蛍光顕微鏡装置
【課題】目的とする蛍光を選択的に視野観察することが可能な蛍光顕微鏡装置を提供する。
【解決手段】磁気共鳴により蛍光強度が変動する蛍光体１を含む試料１６に励起光を照射し、蛍光体１の蛍光を観察する光学顕微鏡３と、電子スピン磁気共鳴を発生させる高周波磁場を試料１６に照射する高周波磁場発生部５と、高周波磁場を変調する変調信号を生成する変調部７と、高周波磁場を変調しながら光学顕微鏡３で観察した試料表面の光強度を複数の画素のそれぞれでサンプリング時間毎に検出する検出器９と、複数の画素の中から光強度の時系列変動が変調信号と互に相関している対象画素を抽出する処理ユニット１０とを備える。
【解決手段】磁気共鳴により蛍光強度が変動する蛍光体１を含む試料１６に励起光を照射し、蛍光体１の蛍光を観察する光学顕微鏡３と、電子スピン磁気共鳴を発生させる高周波磁場を試料１６に照射する高周波磁場発生部５と、高周波磁場を変調する変調信号を生成する変調部７と、高周波磁場を変調しながら光学顕微鏡３で観察した試料表面の光強度を複数の画素のそれぞれでサンプリング時間毎に検出する検出器９と、複数の画素の中から光強度の時系列変動が変調信号と互に相関している対象画素を抽出する処理ユニット１０とを備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光検出磁気共鳴による蛍光顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、蛍光顕微鏡が生体研究分野で広く採用されている。例えば、抗原抗体反応の蛍光観察においては、抗原抗体反応を通じて特定の蛋白質と結合する分子に蛍光体を化学修飾した蛍光分子プローブが用いられる。細胞内部に導入された蛍光分子プローブが目的とする蛋白質を見つけて結合すると、分子内部で電荷移動が発生する。電荷移動がトリガーとなり蛍光体が発光する。あるいは、励起光の照射により蛍光体を発光させる。発光した蛍光体の挙動が蛍光顕微鏡を用いて視野観察される。
【０００３】
従来用いられている蛍光体には、蛍光の短時間寿命（褪色）や不規則な発光（ブリンキング）等の問題が存在する。また、生体研究分野で用いる蛍光体としては、生体細胞に安全な蛍光体が必要となる。従来のセレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）やテルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）等の蛍光体は毒性を有するＣｄを含み、生体への適用は好ましくない。
【０００４】
磁気共鳴により蛍光強度が制御できる蛍光体として、窒素空孔（ＮＶ）中心を有するダイアモンドを用いた蛍光顕微鏡装置が提案されている（非特許文献１参照）。非特許文献１では、ＮＶ中心を配置したナノサイズのダイアモンド粒子（ナノダイアモンド）をマーカーとして含む試料に電子スピン磁気共鳴（ＥＳＲ）が発生する周波数を有する高周波磁場を照射しながら、共焦点レーザ顕微鏡により表面画像観察が実施されている。蛍光強度の測定により、ＮＶ中心の存在位置を常温常圧で観測することができる。更に、ナノスケールの磁性体が周囲に発生する磁気共鳴条件を満たす静磁場の分布の観測に適用することも可能である。静磁場を検出する原子サイズの磁気センサとしてＮＶ中心を有するナノダイアモンドを用いて、ナノメートルの空間分解能を有する顕微鏡としての可能性が示されている。
【０００５】
ダイアモンドは、化学修飾が可能であり、生命活動を阻害する毒性がないと言われている。また、ダイアモンド内に存在するＮＶ中心では、褪色やブリンキングが発生しない。このように、ＮＶ中心を有するダイアモンドを蛍光体として細胞内部に取り入れて、蛍光強度の二次元視野観察が行われている。また、ＮＶ中心がＥＳＲを発生できる特異なスピン状態を有し、基底状態が発光過程に寄与することを利用して、高感度磁気センサへの応用が進められている。
【０００６】
一般に蛍光観察においては、褪色やブリンキングの問題の他にも多くの課題がある。例えば、生体内部には他の蛍光物質が自然に含まれることもある。試料台の汚れ、傷、混入した不純物等に由来する発光が混在することもある。また、顕微鏡の光学部品等の自家蛍光が存在することもある。このようなバックグランド光のため、観測対象となる蛍光体の蛍光強度の測定が困難となる場合がある。また、微弱な蛍光を測定するために臨界状態に置かれた検出器の増幅率は周囲の環境に依存してドリフトするため、蛍光測定のバックグランドを一定に保つことは困難である。
【０００７】
また、蛍光分光の分野では、高周波照射により蛍光スペクトルが変化する現象は、ＮＶ中心に限らず確認されている（非特許文献２参照）。非特許文献２では、強度変調蛍光・マイクロ波二重共鳴（ＡＭ−ＰＭＤＲ）と呼ばれる蛍光スペクトルの有用性が指摘されている。ＡＭ−ＰＭＤＲスペクトルは、照射したマイクロ波に対して強度変調や周波数変調をかけながら測定される。蛍光スペクトルの各ピークに対して、スピン励起に関する情報をラベリングすることができ、スペクトル解析から導かれる物質同定の確度を向上させている。しかしながら、磁気共鳴周波数に対する蛍光強度測定、または周波数一定の高周波磁場を照射しながら励起光波長に対する蛍光強度測定等のように、一次元測定に留まっており、磁気共鳴手法を取り入れた蛍光体の二次元リアルタイム視野観察に応用した例はない。
【０００８】
更に、高周波磁場の強度変調を実施して周期的に発生させた光検出磁気共鳴（ＯＤＭＲ）より、変調された蛍光強度を検波する技術が従来から用いられている(非特許文献３及び４参照)。キノキサリンの三重項やダイアモンド結晶中のＮＶ中心に対して適用して、高周波周波数を掃引した蛍光スペクトルにおいて、バックグランドが排除された波形が得られている。しかしながら、上記の技術を、二次元蛍光画像のリアルタイム視野観察や蛍光体の識別に応用した報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ジー・バラスブラマニアン、他（G. Balasubramanian et al.），ネイチャー（Nature）, ２００８年１０月，第４５５巻，ｐｐ．６４８−６５１
【非特許文献２】ジェイ・エム・デービス、他、（J. M. Davis et al.）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイティッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、１９８２年７月、第７９巻、ｐｐ.４３１３−４３１６
【非特許文献３】山内淳著「磁気共鳴―ＥＳＲ」サイエンス社出版、２００６年３月
【非特許文献４】ピー・ディー・ブロッホ、他、（P. D. Bloch et al.）、ジャーナル・ド・フィジク（Journal De Physique）、１９８５年１０月、第４６巻、ｐｐ.Ｃ７‐５２７‐Ｃ７‐５３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記問題点を鑑み、本発明は、目的とする蛍光を選択的に視野観察することが可能な蛍光顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様によれば、磁気共鳴により蛍光強度が変動する蛍光体を含む試料に励起光を照射し、蛍光体の蛍光を観察する光学顕微鏡と、磁気共鳴を発生させる高周波磁場を試料に照射する高周波磁場発生部と、高周波磁場を変調する変調信号を生成する変調部と、共鳴状態を変調しながら光学顕微鏡で観察した試料表面の光強度の分布を複数の画素のそれぞれでサンプリング時間毎に検出する検出器と、複数の画素の中から光強度の時系列変動が変調信号と互に相関している対象画素を抽出する処理ユニットとを備える蛍光顕微鏡装置が提供される。
【００１２】
本発明の第２の態様によれば、磁気共鳴により蛍光強度が変動する蛍光体を含む試料に励起光を照射し、蛍光体の蛍光を観察する光学顕微鏡と、磁気共鳴を発生させる高周波磁場を試料に照射する高周波磁場発生部と、試料に静磁場及び磁気共鳴の共鳴状態を変動させる変調磁場を印加する変調部と、共鳴状態を変動させながら光学顕微鏡で観察した試料表面の光強度の分布を複数の画素のそれぞれでサンプリング時間毎に検出する検出器と、複数の画素の中から光強度の時系列変動の周期が変調信号に同期している対象画素を抽出する処理ユニットとを備える蛍光顕微鏡装置が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、目的とする蛍光を選択的に視野観察することが可能な蛍光顕微鏡装置を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置の一例を示す図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る蛍光体の一例を示す図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る蛍光体のエネルギ準位の一例を示す図である。
【図４】本発明の実施の形態に係る蛍光体の電子スピン共鳴による蛍光強度の変動の一例を示す図である。
【図５】本発明の実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置による視野観察の一例を示す図である。
【図６】本発明の実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置による視野観察の手順の一例を示すフローチャートである。
【図７】本発明の実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置の他の例を示す図である。
【図８】本発明のその他の実施の形態係る蛍光顕微鏡装置の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下図面を参照して、本発明の形態について説明する。以下の図面の記載において、同一または類似の部分には同一または類似の符号が付してある。但し、図面は模式的なものであり、装置やシステムの構成等は現実のものとは異なることに留意すべきである。したがって、具体的な構成は以下の説明を参酌して判断すべきものである。また図面相互間においても互いの構成等が異なる部分が含まれていることは勿論である。
【００１６】
又、以下に示す本発明の実施の形態は、本発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、本発明の技術的思想は、構成部品の材質、形状、構造、配置等を下記のものに特定するものでない。本発明の技術的思想は、特許請求の範囲に記載された技術的範囲内において、種々の変更を加えることができる。
【００１７】
本発明の実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置は、図１に示すように、光学顕微鏡３、高周波磁場発生部５、変調部７、処理ユニット１０、入力装置１２、出力装置１４を備える。光学顕微鏡３は、光源３２、ダイクロイックミラー３４、バンドパスフィルタ３６、対物レンズ３８を含む。高周波磁場発生部５は、発振器４０、増幅器４２、高周波コイル４４を含む。処理ユニット１０は、入力部２０、変換部２２、演算部２４、出力部２６、記憶部２８を含む。
【００１８】
蛍光顕微鏡装置で視野観察する試料１６は、磁気共鳴により蛍光強度が変動する蛍光体１を含む。試料１６には、蛍光体１の磁気共鳴の共鳴周波数では蛍光強度が変動しない蛍光体１Ａ等を含んでいてもよい。磁気共鳴としては、電子スピン磁気共鳴（ＥＳＲ）を用いて説明するが、核スピン磁気共鳴（ＮＭＲ）であってもよい。
【００１９】
光学顕微鏡３の光源３２から出射された励起光は、ダイクロイックミラー３４を通して対物レンズ３８に導入される。励起光は、対物レンズ３８で適当なビーム径に収束されて、試料１６に照射される。励起光を吸収した蛍光体１、１Ａから放出された蛍光や試料１６表面で反射された励起光等を含む光が、対物レンズ３８、ダイクロイックミラー３４を通り、バンドパスフィルタ３６に導入される。蛍光や反射励起光等を含む光はバンドパスフィルタ３６を通って、蛍光体１の蛍光を含む所定の波長帯が選別され、高感度冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）等の検出器９に入射される。検出器９に入射した光の強度が、二次元に配列された画素のそれぞれでサンプリング時間毎に検出される。検出された光強度の二次元分布が画像として処理ユニット１０に取り込まれ、出力装置１４で表示される。
【００２０】
高周波磁場発生部５の発振器４０で発振された高周波は、増幅器４２により増幅され、試料１６に近接して配置された高周波コイル４４に入力される。高周波コイル４４から試料１６に高周波磁場が照射される。
【００２１】
蛍光体１は、ＥＳＲにより蛍光強度が変動する。蛍光体１として、ＮＶ中心を有するダイアモンド結晶、キノキサリン等が使用可能である。特に、ダイアモンドは、化学修飾が可能で、生命活動を阻害する毒性がないと言われている。また、ＮＶ中心は、褪色やブリンキングの発生が極めて小さい。したがって、平均粒径が約５ｎｍ〜数十ｎｍのナノダイアモンドは、生体観察用の蛍光プローブとして望ましい。
【００２２】
ＮＶ中心は、図２に示すように、炭素（Ｃ）原子位置に置換された窒素（Ｎ）原子と、最近接サイトにＣ原子が存在しない空孔（Ｖ）とが対となって存在する格子欠陥である。ＮＶ中心では、２個の電子がＳ＝１のスピン状態を形成する。図３に示すように、ＮＶ中心の基底状態はスピン三重項3Ａ2であり、励起状態はスピン三重項3Ｅである。また、基底状態と励起状態の間にスピン一重項1Ａ1の中間状態が存在する。スピン三重項3Ａ2、3Ｅ間のエネルギギャップは、約１．９５ｅＶである。
【００２３】
ＮＶ中心の基底状態は、静磁場を印加しない状態でも約２．８７ＧＨｚに相当するエネルギギャップを持つＭｚ＝０の基底状態とＭｚ＝±１の準基底状態に分裂している。したがって、周波数が約２．８７ＧＨｚの高周波磁場を照射すると、ゼロ磁場環境下でもＥＳＲが発生する。ＥＳＲで励起されるＭｚ＝±１の準基底状態は、発光過程において重要な役割を演じ、蛍光強度の変化に影響する。
【００２４】
例えば、波長が約５３２ｎｍの励起光の照射によりＭｚ＝±１の準基底状態から励起状態に励起された電子には、波長が約６３７ｎｍの蛍光を発して励起状態からＭｚ＝±１の準基底状態に戻る放射遷移と、蛍光を発せずに1Ａ1の中間状態を経由してＭｚ＝０の基底状態へ移行する非放射遷移とが存在する。ＥＳＲが起きていない場合では、Ｍｚ＝±１の準基底状態を電子が占有する確率は小さいので、放射遷移が優勢となる。ＥＳＲを発生させた場合、Ｍｚ＝０の基底状態からＭｚ＝±１の準基底状態へ電子が励起されるため、Ｍｚ＝±１の準基底状態を電子が占有する確率が大きくなる。その結果、放射遷移が阻害され、非放射遷移が助長される。
【００２５】
図４は、ＮＶ中心を有するダイアモンド結晶に照射する高周波磁場の周波数に対する蛍光強度の依存性を示す。図４に示すように、ＥＳＲの共鳴周波数ｆＲの近傍の周波数ｆＳ〜ｆＴの範囲で蛍光強度の減少が観測される。したがって、高周波磁場発生部５からＮＶ中心の共鳴周波数ｆＲである約２．８７ＧＨｚの高周波磁場を試料１６に照射することにより、蛍光体１の蛍光強度を変化させることができる。一方、蛍光体１Ａの蛍光強度は、少なくともＮＶ中心の共鳴周波数ｆＲでは変化しない。複数の画素の中から前記光強度の時系列変動の周期が前記変調信号に同期している対象画素を抽出することが可能となる。
【００２６】
実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置では、高周波磁場発生部５により試料１６に含まれる蛍光体１のＮＶ中心にＥＳＲを発生させる高周波磁場を変調部７で生成される変調信号により変調して、ＥＳＲの共鳴状態が変調される。ＮＶ中心の共鳴状態を変調しながら、光学顕微鏡３で励起光を照射して試料表面を観察し、光強度分布を検出器９で検出する。処理ユニット１０は、検出器９で検出された画像の複数の画素の中から、光強度の時系列の周期が変調部７で生成された変調信号に同期している画素を位相検波演算により対象画素として抽出する。
【００２７】
変調部７は、高周波磁場発生部５の発振器４０に電気的に接続された変調信号源である。変調部７で生成される変調信号は、例えば、発振器４０で発振される高周波電気信号を周波数変調する電気信号である。
【００２８】
高周波磁場発生部５の発振器４０で発信された高周波電気信号が変調部７の変調信号により周波数変調される。周波数変調された高周波電気信号は増幅器４２で増幅され、高周波コイル４４に導入される。高周波コイル４４で周波数変調された高周波磁場が生成され、試料１６に照射される。
【００２９】
例えば、高周波電気信号の発振周波数をＥＳＲにより蛍光強度が減少し始める周波数ｆＳと共鳴周波数ｆRの間で周波数変調されるように、中心周波数ｆC、及び変調幅±Δｆを設定する。高周波磁場は、図４に示すように、ＥＳＲにより蛍光体１の蛍光強度が減少し始める周波数ｆSと共鳴周波数ｆRの間の周波数ｆCを中心周波数として変調幅±Δｆの幅で周波数変調される。変調信号を変調周波数ｆFMを有する正弦波とすると、蛍光体１の蛍光強度は、周波数（ｆC−Δｆ）で最大、周波数（ｆC＋Δｆ）で最小となるように、変調信号の変調周波数ｆFMに同期して変動する。
【００３０】
処理ユニット１０の入力部２０は、検出器９の複数の画素でサンプリング時間毎に検出した光強度を時系列画像データとして取得する。時系列画像データに含まれる各画像データは、二次元配列として表現される行列データである。
【００３１】
変換部２２は、検出器９のサンプリング時間に同期して、変調部７からの変調信号をアナログデジタル変換器（ＡＤＣ）等によりデジタル化した参照信号に変換する。
【００３２】
演算部２４は、位相検波回路等により複数の画素のそれぞれで光強度の時系列データに対して参照信号を用いて位相検波の演算を行なう。演算で得られた光強度の時系列変動の周期が、変調信号に同期している対象画素を蛍光体１の蛍光として選択的に抽出して、復調画像を作成する。
【００３３】
出力部２６は、作成された復調画像を出力装置１４に伝送する。記憶部２８は、位相検波演算を処理ユニット１０に実行させるためのプログラムを保存している。また、記憶部２８は、入力部２０で取得された時系列データや、処理ユニット１０における演算において計算途中のデータを一時的に保存する。
【００３４】
入力装置１２は、キーボード、マウス等の機器を指す。入力装置１２から入力操作が行われると対応するキー情報が処理ユニット１０に伝達される。出力装置１４は、モニタなどの画面を指し、液晶表示装置（ＬＣＤ）、発光ダイオード（ＬＥＤ）パネル、エレクトロルミネセンス（ＥＬ）パネル等が使用可能である。出力装置１４は、処理ユニット１０により処理されるデータや得られる画像等を表示する。
【００３５】
処理ユニット１０は、通常のコンピュータシステムの中央処理装置（ＣＰＵ）の一部として構成すればよい。入力部２０、変換部２２、演算部２４、出力部２６は、それぞれ専用のハードウェアで構成しても良く、通常のコンピュータシステムのＣＰＵを用いて、ソフトウェアで実質的に等価な機能を有していても構わない。
【００３６】
例えば、試料１６の蛍光体１の位置に対応する画素の位置を（ｉ，ｊ）で指定する。検出器９のサンプリング時間Δｔで取得される時系列画像データは、指標ｋを用いて指定する。例えば、時間ｋΔｔで取得される画像の位置（ｉ，ｊ）における光強度Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）を
Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）＝Ｄ（ｉ，ｊ）ｓｉｎ（２πｆFM・ｋΔｔ＋θ1） ・・・（１）
で表す。θ1は位相を表す。したがって、位置（ｉ，ｊ）における光強度の時系列データは、指標ｋをインクリメント、又はデクリメントすることで指定することができる。なお、サンプリング時間に関して、標本化定理（ナイキスト定理）によれば、変調周波数ｆFMに対して、少なくとも２倍の周波数を持つサンプリングレートで画像取得を実施すれば、理論的には位相検波は可能である。位相検波の精度を向上させるために、一変調周期内により多くの取得された画像データが含まれることが望ましい。
【００３７】
変調信号からＡＤ変換された参照信号は、次式で表される配列Ｒ0（ｋ）に格納される。
Ｒ0（ｋ）＝ｓｉｎ（２πｆFM・ｋΔｔ＋θ2） ・・・（２）
ここで、θ2は位相を表す。
【００３８】
位置（ｉ，ｊ）における位相検波後の復調信号強度Ａ0（ｉ，ｊ）は、式（１）及び式（２）を用いて算出される。
ここで、Ｎは時系列画像データに含まれる画像のデータ数である。
【００３９】
位相検波により復調された復調信号強度Ａ0（ｉ，ｊ）の内で、式（３）の第１項は、時間に依存しない本質的な信号振幅を与え、位相値θ1及びθ2に依る。式（３）の第２項は、時間に依存し、変調周波数ｆFMの偶数倍の高調波周波数を有する高調波信号成分である。通常のデジタル処理では、位相検波演算後にローパスフィルタを設置して高調波信号成分を除去することにより、式（３）の第１項を蛍光体１の蛍光として抽出する。
【００４０】
また、共鳴周波数ｆRの近傍では蛍光強度が変動しない蛍光体１Ａの位置に対応する画素の光強度は、変調信号によらず一定である。したがって、位相検波演算により除去される。同様に、光学顕微鏡３の対物レンズ３８等の光学部品からの自家蛍光も変調信号に同期せず一定の蛍光強度であるので、位相検波演算で除去される。
【００４１】
なお、演算部２４に高速性能を要求する場合は、演算処理数は少ないほうが望ましい。例えば、データ数Ｎとサンプリング時間Δｔの積ＮΔｔが変調周期の整数倍になるように変調周波数ｆFM、サンプリング時間Δｔ、及びデータ数Ｎを調整しておく。積ＮΔｔが変調周期の整数倍であれば、式（３）の総和を演算する時に周期的に現れる高調波周波数を有する高調波信号成分を除去することができ、高速処理を実現することが可能となる。
【００４２】
また、位相値θ1及びθ2は、初期条件や電気回路による遅延等に起因する位相である。以下の観点から、位相値θ1及びθ2を一致させておくことが望ましい。
【００４３】
通常のデジタル処理による位相検波では、信号に対して直交した位相差を持つ信号をヒルベルト変換を適用して作成する。ヒルベルト変換は、ある時間で取得したデータを中心に前後の時系列データ集団を用いて直交信号を作成する。精度を向上させるためには変換に使用するデータ数を多く取る必要がある。そのために、複数の画像データに対してヒルベルト変換を実施した場合には、多大な演算時間により検波信号の算出に遅れが生じ、リアルタイム処理に支障をきたす虞がある。
【００４４】
また、前述の参照信号に対して直交した参照信号を用意する。例えば、変調信号を生成する変調信号源に加えて、変調信号の位相に対して９０°位相を進めた、あるいは遅らせた信号を生成する直交変調信号源を新たに用意し、ＡＤ変換により直交参照信号を作成する。位相検波処理に使用される直交参照信号は、
Ｒ90（ｋ）＝ｓｉｎ（２πｆFM・ｋΔｔ＋θ2） ・・・（４）
と表せる。式（３）と同様の演算処理を実施することで、次式のような直交参照信号に対する直交復調信号強度が得られる。
【００４５】
しかしながら、復調信号強度Ａ0（ｉ，ｊ）に加えて、直交復調信号強度Ａ90（ｉ，ｊ）の計算も実施する必要がある。更に、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）＝（Ａ0（ｉ，ｊ）2＋Ａ90（ｉ，ｊ）2）1/2を導出する演算処理も必要となる。ここで、式（５）では、位相検波により出現する高調波成分を除去している。例えば、データ数とサンプリング時間の積が変調周期の整数倍となるように変調周波数、サンプリング時間、及びデータ数を調整して、総和の演算処理により高調波成分を除去してもよい。あるいは、ローパスフィルタを設置して高調波成分を除去してもよい。
【００４６】
上述した理由により、位相検波演算の高速化のためには、画像データの取得の前に、θ1＝θ2となるように位相を調整しておくことが望ましい。位相θ1及びθ2を一致させることにより、周波数変調された画像データから復調画像データを最小の演算処理数で構築することが可能となる。
【００４７】
位相θ1及びθ2の調整方法としては、ＮＶ中心からの蛍光強度が周期的に変化するように周波数変調が実施されている共鳴状態において、式（３）の復調信号強度値が最大となるように変調部７の変調信号の位相を調整する。例えば、目視で復調信号強度値を観測しながら、変調部７の変調信号の位相を変化させてもよい。あるいは、より精度よく位相調整する場合は、コンピュータを用いて変調信号の位相を掃引しながら復調信号強度値を計測し、復調信号強度値が最大となる位相を求めてもよい。
【００４８】
実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置では、複数の画像を含む時系列画像データを用いて位相検波演算処理を実施した復調画像において、光強度が変調周波数に同期して変動する光を抽出する。したがって、ＮＶ中心からの蛍光の位置を選択的に反映した復調画像を得ることができる。
【００４９】
例えば、図５に示すように、位相検波演算処理により得られた復調画像、及び検出器９で計測された画像を並べて、出力装置１４の画面の表示部６３、６５に表示する。表示部６５では、位相検波されていないため、蛍光体１の蛍光だけでなく、蛍光体１Ａの蛍光も表示される。表示部６３では、位相検波により蛍光体１Ａの蛍光は除去され、蛍光体１の蛍光を容易に確認することができる。また、光学顕微鏡３に用いる対物レンズ３８等の光学部品からの自家蛍光も同様に除去することができる。
【００５０】
また、従来のように位相検波を行なわずに蛍光強度を計測する場合、検出器９のＣＣＤ等の受光素子及びＣＣＤ周辺の電気回路により決定される波長帯域幅内に存在する光も雑音として画像に混入する。実施の形態においては、特定の周波数で周期的に変動する光成分を位相検波により選択的に抽出するので、実質的に波長帯域幅が狭くなる。したがって、画像の雑音を抑制することができる。即ち、直接ＣＣＤ等により視野観察を実施する従来の蛍光顕微鏡装置に比べ、実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置ではＳ／Ｎ比のよい画像を得ることができる。
【００５１】
なお、実施の形態では、処理ユニット１０に読み込んだ時系列画像データと画像取得に同期した生成した参照信号の時系列データを全て一度に用いて位相検波演算処理を実施している。この場合、処理ユニット１０のハードウェアに依存してデータ読み取り時には演算処理が実行できず、また演算処理時にはデータ読み取りが実行できない。その結果、連続とは言い難い画像更新となる虞もある。このようなハードウェア環境の場合には、遅延時間の少ないリアルタイム処理を実施するために汎用的に用いられるスライディング離散フーリエ変換（ＤＦＴ）法に準ずる位相検波演算を適応してもよい。
【００５２】
次に、実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置による視野観察の手順を、図６に示すフローチャートを用いて説明する。図１に示すように、観察する試料１６には蛍光体１として、ＮＶ中心を有するナノダイアモンドが含有されている。例えば、ナノダイアモンドの平均粒径は約５ｎｍ〜数１０ｎｍである。ＮＶ中心のＥＳＲ共鳴周波数は、約２．８７ＧＨｚである。
【００５３】
ステップＳ１００で、光学顕微鏡３により、試料１６にＮＶ中心を励起する励起光を照射する。光源３２として、例えば波長が約５３２ｎｍのグリーン固体レーザが用いられる。
【００５４】
ステップＳ１０１で、高周波磁場発生部５により、試料１６に高周波磁場が照射される。高周波磁場の周波数は、例えば２８６２ＭＨｚである。
【００５５】
ステップＳ１０２で、変調部７で生成された変調信号により、高周波磁場が周波数変調される。変調信号の周波数変調幅は、例えば±８ＭＨｚである。変調信号の周波数は、数Ｈｚ程度である。
【００５６】
ステップＳ１０３で、検出器９により、光学顕微鏡３で視野観察された試料１６の光強度の分布が、二次元配列された複数の画素でサンプリング時間毎に画像として検出される。検出した画像により、時系列画像データが作成される。
【００５７】
ステップＳ１０４で、処理ユニット１０により位相検波演算処理を実施して、時系列画像データのそれぞれの画像において、複数の画素の中から光強度の時系列変動の周期が、変調信号に同期している対象画素を抽出する。抽出された対象画素を蛍光体１の蛍光として選択的に反映した復調画像が作成される。
【００５８】
ステップＳ１０５で、出力装置１４により、処理ユニット１０から出力された復調画像が、表示される。
【００５９】
実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置による視野観察では、複数の画像を含む時系列画像データを用いて位相検波演算処理を実施した復調画像において、光強度が変調周波数に同期して変動する光を抽出する。したがって、ＮＶ中心からの蛍光の位置を選択的に反映した復調画像を得ることができる。
【００６０】
また、実施の形態では、変調信号の周波数に同期して変動する光信号を選択的に抽出している。したがって、装置ドリフトに起因する不安定なベースラインを除去することができ、長時間の視野観察を安定して行うことが可能となる。
【００６１】
上記説明においては、図４に示したように、ＥＳＲにより蛍光体１の蛍光強度が減少し始める周波数ｆSと共鳴周波数ｆRの間の周波数ｆCを中心周波数として変調幅±Δｆの幅で周波数変調している。しかし、周波数変調の中心周波数を共鳴周波数ｆRに設定してもよい。この場合、ＥＳＲにより変動する蛍光体１の蛍光強度の変動は、変調周波数の２倍の周期で変動する。したがって、位相検波演算処理において、光強度が変調周波数の２倍の周波数で変動する画素を抽出すればよい。
【００６２】
また、周波数変調された高周波磁場を試料に照射しているが、高周波磁場の変調は限定されない。例えば、変調部７で生成された変調信号により、発振器４０で発信された高周波電気信号を振幅変調してもよい。この場合、振幅変調される高周波磁場の周波数をＮＶ中心の共鳴周波数ｆR、又は共鳴周波数ｆRの近傍に設定すればよい。高周波磁場の振幅が最小の時、ＮＶ中心でのＥＳＲが抑制されて蛍光強度が大きくなる。高周波磁場の振幅が最大の時、ＮＶ中心でのＥＳＲが発生して蛍光強度が小さくなる。その結果、振幅変調の周期に同期して変動する蛍光体１の蛍光強度を、位相検波演算処理により選択的に抽出することが可能となる。
【００６３】
また、上記の説明では、ＮＶ中心に高周波磁場を照射することにより、ＥＳＲを発生させている。しかし、図７に示すように、静磁場印加部４６を試料１６の近傍に配置して、試料１６に静磁場を印加してもよい。ＮＶ中心の基底状態は、図３に示したように、ゼロ磁場でも約２．８７ＧＨｚに相当するエネルギ分裂を有しているので、静磁場を印加しなくてもＥＳＲを発生させることができる。静磁場を印加した場合、Ｍｚ＝±１の準基底状態が分裂するため、ゼロ磁場での共鳴周波数とは異なる２つの共鳴周波数でＥＳＲが発生する。したがって、いずれか１つの共鳴周波数の近傍で、高周波磁場に周波数変調を実施すればよい。
【００６４】
（第１の変形例）
本発明の実施の形態の第１の変形例では、ＥＳＲのオフ状態（第１状態）及びオン状態（第２状態）において検出した画像データ間の差分を用いて蛍光体１に対応する画素を抽出する。変調部７は、磁気共鳴をオフ状態、及びオン状態に切り替える信号を高周波磁場発生部５に送信する。処理ユニット１０の演算部２４は、第１及び第２状態のそれぞれで取得された２枚の画像データの差分を演算する。差分が有限な値となる画素が、蛍光体１の位置に対応する対象画素として抽出される。
【００６５】
第１の変形例では、共鳴状態をオンオフさせて取得した２枚の画像を用いて対象画素を抽出する点が実施の形態と異なる。他の構成は、実施の形態と同様であるので、重複する記載は省略する。
【００６６】
図１に示した検出器９において、試料１６の蛍光体１、１Ａの位置に対応する画素の位置を（ｉ，ｊ）で指定する。
【００６７】
まず、変調部７は、高周波磁場の照射を停止又は減少させる信号を高周波磁場発生部５に送る。蛍光体１は、ＥＳＲが発生しない第１状態となる。例えば、高周波磁場発生部５の発振器４０で発振させる高周波電気信号の振幅を０又は十分に弱める信号が用いられる。あるいは、発振器４０の発振周波数を蛍光体１のＥＳＲ共鳴周波数から十分離させる信号でもよい。
【００６８】
検出器９は、観測時間ＴOFF内で第１状態の蛍光体１の画像データ（光強度）ＤOFF（ｉ，ｊ）を取得する。画像データＤOFF（ｉ，ｊ）は、処理ユニット１０の入力部２０を介して記憶部２８に保管される。
【００６９】
次に、変調部７は、共振周波数の高周波磁場を照射させる信号を高周波磁場発生部５に送る。蛍光体１は、高周波磁場の照射により、ＥＳＲが発生した第２状態になる。例えば、発振器４０で発振させる高周波電気信号の振幅が０又は十分に弱い場合は、高周波電気信号の振幅を増大させる信号が用いられる。あるいは、発振器４０の発振周波数が蛍光体１のＥＳＲ共鳴周波数から十分離れている場合は、発振周波数をＥＳＲ共鳴周波数に一致させる信号が用いられる。
【００７０】
検出器９は、観測時間ＴON内で、第２状態の蛍光体１の画像データ（光強度）ＤON（ｉ，ｊ）を取得する。観測時間ＴONは、観測時間ＴOFFと同一である。画像データＤON（ｉ，ｊ）は、処理ユニット１０の入力部２０を介して記憶部２８に保管される。
【００７１】
演算部２４は、記憶部２８から画像データＤOFF（ｉ，ｊ）、ＤON（ｉ，ｊ）を読み出す。画像データＤOFF（ｉ，ｊ）、ＤON（ｉ，ｊ）の差分を演算して、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）とする。
【００７２】
信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は、蛍光体１からの蛍光を抽出したデータに相当する。ここで、蛍光体１の蛍光強度がＥＳＲにより変化する比率をαとする。蛍光体１の位置に対応する画素においては、ＤON（ｉ，ｊ）＝αＤOFF（ｉ，ｊ）である。一方、蛍光体１Ａは、ＥＳＲを起こさないので、ＤON（ｉ，ｊ）＝ＤOFF（ｉ，ｊ）である。したがって、蛍光体１の位置に対応する画素においては、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は、（１−α）ＤOFF（ｉ，ｊ）となる。また、蛍光体１Ａの位置に対応する画素においては、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は、０に近い値となる。このように、第１及び第２状態のそれぞれで取得された２枚の画像データの差分を演算することによって、差分が有限となった画像を、蛍光体１の位置に対応する蛍光として抽出する。
【００７３】
第１の変形例では、ＥＳＲのオン状態及びオフ状態において検出した画像データ間の差分を用いて蛍光体１に対応する画素が抽出される。２枚の画素データ間の差分を取ればよいので、演算処理が単純であり、高速に画像データの処理をすることができる。
【００７４】
なお、上述の説明では、画像データは、ＥＳＲが発生していない第１状態の後にＥＳＲが発生した第２状態で検出している。しかし、画像データの検出は、第２状態で先に行った後に第１状態で行ってもよい。
【００７５】
また、第１及び第２状態での画像データの検出の時間間隔は短くすることが望ましい。検出の間隔が長いと、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）が必ずしも、ＥＳＲのオン状態、オフ状態の相違だけを反映しているとはいえなくなる。例えば、第１状態での検出後から第２状態での検出までの時間経過の間に、蛍光体１Ａが移動すること、あるいは化学反応等により蛍光体１Ａの蛍光強度が褪色すること等が起こる可能性がある。この場合、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）において蛍光体１Ａからの蛍光信号がゼロとならず有限の値として残る可能性が否定できない。
【００７６】
また、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）のＳ／Ｎ比を改善するために、観測時間ＴOFF、ＴONを長くすることや、あるいは画像データ取得を繰り返し実行して積算処理することは有効である。積算処理の一例として、画像データＤOFF（ｉ，ｊ）、ＤON（ｉ，ｊ）を交互に複数回繰り返して取得する手順が挙げられる。複数の画像データＤOFF（ｉ，ｊ）、及び複数の画像データＤON（ｉ，ｊ）を、それぞれ積算処理したΣＤOFF（ｉ，ｊ）、ΣＤON（ｉ，ｊ）を用いて差分｛ΣＤOFF（ｉ，ｊ）−ΣＤON（ｉ，ｊ）｝を演算し、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）とする。画像データＤOFF（ｉ，ｊ）、ＤON（ｉ，ｊ）を交互に取得することにより、蛍光体１Ａの移動や褪色による蛍光強度の変化を低減することが可能である。画像データ取得を繰り返し実行する場合に、画像データを取得するタイミングは必ずしも周期的である必要はない。タイミングは非定期的で、例えば、前の画像データを取得した後に検出部９や処理ユニット１０のデータ取り込み準備ができた時点で次の画像データを取得してもよい。
【００７７】
上記の説明では、画像データＤOFF（ｉ，ｊ）、ＤON（ｉ，ｊ）のそれぞれを取得するための観測時間ＴOFF、ＴONは同一としたが、相違してもよい。観測時間ＴOFF、ＴONが一致していない場合は、観測時間の相違を考慮して、画像データＤOFF（ｉ，ｊ）、ＤON（ｉ，ｊ）の差分を演算する。例えば、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は、｛（ＤON（ｉ，ｊ）／ＴON−ＤOFF（ｉ，ｊ）／ＴOFF）×（ＴOFF＋ＴON）／２｝等として演算すればよい。
【００７８】
抽出された信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は、蛍光体１のみに帰属される蛍光強度の分布を表す蛍光画像データである。一般的な蛍光体における蛍光画像データと同様の画像処理や解析を信号強度Ａ（ｉ，ｊ）に施すことにより、例えば、生体細胞において蛍光体１が局在した位置や蛍光体１の運動、蛍光体１の蛍光強度変化を通して得られる周囲との化学反応過程や生命活動過程等の情報が提供される。
【００７９】
画像処理の一例として、閾値処理は対象物を明確に区別する目的に有効であり、対象物の運動軌跡を計算する際に利用される。上述の説明では、蛍光体１がＥＳＲにより蛍光強度が変化する特徴を利用した画像抽出方法を述べたが、このような手順で得られる蛍光画像データには、一般的な蛍光画像データと同様に、蛍光の揺らぎや検出器９の感度の変動等によって蛍光体１以外からの蛍光信号やその他のノイズ信号が含まれる可能性がある。このような場合、適切な閾値を設定し、閾値以上の強度の画素を「１」（蛍光体１）、閾値より下の強度の画素を「０」（背景）と判定する処理を施せばよい。なお、更に高度な閾値処理を含め、蛍光画像データに関する一般的な画像処理や解析方法については、詳しく説明された文献がある（御橋廣眞編、「日本分光学会測定法シリーズ４２、蛍光分光とイメージングの手法」、学会出版センター、２００６年６月初版）。
【００８０】
（第２の変形例）
本発明の実施の形態の第２の変形例では、観測周期の１／２の時点に関して線対称な関数で表せる変調信号を用い、観測周期内で検出された光強度の時系列画像データについて、観測周期の前半部と後半部との自己相関を求めて蛍光体１に対応する画素を抽出する。例えば、変調部７は、余弦関数で表される変調信号を高周波磁場発生部５に送信する。処理ユニット１０の演算部２４は、観測周期前半部の光強度の検出値と、後半部の光強度の検出値との差分を演算する。算出した差分が有限な値となる画素が、蛍光体１の位置に対応する対象画素として抽出される。
【００８１】
第２の変形例では、観測周期の１／２の時点に関して線対称な変調信号を用い、観測周期の前半部と後半部との光強度検出値の自己相関を演算して対象画素を抽出する点が実施の形態及び第１の変形例と異なる。他の構成は、実施の形態及び第１の変形例と同様であるので、重複する記載は省略する。
【００８２】
図１に示した検出器９において、試料１６の蛍光体１、１Ａの位置に対応する画素の位置を（ｉ，ｊ）で指定する。簡単のため、観測周期Ｔを変調周期と同じにする。変調信号Ｒ（ｔ）としては、ｔ＝Ｔ／２に関して線対称な信号を用いる。即ち、Ｒ（ｔ）＝Ｒ（Ｔ−ｔ）となる。例えば、Ｒ（ｔ）＝Ｃ0ｃｏｓ（２πｔ／Ｔ）が用いられる（Ｃ0は定数）。なお、変調信号として、三角波等を用いてもよい。
【００８３】
まず、変調部７によりトリガー信号が処理ユニット１０及び高周波磁場発生部５に送信され、試料１６の観測が開始される。変調部７は、トリガー信号に続いて変調信号Ｒ（ｔ）を高周波磁場発生部５に送信する。
【００８４】
高周波磁場発生部５の発振器４０は、変調信号Ｒ（ｔ）により変調された高周波信号を増幅器４２を介して高周波コイル４４に伝達する。例えば、高周波磁場強度Ｂ0の振幅変調を行う場合は、高周波磁場強度の変調波形Ｂ（ｔ）は、Ｂ（ｔ）＝Ｂ0（１−Ｃ0／２＋Ｃ0ｃｏｓ（２πｔ／Ｔ）／２）等のように変調される。また、高周波磁場周波数の周波数変調の場合は、周波数の変調波形ｆ（ｔ）は、ｆ（ｔ）＝ｆFM−（Ω／２−Ωｃｏｓ（２πｔ／Ｔ）／２）等のように変調される（Ωは変調幅）。
【００８５】
検出器９は、処理ユニット１０からトリガー信号を受けて、サンプリング時間Δｔごとに時系列画像データを取得する。観測周期Ｔの間に取得される画像データのサンプリング数をＮとする。ただし、Ｎは偶数である。時系列画像データは、処理ユニット１０の入力部２０により、記憶部２８に保管される。
【００８６】
演算部２４は、記憶部２８から時系列画像データを読み出す。各画素について、次式のように、観測周期Ｔの前半部ｋ＝１〜Ｎ／２の画像データと後半部ｋ＝Ｎ／２＋１〜Ｎの画像データとの差分の総和より信号強度Ａ（ｉ，ｊ）を求める。
ここで、ｋ＝１〜Ｎ／２である。
【００８７】
蛍光体１に対応する画素では、光強度Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）、Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ＋Ｎ／２）はそれぞれ、｛ＤOFF（ｉ，ｊ）（１−α／２＋αｃｏｓ（２πｋ／Ｎ）／２）｝、｛ＤOFF（ｉ，ｊ）（１−α／２−αｃｏｓ（２πｋ／Ｎ）／２）｝である。したがって、差分｛Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）−Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ＋Ｎ／２）｝は、｛ＤOFF（ｉ，ｊ）αｃｏｓ（２πｋ／Ｎ）｝となる。
式（６）で算出される信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は、
と表せる。ここで、Σｃｏｓ（２πｋ／Ｎ）は１であるので、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は有限の値となる。一方、蛍光体１Ａに対応する画素では、光強度は変調されず一定強度であるので、信号強度は実質的に０である。このように、観測周期の前半部と後半部との光強度の自己相関を演算することにより、自己相関値が有限となる画素を蛍光体１の位置に対応する蛍光として抽出することができる。
【００８８】
第２の変形例では、観測周期Ｔの１／２の時点に関して線対称な変調信号を用い、観測周期Ｔの前半部及び後半部の時系列画像データの相関関係を演算して蛍光体１に対応する画素を抽出する。光強度の差分を求めて対象となる画素を抽出できるので、演算処理が簡単であり、高速に画像データを処理することが可能である。
【００８９】
なお、上述の説明では、トリガー信号に合わせて高周波磁場の変調及び画像データの検出を行っている。しかし、サンプリング数Ｎが２より十分に多い場合は、高周波磁場の変調及び画像データの検出の開始時間をずらしてもよい。一方、サンプリング数Ｎが２と同程度の場合は、高周波磁場の変調及び画像データの検出の開始時間は厳密に合わせる必要がある。高周波磁場の変調及び画像データの検出の開始時間が合わせられない場合は、トリガー信号受信時刻後に遅延時間を設けて高周波磁場の変調及び画像データの検出の開始時間を合わせればよい。
【００９０】
また、変調信号として余弦波を用いたが、正弦波を用いることも可能である。正弦波を用いる場合、変調信号Ｒ（ｔ）として、Ｃ0ｓｉｎ（２πｔ／Ｔ＋φ）と位相をずらせばよい。なお、サンプリング数Ｎが２と同程度に少なくなる場合、変調信号の位相については注意が必要となる。例えば、余弦波を用いる場合は、位相を０°に、正弦波を用いる場合は位相を９０°に調整する必要がある。
【００９１】
また、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は、式（６）を用いて算出している。しかし、次式のように、光強度の差分の２乗和を用いて算出してもよい。
【００９２】
上述のように、第２の変形例では、観測周期Ｔの間で検出された光強度Ｄ（ｉ，ｊ）の時系列画像データに対して、観測周期Ｔの中で時間をずらした時系列画像データ間で相関関係を演算すればよい。この時、演算で得られる値が、変調信号により変動する蛍光成分に比例するように、時系列画像データ間の時間をずらさなければならない。
【００９３】
（第３の変形例）
本発明の実施の形態の第３の変形例では、図１に示した処理ユニット１０の変換部２２において、変調信号が２値化した参照信号に変換される。演算部２４で、光強度に対して２値化した参照信号を用いて位相検波演算が実施される。
【００９４】
第３の変形例では、変調信号を２値化した参照信号を用いて位相検波を行なう点が実施の形態と異なる。他の構成は、実施の形態と同様であるので、重複する記載は省略する。
【００９５】
図１に示した検出器９において、試料１６の蛍光体１、１Ａの位置に対応する画素の位置を（ｉ，ｊ）で指定する。観測周期Ｔ内で検出器９によりサンプリング時間Δｔ毎に検出された光強度（画像データ）Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）のデータ数をＮとする。変調信号Ｒ（ｋ）として、正弦波を用い、変調周期をＮΔｔとする。例えば、変調信号Ｒ（ｋ）は、Ｃｓｉｎ（２πｋ／Ｎ）である。
【００９６】
処理ユニット１０の変換部２２は、変調部７から取得した変調信号Ｒ（ｋ）を２値化して、次式で表される参照信号ＲＤ（ｋ）を生成する。参照信号ＲＤ（ｋ）は、０＜ｋ≦Ｎ／２の範囲で「１」、Ｎ／２＜ｋ≦Ｎの範囲で「−１」である。変換部２２が汎用コンピュータシステムのＣＰＵを用いてソフトウェアで構成される場合、０を基準として大小の比較により変調信号Ｒ（ｋ）から参照信号ＲＤ（ｋ）に変換することができる。また、変換部２２が専用のハードウェアで構成される場合、０を参照レベルとした高速コンパレータで変調信号Ｒ（ｋ）から参照信号ＲＤ（ｋ）に変換することができる。
【００９７】
演算部２４は、光強度Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）及び参照信号ＲＤ（ｋ）を用いて、次式で表される位相検波演算を行ない、復調信号強度Ａ（ｉ，ｊ）を算出する。
【００９８】
蛍光体１に対応する画素の光強度Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）を｛ＤOFF（ｉ，ｊ）（１−α／２−αｓｉｎ（２πｋ／Ｎ）／２）｝と表す。ここで、ＤOFF（ｉ，ｊ）はＥＳＲが発生していない状態での光強度、αは蛍光体１の蛍光強度がＥＳＲにより変化する比率である。
【００９９】
蛍光体１に対応する画素では、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）＝ＤOFF（ｉ，ｊ）α／πと有限の値となる。一方、蛍光体１Ａ等に対応する画素では、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は実質的に０となる。このように、２値化された参照信号ＲＤ（ｋ）を用いて、蛍光体１の蛍光を抽出することができる。
【０１００】
第３の変形例では、蛍光体１に対応する画素においては、２値化した参照信号ＲＤ（ｋ）を用いて位相検波演算を行なっているため、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）はＤOFF（ｉ，ｊ）α／πとなる。一方、式（２）に示した参照信号Ｒ0（ｋ）を用いて位相検波演算を行なうと、蛍光体１に対応する画素の信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は、ＤOFF（ｉ，ｊ）α／４となる。したがって、第３の変形例では、位相検波演算で得られる信号強度Ａ（ｉ，ｊ）が４／πだけ大きくすることができる。
【０１０１】
また、式（２）で示した参照信号Ｒ0（ｋ）を用いると、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）の位相検波演算は、浮動小数点数同士の乗算と加算となる。それに対して、参照信号ＲＤ（ｋ）は、正負１の整数であるので、式（１０）の位相検波演算は浮動小数点数の加減算とみなせる。したがって、位相検波演算を高速に行なうことが可能となる。
【０１０２】
なお、上記の説明では、説明の容易さから、変調信号の周期をＮΔｔとしている。一般的には、変調信号の周期をＮΔｔの非整数倍に設定してもよい。変調信号の周期をＮΔｔの非整数倍に設定した場合に、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）について、式（９）に示す検波演算処理のみでは、蛍光体１Ａに対応する画素において必ずしも信号強度Ａ（ｉ，ｊ）が０にならず有限の値となる。この場合、以下に示すように、検波演算処理に高調波成分除去処理を追加して信号強度Ａ（ｉ，ｊ）を導出する必要がある。
【０１０３】
先ず、光強度Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）と２値化した参照信号ＲＤ（ｋ）を用いて、次式に示すように、検波演算処理を行い、指標ｋ番目における信号強度Ａ’（ｉ，ｊ，ｋ）を計算する。
Ａ’（ｉ，ｊ，ｋ）＝Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）ＲＤ（ｋ） ・・・（１０）
【０１０４】
次に、Ａ’（ｉ，ｊ，ｋ）を用いて高調波成分除去処理を行う。高調波成分除去処理としては、有限インパルス応答（ＦＩＲ）フィルタや無限インパルス応答（ＩＩＲ）フィルタ等の適切な応答関数を持つデジタルフィルタ処理を用いる。例えば、ＦＩＲフィルタの一つである移動平均フィルタを用いる場合、次式のようにＡ’’（ｉ，ｊ，ｋ）が導出される。
【０１０５】
ここで、総和は、指標ｌについてｌ＝０〜Ｎ−１まで行う。移動平均フィルタの低周波通過帯域は、１／ＮΔｔで与えられ、高調波成分の周波数２／Ｔ（Ｔは変調信号の周期）に比べて十分狭くなるようにＮを大きく設定する必要がある。低周波通過帯域を狭く設定することにより、式（１１）の右辺に含まれる高調波成分が除去される。その結果、蛍光体１に対応する画素においてＡ’’（ｉ，ｊ）＝ＤOFF（ｉ，ｊ）α／π、蛍光体１Ａに対応する画素においてにＡ（ｉ，ｊ）＝０となる。移動平均フィルタ操作により、式（１１）の右辺は一定値となり、指標ｋに依存しなくなる。このようにして求めたＡ’’（ｉ，ｊ）を改めてＡ（ｉ，ｊ）とする。なお、移動平均フィルタを含め、デジタルフィルタ処理については、文献等に詳しく説明されている（例えば、A.V. Oppenheim, R.W. Schafer, “Discrete-time signal processing” 2ndEdition, Prentice-Hall出版社、１９９９年、参照）。
【０１０６】
（その他の実施の形態）
上記のように、本発明の実施の形態を記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面はこの発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者にはさまざまな代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。
【０１０７】
本発明の実施の形態においては、変調信号により高周波磁場を変調して、変調信号に同期してＮＶ中心の蛍光強度を変動させている。しかし、変調信号により、静磁場を変調してＮＶ中心の蛍光強度を変動させてもよい。例えば、図８に示すように、変調部７ａを試料１６の近傍に配置する。変調部７ａは、変調信号を生成する信号源５０、変調信号を増幅する増幅器５２、静磁場及び変調磁場を発生する変調コイル５４を備える。信号源５０は、処理ユニット１０に接続され、変調信号が変換部２２に導入される。
【０１０８】
高周波磁場発生部５は、変調されない高周波磁場を試料１６に照射する。更に、変調部７ａにより、静磁場と、変調信号により変調された変調磁場とが試料１６に印加される。変調磁場により、ＮＶ中心のＥＳＲの共鳴状態が変動する。したがって、式（１）に示した光強度Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）の変調周波数ｆFMを、変調磁場の変調周波数ｆHMで置き換えればよい。
Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）＝Ｄ（ｉ，ｊ）ｓｉｎ（２πｆHM・ｋΔｔ＋θ1） ・・・（１２）
式（１）に代えて式（１２）を用いることにより、上述した位相検波演算処理を適用して、ＮＶ中心の蛍光を抽出することができる。
【０１０９】
また、図８に示した蛍光顕微鏡装置を用いて、実施の形態の第１〜第３の変形例で説明した演算処理によりＮＶ中心の蛍光を抽出してもよい。
【０１１０】
このように、本発明はここでは記載していないさまざまな実施の形態等を含むことは勿論である。したがって、本発明の技術的範囲は上記の説明から妥当な特許請求の範囲に係わる発明特定事項によってのみ定められるものである。
【符号の説明】
【０１１１】
１…蛍光体
３…光学顕微鏡
５…高周波磁場発生部
７、７ａ…変調部
９…検出器
１０…処理ユニット
１４…出力装置
１６…試料
２２…変換部
２４…演算部
２６…出力部
４０…発振器
４４…高周波コイル
４６…静磁場印加部
５０…信号源
５４…変調コイル
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光検出磁気共鳴による蛍光顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、蛍光顕微鏡が生体研究分野で広く採用されている。例えば、抗原抗体反応の蛍光観察においては、抗原抗体反応を通じて特定の蛋白質と結合する分子に蛍光体を化学修飾した蛍光分子プローブが用いられる。細胞内部に導入された蛍光分子プローブが目的とする蛋白質を見つけて結合すると、分子内部で電荷移動が発生する。電荷移動がトリガーとなり蛍光体が発光する。あるいは、励起光の照射により蛍光体を発光させる。発光した蛍光体の挙動が蛍光顕微鏡を用いて視野観察される。
【０００３】
従来用いられている蛍光体には、蛍光の短時間寿命（褪色）や不規則な発光（ブリンキング）等の問題が存在する。また、生体研究分野で用いる蛍光体としては、生体細胞に安全な蛍光体が必要となる。従来のセレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）やテルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）等の蛍光体は毒性を有するＣｄを含み、生体への適用は好ましくない。
【０００４】
磁気共鳴により蛍光強度が制御できる蛍光体として、窒素空孔（ＮＶ）中心を有するダイアモンドを用いた蛍光顕微鏡装置が提案されている（非特許文献１参照）。非特許文献１では、ＮＶ中心を配置したナノサイズのダイアモンド粒子（ナノダイアモンド）をマーカーとして含む試料に電子スピン磁気共鳴（ＥＳＲ）が発生する周波数を有する高周波磁場を照射しながら、共焦点レーザ顕微鏡により表面画像観察が実施されている。蛍光強度の測定により、ＮＶ中心の存在位置を常温常圧で観測することができる。更に、ナノスケールの磁性体が周囲に発生する磁気共鳴条件を満たす静磁場の分布の観測に適用することも可能である。静磁場を検出する原子サイズの磁気センサとしてＮＶ中心を有するナノダイアモンドを用いて、ナノメートルの空間分解能を有する顕微鏡としての可能性が示されている。
【０００５】
ダイアモンドは、化学修飾が可能であり、生命活動を阻害する毒性がないと言われている。また、ダイアモンド内に存在するＮＶ中心では、褪色やブリンキングが発生しない。このように、ＮＶ中心を有するダイアモンドを蛍光体として細胞内部に取り入れて、蛍光強度の二次元視野観察が行われている。また、ＮＶ中心がＥＳＲを発生できる特異なスピン状態を有し、基底状態が発光過程に寄与することを利用して、高感度磁気センサへの応用が進められている。
【０００６】
一般に蛍光観察においては、褪色やブリンキングの問題の他にも多くの課題がある。例えば、生体内部には他の蛍光物質が自然に含まれることもある。試料台の汚れ、傷、混入した不純物等に由来する発光が混在することもある。また、顕微鏡の光学部品等の自家蛍光が存在することもある。このようなバックグランド光のため、観測対象となる蛍光体の蛍光強度の測定が困難となる場合がある。また、微弱な蛍光を測定するために臨界状態に置かれた検出器の増幅率は周囲の環境に依存してドリフトするため、蛍光測定のバックグランドを一定に保つことは困難である。
【０００７】
また、蛍光分光の分野では、高周波照射により蛍光スペクトルが変化する現象は、ＮＶ中心に限らず確認されている（非特許文献２参照）。非特許文献２では、強度変調蛍光・マイクロ波二重共鳴（ＡＭ−ＰＭＤＲ）と呼ばれる蛍光スペクトルの有用性が指摘されている。ＡＭ−ＰＭＤＲスペクトルは、照射したマイクロ波に対して強度変調や周波数変調をかけながら測定される。蛍光スペクトルの各ピークに対して、スピン励起に関する情報をラベリングすることができ、スペクトル解析から導かれる物質同定の確度を向上させている。しかしながら、磁気共鳴周波数に対する蛍光強度測定、または周波数一定の高周波磁場を照射しながら励起光波長に対する蛍光強度測定等のように、一次元測定に留まっており、磁気共鳴手法を取り入れた蛍光体の二次元リアルタイム視野観察に応用した例はない。
【０００８】
更に、高周波磁場の強度変調を実施して周期的に発生させた光検出磁気共鳴（ＯＤＭＲ）より、変調された蛍光強度を検波する技術が従来から用いられている(非特許文献３及び４参照)。キノキサリンの三重項やダイアモンド結晶中のＮＶ中心に対して適用して、高周波周波数を掃引した蛍光スペクトルにおいて、バックグランドが排除された波形が得られている。しかしながら、上記の技術を、二次元蛍光画像のリアルタイム視野観察や蛍光体の識別に応用した報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ジー・バラスブラマニアン、他（G. Balasubramanian et al.），ネイチャー（Nature）, ２００８年１０月，第４５５巻，ｐｐ．６４８−６５１
【非特許文献２】ジェイ・エム・デービス、他、（J. M. Davis et al.）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイティッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、１９８２年７月、第７９巻、ｐｐ.４３１３−４３１６
【非特許文献３】山内淳著「磁気共鳴―ＥＳＲ」サイエンス社出版、２００６年３月
【非特許文献４】ピー・ディー・ブロッホ、他、（P. D. Bloch et al.）、ジャーナル・ド・フィジク（Journal De Physique）、１９８５年１０月、第４６巻、ｐｐ.Ｃ７‐５２７‐Ｃ７‐５３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記問題点を鑑み、本発明は、目的とする蛍光を選択的に視野観察することが可能な蛍光顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様によれば、磁気共鳴により蛍光強度が変動する蛍光体を含む試料に励起光を照射し、蛍光体の蛍光を観察する光学顕微鏡と、磁気共鳴を発生させる高周波磁場を試料に照射する高周波磁場発生部と、高周波磁場を変調する変調信号を生成する変調部と、共鳴状態を変調しながら光学顕微鏡で観察した試料表面の光強度の分布を複数の画素のそれぞれでサンプリング時間毎に検出する検出器と、複数の画素の中から光強度の時系列変動が変調信号と互に相関している対象画素を抽出する処理ユニットとを備える蛍光顕微鏡装置が提供される。
【００１２】
本発明の第２の態様によれば、磁気共鳴により蛍光強度が変動する蛍光体を含む試料に励起光を照射し、蛍光体の蛍光を観察する光学顕微鏡と、磁気共鳴を発生させる高周波磁場を試料に照射する高周波磁場発生部と、試料に静磁場及び磁気共鳴の共鳴状態を変動させる変調磁場を印加する変調部と、共鳴状態を変動させながら光学顕微鏡で観察した試料表面の光強度の分布を複数の画素のそれぞれでサンプリング時間毎に検出する検出器と、複数の画素の中から光強度の時系列変動の周期が変調信号に同期している対象画素を抽出する処理ユニットとを備える蛍光顕微鏡装置が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、目的とする蛍光を選択的に視野観察することが可能な蛍光顕微鏡装置を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置の一例を示す図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る蛍光体の一例を示す図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る蛍光体のエネルギ準位の一例を示す図である。
【図４】本発明の実施の形態に係る蛍光体の電子スピン共鳴による蛍光強度の変動の一例を示す図である。
【図５】本発明の実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置による視野観察の一例を示す図である。
【図６】本発明の実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置による視野観察の手順の一例を示すフローチャートである。
【図７】本発明の実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置の他の例を示す図である。
【図８】本発明のその他の実施の形態係る蛍光顕微鏡装置の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下図面を参照して、本発明の形態について説明する。以下の図面の記載において、同一または類似の部分には同一または類似の符号が付してある。但し、図面は模式的なものであり、装置やシステムの構成等は現実のものとは異なることに留意すべきである。したがって、具体的な構成は以下の説明を参酌して判断すべきものである。また図面相互間においても互いの構成等が異なる部分が含まれていることは勿論である。
【００１６】
又、以下に示す本発明の実施の形態は、本発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、本発明の技術的思想は、構成部品の材質、形状、構造、配置等を下記のものに特定するものでない。本発明の技術的思想は、特許請求の範囲に記載された技術的範囲内において、種々の変更を加えることができる。
【００１７】
本発明の実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置は、図１に示すように、光学顕微鏡３、高周波磁場発生部５、変調部７、処理ユニット１０、入力装置１２、出力装置１４を備える。光学顕微鏡３は、光源３２、ダイクロイックミラー３４、バンドパスフィルタ３６、対物レンズ３８を含む。高周波磁場発生部５は、発振器４０、増幅器４２、高周波コイル４４を含む。処理ユニット１０は、入力部２０、変換部２２、演算部２４、出力部２６、記憶部２８を含む。
【００１８】
蛍光顕微鏡装置で視野観察する試料１６は、磁気共鳴により蛍光強度が変動する蛍光体１を含む。試料１６には、蛍光体１の磁気共鳴の共鳴周波数では蛍光強度が変動しない蛍光体１Ａ等を含んでいてもよい。磁気共鳴としては、電子スピン磁気共鳴（ＥＳＲ）を用いて説明するが、核スピン磁気共鳴（ＮＭＲ）であってもよい。
【００１９】
光学顕微鏡３の光源３２から出射された励起光は、ダイクロイックミラー３４を通して対物レンズ３８に導入される。励起光は、対物レンズ３８で適当なビーム径に収束されて、試料１６に照射される。励起光を吸収した蛍光体１、１Ａから放出された蛍光や試料１６表面で反射された励起光等を含む光が、対物レンズ３８、ダイクロイックミラー３４を通り、バンドパスフィルタ３６に導入される。蛍光や反射励起光等を含む光はバンドパスフィルタ３６を通って、蛍光体１の蛍光を含む所定の波長帯が選別され、高感度冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）等の検出器９に入射される。検出器９に入射した光の強度が、二次元に配列された画素のそれぞれでサンプリング時間毎に検出される。検出された光強度の二次元分布が画像として処理ユニット１０に取り込まれ、出力装置１４で表示される。
【００２０】
高周波磁場発生部５の発振器４０で発振された高周波は、増幅器４２により増幅され、試料１６に近接して配置された高周波コイル４４に入力される。高周波コイル４４から試料１６に高周波磁場が照射される。
【００２１】
蛍光体１は、ＥＳＲにより蛍光強度が変動する。蛍光体１として、ＮＶ中心を有するダイアモンド結晶、キノキサリン等が使用可能である。特に、ダイアモンドは、化学修飾が可能で、生命活動を阻害する毒性がないと言われている。また、ＮＶ中心は、褪色やブリンキングの発生が極めて小さい。したがって、平均粒径が約５ｎｍ〜数十ｎｍのナノダイアモンドは、生体観察用の蛍光プローブとして望ましい。
【００２２】
ＮＶ中心は、図２に示すように、炭素（Ｃ）原子位置に置換された窒素（Ｎ）原子と、最近接サイトにＣ原子が存在しない空孔（Ｖ）とが対となって存在する格子欠陥である。ＮＶ中心では、２個の電子がＳ＝１のスピン状態を形成する。図３に示すように、ＮＶ中心の基底状態はスピン三重項3Ａ2であり、励起状態はスピン三重項3Ｅである。また、基底状態と励起状態の間にスピン一重項1Ａ1の中間状態が存在する。スピン三重項3Ａ2、3Ｅ間のエネルギギャップは、約１．９５ｅＶである。
【００２３】
ＮＶ中心の基底状態は、静磁場を印加しない状態でも約２．８７ＧＨｚに相当するエネルギギャップを持つＭｚ＝０の基底状態とＭｚ＝±１の準基底状態に分裂している。したがって、周波数が約２．８７ＧＨｚの高周波磁場を照射すると、ゼロ磁場環境下でもＥＳＲが発生する。ＥＳＲで励起されるＭｚ＝±１の準基底状態は、発光過程において重要な役割を演じ、蛍光強度の変化に影響する。
【００２４】
例えば、波長が約５３２ｎｍの励起光の照射によりＭｚ＝±１の準基底状態から励起状態に励起された電子には、波長が約６３７ｎｍの蛍光を発して励起状態からＭｚ＝±１の準基底状態に戻る放射遷移と、蛍光を発せずに1Ａ1の中間状態を経由してＭｚ＝０の基底状態へ移行する非放射遷移とが存在する。ＥＳＲが起きていない場合では、Ｍｚ＝±１の準基底状態を電子が占有する確率は小さいので、放射遷移が優勢となる。ＥＳＲを発生させた場合、Ｍｚ＝０の基底状態からＭｚ＝±１の準基底状態へ電子が励起されるため、Ｍｚ＝±１の準基底状態を電子が占有する確率が大きくなる。その結果、放射遷移が阻害され、非放射遷移が助長される。
【００２５】
図４は、ＮＶ中心を有するダイアモンド結晶に照射する高周波磁場の周波数に対する蛍光強度の依存性を示す。図４に示すように、ＥＳＲの共鳴周波数ｆＲの近傍の周波数ｆＳ〜ｆＴの範囲で蛍光強度の減少が観測される。したがって、高周波磁場発生部５からＮＶ中心の共鳴周波数ｆＲである約２．８７ＧＨｚの高周波磁場を試料１６に照射することにより、蛍光体１の蛍光強度を変化させることができる。一方、蛍光体１Ａの蛍光強度は、少なくともＮＶ中心の共鳴周波数ｆＲでは変化しない。複数の画素の中から前記光強度の時系列変動の周期が前記変調信号に同期している対象画素を抽出することが可能となる。
【００２６】
実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置では、高周波磁場発生部５により試料１６に含まれる蛍光体１のＮＶ中心にＥＳＲを発生させる高周波磁場を変調部７で生成される変調信号により変調して、ＥＳＲの共鳴状態が変調される。ＮＶ中心の共鳴状態を変調しながら、光学顕微鏡３で励起光を照射して試料表面を観察し、光強度分布を検出器９で検出する。処理ユニット１０は、検出器９で検出された画像の複数の画素の中から、光強度の時系列の周期が変調部７で生成された変調信号に同期している画素を位相検波演算により対象画素として抽出する。
【００２７】
変調部７は、高周波磁場発生部５の発振器４０に電気的に接続された変調信号源である。変調部７で生成される変調信号は、例えば、発振器４０で発振される高周波電気信号を周波数変調する電気信号である。
【００２８】
高周波磁場発生部５の発振器４０で発信された高周波電気信号が変調部７の変調信号により周波数変調される。周波数変調された高周波電気信号は増幅器４２で増幅され、高周波コイル４４に導入される。高周波コイル４４で周波数変調された高周波磁場が生成され、試料１６に照射される。
【００２９】
例えば、高周波電気信号の発振周波数をＥＳＲにより蛍光強度が減少し始める周波数ｆＳと共鳴周波数ｆRの間で周波数変調されるように、中心周波数ｆC、及び変調幅±Δｆを設定する。高周波磁場は、図４に示すように、ＥＳＲにより蛍光体１の蛍光強度が減少し始める周波数ｆSと共鳴周波数ｆRの間の周波数ｆCを中心周波数として変調幅±Δｆの幅で周波数変調される。変調信号を変調周波数ｆFMを有する正弦波とすると、蛍光体１の蛍光強度は、周波数（ｆC−Δｆ）で最大、周波数（ｆC＋Δｆ）で最小となるように、変調信号の変調周波数ｆFMに同期して変動する。
【００３０】
処理ユニット１０の入力部２０は、検出器９の複数の画素でサンプリング時間毎に検出した光強度を時系列画像データとして取得する。時系列画像データに含まれる各画像データは、二次元配列として表現される行列データである。
【００３１】
変換部２２は、検出器９のサンプリング時間に同期して、変調部７からの変調信号をアナログデジタル変換器（ＡＤＣ）等によりデジタル化した参照信号に変換する。
【００３２】
演算部２４は、位相検波回路等により複数の画素のそれぞれで光強度の時系列データに対して参照信号を用いて位相検波の演算を行なう。演算で得られた光強度の時系列変動の周期が、変調信号に同期している対象画素を蛍光体１の蛍光として選択的に抽出して、復調画像を作成する。
【００３３】
出力部２６は、作成された復調画像を出力装置１４に伝送する。記憶部２８は、位相検波演算を処理ユニット１０に実行させるためのプログラムを保存している。また、記憶部２８は、入力部２０で取得された時系列データや、処理ユニット１０における演算において計算途中のデータを一時的に保存する。
【００３４】
入力装置１２は、キーボード、マウス等の機器を指す。入力装置１２から入力操作が行われると対応するキー情報が処理ユニット１０に伝達される。出力装置１４は、モニタなどの画面を指し、液晶表示装置（ＬＣＤ）、発光ダイオード（ＬＥＤ）パネル、エレクトロルミネセンス（ＥＬ）パネル等が使用可能である。出力装置１４は、処理ユニット１０により処理されるデータや得られる画像等を表示する。
【００３５】
処理ユニット１０は、通常のコンピュータシステムの中央処理装置（ＣＰＵ）の一部として構成すればよい。入力部２０、変換部２２、演算部２４、出力部２６は、それぞれ専用のハードウェアで構成しても良く、通常のコンピュータシステムのＣＰＵを用いて、ソフトウェアで実質的に等価な機能を有していても構わない。
【００３６】
例えば、試料１６の蛍光体１の位置に対応する画素の位置を（ｉ，ｊ）で指定する。検出器９のサンプリング時間Δｔで取得される時系列画像データは、指標ｋを用いて指定する。例えば、時間ｋΔｔで取得される画像の位置（ｉ，ｊ）における光強度Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）を
Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）＝Ｄ（ｉ，ｊ）ｓｉｎ（２πｆFM・ｋΔｔ＋θ1） ・・・（１）
で表す。θ1は位相を表す。したがって、位置（ｉ，ｊ）における光強度の時系列データは、指標ｋをインクリメント、又はデクリメントすることで指定することができる。なお、サンプリング時間に関して、標本化定理（ナイキスト定理）によれば、変調周波数ｆFMに対して、少なくとも２倍の周波数を持つサンプリングレートで画像取得を実施すれば、理論的には位相検波は可能である。位相検波の精度を向上させるために、一変調周期内により多くの取得された画像データが含まれることが望ましい。
【００３７】
変調信号からＡＤ変換された参照信号は、次式で表される配列Ｒ0（ｋ）に格納される。
Ｒ0（ｋ）＝ｓｉｎ（２πｆFM・ｋΔｔ＋θ2） ・・・（２）
ここで、θ2は位相を表す。
【００３８】
位置（ｉ，ｊ）における位相検波後の復調信号強度Ａ0（ｉ，ｊ）は、式（１）及び式（２）を用いて算出される。
ここで、Ｎは時系列画像データに含まれる画像のデータ数である。
【００３９】
位相検波により復調された復調信号強度Ａ0（ｉ，ｊ）の内で、式（３）の第１項は、時間に依存しない本質的な信号振幅を与え、位相値θ1及びθ2に依る。式（３）の第２項は、時間に依存し、変調周波数ｆFMの偶数倍の高調波周波数を有する高調波信号成分である。通常のデジタル処理では、位相検波演算後にローパスフィルタを設置して高調波信号成分を除去することにより、式（３）の第１項を蛍光体１の蛍光として抽出する。
【００４０】
また、共鳴周波数ｆRの近傍では蛍光強度が変動しない蛍光体１Ａの位置に対応する画素の光強度は、変調信号によらず一定である。したがって、位相検波演算により除去される。同様に、光学顕微鏡３の対物レンズ３８等の光学部品からの自家蛍光も変調信号に同期せず一定の蛍光強度であるので、位相検波演算で除去される。
【００４１】
なお、演算部２４に高速性能を要求する場合は、演算処理数は少ないほうが望ましい。例えば、データ数Ｎとサンプリング時間Δｔの積ＮΔｔが変調周期の整数倍になるように変調周波数ｆFM、サンプリング時間Δｔ、及びデータ数Ｎを調整しておく。積ＮΔｔが変調周期の整数倍であれば、式（３）の総和を演算する時に周期的に現れる高調波周波数を有する高調波信号成分を除去することができ、高速処理を実現することが可能となる。
【００４２】
また、位相値θ1及びθ2は、初期条件や電気回路による遅延等に起因する位相である。以下の観点から、位相値θ1及びθ2を一致させておくことが望ましい。
【００４３】
通常のデジタル処理による位相検波では、信号に対して直交した位相差を持つ信号をヒルベルト変換を適用して作成する。ヒルベルト変換は、ある時間で取得したデータを中心に前後の時系列データ集団を用いて直交信号を作成する。精度を向上させるためには変換に使用するデータ数を多く取る必要がある。そのために、複数の画像データに対してヒルベルト変換を実施した場合には、多大な演算時間により検波信号の算出に遅れが生じ、リアルタイム処理に支障をきたす虞がある。
【００４４】
また、前述の参照信号に対して直交した参照信号を用意する。例えば、変調信号を生成する変調信号源に加えて、変調信号の位相に対して９０°位相を進めた、あるいは遅らせた信号を生成する直交変調信号源を新たに用意し、ＡＤ変換により直交参照信号を作成する。位相検波処理に使用される直交参照信号は、
Ｒ90（ｋ）＝ｓｉｎ（２πｆFM・ｋΔｔ＋θ2） ・・・（４）
と表せる。式（３）と同様の演算処理を実施することで、次式のような直交参照信号に対する直交復調信号強度が得られる。
【００４５】
しかしながら、復調信号強度Ａ0（ｉ，ｊ）に加えて、直交復調信号強度Ａ90（ｉ，ｊ）の計算も実施する必要がある。更に、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）＝（Ａ0（ｉ，ｊ）2＋Ａ90（ｉ，ｊ）2）1/2を導出する演算処理も必要となる。ここで、式（５）では、位相検波により出現する高調波成分を除去している。例えば、データ数とサンプリング時間の積が変調周期の整数倍となるように変調周波数、サンプリング時間、及びデータ数を調整して、総和の演算処理により高調波成分を除去してもよい。あるいは、ローパスフィルタを設置して高調波成分を除去してもよい。
【００４６】
上述した理由により、位相検波演算の高速化のためには、画像データの取得の前に、θ1＝θ2となるように位相を調整しておくことが望ましい。位相θ1及びθ2を一致させることにより、周波数変調された画像データから復調画像データを最小の演算処理数で構築することが可能となる。
【００４７】
位相θ1及びθ2の調整方法としては、ＮＶ中心からの蛍光強度が周期的に変化するように周波数変調が実施されている共鳴状態において、式（３）の復調信号強度値が最大となるように変調部７の変調信号の位相を調整する。例えば、目視で復調信号強度値を観測しながら、変調部７の変調信号の位相を変化させてもよい。あるいは、より精度よく位相調整する場合は、コンピュータを用いて変調信号の位相を掃引しながら復調信号強度値を計測し、復調信号強度値が最大となる位相を求めてもよい。
【００４８】
実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置では、複数の画像を含む時系列画像データを用いて位相検波演算処理を実施した復調画像において、光強度が変調周波数に同期して変動する光を抽出する。したがって、ＮＶ中心からの蛍光の位置を選択的に反映した復調画像を得ることができる。
【００４９】
例えば、図５に示すように、位相検波演算処理により得られた復調画像、及び検出器９で計測された画像を並べて、出力装置１４の画面の表示部６３、６５に表示する。表示部６５では、位相検波されていないため、蛍光体１の蛍光だけでなく、蛍光体１Ａの蛍光も表示される。表示部６３では、位相検波により蛍光体１Ａの蛍光は除去され、蛍光体１の蛍光を容易に確認することができる。また、光学顕微鏡３に用いる対物レンズ３８等の光学部品からの自家蛍光も同様に除去することができる。
【００５０】
また、従来のように位相検波を行なわずに蛍光強度を計測する場合、検出器９のＣＣＤ等の受光素子及びＣＣＤ周辺の電気回路により決定される波長帯域幅内に存在する光も雑音として画像に混入する。実施の形態においては、特定の周波数で周期的に変動する光成分を位相検波により選択的に抽出するので、実質的に波長帯域幅が狭くなる。したがって、画像の雑音を抑制することができる。即ち、直接ＣＣＤ等により視野観察を実施する従来の蛍光顕微鏡装置に比べ、実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置ではＳ／Ｎ比のよい画像を得ることができる。
【００５１】
なお、実施の形態では、処理ユニット１０に読み込んだ時系列画像データと画像取得に同期した生成した参照信号の時系列データを全て一度に用いて位相検波演算処理を実施している。この場合、処理ユニット１０のハードウェアに依存してデータ読み取り時には演算処理が実行できず、また演算処理時にはデータ読み取りが実行できない。その結果、連続とは言い難い画像更新となる虞もある。このようなハードウェア環境の場合には、遅延時間の少ないリアルタイム処理を実施するために汎用的に用いられるスライディング離散フーリエ変換（ＤＦＴ）法に準ずる位相検波演算を適応してもよい。
【００５２】
次に、実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置による視野観察の手順を、図６に示すフローチャートを用いて説明する。図１に示すように、観察する試料１６には蛍光体１として、ＮＶ中心を有するナノダイアモンドが含有されている。例えば、ナノダイアモンドの平均粒径は約５ｎｍ〜数１０ｎｍである。ＮＶ中心のＥＳＲ共鳴周波数は、約２．８７ＧＨｚである。
【００５３】
ステップＳ１００で、光学顕微鏡３により、試料１６にＮＶ中心を励起する励起光を照射する。光源３２として、例えば波長が約５３２ｎｍのグリーン固体レーザが用いられる。
【００５４】
ステップＳ１０１で、高周波磁場発生部５により、試料１６に高周波磁場が照射される。高周波磁場の周波数は、例えば２８６２ＭＨｚである。
【００５５】
ステップＳ１０２で、変調部７で生成された変調信号により、高周波磁場が周波数変調される。変調信号の周波数変調幅は、例えば±８ＭＨｚである。変調信号の周波数は、数Ｈｚ程度である。
【００５６】
ステップＳ１０３で、検出器９により、光学顕微鏡３で視野観察された試料１６の光強度の分布が、二次元配列された複数の画素でサンプリング時間毎に画像として検出される。検出した画像により、時系列画像データが作成される。
【００５７】
ステップＳ１０４で、処理ユニット１０により位相検波演算処理を実施して、時系列画像データのそれぞれの画像において、複数の画素の中から光強度の時系列変動の周期が、変調信号に同期している対象画素を抽出する。抽出された対象画素を蛍光体１の蛍光として選択的に反映した復調画像が作成される。
【００５８】
ステップＳ１０５で、出力装置１４により、処理ユニット１０から出力された復調画像が、表示される。
【００５９】
実施の形態に係る蛍光顕微鏡装置による視野観察では、複数の画像を含む時系列画像データを用いて位相検波演算処理を実施した復調画像において、光強度が変調周波数に同期して変動する光を抽出する。したがって、ＮＶ中心からの蛍光の位置を選択的に反映した復調画像を得ることができる。
【００６０】
また、実施の形態では、変調信号の周波数に同期して変動する光信号を選択的に抽出している。したがって、装置ドリフトに起因する不安定なベースラインを除去することができ、長時間の視野観察を安定して行うことが可能となる。
【００６１】
上記説明においては、図４に示したように、ＥＳＲにより蛍光体１の蛍光強度が減少し始める周波数ｆSと共鳴周波数ｆRの間の周波数ｆCを中心周波数として変調幅±Δｆの幅で周波数変調している。しかし、周波数変調の中心周波数を共鳴周波数ｆRに設定してもよい。この場合、ＥＳＲにより変動する蛍光体１の蛍光強度の変動は、変調周波数の２倍の周期で変動する。したがって、位相検波演算処理において、光強度が変調周波数の２倍の周波数で変動する画素を抽出すればよい。
【００６２】
また、周波数変調された高周波磁場を試料に照射しているが、高周波磁場の変調は限定されない。例えば、変調部７で生成された変調信号により、発振器４０で発信された高周波電気信号を振幅変調してもよい。この場合、振幅変調される高周波磁場の周波数をＮＶ中心の共鳴周波数ｆR、又は共鳴周波数ｆRの近傍に設定すればよい。高周波磁場の振幅が最小の時、ＮＶ中心でのＥＳＲが抑制されて蛍光強度が大きくなる。高周波磁場の振幅が最大の時、ＮＶ中心でのＥＳＲが発生して蛍光強度が小さくなる。その結果、振幅変調の周期に同期して変動する蛍光体１の蛍光強度を、位相検波演算処理により選択的に抽出することが可能となる。
【００６３】
また、上記の説明では、ＮＶ中心に高周波磁場を照射することにより、ＥＳＲを発生させている。しかし、図７に示すように、静磁場印加部４６を試料１６の近傍に配置して、試料１６に静磁場を印加してもよい。ＮＶ中心の基底状態は、図３に示したように、ゼロ磁場でも約２．８７ＧＨｚに相当するエネルギ分裂を有しているので、静磁場を印加しなくてもＥＳＲを発生させることができる。静磁場を印加した場合、Ｍｚ＝±１の準基底状態が分裂するため、ゼロ磁場での共鳴周波数とは異なる２つの共鳴周波数でＥＳＲが発生する。したがって、いずれか１つの共鳴周波数の近傍で、高周波磁場に周波数変調を実施すればよい。
【００６４】
（第１の変形例）
本発明の実施の形態の第１の変形例では、ＥＳＲのオフ状態（第１状態）及びオン状態（第２状態）において検出した画像データ間の差分を用いて蛍光体１に対応する画素を抽出する。変調部７は、磁気共鳴をオフ状態、及びオン状態に切り替える信号を高周波磁場発生部５に送信する。処理ユニット１０の演算部２４は、第１及び第２状態のそれぞれで取得された２枚の画像データの差分を演算する。差分が有限な値となる画素が、蛍光体１の位置に対応する対象画素として抽出される。
【００６５】
第１の変形例では、共鳴状態をオンオフさせて取得した２枚の画像を用いて対象画素を抽出する点が実施の形態と異なる。他の構成は、実施の形態と同様であるので、重複する記載は省略する。
【００６６】
図１に示した検出器９において、試料１６の蛍光体１、１Ａの位置に対応する画素の位置を（ｉ，ｊ）で指定する。
【００６７】
まず、変調部７は、高周波磁場の照射を停止又は減少させる信号を高周波磁場発生部５に送る。蛍光体１は、ＥＳＲが発生しない第１状態となる。例えば、高周波磁場発生部５の発振器４０で発振させる高周波電気信号の振幅を０又は十分に弱める信号が用いられる。あるいは、発振器４０の発振周波数を蛍光体１のＥＳＲ共鳴周波数から十分離させる信号でもよい。
【００６８】
検出器９は、観測時間ＴOFF内で第１状態の蛍光体１の画像データ（光強度）ＤOFF（ｉ，ｊ）を取得する。画像データＤOFF（ｉ，ｊ）は、処理ユニット１０の入力部２０を介して記憶部２８に保管される。
【００６９】
次に、変調部７は、共振周波数の高周波磁場を照射させる信号を高周波磁場発生部５に送る。蛍光体１は、高周波磁場の照射により、ＥＳＲが発生した第２状態になる。例えば、発振器４０で発振させる高周波電気信号の振幅が０又は十分に弱い場合は、高周波電気信号の振幅を増大させる信号が用いられる。あるいは、発振器４０の発振周波数が蛍光体１のＥＳＲ共鳴周波数から十分離れている場合は、発振周波数をＥＳＲ共鳴周波数に一致させる信号が用いられる。
【００７０】
検出器９は、観測時間ＴON内で、第２状態の蛍光体１の画像データ（光強度）ＤON（ｉ，ｊ）を取得する。観測時間ＴONは、観測時間ＴOFFと同一である。画像データＤON（ｉ，ｊ）は、処理ユニット１０の入力部２０を介して記憶部２８に保管される。
【００７１】
演算部２４は、記憶部２８から画像データＤOFF（ｉ，ｊ）、ＤON（ｉ，ｊ）を読み出す。画像データＤOFF（ｉ，ｊ）、ＤON（ｉ，ｊ）の差分を演算して、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）とする。
【００７２】
信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は、蛍光体１からの蛍光を抽出したデータに相当する。ここで、蛍光体１の蛍光強度がＥＳＲにより変化する比率をαとする。蛍光体１の位置に対応する画素においては、ＤON（ｉ，ｊ）＝αＤOFF（ｉ，ｊ）である。一方、蛍光体１Ａは、ＥＳＲを起こさないので、ＤON（ｉ，ｊ）＝ＤOFF（ｉ，ｊ）である。したがって、蛍光体１の位置に対応する画素においては、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は、（１−α）ＤOFF（ｉ，ｊ）となる。また、蛍光体１Ａの位置に対応する画素においては、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は、０に近い値となる。このように、第１及び第２状態のそれぞれで取得された２枚の画像データの差分を演算することによって、差分が有限となった画像を、蛍光体１の位置に対応する蛍光として抽出する。
【００７３】
第１の変形例では、ＥＳＲのオン状態及びオフ状態において検出した画像データ間の差分を用いて蛍光体１に対応する画素が抽出される。２枚の画素データ間の差分を取ればよいので、演算処理が単純であり、高速に画像データの処理をすることができる。
【００７４】
なお、上述の説明では、画像データは、ＥＳＲが発生していない第１状態の後にＥＳＲが発生した第２状態で検出している。しかし、画像データの検出は、第２状態で先に行った後に第１状態で行ってもよい。
【００７５】
また、第１及び第２状態での画像データの検出の時間間隔は短くすることが望ましい。検出の間隔が長いと、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）が必ずしも、ＥＳＲのオン状態、オフ状態の相違だけを反映しているとはいえなくなる。例えば、第１状態での検出後から第２状態での検出までの時間経過の間に、蛍光体１Ａが移動すること、あるいは化学反応等により蛍光体１Ａの蛍光強度が褪色すること等が起こる可能性がある。この場合、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）において蛍光体１Ａからの蛍光信号がゼロとならず有限の値として残る可能性が否定できない。
【００７６】
また、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）のＳ／Ｎ比を改善するために、観測時間ＴOFF、ＴONを長くすることや、あるいは画像データ取得を繰り返し実行して積算処理することは有効である。積算処理の一例として、画像データＤOFF（ｉ，ｊ）、ＤON（ｉ，ｊ）を交互に複数回繰り返して取得する手順が挙げられる。複数の画像データＤOFF（ｉ，ｊ）、及び複数の画像データＤON（ｉ，ｊ）を、それぞれ積算処理したΣＤOFF（ｉ，ｊ）、ΣＤON（ｉ，ｊ）を用いて差分｛ΣＤOFF（ｉ，ｊ）−ΣＤON（ｉ，ｊ）｝を演算し、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）とする。画像データＤOFF（ｉ，ｊ）、ＤON（ｉ，ｊ）を交互に取得することにより、蛍光体１Ａの移動や褪色による蛍光強度の変化を低減することが可能である。画像データ取得を繰り返し実行する場合に、画像データを取得するタイミングは必ずしも周期的である必要はない。タイミングは非定期的で、例えば、前の画像データを取得した後に検出部９や処理ユニット１０のデータ取り込み準備ができた時点で次の画像データを取得してもよい。
【００７７】
上記の説明では、画像データＤOFF（ｉ，ｊ）、ＤON（ｉ，ｊ）のそれぞれを取得するための観測時間ＴOFF、ＴONは同一としたが、相違してもよい。観測時間ＴOFF、ＴONが一致していない場合は、観測時間の相違を考慮して、画像データＤOFF（ｉ，ｊ）、ＤON（ｉ，ｊ）の差分を演算する。例えば、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は、｛（ＤON（ｉ，ｊ）／ＴON−ＤOFF（ｉ，ｊ）／ＴOFF）×（ＴOFF＋ＴON）／２｝等として演算すればよい。
【００７８】
抽出された信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は、蛍光体１のみに帰属される蛍光強度の分布を表す蛍光画像データである。一般的な蛍光体における蛍光画像データと同様の画像処理や解析を信号強度Ａ（ｉ，ｊ）に施すことにより、例えば、生体細胞において蛍光体１が局在した位置や蛍光体１の運動、蛍光体１の蛍光強度変化を通して得られる周囲との化学反応過程や生命活動過程等の情報が提供される。
【００７９】
画像処理の一例として、閾値処理は対象物を明確に区別する目的に有効であり、対象物の運動軌跡を計算する際に利用される。上述の説明では、蛍光体１がＥＳＲにより蛍光強度が変化する特徴を利用した画像抽出方法を述べたが、このような手順で得られる蛍光画像データには、一般的な蛍光画像データと同様に、蛍光の揺らぎや検出器９の感度の変動等によって蛍光体１以外からの蛍光信号やその他のノイズ信号が含まれる可能性がある。このような場合、適切な閾値を設定し、閾値以上の強度の画素を「１」（蛍光体１）、閾値より下の強度の画素を「０」（背景）と判定する処理を施せばよい。なお、更に高度な閾値処理を含め、蛍光画像データに関する一般的な画像処理や解析方法については、詳しく説明された文献がある（御橋廣眞編、「日本分光学会測定法シリーズ４２、蛍光分光とイメージングの手法」、学会出版センター、２００６年６月初版）。
【００８０】
（第２の変形例）
本発明の実施の形態の第２の変形例では、観測周期の１／２の時点に関して線対称な関数で表せる変調信号を用い、観測周期内で検出された光強度の時系列画像データについて、観測周期の前半部と後半部との自己相関を求めて蛍光体１に対応する画素を抽出する。例えば、変調部７は、余弦関数で表される変調信号を高周波磁場発生部５に送信する。処理ユニット１０の演算部２４は、観測周期前半部の光強度の検出値と、後半部の光強度の検出値との差分を演算する。算出した差分が有限な値となる画素が、蛍光体１の位置に対応する対象画素として抽出される。
【００８１】
第２の変形例では、観測周期の１／２の時点に関して線対称な変調信号を用い、観測周期の前半部と後半部との光強度検出値の自己相関を演算して対象画素を抽出する点が実施の形態及び第１の変形例と異なる。他の構成は、実施の形態及び第１の変形例と同様であるので、重複する記載は省略する。
【００８２】
図１に示した検出器９において、試料１６の蛍光体１、１Ａの位置に対応する画素の位置を（ｉ，ｊ）で指定する。簡単のため、観測周期Ｔを変調周期と同じにする。変調信号Ｒ（ｔ）としては、ｔ＝Ｔ／２に関して線対称な信号を用いる。即ち、Ｒ（ｔ）＝Ｒ（Ｔ−ｔ）となる。例えば、Ｒ（ｔ）＝Ｃ0ｃｏｓ（２πｔ／Ｔ）が用いられる（Ｃ0は定数）。なお、変調信号として、三角波等を用いてもよい。
【００８３】
まず、変調部７によりトリガー信号が処理ユニット１０及び高周波磁場発生部５に送信され、試料１６の観測が開始される。変調部７は、トリガー信号に続いて変調信号Ｒ（ｔ）を高周波磁場発生部５に送信する。
【００８４】
高周波磁場発生部５の発振器４０は、変調信号Ｒ（ｔ）により変調された高周波信号を増幅器４２を介して高周波コイル４４に伝達する。例えば、高周波磁場強度Ｂ0の振幅変調を行う場合は、高周波磁場強度の変調波形Ｂ（ｔ）は、Ｂ（ｔ）＝Ｂ0（１−Ｃ0／２＋Ｃ0ｃｏｓ（２πｔ／Ｔ）／２）等のように変調される。また、高周波磁場周波数の周波数変調の場合は、周波数の変調波形ｆ（ｔ）は、ｆ（ｔ）＝ｆFM−（Ω／２−Ωｃｏｓ（２πｔ／Ｔ）／２）等のように変調される（Ωは変調幅）。
【００８５】
検出器９は、処理ユニット１０からトリガー信号を受けて、サンプリング時間Δｔごとに時系列画像データを取得する。観測周期Ｔの間に取得される画像データのサンプリング数をＮとする。ただし、Ｎは偶数である。時系列画像データは、処理ユニット１０の入力部２０により、記憶部２８に保管される。
【００８６】
演算部２４は、記憶部２８から時系列画像データを読み出す。各画素について、次式のように、観測周期Ｔの前半部ｋ＝１〜Ｎ／２の画像データと後半部ｋ＝Ｎ／２＋１〜Ｎの画像データとの差分の総和より信号強度Ａ（ｉ，ｊ）を求める。
ここで、ｋ＝１〜Ｎ／２である。
【００８７】
蛍光体１に対応する画素では、光強度Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）、Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ＋Ｎ／２）はそれぞれ、｛ＤOFF（ｉ，ｊ）（１−α／２＋αｃｏｓ（２πｋ／Ｎ）／２）｝、｛ＤOFF（ｉ，ｊ）（１−α／２−αｃｏｓ（２πｋ／Ｎ）／２）｝である。したがって、差分｛Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）−Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ＋Ｎ／２）｝は、｛ＤOFF（ｉ，ｊ）αｃｏｓ（２πｋ／Ｎ）｝となる。
式（６）で算出される信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は、
と表せる。ここで、Σｃｏｓ（２πｋ／Ｎ）は１であるので、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は有限の値となる。一方、蛍光体１Ａに対応する画素では、光強度は変調されず一定強度であるので、信号強度は実質的に０である。このように、観測周期の前半部と後半部との光強度の自己相関を演算することにより、自己相関値が有限となる画素を蛍光体１の位置に対応する蛍光として抽出することができる。
【００８８】
第２の変形例では、観測周期Ｔの１／２の時点に関して線対称な変調信号を用い、観測周期Ｔの前半部及び後半部の時系列画像データの相関関係を演算して蛍光体１に対応する画素を抽出する。光強度の差分を求めて対象となる画素を抽出できるので、演算処理が簡単であり、高速に画像データを処理することが可能である。
【００８９】
なお、上述の説明では、トリガー信号に合わせて高周波磁場の変調及び画像データの検出を行っている。しかし、サンプリング数Ｎが２より十分に多い場合は、高周波磁場の変調及び画像データの検出の開始時間をずらしてもよい。一方、サンプリング数Ｎが２と同程度の場合は、高周波磁場の変調及び画像データの検出の開始時間は厳密に合わせる必要がある。高周波磁場の変調及び画像データの検出の開始時間が合わせられない場合は、トリガー信号受信時刻後に遅延時間を設けて高周波磁場の変調及び画像データの検出の開始時間を合わせればよい。
【００９０】
また、変調信号として余弦波を用いたが、正弦波を用いることも可能である。正弦波を用いる場合、変調信号Ｒ（ｔ）として、Ｃ0ｓｉｎ（２πｔ／Ｔ＋φ）と位相をずらせばよい。なお、サンプリング数Ｎが２と同程度に少なくなる場合、変調信号の位相については注意が必要となる。例えば、余弦波を用いる場合は、位相を０°に、正弦波を用いる場合は位相を９０°に調整する必要がある。
【００９１】
また、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は、式（６）を用いて算出している。しかし、次式のように、光強度の差分の２乗和を用いて算出してもよい。
【００９２】
上述のように、第２の変形例では、観測周期Ｔの間で検出された光強度Ｄ（ｉ，ｊ）の時系列画像データに対して、観測周期Ｔの中で時間をずらした時系列画像データ間で相関関係を演算すればよい。この時、演算で得られる値が、変調信号により変動する蛍光成分に比例するように、時系列画像データ間の時間をずらさなければならない。
【００９３】
（第３の変形例）
本発明の実施の形態の第３の変形例では、図１に示した処理ユニット１０の変換部２２において、変調信号が２値化した参照信号に変換される。演算部２４で、光強度に対して２値化した参照信号を用いて位相検波演算が実施される。
【００９４】
第３の変形例では、変調信号を２値化した参照信号を用いて位相検波を行なう点が実施の形態と異なる。他の構成は、実施の形態と同様であるので、重複する記載は省略する。
【００９５】
図１に示した検出器９において、試料１６の蛍光体１、１Ａの位置に対応する画素の位置を（ｉ，ｊ）で指定する。観測周期Ｔ内で検出器９によりサンプリング時間Δｔ毎に検出された光強度（画像データ）Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）のデータ数をＮとする。変調信号Ｒ（ｋ）として、正弦波を用い、変調周期をＮΔｔとする。例えば、変調信号Ｒ（ｋ）は、Ｃｓｉｎ（２πｋ／Ｎ）である。
【００９６】
処理ユニット１０の変換部２２は、変調部７から取得した変調信号Ｒ（ｋ）を２値化して、次式で表される参照信号ＲＤ（ｋ）を生成する。参照信号ＲＤ（ｋ）は、０＜ｋ≦Ｎ／２の範囲で「１」、Ｎ／２＜ｋ≦Ｎの範囲で「−１」である。変換部２２が汎用コンピュータシステムのＣＰＵを用いてソフトウェアで構成される場合、０を基準として大小の比較により変調信号Ｒ（ｋ）から参照信号ＲＤ（ｋ）に変換することができる。また、変換部２２が専用のハードウェアで構成される場合、０を参照レベルとした高速コンパレータで変調信号Ｒ（ｋ）から参照信号ＲＤ（ｋ）に変換することができる。
【００９７】
演算部２４は、光強度Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）及び参照信号ＲＤ（ｋ）を用いて、次式で表される位相検波演算を行ない、復調信号強度Ａ（ｉ，ｊ）を算出する。
【００９８】
蛍光体１に対応する画素の光強度Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）を｛ＤOFF（ｉ，ｊ）（１−α／２−αｓｉｎ（２πｋ／Ｎ）／２）｝と表す。ここで、ＤOFF（ｉ，ｊ）はＥＳＲが発生していない状態での光強度、αは蛍光体１の蛍光強度がＥＳＲにより変化する比率である。
【００９９】
蛍光体１に対応する画素では、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）＝ＤOFF（ｉ，ｊ）α／πと有限の値となる。一方、蛍光体１Ａ等に対応する画素では、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は実質的に０となる。このように、２値化された参照信号ＲＤ（ｋ）を用いて、蛍光体１の蛍光を抽出することができる。
【０１００】
第３の変形例では、蛍光体１に対応する画素においては、２値化した参照信号ＲＤ（ｋ）を用いて位相検波演算を行なっているため、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）はＤOFF（ｉ，ｊ）α／πとなる。一方、式（２）に示した参照信号Ｒ0（ｋ）を用いて位相検波演算を行なうと、蛍光体１に対応する画素の信号強度Ａ（ｉ，ｊ）は、ＤOFF（ｉ，ｊ）α／４となる。したがって、第３の変形例では、位相検波演算で得られる信号強度Ａ（ｉ，ｊ）が４／πだけ大きくすることができる。
【０１０１】
また、式（２）で示した参照信号Ｒ0（ｋ）を用いると、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）の位相検波演算は、浮動小数点数同士の乗算と加算となる。それに対して、参照信号ＲＤ（ｋ）は、正負１の整数であるので、式（１０）の位相検波演算は浮動小数点数の加減算とみなせる。したがって、位相検波演算を高速に行なうことが可能となる。
【０１０２】
なお、上記の説明では、説明の容易さから、変調信号の周期をＮΔｔとしている。一般的には、変調信号の周期をＮΔｔの非整数倍に設定してもよい。変調信号の周期をＮΔｔの非整数倍に設定した場合に、信号強度Ａ（ｉ，ｊ）について、式（９）に示す検波演算処理のみでは、蛍光体１Ａに対応する画素において必ずしも信号強度Ａ（ｉ，ｊ）が０にならず有限の値となる。この場合、以下に示すように、検波演算処理に高調波成分除去処理を追加して信号強度Ａ（ｉ，ｊ）を導出する必要がある。
【０１０３】
先ず、光強度Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）と２値化した参照信号ＲＤ（ｋ）を用いて、次式に示すように、検波演算処理を行い、指標ｋ番目における信号強度Ａ’（ｉ，ｊ，ｋ）を計算する。
Ａ’（ｉ，ｊ，ｋ）＝Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）ＲＤ（ｋ） ・・・（１０）
【０１０４】
次に、Ａ’（ｉ，ｊ，ｋ）を用いて高調波成分除去処理を行う。高調波成分除去処理としては、有限インパルス応答（ＦＩＲ）フィルタや無限インパルス応答（ＩＩＲ）フィルタ等の適切な応答関数を持つデジタルフィルタ処理を用いる。例えば、ＦＩＲフィルタの一つである移動平均フィルタを用いる場合、次式のようにＡ’’（ｉ，ｊ，ｋ）が導出される。
【０１０５】
ここで、総和は、指標ｌについてｌ＝０〜Ｎ−１まで行う。移動平均フィルタの低周波通過帯域は、１／ＮΔｔで与えられ、高調波成分の周波数２／Ｔ（Ｔは変調信号の周期）に比べて十分狭くなるようにＮを大きく設定する必要がある。低周波通過帯域を狭く設定することにより、式（１１）の右辺に含まれる高調波成分が除去される。その結果、蛍光体１に対応する画素においてＡ’’（ｉ，ｊ）＝ＤOFF（ｉ，ｊ）α／π、蛍光体１Ａに対応する画素においてにＡ（ｉ，ｊ）＝０となる。移動平均フィルタ操作により、式（１１）の右辺は一定値となり、指標ｋに依存しなくなる。このようにして求めたＡ’’（ｉ，ｊ）を改めてＡ（ｉ，ｊ）とする。なお、移動平均フィルタを含め、デジタルフィルタ処理については、文献等に詳しく説明されている（例えば、A.V. Oppenheim, R.W. Schafer, “Discrete-time signal processing” 2ndEdition, Prentice-Hall出版社、１９９９年、参照）。
【０１０６】
（その他の実施の形態）
上記のように、本発明の実施の形態を記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面はこの発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者にはさまざまな代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。
【０１０７】
本発明の実施の形態においては、変調信号により高周波磁場を変調して、変調信号に同期してＮＶ中心の蛍光強度を変動させている。しかし、変調信号により、静磁場を変調してＮＶ中心の蛍光強度を変動させてもよい。例えば、図８に示すように、変調部７ａを試料１６の近傍に配置する。変調部７ａは、変調信号を生成する信号源５０、変調信号を増幅する増幅器５２、静磁場及び変調磁場を発生する変調コイル５４を備える。信号源５０は、処理ユニット１０に接続され、変調信号が変換部２２に導入される。
【０１０８】
高周波磁場発生部５は、変調されない高周波磁場を試料１６に照射する。更に、変調部７ａにより、静磁場と、変調信号により変調された変調磁場とが試料１６に印加される。変調磁場により、ＮＶ中心のＥＳＲの共鳴状態が変動する。したがって、式（１）に示した光強度Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）の変調周波数ｆFMを、変調磁場の変調周波数ｆHMで置き換えればよい。
Ｄ（ｉ，ｊ，ｋ）＝Ｄ（ｉ，ｊ）ｓｉｎ（２πｆHM・ｋΔｔ＋θ1） ・・・（１２）
式（１）に代えて式（１２）を用いることにより、上述した位相検波演算処理を適用して、ＮＶ中心の蛍光を抽出することができる。
【０１０９】
また、図８に示した蛍光顕微鏡装置を用いて、実施の形態の第１〜第３の変形例で説明した演算処理によりＮＶ中心の蛍光を抽出してもよい。
【０１１０】
このように、本発明はここでは記載していないさまざまな実施の形態等を含むことは勿論である。したがって、本発明の技術的範囲は上記の説明から妥当な特許請求の範囲に係わる発明特定事項によってのみ定められるものである。
【符号の説明】
【０１１１】
１…蛍光体
３…光学顕微鏡
５…高周波磁場発生部
７、７ａ…変調部
９…検出器
１０…処理ユニット
１４…出力装置
１６…試料
２２…変換部
２４…演算部
２６…出力部
４０…発振器
４４…高周波コイル
４６…静磁場印加部
５０…信号源
５４…変調コイル
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁気共鳴により蛍光強度が変動する蛍光体を含む試料に励起光を照射し、前記蛍光体の蛍光を観察する光学顕微鏡と、
前記磁気共鳴を発生させる高周波磁場を前記試料に照射する高周波磁場発生部と、
前記高周波磁場を変調する変調信号を生成する変調部と、
前記高周波磁場を変調しながら前記光学顕微鏡で観察した前記試料表面の光強度を複数の画素のそれぞれの位置でサンプリング時間毎に検出する検出器と、
前記複数の画素の中から前記光強度の時系列変動が前記変調信号と互に相関している対象画素を抽出する処理ユニット
とを備えることを特徴とする蛍光顕微鏡装置。
【請求項２】
前記高周波磁場発生部が、高周波電気信号を発振する発振器、前記高周波電気信号により前記高周波磁場を生成する高周波コイルを含むことを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項３】
前記変調信号が、前記高周波電気信号を周波数変調する電気信号であることを特徴とする請求項２に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項４】
前記変調信号が、前記高周波電気信号を振幅変調する電気信号であることを特徴とする請求項２に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項５】
前記試料に静磁場を印加する静磁場印加部を更に備えることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項６】
前記処理ユニットは、前記変調信号を前記サンプリング時間に同期してデジタル化した参照信号に変換する変換部、前記複数の画素のそれぞれで前記光強度に対して前記参照信号を用いて位相検波演算を行ない、前記複数の画素の中から前記光強度の時系列変動の周期が前記変調信号に同期している前記対象画素を前記蛍光体の蛍光として抽出する演算部を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項７】
前記参照信号が、１及び−１の２値化された信号であることを特徴とする請求項６に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項８】
前記変調信号が、前記磁気共鳴が停止又は減少する第１状態、及び前記磁気共鳴が発生する第２状態に切り替えるように、前記高周波電気信号の周波数又は振幅を変調する電気信号であり、
前記処理ユニットは、前記第１及び第２状態のそれぞれで検出された光強度の差分を演算し、前記対象画素を前記蛍光体の蛍光として抽出する演算部を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項９】
前記変調信号が、前記光強度を検出する観測周期内の１／２の時点に関して線対称な関数で表され、
前記処理ユニットは、前記観測周期内で前記サンプリング時間毎に検出された前記光強度の時系列検出値について、前記観測周期の前半部の検出値と、前記観測周期の後半部の検出値との差分を演算して、前記対象画素を前記蛍光体の蛍光として抽出する演算部を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項１０】
前記蛍光体が、炭素原子位置に置換された窒素原子と、最近接サイトに炭素原子が存在しない空孔とが対となって存在する格子欠陥を有するダイアモンド結晶であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項１１】
抽出された前記対象画素を前記蛍光体の蛍光として選択的に表示する出力装置を更に備えることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項１２】
磁気共鳴により蛍光強度が変動する蛍光体を含む試料に励起光を照射し、前記蛍光体の蛍光を観察する光学顕微鏡と、
前記磁気共鳴を発生させる高周波磁場を前記試料に照射する高周波磁場発生部と、
前記試料に静磁場及び前記磁気共鳴の共鳴状態を変動させる変調磁場を印加する変調部と、
前記共鳴状態を変動させながら前記光学顕微鏡で観察した前記試料表面の光強度の分布を複数の画素のそれぞれでサンプリング時間毎に検出する検出器と、
前記複数の画素の中から前記光強度の時系列変動の周期が前記変調信号に同期している対象画素を抽出する処理ユニット
とを備えることを特徴とする蛍光顕微鏡装置。
【請求項１３】
前記処理ユニットは、前記変調信号を前記サンプリング時間に同期してデジタル化した参照信号に変換する変換部、前記複数の画素のそれぞれで前記光強度に対して前記参照信号を用いて位相検波演算を行ない、前記複数の画素の中から前記対象画素を前記蛍光体の蛍光として抽出する演算部を含むことを特徴とする請求項１２に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項１４】
前記蛍光体が、炭素原子位置に置換された窒素原子と、最近接サイトに炭素原子が存在しない空孔とが対となって存在する格子欠陥を有するダイアモンド結晶であることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項１】
磁気共鳴により蛍光強度が変動する蛍光体を含む試料に励起光を照射し、前記蛍光体の蛍光を観察する光学顕微鏡と、
前記磁気共鳴を発生させる高周波磁場を前記試料に照射する高周波磁場発生部と、
前記高周波磁場を変調する変調信号を生成する変調部と、
前記高周波磁場を変調しながら前記光学顕微鏡で観察した前記試料表面の光強度を複数の画素のそれぞれの位置でサンプリング時間毎に検出する検出器と、
前記複数の画素の中から前記光強度の時系列変動が前記変調信号と互に相関している対象画素を抽出する処理ユニット
とを備えることを特徴とする蛍光顕微鏡装置。
【請求項２】
前記高周波磁場発生部が、高周波電気信号を発振する発振器、前記高周波電気信号により前記高周波磁場を生成する高周波コイルを含むことを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項３】
前記変調信号が、前記高周波電気信号を周波数変調する電気信号であることを特徴とする請求項２に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項４】
前記変調信号が、前記高周波電気信号を振幅変調する電気信号であることを特徴とする請求項２に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項５】
前記試料に静磁場を印加する静磁場印加部を更に備えることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項６】
前記処理ユニットは、前記変調信号を前記サンプリング時間に同期してデジタル化した参照信号に変換する変換部、前記複数の画素のそれぞれで前記光強度に対して前記参照信号を用いて位相検波演算を行ない、前記複数の画素の中から前記光強度の時系列変動の周期が前記変調信号に同期している前記対象画素を前記蛍光体の蛍光として抽出する演算部を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項７】
前記参照信号が、１及び−１の２値化された信号であることを特徴とする請求項６に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項８】
前記変調信号が、前記磁気共鳴が停止又は減少する第１状態、及び前記磁気共鳴が発生する第２状態に切り替えるように、前記高周波電気信号の周波数又は振幅を変調する電気信号であり、
前記処理ユニットは、前記第１及び第２状態のそれぞれで検出された光強度の差分を演算し、前記対象画素を前記蛍光体の蛍光として抽出する演算部を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項９】
前記変調信号が、前記光強度を検出する観測周期内の１／２の時点に関して線対称な関数で表され、
前記処理ユニットは、前記観測周期内で前記サンプリング時間毎に検出された前記光強度の時系列検出値について、前記観測周期の前半部の検出値と、前記観測周期の後半部の検出値との差分を演算して、前記対象画素を前記蛍光体の蛍光として抽出する演算部を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項１０】
前記蛍光体が、炭素原子位置に置換された窒素原子と、最近接サイトに炭素原子が存在しない空孔とが対となって存在する格子欠陥を有するダイアモンド結晶であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項１１】
抽出された前記対象画素を前記蛍光体の蛍光として選択的に表示する出力装置を更に備えることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項１２】
磁気共鳴により蛍光強度が変動する蛍光体を含む試料に励起光を照射し、前記蛍光体の蛍光を観察する光学顕微鏡と、
前記磁気共鳴を発生させる高周波磁場を前記試料に照射する高周波磁場発生部と、
前記試料に静磁場及び前記磁気共鳴の共鳴状態を変動させる変調磁場を印加する変調部と、
前記共鳴状態を変動させながら前記光学顕微鏡で観察した前記試料表面の光強度の分布を複数の画素のそれぞれでサンプリング時間毎に検出する検出器と、
前記複数の画素の中から前記光強度の時系列変動の周期が前記変調信号に同期している対象画素を抽出する処理ユニット
とを備えることを特徴とする蛍光顕微鏡装置。
【請求項１３】
前記処理ユニットは、前記変調信号を前記サンプリング時間に同期してデジタル化した参照信号に変換する変換部、前記複数の画素のそれぞれで前記光強度に対して前記参照信号を用いて位相検波演算を行ない、前記複数の画素の中から前記対象画素を前記蛍光体の蛍光として抽出する演算部を含むことを特徴とする請求項１２に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項１４】
前記蛍光体が、炭素原子位置に置換された窒素原子と、最近接サイトに炭素原子が存在しない空孔とが対となって存在する格子欠陥を有するダイアモンド結晶であることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の蛍光顕微鏡装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−１８０５７０（Ｐ２０１１−１８０５７０Ａ）
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０９５２７（Ｐ２０１０−１０９５２７）
【出願日】平成２２年５月１１日（２０１０．５．１１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、独立行政法人科学技術振興機構、「戦略的創造研究推進事業」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【出願人】（０００００４２７１）日本電子株式会社 (811)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１１日（２０１０．５．１１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、独立行政法人科学技術振興機構、「戦略的創造研究推進事業」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１３２２７２）国立大学法人京都大学 (1,269)
【出願人】（０００００４２７１）日本電子株式会社 (811)
【Ｆターム（参考）】
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