蛍光検出方法および蛍光検出装置
【課題】表面プラズモンを利用した蛍光検出において、測定ごとに生じる電場増強場の強度のばらつきを抑えた再現性のある測定を、より簡単かつ低コストに実現する。
【解決手段】表面プラズモンを利用した蛍光検出において、金属膜１２上に生じる電場増強場Ｅｗの強度に略比例するこの電場増強場Ｅｗの散乱光Ｌｓを用いて、電場増強場Ｅｗの強度に対し、蛍光標識Ｆから発せられる蛍光Ｌｆの蛍光量を規格化して補正する。
【解決手段】表面プラズモンを利用した蛍光検出において、金属膜１２上に生じる電場増強場Ｅｗの強度に略比例するこの電場増強場Ｅｗの散乱光Ｌｓを用いて、電場増強場Ｅｗの強度に対し、蛍光標識Ｆから発せられる蛍光Ｌｆの蛍光量を規格化して補正する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモンを利用した蛍光検出方法および蛍光検出装置に関するものであり、特に詳細には、検出した蛍光量を補正する補正機構を有する蛍光検出方法および蛍光検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質やＤＮＡ等を検出するバイオ測定において、全反射照明を利用した検出方法が注目されている。この検出方法は、屈折率の異なる界面で測定光が全反射する際に界面からしみ出す光、すなわちエバネッセント波と、試料中に含まれる被検出物質あるいはこの被検出物質に付けられている標識との散乱、吸収、発光等の光学的な相互作用を分析ことにより、上記被検出物質の存在またはその量を検出する方法である。
【０００３】
このような検出方法の一例としては、蛍光性標識を用いた蛍光検出方法がある（非特許文献１）。
【０００４】
蛍光検出方法は、冷却ＣＣＤ等光検出器の高性能化と相まって、バイオ研究には欠かせない道具となっている。また、蛍光性標識に用いる材料においても、特に可視領域では蛍光量子収率の高い蛍光色素、例えばＦＩＴＣ（蛍光：５２５ｎｍ、蛍光量子収率：０．６）やＣｙ５（蛍光：６８０ｎｍ、蛍光量子収率：０．３）のような実用の目安となる０．２を超える蛍光色素が開発され広く用いられている。さらに、表面プラズモンによる電場の増強を用いて、蛍光信号を増大することにより、１ｐＭ（ピコモーラ）を切るような高感度検出も実現されている。
【０００５】
図３を用いて、上記蛍光検出方法の原理を簡単に説明する。
【０００６】
図３は蛍光検出装置の概念図である。説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
【０００７】
図３に示す蛍光検出装置は、誘電体プレート１１と、その一面の所定領域に設けられた金属膜１２とを備えたセンサチップ１０、励起光Ｌｏを誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で全反射条件を満たす入射角度で、センサチップ１０の金属膜形成面とは反対の側から励起光Ｌｏを照射する励起光照射光学系２０と、金属膜１２に接触している試料Ｓ中に蛍光標識Ｆが付与された被検出物質Ａが存在する場合に、この被検出物質Ａに付与された蛍光標識Ｆから生じる蛍光Ｌｆを検出する光検出器３０とを備えている。
【０００８】
この蛍光検出装置において、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜１２上の試料Ｓ中にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。そして、このエバネッセント波と表面プラズモンにより金属膜１２の表面に電場増強作用を有する電場増強場Ｅｗが局所的に形成される。
【０００９】
今、被検出物質としての抗原Ａを含む試料Ｓから、抗原Ａを検出する場合を考える。金属膜１２上には抗原Ａと特異的に結合する抗原Ａに対する１次抗体Ｂ１が修飾されている。そして試料保持部１３中に試料Ｓが流され、次いで同様に抗原Ａと特異的に結合し、かつ蛍光標識Ｆが修飾された２次抗体Ｂ２が流される。このとき、蛍光標識Ｆは、１次抗体Ｂ１、抗原Ａおよび２次抗体Ｂ２による特異的な結合を介して金属膜１２に固定される。
【００１０】
上記の場合には、電場増強場Ｅｗ内に蛍光標識Ｆが存在することとなり、この蛍光標識Ｆが励起されて蛍光Ｌｆを発することとなる。従って、この蛍光Ｌｆを検出することにより、抗原Ａを検出することができる。なお、蛍光Ｌｆによって直接確認しているのは蛍光標識Ｆであるが、抗原Ａが存在しなければ、蛍光標識Ｆは金属膜１２に固定されることがない。つまり、この蛍光標識Ｆの存在を確認することにより、上記２次抗体Ｂ２と抗原Ａとの結合、すなわち抗原Ａの存在を間接的に確認している。
【非特許文献１】Margarida M. L. M. Vareiro, et al., Analytical Chemistry, Vol. 77, No. 8, p.2426-2431 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上記のような蛍光検出方法において、表面プラズモンによる電場増強場の強度のばらつきに寄与する因子が多いため、測定ごとにこれらの因子を完全に同一に測定条件をそろえることは難しい。これは、試料に実際に含まれている被検出物質が同数であっても、検出される蛍光量がばらつき再現性に乏しいという問題を生じさせる。これらの因子としては、例えば、センサチップの形状誤差およびセッティング誤差、センシング誤差および光学系誤差等の人為的要因による励起光の入射角度のずれや、サンプルの屈折率、センサチップの屈折率およびその表面の凹凸並びに金属膜の厚みおよびその密度等の物理的要因による表面プラズモン発生条件のずれ等が挙げられる。また、測定環境における温度変化についても、上記のような条件のずれを後発的に生じさせる可能性があるため、充分に考慮する必要がある。
【００１２】
一方、上記のような因子は、測定ごとに最適な部品を選択または交換することにより抑えることはできるが、すべての因子を部品の選択または交換によって抑えるには、非常に多くの手間とコストがかかってしまう。
【００１３】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、測定ごとに生じる電場増強場の強度のばらつきを抑えた再現性のある測定を、より簡単かつ低コストに実現する蛍光検出方法および蛍光検出装置の提供を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明による蛍光検出方法は、
誘電体プレートと、誘電体プレートの一面の所定領域に設けられ、かつ蛍光標識が付与された被検出物質を含む試料が供給される金属膜とを用意し、
誘電体プレートと金属膜との界面に対して、金属膜の上面に電場増強場を発生せしめるように、誘電体プレートを通して励起光を照射し、
電場増強場の励起効果によって蛍光標識から生じる蛍光を第１の光検出器により検出し、
第１の光検出器によって検出された蛍光量に基づいて被検出物質の存在量を検出する蛍光検出方法において、
光強度が電場増強場の強度に略比例するこの電場増強場の散乱光を、第２の光検出器によって検出し、
第２の光検出器によって検出された散乱光量を用いて、電場増強場の強度に対し蛍光量を規格化して補正することを特徴とするものである。
【００１５】
そして、本発明による蛍光検出方法において、補正後の蛍光量である補正蛍光量Ｉｆｃを、蛍光量Ｉｆと散乱光量Ｉｓとを用いて、下記式（１）から求めることが好ましい。
Ｉｆｃ＝Ｉｆ／Ｉｓ・・・（１）
【００１６】
ここで、「電場増強場」とは、誘電体プレートと金属膜との界面に対してこの界面で全反射条件を満たすように励起光を照射することによって生じるエバネッセント波と、このエバネッセント波に誘起されて金属膜中に生じる表面プラズモンの電場増強効果とによって、局所的に金属膜の上面に発生する電場の増強作用を有する領域を意味するものとする。
【００１７】
そして、「電場増強場の強度に対し蛍光量を規格化」するとは、ある一定の電場増強場の強度に対して基準となる蛍光量を決め、実測した蛍光量をその基準となる蛍光量から相対的に見積もることを意味するものとする。
【００１８】
一方、本発明による蛍光検出装置は、
誘電体プレートと、
誘電体プレートの一面の所定領域に設けられ、かつ蛍光標識が付与された被検出物質を含む試料が供給される金属膜と、
誘電体プレートと金属膜との界面に対して、金属膜の上面に電場増強場を発生せしめるように、誘電体プレートを通して励起光を照射する光源と、
電場増強場の励起効果によって蛍光標識から生じる蛍光を検出するように配置された第１の光検出器とを有し、
第１の光検出器によって検出された蛍光量に基づいて被検出物質の存在量を検出する蛍光検出装置において、
光強度が電場増強場の強度に略比例するこの電場増強場の散乱光を検出するように配置された第２の光検出器と、
第２の光検出器によって検出された散乱光量を用いて、電場増強場の強度に対し蛍光量を規格化して補正する補正機構とを有することを特徴とするものである。
【００１９】
そして、本発明による蛍光検出装置において、補正機構は、補正後の蛍光量である補正蛍光量Ｉｆｃを、蛍光量Ｉｆと散乱光量Ｉｓとを用いて、上記式（１）から求める手段を有するものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明による蛍光検出方法および蛍光検出装置では、励起光の照射により生じる電場増強場の散乱光の散乱光量に基づいて、測定ごとに検出した蛍光量を補正している。蛍光量と散乱光量は、共に電場増強場の発生状態に依存している。また、電場増強場の発生状態は、測定環境に依存している。従って、電場増強場の発生状態の指標として、光強度が電場増強場の強度に略比例するこの散乱光を用いることにより、電場増強場の強度に対し蛍光量を規格化して補正することが可能となる。これにより、測定ごとにその条件に適した補正が可能となり、測定ごとに生じる電場増強効果の強度のばらつきに寄与する因子を抑えることができるため、測定ごとに最適な部品の選択または交換を行う必要がなく、再現性のある測定をより簡単かつ低コストに実現することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明における最良の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【００２２】
「蛍光検出方法および蛍光検出装置」
図１は、本実施形態による蛍光検出装置の概略図である。
【００２３】
図示の通り、この蛍光検出装置は、誘電体プレート１１と金属膜１２からなるセンサチップ１０と、蛍光標識Ｆを励起しうる所定波長の励起光Ｌｏを発する光源２１と、センサチップ１０を設置するプリズム２２と、センサチップ１０上に供給された蛍光標識Ｆから発せられる蛍光Ｌｆを検出する第１の光検出器３０ａと、第１の光検出器３０ａに蛍光Ｌｆを導光するように配置された２つの平凸レンズ２４と、２つの平凸レンズ２４の間に配置された電場増強場Ｅｗの散乱光Ｌｓを遮断する光学フィルタ２３と、散乱光Ｌｓを検出するように配置された第２の光検出器３０ｂと、第１の光検出器３０ａおよび第２の光検出器３０ｂが共に接続されたパーソナルコンピュータ（ＰＣ）４０からなる。ここで、光源２１は、センサチップ１０上で電場増強場Ｅｗを生じせしめるように誘電体プレート１１に対してプリズム２２側に配置されており、蛍光標識Ｆは、１次抗体Ｂ１、抗原Ａおよび２次抗体Ｂ２を介して金属膜１２に固定されている。ＰＣ４０は、第２の光検出器３０ｂによって検出された、電場増強場Ｅｗの強度に略比例する散乱光Ｌｓの散乱光量を用いて、電場増強場Ｅｗの強度に対し蛍光量を規格化して補正する補正機構を有するものである。また、図１中の符号２５は、２つの平凸レンズ２４と光学フィルタ２３とを含み、第１の光検出器３０ａが装着されている光学系保持部である。
【００２４】
センサチップ１０は、特に制限されないが、前述した図３のセンサチップ１０と同様のものである。センサチップ１０は、誘電体プレート１１の一表面の所定領域に金属膜１２が形成されたものである。
【００２５】
誘電体プレート１１は、例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。誘電体プレート１１は樹脂から形成されたものが望ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を用いることがより望ましい。
【００２６】
金属膜１２は、既知の蒸着法で成膜形成することができる。金属膜１２の厚みは、金属膜１２の材料と、励起光Ｌｏの波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが望ましい。例えば、励起光Ｌｏとして７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜１２として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜１２の厚みは５０ｎｍ±５ｎｍが好適である。なお、金属膜１２は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
【００２７】
なお、センサチップ１０上に液体試料を保持する試料保持部が備えられ、センサチップ１０と試料保持部により液体試料を保持可能な箱状セルが構成されていてもよい。一方、センサチップ１０上に表面張力で留まる程度の微量な液体試料を測定する場合には、試料保持部を備えない態様であってもよい。
【００２８】
プリズム２２は、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で励起光Ｌｏが全反射するようにこの界面に励起光Ｌｏを導光するものである。なお、プリズム２２と誘電体プレート１１とは、屈折率マッチングオイルを介して接触されている。
【００２９】
光源２１は、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。前述のように、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で励起光Ｌｏが全反射すると共に金属膜１２で表面プラズモン共鳴する特定の角度で入射するように配置されている。さらに、光源２１とプリズム２２との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。なお、励起光Ｌｏは、表面プラズモンを誘起するようにＰ偏向で界面に対して入射させることが好ましい。
【００３０】
励起光Ｌｏは、例えばレーザ光源等から得られる単波長光でも白色光源等から得られるブロード光でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。
【００３１】
第１の光検出器３０ａは、試料Ｓ中に含まれる蛍光標識Ｆが発する蛍光Ｌｆを定量的に検出するものであればよく、検出条件に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。また、光検出器は、検出条件に応じて光学フィルタや分光器等の分光手段と組み合わせて用いることができる。なお、光学系保持部２５、２つの平凸レンズ２４、光学フィルタ２３および光検出器３０ａを備えるものとして、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）を好適に用いることができる。
【００３２】
第２の光検出器３０ｂも同様に、検出条件に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。また、光検出器は、検出条件に応じて光学フィルタや分光器等の分光手段と組み合わせて用いることができる。第２の光検出器３０ｂは、図１に示すように、エバネッセント波の進行方向（図１中紙面右側）から散乱光Ｌｓを検出することが好ましい。これにより、ミー散乱によって指向性のある散乱光Ｌｓを効率的に検出することが可能となる。なお、第２の光検出器３０ｂは図２に示すように、光学系保持部２５の内部に組み込んでもよい。このとき、前述した光学フィルタ２３に代えてダイクロイックミラー２３’を用いることにより、蛍光Ｌｆと散乱光Ｌｓを効率よく検出することができる。
【００３３】
ＰＣ４０は、第２の光検出器３０ｂによって検出された、光強度が電場増強場Ｅｗの強度に略比例する散乱光Ｌｓの散乱光量を用いて、電場増強場Ｅｗの強度に対し蛍光量を規格化して補正する補正機構の役割を果たす。なお、上記補正機構の役割を果たせば、特にＰＣ４０に制限されず他の電子計算機等を用いてもよい。
【００３４】
以下、上記蛍光検出装置を用いて、被検出物質としての抗原Ａを含む試料Ｓから、抗原Ａを検出する場合における蛍光検出方法について説明する。
【００３５】
この蛍光検出装置において、光源２１により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜１２上の試料Ｓ中にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。そして、このエバネッセント波と表面プラズモンにより金属膜１２表面に電場増強作用を有する電場増強場Ｅｗが局所的に形成される。
【００３６】
今、被検出物質としての抗原Ａを含む試料Ｓから、抗原Ａを検出する場合を考える。金属膜１２上には抗原Ａと特異的に結合する１次抗体Ｂ１が修飾されている。そして、試料Ｓが流され、次いで同様に抗原Ａと特異的に結合し、かつ蛍光標識Ｆが修飾された２次抗体Ｂ２が流される。このとき、蛍光標識Ｆは、１次抗体Ｂ１、抗原Ａおよび２次抗体Ｂ２による特異的な結合を介して金属膜１２に固定される。
【００３７】
上記の場合には、電場増強場Ｅｗ内に蛍光標識Ｆが存在することとなり、電場増強場Ｅｗの励起効果によってこの蛍光標識Ｆが励起されて蛍光Ｌｆを発することとなる。このとき、理論的にはこの蛍光量を用いて被検出物質の存在量を算出することが可能であるが、実際はセンサチップの形状誤差およびセッティング誤差、センシング誤差および光学系誤差等の人為的要因による励起光の入射角度のずれや、サンプルの屈折率、センサチップの屈折率およびその表面の凹凸並びに金属膜の厚みおよびその密度等の物理的要因による表面プラズモン発生条件のずれ等の影響により、電場増強場Ｅｗの強度にばらつきがあるため補正が必要となる。
【００３８】
そこで、誘電体プレート１１や金属膜１２の表面の凹凸等により生じる電場増強場Ｅｗの散乱光Ｌｓを用いて蛍光量を補正する。補正は、光強度が電場増強場Ｅｗの強度に略比例する散乱光Ｌｓの散乱光量Ｉｓを用いて、電場増強場Ｅｗの強度に対し蛍光量Ｉｆを規格化して行う。このような補正が可能となるのは、電場増強場Ｅｗの散乱される割合が、上記のような励起光Ｌｏの入射角度のずれや表面プラズモン発生条件のずれ等により変化しないためである。さらには、散乱光量Ｉｓが電場増強場Ｅｗの強度に略比例することから、この散乱光量Ｉｓが電場増強場Ｅｗの強度を見積もる指標となるためである。
【００３９】
以下、下記表１の用いながら補正の方法の例を説明し、本発明による蛍光検出方法および蛍光検出装置の作用を説明する。
【表１】
【００４０】
上記表は、ある別々の試料を測定したＣＡＳＥ１〜４の散乱光量の実測値、蛍光量の実測値およびこれら２つの実測値を用いて補正された補正蛍光量を表している。なお、表の数値は、ＣＡＳＥ１を基準とした相対的な数値（無単位系）である。
【００４１】
まず、ＣＡＳＥ２の場合を考える。この場合において、散乱光量の実測値および蛍光量の実測値は、それぞれ０．５および０．５である。実測値からするとＣＡＳＥ１に比べて蛍光量が０．５と半減しているが、散乱光量も０．５と半減していることがわかる。つまり、これは、上記のような励起光の入射角度のずれや表面プラズモン発生条件のずれ等により、電場増強場の強度自体が半減していることを示唆している。そこで、ＣＡＳＥ１を基準とするため、電場増強場Ｅｗの強度に対し蛍光量を規格化して補正する必要が生じる。その具体的な補正の方法は、電場増強場Ｅｗの散乱光Ｌｓが電場増強場Ｅｗの強度に略比例するということを活かして、例えば下記式（１）を用いて行う方法がある。ここで、Ｉｆｃ、ＩｆおよびＩｓは、それぞれ補正後の蛍光量、蛍光量の実測値および散乱光の実測値である。
Ｉｆｃ＝Ｉｆ／Ｉｓ・・・（１）
【００４２】
上記式（１）を用いた場合、ＣＡＳＥ２の補正後の蛍光量は１となる。これより、ＣＡＳＥ２の試料中に含まれる被検出物質の存在量は、ＣＡＳＥ１と同等程度であるという結果を得ることができる。
【００４３】
次に、ＣＡＳＥ３の場合を考える。この場合において、散乱光量の実測値および蛍光量の実測値は、それぞれ０．５および１である。実測値からするとＣＡＳＥ１に比べて蛍光量は同等であるが、散乱光量が０．５と半減していることがわかる。つまり、ＣＡＳＥ２と同様に、上記のような励起光の入射角度のずれや表面プラズモン発生条件のずれ等により、電場増強場の強度自体が半減していることを示唆している。そこで、ＣＡＳＥ１を基準とするため、電場増強場Ｅｗの強度に対し蛍光量Ｉｆを規格化して補正する必要が生じる。ＣＡＳＥ２と同様に、上記式（１）を用いて補正すると、補正後の蛍光量は２となる。これより、ＣＡＳＥ３の試料中に含まれる被検出物質の存在量は、ＣＡＳＥ１の２倍程度であるという結果を得ることができる。
【００４４】
さらに、ＣＡＳＥ４の場合を考える。この場合において、散乱光量の実測値および蛍光量の実測値は、それぞれ２および１である。実測値からするとＣＡＳＥ１に比べて蛍光量は同等であるが、散乱光量が２と倍増していることがわかる。つまり、ＣＡＳＥ２およびＣＡＳＥ３とは異なり、上記のような励起光の入射角度のずれや表面プラズモン発生条件のずれ等による影響が少なく好適な条件の下で測定を行った結果、電場増強場の強度自体が倍増していることを示唆している。そこで、ＣＡＳＥ１を基準とするため、電場増強場Ｅｗの強度に対し蛍光量Ｉｆを規格化して補正する必要が生じる。今までと同様に、上記式（１）を用いて補正すると、補正後の蛍光量は０．５となる。これより、ＣＡＳＥ４の試料中に含まれる被検出物質の存在量は、ＣＡＳＥ１の１／２程度であるという結果を得ることができる。
【００４５】
なお、上述したＣＡＳＥ１〜４を用いた例では、あるＣＡＳＥを基準としてその他のＣＡＳＥを相対的に評価する方法を説明したが、試料中の被検出物質の存在量が既知である複数の検量用試料を用いて、検量データをあらかじめ作成していれば、個々のＣＡＳＥについて被検出物質の存在量を絶対的に評価することも可能である。
【００４６】
以上により、測定ごとに生じる電場増強効果の強度のばらつきに寄与する因子を抑えることができるため、測定ごとに最適な部品の選択または交換を行う必要がなく、再現性のある測定をより簡単かつ低コストに実現することが可能となる。
【００４７】
なお、本発明においては、電場増強場Ｅｗの散乱光Ｌｓを用いた補正機構を有する場合について説明してきたが、励起光の反射光および蛍光の偏向状態をモニタリングすることによっても同様の効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明による第１の蛍光検出装置の一例を示す概略断面図
【図２】本発明による第２の蛍光検出装置の一例を示す概略断面図
【図３】従来法による蛍光検出装置を示す概略断面図
【符号の説明】
【００４９】
１０ センサチップ
１１ 誘電体プレート
１２ 金属膜
１３ 試料保持部
２０ 励起光照射光学系
２１ 光源
２２ プリズム
２３ 光学フィルム
２３’ ダイクロイックミラー
２４ 平凸レンズ
２５ 光学系保持部
３０、３０ａ・ｂ 光検出器
４０ 補正機構
Ａ 抗原
Ｂ１ 一次抗体
Ｂ２ 二次抗体
Ｆ 蛍光標識
Ｌｏ 励起光
Ｌｆ 蛍光
Ｌｓ 散乱光
Ｅｗ 電場増強場
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモンを利用した蛍光検出方法および蛍光検出装置に関するものであり、特に詳細には、検出した蛍光量を補正する補正機構を有する蛍光検出方法および蛍光検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質やＤＮＡ等を検出するバイオ測定において、全反射照明を利用した検出方法が注目されている。この検出方法は、屈折率の異なる界面で測定光が全反射する際に界面からしみ出す光、すなわちエバネッセント波と、試料中に含まれる被検出物質あるいはこの被検出物質に付けられている標識との散乱、吸収、発光等の光学的な相互作用を分析ことにより、上記被検出物質の存在またはその量を検出する方法である。
【０００３】
このような検出方法の一例としては、蛍光性標識を用いた蛍光検出方法がある（非特許文献１）。
【０００４】
蛍光検出方法は、冷却ＣＣＤ等光検出器の高性能化と相まって、バイオ研究には欠かせない道具となっている。また、蛍光性標識に用いる材料においても、特に可視領域では蛍光量子収率の高い蛍光色素、例えばＦＩＴＣ（蛍光：５２５ｎｍ、蛍光量子収率：０．６）やＣｙ５（蛍光：６８０ｎｍ、蛍光量子収率：０．３）のような実用の目安となる０．２を超える蛍光色素が開発され広く用いられている。さらに、表面プラズモンによる電場の増強を用いて、蛍光信号を増大することにより、１ｐＭ（ピコモーラ）を切るような高感度検出も実現されている。
【０００５】
図３を用いて、上記蛍光検出方法の原理を簡単に説明する。
【０００６】
図３は蛍光検出装置の概念図である。説明の便宜上、各部の寸法は実際のものとは異ならせている。
【０００７】
図３に示す蛍光検出装置は、誘電体プレート１１と、その一面の所定領域に設けられた金属膜１２とを備えたセンサチップ１０、励起光Ｌｏを誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で全反射条件を満たす入射角度で、センサチップ１０の金属膜形成面とは反対の側から励起光Ｌｏを照射する励起光照射光学系２０と、金属膜１２に接触している試料Ｓ中に蛍光標識Ｆが付与された被検出物質Ａが存在する場合に、この被検出物質Ａに付与された蛍光標識Ｆから生じる蛍光Ｌｆを検出する光検出器３０とを備えている。
【０００８】
この蛍光検出装置において、励起光照射光学系２０により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜１２上の試料Ｓ中にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。そして、このエバネッセント波と表面プラズモンにより金属膜１２の表面に電場増強作用を有する電場増強場Ｅｗが局所的に形成される。
【０００９】
今、被検出物質としての抗原Ａを含む試料Ｓから、抗原Ａを検出する場合を考える。金属膜１２上には抗原Ａと特異的に結合する抗原Ａに対する１次抗体Ｂ１が修飾されている。そして試料保持部１３中に試料Ｓが流され、次いで同様に抗原Ａと特異的に結合し、かつ蛍光標識Ｆが修飾された２次抗体Ｂ２が流される。このとき、蛍光標識Ｆは、１次抗体Ｂ１、抗原Ａおよび２次抗体Ｂ２による特異的な結合を介して金属膜１２に固定される。
【００１０】
上記の場合には、電場増強場Ｅｗ内に蛍光標識Ｆが存在することとなり、この蛍光標識Ｆが励起されて蛍光Ｌｆを発することとなる。従って、この蛍光Ｌｆを検出することにより、抗原Ａを検出することができる。なお、蛍光Ｌｆによって直接確認しているのは蛍光標識Ｆであるが、抗原Ａが存在しなければ、蛍光標識Ｆは金属膜１２に固定されることがない。つまり、この蛍光標識Ｆの存在を確認することにより、上記２次抗体Ｂ２と抗原Ａとの結合、すなわち抗原Ａの存在を間接的に確認している。
【非特許文献１】Margarida M. L. M. Vareiro, et al., Analytical Chemistry, Vol. 77, No. 8, p.2426-2431 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上記のような蛍光検出方法において、表面プラズモンによる電場増強場の強度のばらつきに寄与する因子が多いため、測定ごとにこれらの因子を完全に同一に測定条件をそろえることは難しい。これは、試料に実際に含まれている被検出物質が同数であっても、検出される蛍光量がばらつき再現性に乏しいという問題を生じさせる。これらの因子としては、例えば、センサチップの形状誤差およびセッティング誤差、センシング誤差および光学系誤差等の人為的要因による励起光の入射角度のずれや、サンプルの屈折率、センサチップの屈折率およびその表面の凹凸並びに金属膜の厚みおよびその密度等の物理的要因による表面プラズモン発生条件のずれ等が挙げられる。また、測定環境における温度変化についても、上記のような条件のずれを後発的に生じさせる可能性があるため、充分に考慮する必要がある。
【００１２】
一方、上記のような因子は、測定ごとに最適な部品を選択または交換することにより抑えることはできるが、すべての因子を部品の選択または交換によって抑えるには、非常に多くの手間とコストがかかってしまう。
【００１３】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、測定ごとに生じる電場増強場の強度のばらつきを抑えた再現性のある測定を、より簡単かつ低コストに実現する蛍光検出方法および蛍光検出装置の提供を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明による蛍光検出方法は、
誘電体プレートと、誘電体プレートの一面の所定領域に設けられ、かつ蛍光標識が付与された被検出物質を含む試料が供給される金属膜とを用意し、
誘電体プレートと金属膜との界面に対して、金属膜の上面に電場増強場を発生せしめるように、誘電体プレートを通して励起光を照射し、
電場増強場の励起効果によって蛍光標識から生じる蛍光を第１の光検出器により検出し、
第１の光検出器によって検出された蛍光量に基づいて被検出物質の存在量を検出する蛍光検出方法において、
光強度が電場増強場の強度に略比例するこの電場増強場の散乱光を、第２の光検出器によって検出し、
第２の光検出器によって検出された散乱光量を用いて、電場増強場の強度に対し蛍光量を規格化して補正することを特徴とするものである。
【００１５】
そして、本発明による蛍光検出方法において、補正後の蛍光量である補正蛍光量Ｉｆｃを、蛍光量Ｉｆと散乱光量Ｉｓとを用いて、下記式（１）から求めることが好ましい。
Ｉｆｃ＝Ｉｆ／Ｉｓ・・・（１）
【００１６】
ここで、「電場増強場」とは、誘電体プレートと金属膜との界面に対してこの界面で全反射条件を満たすように励起光を照射することによって生じるエバネッセント波と、このエバネッセント波に誘起されて金属膜中に生じる表面プラズモンの電場増強効果とによって、局所的に金属膜の上面に発生する電場の増強作用を有する領域を意味するものとする。
【００１７】
そして、「電場増強場の強度に対し蛍光量を規格化」するとは、ある一定の電場増強場の強度に対して基準となる蛍光量を決め、実測した蛍光量をその基準となる蛍光量から相対的に見積もることを意味するものとする。
【００１８】
一方、本発明による蛍光検出装置は、
誘電体プレートと、
誘電体プレートの一面の所定領域に設けられ、かつ蛍光標識が付与された被検出物質を含む試料が供給される金属膜と、
誘電体プレートと金属膜との界面に対して、金属膜の上面に電場増強場を発生せしめるように、誘電体プレートを通して励起光を照射する光源と、
電場増強場の励起効果によって蛍光標識から生じる蛍光を検出するように配置された第１の光検出器とを有し、
第１の光検出器によって検出された蛍光量に基づいて被検出物質の存在量を検出する蛍光検出装置において、
光強度が電場増強場の強度に略比例するこの電場増強場の散乱光を検出するように配置された第２の光検出器と、
第２の光検出器によって検出された散乱光量を用いて、電場増強場の強度に対し蛍光量を規格化して補正する補正機構とを有することを特徴とするものである。
【００１９】
そして、本発明による蛍光検出装置において、補正機構は、補正後の蛍光量である補正蛍光量Ｉｆｃを、蛍光量Ｉｆと散乱光量Ｉｓとを用いて、上記式（１）から求める手段を有するものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明による蛍光検出方法および蛍光検出装置では、励起光の照射により生じる電場増強場の散乱光の散乱光量に基づいて、測定ごとに検出した蛍光量を補正している。蛍光量と散乱光量は、共に電場増強場の発生状態に依存している。また、電場増強場の発生状態は、測定環境に依存している。従って、電場増強場の発生状態の指標として、光強度が電場増強場の強度に略比例するこの散乱光を用いることにより、電場増強場の強度に対し蛍光量を規格化して補正することが可能となる。これにより、測定ごとにその条件に適した補正が可能となり、測定ごとに生じる電場増強効果の強度のばらつきに寄与する因子を抑えることができるため、測定ごとに最適な部品の選択または交換を行う必要がなく、再現性のある測定をより簡単かつ低コストに実現することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明における最良の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【００２２】
「蛍光検出方法および蛍光検出装置」
図１は、本実施形態による蛍光検出装置の概略図である。
【００２３】
図示の通り、この蛍光検出装置は、誘電体プレート１１と金属膜１２からなるセンサチップ１０と、蛍光標識Ｆを励起しうる所定波長の励起光Ｌｏを発する光源２１と、センサチップ１０を設置するプリズム２２と、センサチップ１０上に供給された蛍光標識Ｆから発せられる蛍光Ｌｆを検出する第１の光検出器３０ａと、第１の光検出器３０ａに蛍光Ｌｆを導光するように配置された２つの平凸レンズ２４と、２つの平凸レンズ２４の間に配置された電場増強場Ｅｗの散乱光Ｌｓを遮断する光学フィルタ２３と、散乱光Ｌｓを検出するように配置された第２の光検出器３０ｂと、第１の光検出器３０ａおよび第２の光検出器３０ｂが共に接続されたパーソナルコンピュータ（ＰＣ）４０からなる。ここで、光源２１は、センサチップ１０上で電場増強場Ｅｗを生じせしめるように誘電体プレート１１に対してプリズム２２側に配置されており、蛍光標識Ｆは、１次抗体Ｂ１、抗原Ａおよび２次抗体Ｂ２を介して金属膜１２に固定されている。ＰＣ４０は、第２の光検出器３０ｂによって検出された、電場増強場Ｅｗの強度に略比例する散乱光Ｌｓの散乱光量を用いて、電場増強場Ｅｗの強度に対し蛍光量を規格化して補正する補正機構を有するものである。また、図１中の符号２５は、２つの平凸レンズ２４と光学フィルタ２３とを含み、第１の光検出器３０ａが装着されている光学系保持部である。
【００２４】
センサチップ１０は、特に制限されないが、前述した図３のセンサチップ１０と同様のものである。センサチップ１０は、誘電体プレート１１の一表面の所定領域に金属膜１２が形成されたものである。
【００２５】
誘電体プレート１１は、例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。誘電体プレート１１は樹脂から形成されたものが望ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を用いることがより望ましい。
【００２６】
金属膜１２は、既知の蒸着法で成膜形成することができる。金属膜１２の厚みは、金属膜１２の材料と、励起光Ｌｏの波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが望ましい。例えば、励起光Ｌｏとして７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜１２として金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜１２の厚みは５０ｎｍ±５ｎｍが好適である。なお、金属膜１２は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、およびこれらの合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属を主成分とするものが好ましい。
【００２７】
なお、センサチップ１０上に液体試料を保持する試料保持部が備えられ、センサチップ１０と試料保持部により液体試料を保持可能な箱状セルが構成されていてもよい。一方、センサチップ１０上に表面張力で留まる程度の微量な液体試料を測定する場合には、試料保持部を備えない態様であってもよい。
【００２８】
プリズム２２は、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で励起光Ｌｏが全反射するようにこの界面に励起光Ｌｏを導光するものである。なお、プリズム２２と誘電体プレート１１とは、屈折率マッチングオイルを介して接触されている。
【００２９】
光源２１は、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。前述のように、誘電体プレート１１と金属膜１２との界面で励起光Ｌｏが全反射すると共に金属膜１２で表面プラズモン共鳴する特定の角度で入射するように配置されている。さらに、光源２１とプリズム２２との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。なお、励起光Ｌｏは、表面プラズモンを誘起するようにＰ偏向で界面に対して入射させることが好ましい。
【００３０】
励起光Ｌｏは、例えばレーザ光源等から得られる単波長光でも白色光源等から得られるブロード光でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。
【００３１】
第１の光検出器３０ａは、試料Ｓ中に含まれる蛍光標識Ｆが発する蛍光Ｌｆを定量的に検出するものであればよく、検出条件に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。また、光検出器は、検出条件に応じて光学フィルタや分光器等の分光手段と組み合わせて用いることができる。なお、光学系保持部２５、２つの平凸レンズ２４、光学フィルタ２３および光検出器３０ａを備えるものとして、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）を好適に用いることができる。
【００３２】
第２の光検出器３０ｂも同様に、検出条件に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。また、光検出器は、検出条件に応じて光学フィルタや分光器等の分光手段と組み合わせて用いることができる。第２の光検出器３０ｂは、図１に示すように、エバネッセント波の進行方向（図１中紙面右側）から散乱光Ｌｓを検出することが好ましい。これにより、ミー散乱によって指向性のある散乱光Ｌｓを効率的に検出することが可能となる。なお、第２の光検出器３０ｂは図２に示すように、光学系保持部２５の内部に組み込んでもよい。このとき、前述した光学フィルタ２３に代えてダイクロイックミラー２３’を用いることにより、蛍光Ｌｆと散乱光Ｌｓを効率よく検出することができる。
【００３３】
ＰＣ４０は、第２の光検出器３０ｂによって検出された、光強度が電場増強場Ｅｗの強度に略比例する散乱光Ｌｓの散乱光量を用いて、電場増強場Ｅｗの強度に対し蛍光量を規格化して補正する補正機構の役割を果たす。なお、上記補正機構の役割を果たせば、特にＰＣ４０に制限されず他の電子計算機等を用いてもよい。
【００３４】
以下、上記蛍光検出装置を用いて、被検出物質としての抗原Ａを含む試料Ｓから、抗原Ａを検出する場合における蛍光検出方法について説明する。
【００３５】
この蛍光検出装置において、光源２１により励起光Ｌｏが誘電体プレート１１と金属膜１２との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度で入射されることにより、金属膜１２上の試料Ｓ中にエバネッセント波が滲み出し、このエバネッセント波によって金属膜１２中に表面プラズモンが励起される。そして、このエバネッセント波と表面プラズモンにより金属膜１２表面に電場増強作用を有する電場増強場Ｅｗが局所的に形成される。
【００３６】
今、被検出物質としての抗原Ａを含む試料Ｓから、抗原Ａを検出する場合を考える。金属膜１２上には抗原Ａと特異的に結合する１次抗体Ｂ１が修飾されている。そして、試料Ｓが流され、次いで同様に抗原Ａと特異的に結合し、かつ蛍光標識Ｆが修飾された２次抗体Ｂ２が流される。このとき、蛍光標識Ｆは、１次抗体Ｂ１、抗原Ａおよび２次抗体Ｂ２による特異的な結合を介して金属膜１２に固定される。
【００３７】
上記の場合には、電場増強場Ｅｗ内に蛍光標識Ｆが存在することとなり、電場増強場Ｅｗの励起効果によってこの蛍光標識Ｆが励起されて蛍光Ｌｆを発することとなる。このとき、理論的にはこの蛍光量を用いて被検出物質の存在量を算出することが可能であるが、実際はセンサチップの形状誤差およびセッティング誤差、センシング誤差および光学系誤差等の人為的要因による励起光の入射角度のずれや、サンプルの屈折率、センサチップの屈折率およびその表面の凹凸並びに金属膜の厚みおよびその密度等の物理的要因による表面プラズモン発生条件のずれ等の影響により、電場増強場Ｅｗの強度にばらつきがあるため補正が必要となる。
【００３８】
そこで、誘電体プレート１１や金属膜１２の表面の凹凸等により生じる電場増強場Ｅｗの散乱光Ｌｓを用いて蛍光量を補正する。補正は、光強度が電場増強場Ｅｗの強度に略比例する散乱光Ｌｓの散乱光量Ｉｓを用いて、電場増強場Ｅｗの強度に対し蛍光量Ｉｆを規格化して行う。このような補正が可能となるのは、電場増強場Ｅｗの散乱される割合が、上記のような励起光Ｌｏの入射角度のずれや表面プラズモン発生条件のずれ等により変化しないためである。さらには、散乱光量Ｉｓが電場増強場Ｅｗの強度に略比例することから、この散乱光量Ｉｓが電場増強場Ｅｗの強度を見積もる指標となるためである。
【００３９】
以下、下記表１の用いながら補正の方法の例を説明し、本発明による蛍光検出方法および蛍光検出装置の作用を説明する。
【表１】
【００４０】
上記表は、ある別々の試料を測定したＣＡＳＥ１〜４の散乱光量の実測値、蛍光量の実測値およびこれら２つの実測値を用いて補正された補正蛍光量を表している。なお、表の数値は、ＣＡＳＥ１を基準とした相対的な数値（無単位系）である。
【００４１】
まず、ＣＡＳＥ２の場合を考える。この場合において、散乱光量の実測値および蛍光量の実測値は、それぞれ０．５および０．５である。実測値からするとＣＡＳＥ１に比べて蛍光量が０．５と半減しているが、散乱光量も０．５と半減していることがわかる。つまり、これは、上記のような励起光の入射角度のずれや表面プラズモン発生条件のずれ等により、電場増強場の強度自体が半減していることを示唆している。そこで、ＣＡＳＥ１を基準とするため、電場増強場Ｅｗの強度に対し蛍光量を規格化して補正する必要が生じる。その具体的な補正の方法は、電場増強場Ｅｗの散乱光Ｌｓが電場増強場Ｅｗの強度に略比例するということを活かして、例えば下記式（１）を用いて行う方法がある。ここで、Ｉｆｃ、ＩｆおよびＩｓは、それぞれ補正後の蛍光量、蛍光量の実測値および散乱光の実測値である。
Ｉｆｃ＝Ｉｆ／Ｉｓ・・・（１）
【００４２】
上記式（１）を用いた場合、ＣＡＳＥ２の補正後の蛍光量は１となる。これより、ＣＡＳＥ２の試料中に含まれる被検出物質の存在量は、ＣＡＳＥ１と同等程度であるという結果を得ることができる。
【００４３】
次に、ＣＡＳＥ３の場合を考える。この場合において、散乱光量の実測値および蛍光量の実測値は、それぞれ０．５および１である。実測値からするとＣＡＳＥ１に比べて蛍光量は同等であるが、散乱光量が０．５と半減していることがわかる。つまり、ＣＡＳＥ２と同様に、上記のような励起光の入射角度のずれや表面プラズモン発生条件のずれ等により、電場増強場の強度自体が半減していることを示唆している。そこで、ＣＡＳＥ１を基準とするため、電場増強場Ｅｗの強度に対し蛍光量Ｉｆを規格化して補正する必要が生じる。ＣＡＳＥ２と同様に、上記式（１）を用いて補正すると、補正後の蛍光量は２となる。これより、ＣＡＳＥ３の試料中に含まれる被検出物質の存在量は、ＣＡＳＥ１の２倍程度であるという結果を得ることができる。
【００４４】
さらに、ＣＡＳＥ４の場合を考える。この場合において、散乱光量の実測値および蛍光量の実測値は、それぞれ２および１である。実測値からするとＣＡＳＥ１に比べて蛍光量は同等であるが、散乱光量が２と倍増していることがわかる。つまり、ＣＡＳＥ２およびＣＡＳＥ３とは異なり、上記のような励起光の入射角度のずれや表面プラズモン発生条件のずれ等による影響が少なく好適な条件の下で測定を行った結果、電場増強場の強度自体が倍増していることを示唆している。そこで、ＣＡＳＥ１を基準とするため、電場増強場Ｅｗの強度に対し蛍光量Ｉｆを規格化して補正する必要が生じる。今までと同様に、上記式（１）を用いて補正すると、補正後の蛍光量は０．５となる。これより、ＣＡＳＥ４の試料中に含まれる被検出物質の存在量は、ＣＡＳＥ１の１／２程度であるという結果を得ることができる。
【００４５】
なお、上述したＣＡＳＥ１〜４を用いた例では、あるＣＡＳＥを基準としてその他のＣＡＳＥを相対的に評価する方法を説明したが、試料中の被検出物質の存在量が既知である複数の検量用試料を用いて、検量データをあらかじめ作成していれば、個々のＣＡＳＥについて被検出物質の存在量を絶対的に評価することも可能である。
【００４６】
以上により、測定ごとに生じる電場増強効果の強度のばらつきに寄与する因子を抑えることができるため、測定ごとに最適な部品の選択または交換を行う必要がなく、再現性のある測定をより簡単かつ低コストに実現することが可能となる。
【００４７】
なお、本発明においては、電場増強場Ｅｗの散乱光Ｌｓを用いた補正機構を有する場合について説明してきたが、励起光の反射光および蛍光の偏向状態をモニタリングすることによっても同様の効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明による第１の蛍光検出装置の一例を示す概略断面図
【図２】本発明による第２の蛍光検出装置の一例を示す概略断面図
【図３】従来法による蛍光検出装置を示す概略断面図
【符号の説明】
【００４９】
１０ センサチップ
１１ 誘電体プレート
１２ 金属膜
１３ 試料保持部
２０ 励起光照射光学系
２１ 光源
２２ プリズム
２３ 光学フィルム
２３’ ダイクロイックミラー
２４ 平凸レンズ
２５ 光学系保持部
３０、３０ａ・ｂ 光検出器
４０ 補正機構
Ａ 抗原
Ｂ１ 一次抗体
Ｂ２ 二次抗体
Ｆ 蛍光標識
Ｌｏ 励起光
Ｌｆ 蛍光
Ｌｓ 散乱光
Ｅｗ 電場増強場
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体プレートと、該誘電体プレートの一面の所定領域に設けられ、かつ蛍光標識が付与された被検出物質を含む試料が供給される金属膜とを用意し、
前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に対して、該金属膜の上面に電場増強場を発生せしめるように、該誘電体プレートを通して励起光を照射し、
該電場増強場の励起効果によって前記蛍光標識から生じる蛍光を第１の光検出器により検出し、
該第１の光検出器によって検出された蛍光量に基づいて前記被検出物質の存在量を検出する蛍光検出方法において、
光強度が前記電場増強場の強度に略比例する該電場増強場の散乱光を、第２の光検出器によって検出し、
該第２の光検出器によって検出された散乱光量を用いて、前記電場増強場の強度に対し前記蛍光量を規格化して補正することを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項２】
補正後の前記蛍光量である補正蛍光量Ｉｆｃを、前記蛍光量Ｉｆと前記散乱光量Ｉｓとを用いて、下記式（１）から求めること特徴とする請求項１に記載の蛍光検出方法。
Ｉｆｃ＝Ｉｆ／Ｉｓ・・・（１）
【請求項３】
誘電体プレートと、
該誘電体プレートの一面の所定領域に設けられ、かつ蛍光標識が付与された被検出物質を含む試料が供給される金属膜と、
前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に対して、該金属膜の上面に電場増強場を発生せしめるように、該誘電体プレートを通して励起光を照射する光源と、
該電場増強場の励起効果によって前記蛍光標識から生じる蛍光を検出するように配置された第１の光検出器とを有し、
該第１の光検出器によって検出された蛍光量に基づいて前記被検出物質の存在量を検出する蛍光検出装置において、
光強度が前記電場増強場の強度に略比例する該電場増強場の散乱光を検出するように配置された第２の光検出器と、
該第２の光検出器によって検出された散乱光量を用いて、前記電場増強場の強度に対し前記蛍光量を規格化して補正する補正機構とを有することを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項４】
前記補正機構が、補正後の前記蛍光量である補正蛍光量Ｉｆｃを、前記蛍光量Ｉｆと前記散乱光量Ｉｓとを用いて、上記式（１）から求める手段を有するものであること特徴とする請求項３に記載の蛍光検出装置。
【請求項１】
誘電体プレートと、該誘電体プレートの一面の所定領域に設けられ、かつ蛍光標識が付与された被検出物質を含む試料が供給される金属膜とを用意し、
前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に対して、該金属膜の上面に電場増強場を発生せしめるように、該誘電体プレートを通して励起光を照射し、
該電場増強場の励起効果によって前記蛍光標識から生じる蛍光を第１の光検出器により検出し、
該第１の光検出器によって検出された蛍光量に基づいて前記被検出物質の存在量を検出する蛍光検出方法において、
光強度が前記電場増強場の強度に略比例する該電場増強場の散乱光を、第２の光検出器によって検出し、
該第２の光検出器によって検出された散乱光量を用いて、前記電場増強場の強度に対し前記蛍光量を規格化して補正することを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項２】
補正後の前記蛍光量である補正蛍光量Ｉｆｃを、前記蛍光量Ｉｆと前記散乱光量Ｉｓとを用いて、下記式（１）から求めること特徴とする請求項１に記載の蛍光検出方法。
Ｉｆｃ＝Ｉｆ／Ｉｓ・・・（１）
【請求項３】
誘電体プレートと、
該誘電体プレートの一面の所定領域に設けられ、かつ蛍光標識が付与された被検出物質を含む試料が供給される金属膜と、
前記誘電体プレートと前記金属膜との界面に対して、該金属膜の上面に電場増強場を発生せしめるように、該誘電体プレートを通して励起光を照射する光源と、
該電場増強場の励起効果によって前記蛍光標識から生じる蛍光を検出するように配置された第１の光検出器とを有し、
該第１の光検出器によって検出された蛍光量に基づいて前記被検出物質の存在量を検出する蛍光検出装置において、
光強度が前記電場増強場の強度に略比例する該電場増強場の散乱光を検出するように配置された第２の光検出器と、
該第２の光検出器によって検出された散乱光量を用いて、前記電場増強場の強度に対し前記蛍光量を規格化して補正する補正機構とを有することを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項４】
前記補正機構が、補正後の前記蛍光量である補正蛍光量Ｉｆｃを、前記蛍光量Ｉｆと前記散乱光量Ｉｓとを用いて、上記式（１）から求める手段を有するものであること特徴とする請求項３に記載の蛍光検出装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−２１６５３２（Ｐ２００９−２１６５３２Ａ）
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−６０４３５（Ｐ２００８−６０４３５）
【出願日】平成２０年３月１１日（２００８．３．１１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１１日（２００８．３．１１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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