試料処理方法
【課題】細胞を含む試料から核酸を抽出するといった試料の処理を、実施環境を制限したり溶媒や試薬を使用したりせずに、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で、効率的且つ迅速に行うことができ、特に、血液などの臨床検体を対象とする場合に好適に用いることができる試料処理方法を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明にかかる試料処理方法は、細胞を吸着する物質である細胞吸着物質で表面処理された領域を含む細胞吸着領域をその表面に設けた基板を用いて、細胞を含む試料を細胞吸着領域に据え、細胞吸着物質に吸着している細胞が残るように細胞吸着領域から試料を取り除き、細胞が破壊することで当該細胞に含まれる核酸が露出するまで細胞吸着領域を乾燥することで、細胞に含まれる核酸を抽出する。
【解決手段】本発明にかかる試料処理方法は、細胞を吸着する物質である細胞吸着物質で表面処理された領域を含む細胞吸着領域をその表面に設けた基板を用いて、細胞を含む試料を細胞吸着領域に据え、細胞吸着物質に吸着している細胞が残るように細胞吸着領域から試料を取り除き、細胞が破壊することで当該細胞に含まれる核酸が露出するまで細胞吸着領域を乾燥することで、細胞に含まれる核酸を抽出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を含む試料から当該細胞に含まれる核酸を抽出する等といった試料の処理を行う試料処理方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子欠失や薬剤感受性ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）などの遺伝子診断が広がりつつあり、血液などの臨床検体から遺伝子である核酸を効率的で簡便な操作で抽出する方法や、さらには微量な核酸を簡便に増幅する方法等のような核酸を簡便に分析する方法が求められている。
【０００３】
核酸を含有する試料から核酸を分離したり抽出したりする方法としては、例えば、フェノール・クロロホルム抽出法、核酸含有溶液をエタノール溶液で沈殿して核酸を分離する方法（以下、エタノール分離法と記す場合がある）、特許文献１に開示されている方法、酵素を用いて細胞を溶解して核酸を分離する方法（以下、酵素分離法と記す場合がある）、遠心法を用いた血球分離方法、磁気ビーズを用いた核酸抽出方法、フィルターを用いた核酸抽出方法、特許文献２に開示されている方法などがある。
【０００４】
フェノール・クロロホルム抽出法では、フェノール・クロロホルムを用いて水に難溶性の検体成分（タンパク質や脂質など）を変性することで、当該検体成分を溶解又は沈殿させる。特許文献１に開示されている方法（通称Ｂｏｏｍ法）では、カオトロピック溶液を利用してタンパク質や脂質などの夾雑物を水に可溶化し、核酸を固相担体としてシリカビーズに吸着させて回収し、回収した核酸を洗浄し、洗浄した核酸を再び水相に溶解する。特許文献２では、マイクロな流路を用いて血液成分を分離する。
【０００５】
【特許文献１】特許第２６８０４６２号
【特許文献２】特開２００５−２２４７８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、フェノール・クロロホルム抽出法およびエタノール分離法によれば、人手を要し、簡便に行うことができないという問題点があった。さらに、フェノール・クロロホルム抽出法によれば、フェノール・クロロホルムを用いるので、作業環境などが制限されるという問題点があった。
【０００７】
また、特許文献１に開示されている方法によれば、核酸を抽出するまでの過程において固相担体の回収や容器の移し替え等の操作が必要になるので、作業が煩雑になってしまうという問題点があった。
【０００８】
また、酵素分離法によれば、核酸を分離するために、上述した方法と類似の方法を用いるので、上述と同様の問題点があった。
【０００９】
また、遠心法を用いた血球分離方法によれば遠心分離機構が必要になり、フィルターを用いた核酸抽出方法によれば減圧吸引のための装置が必要になり、磁気ビーズを用いた核酸抽出方法によれば磁気によりビーズを集磁するための機構が必要になるので、装置全体として小型化することが困難であるという問題点があった。また、磁気ビーズを用いた核酸抽出方法によれば、核酸を抽出するまでの過程において、磁気ビーズを集磁することにより磁気ビーズをペレット化した状態で上清液を排出するので、排出されるべき液がビーズ間の隙間に残留し、結果として洗浄効率が低くなる可能性がある。ゆえに、磁気ビーズを用いた核酸抽出方法によれば、ビーズの洗浄を十分に行いたい場合には、洗浄を繰り返し行わなければならないので、作業が煩雑になってしまうという問題点があった。また、磁気ビーズを用いた核酸抽出方法によれば、核酸を抽出するまでの過程において磁気ビーズからなる固相担体の回収や容器の移し替え等の操作が必要になるので、作業が煩雑になってしまうという問題点があった。
【００１０】
また、特許文献２に開示されている方法によれば、血液成分を分離するための分離素子自体を小型化することはできるが、試料を注入したり排出したりするための接続部材やポンプやバルブが必要になるので、装置全体として小型化することが困難であるという問題点があった。
【００１１】
すなわち、上述した方法によれば、試料から核酸を分離・抽出するにあたり、簡便性・迅速性・自動化の程度・小型化適性が必ずしも十分でなく、特に、血液などの臨床検体を対象とする場合には必ずしも実用的でないという問題点があった。
【００１２】
さらに、上述した方法によれば、試料から核酸を抽出した後に引き続いて、核酸の増幅や核酸とプローブとのハイブリダイゼーションやハイブリダイゼーション反応の検出といった核酸の分析を行う場合に、容器の移し替えなどの操作が必要であったり核酸を増幅して検出するための素子が別途必要であったりするので、核酸の抽出から核酸の分析までの工程を、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で、煩雑さを伴わずに一連の流れで行うことが困難であるという問題点があった。
【００１３】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、細胞を含む試料から核酸を抽出するといった試料の処理を、実施環境を制限したり溶媒や試薬を使用したりせずに、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で、効率的且つ迅速に行うことができ、特に、血液などの臨床検体を対象とする場合に好適に用いることができる試料処理方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、試料から核酸を抽出した後に引き続いて、核酸の増幅や核酸とプローブとのハイブリダイゼーションやハイブリダイゼーション反応の検出といった核酸の分析を、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で、煩雑さを伴わずに一連の流れで行うことができる試料処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる請求項１に記載の試料処理方法は、細胞を含む試料を処理する試料処理方法において、前記細胞を吸着する物質である細胞吸着物質で表面処理された領域を含む細胞吸着領域をその表面に設けた基板を用いて、前記試料を前記細胞吸着領域に据える試料据置工程と、前記試料据置工程を実行した後、前記細胞吸着物質に吸着している前記細胞が残るように、前記細胞吸着領域から前記試料を取り除く試料除去工程と、前記試料除去工程を実行した後、前記細胞が破壊することで当該細胞に含まれる前記核酸が露出するまで、前記細胞吸着領域を乾燥する核酸露出乾燥工程と、を実行することで、前記細胞に含まれる前記核酸を抽出することを特徴とする。
【００１５】
また、本発明にかかる請求項２に記載の試料処理方法は、請求項１に記載の試料処理方法において、前記試料除去工程を実行した後、所定の前記細胞を選択的に破壊するための前記物質である破壊物質を、前記細胞吸着領域に据える破壊物質据置工程と、前記破壊物質据置工程を実行した後、前記細胞吸着領域から、前記破壊物質および当該破壊物質により破壊された前記細胞を取り除く破壊物質等除去工程とをさらに実行し、前記核酸露出乾燥工程は、前記破壊物質等除去工程を実行した後、前記細胞吸着領域を乾燥することを特徴とする。
【００１６】
また、本発明にかかる請求項３に記載の試料処理方法は、請求項１または２に記載の試料処理方法において、前記核酸露出乾燥工程を実行した後、前記核酸を増幅するための前記物質である増幅物質を、前記細胞吸着領域に据える増幅物質据置工程と、前記増幅物質据置工程を実行した後、前記抽出した前記核酸および前記増幅物質を覆うように、前記増幅物質の蒸散を防ぐための前記物質である防蒸散物質を、前記細胞吸着領域に据える防蒸散物質据置工程と、前記防蒸散物質据置工程を実行した後、前記細胞吸着領域を所定の温度条件に曝す温度曝露工程と、をさらに実行することで、前記核酸を増幅することを特徴とする。
【００１７】
また、本発明にかかる請求項４に記載の試料処理方法は、請求項３に記載の試料処理方法において、前記細胞吸着領域は、標的とする核酸配列に相補的な配列を含む１種類または複数種類のプローブを、区画を分けて設けており、前記温度曝露工程を実行した後、前記細胞吸着領域から前記防蒸散物質を取り除く防蒸散物質除去工程と、前記防蒸散物質除去工程を実行した後、前記細胞吸着領域を乾燥する吸着領域乾燥工程と、前記吸着領域乾燥工程を実行した後、前記核酸と前記プローブとのハイブリダイゼーション反応を行うための前記物質である反応物質を、前記細胞吸着領域に据える反応物質据置工程と、前記反応物質据置工程を実行した後、前記細胞吸着領域を所定の温度に保つ温度保持工程と、を実行することで、前記増幅した前記核酸と前記プローブとの前記ハイブリダイゼーション反応を行うことを特徴とする。
【００１８】
また、本発明にかかる請求項５に記載の試料処理方法は、請求項４に記載の試料処理方法において、前記温度保持工程を実行した後、前記細胞吸着領域から前記反応物質を取り除く反応物質除去工程と、前記反応物質除去工程を実行した後、前記増幅した前記核酸について前記ハイブリダイゼーション反応の有無を検出する反応検出工程とを実行することを特徴とする。
【００１９】
また、本発明にかかる請求項６に記載の試料処理方法は、請求項１から５のいずれか１つに記載の試料処理方法において、前記基板は、疎水性の前記領域である疎水性領域をさらに設けており、前記細胞吸着領域は、親水性であり前記疎水性領域に囲まれていることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明にかかる請求項７に記載の試料処理方法は、請求項１から６のいずれか１つに記載の試料処理方法において、前記基板は、その表面に前記細胞吸着領域を複数設けていることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明にかかる請求項８に記載の試料処理方法は、請求項７に記載の試料処理方法において、各々の前記細胞吸着領域において、前記細胞吸着物質で表面処理された前記領域の面積は同じであることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明にかかる請求項９に記載の試料処理方法は、請求項１から８のいずれか１つに記載の試料処理方法において、前記細胞吸着領域の形状は円形であり、その直径は２０μｍ以上且つ１０，０００μｍ以下であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明にかかる請求項１０に記載の試料処理方法は、請求項１から９のいずれか１つに記載の試料処理方法において、前記細胞は白血球であり、前記試料は血液であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、細胞を吸着する物質である細胞吸着物質で表面処理された領域を含む細胞吸着領域をその表面に設けた基板を用いて、試料を細胞吸着領域に据え、細胞吸着物質に吸着している細胞が残るように細胞吸着領域から試料を取り除き、細胞が破壊することで当該細胞に含まれる核酸が露出するまで細胞吸着領域を乾燥することで、細胞に含まれる核酸を抽出するので、細胞を含む試料から核酸を抽出するといった試料の処理を、実施環境を制限したり溶媒や試薬を使用したりせずに、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で、効率的且つ迅速に行うことができ、特に、血液などの臨床検体を対象とする場合に好適に用いることができるという効果を奏する。また、本発明によれば、試料から核酸を抽出した後に引き続いて、核酸の増幅や核酸とプローブとのハイブリダイゼーションやハイブリダイゼーション反応の検出といった核酸の分析を、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で、煩雑さを伴わずに一連の流れで行うことができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下に、本発明にかかる試料処理方法の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、本実施の形態により本発明が限定されるものではない。
【００２６】
まず、本実施の形態にかかる試料処理方法を実施するための装置である試料処理装置１００の構成について、図１を参照して説明する。図１は、本実施の形態にかかる試料処理装置１００の構成の一例を示す図である。図１に示すように、試料処理装置１００は、基板１０２と、マイクロタイタープレート１０４と、分注装置１０６と、サーマルサイクラー１０８と、吐出装置１１０と、吐出ヘッド洗浄装置１１２と、蛍光スキャナー１１４と、制御装置１１６と、で構成されている。
【００２７】
基板１０２は、特異的または非特異的に細胞を吸着する物質である細胞吸着物質で表面処理された領域を含む細胞吸着領域をその表面に設けており、具体的にはスライドガラスである。ここで、本実施の形態にかかる基板１０２の一例について、図２および図３ならびに図４および図５を参照して説明する。図２から図５は、本実施の形態にかかる基板１０２の一例を示す斜視図である。
【００２８】
図２に示す基板１０２は、疎水性領域１０２ｂに囲まれた直径１．６ｍｍの円形の親水性キャプチャー領域１０２ａを、その表面に等間隔に合計４８個（４行１２列）配列している。親水性キャプチャー領域１０２ａは、本発明にかかる細胞吸着領域に相当するものであり、本発明にかかる細胞吸着物質に相当するレクチン（レクチンは、非特異的に細胞を吸着する物質である。）で部分的に表面処理された親水性の領域である。疎水性領域１０２ｂは、図２に示すように環状（リング状）に設けられた、親水性キャプチャー領域１０２ａを囲む疎水性の領域である。親水性キャプチャー領域１０２ａは、基板１０２としてのスライドガラスの表面を例えばシランカップリング剤などで処理することで形成される。また、疎水性領域１０２ｂは、例えばフッ素樹脂などを印刷する方法などで、親水性キャプチャー領域１０２ａを避けて当該親水性キャプチャー領域を囲むようにスライドガラスの表面に形成される。
【００２９】
ここで、図３を参照して、親水性キャプチャー領域１０２ａの詳細について説明する。親水性キャプチャー領域１０２ａは、レクチンで表面処理された非特異的細胞吸着コート層１０２ｄを、図３に示すように部分的に設けている。非特異的細胞吸着コート層１０２ｄは、例えばスクリーン印刷などの方法によって、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａ間で同じ面積（例えば３００μｍ2から７８ｍｍ2）で形成される。また、親水性キャプチャー領域１０２ａは、標的とする核酸配列に相補的な配列を含む１種類または複数種類の検出プローブを適当なリンカーを介して配置する検出プローブスポット１０２ｃを、図３に示すように非特異的細胞吸着コート層１０２ｄの領域内に区画を分けてスポット状に等間隔に配列している。なお、複数の検出プローブを配置することにより複数の標的核酸を同時に検出して分析することができ、多項目の分析性に優れる。
【００３０】
図４に示す基板１０２は、疎水性領域１０２ｂに囲まれた直径１．６ｍｍの円形の親水性キャプチャー領域１０２ａを、その表面に等間隔に合計４８個（４行１２列）配列している。親水性キャプチャー領域１０２ａは、白血球に特異的に結合するビーズ等に用いられる抗体であり本発明にかかる細胞吸着物質に相当する白血球特異的抗体で部分的に表面処理された親水性の領域である。白血球特異的抗体としては、例えば、インビトロジェン社製の「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉ ２ｍｌ」（型番：ＤＢ２１００１）や、ワンラムダ社製のリンフォクイックシリーズの「リンフォ Ｔ／Ｂ クイック ５０ｔｅｓｔｓ」（型番：ＬＫ−５０−ＴＢ）などのビーズに用いられる抗体がある。疎水性領域１０２ｂは、図４に示すように基板１０２の表面に全体的に設けられた、親水性キャプチャー領域１０２ａを囲む疎水性の領域である。親水性キャプチャー領域１０２ａは、基板１０２としてのスライドガラスの表面を例えばシランカップリング剤などで処理することで形成される。また、疎水性領域１０２ｂは、例えばフッ素樹脂などを印刷する方法などで、親水性キャプチャー領域１０２ａを避けて当該親水性キャプチャー領域を囲むようにスライドガラスの表面に形成される。
【００３１】
ここで、図５を参照して、親水性キャプチャー領域１０２ａの詳細について説明する。親水性キャプチャー領域１０２ａは、白血球特異的抗体で表面処理された白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅを、図５に示すように部分的に設けている。白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅは、例えばスクリーン印刷などの方法によって、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａ間で同じ面積（例えば３００μｍ2から７８ｍｍ2）で形成される。また、親水性キャプチャー領域１０２ａは、標的とする核酸配列に相補的な配列を含む１種類または複数種類の検出プローブを適当なリンカーを介して配置する検出プローブスポット１０２ｃを、図５に示すように白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅの領域内に区画を分けてスポット状に等間隔に配列している。
【００３２】
なお、本発明にかかる基板は、本実施の形態にかかる上述した図２から図５に示す基板１０２に限定されない。例えば、基板１０２はスライドガラスに限定されない。また、親水性キャプチャー領域１０２ａの配列状態およびその数は図２および図４に限定されない。
【００３３】
また、親水性キャプチャー領域１０２ａの形状は、上述した直径１．６ｍｍの円形に限定されることなく、例えば直径２０μｍから１０，０００μｍの略円形（例えば楕円なども含む）やこれら以外のものでもよい。なお、親水性キャプチャー領域１０２ａの形状が直径２０μｍから１０，０００μｍの略円形である場合、親水性キャプチャー領域１０２ａは、その形状に因り、本発明にかかる試料や破壊物質や増幅物質や防蒸散物質や反応物質などとしての液体を安定して確実に保持することができ、また、その直径に因り、２ｐｌ（ピコリットル）から２６０μｌ（マイクロリットル）程度の微量の液滴を概ね半球状に保持することができる。その結果、試料や各種物質に用いる試薬を効果的に減らすことができる。
【００３４】
また、非特異的細胞吸着コート層１０２ｄおよび白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅは、親水性キャプチャー領域１０２ａに部分的に設けることに限られず、親水性キャプチャー領域１０２ａの全体に設けてもよく、検出プローブスポット１０２ｃを除いた親水性キャプチャー領域１０２ａの全体に設けてもよい。
【００３５】
また、疎水性領域１０２ｂは、親水性キャプチャー領域１０２ａを囲むように設ければよく、図２および図３に示すように環状に設けたり、図４および図５に示すように基板１０２の表面の全体に設けたりする以外にも、例えば親水性キャプチャー領域１０２ａを除いた基板１０２の表面に部分的に設けてもよい。また、検出プローブスポット１０２ｃの配列状態およびその数は、図３および図５に限定されない。
【００３６】
図１に戻り、マイクロタイタープレート１０４は、親水性キャプチャー領域１０２ａに据える本発明にかかる試料や本発明にかかる各種物質（例えば、本発明にかかる破壊物質や増幅物質や防蒸散物質や反応物質、さらにはバッファー液など）を、区画を分けて保持する。
【００３７】
ここで、試料は、有核細胞を少なくとも含むものであり、例えば、ヘパリンなどで抗凝固処理した全血からなる血液や、全血から血液成分を分離した主に白血球からなるバフィーコートなどである。破壊物質は、所定の細胞を選択的に破壊するための物質であり、例えば赤血球を選択的に溶解するように塩濃度を調整した、界面活性剤などによる溶解液である。増幅物質は、核酸を増幅するための物質であり、例えばＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）試薬を含む増幅反応液である。防蒸散物質は、増幅物質や反応物質などの蒸散を防ぐための物質であり、例えばミネラルオイルやシリコンオイルなどのシーリングオイルである。なお、ミネラルオイルとしてはシグマ−アルドリッチ社製のミネラルオイル「Ｍ８６６２」などがあり、シリコンオイルとしてはインビトロジェン社製のＰＣＲ用シリコンオイル「１０８９０−０１０」などがある。反応物質は、核酸と検出プローブとのハイブリダイゼーション反応を行うための物質であり、例えばハイブリダイゼーション反応液である。
【００３８】
分注装置１０６は、マルチピペッター１０６ａを備え、マルチピペッター１０６ａで、試料や各種物質（例えば、破壊物質や増幅物質や防蒸散物質や反応物質、さらにはバッファー液など）をマイクロタイタープレート１０４から吸引したり、吸引した試料や各種物質を親水性キャプチャー領域１０２ａに分注したりする。サーマルサイクラー１０８は、ＰＣＲ反応に必要な温度条件に関するサーマルサイクルを基板１０２または各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに印可したり、基板１０２または各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを室温または所定の温度に保持したりする。
【００３９】
吐出装置１１０は、吐出ヘッド１１０ａを備え、吐出ヘッド１１０ａで、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに据えられている試料や各種物質を吸引して、吸引した試料や各種物質を他の親水性キャプチャー領域１０２ａに吐出する。吐出ヘッド洗浄装置１１２は吐出ヘッド１１０ａを洗浄する。
【００４０】
蛍光スキャナー１１４は、基板挿入部１１４ａを備え、基板挿入部１１４ａに挿入された基板１０２をスキャンして蛍光画像データを作成する。制御装置１１６は、具体的には市販のパーソナルコンピュータであり、分注装置１０６やサーマルサイクラー１０８や吐出装置１１０や吐出ヘッド洗浄装置１１２や蛍光スキャナー１１４と通信可能に接続されており、分注装置１０６やサーマルサイクラー１０８や吐出装置１１０や吐出ヘッド洗浄装置１１２や蛍光スキャナー１１４を制御する。制御装置１１６は、蛍光スキャナー１１４から転送された蛍光画像データを受け取り、当該蛍光画像データに基づいてハイブリダイゼーション反応の有無を検出する機能を備える。
【００４１】
つぎに、以上で説明した試料処理装置１００で実行する試料処理方法について、図６および図７を参照して説明する。図６および図７は、試料処理装置１００で実行する試料処理方法の一例を示す図である。
【００４２】
作業者が、白血球Ｗおよび赤血球Ｒを含みヘパリンで抗凝固処理された全血からなる血液Ｂと、赤血球を選択的に溶解するように塩濃度を調整した、界面活性剤による溶解液Ｓｏと、蛍光標識したプライマーを含むＰＣＲ試薬を含む増幅反応液Ｐと、シーリングオイルＳと、ハイブリダイゼーション反応液Ｈと、バッファー液とをマイクロタイタープレート１０４の所定の区画に置き、図４および図５に示す基板１０２を所定の位置に設置し、制御装置１１６のモニタに表示されているスタートメニュー画面に対しキーボードやマウスなどの入力装置を介して各種条件を設定し、スタートメニュー画面のスタートボタンを押すと、試料処理装置１００は、制御装置１１６を中心として図６に示す試料処理方法を実行する。
【００４３】
まず、制御装置１１６は分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、マイクロタイタープレート１０４から血液Ｂを吸引し、吸引した血液Ｂを各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに約１μl（マイクロリットル）滴下する（工程１：試料据置工程）。これにより、血液Ｂは半球状の液滴として親水性キャプチャー領域１０２ａに保持され、滴下から所定時間経過すると血液Ｂに含まれる血球の一部は沈降などにより白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅに単層状に接触し、単層状に接触している血球のうち白血球Ｗのみが白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅに吸着する。
【００４４】
つぎに、制御装置１１６は、工程１を完了してから所定時間経過すると分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅに吸着している白血球Ｗが残るように、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａからマルチピペッター１０６ａで血液Ｂを取り除く（工程２：試料除去工程）。白血球は白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅに吸着しているため、血液Ｂは、分注装置１０６のマルチピペッター１０６ａで吸い取ることで親水性キャプチャー領域１０２ａから取り除くことができる。なお、マルチピペッター１０６ａで血液Ｂを吸い取る際、マルチピペッター１０６ａのノズル先端で白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅに吸着している白血球Ｗを破壊しないために、当該ノズル先端と白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅとの間に白血球の厚さ程度（約数十μｍ程度）の間隙を設けることが望ましい。
【００４５】
ここで、図２および図３に示す基板１０２を用いた場合には工程２が完了したときに白血球Ｗ以外にも赤血球Ｒなどが非特異的細胞吸着コート層１０２ｄに単層状に吸着している可能性があるので（図７に示す工程２を参照）、当該基板１０２を用いた場合には、制御装置１１６は、図７に示すように工程２を完了してから分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、マイクロタイタープレート１０４から溶解液Ｓｏを吸引し、吸引した溶解液Ｓｏを各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに約１μl（マイクロリットル）滴下し（工程２’：破壊物質据置工程）、所定時間経過してから、マルチピペッター１０６ａで、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａから、赤血球Ｒなどが溶解している溶解液Ｓｏを取り除いてもよい（工程２’：破壊物質等除去工程）。これにより、溶解液Ｓｏは半球状の液滴として親水性キャプチャー領域１０２ａに保持され、非特異的細胞吸着コート層１０２ｄに吸着した赤血球Ｒは溶解液Ｓｏにより溶解してヘモグロビンなど核酸の増幅を阻害する成分などが溶解液Ｓｏ中に溶出し、白血球Ｗのみが非特異的細胞吸着コート層１０２ｄに吸着した状態にすることができる。すなわち、赤血球Ｒを溶解することで核酸の増幅を阻害するヘモグロビンを溶解液Ｓｏと共に効率的且つ効果的に除去することができる。これにより、核酸の増幅に関する工程４を効率よく実行することができ、結果として、核酸と検出プローブとのハイブリダイゼーション反応に関する工程５やハイブリダイゼーション反応の検出に関する工程６での精度も向上することができる。
【００４６】
図６に戻り、制御装置１１６はサーマルサイクラー１０８に指令を出し、サーマルサイクラー１０８は、当該指令を受けると、白血球Ｗが破壊することで白血球Ｗに含まれる核酸が露出するまで基板１０２または各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを室温または適度な温度に保持することで、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａの表面の水分を蒸発させて、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを乾燥する（工程３：核酸露出乾燥工程）。
【００４７】
以上、工程１から工程３により、血液Ｂから核酸Ｎを抽出するといった試料の処理を、実施環境を制限したり溶媒や試薬を使用したりせずに、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で、効率的且つ迅速に行うことができた。また、微量な量の血液Ｂから、白血球Ｗに含まれる核酸Ｎを簡便且つ容易に抽出することができた。これにより、被験者の身体的・精神的負担を軽減することができる。
【００４８】
つぎに、制御装置１１６は分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、マイクロタイタープレート１０４から増幅反応液Ｐを吸引し、吸引した増幅反応液Ｐを各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに約１μl（マイクロリットル）滴下する（工程４：増幅物質据置工程）。これにより、増幅反応液Ｐは半球状の液滴として親水性キャプチャー領域１０２ａに保持される。
そして、制御装置１１６は引き続き分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、マイクロタイタープレート１０４からシーリングオイルＳを吸引し、吸引したシーリングオイルＳを、核酸Ｎおよび増幅反応液Ｐを覆うように（図６に示すように核酸Ｎおよび増幅反応液Ｐの上層に）各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに約５μｌ（マイクロリットル）滴下する（工程４：防蒸散物質据置工程）。これにより、増幅反応液Ｐを封止して、サーマルサイクルにおける増幅反応液Ｐの蒸散を防止する。
そして、制御装置１１６はサーマルサイクラー１０８に指令を出し、サーマルサイクラー１０８は、当該指令を受けると、基板１０２または各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに、ＰＣＲ反応に必要なサーマルサイクルを印可する（工程４：温度曝露工程）。
【００４９】
以上、工程４により、工程３で抽出した核酸Ｎを、同じ基板１０２さらには同じ親水性キャプチャー領域１０２ａにて簡便且つ容易に増幅することができた。換言すると、工程１から工程４の間において、従来技術のように容器の移し替えの操作や新たな容器を必要とせず、１つの基板１０２のみで核酸Ｎの抽出から核酸Ｎの増幅までの工程を簡便且つ容易に行うことができた。また、工程４により、増幅された核酸Ｎに蛍光標識を導入することができた。これにより、増幅用の試薬など高価な試薬の使用量を減らすことができる。なお、核酸の増幅方法は、工程４で示したＰＣＲ法に限定されるものではなく、例えば等温増幅法やその他公知の様々な増幅方法でもよい。
【００５０】
つぎに、制御装置１１６は分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａからシーリングオイルＳを取り除く（工程５：防蒸散物質除去工程）。
そして、制御装置１１６はサーマルサイクラー１０８に指令を出し、サーマルサイクラー１０８は、当該指令を受けると、基板１０２または各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを室温または適度な温度に保持することで、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを乾燥する（工程５：吸着領域乾燥工程）。
そして、制御装置１１６は分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、マイクロタイタープレート１０４からハイブリダイゼーション反応液Ｈを吸引し、吸引したハイブリダイゼーション反応液Ｈを各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに約１μl（マイクロリットル）滴下する（工程５：反応物質据置工程）。これにより、ハイブリダイゼーション反応液Ｈは半球状の液滴として親水性キャプチャー領域１０２ａに保持される。なお、増幅反応液Ｐがハイブリダイゼーション反応のための試薬類をさらに混合してなる場合には、当該工程を省略することができる。
ここで、制御装置１１６は反応物質据置工程に引き続き分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、マイクロタイタープレート１０４からシーリングオイルＳを吸引し、吸引したシーリングオイルＳを、核酸Ｎ（蛍光標識された標的核酸Ｎ１を含む）およびハイブリダイゼーション反応液Ｈを覆うように（図６に示すように標的核酸Ｎ１およびハイブリダイゼーション反応液Ｈの上層に）各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに約５μｌ（マイクロリットル）滴下してもよい。これにより、シーリングオイルＳは半球状の液滴として親水性キャプチャー領域１０２ａに保持される。
そして、制御装置１１６はサーマルサイクラー１０８に指令を出し、サーマルサイクラー１０８は、当該指令を受けると、基板１０２または各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを室温に保持したり、基板１０２または各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに適度な温度（例えば６０℃の温度）を印可して当該温度を保持したりする（工程５：温度保持工程）。
【００５１】
以上、工程５により、工程４で蛍光標識された標的核酸Ｎ１と検出プローブとのハイブリダイゼーション反応を、同じ基板１０２さらには同じ親水性キャプチャー領域１０２ａにて簡便且つ容易に行うことができた。換言すると、工程１から工程５の間において、従来技術のように容器の移し替えの操作や新たな容器を必要とせず、１つの基板１０２のみで核酸Ｎの抽出からハイブリダイゼーション反応までの工程を簡便且つ容易に行うことができた。なお、ハイブリダイゼーションの方法は、工程５で示したハイブリダイゼーション方法に限定されるものではなく、例えば、工程４では蛍光標識を導入せずに、工程５でインターカレーターを用いて標的核酸Ｎ１と検出プローブとのハイブリダイゼーション反応を行ってもよい。
【００５２】
つぎに、制御装置１１６は分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、ハイブリダイゼーション反応液Ｈを取り除く（工程６：反応物質除去工程）。なお、工程５においてハイブリダイゼーション反応液Ｈの上層にシーリングオイルＳを滴下した場合には、分注装置１０６は、マルチピペッター１０６ａで、シーリングオイルＳおよびハイブリダイゼーション反応液Ｈを取り除く。
ここで、制御装置１１６は反応物質除去工程に引き続き分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、マイクロタイタープレート１０４からバッファー液を吸引し、吸引したバッファー液を各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに適量滴下することで、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを洗浄し、制御装置１１６はサーマルサイクラー１０８に指令を出し、サーマルサイクラー１０８は、当該指令を受けると、基板１０２または各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを室温または適度な温度に保持することで、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを乾燥してもよい。
そして、作業者は、基板１０２を蛍光スキャナー１１４の基板挿入部１１４ａに挿入する。
そして、制御装置１１６は蛍光スキャナー１１４に指令を出し、蛍光スキャナー１１４は、当該指令を受けると、基板挿入部１１４ａに基板１０２が適正に挿入されているかを確認し、基板１０２が適正に挿入されていることを確認した場合には基板１０２をスキャンし、スキャンした基板１０２の蛍光画像データを制御装置１１６に転送し、制御装置１１６は、蛍光スキャナー１１４から転送された蛍光画像データを受けると、当該蛍光画像データに基づいて、蛍光標識された標的核酸Ｎ１についてハイブリダイゼーション反応の有無を検出する（工程６：反応検出工程）。
【００５３】
以上、工程６により、蛍光標識された標的核酸Ｎ１のうち検出プローブとハイブリダイズした標的核酸Ｎ１１を、同じ基板１０２さらには同じ親水性キャプチャー領域１０２ａにて簡便且つ容易に検出することができた。換言すると、工程１から工程６の間において、従来技術のように容器の移し替えの操作や新たな容器を必要とせず、１つの基板１０２のみで核酸Ｎの抽出からハイブリダイゼーション反応の検出までの工程を簡便且つ容易に行うことができた。
【００５４】
以上、詳細に説明したように、本実施の形態にかかる試料処理装置１００によれば、白血球特異的抗体で表面処理された白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅを含む親水性キャプチャー領域１０２ａをその表面に設けた基板１０２を用いて、全血などの白血球Ｗを含む血液Ｂを親水性キャプチャー領域１０２ａに据え、親水性キャプチャー領域１０２ａに吸着している白血球Ｗが残るように、親水性キャプチャー領域１０２ａから血液Ｂを取り除き、白血球Ｗが破壊することで当該白血球に含まれる核酸が露出するように、親水性キャプチャー領域１０２ａを乾燥することで、白血球Ｗに含まれる核酸を抽出するので、白血球Ｗを含む血液Ｂから核酸Ｎを抽出するといった試料の処理を、実施環境を制限したり溶媒や試薬を使用したりせずに、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で、効率的且つ迅速に行うことができる。換言すると、核酸の分析に係わる「血液からの核酸の抽出」が簡便且つ容易に行うことができる。また、試料処理装置１００によれば、図２から図５に示すような基板１０２を用いるので、遺伝子欠失や薬剤感受性ＳＮＰなどの遺伝子診断における臨床検査で用いる血液の量や各種試薬の量を効果的に減らすことができ、その結果、被験者の身体的負担や精神的負担を軽減することができるとともに、検査費用を削減することができる。
【００５５】
また、試料処理装置１００によれば、図２および図３に示す基板１０２（非特異的細胞吸着コート層１０２ｄを持つ基板１０２）を用いた場合には、全血などの白血球Ｗを含む血液Ｂを親水性キャプチャー領域１０２ａに据え、親水性キャプチャー領域１０２ａに吸着している白血球Ｗが残るように、親水性キャプチャー領域１０２ａから血液Ｂを取り除いた後、溶解液Ｓｏを各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに据え、所定時間経過してから、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａから溶解液Ｓｏを取り除いてもよいので、親水性キャプチャー領域１０２ａに吸着している血球のうち、核酸の分析には不要で阻害物質となるヘモグロビンを有する赤血球Ｒを選択的に効果的に排除することができ、その結果、核酸の分析の精度を向上することができる。
【００５６】
また、試料処理装置１００によれば、増幅反応液Ｐを親水性キャプチャー領域１０２ａに据え、抽出した核酸Ｎおよび増幅反応液Ｐを覆うように、シーリングオイルＳを親水性キャプチャー領域１０２ａに据え、親水性キャプチャー領域１０２ａを所定の温度条件に曝すことで、核酸Ｎを増幅するので、抽出した核酸Ｎを、同じ基板１０２さらには同じ親水性キャプチャー領域１０２ａにて簡便且つ容易に増幅することができる。
これまで、核酸の増幅に関する技術としては、例えば、親水性を持たせた領域で核酸を増幅して検出する特許第３７４３０９０号の特許公報が開示されている。具体的には、当該特許公報には、親水性の材料の周囲を囲む疎水性の材料で被覆した発熱抵抗体の上に反応溶液を滴下して当該反応溶液にヒートサイクルを印可することで、核酸の増幅を行う技術が開示されている。しかし、当該特許公報では、核酸を分析するには、さらに核酸を抽出し検出するための素子が別途必要になるので、核酸の分析を簡単・小型な装置構成および簡便な操作で効率的且つ迅速に行うことが困難である。
ところが、試料処理装置１００によれば、１つの基板１０２のみで核酸Ｎの抽出から核酸Ｎの増幅までの工程を、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で簡便且つ容易に行うことができる。
【００５７】
また、試料処理装置１００によれば、親水性キャプチャー領域１０２ａからシーリングオイルＳを取り除き、親水性キャプチャー領域１０２ａを乾燥し、ハイブリダイゼーション反応液Ｈを親水性キャプチャー領域１０２ａに据え、親水性キャプチャー領域１０２ａを所定の温度に保つことで、増幅した核酸Ｎとプローブとのハイブリダイゼーション反応を行うので、標的核酸Ｎ１と検出プローブとのハイブリダイゼーション反応を、同じ基板１０２さらには同じ親水性キャプチャー領域１０２ａにて簡便且つ容易に行うことができる。
これまで、ハイブリダイゼーション反応に関する技術としては、特許第３３８６３９１号の特許公報や特許第３３９３５２８号の特許公報や特許第３６２５８２６号の特許公報などが開示されている。特許第３３８６３９１号の特許公報には、標的核酸と相補的な配列を含むプローブを平板な基板上に区域を分けて設ける方法が開示されている。また、特許第３３９３５２８号の特許公報には、標識などを設けた試料核酸とのハイブリダイゼーション反応により標的核酸の有無などを検出する方法が開示されている。特許第３６２５８２６号の特許公報には、表面張力によって隔離される液滴を化学反応させ、特に、プローブとのハイブリダイゼーションにより核酸の検出を行う方法が開示されている。しかし、これら特許公報では、試料からの核酸の抽出や抽出した微量な核酸の増幅に関する技術は開示されておらず、ゆえに、核酸を分析する際には、これら特許公報における核酸の検出方法とは別に、核酸を試料から抽出して微量な核酸を増幅する方法が必要になるので、核酸の分析を簡単・小型な装置構成および簡便な操作で効率的且つ迅速に行うことが困難である。
ところが、試料処理装置１００によれば、１つの基板１０２のみで核酸Ｎの抽出からハイブリダイゼーション反応までの工程を、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で簡便且つ容易に行うことができる。
【００５８】
また、試料処理装置１００によれば、親水性キャプチャー領域１０２ａからハイブリダイゼーション反応液Ｈを取り除き、増幅した核酸についてハイブリダイゼーション反応の有無を検出するので、標的核酸Ｎ１のうち検出プローブとハイブリダイズした標的核酸Ｎ１１を、同じ基板１０２さらには同じ親水性キャプチャー領域１０２ａにて簡便且つ容易に検出することができる。
【００５９】
以上、試料処理装置１００によれば、血液Ｂからの核酸Ｎの抽出から、核酸Ｎの増幅や核酸Ｎとプローブとのハイブリダイゼーションやハイブリダイゼーション反応の検出といった核酸Ｎの分析までを、１つの基板１０２により、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で、煩雑さを伴わずに一連の流れで行うことができる。
【００６０】
また、試料処理装置１００で用いる基板１０２は親水性キャプチャー領域１０２ａの他に疎水性領域１０２ｂをさらに設けており、親水性キャプチャー領域１０２ａは疎水性領域１０２ｂに囲まれているので、血液Ｂや各種物質を親水性キャプチャー領域１０２ａ内に確実に保持することができる。また、試料処理装置１００で用いる基板１０２は、その表面に親水性キャプチャー領域１０２ａを複数設けているので、複数の試料を同時に分析することができ、多検体の処理性に優れている。また、試料処理装置１００で用いる基板１０２において、非特異的細胞吸着コート層１０２ｄまたは白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅの面積は各々の親水性キャプチャー領域１０２ａ間で同じであるので、単層吸着する白血球の量を各々の親水性キャプチャー領域１０２ａ間で一定にすることができ、結果として抽出する核酸の量が一定になり、定量性良く核酸を抽出することができる。また、抽出した核酸の濃度測定などが不要で、且つ安定した核酸の増幅が可能となる。つまり、核酸の分析が簡便且つ容易となり、検出の精度が向上する。また、試料処理装置１００で用いる基板１０２において、親水性キャプチャー領域１０２ａの形状は円形であり、その直径は２０μｍ以上且つ１０，０００μｍ以下であるので、血液Ｂや各種物質を安定して確実に保持することができ、しかも２ｐｌ（ピコリットル）から２６０μｌ（マイクロリットル）程度の微量の液滴を概ね半球状に保持することができる。これにより、血液Ｂや各種物質に用いる試薬の量を減らすことができる。
【００６１】
また、試料処理装置１００で用いた試料は白血球を含む血液であるので、遺伝子欠失や薬剤感受性ＳＮＰなどの遺伝子診断などにおける臨床検査において好適に実施することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
以上のように、本発明にかかる試料処理方法は、バイオ・製薬・医療など様々な分野で好適に用いることができ、特に、血液などの臨床検体から核酸を抽出する場合（例えば、遺伝子欠失や薬剤感受性ＳＮＰなどの遺伝子診断など）に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本実施の形態にかかる試料処理装置１００の構成の一例を示す図である。
【図２】本実施の形態にかかる基板１０２の一例を示す斜視図である。
【図３】本実施の形態にかかる基板１０２の一例を示す斜視図である。
【図４】本実施の形態にかかる基板１０２の一例を示す斜視図である。
【図５】本実施の形態にかかる基板１０２の一例を示す斜視図である。
【図６】試料処理装置１００で実行する試料処理方法の一例を示す図である。
【図７】試料処理装置１００で実行する試料処理方法の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００６４】
１００ 試料処理装置
１０２ 基板
１０２ａ 親水性キャプチャー領域
１０２ｂ 疎水性領域
１０２ｃ 検出プローブスポット
１０２ｄ 非特異的細胞吸着コート層
１０２ｅ 白血球特異的細胞吸着コート層
１０４ マイクロタイタープレート
１０６ 分注装置
１０６ａ マルチピペッター
１０８ サーマルサイクラー
１１０ 吐出装置
１１０ａ 吐出ヘッド
１１２ 吐出ヘッド洗浄装置
１１４ 蛍光スキャナー
１１６ 制御装置
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を含む試料から当該細胞に含まれる核酸を抽出する等といった試料の処理を行う試料処理方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子欠失や薬剤感受性ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）などの遺伝子診断が広がりつつあり、血液などの臨床検体から遺伝子である核酸を効率的で簡便な操作で抽出する方法や、さらには微量な核酸を簡便に増幅する方法等のような核酸を簡便に分析する方法が求められている。
【０００３】
核酸を含有する試料から核酸を分離したり抽出したりする方法としては、例えば、フェノール・クロロホルム抽出法、核酸含有溶液をエタノール溶液で沈殿して核酸を分離する方法（以下、エタノール分離法と記す場合がある）、特許文献１に開示されている方法、酵素を用いて細胞を溶解して核酸を分離する方法（以下、酵素分離法と記す場合がある）、遠心法を用いた血球分離方法、磁気ビーズを用いた核酸抽出方法、フィルターを用いた核酸抽出方法、特許文献２に開示されている方法などがある。
【０００４】
フェノール・クロロホルム抽出法では、フェノール・クロロホルムを用いて水に難溶性の検体成分（タンパク質や脂質など）を変性することで、当該検体成分を溶解又は沈殿させる。特許文献１に開示されている方法（通称Ｂｏｏｍ法）では、カオトロピック溶液を利用してタンパク質や脂質などの夾雑物を水に可溶化し、核酸を固相担体としてシリカビーズに吸着させて回収し、回収した核酸を洗浄し、洗浄した核酸を再び水相に溶解する。特許文献２では、マイクロな流路を用いて血液成分を分離する。
【０００５】
【特許文献１】特許第２６８０４６２号
【特許文献２】特開２００５−２２４７８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、フェノール・クロロホルム抽出法およびエタノール分離法によれば、人手を要し、簡便に行うことができないという問題点があった。さらに、フェノール・クロロホルム抽出法によれば、フェノール・クロロホルムを用いるので、作業環境などが制限されるという問題点があった。
【０００７】
また、特許文献１に開示されている方法によれば、核酸を抽出するまでの過程において固相担体の回収や容器の移し替え等の操作が必要になるので、作業が煩雑になってしまうという問題点があった。
【０００８】
また、酵素分離法によれば、核酸を分離するために、上述した方法と類似の方法を用いるので、上述と同様の問題点があった。
【０００９】
また、遠心法を用いた血球分離方法によれば遠心分離機構が必要になり、フィルターを用いた核酸抽出方法によれば減圧吸引のための装置が必要になり、磁気ビーズを用いた核酸抽出方法によれば磁気によりビーズを集磁するための機構が必要になるので、装置全体として小型化することが困難であるという問題点があった。また、磁気ビーズを用いた核酸抽出方法によれば、核酸を抽出するまでの過程において、磁気ビーズを集磁することにより磁気ビーズをペレット化した状態で上清液を排出するので、排出されるべき液がビーズ間の隙間に残留し、結果として洗浄効率が低くなる可能性がある。ゆえに、磁気ビーズを用いた核酸抽出方法によれば、ビーズの洗浄を十分に行いたい場合には、洗浄を繰り返し行わなければならないので、作業が煩雑になってしまうという問題点があった。また、磁気ビーズを用いた核酸抽出方法によれば、核酸を抽出するまでの過程において磁気ビーズからなる固相担体の回収や容器の移し替え等の操作が必要になるので、作業が煩雑になってしまうという問題点があった。
【００１０】
また、特許文献２に開示されている方法によれば、血液成分を分離するための分離素子自体を小型化することはできるが、試料を注入したり排出したりするための接続部材やポンプやバルブが必要になるので、装置全体として小型化することが困難であるという問題点があった。
【００１１】
すなわち、上述した方法によれば、試料から核酸を分離・抽出するにあたり、簡便性・迅速性・自動化の程度・小型化適性が必ずしも十分でなく、特に、血液などの臨床検体を対象とする場合には必ずしも実用的でないという問題点があった。
【００１２】
さらに、上述した方法によれば、試料から核酸を抽出した後に引き続いて、核酸の増幅や核酸とプローブとのハイブリダイゼーションやハイブリダイゼーション反応の検出といった核酸の分析を行う場合に、容器の移し替えなどの操作が必要であったり核酸を増幅して検出するための素子が別途必要であったりするので、核酸の抽出から核酸の分析までの工程を、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で、煩雑さを伴わずに一連の流れで行うことが困難であるという問題点があった。
【００１３】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、細胞を含む試料から核酸を抽出するといった試料の処理を、実施環境を制限したり溶媒や試薬を使用したりせずに、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で、効率的且つ迅速に行うことができ、特に、血液などの臨床検体を対象とする場合に好適に用いることができる試料処理方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、試料から核酸を抽出した後に引き続いて、核酸の増幅や核酸とプローブとのハイブリダイゼーションやハイブリダイゼーション反応の検出といった核酸の分析を、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で、煩雑さを伴わずに一連の流れで行うことができる試料処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる請求項１に記載の試料処理方法は、細胞を含む試料を処理する試料処理方法において、前記細胞を吸着する物質である細胞吸着物質で表面処理された領域を含む細胞吸着領域をその表面に設けた基板を用いて、前記試料を前記細胞吸着領域に据える試料据置工程と、前記試料据置工程を実行した後、前記細胞吸着物質に吸着している前記細胞が残るように、前記細胞吸着領域から前記試料を取り除く試料除去工程と、前記試料除去工程を実行した後、前記細胞が破壊することで当該細胞に含まれる前記核酸が露出するまで、前記細胞吸着領域を乾燥する核酸露出乾燥工程と、を実行することで、前記細胞に含まれる前記核酸を抽出することを特徴とする。
【００１５】
また、本発明にかかる請求項２に記載の試料処理方法は、請求項１に記載の試料処理方法において、前記試料除去工程を実行した後、所定の前記細胞を選択的に破壊するための前記物質である破壊物質を、前記細胞吸着領域に据える破壊物質据置工程と、前記破壊物質据置工程を実行した後、前記細胞吸着領域から、前記破壊物質および当該破壊物質により破壊された前記細胞を取り除く破壊物質等除去工程とをさらに実行し、前記核酸露出乾燥工程は、前記破壊物質等除去工程を実行した後、前記細胞吸着領域を乾燥することを特徴とする。
【００１６】
また、本発明にかかる請求項３に記載の試料処理方法は、請求項１または２に記載の試料処理方法において、前記核酸露出乾燥工程を実行した後、前記核酸を増幅するための前記物質である増幅物質を、前記細胞吸着領域に据える増幅物質据置工程と、前記増幅物質据置工程を実行した後、前記抽出した前記核酸および前記増幅物質を覆うように、前記増幅物質の蒸散を防ぐための前記物質である防蒸散物質を、前記細胞吸着領域に据える防蒸散物質据置工程と、前記防蒸散物質据置工程を実行した後、前記細胞吸着領域を所定の温度条件に曝す温度曝露工程と、をさらに実行することで、前記核酸を増幅することを特徴とする。
【００１７】
また、本発明にかかる請求項４に記載の試料処理方法は、請求項３に記載の試料処理方法において、前記細胞吸着領域は、標的とする核酸配列に相補的な配列を含む１種類または複数種類のプローブを、区画を分けて設けており、前記温度曝露工程を実行した後、前記細胞吸着領域から前記防蒸散物質を取り除く防蒸散物質除去工程と、前記防蒸散物質除去工程を実行した後、前記細胞吸着領域を乾燥する吸着領域乾燥工程と、前記吸着領域乾燥工程を実行した後、前記核酸と前記プローブとのハイブリダイゼーション反応を行うための前記物質である反応物質を、前記細胞吸着領域に据える反応物質据置工程と、前記反応物質据置工程を実行した後、前記細胞吸着領域を所定の温度に保つ温度保持工程と、を実行することで、前記増幅した前記核酸と前記プローブとの前記ハイブリダイゼーション反応を行うことを特徴とする。
【００１８】
また、本発明にかかる請求項５に記載の試料処理方法は、請求項４に記載の試料処理方法において、前記温度保持工程を実行した後、前記細胞吸着領域から前記反応物質を取り除く反応物質除去工程と、前記反応物質除去工程を実行した後、前記増幅した前記核酸について前記ハイブリダイゼーション反応の有無を検出する反応検出工程とを実行することを特徴とする。
【００１９】
また、本発明にかかる請求項６に記載の試料処理方法は、請求項１から５のいずれか１つに記載の試料処理方法において、前記基板は、疎水性の前記領域である疎水性領域をさらに設けており、前記細胞吸着領域は、親水性であり前記疎水性領域に囲まれていることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明にかかる請求項７に記載の試料処理方法は、請求項１から６のいずれか１つに記載の試料処理方法において、前記基板は、その表面に前記細胞吸着領域を複数設けていることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明にかかる請求項８に記載の試料処理方法は、請求項７に記載の試料処理方法において、各々の前記細胞吸着領域において、前記細胞吸着物質で表面処理された前記領域の面積は同じであることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明にかかる請求項９に記載の試料処理方法は、請求項１から８のいずれか１つに記載の試料処理方法において、前記細胞吸着領域の形状は円形であり、その直径は２０μｍ以上且つ１０，０００μｍ以下であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明にかかる請求項１０に記載の試料処理方法は、請求項１から９のいずれか１つに記載の試料処理方法において、前記細胞は白血球であり、前記試料は血液であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、細胞を吸着する物質である細胞吸着物質で表面処理された領域を含む細胞吸着領域をその表面に設けた基板を用いて、試料を細胞吸着領域に据え、細胞吸着物質に吸着している細胞が残るように細胞吸着領域から試料を取り除き、細胞が破壊することで当該細胞に含まれる核酸が露出するまで細胞吸着領域を乾燥することで、細胞に含まれる核酸を抽出するので、細胞を含む試料から核酸を抽出するといった試料の処理を、実施環境を制限したり溶媒や試薬を使用したりせずに、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で、効率的且つ迅速に行うことができ、特に、血液などの臨床検体を対象とする場合に好適に用いることができるという効果を奏する。また、本発明によれば、試料から核酸を抽出した後に引き続いて、核酸の増幅や核酸とプローブとのハイブリダイゼーションやハイブリダイゼーション反応の検出といった核酸の分析を、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で、煩雑さを伴わずに一連の流れで行うことができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下に、本発明にかかる試料処理方法の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、本実施の形態により本発明が限定されるものではない。
【００２６】
まず、本実施の形態にかかる試料処理方法を実施するための装置である試料処理装置１００の構成について、図１を参照して説明する。図１は、本実施の形態にかかる試料処理装置１００の構成の一例を示す図である。図１に示すように、試料処理装置１００は、基板１０２と、マイクロタイタープレート１０４と、分注装置１０６と、サーマルサイクラー１０８と、吐出装置１１０と、吐出ヘッド洗浄装置１１２と、蛍光スキャナー１１４と、制御装置１１６と、で構成されている。
【００２７】
基板１０２は、特異的または非特異的に細胞を吸着する物質である細胞吸着物質で表面処理された領域を含む細胞吸着領域をその表面に設けており、具体的にはスライドガラスである。ここで、本実施の形態にかかる基板１０２の一例について、図２および図３ならびに図４および図５を参照して説明する。図２から図５は、本実施の形態にかかる基板１０２の一例を示す斜視図である。
【００２８】
図２に示す基板１０２は、疎水性領域１０２ｂに囲まれた直径１．６ｍｍの円形の親水性キャプチャー領域１０２ａを、その表面に等間隔に合計４８個（４行１２列）配列している。親水性キャプチャー領域１０２ａは、本発明にかかる細胞吸着領域に相当するものであり、本発明にかかる細胞吸着物質に相当するレクチン（レクチンは、非特異的に細胞を吸着する物質である。）で部分的に表面処理された親水性の領域である。疎水性領域１０２ｂは、図２に示すように環状（リング状）に設けられた、親水性キャプチャー領域１０２ａを囲む疎水性の領域である。親水性キャプチャー領域１０２ａは、基板１０２としてのスライドガラスの表面を例えばシランカップリング剤などで処理することで形成される。また、疎水性領域１０２ｂは、例えばフッ素樹脂などを印刷する方法などで、親水性キャプチャー領域１０２ａを避けて当該親水性キャプチャー領域を囲むようにスライドガラスの表面に形成される。
【００２９】
ここで、図３を参照して、親水性キャプチャー領域１０２ａの詳細について説明する。親水性キャプチャー領域１０２ａは、レクチンで表面処理された非特異的細胞吸着コート層１０２ｄを、図３に示すように部分的に設けている。非特異的細胞吸着コート層１０２ｄは、例えばスクリーン印刷などの方法によって、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａ間で同じ面積（例えば３００μｍ2から７８ｍｍ2）で形成される。また、親水性キャプチャー領域１０２ａは、標的とする核酸配列に相補的な配列を含む１種類または複数種類の検出プローブを適当なリンカーを介して配置する検出プローブスポット１０２ｃを、図３に示すように非特異的細胞吸着コート層１０２ｄの領域内に区画を分けてスポット状に等間隔に配列している。なお、複数の検出プローブを配置することにより複数の標的核酸を同時に検出して分析することができ、多項目の分析性に優れる。
【００３０】
図４に示す基板１０２は、疎水性領域１０２ｂに囲まれた直径１．６ｍｍの円形の親水性キャプチャー領域１０２ａを、その表面に等間隔に合計４８個（４行１２列）配列している。親水性キャプチャー領域１０２ａは、白血球に特異的に結合するビーズ等に用いられる抗体であり本発明にかかる細胞吸着物質に相当する白血球特異的抗体で部分的に表面処理された親水性の領域である。白血球特異的抗体としては、例えば、インビトロジェン社製の「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉ ２ｍｌ」（型番：ＤＢ２１００１）や、ワンラムダ社製のリンフォクイックシリーズの「リンフォ Ｔ／Ｂ クイック ５０ｔｅｓｔｓ」（型番：ＬＫ−５０−ＴＢ）などのビーズに用いられる抗体がある。疎水性領域１０２ｂは、図４に示すように基板１０２の表面に全体的に設けられた、親水性キャプチャー領域１０２ａを囲む疎水性の領域である。親水性キャプチャー領域１０２ａは、基板１０２としてのスライドガラスの表面を例えばシランカップリング剤などで処理することで形成される。また、疎水性領域１０２ｂは、例えばフッ素樹脂などを印刷する方法などで、親水性キャプチャー領域１０２ａを避けて当該親水性キャプチャー領域を囲むようにスライドガラスの表面に形成される。
【００３１】
ここで、図５を参照して、親水性キャプチャー領域１０２ａの詳細について説明する。親水性キャプチャー領域１０２ａは、白血球特異的抗体で表面処理された白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅを、図５に示すように部分的に設けている。白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅは、例えばスクリーン印刷などの方法によって、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａ間で同じ面積（例えば３００μｍ2から７８ｍｍ2）で形成される。また、親水性キャプチャー領域１０２ａは、標的とする核酸配列に相補的な配列を含む１種類または複数種類の検出プローブを適当なリンカーを介して配置する検出プローブスポット１０２ｃを、図５に示すように白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅの領域内に区画を分けてスポット状に等間隔に配列している。
【００３２】
なお、本発明にかかる基板は、本実施の形態にかかる上述した図２から図５に示す基板１０２に限定されない。例えば、基板１０２はスライドガラスに限定されない。また、親水性キャプチャー領域１０２ａの配列状態およびその数は図２および図４に限定されない。
【００３３】
また、親水性キャプチャー領域１０２ａの形状は、上述した直径１．６ｍｍの円形に限定されることなく、例えば直径２０μｍから１０，０００μｍの略円形（例えば楕円なども含む）やこれら以外のものでもよい。なお、親水性キャプチャー領域１０２ａの形状が直径２０μｍから１０，０００μｍの略円形である場合、親水性キャプチャー領域１０２ａは、その形状に因り、本発明にかかる試料や破壊物質や増幅物質や防蒸散物質や反応物質などとしての液体を安定して確実に保持することができ、また、その直径に因り、２ｐｌ（ピコリットル）から２６０μｌ（マイクロリットル）程度の微量の液滴を概ね半球状に保持することができる。その結果、試料や各種物質に用いる試薬を効果的に減らすことができる。
【００３４】
また、非特異的細胞吸着コート層１０２ｄおよび白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅは、親水性キャプチャー領域１０２ａに部分的に設けることに限られず、親水性キャプチャー領域１０２ａの全体に設けてもよく、検出プローブスポット１０２ｃを除いた親水性キャプチャー領域１０２ａの全体に設けてもよい。
【００３５】
また、疎水性領域１０２ｂは、親水性キャプチャー領域１０２ａを囲むように設ければよく、図２および図３に示すように環状に設けたり、図４および図５に示すように基板１０２の表面の全体に設けたりする以外にも、例えば親水性キャプチャー領域１０２ａを除いた基板１０２の表面に部分的に設けてもよい。また、検出プローブスポット１０２ｃの配列状態およびその数は、図３および図５に限定されない。
【００３６】
図１に戻り、マイクロタイタープレート１０４は、親水性キャプチャー領域１０２ａに据える本発明にかかる試料や本発明にかかる各種物質（例えば、本発明にかかる破壊物質や増幅物質や防蒸散物質や反応物質、さらにはバッファー液など）を、区画を分けて保持する。
【００３７】
ここで、試料は、有核細胞を少なくとも含むものであり、例えば、ヘパリンなどで抗凝固処理した全血からなる血液や、全血から血液成分を分離した主に白血球からなるバフィーコートなどである。破壊物質は、所定の細胞を選択的に破壊するための物質であり、例えば赤血球を選択的に溶解するように塩濃度を調整した、界面活性剤などによる溶解液である。増幅物質は、核酸を増幅するための物質であり、例えばＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）試薬を含む増幅反応液である。防蒸散物質は、増幅物質や反応物質などの蒸散を防ぐための物質であり、例えばミネラルオイルやシリコンオイルなどのシーリングオイルである。なお、ミネラルオイルとしてはシグマ−アルドリッチ社製のミネラルオイル「Ｍ８６６２」などがあり、シリコンオイルとしてはインビトロジェン社製のＰＣＲ用シリコンオイル「１０８９０−０１０」などがある。反応物質は、核酸と検出プローブとのハイブリダイゼーション反応を行うための物質であり、例えばハイブリダイゼーション反応液である。
【００３８】
分注装置１０６は、マルチピペッター１０６ａを備え、マルチピペッター１０６ａで、試料や各種物質（例えば、破壊物質や増幅物質や防蒸散物質や反応物質、さらにはバッファー液など）をマイクロタイタープレート１０４から吸引したり、吸引した試料や各種物質を親水性キャプチャー領域１０２ａに分注したりする。サーマルサイクラー１０８は、ＰＣＲ反応に必要な温度条件に関するサーマルサイクルを基板１０２または各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに印可したり、基板１０２または各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを室温または所定の温度に保持したりする。
【００３９】
吐出装置１１０は、吐出ヘッド１１０ａを備え、吐出ヘッド１１０ａで、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに据えられている試料や各種物質を吸引して、吸引した試料や各種物質を他の親水性キャプチャー領域１０２ａに吐出する。吐出ヘッド洗浄装置１１２は吐出ヘッド１１０ａを洗浄する。
【００４０】
蛍光スキャナー１１４は、基板挿入部１１４ａを備え、基板挿入部１１４ａに挿入された基板１０２をスキャンして蛍光画像データを作成する。制御装置１１６は、具体的には市販のパーソナルコンピュータであり、分注装置１０６やサーマルサイクラー１０８や吐出装置１１０や吐出ヘッド洗浄装置１１２や蛍光スキャナー１１４と通信可能に接続されており、分注装置１０６やサーマルサイクラー１０８や吐出装置１１０や吐出ヘッド洗浄装置１１２や蛍光スキャナー１１４を制御する。制御装置１１６は、蛍光スキャナー１１４から転送された蛍光画像データを受け取り、当該蛍光画像データに基づいてハイブリダイゼーション反応の有無を検出する機能を備える。
【００４１】
つぎに、以上で説明した試料処理装置１００で実行する試料処理方法について、図６および図７を参照して説明する。図６および図７は、試料処理装置１００で実行する試料処理方法の一例を示す図である。
【００４２】
作業者が、白血球Ｗおよび赤血球Ｒを含みヘパリンで抗凝固処理された全血からなる血液Ｂと、赤血球を選択的に溶解するように塩濃度を調整した、界面活性剤による溶解液Ｓｏと、蛍光標識したプライマーを含むＰＣＲ試薬を含む増幅反応液Ｐと、シーリングオイルＳと、ハイブリダイゼーション反応液Ｈと、バッファー液とをマイクロタイタープレート１０４の所定の区画に置き、図４および図５に示す基板１０２を所定の位置に設置し、制御装置１１６のモニタに表示されているスタートメニュー画面に対しキーボードやマウスなどの入力装置を介して各種条件を設定し、スタートメニュー画面のスタートボタンを押すと、試料処理装置１００は、制御装置１１６を中心として図６に示す試料処理方法を実行する。
【００４３】
まず、制御装置１１６は分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、マイクロタイタープレート１０４から血液Ｂを吸引し、吸引した血液Ｂを各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに約１μl（マイクロリットル）滴下する（工程１：試料据置工程）。これにより、血液Ｂは半球状の液滴として親水性キャプチャー領域１０２ａに保持され、滴下から所定時間経過すると血液Ｂに含まれる血球の一部は沈降などにより白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅに単層状に接触し、単層状に接触している血球のうち白血球Ｗのみが白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅに吸着する。
【００４４】
つぎに、制御装置１１６は、工程１を完了してから所定時間経過すると分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅに吸着している白血球Ｗが残るように、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａからマルチピペッター１０６ａで血液Ｂを取り除く（工程２：試料除去工程）。白血球は白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅに吸着しているため、血液Ｂは、分注装置１０６のマルチピペッター１０６ａで吸い取ることで親水性キャプチャー領域１０２ａから取り除くことができる。なお、マルチピペッター１０６ａで血液Ｂを吸い取る際、マルチピペッター１０６ａのノズル先端で白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅに吸着している白血球Ｗを破壊しないために、当該ノズル先端と白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅとの間に白血球の厚さ程度（約数十μｍ程度）の間隙を設けることが望ましい。
【００４５】
ここで、図２および図３に示す基板１０２を用いた場合には工程２が完了したときに白血球Ｗ以外にも赤血球Ｒなどが非特異的細胞吸着コート層１０２ｄに単層状に吸着している可能性があるので（図７に示す工程２を参照）、当該基板１０２を用いた場合には、制御装置１１６は、図７に示すように工程２を完了してから分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、マイクロタイタープレート１０４から溶解液Ｓｏを吸引し、吸引した溶解液Ｓｏを各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに約１μl（マイクロリットル）滴下し（工程２’：破壊物質据置工程）、所定時間経過してから、マルチピペッター１０６ａで、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａから、赤血球Ｒなどが溶解している溶解液Ｓｏを取り除いてもよい（工程２’：破壊物質等除去工程）。これにより、溶解液Ｓｏは半球状の液滴として親水性キャプチャー領域１０２ａに保持され、非特異的細胞吸着コート層１０２ｄに吸着した赤血球Ｒは溶解液Ｓｏにより溶解してヘモグロビンなど核酸の増幅を阻害する成分などが溶解液Ｓｏ中に溶出し、白血球Ｗのみが非特異的細胞吸着コート層１０２ｄに吸着した状態にすることができる。すなわち、赤血球Ｒを溶解することで核酸の増幅を阻害するヘモグロビンを溶解液Ｓｏと共に効率的且つ効果的に除去することができる。これにより、核酸の増幅に関する工程４を効率よく実行することができ、結果として、核酸と検出プローブとのハイブリダイゼーション反応に関する工程５やハイブリダイゼーション反応の検出に関する工程６での精度も向上することができる。
【００４６】
図６に戻り、制御装置１１６はサーマルサイクラー１０８に指令を出し、サーマルサイクラー１０８は、当該指令を受けると、白血球Ｗが破壊することで白血球Ｗに含まれる核酸が露出するまで基板１０２または各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを室温または適度な温度に保持することで、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａの表面の水分を蒸発させて、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを乾燥する（工程３：核酸露出乾燥工程）。
【００４７】
以上、工程１から工程３により、血液Ｂから核酸Ｎを抽出するといった試料の処理を、実施環境を制限したり溶媒や試薬を使用したりせずに、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で、効率的且つ迅速に行うことができた。また、微量な量の血液Ｂから、白血球Ｗに含まれる核酸Ｎを簡便且つ容易に抽出することができた。これにより、被験者の身体的・精神的負担を軽減することができる。
【００４８】
つぎに、制御装置１１６は分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、マイクロタイタープレート１０４から増幅反応液Ｐを吸引し、吸引した増幅反応液Ｐを各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに約１μl（マイクロリットル）滴下する（工程４：増幅物質据置工程）。これにより、増幅反応液Ｐは半球状の液滴として親水性キャプチャー領域１０２ａに保持される。
そして、制御装置１１６は引き続き分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、マイクロタイタープレート１０４からシーリングオイルＳを吸引し、吸引したシーリングオイルＳを、核酸Ｎおよび増幅反応液Ｐを覆うように（図６に示すように核酸Ｎおよび増幅反応液Ｐの上層に）各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに約５μｌ（マイクロリットル）滴下する（工程４：防蒸散物質据置工程）。これにより、増幅反応液Ｐを封止して、サーマルサイクルにおける増幅反応液Ｐの蒸散を防止する。
そして、制御装置１１６はサーマルサイクラー１０８に指令を出し、サーマルサイクラー１０８は、当該指令を受けると、基板１０２または各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに、ＰＣＲ反応に必要なサーマルサイクルを印可する（工程４：温度曝露工程）。
【００４９】
以上、工程４により、工程３で抽出した核酸Ｎを、同じ基板１０２さらには同じ親水性キャプチャー領域１０２ａにて簡便且つ容易に増幅することができた。換言すると、工程１から工程４の間において、従来技術のように容器の移し替えの操作や新たな容器を必要とせず、１つの基板１０２のみで核酸Ｎの抽出から核酸Ｎの増幅までの工程を簡便且つ容易に行うことができた。また、工程４により、増幅された核酸Ｎに蛍光標識を導入することができた。これにより、増幅用の試薬など高価な試薬の使用量を減らすことができる。なお、核酸の増幅方法は、工程４で示したＰＣＲ法に限定されるものではなく、例えば等温増幅法やその他公知の様々な増幅方法でもよい。
【００５０】
つぎに、制御装置１１６は分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａからシーリングオイルＳを取り除く（工程５：防蒸散物質除去工程）。
そして、制御装置１１６はサーマルサイクラー１０８に指令を出し、サーマルサイクラー１０８は、当該指令を受けると、基板１０２または各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを室温または適度な温度に保持することで、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを乾燥する（工程５：吸着領域乾燥工程）。
そして、制御装置１１６は分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、マイクロタイタープレート１０４からハイブリダイゼーション反応液Ｈを吸引し、吸引したハイブリダイゼーション反応液Ｈを各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに約１μl（マイクロリットル）滴下する（工程５：反応物質据置工程）。これにより、ハイブリダイゼーション反応液Ｈは半球状の液滴として親水性キャプチャー領域１０２ａに保持される。なお、増幅反応液Ｐがハイブリダイゼーション反応のための試薬類をさらに混合してなる場合には、当該工程を省略することができる。
ここで、制御装置１１６は反応物質据置工程に引き続き分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、マイクロタイタープレート１０４からシーリングオイルＳを吸引し、吸引したシーリングオイルＳを、核酸Ｎ（蛍光標識された標的核酸Ｎ１を含む）およびハイブリダイゼーション反応液Ｈを覆うように（図６に示すように標的核酸Ｎ１およびハイブリダイゼーション反応液Ｈの上層に）各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに約５μｌ（マイクロリットル）滴下してもよい。これにより、シーリングオイルＳは半球状の液滴として親水性キャプチャー領域１０２ａに保持される。
そして、制御装置１１６はサーマルサイクラー１０８に指令を出し、サーマルサイクラー１０８は、当該指令を受けると、基板１０２または各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを室温に保持したり、基板１０２または各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに適度な温度（例えば６０℃の温度）を印可して当該温度を保持したりする（工程５：温度保持工程）。
【００５１】
以上、工程５により、工程４で蛍光標識された標的核酸Ｎ１と検出プローブとのハイブリダイゼーション反応を、同じ基板１０２さらには同じ親水性キャプチャー領域１０２ａにて簡便且つ容易に行うことができた。換言すると、工程１から工程５の間において、従来技術のように容器の移し替えの操作や新たな容器を必要とせず、１つの基板１０２のみで核酸Ｎの抽出からハイブリダイゼーション反応までの工程を簡便且つ容易に行うことができた。なお、ハイブリダイゼーションの方法は、工程５で示したハイブリダイゼーション方法に限定されるものではなく、例えば、工程４では蛍光標識を導入せずに、工程５でインターカレーターを用いて標的核酸Ｎ１と検出プローブとのハイブリダイゼーション反応を行ってもよい。
【００５２】
つぎに、制御装置１１６は分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、ハイブリダイゼーション反応液Ｈを取り除く（工程６：反応物質除去工程）。なお、工程５においてハイブリダイゼーション反応液Ｈの上層にシーリングオイルＳを滴下した場合には、分注装置１０６は、マルチピペッター１０６ａで、シーリングオイルＳおよびハイブリダイゼーション反応液Ｈを取り除く。
ここで、制御装置１１６は反応物質除去工程に引き続き分注装置１０６に指令を出し、分注装置１０６は、当該指令を受けると、マルチピペッター１０６ａで、マイクロタイタープレート１０４からバッファー液を吸引し、吸引したバッファー液を各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに適量滴下することで、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを洗浄し、制御装置１１６はサーマルサイクラー１０８に指令を出し、サーマルサイクラー１０８は、当該指令を受けると、基板１０２または各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを室温または適度な温度に保持することで、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａを乾燥してもよい。
そして、作業者は、基板１０２を蛍光スキャナー１１４の基板挿入部１１４ａに挿入する。
そして、制御装置１１６は蛍光スキャナー１１４に指令を出し、蛍光スキャナー１１４は、当該指令を受けると、基板挿入部１１４ａに基板１０２が適正に挿入されているかを確認し、基板１０２が適正に挿入されていることを確認した場合には基板１０２をスキャンし、スキャンした基板１０２の蛍光画像データを制御装置１１６に転送し、制御装置１１６は、蛍光スキャナー１１４から転送された蛍光画像データを受けると、当該蛍光画像データに基づいて、蛍光標識された標的核酸Ｎ１についてハイブリダイゼーション反応の有無を検出する（工程６：反応検出工程）。
【００５３】
以上、工程６により、蛍光標識された標的核酸Ｎ１のうち検出プローブとハイブリダイズした標的核酸Ｎ１１を、同じ基板１０２さらには同じ親水性キャプチャー領域１０２ａにて簡便且つ容易に検出することができた。換言すると、工程１から工程６の間において、従来技術のように容器の移し替えの操作や新たな容器を必要とせず、１つの基板１０２のみで核酸Ｎの抽出からハイブリダイゼーション反応の検出までの工程を簡便且つ容易に行うことができた。
【００５４】
以上、詳細に説明したように、本実施の形態にかかる試料処理装置１００によれば、白血球特異的抗体で表面処理された白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅを含む親水性キャプチャー領域１０２ａをその表面に設けた基板１０２を用いて、全血などの白血球Ｗを含む血液Ｂを親水性キャプチャー領域１０２ａに据え、親水性キャプチャー領域１０２ａに吸着している白血球Ｗが残るように、親水性キャプチャー領域１０２ａから血液Ｂを取り除き、白血球Ｗが破壊することで当該白血球に含まれる核酸が露出するように、親水性キャプチャー領域１０２ａを乾燥することで、白血球Ｗに含まれる核酸を抽出するので、白血球Ｗを含む血液Ｂから核酸Ｎを抽出するといった試料の処理を、実施環境を制限したり溶媒や試薬を使用したりせずに、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で、効率的且つ迅速に行うことができる。換言すると、核酸の分析に係わる「血液からの核酸の抽出」が簡便且つ容易に行うことができる。また、試料処理装置１００によれば、図２から図５に示すような基板１０２を用いるので、遺伝子欠失や薬剤感受性ＳＮＰなどの遺伝子診断における臨床検査で用いる血液の量や各種試薬の量を効果的に減らすことができ、その結果、被験者の身体的負担や精神的負担を軽減することができるとともに、検査費用を削減することができる。
【００５５】
また、試料処理装置１００によれば、図２および図３に示す基板１０２（非特異的細胞吸着コート層１０２ｄを持つ基板１０２）を用いた場合には、全血などの白血球Ｗを含む血液Ｂを親水性キャプチャー領域１０２ａに据え、親水性キャプチャー領域１０２ａに吸着している白血球Ｗが残るように、親水性キャプチャー領域１０２ａから血液Ｂを取り除いた後、溶解液Ｓｏを各々の親水性キャプチャー領域１０２ａに据え、所定時間経過してから、各々の親水性キャプチャー領域１０２ａから溶解液Ｓｏを取り除いてもよいので、親水性キャプチャー領域１０２ａに吸着している血球のうち、核酸の分析には不要で阻害物質となるヘモグロビンを有する赤血球Ｒを選択的に効果的に排除することができ、その結果、核酸の分析の精度を向上することができる。
【００５６】
また、試料処理装置１００によれば、増幅反応液Ｐを親水性キャプチャー領域１０２ａに据え、抽出した核酸Ｎおよび増幅反応液Ｐを覆うように、シーリングオイルＳを親水性キャプチャー領域１０２ａに据え、親水性キャプチャー領域１０２ａを所定の温度条件に曝すことで、核酸Ｎを増幅するので、抽出した核酸Ｎを、同じ基板１０２さらには同じ親水性キャプチャー領域１０２ａにて簡便且つ容易に増幅することができる。
これまで、核酸の増幅に関する技術としては、例えば、親水性を持たせた領域で核酸を増幅して検出する特許第３７４３０９０号の特許公報が開示されている。具体的には、当該特許公報には、親水性の材料の周囲を囲む疎水性の材料で被覆した発熱抵抗体の上に反応溶液を滴下して当該反応溶液にヒートサイクルを印可することで、核酸の増幅を行う技術が開示されている。しかし、当該特許公報では、核酸を分析するには、さらに核酸を抽出し検出するための素子が別途必要になるので、核酸の分析を簡単・小型な装置構成および簡便な操作で効率的且つ迅速に行うことが困難である。
ところが、試料処理装置１００によれば、１つの基板１０２のみで核酸Ｎの抽出から核酸Ｎの増幅までの工程を、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で簡便且つ容易に行うことができる。
【００５７】
また、試料処理装置１００によれば、親水性キャプチャー領域１０２ａからシーリングオイルＳを取り除き、親水性キャプチャー領域１０２ａを乾燥し、ハイブリダイゼーション反応液Ｈを親水性キャプチャー領域１０２ａに据え、親水性キャプチャー領域１０２ａを所定の温度に保つことで、増幅した核酸Ｎとプローブとのハイブリダイゼーション反応を行うので、標的核酸Ｎ１と検出プローブとのハイブリダイゼーション反応を、同じ基板１０２さらには同じ親水性キャプチャー領域１０２ａにて簡便且つ容易に行うことができる。
これまで、ハイブリダイゼーション反応に関する技術としては、特許第３３８６３９１号の特許公報や特許第３３９３５２８号の特許公報や特許第３６２５８２６号の特許公報などが開示されている。特許第３３８６３９１号の特許公報には、標的核酸と相補的な配列を含むプローブを平板な基板上に区域を分けて設ける方法が開示されている。また、特許第３３９３５２８号の特許公報には、標識などを設けた試料核酸とのハイブリダイゼーション反応により標的核酸の有無などを検出する方法が開示されている。特許第３６２５８２６号の特許公報には、表面張力によって隔離される液滴を化学反応させ、特に、プローブとのハイブリダイゼーションにより核酸の検出を行う方法が開示されている。しかし、これら特許公報では、試料からの核酸の抽出や抽出した微量な核酸の増幅に関する技術は開示されておらず、ゆえに、核酸を分析する際には、これら特許公報における核酸の検出方法とは別に、核酸を試料から抽出して微量な核酸を増幅する方法が必要になるので、核酸の分析を簡単・小型な装置構成および簡便な操作で効率的且つ迅速に行うことが困難である。
ところが、試料処理装置１００によれば、１つの基板１０２のみで核酸Ｎの抽出からハイブリダイゼーション反応までの工程を、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で簡便且つ容易に行うことができる。
【００５８】
また、試料処理装置１００によれば、親水性キャプチャー領域１０２ａからハイブリダイゼーション反応液Ｈを取り除き、増幅した核酸についてハイブリダイゼーション反応の有無を検出するので、標的核酸Ｎ１のうち検出プローブとハイブリダイズした標的核酸Ｎ１１を、同じ基板１０２さらには同じ親水性キャプチャー領域１０２ａにて簡便且つ容易に検出することができる。
【００５９】
以上、試料処理装置１００によれば、血液Ｂからの核酸Ｎの抽出から、核酸Ｎの増幅や核酸Ｎとプローブとのハイブリダイゼーションやハイブリダイゼーション反応の検出といった核酸Ｎの分析までを、１つの基板１０２により、簡単・小型な装置構成および簡便な操作で、煩雑さを伴わずに一連の流れで行うことができる。
【００６０】
また、試料処理装置１００で用いる基板１０２は親水性キャプチャー領域１０２ａの他に疎水性領域１０２ｂをさらに設けており、親水性キャプチャー領域１０２ａは疎水性領域１０２ｂに囲まれているので、血液Ｂや各種物質を親水性キャプチャー領域１０２ａ内に確実に保持することができる。また、試料処理装置１００で用いる基板１０２は、その表面に親水性キャプチャー領域１０２ａを複数設けているので、複数の試料を同時に分析することができ、多検体の処理性に優れている。また、試料処理装置１００で用いる基板１０２において、非特異的細胞吸着コート層１０２ｄまたは白血球特異的細胞吸着コート層１０２ｅの面積は各々の親水性キャプチャー領域１０２ａ間で同じであるので、単層吸着する白血球の量を各々の親水性キャプチャー領域１０２ａ間で一定にすることができ、結果として抽出する核酸の量が一定になり、定量性良く核酸を抽出することができる。また、抽出した核酸の濃度測定などが不要で、且つ安定した核酸の増幅が可能となる。つまり、核酸の分析が簡便且つ容易となり、検出の精度が向上する。また、試料処理装置１００で用いる基板１０２において、親水性キャプチャー領域１０２ａの形状は円形であり、その直径は２０μｍ以上且つ１０，０００μｍ以下であるので、血液Ｂや各種物質を安定して確実に保持することができ、しかも２ｐｌ（ピコリットル）から２６０μｌ（マイクロリットル）程度の微量の液滴を概ね半球状に保持することができる。これにより、血液Ｂや各種物質に用いる試薬の量を減らすことができる。
【００６１】
また、試料処理装置１００で用いた試料は白血球を含む血液であるので、遺伝子欠失や薬剤感受性ＳＮＰなどの遺伝子診断などにおける臨床検査において好適に実施することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
以上のように、本発明にかかる試料処理方法は、バイオ・製薬・医療など様々な分野で好適に用いることができ、特に、血液などの臨床検体から核酸を抽出する場合（例えば、遺伝子欠失や薬剤感受性ＳＮＰなどの遺伝子診断など）に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本実施の形態にかかる試料処理装置１００の構成の一例を示す図である。
【図２】本実施の形態にかかる基板１０２の一例を示す斜視図である。
【図３】本実施の形態にかかる基板１０２の一例を示す斜視図である。
【図４】本実施の形態にかかる基板１０２の一例を示す斜視図である。
【図５】本実施の形態にかかる基板１０２の一例を示す斜視図である。
【図６】試料処理装置１００で実行する試料処理方法の一例を示す図である。
【図７】試料処理装置１００で実行する試料処理方法の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００６４】
１００ 試料処理装置
１０２ 基板
１０２ａ 親水性キャプチャー領域
１０２ｂ 疎水性領域
１０２ｃ 検出プローブスポット
１０２ｄ 非特異的細胞吸着コート層
１０２ｅ 白血球特異的細胞吸着コート層
１０４ マイクロタイタープレート
１０６ 分注装置
１０６ａ マルチピペッター
１０８ サーマルサイクラー
１１０ 吐出装置
１１０ａ 吐出ヘッド
１１２ 吐出ヘッド洗浄装置
１１４ 蛍光スキャナー
１１６ 制御装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む試料を処理する試料処理方法において、
前記細胞を吸着する物質である細胞吸着物質で表面処理された領域を含む細胞吸着領域をその表面に設けた基板を用いて、
前記試料を前記細胞吸着領域に据える試料据置工程と、
前記試料据置工程を実行した後、前記細胞吸着物質に吸着している前記細胞が残るように、前記細胞吸着領域から前記試料を取り除く試料除去工程と、
前記試料除去工程を実行した後、前記細胞が破壊することで当該細胞に含まれる前記核酸が露出するまで、前記細胞吸着領域を乾燥する核酸露出乾燥工程と、
を実行することで、
前記細胞に含まれる前記核酸を抽出すること
を特徴とする試料処理方法。
【請求項２】
前記試料除去工程を実行した後、所定の前記細胞を選択的に破壊するための前記物質である破壊物質を、前記細胞吸着領域に据える破壊物質据置工程と、
前記破壊物質据置工程を実行した後、前記細胞吸着領域から、前記破壊物質および当該破壊物質により破壊された前記細胞を取り除く破壊物質等除去工程と
をさらに実行し、
前記核酸露出乾燥工程は、前記破壊物質等除去工程を実行した後、前記細胞吸着領域を乾燥すること
を特徴とする請求項１に記載の試料処理方法。
【請求項３】
前記核酸露出乾燥工程を実行した後、前記核酸を増幅するための前記物質である増幅物質を、前記細胞吸着領域に据える増幅物質据置工程と、
前記増幅物質据置工程を実行した後、前記抽出した前記核酸および前記増幅物質を覆うように、前記増幅物質の蒸散を防ぐための前記物質である防蒸散物質を、前記細胞吸着領域に据える防蒸散物質据置工程と、
前記防蒸散物質据置工程を実行した後、前記細胞吸着領域を所定の温度条件に曝す温度曝露工程と、
をさらに実行することで、
前記核酸を増幅すること
を特徴とする請求項１または２に記載の試料処理方法。
【請求項４】
前記細胞吸着領域は、標的とする核酸配列に相補的な配列を含む１種類または複数種類のプローブを、区画を分けて設けており、
前記温度曝露工程を実行した後、前記細胞吸着領域から前記防蒸散物質を取り除く防蒸散物質除去工程と、
前記防蒸散物質除去工程を実行した後、前記細胞吸着領域を乾燥する吸着領域乾燥工程と、
前記吸着領域乾燥工程を実行した後、前記核酸と前記プローブとのハイブリダイゼーション反応を行うための前記物質である反応物質を、前記細胞吸着領域に据える反応物質据置工程と、
前記反応物質据置工程を実行した後、前記細胞吸着領域を所定の温度に保つ温度保持工程と、
を実行することで、
前記増幅した前記核酸と前記プローブとの前記ハイブリダイゼーション反応を行うこと
を特徴とする請求項３に記載の試料処理方法。
【請求項５】
前記温度保持工程を実行した後、前記細胞吸着領域から前記反応物質を取り除く反応物質除去工程と、
前記反応物質除去工程を実行した後、前記増幅した前記核酸について前記ハイブリダイゼーション反応の有無を検出する反応検出工程と
を実行すること
を特徴とする請求項４に記載の試料処理方法。
【請求項６】
前記基板は、疎水性の前記領域である疎水性領域をさらに設けており、
前記細胞吸着領域は、親水性であり前記疎水性領域に囲まれていること
を特徴とする請求項１から５のいずれか１つに記載の試料処理方法。
【請求項７】
前記基板は、その表面に前記細胞吸着領域を複数設けていること
を特徴とする請求項１から６のいずれか１つに記載の試料処理方法。
【請求項８】
各々の前記細胞吸着領域において、前記細胞吸着物質で表面処理された前記領域の面積は同じであること
を特徴とする請求項７に記載の試料処理方法。
【請求項９】
前記細胞吸着領域の形状は円形であり、その直径は２０μｍ以上且つ１０，０００μｍ以下であること
を特徴とする請求項１から８のいずれか１つに記載の試料処理方法。
【請求項１０】
前記細胞は白血球であり、前記試料は血液であること
を特徴とする請求項１から９のいずれか１つに記載の試料処理方法。
【請求項１】
細胞を含む試料を処理する試料処理方法において、
前記細胞を吸着する物質である細胞吸着物質で表面処理された領域を含む細胞吸着領域をその表面に設けた基板を用いて、
前記試料を前記細胞吸着領域に据える試料据置工程と、
前記試料据置工程を実行した後、前記細胞吸着物質に吸着している前記細胞が残るように、前記細胞吸着領域から前記試料を取り除く試料除去工程と、
前記試料除去工程を実行した後、前記細胞が破壊することで当該細胞に含まれる前記核酸が露出するまで、前記細胞吸着領域を乾燥する核酸露出乾燥工程と、
を実行することで、
前記細胞に含まれる前記核酸を抽出すること
を特徴とする試料処理方法。
【請求項２】
前記試料除去工程を実行した後、所定の前記細胞を選択的に破壊するための前記物質である破壊物質を、前記細胞吸着領域に据える破壊物質据置工程と、
前記破壊物質据置工程を実行した後、前記細胞吸着領域から、前記破壊物質および当該破壊物質により破壊された前記細胞を取り除く破壊物質等除去工程と
をさらに実行し、
前記核酸露出乾燥工程は、前記破壊物質等除去工程を実行した後、前記細胞吸着領域を乾燥すること
を特徴とする請求項１に記載の試料処理方法。
【請求項３】
前記核酸露出乾燥工程を実行した後、前記核酸を増幅するための前記物質である増幅物質を、前記細胞吸着領域に据える増幅物質据置工程と、
前記増幅物質据置工程を実行した後、前記抽出した前記核酸および前記増幅物質を覆うように、前記増幅物質の蒸散を防ぐための前記物質である防蒸散物質を、前記細胞吸着領域に据える防蒸散物質据置工程と、
前記防蒸散物質据置工程を実行した後、前記細胞吸着領域を所定の温度条件に曝す温度曝露工程と、
をさらに実行することで、
前記核酸を増幅すること
を特徴とする請求項１または２に記載の試料処理方法。
【請求項４】
前記細胞吸着領域は、標的とする核酸配列に相補的な配列を含む１種類または複数種類のプローブを、区画を分けて設けており、
前記温度曝露工程を実行した後、前記細胞吸着領域から前記防蒸散物質を取り除く防蒸散物質除去工程と、
前記防蒸散物質除去工程を実行した後、前記細胞吸着領域を乾燥する吸着領域乾燥工程と、
前記吸着領域乾燥工程を実行した後、前記核酸と前記プローブとのハイブリダイゼーション反応を行うための前記物質である反応物質を、前記細胞吸着領域に据える反応物質据置工程と、
前記反応物質据置工程を実行した後、前記細胞吸着領域を所定の温度に保つ温度保持工程と、
を実行することで、
前記増幅した前記核酸と前記プローブとの前記ハイブリダイゼーション反応を行うこと
を特徴とする請求項３に記載の試料処理方法。
【請求項５】
前記温度保持工程を実行した後、前記細胞吸着領域から前記反応物質を取り除く反応物質除去工程と、
前記反応物質除去工程を実行した後、前記増幅した前記核酸について前記ハイブリダイゼーション反応の有無を検出する反応検出工程と
を実行すること
を特徴とする請求項４に記載の試料処理方法。
【請求項６】
前記基板は、疎水性の前記領域である疎水性領域をさらに設けており、
前記細胞吸着領域は、親水性であり前記疎水性領域に囲まれていること
を特徴とする請求項１から５のいずれか１つに記載の試料処理方法。
【請求項７】
前記基板は、その表面に前記細胞吸着領域を複数設けていること
を特徴とする請求項１から６のいずれか１つに記載の試料処理方法。
【請求項８】
各々の前記細胞吸着領域において、前記細胞吸着物質で表面処理された前記領域の面積は同じであること
を特徴とする請求項７に記載の試料処理方法。
【請求項９】
前記細胞吸着領域の形状は円形であり、その直径は２０μｍ以上且つ１０，０００μｍ以下であること
を特徴とする請求項１から８のいずれか１つに記載の試料処理方法。
【請求項１０】
前記細胞は白血球であり、前記試料は血液であること
を特徴とする請求項１から９のいずれか１つに記載の試料処理方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−５７８１（Ｐ２００８−５７８１Ａ）
【公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１８０３４２（Ｐ２００６−１８０３４２）
【出願日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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