血管透過性およびアポトーシスの阻害方法
血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体のアゴニストを記載する。ＦＴＹ７２０などの化合物を、スフィンゴシンキナーゼ−２によってスフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストとして作用するリン酸化形態にリン酸化することができる。血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストを、血管透過障害および望ましくない血管内皮細胞アポトーシスならびに新生血管の成長における哺乳動物の治療方法で使用する。スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストを、血管透過障害および望ましくない血管内皮細胞アポトーシスならびに新生血管の成長の治療薬の製造のために使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管透過障害の治療薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用、望ましくない血管内皮細胞アポトーシスの治療薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用、及び哺乳動物における新生血管形成の刺激薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用に関する。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載）合衆国政府は、国立衛生研究所によって支払われた助成金番号ＨＬ６７３３０およびＨＬ７０６９４によって本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
新生血管の形成プロセスを血管形成という。血管形成時に、血管内皮細胞は、順番に、増殖、移動、および形態形成を受けて新規の毛細血管網を形成する。正常または非病的状態下で、虚血に応答した創傷治癒などの十分に定義された病態下ならびに胚および胎児の発達時に血管形成が生じる。しかし、持続的または制御できない血管形成によって種々の病状または病態を引き起こし、固形腫瘍の場合には、病状が持続する病態であり得る。
【０００４】
多数の細胞外および細胞内シグナル伝達分子は、細胞受容体と相互作用して血管系（血管形成に関連する過程が含まれる）における影響を調節する。スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）は、原形質膜局在Ｇタンパク質共役受容体の内皮細胞分化遺伝子ファミリー（Ｓ１Ｐｎ受容体としても公知のＥＤＧ）のメンバーとの相互作用を介した広範な種々の細胞応答を媒介する生物活性スフィンゴ脂質である。
【０００５】
今日まで、このファミリーの５つのメンバー（Ｓ１Ｐ１／ＥＤＧ−１、Ｓ１Ｐ２／ＥＤＧ−５、Ｓ１Ｐ３／ＥＤＧ−３、Ｓ１Ｐ４／ＥＤＧ−６、およびＳ１Ｐ５／ＥＤＧ−８）が異なる細胞型のＳ１Ｐ受容体として同定されている。特に、Ｓ１Ｐ１受容体およびＳ１Ｐ３受容体とのＳ１Ｐ相互作用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの内皮細胞の生存および形態形成で重要な役割を果たすことが証明されており、Ｓ１Ｐ１はｉｎ ｖｉｖｏでの血管成熟に必要である。しかし、Ｓ１Ｐは、免疫系および生殖系などの他の臓器系に対しても高い効果を発揮し、多機能脂質メディエーターであることが示されている。
【０００６】
Ｓ１Ｐおよびその受容体は、脈管構造の調節に関与する。したがって、特に血管系の疾患の治療でＳ１Ｐ受容体を維持することが望ましい。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
有効量の血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストを哺乳動物に投与する工程と、前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、血管透過障害の治療を可能とする哺乳動物の治療方法。
【０００８】
また、別の態様として、有効量の血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストを哺乳動物に投与する工程と、前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、望ましくない血管内皮細胞アポトーシスが移植片拒絶に関連しないこととを含む、望ましくない血管内皮細胞アポトーシスの治療を必要とする哺乳動物の治療方法。
【０００９】
さらに、別の態様として、有効量の血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストを哺乳動物中の部位に投与する工程と、前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、哺乳動物の新生血管を刺激する方法。
【００１０】
本発明の１つの実施形態として、血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、血管透過障害の治療薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用を開示する。
【００１１】
別の実施形態として、血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、望ましくない血管内皮細胞アポトーシスが移植片拒絶に関連しない、望ましくない血管内皮細胞アポトーシスの治療薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用を開示する。
【００１２】
さらに別の実施形態として、血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、哺乳動物における新生血管形成の刺激薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用を開示する。
図面の簡単な説明
【００１３】
図面の簡単な説明については後述する。
【００１４】
発明の詳細な説明
本明細書中で参考として援用される米国特許第６，４８６，２０９号；同第６，４７６，００４号；同第６，４７１，９８０号；同第６，３７２，８００号；同第６，２７４，６２９号；同第６，１８７，８２１号；同第６，００４，５６５号；および同第５，９４８，８２０号に示されるように、ＦＴＹ７２０は、臓器移植の動物モデルでの効果が示された強力な免疫調製薬である。この化合物の作用機構は、Ｔリンパ球中で５つのＳ１Ｐ受容体のうちの４つのアゴニストであるＦＴＹ７２０−Ｐへのリン酸化を含むことが最近示された。ＦＴＹ７２０はリンパ球輸送の強力なモジュレーターであることが以前に示されているが、血管要素に対するＦＴＹ７２０の効果は以前には知られていなかった。
【００１５】
血管内皮細胞がＦＴＹ７２０およびその類似化合物を「活性化する」ための酵素系を含むことを本明細書中で証明する。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）などの培養内皮細胞は、血管形成の研究のための許容されたｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系である。ＨＵＶＥＣ馴化培地または細胞抽出物とのインキュベーションの際、ＦＴＹ７２０はリン酸化され、百日咳毒素感受性様式で移動するために内皮細胞を活性化することができ、これによりＧｉ共役Ｓ１Ｐ受容体を活性化することが示唆される。内皮細胞由来のスフィンゴシンキナーゼ−２（ＳＫ２）がＦＴＹ７２０のＦＴＹ７２０−Ｐへの代謝に関与することを本明細書中に示す。
【００１６】
ＦＴＹ７２０−Ｐおよびその類似化合物である（Ｒ）−ＡＦＤが血管Ｓ１Ｐ受容体を活性化してＳ１Ｐと類似の様式でシグナル伝達経路を刺激することも本明細書中に示す。これらの事象によって内皮細胞アポトーシスが阻害され、血管系がストレスを受ける種々の生理的状態が生じる。Ｓ１Ｐ受容体アゴニストの別の生理学的に関連する効果は、内皮細胞における接着結合アセンブリの誘導である。ＳＩＰ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、および（Ｒ）−ＡＦＤ刺激後にＶＥ−カドヘリン転位置が誘導されることも示す。細胞−細胞接合部分子は、血管透過性を調節するメディエーターの重要な標的である。
【００１７】
ＳＩＰ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、および（Ｒ）−ＡＦＤは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＶＥＧＦ誘導性傍細胞透過性およびｉｎ ｖｉｖｏでのＶＥＧＦ誘導性血管透過性を阻害することができる。ＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤによる内皮細胞における接着結合アセンブリの誘導は、ｉｎ ｖｉｖｏでの２つの重要な応用を有し得る。
【００１８】
一方では、ＦＴＹ７２０の作用機構の一部であり得る。ＦＴＹ７２０は、血脈洞を裏打ちする内皮での細胞−細胞接合部の調節によってリンパ球のリンパ洞への放出（ｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を防止することができる。実際、ＦＴＹ７２０−Ｐは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮細胞単層を介してＴリンパ球のケモカイン誘導性移動を阻害する。他方では、ＦＴＹ７２０は、敗血症の合併症として発症する呼吸窮迫症候群などの急性血管疾患的状況における血管透過性を阻害することができる。さらに、血管透過性の長期的変化は、内皮細胞損傷の顕著な特徴であり、糖尿病に関連する虚血性心血管疾患および末梢血管障害に共通の慢性疾患を発症し得る。ＦＴＹ７２０−Ｐは、血管系の強力な調節薬であり、影響を及ぼされる状況での内皮細胞の健全性のための保護物質として使用することができる。
【００１９】
したがって、本発明は、血管透過性障害の治療が必要な哺乳動物の治療方法、血管内皮細胞アポトーシスの阻害方法、および新生血管形成の刺激方法に関する。本方法は、有効量のＳ１Ｐ以外の血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む。血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストまたはその薬学的に許容可能な形態物を、血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストに応答する疾患、障害、または病態の治療薬の製造のために使用することができる。
【００２０】
適切な血管内皮Ｓ１Ｐ受容体には、例えば、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４、Ｓ１Ｐ５、および１つまたは複数の前記受容体を含む組み合わせが含まれる。１つの実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体には、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ３、およびその組み合わせが含まれる。血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストは、薬学的に許容可能な塩であってよく、そして／またはスフィンゴシン−キナーゼ２酵素によってリン酸化されたものでもよい。
【００２１】
血管内皮Ｓ１Ｐ受容体の適切なアゴニストには、例えば、１，２アミノアルコール、その薬学的に許容可能な塩、そのリン酸化形態物、および１つまたは複数の前記アゴニストを含む組み合わせが含まれる。
【００２２】
本明細書中に記載の血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストの「薬学的に許容可能な形態物」には、このような化合物の薬学的に許容可能な塩、水和物、溶媒化合物、結晶形態、多形体、キレート、非共有結合性複合体、エステル、包接体、プロドラッグ、および混合物が含まれる。薬学的に許容可能な塩は、薬学的に適切である許容可能な形態物である。
【００２３】
「薬学的に許容可能な塩」には、元の化合物を非毒性の酸性塩または塩基性塩に修飾した血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストの誘導体が含まれ、さらに、このような化合物およびこのような塩の薬学的に許容可能な溶媒化合物をも含まれる。薬学的に許容可能な塩の例には、アミンなどの塩基性残基の無機酸塩または有機酸塩およびカルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
薬学的に許容可能な塩には、例えば、非毒性有機酸または無機酸から形成された元の化合物の通常の非毒性塩および四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、通常の非毒性酸の塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸由来の塩；ならびに酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、メシル酸、エシル酸、ベシル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、ＨＯＯＣ−ｎ−ＣＯＯＨ（式中、ｎは０〜４である）などの有機酸から調製した塩が含まれる。薬学的に許容可能な塩を、従来の化学的方法によって元の化合物（塩基性または酸性部分）から合成することができる。
【００２５】
一般に、このような塩を、これらの化合物の遊離酸形態物と適切な塩基（Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ，またはＫの水酸化物、炭酸塩、または重炭酸塩など）の化学量論量との反応、またはこれらの化合物の遊離塩基形態物と適切な酸の化学量論量との反応によって調製することができる。典型的には、このような反応を水中、有機溶媒中、または前記２つの混合物中で行う。一般に、差し支えなければ、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性溶媒が好ましい。さらなる適切な塩のリストを、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｐ．１４１８（１９８５）で見出すことができる。
【００２６】
適切な１，２−アミノアルコールは、式：
【化１】
（Ｒ１は、任意選択的に置換されまたは置換されていないフェニレンまたはフェノキシによって分断されうる、１２〜２２個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の炭素鎖で置換されまたは置換されていないものであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立して水素またはＣ１〜６アルキルであり；ｎは０または１である）を有する。１つの実施形態としては、式Ｉの化合物は、Ｒ１が任意選択的にニトロ、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、またはカルボン酸で置換された１３〜２０個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖のアルキルである化合物、より好ましくは、Ｒ１は、フェニルが、任意選択的にハロゲンに置換された直鎖または分岐鎖のＣ６〜１４アルキル鎖またはＣ６〜１４アルコキシ鎖に置換され、アルキル部分が任意選択的にヒドロキシに置換されたＣ１〜６アルキルとなっている、（フェニル）アルキル−の化合物である。
【００２７】
１つの実施形態としては、Ｒ１は、フェニルの水素を直鎖または分岐鎖のＣ６〜１４アルキル鎖またはＣ６〜１４アルコキシ鎖で置換した（フェニル）Ｃ１〜６アルキルである。Ｃ６〜１４アルキル鎖は、オルト位、メタ位、またはパラ位であり得る。１つの実施形態としては、Ｒ２〜Ｒ５はそれぞれ水素である。
【００２８】
本明細書中で使用される、「任意選択的に分断される」は、アルキル鎖内の任意の位置でアルキル鎖を差し挟むことができることを意味する。例えば、式２を参照のこと。２つの文字または記号の間にないダッシュ（「−」）を使用して、置換のための結合点を示す。例えば、（フェニル）アルキル−は、アルキル基の炭素原子を介して結合している。
【００２９】
本明細書中で使用される、「アルキル」は、特定の数の炭素原子を有する分岐鎖および直鎖両方の飽和脂肪族炭化水素基を含むことが意図される。したがって、本明細書中で使用される、用語「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」には、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基が含まれる。本明細書中で別の基と組み合わせてＣ０〜Ｃｎアルキルを使用する場合（例えば、（フェニル）Ｃ０〜Ｃ４アルキル）、示した基（この場合、フェニル）は、単結合によって直接結合しているか（Ｃ０）、特定の炭素原子数（この場合、１〜約４個の炭素原子）を有するアルキル鎖を介して結合している。
【００３０】
アルキルの例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、およびｓｅｃ−ペンチルが含まれるが、これらに限定されない。好ましいアルキル基は、低級アルキル基（１〜約８個の炭素原子を有するアルキル基）（例えば、Ｃ１〜Ｃ８およびＣ１〜Ｃ６アルキル基）である。
【００３１】
１，２−アミノアルコール誘導体は、１つまたは複数のキラル中心を有し得る。結果として、例えば、とりわけ、キラル出発材料、触媒、または溶媒によって１つの光学異性体（ジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む）を選択的に調製することができるか、またはジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む両方の光学異性体または両方の立体異性体を同時に調製することができる（ラセミ混合物）。化合物はラセミ混合物として存在し得るので、ジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む光学異性体または立体異性体の混合物を、公知の方法（例えば、キラル塩およびキラルクロマトグラフィなどの使用）を使用して分離することができる。
【００３２】
さらに、ジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む１つの光学異性体または立体異性体は、他の異性体よりも好ましい性質を有し得る。本明細書中でラセミ混合物という場合、ジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む光学異性体または実質的に他の異性体を含まない１つの立体異性体が含まれる。
【００３３】
式１の適切な化合物には、ＦＴＹ７２０（式ＩＩ）としても公知の２−アミノ−２−［２−（４−オクタフェニル）エチル］プロパン−１，３ジオールおよびＡＡＬまたは２−アミノ−２−メチル−４−［４−ヘプトキシ−フェニル］ブタン−ｌ−オールとしても公知のヒドロキシメチレン基がメチル基に置換されたＦＴＹ７２０の誘導体、（式ＩＩＩ）が含まれる。
【化２】
【化３】
【００３４】
ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＦＴＹ−７２０およびＡＡＬが、例えば、ＳＫ２キナーゼなどの内因性キナーゼによってリン酸化され、式（ＩＶ）の化合物（ＦＴＹ７２０−Ｐ、すなわち２−アミノ−３−ホスフェート−２−［２−（４−オクタフェニル）エチル］プロパン−１−オール）および（Ｖ）（（Ｒ）−ＡＦＤ、すなわち２−アミノ−２−メチル−４−［４−ヘプトキシ−フェニル］１−二リン酸）を生成することができる。
【化４】
【化５】
【００３５】
血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストは、２−アミノ−２−［２−（４−オクタフェニル）エチル］プロパン−１，３ジオール、２−アミノ−２−メチル−４−［４−ヘプトキシ−フェニル］ブタン−ｌ−オール、２−アミノ−３−ホスフェート−２−［２−（４−オクタフェニル）エチル］プロパン−１−オール、２−アミノ−２−メチル−４−［４−ヘプトキシ−フェニル］１−二リン酸、または１つ若しくは複数の前記アゴニストを含む組み合わせであり得る。
【００３６】
血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストを、血管透過障害の治療有効量で哺乳動物に投与することができる。このような障害には、例えば、内皮損傷、血小板減少症、アテローム性動脈硬化症、虚血性心血管疾患、虚血性末梢血管疾患、糖尿病に関連する末梢血管障害、デング出血熱、成人（急性）呼吸窮迫症候群、血管漏出症候群、敗血症、自己免疫性脈管炎、および１つまたは複数の前記障害を含む組み合わせが含まれる。
【００３７】
内皮損傷は、高血圧、ストレス誘導性ホルモン、化学的毒素、汚染物質、コレステロール、感染因子（例えば、クラミジア・ニューモニエ、ヘリコバクター・ピロリ、ヘルペスウイルス、カンジダ・アルビカンス）、ホモシステイン、および種々の疾患に起因する。内皮損傷に関する病態には、アテローム性動脈硬化症および血管腫が含まれ得る。アテローム性動脈硬化症は、内皮下腔中の脂質沈着と関連する。局所的に高まった血管内皮透過性によって脂質が蓄積され得る。アテロームは、アテローム性動脈硬化病変の中心の壊死塊である。血管腫は、拡張した血管からなる良性腫瘍である。
【００３８】
血小板減少症は、血小板（血球の１つ）数が異常に低下する障害であり、しばしば異常出血に関連する。成人性特発性血小板減少性紫斑症（ＩＴＰ）は、通常、構造血小板抗原に対する抗体の発生に起因する（自己抗体）。ＩＴＰに類似の血小板減少症を発症する障害には、膠原血管病（例えば、ＳＬＥ）またはリンパ増殖性疾患の他に免疫血小板減少症がある。ヘパリン誘導性血小板減少症は、血小板表面膜上でのＦｃ受容体へのヘパリン−抗体複合体の結合に起因する。血小板減少症では、内皮損傷、血管透過性の増大、および組織浮腫が一般的な症状である。
【００３９】
虚血性心疾患は、血液供給が無いか欠乏しているために心筋が損傷するか、または不十分にしか作用しないことで生じる病態である。これはアテローム性動脈硬化症によって最も頻繁に起こり、狭心症、急性心筋梗塞、慢性虚血精神疾患、および突然死をきたす。冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）とも呼ばれる。
【００４０】
いくつかの血管透過性障害は、真性糖尿病に関連し、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性毛細血管症、糖尿病性大血管症、および閉塞性血管障害をきたす。
【００４１】
デング出血熱は、抗原性は異なるが４つの密接に関連するフラビウイルス族のウイルス血清型（ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３、およびＤＥＮ−４）のうちの１つに起因する。これらの血清型のうちの１つでの感染によっては交差防御免疫が得られないので、個体は生涯４つのデング感染症を有し得る。デング熱は熱帯地方の疾患であり、原因となるウイルスの生活環は、ヒト、ネッタイシマカ、家畜、ヒトを餌にする日中に刺す蚊を含む。
【００４２】
デング出血熱／デングショック症候群（ＤＨＦ／ＤＳＳ）で認められる主な病態生理学的異常は、血管透過性の急性の増加である。デング熱は、突発的な高熱、悪寒、頭痛、発疹、出血の徴候、味覚の変化、喉の痛み、吐気、嘔吐、下痢、および激しい筋肉痛および関節痛によって特徴づけられる。極端な場合、デングショックにより、血漿が漏出し、その後血漿の喪失が危機的である場合には、血液量減少性ショックを引き起こす。
【００４３】
全身性血管漏出症候群は、１０％〜７０％の血漿の突発的な一過性血管外遊出に起因する低血圧および血液濃縮の同時発作によって特徴づけられる障害である。臨床的には、この症候群は、低血圧、血液濃縮、低アルブミン血症を示す。休止期間中、毛細血管透過性は正常である。発作の間のみ血管外遊出が起こる。この漏出の病態生理学的性質は不可解なままである。古典的経路における補体の活性化、５−リポキシゲナーゼの持続的な外来的刺激、インターロイキン−２の役割が、考えられる原因として示唆されている。
【００４４】
成人（急性）呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）は、しばしば他の臓器の機能不全に関連する肺の進行性機能不全（特に、酸素を取り込む能力の不全）の急速な発症である。病態は、広範な肺炎および罹患臓器中の微小血管の損傷に関連する。微小血管内皮または肺胞上皮が最初に損傷する。毛細血管の透過性が増加した後に組織化および瘢痕化が起こる。炎症細胞と内皮を損傷する白血球およびサイトカインなどのメディエーターとの相互作用によって毛細血管が欠損し、流動物およびタンパク質が漏出する。
【００４５】
敗血症は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を発症し得る１つの病態である。感染は典型的には局所的であるが、感染は、局所的な感染部位から血流への活性メディエーターの過剰供給を引き起こすほどひどくなり、感染性生物がこの部位から全身感染または敗血症を発症するように拡大し得る。約５０％の敗血症は、主なエフェクター分子がリポ多糖であるグラム陰性菌に起因する。敗血症によって血管透過性が増加し、極端な場合、多臓器不全を引き起こし得る。
【００４６】
自己免疫性脈管炎は、自己免疫応答によって引き起こされる血管の炎症および損傷によって特徴づけられる疾患群である。血管の脈管炎誘導性損傷は、血管透過性の増加、動脈瘤形成または出血を引き起こす血管の脆弱化、ならびに閉塞および局所性虚血を引き起こす血栓症および内膜増殖を引き起こし得る。
【００４７】
本発明はまた、有効量の血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストの投与によるアポトーシス関連障害などの望ましくない血管内皮細胞アポトーシスの治療方法を含む。望ましくないアポトーシスは、移植片拒絶に関連しない。アポトーシスは、最終的に細胞が死滅する一連の慎重に制御された細胞事象である。アポトーシスの形態学的特徴には、細胞萎縮および細胞−細胞接触の喪失、核クロマチンの濃縮およびその後の断片化、細胞膜の波打ち現象、細胞膜の気泡化、ならびにアポトーシス小体が含まれる。
【００４８】
この過程の終了後、隣接細胞およびマクロファージは、アポトーシス細胞由来のフラグメントを貪食する。最適に定義されたアポトーシスの生化学的事象は、核ＤＮＡの規則正しい破壊を含む。アポトーシスのシグナルにより、ヌクレオソーム間のリンカー領域で二本鎖ＤＮＡを切断する特異的カルシウムおよびマグネシウム依存性エンドヌクレアーゼの活性化が促進される。この過程により、約１８０〜約２００塩基対のフラグメントであるＤＮＡフラグメントが産生される。
【００４９】
アポトーシスの調節異常は病状で重要な役割を果たし得るが、疾患は過剰または過少なアポトーシスによって発症し得る。過少なアポトーシスに関連する疾患の例は、一定の癌である。過剰または不適切なアポトーシスに関連するアポトーシス関連疾患の例には、虚血性疾患（再灌流損傷を除く）、末梢血栓症、神経変性疾患、末梢神経損傷、再生不良性貧血、肝臓損傷、およびＨＩＶ感染が含まれる。さらに、内皮アポトーシスは、腫瘍の治療で使用される放射線療法の顕著な特徴である。Ｓ１Ｐ受容体アゴニストは、血管機能を保護するための放射線療法を受ける患者の治療に有用であり得る。
【００５０】
アポトーシスは、心不全における細胞死の主な根本にある原因である。虚血性疾患の例には、特発性心筋症、薬物（例えば、アドリアマイシン）によって誘導される心筋症、慢性アルコール中毒によって誘導される心筋症、家族性心筋症、ウイルス性心筋炎もしくはウイルス性心筋症、心筋梗塞、狭心症、鬱血性心不全、および不整脈などの心疾患ならびに脳卒中、くも膜下出血、脳梗塞、および脳血栓症などの脳血管疾患が含まれる。
【００５１】
アポトーシスはまた、いくつかの神経変性疾患に関連する。このような神経変性疾患の例には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、および色素性網膜炎が含まれる。血管内皮Ｓ１Ｐ受容体アゴニストの使用により、神経損傷を誘導する血管損傷を修復することができる。
【００５２】
本発明は、さらに、血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストの投与による新生血管成長の刺激方法を含む。新生血管形成を、例えば、ウイルス形質導入による所与の組織中のスフィンゴシンキナーゼ−２の発現およびＦＴＹ７２０の経口投与による局所ＦＴＹ７２０−Ｐ産生の誘導によって臓器特異的様式で刺激することができる。このような治療を使用して、血管成長が欠損し得る糖尿病個体の脚を治療することができる。血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストを使用して、この状況において血管成長を刺激することができる。さらに、心臓における新生血管成長の刺激は、心疾患個体の心機能に有利であり得る。例えば、スフィンゴシンキナーゼ−２をウイルス遺伝子療法によって心臓で発現するように誘導し、その後ＦＴＹ７２０を投与して局所的にＦＴＹ７２０−Ｐを産生して心臓における血管形成を誘導することができる。
【００５３】
血管内皮Ｓ１Ｐ受容体アゴニストの投与のための１日投薬量は、例えば、使用したアゴニスト、宿主、投与様式、および治療をうける病態の重症度に依存して変化する。適切な１日投薬量は、一回用量または分割用量として約０．０１〜約１０ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）／日または約０．１〜約２．５ｍｇ／ｋｇ／日である。経口投与に適切な単位投薬形態は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な賦形薬またはキャリアと共に約１〜約１００ｍｇまたは約５〜約５０ｍｇの有効成分（例えば、ＦＴＹ７２０）を含む。別の方法として、アゴニストを遊離形態または薬学的に許容可能な塩形態で投与することができ、例えば、上記の投薬量で１週間に２回または３回投与することもできる。
【００５４】
血管内皮Ｓ１Ｐ受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、血管透過性および血管内皮細胞アポトーシスに関連する障害の治療で使用されるさらなる薬物を含み得る。適切なさらなる薬物には、例えば、細胞傷害薬、化学療法薬、ホルモン、ステロイド系抗炎症薬（例えば、プレドニゾンおよびコルチコステロイドなど）、非ステロイド系抗炎症薬（例えば、ＮＳＡＩＤ、アスピリン、およびアセトアミノフェンなど）、および１つまたは複数の上記のさらなる薬物を含む組み合わせが含まれる。
【００５５】
１つまたは複数の生理学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を使用して、薬学的組成物を処方することができる。したがって、化合物ならびにその生理学的に許容可能な塩および溶媒化合物を、吸入または通気法（口腔または鼻腔のいずれかによる）、または経口、頬側、非経口、もしくは直腸投与による投与のために処方することができる。
【００５６】
経口投与のための薬学的組成は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）；および１つまたは複数の前記賦形剤を含む組み合わせなどの薬学的に許容可能な賦形剤と共に、例えば、当該分野で公知の手段によって調製された錠剤またはカプセルの形態を取ることができる。
【００５７】
当該分野で周知の方法によって、錠剤をコーティングすることができる。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態を取ることができ、さらに、使用前に水または他の適切な賦形剤で構成するための乾燥生成物の形態をとることもできる。このような液体調製物を、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性賦形剤（例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、または分留食用油）；防腐剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）；および１つまたは複数の前記添加剤を含む組み合わせなどの薬学的に許容可能な添加剤を使用した従来の手段によって調製することができる。この調整物はまた、必要に応じて、緩衝塩、香味物質、着色料、および甘味料を含み得る。
【００５８】
経口投与のための調製物を、活性化合物を制御して放出するために適切に処方することができる。頬側投与のために、組成物は、当該分野で公知の技術によって処方された錠剤またはロゼンジの形態を取ることができる。吸入による投与のために、化合物を、適切な高圧ガス（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガス）を使用した圧縮パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で使用する。圧縮エアロゾルの場合、定量を送るためのバルブを設けることによって投薬単位を決定することができる。
【００５９】
例えば、吸入器または注入器で使用するために化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含むゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方することができる。注射（例えば、ボーラス注射または持続注入）による非経口投与のための化合物を処方することができる。注射用処方物は、防腐剤を添加した単位投薬形態（例えば、アンプル）または複数回投与コンテナで用いることができる。組成物は、懸濁液、溶液、または油性もしくは水性賦形剤における乳濁液などの形態を取ることができ、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの処方剤（Fｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ Aｇｅｎｔ）を含み得る。
【００６０】
あるいは、有効成分は、使用前に適切な賦形剤（例えば、滅菌無発熱因子水）で構成するための粉末形態であり得る。例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤の基剤を含む坐剤または保持浣腸剤などの直腸組成物中に化合物を処方することもできる。前記処方物に加えて、化合物を持続性調製物として処方することができる。このような長期作用処方物を、注入（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、化合物を、適切な高分子材料もしくは疎水性材料（例えば、許容可能なオイル中での乳濁液として）またはイオン交換樹脂を使用して処方することができるか、またはやや溶けにくい誘導体（例えば、やや溶けにくい塩）として処方することができる。
【００６１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＦＴＹ７２０がＳＫ２キナーゼによってリン酸化されるので、個体のＳＫ２キナーゼのレベルを測定して、疾患治療における血管内皮Ｓ１Ｐ受容体アゴニストの有効性を予想することができる。例えば、この試験を使用して、所与の個体がＦＴＹ７２０療法の候補であるかどうかを予想することができる。あるいは、個体のＳＫ２キナーゼレベルが低い場合、投与に好ましい化合物は、血管内皮Ｓ１Ｐ受容体アゴニストまたは異なる化学構造を有する別のＳ１Ｐ受容体アゴニストのリン酸化形態物であり得る。
【００６２】
本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに例示する。
[実施例]
【００６３】
一般的方法
試薬。無脂肪酸血清アルブミン（ｆｆａ−ＢＳＡ）、４−デオキシピリドキシン、およびβ−グリセリンリン酸、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−デキストラン（平均分子量２，０００キロダルトン（ｋＤａ）および１６５ｋＤａ）を、シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社から購入した。スフィンゴシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシン（ＤＭＳ）およびＳ１Ｐを、バイオモルリサーチラボラトリズ（Ｂｉｏｍｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）から購入した。{γ−３２Ｐ}ＡＴＰ（比活性６，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および{メチル−３Ｈ}−チミジン（比活性８６ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をアマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社から入手した。ＦＴＹ７２０、ホスホＦＴＹ７２０、（Ｓ）−ＡＡＬ、（Ｒ）−ＡＡＬ、およびホスホ−（Ｒ）−ＡＡＬは、Ｖ．Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ博士から提供を受けた。ホスホ−Ａｋｔ、Ａｋｔ、ホスホ−ＥＲＫｌ／２、およびＥＲＫ−１／２抗体を、セルシグナリングテック（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈ．）社から入手し、ＶＥ−カドヘリン抗体を、サンタクルズバイオテック（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社から入手した。
【００６４】
マウスＳＫ１およびＳＫ２のｃＤＮＡクローニング。マウス肝臓ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、正方向プライマーである配列番号１（ＡＧＣ ＣＣＣ ＡＴＧ ＴＧＧ ＴＧＧ ＴＧＴ ＴＧＴ）および配列番号２（ＡＴＴ ＡＴＧ ＧＣＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＴＡ ＣＴ）ならびに逆方向プライマーである配列番号３（ＧＧＣ ＡＣＡ ＧＡＧ ＴＴＡ ＴＧＧ ＴＴＣ ＴＴＣ）および配列番号４（ＡＧＧ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＴＧ ＴＧＧ ＣＴＴ ＴＴＧ ＡＣ）をそれぞれ使用した逆転写ＰＣＲによってマウススフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ１およびおＳＫ２）のｃＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ３．１でクローン化する。Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびＤＮＡ配列を確認した。次いで、ＳＫ１およびＳＫ２のｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１真核生物発現ベクター（Ｉｎｖiｔｒｏｇｅｎ社製）でクローン化した。
【００６５】
細胞培養およびトランスフェクション。ＨＵＶＥＣ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ｐ４−１１）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびヘパリン安定化内皮細胞成長因子を添加したＭ１９９培地で培養した。６０ｍｍ皿中の２９３Ｔ細胞を、ベクターのみまたはＳＫ構築物を含んだベクター４マイクログラム（μｇ）にて、リン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、４℃で、２５ミリモル（ｍＭ）ヘぺス（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１×プロテアーゼインヒビター混合物４００マイクロリットル（μｌ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を使用した掻き取りによって細胞を回収し、短時間の超音波処理によって破壊した。細胞ホモジネートを、４℃、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。
【００６６】
統計分析。全実験を２〜５回行い、各実験を示す。移動およびアポトーシス実験では、結果を３回の平均値で示す。マイクロソフト社のエクセルソフトウェアを使用したスチューデントｔ検定によってＰ値を計算した。
【実施例１】
【００６７】
実施例１：血管内皮細胞におけるスフィンゴシンキナーゼによるＦＴＹ７２０のリン酸化。Ｓ１Ｐは、内皮細胞走化性の強力な誘導物質であるので、内皮細胞移動に対するＦＴＹ７２０およびその類似化合物の効果を試験した。９６ウェル走化性マイクロチャンバー（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ社製）を使用して、ＨＵＶＥＣ移動を試験した（Ｐａｉｋ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｎｕ ２７６：１１８３０−１１８３７（２００１））。簡単に述べれば、孔径が８マイクロメーター（μｍ）のポリカーボネートフィルターを、５マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）のフィブロネクチンでコーティングした。Ｓ１Ｐ、ＦＴＹ７２０、ＡＡＬ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、または（Ｒ）−ＡＦＤを、０．１％ｆｆａ−ＢＳＡで適切な濃度に希釈した。
【００６８】
８５μｌの上記溶液またはＨＵＶＥＣ由来の馴化培地を、下のチャンバーに添加した。０．１％ウシ血清アルブミンを含むＭ１９９中に懸濁した約５×１０４個の細胞を、上の区画に入れた。細胞を５％ＣＯ２を含む湿室中にて３７℃で４時間移動させた。インキュベーション後、フィルターを除去し、細胞を０．１％クリスタルバイオレットで染色し、９６ウェルプレート中にて１０％酢酸で溶離した。スペクトラマックス３４０（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ３４０）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）プレートリーダーによって５７５ナノメートル（ｎｍ）での吸光度に基づいて定量した。
【００６９】
無添加のＭ１９９培地での細胞の３回の洗浄および異なる濃度のＦＴＹ７２０または（Ｒ）−ＡＡＬを含む０．１％無脂肪酸ＢＳＡとの３時間のインキュベーションによって、内皮細胞によるＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬの活性化を行った。
【００７０】
インキュベーション後、馴化培地を除去し、１，０００×ｇで１０分間遠心分離し、移動アッセイを行った。
【００７１】
図１は、化学誘引物質であるＳ１Ｐ（１００ナノモル（ｎＭ））、種々の濃度のＦＴＹ７２０（ＦＴＹ）およびＡＡＬを使用したＨＵＶＥＣ（白のバー：コントロール、黒のバー：百日咳毒素治療）の移動実験の結果を示す。実験では表示濃度のＦＴＹ７２０（ＦＴＹ）、（Ｒ）−ＡＡＬ、または（Ｓ）−ＡＡＬとの３時間のインキュベーション後の内皮細胞由来の馴化培地を用いた。データ＝３回繰り返した各実験由来の３連の値の平均±ＳＥ（Ｎ＝３）。＊賦形剤コントロールに対してｐ＜０．０１、＃百日咳毒素を含まない細胞に対してｐ＜０．０１。
【００７２】
広範な濃度範囲においてＦＴＹ７２０およびその構造上の類似化合物である（Ｒ）−ＡＡＬによっては、内皮細胞移動は誘導されなかった（図１）。しかし、ＦＴＹ７２０または（Ｒ）−ＡＡＬをＨＵＶＥＣと３時間インキュベートした場合、これらは内皮細胞の強力な化学誘引物質へと活性化された。この馴化培地誘導性移動は、用量依存性且つ百日咳毒素感受性であり、Ｇｉ共役受容体の関与を示す。対照的に、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）によってリン酸化することができないエナンチオマー（Ｓ）−ＡＡＬは、内皮細胞とのインキュベーション後に移動を誘導しなかった。これらのデータは、内皮細胞によってＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬが内皮細胞の化学誘引物質であるリン酸化誘導体へとリン酸化されて活性化するという仮説と一致する。
【００７３】
ＨＵＶＥＣ細胞中のＳＫ１およびＳＫ２転写物の存在を、配列番号ｌ〜４のプライマー（ＳＫ１についてはＴＧＧＡＧＴＡＴＧＡＡＴＧＣＣＣＣＴＡＣ、ＣＧＣＴＡＡＣＣＡＴＣＡＡＴＴＣＣＣＣ、ＳＫ２についてはＧＡＴＣＡＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＡＣ、ＧＧＣＡＴＣＴＴＣＡＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣ）を使用したＲＴ−ＰＣＲによって検出した（データ示さず）。
【００７４】
ＳＫ１およびＳＫ２がＦＴＹ７２０リン酸化に関与する可能性をさらに探索するために、ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬの活性形態物への変換の阻害についてＳＫインヒビターであるＤＭＳを用いて試験した。図２は、Ｓ１Ｐ（１００ｎＭ）または１０μＭ ＤＭＳの非存在下（白色のバー）もしくは存在下（黒色のバー）での１００ｎＭ ＦＴＹ７２０（ＦＴＹ）もしくは１００ｎＭ（Ｒ）−ＡＡＬとの３時間のインキュベーション後の内皮細胞由来の馴化培地を使用した、ＨＵＶＥＣの移動実験の結果を示す。＊賦形剤コントロールに対してｐ＜０．０１。ＤＭＳ処理（１０μＭ）は、ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬを活性化する内皮細胞の能力を強力に阻害した（図２）。これらの結果により、ＨＵＶＥＣ中に存在するＳＫ活性がＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬの両方をリン酸化して活性化させることができることが示唆される。
【実施例２】
【００７５】
実施例２：ＦＴＹ７２０およびＲ−ＡＡＬのリン酸化の確認。ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬが内皮細胞によってリン酸化されることを確認するために、全細胞抽出物およびＨＵＶＥＣ由来の馴化培地を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを行った。細胞を無添加のＭ１９９培地で３回洗浄し、０．１％ｆｆａ−ＢＳＡで表示の時間インキュベートした。インキュベーション後、馴化培地を除去し、１，０００×ｇで１０分間遠心分離し、キナーゼ活性アッセイのために使用した。４℃において、２５ｍＭ ヘペス（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１×プロテアーゼインヒビター混合物４００μｌを使用して細胞を掻き取り、短時間の超音波処理によって破壊した。細胞ホモジネートを、４℃、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。
【００７６】
キナーゼアッセイでは、３００μｌの馴化培地（３時間のインキュベーション後の５×１０５個の細胞由来）または１０μｇのＨＵＶＥＣ由来の全細胞抽出物を、キナーゼ活性の供給源として使用した。反応物は、２０μＭスフィンゴシンまたは１００μＭ ＦＴＹ７２０もしくはＡＡＬ、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（１０μＣｉ）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ ＮａＦ、０．５ｍＭ ４−デオキシピリドキシン、４０ｍＭグリセリンリン酸、および３００μｌのＭ１９９を含んでおり、３７℃で３０分間インキュベートした。脂質を抽出し、サンプルを５０μｌのクロロホルムに再懸濁した。脂質を、１−ブタノール／酢酸／水（６０／２０／２０体積／体積）緩衝液を使用したシリカゲルＧ６０でのＴＬＣによって分離し、ホスホイメージャー（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で定量した。
【００７７】
図３に示すように、ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬは、ＨＵＶＥＣ中に存在するキナーゼ活性によってリン酸化された（図３の上のパネル、比活性はそれぞれ３．８５±０．７５および１５±０．９３ｐｍｏｌ／ｍｇ／分）。予想どおり、スフィンゴシンはこのキナーゼ活性の有効な基質であった（比活性７５．７±６（ピコモル／ミリグラム／分（ｐｍｏｌ／ｍｇ／分））。対照的に、（Ｓ）−ＡＡＬのリン酸化物は検出不可能であり、移動アッセイで得られた結果と一致した。ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬのリン酸化は、ＤＭＳ（５０μＭ）によって阻害された。同様に、キナーゼ活性は、ＨＵＶＥＣ由来の馴化培地で検出され（図３の下のパネル）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０によって阻害され、ＳＫの酵素活性を高める条件であるＫＣｌ（２００ｍＭ）によって増加した（データ示さず）。
【実施例３】
【００７８】
実施例３：ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬのリン酸化におけるＳＫ２の役割の確認。ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬのリン酸化におけるＳＫ２の役割を確認するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＳＫ１またはＳＫ２のｃＤＮＡのいずれかを含むｐｃＤＮＡ３．１／Ｎｅｏ発現ベクターで一過性にトランスフェクトし、ＦＴＹ７２０、（Ｒ）−ＡＡＬ、および（Ｓ）−ＡＡＬのリン酸化についてチェックした。図４に、ベクターコントロール２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ）、ＳＫ１過剰発現２９３Ｔ細胞（ＳＫ１−２９３Ｔ）、およびＳＫ２過剰発現２９３Ｔ細胞（ＳＫ２−２９３Ｔ）由来の抽出物を使用して行ったｉｎ ｖｉｔｒｏでのキナーゼアッセイのＴＬＣ−オートラジオグラフィの結果を示す。
【００７９】
賦形剤コントロール＝（Ｃ）、１００μＭ ＦＴＹ７２０＝（Ｆ）、１００μＭ（Ｒ）−ＡＡＬ＝（Ｒ）、１００μＭ（Ｓ）−ＡＡＬ＝（Ｓ）、または２０μＭスフィンゴシン＝（ＳＧ）を基質として使用する。（＋）を示す場合、５０μＭのＤＭＳを含んでいる。Ｎ＝３〜５の代表的実験を示す。ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔに対するＳＫ１−２９３Ｔ（白色のバー）およびＳＫ２−２９３Ｔ（黒色のバー）の比活性の誘導倍率を、下のパネルに示す。矢印はリン酸化化合物を示す。
【００８０】
ベクターでトランスフェクトした細胞で低レベルの内因性スフィンゴシンキナーゼ活性が検出された（図４）。ＳＫ１細胞抽出物は、コントロール２９３Ｔ細胞と同等のＦＴＹ７２０または（Ｒ）−ＡＡＬキナーゼ活性を示した一方で、ＳＫ１−２９３Ｔ細胞においてはリン酸化したスフィンゴシンが有意に増加した（比活性は、２９３Ｔ細胞の１０．５ｐｍｏｌ／ｍｇ／分に対して４８．１ｐｍｏｌ／ｍｇ／分、図４）。ＳＫ２−２９３Ｔ細胞は、コントロール２９３Ｔ細胞に対してＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬキナーゼ活性が増加した（それぞれ３．７倍および７倍の誘導）。
【００８１】
ＦＴＹ７２０、（Ｒ）−ＡＡＬ、およびスフィンゴシンにおけるＳＫ２−２９３Ｔの比活性は、それぞれ４１．６、１９９．５、および３１９．９ｐｍｏｌ／分／ｍｇであった。２９３Ｔ、ＳＫ１−２９３Ｔ、およびＳＫ２−２９３Ｔ細胞における（Ｓ）−ＡＡＬのリン酸化は辛うじて検出可能であった。ＦＴＹ７２０、（Ｒ）−ＡＡＬ、およびスフィンゴシンキナーゼ活性は、ＤＭＳ（５０μＭ）とのインキュベーションによって阻害された。これらの結果により、ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬのリン酸化、ならびにそれによりこれらの化合物がＳ１Ｐ受容体アゴニストへと活性化する際のＳＫ２の役割が示唆される。さらに、結果は、ＨＵＶＥＣが細胞外培地中に存在するＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬの両方をリン酸化して活性化させることができることを示す。
【実施例４】
【００８２】
実施例４：内皮細胞応答に対するＦＴＹ７２０−Ｐの効果。ＦＴＹ７２０−Ｐおよびその類似化合物である（Ｒ）−ＡＦＤの効果を、ＨＵＶＥＣで研究した。図５では、データ＝３回の平均±ＳＥ。Ｎ＝３。＊ｐ＜０．０１（賦形剤コントロールに対する治療について）、＃ｐ＜０．０１（百日咳毒素を含まない細胞に対して）。ＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤは共にＨＵＶＥＣの強力な化学誘引物質であった（図５）。これらは共に１０ｎＭで最大の効果を示すが（それぞれ、１３倍および９倍の誘導）、Ｓ１Ｐがわずかだがより強力であった（１４倍の誘導）。ＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤ誘導性移動は、百日咳毒素（２００ｎｇ／ｍＬ）によって阻害され、ヘテロ三量体Ｇｉタンパク質経路によって媒介される効果であることを示す。
【００８３】
内皮細胞形態形成（内皮細胞の移動、生存、および接着結合アセンブリを必要とする現象）は、Ｓ１Ｐ１およびＳ１Ｐ３受容体のリガンド依存性の活性化によって媒介される。Ｓ１Ｐは、内皮細胞におけるＡｋｔプロテインキナーゼおよびＥＲＫプロテインキナーゼのリン酸化を誘導することが示され、Ａｋｔが介在するＳ１Ｐ１／ＥＤＧ−１受容体のリン酸化は、Ｓ１Ｐ誘導性移動に必要である。ＨＵＶＥＣにおけるＡｋｔおよびＥＲＫのリン酸化に対するＦＴＹ７２０−Ｐおよびその類似化合物の効果を、ウェスタンブロット分析で研究した。ＨＵＶＥＣ細胞のコンフルエントな培養物を、処理前に０．１％ｆｆａ−ＢＳＡ Ｍ１９９中で２時間血清を枯渇させた。
【００８４】
次いで、これらを１ｍＭフッ化ナトリウムおよび１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを含む氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、放射性免疫沈降アッセイ緩衝液（０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ−４０、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭβ−グリセリンリン酸、および１×プロテアーゼインヒビターカクテル）中でホモジネートした。サンプルを、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ（ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｙｅ試薬）によって上清のタンパク質濃度を決定した。等量のタンパク質を、１０％ポリアクリルアミドゲルにて分離し、ニトロセルロースメンブレンにブロッティングした。ホスホ−Ａｋｔ、Ａｋｔ、ホスホ−ＥＲＫ１／２、またはＥＲＫ−１／２抗体を使用して、免疫ブロット法による分析を行った。
【００８５】
ＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤは、５分後にＡｋｔ（１００ｎＭでそれぞれ３．７倍および４．５倍、図６）およびＥＲＫ−１／２（１００ｎＭでそれぞれ９．３倍および８．２倍、図６）のリン酸化物のレベルを増加へと誘導した。このリン酸化の経時変化は、ＦＴＹ７２０−Ｐ、（Ｒ）−ＡＦＤ、およびＳ１Ｐ間で類似し、５分の刺激後に最大レベルのリン酸化が達成された（データ示さず）。
【００８６】
ＡｋｔおよびＥＲＫのリン酸化に対するＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤの効果は用量依存性であり（データ示さず）、ＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤによって誘導されたリン酸化の程度はＳ１Ｐによって誘導された程度より高かった。しかし、非リン酸化誘導体（ＦＴＹ７２０またはＡＡＬ）は、内皮細胞においてホスホ−Ａｋｔまたはホスホ−ＥＲＫ１／２を誘導しなかった。Ｓ１Ｐ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、および（Ｒ）−ＡＦＤによるＡｋｔ、ＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２のリン酸化は、百日咳毒素とのインキュベーションによって阻害され（図７）、Ｇｉ共役受容体の関与を示す。
【実施例５】
【００８７】
実施例５：アポトーシスに対するＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤの効果。ＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２活性化は、内皮細胞におけるＳ１Ｐの残存効果に必要であり、ＦＴＹ７２０−Ｐおよびその類似化合物である（Ｒ）−ＡＦＤがＨＵＶＥＣにおける血清欠乏によって誘導されたアポトーシスを防止することができるかどうかを試験した。この試験では、ＨＵＶＥＣ細胞を、｛メチル−３Ｈ｝−チミジン（１μＣｉ／ｍｌ）で１６時間標識した。次いで、これらを洗浄し、異なる処理を含む０．１％ｆｆａ−ＢＳＡ Ｍ１９９を添加した。８時間後、記載のように断片化ＤＮＡを可溶化し、定量した。
【００８８】
結果を、図８および９に示す。ＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤは、用量依存的にアポトーシスから細胞を有意に保護し（図８）、非常に低濃度（１０ｎＭ）で最大の効果が得られた（ＤＮＡ断片化の約７０％を阻害）。Ｓ１Ｐを用いた場合、より高い濃度（１μＭ）において同様にＤＮＡのフラグメント化の阻害が認められた。百日咳毒素処理によってＳ１Ｐ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、および（Ｒ）−ＡＦＤの抗アポトーシス効果も阻害され（図９）、Ｇｉを介したシグナル伝達が重要であることが示された。
【実施例６】
【００８９】
実施例６：ＦＴＹ７２０−Ｐはｉｎ ｖｉｔｒｏで接着結合アセンブリおよび血管透過性を調整する。内皮細胞の形態形成および透過性における重要な細胞内構造である接着結合の形成に必要なＶＥ−カドヘリンアセンブリに対するＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤの効果を評価した。カドヘリンは、特定の細胞−細胞接触の形成に関与する細胞接着分子のファミリーである。ＶＥ−カドヘリン（またはカドヘリン−５）は、細胞−細胞接触において細胞内結合（接着結合）に局在していることが示されている。多数の実験観察により、このカドヘリンは、内皮細胞の管状構造へのアセンブリを含んだ新脈管形成に関する血管生物学の種々の態様に関与することが示唆される。
【００９０】
ＶＥ−カドヘリンの局在化に対するＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤの効果を、免疫蛍光検査法を使用して検討した。この研究では、２×１０５個の細胞を、３５ｍｍのガラス底ペトリ皿に入れた。３日後、細胞を洗浄し、処理前に３時間血清を枯渇させた。次いで、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄、固定し、ＶＥ−カドヘリン抗体（１μｇ／ｍｌ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）を使用した免疫蛍光検査法による分析を行った。ローダミンと組み合わせたヤギの抗マウスＩｇＧ（１：１０００、Ｃａｐｐｅｌ社製）を使用して、一次抗体染色を視覚化した。ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）ＬＳＭ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡にて共焦点顕微鏡法を行った。ローダミン蛍光を、５４３ｎｍヘリウム／ネオンレーザーを使用して励起し、放出された蛍光を５３０ｎｍロングパスフィルターを使用して検出した。
【００９１】
ＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤでの３０分間のＨＵＶＥＣの処理により、細胞−細胞接触領域でＶＥ−カドヘリン局在化の増加がみられた（表１０）。この効果は、Ｓ１Ｐで認められた効果に匹敵した。しかし、非リン酸化前駆体であるＦＴＹおよび（Ｒ）−ＡＡＬは接着結合のためのＶＥ−カドヘリン移行へとは誘導しなかった。これらの結果は、ＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤが、内皮細胞中での接着結合アセンブリを誘導するように血管Ｓ１Ｐ受容体に対して作用することを示す。
【００９２】
いくつかの研究は、ＶＥ−カドヘリンが血管透過性の重要な決定要因であり得ることを示した。ＶＥ−カドヘリンのＶＥＧＦ誘導性チロシンリン酸化により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの血管透過性が増加した。さらに、Ｓ１Ｐは、Ｓ１Ｐ１／Ｇｉ／Ｒａｃ依存性プロセスを介してトロンビン誘導性傍細胞透過性を阻害することを示した。細胞系を使用して、血管透過性に対するＳ１Ｐ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、および（Ｒ）−ＡＦＤの効果を評価した。マウス胚内皮細胞（５×１０４）を、トランスウェルポリカーボネートフィルター（直径６．５ｍｍ、孔径０．４μｍ；商標Ｃｏｓｔａｒ）中で２日間培養した。培養培地を、血清／フェノールレッドの入っていないＤＭＥＭ（ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、Ｌ−グルタミン、および塩酸ピリドキシン）（０．１ｍＬは上のチャンバー、０．６ｍＬは下のチャンバー）と置換した。
【００９３】
細胞を、ＦＴＹ７２０、その誘導体、またはＳ１Ｐで１時間、前処理した。ＦＩＴＣ−デキストラン（平均分子量＝２，０００ｋＤａ）を、マウスの組換えＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の非存在下または存在下のいずれかで上の区画に添加した。表示の期間（５〜４５分）後に下のウェル由来の培地を採取した。サンプルを、黒色の硬い底の９６ウェルプレート（商標Ｃｏｓｔａｒ）に入れ、４８８ｎｍ励起でサイトフルオ（ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ（Ｒ））蛍光マルチウェルプレートリーダー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して、蛍光強度を測定した。データ＝２つの値の平均±ＳＥ。Ｎ＝２。＊ｐ＜０．０１（未処理に対するＶＥＧＦ）。
＃ｐ＜０．０１（ＶＥＧＦのみに対する処理＋ＶＥＧＦ）。
【００９４】
傍細胞透過性アッセイの結果を、図１１および１２に示す。ＶＥＧＦを使用しない場合、下の区画の蛍光は時間と共に増加した（図１１）。しかし、細胞をＶＥＧＦで処理した場合、下の区画で蛍光の有意な増加が認められ、Ｓ１Ｐ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、および（Ｒ）−ＡＦＤによって非常に阻害された（図１１、４５分の測定点を示す）。これらの結果は、ＶＥＧＦ誘導性傍細胞透過性がＳ１Ｐ受容体アゴニストであるＳ１Ｐ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、および（Ｒ）−ＡＦＤによって拮抗されることを示す。
【実施例７】
【００９５】
実施例７：ＦＴＹ７２０−Ｐはｉｎ ｖｉｖｏで接着結合アセンブリおよび血管透過性を調整する。血管透過性の調節における血漿由来ＦＴＹ７２０−Ｐまたは（Ｒ）−ＡＦＤの役割をｉｎ ｖｉｖｏで試験した。この可能性を試験するために、ＦＴＹ７２０、（Ｒ）−ＡＦＤ、または（Ｓ）−ＡＡＬ前処理マウスでｉｎ ｖｉｖｏ血管透過モデルを使用した。正常なＦＶＢ／Ｎ雌または雄マウスを、ＦＴＹ７２０（５０μｇ）、Ｓ−ＡＡＬエナンチオマー（５０μｇ）、Ｒ−ＡＡＬエナンチオマー（５０μｇ）、および賦形剤コントロールとしての水を用いての強制栄養法によって処置した。５時間の強制栄養法による処理後、動物を２％Ａｖｅｒｔｉｎ（商標）（０．５ｃｃ／２０ｇ）で麻酔し、尾静脈を介して１００μｌのＦＩＴＣ−デキストラン（５ｍｇ／ｍｌ、１６５ｋＤａ）を注入した。動物を、蛍光解剖顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＳＴＶ１１型，Ｚｅｉｓｓ社製）下の加温テーブルにのせ、耳の中心血管を画像化した。コントロール生理食塩水またはマウス血管内皮成長因子（ｍＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ）を、３０ゲージのニードル（３０μｌ）を使用して中耳に皮下注射した。次いで、耳の脈管構造を、注射から５分〜１２０分後に特定の暴露回数で定位置で画像化した。次いで、イメージプロプラス（ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓ）（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製）においてピクセルベースの閾値を使用して蛍光画像を定量した。
【００９６】
結果を図１３および１４に示す。分析５時間前にマウスに対し一回経口投与した前処置により、ＦＴＹ７２０がＶＥＧＦによって誘導された血管透過性を非常に抑制することが示された（図１３および１４）。（Ｒ）−ＡＡＬもｉｎ ｖｉｖｏでの血管透過性を強く阻害するが、（Ｓ）−ＡＡＬではそうではない。これらのデータにより、ｉｎ ｖｉｖｏでのスフィンゴシンキナーゼによるＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬのリン酸化および内皮細胞上でのＳ１Ｐ受容体の活性化によりＶＥＧＦ誘導性血管透過性が阻害されることが示唆される。
【００９７】
血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストは、血管透過性、アポトーシス、および血管形成に対して効果を有することが示された。特に、ＦＴＹ７２０およびその類似化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏでリン酸化されて（例えば、ＦＴＹ７２０−Ｐ）血管内皮Ｓ１Ｐ受容体に結合できることが示された。血管内皮Ｓ１Ｐ受容体アゴニストを、血管透過性障害、過剰な血管内皮アポトーシスに関連する障害の治療および新生血管を成長させるために使用することができる。
【００９８】
全ての引用した特許、特許出願、および他の引用文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００９９】
本発明は好ましい実施形態を参照して記載されているが、本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更を行うことができ、その要素を等価物と置換することができると当業者は理解している。さらに、その本質的な範囲を逸脱することなく本発明の教示に特定の状況または材料を適合させるために多数の修正形態を得ることができる。したがって、本発明は本発明の実施のための最良の形態として開示した特定の実施形態に制限されないが、本発明は添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる全ての実施形態が含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】細胞インキュベーションを行うか行わずにＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬに晒したＨＵＶＥＣについての細胞移動試験の結果を示すグラフである。
【図２】ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬを活性化する内皮細胞の能力がスフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）インヒビターであるジメチルスフィンゴシン（ＤＭＳ）によって阻害されることを証明した細胞移動アッセイの結果を示すグラフである。
【図３】馴化培地（ＣＭ）およびＨＵＶＥＣ由来の全細胞抽出物（ＴＣＥ）を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）−オートラジオグラフィの結果である。
【図４】ベクターコントロール２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ）、ＳＫＩ過剰発現２９３Ｔ細胞（ＳＫ１−２９３Ｔ）、およびＳＫ２過剰発現２９３Ｔ細胞（ＳＫ２−２９３Ｔ）由来の抽出物を使用して行ったｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイのＴＬＣ−オートラジオグラフィの結果である。ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に対するＳＫ１−２９３Ｔ（白色のバー）およびＳＫ２−２９３Ｔ（黒色のバー）の比活性誘導の倍率を下のパネルに示す。
【図５】表示濃度でＳ１Ｐ（１００ｎＭ）、ＦＴＹ７２０−Ｐ（ＦＴＹ−Ｐ）、または（Ｒ）−ＡＦＤ（（Ｒ）−ＡＡＬのリン酸化形態）を使用した、ＨＵＶＥＣ（白色のバー：コントロール、黒色のバー：百日咳毒素処理）の移動実験の結果を示す図である。
【図６】表示濃度におけるＳＩＰ、ＦＴＹ７２０−Ｐ（ＦＴＹ−Ｐ）、ＦＴＹ７２０（ＦＴＹ）、（Ｒ）−ＡＦＤ、または（Ｒ）−ＡＡＬで５分間刺激を与えた後の、ＨＵＶＥＣ中のホスホ−Ａｋｔ、総Ａｋｔ、ホスホ−ＥＲＫ−１／２、および総ＥＲＫ−１／２のウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図７】百日咳毒素処理がＳ１Ｐ、ＦＴＹ７２０−Ｐ（ＦＴＹ−Ｐ）、および（Ｒ）−ＡＦＤによるＡｋｔおよびＥＲＫ−１／２のリン酸化を阻害することを示すウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図８】ＨＵＶＥＣ細胞における{メチル−３Ｈ}−チミジン組み込み後のＤＮＡ断片化率の測定によるアポトーシスに対するＦＴＹ７２０−Ｐの効果についての結果を示す図である。
【図９】百日咳毒素処理によってアポトーシスに対するＳＩＰ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、および（Ｒ）−ＡＦＤの防御効果を阻害することを示すＤＮＡ断片のアッセイの結果を示す図である。
【図１０】Ｃ：賦形剤コントロール、Ｓ１Ｐ：１００ｎＭ Ｓ１Ｐ、ＦＴＹ：１０ｎＭ ＦＴＹ７２０、ＦＴＹ７２０−Ｐ：１０ｎＭ ＦＴＹ７２０−Ｐ、ＡＡＬ：１０ｎＭ（Ｒ）−ＡＡＬ、ＡＦＤ：１０ｎＭ（Ｒ）−ＡＦＤである免疫蛍光検査法の結果を示す図である。スケールバー＝５０μｍ。
【図１１】ＶＥＧＦ誘導性傍細胞透過性の経時変化を示すグラフである：ＶＥＧＦ：２０ｎｇ／ｍＬ、ＦＴＹ７２０−Ｐ：１００ｎＭ ＦＴＹ７２０−Ｐ。
【図１２】１００ｎＭ Ｓ１Ｐ（Ｓ１Ｐ）、１００ｎＭ ＦＴＹ７２０−Ｐ（ＦＴＹ−Ｐ）、および１００ｎＭ（Ｒ）−ＡＦＤ（（Ｒ）−ＡＦＤ）がＶＥＧＦ誘導性傍細胞透過性を阻害することを示すグラフである。
【図１３】マウスの耳微小血管透過性のアッセイ結果である蛍光画像を示す図である。
【図１４】耳の血管外蛍光の定量結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管透過障害の治療薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用、望ましくない血管内皮細胞アポトーシスの治療薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用、及び哺乳動物における新生血管形成の刺激薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用に関する。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載）合衆国政府は、国立衛生研究所によって支払われた助成金番号ＨＬ６７３３０およびＨＬ７０６９４によって本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
新生血管の形成プロセスを血管形成という。血管形成時に、血管内皮細胞は、順番に、増殖、移動、および形態形成を受けて新規の毛細血管網を形成する。正常または非病的状態下で、虚血に応答した創傷治癒などの十分に定義された病態下ならびに胚および胎児の発達時に血管形成が生じる。しかし、持続的または制御できない血管形成によって種々の病状または病態を引き起こし、固形腫瘍の場合には、病状が持続する病態であり得る。
【０００４】
多数の細胞外および細胞内シグナル伝達分子は、細胞受容体と相互作用して血管系（血管形成に関連する過程が含まれる）における影響を調節する。スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）は、原形質膜局在Ｇタンパク質共役受容体の内皮細胞分化遺伝子ファミリー（Ｓ１Ｐｎ受容体としても公知のＥＤＧ）のメンバーとの相互作用を介した広範な種々の細胞応答を媒介する生物活性スフィンゴ脂質である。
【０００５】
今日まで、このファミリーの５つのメンバー（Ｓ１Ｐ１／ＥＤＧ−１、Ｓ１Ｐ２／ＥＤＧ−５、Ｓ１Ｐ３／ＥＤＧ−３、Ｓ１Ｐ４／ＥＤＧ−６、およびＳ１Ｐ５／ＥＤＧ−８）が異なる細胞型のＳ１Ｐ受容体として同定されている。特に、Ｓ１Ｐ１受容体およびＳ１Ｐ３受容体とのＳ１Ｐ相互作用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの内皮細胞の生存および形態形成で重要な役割を果たすことが証明されており、Ｓ１Ｐ１はｉｎ ｖｉｖｏでの血管成熟に必要である。しかし、Ｓ１Ｐは、免疫系および生殖系などの他の臓器系に対しても高い効果を発揮し、多機能脂質メディエーターであることが示されている。
【０００６】
Ｓ１Ｐおよびその受容体は、脈管構造の調節に関与する。したがって、特に血管系の疾患の治療でＳ１Ｐ受容体を維持することが望ましい。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
有効量の血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストを哺乳動物に投与する工程と、前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、血管透過障害の治療を可能とする哺乳動物の治療方法。
【０００８】
また、別の態様として、有効量の血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストを哺乳動物に投与する工程と、前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、望ましくない血管内皮細胞アポトーシスが移植片拒絶に関連しないこととを含む、望ましくない血管内皮細胞アポトーシスの治療を必要とする哺乳動物の治療方法。
【０００９】
さらに、別の態様として、有効量の血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストを哺乳動物中の部位に投与する工程と、前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、哺乳動物の新生血管を刺激する方法。
【００１０】
本発明の１つの実施形態として、血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、血管透過障害の治療薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用を開示する。
【００１１】
別の実施形態として、血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、望ましくない血管内皮細胞アポトーシスが移植片拒絶に関連しない、望ましくない血管内皮細胞アポトーシスの治療薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用を開示する。
【００１２】
さらに別の実施形態として、血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、哺乳動物における新生血管形成の刺激薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用を開示する。
図面の簡単な説明
【００１３】
図面の簡単な説明については後述する。
【００１４】
発明の詳細な説明
本明細書中で参考として援用される米国特許第６，４８６，２０９号；同第６，４７６，００４号；同第６，４７１，９８０号；同第６，３７２，８００号；同第６，２７４，６２９号；同第６，１８７，８２１号；同第６，００４，５６５号；および同第５，９４８，８２０号に示されるように、ＦＴＹ７２０は、臓器移植の動物モデルでの効果が示された強力な免疫調製薬である。この化合物の作用機構は、Ｔリンパ球中で５つのＳ１Ｐ受容体のうちの４つのアゴニストであるＦＴＹ７２０−Ｐへのリン酸化を含むことが最近示された。ＦＴＹ７２０はリンパ球輸送の強力なモジュレーターであることが以前に示されているが、血管要素に対するＦＴＹ７２０の効果は以前には知られていなかった。
【００１５】
血管内皮細胞がＦＴＹ７２０およびその類似化合物を「活性化する」ための酵素系を含むことを本明細書中で証明する。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）などの培養内皮細胞は、血管形成の研究のための許容されたｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系である。ＨＵＶＥＣ馴化培地または細胞抽出物とのインキュベーションの際、ＦＴＹ７２０はリン酸化され、百日咳毒素感受性様式で移動するために内皮細胞を活性化することができ、これによりＧｉ共役Ｓ１Ｐ受容体を活性化することが示唆される。内皮細胞由来のスフィンゴシンキナーゼ−２（ＳＫ２）がＦＴＹ７２０のＦＴＹ７２０−Ｐへの代謝に関与することを本明細書中に示す。
【００１６】
ＦＴＹ７２０−Ｐおよびその類似化合物である（Ｒ）−ＡＦＤが血管Ｓ１Ｐ受容体を活性化してＳ１Ｐと類似の様式でシグナル伝達経路を刺激することも本明細書中に示す。これらの事象によって内皮細胞アポトーシスが阻害され、血管系がストレスを受ける種々の生理的状態が生じる。Ｓ１Ｐ受容体アゴニストの別の生理学的に関連する効果は、内皮細胞における接着結合アセンブリの誘導である。ＳＩＰ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、および（Ｒ）−ＡＦＤ刺激後にＶＥ−カドヘリン転位置が誘導されることも示す。細胞−細胞接合部分子は、血管透過性を調節するメディエーターの重要な標的である。
【００１７】
ＳＩＰ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、および（Ｒ）−ＡＦＤは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＶＥＧＦ誘導性傍細胞透過性およびｉｎ ｖｉｖｏでのＶＥＧＦ誘導性血管透過性を阻害することができる。ＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤによる内皮細胞における接着結合アセンブリの誘導は、ｉｎ ｖｉｖｏでの２つの重要な応用を有し得る。
【００１８】
一方では、ＦＴＹ７２０の作用機構の一部であり得る。ＦＴＹ７２０は、血脈洞を裏打ちする内皮での細胞−細胞接合部の調節によってリンパ球のリンパ洞への放出（ｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を防止することができる。実際、ＦＴＹ７２０−Ｐは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮細胞単層を介してＴリンパ球のケモカイン誘導性移動を阻害する。他方では、ＦＴＹ７２０は、敗血症の合併症として発症する呼吸窮迫症候群などの急性血管疾患的状況における血管透過性を阻害することができる。さらに、血管透過性の長期的変化は、内皮細胞損傷の顕著な特徴であり、糖尿病に関連する虚血性心血管疾患および末梢血管障害に共通の慢性疾患を発症し得る。ＦＴＹ７２０−Ｐは、血管系の強力な調節薬であり、影響を及ぼされる状況での内皮細胞の健全性のための保護物質として使用することができる。
【００１９】
したがって、本発明は、血管透過性障害の治療が必要な哺乳動物の治療方法、血管内皮細胞アポトーシスの阻害方法、および新生血管形成の刺激方法に関する。本方法は、有効量のＳ１Ｐ以外の血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストを哺乳動物に投与する工程を含む。血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストまたはその薬学的に許容可能な形態物を、血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストに応答する疾患、障害、または病態の治療薬の製造のために使用することができる。
【００２０】
適切な血管内皮Ｓ１Ｐ受容体には、例えば、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４、Ｓ１Ｐ５、および１つまたは複数の前記受容体を含む組み合わせが含まれる。１つの実施形態では、Ｓ１Ｐ受容体には、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ３、およびその組み合わせが含まれる。血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストは、薬学的に許容可能な塩であってよく、そして／またはスフィンゴシン−キナーゼ２酵素によってリン酸化されたものでもよい。
【００２１】
血管内皮Ｓ１Ｐ受容体の適切なアゴニストには、例えば、１，２アミノアルコール、その薬学的に許容可能な塩、そのリン酸化形態物、および１つまたは複数の前記アゴニストを含む組み合わせが含まれる。
【００２２】
本明細書中に記載の血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストの「薬学的に許容可能な形態物」には、このような化合物の薬学的に許容可能な塩、水和物、溶媒化合物、結晶形態、多形体、キレート、非共有結合性複合体、エステル、包接体、プロドラッグ、および混合物が含まれる。薬学的に許容可能な塩は、薬学的に適切である許容可能な形態物である。
【００２３】
「薬学的に許容可能な塩」には、元の化合物を非毒性の酸性塩または塩基性塩に修飾した血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストの誘導体が含まれ、さらに、このような化合物およびこのような塩の薬学的に許容可能な溶媒化合物をも含まれる。薬学的に許容可能な塩の例には、アミンなどの塩基性残基の無機酸塩または有機酸塩およびカルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
薬学的に許容可能な塩には、例えば、非毒性有機酸または無機酸から形成された元の化合物の通常の非毒性塩および四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、通常の非毒性酸の塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸由来の塩；ならびに酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、メシル酸、エシル酸、ベシル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、ＨＯＯＣ−ｎ−ＣＯＯＨ（式中、ｎは０〜４である）などの有機酸から調製した塩が含まれる。薬学的に許容可能な塩を、従来の化学的方法によって元の化合物（塩基性または酸性部分）から合成することができる。
【００２５】
一般に、このような塩を、これらの化合物の遊離酸形態物と適切な塩基（Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ，またはＫの水酸化物、炭酸塩、または重炭酸塩など）の化学量論量との反応、またはこれらの化合物の遊離塩基形態物と適切な酸の化学量論量との反応によって調製することができる。典型的には、このような反応を水中、有機溶媒中、または前記２つの混合物中で行う。一般に、差し支えなければ、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性溶媒が好ましい。さらなる適切な塩のリストを、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｐ．１４１８（１９８５）で見出すことができる。
【００２６】
適切な１，２−アミノアルコールは、式：
【化１】
（Ｒ１は、任意選択的に置換されまたは置換されていないフェニレンまたはフェノキシによって分断されうる、１２〜２２個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の炭素鎖で置換されまたは置換されていないものであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立して水素またはＣ１〜６アルキルであり；ｎは０または１である）を有する。１つの実施形態としては、式Ｉの化合物は、Ｒ１が任意選択的にニトロ、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、またはカルボン酸で置換された１３〜２０個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖のアルキルである化合物、より好ましくは、Ｒ１は、フェニルが、任意選択的にハロゲンに置換された直鎖または分岐鎖のＣ６〜１４アルキル鎖またはＣ６〜１４アルコキシ鎖に置換され、アルキル部分が任意選択的にヒドロキシに置換されたＣ１〜６アルキルとなっている、（フェニル）アルキル−の化合物である。
【００２７】
１つの実施形態としては、Ｒ１は、フェニルの水素を直鎖または分岐鎖のＣ６〜１４アルキル鎖またはＣ６〜１４アルコキシ鎖で置換した（フェニル）Ｃ１〜６アルキルである。Ｃ６〜１４アルキル鎖は、オルト位、メタ位、またはパラ位であり得る。１つの実施形態としては、Ｒ２〜Ｒ５はそれぞれ水素である。
【００２８】
本明細書中で使用される、「任意選択的に分断される」は、アルキル鎖内の任意の位置でアルキル鎖を差し挟むことができることを意味する。例えば、式２を参照のこと。２つの文字または記号の間にないダッシュ（「−」）を使用して、置換のための結合点を示す。例えば、（フェニル）アルキル−は、アルキル基の炭素原子を介して結合している。
【００２９】
本明細書中で使用される、「アルキル」は、特定の数の炭素原子を有する分岐鎖および直鎖両方の飽和脂肪族炭化水素基を含むことが意図される。したがって、本明細書中で使用される、用語「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」には、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基が含まれる。本明細書中で別の基と組み合わせてＣ０〜Ｃｎアルキルを使用する場合（例えば、（フェニル）Ｃ０〜Ｃ４アルキル）、示した基（この場合、フェニル）は、単結合によって直接結合しているか（Ｃ０）、特定の炭素原子数（この場合、１〜約４個の炭素原子）を有するアルキル鎖を介して結合している。
【００３０】
アルキルの例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、およびｓｅｃ−ペンチルが含まれるが、これらに限定されない。好ましいアルキル基は、低級アルキル基（１〜約８個の炭素原子を有するアルキル基）（例えば、Ｃ１〜Ｃ８およびＣ１〜Ｃ６アルキル基）である。
【００３１】
１，２−アミノアルコール誘導体は、１つまたは複数のキラル中心を有し得る。結果として、例えば、とりわけ、キラル出発材料、触媒、または溶媒によって１つの光学異性体（ジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む）を選択的に調製することができるか、またはジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む両方の光学異性体または両方の立体異性体を同時に調製することができる（ラセミ混合物）。化合物はラセミ混合物として存在し得るので、ジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む光学異性体または立体異性体の混合物を、公知の方法（例えば、キラル塩およびキラルクロマトグラフィなどの使用）を使用して分離することができる。
【００３２】
さらに、ジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む１つの光学異性体または立体異性体は、他の異性体よりも好ましい性質を有し得る。本明細書中でラセミ混合物という場合、ジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む光学異性体または実質的に他の異性体を含まない１つの立体異性体が含まれる。
【００３３】
式１の適切な化合物には、ＦＴＹ７２０（式ＩＩ）としても公知の２−アミノ−２−［２−（４−オクタフェニル）エチル］プロパン−１，３ジオールおよびＡＡＬまたは２−アミノ−２−メチル−４−［４−ヘプトキシ−フェニル］ブタン−ｌ−オールとしても公知のヒドロキシメチレン基がメチル基に置換されたＦＴＹ７２０の誘導体、（式ＩＩＩ）が含まれる。
【化２】
【化３】
【００３４】
ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＦＴＹ−７２０およびＡＡＬが、例えば、ＳＫ２キナーゼなどの内因性キナーゼによってリン酸化され、式（ＩＶ）の化合物（ＦＴＹ７２０−Ｐ、すなわち２−アミノ−３−ホスフェート−２−［２−（４−オクタフェニル）エチル］プロパン−１−オール）および（Ｖ）（（Ｒ）−ＡＦＤ、すなわち２−アミノ−２−メチル−４−［４−ヘプトキシ−フェニル］１−二リン酸）を生成することができる。
【化４】
【化５】
【００３５】
血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストは、２−アミノ−２−［２−（４−オクタフェニル）エチル］プロパン−１，３ジオール、２−アミノ−２−メチル−４−［４−ヘプトキシ−フェニル］ブタン−ｌ−オール、２−アミノ−３−ホスフェート−２−［２−（４−オクタフェニル）エチル］プロパン−１−オール、２−アミノ−２−メチル−４−［４−ヘプトキシ−フェニル］１−二リン酸、または１つ若しくは複数の前記アゴニストを含む組み合わせであり得る。
【００３６】
血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストを、血管透過障害の治療有効量で哺乳動物に投与することができる。このような障害には、例えば、内皮損傷、血小板減少症、アテローム性動脈硬化症、虚血性心血管疾患、虚血性末梢血管疾患、糖尿病に関連する末梢血管障害、デング出血熱、成人（急性）呼吸窮迫症候群、血管漏出症候群、敗血症、自己免疫性脈管炎、および１つまたは複数の前記障害を含む組み合わせが含まれる。
【００３７】
内皮損傷は、高血圧、ストレス誘導性ホルモン、化学的毒素、汚染物質、コレステロール、感染因子（例えば、クラミジア・ニューモニエ、ヘリコバクター・ピロリ、ヘルペスウイルス、カンジダ・アルビカンス）、ホモシステイン、および種々の疾患に起因する。内皮損傷に関する病態には、アテローム性動脈硬化症および血管腫が含まれ得る。アテローム性動脈硬化症は、内皮下腔中の脂質沈着と関連する。局所的に高まった血管内皮透過性によって脂質が蓄積され得る。アテロームは、アテローム性動脈硬化病変の中心の壊死塊である。血管腫は、拡張した血管からなる良性腫瘍である。
【００３８】
血小板減少症は、血小板（血球の１つ）数が異常に低下する障害であり、しばしば異常出血に関連する。成人性特発性血小板減少性紫斑症（ＩＴＰ）は、通常、構造血小板抗原に対する抗体の発生に起因する（自己抗体）。ＩＴＰに類似の血小板減少症を発症する障害には、膠原血管病（例えば、ＳＬＥ）またはリンパ増殖性疾患の他に免疫血小板減少症がある。ヘパリン誘導性血小板減少症は、血小板表面膜上でのＦｃ受容体へのヘパリン−抗体複合体の結合に起因する。血小板減少症では、内皮損傷、血管透過性の増大、および組織浮腫が一般的な症状である。
【００３９】
虚血性心疾患は、血液供給が無いか欠乏しているために心筋が損傷するか、または不十分にしか作用しないことで生じる病態である。これはアテローム性動脈硬化症によって最も頻繁に起こり、狭心症、急性心筋梗塞、慢性虚血精神疾患、および突然死をきたす。冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）とも呼ばれる。
【００４０】
いくつかの血管透過性障害は、真性糖尿病に関連し、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性毛細血管症、糖尿病性大血管症、および閉塞性血管障害をきたす。
【００４１】
デング出血熱は、抗原性は異なるが４つの密接に関連するフラビウイルス族のウイルス血清型（ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３、およびＤＥＮ−４）のうちの１つに起因する。これらの血清型のうちの１つでの感染によっては交差防御免疫が得られないので、個体は生涯４つのデング感染症を有し得る。デング熱は熱帯地方の疾患であり、原因となるウイルスの生活環は、ヒト、ネッタイシマカ、家畜、ヒトを餌にする日中に刺す蚊を含む。
【００４２】
デング出血熱／デングショック症候群（ＤＨＦ／ＤＳＳ）で認められる主な病態生理学的異常は、血管透過性の急性の増加である。デング熱は、突発的な高熱、悪寒、頭痛、発疹、出血の徴候、味覚の変化、喉の痛み、吐気、嘔吐、下痢、および激しい筋肉痛および関節痛によって特徴づけられる。極端な場合、デングショックにより、血漿が漏出し、その後血漿の喪失が危機的である場合には、血液量減少性ショックを引き起こす。
【００４３】
全身性血管漏出症候群は、１０％〜７０％の血漿の突発的な一過性血管外遊出に起因する低血圧および血液濃縮の同時発作によって特徴づけられる障害である。臨床的には、この症候群は、低血圧、血液濃縮、低アルブミン血症を示す。休止期間中、毛細血管透過性は正常である。発作の間のみ血管外遊出が起こる。この漏出の病態生理学的性質は不可解なままである。古典的経路における補体の活性化、５−リポキシゲナーゼの持続的な外来的刺激、インターロイキン−２の役割が、考えられる原因として示唆されている。
【００４４】
成人（急性）呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）は、しばしば他の臓器の機能不全に関連する肺の進行性機能不全（特に、酸素を取り込む能力の不全）の急速な発症である。病態は、広範な肺炎および罹患臓器中の微小血管の損傷に関連する。微小血管内皮または肺胞上皮が最初に損傷する。毛細血管の透過性が増加した後に組織化および瘢痕化が起こる。炎症細胞と内皮を損傷する白血球およびサイトカインなどのメディエーターとの相互作用によって毛細血管が欠損し、流動物およびタンパク質が漏出する。
【００４５】
敗血症は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を発症し得る１つの病態である。感染は典型的には局所的であるが、感染は、局所的な感染部位から血流への活性メディエーターの過剰供給を引き起こすほどひどくなり、感染性生物がこの部位から全身感染または敗血症を発症するように拡大し得る。約５０％の敗血症は、主なエフェクター分子がリポ多糖であるグラム陰性菌に起因する。敗血症によって血管透過性が増加し、極端な場合、多臓器不全を引き起こし得る。
【００４６】
自己免疫性脈管炎は、自己免疫応答によって引き起こされる血管の炎症および損傷によって特徴づけられる疾患群である。血管の脈管炎誘導性損傷は、血管透過性の増加、動脈瘤形成または出血を引き起こす血管の脆弱化、ならびに閉塞および局所性虚血を引き起こす血栓症および内膜増殖を引き起こし得る。
【００４７】
本発明はまた、有効量の血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストの投与によるアポトーシス関連障害などの望ましくない血管内皮細胞アポトーシスの治療方法を含む。望ましくないアポトーシスは、移植片拒絶に関連しない。アポトーシスは、最終的に細胞が死滅する一連の慎重に制御された細胞事象である。アポトーシスの形態学的特徴には、細胞萎縮および細胞−細胞接触の喪失、核クロマチンの濃縮およびその後の断片化、細胞膜の波打ち現象、細胞膜の気泡化、ならびにアポトーシス小体が含まれる。
【００４８】
この過程の終了後、隣接細胞およびマクロファージは、アポトーシス細胞由来のフラグメントを貪食する。最適に定義されたアポトーシスの生化学的事象は、核ＤＮＡの規則正しい破壊を含む。アポトーシスのシグナルにより、ヌクレオソーム間のリンカー領域で二本鎖ＤＮＡを切断する特異的カルシウムおよびマグネシウム依存性エンドヌクレアーゼの活性化が促進される。この過程により、約１８０〜約２００塩基対のフラグメントであるＤＮＡフラグメントが産生される。
【００４９】
アポトーシスの調節異常は病状で重要な役割を果たし得るが、疾患は過剰または過少なアポトーシスによって発症し得る。過少なアポトーシスに関連する疾患の例は、一定の癌である。過剰または不適切なアポトーシスに関連するアポトーシス関連疾患の例には、虚血性疾患（再灌流損傷を除く）、末梢血栓症、神経変性疾患、末梢神経損傷、再生不良性貧血、肝臓損傷、およびＨＩＶ感染が含まれる。さらに、内皮アポトーシスは、腫瘍の治療で使用される放射線療法の顕著な特徴である。Ｓ１Ｐ受容体アゴニストは、血管機能を保護するための放射線療法を受ける患者の治療に有用であり得る。
【００５０】
アポトーシスは、心不全における細胞死の主な根本にある原因である。虚血性疾患の例には、特発性心筋症、薬物（例えば、アドリアマイシン）によって誘導される心筋症、慢性アルコール中毒によって誘導される心筋症、家族性心筋症、ウイルス性心筋炎もしくはウイルス性心筋症、心筋梗塞、狭心症、鬱血性心不全、および不整脈などの心疾患ならびに脳卒中、くも膜下出血、脳梗塞、および脳血栓症などの脳血管疾患が含まれる。
【００５１】
アポトーシスはまた、いくつかの神経変性疾患に関連する。このような神経変性疾患の例には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、および色素性網膜炎が含まれる。血管内皮Ｓ１Ｐ受容体アゴニストの使用により、神経損傷を誘導する血管損傷を修復することができる。
【００５２】
本発明は、さらに、血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストの投与による新生血管成長の刺激方法を含む。新生血管形成を、例えば、ウイルス形質導入による所与の組織中のスフィンゴシンキナーゼ−２の発現およびＦＴＹ７２０の経口投与による局所ＦＴＹ７２０−Ｐ産生の誘導によって臓器特異的様式で刺激することができる。このような治療を使用して、血管成長が欠損し得る糖尿病個体の脚を治療することができる。血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストを使用して、この状況において血管成長を刺激することができる。さらに、心臓における新生血管成長の刺激は、心疾患個体の心機能に有利であり得る。例えば、スフィンゴシンキナーゼ−２をウイルス遺伝子療法によって心臓で発現するように誘導し、その後ＦＴＹ７２０を投与して局所的にＦＴＹ７２０−Ｐを産生して心臓における血管形成を誘導することができる。
【００５３】
血管内皮Ｓ１Ｐ受容体アゴニストの投与のための１日投薬量は、例えば、使用したアゴニスト、宿主、投与様式、および治療をうける病態の重症度に依存して変化する。適切な１日投薬量は、一回用量または分割用量として約０．０１〜約１０ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）／日または約０．１〜約２．５ｍｇ／ｋｇ／日である。経口投与に適切な単位投薬形態は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な賦形薬またはキャリアと共に約１〜約１００ｍｇまたは約５〜約５０ｍｇの有効成分（例えば、ＦＴＹ７２０）を含む。別の方法として、アゴニストを遊離形態または薬学的に許容可能な塩形態で投与することができ、例えば、上記の投薬量で１週間に２回または３回投与することもできる。
【００５４】
血管内皮Ｓ１Ｐ受容体アゴニストを含む薬学的組成物は、血管透過性および血管内皮細胞アポトーシスに関連する障害の治療で使用されるさらなる薬物を含み得る。適切なさらなる薬物には、例えば、細胞傷害薬、化学療法薬、ホルモン、ステロイド系抗炎症薬（例えば、プレドニゾンおよびコルチコステロイドなど）、非ステロイド系抗炎症薬（例えば、ＮＳＡＩＤ、アスピリン、およびアセトアミノフェンなど）、および１つまたは複数の上記のさらなる薬物を含む組み合わせが含まれる。
【００５５】
１つまたは複数の生理学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を使用して、薬学的組成物を処方することができる。したがって、化合物ならびにその生理学的に許容可能な塩および溶媒化合物を、吸入または通気法（口腔または鼻腔のいずれかによる）、または経口、頬側、非経口、もしくは直腸投与による投与のために処方することができる。
【００５６】
経口投与のための薬学的組成は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）；および１つまたは複数の前記賦形剤を含む組み合わせなどの薬学的に許容可能な賦形剤と共に、例えば、当該分野で公知の手段によって調製された錠剤またはカプセルの形態を取ることができる。
【００５７】
当該分野で周知の方法によって、錠剤をコーティングすることができる。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、または懸濁液の形態を取ることができ、さらに、使用前に水または他の適切な賦形剤で構成するための乾燥生成物の形態をとることもできる。このような液体調製物を、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性賦形剤（例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、または分留食用油）；防腐剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）；および１つまたは複数の前記添加剤を含む組み合わせなどの薬学的に許容可能な添加剤を使用した従来の手段によって調製することができる。この調整物はまた、必要に応じて、緩衝塩、香味物質、着色料、および甘味料を含み得る。
【００５８】
経口投与のための調製物を、活性化合物を制御して放出するために適切に処方することができる。頬側投与のために、組成物は、当該分野で公知の技術によって処方された錠剤またはロゼンジの形態を取ることができる。吸入による投与のために、化合物を、適切な高圧ガス（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガス）を使用した圧縮パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で使用する。圧縮エアロゾルの場合、定量を送るためのバルブを設けることによって投薬単位を決定することができる。
【００５９】
例えば、吸入器または注入器で使用するために化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含むゼラチンのカプセルおよびカートリッジを処方することができる。注射（例えば、ボーラス注射または持続注入）による非経口投与のための化合物を処方することができる。注射用処方物は、防腐剤を添加した単位投薬形態（例えば、アンプル）または複数回投与コンテナで用いることができる。組成物は、懸濁液、溶液、または油性もしくは水性賦形剤における乳濁液などの形態を取ることができ、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの処方剤（Fｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ Aｇｅｎｔ）を含み得る。
【００６０】
あるいは、有効成分は、使用前に適切な賦形剤（例えば、滅菌無発熱因子水）で構成するための粉末形態であり得る。例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤の基剤を含む坐剤または保持浣腸剤などの直腸組成物中に化合物を処方することもできる。前記処方物に加えて、化合物を持続性調製物として処方することができる。このような長期作用処方物を、注入（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、化合物を、適切な高分子材料もしくは疎水性材料（例えば、許容可能なオイル中での乳濁液として）またはイオン交換樹脂を使用して処方することができるか、またはやや溶けにくい誘導体（例えば、やや溶けにくい塩）として処方することができる。
【００６１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＦＴＹ７２０がＳＫ２キナーゼによってリン酸化されるので、個体のＳＫ２キナーゼのレベルを測定して、疾患治療における血管内皮Ｓ１Ｐ受容体アゴニストの有効性を予想することができる。例えば、この試験を使用して、所与の個体がＦＴＹ７２０療法の候補であるかどうかを予想することができる。あるいは、個体のＳＫ２キナーゼレベルが低い場合、投与に好ましい化合物は、血管内皮Ｓ１Ｐ受容体アゴニストまたは異なる化学構造を有する別のＳ１Ｐ受容体アゴニストのリン酸化形態物であり得る。
【００６２】
本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに例示する。
[実施例]
【００６３】
一般的方法
試薬。無脂肪酸血清アルブミン（ｆｆａ−ＢＳＡ）、４−デオキシピリドキシン、およびβ−グリセリンリン酸、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−デキストラン（平均分子量２，０００キロダルトン（ｋＤａ）および１６５ｋＤａ）を、シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社から購入した。スフィンゴシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシン（ＤＭＳ）およびＳ１Ｐを、バイオモルリサーチラボラトリズ（Ｂｉｏｍｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）から購入した。{γ−３２Ｐ}ＡＴＰ（比活性６，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および{メチル−３Ｈ}−チミジン（比活性８６ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をアマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社から入手した。ＦＴＹ７２０、ホスホＦＴＹ７２０、（Ｓ）−ＡＡＬ、（Ｒ）−ＡＡＬ、およびホスホ−（Ｒ）−ＡＡＬは、Ｖ．Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ博士から提供を受けた。ホスホ−Ａｋｔ、Ａｋｔ、ホスホ−ＥＲＫｌ／２、およびＥＲＫ−１／２抗体を、セルシグナリングテック（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈ．）社から入手し、ＶＥ−カドヘリン抗体を、サンタクルズバイオテック（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社から入手した。
【００６４】
マウスＳＫ１およびＳＫ２のｃＤＮＡクローニング。マウス肝臓ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、正方向プライマーである配列番号１（ＡＧＣ ＣＣＣ ＡＴＧ ＴＧＧ ＴＧＧ ＴＧＴ ＴＧＴ）および配列番号２（ＡＴＴ ＡＴＧ ＧＣＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＴＡ ＣＴ）ならびに逆方向プライマーである配列番号３（ＧＧＣ ＡＣＡ ＧＡＧ ＴＴＡ ＴＧＧ ＴＴＣ ＴＴＣ）および配列番号４（ＡＧＧ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＴＧ ＴＧＧ ＣＴＴ ＴＴＧ ＡＣ）をそれぞれ使用した逆転写ＰＣＲによってマウススフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ１およびおＳＫ２）のｃＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ３．１でクローン化する。Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびＤＮＡ配列を確認した。次いで、ＳＫ１およびＳＫ２のｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１真核生物発現ベクター（Ｉｎｖiｔｒｏｇｅｎ社製）でクローン化した。
【００６５】
細胞培養およびトランスフェクション。ＨＵＶＥＣ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，ｐ４−１１）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびヘパリン安定化内皮細胞成長因子を添加したＭ１９９培地で培養した。６０ｍｍ皿中の２９３Ｔ細胞を、ベクターのみまたはＳＫ構築物を含んだベクター４マイクログラム（μｇ）にて、リン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、４℃で、２５ミリモル（ｍＭ）ヘぺス（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１×プロテアーゼインヒビター混合物４００マイクロリットル（μｌ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を使用した掻き取りによって細胞を回収し、短時間の超音波処理によって破壊した。細胞ホモジネートを、４℃、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。
【００６６】
統計分析。全実験を２〜５回行い、各実験を示す。移動およびアポトーシス実験では、結果を３回の平均値で示す。マイクロソフト社のエクセルソフトウェアを使用したスチューデントｔ検定によってＰ値を計算した。
【実施例１】
【００６７】
実施例１：血管内皮細胞におけるスフィンゴシンキナーゼによるＦＴＹ７２０のリン酸化。Ｓ１Ｐは、内皮細胞走化性の強力な誘導物質であるので、内皮細胞移動に対するＦＴＹ７２０およびその類似化合物の効果を試験した。９６ウェル走化性マイクロチャンバー（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ社製）を使用して、ＨＵＶＥＣ移動を試験した（Ｐａｉｋ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｎｕ ２７６：１１８３０−１１８３７（２００１））。簡単に述べれば、孔径が８マイクロメーター（μｍ）のポリカーボネートフィルターを、５マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）のフィブロネクチンでコーティングした。Ｓ１Ｐ、ＦＴＹ７２０、ＡＡＬ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、または（Ｒ）−ＡＦＤを、０．１％ｆｆａ−ＢＳＡで適切な濃度に希釈した。
【００６８】
８５μｌの上記溶液またはＨＵＶＥＣ由来の馴化培地を、下のチャンバーに添加した。０．１％ウシ血清アルブミンを含むＭ１９９中に懸濁した約５×１０４個の細胞を、上の区画に入れた。細胞を５％ＣＯ２を含む湿室中にて３７℃で４時間移動させた。インキュベーション後、フィルターを除去し、細胞を０．１％クリスタルバイオレットで染色し、９６ウェルプレート中にて１０％酢酸で溶離した。スペクトラマックス３４０（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ３４０）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）プレートリーダーによって５７５ナノメートル（ｎｍ）での吸光度に基づいて定量した。
【００６９】
無添加のＭ１９９培地での細胞の３回の洗浄および異なる濃度のＦＴＹ７２０または（Ｒ）−ＡＡＬを含む０．１％無脂肪酸ＢＳＡとの３時間のインキュベーションによって、内皮細胞によるＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬの活性化を行った。
【００７０】
インキュベーション後、馴化培地を除去し、１，０００×ｇで１０分間遠心分離し、移動アッセイを行った。
【００７１】
図１は、化学誘引物質であるＳ１Ｐ（１００ナノモル（ｎＭ））、種々の濃度のＦＴＹ７２０（ＦＴＹ）およびＡＡＬを使用したＨＵＶＥＣ（白のバー：コントロール、黒のバー：百日咳毒素治療）の移動実験の結果を示す。実験では表示濃度のＦＴＹ７２０（ＦＴＹ）、（Ｒ）−ＡＡＬ、または（Ｓ）−ＡＡＬとの３時間のインキュベーション後の内皮細胞由来の馴化培地を用いた。データ＝３回繰り返した各実験由来の３連の値の平均±ＳＥ（Ｎ＝３）。＊賦形剤コントロールに対してｐ＜０．０１、＃百日咳毒素を含まない細胞に対してｐ＜０．０１。
【００７２】
広範な濃度範囲においてＦＴＹ７２０およびその構造上の類似化合物である（Ｒ）−ＡＡＬによっては、内皮細胞移動は誘導されなかった（図１）。しかし、ＦＴＹ７２０または（Ｒ）−ＡＡＬをＨＵＶＥＣと３時間インキュベートした場合、これらは内皮細胞の強力な化学誘引物質へと活性化された。この馴化培地誘導性移動は、用量依存性且つ百日咳毒素感受性であり、Ｇｉ共役受容体の関与を示す。対照的に、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）によってリン酸化することができないエナンチオマー（Ｓ）−ＡＡＬは、内皮細胞とのインキュベーション後に移動を誘導しなかった。これらのデータは、内皮細胞によってＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬが内皮細胞の化学誘引物質であるリン酸化誘導体へとリン酸化されて活性化するという仮説と一致する。
【００７３】
ＨＵＶＥＣ細胞中のＳＫ１およびＳＫ２転写物の存在を、配列番号ｌ〜４のプライマー（ＳＫ１についてはＴＧＧＡＧＴＡＴＧＡＡＴＧＣＣＣＣＴＡＣ、ＣＧＣＴＡＡＣＣＡＴＣＡＡＴＴＣＣＣＣ、ＳＫ２についてはＧＡＴＣＡＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＴＡＣ、ＧＧＣＡＴＣＴＴＣＡＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣ）を使用したＲＴ−ＰＣＲによって検出した（データ示さず）。
【００７４】
ＳＫ１およびＳＫ２がＦＴＹ７２０リン酸化に関与する可能性をさらに探索するために、ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬの活性形態物への変換の阻害についてＳＫインヒビターであるＤＭＳを用いて試験した。図２は、Ｓ１Ｐ（１００ｎＭ）または１０μＭ ＤＭＳの非存在下（白色のバー）もしくは存在下（黒色のバー）での１００ｎＭ ＦＴＹ７２０（ＦＴＹ）もしくは１００ｎＭ（Ｒ）−ＡＡＬとの３時間のインキュベーション後の内皮細胞由来の馴化培地を使用した、ＨＵＶＥＣの移動実験の結果を示す。＊賦形剤コントロールに対してｐ＜０．０１。ＤＭＳ処理（１０μＭ）は、ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬを活性化する内皮細胞の能力を強力に阻害した（図２）。これらの結果により、ＨＵＶＥＣ中に存在するＳＫ活性がＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬの両方をリン酸化して活性化させることができることが示唆される。
【実施例２】
【００７５】
実施例２：ＦＴＹ７２０およびＲ−ＡＡＬのリン酸化の確認。ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬが内皮細胞によってリン酸化されることを確認するために、全細胞抽出物およびＨＵＶＥＣ由来の馴化培地を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを行った。細胞を無添加のＭ１９９培地で３回洗浄し、０．１％ｆｆａ−ＢＳＡで表示の時間インキュベートした。インキュベーション後、馴化培地を除去し、１，０００×ｇで１０分間遠心分離し、キナーゼ活性アッセイのために使用した。４℃において、２５ｍＭ ヘペス（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１×プロテアーゼインヒビター混合物４００μｌを使用して細胞を掻き取り、短時間の超音波処理によって破壊した。細胞ホモジネートを、４℃、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。
【００７６】
キナーゼアッセイでは、３００μｌの馴化培地（３時間のインキュベーション後の５×１０５個の細胞由来）または１０μｇのＨＵＶＥＣ由来の全細胞抽出物を、キナーゼ活性の供給源として使用した。反応物は、２０μＭスフィンゴシンまたは１００μＭ ＦＴＹ７２０もしくはＡＡＬ、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（１０μＣｉ）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ ＮａＦ、０．５ｍＭ ４−デオキシピリドキシン、４０ｍＭグリセリンリン酸、および３００μｌのＭ１９９を含んでおり、３７℃で３０分間インキュベートした。脂質を抽出し、サンプルを５０μｌのクロロホルムに再懸濁した。脂質を、１−ブタノール／酢酸／水（６０／２０／２０体積／体積）緩衝液を使用したシリカゲルＧ６０でのＴＬＣによって分離し、ホスホイメージャー（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で定量した。
【００７７】
図３に示すように、ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬは、ＨＵＶＥＣ中に存在するキナーゼ活性によってリン酸化された（図３の上のパネル、比活性はそれぞれ３．８５±０．７５および１５±０．９３ｐｍｏｌ／ｍｇ／分）。予想どおり、スフィンゴシンはこのキナーゼ活性の有効な基質であった（比活性７５．７±６（ピコモル／ミリグラム／分（ｐｍｏｌ／ｍｇ／分））。対照的に、（Ｓ）−ＡＡＬのリン酸化物は検出不可能であり、移動アッセイで得られた結果と一致した。ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬのリン酸化は、ＤＭＳ（５０μＭ）によって阻害された。同様に、キナーゼ活性は、ＨＵＶＥＣ由来の馴化培地で検出され（図３の下のパネル）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０によって阻害され、ＳＫの酵素活性を高める条件であるＫＣｌ（２００ｍＭ）によって増加した（データ示さず）。
【実施例３】
【００７８】
実施例３：ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬのリン酸化におけるＳＫ２の役割の確認。ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬのリン酸化におけるＳＫ２の役割を確認するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＳＫ１またはＳＫ２のｃＤＮＡのいずれかを含むｐｃＤＮＡ３．１／Ｎｅｏ発現ベクターで一過性にトランスフェクトし、ＦＴＹ７２０、（Ｒ）−ＡＡＬ、および（Ｓ）−ＡＡＬのリン酸化についてチェックした。図４に、ベクターコントロール２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ）、ＳＫ１過剰発現２９３Ｔ細胞（ＳＫ１−２９３Ｔ）、およびＳＫ２過剰発現２９３Ｔ細胞（ＳＫ２−２９３Ｔ）由来の抽出物を使用して行ったｉｎ ｖｉｔｒｏでのキナーゼアッセイのＴＬＣ−オートラジオグラフィの結果を示す。
【００７９】
賦形剤コントロール＝（Ｃ）、１００μＭ ＦＴＹ７２０＝（Ｆ）、１００μＭ（Ｒ）−ＡＡＬ＝（Ｒ）、１００μＭ（Ｓ）−ＡＡＬ＝（Ｓ）、または２０μＭスフィンゴシン＝（ＳＧ）を基質として使用する。（＋）を示す場合、５０μＭのＤＭＳを含んでいる。Ｎ＝３〜５の代表的実験を示す。ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔに対するＳＫ１−２９３Ｔ（白色のバー）およびＳＫ２−２９３Ｔ（黒色のバー）の比活性の誘導倍率を、下のパネルに示す。矢印はリン酸化化合物を示す。
【００８０】
ベクターでトランスフェクトした細胞で低レベルの内因性スフィンゴシンキナーゼ活性が検出された（図４）。ＳＫ１細胞抽出物は、コントロール２９３Ｔ細胞と同等のＦＴＹ７２０または（Ｒ）−ＡＡＬキナーゼ活性を示した一方で、ＳＫ１−２９３Ｔ細胞においてはリン酸化したスフィンゴシンが有意に増加した（比活性は、２９３Ｔ細胞の１０．５ｐｍｏｌ／ｍｇ／分に対して４８．１ｐｍｏｌ／ｍｇ／分、図４）。ＳＫ２−２９３Ｔ細胞は、コントロール２９３Ｔ細胞に対してＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬキナーゼ活性が増加した（それぞれ３．７倍および７倍の誘導）。
【００８１】
ＦＴＹ７２０、（Ｒ）−ＡＡＬ、およびスフィンゴシンにおけるＳＫ２−２９３Ｔの比活性は、それぞれ４１．６、１９９．５、および３１９．９ｐｍｏｌ／分／ｍｇであった。２９３Ｔ、ＳＫ１−２９３Ｔ、およびＳＫ２−２９３Ｔ細胞における（Ｓ）−ＡＡＬのリン酸化は辛うじて検出可能であった。ＦＴＹ７２０、（Ｒ）−ＡＡＬ、およびスフィンゴシンキナーゼ活性は、ＤＭＳ（５０μＭ）とのインキュベーションによって阻害された。これらの結果により、ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬのリン酸化、ならびにそれによりこれらの化合物がＳ１Ｐ受容体アゴニストへと活性化する際のＳＫ２の役割が示唆される。さらに、結果は、ＨＵＶＥＣが細胞外培地中に存在するＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬの両方をリン酸化して活性化させることができることを示す。
【実施例４】
【００８２】
実施例４：内皮細胞応答に対するＦＴＹ７２０−Ｐの効果。ＦＴＹ７２０−Ｐおよびその類似化合物である（Ｒ）−ＡＦＤの効果を、ＨＵＶＥＣで研究した。図５では、データ＝３回の平均±ＳＥ。Ｎ＝３。＊ｐ＜０．０１（賦形剤コントロールに対する治療について）、＃ｐ＜０．０１（百日咳毒素を含まない細胞に対して）。ＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤは共にＨＵＶＥＣの強力な化学誘引物質であった（図５）。これらは共に１０ｎＭで最大の効果を示すが（それぞれ、１３倍および９倍の誘導）、Ｓ１Ｐがわずかだがより強力であった（１４倍の誘導）。ＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤ誘導性移動は、百日咳毒素（２００ｎｇ／ｍＬ）によって阻害され、ヘテロ三量体Ｇｉタンパク質経路によって媒介される効果であることを示す。
【００８３】
内皮細胞形態形成（内皮細胞の移動、生存、および接着結合アセンブリを必要とする現象）は、Ｓ１Ｐ１およびＳ１Ｐ３受容体のリガンド依存性の活性化によって媒介される。Ｓ１Ｐは、内皮細胞におけるＡｋｔプロテインキナーゼおよびＥＲＫプロテインキナーゼのリン酸化を誘導することが示され、Ａｋｔが介在するＳ１Ｐ１／ＥＤＧ−１受容体のリン酸化は、Ｓ１Ｐ誘導性移動に必要である。ＨＵＶＥＣにおけるＡｋｔおよびＥＲＫのリン酸化に対するＦＴＹ７２０−Ｐおよびその類似化合物の効果を、ウェスタンブロット分析で研究した。ＨＵＶＥＣ細胞のコンフルエントな培養物を、処理前に０．１％ｆｆａ−ＢＳＡ Ｍ１９９中で２時間血清を枯渇させた。
【００８４】
次いで、これらを１ｍＭフッ化ナトリウムおよび１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを含む氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、放射性免疫沈降アッセイ緩衝液（０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ−４０、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭβ−グリセリンリン酸、および１×プロテアーゼインヒビターカクテル）中でホモジネートした。サンプルを、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ（ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｙｅ試薬）によって上清のタンパク質濃度を決定した。等量のタンパク質を、１０％ポリアクリルアミドゲルにて分離し、ニトロセルロースメンブレンにブロッティングした。ホスホ−Ａｋｔ、Ａｋｔ、ホスホ−ＥＲＫ１／２、またはＥＲＫ−１／２抗体を使用して、免疫ブロット法による分析を行った。
【００８５】
ＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤは、５分後にＡｋｔ（１００ｎＭでそれぞれ３．７倍および４．５倍、図６）およびＥＲＫ−１／２（１００ｎＭでそれぞれ９．３倍および８．２倍、図６）のリン酸化物のレベルを増加へと誘導した。このリン酸化の経時変化は、ＦＴＹ７２０−Ｐ、（Ｒ）−ＡＦＤ、およびＳ１Ｐ間で類似し、５分の刺激後に最大レベルのリン酸化が達成された（データ示さず）。
【００８６】
ＡｋｔおよびＥＲＫのリン酸化に対するＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤの効果は用量依存性であり（データ示さず）、ＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤによって誘導されたリン酸化の程度はＳ１Ｐによって誘導された程度より高かった。しかし、非リン酸化誘導体（ＦＴＹ７２０またはＡＡＬ）は、内皮細胞においてホスホ−Ａｋｔまたはホスホ−ＥＲＫ１／２を誘導しなかった。Ｓ１Ｐ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、および（Ｒ）−ＡＦＤによるＡｋｔ、ＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２のリン酸化は、百日咳毒素とのインキュベーションによって阻害され（図７）、Ｇｉ共役受容体の関与を示す。
【実施例５】
【００８７】
実施例５：アポトーシスに対するＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤの効果。ＥＲＫ−１およびＥＲＫ−２活性化は、内皮細胞におけるＳ１Ｐの残存効果に必要であり、ＦＴＹ７２０−Ｐおよびその類似化合物である（Ｒ）−ＡＦＤがＨＵＶＥＣにおける血清欠乏によって誘導されたアポトーシスを防止することができるかどうかを試験した。この試験では、ＨＵＶＥＣ細胞を、｛メチル−３Ｈ｝−チミジン（１μＣｉ／ｍｌ）で１６時間標識した。次いで、これらを洗浄し、異なる処理を含む０．１％ｆｆａ−ＢＳＡ Ｍ１９９を添加した。８時間後、記載のように断片化ＤＮＡを可溶化し、定量した。
【００８８】
結果を、図８および９に示す。ＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤは、用量依存的にアポトーシスから細胞を有意に保護し（図８）、非常に低濃度（１０ｎＭ）で最大の効果が得られた（ＤＮＡ断片化の約７０％を阻害）。Ｓ１Ｐを用いた場合、より高い濃度（１μＭ）において同様にＤＮＡのフラグメント化の阻害が認められた。百日咳毒素処理によってＳ１Ｐ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、および（Ｒ）−ＡＦＤの抗アポトーシス効果も阻害され（図９）、Ｇｉを介したシグナル伝達が重要であることが示された。
【実施例６】
【００８９】
実施例６：ＦＴＹ７２０−Ｐはｉｎ ｖｉｔｒｏで接着結合アセンブリおよび血管透過性を調整する。内皮細胞の形態形成および透過性における重要な細胞内構造である接着結合の形成に必要なＶＥ−カドヘリンアセンブリに対するＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤの効果を評価した。カドヘリンは、特定の細胞−細胞接触の形成に関与する細胞接着分子のファミリーである。ＶＥ−カドヘリン（またはカドヘリン−５）は、細胞−細胞接触において細胞内結合（接着結合）に局在していることが示されている。多数の実験観察により、このカドヘリンは、内皮細胞の管状構造へのアセンブリを含んだ新脈管形成に関する血管生物学の種々の態様に関与することが示唆される。
【００９０】
ＶＥ−カドヘリンの局在化に対するＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤの効果を、免疫蛍光検査法を使用して検討した。この研究では、２×１０５個の細胞を、３５ｍｍのガラス底ペトリ皿に入れた。３日後、細胞を洗浄し、処理前に３時間血清を枯渇させた。次いで、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄、固定し、ＶＥ−カドヘリン抗体（１μｇ／ｍｌ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）を使用した免疫蛍光検査法による分析を行った。ローダミンと組み合わせたヤギの抗マウスＩｇＧ（１：１０００、Ｃａｐｐｅｌ社製）を使用して、一次抗体染色を視覚化した。ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）ＬＳＭ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡にて共焦点顕微鏡法を行った。ローダミン蛍光を、５４３ｎｍヘリウム／ネオンレーザーを使用して励起し、放出された蛍光を５３０ｎｍロングパスフィルターを使用して検出した。
【００９１】
ＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤでの３０分間のＨＵＶＥＣの処理により、細胞−細胞接触領域でＶＥ−カドヘリン局在化の増加がみられた（表１０）。この効果は、Ｓ１Ｐで認められた効果に匹敵した。しかし、非リン酸化前駆体であるＦＴＹおよび（Ｒ）−ＡＡＬは接着結合のためのＶＥ−カドヘリン移行へとは誘導しなかった。これらの結果は、ＦＴＹ７２０−Ｐおよび（Ｒ）−ＡＦＤが、内皮細胞中での接着結合アセンブリを誘導するように血管Ｓ１Ｐ受容体に対して作用することを示す。
【００９２】
いくつかの研究は、ＶＥ−カドヘリンが血管透過性の重要な決定要因であり得ることを示した。ＶＥ−カドヘリンのＶＥＧＦ誘導性チロシンリン酸化により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの血管透過性が増加した。さらに、Ｓ１Ｐは、Ｓ１Ｐ１／Ｇｉ／Ｒａｃ依存性プロセスを介してトロンビン誘導性傍細胞透過性を阻害することを示した。細胞系を使用して、血管透過性に対するＳ１Ｐ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、および（Ｒ）−ＡＦＤの効果を評価した。マウス胚内皮細胞（５×１０４）を、トランスウェルポリカーボネートフィルター（直径６．５ｍｍ、孔径０．４μｍ；商標Ｃｏｓｔａｒ）中で２日間培養した。培養培地を、血清／フェノールレッドの入っていないＤＭＥＭ（ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、Ｌ−グルタミン、および塩酸ピリドキシン）（０．１ｍＬは上のチャンバー、０．６ｍＬは下のチャンバー）と置換した。
【００９３】
細胞を、ＦＴＹ７２０、その誘導体、またはＳ１Ｐで１時間、前処理した。ＦＩＴＣ−デキストラン（平均分子量＝２，０００ｋＤａ）を、マウスの組換えＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の非存在下または存在下のいずれかで上の区画に添加した。表示の期間（５〜４５分）後に下のウェル由来の培地を採取した。サンプルを、黒色の硬い底の９６ウェルプレート（商標Ｃｏｓｔａｒ）に入れ、４８８ｎｍ励起でサイトフルオ（ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ（Ｒ））蛍光マルチウェルプレートリーダー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して、蛍光強度を測定した。データ＝２つの値の平均±ＳＥ。Ｎ＝２。＊ｐ＜０．０１（未処理に対するＶＥＧＦ）。
＃ｐ＜０．０１（ＶＥＧＦのみに対する処理＋ＶＥＧＦ）。
【００９４】
傍細胞透過性アッセイの結果を、図１１および１２に示す。ＶＥＧＦを使用しない場合、下の区画の蛍光は時間と共に増加した（図１１）。しかし、細胞をＶＥＧＦで処理した場合、下の区画で蛍光の有意な増加が認められ、Ｓ１Ｐ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、および（Ｒ）−ＡＦＤによって非常に阻害された（図１１、４５分の測定点を示す）。これらの結果は、ＶＥＧＦ誘導性傍細胞透過性がＳ１Ｐ受容体アゴニストであるＳ１Ｐ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、および（Ｒ）−ＡＦＤによって拮抗されることを示す。
【実施例７】
【００９５】
実施例７：ＦＴＹ７２０−Ｐはｉｎ ｖｉｖｏで接着結合アセンブリおよび血管透過性を調整する。血管透過性の調節における血漿由来ＦＴＹ７２０−Ｐまたは（Ｒ）−ＡＦＤの役割をｉｎ ｖｉｖｏで試験した。この可能性を試験するために、ＦＴＹ７２０、（Ｒ）−ＡＦＤ、または（Ｓ）−ＡＡＬ前処理マウスでｉｎ ｖｉｖｏ血管透過モデルを使用した。正常なＦＶＢ／Ｎ雌または雄マウスを、ＦＴＹ７２０（５０μｇ）、Ｓ−ＡＡＬエナンチオマー（５０μｇ）、Ｒ−ＡＡＬエナンチオマー（５０μｇ）、および賦形剤コントロールとしての水を用いての強制栄養法によって処置した。５時間の強制栄養法による処理後、動物を２％Ａｖｅｒｔｉｎ（商標）（０．５ｃｃ／２０ｇ）で麻酔し、尾静脈を介して１００μｌのＦＩＴＣ−デキストラン（５ｍｇ／ｍｌ、１６５ｋＤａ）を注入した。動物を、蛍光解剖顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＳＴＶ１１型，Ｚｅｉｓｓ社製）下の加温テーブルにのせ、耳の中心血管を画像化した。コントロール生理食塩水またはマウス血管内皮成長因子（ｍＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ）を、３０ゲージのニードル（３０μｌ）を使用して中耳に皮下注射した。次いで、耳の脈管構造を、注射から５分〜１２０分後に特定の暴露回数で定位置で画像化した。次いで、イメージプロプラス（ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓ）（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製）においてピクセルベースの閾値を使用して蛍光画像を定量した。
【００９６】
結果を図１３および１４に示す。分析５時間前にマウスに対し一回経口投与した前処置により、ＦＴＹ７２０がＶＥＧＦによって誘導された血管透過性を非常に抑制することが示された（図１３および１４）。（Ｒ）−ＡＡＬもｉｎ ｖｉｖｏでの血管透過性を強く阻害するが、（Ｓ）−ＡＡＬではそうではない。これらのデータにより、ｉｎ ｖｉｖｏでのスフィンゴシンキナーゼによるＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬのリン酸化および内皮細胞上でのＳ１Ｐ受容体の活性化によりＶＥＧＦ誘導性血管透過性が阻害されることが示唆される。
【００９７】
血管内皮Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストは、血管透過性、アポトーシス、および血管形成に対して効果を有することが示された。特に、ＦＴＹ７２０およびその類似化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏでリン酸化されて（例えば、ＦＴＹ７２０−Ｐ）血管内皮Ｓ１Ｐ受容体に結合できることが示された。血管内皮Ｓ１Ｐ受容体アゴニストを、血管透過性障害、過剰な血管内皮アポトーシスに関連する障害の治療および新生血管を成長させるために使用することができる。
【００９８】
全ての引用した特許、特許出願、および他の引用文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００９９】
本発明は好ましい実施形態を参照して記載されているが、本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更を行うことができ、その要素を等価物と置換することができると当業者は理解している。さらに、その本質的な範囲を逸脱することなく本発明の教示に特定の状況または材料を適合させるために多数の修正形態を得ることができる。したがって、本発明は本発明の実施のための最良の形態として開示した特定の実施形態に制限されないが、本発明は添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる全ての実施形態が含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】細胞インキュベーションを行うか行わずにＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬに晒したＨＵＶＥＣについての細胞移動試験の結果を示すグラフである。
【図２】ＦＴＹ７２０および（Ｒ）−ＡＡＬを活性化する内皮細胞の能力がスフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）インヒビターであるジメチルスフィンゴシン（ＤＭＳ）によって阻害されることを証明した細胞移動アッセイの結果を示すグラフである。
【図３】馴化培地（ＣＭ）およびＨＵＶＥＣ由来の全細胞抽出物（ＴＣＥ）を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイの薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）−オートラジオグラフィの結果である。
【図４】ベクターコントロール２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ）、ＳＫＩ過剰発現２９３Ｔ細胞（ＳＫ１−２９３Ｔ）、およびＳＫ２過剰発現２９３Ｔ細胞（ＳＫ２−２９３Ｔ）由来の抽出物を使用して行ったｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイのＴＬＣ−オートラジオグラフィの結果である。ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に対するＳＫ１−２９３Ｔ（白色のバー）およびＳＫ２−２９３Ｔ（黒色のバー）の比活性誘導の倍率を下のパネルに示す。
【図５】表示濃度でＳ１Ｐ（１００ｎＭ）、ＦＴＹ７２０−Ｐ（ＦＴＹ−Ｐ）、または（Ｒ）−ＡＦＤ（（Ｒ）−ＡＡＬのリン酸化形態）を使用した、ＨＵＶＥＣ（白色のバー：コントロール、黒色のバー：百日咳毒素処理）の移動実験の結果を示す図である。
【図６】表示濃度におけるＳＩＰ、ＦＴＹ７２０−Ｐ（ＦＴＹ−Ｐ）、ＦＴＹ７２０（ＦＴＹ）、（Ｒ）−ＡＦＤ、または（Ｒ）−ＡＡＬで５分間刺激を与えた後の、ＨＵＶＥＣ中のホスホ−Ａｋｔ、総Ａｋｔ、ホスホ−ＥＲＫ−１／２、および総ＥＲＫ−１／２のウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図７】百日咳毒素処理がＳ１Ｐ、ＦＴＹ７２０−Ｐ（ＦＴＹ−Ｐ）、および（Ｒ）−ＡＦＤによるＡｋｔおよびＥＲＫ−１／２のリン酸化を阻害することを示すウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図８】ＨＵＶＥＣ細胞における{メチル−３Ｈ}−チミジン組み込み後のＤＮＡ断片化率の測定によるアポトーシスに対するＦＴＹ７２０−Ｐの効果についての結果を示す図である。
【図９】百日咳毒素処理によってアポトーシスに対するＳＩＰ、ＦＴＹ７２０−Ｐ、および（Ｒ）−ＡＦＤの防御効果を阻害することを示すＤＮＡ断片のアッセイの結果を示す図である。
【図１０】Ｃ：賦形剤コントロール、Ｓ１Ｐ：１００ｎＭ Ｓ１Ｐ、ＦＴＹ：１０ｎＭ ＦＴＹ７２０、ＦＴＹ７２０−Ｐ：１０ｎＭ ＦＴＹ７２０−Ｐ、ＡＡＬ：１０ｎＭ（Ｒ）−ＡＡＬ、ＡＦＤ：１０ｎＭ（Ｒ）−ＡＦＤである免疫蛍光検査法の結果を示す図である。スケールバー＝５０μｍ。
【図１１】ＶＥＧＦ誘導性傍細胞透過性の経時変化を示すグラフである：ＶＥＧＦ：２０ｎｇ／ｍＬ、ＦＴＹ７２０−Ｐ：１００ｎＭ ＦＴＹ７２０−Ｐ。
【図１２】１００ｎＭ Ｓ１Ｐ（Ｓ１Ｐ）、１００ｎＭ ＦＴＹ７２０−Ｐ（ＦＴＹ−Ｐ）、および１００ｎＭ（Ｒ）−ＡＦＤ（（Ｒ）−ＡＦＤ）がＶＥＧＦ誘導性傍細胞透過性を阻害することを示すグラフである。
【図１３】マウスの耳微小血管透過性のアッセイ結果である蛍光画像を示す図である。
【図１４】耳の血管外蛍光の定量結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、血管透過障害の治療薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用。
【請求項２】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストが、式：
【化１】
（式中、Ｒ１は１２〜２２個の炭素原子を有する置換または非置換の直鎖または分岐鎖の炭素鎖であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立して水素または低級アルキルである）を有する１，２−アミノアルコール、その薬学的に許容可能な塩、またはそのリン酸化形態物である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｒ１が置換または非置換のフェニレンによって分断されている、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストが、２−アミノ−２−［２−（４−オクタフェニル）エチル］プロパン−１，３ジオール、２−アミノ−２−メチル−４−［４−ヘプトキシ−フェニル］ブタン−ｌ−オール、２−アミノ−３−ホスフェート−２−［２−（４−オクタフェニル）エチル］プロパン−１−オール、２−アミノ−２−メチル−４−［４−ヘプトキシ−フェニル］１−二リン酸、または１つ若しくは複数の前記アゴニストを含む組み合わせである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシンキナーゼ−２によってリン酸化される、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがＡｋｔタンパク質キナーゼ、ＥＲＫタンパク質キナーゼ、または１つ若しくは複数の前記キナーゼを含む組み合わせのリン酸化を刺激する、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体が、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４、Ｓ１Ｐ５、または１つ若しくは複数の前記受容体を含む組み合わせである、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストが接着結合アセンブリを誘導する、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記血管透過障害が、内皮損傷、血小板減少症、アテローム性動脈硬化症、虚血性心血管疾患、虚血性末梢血管疾患、糖尿病に関連する末梢血管障害、デング出血熱、成人（急性）呼吸窮迫症候群、血管漏出症候群、敗血症、自己免疫性脈管炎、または１つ若しくは複数の前記障害を含む組み合わせである、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、望ましくない血管内皮細胞アポトーシスが移植片拒絶に関連しない、望ましくない血管内皮細胞アポトーシスの治療薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用。
【請求項１１】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストが、式：
【化２】
（式中、Ｒ１は１２〜２２個の炭素原子を有する置換または非置換の直鎖または分岐鎖の炭素鎖であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立して水素または低級アルキルである）を有する１，２−アミノアルコール、その薬学的に許容可能な塩、またはそのリン酸化形態物である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
Ｒ１が置換または非置換のフェニレンによって分断されている、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストが、２−アミノ−２−［２−（４−オクタフェニル）エチル］プロパン−１，３ジオール、２−アミノ−２−メチル−４−［４−ヘプトキシ−フェニル］ブタン−ｌ−オール、２−アミノ−３−ホスフェート−２−［２−（４−オクタフェニル）エチル］プロパン−１−オール、２−アミノ−２−メチル−４−［４−ヘプトキシ−フェニル］１−二リン酸、または１つ若しくは複数の前記アゴニストを含む組み合わせである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシンキナーゼ−２によってリン酸化される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがＡｋｔタンパク質キナーゼ、ＥＲＫタンパク質キナーゼ、または１つ若しくは複数の前記キナーゼを含む組み合わせのリン酸化を刺激する、請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体が、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４、Ｓ１Ｐ５、または１つ若しくは複数の前記受容体を含む組み合わせである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１７】
前記望ましくない血管内皮細胞アポトーシスがアポトーシス関連障害に関連する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１８】
前記アポトーシス関連障害が、特発性心筋症、薬物によって誘導される心筋症 、慢性アルコール中毒によって誘導される心筋症、家族性心筋症、ウイルス性心筋炎、ウイルス性心筋症、心筋梗塞、狭心症、末梢性血栓症、鬱血性心不全、不整脈、脳卒中、くも膜下出血、脳硬塞、脳血栓症、または１つ若しくは複数の前記障害を含む組み合わせである、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記望ましくない血管内皮細胞アポトーシスが放射線療法に関連する、請求項１０に記載の使用。
【請求項２０】
血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、哺乳動物における新生血管形成の刺激薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用。
【請求項２１】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストが、式：
【化３】
（式中、Ｒ１は１２〜２２個の炭素原子を有する置換または非置換の直鎖または分岐鎖の炭素鎖であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立して水素または低級アルキルである）を有する１，２−アミノアルコール、その薬学的に許容可能な塩、またはそのリン酸化形態物である、請求項２０に記載の使用。
【請求項１】
血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、血管透過障害の治療薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用。
【請求項２】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストが、式：
【化１】
（式中、Ｒ１は１２〜２２個の炭素原子を有する置換または非置換の直鎖または分岐鎖の炭素鎖であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立して水素または低級アルキルである）を有する１，２−アミノアルコール、その薬学的に許容可能な塩、またはそのリン酸化形態物である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｒ１が置換または非置換のフェニレンによって分断されている、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストが、２−アミノ−２−［２−（４−オクタフェニル）エチル］プロパン−１，３ジオール、２−アミノ−２−メチル−４−［４−ヘプトキシ−フェニル］ブタン−ｌ−オール、２−アミノ−３−ホスフェート−２−［２−（４−オクタフェニル）エチル］プロパン−１−オール、２−アミノ−２−メチル−４−［４−ヘプトキシ−フェニル］１−二リン酸、または１つ若しくは複数の前記アゴニストを含む組み合わせである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシンキナーゼ−２によってリン酸化される、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがＡｋｔタンパク質キナーゼ、ＥＲＫタンパク質キナーゼ、または１つ若しくは複数の前記キナーゼを含む組み合わせのリン酸化を刺激する、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体が、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４、Ｓ１Ｐ５、または１つ若しくは複数の前記受容体を含む組み合わせである、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストが接着結合アセンブリを誘導する、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記血管透過障害が、内皮損傷、血小板減少症、アテローム性動脈硬化症、虚血性心血管疾患、虚血性末梢血管疾患、糖尿病に関連する末梢血管障害、デング出血熱、成人（急性）呼吸窮迫症候群、血管漏出症候群、敗血症、自己免疫性脈管炎、または１つ若しくは複数の前記障害を含む組み合わせである、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、望ましくない血管内皮細胞アポトーシスが移植片拒絶に関連しない、望ましくない血管内皮細胞アポトーシスの治療薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用。
【請求項１１】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストが、式：
【化２】
（式中、Ｒ１は１２〜２２個の炭素原子を有する置換または非置換の直鎖または分岐鎖の炭素鎖であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立して水素または低級アルキルである）を有する１，２−アミノアルコール、その薬学的に許容可能な塩、またはそのリン酸化形態物である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
Ｒ１が置換または非置換のフェニレンによって分断されている、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストが、２−アミノ−２−［２−（４−オクタフェニル）エチル］プロパン−１，３ジオール、２−アミノ−２−メチル−４−［４−ヘプトキシ−フェニル］ブタン−ｌ−オール、２−アミノ−３−ホスフェート−２−［２−（４−オクタフェニル）エチル］プロパン−１−オール、２−アミノ−２−メチル−４−［４−ヘプトキシ−フェニル］１−二リン酸、または１つ若しくは複数の前記アゴニストを含む組み合わせである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシンキナーゼ−２によってリン酸化される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがＡｋｔタンパク質キナーゼ、ＥＲＫタンパク質キナーゼ、または１つ若しくは複数の前記キナーゼを含む組み合わせのリン酸化を刺激する、請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体が、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４、Ｓ１Ｐ５、または１つ若しくは複数の前記受容体を含む組み合わせである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１７】
前記望ましくない血管内皮細胞アポトーシスがアポトーシス関連障害に関連する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１８】
前記アポトーシス関連障害が、特発性心筋症、薬物によって誘導される心筋症 、慢性アルコール中毒によって誘導される心筋症、家族性心筋症、ウイルス性心筋炎、ウイルス性心筋症、心筋梗塞、狭心症、末梢性血栓症、鬱血性心不全、不整脈、脳卒中、くも膜下出血、脳硬塞、脳血栓症、または１つ若しくは複数の前記障害を含む組み合わせである、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記望ましくない血管内皮細胞アポトーシスが放射線療法に関連する、請求項１０に記載の使用。
【請求項２０】
血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストがスフィンゴシン−１−リン酸ではない、哺乳動物における新生血管形成の刺激薬の製造のための血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニスト、その薬学的に許容可能な形態物、またはそのリン酸化形態物の使用。
【請求項２１】
前記血管内皮スフィンゴシン−１−リン酸受容体アゴニストが、式：
【化３】
（式中、Ｒ１は１２〜２２個の炭素原子を有する置換または非置換の直鎖または分岐鎖の炭素鎖であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ独立して水素または低級アルキルである）を有する１，２−アミノアルコール、その薬学的に許容可能な塩、またはそのリン酸化形態物である、請求項２０に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００７−５２３８５８（Ｐ２００７−５２３８５８Ａ）
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１７３６１（Ｐ２００６−５１７３６１）
【出願日】平成１６年６月１８日（２００４．６．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１９４２０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００２５５９
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５００４８９９５６）ユニバーシティ オブ コネチカット (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月１８日（２００４．６．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１９４２０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００２５５９
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５００４８９９５６）ユニバーシティ オブ コネチカット (3)
【Ｆターム（参考）】
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