血小板凝集抑制組成物
【課題】
血栓症は血栓が生じた血管の部位によって多様な疾病を誘発するようになる。その中でも特に脳血管や心臓血管に生じた場合には脳卒中、脳出血、脳梗塞、心不全症、心筋梗塞、心臓麻痺等深刻な症状が発生し、半身不随を引き起こし、ひどい場合には死亡することもある。現在、血栓症を解決するために、血栓の生成を抑制する抗血栓剤及び血栓形成予防剤と、生成された血栓を溶解させる血栓溶解剤の研究開発が主に行われている。本発明は、幅広い飲食品に使用可能な血小板凝集抑制組成物及びそれを含有する飲食品、医薬部外品及び医薬品を提供することを目的とする。
【解決手段】 アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物を含有することにより上記課題を解決する。
血栓症は血栓が生じた血管の部位によって多様な疾病を誘発するようになる。その中でも特に脳血管や心臓血管に生じた場合には脳卒中、脳出血、脳梗塞、心不全症、心筋梗塞、心臓麻痺等深刻な症状が発生し、半身不随を引き起こし、ひどい場合には死亡することもある。現在、血栓症を解決するために、血栓の生成を抑制する抗血栓剤及び血栓形成予防剤と、生成された血栓を溶解させる血栓溶解剤の研究開発が主に行われている。本発明は、幅広い飲食品に使用可能な血小板凝集抑制組成物及びそれを含有する飲食品、医薬部外品及び医薬品を提供することを目的とする。
【解決手段】 アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物を含有することにより上記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物を含有する血小板凝集抑制組成物及びそれを含有する飲食品、医薬部外品及び医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
血栓は、プラークの破裂等さまざまな原因によって活性化された血小板の血管内膜への粘着と凝集による血小板血栓、次いでフィブリノーゲン等の種々の凝固系因子が関与するフィブリン血栓へと進行する。身体が正常なときには、この血栓のもととなるフィブリンを溶かす働きをする線溶酵素が血栓予防をして、線溶酵素が不足するとフィブリンを溶解できなくなり、血栓ができるようになる。
形成された血栓は血管に沈着し、血管の断面積を減少させ、血液の循環を阻害し、その結果、血液が細胞及び組職で栄養分と酸素を正常に供給することができず、また、細胞及び組織の老廃物を排出できなくなり、毒性が蓄積される等の問題点が発生するようになる。
血管の中で、血栓といわれる血液の固まりが引き起こす症状を広義の血栓症（以下、単に「血栓症」と記載した場合は、広義の血栓症をいう）と呼び、血栓が原因になって起こる病態は狭義の血栓症と塞栓症に分けられる。狭義の血栓症は血栓が形成個所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することによる症状で、塞栓症は血栓が形成個所から剥がれて血流によって移動し、他の個所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することによって起こる病態のことを指す。
このような血栓症は血栓が生じた血管の部位によって多様な疾病を誘発するようになる。その中でも特に脳血管や心臓血管に生じた場合には脳卒中、脳出血、脳梗塞、心不全症、心筋梗塞、心臓麻痺等深刻な症状が発生し、半身不随を引き起こし、ひどい場合には死亡することもある。
【０００３】
これら心疾患、脳血管疾患等を引き起こす重大な血栓は血流のうっ帯下で形成されるフィブリン血栓とは機序の点で異なり、動脈等の比較的速く豊富な血流の存在下で形成されていると考えられる。血流下では、凝固因子は活性化されても血流によって希釈されてしまうため血栓形成に至らない。しかし、損傷血管壁に粘着し、凝集して局所濃度を高める成分である血小板が血栓の形成により重要な役割を果たす。
血管内皮細胞が障害を受け剥離すると、血管内皮細胞下組織のコラーゲンが露出し、血管内皮細胞で合成されるｖｏｎ−ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷＦ：ＶＩＩ因子）により、コラーゲンとｖＷＦ受容体（ＧｐＩｂ）の間に架橋を形成（粘着）される。さらに、血小板が例えばトロンビンのようなアゴニストによって活性化され、フィブリノーゲン受容体（ＧｐＩＩｂ−ＩＩＩａ）によりフィブリノーゲンを介して他の血小板と結合し、血小板凝集を引き起し、血小板血栓が形成される。従って、ｖＷＦよるコラーゲンとＧｐＩｂの間の架橋形成またはフィブリノーゲンとその他の血清蛋白質が、ＧｐＩＩｂ−ＩＩＩａとの結合を抑制できるかどうかが血栓形成を予防する一つの重要な要件となる。
このｖＷＦよるコラーゲンとＧｐＩｂの間の架橋形成を促進するアゴニストとしては、リストセチンがある。
【０００４】
リストセチンは抗生物質であるが、その強力な副作用のために、医薬品市場から撤去されたが、リストセチンがインビトロでウサギの血小板を凝集させることが発見された。血液においては、ヒト血小板もリストセチンがインビトロでｖＷＦに惹起させてＧｐＩｂとの結合能力を獲得して血小板凝集するが、フォンビルブラント症候群に冒されている患者の場合には血小板凝集は起こらないことから、ｖＷＦの生理活性をインビトロで測定する方法として、リストセチン惹起血小板凝集反応や、リストセチン存在下でのｖＷＦのｖＷＦへの結合を測定する方法に広く利用されている。
【０００５】
現在、血栓症を解決するために、血栓の生成を抑制する抗血栓剤及び血栓形成予防剤と、生成された血栓を溶解させる血栓溶解剤の研究開発が主に行われている。
血小板凝集及び血栓形成予防剤として、アスピリン、チクロピジン、ヒルジン（トロンビン阻害剤）、トロンボキサンＡ２シンターゼ抑制剤、などが製品化されている。
【０００６】
トロンビンは、他の経路とはほとんど無関係に血小板の凝集を起こすが、血小板が他のメカニズムによってあらかじめ活性化されていないと、実質的に有効な量のトロンビンが存在することはない。ヒルジンは、非常に効果的な抗血栓剤である。しかしトロンビン阻害剤は、抗血小板剤と抗凝血剤の両方として機能するため、やはり過剰な出血を起こす可能性がある。
アスピリンなどは、心筋梗塞などの疾患予防のための抗血小板療法用薬剤として広く用いられているが、アスピリンはＡＤＰによって誘起される血小板の凝集に対しては効果がないため、血小板の凝集に対する効果は限られており、胃腸障害などの副作用などがあり、このため、食品や医薬品の分野においては、安全性が高く、安価で実用性の高い抗血小板凝集療法用薬剤が求められている。
食品成分としては、ナットウキナーゼや多価不飽和脂肪酸、グルコサミン、タマネギの薄皮（例えば、特許文献１参照。）等の素材が知られているが、風味や性状等に問題があり、幅広く食品に応用できなかった。
また、最近では、キウイフルーツ抽出物（例えば、特許文献２参照。）についての特許が公開されたが、中性域での活性が弱いという欠点がある。
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１７１９３４号公報（第２頁）
【特許文献２】特開２００３−１７１２９４号公報（第２頁−５頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、幅広い飲食品に使用可能な血小板凝集抑制組成物及びそれを含有する飲食品、医薬部外品及び医薬品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは様々な天然植物を利用して抗凝固成分を捜す目的で、多角的に研究検討した結果、アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物に優れた抗血小板凝集活性があることを見出し、本発明を完成させた。
【発明の効果】
【００１０】
本発明で得られたアムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物を含有する血小板凝集抑制組成物は、ｖＷＦよるコラーゲンとＧｐＩｂの間の架橋形成による血小板凝集をおこすアゴニストであるリストセチンを加えた時の血小板凝集率、いわゆるリストセチン惹起血小板凝集試験によって測定した結果から、ｖＷＦよるコラーゲンとＧｐＩｂの間の架橋形成を抑制することに抗血小板凝集効果が高いことがわかった。
本発明はアムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物を含有する血小板凝集抑制組成物を各種飲食品及び医薬品等に利用して、血小板凝集による血栓の生成を抑制することで脳卒中、脳出血、脳梗塞、心不全症、心筋梗塞、心臓麻痺等のような心血関係疾患を予防することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に用いるアムラーとは、学名：エンビリカ・オフィシナル（Ｅｍｂｌｉｃａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）又は、フィランサス・エンブリカ（Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ ｅｍｂｉｌｉｃａ）といい、トウダイグサ科コミカンソウ属に属する落葉の亜高木であり、インドからマレーシア地域及び中国南部にかけて分布しており、インドが原産地と考えられている。また、各地方又は言語により、各々固有の名称があり、余柑子、油甘、奄摩勒、エンブリック・ミロバラン、アーマラキー、マラッカノキ、マラッカツリー、インディアングーズベリー、アロンラ、アミラ、アミラキ、アミラキャトラ、ネリカイ、ネルリ、タシャ、カユラカ、ケムラカ、ナックホンポン等とも称されている。
【００１２】
本発明において、アムラーの部位としては、果実が好ましく用いられる。その形態は、特に限定するものではなく、未熟果実、完熟果実、乾燥果実、果汁、果汁粉末等のいずれでも良い。
果汁又は果汁粉末の場合は、そのままでも使用できるが、生果実又は乾燥果実等、水不溶性成分を含むものを使用する場合は、抽出により、水不溶性成分が除去されていることが効果を上げる点で好ましい。
抽出の際、生果実を使用する場合は、種子を除去した後、水を添加又は無添加で、抽出効率を高めるためにミキサー等により破砕、均質化したものを用いることが好ましい。
乾燥果実を使用する場合は、抽出効率を高めるために４０メッシュ以下の粒度になるように粉砕されていることが好ましい。
【００１３】
抽出方法は、抽出溶媒、抽出温度等、特に限定されるものではなく、抽出溶媒としては、水、塩基、酸、親水性溶媒、アセトンを使うことができる。親水性溶媒はメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコールの低級アルコール群より選ばれる１種類以上が操作性、抽出効率の点から好ましい。特に好ましくは、水、塩基、酸のいずれかである。
酸又は塩基を抽出溶媒に使用する場合、抽出物を中和させることが好ましい。中和反応によって生成された塩は、透析法やゲル濾過等、公知の方法により、取り除くことができる。水を抽出溶媒として用いた場合には、上記のような中和反応は必要なく、生成された塩を取り除く必要もないため、水を用いることが更に好ましい。
この時使用する酸としては、特に限定するものではなく、大部分の酸を使うことができるが、入手のしやすさの点及び操作性の点により塩酸、硫酸より選ばれる１種又は両者の併用が好ましい。
また、塩基としては、特に限定するものではなく、大部分の塩基を使うことができるが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムより選ばれる１種又は両者の併用が好ましい。
抽出に使用される酸又は塩基の濃度は、抽出物を酵素処理する前であっても後であっても特に限定するものではなく、酸又は塩基の強さによって変化するが、操作性及び抽出効率の点より、０．０１〜０．５モルの濃度を使用することが好ましい。
【００１４】
上記の抽出において、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、タンナーゼまたは、セルラーゼ等の酵素を１種類又は２種類以上を組み合わせて併用することも可能である。
更に、上記の抽出において、抽出残渣に対して再度抽出工程を１回又はそれ以上繰り返すことで、抽出効率が向上し、収率が向上するので、好ましい。この場合の抽出に用いる溶媒は、同じでも良いし、別の溶媒を用いても良い。
【００１５】
上記の抽出物は、そのままでも使用できるが、濾過、遠心分離及び分留により、不溶性物質及び溶媒を取り除くことにより、抗血小板凝集効果が高くなり、応用範囲も広がるので好ましい。
不溶性物質及び溶媒を取り除いた後、果汁又は抽出液をそのまま又は濃縮した後に有機溶媒を用いて分配を行い、それぞれの溶媒可溶画分を得る。これら溶媒可溶画分は、更に抗血小板凝集効果が高くなるので好ましい。有機溶媒としてはメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコールの低級アルコールや酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルエーテル、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、アセトン又はクロロホルムが使用できる。また可溶画分の純度を上げる為には、他の疎水性溶媒による分配を組み合わせることもできるが、エチルアルコール好ましい。これら溶媒の濃度としては、特に限定するものではないが、収率及び効果の点より、終濃度として２０〜８０％が好ましく、２０〜６０％が更に好ましい。
さらに純度を高める為に、フェノール系、スチレン系、アクリル酸系、エポキシアミン系、ピリジン系、メタクリル系などを母体とした疎水性樹脂を用いることも可能である。その場合、樹脂吸着後の溶離液としては、メチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコールなどの低級アルコール及びアセトンを単独又は水溶液として使用できる。
抽出物及び画分はそのままでの使用も可能だが、必要であれば噴霧乾燥や凍結乾燥等の手段により乾燥粉末化させて使用することも可能である。
【００１６】
本発明において抗血小板凝集とは、血小板の凝集を抑制することをいい、単に抗血小板（Ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ）ともよばれる。抗血小板凝集活性は、例えば、例えば、全血血小板凝集測定装置（Ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ）を使用して、採取血液に、ｖＷＦよるコラーゲンとＧｐＩｂの間の架橋形成による血小板凝集をおこすアゴニストであるリストセチンを加えた時の血小板凝集率を測定する方法により確認することができる。
【００１７】
本発明の血小板凝集抑制組成物は、飲食品、医薬品、飼料等に応用でき、好ましくは、人が手軽に摂食できる飲食品又は医薬品が好ましい。
本発明における飲食品とは溶液、懸濁物、粉末、固体成形物等経口摂取可能な形態であれば良く特に限定するものではない。より具体的には、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品等の即席食品類、清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料等の飲料類、パン、パスタ、麺、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等の小麦粉製品、飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、デザート菓子等の菓子類、ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素等の調味料、加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズ等の油脂類、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類等の乳製品、冷凍食品、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品等の水産加工品、畜肉ハム・ソーセージ等の畜産加工品、農産缶詰、ジャム・マーマレード類、漬け物、煮豆、シリアル等の農産加工品、栄養食品、錠剤、カプセル等が例示される。
【００１８】
本発明の血小板凝集抑制組成物の飲食品としての摂取量は、本発明の病気の状態、病人の体重、年齢、体質、体調等によって調整されるべきであるが、一般に１日あたり、血小板凝集抑制組成物として０．０５ｇ〜２０ｇ、好ましくは０．１ｇ〜５ｇの範囲で適宜選択することができる。これを病気の状態や食品等の形態によって１日１ないし数回にわけて摂取することができる。
【００１９】
本発明において、血小板凝集抑制組成物又は、それを含有する飲食品等に加工する際に、各種栄養成分を強化することができる。
強化できる栄養成分としては、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ナイアシン（ニコチン酸）、パントテン酸、葉酸等のビタミン類、リジン、スレオニン、トリプトファン等の必須アミノ酸類や、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅等のミネラル類及び、例えば、α−リノレン酸、ＥＰＡ、ＤＨＡ、月見草油、オクタコサノール、カゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）、カゼインカルシウムペプチド（ＣＣＰ）、水溶性食物繊維、不溶性食物繊維、オリゴ糖等の人の健康に寄与する物質類、その他の食品や食品添加物として認可されている有用物質の１種又は２種以上が使用できる。
【００２０】
本発明における医薬部外品及び医薬品とは、経口または非経口投与に適した賦形剤、その他の添加剤を用いて、常法に従って、経口製剤または注射剤として調製することができる。好ましいのは、経口製剤であり、最も好ましいのは、容易に服用でき且つ保存、持ち運びに便利な経口固形製剤である。
経口固形製剤としては、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤等が用いられる。このような固形製剤においては、適宜の薬理学的に許容され得る坦体、賦形剤（例えばデンプン、乳糖、白糖、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムなど）、結合剤（例えばデンプン、アラビアガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなど）、滑沢剤（例えばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムなど）、崩壊剤（例えばカルボキシメチルセルロース、タルクなど）、などと混合し、常法により錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤等を調整することが出来る。経口液状製剤は、製薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エチルアルコールを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与しての注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エチルアルコールのようなアルコール類、ポリソルベート８０等がある。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えばラクトース）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のような補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保管フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
本発明の血小板凝集抑制組成物の医薬品としての投与量は、投与ルート、疾患の症状、投与対象の年齢、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定されるが、通常、成人１人当たり有効成分約４０ｍｇ〜３ｇ／日、好ましくは１００〜５００ｍｇ／日である。
【００２１】
以下本発明を、実施例にて詳細に説明するが、次の実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２２】
（実施例１）血小板凝集抑制組成物の調製１
アムラー乾燥果実を４０メッシュ以下に粉砕し、その粉末８０ｇに、蒸留水２Ｌを加え、５５℃で３時間抽出した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清を濾過し、抽出物と残渣を分離した。その残渣に蒸留水２Ｌを加え、同条件でもう１回繰り返し抽出し、それぞれの抽出液をあわせた後、凍結乾燥し、本発明の血小板凝集抑制組成物Ａ３５．０ｇを得た。収率は４３．８％であった。
【００２３】
（試験例１）抗血小板凝集活性の確認１
本発明の抗血小板凝集組成物の抗血小板凝集活性を、全血血小板凝集能測定装置（ＷＢＡ−Ｎｅｏ：アイエスケ−社製）を使用して、健常人の血液２００μＬに、試料５μＬを添加したのち、凝集を惹起させる物質として最終濃度が１０μＭになるように調整した硫酸リストセチン（アメリカン バイオケミカル ：１００ｍｇ／バイアル）２２μＬを加え、５分後の血小板凝集率を測定した。
別途、対照として水（試料濃度０ｍｇ／ｍＬ）を添加して、同じ方法で血小板凝集率を測定した。測定された血小板凝集率から、下記の数式によって、対照に対する抗血小板凝集活性（％）を計算した。
抗血小板凝集活性（％）＝（対照の血小板凝集率−試料添加時の血小板凝集率）／対照の血小板凝集率×１００
試料は、血小板凝集抑制組成物Ａを蒸留水で希釈して１．２５、２．５、５．０ｍｇ／ｍＬと調製したもので、血小板凝集抑制組成物Ａの濃度と各濃度での抗血小板凝集活性を測定した結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
上記表１の結果により、血小板凝集において本発明の血小板凝集抑制組成物は、ｖＷＦよるコラーゲンとＧｐＩｂの間の架橋形成を抑制することに抗血小板凝集効果が示唆された。また、血小板凝集抑制組成物の濃度を増加させることによって比例的に抗血小板凝集活性も増加することが確認できた。
【００２６】
（実施例２）血小板凝集抑制組成物の調製２
アムラー乾燥果実を４０メッシュ以下に粉砕し、その粉末８０ｇに、蒸留水２Ｌを加え、５５℃で３時間抽出した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清を濾過し、抽出物と残渣を分離した。その残渣に蒸留水２Ｌを加え、同条件でもう１回繰り返し抽出し、それぞれの抽出液をあわせて、減圧濃縮し、２００ｍＬとした。この濃縮液にエチルアルコールを加え、１Ｌになるように調製（最終エチルアルコール濃度８０％）した後、４℃で２４時間静置後、不溶性成分を沈殿させた。沈澱物を遠心分離で分離除去し、上清を減圧濃縮後、水１Ｌに再溶解し、濾過して不溶性成分除去後、濾液を凍結乾燥して本発明の血小板凝集抑制組成物Ｂ１２．５ｇ（収率１５．６％）を得た。
同様にして、エチルアルコールの終濃度が２０％、４０％、６０％にして、本発明の血小板凝集抑制組成物組成物Ｃ１３．６ｇ（収率１７．０％）、Ｄ２０．８ｇ（収率２６．０％）、Ｅ２１．２ｇ（収率２６．５％）を得た。
【００２７】
（実施例３）血小板凝集抑制組成物の調製３
アムラー乾燥果実を４０メッシュ以下に粉砕し、その粉末８０ｇに、蒸留水２Ｌを加え、５５℃で３時間抽出した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清を濾過し、抽出物と残渣を分離した。その残渣に蒸留水２Ｌを加え、同条件でもう１回繰り返し抽出し、それぞれの抽出液をあわせた後、凍結乾燥し、乾燥物約３７．０ｇを得た。その乾燥物３５ｇにエチルアルコール１Ｌを加え、４℃で２４時間静置後、不溶性成分を沈殿させた。沈澱物を遠心分離で分離除去し、上清を減圧濃縮後、水１Ｌに再溶解し、濾過して不溶性成分除去後、濾液を凍結乾燥して本発明の血小板凝集抑制組成物Ｆ３．５ｇを得た。
【００２８】
（実施例４）血小板凝集抑制組成物の調製３
アムラー乾燥果実を４０メッシュ以下に粉砕し、その粉末８０ｇに、蒸留水２Ｌ加え、５５℃で３時間抽出した。その後、遠心分離し、その上清を濾過し、抽出物と残渣を分離した。その残渣に蒸留水２Ｌを入れ、同条件でもう１回繰り返し抽出し、それぞれの抽出液をあわせて、減圧濃縮し、２００ｍＬとした。この濃縮液に酢酸エチルを加え、５００ｍＬになるように調製（最終酢酸エチル濃度６０％）し、よく攪拌後、４℃で２４時間静置した後、酢酸エチル層を分離し、減圧濃縮後、濾液を凍結乾燥して本発明の血小板凝集抑制組成物Ｇ１２．５ｇを得た。
【００２９】
（実施例５）血小板凝集抑制組成物の調製４
アムラー乾燥果実を４０メッシュ以下に粉砕し、その粉末１００ｇに、蒸留水２Ｌを加え、さらにペクチナーゼ０．１ｇ及びタンナーゼ０．１ｇを加えて、５５℃で２時間抽出した。その後、９０℃で３０分間酵素失活させた。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清を濾過し、濾液をスプレードライし、本発明の血小板凝集抑制組成物Ｈ４５ｇを得た。
【００３０】
（試験例３）抗血小板凝集活性の確認２
実施例２で得られた血小板凝集抑制組成物Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、実施例３で得られた血小板凝集抑制組成物Ｆ、実施例４で得られた血小板凝集抑制組成物Ｇ及び実施例５で得られた血小板凝集抑制組成物Ｈについて、５．０ｍｇ／ｍＬの濃度で試験例１と同じ方法で血小板凝集率を測定し、抗血小板凝集活性を算出した。その結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】
表３に示すようにどの血小板凝集抑制組成物も高い抗血小板凝集活性を示した。
【００３３】
（実施例４）血小板凝集抑制組成物含有食品（錠菓）の調製
実施例１で得られた血小板凝集抑制組成物Ａ５ｇ、乳糖３０ｇ、ＤＨＡ含有粉末油脂（サンコートＤＹ−５；太陽化学株式会社製）１２ｇ、ショ糖脂肪酸エステル４ｇ、ヨーグルト香料４ｇを混合し、この混合物をロータリー式打錠機を用いて加圧成形して１錠が３００ｍｇの本発明の血小板凝集抑制組成物含有飲食品（錠菓）を得た。
【００３４】
（実施例５）血小板凝集抑制組成物含有飲料の調製
実施例２で得られた血小板凝集抑制組成物Ａ５ｇ及び、１／５濃縮グレープフルーツ透明果汁２．１ｇ、エリスリトール３０ｇ、クエン酸結晶２．５ｇ、クエン酸三ナトリウム０．５ｇ、Ｌ−アスコルビン酸０．５ｇ、乳酸カルシウム１．９３ｇ、ＣＣＰ０．１５ｇ、グレープフルーツ香料１．０を水に混合溶解して、全量を１０００ｍＬとし、それを１００ｍＬの瓶に充填し、キャップで密栓した後、９０℃、３０分間加熱殺菌をして、本発明の血小板凝集抑制組成物含有飲食品を得た。
【００３５】
（実施例６）血小板凝集抑制組成物含有飲料（野菜果汁混合飲料）の調製
実施例２で得られた血小板凝集抑制組成物Ｃ０．２ｇ及び、グアーガム分解物（サンファイバーＲ；太陽化学株式会社製）３ｇを市販の野菜果汁混合飲料１００ｍＬに添加混合溶解して、本発明の血小板凝集抑制組成物含有飲食品（野菜果汁混合飲料）を得た。
【００３６】
（実施例７）血小板凝集抑制組成物含有クッキーの調製
実施例２で得られた血小板凝集抑制組成物Ｄ４ｇ及び、市販のケーキミックス粉２００ｇを容器に入れた後、バター３５ｇを入れ、木杓子で混ぜ合わせた。それに溶き卵２５ｇを加えて、なめらかな生地になるまで良く練った。小麦粉を振った台の上に生地を取り出し、さらに小麦粉を振って麺棒で５ｍｍの厚さに伸ばし、丸型で抜き、それを１７０℃のオーブンで１０分間焼いて、１個約５ｇの本発明の血小板凝集抑制組成物含有クッキーを得た。
【００３７】
（実施例８）血小板凝集抑制組成物含有ヨーグルトの調製
実施例５で得られた血小板凝集抑制組成物Ｈ１ｇ、市販の脱脂乳（明治乳業社製。蛋白質含量３４％）９５ｇ、及び市販の無塩バター（雪印乳業社製）３５ｇを温水０．８Ｌに溶解し、均質化し、全量を１Ｌに調整した。次いで、９０℃で１５分間加熱殺菌し、冷却し、市販の乳酸菌スターター（ハンゼン社製）３ｇ（ストレプトコッカス・サーモフィラス２ｇ及びラクトバシラス・ブルガリクス１ｇ）を接種し、均一に混合し、１００ｍＬの容器に分注，充填し、密封し、３７℃で２０時間発酵させた後、冷却し、本発明の血小板凝集抑制組成物含有ヨーグルトを得た。
【００３８】
（実施例９）血小板凝集抑制組成物含有経口流動食の調製
カゼインナトリウム（ＤＭＶ社製）５０ｇ、卵白酵素分解物（太陽化学社製）４２．５ｇ、デキストリン（松谷化学社製）１００ｇ水１Ｌに溶解し、水相をタンク内に調製した。これとは別に、ＭＣＴ（花王社製）４５ｇ、パーム油（不二製油社製）１７．５ｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）３５ｇ、レシチン（太陽化学社製）０．７ｇ、消泡剤（太陽化学社製）１ｇを混合溶解し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、７０℃に加温し、更に、ホモゲナイザーにより１４．７ＭＰａの圧力で均質化した。次いで、９０℃で１０分間殺菌した後、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約２６０ｇを調製した。この中間製品粉末２００ｇに実施例２で得られた血小板凝集抑制組成物Ｃ４ｇ、デキストリン（松谷化学社製）１５６ｇ、グアーガム分解物（サンファイバーＲ；太陽化学株式会社製）１８ｇ、少量のビタミンとミネラルおよび粉末香料を添加し、均一に混合して、血小板凝集抑制組成物を含有する経口流動食約３８０ｇを得た。
【００３９】
（実施例１０）血小板凝集抑制組成物含有錠剤の調製
実施例３で得られた血小板凝集抑制組成物Ｇ１０ｇ、結晶セルロース５ｇ、トウモロコシデンプン１３．８ｇ、乳糖３２．５ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース３．３ｇを混合し、顆粒化した。この顆粒化物にステアリン酸マグネシウム１．０ｇを加え、均一に混合し、この混合物をロータリー式打錠機を用いて加圧成形して一錠が１３０ｍｇの本発明の血小板凝集抑制組成物含有錠剤を得た。
【００４０】
本発明の実施態様ならびに目的生成物を挙げれば以下の通りである。
（１） アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物を含有することを特徴とする血小板凝集抑制組成物。
（２） アムラーの果実又は果汁の抽出物が、アムラーの果実又は果汁から水、塩基、酸、親水性溶媒により抽出されていることをより抽出されていることを特徴とする前記（１）記載の血小板凝集抑制組成物。
（３） アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物が、アムラーの果実又は果汁から水により抽出されていることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の血小板凝集抑制組成物。
（４） 親水性溶媒がメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコールの群より選ばれる少なくとも１種類以上の低級アルコールであることを特徴とする前記（１）又は（２）の血小板凝集抑制組成物。
（５） アムラーの果実又は果汁の抽出物から有機溶媒のいずれか１種類又は２種類以上により分画されていることを特徴とする前記（１）〜（４）いずれか記載の血小板凝集抑制組成物。
（６） 有機溶媒がメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルエーテル、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、又はクロロホルムからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする前記（５）記載の血小板凝集抑制組成物。
（７） アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物がエチルアルコールにより分画されていることを特徴とする前記（１）〜（４）いずれか記載の血小板凝集抑制組成物。
（８） アムラーの果実、果汁、葉又はその抽出物が、エチルアルコールにより沈殿成分として分画されていることを特徴とする前記（１）〜（４）いずれか記載の血小板凝集抑制組成物。
（９） アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物が、エチルアルコールで分画する際のエチルアルコール濃度が、２０〜８０％であり、そのエチルアルコール可溶画分であることを特徴とする前記（８）記載の血小板凝集抑制組成物。
（１０） アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物が、エチルアルコールで分画する際のエチルアルコール濃度が、２０〜６０％であり、そのエチルアルコール可溶画分であることを特徴とする前記（８）記載の血小板凝集抑制組成物。
（１１） アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物が、疎水性樹脂を用いたクロマトグラフィーやカラムにより純度を高めることを特徴とする前記（１）〜（１０）いずれか記載の血小板凝集抑制組成物。
（１２） 疎水性樹脂が、フェノール系、スチレン系、アクリル酸系、エポキシアミン系、ピリジン系、メタクリル系などを母体とすることを特徴とする前記（１１）記載の血小板凝集抑制組成物。
（１３） 前記（１）〜（１２）いずれか記載の血小板凝集抑制組成物を含有することを特徴とする飲食品。
（１４） 前記（１）〜（１２）いずれか記載の血小板凝集抑制組成物を含有することを特徴とする医薬品。
（１５） 前記（１）〜（１２）いずれか記載の血小板凝集抑制組成物を含有することを特徴とする医薬品。
（１６） 前記（１）〜（１２）いずれか記載の血小板凝集抑制組成物を含有することを特徴とする飼料。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明で得られたアムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物を含有するの血小板凝集抑制組成物は、血小板凝集において、ｖＷＦよるコラーゲンとＧｐＩｂの間の架橋形成を抑制による抗血小板凝集効果が高く、各種飲食品及び医薬品等に利用して、血小板凝集抑制組成物による血栓の生成を抑制することで脳卒中、脳出血、脳梗塞、心不全症、心筋梗塞、心臓麻痺等のような心血関係疾患を予防することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物を含有する血小板凝集抑制組成物及びそれを含有する飲食品、医薬部外品及び医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
血栓は、プラークの破裂等さまざまな原因によって活性化された血小板の血管内膜への粘着と凝集による血小板血栓、次いでフィブリノーゲン等の種々の凝固系因子が関与するフィブリン血栓へと進行する。身体が正常なときには、この血栓のもととなるフィブリンを溶かす働きをする線溶酵素が血栓予防をして、線溶酵素が不足するとフィブリンを溶解できなくなり、血栓ができるようになる。
形成された血栓は血管に沈着し、血管の断面積を減少させ、血液の循環を阻害し、その結果、血液が細胞及び組職で栄養分と酸素を正常に供給することができず、また、細胞及び組織の老廃物を排出できなくなり、毒性が蓄積される等の問題点が発生するようになる。
血管の中で、血栓といわれる血液の固まりが引き起こす症状を広義の血栓症（以下、単に「血栓症」と記載した場合は、広義の血栓症をいう）と呼び、血栓が原因になって起こる病態は狭義の血栓症と塞栓症に分けられる。狭義の血栓症は血栓が形成個所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することによる症状で、塞栓症は血栓が形成個所から剥がれて血流によって移動し、他の個所で血流を部分的にあるいは完全に閉塞することによって起こる病態のことを指す。
このような血栓症は血栓が生じた血管の部位によって多様な疾病を誘発するようになる。その中でも特に脳血管や心臓血管に生じた場合には脳卒中、脳出血、脳梗塞、心不全症、心筋梗塞、心臓麻痺等深刻な症状が発生し、半身不随を引き起こし、ひどい場合には死亡することもある。
【０００３】
これら心疾患、脳血管疾患等を引き起こす重大な血栓は血流のうっ帯下で形成されるフィブリン血栓とは機序の点で異なり、動脈等の比較的速く豊富な血流の存在下で形成されていると考えられる。血流下では、凝固因子は活性化されても血流によって希釈されてしまうため血栓形成に至らない。しかし、損傷血管壁に粘着し、凝集して局所濃度を高める成分である血小板が血栓の形成により重要な役割を果たす。
血管内皮細胞が障害を受け剥離すると、血管内皮細胞下組織のコラーゲンが露出し、血管内皮細胞で合成されるｖｏｎ−ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷＦ：ＶＩＩ因子）により、コラーゲンとｖＷＦ受容体（ＧｐＩｂ）の間に架橋を形成（粘着）される。さらに、血小板が例えばトロンビンのようなアゴニストによって活性化され、フィブリノーゲン受容体（ＧｐＩＩｂ−ＩＩＩａ）によりフィブリノーゲンを介して他の血小板と結合し、血小板凝集を引き起し、血小板血栓が形成される。従って、ｖＷＦよるコラーゲンとＧｐＩｂの間の架橋形成またはフィブリノーゲンとその他の血清蛋白質が、ＧｐＩＩｂ−ＩＩＩａとの結合を抑制できるかどうかが血栓形成を予防する一つの重要な要件となる。
このｖＷＦよるコラーゲンとＧｐＩｂの間の架橋形成を促進するアゴニストとしては、リストセチンがある。
【０００４】
リストセチンは抗生物質であるが、その強力な副作用のために、医薬品市場から撤去されたが、リストセチンがインビトロでウサギの血小板を凝集させることが発見された。血液においては、ヒト血小板もリストセチンがインビトロでｖＷＦに惹起させてＧｐＩｂとの結合能力を獲得して血小板凝集するが、フォンビルブラント症候群に冒されている患者の場合には血小板凝集は起こらないことから、ｖＷＦの生理活性をインビトロで測定する方法として、リストセチン惹起血小板凝集反応や、リストセチン存在下でのｖＷＦのｖＷＦへの結合を測定する方法に広く利用されている。
【０００５】
現在、血栓症を解決するために、血栓の生成を抑制する抗血栓剤及び血栓形成予防剤と、生成された血栓を溶解させる血栓溶解剤の研究開発が主に行われている。
血小板凝集及び血栓形成予防剤として、アスピリン、チクロピジン、ヒルジン（トロンビン阻害剤）、トロンボキサンＡ２シンターゼ抑制剤、などが製品化されている。
【０００６】
トロンビンは、他の経路とはほとんど無関係に血小板の凝集を起こすが、血小板が他のメカニズムによってあらかじめ活性化されていないと、実質的に有効な量のトロンビンが存在することはない。ヒルジンは、非常に効果的な抗血栓剤である。しかしトロンビン阻害剤は、抗血小板剤と抗凝血剤の両方として機能するため、やはり過剰な出血を起こす可能性がある。
アスピリンなどは、心筋梗塞などの疾患予防のための抗血小板療法用薬剤として広く用いられているが、アスピリンはＡＤＰによって誘起される血小板の凝集に対しては効果がないため、血小板の凝集に対する効果は限られており、胃腸障害などの副作用などがあり、このため、食品や医薬品の分野においては、安全性が高く、安価で実用性の高い抗血小板凝集療法用薬剤が求められている。
食品成分としては、ナットウキナーゼや多価不飽和脂肪酸、グルコサミン、タマネギの薄皮（例えば、特許文献１参照。）等の素材が知られているが、風味や性状等に問題があり、幅広く食品に応用できなかった。
また、最近では、キウイフルーツ抽出物（例えば、特許文献２参照。）についての特許が公開されたが、中性域での活性が弱いという欠点がある。
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１７１９３４号公報（第２頁）
【特許文献２】特開２００３−１７１２９４号公報（第２頁−５頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、幅広い飲食品に使用可能な血小板凝集抑制組成物及びそれを含有する飲食品、医薬部外品及び医薬品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは様々な天然植物を利用して抗凝固成分を捜す目的で、多角的に研究検討した結果、アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物に優れた抗血小板凝集活性があることを見出し、本発明を完成させた。
【発明の効果】
【００１０】
本発明で得られたアムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物を含有する血小板凝集抑制組成物は、ｖＷＦよるコラーゲンとＧｐＩｂの間の架橋形成による血小板凝集をおこすアゴニストであるリストセチンを加えた時の血小板凝集率、いわゆるリストセチン惹起血小板凝集試験によって測定した結果から、ｖＷＦよるコラーゲンとＧｐＩｂの間の架橋形成を抑制することに抗血小板凝集効果が高いことがわかった。
本発明はアムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物を含有する血小板凝集抑制組成物を各種飲食品及び医薬品等に利用して、血小板凝集による血栓の生成を抑制することで脳卒中、脳出血、脳梗塞、心不全症、心筋梗塞、心臓麻痺等のような心血関係疾患を予防することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に用いるアムラーとは、学名：エンビリカ・オフィシナル（Ｅｍｂｌｉｃａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）又は、フィランサス・エンブリカ（Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ ｅｍｂｉｌｉｃａ）といい、トウダイグサ科コミカンソウ属に属する落葉の亜高木であり、インドからマレーシア地域及び中国南部にかけて分布しており、インドが原産地と考えられている。また、各地方又は言語により、各々固有の名称があり、余柑子、油甘、奄摩勒、エンブリック・ミロバラン、アーマラキー、マラッカノキ、マラッカツリー、インディアングーズベリー、アロンラ、アミラ、アミラキ、アミラキャトラ、ネリカイ、ネルリ、タシャ、カユラカ、ケムラカ、ナックホンポン等とも称されている。
【００１２】
本発明において、アムラーの部位としては、果実が好ましく用いられる。その形態は、特に限定するものではなく、未熟果実、完熟果実、乾燥果実、果汁、果汁粉末等のいずれでも良い。
果汁又は果汁粉末の場合は、そのままでも使用できるが、生果実又は乾燥果実等、水不溶性成分を含むものを使用する場合は、抽出により、水不溶性成分が除去されていることが効果を上げる点で好ましい。
抽出の際、生果実を使用する場合は、種子を除去した後、水を添加又は無添加で、抽出効率を高めるためにミキサー等により破砕、均質化したものを用いることが好ましい。
乾燥果実を使用する場合は、抽出効率を高めるために４０メッシュ以下の粒度になるように粉砕されていることが好ましい。
【００１３】
抽出方法は、抽出溶媒、抽出温度等、特に限定されるものではなく、抽出溶媒としては、水、塩基、酸、親水性溶媒、アセトンを使うことができる。親水性溶媒はメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコールの低級アルコール群より選ばれる１種類以上が操作性、抽出効率の点から好ましい。特に好ましくは、水、塩基、酸のいずれかである。
酸又は塩基を抽出溶媒に使用する場合、抽出物を中和させることが好ましい。中和反応によって生成された塩は、透析法やゲル濾過等、公知の方法により、取り除くことができる。水を抽出溶媒として用いた場合には、上記のような中和反応は必要なく、生成された塩を取り除く必要もないため、水を用いることが更に好ましい。
この時使用する酸としては、特に限定するものではなく、大部分の酸を使うことができるが、入手のしやすさの点及び操作性の点により塩酸、硫酸より選ばれる１種又は両者の併用が好ましい。
また、塩基としては、特に限定するものではなく、大部分の塩基を使うことができるが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムより選ばれる１種又は両者の併用が好ましい。
抽出に使用される酸又は塩基の濃度は、抽出物を酵素処理する前であっても後であっても特に限定するものではなく、酸又は塩基の強さによって変化するが、操作性及び抽出効率の点より、０．０１〜０．５モルの濃度を使用することが好ましい。
【００１４】
上記の抽出において、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、タンナーゼまたは、セルラーゼ等の酵素を１種類又は２種類以上を組み合わせて併用することも可能である。
更に、上記の抽出において、抽出残渣に対して再度抽出工程を１回又はそれ以上繰り返すことで、抽出効率が向上し、収率が向上するので、好ましい。この場合の抽出に用いる溶媒は、同じでも良いし、別の溶媒を用いても良い。
【００１５】
上記の抽出物は、そのままでも使用できるが、濾過、遠心分離及び分留により、不溶性物質及び溶媒を取り除くことにより、抗血小板凝集効果が高くなり、応用範囲も広がるので好ましい。
不溶性物質及び溶媒を取り除いた後、果汁又は抽出液をそのまま又は濃縮した後に有機溶媒を用いて分配を行い、それぞれの溶媒可溶画分を得る。これら溶媒可溶画分は、更に抗血小板凝集効果が高くなるので好ましい。有機溶媒としてはメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコールの低級アルコールや酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルエーテル、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、アセトン又はクロロホルムが使用できる。また可溶画分の純度を上げる為には、他の疎水性溶媒による分配を組み合わせることもできるが、エチルアルコール好ましい。これら溶媒の濃度としては、特に限定するものではないが、収率及び効果の点より、終濃度として２０〜８０％が好ましく、２０〜６０％が更に好ましい。
さらに純度を高める為に、フェノール系、スチレン系、アクリル酸系、エポキシアミン系、ピリジン系、メタクリル系などを母体とした疎水性樹脂を用いることも可能である。その場合、樹脂吸着後の溶離液としては、メチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコールなどの低級アルコール及びアセトンを単独又は水溶液として使用できる。
抽出物及び画分はそのままでの使用も可能だが、必要であれば噴霧乾燥や凍結乾燥等の手段により乾燥粉末化させて使用することも可能である。
【００１６】
本発明において抗血小板凝集とは、血小板の凝集を抑制することをいい、単に抗血小板（Ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ）ともよばれる。抗血小板凝集活性は、例えば、例えば、全血血小板凝集測定装置（Ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ）を使用して、採取血液に、ｖＷＦよるコラーゲンとＧｐＩｂの間の架橋形成による血小板凝集をおこすアゴニストであるリストセチンを加えた時の血小板凝集率を測定する方法により確認することができる。
【００１７】
本発明の血小板凝集抑制組成物は、飲食品、医薬品、飼料等に応用でき、好ましくは、人が手軽に摂食できる飲食品又は医薬品が好ましい。
本発明における飲食品とは溶液、懸濁物、粉末、固体成形物等経口摂取可能な形態であれば良く特に限定するものではない。より具体的には、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品等の即席食品類、清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料等の飲料類、パン、パスタ、麺、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等の小麦粉製品、飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、デザート菓子等の菓子類、ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素等の調味料、加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズ等の油脂類、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類等の乳製品、冷凍食品、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品等の水産加工品、畜肉ハム・ソーセージ等の畜産加工品、農産缶詰、ジャム・マーマレード類、漬け物、煮豆、シリアル等の農産加工品、栄養食品、錠剤、カプセル等が例示される。
【００１８】
本発明の血小板凝集抑制組成物の飲食品としての摂取量は、本発明の病気の状態、病人の体重、年齢、体質、体調等によって調整されるべきであるが、一般に１日あたり、血小板凝集抑制組成物として０．０５ｇ〜２０ｇ、好ましくは０．１ｇ〜５ｇの範囲で適宜選択することができる。これを病気の状態や食品等の形態によって１日１ないし数回にわけて摂取することができる。
【００１９】
本発明において、血小板凝集抑制組成物又は、それを含有する飲食品等に加工する際に、各種栄養成分を強化することができる。
強化できる栄養成分としては、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ナイアシン（ニコチン酸）、パントテン酸、葉酸等のビタミン類、リジン、スレオニン、トリプトファン等の必須アミノ酸類や、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅等のミネラル類及び、例えば、α−リノレン酸、ＥＰＡ、ＤＨＡ、月見草油、オクタコサノール、カゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）、カゼインカルシウムペプチド（ＣＣＰ）、水溶性食物繊維、不溶性食物繊維、オリゴ糖等の人の健康に寄与する物質類、その他の食品や食品添加物として認可されている有用物質の１種又は２種以上が使用できる。
【００２０】
本発明における医薬部外品及び医薬品とは、経口または非経口投与に適した賦形剤、その他の添加剤を用いて、常法に従って、経口製剤または注射剤として調製することができる。好ましいのは、経口製剤であり、最も好ましいのは、容易に服用でき且つ保存、持ち運びに便利な経口固形製剤である。
経口固形製剤としては、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤等が用いられる。このような固形製剤においては、適宜の薬理学的に許容され得る坦体、賦形剤（例えばデンプン、乳糖、白糖、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムなど）、結合剤（例えばデンプン、アラビアガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなど）、滑沢剤（例えばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムなど）、崩壊剤（例えばカルボキシメチルセルロース、タルクなど）、などと混合し、常法により錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤等を調整することが出来る。経口液状製剤は、製薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エチルアルコールを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与しての注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エチルアルコールのようなアルコール類、ポリソルベート８０等がある。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えばラクトース）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のような補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保管フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
本発明の血小板凝集抑制組成物の医薬品としての投与量は、投与ルート、疾患の症状、投与対象の年齢、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定されるが、通常、成人１人当たり有効成分約４０ｍｇ〜３ｇ／日、好ましくは１００〜５００ｍｇ／日である。
【００２１】
以下本発明を、実施例にて詳細に説明するが、次の実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２２】
（実施例１）血小板凝集抑制組成物の調製１
アムラー乾燥果実を４０メッシュ以下に粉砕し、その粉末８０ｇに、蒸留水２Ｌを加え、５５℃で３時間抽出した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清を濾過し、抽出物と残渣を分離した。その残渣に蒸留水２Ｌを加え、同条件でもう１回繰り返し抽出し、それぞれの抽出液をあわせた後、凍結乾燥し、本発明の血小板凝集抑制組成物Ａ３５．０ｇを得た。収率は４３．８％であった。
【００２３】
（試験例１）抗血小板凝集活性の確認１
本発明の抗血小板凝集組成物の抗血小板凝集活性を、全血血小板凝集能測定装置（ＷＢＡ−Ｎｅｏ：アイエスケ−社製）を使用して、健常人の血液２００μＬに、試料５μＬを添加したのち、凝集を惹起させる物質として最終濃度が１０μＭになるように調整した硫酸リストセチン（アメリカン バイオケミカル ：１００ｍｇ／バイアル）２２μＬを加え、５分後の血小板凝集率を測定した。
別途、対照として水（試料濃度０ｍｇ／ｍＬ）を添加して、同じ方法で血小板凝集率を測定した。測定された血小板凝集率から、下記の数式によって、対照に対する抗血小板凝集活性（％）を計算した。
抗血小板凝集活性（％）＝（対照の血小板凝集率−試料添加時の血小板凝集率）／対照の血小板凝集率×１００
試料は、血小板凝集抑制組成物Ａを蒸留水で希釈して１．２５、２．５、５．０ｍｇ／ｍＬと調製したもので、血小板凝集抑制組成物Ａの濃度と各濃度での抗血小板凝集活性を測定した結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
上記表１の結果により、血小板凝集において本発明の血小板凝集抑制組成物は、ｖＷＦよるコラーゲンとＧｐＩｂの間の架橋形成を抑制することに抗血小板凝集効果が示唆された。また、血小板凝集抑制組成物の濃度を増加させることによって比例的に抗血小板凝集活性も増加することが確認できた。
【００２６】
（実施例２）血小板凝集抑制組成物の調製２
アムラー乾燥果実を４０メッシュ以下に粉砕し、その粉末８０ｇに、蒸留水２Ｌを加え、５５℃で３時間抽出した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清を濾過し、抽出物と残渣を分離した。その残渣に蒸留水２Ｌを加え、同条件でもう１回繰り返し抽出し、それぞれの抽出液をあわせて、減圧濃縮し、２００ｍＬとした。この濃縮液にエチルアルコールを加え、１Ｌになるように調製（最終エチルアルコール濃度８０％）した後、４℃で２４時間静置後、不溶性成分を沈殿させた。沈澱物を遠心分離で分離除去し、上清を減圧濃縮後、水１Ｌに再溶解し、濾過して不溶性成分除去後、濾液を凍結乾燥して本発明の血小板凝集抑制組成物Ｂ１２．５ｇ（収率１５．６％）を得た。
同様にして、エチルアルコールの終濃度が２０％、４０％、６０％にして、本発明の血小板凝集抑制組成物組成物Ｃ１３．６ｇ（収率１７．０％）、Ｄ２０．８ｇ（収率２６．０％）、Ｅ２１．２ｇ（収率２６．５％）を得た。
【００２７】
（実施例３）血小板凝集抑制組成物の調製３
アムラー乾燥果実を４０メッシュ以下に粉砕し、その粉末８０ｇに、蒸留水２Ｌを加え、５５℃で３時間抽出した。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清を濾過し、抽出物と残渣を分離した。その残渣に蒸留水２Ｌを加え、同条件でもう１回繰り返し抽出し、それぞれの抽出液をあわせた後、凍結乾燥し、乾燥物約３７．０ｇを得た。その乾燥物３５ｇにエチルアルコール１Ｌを加え、４℃で２４時間静置後、不溶性成分を沈殿させた。沈澱物を遠心分離で分離除去し、上清を減圧濃縮後、水１Ｌに再溶解し、濾過して不溶性成分除去後、濾液を凍結乾燥して本発明の血小板凝集抑制組成物Ｆ３．５ｇを得た。
【００２８】
（実施例４）血小板凝集抑制組成物の調製３
アムラー乾燥果実を４０メッシュ以下に粉砕し、その粉末８０ｇに、蒸留水２Ｌ加え、５５℃で３時間抽出した。その後、遠心分離し、その上清を濾過し、抽出物と残渣を分離した。その残渣に蒸留水２Ｌを入れ、同条件でもう１回繰り返し抽出し、それぞれの抽出液をあわせて、減圧濃縮し、２００ｍＬとした。この濃縮液に酢酸エチルを加え、５００ｍＬになるように調製（最終酢酸エチル濃度６０％）し、よく攪拌後、４℃で２４時間静置した後、酢酸エチル層を分離し、減圧濃縮後、濾液を凍結乾燥して本発明の血小板凝集抑制組成物Ｇ１２．５ｇを得た。
【００２９】
（実施例５）血小板凝集抑制組成物の調製４
アムラー乾燥果実を４０メッシュ以下に粉砕し、その粉末１００ｇに、蒸留水２Ｌを加え、さらにペクチナーゼ０．１ｇ及びタンナーゼ０．１ｇを加えて、５５℃で２時間抽出した。その後、９０℃で３０分間酵素失活させた。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、その上清を濾過し、濾液をスプレードライし、本発明の血小板凝集抑制組成物Ｈ４５ｇを得た。
【００３０】
（試験例３）抗血小板凝集活性の確認２
実施例２で得られた血小板凝集抑制組成物Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、実施例３で得られた血小板凝集抑制組成物Ｆ、実施例４で得られた血小板凝集抑制組成物Ｇ及び実施例５で得られた血小板凝集抑制組成物Ｈについて、５．０ｍｇ／ｍＬの濃度で試験例１と同じ方法で血小板凝集率を測定し、抗血小板凝集活性を算出した。その結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】
表３に示すようにどの血小板凝集抑制組成物も高い抗血小板凝集活性を示した。
【００３３】
（実施例４）血小板凝集抑制組成物含有食品（錠菓）の調製
実施例１で得られた血小板凝集抑制組成物Ａ５ｇ、乳糖３０ｇ、ＤＨＡ含有粉末油脂（サンコートＤＹ−５；太陽化学株式会社製）１２ｇ、ショ糖脂肪酸エステル４ｇ、ヨーグルト香料４ｇを混合し、この混合物をロータリー式打錠機を用いて加圧成形して１錠が３００ｍｇの本発明の血小板凝集抑制組成物含有飲食品（錠菓）を得た。
【００３４】
（実施例５）血小板凝集抑制組成物含有飲料の調製
実施例２で得られた血小板凝集抑制組成物Ａ５ｇ及び、１／５濃縮グレープフルーツ透明果汁２．１ｇ、エリスリトール３０ｇ、クエン酸結晶２．５ｇ、クエン酸三ナトリウム０．５ｇ、Ｌ−アスコルビン酸０．５ｇ、乳酸カルシウム１．９３ｇ、ＣＣＰ０．１５ｇ、グレープフルーツ香料１．０を水に混合溶解して、全量を１０００ｍＬとし、それを１００ｍＬの瓶に充填し、キャップで密栓した後、９０℃、３０分間加熱殺菌をして、本発明の血小板凝集抑制組成物含有飲食品を得た。
【００３５】
（実施例６）血小板凝集抑制組成物含有飲料（野菜果汁混合飲料）の調製
実施例２で得られた血小板凝集抑制組成物Ｃ０．２ｇ及び、グアーガム分解物（サンファイバーＲ；太陽化学株式会社製）３ｇを市販の野菜果汁混合飲料１００ｍＬに添加混合溶解して、本発明の血小板凝集抑制組成物含有飲食品（野菜果汁混合飲料）を得た。
【００３６】
（実施例７）血小板凝集抑制組成物含有クッキーの調製
実施例２で得られた血小板凝集抑制組成物Ｄ４ｇ及び、市販のケーキミックス粉２００ｇを容器に入れた後、バター３５ｇを入れ、木杓子で混ぜ合わせた。それに溶き卵２５ｇを加えて、なめらかな生地になるまで良く練った。小麦粉を振った台の上に生地を取り出し、さらに小麦粉を振って麺棒で５ｍｍの厚さに伸ばし、丸型で抜き、それを１７０℃のオーブンで１０分間焼いて、１個約５ｇの本発明の血小板凝集抑制組成物含有クッキーを得た。
【００３７】
（実施例８）血小板凝集抑制組成物含有ヨーグルトの調製
実施例５で得られた血小板凝集抑制組成物Ｈ１ｇ、市販の脱脂乳（明治乳業社製。蛋白質含量３４％）９５ｇ、及び市販の無塩バター（雪印乳業社製）３５ｇを温水０．８Ｌに溶解し、均質化し、全量を１Ｌに調整した。次いで、９０℃で１５分間加熱殺菌し、冷却し、市販の乳酸菌スターター（ハンゼン社製）３ｇ（ストレプトコッカス・サーモフィラス２ｇ及びラクトバシラス・ブルガリクス１ｇ）を接種し、均一に混合し、１００ｍＬの容器に分注，充填し、密封し、３７℃で２０時間発酵させた後、冷却し、本発明の血小板凝集抑制組成物含有ヨーグルトを得た。
【００３８】
（実施例９）血小板凝集抑制組成物含有経口流動食の調製
カゼインナトリウム（ＤＭＶ社製）５０ｇ、卵白酵素分解物（太陽化学社製）４２．５ｇ、デキストリン（松谷化学社製）１００ｇ水１Ｌに溶解し、水相をタンク内に調製した。これとは別に、ＭＣＴ（花王社製）４５ｇ、パーム油（不二製油社製）１７．５ｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）３５ｇ、レシチン（太陽化学社製）０．７ｇ、消泡剤（太陽化学社製）１ｇを混合溶解し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、７０℃に加温し、更に、ホモゲナイザーにより１４．７ＭＰａの圧力で均質化した。次いで、９０℃で１０分間殺菌した後、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約２６０ｇを調製した。この中間製品粉末２００ｇに実施例２で得られた血小板凝集抑制組成物Ｃ４ｇ、デキストリン（松谷化学社製）１５６ｇ、グアーガム分解物（サンファイバーＲ；太陽化学株式会社製）１８ｇ、少量のビタミンとミネラルおよび粉末香料を添加し、均一に混合して、血小板凝集抑制組成物を含有する経口流動食約３８０ｇを得た。
【００３９】
（実施例１０）血小板凝集抑制組成物含有錠剤の調製
実施例３で得られた血小板凝集抑制組成物Ｇ１０ｇ、結晶セルロース５ｇ、トウモロコシデンプン１３．８ｇ、乳糖３２．５ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース３．３ｇを混合し、顆粒化した。この顆粒化物にステアリン酸マグネシウム１．０ｇを加え、均一に混合し、この混合物をロータリー式打錠機を用いて加圧成形して一錠が１３０ｍｇの本発明の血小板凝集抑制組成物含有錠剤を得た。
【００４０】
本発明の実施態様ならびに目的生成物を挙げれば以下の通りである。
（１） アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物を含有することを特徴とする血小板凝集抑制組成物。
（２） アムラーの果実又は果汁の抽出物が、アムラーの果実又は果汁から水、塩基、酸、親水性溶媒により抽出されていることをより抽出されていることを特徴とする前記（１）記載の血小板凝集抑制組成物。
（３） アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物が、アムラーの果実又は果汁から水により抽出されていることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の血小板凝集抑制組成物。
（４） 親水性溶媒がメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコールの群より選ばれる少なくとも１種類以上の低級アルコールであることを特徴とする前記（１）又は（２）の血小板凝集抑制組成物。
（５） アムラーの果実又は果汁の抽出物から有機溶媒のいずれか１種類又は２種類以上により分画されていることを特徴とする前記（１）〜（４）いずれか記載の血小板凝集抑制組成物。
（６） 有機溶媒がメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルエーテル、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、又はクロロホルムからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする前記（５）記載の血小板凝集抑制組成物。
（７） アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物がエチルアルコールにより分画されていることを特徴とする前記（１）〜（４）いずれか記載の血小板凝集抑制組成物。
（８） アムラーの果実、果汁、葉又はその抽出物が、エチルアルコールにより沈殿成分として分画されていることを特徴とする前記（１）〜（４）いずれか記載の血小板凝集抑制組成物。
（９） アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物が、エチルアルコールで分画する際のエチルアルコール濃度が、２０〜８０％であり、そのエチルアルコール可溶画分であることを特徴とする前記（８）記載の血小板凝集抑制組成物。
（１０） アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物が、エチルアルコールで分画する際のエチルアルコール濃度が、２０〜６０％であり、そのエチルアルコール可溶画分であることを特徴とする前記（８）記載の血小板凝集抑制組成物。
（１１） アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物が、疎水性樹脂を用いたクロマトグラフィーやカラムにより純度を高めることを特徴とする前記（１）〜（１０）いずれか記載の血小板凝集抑制組成物。
（１２） 疎水性樹脂が、フェノール系、スチレン系、アクリル酸系、エポキシアミン系、ピリジン系、メタクリル系などを母体とすることを特徴とする前記（１１）記載の血小板凝集抑制組成物。
（１３） 前記（１）〜（１２）いずれか記載の血小板凝集抑制組成物を含有することを特徴とする飲食品。
（１４） 前記（１）〜（１２）いずれか記載の血小板凝集抑制組成物を含有することを特徴とする医薬品。
（１５） 前記（１）〜（１２）いずれか記載の血小板凝集抑制組成物を含有することを特徴とする医薬品。
（１６） 前記（１）〜（１２）いずれか記載の血小板凝集抑制組成物を含有することを特徴とする飼料。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明で得られたアムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物を含有するの血小板凝集抑制組成物は、血小板凝集において、ｖＷＦよるコラーゲンとＧｐＩｂの間の架橋形成を抑制による抗血小板凝集効果が高く、各種飲食品及び医薬品等に利用して、血小板凝集抑制組成物による血栓の生成を抑制することで脳卒中、脳出血、脳梗塞、心不全症、心筋梗塞、心臓麻痺等のような心血関係疾患を予防することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物を含有することを特徴とする血小板凝集抑制組成物。
【請求項２】
アムラーの果実又は果汁の抽出物が、アムラーの果実又は果汁から水、塩基、酸、親水性溶媒、アセトンからなる群より選ばれる少なくとも１種により抽出されていることを特徴とする請求項１記載の血小板凝集抑制組成物。
【請求項３】
アムラーの果実又は果汁の抽出物の有機溶媒による分画物を含有することを特徴とする請求項１又は２記載の血小板凝集抑制組成物。
【請求項４】
有機溶媒がメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルエーテル、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、又はクロロホルムからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項３記載の血小板凝集抑制組成物。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか記載の血小板凝集抑制組成物を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項６】
請求項１〜４いずれか記載の血小板凝集抑制組成物を含有することを特徴とする医薬部外品。
【請求項７】
請求項１〜４いずれか記載の血小板凝集抑制組成物を含有することを特徴とする医薬品。
【請求項１】
アムラーの果実、果汁又はそれらの抽出物を含有することを特徴とする血小板凝集抑制組成物。
【請求項２】
アムラーの果実又は果汁の抽出物が、アムラーの果実又は果汁から水、塩基、酸、親水性溶媒、アセトンからなる群より選ばれる少なくとも１種により抽出されていることを特徴とする請求項１記載の血小板凝集抑制組成物。
【請求項３】
アムラーの果実又は果汁の抽出物の有機溶媒による分画物を含有することを特徴とする請求項１又は２記載の血小板凝集抑制組成物。
【請求項４】
有機溶媒がメチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、メチルエーテル、メチルイソブチルケトン、ヘキサン、又はクロロホルムからなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項３記載の血小板凝集抑制組成物。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか記載の血小板凝集抑制組成物を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項６】
請求項１〜４いずれか記載の血小板凝集抑制組成物を含有することを特徴とする医薬部外品。
【請求項７】
請求項１〜４いずれか記載の血小板凝集抑制組成物を含有することを特徴とする医薬品。
【公開番号】特開２００６−１３７７０１（Ｐ２００６−１３７７０１Ａ）
【公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３２８５３６（Ｐ２００４−３２８５３６）
【出願日】平成１６年１１月１２日（２００４．１１．１２）
【出願人】（０００２０４１８１）太陽化学株式会社 (244)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月１２日（２００４．１１．１２）
【出願人】（０００２０４１８１）太陽化学株式会社 (244)
【Ｆターム（参考）】
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