００１０】
本発明の虫歯予防剤において、前記藻類は、ミル、イセモミル、タマミル、コブシミル、クロミル、モツレミル及びナガミルからなるグループから選択される少なくとも１種類のミル属の生物種に属する場合がある。
【００１１】
本発明の虫歯予防剤において、前記藻類はミルの場合がある。
【００１２】
本発明の虫歯予防剤において、前記藻体抽出物は、粉砕された藻体を水溶液で抽出して得られる場合がある。
【００１３】
本発明の虫歯予防剤において、前藻体抽出物はＧａｌＮＡｃと競合する糖鎖に結合するレクチンの場合がある。
【００１４】
本発明は、本発明の虫歯予防剤を含む医薬品組成物を提供する。
【００１５】
本発明は、本発明の虫歯予防剤を含む食品組成物を提供する。
【００１６】
本発明は、本発明の虫歯予防剤を含む歯磨き剤を提供する。
【００１７】
本発明は、本発明の虫歯予防剤を含む口内洗浄剤を提供する。
【００１８】
本発明は、本発明の虫歯予防剤を口腔内に投与するステップを含む、虫歯の予防方法を提供する。
【００１９】
本発明の藻類は、緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、ミル目（Ｃｏｄｉａｌｅｓ、最近の分類ではハネモ目（Ｂｒｙｏｐｓｉｄａｌｅｓとされる場合がある。）のミル科（Ｃｏｄｉａｃｅａｅ）に属する。本発明の藻類は、ミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｆｒａｇｉｌｅ）、イセモミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ）、タマミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｍｉｎｕｓ）、コブシミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｓｐｏｎｇｉｏｓｕｍ）、クロミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｓｕｂｔｕｂｕｌｏｓｕｍ）、モツレミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｉｎｔｒｉｃａｔｕｍ）、ハイミル（Ｃｏｄｉｕｍ ａｄｈａｅｒｅｎｓ）、ナンバンハイミル（Ｃｏｄｉｕｍ ａｒａｂｉｃｕｍ）、ネザシミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｃｏａｃｔｕｍ）、ヒゲミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｂａｒｂａｔｕｍ）、サキブトミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｃｏｎｔｒａｃｔｕｍ）、ヒラミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｌａｔｕｍ）及びナガミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃｕｍ）を含むが、これらに限られない、ミル属（Ｃｏｄｉｕｍ）の生物種に属する場合がある。
【００２０】
本発明の藻類の抽出物を回収する方法は、口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、いかなる方法であってもかまわない。
【００２１】
本発明の藻類の抽出物は、藻体のいかなる組織から採取されてもかまわない。前記藻体は、洗浄後、ホモジナイザー等で破砕された後か、あるいは凍結乾燥で粉末状にされたり、粉砕機で粉末状にされた後に抽出処理を施される場合がある。抽出に用いる水溶液には、生理食塩水のようにＮａＣｌその他の塩類を含む水溶液と、アセトンその他の水溶性有機溶媒及び／又はアルコールと水との混合液と、精製水又は脱イオン水とを含むが、これらに限定されない、その他の当業者に周知の水性溶媒を用いることができる。ここで、前記アルコールは、エタノール、エチレングリコール、ブチレングリコール、グリセリンを含むが、これらに限定されないアルコールの場合がある。前記水性溶媒は酸性又はアルカリ性のｐＨを有する場合がある。前記水性溶媒のｐＨを調整するためには、アジピン酸、クエン酸、グルコン酸、コハク酸、酢酸、酒石酸、乳酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸塩類のカリウム又はナトリウム塩を含むが、これらに限られないｐＨ調整剤が用いられる場合がある。またｐＨを一定に保つために、Ｔｒｉｓ塩酸バッファー、Ｈｅｐｅｓバッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、クエン酸バッファー、グリシン−塩酸バッファーを含むが、これらに限られない、バッファーが用いられる場合がある。抽出方法は、浸漬抽出方法と、加圧抽出方法と、超臨界又は亜超臨界抽出方法とを含むが、これらに限られない。抽出条件は、口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、いかなる条件であってもかまわないが、抽出時間は１０分間から２４時間が好ましく、抽出温度は、４°Ｃ以上であってもよく、室温以上であることが好ましく、１５°Ｃ以上であることがより好ましい。
【００２２】
前記藻類の抽出物の精製及び濃縮は、遠心分離、塩析、透析、減圧濃縮、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を含むが、これらに限られない技術を、単独で、あるいは、いずれかの組み合わせで、利用して行われる場合がある。
【００２３】
精製又は濃縮後、必要に応じて、藻類の抽出物は、減圧乾燥されてもかまわないし、前記溶媒で希釈されてもかまわない。また、前記抽出物は混合して用いられてもかまわない。
【００２４】
本明細書においてレクチンとは、動物の免疫系に関与する抗体、Ｔ細胞レセプター、Ｔｏｌｌ様受容体その他の免疫タンパク質以外のタンパク質であって、糖鎖に特異的に結合する能力を有するタンパク質をいう。通常、レクチンは赤血球その他の動物細胞を凝集することができる。堀貫治（化学と生物、３２：５８６−５９４、（１９９４））によると、ミル科の藻類由来のレクチンはＧａｌＮａｃと競合する糖鎖に結合するという共通点がある。
【００２５】
本発明の抽出物又はレクチンは、ヒト、ブタ、ヒツジ、ウサギ等の血液を用いる当業者に周知の方法で赤血球凝集活性を測定することができる。テスト溶液を添加することによって赤血球が有意に凝集された場合には、前記テスト溶液中にはレクチンが含まれると推定することができる。また、前記テスト溶液にさまざまな糖を添加することによって赤血球凝集を低濃度で阻害するかどうかを調べることによって、前記レクチンが結合する糖鎖の構造を調べることができる。
【００２６】
本発明のレクチンはＧａｌＮＡｃと競合する。これは、本発明のレクチンが結合する糖鎖の末端がＧａｌＮＡｃであることを示唆する。しかし、本発明のレクチンは、末端にＧａｌＮＡｃを有する全ての糖鎖と結合するとは限らない。末端から２番目ないし３番目の糖残基が特定の構造の糖鎖とだけ結合するが、ＧａｌＮＡｃ存在下では結合が阻害される可能性がある。
【００２７】
本発明の虫歯予防剤に含まれるレクチンは、ミル目藻類の藻体抽出物から精製されたタンパク質か、組換えＤＮＡ技術によってさまざまな宿主で発現され精製されたタンパク質か、あるいは、前記藻体又はその抽出物であって、口腔内に投与されると口腔内硬組織への口腔細菌、特に、ミュータンス菌の付着及び増殖を抑制又は阻害する作用を発揮するのに十分な活性を有するものかの場合がある。すなわち、前記レクチンはミル目藻類の藻体そのものか、あるいは、その加工物かとして利用される場合がある。
【００２８】
本発明の虫歯予防剤の剤型は、本発明の口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、いかなる剤型であってもかまわない。
【００２９】
本発明の医薬品組成物は、口腔内硬組織への口腔細菌、特に、ミュータンス菌の付着及び増殖を抑制又は阻害するための全ての医薬品を含み、本発明の口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、他のいかなる成分を含むものであってもかまわない。
【００３０】
本発明の食品組成物は、本発明の口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、他のいかなる成分を含むものであってもかまわない。本発明の食品組成物は、エリスリトール、キシリトール等の糖アルコール類を含む場合がある。
【００３１】
本発明の歯磨き剤には、練り歯磨、液状歯磨及び潤製歯磨が含まれるが、これらに限定されない。本発明の口内洗浄剤は、洗口液、うがい用錠剤、トローチ及びチュウーインガムが含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明の歯磨き剤又は口内洗浄剤は、本発明の口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、他のいかなる成分を含むものであってもかまわない。前記成分の具体例は、賦形剤、乳化剤、安定剤、香料、甘味料が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
歯磨き剤の場合は、例えば、研磨剤、粘結剤、粘稠剤、界面活性剤、甘味剤、防腐剤、香料、着色剤、各種有効成分などを配合することができ、これらの成分を水と混合することにより製造することができる。なお、これらの成分の配合量は、本発明の口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわない範囲で通常量とすることができる。
【００３４】
研磨剤には、沈降性シリカ、シリカゲル、アルミノシリケート、ジルコノシリケート等のシリカ系研磨剤、第２リン酸カルシウム２水和物及び無水和物、ピロリン酸カルシウム、ゼオライト、ケイ酸ジルコニウム、合成樹脂系研磨剤等が含まれるが、これらに限定されない
【００３５】
粘結剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、カラギーナン、ゼラチン等が含まれるが、これらに限定されない。粘稠剤には、グリセリン、ソルビットが含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
界面活性剤としては、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤等を配合することができ、具体的には、ラウリル硫酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
甘味剤には、サッカリンナトリウム、ステビオサイド、ステビアエキスが含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
防腐剤には、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。香料には、１−メントールが含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
着色剤には、青色１号、黄色４号が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
各種有効成分には、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化アンモニウム等が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明のミル目藻類の藻体抽出物は、生理食塩水のようにＮａＣｌその他の塩類を含む水溶液と、アセトンその他の水溶性有機溶媒及び／又はアルコールと水との混合液と、精製水又は脱イオン水とを含むが、これらに限定されない、その他の当業者に周知の水性溶媒に溶解することができる。ここで、前記アルコールは、エタノール、エチレングリコール、ブチレングリコール、グリセリンを含むが、これらに限定されないアルコールの場合がある。前記水性溶媒は酸性又はアルカリ性のｐＨを有する場合がある。前記水性溶媒のｐＨを調整するためには、アジピン酸、クエン酸、グルコン酸、コハク酸、酢酸、酒石酸、乳酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸塩類のカリウム又はナトリウム塩を含むが、これらに限られないｐＨ調整剤が用いられる場合がある。またｐＨを一定に保つために、Ｔｒｉｓ塩酸バッファー、Ｈｅｐｅｓバッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、クエン酸バッファー、グリシン−塩酸バッファーを含むが、これらに限られない、バッファーが用いられる場合がある。本発明の抽出液のタンパク質濃度は、口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、いかなる濃度であってもかまわないが、３１．２５μｇ／ｍＬ以上が好ましく、１２５μｇ／ｍＬ以上がより好ましい。本発明のレクチン濃度は、口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、いかなる濃度であってもかまわないが、０．５μｇ／ｍＬ以上が好ましく、５μｇ／ｍＬ以上がより好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】唾液がコーティングされた基質へのミュータンス菌の付着及び増殖に対するミル及びヤナギマツタケの抽出物による抑制効果を示すグラフ。
【図２】ミュータンス菌の付着及び増殖に対する、ミル及びヤナギマツタケ由来の精製レクチンによる抑制効果を示すグラフ。
【図３】別の実施例のミル由来の抽出物のタンパク質濃度と、ミュータンス菌の付着及び増殖に対する抑制効果との関係を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【００４４】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【実施例１】
【００４５】
ミル及びヤナギマツタケの抽出成分のミュータンス菌の付着及び増殖に対する抑制効果
抽出液の調製
原料として、ミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｆｒａｇｉｌｅ）の藻体と、ヤナギマツタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）の子実体とが用いられた。前記原料は、乾燥されない生の海藻及びキノコの状態で栽培業者から購入された。前記原料５０ないし１００ｇに１０倍量のＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３、Ｄ５６５２、シグマアルドリッチ、以下、「ＰＢＳ」という。）が添加され、直径０．５ｍｍのビーズと、ビーズ式組織破砕装置（Ｂｅａｄ−Ｂｅａｔｅｒ、１１０７９００、Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔ社）とを用いてペースト状になるまで５０００ｒｐｍ２分間破砕された。その後、室温で３０分間静置され、ミル及びヤナギマツタケの抽出液が調製された。前記抽出液は、３７，０００×ｇで１５分間遠心され、上清が採取された。抽出液のタンパク質濃度は、ＢＣＡプロテインアッセイキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて測定された。抽出液のＰＢＳによる２倍希釈系列が調製され、ミュータンス菌の付着及び増殖に対する効果を評価する実験に供された。
【００４６】
ミュータンス菌は、Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ Ｂｒｏｔｈで３７°Ｃ、終夜培養され、１，０００×ｇ、１０分間の遠心により上清除去後、等量のＰＢＳに懸濁された。同様の操作を２度繰り返して洗浄した後、６６０ｎｍで吸光度が測定された。測定された吸光度を基に、ミュータンス菌はＰＢＳでＯＤ６６０が０．０５又は０．１になるように希釈され、ミュータンス菌サンプル液が調製された。前記サンプル液は密封され、２５°Ｃで５時間保温された後に用いられた。
【００４７】
抽出液のバイオフィルム抑制アッセイ
マルチプレート（平底、９６穴、ポリスチレン製、Ｎｕｎｃ社 マルチソープ ｃｏｄｅ：４６７１４０）に歯磨き後３時間のヒト唾液を１００μＬ添加され、３７°Ｃで２時間のコーティングが行われた。実験には、異なる３名の被験者のヒト唾液が用いられた。その後前記マルチプレートはＰＢＳで洗浄され、ＰＢＳで希釈されたミル及びヤナギマツタケの抽出液が添加されて３７°Ｃで１時間インキュベーションされた。その後前記マルチプレートがＰＢＳで洗浄され、１００μＬのＰＢＳ中の５×１０７個のミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）が各ウェルに添加されて３７°Ｃで終夜培養された。前記プレートはＰＢＳで洗浄され、０．２５％のグルタルアルデヒド／ＰＢＳが１００μＬ添加されて室温で３０分間固定された。その後ＰＢＳで洗浄され、２．３％のクリスタルバイオレット（グラム染色用）が１００μＬ添加されて室温で１時間染色された。その後流水で洗浄され、エタノールが１００μＬ添加されて室温で１時間色素が溶出された。菌体数の定量は、プレートリーダーを用いて各ウェルのエタノール液中の色素濃度を吸光波長５７０ｎｍで測定することによって実施された。
【００４８】
口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性は抑制指数Ｉｘとして定量化された。すなわち、同一条件ごとの吸光度の測定値の平均Ａｘと、異なる被験者ごとの唾液によるコーティングを行わなかったウェルの吸光度の測定値の平均Ａｎと、異なる被験者ごとの唾液によるコーティングを行ったが、レクチンによるインキュベーションを行わなかったウェルの吸光度の測定値の平均Ａｐとから、同一条件ごとの抑制指数Ｉｘが以下の式（Ｉ）を用いて算出され、プロットされた。
【００４９】
式（Ｉ） Ｉｘ＝１００×（Ａｘ−Ａｎ）／（Ａｐ−Ａｎ）
【００５０】
抑制指数Ｉｘの値が小さいほど、ミュータンス菌の付着及び増殖が抽出物又は精製レクチンによって抑制されたことを示す。
【００５１】
アッセイの結果
図１は、唾液がコーティングされた基質へのミュータンス菌の付着及び増殖に対するミル及びヤナギマツタケの抽出物による抑制効果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は同一条件ごとに２回繰り返した実験結果の測定値の標準偏差を示す。図１の右端から４本の棒グラフは対照実験の結果で、右端から順に、レクチン−、唾液＋及びミュータンス菌＋（唾液＋ミュータンス菌（レクチン無しの陽性対照））と、レクチン−、唾液−及びミュータンス菌＋（ミュータンス菌のみ）と、レクチン−、唾液＋及びミュータンス菌−（唾液のみ）と、レクチン−、唾液−及びミュータンス菌−（ウェルのみ）との４種類の条件であった。各条件の抑制指数は、唾液＋ミュータンス菌では１００、ミュータンス菌のみでは２０であり、唾液のみ及びウェルのみでは有意な抑制指数は示されなかった。ミル抽出物の抑制指数は、タンパク質濃度が０．０３１２５ｍｇ／ｍＬのとき９０で、０．０６２５ｍｇ／ｍＬのとき８０で、０．１２５ｍｇ／ｍＬ及び０．２５ｍｇ／ｍＬのときはいずれも６０で、０．５ｍｇ／ｍＬのとき５５であった。また、ヤナギマツタケ抽出物の抑制指数は、タンパク質濃度が０．３１２５ｍｇ／ｍＬのとき１４５で、０．６２５ｍｇ／ｍＬのとき１３５で、１．２５ｍｇ／ｍＬのとき１３０で、２．５ｍｇ／ｍＬのとき１００で、５ｍｇ／ｍＬのとき６５であった。以上の結果から、ミュータンス菌の付着及び増殖を抑制する効果は、ミル抽出物では０．０３１２５ｍｇ／ｍＬないし２ｍｇ／ｍＬの範囲で認められ、ヤナギマツタケ抽出物では５ｍｇ／ｍＬのみで認められた。したがって、ミル抽出物にはヤナギマツタケ抽出物の１００分の１未満の濃度でミュータンス菌の付着及び増殖を抑制する効果があり、ミュータンス菌の付着及び増殖を抑制する因子の活性が非常に高いことが示された。
【実施例２】
【００５２】
ミル及びヤナギマツタケのレクチンの精製
ミル及びヤナギマツタケの抽出物は実施例１と同様にして調製された。前記抽出物それぞれは、糖タンパク質（アシアロフェツイン、Ａ４７８１、シグマアルドリッチ社）が固定された担体（ＧＥヘルスサイエンス、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を充填したカラムに適用された。アシアロフェツインと特異的に結合しない物質がＰＢＳで溶出された後、アシアロフェツインとの結合がＧａｌＮＡｃによって競合阻害される物質が２００ｍＭ ＧａｌＮＡｃを含むＰＢＳで溶出された。前記抽出物のタンパク質濃度と、精製されたレクチンのタンパク質濃度とは、ＢＣＡ プロテインアッセイキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて測定された。
【００５３】
精製の結果
表１は、ミル及びヤナギマツタケから精製されたレクチンのタンパク質の量及び収率を示す。ミルからは糖鎖結合タンパク質５．８ｍｇが、ヤナギマツタケ４９ｇからは糖鎖結合タンパク質０．２ｍｇが、それぞれ採取された。ミル及びヤナギマツタケのレクチン精製収率は、それぞれ８．１１％及び０．０２％であった。
【００５４】
【表１】
【００５５】
精製レクチンによるバイオフィルム抑制アッセイ
ミュータンス菌の付着及び増殖に対する精製レクチンによる抑制効果は実施例１と同様の手順で評価された。対照として、ＡＢＡ（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（マッシュルーム由来の血液凝集素）、３０００９２、生化学バイオビジネス）と、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、８１−００３−３、ミリポア）とが用いられた。
【００５６】
アッセイの結果
図２は、ミュータンス菌の付着及び増殖に対する、ミル及びヤナギマツタケ由来の精製レクチンによる抑制効果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は同一条件ごとに２回繰り返した実験結果の測定値の標準偏差を示す。
【００５７】
図２の右端から４本の棒グラフは対照実験の結果で、右端から順に、レクチン−、唾液−及びミュータンス菌−（ウェルのみ）と、レクチン−、唾液−及びミュータンス菌＋（ミュータンス菌のみ）と、レクチン−、唾液＋及びミュータンス菌−（唾液のみ）と、レクチン−、唾液＋及びミュータンス菌＋（唾液＋ミュータンス菌（レクチン無しの陽性対照））との４種類の条件であった。各条件の抑制指数は、唾液＋ミュータンス菌では１００、ミュータンス菌のみでは１４であり、唾液のみ及びウェルのみでは有意な抑制指数は示されなかった。また、ＡＢＡ及びＢＳＡの濃度が１００μｇ／ｍＬの抑制指数は、それぞれ、２４及び９７であった。精製レクチンの濃度が、０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ及び４０μｇ／ｍＬの抑制指数は、ミルでは、１０２、７６及び２６であり、ヤナギマツタケでは、９１、８４及び３９であった。以上の結果から、ミル及びヤナギマツタケの精製レクチンは、ミュータンス菌の付着及び増殖を顕著に抑制することが示された。また、４０μｇ／ｍＬのミルの精製レクチンは、１００μｇ／ｍＬのＡＢＡと同程度にミュータンス菌の付着及び増殖を抑制することが示された。
【実施例３】
【００５８】
別のプロトコールで調製されたミル由来のタンパク質のミュータンス菌の付着及び増殖に対する抑制効果
ミル由来タンパク質の調製
生ミル１７．４９ｋｇが４０°Ｃで乾燥された。乾燥重量１．５ｋｇの乾燥されたミルの藻体は、ミキサー粉砕で粉末化された後、３０Ｌの精製水が添加され、１５°Ｃで１６時間攪拌され、可溶性成分が抽出された。前記可溶性成分を含む溶液は４，０００×ｇの連続遠心により固形物が除去され、上清が採取された。前記上清は、６０°Ｃで減圧乾燥された。抽出液のタンパク質濃度は、ＢＣＡプロテインアッセイキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて測定された。抽出液のＰＢＳによる２倍希釈系列が調製され、ミュータンス菌の付着及び増殖に対する効果を評価する実験に供された。
【００５９】
マッシュルーム及びヤナギマツタケ由来のタンパク質の調製
９．１ｇのマッシュルームと、５０ｋｇのヤナギマツタケが前節に説明されたミルと同様に、乾燥の後、精製水で可溶性成分が抽出された。抽出物のタンパク質濃度もミルと同様にして測定された。
【００６０】
バイオフィルム抑制アッセイ
ミュータンス菌の付着及び増殖に対するミル等の抽出物による抑制効果は実施例１と同様の手順で評価された。
【００６１】
結果
図３は、ミル由来の精製水抽出物のタンパク質濃度と、ミュータンス菌の付着及び増殖に対する抑制効果との関係を示すグラフである。図３から明らかなとおり、ミル由来の精製水抽出物はタンパク質濃度が２５μｇ／ｍＬと５０μｇ／ｍＬとの間で急激に抑制指数が低下し、５０％抑制濃度は４０μｇ／ｍＬであった。
【００６２】
以下の表２は、ミル、マッシュルーム及びヤナギマツタケの精製水抽出物の精製結果と、５０％抑制濃度とを示す表である。ミル、マッシュルーム及びヤナギマツタケの精製水抽出物から回収された固形物は、それぞれ、４６１ｇ、２５．５ｍｇ及び１５５０ｇであり、その中のタンパク質含有量は、それぞれ、８．３ｇ、９．９ｍｇ及び５０６ｇであった。そして、ミル、マッシュルーム及びヤナギマツタケの精製水抽出物の５０％抑制濃度は、それぞれ、４０μｇ／ｍＬ、９０μｇ／ｍＬ及び４０００μｇ／ｍＬであった。
【００６３】
【表２】
【００６４】
以上の結果から、本実施例の精製水抽出物では、ミルが最も低い濃度でミュータンス菌のバイオフィルム形成を抑制できることが明らかになった。
【００６５】
ミルはほぼ無味無臭の海藻で、海松として我が国では古来食べられてきた記録がある。そこで、ミルの抽出物又は精製レクチンは安全性からも問題がない。なお、ミル属を含む多数の属の緑藻類の海藻由来の抽出物が、歯周病原菌ポルフィロモナス ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に対して抗菌力を示すことは、特開平９−４８７１５号出願公開公報に開示されている。しかし、前記公報には、前記抽出物はミュータンス菌には影響を与えないこと、及び、水による抽出物でもクロロホルム−メタノールによる抽出物でも抗菌特性は変わらないことが開示される。クロロホルム−メタノールによる抽出では、タンパク質は変性のためクロロホルム−メタノール液層には分配されないと考えられるので、前記公報に開示される抗菌成分はタンパク質ではありえない。そこで、本発明の虫歯予防剤は、前記公報には開示も示唆もされていないと結論される。
【実施例４】
【００６６】
練歯磨の調製
下記の処方にしたがって練歯磨が調製される。
炭酸カルシウム ５０．００％
グリセリン ２０．００％
カラゲナン ０．５０％
カルボキシメチルセルロース １．００％
ラウリルジエタノールアマイド １．００％
ショ糖モノラウレート ２．００％
香料 １．００％
サッカリン ０．１０％
ミル抽出物 ０．０５％
水 残余
【実施例５】
【００６７】
練歯磨の調製
下記の処方にしたがって練歯磨が調製される。
水酸化アルミニウム ４５．００％
ゲル化性シリカ ２．００％
ソルビット ２５．００％
カルボキシメチルセルロース １．００％
ラウリル硫酸ナトリウム ２．００％
香料 １．００％
サッカリンナトリウム ０．１０％
ミル抽出物 ０．０４％
水 残余
【実施例６】
【００６８】
洗口液の調製
下記の処方にしたがって洗口液が調製される。
エタノール ２０．００％
香料 １．００％
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ０．３０％
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．１０％
サッカリンナトリウム ０．０５％
ミル抽出物 ０．０４％
水 残余
【実施例７】
【００６９】
チュ−インガムの調製
下記の処方にしたがってチュ−インガムが調製される。
砂糖 ５３．００％
ガムベ−ス ２０．００％
グルコ−ス １０．００％
香料 ０．５０％
ミル抽出物 ０．１０％
水飴 残余
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミル科藻類の藻体抽出物を含む虫歯予防剤、特に、ミル科藻類の藻体抽出物を含み、口腔内のプラーク又はバイオフィルムへの付着及び増殖を抑制する効果を有する虫歯予防剤と、該虫歯予防剤を含む、医薬品組成物、食品組成物、歯磨き剤及び口内洗浄剤とに関する。
【背景技術】
【０００２】
口腔細菌は、口腔内のプラーク又はバイオフィルムに付着して増殖し、齲蝕すなわち虫歯や歯槽膿漏その他の歯周病を引き起こす。前記プラーク又はバイオフィルムは、唾液の生体高分子が歯の表面に付着してペリクルという皮膜を形成し、該ペリクルに口腔細菌が付着することにより成長する。したがって虫歯や歯周病の予防のためにはペリクルへの口腔細菌の付着を抑制又は阻止する必要がある。エリスリトール、キシリトール等の糖アルコール類には虫歯抑制効果があることが知られているが、糖アルコールは口腔細菌の代謝により齲蝕の原因となる乳酸を産生しないために虫歯が出来にくくなるものであり、口腔細菌の付着の抑制や阻止には関与しない。
【０００３】
口腔細菌がペリクルや他の口腔細菌の菌体に付着する際には、口腔細菌の産生する糖鎖結合タンパク質のレクチンが関与していると考えられる。つまり、ペリクルに滞積した唾液の生体高分子、すなわち、多糖類又は糖タンパク質と口腔細菌レクチンとが糖鎖特異的な結合を行うことにより、ペリクルに口腔細菌が付着すると考えられる。すると、外部から口腔細菌のレクチンと競合するレクチンを口腔内に投与することによって、ペリクルの糖鎖への口腔細菌のレクチンの結合を阻害すれば、口腔細菌のバイオフィルムへの付着及び増殖を抑制又は阻害して、虫歯や歯周病のような口腔細菌による感染症を予防することができる。
【０００４】
実際にこのような発想に基づいて、口腔細菌とペリクルとの結合を阻害するレクチンが非特許文献１ないし３に報告されている。これらの文献で報告されたレクチンには、植物のグルコース・マンノース認識レクチンや、藻類のムチン認識レクチンがある。また、特許文献１には、マッシュルーム由来のレクチンＡＢＡ等には、口腔内のプラーク又はバイオフィルムへの付着及び増殖を抑制する効果があることが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｅｉｘｅｉｒａ， Ｅ．Ｈ．ら、Ｊ Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１０１： １１１−６ （２００６）．
【非特許文献２】Ｔｅｉｘｅｉｒａ， Ｅ．Ｈ．ら、Ｊ Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１０３： １００１−６ （２００７）．
【非特許文献３】Ｉｓｌａｍ，Ｂ．ら、Ｊ Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１０６： １６８２−９ （２００９）．
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６７９０３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、マッシュルームの抽出成分を用いて虫歯予防剤を開発する場合には、抽出成分中のタンパク質は１ミリリットルあたり数ミリグラムを必要とし、大量に安定して調製することが困難である。またマッシュルームの抽出成分は、強い臭い及びえぐみがあるので、食品に添加するのには適さない。そこで、臭いや味が問題にならないような材料に由来する虫歯予防剤を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ミル科藻類の藻体抽出物を含む虫歯予防剤を提供する。
【０００９】
本発明の虫歯予防剤において、前記藻類はミル属に属する場合がある。
【００１０】
本発明の虫歯予防剤において、前記藻類は、ミル、イセモミル、タマミル、コブシミル、クロミル、モツレミル及びナガミルからなるグループから選択される少なくとも１種類のミル属の生物種に属する場合がある。
【００１１】
本発明の虫歯予防剤において、前記藻類はミルの場合がある。
【００１２】
本発明の虫歯予防剤において、前記藻体抽出物は、粉砕された藻体を水溶液で抽出して得られる場合がある。
【００１３】
本発明の虫歯予防剤において、前藻体抽出物はＧａｌＮＡｃと競合する糖鎖に結合するレクチンの場合がある。
【００１４】
本発明は、本発明の虫歯予防剤を含む医薬品組成物を提供する。
【００１５】
本発明は、本発明の虫歯予防剤を含む食品組成物を提供する。
【００１６】
本発明は、本発明の虫歯予防剤を含む歯磨き剤を提供する。
【００１７】
本発明は、本発明の虫歯予防剤を含む口内洗浄剤を提供する。
【００１８】
本発明は、本発明の虫歯予防剤を口腔内に投与するステップを含む、虫歯の予防方法を提供する。
【００１９】
本発明の藻類は、緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、ミル目（Ｃｏｄｉａｌｅｓ、最近の分類ではハネモ目（Ｂｒｙｏｐｓｉｄａｌｅｓとされる場合がある。）のミル科（Ｃｏｄｉａｃｅａｅ）に属する。本発明の藻類は、ミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｆｒａｇｉｌｅ）、イセモミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ）、タマミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｍｉｎｕｓ）、コブシミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｓｐｏｎｇｉｏｓｕｍ）、クロミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｓｕｂｔｕｂｕｌｏｓｕｍ）、モツレミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｉｎｔｒｉｃａｔｕｍ）、ハイミル（Ｃｏｄｉｕｍ ａｄｈａｅｒｅｎｓ）、ナンバンハイミル（Ｃｏｄｉｕｍ ａｒａｂｉｃｕｍ）、ネザシミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｃｏａｃｔｕｍ）、ヒゲミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｂａｒｂａｔｕｍ）、サキブトミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｃｏｎｔｒａｃｔｕｍ）、ヒラミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｌａｔｕｍ）及びナガミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃｕｍ）を含むが、これらに限られない、ミル属（Ｃｏｄｉｕｍ）の生物種に属する場合がある。
【００２０】
本発明の藻類の抽出物を回収する方法は、口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、いかなる方法であってもかまわない。
【００２１】
本発明の藻類の抽出物は、藻体のいかなる組織から採取されてもかまわない。前記藻体は、洗浄後、ホモジナイザー等で破砕された後か、あるいは凍結乾燥で粉末状にされたり、粉砕機で粉末状にされた後に抽出処理を施される場合がある。抽出に用いる水溶液には、生理食塩水のようにＮａＣｌその他の塩類を含む水溶液と、アセトンその他の水溶性有機溶媒及び／又はアルコールと水との混合液と、精製水又は脱イオン水とを含むが、これらに限定されない、その他の当業者に周知の水性溶媒を用いることができる。ここで、前記アルコールは、エタノール、エチレングリコール、ブチレングリコール、グリセリンを含むが、これらに限定されないアルコールの場合がある。前記水性溶媒は酸性又はアルカリ性のｐＨを有する場合がある。前記水性溶媒のｐＨを調整するためには、アジピン酸、クエン酸、グルコン酸、コハク酸、酢酸、酒石酸、乳酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸塩類のカリウム又はナトリウム塩を含むが、これらに限られないｐＨ調整剤が用いられる場合がある。またｐＨを一定に保つために、Ｔｒｉｓ塩酸バッファー、Ｈｅｐｅｓバッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、クエン酸バッファー、グリシン−塩酸バッファーを含むが、これらに限られない、バッファーが用いられる場合がある。抽出方法は、浸漬抽出方法と、加圧抽出方法と、超臨界又は亜超臨界抽出方法とを含むが、これらに限られない。抽出条件は、口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、いかなる条件であってもかまわないが、抽出時間は１０分間から２４時間が好ましく、抽出温度は、４°Ｃ以上であってもよく、室温以上であることが好ましく、１５°Ｃ以上であることがより好ましい。
【００２２】
前記藻類の抽出物の精製及び濃縮は、遠心分離、塩析、透析、減圧濃縮、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を含むが、これらに限られない技術を、単独で、あるいは、いずれかの組み合わせで、利用して行われる場合がある。
【００２３】
精製又は濃縮後、必要に応じて、藻類の抽出物は、減圧乾燥されてもかまわないし、前記溶媒で希釈されてもかまわない。また、前記抽出物は混合して用いられてもかまわない。
【００２４】
本明細書においてレクチンとは、動物の免疫系に関与する抗体、Ｔ細胞レセプター、Ｔｏｌｌ様受容体その他の免疫タンパク質以外のタンパク質であって、糖鎖に特異的に結合する能力を有するタンパク質をいう。通常、レクチンは赤血球その他の動物細胞を凝集することができる。堀貫治（化学と生物、３２：５８６−５９４、（１９９４））によると、ミル科の藻類由来のレクチンはＧａｌＮａｃと競合する糖鎖に結合するという共通点がある。
【００２５】
本発明の抽出物又はレクチンは、ヒト、ブタ、ヒツジ、ウサギ等の血液を用いる当業者に周知の方法で赤血球凝集活性を測定することができる。テスト溶液を添加することによって赤血球が有意に凝集された場合には、前記テスト溶液中にはレクチンが含まれると推定することができる。また、前記テスト溶液にさまざまな糖を添加することによって赤血球凝集を低濃度で阻害するかどうかを調べることによって、前記レクチンが結合する糖鎖の構造を調べることができる。
【００２６】
本発明のレクチンはＧａｌＮＡｃと競合する。これは、本発明のレクチンが結合する糖鎖の末端がＧａｌＮＡｃであることを示唆する。しかし、本発明のレクチンは、末端にＧａｌＮＡｃを有する全ての糖鎖と結合するとは限らない。末端から２番目ないし３番目の糖残基が特定の構造の糖鎖とだけ結合するが、ＧａｌＮＡｃ存在下では結合が阻害される可能性がある。
【００２７】
本発明の虫歯予防剤に含まれるレクチンは、ミル目藻類の藻体抽出物から精製されたタンパク質か、組換えＤＮＡ技術によってさまざまな宿主で発現され精製されたタンパク質か、あるいは、前記藻体又はその抽出物であって、口腔内に投与されると口腔内硬組織への口腔細菌、特に、ミュータンス菌の付着及び増殖を抑制又は阻害する作用を発揮するのに十分な活性を有するものかの場合がある。すなわち、前記レクチンはミル目藻類の藻体そのものか、あるいは、その加工物かとして利用される場合がある。
【００２８】
本発明の虫歯予防剤の剤型は、本発明の口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、いかなる剤型であってもかまわない。
【００２９】
本発明の医薬品組成物は、口腔内硬組織への口腔細菌、特に、ミュータンス菌の付着及び増殖を抑制又は阻害するための全ての医薬品を含み、本発明の口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、他のいかなる成分を含むものであってもかまわない。
【００３０】
本発明の食品組成物は、本発明の口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、他のいかなる成分を含むものであってもかまわない。本発明の食品組成物は、エリスリトール、キシリトール等の糖アルコール類を含む場合がある。
【００３１】
本発明の歯磨き剤には、練り歯磨、液状歯磨及び潤製歯磨が含まれるが、これらに限定されない。本発明の口内洗浄剤は、洗口液、うがい用錠剤、トローチ及びチュウーインガムが含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明の歯磨き剤又は口内洗浄剤は、本発明の口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、他のいかなる成分を含むものであってもかまわない。前記成分の具体例は、賦形剤、乳化剤、安定剤、香料、甘味料が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
歯磨き剤の場合は、例えば、研磨剤、粘結剤、粘稠剤、界面活性剤、甘味剤、防腐剤、香料、着色剤、各種有効成分などを配合することができ、これらの成分を水と混合することにより製造することができる。なお、これらの成分の配合量は、本発明の口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわない範囲で通常量とすることができる。
【００３４】
研磨剤には、沈降性シリカ、シリカゲル、アルミノシリケート、ジルコノシリケート等のシリカ系研磨剤、第２リン酸カルシウム２水和物及び無水和物、ピロリン酸カルシウム、ゼオライト、ケイ酸ジルコニウム、合成樹脂系研磨剤等が含まれるが、これらに限定されない
【００３５】
粘結剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、カラギーナン、ゼラチン等が含まれるが、これらに限定されない。粘稠剤には、グリセリン、ソルビットが含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
界面活性剤としては、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤等を配合することができ、具体的には、ラウリル硫酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
甘味剤には、サッカリンナトリウム、ステビオサイド、ステビアエキスが含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
防腐剤には、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。香料には、１−メントールが含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
着色剤には、青色１号、黄色４号が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
各種有効成分には、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化アンモニウム等が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明のミル目藻類の藻体抽出物は、生理食塩水のようにＮａＣｌその他の塩類を含む水溶液と、アセトンその他の水溶性有機溶媒及び／又はアルコールと水との混合液と、精製水又は脱イオン水とを含むが、これらに限定されない、その他の当業者に周知の水性溶媒に溶解することができる。ここで、前記アルコールは、エタノール、エチレングリコール、ブチレングリコール、グリセリンを含むが、これらに限定されないアルコールの場合がある。前記水性溶媒は酸性又はアルカリ性のｐＨを有する場合がある。前記水性溶媒のｐＨを調整するためには、アジピン酸、クエン酸、グルコン酸、コハク酸、酢酸、酒石酸、乳酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸塩類のカリウム又はナトリウム塩を含むが、これらに限られないｐＨ調整剤が用いられる場合がある。またｐＨを一定に保つために、Ｔｒｉｓ塩酸バッファー、Ｈｅｐｅｓバッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、クエン酸バッファー、グリシン−塩酸バッファーを含むが、これらに限られない、バッファーが用いられる場合がある。本発明の抽出液のタンパク質濃度は、口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、いかなる濃度であってもかまわないが、３１．２５μｇ／ｍＬ以上が好ましく、１２５μｇ／ｍＬ以上がより好ましい。本発明のレクチン濃度は、口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性を実質的に損なわないことを条件として、いかなる濃度であってもかまわないが、０．５μｇ／ｍＬ以上が好ましく、５μｇ／ｍＬ以上がより好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】唾液がコーティングされた基質へのミュータンス菌の付着及び増殖に対するミル及びヤナギマツタケの抽出物による抑制効果を示すグラフ。
【図２】ミュータンス菌の付着及び増殖に対する、ミル及びヤナギマツタケ由来の精製レクチンによる抑制効果を示すグラフ。
【図３】別の実施例のミル由来の抽出物のタンパク質濃度と、ミュータンス菌の付着及び増殖に対する抑制効果との関係を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【００４４】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【実施例１】
【００４５】
ミル及びヤナギマツタケの抽出成分のミュータンス菌の付着及び増殖に対する抑制効果
抽出液の調製
原料として、ミル（Ｃｏｄｉｕｍ ｆｒａｇｉｌｅ）の藻体と、ヤナギマツタケ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）の子実体とが用いられた。前記原料は、乾燥されない生の海藻及びキノコの状態で栽培業者から購入された。前記原料５０ないし１００ｇに１０倍量のＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３、Ｄ５６５２、シグマアルドリッチ、以下、「ＰＢＳ」という。）が添加され、直径０．５ｍｍのビーズと、ビーズ式組織破砕装置（Ｂｅａｄ−Ｂｅａｔｅｒ、１１０７９００、Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔ社）とを用いてペースト状になるまで５０００ｒｐｍ２分間破砕された。その後、室温で３０分間静置され、ミル及びヤナギマツタケの抽出液が調製された。前記抽出液は、３７，０００×ｇで１５分間遠心され、上清が採取された。抽出液のタンパク質濃度は、ＢＣＡプロテインアッセイキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて測定された。抽出液のＰＢＳによる２倍希釈系列が調製され、ミュータンス菌の付着及び増殖に対する効果を評価する実験に供された。
【００４６】
ミュータンス菌は、Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ Ｂｒｏｔｈで３７°Ｃ、終夜培養され、１，０００×ｇ、１０分間の遠心により上清除去後、等量のＰＢＳに懸濁された。同様の操作を２度繰り返して洗浄した後、６６０ｎｍで吸光度が測定された。測定された吸光度を基に、ミュータンス菌はＰＢＳでＯＤ６６０が０．０５又は０．１になるように希釈され、ミュータンス菌サンプル液が調製された。前記サンプル液は密封され、２５°Ｃで５時間保温された後に用いられた。
【００４７】
抽出液のバイオフィルム抑制アッセイ
マルチプレート（平底、９６穴、ポリスチレン製、Ｎｕｎｃ社 マルチソープ ｃｏｄｅ：４６７１４０）に歯磨き後３時間のヒト唾液を１００μＬ添加され、３７°Ｃで２時間のコーティングが行われた。実験には、異なる３名の被験者のヒト唾液が用いられた。その後前記マルチプレートはＰＢＳで洗浄され、ＰＢＳで希釈されたミル及びヤナギマツタケの抽出液が添加されて３７°Ｃで１時間インキュベーションされた。その後前記マルチプレートがＰＢＳで洗浄され、１００μＬのＰＢＳ中の５×１０７個のミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）が各ウェルに添加されて３７°Ｃで終夜培養された。前記プレートはＰＢＳで洗浄され、０．２５％のグルタルアルデヒド／ＰＢＳが１００μＬ添加されて室温で３０分間固定された。その後ＰＢＳで洗浄され、２．３％のクリスタルバイオレット（グラム染色用）が１００μＬ添加されて室温で１時間染色された。その後流水で洗浄され、エタノールが１００μＬ添加されて室温で１時間色素が溶出された。菌体数の定量は、プレートリーダーを用いて各ウェルのエタノール液中の色素濃度を吸光波長５７０ｎｍで測定することによって実施された。
【００４８】
口腔細菌と唾液の生体高分子との結合を抑制又は阻害する活性は抑制指数Ｉｘとして定量化された。すなわち、同一条件ごとの吸光度の測定値の平均Ａｘと、異なる被験者ごとの唾液によるコーティングを行わなかったウェルの吸光度の測定値の平均Ａｎと、異なる被験者ごとの唾液によるコーティングを行ったが、レクチンによるインキュベーションを行わなかったウェルの吸光度の測定値の平均Ａｐとから、同一条件ごとの抑制指数Ｉｘが以下の式（Ｉ）を用いて算出され、プロットされた。
【００４９】
式（Ｉ） Ｉｘ＝１００×（Ａｘ−Ａｎ）／（Ａｐ−Ａｎ）
【００５０】
抑制指数Ｉｘの値が小さいほど、ミュータンス菌の付着及び増殖が抽出物又は精製レクチンによって抑制されたことを示す。
【００５１】
アッセイの結果
図１は、唾液がコーティングされた基質へのミュータンス菌の付着及び増殖に対するミル及びヤナギマツタケの抽出物による抑制効果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は同一条件ごとに２回繰り返した実験結果の測定値の標準偏差を示す。図１の右端から４本の棒グラフは対照実験の結果で、右端から順に、レクチン−、唾液＋及びミュータンス菌＋（唾液＋ミュータンス菌（レクチン無しの陽性対照））と、レクチン−、唾液−及びミュータンス菌＋（ミュータンス菌のみ）と、レクチン−、唾液＋及びミュータンス菌−（唾液のみ）と、レクチン−、唾液−及びミュータンス菌−（ウェルのみ）との４種類の条件であった。各条件の抑制指数は、唾液＋ミュータンス菌では１００、ミュータンス菌のみでは２０であり、唾液のみ及びウェルのみでは有意な抑制指数は示されなかった。ミル抽出物の抑制指数は、タンパク質濃度が０．０３１２５ｍｇ／ｍＬのとき９０で、０．０６２５ｍｇ／ｍＬのとき８０で、０．１２５ｍｇ／ｍＬ及び０．２５ｍｇ／ｍＬのときはいずれも６０で、０．５ｍｇ／ｍＬのとき５５であった。また、ヤナギマツタケ抽出物の抑制指数は、タンパク質濃度が０．３１２５ｍｇ／ｍＬのとき１４５で、０．６２５ｍｇ／ｍＬのとき１３５で、１．２５ｍｇ／ｍＬのとき１３０で、２．５ｍｇ／ｍＬのとき１００で、５ｍｇ／ｍＬのとき６５であった。以上の結果から、ミュータンス菌の付着及び増殖を抑制する効果は、ミル抽出物では０．０３１２５ｍｇ／ｍＬないし２ｍｇ／ｍＬの範囲で認められ、ヤナギマツタケ抽出物では５ｍｇ／ｍＬのみで認められた。したがって、ミル抽出物にはヤナギマツタケ抽出物の１００分の１未満の濃度でミュータンス菌の付着及び増殖を抑制する効果があり、ミュータンス菌の付着及び増殖を抑制する因子の活性が非常に高いことが示された。
【実施例２】
【００５２】
ミル及びヤナギマツタケのレクチンの精製
ミル及びヤナギマツタケの抽出物は実施例１と同様にして調製された。前記抽出物それぞれは、糖タンパク質（アシアロフェツイン、Ａ４７８１、シグマアルドリッチ社）が固定された担体（ＧＥヘルスサイエンス、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を充填したカラムに適用された。アシアロフェツインと特異的に結合しない物質がＰＢＳで溶出された後、アシアロフェツインとの結合がＧａｌＮＡｃによって競合阻害される物質が２００ｍＭ ＧａｌＮＡｃを含むＰＢＳで溶出された。前記抽出物のタンパク質濃度と、精製されたレクチンのタンパク質濃度とは、ＢＣＡ プロテインアッセイキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて測定された。
【００５３】
精製の結果
表１は、ミル及びヤナギマツタケから精製されたレクチンのタンパク質の量及び収率を示す。ミルからは糖鎖結合タンパク質５．８ｍｇが、ヤナギマツタケ４９ｇからは糖鎖結合タンパク質０．２ｍｇが、それぞれ採取された。ミル及びヤナギマツタケのレクチン精製収率は、それぞれ８．１１％及び０．０２％であった。
【００５４】
【表１】
【００５５】
精製レクチンによるバイオフィルム抑制アッセイ
ミュータンス菌の付着及び増殖に対する精製レクチンによる抑制効果は実施例１と同様の手順で評価された。対照として、ＡＢＡ（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（マッシュルーム由来の血液凝集素）、３０００９２、生化学バイオビジネス）と、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、８１−００３−３、ミリポア）とが用いられた。
【００５６】
アッセイの結果
図２は、ミュータンス菌の付着及び増殖に対する、ミル及びヤナギマツタケ由来の精製レクチンによる抑制効果を示すグラフである。各実験条件の誤差棒は同一条件ごとに２回繰り返した実験結果の測定値の標準偏差を示す。
【００５７】
図２の右端から４本の棒グラフは対照実験の結果で、右端から順に、レクチン−、唾液−及びミュータンス菌−（ウェルのみ）と、レクチン−、唾液−及びミュータンス菌＋（ミュータンス菌のみ）と、レクチン−、唾液＋及びミュータンス菌−（唾液のみ）と、レクチン−、唾液＋及びミュータンス菌＋（唾液＋ミュータンス菌（レクチン無しの陽性対照））との４種類の条件であった。各条件の抑制指数は、唾液＋ミュータンス菌では１００、ミュータンス菌のみでは１４であり、唾液のみ及びウェルのみでは有意な抑制指数は示されなかった。また、ＡＢＡ及びＢＳＡの濃度が１００μｇ／ｍＬの抑制指数は、それぞれ、２４及び９７であった。精製レクチンの濃度が、０．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ及び４０μｇ／ｍＬの抑制指数は、ミルでは、１０２、７６及び２６であり、ヤナギマツタケでは、９１、８４及び３９であった。以上の結果から、ミル及びヤナギマツタケの精製レクチンは、ミュータンス菌の付着及び増殖を顕著に抑制することが示された。また、４０μｇ／ｍＬのミルの精製レクチンは、１００μｇ／ｍＬのＡＢＡと同程度にミュータンス菌の付着及び増殖を抑制することが示された。
【実施例３】
【００５８】
別のプロトコールで調製されたミル由来のタンパク質のミュータンス菌の付着及び増殖に対する抑制効果
ミル由来タンパク質の調製
生ミル１７．４９ｋｇが４０°Ｃで乾燥された。乾燥重量１．５ｋｇの乾燥されたミルの藻体は、ミキサー粉砕で粉末化された後、３０Ｌの精製水が添加され、１５°Ｃで１６時間攪拌され、可溶性成分が抽出された。前記可溶性成分を含む溶液は４，０００×ｇの連続遠心により固形物が除去され、上清が採取された。前記上清は、６０°Ｃで減圧乾燥された。抽出液のタンパク質濃度は、ＢＣＡプロテインアッセイキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて測定された。抽出液のＰＢＳによる２倍希釈系列が調製され、ミュータンス菌の付着及び増殖に対する効果を評価する実験に供された。
【００５９】
マッシュルーム及びヤナギマツタケ由来のタンパク質の調製
９．１ｇのマッシュルームと、５０ｋｇのヤナギマツタケが前節に説明されたミルと同様に、乾燥の後、精製水で可溶性成分が抽出された。抽出物のタンパク質濃度もミルと同様にして測定された。
【００６０】
バイオフィルム抑制アッセイ
ミュータンス菌の付着及び増殖に対するミル等の抽出物による抑制効果は実施例１と同様の手順で評価された。
【００６１】
結果
図３は、ミル由来の精製水抽出物のタンパク質濃度と、ミュータンス菌の付着及び増殖に対する抑制効果との関係を示すグラフである。図３から明らかなとおり、ミル由来の精製水抽出物はタンパク質濃度が２５μｇ／ｍＬと５０μｇ／ｍＬとの間で急激に抑制指数が低下し、５０％抑制濃度は４０μｇ／ｍＬであった。
【００６２】
以下の表２は、ミル、マッシュルーム及びヤナギマツタケの精製水抽出物の精製結果と、５０％抑制濃度とを示す表である。ミル、マッシュルーム及びヤナギマツタケの精製水抽出物から回収された固形物は、それぞれ、４６１ｇ、２５．５ｍｇ及び１５５０ｇであり、その中のタンパク質含有量は、それぞれ、８．３ｇ、９．９ｍｇ及び５０６ｇであった。そして、ミル、マッシュルーム及びヤナギマツタケの精製水抽出物の５０％抑制濃度は、それぞれ、４０μｇ／ｍＬ、９０μｇ／ｍＬ及び４０００μｇ／ｍＬであった。
【００６３】
【表２】
【００６４】
以上の結果から、本実施例の精製水抽出物では、ミルが最も低い濃度でミュータンス菌のバイオフィルム形成を抑制できることが明らかになった。
【００６５】
ミルはほぼ無味無臭の海藻で、海松として我が国では古来食べられてきた記録がある。そこで、ミルの抽出物又は精製レクチンは安全性からも問題がない。なお、ミル属を含む多数の属の緑藻類の海藻由来の抽出物が、歯周病原菌ポルフィロモナス ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）に対して抗菌力を示すことは、特開平９−４８７１５号出願公開公報に開示されている。しかし、前記公報には、前記抽出物はミュータンス菌には影響を与えないこと、及び、水による抽出物でもクロロホルム−メタノールによる抽出物でも抗菌特性は変わらないことが開示される。クロロホルム−メタノールによる抽出では、タンパク質は変性のためクロロホルム−メタノール液層には分配されないと考えられるので、前記公報に開示される抗菌成分はタンパク質ではありえない。そこで、本発明の虫歯予防剤は、前記公報には開示も示唆もされていないと結論される。
【実施例４】
【００６６】
練歯磨の調製
下記の処方にしたがって練歯磨が調製される。
炭酸カルシウム ５０．００％
グリセリン ２０．００％
カラゲナン ０．５０％
カルボキシメチルセルロース １．００％
ラウリルジエタノールアマイド １．００％
ショ糖モノラウレート ２．００％
香料 １．００％
サッカリン ０．１０％
ミル抽出物 ０．０５％
水 残余
【実施例５】
【００６７】
練歯磨の調製
下記の処方にしたがって練歯磨が調製される。
水酸化アルミニウム ４５．００％
ゲル化性シリカ ２．００％
ソルビット ２５．００％
カルボキシメチルセルロース １．００％
ラウリル硫酸ナトリウム ２．００％
香料 １．００％
サッカリンナトリウム ０．１０％
ミル抽出物 ０．０４％
水 残余
【実施例６】
【００６８】
洗口液の調製
下記の処方にしたがって洗口液が調製される。
エタノール ２０．００％
香料 １．００％
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ０．３０％
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．１０％
サッカリンナトリウム ０．０５％
ミル抽出物 ０．０４％
水 残余
【実施例７】
【００６９】
チュ−インガムの調製
下記の処方にしたがってチュ−インガムが調製される。
砂糖 ５３．００％
ガムベ−ス ２０．００％
グルコ−ス １０．００％
香料 ０．５０％
ミル抽出物 ０．１０％
水飴 残余
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミル科藻類の藻体抽出物を含むことを特徴とする、虫歯予防剤。
【請求項２】
前記藻類はミル属に属することを特徴とする、請求項１に記載の虫歯予防剤。
【請求項３】
前記藻類は、ミル、イセモミル、タマミル、コブシミル、クロミル、モツレミル、ハイミル、ナンバンハイミル、ネザシミル、ヒゲミル、サキブトミル、ヒラミル及びナガミルからなるグループから選択される少なくとも１種類のミル属の生物種に属することを特徴とする、請求項２に記載の虫歯予防剤。
【請求項４】
前記藻類はミルであることを特徴とする、請求項３に記載の虫歯予防剤。
【請求項５】
前記藻体抽出物は、粉砕された藻体を水溶液で抽出して得られることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の虫歯予防剤。
【請求項６】
前記藻体抽出物は、ＧａｌＮＡｃと競合する糖鎖に結合するレクチンであることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の虫歯予防剤。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１つに記載の虫歯予防剤を含むことを特徴とする、医薬品組成物。
【請求項８】
請求項１ないし６のいずれか１つに記載の虫歯予防剤を含むことを特徴とする、食品組成物。
【請求項９】
請求項１ないし６のいずれか１つに記載の虫歯予防剤を含むことを特徴とする、歯磨き剤。
【請求項１０】
請求項１ないし６のいずれか１つに記載の虫歯予防剤を含むことを特徴とする、口内洗浄剤。
【請求項１】
ミル科藻類の藻体抽出物を含むことを特徴とする、虫歯予防剤。
【請求項２】
前記藻類はミル属に属することを特徴とする、請求項１に記載の虫歯予防剤。
【請求項３】
前記藻類は、ミル、イセモミル、タマミル、コブシミル、クロミル、モツレミル、ハイミル、ナンバンハイミル、ネザシミル、ヒゲミル、サキブトミル、ヒラミル及びナガミルからなるグループから選択される少なくとも１種類のミル属の生物種に属することを特徴とする、請求項２に記載の虫歯予防剤。
【請求項４】
前記藻類はミルであることを特徴とする、請求項３に記載の虫歯予防剤。
【請求項５】
前記藻体抽出物は、粉砕された藻体を水溶液で抽出して得られることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の虫歯予防剤。
【請求項６】
前記藻体抽出物は、ＧａｌＮＡｃと競合する糖鎖に結合するレクチンであることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の虫歯予防剤。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１つに記載の虫歯予防剤を含むことを特徴とする、医薬品組成物。
【請求項８】
請求項１ないし６のいずれか１つに記載の虫歯予防剤を含むことを特徴とする、食品組成物。
【請求項９】
請求項１ないし６のいずれか１つに記載の虫歯予防剤を含むことを特徴とする、歯磨き剤。
【請求項１０】
請求項１ないし６のいずれか１つに記載の虫歯予防剤を含むことを特徴とする、口内洗浄剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−２４６４６５（Ｐ２０１１−２４６４６５Ａ）
【公開日】平成２３年１２月８日（２０１１．１２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０１２３０（Ｐ２０１１−１０１２３０）
【出願日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【出願人】（５０６１１５２３７）株式会社グライエンス (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月８日（２０１１．１２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【出願人】（５０６１１５２３７）株式会社グライエンス (2)
【Ｆターム（参考）】
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