表面の生体適合性の改質方法
【課題】生体または生体に由来する物質と接触する表面の生体適合性を改質、特に、向上せしめる方法。具体的には、生体内の血液と人工物である材料とが接触した時に生じる血液の変性を低減乃至防止する方法の提供。
【解決手段】環状ニトロキシドラジカル部分を担持する反復単位よりなる群から選ばれるいずれか１種の単位を、少なくとも、ポリマー主鎖の反復単位の１５％以上含んでなり、他の反復単位が存在する場合には、対応する単位の環状ニトロキシドラジカル部分が水素原子もしくは他の官能基を形成し得る基である反復単位または該反復単位と一緒になってコポリマーを形成しうる反復単位を含む、ポリマーを固定する工程を含んでなる、上記方法。
【解決手段】環状ニトロキシドラジカル部分を担持する反復単位よりなる群から選ばれるいずれか１種の単位を、少なくとも、ポリマー主鎖の反復単位の１５％以上含んでなり、他の反復単位が存在する場合には、対応する単位の環状ニトロキシドラジカル部分が水素原子もしくは他の官能基を形成し得る基である反復単位または該反復単位と一緒になってコポリマーを形成しうる反復単位を含む、ポリマーを固定する工程を含んでなる、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体または生体に由来する物質と接触する表面の生体適合性を改質、特に、向上せしめる方法に関する。より具体的には、本発明は生体内の血液と人工物である材料とが接触した時に生じる血液の変性を低減乃至防止する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の医療工学の発展に伴い医療現場では、人工血管や人工心肺などの人工臓器が使用されるようになってきた。現在使用されている人工臓器の多くは高分子材料からできており、血液や生体組織と直接接触するものについては、生体適合性、特に、血液適合性や組織適合性が要求される。例えば、材料に血液が接触すると生体液は活性化され、酸化ストレスの上昇、血液の凝固反応や炎症反応を引き起こす。このとき活性化された白血球などの食細胞は、活性酸素種（ＲＯＳ）を産生すると伴に炎症性サイトカインを放出する。
【０００３】
現在までに血液の活性化を小さくするために親水性ポリマー、生体膜を模倣したポリマー、ミクロドメイン構造を持つポリマー、生理活性物質を固定化した表面など様々な研究がなされてきた（例えば、非特許文献１および非特許文献２参照）。最近ではアセチルコリン基を有する高分子（ＰＭＰＣ）やポリアクリル酸２−メトキシエチルなどの生体適合性の良い新規ポリマーが開発されて来ている（例えば、特許文献１および特許文献２参照）。これらの材料は比較的性能がよく、その一部は実用化されているものの、完全に問題が解決されているわけではない。たとえば親水性ポリマーは血小板の吸着は抑制するが血液の活性化反応については抑制することができないことが挙げられる。生理活性物質は動物由来物質であり安全面に問題があることや、生理活性の自然低下といった問題がある。最近、トコフェロールのような抗酸化剤を表面にコーティングしてＲＯＳの発生を抑える方法が一定の成果を上げているものの、高価で化学量論的反応のため、公算可能が継続しないという問題があった。また、医療用物品の表面を被覆するためのポリマー性キャリアとして、ポリ（ヒドロキアルカン酸エステル−ｃｏ−エステルアミド）の側鎖に活性酸素をはじめとするフリーラジカルの捕捉剤としての２，２’，６，６’−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシフリーラジカル（ＴＥＭＰＯ）を担持させたポリマーも提案されている（特許文献３参照）。なお、特許文献３では、上記フリーラジカル捕捉剤の他に、多種多様な薬剤、例えば、増殖抑制薬、抗血小板薬もしくは抗凝固薬、診断用薬剤を該ポリマーの側鎖に担持させることが提案されている。しかし、これらの薬剤を担持するポリマーで被覆された表面が具体的にどのような挙動を示すかを明らかにするデータは何ら開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−１６１９５４
【特許文献２】ＷＯ２００８／０２３６０４
【特許文献３】ＷＯ２００６／０７８３５６
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｅｇａｎ Ｃ．Ｆｒｏｓｔ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２６（２００５）１６８５-１６９３
【非特許文献２】Ｋａｚｕｈｉｋｏ Ｉｓｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｄｎ．１０（３）２７１−２８２（１９９９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記先行技術の問題点は、下記のようにまとめることができる。
１）親水性ポリマーのミクロ相分離膜は、一度活性酸素が発生するとその活性酸素を捕捉することができない。
２）生体活性物質を固定化した表面は、当該物質は、通常、動物由来物質であり、生体で使用する際の安全面に問題があり、また、一度発生した活性酸素を捕捉することもできない。また、表面へ固定化が困難であり、表面の物理的安定が低い。
３）生体膜模倣ポリマーは、一度活性酸素が発生するとその活性酸素を捕捉することができない。
４）フリーラジカル捕捉剤を担持させたポリマーから形成される塗膜が抗血小板薬もしくは抗凝固薬を担持させたポリマーと異なり血液や生体に対して具体的にどのように作用するのか推測できない。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、生体または生体に由来する物質と接触する表面に対して容易、かつ、安定に固定できる材料を用い、生体適合性に関連して、広範にかつ、より具体的に有意な挙動を示すように該表面を改質するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは先に、触媒的に酸化還元を司るニトロキシラジカルを高分子に担持することにより生体内での代謝を回避し、ＲＯＳ消去剤として機能することを見出し提案した（特願２００８−１２０６２６及び特願２００８−１７８１５０）。今ここに、ＴＥＭＰＯ等のニトロキシドラジカルを側鎖に担持した一定の反復単位を含むポリマーが、生体または生体に由来する物質と接触する表面に安定に固定でき、該表面上でＲＯＳを消去もしくは吸収できることのみならず、該表面が、とくに、生体内の血液と人工物である材料とが接触した時に生じる血液の変性を低減乃至防止できることを見出した。これは、特許文献３が具体的に血液に関連するものとして、抗血小板薬、抗凝固薬、及び抗トロンビン薬、例えば、ヘパリンナトリウム、低分子ヘパリン、へパリノイド、ヒルジン、アルガトロパン、フォルスコリン、プロスタサイクリン等を使用することと明確に異なる。
【０００９】
したがって、本発明は、本発明は生体または生体に由来する物質と接触する表面の生体適合性を改質する方法であって、該表面に
環状ニトロキシドラジカル部分を担持する反復単位を、少なくとも、ポリマー主鎖の反復単位の１５％以上含んでなり、他の反復単位が存在する場合には、対応する環状ニトロキシラジカル部分が水素原子もしくは官能基である反復単位であるか、または該反復単位と一緒になってコポリマーを形成しうる別の反復単位を含み、かつ、環状ニトロキシドラジカル部分を担持する反復単位と存在する場合の他の反復単位は相互にランダムに存在するかまたはブロックを形成してもよい、ポリマーを固定する工程を含んでなる、上記方法が提供される。好ましくは、該ポリマーはフィルムまたは被膜として目的の表面に固定される。
【００１０】
本発明によれば、生体または生体に由来する物質と接触する表面とし、限定されるものでないが、ダイアライザー、コンタクトレンズ、人工血管、人工臓器、注射器、培養シャーレ、ピペットチップ、といった直接血液や血漿などの体液や細胞、組織などと接触する医療用具等の表面の生体適合性、特に血液適合性を改質乃至向上できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】表面処理例１のコーティング表面の反応ＴＥＭＰＯＬに対するソックスレー洗浄後のＥＳＲ測定結果を示す。
【図２】上記ＥＳＲ測定結果についてＥＳＲ強度を縦軸に、洗浄時間を横軸にプロットしたグラフ表示である。
【図３】ソックスレー洗浄後のコーティングのＥＳＲ測定結果を示す。
【図４】試験例１におけるＮＲＰランダムコポリマーに関する全血接触試験による血球数の変動についてのグラフ表示である。
【図５】製造例３で製造されたＰＣＭＳの１Ｈ ＮＭＲスペクトラムである。
【図６】製造例３で製造されたＰＣＭＳのＧＰＣの測定結果を示す。
【図７】表面処理例２で処理した表面のＸＰＳの測定結果を示す。
【図８】試験例２におけるＮＲＰホモポリマーに関する全血接触試験による血球数（Ａ：血小板、Ｂ：白血球）の変動についてのグラフ表示である。
【図９】試験例２におけるビーズ表面の電子顕微鏡写真である（左：ＴＥＭＰＯを含まないポリマー処理、右：ＴＥＭＰＯ含有ポリマー処理）。
【図１０】試験例３における活性酸素産生量の経時的な変動のグラフ表示である。
【図１１】試験例３におけるＴＥＭＰＯ導入率の異なる各ポリマーコート表面の活性酸素産生量のグラフ表示である。
【発明の詳細な記述】
【００１２】
本発明にいう、生体適合性とは、長期間にわたって生体に悪影響も強い刺激も与えず、本来の機能を果たしながら生体と共存できる属性をいう。生体は、人体をはじめ哺乳動物，その他の動物、さらには、植物を包含する概念で使用しており、したがって、生体に由来する物質とは、動物の器官、臓器、細胞、体液（例えば、ヒトにおいては血液、涙、唾液）等を意味する。
【００１３】
上記表面の改質に使用できる、ポリマーは、下記式（ａ）〜（ｐ）で表される反復単位を、少なくとも、ポリマー主鎖の反復単位の１５％以上、好ましくは２０％、より好ましくは３５％以上をランダムもしくはブロックを形成するように含むコポリマーであるか、またはすべての反復単位がそれらのいずれかの１種であるホモポリマーであることができる。
【００１４】
【化１】
【００１５】
【化２】
【００１６】
【化３】
【００１７】
【化４】
【００１８】
上式中、Ｒは環状ニトロキシドラジカル部分を表し、
ｎは、５〜１０，０００、好ましくは、５〜５，０００、より好ましくは５〜２，５００の整数を表す。
【００１９】
上記反復単位が、ポリマー主鎖の反復単位の１００％を占めない場合、存在し得る残りの反復単位は、上記環状ニトロキシドラジカル部分を表す、Ｒが水素原子であるか、または他の官能基を形成し得る基を有するランダムに存在するかもしくはブロックを形成するように存在する反復単位である。ポリハロメチルスチレン（ａ）において、他の官能基を形成し得る基は−（ＣＨ２）−ＯＲまたは−（ＣＨ２）−ＮＨＲの−ＯＲおよび−ＮＨＲがハロゲン原子、例えば、フッ素、塩素もしくは臭素原子であることができる。
【００２０】
これらの反復単位のうち、ポリハロメチルスチレンから誘導できる反復単位（ａ）：
【００２１】
【化５】
【００２２】
を好もしいものとして挙げることができる。このような反復単位を含むポリマーは、一般的に、これらの反復単位に起因して疎水性を示すが、それにもかかわらず、生体適合性を上記表面に付与することができる。
【００２３】
Ｒの環状ニトロキシラジカル部分は、必要により、連結基、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−、−（ＣＨ２）３−Ｏ−、−（ＣＨ２）３−Ｓ−、−ＣＯ（ＣＨ２）３−Ｏ−、−（ＣＨ２）３−Ｏ−等を介して結合することができる、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，４，４，−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル、および２，４，４−トリメチル−イミダゾリジン−３−オキシ−２−イル等から選ぶことができる。より具体的には、次式
【００２４】
【化６】
【００２５】
（式中、Ｒ’はメチル基である。）
のいずれかで表される環状ニトロキシドラジカル化合物の残基であることができる。
【００２６】
上記のポリマーは、例えば、下記の反復単位を含むそれ自体公知のポリマーに上記の環状ニトロキシドラジカル部分を導入することにより製造できる。なお、この導入は、下記の反復単位を有するそれ自体公知のポリマーを表面に塗布した後、ニトロキシラジカル部分を導入してもよい。塗布は、それ自体公知のポリマー溶液を用いる塗布等であることができる。
式：
【００２７】
【化７】
【００２８】
（ここで、ｐは１または２を表し、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリアミノ酸エステル鎖セグメント（ｉ）。
式：
【００２９】
【化８】
【００３０】
（ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、Ｒ２は水素原子またはＣ１−５アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリ（（メタ）アクリル酸エステル）鎖セグメント（ｉｉ）。
式：
【００３１】
【化９】
【００３２】
（ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるスチレン−無水マレイン酸共重合体鎖セグメント（ｉｉｉ）。
式：
【００３３】
【化１０】
【００３４】
（ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により
置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリリンゴ酸エステル鎖セグメント（ｉｖ）。
式：
【００３５】
【化１１】
【００３６】
（ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリアミック酸鎖セグメント（ｖ）。
式：
【００３７】
【化１２】
【００３８】
（ここで、Ｌ１は塩素、臭素またはヨウ素原子を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリ（ハロメチルスチレン）鎖セグメント（ｖｉ）。
式：
【００３９】
【化１３】
【００４０】
（ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリ（グリシジル メタクリレート）鎖セグメント（ｖｉｉ）。
式：
【００４１】
【化１４】
【００４２】
（ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリ（２−ヒドロキシエチル
メタクリレート）鎖セグメント（ｖｉｉｉ）。
式：
【００４３】
【化１５】
【００４４】
（ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリエピクロロヒドリン鎖セグメント（ｉｘ）。
式：
【００４５】
【化１６】
【００４６】
（ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリ−３，３−ビスクロロメチルオキセタン鎖セグメント（ｘ）。
【００４７】
環状ニトロキシドラジカルの上記反復単位を含むポリマーへの導入は、例えば、前者のラジカル以外の官能基（例えば、アミノ基、アミノメチル基、ヒドロキシル基、ヒドロキシメチル基、カルキシル基またはカルボメチル基）と上記反復単位における反応性基（ハロゲン原子、カルボキシル基、エステル基、酸無水物基、マレイミド基またはエポキシド基）を介して、それ自体公知の縮合または不可反応等を実施することにより達成できる。
【００４８】
本発明で使用できるポリマーが環状ニトロキシドラジカル部分を担持する反復単位（（ａ）〜（ｐ））以外の反復単位を有するコポリマーである場合、該コポリマーは、上記（ａ）〜（ｐ）で表される反復単位のＲが水素原子を表す反復単位、上記（ｉ）〜（ｘ）、あるいはまた、より具体的には、下記式（ｎは３〜１，０００の整数を表し、ｐは３〜５，０００の整数を表す。）で表される反復単位よりなる群から選ばれる反復単位であることができる。環状ニトロキシドラジカル部分を担持する反復単位（（ａ）〜（ｐ））のいずれかと、それ以外の反復単位は、ランダムに存在するかもしくはブロックを形成して存
在することができるが、好ましくはランダムに存在することができる。
【００４９】
【化１７】
【００５０】
【化１８】
【００５１】
【化１９】
【００５２】
【化２０】
【００５３】
本発明にいう、生体適合性は、上記の定義の範疇内のものであれば、限定されるものでないが、血液適合性に注目している。本発明にいう、かような血液適合性の改質とは、より具体的には、血液と対応する未処理の表面が接触した場合に生じる該表面への血球吸着が上記ポリマーの塗布された表面では抑制され（表面と接触する血液の血小板および／または白血球の減少が抑制される）、または、血液中の活性酸素量の増加が抑制されることを意図している。
【００５４】
したがって、本発明に従えば、ポリ（クロロメチルスチレン）（ＰＣＭＳ）のような反応性高分子に任意の割合でＴＥＭＰＯを導入し、残りの反応基を介して、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等をさらに導入した表面を形成することができる。これにより血液適合性だけでなく、ＲＯＳが関与していることが考えられているコンタクトレンズや培養シャーレなど様々な機器表面の改質が可能である。この残りの反応性基がハロゲン原子である場合、さらには発明者らが先に提案した、特願２００８−２３８１３３に開示したような大気圧プラズマにより該ハロゲン原子を介して対応するポリマーを表面に固定することもできる。
【００５５】
本発明では、安定なニトロキシドラジカルを有するホモポリマー、ランダムコポリマー（ＮＲＰ）の被膜を表面に固定することで血液と材料が接触した際の活性酸素を捕捉することが可能である。また、本発明によれば、上記ポリマーから本質的になり、遊離したＴＥＭＰＯＬやその他のヘモグロビン、アルブミン等を含めることなく形成したコーティングが上記の生体適合性を向上できるが、本発明の目的に悪影響を及ぼさない範囲でアルブミン等を併用してもよい。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
以下、本発明を、具体例を挙げて説明するが、本発明をこれらに限定することを意味しない。
【００５７】
製造例１：
（１）ＭＥＡ（２−メトキシメチルアクリレート）／ＣＭＳ（クロロメチルスチレン）のランダムコポリマー（ＰＣＭ）の合成
【００５８】
【化２１】
【００５９】
反応容器に撹拌子と反応開始剤としてのアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を加え、窒素置換を行った。そこに２０分窒素バブリングを行った１，４−ジオキサン、２−メトキシメチルアクリレート（ＭＥＡ）、クロロメチルスチレン（ＣＭＳ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）測定用の内部標準物質デカンを加えた。スターラーで撹拌しながら６５℃に加熱したオイルバスに反応容器を入れ重合を開始した。ＧＣ測定のため１時間毎にサンプルを０．５ｍＬ採取し、氷浴で冷却した後ＧＣ測定を行った。重合の停止はＧＣ測定によるＭＥＡ、ＣＭＳモノマーどちらかの転化率が８割程度になったところで行った。重合反応の停止は反応容器をオイルバスから取り出し、氷浴に浸けることにより行った。生成物は、冷却した大過剰のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に沈殿させ、デカンテーションを行った。この過程を３回繰り返すことで精製した。沈殿物をナスフラスコに回収し、ＩＰＡをエバポレーターにより蒸発させた後、少量のベンゼンに溶解させ、液体窒素で凍結させ、減圧下で凍結乾燥を行った。ベンゼン凍結乾燥後ＧＰＣ、およびＣＤＣｌ３を用いて１Ｈ ＮＭＲ測定を行った。ＧＰＣ測定に関しては、ＰＳ検量線を用いて分子量を決定した。表１に実際に行った重合の仕込み量を示す。
【００６０】
得られたＰＣＭの１Ｈ ＮＭＲおよびＰＣ測定結果を表２に示す。組成比については１Ｈ ＮＭＲ測定より求めた値である。
【００６１】
【表１】
【００６２】
【表２】
【００６３】
（２）反応容器に撹拌子とＰＣＭ ２０ｍｇを加え窒素置換を３回行った（容器[1]）。これと並行して別の容器に撹拌子、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ（ＴＥＭＰＯＬ）、ＮａＨ（ＴＥＭＰＯＬに対し２当量）を加え窒素置換を３回行った（容器[2]）。続いて両容器にそれぞれジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２ｍｌを加え、撹拌した。試薬が完全に混ざり合ったところで容器[2]の混合液を容器[1]に加え、一晩撹拌し反応させた。反応後、ＮａＨにより生じた塩を取り除くため反応溶液を吸引濾過した。濾液として得られた反応溶液はＴＥＭＰＯ含有ポリマー（ＮＲＰランダムコポリマー）溶液としてガラスビーズへのポリマーコーティングに用いた。
【００６４】
表面処理例１：ＮＲＰのガラスビーズへのコーティング
ガラスビーズへのポリマーのコーティングは溶媒留去法により行った。ＮＲＰランダムコポリマー溶液２ｍＬに７ｇガラスビーズを加え、浸潤させた。このビーズをシャーレに均一に広げデシケータにより真空下完全に乾燥を行った。次にこのポリマーコートビーズ７ｇを１５０ｍＬの蒸留水でソックスレー洗浄した。ＮＲＰ溶液中には、未反応のＴＥＭＰＯＬが存在するためポリマーコーティング後、未反応ＴＥＭＰＯＬを除去するためにソックスレー洗浄を行った。ソックスレー洗浄に関しては１時間毎に抽出液を０．５ｍＬ採取し、ＥＳＲ測定を行った。抽出液のＥＳＲシグナルがプラトーに達した（つまりビーズよりＴＥＭＰＯＬが流れでなくなった）のを確認できたところで洗浄を終了した。洗浄後、ビーズをゆっくりと吸引濾過した。ビーズがほぼ乾燥したら、シャーレへ均一に広げデシケータにより真空下完全に乾燥させた。以上の操作によりＮＲＰコートビーズを得た。
【００６５】
ソックスレー洗浄の抽出液を採取し、ＥＳＲ測定を行った結果を図１に示す。またＥＳＲ強度を縦軸、洗浄時間を横軸にプロットしたグラフを図２に示す。図２から７時間洗浄したところでＥＳＲ強度はプラトーに達していることが明らかとなった。したがって８時間のソックスレー洗浄でビーズ表面に存在するフリーのＴＥＭＰＯＬは、完全に除去されたことが示された。さらに抽出液のシグナル強度から、ガラスビーズ表面に存在するＴＥＭＰＯ量を求めた。その結果ＴＥＭＰＯはＣＭＳ基に対し１００％近く導入できていることが確認された。
【００６６】
１００ｍｇのＮＲＰコートビーズを１ｍＬクロロホルムに浸すことでコーティング層を抽出し、ＥＳＲ測定を行った結果を図３に示す。クロロホルム溶液からは、ＥＳＲシグナルが観察されソックスレー洗浄後もガラスビーズ表面にラジカルが存在することを確認した。通常、低分子ＴＥＭＰＯは希薄溶液中において、窒素核と不対電子の相互作用により３本線のスペクトルを示すが、検出されたＥＳＲシグナルは、溶液のラジカル（ＴＥＭＰＯ）濃度が低いにも関わらずブロードな１本線のスペクトルを示した。これは、ＰＣＭＳにＴＥＭＰＯが固定化されたことによってＴＥＭＰＯの運動性が低下し、スペクトルの線幅が増大した結果、スペクトルが３本線から１本線に変化したものと考えられる。したがってＴＥＭＰＯはＰＣＭＳポリマーに結合しており、ガラスビーズ表面にはＮＲＰランダムコポリマーがコートされていることが示唆された。
【００６７】
試験例１：ＮＲＰランダムコポリマーの全血接触試験
１００ｍｇのポリマーコートビーズを５００μＬチューブへ入れたもの及びコントロールとしてビーズの入っていないチューブに生理食塩水４０μＬを添加。ＳＤラット（オス、５−６週齢）から心臓採血により得たヘパリン濃度５ ＩＵ／ｍＬの血液を、各ポリマーコートビーズが入ったチューブへ４００μＬ分注し、室温にて２０分間混和を行った。混和はロータリーミキサーを用いてチューブが１分間に１回の割合で回転するように行った。所定時間混和後、直ちにｃｅｌｌｔａｃ α（ＮＩＨＯＮ ＫＯＨＤＥＮ）にて血球数を測定した。血球数については、コントロール（容器のみ）の値を１００％とし計算を行った。
【００６８】
図４にビーズと血液を２０分間接触混和させた際の血小板減少率示す。この結果から、ＰＣＭについてはＭＥＡの組成比が増加することで血小板減少が抑制されていくことが明らかとなった。ＴＥＭＰＯの導入効果については、全ての組成比のサンプルについてもＴＥＭＰＯを導入したＰＣＭＴの方がＰＣＭに比べ血小板減少が抑制できていることが図より明らかとなった。またＣＭＳの組成比が大きなポリマーほどＴＥＭＰＯ導入後の血小板減少抑制の効果が大きいことが分かった。これはＣＭＳの組成比が大きなポリマーほどより多くのＴＥＭＰＯが導入されたためだと考えられる。
【００６９】
製造例２：
（１）ポリクロロメチルスチレン（ＰＣＭＳ）の合成
反応容器に撹拌子とＡＩＢＮ（１ｍｍｏｌ、１６４．２ｍｇ）を加えた。次に反応容器中を真空にした後、窒素雰囲気下とした。この操作を３回繰り返すことにより、反応容器内を窒素雰囲気にした。そこに２０分間窒素バブリングを行ったジオキサン（５０ｍＬ）、ＣＭＳ（１００ｍｍｏｌ、１４．２ｍｇ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）測定用の内部標準物質ｎ−デカン（３ｍＬ）を加えた。スターラーで撹拌しながら６５℃に熱したオイルバスに反応容器を入れ重合を開始した。ＧＣ測定のため１時間毎にサンプルを０．５ｍＬ採取し、氷浴で冷却した後ＧＣ測定を行った。１８時間攪拌後、反応容器を氷浴につけ、重合反応を停止させた。生成物はメタノールを用いた再沈精製を行った。沈殿物をナスフラスコに回収し、メタノールをエバポレーターにより蒸発させた後、少量のベンゼンに溶解させ、液体窒素で凍結し、減圧下で凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、白色の粉末状のポリマーが９．６グラム得られ、収率は６３．２％となった。得られたポリマーはゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）測定およびＣＤＣｌ３を用いて１Ｈ ＮＭＲ測定を行った。ＧＰＣ測定に関しては、ＰＳ検量線を用いて分子量を決定した。ラジカル重合により得られたＰＣＭＳホモポリマーの１Ｈ ＮＭＲ測定結果よりＰＣＭＳホモポリマーが合成されていることが確認された（図５）。またＧＰＣ測定結果より数量平均分子量Ｍｎは１３０００、多分散度Ｍｗ／Ｍｎは２．１と決定された（図６）。
【００７０】
製造例および表面処理例２：ＰＣＭＳ−ＴＥＭＰＯ（ＮＲＰホモポリマー）の合成とコーティング
ＰＣＭＳ−ＴＥＭＰＯは、製造例１の（２）に記載の方法に準じて、以下のスキームにより合成した
【００７１】
【化２２】
【００７２】
ガラスビーズへのポリマーのコーティングは上記の表面処理例１と同様の方法を用いた。
【００７３】
ガラスビーズ表面へポリマーがコートされているかを確認するためＸＰＳ測定を行った。その結果を図７に示す。図７よりコーティングされていないガラスビーズに比べＰＣＭＳコートビーズ、ＰＣＭＳ−ＴＥＭＯ（ＮＲＰ）コートビーズのＣ元素ピークが大きいことが確認できる。このことからガラスビーズ表面に確かにポリマーがコートされていることが確認された。またＰＣＭＳコートビーズではＣｌ元素ピークが観察され、目的のポリマーがコート出来ていることが明らかとなった。
【００７４】
さらにＰＣＭＳ−ＴＥＭＰＯ（ＮＲＰ）コートビーズでは、Ｃｌ元素ピークは見られず、ＴＥＭＰＯ由来のＮ元素ピークが現れた。これはＴＥＭＰＯＬとＣＭＳ基が反応し、ポリマーからＣｌ元素が抜け、ＴＥＭＰＯが導入されたことを示す結果である。したがってＴＥＭＰＯはポリマーに結合した状態でガラスビーズ表面に存在していることが明らかとなった。以上の結果よりガラスビーズ表面にＮＲＰがコートされたことが確認された。
【００７５】
各ＴＥＭＰＯ仕込み比のＮＲＰについてもＸＰＳ測定を行い、Ｎ元素とＣｌ元素の比より、ＰＣＭＳへのＴＥＭＰＯの導入率を求めた。その結果を表３にまとめる。
【００７６】
表３より、ＴＥＭＰＯ仕込み比の増加に従いＴＥＭＰＯ導入量も増加していることがわかる。またＥＳＲ測定より求めたＴＥＭＰＯ導入率とＸＰＳ測定より求めた導入率は同等の値を示し、目的のポリマーがガラスビーズにコート出来ていることが明らかとなった。
【００７７】
【表３】
【００７８】
試験例２：ＰＣＭＳ−ＴＥＭＰＯ（ＮＲＰホモポリマー）コートビーズの全血接触試験
１００ｍｇのポリマーコートビーズを５００μＬチューブへ入れたもの及びコントロールとしてビーズの入っていないチューブに生理食塩水４０μＬを添加。ＳＤラット（オス、５−６週齢）から心臓採血により得たヘパリン濃度５ ＩＵ／ｍＬの血液を、各ポリマーコートビーズが入ったチューブへ４００μＬ分注し、室温にて３０分間混和を行った。混和はロータリーミキサーを用いてチューブが１分間に１回の割合で回転するように行った。所定時間混和後、直ちにｃｅｌｌｔａｃ α（ＮＩＨＯＮ ＫＯＨＤＥＮ）にて血球数を測定した。血球数については、コントロール（容器のみ）の値を１００％とし計算を行った。
【００７９】
ポリマーコートビーズに５ＩＵ／ｍＬ濃度ヘパリン化全血を接触させ、血小板数・白血球数を測定した結果を図８に示す。血小板減少はＰＣＭＳへのＴＥＭＰＯ導入率が増すにつれ、抑制されることが観察された。同様に白血球についてもＴＥＭＰＯ導入率が増すことで減少が抑制されることが観察された。これはビーズ表面に存在するＴＥＭＰＯにより、材料への血球吸着が抑制できることを示唆する結果である（図９）。図９のＳＥＭ画像からもＰＣＭＳ−ＴＥＭＰＯコートビーズは、ＰＣＭＳコートビーズよりも明らかに血球吸着が少なく、ＴＥＭＰＯ導入が表面と生体適合性を向上する効果をしめすことが確認された。
【００８０】
試験例３：活性酸素測定
ビーズと血液が接触した時に生じる活性酸素は、化学発光法により測定した。化学発光物質としては、スーパーオキシド特異的に発光を示す試薬ＭＰＥＣを用いた。９６ウェルプレートに各ポリマーコートビー５０ｍｇを加え、そこにエタノールに溶解させた１ｍＭ
ＭＰＥＣ溶液５０μＬを分注した。次に終濃度が１％となるようにＰＢＳ（１ｍＭ ｐＨ７．４）で２％に薄めた血液（５−６週齢ラットより心臓採血で得た全血）を５０μＬ分注し、直ちに発光量をマイクロプレートリーダーにより３０秒のインターバルで測定した。ビーズと血液との接触によって生じた活性酸素産生量を求めるため、ビーズを入れていない血液のみの時に生じる発光量を目的のサンプルの発光量から差し引いてバックグラウンドを補正した。その結果を図１０に示す。図１０より、ＰＣＭＳコートビーズ（Ｔ０−ｂｅａｄｓ）では、血液と接触後、発光量は徐々に増加していき活性酸素が産生されていることが観察された。一方ＰＣＭＳ−ＴＥＭＰＯコートビーズ（Ｔ９４−ｂｅａｄｓ）では、血液を接触後も発光量の増加が見られず、ほとんど活性酸素が産生されていなことが確認された。
【００８１】
次に異なるＴＥＭＰＯ導入率のＮＲＰコートビーズを用いて活性酸素産生量を測定した。９６ウェルプレートに各ＮＲＰコートビーズを加え、そこに１ｍＭ ＭＰＥＣ ５０ｍｌを分注した。次に終濃度が１％になるように二％希釈血液５０μＬを分注し、マイクロプレートリーダーを用いて１分間の発光量積算値を測定した（図１１）。図１１より、ＴＥＭＰＯの導入率が増すほど、発光量は小さくなり活性酸素の産生が抑制されていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明より安定ニトロキシラジカルを含むポリマーで一定の表面を処理することにより、無処理表面が血液と接触した際に生じる可能性のある血液の変性、例えば、活性酸素発生を抑制し血液の活性化を抑制することができる。したがって、本発明は、血液の吸着を防ぐため、血液と直接接触する人工血管や人工臓器などの表面コーティング剤に関連する技術分野の産業で利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体または生体に由来する物質と接触する表面の生体適合性を改質、特に、向上せしめる方法に関する。より具体的には、本発明は生体内の血液と人工物である材料とが接触した時に生じる血液の変性を低減乃至防止する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の医療工学の発展に伴い医療現場では、人工血管や人工心肺などの人工臓器が使用されるようになってきた。現在使用されている人工臓器の多くは高分子材料からできており、血液や生体組織と直接接触するものについては、生体適合性、特に、血液適合性や組織適合性が要求される。例えば、材料に血液が接触すると生体液は活性化され、酸化ストレスの上昇、血液の凝固反応や炎症反応を引き起こす。このとき活性化された白血球などの食細胞は、活性酸素種（ＲＯＳ）を産生すると伴に炎症性サイトカインを放出する。
【０００３】
現在までに血液の活性化を小さくするために親水性ポリマー、生体膜を模倣したポリマー、ミクロドメイン構造を持つポリマー、生理活性物質を固定化した表面など様々な研究がなされてきた（例えば、非特許文献１および非特許文献２参照）。最近ではアセチルコリン基を有する高分子（ＰＭＰＣ）やポリアクリル酸２−メトキシエチルなどの生体適合性の良い新規ポリマーが開発されて来ている（例えば、特許文献１および特許文献２参照）。これらの材料は比較的性能がよく、その一部は実用化されているものの、完全に問題が解決されているわけではない。たとえば親水性ポリマーは血小板の吸着は抑制するが血液の活性化反応については抑制することができないことが挙げられる。生理活性物質は動物由来物質であり安全面に問題があることや、生理活性の自然低下といった問題がある。最近、トコフェロールのような抗酸化剤を表面にコーティングしてＲＯＳの発生を抑える方法が一定の成果を上げているものの、高価で化学量論的反応のため、公算可能が継続しないという問題があった。また、医療用物品の表面を被覆するためのポリマー性キャリアとして、ポリ（ヒドロキアルカン酸エステル−ｃｏ−エステルアミド）の側鎖に活性酸素をはじめとするフリーラジカルの捕捉剤としての２，２’，６，６’−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシフリーラジカル（ＴＥＭＰＯ）を担持させたポリマーも提案されている（特許文献３参照）。なお、特許文献３では、上記フリーラジカル捕捉剤の他に、多種多様な薬剤、例えば、増殖抑制薬、抗血小板薬もしくは抗凝固薬、診断用薬剤を該ポリマーの側鎖に担持させることが提案されている。しかし、これらの薬剤を担持するポリマーで被覆された表面が具体的にどのような挙動を示すかを明らかにするデータは何ら開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−１６１９５４
【特許文献２】ＷＯ２００８／０２３６０４
【特許文献３】ＷＯ２００６／０７８３５６
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｅｇａｎ Ｃ．Ｆｒｏｓｔ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２６（２００５）１６８５-１６９３
【非特許文献２】Ｋａｚｕｈｉｋｏ Ｉｓｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｄｎ．１０（３）２７１−２８２（１９９９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記先行技術の問題点は、下記のようにまとめることができる。
１）親水性ポリマーのミクロ相分離膜は、一度活性酸素が発生するとその活性酸素を捕捉することができない。
２）生体活性物質を固定化した表面は、当該物質は、通常、動物由来物質であり、生体で使用する際の安全面に問題があり、また、一度発生した活性酸素を捕捉することもできない。また、表面へ固定化が困難であり、表面の物理的安定が低い。
３）生体膜模倣ポリマーは、一度活性酸素が発生するとその活性酸素を捕捉することができない。
４）フリーラジカル捕捉剤を担持させたポリマーから形成される塗膜が抗血小板薬もしくは抗凝固薬を担持させたポリマーと異なり血液や生体に対して具体的にどのように作用するのか推測できない。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、生体または生体に由来する物質と接触する表面に対して容易、かつ、安定に固定できる材料を用い、生体適合性に関連して、広範にかつ、より具体的に有意な挙動を示すように該表面を改質するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは先に、触媒的に酸化還元を司るニトロキシラジカルを高分子に担持することにより生体内での代謝を回避し、ＲＯＳ消去剤として機能することを見出し提案した（特願２００８−１２０６２６及び特願２００８−１７８１５０）。今ここに、ＴＥＭＰＯ等のニトロキシドラジカルを側鎖に担持した一定の反復単位を含むポリマーが、生体または生体に由来する物質と接触する表面に安定に固定でき、該表面上でＲＯＳを消去もしくは吸収できることのみならず、該表面が、とくに、生体内の血液と人工物である材料とが接触した時に生じる血液の変性を低減乃至防止できることを見出した。これは、特許文献３が具体的に血液に関連するものとして、抗血小板薬、抗凝固薬、及び抗トロンビン薬、例えば、ヘパリンナトリウム、低分子ヘパリン、へパリノイド、ヒルジン、アルガトロパン、フォルスコリン、プロスタサイクリン等を使用することと明確に異なる。
【０００９】
したがって、本発明は、本発明は生体または生体に由来する物質と接触する表面の生体適合性を改質する方法であって、該表面に
環状ニトロキシドラジカル部分を担持する反復単位を、少なくとも、ポリマー主鎖の反復単位の１５％以上含んでなり、他の反復単位が存在する場合には、対応する環状ニトロキシラジカル部分が水素原子もしくは官能基である反復単位であるか、または該反復単位と一緒になってコポリマーを形成しうる別の反復単位を含み、かつ、環状ニトロキシドラジカル部分を担持する反復単位と存在する場合の他の反復単位は相互にランダムに存在するかまたはブロックを形成してもよい、ポリマーを固定する工程を含んでなる、上記方法が提供される。好ましくは、該ポリマーはフィルムまたは被膜として目的の表面に固定される。
【００１０】
本発明によれば、生体または生体に由来する物質と接触する表面とし、限定されるものでないが、ダイアライザー、コンタクトレンズ、人工血管、人工臓器、注射器、培養シャーレ、ピペットチップ、といった直接血液や血漿などの体液や細胞、組織などと接触する医療用具等の表面の生体適合性、特に血液適合性を改質乃至向上できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】表面処理例１のコーティング表面の反応ＴＥＭＰＯＬに対するソックスレー洗浄後のＥＳＲ測定結果を示す。
【図２】上記ＥＳＲ測定結果についてＥＳＲ強度を縦軸に、洗浄時間を横軸にプロットしたグラフ表示である。
【図３】ソックスレー洗浄後のコーティングのＥＳＲ測定結果を示す。
【図４】試験例１におけるＮＲＰランダムコポリマーに関する全血接触試験による血球数の変動についてのグラフ表示である。
【図５】製造例３で製造されたＰＣＭＳの１Ｈ ＮＭＲスペクトラムである。
【図６】製造例３で製造されたＰＣＭＳのＧＰＣの測定結果を示す。
【図７】表面処理例２で処理した表面のＸＰＳの測定結果を示す。
【図８】試験例２におけるＮＲＰホモポリマーに関する全血接触試験による血球数（Ａ：血小板、Ｂ：白血球）の変動についてのグラフ表示である。
【図９】試験例２におけるビーズ表面の電子顕微鏡写真である（左：ＴＥＭＰＯを含まないポリマー処理、右：ＴＥＭＰＯ含有ポリマー処理）。
【図１０】試験例３における活性酸素産生量の経時的な変動のグラフ表示である。
【図１１】試験例３におけるＴＥＭＰＯ導入率の異なる各ポリマーコート表面の活性酸素産生量のグラフ表示である。
【発明の詳細な記述】
【００１２】
本発明にいう、生体適合性とは、長期間にわたって生体に悪影響も強い刺激も与えず、本来の機能を果たしながら生体と共存できる属性をいう。生体は、人体をはじめ哺乳動物，その他の動物、さらには、植物を包含する概念で使用しており、したがって、生体に由来する物質とは、動物の器官、臓器、細胞、体液（例えば、ヒトにおいては血液、涙、唾液）等を意味する。
【００１３】
上記表面の改質に使用できる、ポリマーは、下記式（ａ）〜（ｐ）で表される反復単位を、少なくとも、ポリマー主鎖の反復単位の１５％以上、好ましくは２０％、より好ましくは３５％以上をランダムもしくはブロックを形成するように含むコポリマーであるか、またはすべての反復単位がそれらのいずれかの１種であるホモポリマーであることができる。
【００１４】
【化１】
【００１５】
【化２】
【００１６】
【化３】
【００１７】
【化４】
【００１８】
上式中、Ｒは環状ニトロキシドラジカル部分を表し、
ｎは、５〜１０，０００、好ましくは、５〜５，０００、より好ましくは５〜２，５００の整数を表す。
【００１９】
上記反復単位が、ポリマー主鎖の反復単位の１００％を占めない場合、存在し得る残りの反復単位は、上記環状ニトロキシドラジカル部分を表す、Ｒが水素原子であるか、または他の官能基を形成し得る基を有するランダムに存在するかもしくはブロックを形成するように存在する反復単位である。ポリハロメチルスチレン（ａ）において、他の官能基を形成し得る基は−（ＣＨ２）−ＯＲまたは−（ＣＨ２）−ＮＨＲの−ＯＲおよび−ＮＨＲがハロゲン原子、例えば、フッ素、塩素もしくは臭素原子であることができる。
【００２０】
これらの反復単位のうち、ポリハロメチルスチレンから誘導できる反復単位（ａ）：
【００２１】
【化５】
【００２２】
を好もしいものとして挙げることができる。このような反復単位を含むポリマーは、一般的に、これらの反復単位に起因して疎水性を示すが、それにもかかわらず、生体適合性を上記表面に付与することができる。
【００２３】
Ｒの環状ニトロキシラジカル部分は、必要により、連結基、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−、−（ＣＨ２）３−Ｏ−、−（ＣＨ２）３−Ｓ−、−ＣＯ（ＣＨ２）３−Ｏ−、−（ＣＨ２）３−Ｏ−等を介して結合することができる、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，４，４，−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル、および２，４，４−トリメチル−イミダゾリジン−３−オキシ−２−イル等から選ぶことができる。より具体的には、次式
【００２４】
【化６】
【００２５】
（式中、Ｒ’はメチル基である。）
のいずれかで表される環状ニトロキシドラジカル化合物の残基であることができる。
【００２６】
上記のポリマーは、例えば、下記の反復単位を含むそれ自体公知のポリマーに上記の環状ニトロキシドラジカル部分を導入することにより製造できる。なお、この導入は、下記の反復単位を有するそれ自体公知のポリマーを表面に塗布した後、ニトロキシラジカル部分を導入してもよい。塗布は、それ自体公知のポリマー溶液を用いる塗布等であることができる。
式：
【００２７】
【化７】
【００２８】
（ここで、ｐは１または２を表し、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリアミノ酸エステル鎖セグメント（ｉ）。
式：
【００２９】
【化８】
【００３０】
（ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、Ｒ２は水素原子またはＣ１−５アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリ（（メタ）アクリル酸エステル）鎖セグメント（ｉｉ）。
式：
【００３１】
【化９】
【００３２】
（ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるスチレン−無水マレイン酸共重合体鎖セグメント（ｉｉｉ）。
式：
【００３３】
【化１０】
【００３４】
（ここで、Ｒ１は非結合末端において１個のフェニル基もしくはベンズヒドリル基により
置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリリンゴ酸エステル鎖セグメント（ｉｖ）。
式：
【００３５】
【化１１】
【００３６】
（ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリアミック酸鎖セグメント（ｖ）。
式：
【００３７】
【化１２】
【００３８】
（ここで、Ｌ１は塩素、臭素またはヨウ素原子を表し、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリ（ハロメチルスチレン）鎖セグメント（ｖｉ）。
式：
【００３９】
【化１３】
【００４０】
（ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリ（グリシジル メタクリレート）鎖セグメント（ｖｉｉ）。
式：
【００４１】
【化１４】
【００４２】
（ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリ（２−ヒドロキシエチル
メタクリレート）鎖セグメント（ｖｉｉｉ）。
式：
【００４３】
【化１５】
【００４４】
（ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリエピクロロヒドリン鎖セグメント（ｉｘ）。
式：
【００４５】
【化１６】
【００４６】
（ここで、ｎは３〜１，０００の整数を表す。）で表されるポリ−３，３−ビスクロロメチルオキセタン鎖セグメント（ｘ）。
【００４７】
環状ニトロキシドラジカルの上記反復単位を含むポリマーへの導入は、例えば、前者のラジカル以外の官能基（例えば、アミノ基、アミノメチル基、ヒドロキシル基、ヒドロキシメチル基、カルキシル基またはカルボメチル基）と上記反復単位における反応性基（ハロゲン原子、カルボキシル基、エステル基、酸無水物基、マレイミド基またはエポキシド基）を介して、それ自体公知の縮合または不可反応等を実施することにより達成できる。
【００４８】
本発明で使用できるポリマーが環状ニトロキシドラジカル部分を担持する反復単位（（ａ）〜（ｐ））以外の反復単位を有するコポリマーである場合、該コポリマーは、上記（ａ）〜（ｐ）で表される反復単位のＲが水素原子を表す反復単位、上記（ｉ）〜（ｘ）、あるいはまた、より具体的には、下記式（ｎは３〜１，０００の整数を表し、ｐは３〜５，０００の整数を表す。）で表される反復単位よりなる群から選ばれる反復単位であることができる。環状ニトロキシドラジカル部分を担持する反復単位（（ａ）〜（ｐ））のいずれかと、それ以外の反復単位は、ランダムに存在するかもしくはブロックを形成して存
在することができるが、好ましくはランダムに存在することができる。
【００４９】
【化１７】
【００５０】
【化１８】
【００５１】
【化１９】
【００５２】
【化２０】
【００５３】
本発明にいう、生体適合性は、上記の定義の範疇内のものであれば、限定されるものでないが、血液適合性に注目している。本発明にいう、かような血液適合性の改質とは、より具体的には、血液と対応する未処理の表面が接触した場合に生じる該表面への血球吸着が上記ポリマーの塗布された表面では抑制され（表面と接触する血液の血小板および／または白血球の減少が抑制される）、または、血液中の活性酸素量の増加が抑制されることを意図している。
【００５４】
したがって、本発明に従えば、ポリ（クロロメチルスチレン）（ＰＣＭＳ）のような反応性高分子に任意の割合でＴＥＭＰＯを導入し、残りの反応基を介して、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等をさらに導入した表面を形成することができる。これにより血液適合性だけでなく、ＲＯＳが関与していることが考えられているコンタクトレンズや培養シャーレなど様々な機器表面の改質が可能である。この残りの反応性基がハロゲン原子である場合、さらには発明者らが先に提案した、特願２００８−２３８１３３に開示したような大気圧プラズマにより該ハロゲン原子を介して対応するポリマーを表面に固定することもできる。
【００５５】
本発明では、安定なニトロキシドラジカルを有するホモポリマー、ランダムコポリマー（ＮＲＰ）の被膜を表面に固定することで血液と材料が接触した際の活性酸素を捕捉することが可能である。また、本発明によれば、上記ポリマーから本質的になり、遊離したＴＥＭＰＯＬやその他のヘモグロビン、アルブミン等を含めることなく形成したコーティングが上記の生体適合性を向上できるが、本発明の目的に悪影響を及ぼさない範囲でアルブミン等を併用してもよい。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
以下、本発明を、具体例を挙げて説明するが、本発明をこれらに限定することを意味しない。
【００５７】
製造例１：
（１）ＭＥＡ（２−メトキシメチルアクリレート）／ＣＭＳ（クロロメチルスチレン）のランダムコポリマー（ＰＣＭ）の合成
【００５８】
【化２１】
【００５９】
反応容器に撹拌子と反応開始剤としてのアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を加え、窒素置換を行った。そこに２０分窒素バブリングを行った１，４−ジオキサン、２−メトキシメチルアクリレート（ＭＥＡ）、クロロメチルスチレン（ＣＭＳ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）測定用の内部標準物質デカンを加えた。スターラーで撹拌しながら６５℃に加熱したオイルバスに反応容器を入れ重合を開始した。ＧＣ測定のため１時間毎にサンプルを０．５ｍＬ採取し、氷浴で冷却した後ＧＣ測定を行った。重合の停止はＧＣ測定によるＭＥＡ、ＣＭＳモノマーどちらかの転化率が８割程度になったところで行った。重合反応の停止は反応容器をオイルバスから取り出し、氷浴に浸けることにより行った。生成物は、冷却した大過剰のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に沈殿させ、デカンテーションを行った。この過程を３回繰り返すことで精製した。沈殿物をナスフラスコに回収し、ＩＰＡをエバポレーターにより蒸発させた後、少量のベンゼンに溶解させ、液体窒素で凍結させ、減圧下で凍結乾燥を行った。ベンゼン凍結乾燥後ＧＰＣ、およびＣＤＣｌ３を用いて１Ｈ ＮＭＲ測定を行った。ＧＰＣ測定に関しては、ＰＳ検量線を用いて分子量を決定した。表１に実際に行った重合の仕込み量を示す。
【００６０】
得られたＰＣＭの１Ｈ ＮＭＲおよびＰＣ測定結果を表２に示す。組成比については１Ｈ ＮＭＲ測定より求めた値である。
【００６１】
【表１】
【００６２】
【表２】
【００６３】
（２）反応容器に撹拌子とＰＣＭ ２０ｍｇを加え窒素置換を３回行った（容器[1]）。これと並行して別の容器に撹拌子、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ（ＴＥＭＰＯＬ）、ＮａＨ（ＴＥＭＰＯＬに対し２当量）を加え窒素置換を３回行った（容器[2]）。続いて両容器にそれぞれジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２ｍｌを加え、撹拌した。試薬が完全に混ざり合ったところで容器[2]の混合液を容器[1]に加え、一晩撹拌し反応させた。反応後、ＮａＨにより生じた塩を取り除くため反応溶液を吸引濾過した。濾液として得られた反応溶液はＴＥＭＰＯ含有ポリマー（ＮＲＰランダムコポリマー）溶液としてガラスビーズへのポリマーコーティングに用いた。
【００６４】
表面処理例１：ＮＲＰのガラスビーズへのコーティング
ガラスビーズへのポリマーのコーティングは溶媒留去法により行った。ＮＲＰランダムコポリマー溶液２ｍＬに７ｇガラスビーズを加え、浸潤させた。このビーズをシャーレに均一に広げデシケータにより真空下完全に乾燥を行った。次にこのポリマーコートビーズ７ｇを１５０ｍＬの蒸留水でソックスレー洗浄した。ＮＲＰ溶液中には、未反応のＴＥＭＰＯＬが存在するためポリマーコーティング後、未反応ＴＥＭＰＯＬを除去するためにソックスレー洗浄を行った。ソックスレー洗浄に関しては１時間毎に抽出液を０．５ｍＬ採取し、ＥＳＲ測定を行った。抽出液のＥＳＲシグナルがプラトーに達した（つまりビーズよりＴＥＭＰＯＬが流れでなくなった）のを確認できたところで洗浄を終了した。洗浄後、ビーズをゆっくりと吸引濾過した。ビーズがほぼ乾燥したら、シャーレへ均一に広げデシケータにより真空下完全に乾燥させた。以上の操作によりＮＲＰコートビーズを得た。
【００６５】
ソックスレー洗浄の抽出液を採取し、ＥＳＲ測定を行った結果を図１に示す。またＥＳＲ強度を縦軸、洗浄時間を横軸にプロットしたグラフを図２に示す。図２から７時間洗浄したところでＥＳＲ強度はプラトーに達していることが明らかとなった。したがって８時間のソックスレー洗浄でビーズ表面に存在するフリーのＴＥＭＰＯＬは、完全に除去されたことが示された。さらに抽出液のシグナル強度から、ガラスビーズ表面に存在するＴＥＭＰＯ量を求めた。その結果ＴＥＭＰＯはＣＭＳ基に対し１００％近く導入できていることが確認された。
【００６６】
１００ｍｇのＮＲＰコートビーズを１ｍＬクロロホルムに浸すことでコーティング層を抽出し、ＥＳＲ測定を行った結果を図３に示す。クロロホルム溶液からは、ＥＳＲシグナルが観察されソックスレー洗浄後もガラスビーズ表面にラジカルが存在することを確認した。通常、低分子ＴＥＭＰＯは希薄溶液中において、窒素核と不対電子の相互作用により３本線のスペクトルを示すが、検出されたＥＳＲシグナルは、溶液のラジカル（ＴＥＭＰＯ）濃度が低いにも関わらずブロードな１本線のスペクトルを示した。これは、ＰＣＭＳにＴＥＭＰＯが固定化されたことによってＴＥＭＰＯの運動性が低下し、スペクトルの線幅が増大した結果、スペクトルが３本線から１本線に変化したものと考えられる。したがってＴＥＭＰＯはＰＣＭＳポリマーに結合しており、ガラスビーズ表面にはＮＲＰランダムコポリマーがコートされていることが示唆された。
【００６７】
試験例１：ＮＲＰランダムコポリマーの全血接触試験
１００ｍｇのポリマーコートビーズを５００μＬチューブへ入れたもの及びコントロールとしてビーズの入っていないチューブに生理食塩水４０μＬを添加。ＳＤラット（オス、５−６週齢）から心臓採血により得たヘパリン濃度５ ＩＵ／ｍＬの血液を、各ポリマーコートビーズが入ったチューブへ４００μＬ分注し、室温にて２０分間混和を行った。混和はロータリーミキサーを用いてチューブが１分間に１回の割合で回転するように行った。所定時間混和後、直ちにｃｅｌｌｔａｃ α（ＮＩＨＯＮ ＫＯＨＤＥＮ）にて血球数を測定した。血球数については、コントロール（容器のみ）の値を１００％とし計算を行った。
【００６８】
図４にビーズと血液を２０分間接触混和させた際の血小板減少率示す。この結果から、ＰＣＭについてはＭＥＡの組成比が増加することで血小板減少が抑制されていくことが明らかとなった。ＴＥＭＰＯの導入効果については、全ての組成比のサンプルについてもＴＥＭＰＯを導入したＰＣＭＴの方がＰＣＭに比べ血小板減少が抑制できていることが図より明らかとなった。またＣＭＳの組成比が大きなポリマーほどＴＥＭＰＯ導入後の血小板減少抑制の効果が大きいことが分かった。これはＣＭＳの組成比が大きなポリマーほどより多くのＴＥＭＰＯが導入されたためだと考えられる。
【００６９】
製造例２：
（１）ポリクロロメチルスチレン（ＰＣＭＳ）の合成
反応容器に撹拌子とＡＩＢＮ（１ｍｍｏｌ、１６４．２ｍｇ）を加えた。次に反応容器中を真空にした後、窒素雰囲気下とした。この操作を３回繰り返すことにより、反応容器内を窒素雰囲気にした。そこに２０分間窒素バブリングを行ったジオキサン（５０ｍＬ）、ＣＭＳ（１００ｍｍｏｌ、１４．２ｍｇ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）測定用の内部標準物質ｎ−デカン（３ｍＬ）を加えた。スターラーで撹拌しながら６５℃に熱したオイルバスに反応容器を入れ重合を開始した。ＧＣ測定のため１時間毎にサンプルを０．５ｍＬ採取し、氷浴で冷却した後ＧＣ測定を行った。１８時間攪拌後、反応容器を氷浴につけ、重合反応を停止させた。生成物はメタノールを用いた再沈精製を行った。沈殿物をナスフラスコに回収し、メタノールをエバポレーターにより蒸発させた後、少量のベンゼンに溶解させ、液体窒素で凍結し、減圧下で凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、白色の粉末状のポリマーが９．６グラム得られ、収率は６３．２％となった。得られたポリマーはゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）測定およびＣＤＣｌ３を用いて１Ｈ ＮＭＲ測定を行った。ＧＰＣ測定に関しては、ＰＳ検量線を用いて分子量を決定した。ラジカル重合により得られたＰＣＭＳホモポリマーの１Ｈ ＮＭＲ測定結果よりＰＣＭＳホモポリマーが合成されていることが確認された（図５）。またＧＰＣ測定結果より数量平均分子量Ｍｎは１３０００、多分散度Ｍｗ／Ｍｎは２．１と決定された（図６）。
【００７０】
製造例および表面処理例２：ＰＣＭＳ−ＴＥＭＰＯ（ＮＲＰホモポリマー）の合成とコーティング
ＰＣＭＳ−ＴＥＭＰＯは、製造例１の（２）に記載の方法に準じて、以下のスキームにより合成した
【００７１】
【化２２】
【００７２】
ガラスビーズへのポリマーのコーティングは上記の表面処理例１と同様の方法を用いた。
【００７３】
ガラスビーズ表面へポリマーがコートされているかを確認するためＸＰＳ測定を行った。その結果を図７に示す。図７よりコーティングされていないガラスビーズに比べＰＣＭＳコートビーズ、ＰＣＭＳ−ＴＥＭＯ（ＮＲＰ）コートビーズのＣ元素ピークが大きいことが確認できる。このことからガラスビーズ表面に確かにポリマーがコートされていることが確認された。またＰＣＭＳコートビーズではＣｌ元素ピークが観察され、目的のポリマーがコート出来ていることが明らかとなった。
【００７４】
さらにＰＣＭＳ−ＴＥＭＰＯ（ＮＲＰ）コートビーズでは、Ｃｌ元素ピークは見られず、ＴＥＭＰＯ由来のＮ元素ピークが現れた。これはＴＥＭＰＯＬとＣＭＳ基が反応し、ポリマーからＣｌ元素が抜け、ＴＥＭＰＯが導入されたことを示す結果である。したがってＴＥＭＰＯはポリマーに結合した状態でガラスビーズ表面に存在していることが明らかとなった。以上の結果よりガラスビーズ表面にＮＲＰがコートされたことが確認された。
【００７５】
各ＴＥＭＰＯ仕込み比のＮＲＰについてもＸＰＳ測定を行い、Ｎ元素とＣｌ元素の比より、ＰＣＭＳへのＴＥＭＰＯの導入率を求めた。その結果を表３にまとめる。
【００７６】
表３より、ＴＥＭＰＯ仕込み比の増加に従いＴＥＭＰＯ導入量も増加していることがわかる。またＥＳＲ測定より求めたＴＥＭＰＯ導入率とＸＰＳ測定より求めた導入率は同等の値を示し、目的のポリマーがガラスビーズにコート出来ていることが明らかとなった。
【００７７】
【表３】
【００７８】
試験例２：ＰＣＭＳ−ＴＥＭＰＯ（ＮＲＰホモポリマー）コートビーズの全血接触試験
１００ｍｇのポリマーコートビーズを５００μＬチューブへ入れたもの及びコントロールとしてビーズの入っていないチューブに生理食塩水４０μＬを添加。ＳＤラット（オス、５−６週齢）から心臓採血により得たヘパリン濃度５ ＩＵ／ｍＬの血液を、各ポリマーコートビーズが入ったチューブへ４００μＬ分注し、室温にて３０分間混和を行った。混和はロータリーミキサーを用いてチューブが１分間に１回の割合で回転するように行った。所定時間混和後、直ちにｃｅｌｌｔａｃ α（ＮＩＨＯＮ ＫＯＨＤＥＮ）にて血球数を測定した。血球数については、コントロール（容器のみ）の値を１００％とし計算を行った。
【００７９】
ポリマーコートビーズに５ＩＵ／ｍＬ濃度ヘパリン化全血を接触させ、血小板数・白血球数を測定した結果を図８に示す。血小板減少はＰＣＭＳへのＴＥＭＰＯ導入率が増すにつれ、抑制されることが観察された。同様に白血球についてもＴＥＭＰＯ導入率が増すことで減少が抑制されることが観察された。これはビーズ表面に存在するＴＥＭＰＯにより、材料への血球吸着が抑制できることを示唆する結果である（図９）。図９のＳＥＭ画像からもＰＣＭＳ−ＴＥＭＰＯコートビーズは、ＰＣＭＳコートビーズよりも明らかに血球吸着が少なく、ＴＥＭＰＯ導入が表面と生体適合性を向上する効果をしめすことが確認された。
【００８０】
試験例３：活性酸素測定
ビーズと血液が接触した時に生じる活性酸素は、化学発光法により測定した。化学発光物質としては、スーパーオキシド特異的に発光を示す試薬ＭＰＥＣを用いた。９６ウェルプレートに各ポリマーコートビー５０ｍｇを加え、そこにエタノールに溶解させた１ｍＭ
ＭＰＥＣ溶液５０μＬを分注した。次に終濃度が１％となるようにＰＢＳ（１ｍＭ ｐＨ７．４）で２％に薄めた血液（５−６週齢ラットより心臓採血で得た全血）を５０μＬ分注し、直ちに発光量をマイクロプレートリーダーにより３０秒のインターバルで測定した。ビーズと血液との接触によって生じた活性酸素産生量を求めるため、ビーズを入れていない血液のみの時に生じる発光量を目的のサンプルの発光量から差し引いてバックグラウンドを補正した。その結果を図１０に示す。図１０より、ＰＣＭＳコートビーズ（Ｔ０−ｂｅａｄｓ）では、血液と接触後、発光量は徐々に増加していき活性酸素が産生されていることが観察された。一方ＰＣＭＳ−ＴＥＭＰＯコートビーズ（Ｔ９４−ｂｅａｄｓ）では、血液を接触後も発光量の増加が見られず、ほとんど活性酸素が産生されていなことが確認された。
【００８１】
次に異なるＴＥＭＰＯ導入率のＮＲＰコートビーズを用いて活性酸素産生量を測定した。９６ウェルプレートに各ＮＲＰコートビーズを加え、そこに１ｍＭ ＭＰＥＣ ５０ｍｌを分注した。次に終濃度が１％になるように二％希釈血液５０μＬを分注し、マイクロプレートリーダーを用いて１分間の発光量積算値を測定した（図１１）。図１１より、ＴＥＭＰＯの導入率が増すほど、発光量は小さくなり活性酸素の産生が抑制されていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明より安定ニトロキシラジカルを含むポリマーで一定の表面を処理することにより、無処理表面が血液と接触した際に生じる可能性のある血液の変性、例えば、活性酸素発生を抑制し血液の活性化を抑制することができる。したがって、本発明は、血液の吸着を防ぐため、血液と直接接触する人工血管や人工臓器などの表面コーティング剤に関連する技術分野の産業で利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体または生体に由来する物質と接触する表面の生体適合性を改質する方法であって、該表面に
下記式で表される、環状ニトロキシドラジカル部分を担持する反復単位よりなる群から選ばれるいずれか１種の単位を、少なくとも、ポリマー主鎖の反復単位の１５％以上含んでなり、他の反復単位が存在する場合には、対応する単位の環状ニトロキシドラジカル部分が水素原子もしくは他の官能基を形成し得る基である反復単位または該反復単位と一緒になってコポリマーを形成しうる反復単位を含む、ポリマーを固定する工程を含んでなる、上記方法：
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
上式中、Ｒは環状ニトロキシドラジカル部分を表し、
ｎは、５〜１０，０００の整数を表す。
【請求項２】
環状ニトロキシドラジカル部分が、Ｒの環状ニトロキシラジカル部分は、必要により、連結基、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−、−（ＣＨ２）３−Ｏ−、−（ＣＨ２）３−Ｓ−、−ＣＯ（ＣＨ２）３−Ｏ−、−（ＣＨ２）３−Ｏ−等を介して結合することができる、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，４，４，−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル、および２，４，４−トリメチル−イミダゾリジン−３−オキシ−２−イルよりなる群から選ばれる，請求項１記載の方法。
【請求項３】
生体適合性が、血液適合性である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法であって、生体適合性の改質が、血液と未処理の表面が接触した場合に生じる該表面への血球吸着の抑制または血液中の活性酸素量の増加の抑制する性質である、上記方法。
【請求項５】
環状ニトロキシドラジカル部分を担持する反復単位が、ポリハロメチルスチレン（ａ）：
【化５】
のいずれかであり、該単位が少なくとも、ポリマー主鎖の反復単位の２５％以上含んでなり、他の反復単位が存在する場合の反復単位が，上記式（ａ）のＲが水素原子で表される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
環状ニトロキシドラジカル部分を担持する反復単位が、ポリハロメチルスチレン由来の反復単位（ａ）：
【化６】
のいずれかであり、該単位が少なくとも、ポリマー主鎖の反復単位の２５％以上含んでなり、他の反復単位が存在する場合の反復単位が下記式で表される反復単位よりなる群から選ばれる反復単位である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法：
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
（上式中、ｎは３〜１，０００の整数を表し、ｐは３〜５，０００の整数を表す。）。
【請求項７】
一般式Ｉ：
−Ａ−Ｂ−
で表され、かつ、
Ａが、式
【化１１】
（式中、ｎは５〜１０，０００の整数を表す。）
で表され、かつ、Ｒが式
【化１２】
（式中、Ｒ’はメチル基である。）のいずれかで表される、反復単位よりなる群から選ばれ、そして
Ｂが、式
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
（上式中、ｎは３〜１，０００の整数を表し、ｐは３〜５，０００の整数を表す。）
で表される反復単位よりなる群から選ばれる反復単位
を含んでなるランダムコポリマー。
【請求項１】
生体または生体に由来する物質と接触する表面の生体適合性を改質する方法であって、該表面に
下記式で表される、環状ニトロキシドラジカル部分を担持する反復単位よりなる群から選ばれるいずれか１種の単位を、少なくとも、ポリマー主鎖の反復単位の１５％以上含んでなり、他の反復単位が存在する場合には、対応する単位の環状ニトロキシドラジカル部分が水素原子もしくは他の官能基を形成し得る基である反復単位または該反復単位と一緒になってコポリマーを形成しうる反復単位を含む、ポリマーを固定する工程を含んでなる、上記方法：
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
上式中、Ｒは環状ニトロキシドラジカル部分を表し、
ｎは、５〜１０，０００の整数を表す。
【請求項２】
環状ニトロキシドラジカル部分が、Ｒの環状ニトロキシラジカル部分は、必要により、連結基、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−、−（ＣＨ２）３−Ｏ−、−（ＣＨ２）３−Ｓ−、−ＣＯ（ＣＨ２）３−Ｏ−、−（ＣＨ２）３−Ｏ−等を介して結合することができる、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，４，４，−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル、および２，４，４−トリメチル−イミダゾリジン−３−オキシ−２−イルよりなる群から選ばれる，請求項１記載の方法。
【請求項３】
生体適合性が、血液適合性である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法であって、生体適合性の改質が、血液と未処理の表面が接触した場合に生じる該表面への血球吸着の抑制または血液中の活性酸素量の増加の抑制する性質である、上記方法。
【請求項５】
環状ニトロキシドラジカル部分を担持する反復単位が、ポリハロメチルスチレン（ａ）：
【化５】
のいずれかであり、該単位が少なくとも、ポリマー主鎖の反復単位の２５％以上含んでなり、他の反復単位が存在する場合の反復単位が，上記式（ａ）のＲが水素原子で表される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
環状ニトロキシドラジカル部分を担持する反復単位が、ポリハロメチルスチレン由来の反復単位（ａ）：
【化６】
のいずれかであり、該単位が少なくとも、ポリマー主鎖の反復単位の２５％以上含んでなり、他の反復単位が存在する場合の反復単位が下記式で表される反復単位よりなる群から選ばれる反復単位である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法：
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
（上式中、ｎは３〜１，０００の整数を表し、ｐは３〜５，０００の整数を表す。）。
【請求項７】
一般式Ｉ：
−Ａ−Ｂ−
で表され、かつ、
Ａが、式
【化１１】
（式中、ｎは５〜１０，０００の整数を表す。）
で表され、かつ、Ｒが式
【化１２】
（式中、Ｒ’はメチル基である。）のいずれかで表される、反復単位よりなる群から選ばれ、そして
Ｂが、式
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
（上式中、ｎは３〜１，０００の整数を表し、ｐは３〜５，０００の整数を表す。）
で表される反復単位よりなる群から選ばれる反復単位
を含んでなるランダムコポリマー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１１−７８７０６（Ｐ２０１１−７８７０６Ａ）
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３５７２３（Ｐ２００９−２３５７２３）
【出願日】平成２１年１０月９日（２００９．１０．９）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月９日（２００９．１０．９）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【出願人】（８０３０００１１５）学校法人東京理科大学 (545)
【Ｆターム（参考）】
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