血圧降下作用を有するローヤルゼリーの製造方法
【課題】 血圧降下作用などの有用な特性を発揮するローヤルゼリーを得ることのできる新しい技術を提供する。
【解決手段】 ローヤルゼリーを微生物（例えば、アスペルギルス属、モナスカス属またはリゾプス属の微生物）で発酵させ、好ましくは、発酵工程の後に微生物を殺菌する工程を含む、血圧降下作用を有するローヤルゼリーの製造方法。アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するローヤルゼリーが得られる。
【解決手段】 ローヤルゼリーを微生物（例えば、アスペルギルス属、モナスカス属またはリゾプス属の微生物）で発酵させ、好ましくは、発酵工程の後に微生物を殺菌する工程を含む、血圧降下作用を有するローヤルゼリーの製造方法。アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するローヤルゼリーが得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血圧降下作用を有するローヤルゼリーの製造方法、ならびに、該方法によって得られるローヤルゼリーを含有するローヤルゼリー組成物および血圧降下剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ローヤルゼリーとは、若い働き蜂の咽頭腺により分泌される乳白色したペースト状物質であり、その成分は必須アミノ酸をはじめとするアミノ酸が豊富に含まれ良質なタンパク質を構成している。さらに、ビタミン類、ミネラル類、炭水化物などの微量成分を含んでいる。例えばビタミン類ではビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、成長促進や老化防止に効果のあるパントテン酸、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥなどが挙げられる。ミネラル類ではカリウム、マグネシウム、カルシウム、銅、鉄、リンなどがあげられる。炭水化物ではブドウ糖、果糖などが挙げられる。さらに、アセチルコリン様物質、有機酸（１０−ヒドロキシデセン酸など）、脂肪、タンパク質性の抗菌物質であるロイアリシンなどが含まれている。
【０００３】
このようにローヤルゼリーには様々な栄養成分を含んでおり、例えば、抗菌作用、免疫増強作用、抗炎症作用、老化防止作用、更年期障害の予防・治療、抗がん作用など数多くの効果が知られている。
【０００４】
一方、生活習慣病の中でも高血圧患者数は我が国では３０歳以上で２０００万人と推定され、高血圧は現在の国民病ともいわれる側面をもっている。高血圧は各種慢性疾患に対するリスクファクターとなり、脳血管障害、心筋梗塞などの血管障害を誘発することが知られている。今後ますます高齢化が進むにつれ、高血圧症者も増大することが予想され、高血圧の改善あるいは発症の予防が課題となっている（非特許文献１）。
【０００５】
アンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥと略することがある）はアンジオテンシンＩを血圧上昇物質であるアンジオテンシンＩＩに変換し、血圧降下作用をもつブラジキニンを分解するため血圧を上昇させる働きがある。したがってＡＣＥを阻害する物質（ＡＣＥ阻害物質）があれば血圧を下げることができ、高血圧症予防又は治療に効果があることが期待される。
ＡＣＥ活性を抑制させることにより血圧を降下させるＡＣＥ阻害物質として、例えば、カプトプリルが開発され医薬品として利用されている。
【０００６】
一方、食品分野においては、乳カゼイン（非特許文献２）、わかめタンパク質（非特許文献３）、かつお節（非特許文献４、非特許文献５）、イワシ（非特許文献６）などの酵素分解物、発酵乳（非特許文献７）、ブナハリタケエキス（非特許文献８）などＡＣＥ阻害阻害物質を含む食品が数多く市販されている。
【０００７】
近年では動物の消化酵素であるトリプシンや枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）どの微生物由来のプロテアーゼを用いてローヤルゼリーを加水分解することによりＡＣＥ阻害物質を得る試みがなされている（特許文献１、非特許文献９）。さらに、枯草菌由来のプロテアーゼを用いてローヤルゼリーを加水分解した際の血圧降下の関与成分としてはイソロイシン−チロシン、バリン−チロシンおよびイソロイシン−バリン−チロシンなどのペプチドが知られている（非特許文献１０）。しかし、ローヤルゼリーの消化に用いるトリプシンは動物由来の消化酵素であり、トリプシンで加水分解したローヤルゼリーは動物由来の感染性物質の混入を完全に否定することは困難であるという問題があり、より安全なローヤルゼリー由来のＡＣＥ阻害物質が望まれている。また、プロテアーゼにより生産されるものはローヤルゼリーが加水分解されたペプチドであり、それ以外の有用産物の生産は見込めず、食品の高付加価値化は期待できない。
【０００８】
ローヤルゼリーは上記のように様々な効果があり、長年食されてきたが最近になって、ローヤルゼリーにアレルゲンが含まれていることが徐々に明らかになってきた。アレルゲンを低下させるために蛋白質分解酵素処理及び／又は糖分解酵素処理を行う方法が知られている(特許文献２、特許文献３)。しかし、アレルギーの低下とＡＣＥ阻害物質を産生する酵素が異なるため、一度の操作でＡＣＥ阻害物質と低アレルゲン化を行うには操作が煩雑であり、簡便な方法が望まれていた。
【非特許文献１】藤田裕之他、薬理と治療 Ｖｏｌ．２５ Ｎｏ．８ １４７（２１５５）−１５１（２１５９）
【非特許文献２】Ｓ．ｍａｒｕｙａｍａ，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，１５８１（１９８７）．
【非特許文献３】Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０，８２−９０，２００４
【非特許文献４】Ｙｏｋｏｙａｍａ Ｋ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６，１５４１（１９９２）
【非特許文献５】Ｈ． Ｆｕｊｉｔａ．ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．， ６５：５６４（２０００）
【非特許文献６】関英治 他、日本農芸化学会誌 第６９巻（８号）、１０１３−１０２０（１９９５）
【非特許文献７】Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｎ． ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ， ７７， ９１７−９２２ （１９９４）
【非特許文献８】坂元雄二 他、応用薬理 第６１巻（４／５）、２２１−２２９（２００１）
【非特許文献９】丸山広恵 他、日本食品科学工学会誌 第５０巻（７号）、３１０−３１５（２００３年）
【非特許文献１０】Ｔｏｋｕｎａｇａ Ｋ． ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２７（２），１８９−１９２（２００４）
【特許文献１】特開平４−２７９５９７号公報
【特許文献２】特開２００２−１１２７１５号公報、
【特許文献３】特開２００５−２８７４１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、血圧降下作用などの有用な特性を発揮するローヤルゼリーを得ることのできる新しい技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意検討を行った結果、ローヤルゼリーには抗菌物質である１０−ヒドロキシデセン酸やロイアリシンが含まれているにもかかわらず、ローヤルゼリーと微生物を混合し、発酵を行うことにより、前記課題が解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、
１．ローヤルゼリーを微生物で発酵させる工程を含むことを特徴とする、血圧降下作用を有するローヤルゼリーの製造方法。
２．微生物がアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）、モナスカス属（Ｍｏｎａｓｃｕｓ属）または、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属）の微生物であることを特徴とする、前記１に記載のローヤルゼリーの製造方法、
３．微生物がアスペルギルス ホエニシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）、アスペルギルス メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ）、モナスカス パープレウス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）または、リゾプス ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）であることを特徴とする、前記１に記載のローヤルゼリーの製造方法、
４．発酵工程の後に、微生物を殺菌する工程を含むことを特徴とする、前記１〜３のいずれかに記載のローヤルゼリーの製造方法、
５．加熱により微生物の殺菌を行うことを特徴とする、前記４に記載のローヤルゼリーの製造方法、
６．血圧降下作用を有するローヤルゼリーがアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有することを特徴とする、前記１〜５のいずれか１に記載のローヤルゼリーの製造方法、
７．前記１〜６のいずれかの方法によって得られる血圧降下作用を有するローヤルゼリーを含有することを特徴とする、ローヤルゼリー組成物、
８．前記１〜６のいずれかの方法によって得られる血圧降下作用を有するローヤルゼリーを有効成分として含有することを特徴とする、血圧降下剤、
からなる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によるとより安全で簡便な方法により血圧降下作用を有するローヤルゼリーを製造することができ、この血圧降下作用を有するローヤルゼリーを利用して、ローヤルゼリー組成物質や血圧降下剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の血圧降下作用を有するローヤルゼリーは、ローヤルゼリーを微生物で発酵させる工程により製造される。
【００１４】
ローヤルゼリーの原産国は例えば日本、中国、台湾、タイ、ブラジル、ヨーロッパ諸国、オセアニア諸国、アメリカなどを挙げることができ、いずれの原産国のローヤルゼリーを用いてもよい。また、複数の原産国のローヤルゼリーを適宜混合して用いてもよい。ローヤルゼリーは液体であることが必要であり、凍結乾燥状態のローヤルゼリーを用いる場合は精製水、水道水または適当な緩衝液などで溶解して用いることができる。また、凍結状態のローヤルゼリーは融解して用いることができる。
【００１５】
さらに、ローヤルゼリーは加熱、遠心分離、アルコール抽出、ろ過、フリーズドライまたは熱風乾燥などの加工並びに各種栄養素などが添加されたものであってもよい。
ローヤルゼリーと混合する微生物は特に制限がなく例えば細菌、酵母、カビなどを挙げられ、これらの中でもカビが好適に挙げられる。さらにアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）、モナスカス属（Ｍｏｎａｓｃｕｓ属）または、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属）に属するカビを好適に挙げることができる。アスペルギルス属のカビとして具体的にはアスペルギルス ホエニシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）、アスペルギルス オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ）、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス ソウヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス コニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス ウエンティ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｗｅｎｔｉｉ）、アスペルギルス スルフレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ）、アスペルギルス タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉｉ）などを挙げることができ、好ましくはアスペルギルス ホエニシス、アスペルギルス メレウスを挙げることができる。
またモナスカス属（Ｍｏｎａｓｃｕｓ属）のカビとして具体的にはモナスカス ピロウサス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ）、モナスカス パープレウス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）、モナスカス ルーバー（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｂｅｒ）、モナスカス ルニスポラス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ）などを挙げることができ、好ましくはモナスカス パープレウス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）を挙げることができる。
さにらに、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属）のカビとして具体的にリゾプス ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）を挙げることができる。
【００１６】
これら微生物は単独で使用してもよく、２種以上の微生物を使用してもよい。また、微生物とローヤルゼリーを混合する場合、必要な菌体量を一度にローヤルゼリーと混合してもよいし、必要な菌体量を２回以上に分けて混合してもよい。また、２種以上の微生物を使用する場合、ぞれぞれの微生物を同時にローヤルゼリーと混合してもよく、別々に分けてローヤルゼリーと混合してもよい。
【００１７】
ローヤルゼリーと混合する微生物は、固体培地で培養した微生物、液体培地で培養した微生物などを用いることができる。固体培地を用いて培養した微生物の場合、例えば、固体培地を用いて培養した微生物を滅菌水、滅菌した生理的食塩水または滅菌した緩衝液に懸濁してローヤルゼリーと混合してもよい。また、固体培地を用いて培養した微生物を白金耳または白金鈎でかきとりローヤルゼリーと混合してもよい。
【００１８】
また、液体培養した微生物をローヤルゼリーと混合する場合、滅菌水、滅菌した生理的食塩水または滅菌した緩衝液などで菌体を洗浄し培養液を除去しても良い。さらに、菌体を洗浄した場合、ガラスフィルター等で菌体より余分な水分を除去した後、ローヤルゼリーと混合してもよいし、洗浄した菌体を再度、滅菌水、滅菌した生理的食塩水または滅菌した緩衝液に懸濁してローヤルゼリーと混合してもよい。
【００１９】
さらに、液体培養終了後、上記のような洗浄を行わず、菌体と培養液の混合液をローヤルゼリーと混合してもよい。
微生物の培養の条件は微生物が生育できる条件であれば特に制限はなく、適宜条件を選択できる。
例えば、培地のｐＨは微生物が増殖できるｐＨであれば特に限定されないが、カビであればｐＨ３〜８、好ましくはｐＨ４〜６のｐＨを挙げることができる。
また、培養温度は微生物が増殖できる温度であれば特に限定されないが、カビであれば５〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃の培養温度を挙げることができる。
【００２０】
さらに、培養方法は静置培養、振とう培養、攪拌培養、通気攪拌培養などの培養方法で培養することができる。
培地成分として例えば、炭素源としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、スクロース、フラクトース、マンニトール、ソルビトール、グリセリン、エチレングリコール、澱粉、糖蜜、コーン・ステープ・リカー、麦芽エキス、澱粉水解物などを単独または二種以上混合したものを例示できる。窒素源としては、アンモニユウム塩、硝酸塩などの無機性窒素源や、ペプトン、大豆粉、肉エキス、カゼイン、カザミノ酸、尿素などの有機性窒素源を単独または二種以上混合したものを例示できる。また、培地には必要に応じて、アミノ酸、各種ビタミン、酵母エキス、粉末酵母、脂肪酸などの有機微量栄養素、リン酸塩、鉄塩、マンガン塩、マグネシウム塩、その他の金属塩などの無機塩類をそれぞれ単独または二種以上併用して用いることができる。
【００２１】
微生物と混合した後のローヤルゼリーの固形分濃度は、０．１〜３０Ｗ／Ｖ％を挙げることがで、好ましくは１〜１５Ｗ／Ｖ％、より好ましくは４〜１０Ｗ／Ｖ％を挙げることができる。ここで、例えば１０Ｗ／Ｖ％は、１００mLのローヤルゼリー混合物を凍結乾燥などにより乾燥させたとき１０ｇの乾燥品が得られることを意味している。
【００２２】
微生物とローヤルゼリーを混合し発酵する時間は目的とする血圧降下物質が産生及び／又はアレルゲン性タンパク質が減少する時間であれば特に限定されないが、半日〜１０日間、好ましくは１日〜４日間が好ましい。
また、微生物とローヤルゼリーを混合する際のローヤルゼリーのｐＨは目的とする血圧降下物質が産生及び／又はアレルゲン性タンパク質が減少するｐＨであれば特に限定されないが、カビを用いた場合は、ｐＨ３〜８、好ましくはｐＨ４〜６が好ましい。
【００２３】
微生物とローヤルゼリーを混合し発酵させている間の温度は血圧降下物質が産生及び／又はアレルゲン性タンパク質が減少する温度であれば特に限定されないが、カビを用いた場合は５℃〜４０℃、好ましくは１５℃〜３５℃、より好ましくは２０℃〜３０℃が好ましい。
微生物とローヤルゼリーを混合し発酵させている間は、静置、振とう、攪拌、通気攪拌などを行ってもよい。
【００２４】
ローヤルゼリーに炭素源、窒素源、有機微量栄養素、無機塩類、脂質類などを単独または二種以上を添加してもよい。例えば炭素源としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、スクロース、フラクトース、マンニトール、ソルビトール、グリセリン、エチレングリコール、澱粉、糖蜜、コーン・ステープ・リカー、麦芽エキス、澱粉水解物などを単独または二種以上混合したものを例示できる。窒素源としては、アンモニユウム塩、硝酸塩などの無機性窒素源や、ペプトン、大豆粉、肉エキス、カゼイン、カザミノ酸、尿素などの有機性窒素源を単独または二種以上混合したものを例示できる。また、有機微量栄養素としては、アミノ酸、各種ビタミン、酵母エキス、粉末酵母、脂肪酸、または無機塩類としては、リン酸塩、鉄塩、マンガン塩、マグネシウム塩、その他の金属塩をそれぞれ単独または二種以上混合したもの例示できる。
【００２５】
なお、本明細書で用いる発酵の意味は微生物とローヤルゼリーと混合することにより、血圧降下作用を有するローヤルゼリーが産生されればよく、ローヤルゼリーと微生物の混合物中で微生物が増殖してもしなくてもよい。本発明によって得られる血圧降下性ローヤルゼリーは、重要な特徴の一つとしてＡＣＥ阻害作用を発揮する。このようなＡＣＥ阻害物質は、微生物により作られたプロテアーゼなどの酵素の他に種々の酵素の作用により、単に酵素処理する場合に比べてＡＣＥ阻害物質の生産性の向上や、種々の栄養成分の生産が見込まれる。さらに、微生物が菌体内にローヤルゼリーまたはその分解物を取込み菌体内で生産されたものであってもよい。
【００２６】
本発明に従う血圧降下作用を有するローヤルゼリーの製造においては、一般に、如上の発酵工程の後に微生物を殺菌する工程を含む。微生物とローヤルゼリーの発酵液の殺菌方法は、微生物が食品として問題がない程度に殺菌されればよい。殺菌方法としては、加熱により殺菌する方法、薬剤を用いて殺菌する方法、ろ過により微生物を除菌する方法、遠心分離を用いて微生物を除菌する方法が例示でき、これら方法を単独で用いてもよいし、二種類以上を組み合わせてもよい。好ましくは、加熱により微生物を殺菌する。加熱温度は６０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上で加熱することが好ましい。
【００２７】
本発明のローヤルゼリーを各種クロマトグラフィーを用いてＡＣＥ阻害物質を精製してもよい。精製方法としてはゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動などを挙げることができ、これら単独若しくは組み合わせることにより精製を行うことも可能である。
【００２８】
ゲルろ過クロマトグラフィーは、種々な分子量のタンパク質を分離できるゲルろ過クロマトグラフィー用の担体があり、分子量が約１万以下のタンパク質を分離できるゲルろ過クロマトグラフィー用の担体が好ましい。イオン交換クロマトグラフィーに用いられているイオン交換基としては、陰イオン交換体、陽イオン交換体などがあり、陰イオン交換体としては、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ基）、四級アミノエチル基（ＱＡＥ）などを例示することができる。また、陽イオン交換体としては、カルボキシメチル（ＣＭ）基、スルホプロピル（ＳＰ）基を例示することができる。疎水クロマトグラフィーに用いられる担体としてはブチル基（Ｂｕｔｙｌ基）、エチル基（Ｅｔｈｙｌ基）、フェニル基（Ｐｈｅｎｙｌ基）が結合した担体を例示することができる。逆相クロマトグラフィーに用いられる担体としとはオクタデシル基（Ｃ１８）、オクタデシル基とはアルキル基の長さが異なるＣ３０、Ｃ８、Ｃ４などが結合した担体が例示される。順相クロマトグラフィーに用いられる担体としてはシリカゲルのほか、シアノプロピル基、ジオール構造を有する官能基、アミノプロピル基、ポリアミンなどが結合した担体が例示される。
【００２９】
本発明の血圧降下作用を有するローヤルゼリーは、上記のクロマトグラフィー等を用いて精製を行なうことにより血圧降下剤として利用することができる。また、本発明の血圧降下性ローヤルゼリーまたはその精製品に各種成分を添加することによりローヤルゼリー組成物として供することができる。各種成分としては、例えば糖、脂質、乳化剤、増粘剤、調味料、香料、酸味調整剤、保存料、果汁、香料、各種栄養成分などが挙げられ、本発明の効果を損なわない範囲で使用することができる。また、各種成分は単独で用いても良いし二種以上を混合して用いてもよい。例えば糖としては、蔗糖、異性化糖、グルコース、フラクトース、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース等を例示することができる。乳化剤としては、蔗糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、レシチン等を例示することができる。増粘剤としてはカラギーナン、アラビアガム、キサンタンガム、グァーガム、ペクチン、ローカストビーンガム増粘剤澱粉、ジェランガム等を例示することができる。酸味調整剤としては、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、フマル酸、グルコン酸、酒石酸等を例示することができる。保存料としては、安息香酸及びその塩、ソルビン酸及びその塩、パラベン、亜硫酸ナトリウム、ペクチン分解物、グリシン等を例示することができる。果汁としては、トマト果汁、梅果汁、リンゴ果汁、レモン果汁、オレンジ果汁、ベリー系果汁等を例示することができる。香料としては、ハーブ、スパイスなどの香辛料、フルーツ系香料、バニラなどの香料等を例示することができる。この他、好ましい他の栄養成分として、ビタミンＤ等のビタミン類やカルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛等のミネラル類等が挙げられる。
【００３０】
本発明によって得られる血圧降下作用を有するローヤルゼリー、ローヤルゼリー組成物または血圧降下剤はそれらを添加・配合して調製した食品として供することもできる。そのような食品の具体的形態としては、例えば、飲料類、菓子、キャンディ、ガム、パン、畜肉製品、乳製品、レトルト食品、即席食品、冷凍食品、ゼリー状食品、養蜂産品、漬物、調味料等を挙げることができる。これらの食品は、いわゆる健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養機能食品、栄養補助食品、サプリメントなどとしても有用である。また、それらの食品としての形状としては、顆粒、粉末、タブレット、カプセル、チュアブル、ドリンク、ゼリー、ペースト、粒などを挙げることができる。
さらに、ローヤルゼリーを発酵させることにより、上記のようにＡＣＥ阻害物質の生産の他に、抗酸化物質、モナコリンＫ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、コリン（アセチルコリンの前駆体）などの生産が見込まれる。これらの効果としては、抗酸化物質は血流改善、モナコリンＫは血中コレステロールの低下、ＧＡＢＡは血圧降下、コリンは血圧降下および動脈硬化予防などが期待される。
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
ＡＣＥ阻害活性測定方法
＜ホウ酸緩衝液の調製＞
５０ｍＭ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７４５０ｍＬと２２０ｍＭ
Ｈ３ＢＯ４５５０ｍＬを混合し、ｐＨ８．３のホウ酸緩衝液を調製した。
＜基質溶液の調製＞
約３０ｍＬのホウ酸緩衝液にＢｚ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ・Ｈ２Ｏ（分子量４４７．４９ ペプチド研究所社製）１７０ｍｇ、ＮａＣｌ１．７８ｇを溶解後、１ＮＮａＯＨでｐＨ８．３に調整し、ホウ酸緩衝液で５０ｍＬにメスアップして、基質溶液とした。
＜ＡＣＥ溶液の調製＞
アンギオテンシン変換酵素（ウサギ肺由来 シグマ社製）をホウ酸緩衝液で溶解して６０ｍＵ／ｍＬの溶液をＡＣＥ溶液とした。
ＡＣＥ阻害活性の測定方法
【００３２】
（１）阻害活性の測定
サンプル３０μＬと基質溶液２５０μＬを混合し、３７℃で５分間放置した。５分間放置した後、ＡＣＥ溶液を１００μＬ添加し、３７℃で３０分間反応後、１ＮＨＣｌを２５０μＬ添加し、反応を停止させた。反応停止後１．５ｍＬの酢酸エチルを添加し、激しく１分間攪拌した。次に３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い上層の酢酸エチル層を０．５ｍＬ分取し、遠心エバポレーター（４０℃、１．５時間）で蒸発乾固させた。蒸発乾固させたものに２ｍＬの精製水を加え、溶解後、２２８ｎｍにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をＡとする。
【００３３】
（２）ブランクの測定
サンプル３０μＬ、基質溶液２５０μＬ及び１ＮＨＣｌ２５０μＬを混合し、３７℃で５分間放置した。５分間放置した後、ＡＣＥ溶液を１００μＬ添加し、３７℃で３０分間放置した。放置の後、１．５ｍＬの酢酸エチルを添加し、激しく１分間攪拌した。次に３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い上層の酢酸エチル層を０．５ｍＬ分取し、遠心エバポレーター（４０℃、１．５時間）で蒸発乾固させた。蒸発乾固させたものに２ｍＬの精製水を加え、溶解後、２２８ｎｍにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をＢとする。
【００３４】
（３）コントロールの測定
前記（１）活性の測定でサンプルの代わりにホウ酸緩衝液を用いて同様に操作を行い、２２８ｎｍにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をＣとする。さらに、前記（２）ブランクの測定の測定でサンプルの代わりにホウ酸緩衝液を用いて同様に操作を行い、２２８ｎｍにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をＤとする。
【００３５】
（４）計算
下式によりＡＣＥ阻害活性を求めた。
ＡＣＥ阻害活性（％）＝（Ａ−Ｂ）×１００／（Ｃ−Ｄ）
【実施例２】
【００３６】
微生物の準備
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門より、アスペルギルス ホエニシス ＮＢＲＣ６６４８（以下、ＮＢＲＣ６６４８と略することがある）のＬ−凍乾標品を購入した。Ｌ−凍乾標品のアンプルを開封し、下記に示す方法で調製した復元液０．２ｍＬを滅菌したバスツールピペット用いて加えた。約３０分放置後、攪拌してＮＢＲＣ６６４８を懸濁し、懸濁液を調製した。栄研器材株式会社製パールコア(登録商標)ポテトデキストロース寒天培地を用いて使用方法に従い平板培地（直径９ｃｍの丸型シャーレ）を調製し、前記懸濁液を滅菌したパスツールピペットで０．１ｍＬとり、前記平板培地に接種し、コーンラージ棒で平板培地全体に塗布した。２５℃で７日間培養を行し、ＮＢＲＣ６６４８が増殖した平板を調製した。
【００３７】
＜復元液の調製＞
精製水１００ｍＬにペプトン（日本製薬株式会社製）０．５ｇ、酵母エキス（日本製薬株式会社製）０．３ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．１ｇを溶解し、１ＮＮａＯＨまたは１ＮＨＣｌでｐＨを７．０に調製し、１２１℃で１５分間オートクレーブを行い滅菌した。
【実施例３】
【００３８】
ＮＢＲＣ６６４８の培養
実施例２のＮＢＲＣ６６４８が増殖した平板１枚に滅菌した０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５ｍＬ添加し、滅菌したスパーテルで培地を削らないように注意しながら、ＮＢＲＣ６６４８をかきとった。さらに１０ｍＬの滅菌した０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を添加し、かきとったＮＢＲＣ６６４８を懸濁し懸濁液を調製した。平板２枚分の懸濁液を全量下記に示す方法で用意したジャーファメンターに接種し、培養温度２４℃、攪拌スピード３００ｒｐｍ、通気量１０Ｌ／ｍｉｎで培養を３日間行い、ＮＢＲＣ６６４８培養液を得た。
【００３９】
＜ジャーファメンターの用意＞
約５Ｌの精製水にグルコース２４０ｇ、大豆ペプチド（不二製油株式会社製）６０ｇ、酵母エキス（日本製薬株式会社製）３０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １２ｇを溶解し、さらに、消泡剤０．６ｍＬ（消泡シリコーンＴＳＡ７３７ ＧＥ東芝シリコーン社製）を添加し、１ＮＮａＯＨまたは１ＮＨＣｌでｐＨを４．８に調製後、精製水で６Ｌにメスアップし培地を調製した。調製した６Ｌの培地を株式会社ＭＢＳ社製１０Ｌジャーファメンターに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブを行い滅菌した。
【実施例４】
【００４０】
７５０ｍＬの滅菌水に３０ｗ／ｖ％の中国製ローヤルゼリー２５０ｍＬを加え攪拌を行いながら、１０ＮＮａＯＨを用いてｐＨを５．５に調整し、滅菌した５００ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコに２５０ｍＬ分注した。下記に示す方法により調製したＮＢＲＣ６６４８ ７．５ｇを投入し、滅菌したシリコセン（登録商標）で蓋をし、発酵を行った。発酵は温度３０℃、攪拌スピード１４０ｒｐｍ、で５日間行い、適宜、無菌的にサンプリングを行った。ついで、サンプリングした発酵液約５ｍＬをガラス製試験管にとり、沸騰水中に１０分放置し、殺菌を行い、実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法に従ってＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果を図１に示す。なお、ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルは下記に示す方法で調製した。
図１に示すようにＡＣＥ阻害活性がローヤルゼリーとＮＢＲＣ６６４８を混合することにより上昇した。また、２日間でＡＣＥ阻害活性は約３０％になり、その後、徐々に上昇した。
【００４１】
＜ＮＢＲＣ６６４８の調製方法＞
実施例３で得られたＮＢＲＣ６６４８培養液を、滅菌した１７Ｇ１ガラスろ過器にとり吸引ろ過を行い、培養液を除去した。ろ過されずに残ったＮＢＲＣ６６４８の約５倍量（重量比）の滅菌した０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加え、吸引ろ過を行い、菌体を洗浄した。さらに、吸引を行い余分な０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を取除き、ＮＢＲＣ６６４８の調製を行った。なお、ＮＢＲＣ６６４８の調製は無菌的に行った。
【００４２】
＜ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルの調製方法＞
殺菌を行った発酵液を、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法で調製したホウ酸緩衝液で１．５倍希釈してＡＣＥ阻害活性測定用サンプルとした。
【実施例５】
【００４３】
２日目にＮＢＲＣ６６４８を７．５ｇ再度投入した以外は、実施例４と同様に操作を行った。その結果を図２に示す。
図２に示すようにＡＣＥ阻害活性はローヤルゼリーをＮＢＲＣ６６４８で発酵することにより上昇した。また、３日間でＡＣＥ阻害活性は約４５％になりその後、ＡＣＥ阻害活性が徐々に上昇した。さらに、実施例４のＮＢＲＣ６６４８を１回投入するよりも、２日目にＮＢＲＣ６６４８を再度投入した方が、ＡＣＥ阻害活性が高かった。
【実施例６】
【００４４】
４．５Ｌの滅菌水に３０ｗ／ｖ％の中国製ローヤルゼリー１．５Ｌを加え攪拌を行いながら、１０ＮＮａＯＨを用いてｐＨを５．５に調整し、滅菌した１０Ｌジャーファメンター（株式会社ＭＢＳ社製）に分注した。下記に示す方法により調製したＮＢＲＣ６６４８ １８０ｇを投入し発酵を行った。温度３０℃、攪拌スピード２００ｒｐｍ、通気量５Ｌ／ｍｉｎで発酵を行い、発酵開始後、２日目に再度下記に示す方法により調製したＮＢＲＣ６６４８ １８０ｇを投入した。適宜、無菌的にサンプリングを行った。ついで、サンプリングした発酵液約５ｍＬをガラス製試験管にとり、沸騰水中に１０分放置し、殺菌を行い、実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法に従ってＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果を図３に示す。なお、ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルは下記に示す方法で調製した。
図３に示すようにＡＣＥ阻害活性はローヤルゼリーをＮＢＲＣ６６４８で発酵することにより上昇した。
ＮＢＲＣ６６４８の調製方法
【００４５】
実施例３で得られたＮＢＲＣ６６４８培養液を、滅菌した１７Ｇ１ガラスろ過器にとり吸引ろ過を行い、培養液を除去した。ろ過されずに残ったＮＢＲＣ６６４８の約５倍量（重量比）の滅菌した０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加え、吸引ろ過を行い、菌体を洗浄した。さらに、吸引を行い余分な０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を取除き、ＮＢＲＣ６６４８の調製を行った。なお、ＮＢＲＣ６６４８の調製は無菌的に行った。
ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルの調製方法
殺菌を行った発酵液を、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法で調製したホウ酸緩衝液で６倍希釈してＡＣＥ阻害活性測定用サンプルとした。
【実施例７】
【００４６】
１．２５Ｌの滅菌水に３０ｗ／ｖ％の中国製ローヤルゼリー１．２５Ｌを加え攪拌を行いながら、１０ＮＮａＯＨを用いてｐＨを５．５に調整し、滅菌した１０Ｌジャーファメンター（株式会社ＭＢＳ社製）に分注した。実施例３で得られたＮＢＲＣ６６４８の培養液２Ｌを投入し、温度３０℃、攪拌スピード２００ｒｐｍ、通気量５Ｌ／ｍｉｎで放置し、２日目に再度ＮＢＲＣ６６４８の培養液２Ｌを投入した。適宜無菌的にサンプリングを行った。ついで、サンプリングした発酵液約５ｍＬをガラス製試験管にとり、沸騰水中に１０分放置し、殺菌を行い、実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法に従ってＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果を図４に示す。なお、ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルは下記に示す方法で調製した。
図４に示すようにＡＣＥ阻害活性はローヤルゼリーをＮＢＲＣ６６４８で発酵することにより上昇した。また、実施例６の菌体を洗浄した場合よりＡＣＥ阻害活性が高かった。これは、菌体の他に培養液を投入することにより、培養液に残存している栄養素が好適に働いたためだと考えられる。
【００４７】
＜ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルの調製方法＞
殺菌を行った発酵液を、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法で調製したホウ酸緩衝液で希釈した。希釈倍率は培養液の再投入前は６．６倍に希釈し、培養液再投入後は４．６倍希釈に希釈してＡＣＥ阻害活性測定用サンプルとした。
【実施例８】
【００４８】
１．２５Ｌの滅菌水に３０ｗ／ｖ％の中国製ローヤルゼリー１．２５Ｌを加え攪拌を行いながら、１０ＮＮａＯＨを用いてｐＨを５．５に調整し、滅菌した１０Ｌジャーファメンター（株式会社ＭＢＳ社製）に分注した。実施例３で得られたＮＢＲＣ６６４８の培養液２Ｌを投入し、温度３０℃、攪拌スピード２００ｒｐｍ、通気量５Ｌ／ｍｉｎで放置し、２日目に再度ＮＢＲＣ６６４８の培養液２Ｌを投入した。４日後に終了し、発酵液を２つの５Ｌのステンレス製ビーカーに等量ずつ分注した。それぞれを沸騰水中に４０分間放置し、殺菌を行い、３Ｍ社製「ペトリフィルムカビ・酵母用」を使用手順に従って操作を行い、無菌試験を行った。その結果、ＮＢＲＣ６６４８は検出されなかった。なお、「ペトリフィルムカビ・酵母用」の培養は２４℃で２日間行った。
【実施例９】
【００４９】
実施例８の殺菌した発酵液を凍結乾燥したところ、約６５０ｇと凍結乾燥品が得られた。
【実施例１０】
【００５０】
アスペルギルス メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ）
ＮＢＲＣ４３３９（以下ＮＢＲＣ４３３９と略することがある）によるＡＣＥ阻害物質の生産
ＮＢＲＣ４３３９が生育したポテトデキストロース平板培地１枚（直径９ｃｍの丸型シャーレ）に滅菌した０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５ｍＬ添加し、滅菌したスパーテルで培地を削らないように注意しながら、ＮＢＲＣ４３３９をかきとった。さらに１０ｍＬの滅菌した０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を添加し、かきとったＮＢＲＣ４３３９を懸濁し懸濁液を調製した。懸濁液０．２５ｍＬを下記に示す前培用培地に植菌し、２４℃で３日間前培養を行い、前培養液を得た。
【００５１】
次に３０ｍＬの滅菌水に３０ｗ／ｖ％の中国製ローヤルゼリー３０ｍＬを加え攪拌を行いながら、１０ＮＮａＯＨを用いてｐＨを５．５に調整し、滅菌した３００ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコに全量分注し、滅菌したシリコセン（登録商標）で蓋をした。次いで前記前培養液５０ｍＬを接種し、温度２４℃、攪拌スピード３００ｒｐｍで発酵を行った。その結果を図５に示す。図５に示すようにＮＢＲＣ４３３９でローヤルゼリーを発酵させることにより、ＡＣＥ阻害物質が生産された。なお、ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルはサンプリングを行った発酵液を、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法で調製したホウ酸緩衝液で６．５倍希釈してＡＣＥ阻害活性測定用サンプルとした。
【００５２】
＜前培用培地＞
４ｗ／ｖ％グルコース、１ｗ／ｖ％大豆ペプチド（不二製油株式会社製）、０．５ｗ／ｖ％酵母エキス（日本製薬株式会社製）、０．５ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、０．２ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ４．８の前培養培地５０mLを２００ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブを行い滅菌した。
【実施例１１】
【００５３】
モナスカス パープレウス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）ＮＢＲＣ４４７８（以下ＮＢＲＣ４４７８と略することがある）によるＡＣＥ阻害物質の生産
ＮＢＲＣ４４７８が生育したポテトデキストロース平板培地１枚（直径９ｃｍの丸型シャーレ）に滅菌した０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５ｍＬ添加し、滅菌したスパーテルで培地を削らないように注意しながら、ＮＢＲＣ４４７８をかきとった。さらに１０ｍＬの滅菌した０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を添加し、かきとったＮＢＲＣ４４７８を懸濁し懸濁液を調製した。懸濁液１０ｍＬを下記に示す前培用培地に植菌し、培養温度３０℃、攪拌スピード１５０ｒｐｍ、通気量４Ｌ／ｍｉｎの培養条件で３日間前培養を行い、前培養液を得た。
【００５４】
次に３０ｍＬの滅菌水に３０ｗ／ｖ％の中国製ローヤルゼリー３０ｍＬを加え攪拌を行いながら、１０ＮＮａＯＨを用いてｐＨを５．５に調整し、滅菌した３００ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコに全量分注し、滅菌したシリコセン（登録商標）で蓋をした。次いで前記前培養液５０ｍＬを接種し、温度３０℃、攪拌スピード１４０ｒｐｍで発酵を行った。その結果を図６に示す。図６に示すようにＮＢＲＣ４４７８でローヤルゼリーを発酵させることにより、ＡＣＥ阻害物質が生産された。なお、ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルはサンプリングを行った発酵液を、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法で調製したホウ酸緩衝液で８．８倍希釈してＡＣＥ阻害活性測定用サンプルとした。
【００５５】
＜前培用培地＞
４ｗ／ｖ％グルコース、１ｗ／ｖ％大豆ペプチド（不二製油株式会社製）、０．５ｗ／ｖ％酵母エキス（日本製薬株式会社製）、０．５ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、０．２ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｖ／ｖ％消泡剤０．６ｍＬ（消泡シリコーンＴＳＡ７３７ ＧＥ東芝シリコーン社製）、ｐＨ４．８の前培養培２Lを５Ｌ容量のジャーファメンターに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブを行い滅菌した。
【実施例１２】
【００５６】
リゾプス ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）ＮＢＲＣ４７５９（以下ＮＢＲＣ４７５９と略することがある）によるＡＣＥ阻害物質の生産
ＮＢＲＣ４７５９が生育したポテトデキストロース平板培地１枚（直径９ｃｍの丸型シャーレ）に滅菌水を５ｍＬ添加し、滅菌したスパーテルで培地を削らないように注意しなが、ＮＢＲＣ４７５９をかきとった。さらに１０ｍＬの滅菌水を添加し、かきとったＮＢＲＣ４７５９を懸濁し懸濁液を調製した。懸濁液０．３ｍＬを下記に示す前培用培地に植菌し、培養温度３０℃、攪拌スピード１４０ｒｐｍの培養条件で６日間前培養を行い、前培養液を得た。
【００５７】
次に３０ｍＬの滅菌水に３０ｗ／ｖ％の中国製ローヤルゼリー３０ｍＬを加え攪拌を行いながら、６ＮＨＣｌを用いてｐＨを３．０に調整し、滅菌した３００ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコに全量分注し、滅菌したシリコセン（登録商標）で蓋をした。次いで前記前培養液３０ｍＬを接種し、温度３７℃、攪拌スピード１４０ｒｐｍで発酵を行った。その結果を図７に示す。図７に示すようにＮＢＲＣ４７５９でローヤルゼリーを発酵させることにより、ＡＣＥ阻害物質が生産された。なお、ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルはサンプリングを行った発酵液を沸騰水中で３０分間放置後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法で調製したホウ酸緩衝液で１５倍希釈してＡＣＥ阻害活性測定用サンプルとした。
【００５８】
＜前培用培地＞
４ｗ／ｖ％グルコース、１ｗ／ｖ％大豆ペプチド（不二製油株式会社製）、０．５ｗ／ｖ％酵母エキス（日本製薬株式会社製）、０．２ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、０．２ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ３．０の前培養培１００ｍLを３００ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分間オートクレーブを行い滅菌した。
【実施例１３】
【００５９】
プロテアーゼ活性測定方法
（１）基質溶液の調製
７５ｍＬの１００ｍＭ乳酸緩衝液（ｐＨ３．０）に０．６ｇのカゼイン（ハマルステイン処方）を懸濁させ、沸騰水中で加熱溶解した。放冷後、ｐＨを３．０に調整し、１００ｍＬにメスアップして、基質溶液とした。
【００６０】
（２）プロテアーゼ活性の測定
２ｍＬの基質溶液を３７℃で５分間放置した後、サンプル液を０．４ｍＬ添加し、３７℃で１時間反応後、０．４４Ｍトリクロロ酢酸溶液を２ｍＬ添加し、反応を停止させた。反応停止後１０分間室温に放置して、Ｎｏ２のろ紙（アドバンテック東洋）でろ過を行った。ろ液０．５ｍＬに０．５５ＭＮａ２ＣＯ３溶液１．２５ｍＬ及び精製水で３倍希釈したフェノール試薬０．２５ｍＬを添加し、３７℃で３０分間放置後６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をＡとする。
【００６１】
（３）ブランクの測定
０．４４Ｍトリクロロ酢酸溶液を２ｍＬ添加後にサンプル液０．４ｍＬを加えた以外は上記（２）プロテアーゼ活性の測定と同様に行った。このときの６６０ｎｍにおける吸光度をＢとする。
【００６２】
（４）計算
下式によりΔＡ６６０を求めた。
ΔＡ６６０＝Ａ−Ｂ
【実施例１４】
【００６３】
実施例１２で得られた前培養液を１００ｍＭ乳酸緩衝液（ｐＨ３．０）で４０倍に希釈して実施例１３に示すプロテアーゼ活性測定を行ったところ、ΔＡ６６０が０．５０であった。リゾプス ニベウス由来のプロテアーゼであるニューラーゼ（天野エンザイム社製）を精製水で溶解し、実施例１２で得られた前培養液と同じΔＡ６６０になるように濃度調整をおこなった。濃度調整を行ったニューラーゼ溶液を実施例１２の前培養液の代わりにローヤルゼリー溶液に添加し、発酵（実施例１２）と酵素処理（ニュラーゼ）の違いによるＡＣＥ阻害物質の生産性の比較を行った。その結果を図８に示す。
図８に示すように発酵の方がＡＣＥ阻害物質の生産性が高かった。
【実施例１５】
【００６４】
４０ｍＬの滅菌水に３０ｗ／ｖ％の中国製ローヤルゼリー４０ｍＬを加え攪拌を行いながら、１０ＮＮａＯＨを用いてｐＨを７．０に調整し、前培養液２０ｍＬを接種した以外は実施例１０と同様に操作を行いローヤルゼリーを発酵させた。発酵開始後、２日目の発酵液を沸騰水中で３０分間加熱して殺菌後凍結乾燥を行い、ローヤルゼリー組成物を得た。高血圧自然発症マウス（ＳＨＲ）を２週間予備飼育後、１３週齢のＳＨＲマウスに（一群６匹、雄）にローヤルゼリー組成物を２．５ｍｇ／ｍＬになるように精製水で溶解し、体重１ｋｇ当り１０ｍＬ投与した（２５ｍｇ／Ｋｇ）。その結果、投与後６時間後ローヤルゼリー組成物投与群の血圧の平均は１６４ｍｍＨｇであり、対象群の血圧の平均は１９６ｍｍＨｇであり、ローヤルゼリー組成物を投与することにより有意（ｐ＜０．０５）に血圧降下作用を示した。なお、対象群は精製水を１０ｍＬ投与した。
ｄｄＹマウスを用いてマウス局所アナフラキシー法によるアレルゲン検定試験を行った。つまり、ローヤルゼリー組成物の蛋白質濃度を５ｍｇ/ｍＬになるように調製し、フロイント不完全アジュバントを１：１の割合で混合してエマルジョンを作成した。各エマルジョンをマウス１匹あたり０．２ｍＬ腹腔内投与して感作し、１４日間飼育を行った（一群１２匹、雄）。マウスをエーテル麻酔後、腹部を約３×４ｃｍの広さに刈毛し、０．５％エバンスブルーを０．２ｍＬ静脈内投与した。感作に使用したローヤル組成物の蛋白質濃度を２ｍｇ/ｍＬになるように調製し、エバンスブルー投与後２分以後に、マウス１匹あたり５０μＬ腹壁皮内投与して惹起した。１０分後、腹部皮膚を剥離し、惹起によって生じた青色斑の長径と短径を測定して、平均直径を求めた。発酵前のローヤルゼリーも同様に行った。その結果、発酵前のローヤルゼリーと比較して発酵後のローヤルゼリー組成物のアレルゲンが低下した。
【実施例１６】
【００６５】
実施例１２で得られた発酵液を沸騰水中で３０分間加熱して殺菌後凍結乾燥を行い、ローヤルゼリー組成物を得た。高血圧自然発症マウス（ＳＨＲ）を２週間予備飼育後、６週齢のＳＨＲマウスに（一群９匹、雄）にローヤルゼリー組成物を０．９３ｍｇ／ｍＬになるように精製水で溶解し、体重１ｋｇ当り１０ｍＬ投与した（９．３ｍｇ／Ｋｇ）。その結果、投与後４週間後ローヤルゼリー組成物投与群の血圧の平均は１７２ｍｍＨｇであり、対象群の血圧の平均は１９０ｍｍＨｇであり、ローヤルゼリー組成物を投与することにより有意（ｐ＜０．０５）に血圧降下作用を示した。なお、対象群は精製水を１０ｍＬ投与した。
ＳＤラットを１週間予備飼育後、６週目のＳＤラット（一群雄、雌各６匹）を使用して、単回投与毒性試験を行った。ＳＤラットに体重１ｋｇあたり２ｇの割合で経口投与し、１４日間観察した。その結果、全例とも死亡動物はなく、また副作用も認められず、１４日目の剖検においても、組織、臓器の異常はなんら観察されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によって得られる血圧降下作用を有するローヤルゼリーは、ローヤルゼリー組成物または血圧降下剤として飲食物などに好適に使用することができ、特に健康食品などに好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ＮＢＲＣ６６４８を用いた発酵日数とＡＣＥ活性の推移を示す図である。
【図２】ＮＢＲＣ６６４８を用いた別の例における発酵日数とＡＣＥ活性の推移を示す図である。
【図３】ＮＢＲＣ６６４８を用いた更に別の例における発酵日数とＡＣＥ活性の推移を示す図である。
【図４】ＮＢＲＣ６６４８を用いた更に別の例における発酵日数とＡＣＥ活性の推移を示す図である。
【図５】ＮＢＲＣ４３３９を用いたときの発酵日数とＡＣＥ活性の推移を示す図である。
【図６】ＮＢＲＣ４４７８を用いたときの発酵日数とＡＣＥ活性の推移を示す図である。
【図７】ＮＢＲＣ４７５９を用いたときの発酵日数とＡＣＥ活性の推移を示す図である。
【図８】発酵（実施例１２）と酵素処理（ニュラーゼ）の違いによるＡＣＥ阻害物質の生産性の比較を行った図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血圧降下作用を有するローヤルゼリーの製造方法、ならびに、該方法によって得られるローヤルゼリーを含有するローヤルゼリー組成物および血圧降下剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ローヤルゼリーとは、若い働き蜂の咽頭腺により分泌される乳白色したペースト状物質であり、その成分は必須アミノ酸をはじめとするアミノ酸が豊富に含まれ良質なタンパク質を構成している。さらに、ビタミン類、ミネラル類、炭水化物などの微量成分を含んでいる。例えばビタミン類ではビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、成長促進や老化防止に効果のあるパントテン酸、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥなどが挙げられる。ミネラル類ではカリウム、マグネシウム、カルシウム、銅、鉄、リンなどがあげられる。炭水化物ではブドウ糖、果糖などが挙げられる。さらに、アセチルコリン様物質、有機酸（１０−ヒドロキシデセン酸など）、脂肪、タンパク質性の抗菌物質であるロイアリシンなどが含まれている。
【０００３】
このようにローヤルゼリーには様々な栄養成分を含んでおり、例えば、抗菌作用、免疫増強作用、抗炎症作用、老化防止作用、更年期障害の予防・治療、抗がん作用など数多くの効果が知られている。
【０００４】
一方、生活習慣病の中でも高血圧患者数は我が国では３０歳以上で２０００万人と推定され、高血圧は現在の国民病ともいわれる側面をもっている。高血圧は各種慢性疾患に対するリスクファクターとなり、脳血管障害、心筋梗塞などの血管障害を誘発することが知られている。今後ますます高齢化が進むにつれ、高血圧症者も増大することが予想され、高血圧の改善あるいは発症の予防が課題となっている（非特許文献１）。
【０００５】
アンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥと略することがある）はアンジオテンシンＩを血圧上昇物質であるアンジオテンシンＩＩに変換し、血圧降下作用をもつブラジキニンを分解するため血圧を上昇させる働きがある。したがってＡＣＥを阻害する物質（ＡＣＥ阻害物質）があれば血圧を下げることができ、高血圧症予防又は治療に効果があることが期待される。
ＡＣＥ活性を抑制させることにより血圧を降下させるＡＣＥ阻害物質として、例えば、カプトプリルが開発され医薬品として利用されている。
【０００６】
一方、食品分野においては、乳カゼイン（非特許文献２）、わかめタンパク質（非特許文献３）、かつお節（非特許文献４、非特許文献５）、イワシ（非特許文献６）などの酵素分解物、発酵乳（非特許文献７）、ブナハリタケエキス（非特許文献８）などＡＣＥ阻害阻害物質を含む食品が数多く市販されている。
【０００７】
近年では動物の消化酵素であるトリプシンや枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）どの微生物由来のプロテアーゼを用いてローヤルゼリーを加水分解することによりＡＣＥ阻害物質を得る試みがなされている（特許文献１、非特許文献９）。さらに、枯草菌由来のプロテアーゼを用いてローヤルゼリーを加水分解した際の血圧降下の関与成分としてはイソロイシン−チロシン、バリン−チロシンおよびイソロイシン−バリン−チロシンなどのペプチドが知られている（非特許文献１０）。しかし、ローヤルゼリーの消化に用いるトリプシンは動物由来の消化酵素であり、トリプシンで加水分解したローヤルゼリーは動物由来の感染性物質の混入を完全に否定することは困難であるという問題があり、より安全なローヤルゼリー由来のＡＣＥ阻害物質が望まれている。また、プロテアーゼにより生産されるものはローヤルゼリーが加水分解されたペプチドであり、それ以外の有用産物の生産は見込めず、食品の高付加価値化は期待できない。
【０００８】
ローヤルゼリーは上記のように様々な効果があり、長年食されてきたが最近になって、ローヤルゼリーにアレルゲンが含まれていることが徐々に明らかになってきた。アレルゲンを低下させるために蛋白質分解酵素処理及び／又は糖分解酵素処理を行う方法が知られている(特許文献２、特許文献３)。しかし、アレルギーの低下とＡＣＥ阻害物質を産生する酵素が異なるため、一度の操作でＡＣＥ阻害物質と低アレルゲン化を行うには操作が煩雑であり、簡便な方法が望まれていた。
【非特許文献１】藤田裕之他、薬理と治療 Ｖｏｌ．２５ Ｎｏ．８ １４７（２１５５）−１５１（２１５９）
【非特許文献２】Ｓ．ｍａｒｕｙａｍａ，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，１５８１（１９８７）．
【非特許文献３】Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０，８２−９０，２００４
【非特許文献４】Ｙｏｋｏｙａｍａ Ｋ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６，１５４１（１９９２）
【非特許文献５】Ｈ． Ｆｕｊｉｔａ．ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．， ６５：５６４（２０００）
【非特許文献６】関英治 他、日本農芸化学会誌 第６９巻（８号）、１０１３−１０２０（１９９５）
【非特許文献７】Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｎ． ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ， ７７， ９１７−９２２ （１９９４）
【非特許文献８】坂元雄二 他、応用薬理 第６１巻（４／５）、２２１−２２９（２００１）
【非特許文献９】丸山広恵 他、日本食品科学工学会誌 第５０巻（７号）、３１０−３１５（２００３年）
【非特許文献１０】Ｔｏｋｕｎａｇａ Ｋ． ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２７（２），１８９−１９２（２００４）
【特許文献１】特開平４−２７９５９７号公報
【特許文献２】特開２００２−１１２７１５号公報、
【特許文献３】特開２００５−２８７４１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、血圧降下作用などの有用な特性を発揮するローヤルゼリーを得ることのできる新しい技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意検討を行った結果、ローヤルゼリーには抗菌物質である１０−ヒドロキシデセン酸やロイアリシンが含まれているにもかかわらず、ローヤルゼリーと微生物を混合し、発酵を行うことにより、前記課題が解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、
１．ローヤルゼリーを微生物で発酵させる工程を含むことを特徴とする、血圧降下作用を有するローヤルゼリーの製造方法。
２．微生物がアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）、モナスカス属（Ｍｏｎａｓｃｕｓ属）または、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属）の微生物であることを特徴とする、前記１に記載のローヤルゼリーの製造方法、
３．微生物がアスペルギルス ホエニシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）、アスペルギルス メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ）、モナスカス パープレウス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）または、リゾプス ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）であることを特徴とする、前記１に記載のローヤルゼリーの製造方法、
４．発酵工程の後に、微生物を殺菌する工程を含むことを特徴とする、前記１〜３のいずれかに記載のローヤルゼリーの製造方法、
５．加熱により微生物の殺菌を行うことを特徴とする、前記４に記載のローヤルゼリーの製造方法、
６．血圧降下作用を有するローヤルゼリーがアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有することを特徴とする、前記１〜５のいずれか１に記載のローヤルゼリーの製造方法、
７．前記１〜６のいずれかの方法によって得られる血圧降下作用を有するローヤルゼリーを含有することを特徴とする、ローヤルゼリー組成物、
８．前記１〜６のいずれかの方法によって得られる血圧降下作用を有するローヤルゼリーを有効成分として含有することを特徴とする、血圧降下剤、
からなる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によるとより安全で簡便な方法により血圧降下作用を有するローヤルゼリーを製造することができ、この血圧降下作用を有するローヤルゼリーを利用して、ローヤルゼリー組成物質や血圧降下剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の血圧降下作用を有するローヤルゼリーは、ローヤルゼリーを微生物で発酵させる工程により製造される。
【００１４】
ローヤルゼリーの原産国は例えば日本、中国、台湾、タイ、ブラジル、ヨーロッパ諸国、オセアニア諸国、アメリカなどを挙げることができ、いずれの原産国のローヤルゼリーを用いてもよい。また、複数の原産国のローヤルゼリーを適宜混合して用いてもよい。ローヤルゼリーは液体であることが必要であり、凍結乾燥状態のローヤルゼリーを用いる場合は精製水、水道水または適当な緩衝液などで溶解して用いることができる。また、凍結状態のローヤルゼリーは融解して用いることができる。
【００１５】
さらに、ローヤルゼリーは加熱、遠心分離、アルコール抽出、ろ過、フリーズドライまたは熱風乾燥などの加工並びに各種栄養素などが添加されたものであってもよい。
ローヤルゼリーと混合する微生物は特に制限がなく例えば細菌、酵母、カビなどを挙げられ、これらの中でもカビが好適に挙げられる。さらにアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）、モナスカス属（Ｍｏｎａｓｃｕｓ属）または、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属）に属するカビを好適に挙げることができる。アスペルギルス属のカビとして具体的にはアスペルギルス ホエニシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）、アスペルギルス オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ）、アスペルギルス ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス ソウヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス コニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス ウエンティ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｗｅｎｔｉｉ）、アスペルギルス スルフレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ）、アスペルギルス タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉｉ）などを挙げることができ、好ましくはアスペルギルス ホエニシス、アスペルギルス メレウスを挙げることができる。
またモナスカス属（Ｍｏｎａｓｃｕｓ属）のカビとして具体的にはモナスカス ピロウサス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ）、モナスカス パープレウス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）、モナスカス ルーバー（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｒｕｂｂｅｒ）、モナスカス ルニスポラス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｌｕｎｉｓｐｏｒａｓ）などを挙げることができ、好ましくはモナスカス パープレウス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）を挙げることができる。
さにらに、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属）のカビとして具体的にリゾプス ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）を挙げることができる。
【００１６】
これら微生物は単独で使用してもよく、２種以上の微生物を使用してもよい。また、微生物とローヤルゼリーを混合する場合、必要な菌体量を一度にローヤルゼリーと混合してもよいし、必要な菌体量を２回以上に分けて混合してもよい。また、２種以上の微生物を使用する場合、ぞれぞれの微生物を同時にローヤルゼリーと混合してもよく、別々に分けてローヤルゼリーと混合してもよい。
【００１７】
ローヤルゼリーと混合する微生物は、固体培地で培養した微生物、液体培地で培養した微生物などを用いることができる。固体培地を用いて培養した微生物の場合、例えば、固体培地を用いて培養した微生物を滅菌水、滅菌した生理的食塩水または滅菌した緩衝液に懸濁してローヤルゼリーと混合してもよい。また、固体培地を用いて培養した微生物を白金耳または白金鈎でかきとりローヤルゼリーと混合してもよい。
【００１８】
また、液体培養した微生物をローヤルゼリーと混合する場合、滅菌水、滅菌した生理的食塩水または滅菌した緩衝液などで菌体を洗浄し培養液を除去しても良い。さらに、菌体を洗浄した場合、ガラスフィルター等で菌体より余分な水分を除去した後、ローヤルゼリーと混合してもよいし、洗浄した菌体を再度、滅菌水、滅菌した生理的食塩水または滅菌した緩衝液に懸濁してローヤルゼリーと混合してもよい。
【００１９】
さらに、液体培養終了後、上記のような洗浄を行わず、菌体と培養液の混合液をローヤルゼリーと混合してもよい。
微生物の培養の条件は微生物が生育できる条件であれば特に制限はなく、適宜条件を選択できる。
例えば、培地のｐＨは微生物が増殖できるｐＨであれば特に限定されないが、カビであればｐＨ３〜８、好ましくはｐＨ４〜６のｐＨを挙げることができる。
また、培養温度は微生物が増殖できる温度であれば特に限定されないが、カビであれば５〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃の培養温度を挙げることができる。
【００２０】
さらに、培養方法は静置培養、振とう培養、攪拌培養、通気攪拌培養などの培養方法で培養することができる。
培地成分として例えば、炭素源としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、スクロース、フラクトース、マンニトール、ソルビトール、グリセリン、エチレングリコール、澱粉、糖蜜、コーン・ステープ・リカー、麦芽エキス、澱粉水解物などを単独または二種以上混合したものを例示できる。窒素源としては、アンモニユウム塩、硝酸塩などの無機性窒素源や、ペプトン、大豆粉、肉エキス、カゼイン、カザミノ酸、尿素などの有機性窒素源を単独または二種以上混合したものを例示できる。また、培地には必要に応じて、アミノ酸、各種ビタミン、酵母エキス、粉末酵母、脂肪酸などの有機微量栄養素、リン酸塩、鉄塩、マンガン塩、マグネシウム塩、その他の金属塩などの無機塩類をそれぞれ単独または二種以上併用して用いることができる。
【００２１】
微生物と混合した後のローヤルゼリーの固形分濃度は、０．１〜３０Ｗ／Ｖ％を挙げることがで、好ましくは１〜１５Ｗ／Ｖ％、より好ましくは４〜１０Ｗ／Ｖ％を挙げることができる。ここで、例えば１０Ｗ／Ｖ％は、１００mLのローヤルゼリー混合物を凍結乾燥などにより乾燥させたとき１０ｇの乾燥品が得られることを意味している。
【００２２】
微生物とローヤルゼリーを混合し発酵する時間は目的とする血圧降下物質が産生及び／又はアレルゲン性タンパク質が減少する時間であれば特に限定されないが、半日〜１０日間、好ましくは１日〜４日間が好ましい。
また、微生物とローヤルゼリーを混合する際のローヤルゼリーのｐＨは目的とする血圧降下物質が産生及び／又はアレルゲン性タンパク質が減少するｐＨであれば特に限定されないが、カビを用いた場合は、ｐＨ３〜８、好ましくはｐＨ４〜６が好ましい。
【００２３】
微生物とローヤルゼリーを混合し発酵させている間の温度は血圧降下物質が産生及び／又はアレルゲン性タンパク質が減少する温度であれば特に限定されないが、カビを用いた場合は５℃〜４０℃、好ましくは１５℃〜３５℃、より好ましくは２０℃〜３０℃が好ましい。
微生物とローヤルゼリーを混合し発酵させている間は、静置、振とう、攪拌、通気攪拌などを行ってもよい。
【００２４】
ローヤルゼリーに炭素源、窒素源、有機微量栄養素、無機塩類、脂質類などを単独または二種以上を添加してもよい。例えば炭素源としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、スクロース、フラクトース、マンニトール、ソルビトール、グリセリン、エチレングリコール、澱粉、糖蜜、コーン・ステープ・リカー、麦芽エキス、澱粉水解物などを単独または二種以上混合したものを例示できる。窒素源としては、アンモニユウム塩、硝酸塩などの無機性窒素源や、ペプトン、大豆粉、肉エキス、カゼイン、カザミノ酸、尿素などの有機性窒素源を単独または二種以上混合したものを例示できる。また、有機微量栄養素としては、アミノ酸、各種ビタミン、酵母エキス、粉末酵母、脂肪酸、または無機塩類としては、リン酸塩、鉄塩、マンガン塩、マグネシウム塩、その他の金属塩をそれぞれ単独または二種以上混合したもの例示できる。
【００２５】
なお、本明細書で用いる発酵の意味は微生物とローヤルゼリーと混合することにより、血圧降下作用を有するローヤルゼリーが産生されればよく、ローヤルゼリーと微生物の混合物中で微生物が増殖してもしなくてもよい。本発明によって得られる血圧降下性ローヤルゼリーは、重要な特徴の一つとしてＡＣＥ阻害作用を発揮する。このようなＡＣＥ阻害物質は、微生物により作られたプロテアーゼなどの酵素の他に種々の酵素の作用により、単に酵素処理する場合に比べてＡＣＥ阻害物質の生産性の向上や、種々の栄養成分の生産が見込まれる。さらに、微生物が菌体内にローヤルゼリーまたはその分解物を取込み菌体内で生産されたものであってもよい。
【００２６】
本発明に従う血圧降下作用を有するローヤルゼリーの製造においては、一般に、如上の発酵工程の後に微生物を殺菌する工程を含む。微生物とローヤルゼリーの発酵液の殺菌方法は、微生物が食品として問題がない程度に殺菌されればよい。殺菌方法としては、加熱により殺菌する方法、薬剤を用いて殺菌する方法、ろ過により微生物を除菌する方法、遠心分離を用いて微生物を除菌する方法が例示でき、これら方法を単独で用いてもよいし、二種類以上を組み合わせてもよい。好ましくは、加熱により微生物を殺菌する。加熱温度は６０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上で加熱することが好ましい。
【００２７】
本発明のローヤルゼリーを各種クロマトグラフィーを用いてＡＣＥ阻害物質を精製してもよい。精製方法としてはゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動などを挙げることができ、これら単独若しくは組み合わせることにより精製を行うことも可能である。
【００２８】
ゲルろ過クロマトグラフィーは、種々な分子量のタンパク質を分離できるゲルろ過クロマトグラフィー用の担体があり、分子量が約１万以下のタンパク質を分離できるゲルろ過クロマトグラフィー用の担体が好ましい。イオン交換クロマトグラフィーに用いられているイオン交換基としては、陰イオン交換体、陽イオン交換体などがあり、陰イオン交換体としては、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ基）、四級アミノエチル基（ＱＡＥ）などを例示することができる。また、陽イオン交換体としては、カルボキシメチル（ＣＭ）基、スルホプロピル（ＳＰ）基を例示することができる。疎水クロマトグラフィーに用いられる担体としてはブチル基（Ｂｕｔｙｌ基）、エチル基（Ｅｔｈｙｌ基）、フェニル基（Ｐｈｅｎｙｌ基）が結合した担体を例示することができる。逆相クロマトグラフィーに用いられる担体としとはオクタデシル基（Ｃ１８）、オクタデシル基とはアルキル基の長さが異なるＣ３０、Ｃ８、Ｃ４などが結合した担体が例示される。順相クロマトグラフィーに用いられる担体としてはシリカゲルのほか、シアノプロピル基、ジオール構造を有する官能基、アミノプロピル基、ポリアミンなどが結合した担体が例示される。
【００２９】
本発明の血圧降下作用を有するローヤルゼリーは、上記のクロマトグラフィー等を用いて精製を行なうことにより血圧降下剤として利用することができる。また、本発明の血圧降下性ローヤルゼリーまたはその精製品に各種成分を添加することによりローヤルゼリー組成物として供することができる。各種成分としては、例えば糖、脂質、乳化剤、増粘剤、調味料、香料、酸味調整剤、保存料、果汁、香料、各種栄養成分などが挙げられ、本発明の効果を損なわない範囲で使用することができる。また、各種成分は単独で用いても良いし二種以上を混合して用いてもよい。例えば糖としては、蔗糖、異性化糖、グルコース、フラクトース、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース等を例示することができる。乳化剤としては、蔗糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、レシチン等を例示することができる。増粘剤としてはカラギーナン、アラビアガム、キサンタンガム、グァーガム、ペクチン、ローカストビーンガム増粘剤澱粉、ジェランガム等を例示することができる。酸味調整剤としては、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、フマル酸、グルコン酸、酒石酸等を例示することができる。保存料としては、安息香酸及びその塩、ソルビン酸及びその塩、パラベン、亜硫酸ナトリウム、ペクチン分解物、グリシン等を例示することができる。果汁としては、トマト果汁、梅果汁、リンゴ果汁、レモン果汁、オレンジ果汁、ベリー系果汁等を例示することができる。香料としては、ハーブ、スパイスなどの香辛料、フルーツ系香料、バニラなどの香料等を例示することができる。この他、好ましい他の栄養成分として、ビタミンＤ等のビタミン類やカルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛等のミネラル類等が挙げられる。
【００３０】
本発明によって得られる血圧降下作用を有するローヤルゼリー、ローヤルゼリー組成物または血圧降下剤はそれらを添加・配合して調製した食品として供することもできる。そのような食品の具体的形態としては、例えば、飲料類、菓子、キャンディ、ガム、パン、畜肉製品、乳製品、レトルト食品、即席食品、冷凍食品、ゼリー状食品、養蜂産品、漬物、調味料等を挙げることができる。これらの食品は、いわゆる健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養機能食品、栄養補助食品、サプリメントなどとしても有用である。また、それらの食品としての形状としては、顆粒、粉末、タブレット、カプセル、チュアブル、ドリンク、ゼリー、ペースト、粒などを挙げることができる。
さらに、ローヤルゼリーを発酵させることにより、上記のようにＡＣＥ阻害物質の生産の他に、抗酸化物質、モナコリンＫ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、コリン（アセチルコリンの前駆体）などの生産が見込まれる。これらの効果としては、抗酸化物質は血流改善、モナコリンＫは血中コレステロールの低下、ＧＡＢＡは血圧降下、コリンは血圧降下および動脈硬化予防などが期待される。
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
ＡＣＥ阻害活性測定方法
＜ホウ酸緩衝液の調製＞
５０ｍＭ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７４５０ｍＬと２２０ｍＭ
Ｈ３ＢＯ４５５０ｍＬを混合し、ｐＨ８．３のホウ酸緩衝液を調製した。
＜基質溶液の調製＞
約３０ｍＬのホウ酸緩衝液にＢｚ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ・Ｈ２Ｏ（分子量４４７．４９ ペプチド研究所社製）１７０ｍｇ、ＮａＣｌ１．７８ｇを溶解後、１ＮＮａＯＨでｐＨ８．３に調整し、ホウ酸緩衝液で５０ｍＬにメスアップして、基質溶液とした。
＜ＡＣＥ溶液の調製＞
アンギオテンシン変換酵素（ウサギ肺由来 シグマ社製）をホウ酸緩衝液で溶解して６０ｍＵ／ｍＬの溶液をＡＣＥ溶液とした。
ＡＣＥ阻害活性の測定方法
【００３２】
（１）阻害活性の測定
サンプル３０μＬと基質溶液２５０μＬを混合し、３７℃で５分間放置した。５分間放置した後、ＡＣＥ溶液を１００μＬ添加し、３７℃で３０分間反応後、１ＮＨＣｌを２５０μＬ添加し、反応を停止させた。反応停止後１．５ｍＬの酢酸エチルを添加し、激しく１分間攪拌した。次に３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い上層の酢酸エチル層を０．５ｍＬ分取し、遠心エバポレーター（４０℃、１．５時間）で蒸発乾固させた。蒸発乾固させたものに２ｍＬの精製水を加え、溶解後、２２８ｎｍにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をＡとする。
【００３３】
（２）ブランクの測定
サンプル３０μＬ、基質溶液２５０μＬ及び１ＮＨＣｌ２５０μＬを混合し、３７℃で５分間放置した。５分間放置した後、ＡＣＥ溶液を１００μＬ添加し、３７℃で３０分間放置した。放置の後、１．５ｍＬの酢酸エチルを添加し、激しく１分間攪拌した。次に３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い上層の酢酸エチル層を０．５ｍＬ分取し、遠心エバポレーター（４０℃、１．５時間）で蒸発乾固させた。蒸発乾固させたものに２ｍＬの精製水を加え、溶解後、２２８ｎｍにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をＢとする。
【００３４】
（３）コントロールの測定
前記（１）活性の測定でサンプルの代わりにホウ酸緩衝液を用いて同様に操作を行い、２２８ｎｍにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をＣとする。さらに、前記（２）ブランクの測定の測定でサンプルの代わりにホウ酸緩衝液を用いて同様に操作を行い、２２８ｎｍにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をＤとする。
【００３５】
（４）計算
下式によりＡＣＥ阻害活性を求めた。
ＡＣＥ阻害活性（％）＝（Ａ−Ｂ）×１００／（Ｃ−Ｄ）
【実施例２】
【００３６】
微生物の準備
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門より、アスペルギルス ホエニシス ＮＢＲＣ６６４８（以下、ＮＢＲＣ６６４８と略することがある）のＬ−凍乾標品を購入した。Ｌ−凍乾標品のアンプルを開封し、下記に示す方法で調製した復元液０．２ｍＬを滅菌したバスツールピペット用いて加えた。約３０分放置後、攪拌してＮＢＲＣ６６４８を懸濁し、懸濁液を調製した。栄研器材株式会社製パールコア(登録商標)ポテトデキストロース寒天培地を用いて使用方法に従い平板培地（直径９ｃｍの丸型シャーレ）を調製し、前記懸濁液を滅菌したパスツールピペットで０．１ｍＬとり、前記平板培地に接種し、コーンラージ棒で平板培地全体に塗布した。２５℃で７日間培養を行し、ＮＢＲＣ６６４８が増殖した平板を調製した。
【００３７】
＜復元液の調製＞
精製水１００ｍＬにペプトン（日本製薬株式会社製）０．５ｇ、酵母エキス（日本製薬株式会社製）０．３ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．１ｇを溶解し、１ＮＮａＯＨまたは１ＮＨＣｌでｐＨを７．０に調製し、１２１℃で１５分間オートクレーブを行い滅菌した。
【実施例３】
【００３８】
ＮＢＲＣ６６４８の培養
実施例２のＮＢＲＣ６６４８が増殖した平板１枚に滅菌した０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５ｍＬ添加し、滅菌したスパーテルで培地を削らないように注意しながら、ＮＢＲＣ６６４８をかきとった。さらに１０ｍＬの滅菌した０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を添加し、かきとったＮＢＲＣ６６４８を懸濁し懸濁液を調製した。平板２枚分の懸濁液を全量下記に示す方法で用意したジャーファメンターに接種し、培養温度２４℃、攪拌スピード３００ｒｐｍ、通気量１０Ｌ／ｍｉｎで培養を３日間行い、ＮＢＲＣ６６４８培養液を得た。
【００３９】
＜ジャーファメンターの用意＞
約５Ｌの精製水にグルコース２４０ｇ、大豆ペプチド（不二製油株式会社製）６０ｇ、酵母エキス（日本製薬株式会社製）３０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １２ｇを溶解し、さらに、消泡剤０．６ｍＬ（消泡シリコーンＴＳＡ７３７ ＧＥ東芝シリコーン社製）を添加し、１ＮＮａＯＨまたは１ＮＨＣｌでｐＨを４．８に調製後、精製水で６Ｌにメスアップし培地を調製した。調製した６Ｌの培地を株式会社ＭＢＳ社製１０Ｌジャーファメンターに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブを行い滅菌した。
【実施例４】
【００４０】
７５０ｍＬの滅菌水に３０ｗ／ｖ％の中国製ローヤルゼリー２５０ｍＬを加え攪拌を行いながら、１０ＮＮａＯＨを用いてｐＨを５．５に調整し、滅菌した５００ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコに２５０ｍＬ分注した。下記に示す方法により調製したＮＢＲＣ６６４８ ７．５ｇを投入し、滅菌したシリコセン（登録商標）で蓋をし、発酵を行った。発酵は温度３０℃、攪拌スピード１４０ｒｐｍ、で５日間行い、適宜、無菌的にサンプリングを行った。ついで、サンプリングした発酵液約５ｍＬをガラス製試験管にとり、沸騰水中に１０分放置し、殺菌を行い、実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法に従ってＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果を図１に示す。なお、ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルは下記に示す方法で調製した。
図１に示すようにＡＣＥ阻害活性がローヤルゼリーとＮＢＲＣ６６４８を混合することにより上昇した。また、２日間でＡＣＥ阻害活性は約３０％になり、その後、徐々に上昇した。
【００４１】
＜ＮＢＲＣ６６４８の調製方法＞
実施例３で得られたＮＢＲＣ６６４８培養液を、滅菌した１７Ｇ１ガラスろ過器にとり吸引ろ過を行い、培養液を除去した。ろ過されずに残ったＮＢＲＣ６６４８の約５倍量（重量比）の滅菌した０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加え、吸引ろ過を行い、菌体を洗浄した。さらに、吸引を行い余分な０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を取除き、ＮＢＲＣ６６４８の調製を行った。なお、ＮＢＲＣ６６４８の調製は無菌的に行った。
【００４２】
＜ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルの調製方法＞
殺菌を行った発酵液を、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法で調製したホウ酸緩衝液で１．５倍希釈してＡＣＥ阻害活性測定用サンプルとした。
【実施例５】
【００４３】
２日目にＮＢＲＣ６６４８を７．５ｇ再度投入した以外は、実施例４と同様に操作を行った。その結果を図２に示す。
図２に示すようにＡＣＥ阻害活性はローヤルゼリーをＮＢＲＣ６６４８で発酵することにより上昇した。また、３日間でＡＣＥ阻害活性は約４５％になりその後、ＡＣＥ阻害活性が徐々に上昇した。さらに、実施例４のＮＢＲＣ６６４８を１回投入するよりも、２日目にＮＢＲＣ６６４８を再度投入した方が、ＡＣＥ阻害活性が高かった。
【実施例６】
【００４４】
４．５Ｌの滅菌水に３０ｗ／ｖ％の中国製ローヤルゼリー１．５Ｌを加え攪拌を行いながら、１０ＮＮａＯＨを用いてｐＨを５．５に調整し、滅菌した１０Ｌジャーファメンター（株式会社ＭＢＳ社製）に分注した。下記に示す方法により調製したＮＢＲＣ６６４８ １８０ｇを投入し発酵を行った。温度３０℃、攪拌スピード２００ｒｐｍ、通気量５Ｌ／ｍｉｎで発酵を行い、発酵開始後、２日目に再度下記に示す方法により調製したＮＢＲＣ６６４８ １８０ｇを投入した。適宜、無菌的にサンプリングを行った。ついで、サンプリングした発酵液約５ｍＬをガラス製試験管にとり、沸騰水中に１０分放置し、殺菌を行い、実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法に従ってＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果を図３に示す。なお、ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルは下記に示す方法で調製した。
図３に示すようにＡＣＥ阻害活性はローヤルゼリーをＮＢＲＣ６６４８で発酵することにより上昇した。
ＮＢＲＣ６６４８の調製方法
【００４５】
実施例３で得られたＮＢＲＣ６６４８培養液を、滅菌した１７Ｇ１ガラスろ過器にとり吸引ろ過を行い、培養液を除去した。ろ過されずに残ったＮＢＲＣ６６４８の約５倍量（重量比）の滅菌した０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加え、吸引ろ過を行い、菌体を洗浄した。さらに、吸引を行い余分な０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を取除き、ＮＢＲＣ６６４８の調製を行った。なお、ＮＢＲＣ６６４８の調製は無菌的に行った。
ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルの調製方法
殺菌を行った発酵液を、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法で調製したホウ酸緩衝液で６倍希釈してＡＣＥ阻害活性測定用サンプルとした。
【実施例７】
【００４６】
１．２５Ｌの滅菌水に３０ｗ／ｖ％の中国製ローヤルゼリー１．２５Ｌを加え攪拌を行いながら、１０ＮＮａＯＨを用いてｐＨを５．５に調整し、滅菌した１０Ｌジャーファメンター（株式会社ＭＢＳ社製）に分注した。実施例３で得られたＮＢＲＣ６６４８の培養液２Ｌを投入し、温度３０℃、攪拌スピード２００ｒｐｍ、通気量５Ｌ／ｍｉｎで放置し、２日目に再度ＮＢＲＣ６６４８の培養液２Ｌを投入した。適宜無菌的にサンプリングを行った。ついで、サンプリングした発酵液約５ｍＬをガラス製試験管にとり、沸騰水中に１０分放置し、殺菌を行い、実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法に従ってＡＣＥ阻害活性を測定した。その結果を図４に示す。なお、ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルは下記に示す方法で調製した。
図４に示すようにＡＣＥ阻害活性はローヤルゼリーをＮＢＲＣ６６４８で発酵することにより上昇した。また、実施例６の菌体を洗浄した場合よりＡＣＥ阻害活性が高かった。これは、菌体の他に培養液を投入することにより、培養液に残存している栄養素が好適に働いたためだと考えられる。
【００４７】
＜ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルの調製方法＞
殺菌を行った発酵液を、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法で調製したホウ酸緩衝液で希釈した。希釈倍率は培養液の再投入前は６．６倍に希釈し、培養液再投入後は４．６倍希釈に希釈してＡＣＥ阻害活性測定用サンプルとした。
【実施例８】
【００４８】
１．２５Ｌの滅菌水に３０ｗ／ｖ％の中国製ローヤルゼリー１．２５Ｌを加え攪拌を行いながら、１０ＮＮａＯＨを用いてｐＨを５．５に調整し、滅菌した１０Ｌジャーファメンター（株式会社ＭＢＳ社製）に分注した。実施例３で得られたＮＢＲＣ６６４８の培養液２Ｌを投入し、温度３０℃、攪拌スピード２００ｒｐｍ、通気量５Ｌ／ｍｉｎで放置し、２日目に再度ＮＢＲＣ６６４８の培養液２Ｌを投入した。４日後に終了し、発酵液を２つの５Ｌのステンレス製ビーカーに等量ずつ分注した。それぞれを沸騰水中に４０分間放置し、殺菌を行い、３Ｍ社製「ペトリフィルムカビ・酵母用」を使用手順に従って操作を行い、無菌試験を行った。その結果、ＮＢＲＣ６６４８は検出されなかった。なお、「ペトリフィルムカビ・酵母用」の培養は２４℃で２日間行った。
【実施例９】
【００４９】
実施例８の殺菌した発酵液を凍結乾燥したところ、約６５０ｇと凍結乾燥品が得られた。
【実施例１０】
【００５０】
アスペルギルス メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ）
ＮＢＲＣ４３３９（以下ＮＢＲＣ４３３９と略することがある）によるＡＣＥ阻害物質の生産
ＮＢＲＣ４３３９が生育したポテトデキストロース平板培地１枚（直径９ｃｍの丸型シャーレ）に滅菌した０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５ｍＬ添加し、滅菌したスパーテルで培地を削らないように注意しながら、ＮＢＲＣ４３３９をかきとった。さらに１０ｍＬの滅菌した０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を添加し、かきとったＮＢＲＣ４３３９を懸濁し懸濁液を調製した。懸濁液０．２５ｍＬを下記に示す前培用培地に植菌し、２４℃で３日間前培養を行い、前培養液を得た。
【００５１】
次に３０ｍＬの滅菌水に３０ｗ／ｖ％の中国製ローヤルゼリー３０ｍＬを加え攪拌を行いながら、１０ＮＮａＯＨを用いてｐＨを５．５に調整し、滅菌した３００ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコに全量分注し、滅菌したシリコセン（登録商標）で蓋をした。次いで前記前培養液５０ｍＬを接種し、温度２４℃、攪拌スピード３００ｒｐｍで発酵を行った。その結果を図５に示す。図５に示すようにＮＢＲＣ４３３９でローヤルゼリーを発酵させることにより、ＡＣＥ阻害物質が生産された。なお、ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルはサンプリングを行った発酵液を、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法で調製したホウ酸緩衝液で６．５倍希釈してＡＣＥ阻害活性測定用サンプルとした。
【００５２】
＜前培用培地＞
４ｗ／ｖ％グルコース、１ｗ／ｖ％大豆ペプチド（不二製油株式会社製）、０．５ｗ／ｖ％酵母エキス（日本製薬株式会社製）、０．５ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、０．２ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ４．８の前培養培地５０mLを２００ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブを行い滅菌した。
【実施例１１】
【００５３】
モナスカス パープレウス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）ＮＢＲＣ４４７８（以下ＮＢＲＣ４４７８と略することがある）によるＡＣＥ阻害物質の生産
ＮＢＲＣ４４７８が生育したポテトデキストロース平板培地１枚（直径９ｃｍの丸型シャーレ）に滅菌した０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５ｍＬ添加し、滅菌したスパーテルで培地を削らないように注意しながら、ＮＢＲＣ４４７８をかきとった。さらに１０ｍＬの滅菌した０．５％ＮａＣｌ含有１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を添加し、かきとったＮＢＲＣ４４７８を懸濁し懸濁液を調製した。懸濁液１０ｍＬを下記に示す前培用培地に植菌し、培養温度３０℃、攪拌スピード１５０ｒｐｍ、通気量４Ｌ／ｍｉｎの培養条件で３日間前培養を行い、前培養液を得た。
【００５４】
次に３０ｍＬの滅菌水に３０ｗ／ｖ％の中国製ローヤルゼリー３０ｍＬを加え攪拌を行いながら、１０ＮＮａＯＨを用いてｐＨを５．５に調整し、滅菌した３００ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコに全量分注し、滅菌したシリコセン（登録商標）で蓋をした。次いで前記前培養液５０ｍＬを接種し、温度３０℃、攪拌スピード１４０ｒｐｍで発酵を行った。その結果を図６に示す。図６に示すようにＮＢＲＣ４４７８でローヤルゼリーを発酵させることにより、ＡＣＥ阻害物質が生産された。なお、ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルはサンプリングを行った発酵液を、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法で調製したホウ酸緩衝液で８．８倍希釈してＡＣＥ阻害活性測定用サンプルとした。
【００５５】
＜前培用培地＞
４ｗ／ｖ％グルコース、１ｗ／ｖ％大豆ペプチド（不二製油株式会社製）、０．５ｗ／ｖ％酵母エキス（日本製薬株式会社製）、０．５ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、０．２ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｖ／ｖ％消泡剤０．６ｍＬ（消泡シリコーンＴＳＡ７３７ ＧＥ東芝シリコーン社製）、ｐＨ４．８の前培養培２Lを５Ｌ容量のジャーファメンターに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブを行い滅菌した。
【実施例１２】
【００５６】
リゾプス ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）ＮＢＲＣ４７５９（以下ＮＢＲＣ４７５９と略することがある）によるＡＣＥ阻害物質の生産
ＮＢＲＣ４７５９が生育したポテトデキストロース平板培地１枚（直径９ｃｍの丸型シャーレ）に滅菌水を５ｍＬ添加し、滅菌したスパーテルで培地を削らないように注意しなが、ＮＢＲＣ４７５９をかきとった。さらに１０ｍＬの滅菌水を添加し、かきとったＮＢＲＣ４７５９を懸濁し懸濁液を調製した。懸濁液０．３ｍＬを下記に示す前培用培地に植菌し、培養温度３０℃、攪拌スピード１４０ｒｐｍの培養条件で６日間前培養を行い、前培養液を得た。
【００５７】
次に３０ｍＬの滅菌水に３０ｗ／ｖ％の中国製ローヤルゼリー３０ｍＬを加え攪拌を行いながら、６ＮＨＣｌを用いてｐＨを３．０に調整し、滅菌した３００ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコに全量分注し、滅菌したシリコセン（登録商標）で蓋をした。次いで前記前培養液３０ｍＬを接種し、温度３７℃、攪拌スピード１４０ｒｐｍで発酵を行った。その結果を図７に示す。図７に示すようにＮＢＲＣ４７５９でローヤルゼリーを発酵させることにより、ＡＣＥ阻害物質が生産された。なお、ＡＣＥ阻害活性測定用サンプルはサンプリングを行った発酵液を沸騰水中で３０分間放置後、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を実施例１に示すＡＣＥ阻害活性測定方法で調製したホウ酸緩衝液で１５倍希釈してＡＣＥ阻害活性測定用サンプルとした。
【００５８】
＜前培用培地＞
４ｗ／ｖ％グルコース、１ｗ／ｖ％大豆ペプチド（不二製油株式会社製）、０．５ｗ／ｖ％酵母エキス（日本製薬株式会社製）、０．２ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、０．２ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ３．０の前培養培１００ｍLを３００ｍＬ容量のバッフル付三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分間オートクレーブを行い滅菌した。
【実施例１３】
【００５９】
プロテアーゼ活性測定方法
（１）基質溶液の調製
７５ｍＬの１００ｍＭ乳酸緩衝液（ｐＨ３．０）に０．６ｇのカゼイン（ハマルステイン処方）を懸濁させ、沸騰水中で加熱溶解した。放冷後、ｐＨを３．０に調整し、１００ｍＬにメスアップして、基質溶液とした。
【００６０】
（２）プロテアーゼ活性の測定
２ｍＬの基質溶液を３７℃で５分間放置した後、サンプル液を０．４ｍＬ添加し、３７℃で１時間反応後、０．４４Ｍトリクロロ酢酸溶液を２ｍＬ添加し、反応を停止させた。反応停止後１０分間室温に放置して、Ｎｏ２のろ紙（アドバンテック東洋）でろ過を行った。ろ液０．５ｍＬに０．５５ＭＮａ２ＣＯ３溶液１．２５ｍＬ及び精製水で３倍希釈したフェノール試薬０．２５ｍＬを添加し、３７℃で３０分間放置後６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。このときの吸光度をＡとする。
【００６１】
（３）ブランクの測定
０．４４Ｍトリクロロ酢酸溶液を２ｍＬ添加後にサンプル液０．４ｍＬを加えた以外は上記（２）プロテアーゼ活性の測定と同様に行った。このときの６６０ｎｍにおける吸光度をＢとする。
【００６２】
（４）計算
下式によりΔＡ６６０を求めた。
ΔＡ６６０＝Ａ−Ｂ
【実施例１４】
【００６３】
実施例１２で得られた前培養液を１００ｍＭ乳酸緩衝液（ｐＨ３．０）で４０倍に希釈して実施例１３に示すプロテアーゼ活性測定を行ったところ、ΔＡ６６０が０．５０であった。リゾプス ニベウス由来のプロテアーゼであるニューラーゼ（天野エンザイム社製）を精製水で溶解し、実施例１２で得られた前培養液と同じΔＡ６６０になるように濃度調整をおこなった。濃度調整を行ったニューラーゼ溶液を実施例１２の前培養液の代わりにローヤルゼリー溶液に添加し、発酵（実施例１２）と酵素処理（ニュラーゼ）の違いによるＡＣＥ阻害物質の生産性の比較を行った。その結果を図８に示す。
図８に示すように発酵の方がＡＣＥ阻害物質の生産性が高かった。
【実施例１５】
【００６４】
４０ｍＬの滅菌水に３０ｗ／ｖ％の中国製ローヤルゼリー４０ｍＬを加え攪拌を行いながら、１０ＮＮａＯＨを用いてｐＨを７．０に調整し、前培養液２０ｍＬを接種した以外は実施例１０と同様に操作を行いローヤルゼリーを発酵させた。発酵開始後、２日目の発酵液を沸騰水中で３０分間加熱して殺菌後凍結乾燥を行い、ローヤルゼリー組成物を得た。高血圧自然発症マウス（ＳＨＲ）を２週間予備飼育後、１３週齢のＳＨＲマウスに（一群６匹、雄）にローヤルゼリー組成物を２．５ｍｇ／ｍＬになるように精製水で溶解し、体重１ｋｇ当り１０ｍＬ投与した（２５ｍｇ／Ｋｇ）。その結果、投与後６時間後ローヤルゼリー組成物投与群の血圧の平均は１６４ｍｍＨｇであり、対象群の血圧の平均は１９６ｍｍＨｇであり、ローヤルゼリー組成物を投与することにより有意（ｐ＜０．０５）に血圧降下作用を示した。なお、対象群は精製水を１０ｍＬ投与した。
ｄｄＹマウスを用いてマウス局所アナフラキシー法によるアレルゲン検定試験を行った。つまり、ローヤルゼリー組成物の蛋白質濃度を５ｍｇ/ｍＬになるように調製し、フロイント不完全アジュバントを１：１の割合で混合してエマルジョンを作成した。各エマルジョンをマウス１匹あたり０．２ｍＬ腹腔内投与して感作し、１４日間飼育を行った（一群１２匹、雄）。マウスをエーテル麻酔後、腹部を約３×４ｃｍの広さに刈毛し、０．５％エバンスブルーを０．２ｍＬ静脈内投与した。感作に使用したローヤル組成物の蛋白質濃度を２ｍｇ/ｍＬになるように調製し、エバンスブルー投与後２分以後に、マウス１匹あたり５０μＬ腹壁皮内投与して惹起した。１０分後、腹部皮膚を剥離し、惹起によって生じた青色斑の長径と短径を測定して、平均直径を求めた。発酵前のローヤルゼリーも同様に行った。その結果、発酵前のローヤルゼリーと比較して発酵後のローヤルゼリー組成物のアレルゲンが低下した。
【実施例１６】
【００６５】
実施例１２で得られた発酵液を沸騰水中で３０分間加熱して殺菌後凍結乾燥を行い、ローヤルゼリー組成物を得た。高血圧自然発症マウス（ＳＨＲ）を２週間予備飼育後、６週齢のＳＨＲマウスに（一群９匹、雄）にローヤルゼリー組成物を０．９３ｍｇ／ｍＬになるように精製水で溶解し、体重１ｋｇ当り１０ｍＬ投与した（９．３ｍｇ／Ｋｇ）。その結果、投与後４週間後ローヤルゼリー組成物投与群の血圧の平均は１７２ｍｍＨｇであり、対象群の血圧の平均は１９０ｍｍＨｇであり、ローヤルゼリー組成物を投与することにより有意（ｐ＜０．０５）に血圧降下作用を示した。なお、対象群は精製水を１０ｍＬ投与した。
ＳＤラットを１週間予備飼育後、６週目のＳＤラット（一群雄、雌各６匹）を使用して、単回投与毒性試験を行った。ＳＤラットに体重１ｋｇあたり２ｇの割合で経口投与し、１４日間観察した。その結果、全例とも死亡動物はなく、また副作用も認められず、１４日目の剖検においても、組織、臓器の異常はなんら観察されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によって得られる血圧降下作用を有するローヤルゼリーは、ローヤルゼリー組成物または血圧降下剤として飲食物などに好適に使用することができ、特に健康食品などに好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ＮＢＲＣ６６４８を用いた発酵日数とＡＣＥ活性の推移を示す図である。
【図２】ＮＢＲＣ６６４８を用いた別の例における発酵日数とＡＣＥ活性の推移を示す図である。
【図３】ＮＢＲＣ６６４８を用いた更に別の例における発酵日数とＡＣＥ活性の推移を示す図である。
【図４】ＮＢＲＣ６６４８を用いた更に別の例における発酵日数とＡＣＥ活性の推移を示す図である。
【図５】ＮＢＲＣ４３３９を用いたときの発酵日数とＡＣＥ活性の推移を示す図である。
【図６】ＮＢＲＣ４４７８を用いたときの発酵日数とＡＣＥ活性の推移を示す図である。
【図７】ＮＢＲＣ４７５９を用いたときの発酵日数とＡＣＥ活性の推移を示す図である。
【図８】発酵（実施例１２）と酵素処理（ニュラーゼ）の違いによるＡＣＥ阻害物質の生産性の比較を行った図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ローヤルゼリーを微生物で発酵させる工程を含むことを特徴とする、血圧降下作用を有するローヤルゼリーの製造方法。
【請求項２】
微生物がアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）、モナスカス属（Ｍｏｎａｓｃｕｓ属）または、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属）の微生物であることを特徴とする、請求項１に記載のローヤルゼリーの製造方法。
【請求項３】
微生物がアスペルギルス ホエニシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）、アスペルギルス メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ）、モナスカス パープレウス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）または、リゾプス ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）であることを特徴とする、請求項１に記載のローヤルゼリーの製造方法。
【請求項４】
発酵工程の後に、微生物を殺菌する工程を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のローヤルゼリーの製造方法。
【請求項５】
加熱により微生物の殺菌を行うことを特徴とする請求項４に記載のローヤルゼリーの製造方法。
【請求項６】
血圧降下作用を有するローヤルゼリーがアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１に記載のローヤルゼリーの製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかの方法によって得られる血圧降下作用を有するローヤルゼリーを含有することを特徴とする、ローヤルゼリー組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかの方法によって得られる血圧降下作用を有するローヤルゼリーを有効成分として含有することを特徴とする、血圧降下剤。
【請求項１】
ローヤルゼリーを微生物で発酵させる工程を含むことを特徴とする、血圧降下作用を有するローヤルゼリーの製造方法。
【請求項２】
微生物がアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属）、モナスカス属（Ｍｏｎａｓｃｕｓ属）または、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属）の微生物であることを特徴とする、請求項１に記載のローヤルゼリーの製造方法。
【請求項３】
微生物がアスペルギルス ホエニシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）、アスペルギルス メレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｅｌｌｅｕｓ）、モナスカス パープレウス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）または、リゾプス ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）であることを特徴とする、請求項１に記載のローヤルゼリーの製造方法。
【請求項４】
発酵工程の後に、微生物を殺菌する工程を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のローヤルゼリーの製造方法。
【請求項５】
加熱により微生物の殺菌を行うことを特徴とする請求項４に記載のローヤルゼリーの製造方法。
【請求項６】
血圧降下作用を有するローヤルゼリーがアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１に記載のローヤルゼリーの製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかの方法によって得られる血圧降下作用を有するローヤルゼリーを含有することを特徴とする、ローヤルゼリー組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかの方法によって得られる血圧降下作用を有するローヤルゼリーを有効成分として含有することを特徴とする、血圧降下剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００８−４８７２９（Ｐ２００８−４８７２９Ａ）
【公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１９１６８９（Ｐ２００７−１９１６８９）
【出願日】平成１９年７月２４日（２００７．７．２４）
【出願人】（５９２２０７８０９）森川健康堂株式会社 (14)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月２４日（２００７．７．２４）
【出願人】（５９２２０７８０９）森川健康堂株式会社 (14)
【Ｆターム（参考）】
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